BRPI0811023B1

BRPI0811023B1 - métodos de regulação negativa ou diminuição da troca de dióxido de carbono (co2) e/ou água em uma célula-guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta, de fechamento de um poro estomatal em uma célula-guarda na epiderme de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta ou para produzir uma célula guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta com eficiência de uso de água melhorado ou resistente à seca, e, molécula de ácido nucléico

Info

Publication number: BRPI0811023B1
Application number: BRPI0811023A
Authority: BR
Inventors: Boisson-Demier Aurelien; Hu Honghong; M Kuhn Josef; Schroeder Julian; Israelsson Maria; Yang Yingzhen
Original assignee: Univ California
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2019-01-02
Also published as: UA101156C2; US10378021B2; US20100299782A1; US20170067074A1; EA029920B1; US9505811B2; US8916745B2; CL2012000197A1; CA2685425C; MX2009011591A; EA019514B1; ZA200907498B; WO2008134571A1; EP3196310A1; CN103555735B; CA3017478A1; EA201300790A1; AU2008245611A1; US20140298543A1; EP2147100A4

Description

“MÉTODOS DE REGULAÇÃO NEGATIVA OU DIMINUIÇÃO DA TROCA DE DIÓXIDO DE CARBONO (CO2) E/OU ÁGUA EM UMA CÉLULA-GUARDA DE UMA PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, FOLHA DE PLANTA, ÓRGÃO DE PLANTA OU PARTE DE PLANTA, DE FECHAMENTO DE UM PORO ESTOMATAL EM UMA CÉLULAGUARDA NA EPIDERME DE UMA PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, FOLHA DE PLANTA, ÓRGÃO DE PLANTA OU PARTE DE PLANTA OU PARA PRODUZIR UMA CÉLULA GUARDA, PLANTA, CÉLULA DE PLANTA, FOLHA DE PLANTA, ÓRGÃO DE PLANTA OU PARTE DE PLANTA COM EFICIÊNCIA DE USO DE ÁGUA MELHORADO OU RESISTENTE À SECA, E, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO”

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere à biologia molecular e celular de planta. Em particular, a invenção proporciona composições e métodos para manipulação da troca de água e/ou dióxido de carbono (CO₂) através do estômato de plantas por meio de expressão e controle de genes sensores de CO2, incluindo os novos genes sensores de CO2 da presente invenção. A invenção também proporciona plantas resistentes à estiagem; e métodos para manipulação de plantas com eficiência de uso de água aumentada e plantas resistentes à estiagem.

ANTECEDENTES

Poros estomatais na epiderme de folhas de planta permitem o controle de perda de água pela planta e o influxo de CO2 em plantas a partir da atmosfera. O dióxido de carbono é captado para fixação de carbono fotossintético e água é perdida durante o processo de transpiração através dos poros estomatais. Cada estômato é composto de um par especializado de células denominadas células-guarda, as quais podem modificar o tamanho do poro estomatal controlando o estado de turgor das células-guarda. Um traço

Petição 870180040931, de 16/05/2018, pág. 8/14 importante em agricultura, em aplicações biotecnológicas e na produção de biocombustíveis é a eficiência do uso de água das plantas. A eficiência do uso de água define quão bem uma planta pode equilibrar a perda de água através do estômato com a captação de CO₂ líquida em folhas para fotossíntese e, consequentemente, seu acúmulo de biomassa. Vários fatores bióticos e abióticos influenciam o estado da abertura estomatal, desse modo, otimizando a eficiência de uso de água de uma planta em uma determinada condição. A concentração de CO₂ regula os movimentos estomatais, onde altos níveis de CO₂ levarão a fechamento estomatal e baixos níveis de CO₂ induzirão à abertura estomatal. Assim, o CO₂ regula o influxo de CO₂ para as plantas e perda de água da planta em uma escala global. Contudo, no momento, nenhum sensor de CO₂ foi identificado. Conhecimento sobre receptores de CO₂ que regulam respostas ao CO₂ podería ser usado para manipular a resposta ao CO₂, de modo que a eficiência de uso de água durante crescimento da planta podería ser intensificada através de manipulação.

Como as plantas percebem o nível de dióxido de carbono (CO₂) permanece desconhecido. Conhecimento de como o CO₂ é percebido por uma planta podería ser usado para manipular a resposta ao CO₂, de modo que o carbono e eficiência de uso de água durante crescimento da planta poderíam ser intensificados.

Carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (PEPC; EC 4.1.1.31) é uma enzima chave da fotossíntese naquelas espécies de planta exibindo a via C4 ou CAM para fixação de CO₂. O principal substrato de PEPC é a forma livre de PEP. PEPC catalisa a conversão de PEP e bicarbonato em fosfato inorgânico de ácido oxalacético (Pi). Essa reação é a primeira etapa de uma via metabólica conhecida como a via C4 de ácido dicarboxílico, a qual minimiza perdas de energia produzidas pela foto-respiração. PEPC está presente em plantas, algas, cianobactérias e bactérias.

A fixação de carbono ou a conversão de CO₂ em formas

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 16/196 reduzidas passíveis de bioquímica celular, ocorre através de diversas vias metabólicas em vários organismos. A mais familiar dessas é o Ciclo de Calvin (ou ciclo de Calvin-Benson), o qual está presente em cianobactérias e seus derivados de plastídeo, tais como cloroplastos e proteobactérias. O ciclo de Calvin utiliza a enzima Rubisco ou carboxilase/oxigenase de ribulose-1,5bifosfato. A Rubisco existe em pelo menos duas formas: Rubisco da forma I, a qual é encontrada em proteobactérias, cianobactérias e plastídeos, por exemplo, como um octo-dímero composto de oito grandes subunidades e oito pequenas subunidades; Rubisco da forma II é uma forma dimérica da enzima, por exemplo, conforme encontrado em proteobactérias. A Rubisco contém duas atividades enzimáticas competitivas: uma atividade de oxigenase e uma de carboxilase. A reação de oxigenação catalisada pela Rubisco é um processo dispendioso, uma vez que ele compete com e reduz significativamente a quantidade líquida de carbono fixado. A espécie de enzima Rubisco codificada em vários organismos fotossintéticos foi selecionada através de evolução natural para proporcionar plantas superiores com uma enzima Rubisco que é substancialmente mais eficiente na carboxilação na presença de oxigênio atmosférico.

SUMÁRIO

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação da troca de água e/ou dióxido de carbono (CO₂) através de estômatos de planta por meio de controle de genes sensores de CO2, incluindo os novos genes sensores de CO2 da presente invenção designados genes CChSen. Os métodos da invenção, controlando como o CO2 é percebido por uma planta, podem ser usados para manipular a resposta ao CO2, de modo que o carbono e água são usados mais (ou menos) eficientemente durante crescimento da planta. Assim, os métodos da invenção podem ser usados para modificar a captação líquida de CO2 e eficiência de uso de água em plantas através de manipulação da expressão e/ou atividade de genes sensores de

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CO2, incluindo qualquer um dos novos genes sensores de CO2 da presente invenção ou qualquer combinação dos mesmos. Essas descobertas demonstram um papel potencialmente vital de genes sensores de CO2, incluindo qualquer um dos novos genes sensores de CO2 da presente invenção, na captação e/ou sinalização da percepção de CO2 em plantas.

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação da troca de água e CO2 através do estômato por meio de controle de genes sensores de CO2, incluindo qualquer um dos novos genes sensores de CO2 da presente invenção, incluindo regulação positiva ou regulação negativa de expressão, a qual pode ser acompanhada por regulação positiva ou regulação negativa ou inibição de genes sensores de CO2 e/ou transcrições, incluindo a sequência da presente invenção. A invenção proporciona composições e métodos para modificar a captação de CO2 líquida e eficiência de uso de água em plantas. A invenção proporciona plantas, por exemplo, plantas transgênicas, que mostram crescimento aprimorado sob condições limitativas de água; assim, a invenção proporciona plantas tolerantes à estiagem (por exemplo, safras). A invenção proporciona métodos para manipulação de eficiência de uso de água intensificada em plantas ou tolerância à estiagem em plantas (por exemplo, safras). A invenção proporciona composições e métodos para manipulação do acúmulo de biomassa e/ou produção de biocombustível em uma planta através de controle de qualquer um, dois ou três genes sensores de CO2 recentemente descobertos e/ou transcrições da presente invenção.

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação da abertura ou fechamento de poros estomatais sobre célulasguarda na epiderme de folhas de planta, desse modo, permitindo o controle de perda de água da planta e o influxo de CO2 em plantas a partir da atmosfera.

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação da captação de dióxido de carbono, fixação de carbono fotossintético e/ou perda

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 18/196 de água através do processo de transpiração por meio dos poros estomatais; cada estômato é composto de um par especializado de células denominadas células-guarda, as quais podem modificar o tamanho do poro estomatal através de controle do estado de turgor da célula-guarda. A invenção 5 proporciona composições e métodos para manipulação do estado de turgor de células-guarda.

A invenção proporciona composições e métodos para intensificação da produção de biomassa para a produção de biocombustível através de manipulação de eficiência de uso de água de plantas; a eficiência 10 de uso de água define quão bem uma planta pode equilibrar a perda de água através de estômatos com a captação de CO₂ líquida para fotossíntese e, consequentemente, seu acúmulo de biomassa.

Os inventores identificaram um mutante duplo e um mutante triplo em Arabidopsis thaliana que carece da expressão de comprimento total 15 de genes homólogos que são altamente expressos em células-guarda do tipo silvestre, de acordo com análises de microarranjo célula-específico. O mutante duplo CChSen e o mutante triplo mostram uma resposta estomatal defectiva, conforme medido através de análise de permuta de gás em tempo real, a alterações na concentração de dióxido de carbono ([CO₂]); ambos com 20 relação a alterações de 365 ppm de CO₂ ambiente para 800 ppm de CO₂elevado e de 800 ppm de CO₂ e a partir de 800 ppm de CO₂ para 100 ppm de CO₂ reduzido. As proteínas CCLSen-codificadas são conhecidas por se ligar ao CO₂. Essas descobertas demonstram um papel dos ácidos nucleicos da presente invenção, os assim denominados genes CO₂5en, na 25 captação/sinalização de percepção de CO₂. A invenção proporciona meios para controlar como as plantas podem captar o CO₂, assim, também proporcionando meios para produzir safras com carbono e eficiência de uso de água alterados. Assim, a invenção proporciona composições (por exemplo, plantas transgênicas) e métodos para aliviar os efeitos de elevação de [CO₂]

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 19/196 atmosférico sobre diferentes espécies de plantas.

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação de como o CO₂ é percebido em plantas e composições e métodos para controle da produção de safras com eficiência de uso de água (WUE) 5 alterada. Muitas plantas exibem uma fraca resposta de movimento estomatal a diferentes concentrações de CO2. Dados do mutante duplo da presente invenção (dos genes CA1/CA4) mostram uma resposta estomatal defectiva ao [CO2] alterado e superexpressão de qualquer gene em células-guarda aumenta dramaticamente a eficiência de uso de água em plantas. Esses dados 10 demonstram que superexpressão de todos ou um desses genes (por exemplo, CChSen da invenção) estimula uma resposta aprimorada ao CO2. Assim, superexpressão dos ácidos nucleicos da presente invenção (resultando em superexpressão de proteínas C^^ew-codificadas) intensifica a WUE à luz de elevação contínua das concentrações de CO2 atmosférico. Plantas 15 transgênicas ou manipuladas (por exemplo, safras) da presente invenção fechariam seus estômatos em um grau maior do que plantas do tipo silvestre, desse modo, preservando seu uso de água; a invenção proporciona métodos para superexpressão de proteínas C^^ew-codificadas, por exemplo, através de inserção ou infecção de plantas com ácidos nucleicos que codificam 20 CChSen, por exemplo, como plasmídeos, vírus e semelhantes. Como uma consequência, plantas (por exemplo, safras) da presente invenção terão maior eficiência de uso de água e terão resistência aumentada à estiagem.

A invenção também proporciona composições e métodos para inibição da expressão de genes CChSen, transcrições e proteínas CC^Sen, por 25 exemplo, através de repressão antissenso e/ou RNAi de sensores de CO2 em células-guarda. Safras podem mostrar uma forte resposta ao CO2 atmosférico elevado, de modo que elas fecham seus estômatos de modo relativamente forte, o que tem várias desvantagens para produção e rendimentos agrícolas, por exemplo, uma forte resposta de fechamento estomatal CO2-induzido

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 20/196 limitará a capacidade dessas safras de fixar carbono para crescimento máximo. As plantas transgênicas subexpressando CC^Sen ou plantas subexpressando CChSen da presente invenção se dirigem a esse problema abrindo seus estômatos em um grau maior do que plantas do tipo silvestre, impedindo rendimentos limitados quando água suficiente está disponível.

A invenção também proporciona composições e métodos que se dirigem ao principal problema quando safras não podem suportar temperaturas aumentadas que levam a uma ruptura de metabolismo, fotossíntese e crescimento: CO₂ elevado faz com que o estômato se feche; e 10 isso aumenta a temperatura da folha em virtude de evaporação de água (transpiração) reduzida a partir das folhas. Assim, as composições e métodos da presente invenção, através de inibição da expressão de ácidos nucleicos de CChSen e/ou proteínas CO₂Sen, ajudam as safras que, de outro modo, seriam sensíveis a temperaturas elevadas, a enfrentar as concentrações de CO₂15 atmosférico aumentadas, também reduzindo ou aliviando um aumento acelerado nas temperaturas da folha. A invenção proporciona composições e métodos compreendendo antissenso e RNAi para repressão de sensores de CO₂ em células-guarda. Em um aspecto, um promotor de célula-guarda proporciona um meio para reduzir a temperatura da folha através de 20 intensificação de transpiração nessas safras e também para maximizar os rendimentos da safra.

As composições e métodos da invenção podem ser usados para manipular como as plantas percebem o CO₂, assim, prática da presente invenção pode melhorar nossas previsões dos efeitos de elevação das 25 concentrações de CO₂ atmosférico sobre diferentes espécies de planta. A presente invenção também demonstra um papel vital dos genes CO₂Sen identificados na captação/sinalização de percepção de CO₂. As composições e métodos da invenção podem ser usados para manipular o crescimento de planta, por exemplo, através de manipulação de como o CO₂ é percebido por

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 21/196 uma planta, as composições e métodos da invenção podem ser usados para manipular a resposta ao CO₂ de uma planta, de modo que o carbono e eficiência de uso de água durante crescimento da planta sejam intensificados.

Também proporcionados aqui são kits compreendendo ácidos nucleicos e/ou proteínas da presente invenção e instruções para fabricação e/ou uso dos mesmos e instruções para a prática dos métodos proporcionados aqui.

A invenção proporciona ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes (polinucleotídeo) compreendendo:

(a) uma sequência de ácido (polinucleotídeo) nucleico que codifica SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 ou fragmentos funcionais das mesmas, em que o fragmento funcional tem uma atividade de proteína CO₂Sen (sensor de CO₂), uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(b) uma sequência de ácido (polinucleotídeo) nucleico tendo pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou identidade de sequência completa à SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e/ou SEQ ID NO: 35, sobre uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 ou mais resíduos ou sobre o comprimento total de uma sequência de codificação de proteína (transcrição) ou gene, em que o ácido nucleico codifica:

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 22/196 (i) uma proteína CCfSen (sensor de CO₂) que tem uma atividade de proteína CCfSen (sensor de CO2), (ii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica; ou (iii) um polipeptídeo ou peptídeo capaz de geração de um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo uma sequência SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 9;

(c) um ácido (polinucleotídeo) nucleico que codifica um fragmento funcional da proteína codificada pelo ácido nucleico de (b), em que o fragmento funcional tem uma atividade de proteína CO2Sen (sensor de CO2) ou uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(d) uma sequência de ácido (polinucleotídeo) nucleico tendo pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou identidade de sequência completa à SEQ ID NO: 10 e/ou SEQ ID NO: 11, sobre uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou mais resíduos ou sobre o comprimento total de um promotor tendo atividade específica de célula-guarda ou uma região regulatória de transcrição tendo atividade específica de célula-guarda, em que o ácido nucleico compreende ou consiste de um promotor célula-guarda-específico ou uma região regulatória de transcrição célula-guarda-específica;

(e) o ácido (polinucleotídeo) nucleico de (b) ou (d), em que a identidade de sequência é calculada usando um algoritmo de comparação de sequência consistindo do algoritmo BLAST versão 2.2.2 onde uma configuração de filtragem é ajustada em blastall -p blastp -d nr pataa -F F e todas as outras opções são ajustadas nominalmente;

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 23/196 (f) uma sequência de ácido (polinucleotídeo) nucleico que se hibridiza, sob condições estringentes, a um ácido nucleico compreendendo:

(i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 e/ou SEQ ID NO: 35, em que o ácido nucleico codifica:

(A) uma proteína CO2Sen (sensor de CO₂) que tem uma atividade de proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou (B) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(ii) SEQ ID NO: 10 e/ou SEQ ID NO: 11, em que o ácido nucleico tem uma atividade de promotor célula-guarda-específico ou uma atividade de região regulatória de transcrição célula-guarda-específica;

e as condições estringentes incluem uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65°C durante cerca de 15 minutos;

(g) o ácido nucleico de (f), em que o ácido nucleico tem pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ou mais resíduos de comprimento ou o comprimento total da região de codificação de proteína ou gene ou promotor ou região regulatória de transcrição; ou (h) um ácido (polinucleotídeo) nucleico totalmente (completamente) complementar a qualquer um de (a) a (g).

A invenção proporciona oligonucleotídeos antissenso compreendendo:

(a) uma sequência de ácido nucleico complementar a ou capaz de hibridização, sob condições estringentes, a uma sequência da invenção ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 24/196 uma subsequência da mesma; ou, (b) o oligonucleotídeo antissenso de (a), em que o oligonucleotídeo antissenso tem entre cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80 ou cerca de 60 a 100 bases de comprimento.

A invenção proporciona métodos de inibição ou diminuição da tradução de uma mensagem de codificação de proteína CC^Sen (sensor de CO₂) em uma célula ou uma planta ou parte de planta compreendendo administração, à célula ou uma planta ou parte de planta ou expressão, na célula ou uma planta ou parte de planta, de um oligonucleotídeo antissenso compreendendo (a) um ácido nucleico da invenção; ou, (b) uma sequência de ácido nucleico complementar a ou capaz de hibridização, sob condições estringentes, a uma sequência de ácido nucleico da invenção.

A invenção proporciona moléculas de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) compreendendo:

(a) uma subsequência de uma sequência de ácido nucleico da invenção;

(b) a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de (a), em que o RNA inibitório de filamento duplo é um siRNA ou uma molécula de siRNA ou (c) a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de (a) ou (b) tendo um comprimento de cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplos de comprimento.

A invenção proporciona métodos de inibição ou diminuição da expressão de proteína CC^Sen (sensor de CO2) e/ou mensagem de CChSen em uma célula ou uma planta ou parte de planta compreendendo administração, à célula ou uma planta ou parte de planta ou expressão, na célula ou uma planta ou parte de planta: (a) a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de acordo com a reivindicação 4; ou, (b) um RNA filamento duplo

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 25/196 inibitório (iRNA), em que o RNA compreende uma subsequência de uma sequência de ácido nucleico da invenção em que, em um aspecto, o RNAi é um siRNA ou uma molécula de miRNA.

A invenção proporciona um cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial compreendendo:

(a) um ácido nucleico (sequência) da invenção;

(b) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de (a), em que o ácido nucleico da invenção compreende ou consiste de uma sequência de codificação de proteína CC^Sen (sensor de CO2) e a sequência de codificação de proteína é operavelmente ligada a um promotor ou uma região regulatória de transcrição;

(c) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de (b), em que o promotor é um promotor célula-guarda-específico ou uma região regulatória de transcrição célula-guarda-específica;

(d) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de (c), em que o ácido nucleico da invenção compreende ou consiste de um promotor célula-guarda-específico ou uma região regulatória de transcrição célula-guarda-específica e o promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação de proteína;

(e) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de (d), em que a sequência de codificação de proteína codifica um polipeptídeo tendo atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(f) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de (b), em que o promotor ou uma região regulatória de transcrição compreende um promotor constitutivo ou uma região regulatória de transcrição, um promotor tecido-específico ou uma

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 26/196 região regulatória de transcrição, um promotor induzível ou uma região regulatória de transcrição, um promotor de silenciamento, um promotor de captação de CO2;

(g) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de qualquer um de (a) a (f), em que o vírus recombinante é um vírus de planta ou o vetor é um vetor de planta; ou (h) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial de qualquer um de (a) a (g), em que o promotor compreende a sequência de promotor ou uma região regulatória de transcrição de SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou subsequências funcionais (regulatórias de transcrição) das mesmas.

A invenção proporciona uma célula transduzida ou transformada compreendendo:

(a) o cassete de expressão, plasmídeo, vírus recombinante, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial da invenção ou um ácido nucleico (sequência) da invenção;

(b) a célula transduzida ou transformada de (a), em que a célula é uma célula bacteriana, uma célula de mamífero, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta;

(c) a célula transduzida ou transformada de (a), em que a célula é uma célula-guarda de planta.

A invenção proporciona uma planta, célula de planta, órgão de planta, folha de planta, fruto de planta ou semente compreendendo:

(b) a planta, célula de planta, órgão de planta, folha de planta, fruto de planta ou semente de (a), em que a planta é ou a célula de planta, órgão de planta, folha de planta, fruto de planta ou semente é derivada de: (i)

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 27/196 uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea; (ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), Unho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.

A invenção proporciona uma planta, célula de planta, parte de planta, folha de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente transgênica compreendendo:

(a) um ácido nucleico heterólogo, em que o ácido nucleico heterólogo compreende um ácido nucleico (sequência) da invenção ou o cassete de expressão, plasmídeo, vírus, vetor, cosmídeo ou cromossoma artificial da invenção, (b) a planta, célula de planta, parte de planta, folha de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente transgênica de (a), em que a célula de planta é uma célula-guarda de planta; ou (c) a planta, célula de planta, parte de planta, folha de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente transgênica de (a), em que a planta é ou a célula de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente é

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 28/196 derivada de: (i) uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea; (ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), Unho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.

A invenção proporciona polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes compreendendo:

(a) uma sequência de aminoácido compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9 ou fragmentos funcionais das mesmas, em que o fragmento funcional tem uma atividade de proteína CO2Sen (sensor de CO₂) ou uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(b) uma sequência de aminoácido tendo pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou identidade de sequência completa (aminoácido) à SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 9, sobre uma

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 29/196 região de pelo menos cerca de 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300,

350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos ou sobre o comprimento total do polipeptídeo, em que o polipeptídeo tem uma atividade de proteína CC^Sen (sensor de CO₂) ou uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou o polipeptídeo é capaz de geração de um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo tendo uma sequência SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 e/ou SEQ ID NO: 9;

(c) um fragmento funcional do polipeptídeo de (b), em que o fragmento funcional tem uma atividade de proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(d) o polipeptídeo de (b), em que a identidade de sequência é calculada usando um algoritmo de comparação de sequência consistindo do algoritmo BLAST versão 2.2.2 onde uma configuração de filtragem é ajustada para blastall -p blastp -d nr pataa -F F e todas as outras opções são ajustadas nominalmente;

(e) o polipeptídeo de qualquer um de (a) to (d) tendo pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa e retendo sua atividade de proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica;

(f) o polipeptídeo de (e), em que a pelo menos uma substituição de aminoácido conservativa compreende substituição de um aminoácido por outro aminoácido de características semelhantes; ou uma substituição conservativa compreende: substituição de um aminoácido alifático por outro aminoácido alifático; substituição de uma serina por uma treonina ou vice versa; substituição de um resíduo ácido por outro resíduo ácido; substituição de um resíduo trazendo um grupo amida por outro resíduo

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 30/196 trazendo um grupo amida; troca de um resíduo básico por outro resíduo básico; ou substituição de um resíduo aromático por outro resíduo aromático;

(g) o polipeptídeo de qualquer um de (a) a (f), ainda compreendendo uma sequência de aminoácido heteróloga.

(a) um polipeptídeo heterólogo ou sintético compreendendo o polipeptídeo da invenção;

(b) a planta, célula de planta, parte de planta, folha de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente transgênica de (a), em que a célula de planta é uma célula-guarda de planta; ou (c) a planta, célula de planta, parte de planta, folha de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente transgênica de (a), em que a planta é ou a célula de planta, órgão de planta, fruto de planta ou semente é isolada e/ou derivada de: (i) uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea;

(ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), Unho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus,

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 31/196

Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella,

Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.

A invenção proporciona um preparado de proteína compreendendo o polipeptídeo da invenção, em que o preparado de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.

A invenção proporciona uma proteína imobilizada ou um polinucleotídeo imobilizado, em que a proteína compreendo polipeptídeo da invenção e o polinucleotídeo compreendo ácido nucléico da invenção em que, em um aspecto, a proteína ou polinucleotídeo é imobilizado sobre uma lasca de madeira, um papel, uma célula, a metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula grafítica, um glóbulo, um gel, uma lâmina, um arranjo ou um tubo capilar.

A invenção proporciona um anticorpo isolado, sintético ou recombinante que se liga especificamente ao polipeptídeo da invenção em que, em um aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou policlonal ou é um anticorpo com uma única cadeia.

A invenção proporciona um hibridoma compreendendo um anticorpo da invenção.

A invenção proporciona um arranjo compreendendo proteína imobilizada ou um polinucleotídeo imobilizado da invenção; ou o anticorpo da invenção; ou uma combinação dos mesmos.

A invenção proporciona um método de produção de um polipeptídeo recombinante compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de um ácido nucléico operavelmente ligado a um promotor, em que o ácido nucléico compreende uma sequência de ácido nucléico da invenção; e (b) expressão do ácido nucléico da etapa (a) sob condições que permitem expressão do polipeptídeo, desse modo, produzindo um polipeptídeo recombinante e, em um aspecto, o método ainda compreende transformação de uma célula hospedeira com o ácido nucléico da etapa (a), seguido por

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 32/196 expressão do ácido nucleico da etapa (a), desse modo, produzindo um polipeptídeo recombinante em uma célula transformada.

A invenção proporciona um método para catalisar enzimaticamente a conversão de dióxido de carbono em bicarbonato e prótons compreendendo contato do polipeptídeo da invenção ou um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico da invenção com dióxido de carbono sob condições que permitem a catálise enzimática da conversão de dióxido de carbono em bicarbonato e prótons.

A invenção proporciona métodos para regulação negativa ou diminuição de troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célulaguarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo:

(A) (a) fornecimento de:

(i) ácido nucleico expressando proteína CCfSen (sensor de CO2) e/ou um gene CChSen ou transcrição (mensagem);

(ii) o ácido nucleico ou gene CChSen de (i), em que o ácido nucleico expressando proteína ou o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou o ácido nucleico expressando proteína ou proteína CChSen compreende uma sequência de aminoácido da invenção;

(iii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (CA) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de CA;

(iv) um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de CA, em que o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 33/196 e/ou SEQ ID NO: 35;

(v) um ácido nucleico antissenso ou um ácido nucleico inibitório da expressão de um ácido nucleico que codifica polipeptídeo de PEPC; e/ou (vi) o método de (v), em que o ácido nucleico antissenso ou inibitório objetiva um ácido nucleico que codifica polipeptídeo de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) compreendendo SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e/ou SEQ ID NO: 15; e (b) (i) expressão de ou superexpressão do ácido nucleico ou gene de (a) ou um ácido nucleico de CO2Sen (sensor de CO2) que expressa proteína e/ou um gene CChSen ou transcrição (mensagem) e/ou uma anidrase carbônica ou uma anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que expressa anidrase carbônica na célula-guarda ou (ii) expressão do ácido nucleico antissenso ou ácido nucleico inibitório da expressão de um ácido nucleico que codifica polipeptídeo de PEPC na célula-guarda ou (iii) contato da célulaguarda com o polipeptídeo tendo atividade de anidrase carbônica, desse modo, regulando positivamente ou aumentando a troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célula-guarda;

(B) o método de (A), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção;

(C) o método de (A) ou (B), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO2 sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2 ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que o ácido nucleico antissenso ou ácido nucleico inibitório da expressão de um ácido

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 34/196 nucleico que codifica polipeptídeo de PEPC compreende miRNA ou siRNA ou um oligonucleotídeo antissenso.

A invenção proporciona métodos para regulação positiva ou aumento da troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célulaguarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo:

(A) (a) fornecimento de:

(i) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão de um gene CChSen ou transcrição (mensagem), em que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou uma sequência que codifica a proteína CChSen da invenção;

(ii) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório a um ácido nucleico que codifica uma anidrase carbônica de planta (CA) ou uma anidrase β-carbônica de planta;

(iii) um ácido nucleico expressando proteína de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem); e/ou (iv) um polipeptídeo de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC); e (b) (i) expressão do ácido nucleico antissenso ou inibitório na célula-guarda ou (ii) expressão de ácido nucleico expressando proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) na célula-guarda ou (iii) contato da célula-guarda com o polipeptídeo tendo atividade de PEPC, desse modo, regulando positivamente ou aumentando a troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célula-guarda;

(Β) o método de (A), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção;

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 35/196 (C) o método de (A) ou (B), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO₂ sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO₂ ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO₂ ou ppm reduzido de CO₂; ou (D) o método de (A), (B) ou (C), em que o ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão do gene CChSen ou transcrição (mensagem) ou antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão da anidrase carbônica (CA) ou anidrase β-carbônica, compreende o oligonucleotídeo antissenso de acordo com a reivindicação 2 ou a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de acordo com a reivindicação 4 ou um mi RNA ou um siRNA.

A invenção proporciona métodos para regulação da troca de água em uma célula de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo:

(A) superexpressão ou subexpressão, na planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta, de:

(i) uma proteína CO₂Sen (CO₂ sensor) e/ou um gene CChSen ou transcrição (mensagem), em que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou a proteína CO₂Sen compreende uma sequência de aminoácido da invenção; ou (ii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (CA) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de anidrase carbônica; ou (iii) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de PEPC; ou (iv) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco ou um ácido

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 36/196 nucleico que codifica um polipeptídeo de Rubisco, desse modo, regulando a troca de água (regulação negativa ou diminuição da troca de água através de superexpressão da proteína CChSen ou CA ou regulação positiva ou aumento da troca de água através de subexpressão da proteína CChSen ou CA) na planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta;

(B) o método de (A), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção; ou (C) o método de (A) ou (B), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO2 sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2 ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que a superexpressão ou expressão aumentada ou subexpressão ou inibição é em uma célula-guarda de planta; ou (E) o método de qualquer um de (A) a (D), em que superexpressão da proteína CChSen (sensor de CO2) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) diminui a troca de água e subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína CChSen (sensor de CO2) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) aumenta a troca de água; ou (F) o método de qualquer um de (A) a (D), em que subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) diminui a troca de água ou superexpressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 37/196 transcrição (mensagem) aumenta a troca de água.

A invenção proporciona métodos para regulação de captação de água ou perda de água em uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo superexpressão ou subexpressão, na planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta, de:

(A) (i) uma proteína CChSen (sensor de CO2) e/ou um gene CChSen ou transcrição (mensagem), em que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou a proteína CChSen compreende uma sequência de aminoácido da invenção; ou (ii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (CA) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo; ou (iii) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de PEPC; ou (iv) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de Rubisco, desse modo, regulando a captação de água ou perda de água (regulação negativa da captação de água ou causando conservação de água, através de superexpressão da proteína CChSen ou CA ou regulação positiva de troca de água ou aumento da perda de água através de subexpressão da proteína CChSen ou CA) na planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta;

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 38/196 (C) o método de (A) ou (B), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO₂ sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO₂ ou ppm reduzido de CO₂ ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO₂ ou ppm reduzido de CO₂; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que a superexpressão ou expressão aumentada é em uma célula-guarda de planta; ou (E) o método de qualquer um de (A) a (D), em que superexpressão da proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) diminui a perda de água e subexpressão ou inibição de expressão da proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) aumenta a perda de água; ou (F) o método de qualquer um de (A) a (D), em que subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) diminui a perda de água ou superexpressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) aumenta a perda de água.

A invenção proporciona métodos para produzir uma planta com eficiência de uso de água (WUE) intensificada ou resistente à estiagem compreendendo:

(A) superexpressão ou aumento da expressão de:

(i) uma proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) e/ou um gene CChSen ou transcrição (mensagem), em que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou a proteína CO₂Sen compreende uma sequência de aminoácido da invenção; ou (ii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (CA) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo; ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 39/196 (iii) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de PEPC; ou (iv) um polipeptídeo tendo uma atividade de carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de Rubisco, desse modo, produzindo uma planta com eficiência de uso de água (WUE) intensificada ou resistente à estiagem;

(Β) o método de (A), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção; ou (C) o método de (A) ou (B), em que a superexpressão ou expressão aumentada é em uma célula-guarda de planta; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que superexpressão de uma proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) intensifica a eficiência de uso de água (WUE) ou intensifica a resistência à estiagem e subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína CO₂Sen (sensor de CO₂) ou anidrase carbônica e/ou um gene CChSen ou de anidrase carbônica ou transcrição (mensagem) aumenta a perda de água ou diminui a WUE; ou (E) o método de qualquer um de (A) a (C), em que subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) intensifica a eficiência de uso de água (WUE) ou intensifica a resistência à estiagem ou superexpressão de uma proteína de PEPC e/ou um gene de PEPC ou transcrição (mensagem) aumenta a perda de água ou diminui a WUE.

A invenção proporciona uma planta, parte de planta, órgão de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 40/196 planta, folha ou semente: (a) feita através de um processo compreendendo o método da invenção; ou (b) feita através de um processo compreendendo o método da invenção ou modificada através do método da invenção, em que a planta é isolada e/ou derivada de: (i) uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea; (ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), linho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.

A invenção proporciona métodos para produção de uma planta resistente ao calor compreendendo subexpressão de uma proteína CChSen e/ou um gene CÜ2Sen ou transcrição (mensagem) ou uma anidrase carbônica (CA), em uma célula ou células de uma planta, o método compreendendo:

(A) (a) fornecimento de:

(i) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão de um gene CÜ2Sen ou transcrição (mensagem), em que o gene CÜ2Sen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou uma sequência que codifica uma proteína CChSen da invenção;

(ii) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo,

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 41/196 inibitório to um ácido nucleico que codifica uma anidrase carbônica de planta (CA) ou uma anidrase β-carbônica de planta; e/ou (iii) um ácido nucleico que codifica uma carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) e (b) expressão do ácido nucleico antissenso ou inibitório de CChSen ou CA na célula-guarda e/ou expressão do ácido nucleico que codifica PEPC, desse modo, produzindo uma planta resistente ao calor através de regulação positiva ou aumento da troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água na célula ou células de planta;

(Β) o método de (A), em que a célula é uma célula-guarda de planta;

(C) o método de (A) ou (B), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção;

(D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO2 sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2 ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO2 ambiente, ppm elevado de CO2 ou ppm reduzido de CO2; ou (E) o método de qualquer um de (A) a (D), em que o ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão do gene CChSen ou transcrição (mensagem) ou antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão da anidrase carbônica (CA) ou anidrase β-carbônica, compreende o oligonucleotídeo antissenso de acordo com a reivindicação 2 ou a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de acordo com a reivindicação 4 ou um miRNA ou um siRNA.

A invenção proporciona uma planta, parte de planta, órgão de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 42/196 planta, folha ou semente: (a) feita através de um processo compreendendo o método da invenção; ou (b) feita através de um processo compreendendo o método da invenção ou modificada através do método da invenção, em que a planta é isolada e/ou derivada de: (i) uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea; (ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), linho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.

A invenção proporciona métodos para abertura de um poro estomatal em uma planta, parte de planta, um órgão de planta, uma folha de planta ou uma célula de planta, compreendendo subexpressão ou inibição de expressão de uma proteína CC^Sen e/ou um gene CÜ2Sen ou transcrição (mensagem) ou anidrase carbônica (CA) em uma célula ou células da planta, parte de planta, órgão de planta, folha de planta ou célula de planta, o método compreendendo:

(A) (a) fornecimento de:

(i) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão de um gene CÜ2Sen ou transcrição (mensagem), em

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 43/196 que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou uma sequência que codifica uma proteína CCfSen da invenção;

(ii) um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório a um ácido nucleico que codifica uma anidrase carbônica de planta (CA) ou uma anidrase β-carbônica de planta; e/ou (iii) um ácido nucleico que codifica uma carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC); e (b) expressão do ácido nucleico antissenso ou inibitório de CCfSen e/ou CA na célula ou células da planta, parte de planta, órgão de planta, folha de planta ou célula de planta ou expressão do ácido nucleico que codifica PEPC na planta, parte de planta, órgão de planta, folha de planta ou célula de planta, desse modo, causando subexpressão e/ou inibição de expressão da proteína CCfSen e/ou do gene CChSen ou transcrição (mensagem) e/ou da anidrase carbônica (CA) e/ou expressão da PEPC e fazendo com que o poro estomatal se abra;

(B) o método de (A), em que a célula é uma célula-guarda de planta;

(D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que a planta é caracterizada por troca controlada de CO₂ sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO₂ ou ppm reduzido de CO₂ ou a planta é caracterizada por troca controlada de água sob 365 ppm de CO₂ ambiente, ppm elevado de CO₂ou ppm reduzido de CO₂; ou (E) o método de qualquer um de (A) a (D), em que o ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão do gene

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 44/196

CChSen ou transcrição (mensagem) ou antissenso a ou, de outro modo, inibitório da expressão da anidrase carbônica (CA) ou anidrase β-carbônica, compreende o oligonucleotídeo antissenso de acordo com a reivindicação 2 ou a molécula de RNA inibitório de filamento duplo (RNAi) de acordo com a reivindicação 4 ou um miRNA ou um siRNA.

A invenção proporciona métodos para fechamento de um poro estomatal sobre uma célula-guarda na epiderme de uma planta, uma folha de planta, órgão de planta ou uma célula de planta, compreendendo superexpressão da proteína CChSen e/ou um gene CChSen ou transcrição 10 (mensagem) em uma célula ou células da planta, compreendendo:

(A) (a) superexpressão ou aumento da expressão de:

(i) uma proteína CChSen (sensor de CCh) e/ou um gene

CChSen ou transcrição (mensagem), em que o gene CChSen ou transcrição (mensagem) compreende uma sequência da invenção e/ou a proteína CChSen 15 compreende uma sequência de aminoácido da invenção; ou (ii) um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (CA) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, desse modo, causando superexpressão e/ou aumento da 20 expressão da proteína CChSen e/ou do gene CChSen ou transcrição (mensagem) e/ou da anidrase carbônica (CA) e fazendo com que o poro estomatal se feche; ou (b) inibição ou diminuição de expressão de um gene de carboxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) (ou carboxilase de PEP ou PEPC) ou 25 mensagem (transcrição);

(B) o método de (A), em que a célula é uma célula-guarda de planta; ou (C) o método de (A) ou (B), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 45/196 com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção.

A invenção proporciona métodos para intensificação ou otimização de acúmulo de biomassa em uma planta, uma folha de planta, um 5 órgão de planta, uma parte de planta, uma célula de planta ou semente por meio de equilíbrio da perda de água através do estômato com a captação líquida de CO2 para fotossíntese e, consequentemente, intensificação ou otimização de acúmulo de biomassa na planta, folha de planta, parte de planta, órgão de planta, célula de planta ou semente, compreendendo abertura 10 ou fechamento de poros estomatais usando uma composição e/ou método da invenção.

A invenção proporciona métodos para redução de temperatura da folha e intensificação de transpiração em uma planta, uma folha de planta ou uma célula de planta, compreendendo abertura de um poro estomatal uma 15 célula ou células da planta usando uma composição e/ou método da invenção.

Em modalidades alternativas de qualquer um dos métodos da invenção, a planta ou célula de planta é isolada e/ou derivada de: (i) uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea; (ii) trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, milho verde (milho), tabaco, um legume, um tremoço, batata, 20 beterraba sacarínica, ervilha, feijão, semente de soja (soja), uma planta crucífera, uma couve-flor, colza (ou nabo ou canola), cana (cana-de-açúcar), Unho, algodão, palma, beterraba sacarínica, amendoim, uma árvore, um álamo, um tremoço, uma árvore de algodão de seda, salgueiro do deserto, arbusto creosoto, chenopodioideae, balsa, rami, kenaf, cânhamo, vinagreira, 25 juta ou sisal abacá; ou, (c) uma espécie dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana,

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Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus,

Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio,

Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis,

Vigna ou Zea.

A invenção proporciona ativadores transcricionais, por exemplo, que atuam como promotores ou intensificadores, para a regulação de expressão de um ácido nucleico em uma célula de planta, em que o ativador transcricional (por exemplo, promotor) compreende uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou subsequências funcionais (regulatórias de transcrição) das mesmas, em que, em um aspecto, o ativador transcricional (por exemplo, promotor) superregula a transcrição e, em um aspecto, o ativador transcricional (por exemplo, promotor) superregula a transcrição em uma célula-guarda de planta de maneira específica e, em um aspecto, a célulaguarda é uma célula-guarda de folha ou uma célula-guarda de caule.

A invenção proporciona métodos para diminuição de eficiência de oxigenação e aumento da fixação de carbono em uma célulaguarda na epiderme de uma planta, uma folha de planta, órgão de planta ou uma célula de planta compreendendo inibição ou diminuição de uma atividade da enzima carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco e/ou um gene de Rubisco ou transcrição (mensagem) em uma célula ou células da planta, compreendendo:

(A) (a) fornecimento de um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório de um ácido nucleico que codifica Rubisco de planta; e (b) inibição ou diminuição de expressão de um gene de Rubisco ou mensagem (transcrição) em uma célula-guarda de planta;

(Β) o método de (A), em que a célula é uma célula-guarda de planta;

(C) o método de (A) ou (B), em que a planta é uma planta

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 47/196 transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que o ácido nucleico que codifica Rubisco é um gene de Rubisco ou mensagem (transcrição) ou um ácido nucleico que codifica Rubisco compreendendo todas ou uma subsequência de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.

A invenção proporciona métodos para aumento da eficiência de oxigenação e diminuição de fixação de carbono em uma célula-guarda na epiderme de uma planta, uma folha de planta, órgão de planta ou uma célula de planta compreendendo aumento de expressão de uma atividade de enzima carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco e/ou um gene de Rubisco ou transcrição (mensagem) em uma célula ou células da planta, compreendendo:

(A) (a) fornecimento de um ácido nucleico que codifica Rubisco de planta; e (b) expressão do ácido nucleico que codifica Rubisco na célula-guarda;

(B) o método de (A), em que a célula é uma célula-guarda de planta;

(C) o método de (A) ou (B), em que a planta é uma planta transgênica da invenção ou uma planta transduzida, transformada ou infectada com o cassete de expressão, plasmídeo, vírus ou vetor da invenção ou a célula de planta é a célula transduzida da invenção; ou (D) o método de qualquer um de (A) a (C), em que o ácido nucleico que codifica Rubisco é um gene de Rubisco ou mensagem (transcrição) ou um ácido nucleico que codifica Rubisco compreendendo todas ou uma subsequência de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 48/196 ou SEQ ID NO: 19.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são apresentados nos desenhos em anexo e na descrição abaixo. Outras características, objetivos e vantagens da invenção se tomarão evidentes a partir da descrição e desenhos e das reivindicações.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, sequências do GenBank e depósitos na ATCC mencionados aqui são aqui expressamente incorporados por referência para todas as finalidades.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo Escritório quando de solicitação e pagamento das taxas necessárias.

A Figura 1 ilustra graficamente dados mostrando a condutância estomatal em Arabidopsis thaliana do tipo silvestre e o mutante duplo sensor de CO₂ da presente invenção; conforme descrito em detalhes no Exemplo 1, abaixo.

A Figura 2 ilustra fotografias mostrando vários níveis de expressão fotografias mostrando vários níveis de expressão em diferentes estágios de desenvolvimento de célula-guarda (GC): Figura 2A: vários níveis de expressão em diferentes estágios de desenvolvimento de células-guarda; Figura 2B: Expressão de 27-GUS em folha jovem e caules de folha; Figura 2C: Expressão de 27-GUS em nível superior de hipocótilo; Figura 2D: Expressão de 27-GUS em caule e borda de folha; Figura 2E e Figura 2F: Quatro lábios em tipo silvestre (wt); conforme descrito em detalhes no Exemplo 1, abaixo.

As Figuras 3A-H são fotografias mostrando expressão de 27YC3.6 (SEQ ID NO: 10) em GC sobre o caule de folhas adjacentes, mas não na folha muito jovem (sublinhado) (A & A’). 27-YC3.6 é expresso

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 49/196 principalmente em GC madura, muito fracamente em GC muito fracas ou imaturas (seta branca em B & B’). 27-YC3.60 (SEQ ID NO: 11) é também expresso em GCs sobre hipocótilo (C & C’). 27-YC3.6 (SEQ ID NO: 10) é também expressa em GCs sobre sépalas (D & D’); conforme descrito em detalhes no Exemplo 1, abaixo.

A Figura 4A ilustra graficamente dados mostrando que no mutante duplo SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 7, as plantas perdem a capacidade de expressar esses dois genes, resultando em uma forte deficiência de fechamento estomatal induzido por CO2 quando comparado com as plantas do tipo silvestre (wt); a Figura 4B ilustra graficamente estudos mostrando a complementação do mutante duplo SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 7 com o fenótipo CO2 através de expressão transgênica do cDNA de CORP1 (SEQ ID NO: 7); a Figura 4a e Figura 4b ilustram (a) as condutâncias estomatais relativas do mutante duplo (corpl corp2), WT (tipo silvestre) e (b) um linhagem transgênica complementada (CORP1/ corpl corp2) expressando CORP1 em resposta a alterações nas concentrações de CO2 (eixo X: ppm de [CO2]); a Figura 4C ilustra graficamente dados mostrando que plantas mutante duplo corpl/corp2 não mostram ruptura de outras vias de sinalização importantes em células-guarda, incluindo fechamento estomatal induzido pelo hormônio estiagem-induzido, ácido abscísico (ABA), a Figura 4(c) ilustra graficamente dados demonstrando a resposta intacta de plantas mutante duplo SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1 ou corpl/corp2 e tipo silvestre ao ácido abscísico (ABA); conforme descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo.

A Figura 5A e Figura 5B ilustram graficamente dados mostrando que CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) podem complementar mutantes duplos calca4 (mutantes são designados por uma letra minúscula em itálico) em graus variados; conforme descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo.

As Figuras 6 e 7: a Figura 6 ilustra dados mostrando a

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 50/196 condutância estomatal relativa, a qual reflete a troca de gás e eficiência de uso de água (WUE), das plantas de complementação CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1); esses resultados são resumidos e graficamente ilustrados na

Figura 7; conforme descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo.

A Figura 8 ilustra fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em plantas de complementação, em particular, em folhas e em célulasguarda e em células de mesófilo, conforme indicado nas Figuras; conforme descrito em detalhes no Exemplo 2, abaixo.

As Figuras 9A e 9B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)). As Figuras 9C, 9D e 9E ilustram dados de um sensor de CO₂mostrando regulação deficiente de troca de gás pelo CO₂; nota: Condição de luz = luz vermelha (50 pmoles-m ^s¹), luz azul (6 pmoles-m ²-s '); conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

A Figura 10A ilustra graficamente um resumo de dados mostrando a resposta intacta ao ácido abscísico no mutante duplo calca4 (CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)). A Figura 10B ilustra graficamente um resumo de dados mostrando que um inibidor de CAI (SEQ ID NO: 7) e/ou CA4 (SEQ ID NO: 1) imita a insensibilidade ao CO₂ em plantas do tipo silvestre (WT); conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

As Figuras 11A e 11B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ

ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID

NO: 1)) e a Figura 11C ilustra graficamente dados mostrando que o DNA genômico de genes CAI (SEQ ID NO: 7) ou CA4 (SEQ ID NO: 1) pode complementar a resposta ao CO₂; condição de luz: luz vermelha (50

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 51/196 pmoles-m ²-s '), luz azul (6 pmoles-m ²-s '); conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

As Figuras 12A, 12B e 12C ilustram, graficamente e por meio de fotografias, um resumo de dados mostrando que a fotossíntese não é prejudicada no mutante duplo knockout sensor de CO2: luz durante período pré-adaptação, antes de medições de fluorescência PS: 50 μιηο^/ιη²^: 88% luz vermelha, 12% luz azul; 2000 μιηο^/ιη²^: 90% luz vermelha, 10% luz azul. A Figura 12D ilustra a taxa de assimilação de CO2 no escuro e em luz vermelha (onde a luz vermelha: 300 pmoles-m^s¹); conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

As Figuras 13A, 13B, 13C e 13D ilustram, graficamente e por meio de fotografias, que folhas alvejadas com fotossíntese prejudicada mostram regulação intacta de troca de gás por CO2; conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

As Figuras 14A e 14B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)); e as Figuras 14C e 14D ilustram, graficamente e por meio de fotografias, que plantas de superexpressando sensores de CO2, onde CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) são operavelmente ligadas a promotores células-guarda objetivados da presente invenção, mostram eficiência de uso de água (WUE) intensificada; na Figura 14D, os dados não mostram efeito observado sobre o momento de floração; conforme descrito em detalhes no Exemplo 2 e Exemplo 4, abaixo.

A Figura 15 resume graficamente dados mostrando perfis transcricionais de genes expressos em células-guarda e células de mesófilo, conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 16 é a sequência de ácido nucleico de GC1 (SEQ ID NO: 10); conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

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As Figuras 17A a L ilustram fotomicrografias de análise de expressão do gene GC1 (Atlg22690) em resposta a diferentes tratamentos: a Figura 17A ilustra uma fotografia mostrando que o promotor GC1 media forte expressão de repórter em células-guarda de mudas de Arabidopsis do tipo silvestre, a fotografia mostrando uma muda transgênica pGCl::GUS de duas semanas de idade; a Figura 17B ilustra que pGCl::GUS conferiu forte expressão de GUS em células-guarda de folhas e também em células-guarda de petíolos e hipocótilos, conforme ilustrado nas Figuras 17C, D, E; célulasguarda mais jovens ou imaturas não mostraram ou mostraram expressão muito menor de GFP, conforme ilustrado na Figura 17F, G; e células-guarda em sépalas e hipocótilos também mostraram expressão de GFP, conforme ilustrado nas Figuras 17H, I, J, K; e coloração de GUS mostrou expressão de gene repórter em estômatos agrupados, conforme ilustrado na Figura 17L; expressão de GFP foi observada em estômatos agrupados em plantas tmm transformadas compGCl::YC3.60, conforme ilustrado na Figura 17M; e forte expressão de GFP em células-guarda foi observada em folhas de tabaco, conforme ilustrado na Figura 17N, conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 18A ilustra fotografias que são representativas de plantas TI de diferentes linhagens transgênicas promotor:.GUS: t a Figura 18B ilustra graficamente a deleção serial (estrutural ou de sequência) do promotor pGCl para definir regiões para expressão em célula-guarda, conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 19 ilustra transientes de cálcio intracelular impostos em células-guarda expressando pGCl::YC3.60 e transitórios de cálcio espontâneos ocorrem em células-guarda de plantas transgênicapGCl::YC3.60 intactas: a Figura 19A ilustra a imagem por fluorescência de epiderme de folha de plantas transgênicas pGCl ::YC3.60: a Figura 19B ilustra dados mostrando que as 6 células-guarda no painel A produziram todas transientes

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 53/196 de cálcio intracelular em resposta a oscilações de cálcio impostas; a Figura 19C ilustra uma imagem radiométrica pseudo-colorida da folha de plantas Col intactas transformadas com pGCl::YC3.60\ a Figura 19D ilustra o curso de tempo das proporções de emissão de duas células-guarda marcadas por uma seta em C, mostrando que transientes de cálcio espontâneos ocorrem em plantas Arabidopsis intactas, conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 20 ilustra micrografias da redução causada por pGCl(Dl)::anti-GFP de expressão de GFP em células-guarda de plantas 35S::GFP: A Figura 20A ilustra a epiderme de folha de uma planta transgênica 35S::GFP (campo brilhante com filtro de GFP); a Figura 20B ilustra a formação de imagem fluorescente da mesma folha de epiderme de folha mostrada na 20A; a Figura 20C ilustra a epiderme da folha de uma planta transgênica TI expressando pGCl(Dl)::anti-GFP na base 5S::GFP-, a Figura 20D ilustra a formação de imagem por fluorescência da mesma epiderme de folha mostrada em 20C, conforme escrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 21A, Figura 21B, Figura 21C e Figura 21D ilustram que superexpressão célula-guarda objetivada de sensores de CO2 em plantas mostra respostas intensificadas ao CO2 na regulação da troca de gás, conforme descrito em detalhes no Exemplo 3, abaixo.

A Figura 22 ilustra uma árvore filogenética de anidrases carbônicas de Arabidopsis, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

A Figura 23 ilustra graficamente dados mostrando que plantas mutantes para anidrase carbônica mostraram respostas estomatais robustas à luz azul e transição de claro-escuro, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

A Figura 24A ilustra dados mostrando que os mutantes duplos

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 54/196 ca4ca6 exibem respostas intactas ao CO₂, enquanto que calca4 e calca4ca6 mostram a mesma deficiência de percepção de CO₂; Figura 24B, Figura 24C,

Figura 24D e Figura 24E ilustram graficamente a condutância estomatal, em moles de água m'² seg¹, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

A Figura 25 ilustra dados demonstrando que várias linhagens transgênicas independentes de calca4 transformadas com uma cópia do tipo silvestre de CAI ou CA4 exibem recuperação de respostas induzidas por alteração em [CO₂J: duas linhagens adicionais complementadas com CAI, CA1#2 (Figura 25A) e CA1#3 (Figura 25B) ou CA4, CA4#2 (Figura 25C) e CA4#3 (Figura 25D) mostram aumento e diminuição normais de condutância estomatal em resposta a alterações de [CO₂], conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

A Figura 26 ilustra fotografias fluorescentes (formação de imagem confocal) de células com diferentes padrões de localização de CA1YFP e CA4-YFP em protoplastas de tabaco: plasmídeos que codificam YFP, FLS2-YFP, CAI-YFP e CA4-YFP foram transitoriamente expressos em protoplastas de tabaco; filtros são indicados na parte superior da figura, enquanto que as fusões são indicadas à esquerda na figura; as fotografias à direita na Figura 26 mostram uma sobreposição de imagens de YFP e clorofila, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

As Figuras 27A a G e Figura 14C ilustram graficamente dados graficamente dados mostrando que expressão célula-guarda preferencial acionada de cDNAs de CAI ou CA4 restaura a percepção de CO₂ em plantas superexpressando calca4 e CA e exibem eficiência de uso de água aprimorada; A Figura 27A e Figura 27B ilustram graficamente uma análise por RT-PCR de expressão de CAI e CA4 em protoplastas de células-guarda e células de mesófilo de plantas complementadas com CAI ou CA4 acionados por um promotor célula-guarda objetivado da presente invenção; a Figura 27C e Figura 27D ilustram graficamente a alteração de condutância estomatal

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 55/196 induzida por CO₂ de linhagens célula-guarda objetivadas, mutante duplo calca4 e plantas do tipo silvestre (WT) em resposta aos desvios de [CO₂] indicados: expressão de CAI ou CA4 em células-guarda é suficiente para a restauração da resposta ao CO₂; a Figura 27E ilustra graficamente a 5 condutância estomatal de folhas de calca4, tipo silvestre, htl-2 e mutante triplo calca4htl-2 em resposta às alterações de [CO₂] indicadas; a Figura 27F e Figura 27G ilustram graficamente a condutância estomatal de linhagens superexpressando CA e plantas do tipo silvestre (WT) em resposta às alterações de [CO₂] indicadas, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, 10 abaixo.

As Figuras 28A a F ilustram graficamente que a complementação célula-guarda específica de CAI ou CA4 restaura as respostas estomatais ao CO₂ em calca4: dados de resposta ao CO₂ de uma linhagem adicional complementada com expressão de CAI ou CA4 célula15 guarda objetivada, conforme graficamente ilustrado na Figura 28A e Figura 28B e resposta de condutância estomatal relativa ao CO₂ de 4 linhagens complementadas independentes célula-guarda objetivadas analisadas; duas na Figura 27C e Figura 27D; duas na Figura 28A e Figura 28B; as Figuras 28C a F ilustram graficamente que os valores de condutância estomatal relativa 20 foram normalizados para um último ponto de dados antes da troca para 365800 ppm de CO₂, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

A Figura 29 ilustra graficamente dados mostrando que superexpressão de CAI ou CA4 em células-guarda do tipo silvestre diminui a condutância estomatal global e aumenta ligeiramente a magnitude da resposta 25 estomatal ao CO₂; Figura 29C e Figura 29D ilustram graficamente análise por RT-PCR de CAI ou CA4 em folhas de linhagens de superexpressão acionados pelo promotor célula-guarda preferencial pGCl; medições da condutância estomatal de uma linhagem adicional superexpressando o gene CAI, conforme ilustrado na Figura 29A e a linhagem adicional superexpressando o

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 56/196 gene CA4, conforme ilustrado na Figura 29B. Valores de condutância estomatal relativa, conforme ilustrado na Figura 29C, Figura 29D, Figura 29E e Figura 29F, foram normalizados para o último ponto de dados antes da troca para 365-800 ppm de CO2, conforme descrito em detalhes no Exemplo 4, abaixo.

Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos idênticos.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção proporciona composições e métodos para 10 manipulação da troca de água e dióxido de carbono (CO2) através de estômatos da planta por meio de controle de genes sensores de CO2 designados “genes CChSen”, incluindo os ácidos nucleicos sensores de CO2 (por exemplo, os genes ou mensagens ou transcrições) e polipeptídeos da presente invenção. A invenção proporciona composições e métodos para 15 super- ou subexpressão de ácidos nucleicos sensores de CO2 e polipeptídeos sensores de CO2, incluindo os ácidos nucleicos e polipeptídeos sensores de CO2 da presente invenção. A invenção proporciona composições e métodos para superexpressão de ácidos nucleicos sensores de CO2 e polipeptídeos sensores de CO2, incluindo os ácidos nucleicos e polipeptídeos sensores de 20 CO2 da presente invenção, para manipular uma resposta aprimorada ao CO2 em uma planta, parte de planta, órgão de planta, a folha e semelhantes.

Superexpressão de um ou vários genes sensores de CO2 designados genes CChSen, incluindo os ácidos nucleicos sensores de CO2 (por exemplo, os genes ou mensagens ou transcrições) ou polipeptídeos 25 sensores de CO2, incluindo os polipeptídeos sensores de CO2 da presente invenção, estimula uma resposta aprimorada ao CO2. Assim, superexpressão de todos ou um dos ácidos nucleicos da presente invenção (para superexpressar as proteínas CChSen) intensifica uma WUE e produz uma planta mais eficiente e resistente à estiagem, particularmente à luz das

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 57/196 concentrações continuamente crescentes de CO2 atmosférico. Plantas transgênicas (por exemplo, safras) da presente invenção (através de superexpressão de todas ou uma das proteínas CChSen da presente invenção) fecham seus estômatos em um grau maior do que plantas do tipo silvestre, desse modo, preservando seu uso de água. Em virtude do fato de a eficiência de uso de água definir quão bem uma planta pode equilibrar a perda de água através do estômato com a captação líquida de CO2 para fotossíntese e, consequentemente, seu acúmulo de biomassa, a invenção pode ser usada no aumento da biomassa de uma planta e, assim, os métodos da invenção têm aplicações na área de biocombustíveis/energia alternativa.

A invenção também proporciona composições e métodos para inibição da expressão de genes CChSew, transcrições e proteínas CChSen, por exemplo, através de repressão através de e/ou RNAi de sensores de CO2 em células-guarda em qualquer planta ou célula de planta, por exemplo, uma safra agrícola. Com a subexpressão de CChSen em plantas transgênicas ou subexpressão de CChSen em plantas da presente invenção permite que as mesmas possam abrir seus estômatos em um grau maior do que plantas do tipo silvestre.

A invenção também proporciona plantas, por exemplo, safras agrícolas, que podem suportar temperaturas aumentadas - assim, preservando uma ruptura de metabolismo, fotossíntese e crescimento. Assim, composições e métodos da presente invenção, através de inibição da expressão de ácidos nucleicos de CChSen e/ou proteínas CChSe, ajudam safras que, de outro modo, seriam sensíveis a temperaturas elevadas a suportar as concentrações aumentadas de CO2 atmosférico, também, reduzindo ou aliviando um aumento acelerado na temperatura das folhas. A invenção proporciona composições e métodos compreendendo antissenso e RNAi para repressão de sensores de CO2 em células-guarda. Em um aspecto, um promotor de célula-guarda proporciona um meio para reduzir a

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 58/196 temperatura da folha através de intensificação de transpiração nessas safras e também maximizar os rendimentos da safra.

A invenção proporciona composições e métodos para regulação negativa/diminuição ou, altemativamente, aumento da troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou em uma planta, por exemplo, através da célula-guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo, inter alia, uso de um polipeptídeo tendo atividade de anidrase carbônica, “Carboxilase de Fosfoenolpiruvato (PEP)” (ou carboxilase de PEP ou PEPC) e/ou a enzima carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco.

A invenção proporciona composições e métodos para manipulação de carboxilase de PEP, a qual é uma enzima chave na fotossíntese em plantas C4. Uma vez que a carboxilase de PEP ou PEPC não pode usar CO2 diretamente como um substrato, a PEPC conta com a anidrase carbônica (CA) para proporcionar HCO3·. A reação catalisada pela carboxilase de PEP (PEPC) é (nota: Pi é fosfato inorgânico):

PEP + HCO3· <=> oxaloacetato (OAA) + Pi

OAA pode ser subsequentemente reduzido em malato. Em algumas células de planta, CO2 é liberado para Rubisco e fotossíntese 3m C3.

Em plantas C4 (usando a via C4 de fixação de carbono, também denominada a via de Hatch-Slack), o malato pode ser transportado em células de parede espessa (em plantas C4, células de parede espessa são células fotossintéticas dispostas em paredes hermeticamente acondicionadas em tomo dos veios da folha; o ciclo de Calvin está confinado aos cloroplastos das células de parede espessa) onde CO2 é liberado para Rubisco e fotossíntese em C3; e a invenção também proporciona composições e métodos para manipulação de enzimas Rubisco. Em um aspecto da invenção, expressão de enzimas Rubisco, por exemplo, uma pequena subunidade Rubisco, é inibida ou reprimida (diminuída), por exemplo, em uma célulaPetição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 59/196 guarda de uma planta. Através de inibição ou repressão (diminuição) de expressão de Rubisco, a eficiência de oxigenação diminui e a fixação de carbono pode aumentar e os níveis de CO2 em células-guarda caem. Isso podería reduzir a regulação de fechamento estomatal pelo CO2.

Em um aspecto da invenção, níveis altos ou reduzidos de carboxilase de PEP ou PEPC são manipulados em células-guarda de plantas para manipular o controle de movimentos estomatais pelo CO2 e a quantidade de ânions de malato²' orgânico intracelular. Um aumento nos níveis de PEPC induzirá à abertura estomatal; uma diminuição na PEPC resultará no fechamento estomatal; assim, embora a invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo de ação em particular, o aumento nos níveis de PEPC induzirá a um aumento no malato, o qual equilibra o acúmulo de íons de potássio positivos (K⁺) durante abertura estomatal; e, em virtude de um aumento na concentração de sal potássio (K⁺) intracelular, isso induzirá à abertura estomatal. Assim, a invenção proporciona composições e métodos para abertura e fechamento de estômato de plantas ou aumento ou diminuição da quantidade de estômato através de super- ou subexpressão de PEPC, respectivamente.

A invenção proporciona composições e métodos para regulação de troca de dióxido de carbono (CO2) e uso e captação de CO2 em uma planta ou parte de planta, por exemplo, a folha, através de manipulação de expressão de uma proteína de ligação a CO2, “Carboxilase de Fosfoenolpiruvato (PEP)” (ou carboxilase de PEP ou PEPC) e/ou a enzima carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco; assim, a invenção também proporciona composições e métodos para manipulação de transdução de sinal de CO2 e regulação de troca de gás em uma planta ou parte de planta. Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona composições e métodos para manipulação de uma quantidade aumentada de PEPC (para facilitar a abertura estomatal) e/ou manipulação da quantidade de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 60/196 enzima “Rubisco”.

Em aspectos alternativos da presente invenção, ácidos nucleicos de PEPC e Rubisco são expressos em células de planta, por exemplo, em células-guarda de planta e células de mesófilo; e, em um aspecto, eles são expressos em altos níveis (maiores do que os níveis do tipo silvestre); ou a expressão de ácidos nucleicos de PEPC e Rubisco é inibida, diminuída ou reprimida em células de planta, por exemplo, em células-guarda de planta e células de mesófilo; e, em um aspecto, eles são expressos em menores níveis (menores do que os níveis do tipo silvestre). Células de planta manipuladas nessas modalidades alternativas incluem plantas e células de planta isoladas cultivadas ou transgênicas da presente invenção.

Elementos Regulatórios Transcricionais

A invenção também proporciona promotores para regulação de expressão de um ácido nucléico em uma célula de planta, em que o promotor compreende uma sequência conforme apresentado em SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11 ou subsequências funcionais (regulatórias de transcrição) das mesmas, em que, em um aspecto, o promotor superregula a transcrição e, em um aspecto, o promotor superregula a transcrição em uma célula-guarda de planta de maneira específica e, em um aspecto, a célula-guarda é uma célulaguarda de folha ou uma célula-guarda de caule. A invenção também proporciona cassetes de expressão, plasmídeos, vírus e vetores compreendendo o promotor da invenção. Em um aspecto, a invenção também proporciona cassetes de expressão, plasmídeos, vírus e vetores compreendendo um promotor da invenção operavelmente ligado a um ácido nucléico da invenção, por exemplo, qualquer gênero de polinucleotídeos baseados em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,

SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8 exemplificativas.

Esse promotor da invenção é um promotor forte, particularmente em células-guarda de planta e, em algumas modalidades, é

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 61/196 específico para células-guarda, por exemplo, as SEQ ID NO: 10 e SEQ ID

NO: 11 exemplificativas (sua expressão pode ser fraca em outras células, por exemplo, células epidérmicas ou células de mesófilo e ainda considerado “célula-guarda-específica”).

Baseado em dados de microarranjos múltiplos, os promotores da invenção são cerca de 20 vezes mais fortes do que o promotor ΚΑΤΙ de célula-guarda conhecido e também é mais forte em células-guarda do que o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor. Veja Figuras da presente invenção e Exemplos, abaixo.

Embora um ácido nucleico da invenção possa ser operavelmente figado a um promotor da presente invenção, em modalidades alternativas ele também pode ser operavelmente figado a qualquer promotor constitutivo e/ou planta ou célula de planta-específico, por exemplo, um promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), um promotor de 15 sintase de manopina (MAS), um promotor Γ ou 2' derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, um promotor 35S do vírus mosaico de figo, um promotor de actina, um promotor de actina de arroz, um promotor de ubiquitina, por exemplo, um promotor de ubiquitina-1 de milho e semelhantes.

Exemplos de promotores constitutivos de planta os quais podem ser úteis para expressão da sequência TF incluem: o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV), o qual confere expressão constitutiva em alto nível na maioria dos tecidos de planta (veja, por exemplo, Odell e colaboradores (1985) Nature 313: 810-812); o promotor de sintase de 25 nopalina (An e colaboradores (1988) Plant Physiol. 88: 547-552); e o promotor de sintase de octopina (Fromm e colaboradores (1989) Cell Plant 1: 977-984).

Os fatores de transcrição (por exemplo, os promotores) da invenção ou outros fatores de transcrição podem ser operavelmente ligados a

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 62/196 uma sequência de codificação da invenção, por exemplo, uma proteína regulatória de CO2 da invenção. As proteínas regulatórias de CO2 da invenção podem ser operavelmente ligadas a um promotor ou intensificador específico que faz com que o fator de transcrição e, assim, a sequência de codificação, seja expressa em resposta a sinais temporais ou tecido-específicos ambientais.

Uma variedade de promotores de gene de planta que regulam a expressão gênica em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos, de desenvolvimento e de uma maneira tecido-específica podem ser usados para expressão de uma sequência TF em plantas. A escolha de um promotor é 10 baseada grandemente sobre o fenótipo de interesse e é determinada por fatores tais como tecido (por exemplo, semente, fruto, raiz, pólen, tecido vascular, flor, carpelo, etc.), indutibilidade (por exemplo, em resposta a ferimentos, calor, frio, estiagem, luz, patógenos, etc.), timing, estágio de desenvolvimento e semelhantes.

Numerosos fatores conhecidos foram caracterizados e podem ser empregados favoravelmente para promover a expressão de um polinucleotídeo da invenção em uma planta transgênica ou célula de interesse. Por exemplo, promotores tecido-específicos incluem: promotores sementeespecíficos (tais como os promotores de napina, faseolina ou DC3 descritos 20 na Pat. U.S. No. 5.773.697), promotores fruto-específicos que são ativos durante amadurecimento de fruto (tal como o promotor dru 1 (Pat. U.S. No. 5.783.393) ou o promotor 2A11 (por exemplo, veja Pat. U.S. No. 4.943.674) e o promotor de poligalacturonase de tomate (por exemplo, veja Bird e colaboradores (1988) Plant Mol. Biol. 11: 651-662), promotores raiz25 específicos, tais como aqueles divulgados nas Pats. U.S. Nos. 5.618.988,

5.837.848 e 5.905.186, promotores pólen-ativos, tais como PTA29, PTA26 e PTA13 (por exemplo, veja Pat. U.S. No. 5.792.929), promotores ativos em tecido vascular (por exemplo, veja Ringli e Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37: 977-988), flor-específicos (por exemplo, veja Kaiser e colaboradores (1995)

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 63/196

Plant Mol. Biol. 28: 231-243), pólen (por exemplo, veja Baerson e colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947-1959), carpelos (por exemplo, veja Ohl e colaboradores (1990) Plant Cell 2: 837-848), pólen e óvulos (por exemplo, veja Baerson e colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255-267), 5 promotores auxina-induzíveis (tais como aqueles descritos em van der Kop e colaboradores (1999) Plant Mol. Biol. 39: 979-990 ou Baumann e colaboradores, (1999) Plant Cell 11: 323-334), promotor citoquininainduzível (por exemplo, veja Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743753), promotores responsivos à giberelina (por exemplo, veja Shi e 10 colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053-1060, Willmott e colaboradores (1998) Plant Molec. Biol. 38: 817-825) e semelhantes.

Promotores adicionais que podem ser usados na prática da presente invenção são aqueles que estimulam a expressão em resposta ao calor (por exemplo, veja Ainley e colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 22: 15 13-23), luz (por exemplo, o promotor rbcS-3A de ervilha, Kuhlemeier e colaboradores (1989) Plant Cell 1: 471-478 e o promotor rbcS d milho, Schaffner e Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012); ferimento (por exemplo, wunl, Siebertz e colaboradores (1989) Plant Cell 1: 961-968); patógenos (tal como o promotor PR-1 descrito em Buchel e colaboradores (1999) Plant Mol. 20 Biol. 40: 387-396 e o promotor PDF1.2 descrito em Manners e colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071-1080) e produtos químicos, tais como jasmonato de metila ou ácido salicílico (por exemplo, veja Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Além disso, o timing da expressão pode ser controlado usando promotores tais como aqueles que 25 atuam na senescência (por exemplo, veja Gan e Amasino (1995) Science 270: 1986-1988); ou desenvolvimento tardio de semente (por exemplo, veja Odell e colaboradores (1994) Plant Physiol. 106: 447-458).

Promotores tecido-específicos podem promover a transcrição apenas dentro de uma determinada estrutura de tempo do estágio de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 64/196 desenvolvimento dentro desse tecido. Veja, por exemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, que caracteriza o promotor do gene LEAFY de Arabidopsis. Veja também Cardon (1997) Plant J 12: 367-77, que descreve o fator de transcrição SPL3, o qual reconhece um motivo de sequência 5 conservado na região promotora do gene API de identidade de meristema floral de A. thaliana: e Mandei (1995) Plant Molecular Biology, Vol. 29, páginas 995-1004, que descreve o promotor eIF4 de meristema. Promotores tecido-específicos os quais são ativos por todo o ciclo de vida de um tecido em particular podem ser usados. Em um aspecto, os ácidos nucleicos da 10 invenção são operavelmente ligados a um promotor ativo primariamente apenas em células de fibra de algodão. Em um aspecto, os ácidos nucleicos da invenção são operavelmente ligados a um promotor ativo primariamente durante os estágios de alongamento da célula de fibra de algodão, por exemplo, conforme descrito por Rinehart (1996) supra. Os ácidos nucleicos 15 podem ser operavelmente ligados ao promotor do gene Fbl2A para serem expressos preferencialmente em células de fibra de algodão (Ibid). Veja também, John (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 5769-5773; John e colaboradores, Patentes U.S. Nos. 5.608.148 e 5.602.321, que descrevem promotores específicos para fibra de algodão e métodos para a construção de 20 plantas transgênicas de algodão. Promotores raiz-específicos podem também ser usados para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Exemplos de promotores raiz-específicos incluem o promotor do gene de desidrogenase de álcool (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60). Outros promotores que podem ser usados para expressar os ácidos nucleicos da invenção incluem, 25 por exemplo, promotores óvulo-específicos, embrião-específicos, endosperma-específicos, integumento-específicos, envoltório da sementeespecíficos ou alguma combinação dos mesmos; um promotor folhaespecífico (veja, por exemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285 1295, que descreve um promotor folha-específico em milho); o promotor ORF13 de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 65/196

Agrobacterium rhizogenes (o qual exibe alta atividade em raízes; veja, por exemplo, Hansen (1997) supra); um promotor específicos a pólen de milho (veja, por exemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161 168); um promotor de tomate ativo durante amadurecimento de fruto, senescência e a 5 abscisão de folhas e, em menor grau, de flores pode ser usado (veja, por exemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731 746); um promotor pistilo-específico do gene SK2 de batata (veja, por exemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425-431); o gene Blec4 de ervilha, o qual é ativo em tecido epidérmico de ápices de broto vegetativo e floral de alfafa transgênica, tomando-o uma 10 ferramenta útil para objetivar a expressão de genes estranhos à camada epidérmica de brotos ou fibras em crescimento ativo; o gene BEL1 óvuloespecífico (veja, por exemplo, Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank No. U39944); e/ou o promotor em Klee, Patente U.S. No. 5.589.583, que descreve uma região promotora de planta que é capaz de conferir altos níveis de 15 transcrição em tecido meristemático e/ou células em divisão rápida.

Altemativamente, promotores de planta os quais são induzíveis quando de exposição a hormônios de planta, tais como auxinas, são usados para expressar os ácidos nucleicos da invenção. Por exemplo, a invenção pode usar o fragmento promotor El dos elementos auxina20 responsivos (AuxREs) na semente de soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); o promotor GST6 de Arabidopsis auxina-responsivo (também responsivo ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955-966); o promotor parC auxina-induzível de tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913); um elemento de resposta à biotina em planta 25 (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); e o promotor responsivo ao hormônio de estresse ácido abscísico (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

Os ácidos nucleicos da invenção podem também ser operavelmente ligados a promotores de planta os quais são induzíveis quando

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 66/196 de exposição a reagentes químicos os quais podem ser aplicados à planta, tais como herbicidas ou antibióticos. Por exemplo, o promotor In2-2 de milho, ativado por protetores de cultura contra herbicida de benzeno-sulfonamida, pode ser usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577);

aplicação de protetores de cultura contra diferentes herbicidas induz a padrões distintos de expressão gênica, incluindo expressão na raiz, hidatódios e no meristema apical do broto. A sequência de codificação pode estar sob o controle, por exemplo, de um promotor tetraciclina-induzível, por exemplo, conforme descrito em plantas transgênicas de tabaco contendo o gene de 10 decarboxilase de arginina de Avena sativa L. (aveia) (Masgrau (1997) Plant J.

11: 465-473); ou um elemento responsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Usando promotores quimicamente induzidos (por exemplo, hormônio ou pesticida), isto é, promotores responsivos a um produto químico o qual pode ser aplicado à planta transgênica no campo, 15 expressão de um polipeptídeo da invenção pode ser induzida em um estágio de desenvolvimento particular da planta. Assim, a invenção também proporciona plantas transgênicas contendo um gene induzível que codifica polipeptídeos da invenção cuja faixa de hospedeiro está limitada a espécies de plantas alvo, tais como milho, arroz, cevada, trigo, batata ou outras safras, 20 induzível em qualquer estágio de desenvolvimento da oxigênio.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que um promotor tecido-específico pode acionar a expressão de sequências operavelmente ligadas em outros tecidos que não o tecido alvo. Assim, um promotor tecidoespecífico é um que aciona expressão preferencial no tecido ou tipo de célula 25 alvo, mas pode também levar a alguma expressão em outros tecidos também.

Os ácidos nucleicos da invenção podem também ser operavelmente ligados a promotores de planta os quais são induzíveis quando de exposição a reagentes químicos. Esses reagentes incluem, por exemplo, herbicidas, auxinas sintéticas ou antibióticos os quais podem ser aplicados,

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 67/196 por exemplo, pulverizados, sobre as plantas transgênicas. Expressão induzível dos ácidos nucleicos da invenção permitirá que o produtor selecione plantas com a expressão e/ou atividade de proteína ótima. O desenvolvimento de partes de uma planta pode, assim, ser controlado. Dessa forma, a invenção proporciona um meio para facilitar a colheita de plantas e partes de plantas.

Por exemplo, em várias modalidades, o promotor In2-2 de milho, ativado por protetores de cultura contra herbicidas de benzeno-sulfonamida, é usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); aplicação de protetores de cultura contra diferentes herbicidas induz a padrões de expressão gênica 10 distintos, incluindo expressão na raiz, hidatódios e no meristema apical de broto. Sequências de codificação da invenção também estão sob o controle de um promotor tetraciclina-induzível, por exemplo, conforme descrito com plantas transgênicas de tabaco contendo o gene de decarboxilase de arginina de Avena sativa L. (aveia) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); ou um 15 elemento responsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324).

Em alguns aspectos, expressão apropriada de polipeptídeo pode requerer a região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, a 20 partir de uma variedade de outros genes de planta (ou animal ou outros) ou de genes no T-DNA de Agrobacterium.

Plantas compreendendo um ácido nucleico da presente invenção

A invenção proporciona plantas transgênicas e sementes 25 compreendendo um ácido nucleico, um polipeptídeo (por exemplo, uma proteína CChSen), um cassete de expressão ou vetor ou uma célula transfectada ou transformada da invenção. A invenção também proporciona produtos de planta, por exemplo, sementes, folhas, extratos e semelhantes, compreendendo um ácido nucleico e/ou um polipeptídeo (por exemplo, uma

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 68/196 proteína CC^Sen) da invenção. A planta tr a pode ser dicotiledônea (uma dicotiledônea) ou monocotiledônea (uma monocotiledônea). A invenção também proporciona métodos de produção e uso dessas plantas e sementes transgênicas. A expressão, na planta ou célula de planta transgênica, de um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtida de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.309.872.

Acido nucleicos e construtos de expressão da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta através de qualquer meio. Por exemplo, ácido nucleicos ou construtos de expressão podem ser introduzidos no genoma de um hospedeiro vegetal desejado ou os ácidos nucleicos ou construtos de expressão podem ser epissomas. Introdução no genoma de uma planta desejada pode ser tal que a produção de proteína CC^Sen do hospedeiro é regulada por elementos de controle de transcrição ou tradução endógenos ou por um promotor heterólogo, por exemplo, um promotor da presente invenção. A invenção também proporciona “plantas knockout” onde inserção da sequência gênica, por exemplo, através de recombinação homóloga, rompeu a expressão do gene endógeno. Meios para gerar plantas “knockout” são bem conhecidos na técnica.

Os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção podem ser expressos ou inseridos em qualquer planta, parte de planta, célula de planta ou semente. As plantas transgênicas da invenção ou uma planta ou célula de planta compreendendo um ácido nucléico da presente invenção (por exemplo, uma célula transfectada, infectada ou transformada) podem ser dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Exemplos de monocots compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, como plantas transgênicas monocots da invenção, são gramíneas, tal como grama do prado (grama azul, Poa), gramas de forragem, tais como festuca, joio, gramas temperadas, tal como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho verde (milho). Exemplos de dicots compreendendo um ácido

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 69/196 nucleico da presente invenção, por exemplo, como plantas transgênicas dicots da invenção, são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba sacarínica, ervilha, feijão e semente de soja e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, colza e o organismo modelo 5 intimamente relacionado Arabidopsis thaliana. Assim, planta ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico da presente invenção, incluindo as plantas e sementes transgênicas da invenção, incluem uma ampla faixa de plantas incluindo, mas não limitado a, espécies dos gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, 10 Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria,

Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, 15 Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna e Zea.

Os ácidos nucleicos e polipeptídeos da invenção podem ser expressos ou inseridos em qualquer célula, órgão, semente ou tecido de planta, incluindo tecidos ou plantas diferenciadas e não diferenciadas 20 incluindo, mas não limitado a, raízes, caules, brotos, cotilédones, epicótilo, hipocótilo, folhas, pólen, sementes, tecido tumoral e várias formas de células em cultura, tais como células únicas, protoplasto, embrião e tecido de caule. Um tecido de planta pode estar em plantas ou em cultura de órgãos, tecidos ou célula.

Plantas transgênicas

A invenção proporciona plantas transgênicas compreendendo e expressando os genes CO2Sen e proteínas da presente invenção; por exemplo, a invenção proporciona plantas, por exemplo, plantas transgênicas, que mostram crescimento aprimorado sob condições limitativas de água; assim, a

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 70/196 invenção proporciona plantas tolerantes à estiagem (por exemplo, safras).

Uma planta transgênica da presente invenção pode também incluir a maquinaria necessária para expressão ou alteração da atividade de um polipeptídeo codificado por um gene endógeno, por exemplo, alterando o estado de fosforilação do polipeptídeo para mantê-lo em um estado ativado.

As plantas transgênicas (ou células de planta ou explantes de planta ou tecidos de planta) incorporando os polinucleotídeos da invenção e/ou expressando os polipeptídeos da invenção podem ser produzidas através de uma variedade de técnicas bem estabelecidas, conforme descrito acima. Após construção de um vetor, mais tipicamente um cassete de expressão, incluindo um polinucleotídeo, por exemplo, que codifica um fator de transcrição ou homólogo de fator de transcrição da invenção, técnicas padrões podem ser usadas para introduzir o polinucleotídeo em uma planta, uma célula de planta, um explante de planta ou um tecido de planta de interesse. Em um aspecto, a célula, explante ou tecido de planta pode ser regenerado para produzir uma planta transgênica.

A planta pode ser qualquer planta superior, incluindo gimnospermas, plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Protocolos adequados estão disponíveis para Leguminosae (alfafa, semente de soja, cravo-da-índia, etc.), Umbelliferae (cenoura, aipo, pastinaca), Cruciferae (couve, rabanete, colza, brócolis, etc.), Curcurbitaceae (melões e abóbora), Gramineae (trigo, milho, arroz, cevada, painço, etc.), Solanaceae (batata, tomate, tabaco, pimentas, etc.) e várias outras safras. Veja os protocolos descritos em Ammirato e colaboradores, eds., (1984) Handbook of Plant Cell Culture—Crop Species, Macmillan Publ. Co., New York, N.Y.; Shimamoto e colaboradores (1989) Nature 338: 274-276; Fromm e colaboradores (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; e Vasil e colaboradores (1990) Bio/Technol. 8: 429434.

A transformação e regeneração de células de planta

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 71/196 monocotiledônea e dicotiledônea é agora rotina e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada pelo praticante. A escolha do método variará com o tipo de planta a ser transformada; aqueles habilitados na técnica reconhecerão a adequabilidade de métodos particulares para determinados tipos de planta. Métodos adequados podem incluir, mas não estão limitados a: eletroporação de protoplastas de planta; transformação lipossoma-mediada; transformação mediada por polietileno glicol (PEG); transformação usando vírus; micro-injeção de células de planta; bombardeamento com microprojétil de células de planta; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Transformação significa introdução de uma sequência de nucleotídeo em uma planta de maneira a causar expressão estável ou transitória da sequência.

Exemplos com sucesso da modificação de características de uma planta através de transformação com sequências clonadas as quais servem para ilustrar o conhecimento atual nesse campo de tecnologia incluem, por exemplo: Pats. U.S. Nos. 5.571.706; 5.677.175; 5.510.471; 5.750.386; 5.597.945; 5.589.615; 5.750.871; 5.268.526; 5.780.708;

5.538.880; 5.773.269; 5.736.369 e 5.619.042.

Após transformação, as plantas são, de preferência, selecionadas usando um marcador selecionável incorporado no vetor de transformação. Tipicamente, tal marcador conferirá resistência a antibiótico ou herbicida sobre as plantas transformadas e seleção de transformantes pode ser realizada expondo as plantas a concentrações apropriadas do antibiótico ou herbicida.

Após transformadas, as plantas são selecionadas e crescidas até maturidade e aquelas plantas mostrando um traço modificado são identificados. O traço modificado pode ser qualquer um daqueles traços descritos acima. Adicionalmente, para confirmar que o traço modificado é em virtude de alterações nos níveis de expressão ou atividade do polipeptídeo ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 72/196 polinucleotídeo da invenção pode ser determinado através de análise de expressão de mRNA usando Northem blots, RT-PCR ou microarranjos ou expressão de proteína usando imunoblots ou Western blots ou ensaios de deslocamento de gel.

Acido nucleicos e construtos de expressão da invenção podem ser introduzidos em uma célula de planta através de qualquer meio. Por exemplo, ácido nucleicos ou construtos de expressão podem ser introduzidos no genoma de um hospedeiro vegetal desejado ou os ácidos nucleicos ou construtos de expressão podem ser epissomas. Introdução no genoma de uma planta desejada pode ser tal que a produção de sensor de CO2 do hospedeiro seja regulada por elementos de controle de transcrição ou tradução endógenos.

A invenção também proporciona “plantas knockout” onde a inserção da sequência gênica, por exemplo, através de recombinação homóloga, rompeu a expressão do gene endógeno. Meios para gerar plantas “knockout” são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Strepp (1998) Proc Natl. Acad. Sei. USA 95: 4368-4373; Miao (1995) Plant J 7: 359-365. Veja discussão sobre plantas transgênicas abaixo.

Em um aspecto, a produção de plantas ou sementes transgênicas compreende incorporação de sequências da invenção e, em um aspecto (opcionalmente), genes marcadores em um construto de expressão alvo (por exemplo, um plasmídeo), junto com o posicionamento do promotor e das sequências terminadoras. Isso pode envolver transferência do gene modificado para uma planta através de um método adequado. Por exemplo, um construto pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastas da célula de planta ou os construtos podem ser introduzidos diretamente no tecido de planta usando métodos balísticos, tal como bombardeamento de partículas de DNA. Por exemplo, veja Christou (1997)

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 73/196

Plant Mol. Biol. 35: 197-203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17-30; Klein (1987) Nature 327: 70-73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 6369, que discutem o uso de bombardeamento de partículas para introduzir transgenes em trigo; e Adam (1997) supra, para uso do bombardeamento de 5 partículas para introduzir YACs em células de planta. Por exemplo, Rinehart (1997) supra, usou bombardeamento de partículas para gerar plantas transgênicas de algodão. Aparelho para aceleração de partículas é descrito na Pat. U.S. No. 5.015.580; e o instrumento de aceleração de partículas comercialmente disponível BioRad (Biolistics) PDS-2000; veja também, 10 John, Patente U.S. No. 5.608.148; e Ellis, Patente U.S. No. 5.681.730, que descrevem a transformação partícula-mediada de gimnospermas.

Em um aspecto, protoplastas podem ser imobilizados e injetados com um ácido nucleico, por exemplo, um construto de expressão. Embora a regeneração de planta a partir de protoplastas não seja fácil com 15 cereais, regeneração de planta é possível em legumes usando embriogênese somática a partir de protoplasto derivado de caule. Tecidos organizados podem ser transformados com DNA nu usando a técnica de pistola de gene, onde o DNA é revestido sobre microprojéteis de tungstênio, disparando 1/100° do tamanho de células, o qual pode levar o DNA profundamente às 20 células e organelas. Tecido transformado é, então, induzido a regenerar, usualmente através de embriogênese somática. Essa técnica tem obtido sucesso em várias espécies de cereal, incluindo milho e arroz.

Em um aspecto, a terceira etapa pode envolver seleção e regeneração de plantas inteiras capazes de transmitir o gene alvo incorporado 25 para a próxima geração. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de determinados fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual, tipicamente contando com um marcador biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. Regeneração de planta a partir de protoplastas cultivados é descrita

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 74/196 em Evans e colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração também pode ser obtida a partir de caule, explantes, órgãos de planta ou partes das mesmas. Tais técnicas de regeneração são descritas, de modo geral, em Klee (1987) Ann. Rev. de Plant Phys. 38: 467-486. Para obter plantas inteiras a partir de tecidos transgênicos, tais como embriões imaturos, elas podem ser crescidas sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura tecidual. Uma vez que plantas inteiras são geradas e produzem semente, avaliação da prole começa.

Após o cassete de expressão ser estavelmente incorporado em plantas transgênicas, ele pode ser introduzido em outras plantas através de cruzamento sexual. Qualquer uma de uma série de técnicas padrões de produção pode ser usada, dependendo da espécie a ser cruzada. Uma vez que expressão transgênica dos ácidos nucleicos da invenção leva a alterações fenotípicas, plantas compreendendo os ácidos nucleicos recombinantes da invenção podem ser sexualmente cruzadas com uma segunda planta a fim de obter um produto final. Assim, a semente da invenção pode ser derivada de um cruzamento entre duas plantas transgênicas da invenção ou um cruzamento entre uma planta da invenção e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos da invenção para produzir uma planta na qual o comportamento de floração é alterado) podem ser intensificados quando ambas as plantas parentais expressam os polipeptídeos, por exemplo, um sensor de CO2 da invenção. Os efeitos desejados podem ser passados para futuras gerações da planta através de meios padrões de propagação.

Moléculas inibitórias antissenso

Em um aspecto, a invenção proporciona modalidades

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 75/196 antissenso inibitórias compreendendo uma sequência da presente invenção (a qual inclui fitas senso e antissenso). Ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente ou sintéticos podem ser usados como oligonucleotídeos antissenso. Os oligonucleotídeos antissenso podem ser de qualquer comprimento; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligonucleotídeos antissenso têm entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. O comprimento ótimo pode ser determinado através de seleção de rotina. Os oligonucleotídeos antissenso podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ótima pode ser determinada através de seleção de rotina. Uma ampla variedade de análogos de ácido nucleico e nucleotídeo sintéticos, que não ocorrem naturalmente são conhecidos, os quais pode se dirigir a esse problema potencial. Por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) contendo partes principais não-iônicas, tais como unidades de N-(2-aminoetil) glicina, podem ser usados. Oligonucleotídeos antissenso tendo ligações de fosforotioato também podem ser usados, conforme descrito no WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996). Oligonucleotídeos antissenso tendo análogos de parte principal de DNA sintética fornecidos pela invenção pode também incluir ácidos nucleicos de fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato e morfolino carbamato, conforme descrito acima.

Interferência de RNA (RNAi)

Em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula de

RNA inibitória, uma assim denominada molécula de “RNAi”, compreendendo uma sequência da presente invenção. Em um aspecto, a molécula de RNAi compreende uma molécula de RNA filamento duplo (dsRNA). A molécula de RNAi pode compreender uma molécula de RNA filamento duplo (dsRNA), por exemplo, moléculas de siRNA, miRNA

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 76/196 (microRNA) e/ou RNA curto de hairpina (shRNA). A molécula de RNAi, por exemplo, siRNA (pequeno RNA inibitório), pode inibir a expressão de genes

CChSen e/ou miRNA (micro RNA), que inibe a tradução de um gene CChSen ou quaisquer genes sensores de CO₂ relacionados.

Em aspectos alternativos, o RNAi tem cerca de 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplos de comprimento. Embora a invenção não esteja limitada por qualquer mecanismo de ação em particular, o RNAi pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA fita simples (ssRNA) de sequências similares ou 10 idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta ao

RNA filamento duplo (dsRNA), mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado através de um processo denominado interferência de RNA (RNAi). Um possível mecanismo por trás da RNAi, por exemplo, siRNA para inibição de transcrição e/ou miRNA para inibição de tradução, é a ruptura de um RNA 15 filamento duplo (dsRNA) equivalente a uma sequência gênica específica em pedaços curtos denominados RNA curtos de interferência, os quais disparam a degradação do mRNA que combina com essa sequência. Em um aspecto, os RNAi’s da invenção são usados em produtos terapêuticos para silenciamento de gene. Veja, por exemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7: 1040-1046.

Em um aspecto, a invenção proporciona métodos para degradar seletivamente o RNA usando os RNAi’s da invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi da invenção podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, tecido ou órgão de planta ou semente ou uma planta.

Em um aspecto, introdução intracelular do RNAi (por exemplo, miRNA ou siRNA) é através de intemalização de um ligante específico para a célula alvo ligado a uma proteína de ligação de RNA compreendendo um RNAi (por exemplo, microRNA) adsorvido. O ligante é específico para um antígeno único na superfície da célula alvo. O ligante pode

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 77/196 ser espontaneamente internalizado após ligação ao antígeno na superfície celular. Se o antígeno único na superfície celular não é naturalmente internalizado após ligação a seu ligante, intemalização pode ser promovida através da incorporação de um peptídeo rico em arginina ou outro peptídeo 5 permeável à membrana, na estrutura do ligante ou proteína de ligação a RNA ou fixação de tal peptídeo ao ligante ou proteína de ligação a RNA. Veja, por exemplo, Pubs. de Ped. de Patente U.S. Nos. 20060030003; 20060025361; 20060019286; 20060019258. Em um aspecto, a invenção proporciona formulações baseadas em lipídio para distribuição, por exemplo, introdução, 10 de ácidos nucleicos da invenção como partículas de ácido nucleico-lipídio compreendendo uma molécula de RNAi a uma célula; veja, por exemplo, Pub. de Ped. de Patente U.S. No. 20060008910.

Métodos para fabricação e uso de moléculas de RNAi, por exemplo, siRNA e/ou miRNA, para degradar seletivamente RNA são bem 15 conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.506.559;

6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Métodos para produzir construtos de expressão, por exemplo, vetores ou plasmídeos, a partir dos quais um polinucleotídeo inibitório de gene CChSen (por exemplo, um siRNA duplo da invenção) é transcrição são 20 bem conhecidos e rotineiros. Uma região regulatória (por exemplo, promotor, intensificador, silenciador, doador de união, aceitador, etc.) pode ser usada para transcrever uma fita de RNA ou fitas de RNA de um polinucleotídeo inibitório de gene CChSen a partir de um construto de expressão. Quando de produção de uma molécula inibitória de gene CChSen de siRNA duplo, as 25 fitas senso e antissenso da porção objetivada do IRES objetivado podem ser transcritas como duas fitas de RNA distintas que anelarão juntas ou como uma única fita de RNA que formará um loop de hairpina e anelará consigo mesma. Por exemplo, um construto objetivando uma porção de um gene CChSen é inserido entre dois promotores (por exemplo, dois promotores de

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 78/196 planta, virais, de bacteriófago T7 ou outros), de modo que transcrição ocorre bidirecionalmente e resultará em fitas de RNA complementares que podem subsequentemente anelar para formar um siRNA inibitório da invenção. Altemativamente, uma porção objetivada de um gene CChSen pode ser criada como uma primeira e segunda regiões de codificação juntas sobre um único vetor de expressão, em que a primeira região de codificação do gene CChSen objetivado está na orientação senso com relação a seu promotor de controle e em que a segunda região de do gene CChSen está na orientação antissenso com relação a seu promotor de controle. Se transcrição das regiões de codificação senso e antissenso da porção objetivada do gene CChSen objetivaod ocorre a partir de dois promotores distintos, o resultado pode ser duas fitas de RNA distintas que podem subsequentemente anelar para formar um siRNA inibitório de gene CChSen, por exemplo, um siRNA inibitório de gene CChSen da invenção.

Em outro aspecto, transcrição da porção objetivada senso e antissenso do gene CChSen objetivado é controlada por um único promotor e o transcrição resultante será uma fita de RNA de hairpina única que é autocomplementar, isto é, forma uma dupla através de reduplicação de si mesma para criar uma molécula de siRNA inibitória de gene CChSen. Nessa configuração, um espaçador, por exemplo, de nucleotídeos, entre as regiões de codificação senso e antissenso da porção objetivada do gene CChSen objetivado pode melhorar a capacidade do RNA fita simples de formar um loop de hairpina, em que o loop de hairpina compreende o espaçador. Nessas modalidades, o espaçador compreende uma extensão de nucleotídeos de entre cerca de 5 a 50 nucleotídeos. Em um aspecto, as regiões de codificação senso e antissenso do siRNA podem, cada uma, estar sobre um vetor de expressão distinto e sob o controle de seu próprio promotor.

Ribozimas inibitórias

A invenção proporciona ribozimas capazes de ligação à

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 79/196 mensagem do gene sensor de CO₂. Essas ribozimas podem inibir a atividade do gene sensor de CO₂, por exemplo, através de objetivação de mRNA. Estratégias para criação de ribozimas e seleção da sequência antissenso específica ao gene sensor de CO₂ para objetivação são bem descritas na 5 literatura de patente e científica e aqueles habilitados na técnica podem criar tais ribozimas usando os novos reagentes da invenção. Ribozimas atuam através de ligação a um RNA alvo por meio da porção de ligação a RNA alvo de uma ribozima a qual é mantida em proximidade íntima a uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA alvo. Assim, a ribozima reconhece e se 10 figa a um RNA alvo através de emparelhamento de base complementar e, uma vez ligada ao local correto, atua enzimaticamente para clivar e inativar o RNA alvo. Clivagem de um RNA alvo de tal maneira destruirá sua capacidade de síntese direta de uma proteína codificada se a clivagem ocorre na sequência de codificação. Após uma ribozima ter sido ligada e clivado seu RNA alvo, 15 ela pode ser liberada desse RNA para se ligar e clivar novos alvos repetidamente.

Anidrase carbônica (carbonato desidratase)

A invenção proporciona métodos para regulação negativa ou diminuição da troca de dióxido de carbono (CO₂) e/ou água em uma célula20 guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo expressão, em uma célula, de um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica. Em aspectos alternativos, qualquer anidrase carbônica (carbonato desidratase) pode ser usada, por exemplo, 25 incluindo enzimas anidrase carbônica (carbonato desidratase) de planta ou bacterianas. Enzimas anidrase carbônica (carbonato desidratase) exemplificativas que podem ser usadas para praticar a presente invenção incluem enzimas anidrase carbônica (carbonato desidratase) isoladas ou derivada de:

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 80/196

Arroz (Oryza sativa)

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NM 001072308 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0sllg0153200), cds completa gill 15484228lreflNM_001072308.1l[l 15484228]

NM 001069944 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s09g0464000), cds completa gill 15479630lreflNM_001069944.1l[l 15479630]

NM 001069887 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s09g0454500), cds completa gilll5479516lreflNM_001069887.1l[115479516]

NM 001068550 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s08g0470200), cds completa gill 15476837lreflNM_001068550.1l[l 15476837]

NM 001068366 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s08g0423500), cds completa gill 15476469lreflNM_001068366.1l[l 15476469]

NM 001064586 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s06g0610100), cds completa gill 15468903lreflNM_001064586. II [115468903]

NM 001053565 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar japonica) (0s02g0533300), cds completa gill 15446500lreflNM_001053565.1l[l 15446500]

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Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 81/196

NM 001050212 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar iaponica) 0s01g0640000 (0s01g0640000), cds completa gilll5438794lreflNM_001050212.1l[l 15438794]

NM 001050211 (= Número de acesso ao Genbank) mRNA de Oryza sativa (grupo cultivar iaponica) 0s01g0639900 (0s01g0639900), cds parcial gilll5438792lreflNM_001050211.1l[115438792]

EF576561 mRNA de anidrase carbônica de Oryza sativa (grupo cultivar indica), clone OSS-385-480-G10, cds parcial gil 149392692lgblEF576561.11 [ 149392692]

AF182806 mRNA de anidrase carbônica 3 de Oryza sativa, cds completa gil5917782lgblAFl 82806.1IAF1828O6[5917782]

U08404 mRNA de anidrase carbônica de cloroplasto de Oryza sativa, cds completa gil606816lgblU08404.1IOSU08404[606816]

Milho: (zea mays)

NM 001111889 mRNA de anidrase carbônica de Zea mays (LOC542302) gil 162459146lreflNM_001111889. II [162459146]

U08403 mRNA de anidrase carbônica Bantam Golden de Zea mays, cds completa gil606814lgblU08403.1IZMU08403[606814]

U08401 mRNA de anidrase carbônica de Zea mays, cds completa gil606810lgblU08401.1IZMU08401[606810]

M95073 mRNA de homólogo de anidrase carbônica putativo de Zea mays, cds parcial gill68561lgblM95073.1IMZEORFN[168561]

Soja (Glycine)

AJ239132

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 82/196 mRNA de Glycine max para anidrase carbônica gil4902524lembl AJ239132.11 [4902524]

Tomate (Lycopersicon)

AJ849376 mRNA de Lycopersicon esculentum para anidrase carbônica de cloroplasto (gene ca2) gil56562176lemblAJ849376.1l[56562176]

AJ849375 mRNA de Lycopersicon esculentum para anidrase carbônica (gene cal) gil56562174lemblAJ849375.1l[56562174]

Nicotiana tabacum

AF492468 mRNA de Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae nectarina III (NEC3), cds completa gil29468279lgbl AF492468.11 [29468279]

AF454759 mRNA de anidrase beta-carbônica de Nicotiana tabacum (CA), cds completa; gene nuclear para produto de cloroplasto gil22550385lgblAF454759.2l[22550385]

AB009887 mRNA de Nicotiana tabacum para anidrase carbônica, cds parcial gil8096276ldbjlAB009887.1l[8096276]

AB012863 mRNA de Nicotiana paniculata para NPCA1, cds completa gil3061270ldbjlAB012863.1l[3061270]

L19255 mRNA de anidrase carbônica de cloroplasto de Nicotiana tabacum, extremidade 3' gil310920lgblL19255.1ITOBCARANHY[310920]

M94135

Gene de anidrase carbônica de cloroplasto de Nicotiana tabacum, cds completa gill70218lgblM94135.1ITOBCLCAA[170218]

AY974608 mRNA de anidrase carbônica de cloroplasto de Nicotiana benthamiana, clone 30F62,

Cds parcial; gene nuclear para produto de cloroplasto

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 83/196 gil62865756lgblAY974608.1l[62865756]

AY974607 mRNA de anidrase carbônica de cloroplasto de Nicotiana benthamiana, clone 30C84, cds parcial; gene nuclear para produto de cloroplasto gil62865754lgblAY974607. II [62865754]

AY974606 mRNA de anidrase carbônica de cloroplasto de Nicotiana benthamiana, clone 30B10, cds parcial; gene nuclear para produto de cloroplasto gi162865752Igb IAY974606.11 [62865752]

Cevada (Hordeum)

L36959 mRNA de anidrase carbônica de Hordeum vulgare, cds completa gil558498lgblL36959.1IBLYCA[558498]

Algodão (Gossypium)

AF132855 mRNA de anidrase carbônica de Gossypium hirsutum, isoforma 2 (CA2), cds parcial; gene nuclear para produto de plastídeo gil4754914lgblAFl 32855.1IAF132855 [4754914]

AF132854 mRNA de anidrase carbônica de Gossypium hirsutum, isoforma 1 (CAI), cds parcial; gene nuclear para produto de plastídeo gil4754912lgblAF132854.1IAF132854[4754912]

X

Alamo

U55837 mRNA de anidrase carbônica de Populus tremula x Populus tremuloides (CAI a), gene nuclear que codifica proteína de cloroplasto, cds completa gill354514lgblU55837.1IPTU55837[1354514]

U55838 mRNA de anidrase carbônica de Populus tremula x Populus tremuloides (CAlb), gene nuclear que codifica proteína de cloroplasto, cds completa gill354516lgblU55838.1IPTU55838[1354516]

Cucumis

DQ641132

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 84/196 mRNA de anidrase carbônica de Cucumis sativus, clone CU8F3, cds parcial gilll7663159lgblDQ641132.ll[l 17663159]

Lycopersicon

Medicago

X93312 mRNA de M. sativa para anidrase carbônica gill938226lemblX93312.1l[1938226]

Phaseolus

AJ547634 mRNA parcial de Phaseolus vulgaris para anidrase carbônica (gene ca) gil28556429lembl AJ547634.11 [28556429]

Pisum

X52558 mRNA do envoltório de ervilha para anidrase carbônica (EC 4.2.1.1) gil20672lemblX52558.1l[20672]

M63627 mRNA de anidrase carbônica de P. sativum, cds completa gil 169056lgblM63627.1IERVILHACAMRA[169056]

Pyrus

AF195204 mRNA de anidrase carbônica de Pyrus pyrifolia, gênero Whangkeumbae, isoforma 1 (CAI) cds completa gil8698882lgblAF195204.1IAF195204[8698882]

Prunus

EF640698 mRNA de anidrase carbônica de Prunus dulcis, clone Pdbcs-E45 putativo, cds parcial gill48807206lgblEF640698.1l[148807206]

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 85/196

Vigna

AF139464 mRNA de anidrase carbônica de Vigna radiata (CipCal), cds completa; gene nuclear para produto de cloroplasto gil8954288lgblAF139464.2IAF139464[8954288]

Ácidos nucleicos que codificam anidrase carbônica de qualquer gene de anidrase carbônica, por exemplo, incluindo genes de planta e bacterianos, podem ser usados para praticar a presente invenção; por 5 exemplo, um ácido nucleico de qualquer gene de anidrase carbônica de qualquer planta pode ser usados, incluindo qualquer sequência de ácido nucleico que codifica anidrase carbônica de qualquer família de gene de Arabidopsis, por exemplo, qualquer sequência de ácido nucleico que codifica anidrase carbônica de uma família Arabidopsis, por exemplo, de Arabidopsis 10 thaliana, pode ser usado para praticar as composições e métodos da presente invenção, tais como as sequências de ácido nucleico que codificam anidrase carbônica exemplificativas (veja Exemplo 6, abaixo):

Família de

gene	Número AGI^a	Nomenclatura oficial^b	designação
alfa (a)	At3g52720	AtaCAl	SEQ ID NO: 21
	At2g28210	AtaCA2	SEQ ID NO: 22
	At5g04180	AtaCA3	SEQ ID NO: 23
	At4g20990	AtaCA4	SEQ ID NO: 24
	Atlg08065	AtaCA5	SEQ ID NO: 25
	At4g21000	AtaCAÓ	SEQ ID NO: 26
	Atlg08080	AtaCA7	SEQ ID NO: 27
	At5g56330	AtaCA8	SEQ ID NO: 28
beta (β)	At3g01500	AtpCAl	CAI (SEQ ID NO: 7)
	At5gl4740	AtpCA2	CA2 (SEQ ID NO: 20)
	Atlg23730	AtpCA3	SEQ ID NO: 29
	Atlg70410	AtpCA4	CA4 (SEQ ID NO: 1)
	At4g33580	AtpCA5	SEQ ID NO: 30
	Atlg58180	AtpCAÓ	CA6 (SEQ ID NO: 4
gama (γ)	Atlgl9580	ΑίγϋΑΙ	SEQ ID NO: 31
	Atlg47260	ΑίγϋΑ2	SEQ ID NO: 32
	At5g66510	ΑίγϋΑ3	SEQ ID NO: 33
	At5g63510	AtyCALl	SEQ ID NO: 34
	At3g48680	AtyCAL2	SEQ ID NO: 35

a Números do locus do Arabidopsis thaliana Genome Initiative b De acordo com Fabre N. e colaboradores (2007) Plant, Cell Environment

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 86/196

30: 617-629; ou do web site The Arabidopsis Information Resource (Camegie Institution for Science, Department of Plant Biology, Stanford, CA, fundado pela National Science Foundation).

Consequentemente, em aspectos alternativos, qualquer anidrase carbônica (carbonato desidratase) pode ser usada para praticar a presente invenção.

X

Geração e Manipulação de Acido nucleicos

Em aspectos alternativos, a invenção proporciona, por exemplo, ácidos nucleicos isolados, sintéticos e/ou recombinantes que codificam novos genes sensores de CO2 e sequências de codificação da presente invenção, ácido nucleicos (por exemplo, siRNA, microRNA, antissenso) que podem inibir a expressão de genes sensores de CO2 ou mensagens e elementos regulatórios de transcrição específicos para célulasguarda, tais como promotores. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser feitos, isolados e/ou manipuladas, por exemplo, através de clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico através de PCR e semelhantes.

Os ácidos nucleicos usados para praticar a presente invenção, seja RNA, iRNA, ácido nucleico antissenso, cDNA, DNA genômico, vetores, vírus ou híbridos dos mesmos, podem ser isolados de uma variedade de fontes, geneticamente manipuladas, amplificadas e/ou expressas/geradas continuamente. Polipeptídeos recombinantes (por exemplo, glicosil hidrolases da invenção) gerados a partir desses ácidos nucleicos podem ser individualmente isolados ou clonados e testados com relação a uma atividade desejada. Qualquer sistema de expressão recombinante pode ser usado, incluindo sistemas de expressão de célula bacteriana, fúngica, de mamífero, levedura, inseto ou planta.

Altemativamente, esses ácidos nucleicos podem ser sintetizados in vitro através de técnicas de síntese química bem conhecidas

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 87/196 conforme descrito, por exemplo, em Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:

661; Belousov (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free

Radie. Biol. Med. 19: 373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 78867896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol.

68: 109; Beaucage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; Patente U.S. No. 4.458.066.

Técnicas para manipulação de ácido nucleicos tais como, por exemplo, subclonagem, sondas de rotulação (por exemplo, rotulação com iniciador aleatório usando Klenow polimerase, tradução nick, amplificação), sequenciamento, hibridização e semelhantes, são bem descritas 10 na literatura científica e de patente; veja, por exemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2^a ED.), Vols. 13, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND 15 MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Parte I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier,

N.Y. (1993).

Outro meio útil para obtenção e manipulação de ácido nucleicos usados para praticar os métodos da invenção é clonagem a partir de 20 amostras genômicas e, se desejado, selecionar e re-clonar insertos isolados ou amplificados, por exemplo, a partir de clones genômicos ou clones de cDNA. Fontes de ácido nucléico usadas nos métodos da invenção incluem bibliotecas de cDNA ou genômicas contidas, por exemplo, em cromossomas artificiais de mamífero (MACs), veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.721.118;

6.025.155; cromossomas artificiais humanos, veja, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15: 333-335; cromossomas artificiais de levedura (YAC); cromossomas artificiais bacterianos (BAC); cromossomas artificiais Pl; veja, por exemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; vetores Pl-derivados (PACs), veja, por exemplo, Kem (1997) Biotechniques 23: 120-124;

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 88/196 cosmídeos, vírus recombinantes, fagos ou plasmídeos.

A invenção proporciona proteínas de fusão e ácido nucleicos que codificam as mesmas. Um polipeptídeo da invenção pode ser fundido a um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo, tal como peptídeos de identificação 5 N-terminal, os quais conferem características desejadas, tais como detecção fluorescente, estabilidade aumentada e/ou purificação simplificada. Peptídeos e polipeptídeos da invenção podem também ser sintetizados e expressos como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados aos mesmos, por exemplo, para a produção de um peptídeo mais imunogênico, para isolar 10 mais prontamente um peptídeo recombinantemente produzido, para identificar e isolar anticorpos e células B expressando anticorpos e semelhantes. Domínios que facilitam a detecção e purificação incluem, por exemplo, peptídeos de quelação de metal, tais como tratos de polihistidina e módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre metais imobilizados, 15 domínios de proteína A que permitem a purificação sobre imunoglobulina imobilizada e o domínio utilizado no sistema de purificação por afinidade/extensão FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de sequências ligantes cliváveis, tais como Fator Xa ou enteroquínase (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o motivo 20 compreendendo peptídeo ou polipeptídeo, facilita a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de ácido nucleico que codifica epítopo ligada a seis resíduos de histidina, seguido por uma tioredoxina e um sítio de enteroquínase (veja por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 40425 414). Os resíduos de histidina facilitam a detecção e purificação, enquanto que o sítio de clivagem de enteroquínase proporciona um meio para purificação do epítopo a partir do restante da proteína de fusão. Tecnologia referente a vetores que codificam proteínas de fusão e aplicação de proteínas de fusão são bem descritos na literatura de patente e científica; veja por

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 89/196 exemplo, Kroll (1993) DNA Cell Biol., 12: 441-53.

Acido nucleicos ou sequências de ácido nucleico da invenção podem ser um oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo ou um fragmento de qualquer um desses, DNA ou RNA de origem genômica ou sintética o qual pode ser filamento duplo ou fita simples e pode representar uma fita senso ou antissenso, um ácido nucleico peptídico (PNA) ou qualquer material semelhante a DNA ou semelhante a RNA, natural ou de origem sintética. As frases “ácido nucleico” ou “sequência de ácido nucleico” incluem oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo ou um fragmento de qualquer um desses, DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, iRNA) de origem genômica ou sintética o qual pode ser fita simples ou filamento duplo e pode representar uma fita senso ou antissenso, um ácido nucleico peptídico (PNA) ou qualquer material semelhante a DNA ou semelhante a RNA, natural ou de origem sintética incluindo, por exemplo, iRNA, ribonucleoproteínas (por exemplo, iRNAs filamento duplo, por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucleicos, isto é, oligonucleotídeos, contendo análogos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas semelhantes a ácido nucleico com partes principais sintéticas; veja por exemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36: 86928698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6: 153-156. “Oligonucleotídeo” inclui um polideóxinucleotídeo fita simples ou duas fitas de polideóxinucleotídeo complementares que podem ser quimicamente sintetizadas. Tais oligonucleotídeos sintéticos não têm 5' fosfato e, assim, não se ligarão a outro oligonucleotídeo sem a adição de um fosfato com um ATP na presença de uma quinase. Um oligonucleotídeo sintético pode se ligar a um fragmento que não tenha sido desfosforilado.

Em aspectos alternativos, o termo gene significa o segmento de DNA envolvido em produção de uma cadeia polipeptídica; ele pode incluir

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 90/196 regiões que precedem e seguem a região de codificação (líder e trailer), bem como, onde aplicável, sequências intervenientes (íntrons) entre segmentos de codificação (exons). Operavelmente ligado pode se referir a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucleico (por exemplo, 5 DNA). Em aspectos alternativos, ele pode se referir à relação funcional da sequência regulatória de transcrição a uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma sequência de codificação, tal como um ácido nucleico da invenção, se ele estimula ou modula a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada ou outro 10 sistema de expressão. Em aspectos alternativos, sequências regulatórias de transcrição promotoras podem ser operavelmente ligadas a uma sequência transcrita, onde elas podem ser fisicamente contínuas à sequência transcrita, isto é, elas podem ser de czs-atuação. Em aspectos alternativos, sequências regulatórias de transcrição, tais como intensificadores, não precisam ser 15 fisicamente contínuas ou estar localizada em proximidade íntima com as sequências de codificação cuja transcrição elas intensificam.

Em aspectos alternativos, a invenção proporciona cassetes de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo da presente invenção, a qual pode ser capaz de afetar a expressão do ácido nucleico, por 20 exemplo, um gene estrutural (isto é, uma sequência de codificação de proteína da invenção) em um hospedeiro compatível com tais sequências. Cassetes de expressão podem incluir pelo menos um promotor operavelmente ligado com a sequência de codificação de polipeptídeo; e, em um aspecto, com outras sequências, por exemplo, sinais de término de transcrição. Fatores adicionais 25 necessários ou úteis para afetar a expressão também podem ser usados, por exemplo, intensificadores. Em aspectos alternativos, cassetes de expressão também incluem plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombinantes, qualquer forma de DNA nu recombinante e semelhantes. Em aspectos alternativos, um vetor da invenção pode compreender um ácido nucleico

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 91/196 que pode infectar, transfectar, transduzir transitória ou permanentemente uma célula. Em aspectos alternativos, um vetor pode ser um ácido nucleico nu ou um ácido nucleico em complexo com uma proteína ou lipídio. Em aspectos alternativos, vetores compreendem ácidos nucleicos e/ou proteínas e/ou 5 membranas virais ou bacterianas (por exemplo, uma membrana celular, um envoltório lipídico viral, etc.). Em aspectos alternativos, vetores incluem, mas não estão limitados a, replicons (por exemplo, replicons de RNA, bacteriófagos) aos quais fragmentos de DNA podem ser presos e serem reproduzidos. Vetores, assim, incluem, mas não estão limitados a, RNA, DNA 10 ou RNA circular ou linear de auto-replicação (por exemplo, plasmídeos, vírus e semelhantes; veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.217.879) e incluem os plasmídeos de expressão e não-expressão. Em aspectos alternativos, o vetor pode ser estavelmente reproduzido pelas células durante mitose como uma estrutura autônoma ou é incorporado dentro do genoma do hospedeiro.

Em aspectos alternativos, promotores usados para praticar a invenção incluem todas as sequências capazes de acionar a transcrição de uma sequência de codificação em uma célula, por exemplo, uma célula de planta. Assim, promotores usados nos construtos da invenção incluem elementos de controle transcricional de cA-atuação e sequências regulatórias que estão 20 envolvidas em regulação ou modulação do timing e/ou taxa de transcrição de um gene. Por exemplo, um promotor usado para praticar a presente invenção pode ser um elemento de controle transcricional de cA-atuação, incluindo um intensificador, um promotor, um terminador de transcrição, uma origem de replicação, uma sequência de integração cromossômica, regiões 25 não traduzidas 3' e 5' ou uma sequência intrônica, os quais estão envolvidos em regulação transcricional. Essas sequências de cA-atuação interagem, tipicamente, com proteínas ou outras biomoléculas para realizar (ativar/desativar, regular, modular, etc.) a transcrição. Promotores constitutivos usados para praticar a presente invenção podem ser aqueles

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 92/196 que acionam a expressão continuamente sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Promotores induzíveis ou reguláveis usados para praticar a presente invenção podem dirigir a expressão do ácido nucléico da invenção sob a influência de condições ambientais ou condições de desenvolvimento. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição através de promotores induzíveis usados para praticar a presente invenção incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, estiagem ou a presença de luz. Promotores tecido-específicos usados para praticar a presente invenção podem ser elementos de controle transcricionais que são ativos apenas em células ou tecidos ou órgãos particulares, por exemplo, em plantas ou animais. Regulação tecido-específica pode ser obtida por determinados fatores intrínsecos que asseguram que genes que codificam proteínas específicas a um determinado tecido são expressos.

Hibridização se refere ao processo pelo qual uma fita de ácido nucléico se une a uma fita complementar através de emparelhamento de base. Reações de hibridização podem ser sensíveis e seletivas, de modo que uma sequência de interesse particular pode ser identificada mesmo em amostras nas quais ela está presente em baixas concentrações. Condições adequadamente estringentes podem ser definidas, por exemplo, pelas concentrações de sal ou formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridização ou pela temperatura de hibridização e são bem conhecidas na técnica. Em particular, a estringência pode ser aumentada reduzindo a concentração de sal, aumentando a concentração de formamida ou elevando a temperatura de hibridização. Em aspectos alternativos, os ácidos nucleicos da invenção são definidos por sua capacidade de hibridizar sob várias condições de estringência (por exemplo, alta, média e baixa), conforme apresentado aqui.

Por exemplo, hibridização sob condições de alta estringência

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 93/196 poderia ocorrer em formamida a cerca de 50% em tomo de 37 °C a 42 °C.

Hibridização ocorrería sob condições de estringência reduzida em formamida a cerca de 35% a 35% em tomo de 30 °C a 35 °C. Em particular, hibridização poderia ocorrer sob condições de alta estringência a 42 °C em formamida a

50%, 5X SSPE, SDS a 0,3% e 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado. Hibridização poderia ocorrer sob condições de estringência reduzida conforme descrito acima, mas em formamida a 35% em uma temperatura reduzida de 35 °C. A faixa de temperatura correspondendo a um nível de estringência em particular pode ser ainda limitada calculando-se a 10 proporção de purina para pirimidina do ácido nucleico de interesse e ajustando a temperatura conforme desejado. Variações nas faixas e condições acima são bem conhecidas na técnica.

As homologias de sequência de proteína e/ou ácido nucleico podem ser avaliadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos e 15 programas de comparação de sequência conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, mas não estão limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85(8): 2444-2448, 1988; Altschul e colaboradores, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Thompson e colaboradores, Nucleic Acids Res. 20 22(2): 4673-4680, 1994; Higgins e colaboradores, Methods Enzymol. 266:

383-402, 1996; Altschul e colaboradores, J. Mol. Biol. 215(3): 403-410, 1990; Altschul e colaboradores, Nature Genetics 3: 266-272, 1993).

A homologia ou identidade é, frequentemente, medida usando um software de análise de sequência (por exemplo, O Pacote de Software de 25 Análise de Sequência do Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software combina sequências similares atribuindo graus de homologia a várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos homologia e identidade, no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 94/196 polipeptídeo, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas ou têm um percentual específico de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos que são os mesmos quando comparados e alinhados para correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região 5 designada usando qualquer um de uma série de algoritmos de comparação de sequência ou através de alinhamento manual e inspeção visual.

Um exemplo de um algoritmo útil são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul e colaboradores, Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402, 1977 e Altschul e colaboradores, J. Mol. Biol. 215: 40310 410, 1990, respectivamente. Software para realização de análises pelo BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de alto escore (HSPs) identificando palavras curtas de extensão W na sequência query, as quais são equivalentes ou satisfazem um escore T de 15 limiar com valor positivo quando alinhadas com uma palavra da mesma extensão em uma sequência de banco de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra vizinha (Altschul e colaboradores, supra). Esses hits de palavra vizinha iniciais atuam como sementes para iniciar buscas para descobrir HSPs mais longos contendo os mesmos. Os hits de palavra são 20 estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência, tanto quanto o escore de alinhamento cumulativo possa ser aumentado. Escores cumulativos são calculados usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos equivalentes; sempre >0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de escore é usada para calcular o 25 escore cumulativo. Extensão dos hits de palavra em cada direção é impedida quando: o escore de alinhamento cumulativo falha em uma quantidade X a partir de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo vai para zero ou abaixo em virtude do acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de escore negativo; ou o final de qualquer sequência é atingido. Os

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 95/196 parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa, como padrões, uma extensão de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa, como defaults, uma extensão de palavra de 3 e expectativas (E) de 10 e a matriz de escore BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915, 1989) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas.

Em um aspecto, as homologias de sequência de proteína e ácido nucleico são avaliadas usando o Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Em particular, cinco programas BLAST específicos são usados para desempenhar as seguintes tarefas:

(1) BLASTP e BLAST3 comparam uma sequência query de aminoácido contra um banco de dados de sequência de proteína;

(2) BLASTN compara uma sequência query de nucleotídeo contra um banco de dados de sequência de nucleotídeo;

(3) BLASTX compara os produtos de tradução conceituais de seis-redes de uma sequência query de nucleotídeo (ambas as fitas) contra um banco de dados de sequência de proteína;

(4) TBLASTN compara uma sequência query de proteína contra um banco de dados de sequência de nucleotídeo traduzido em todas as seis redes de leitura (ambas as fitas); e (5) TBLASTX compara as traduções de seis redes de uma sequência query de nucleotídeo contra as traduções de seis-redes de um banco de dados de sequência de nucleotídeo.

Polipeptídeos e peptídeos

Em um aspecto, a invenção proporciona polipeptídeos e peptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes tendo atividade sensora de

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CO2 ou polipeptídeos e peptídeos capazes de gerar um anticorpo que se liga especificamente a um sensor de CO2, incluindo um sensor de CO2 da presente invenção, incluindo as sequências de aminoácido da invenção, as quais incluem aquelas tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,

57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,

70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,

83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,

96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou 100% (completa) de identidade de sequência a um polipeptídeo sensor de CO2 exemplificativo da invenção.

Por exemplo, sequências exemplificativas da presente invenção incluem:

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 97/196 xf00

o

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QO

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Ο

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ΓΟΟ

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QO QO

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o <N

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ο <N

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Polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser isolados de fontes naturais, podem ser polipeptídeos sintéticos ou recombinantemente gerados. Peptídeos e proteínas podem ser recombinantemente expressos in vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos da invenção podem ser feitos e isolados usando qualquer método conhecido na técnica. Polipeptídeos e peptídeos da invenção podem também ser sintetizados, no todo ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica. Veja por exemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Hom (1980) Nucleic Acid Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA. Por exemplo, síntese de peptídeo pode ser realizada usando várias técnicas de fase sólida (veja por exemplo, Roberge (1995) Science 269: 202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289: 3-13) e síntese automática de DNA pode ser obtida, por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Os peptídeos e polipeptídeos da invenção também podem ser glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós-traducionalmente, seja através de mecanismos celulares ou quimicamente, em que o primeiro incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, os quais podem ser nativos à sequência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na sequência de codificação de ácido nucleico. A glicosilação pode ser O-ligada ou N-ligada.

Em aspectos alternativos, aminoácidos e/ou sequências de aminoácido da presente invenção incluem uma sequência de oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou proteína ou um fragmento, porção ou subunidade de qualquer um desses e moléculas sintéticas e que ocorrem naturalmente. Em aspectos alternativos, os polipeptídeos d antígeno são aminoácidos unidos uns aos outros através de ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas e

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 105/196 podem conter outros aminoácidos modificados que não os 20 aminoácidos gene-codificados. Os polipeptídeos podem ser modificados através de processos naturais, tal como processamento pós-traducional ou através de métodos de modificação química que são bem conhecidos na técnica.

Modificações podem ocorrer em qualquer parte no polipeptídeo, incluindo a parte principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e o carbóxi ou amino término. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variados em diversos locais em um determinado polipeptídeo. Também, um determinado polipeptídeo pode ter 10 quaisquer tipos de modificações. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, fixação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização com ligação cruzada, formação 15 de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação e 20 adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, tal como arginilação. Veja, por exemplo, Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2^a Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, páginas 1-12 (1983).

Os peptídeos e polipeptídeos da invenção, conforme definido acima, incluem todas as formas miméticas e peptidomiméticas. Os termos mimético e peptidomimético se referem a um composto químico sintético o qual tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipeptídeos da invenção. O mimético pode ser totalmente

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 106/196 composto de análogos sintéticos não naturais de aminoácidos ou é uma molécula quimérica de aminoácidos peptídicos parcialmente naturais e análogos parcialmente não naturais de aminoácidos. O mimético também pode incorporar qualquer quantidade de substituições conservativas de 5 aminoácido natural, na medida em que tais substituições também não alterem substancialmente a estrutura e/ou atividade do mimético. Conforme com os polipeptídeos da invenção, os quais são variantes conservativas, experimentação de rotina determinará se um mimético está dentro do escopo da invenção, isto é, se sua estrutura e/ou função não é substancialmente 10 alterada. Assim, em um aspecto, uma composição mimética está dentro do escopo da invenção se ela tem uma atividade sensora de CO2.

Composições miméticas de polipeptídeo da invenção podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais. Em um aspecto alternativo, composições miméticas da invenção incluem um ou todos 15 dos três grupos estruturais a seguir: a) outros grupos de ligação a resíduo que não a ligação de amida natural (“ligação peptídica”); b) resíduos não naturais em lugar de resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente; ou c) resíduos os quais induzem à imitação estrutural secundária, isto é, induzem ou estabilizam uma estrutura secundária, por exemplo, uma beta volta, gama 20 volta, beta folha, conformação de alfa hélice e semelhantes. Por exemplo, um polipeptídeo da invenção pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos são unidos através de outros meios químicos que não ligações peptídicas naturais. Resíduos peptidomiméticos individuais podem ser unidos através de ligações peptídicos, outras ligações químicas ou 25 meios de acoplamento tais como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de Nhidróxi-succinimida, maleimidas bifuncionais, N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou Ν,Ν’-diisopropilcarbodiimida (DIC). Grupos de ligação que podem ser alternativos à ligação de amida tradicional (ligação peptídica) incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-),

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 107/196 aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2-S), tetrazola (CN₄-), tiazola, retroamida, tioamida ou éster (veja, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, Peptides and Proteins, Vol. 7, páginas 267-357, “Peptide Backbone Modifications,” Marcell Dekker, NY).

Um polipeptídeo da invenção pode também ser caracterizado como um mimético por conter todos ou alguns resíduos não naturais em lugar dos resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente. Resíduos não naturais são bem descritos na literatura científica e de patente; umas poucas composições não naturais exemplificativas úteis como miméticos de resíduos de aminoácido natural e diretrizes são fornecidas abaixo. Miméticos de aminoácidos aromáticos podem ser gerados através de substituição, por exemplo, de D- ou L-naftilalanina; D- ou L- fenilglicina; D- ou L-2 tienilalanina; D- ou L-l, -2, 3- ou 4- pirenilalanina; D- ou L-3 tienilalanina; D- ou L-(2-piridinil)-alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2pirazinil)-alanina; D- ou L-(4-isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- ou Lp-bifenilfenilalanina; D- ou L-p-metóxi-bifenilfenilalanina; D- ou L-2indol(alquil)alaninas; e, D- ou L-alquilalaninas, onde alquila pode ser metila, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-butila, sec-butila, isopentila substituída ou não substituída ou aminoácidos não ácidos. Anéis aromáticos de um aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pirazolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila e piridilapiridila.

Miméticos de aminoácidos ácidos podem ser gerados através de substituição, por exemplo, por exemplo, com aminoácidos de nãocarboxilato, enquanto se mantém uma carga negativa (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Grupos laterais carboxila (por exemplo, aspartila ou glutamila) podem também ser seletivamente modificados através de reação

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 108/196 com carbodiimidas (R’-N-C-N-R’) tais como, por exemplo, l-ciclohexil-3(2morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou l-etil-3(4-azônia-4,4-dimetolpentil) carbodiimida. Aspartila ou glutamila pode também ser convertida em resíduos de asparaginila e glutaminila através de reação com íons de amônio.

Miméticos de aminoácidos básicos podem ser gerados através de substituição, por exemplo, (além de lisina e arginina), com os aminoácidos omitina, citrulina ou ácido (guanidino)-acético ou ácido (guanidino)alquil-acético, onde alquila é definida acima. Derivados de nitrila (por exemplo, contendo a porção CN em lugar de COOH) podem ser substituídos por asparagina ou 10 glutamina. Resíduos de asparaginila e glutaminila podem ser deaminados aos resíduos de aspartila ou glutamila correspondentes. Miméticos de resíduos de arginina podem ser gerados através de reação, por exemplo, com um ou mais reagentes convencionais incluindo, por exemplo, fenilglioxal, 2,3butanodiona, 1,2-ciclo-hexanodiona ou niidrina, de preferência sob condições 15 alcalinas. Miméticos de resíduo de tirosina podem ser gerados através de reação de tirosila, por exemplo, com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Miméticos de resíduos de cisteína podem ser gerados através de reação de 20 resíduos de cisteína, por exemplo, com alfa-haloacetatos, tais como ácido 2cloroacético ou cloroacetamida e aminas correspondentes; para proporcionar derivados de carbóximetila ou carbóxiamidometila. Miméticos de resíduo de cisteína também podem ser gerados através de reação de resíduos de cisteína, por exemplo, com bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(525 imidozoil) propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfeto de metil 2-piridila; p-cloromercúrio-benzeno; 2-cloromercúrio-4-nitrofenol; ou cloro-7 -nitrobenzo-oxa-1,3 -diazola.

Miméticos de lisina podem ser gerados (e resíduos amino terminais podem ser alterados) através de reação de lisinila, por exemplo, com ácido succínico ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 109/196 outros anidridos de ácido carboxílico. Miméticos de resíduos contendo lisina e outros alfa-amino também podem ser gerados através de reação com imidoésteres, tais como picolinimidato de metila, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitro-benzeno-sulfônico, O-metilisouréia,

2,4, pentanodiona e reações catalisadas por transamidase com glioxilato.

Miméticos de metionina podem ser gerados através de reação, por exemplo, com sulfóxido de metionina. Miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, 3- ou 4-hidróxi prolina, dehidroprolina, 3- ou 4-metilprolina ou 3,3,-dimetilprolina. Miméticos de 10 resíduo de histidina podem ser gerados através de reação de histidila, por exemplo, dietilprocarbonato ou brometo de para-bromofenacila. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados através de hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos hidroxila de resíduos de serila ou treonila; metilação dos grupos alfa-amino de Usina, arginina e histidina; 15 acetilação da amina N-terminal; metilação de resíduos de amida de cadeia principal ou substituição com N-metil aminoácidos; ou amidação de grupos carboxila C-terminais.

A invenção também proporciona métodos para modificação dos polipeptídeos da invenção, seja através de processos naturais, tal como 20 processamento pós-traducional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc.) ou através de técnicas de modificação química e os pofipeptídeos modificados resultantes. Modificações podem ocorrer em qualquer parte no pofipeptídeo, incluindo a parte principal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e o carbóxi ou amino término. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação 25 pode estar presente no mesmo ou em graus variados em diversos locais em um determinado pofipeptídeo. Também, um determinado pofipeptídeo pode ter quaisquer tipos de modificações. Modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma porção heme, fixação covalente de um nucleotídeo ou

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 110/196 derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, fixação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização com ligação cruzada, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações cruzadas covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação e adição de aminoácidos mediada por RNA de transferência a proteínas, tal como arginilação. Veja, por exemplo, Creighton, T.E., Proteins - Structure and Molecular Properties 2^a Ed., W.H. Freeman and Company, New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, páginas 1-12 (1983).

Métodos de síntese química de peptídeo em fase sólida também podem ser usados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos da invenção. Tais métodos são conhecidos na técnica desde 1960 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963) (veja também Stewart, J. M. e Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2^a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, 111., páginas 11-12)) e foram recentemente empregados em kits de design e síntese de peptídeo para laboratório comercialmente disponíveis (Cambridge Research Biochemicals). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis tem utilizado, em geral, os ensinamentos de Η. M. Geysen e colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81: 3998 (1984) e proporcionam a síntese de peptídeos sobre as pontas de hastes ou pinos, todos os quais estão conectados a uma única placa. Quando tal sistema é utilizado, uma placa de hastes ou pinos é invertida e inserida em uma segunda placa de cavidades ou reservatórios correspondentes, a qual contém soluções para fixação ou ancoragem de um aminoácido apropriado às pontas do pino ou haste. Repetindo tal etapa de processo, isto é, invertendo e inserindo as pontas da

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 111/196 haste e pino em soluções apropriadas, aminoácidos são desenvolvidos em peptídeos desejados. Além disso, uma série de sistemas de síntese de peptídeo FMOC estão disponíveis. Por exemplo, montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser realizado sobre um suporte sólido usando um sintetizador de peptídeo automático Applied Biosystems, Inc. Modelo 431 A™. Tal equipamento proporciona pronto acesso aos peptídeos da invenção, seja através de síntese direta ou através de síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados usando outras técnicas conhecidas.

A invenção inclui polipeptídeos da invenção com e sem sequências sinalizadoras, isto é, sequências líderes. O polipeptídeo compreendendo uma sequência sinalizadora da invenção pode ser um sensor de CO2 da invenção ou outro sensor de CO2 ou outra enzima ou outro polipeptídeo.

Anticorpos e métodos de seleção baseados em anticorpo

A invenção proporciona anticorpos isolados, sintéticos ou recombinantes que se ligam especificamente a um sensor de CO2 da invenção. Esses anticorpos podem ser usados para isolar, identificar ou quantificar os polipeptídeos sensores de CO2 da invenção ou polipeptídeos relacionados. Esses anticorpos podem ser usados para isolar outros polipeptídeos dentro do escopo da invenção ou outros sensores de CO2 relacionados. Os anticorpos podem ser criados para se ligar a um sítio ativo de um sensor de CO2. Assim, a invenção proporciona métodos de inibição de sensor de CO2 usando os anticorpos da invenção.

A invenção proporciona fragmentos das enzimas da invenção, incluindo fragmentos imunogênicos de um polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona composições compreendendo um polipeptídeo ou peptídeo da invenção e adjuvantes ou veículos e semelhantes.

Os anticorpos podem ser usados em imunoprecipitação, coloração, colunas de imunoafinidade e semelhantes. Se desejado, sequências

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 112/196 de ácido nucleico que codificam antígenos específicos podem ser geradas através de imunização, seguido por isolamento do polipeptídeo ou ácido nucleico, amplificação ou clonagem e imobilização do polipeptídeo sobre um arranjo da invenção. Altemativamente, os métodos da invenção podem ser 5 usados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula a ser modificada, por exemplo, a afinidade de um anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a capacidade de fazer ou modificar anticorpos pode ser um fenótipo manipulado em uma célula através dos métodos da invenção.

Em aspectos alternativos, um anticorpo da invenção inclui um peptídeo ou polipeptídeo derivado, modelado após ou substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina ou fragmentos dos mesmos, capaz de se ligar especificamente a um antígeno ou epítopo; veja, por exemplo Fundamental Immunology, Terceira Edição, W.E.

Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175: 267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97. O termo anticorpo inclui porções de ligação a antígeno, isto é, sítios de ligação a antígeno (por exemplo, fragmentos, subsequências, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) que retêm capacidade de se 20 ligar a antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados, através de uma ligação de dissulfeto, na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo dos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo dos 25 domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e colaboradores, (1989) Nature 341: 544-546), o qual consiste de um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada. Anticorpos com uma única cadeia são também incluídos por referência no termo anticorpo.

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100

Métodos de imunização, produção e isolamento de anticorpos (policlonais e monoclonais) são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica e descritos na literatura científica e de patente; veja, por exemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7^a ed.) Lange Medicai Publications, Los Altos, CA (“Stites”); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2^a ed.) Academic Press, New York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256: 495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York. Anticorpos também podem ser gerados in vitro, por exemplo, usando expressão em sítio de ligação de anticorpo recombinante de bibliotecas de phage display, além dos métodos in vivo tradicionais usando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45.

Arranjos ou “Biolascas”

Ácido nucleicos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser imobilizados a ou aplicados a um arranjo, por exemplo, uma “biolasca”. Arranjos podem ser usados para selecionar ou monitorar bibliotecas de composições (por exemplo, pequenas moléculas, anticorpos, ácidos nucleicos, etc.) com relação à sua capacidade de se ligar a ou modular a atividade de um ácido nucleico ou polipeptídeo da invenção. Por exemplo, em um aspecto da invenção, um parâmetro monitorado é expressão de transcrição de um gene sensor de CO2. Um ou mais ou todos os transcriçãos de uma célula podem ser medidos através de hibridização de uma amostra compreendendo transcriçãos da célula ou ácidos nucleicos representativos de ou complementares aos transcriçãos de uma célula, através de hibridização a ácidos nucleicos imobilizados sobre um arranjo ou biolasca. Usando um arranjo de ácidos nucleicos sobre uma microlasca, alguns ou todos os transcriçãos de uma

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101 célula podem ser simultaneamente quantificados. Altemativamente, arranjos compreendendo ácido nucléico genômico também podem ser usados para determinar o genótipo de uma cepa recentemente manipulada feita através dos métodos da invenção. Arranjos de polipeptídeo também podem ser usados para quantificar simultaneamente uma pluralidade de proteínas. A presente invenção pode ser praticada com qualquer arranjo conhecido, também referido como um microarranjo ou arranjo de ácido nucléico ou arranjo de polipeptídeo ou arranjo de anticorpo ou biolasca ou variações dos mesmos. Arranjos são genericamente uma pluralidade de pontos ou elementos alvo, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizadas sobre uma área definida da superfície de um substrato para ligação específica a uma molécula de amostra, por exemplo, transcriçãos de mRNA.

Os termos arranjo ou microarranjo ou biolasca ou lasca, conforme usado aqui, são uma pluralidade de elementos alvo, cada elemento alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucleicos imobilizados sobre uma área definida da superfície de um substrato, conforme discutido em maiores detalhes abaixo.

Na prática dos métodos da invenção, qualquer arranjo conhecido e/ou método de produção e uso de arranjos pode ser incorporado, no todo ou em parte, ou variações dos mesmos conforme descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606;

6.054.270;	6.048.695;	6.045.996;	6.022.963;	6.013.440;	5.965.452;
5.959.098;	5.856.174;	5.830.645;	5.770.456;	5.632.957;	5.556.752;
5.143.854;	5.807.522;	5.800.992;	5.744.305;	5.700.637;	5.556.752;

5.434.049; veja também, por exemplo, WO 99/51773; WO 99/09217; WO

97/46313; WO 96/17958; veja também, por exemplo, Johnston (1998) Curr.

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102

Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kem (1997) Biotechniques 23: 120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes,

Chromosomes & Câncer 20: 399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21: 25-32. Veja também Pedidos de Patente U.S. Publicados Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Kits e Bibliotecas

A invenção proporciona kits compreendendo composições e métodos da invenção, incluindo células e/ou polipeptídeos da invenção, sequências alvo, agentes de transfecção, agentes de transdução, instruções (com relação aos métodos da invenção) ou qualquer combinação dos mesmos. Como tal, kits, células, vetores e semelhantes são proporcionados aqui.

A invenção proporciona composições e métodos para modulação do tamanho e/ou estatura de uma planta, por exemplo, incluindo modulação seletiva, por exemplo, de uma planta inteira ou uma porção particular de uma planta ou taxa de crescimento ou vigor da muda, os quais permitem a produção de plantas melhor adequadas para uma indústria em particular. Por exemplo, reduções na altura de safras e espécies de árvore específicas pode ser benéfica para permitir fácil colheita. Altemativamente, aumento da altura, espessura ou tamanho de órgão, número de órgão, podem ser benéficos para fornecimento de mais biomassa útil para processamento em alimento, ração, combustíveis e/ou produtos químicos. Outros exemplos de traços comercialmente desejáveis incluem aumento do comprimento dos caules florais de flores de corte, aumento ou alteração do tamanho e formato da folha ou intensificação do tamanho de sementes e/ou frutos. Alterações no tamanho de órgão, número de órgão e biomassa também resultam em alterações na massa de moléculas constituintes, tais como produtos secundários, e conversão das plantas em unidades para esses compostos. Assim, as composições e métodos da invenção podem ser usados para

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103 modular o tamanho da planta, crescimento vegetativo, taxa de crescimento da planta, número de órgão, arquitetura da planta e/ou biomassa.

A invenção será ainda descrita com referência aos exemplos a seguir; contudo, deve ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1; Manipulação de troca de água e dióxido de carbono (CO2) através de estômatos da planta por meio de controle de genes sensores de CO2 da invenção

A invenção proporciona métodos para manipulação da troca de água e dióxido de carbono (CO2) através de estômatos da planta por meio de controle de CO2 sensor genes da presente invenção.

Um mutante duplo de Arabidopsis thaliana foi construído: esse mutante duplo carece da expressão de comprimento total de dois genes homólogos que são altamente expressos em células-guarda do tipo silvestre, de acordo com análises de microarranjo célula-específicas.

O mutante duplo de Arabidopsis thaliana carece de expressão de comprimento total de genes homólogos altamente expressos em célulasguarda do tipo silvestre, de acordo com análises de microarranjo célulaespecíficas. O mutante duplo CO2Sen mostra uma resposta estomatal defectiva, conforme medido através de análise de troca de gás em tempo real com relação as alterações no [CO2]; no que se refere as alterações de 365 ppm de CO2 ambiente para 800 ppm de CO2 elevado e de 800 ppm de CO2 para 100 ppm de CO2 reduzido. As proteínas codificadas do tipo CO2sens se ligam ao CO2.

A Figura 1 ilustra graficamente dados mostrando a condutância estomatal em Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia do tipo silvestre e o mutante duplo sensor de CO2. 365 ppm de CO2 ambiente 0-1800 segundos, 800 ppm de CO2 1800-3600 segundos, 100 ppm de CO2 3600Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 117/196

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9000.

A Figura 2 ilustra vários níveis de expressão em diferentes estágios de desenvolvimento de células-guarda (GC):

A Figura 2A: vários níveis de expressão em diferentes estágios de GCs.

A Figura 2B: Expressão de 27-GUS em folha jovem e caules.

A Figura 2C: Expressão de 27-GUS a nível superior de hipocótilo.

A Figura 2D: Expressão de 27-GUS em caule e borda da folha.

A Figura 2E & Figura 2F: Quatro lábios no tipo silvestre.

A Figura 3 ilustra a expressão de 27-YC3.6 (SEQ ID NO: 10) em GC sobre o caule de folhas adjacentes, mas não na folha muito jovem (sublinhado) (A & A’). 27-YC3.6 é expresso principalmente em GC madura, muito fracamente em GC jovem ou imatura (seta branca em B & B’). 27YC3.60 (SEQ ID NO: 11) é também expresso em GCs sobre o hipocótilo (C & C’). 27-YC3.6 (SEQ ID NO: 10) é também expresso em GCs sobre as sépalas (D & D’).

Exemplo 2; Caracterização de receptores de CO2 que controlam a captação de CO2 pela planta e eficiência de uso de água

A invenção proporciona composições e métodos para controle da abertura e/ou fechamento dos poros estomatais de planta. Poros estomatais são formados por pares de células-guarda na epiderme de folhas e permitem o controle da perda de água pela planta e influxo de dióxido de carbono (CO2) em plantas. A invenção proporciona composições e métodos para controle da quantidade de CO2 captado para fixação de carbono fotossintética e da quantidade de água perdida através do processo de transpiração por meio desses poros estomatais controlados. A invenção proporciona composições e métodos para fornecimento de mecanismos de transdução de sinal em células-guarda para captar os níveis de CO2, estado de água, luz e outros

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105 estímulos ambientais a fim de regular as aberturas estomatais para otimização do influxo de CO2, perda de água e crescimento da planta sob condições diversas.

A invenção proporciona composições e métodos para sensibilização das plantas a altos níveis de CO2 para disparar o fechamento estomatal e sensibilizar as plantas a baixos níveis de CO2 para induzir à abertura estomatal. Em um aspecto, as composições e métodos da invenção são usados para auxiliar na captura de [CO2] atmosférico (o que, em um aspecto, é realizado através de inibição da expressão de proteínas de resposta 10 ao CO2 in vivo ou in situ), por exemplo, para aliviar níveis crescentes de [CO2] atmosférico, os quais são previsto como duplicando dentro do século atual. Em um aspecto, as composições e métodos da invenção aliviarão o efeito de fechamento estomatal por níveis crescentes de [CO2] atmosférico (o que, em um aspecto, é realizado através de intensificação da expressão de 15 proteína de resposta ao CO2 in vivo ou in situ), notando que aumentos no CO2 ambiente reduzirão as aberturas estomatais de diferentes espécies de planta em até 40%. Em um aspecto, as composições e métodos da invenção podem ser usados para aliviar os efeitos profundos sobre a troca de gás, fixação de carbono, temperatura da folha e/ou eficiência de uso de água de plantas 20 causados, por exemplo, em uma escala global, pelos níveis crescentes de [CO2] atmosférico.

Pela primeira vez, mutantes que mostram insensibilidade ao CO2 em respostas estomatais ao CO2, mas não prejudicam as respostas ao ácido abscísico, foram feitos e caracterizados pelos inventores usando análise 25 de microarranjo específico para células-guarda, a presente invenção identificou um mutante duplo em dois genes homólogos denominados: proteína 1 de resposta ao CO2 (CORP1), também designado “CAI” ou At3g01500 ou SEQ ID NO: 7; e proteína 2 de resposta ao CO2 (CORP2), também designado “CA4” ou Atlg70410 ou SEQ ID NO: 1; ambos os quais

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106 são altamente expressos em células-guarda de plantas Arabidopsis. Enquanto que mutantes com knockout simples não mostram fenótipo, plantas mutantes duplo nesses dois genes mostraram uma forte deficiência no fechamento estomatal induzido por CO2, comparado com plantas do tipo 5 silvestre (wt), conforme ilustrado na Figura 4a. Estudos mostram a complementação desse fenótipo de CO2 através de expressão transgênica do cDNA de CORP1 (SEQ ID NO: 7), conforme ilustrado na Figura 4b. A Figura 4a e Figura 4b ilustram as condutâncias estomatais relativas do mutante duplo (corpl corp2), WT (tipo silvestre) e (b) uma linhagem 10 transgênica complementada (CORP1/ corpl corp2) expressando CORP1 em resposta a alterações nas concentrações de CO2 (eixo X: ppm de [CO2]).

Proteínas CORP se ligam ao CO2. corpl (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 7) e corp2 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 1) são também expressas em outras células de planta. Plantas mutantes 15 duplo corpl/corp2 não mostram ruptura de outras vias de sinalização importantes em células-guarda, incluindo fechamento estomatal induzido pelo hormônio estiagem-induzido, ácido abscísico (ABA), conforme ilustrado na Figura 4c. A Figura 4(c) ilustra graficamente dados demonstrando a resposta intacta do mutante duplo SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1 ou corpl/corp2 e 20 plantas do tipo silvestre ao ácido abscísico (ABA).

Esses dados demonstram que CORP1 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 7) e CORP2 (SEQ ID NO: 1) funcionam como receptores de CO2 em células-guarda que controlam a troca de gás global da planta e obtêm uma compreensão dos mecanismos moleculares que mediam a 25 transdução de sinal de CO2 via CORP1 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 7) e CORP2 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 1) em célulasguarda.

Em outro aspecto, para facilitar análises de localização(ões) subcelular(es) de proteínas CORP, incluindo as proteínas CORP da presente

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107 invenção, por exemplo, proteínas CORP1 e CORP2, a invenção também proporciona tags N- e C-terminais (por exemplo, fusões YFP) com proteínas CORP, incluindo as proteínas CORP da presente invenção, por exemplo, CORP1 e CORP2. Essas proteínas CORP rotuladas são introduzidas em 5 plantas do tipo silvestre e mutante duplo corpl corp2. Localização celular e complementação simultânea são analisadas.

Em outro aspecto, genes que codificam CORP, tais como ácidos nucleicos da presente invenção que codificam proteínas CORP, por exemplo, corp 1 e corp 2, são operavelmente ligados a várias sequências 10 regulatórias transcricionais, por exemplo, promotores, tais como sequências regulatórias de transcrição específicas para células-guarda, por exemplo, promotores células-guarda específicos da presente invenção. Esses ácidos nucleicos são usados para determinar se CORP1 e/ou CORP2 podem ser expressas em células-guarda para sinalização estomatal funcional de CO₂; por 15 exemplo, se CORP1 e/ou CORP2 sozinhas ou juntas são suficientes para sinalização estomatal funcional de CO₂ em uma célula, tecido ou órgão de planta.

Em um aspecto, a invenção introduz esses dois genes sob o controle de um promotor células-guarda específico, por exemplo, sequências 20 regulatórias de transcrição células-guarda específicas da presente invenção, por exemplo, promotores células-guarda específicos da presente invenção, promotores célula de mesófilo específicos e/ou o promotor ecotópico 35S, em plantas mutante duplo corpl corp2 para determinar o requisito célulaespecífico para complementação da resposta deficiente ao CO₂. Análises de 25 troca de gás e transdução de sinalização estomatal são conduzidas para essa finalidade. Dados mostraram que esses receptores funcionam em sinalização de CO₂ estomatal em células-guarda.

Em um aspecto, a invenção se caracteriza por mecanismos de sinalização de CO₂ mediados por proteínas CORP, por exemplo, usando

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108 ácidos nucleicos que codificam CORP da presente invenção e, em um método exemplificativo, proteínas de interação CORP são isoladas de células de planta, bactéria ou outras. Em um aspecto, os métodos compreendem o uso de sistemas de seleção de levedura com dois híbridos, seleção em um sistema de 5 divisão de ubiquitina e/ou sistemas de co-imunoprecipitação usando, por exemplo, proteínas COPR YFP-rotuladas (ou equivalentemente rotuladas). As funções de agentes de interação CORP na transdução de sinal de CO₂ são identificadas e analisadas.

Em um aspecto, a invenção proporciona células, tecidos, 10 órgãos e/ou linhagens de célula superexpressando CORP tipo de célulaespecífica, por exemplo, para analisar a eficiência de uso de água de plantas em diferentes concentrações de CO₂ e manipular eficiência de uso de água aprimorada em Arabidopsis e selecionar safras econômicas importantes, por exemplo, economicamente importantes, para fixação de carbono. Dados 15 mostram um aumento de mais de cinquenta por cento (>50 %) na eficiência de uso de água em Arabidopsis através de superexpressão de CORP (usando ácidos nucleicos que codificam corp da presente invenção).

Complementação do mutante duplo dos dois genes homólogos, proteína 1 de resposta ao CO₂ (CORP1), também designado “CAI” ou 20 At3g01500 ou SEQ ID NO: 7; e proteína 2 de resposta ao CO₂ (CORP2), também designado “CA4” ou Atlg70410 ou SEQ ID NO: 1, foi feita. Nós medimos o índice estomatal de plantas complementadas e plantas de superexpressão. Conforme ilustrado na Figura 5A e Figura 5B, CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) podem complementar esses mutantes duplos 25 em graus variados. Superexpressão de CAI diminui o índice estomatal. Um índice estomatal é definido como: (número de estômatos por mm² x 100)/(número de estômatos por mm² + número de células epidérmicas por mm²; ou, altemativamente: índice estomatal (I) = [S / (E+S)] * 100, onde S é o número de estômatos por área unitária e E é o número de células

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109 epidérmicas pela mesma área unitária. Esse valor de índice estomatal pode ser útil em comparação de folhas de diferentes tamanhos; umidade relativa e intensidade de luz durante desenvolvimento da folha, que afetam o valor do índice estomatal.

A troca de gás e eficiência de uso de água (WUE) das plantas complementadas com CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) foram também medidos. A troca de gás e WUE das plantas são medidas pela manhã. Resultados exemplificativos são analisados e mostrados na Figura 6, mostrando a condutância estomatal relativa; onde esses resultados são resumidos e graficamente ilustrados na Figura 7.

A Figura 8 ilustra fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em plantas complementadas, em particular em folhas e células-guarda e em células de mesófilo.

As Figuras 9A e 9B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)). As Figuras 9C, 9D e 9E ilustram dados de um sensor de CO₂mostrando a regulação deficiente de CO₂ de troca de gás; nota: Condição de luz = luz vermelha (50 pmoles-m ²-s '), luz azul (6 pmoles-m ²-s ').

A Figura 10A ilustra graficamente um resumo de dados mostrando a resposta intacta ao ácido abscísico no mutante duplo calca4 (CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)). A Figura 10B ilustra graficamente um resumo de dados mostrando que um inibidor de CAI (SEQ ID NO: 7) e/ou CA4 (SEQ ID NO: 1) imita a insensibilidade ao CO₂ em plantas do tipo silvestre (WT).

As Figuras 11A e 11B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID

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NO: 1)) e a Figura 11C ilustra dados mostrando que DNA genômico de genes

CAI (SEQ ID NO: 7) ou CA4 (SEQ ID NO: 1) pode complementar a resposta ao CO2 sob diferentes condições de luz: luz vermelha (50 pmoles-m ²-s '), luz azul (6 pmole-m ^s¹).

As Figuras 12A, 12B e 12C ilustram graficamente um resumo de dados mostrando que a fotossíntese não é prejudicada em plantas duplo mutantes calca4 com knockout de sensor de CO2: luz durante período préadaptação, antes de medições, antes de medição de fluorescência PS: 50 pmoles/m²/s: 88% luz vermelha, 12% luz azul; 2000 pmoles/m²/s: 90% luz vermelha, 10% luz azul. A Figura 12D ilustra a taxa de assimilação de CO2 no escuro e em luz vermelha: 300 pmoles-m ^s¹).

As Figuras 13A, 13B e 13C ilustram, graficamente e por meio de fotografias, que folhas alvejadas com fotossíntese prejudicada mostram regulação de troca de gás intacta por CO2.

As Figuras 14A e 14B ilustram fotomicrografias de Northem blots mostrando o nível de expressão de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) em knockouts duplos (de CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1)); e as Figuras 14C e 14D ilustram, graficamente e por meio de fotografia, que plantas superexpressando sensor de CO2, onde CAI (SEQ ID NO: 7) e CA4 (SEQ ID NO: 1) são operavelmente ligados a promotores células-guarda objetivados da presente invenção, mostrando eficiência de uso de água (WUE) intensificada. Na Figura 14D, os dados não mostram efeito observado sobre o momento de floração.

Exemplo 3; Isolamento e caracterização de um promotor de célulasguarda forte de Arabidopsis e seu uso como um ativador transcricional em células-guarda

A invenção proporciona ativadores transcricionais que são muito ativos em células-guarda de planta; incluindo ativadores transcricionais células-guarda específicos, tais como promotores. Por exemplo, a invenção

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111 proporciona ácido nucleicos (polinucleotídeos) tendo uma sequência pelo menos cerca de 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou identidade de sequência completa à SEQ ID NO: 10 e/ou SEQ ID NO: 11, sobre uma região de pelo menos cerca de 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 ou mais resíduos ou sobre o comprimento total de um promotor tendo atividade específica de célula-guarda ou uma região regulatória de transcrição tendo atividade específica de célula-guarda, em que o ácido nucleico compreende ou consiste de um promotor célula-guardaespecífico ou uma região regulatória de transcrição célula-guarda-específica.

Em um aspecto, a invenção proporciona regiões regulatórias de transcrição de célula-guarda que proporcionam, consistentemente, alta expressão de sequências heterólogas em uma célula de planta, por exemplo, proporcionam consistentemente alta expressão de transgenes de interesse. Em um aspecto, as regiões regulatórias de transcrição da presente invenção são usadas para melhorar os métodos disponíveis para expressão gênica objetivada em células-guarda.

Candidatos a promotor forte de célula-guarda foram isolados baseado em novas análises de microarranjo células-guarda específico de 23.000 genes. Uma abordagem baseada em microarranjo célula-guarda específico foi usada para analisar promotores fortes putativos célula-guarda específicos. Um promotor pGCl (Atlg22690) acionou forte expressão de genes repórteres (repórteres de cálcio baseados em GUS e GFP) em célulasguarda de Arabidopsis e tabaco. Supressão específica de gene em célulasguarda também foi obtida através de repressão antissenso acionada por pGCl.

Resultados: Um promotor, pGCl (Atlg22690), acionou expressão de gene repórter forte e relativamente específica em células-guarda, incluindo GUS (beta-glucuronidase) e yellow cameleon YC3.60 (repórter

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FRET de cálcio GFP-baseada). Expressão do gene repórter foi mais fraca em células-guarda imaturas. A expressão de YC3.60 foi suficientemente forte para formar uma imagem da dinâmica de Ca²⁺ intracelular em células-guarda de plantas intactas e resolveu transientes de cálcio espontâneos em célulasguarda. O promotor GC1 também mediou forte expressão do repórter em estômatos agrupados no mutante com desenvolvimento estomatal too-manymouths (tmm).

Além disso, os mesmos construtos de promotor: :repórter também acionam expressão de repórter célula-guarda específico em tabaco, ilustrando o potencial desse promotor como um método para expressão em alto nível em células-guarda. Uma deleção serial do promotor definiu uma região promotora de expressão em células-guarda. Além disso, repressão antissenso usando pGCl foi poderosa para redução de expressão gênica GFP específica em células-guarda, enquanto que expressão em células epidérmicas de folha não foi reprimida, demonstrando forte repressão gênica preferencial pelo tipo de célula.

Conclusão: O promotor pGCl da presente invenção aciona forte expressão de repórter em células-guarda de plantas Arabidopsis e tabaco. Os promotores da presente invenção podem proporcionar uma ferramenta potente para expressão ou silenciamento gênico células-guarda objetivado. Os promotores da presente invenção podem ser usados para reduzir expressão gênica específica em células-guarda, fornecer um método para superar limitações provenientes de redundância genética e letalidade. Os promotores da presente invenção podem ser usados para manipulação de vias de sinalização em células-guarda e modificação do desempenho da planta sob condições de estresse.

Resultados

Isolamento de pGCl, um promotor forte em célula-guarda

Dados de microarranjo células-guarda específico foram

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113 analisados lado a lado com dados de microarranjo específicos para células de mesófilo [veja referência 26, citada abaixo] para pesquisar candidatos a promotor forte em células-guarda com baixos níveis de expressão em células de mesófilo. Experimentos de microarranjo adicionais com células-guarda e células de mesófilo foram conduzidos, abrangendo 234.000 genes (fonte: ATH1 Affymetrix, Santa Clara, CA). Além disso, genes candidatos foram analisados usando GENEVESTIGATOR™ para selecionar genes com baixos níveis de expressão em tecidos que não são de folha através de mais de 2000 experimentos de microarranjo [veja referência 27, citada abaixo]. Célulasguarda e células de mesófilo expostas ao ABA também foram analisadas, uma vez que a síntese de ABA é induzida sob várias condições de estresse. Os seguintes critérios foram usados para seleção de candidatos a promotor forte em células-guarda. O sinal bruto em células-guarda foi ajustado acima de 10000, o sinal bruto em células de mesófilo foi ajustado abaixo de 1000 e as vezes de redução ou indução pelo ABA foi ajustada como sendo menos de dois. Perfis transcricionais de vários genes passaram nesses critérios; veja Figura 15, a qual resume graficamente dados mostrando os perfis de transcrição de genes expressos em células-guarda e células de mesófilo.

Na Figura 15, níveis médios de transcrição de ΚΑΤΙ (At5g46240), AtMYBóO (Atlg08810), AtMYBól (Atlg09540), RAB18 (At5g66400), GC1 (Atlg22690) (SEQ ID NO: 10) e AtACT7 (At5g09810) de dois microarranjos diferentes são mostrados. Enquanto ΚΑΤΙ, AtMYBóO e GC1 exibiram todos expressão célula-guarda específica, o nível de transcrição de GC1 foi o maior dentre os três genes. RAB18 também exibiu expressão muito forte em células-guarda, mas seu nível de expressão em células de mesófilo foi fortemente induzido através de tratamento com ABA.

Os promotores putativos (1 a 2kb a montante do códon inicial ATG anotado, veja Figura 16) foram amplificados através de PCR e clonados em um vetor repórter GUS. Coloração com GUS das plantas transgênicas TI

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114 mostrou coloração célula-guarda específica para um candidato a promotor em particular (Atlg22690), designado como pGCl. Atlg22690 está dentre os genes mais altamente expressos em células-guarda. Ele mostrou expressão relativamente alta em células-guarda e baixa expressão em células de mesófilo. Atlg22690 codifica uma pequena proteína rica em cisteína (119 aminoácidos). Ele pertence à família GASA (homólogo de proteína de transcrição GA-estimulada (GAST1)). Um estudo de Wigoda e colaboradores [28] sugeriu que GIP2 (uma proteína GASA de Petunia hybrida) exibiu atividade antioxidante in planta. A linhagem insercional de T-DNA em Atlg22690 não proporcionou quaisquer fenótipos estomatais perceptíveis sob nossas condições típicas de laboratório (dados não publicados). Além disso, nossos dados de microarranjo de célula-guarda mostrou que dois outros genes GASA também mostraram alto nível de expressão em células-guarda (GASA 1 (Atlg75750) e GASA 4 (At5gl5230).

A Figura 16 é a sequência do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10, mas a sequência da Figura 16 também tem um ATG adicionado à extremidade 3'): em GC1, o sítio de início transcricional é denotado como +1 e o códon inicial putativo (ATG) está localizado a +23/+25 bp. Os sítios iniciais Dof, 5’TAAAG-3’ (+) ou 5’-CTTTA-3’(-), os quais foi mostrado que contribuem para a expressão gênica células-guarda especifica [24], estão em destaque. ABRE, o elemento de resposta ao ácido abscísico, 5’-ACGTG-3’ (+) ou 5’CACGT-3’ (-), estão realçados e rotulados. A caixa TATA (5’-TATATAA3’) e o códon inicial (ATG) são mostrados em negrito com caixas tracejadas. As setas marcam as posições para análises de deleção de promotor na Figura 18.

Nós analisamos expressão do gene GC1 (Atlg22690) em resposta a diferentes tratamentos nos dados de microarranjo compilados pelo GENEVESTIGATOR™ [27, 29]. Dentre 96 tratamentos, 8 tratamentos afetaram a expressão de Atlg22690 mais de duas vezes. Sal e estresse

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115 osmótico diminuíram dramaticamente a expressão do gene Atlg22690 (mais de 10 vezes) [30]. Enquanto isso, luz, ABA, GA, frio ou estiagem não induziram a uma alteração de mais de duas vezes na expressão do gene

Atlg22690. Isso sugere que GC1 (Atlg22690) tem uma expressão relativamente constante sob a maioria das situações.

De modo interessante, pGCl::GUS não apenas conferiu forte expressão de GUS em células-guarda em folhas (Figura 17A, B), mas também em células-guarda em petíolos e hipocótilos (Figura 17C, D, E). Coloração com GUS de outras fusões candidatas de promotor-GUS não foi muito forte 10 em células-guarda e/ou mostrou expressão repórter em outros tecidos. Portanto, nós nos focalizamos sobre o pGCl durante o resto do estudo. O promotor GC1 também foi fundido a um segundo repórter, um repórter de cálcio GFP-baseado, yellow cameleon 3.60 (YC3.60) [31]. A maioria das plantas transgênicas TI (aproximadamente 75%) transformadas com 15 pGCl::YC3.60 exibiu forte fluorescência célula-guarda específica, indica um alto grau de eficiência de expressão em célula-guarda por planta transformada. Algumas plantas também mostraram fluorescência em algumas células epidérmicas de folha (dados não mostrados). Contudo, células-guarda mais jovens ou imaturas não mostraram ou mostraram muito menos expressão 20 de GFP (Figuras 17F, G). Além disso, células-guarda em sépalas e hipocótilos também mostraram expressão de GFP (Figuras 17H, I, J, K).

Nós ainda examinamos se o promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) poderia acionar expressão de repórter célula-guarda específica em um mutante em desenvolvimento de célula-guarda, too many mouths (tmm) [32]. 25 O mutante tmm foi transformado com o construto pGCl::GUS ou pGCl::YC3.60. Coloração com GUS mostrou expressão do gene repórter em estômatos agrupados (Figura 17L). Similarmente, expressão de GFP foi observada em estômatos agrupados em plantas tmm transformadas com pGCl::YC3.60 (Figura 17M).

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Para testar se o promotor GC1 pode acionar expressão de gene repórter células-guarda específica em plantas além de Arabidopsis, nós também transformamos pGCl::YC3.60 em plantas de tabaco. De modo interessante, forte expressão de GFP em células-guarda foi observada em folhas de tabaco; veja Figura 17N.

Em resumo, para a Figura 17: o promotor GC1 media forte expressão de repórter em células-guarda em mudas de Arabidopsis do tipo silvestre, o mutante too many mouths e também em tabaco:

Figura 17A: Uma muda transgênica pGCl::GUS de duas semanas de idade.

Figura 17B. Diferentes estágios de células-guarda exibiram diferentes níveis de expressão de GUS.

Figura 17C. Parte superior do hipocótilo.

Figura 17D: Folha jovem e petíolo.

Figura 17E: Borda da folha e petíolo.

Figura 17F e Figura G: pGCl::YC3.60 foi expresso principalmente em células-guarda maduras, fracamente em células-guarda jovens ou imaturas (setas brancas em (f) & (g)).

Figura 17H e 171: pGCl::YC3.60 foi expresso em célulasguarda sobre o hipocótilo.

Figura 17J e 17K: pGCl::YC3.60 foi expresso em célulasguarda sobre a sépala.

Figura 17L e 17M: pGCl mediou a expressão do repórter GUS (L) e GFP (M) em estômatos agrupados em too many mouths.

Figura 17N: pGCl mediou forte expressão de gene repórter em células-guarda de tabaco.

Deleções seriais de promotor definem uma região para especificidade e resistência de células-guarda

Uma região promotora pode conter elementos intensificadores

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117 e repressores. Para testar qual parte do promotor de 1716 pares de base (bp) original (comprimento total, FL, -1693 bp/+23 bp) é requerida para forte expressão de repórter células-guarda específica, quatro versões 5’ truncadas do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) foram geradas como Dl (-1140 bp/+23 bp), D2 (-861 bp /+23 bp), D3 (-43 bp/+23 bp) e D4 (-224 bp/+23 bp), veja Figura 18. Esses promotores truncados foram usados para fusão ao repórter GUS a fim de gerar os seguintes construtos: pGCl(Dl)::GUS, pGCl(D2)::GUS, pGCl(D3)::GUS e pGCl(D4)::GUS. Esses construtos repórteres de GUS foram transformados em plantas do tipo silvestre Columbia lado a lado com o construto pGCl(FL)::GUS original. Mudas TI (n = 50100) de cada evento de transformação foram empoçadas e coradas. O pGCl(DT) truncado acionou expressão similar ou mais forte de GUS em mudas do que o promotor original de comprimento total (Figura 4A), sugerindo que elementos na região de -1693 bp a -1140 bp poderíam reprimir a atividade do promotor em células-guarda. Os promotores pGCl(D2) e pGCl(D3) levaram a uma expressão mais fraca do gene repórter em célulasguarda do que o pGCl(FL\ sugerindo que elementos na região de -1140 bp a -443 bp poderíam intensificar a atividade do promotor em células-guarda. O promotor mais curto, pGCl(D4), acionou expressão do gene repórter em outros tecidos que não células, tais como raízes e envoltórios de semente, sugerindo que a região de -861 bp a -224 bp era requerida para atividade células-guarda específica. Essa região contém 8 elementos (T/A)AAAG que foi mostrado ser requeridos para atividade células-guarda específica do promotor KST1 em batata [24]. O promotor truncado, pGCl(Dl), mostrou forte expressão em células-guarda, sugerindo que ele contém elementos para especificidade por célula-guarda e resistência do promotor. Consequentemente, a invenção proporciona ativadores transcricionais (tais como promotores) que são específicos para células-guarda os quais compreendem ou consistem essencialmente da região de -861 bp a -224 bp; e

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118 proporciona ativadores transcricionais (tais como promotores) que são específicos para células-guarda, os quais compreendem ou consistem essencialmente da região de -1140 bp a -443 bp.

Em resumo, a Figura 18 ilustra deleções seriais do promotor pGCl para definir regiões para expressão em células-guarda, onde a Figura 18A ilustra fotografias que são representativas de plantas TI de diferentes linhagens transgênicas de promotor::GUS. O promotor pGCl (Dl) (1140/+23) mediou expressão mais forte de GUS em células-guarda do que o promotor original de comprimento total (EL) (-1693/+23). Expressão de GUS de pGCl(D2)::GUS e pGCl(D3)::GUS foi mais fraca do que aquela de pGCl(FL)::GUS e pGCl(Dl)::GUS. O promotor mais curto pGCl(D4) (224/+23) aciona expressão do repórter em tecidos e células, além de célulasguarda.

A Figura 18B ilustra graficamente a deleção serial (estrutural ou de sequência) do promotor pGCl para definir regiões para expressão em células-guarda. As setas pretas significam elementos TAAAG, enquanto que as setas cinzas menores significam elementos AAAAG. As setas na parte de cima da linhagem promotora estão sobre a mesma fita senso, enquanto que as setas abaixo da linhagem promotora estão sobre a fita antissenso. O TAAAG central sobre a fita senso foi também marcado por uma estrela e foi escolhido para mutagênese de bloqueio. A região de -1693 a -1140 contém elementos repressores para expressão em células-guarda e a região de -1140 a -224 contém elementos para especificidade em células-guarda e também elementos intensificadores para expressão em células-guarda.

Formação de imagem de cálcio em células-guarda de plantas intactas

Muitos estímulos fisiológicos em células de planta induzem a alterações na concentração de cálcio intracelular. O cálcio atua como um mensageiro secundário em qualquer cascata de transdução de sinal [33]. As

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119 concentrações de cálcio citosólico podem ser monitoradas através de repórteres químicos, tal como o corante fluorescente radiométrico Ca²⁺sensível fura-2 [34, 35], a proteína luminescente sensível ao cálcio geneticamente codificada aequorina [14] ou o repórter de cálcio radiométrico fluorescente yellow cameleon [12, 15, 36]. Foi mostrado que sinais de fechamento estomatal, tais como ABA e CO₂, induzem à elevações de cálcio em células-guarda [16, 18, 19, 37-42]. Transientes espontâneos de cálcio em amostras de epiderme de folha também foram observados sem qualquer tratamento com ABA [15, 43, 44]. Não está claro se transientes espontâneos de cálcio ocorrem em células-guarda em plantas intactas, uma vez que células-guarda de Vicia faba injetadas com fura-2 não mostram tais transientes [45].

Um indicador de cálcio de nova geração, yellow cameleon, YC3.60, mostra uma alteração intensificada cálcio-dependente na proporção de YFP/CFP em quase 600% comparado com yellow cameleon 2.1 [31]. Combinando o promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) com YC3.60,pGCl::YC3.60, conforme descrito acima, nós observamos forte expressão em células-guarda de YC3.60 em folhas, hipocótilos e sépalas intactas, conforme ilustrado na Figura 19.

Em resumo, a Figura 19 ilustra transientes de cálcio intracelular impostos em células-guarda expressando pGCl::YC3.60 e transientes espontâneos de cálcio ocorridos em células-guarda de plantas transgênicas pGCl::YC3.60 intactas:

A Figura 19A ilustra a imagem por fluorescência de epiderme de folha de uma planta transgênica pGCl::YC3.60. Note que as células epidérmicas adjacentes não eram fluorescentes.

A Figura 19B ilustra que as seis células-guarda no painel A produziram todas transientes de cálcio intracelular em resposta às oscilações de cálcio impostas. As setas marcam o ponto de troca do tampão de

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120 despolarização para o tampão de hiperpolarização contendo Ca²⁺ (veja a seção

Métodos).

A Figura 19C ilustra uma imagem radiométrica pseudocolorida da folha de plantas Col intactas transformadas com pGCl::YC3.60. A cor laranja-amarela indica maior [Ca²⁺] e a cor azul indica menor [Ca²⁺J. Transientes espontâneos de cálcio ocorreram em folhas de plantas Arabidopsis intactas.

A Figura 19D ilustra um curso de tempo (25 minutos) das proporções de emissão das duas células-guarda marcadas por uma seta em C, mostrando que transientes espontâneos de cálcio ocorrem em plantas Arabidopsis intactas. A proporção foi calculada para células individuais dividindo-se a intensidade de emissão de YFP pela intensidade de emissão de CFP.

Primeiro, nós medimos os transientes de cálcio em epiderme de folha intacta de plantas transformadas com pGCl::YC3.60 impondo oscilações de cálcio, conforme descrito previamente [11, 46]. Transientes robustos de cálcio com alterações radiométricas em um fator de até 4 com relação à proporção de Unha de base puderam ser observados em célulasguarda, veja Figura 19B. Alterações radiométricas de aproximadamente 0,5 foram observadas usando 35S::YC2.1 em resposta aos transientes de cálcio impostos [15, 43, 44, 46]. Isso confirmou adicionalmente a eficiência robusta de sinal para ruído radiométrico de YC3.60.

Em seguida, nós realizamos formação de imagem de cálcio em mudas de Arabidopsis intactas montando folhas sobre uma lamínula para microscópio. Dois métodos diferentes foram testados: o primeiro foi submergir apenas a raiz em água e deixar o broto em ar e o segundo foi submergir a planta toda em água. Transientes espontâneos de cálcio foram detectados sob ambas as condições, veja Tabela 1, abaixo.

Um curso de tempo/transientes de cálcio representativo é

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121 mostrado na Figura 19D. De modo interessante, os transientes espontâneos de cálcio de duas células-guarda do mesmo estômato frequentemente não estão sincronizados, veja Figura 19C, D. Esses experimentos demonstram claramente que transientes espontâneos de cálcio ocorreram em célulasguarda de plantas intactas e não eram um defeito de formação de imagem da epiderme excisada e ilustram o potencial do promotor pGCl (SEQ ID NO: 10) da presente invenção como um método para acionar expressão de transgene e repórter em células-guarda.

O uso de pGCl para manipular expressão gene específica em células-guarda

Manipulação de expressão gene específica em células-guarda, seja de um gene do tipo silvestre altamente expresso ou uma forma mutante dominante ou redução de sua expressão em células-guarda, seria muito poderoso para testar uma função gene específica em células-guarda. Para explorar adicionalmente a aplicação do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10), nós utilizamos a abordagem antissenso para analisar a redução de expressão gênica em células-guarda. Para essa finalidade, uma linhagem transgênica 35S::GFP com expressão estável de GFP em células-guarda e células epidérmicas, veja Figura 20A, B, foi transformada com um construto pGCl(Dl)::anti-GFP (anti-GFP fundido ao promotor truncado GC1 pGCl(Dl)). 34 de 40 plantas TI de plantas 35S::GFP transformadas com pGCl(Dl)::anti-GFP mostraram expressão de GFP grandemente reduzida, enquanto que o nível de expressão de GFP em células epidérmicas não foi alterado, conforme ilustrado nas Figuras 20C, D.

Em resumo, a Figura 20 ilustra micrografias de pGCl(Dl)::anti-GFP, que causou redução da expressão de GFP em célulasguarda de plantas 35S::GFP:

A Figura 20A ilustra a epiderme de folha de uma planta transgênica 35S::GFP (campo brilhante com filtro GFP). As setas marcam

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122 estômatos.

A Figura 20B ilustra a formação de imagem por fluorescência da mesma epiderme de folha mostrada em A. Estômatos são marcados por setes mais claras (amarelo). Note que células-guarda e células epidérmicas adjacentes são fluorescentes.

A Figura 20C ilustra a epiderme de folha de uma planta transgênica TI expressando pGCl(Dl)::anti-GFP na base 35S::GFP. Todos os estômatos são marcados por setas mais claras (amarelo).

A Figura 20D ilustra a formação de imagem por fluorescência da mesma epiderme de folha mostrada em 20C. Note que 7 (marcados por setas relativamente mais escuras (azuis)) de 8 estômatos mostraram expressão reduzida de GFP comparado com as células epidérmicas adjacentes. Um par de células-guarda (marcado pela seta mais clara (amarela)) ainda exibiu expressão moderada de GFP. Esse estômato era relativamente imaturo comparado com os outros 7 estômatos.

Essas observações demonstram uma eficiência de repressão antissenso acentuada usando a sequência da presente invenção pGCl(Dl) (SEQ ID NO: 10). De modo interessante, menos supressão de expressão de GFP foi observada em células-guarda imaturas (veja seta mais clara (amarela) na Figura 20D, versus as setas mais escuras (azuis)). Isso é consistente com a observação de que o pGCl aciona menos expressão de gene repórter em células-guarda imaturas; veja, por exemplo, Figura 17G, discutida acima. Esse experimento demonstra que uma abordagem antissenso usando sequências da presente invenção pode ser usada para reduzir a expressão de genes selecionados em células-guarda sem afetar sua expressão em outros tipos de célula.

Discussão

A presente invenção identifica, pela primeira vez, o promotor forte de células-guarda de Arabidopsis, pGCl (SEQ ID NO: 10). Análises de

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123 fusão de promotor: :repórter mostraram que o pGCl (SEQ ID NO: 10) tem forte expressão de gene repórter células-guarda específica, por exemplo, em plantas Arabidopsis do tipo silvestre e no mutante de desenvolvimento de células-guarda, too many mouths [32] e também em plantas de tabaco. Deleções seriais do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) definiram regiões para expressão de células-guarda. Formação de imagem de cálcio em plantas intactas se tomou possível via a combinação do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) e uma nova geração do repórter de cálcio, YC3.60 [31]. O promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) da invenção foi também poderoso para realizar knockout de expressão gene específica em células-guarda usando uma abordagem antissenso.

Comparação entre o promotor GC1 e outros promotores conhecidos de células-guarda

Como o regulador central de transpiração de água e captação de CO2, células-guarda foram desenvolvidas como um sistema modelo integrativo para investigar a interação entre atividades do canal/transportador de íons, luz, hormônios de planta, mensageiros secundários, o tráfego em citoesqueleto e membrana na regulação de consequências fisiológicas: a abertura estomatal [2, 4, 5, 47, 48]. Vários promotores de células-guarda foram reportados. O promotor ΚΑΤΙ (At5g46240) conferiu expressão repórter específica em células-guarda, mesmo embora algumas vezes ele tenha induzido à expressão de repórter em outras células e tecidos, tais como raízes e inflorescências [25]. AtMYBóO (Atlg08810) também mostrou expressão específica em células-guarda, baseado no estudo com promotor::GUS e promotor::GFP [49]. AtMYBól (Atlg09540) também mostrou ser expresso principalmente em células-guarda [50].

Baseado em nossos dados de microarranjo célula-guarda específicos, nós estimamos os níveis médios de transcrição na Figura 15, discutidos acima. O sinal de expressão do gene AtMYBól foi o mais baixo

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124 dentre os genes. No caso de ΚΑΤΙ, sua expressão em células-guarda foi muito maior do que aquela em células de mesófilo. Mas seu sinal bruto foi aproximadamente 5 a 10 vezes menor do que aquela de GC1. AtMYBóO também exibiu alta expressão células-guarda específica comparado com sua expressão em células de mesófilo. Contudo, o sinal bruto de AtMYBóO também era aproximadamente um terço daquele do promotor da presente invenção GC1 (SEQ ID NO: 10). Além disso, AtMYBóO é também altamente expresso em sementes baseados em análises de microarranjo GENEVESTIGATOR™ [27, 29, 51-54]. Similarmente, RAB18 (At5g66400) é também altamente expresso em sementes, além de sua forte expressão em células-guarda. pGCl acionou expressão muito forte e específica de gene repórter em células-guarda (expressão é muito baixa em tecidos/órgãos que não são de folha), embora expressão de gene repórter fosse observada em células epidérmicas de algumas plantas transformadas com pGCl::YC3.60. Em resumo, o promotor GC1 é um promotor de células-guarda muito forte dentre aqueles analisados.

Transientes espontâneos de cálcio em células-guarda

Estudos com plantas Arabidopsis intactas usando o repórter de cálcio geneticamente codificado YC3.60 acionado pelo promotor GC1 mostrou que transientes espontâneos de cálcio ocorrerem em células-guarda em plantas Arabidopsis intactas. Isso é consistente com observações anteriores de transientes espontâneos de cálcio em células-guarda de Arabidopsis [15, 43, 44]. Contudo, os mecanismos que causam transientes espontâneos de cálcio ainda não foram caracterizados profundamente. Várias linhas de evidência sugerem uma conexão entre hiperpolarização da membrana plasmática de células-guarda e transientes espontâneos de cálcio em células-guarda.

Em experimentos onde o potencial de membrana e [Ca²⁺]_cytforam medidos simultaneamente, hiperpolarização causou aumentos ABA

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125 induzidos [Ca²⁺]cyt. Manutenção de células-guarda em um estado mais hiperpolarizado produziu oscilações espontâneas de [Ca²⁺]cyt em célulasguarda de Vicia faba [38], em uma sub-população de células-guarda de Commelina [39] e em células-guarda de Arabidopsis [43]. Análises de 5 formação de imagem de cálcio em plantas Arabidopsis intactas usando pGCl::YC3.60 mostram que transientes espontâneos de cálcio também ocorrem em plantas intactas.

Esses transientes espontâneos de Ca²⁺ podem também ser o resultado de sinalização integrada por múltiplos estímulos convergentes em 10 células-guarda, tais como condições de luz, CO2 e equilíbrio de água. Em Vicia faba, nenhum transiente espontâneo de cálcio foi observado em célulasguarda em plantas intactas [45]. Nesse caso, fura-2 (aproximadamente 100 μΜ) foi injetado em células-guarda. Altas concentrações de fura-2 podem inibir as elevações de cálcio, uma vez que carregamento do análogo próximo 15 de fura-2, BAPTA, em células-guarda de Arabidopsis inibe efetivamente esses transientes de cálcio [44].

Em contraste, a baixa concentração estimada de yellow cameleon em células-guarda de plantas transgênicas pGCl (SEQ ID NO: 10)::YC3.60 era de aproximadamente 1 μΜ (veja Métodos, discutidos aqui). 20 A menor concentração de yellow cameleon interferiria menos com a homeostase de cálcio em células-guarda e poderia monitorar mais facilmente a dinâmica da concentração de cálcio. Note que baixas concentrações de fura2 injetado também permitem resolução de transientes repetitivos de cálcio em células-guarda [38, 39]. Note que corantes fluorescentes BAPTA-derivados, 25 tais como fura-2 e indo-1, têm determinadas vantagens complementares ao cameleon, uma vez que eles são carregados em células que não são facilmente transformadas [55] e esses corantes podem reportar rápidos transientes de Ca²⁺ em uma escala de mili-segundos que ocorrem em neurônios [56], mas atualmente não foram ainda reportados em plantas usando fura-2 ou indo-1.

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O cálcio circadiano oscila a nível de folha de planta inteira com um ritmo diário demonstrado por vários grupos usando aequorina como o repórter de cálcio [57-59]. Mais provavelmente, essa oscilação do cálcio circadiano resulta de alterações sincronizadas no cálcio citosólico de Unha de 5 base em uma população de célula [60]. Uma vez que a oscilação de cálcio circadiano está relacionada à Unha de base de cálcio intracelular, os rápidos transientes de cálcio espontâneo em células-guarda individuais provavelmente seriam filtrados de medições do cálcio circadiano [60]. Transientes repetitivos de cálcio podem refletir funções que incluem homeostase contínua de cálcio 10 entre as reservas de cálcio extracelular, cálcio citoplásmico e cálcio intracelular. Transientes espontâneos de cálcio em células-guarda também se correlacionam com a hipótese de iniciar sensor de cálcio recentemente proposta para especificidade de cálcio em sinalização, na qual os sinais de fechamento de estômato pelo ABA e CO2 são propostos como produzindo 15 (de-inativando) etapas sensíveis ao cálcio que mediam o fechamento estomatal [44, 61].

Cis elementos (T/A)AAAG e expressão células-guarda específica (T/A)AAAG, um motivo de ligação para fatores de transcrição 20 de dedo de zinco Dof, foi sugerido como exercendo um papel crítico para expressão células-guarda específica de atividade do promotor KST1 em batata baseado em mutagênese em bloco [24]. Contudo, as regiões promotoras putativas (1800 bp antes do códon inicial ATG) para AtACT7 (At5g09810), ΚΑΤΙ (At5g46240), RAB18 (At5g66400), AtMYBóO (Atlg08810), AtMYBól 25 (Atlg09540) e GC1 (Atlg22690) contêm todas um número similar de motivos de ligação a fator Dof, os elementos (T/A)AAAG, mesmo embora algumas delas não mostrem preferência por expressão em células-guarda. AtMYBól, o qual mostrou baixa expressão em células-guarda (Figura 15), contém 29 elementos (T/A)AAAG em sua região promotora putativa, enquanto que o

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127 promotor AtACT7 contém 23 elementos (T/A)AAAG. Truncamento de promotor sugere que a região de -861 bp a -224 bp no promotor GC1 (SEQI NO: 10) contém elementos para atividade de promotor células-guarda específica; veja Figura 18, discutida acima. Essa região contém 8 elementos (T/A)AAAG. Contudo, mutagênese em bloco do motivo TAAAG central sobre a fita senso (marcado por uma estrela na Figura 18B) nessa região não afetou a expressão do repórter em células-guarda. Assim, o elemento (T/A)AAAG sozinho não pode explicar porque o GC1 e outros genes célulasguarda específicos exibiram expressão células-guarda específica.

Conclusões

Análises de microarranjo (ATH1) de genes expressos em células-guarda foi usada para isolar e caracterizar um novo promotor de células-guarda da presente invenção, pGCl (SEQ ID NO: 10). Nós analisamos o potencial de pGCl (SEQ ID NO: 10) como uma ferramenta para manipulação de expressão gênica em células-guarda. O promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) foi usado para testar várias manipulações experimentais. O promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) foi usado para expressar o repórter de cálcio YC3.60 em células-guarda. Isso permitiu realizar experimentos de formação de imagem de cálcio em células-guarda de plantas Arabidopsis intactas.

Para mutantes insercionais de T-DNA, frequentemente é necessário gerar centenas de transformantes para obter pelo menos umas poucas linhagens expressando um gene repórter em células-guarda quando usando o promotor 35S. Em contraste, o uso do promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) da presente invenção proporciona um método para aumentar dramaticamente a taxa de sucesso de expressão de gene repórter. Além disso, expressão de GFP antissenso células-guarda específica usando o promotor GC1 silenciou eficientemente a expressão de GFP em células-guarda de plantas transgênicas 35S::GFP.

Esses dados e a alta eficiência de transformação juntos

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128 demonstram que os promotores da presente invenção, incluindo o promotor GC1 (SEQ ID NO: 10) da presente invenção, proporcionam uma ferramenta poderosa para manipulação da expressão de componentes de sinalização em células-guarda e para expressão de repórteres de diversos mensageiros secundários. Assim, os promotores da presente invenção, incluindo o promotor GC1 (SEQ ID NO: 10), proporcionam composições e métodos para intensificar seletivamente a expressão em células-guarda, monitorar eventos de sinalização em células-guarda em resposta a diferentes tratamentos e estudar respostas de plantas inteiras em mutantes transgênicos células-guarda específicos.

Material e métodos

Material vegetal

Plantas Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) foram usadas para experimentos de transformação, a menos que de outro modo especificado. A linhagem transgênica 35S::GFP foi gerada durante um estudo anterior [62]. Um mutante de desenvolvimento de célula-guarda, too many mouths, foi uma cortesia do Dr. Fred Sack na University de British Columbia, Vancouver.

Experimentos de microarranjo GeneChip

O crescimento da planta, tratamento com ABA, isolamento de protoplasta de células-guarda e extração de RNA foram realizados conforme previamente descrito [26]. Arranjos de genoma de Arabidopsis ATH1 Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA) foram usados, representando aproximadamente 24.000 genes. Transcriçãos foram amplificados, rotulados e hibridizados na University of Califórnia, San Diego Gene Chip Core Facility. Para cada condição (com ou sem tratamento com ABA, células-guarda ou célula de mesófilo), duas hibridizações independentes foram realizadas. Inibidores transcricionais (33 mg/L de actinomicina D e 100 mg/L de cordicepina) foram adicionados durante isolamento de protoplasta para

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129 amostras de RNA para quatro hibridizaçoes de lasca, conforme descrito [26].

Dados do arranjo ATH1 foram depositados no MIAMEXPRESS™ [63] com um número de acesso E-MEXP-1443.

Construção de plasmídeos recombinantes

Para amplificar o promotor GC1 (Atlg22690) do DNA genômico Col através de PCR, iniciadores YZ27 (5’CATGCCATGGatttcttgagtagtgattttgaag-3 ’, à direita antes do códon inicial ATG com sítio Ncol) e YZ28 (5 ’ -ACGCGTCGACgagtaaagattcagtaacccg-3 ’, 1693 bp a montante do início transcricional (Figura 16) com sítio Sall) foram utilizados. O produto de PCR foi clonado no vetor pGEM-Teasy (Invitrogen, Carlsbad, CA) para criar pGEM-T-pGCl.

Para clonar o promotor GC1 no vetor pBIlOl, pGEM-T-pGCl foi primeiro cortado com Ncol. A extremidade aderente foi, então, enchida com DNA polimerase T4 (New England BioLabs) para criar uma extremidade cega. O fragmento pGCl foi, então, liberado através de digestão com Sall. Enquanto isso, o vetor de destino, pBIlOl, foi cortado seqüencialmente com Smal e Sall. O fragmento pGCl foi, então, inserido a montante do gene repórter GUS no vetor pBIlOl para criar o construto pBI101-pGCl::GUS (simplificado como pGCl::GUS).

Para criar uma série de deleções 5’ do promotor pGCl, o iniciador YZ27 foi usado com os iniciadores YZ159 (5’GCGTCGACatggttgcaacagagaggatga-3’, 1141 bp a montante do início transcricional, Dl), YZ160 (5’-GCGTCGACctaatgaagggtgccgcttattg-3’, 861 bp a montante do início transcricional, D2), YZ161 (5’GCGTCGACcaatattgcgtctgcgtttcct-3’, 466 bp a montante do início transcricional, D3) e YZ162 (5’-GCGTCGACgaaccaatcaaaactgtttgcata-3’, 224 bp a montante do início transcricional, D4) respectivamente, para PCR genômica a fim de amplificar pGCl(Dl), pGCl(D2), pGCl(D3) e pGCl(D4), respectivamente (Figura 4). Os fragmentos de PCR foram, então, clonados no

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130 vetor pGEM-T-easy e, então, subclonados no vetor pBIlOl para criar pBIlOlpGCl(Dl)::GUS, pBI101-pGCl(D2)::GUS, pBI101-pGCl(D3)::GUS e pBI101-pGCl(D4)::GUS.

Para criar o construto pBI101-pGCl::YC3.60, YC3.60 foi primeiro liberado do pcDNA3-YC3.60 [31] através de digestão dupla com EcoRI/BamHI. Então, o fragmento BamHI-5 YC3.60-3 ’-EcoRI foi clonado no vetor pSK (preparado através de digestão com EcoRI e BamHI) para criar o construto pSK-YC3.60. O pSK-YC3.60 foi, então, digerido com Notl e Ncol para receber o fragmento NotI-5’-/?GC7-3’-NcoI do pGEM-T-pGCl. Essa ligação resultou no pSK-pGCl::YC3.60. O fragmento pGCl::YC3.60 foi liberado através de digestão dupla com SalI/SacI, enquanto o vetor pBIlOl foi digerido com SalVSacI para remover o gene repórter GUS. O /?B77O7(SalVSacI) foi ligado com SalI-5’-pGCl::YC3.60-3’-SacI para criar o construto pBI101-pGCl::YC3.60.

Para criar o vetor binário pGreenlI 0179-pGCl(Dl)::antiGFP com marcador seletivo higromicina em planta, o terminador 35S foi amplificado com YZ439 (5’ -AAGAGATCTATCTAGAGTCCGCAA-3 ’. com Xbal) e YZ440 (5’ -GCACGCTCGAGCTCgtcactggattttggttttagg-3 ’, com um sítio Saci) a partir do vetor pAVA319 [64]. O produto de PCR foi, então, subsequente digerido com Xbal e Saci. O terminador-SacI-3' 5’-XbaI-35S foi ligado ao pGreenlI 0179-XAbI.. .Saci para criar pGreenlI 0179-terminador. O pGCl(Dl) foi liberado do pGEM-T-pGCl(Dl) através de digestão com Notl, então, cortado com Sall para criar 5’-SalI-pGCl(Dl)-NotI(extremidade cega sem enchimento). Enquanto isso, o terminador pGreenlI 0179 foi duplamente digerido com Sall e EcoRV. Esses dois fragmentos foram ligados para gerar o vetor pGreenlI 0179-pGCP(Dl)-terminador. O GFP antissenso foi amplificado com iniciadores YZ449 (5’ACATGCCATGGttacttgtacagctcgtccatgcc-3’, extremidade reversa de GFP com Ncol) e YZ513 (5 ’ -ctagTCTAGAatggtgagcaagggcgagg -3’, início de

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GFP com Xbal). O fragmento de PCR foi duplamente digerido com Ncol e

Xbal. O pGreenlI 0179-pGCl(Dl)-Terminador foi também duplamente digerido com Ncol e Xbal. O fragmento pGeenlI 0179-pGCl(Dl)Terminador foi ligado com 5’ -NcoI-anri-GFP-XbaI-3’ para produzir o construto binário pGeenlI 0179-pGCl(Dl)::anti-GFP.

O motivo central TAAAG (-579—>-575) sobre a fita senso foi trocado para CGGGA através de mutagênese de bloqueio usando o kit de mutagênese sítio-dirigida QUICKCHANGE™ da Stratagene (La Jolla, Califórnia).

Transformação e seleção de Arabidopsis

Os construtos binários, pBI101-pGCl::YC3.60, pBIlOlpGCl::GUS, pBI101-pGCl(Dl)::GUS, pBI101-pGCl(D2)::GUS, pBIlOlpGCl(D3)::GUS e pBI101-pGCl(D4)::GUS foram transformados na cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens através de eletroporação. Os transformantes foram selecionados sobre lâminas LB com canamicina (marcador seletivo para o construto) e gentamicina (marcador seletivo para Agrobacterium). Plantas Arabidopsis foram, então, transformadas através de Agrobacterium GV3101 hospedando os respectivos construtos, seguindo o método de imersão conforme descrito por Clough e Bent [65]. As sementes T0 foram selecionadas sobre lâminas com V2 MS com 50 μg/ml de canamicina.

No caso de pGreenlI 0179-pGCl(Dl)::anti-GFP, GV3101 com o plasmídeo auxiliar pSOUP foi usado como a cepa hospedeira e a seleção de transformantes de Agrobacterium foi realizada sobre lâminas LB com canamicina, gentamicina e tetraciclina. Isso foi usado para transformar plantas transgênicas 35S::GFP (resistentes à canamicina). As sementes T0 foram selecionadas sobre lâminas V2 MS com 25 μg/ml de higromicina (Roche).

Coloração com GUS

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Mudas foram coradas seguindo um protocolo previamente descrito [62].

Aquisição de imagem por Epi-fluorescência

Mudas de Arabidopsis transgênica ou sépalas de pBIlOlpGCl::YC3.60 foram simplesmente colocadas entre uma lâmina e uma lamínula para microscópio. Uma câmera digital ΝΙΚΟΝ™ foi presa ao microscópio. O tempo de exposição para a imagem brilhante é de 5 segundos e 15-25 segundos para imagem por fluorescência (comprimento de onda de excitação é de 440 nm). Para plantas 35S::GFP e plantas 35S::GFP transformadas com pGREENII™ QV19-pGCl(Dl)::anti-GFP, epiderme de folha intacta foi usada para aquisição de imagem por epi-fluorescência.

Transformação de planta de tabaco

Culturas de broto estéril in vitro de Nicotiana tabacum cv. SR1 foram mantidas sobre meio agar ¹/2MS contendo 15 g/1 de sacarose. O pH foi ajustado para 5,5 antes de sujeição à autoclave. A cultura de tabaco foi crescida a 25 °C, com um ciclo de claro/escuro de 16/8 h (intensidade de luz era de aproximadamente 70 pmoles m'² s¹). Transformação estável de Nicotiana tabacum SR1 com pBI101-pGCl-YC3.60 foi realizada conforme descrito previamente [66]. Brotos de tabaco transgênico regenerados foram selecionados através da resistência à canamicina (100 μg/ml) e foram, então, transferidos para meio agar ¹/2MS contendo 15 g/1 de sacarose suplementado com canamicina (100 μg/ml) e cefotaxima (200 μg/ml). Plantas TI regeneradas, as quais foram capazes de apresentar organogênese de raiz na presença de canamicina foram, então, analisadas com relação à expressão de cameleon.

Análise confocal de tabaco transgênico

As folhas de tabaco da planta transformada com pBIlOlpGCl-YC3.60 foram observadas com um microscópio confocal a laser Leica TCS SP2™ (Leica Microsystems). Para detecção de cameleon, a excitação

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133 estava a 514 nm e a emissão entre 525 e 540 nm. As imagens adquiridas pelo microscópio confocal foram processadas usando IMAGE J™ [67].

Formação de imagem de cálcio e transientes de Ca²⁺impostos

Toda formação de imagem de cálcio nesse trabalho foi realizada com um microscópio invertido TE300™ usando uma adaptação de epi-fluorescência TE-FM™ (Nikon Inc. Melville, NY). Excitação a partir de uma lâmpada de xenônio de 75W (Osram, Alemanha) que estava sempre atenuada a 97% usando filtros de densidade neutra 4x e 8x (transmissão de 3%) para reduzir o branqueamento de repórteres durante formação de imagem tempo-decomposta. A especificidade de comprimento de onda foi obtida com um conjunto de filtro cameleon (excitção de 440/20, emissão 1 de 485/40, emissão2 535/30, dicróico 455DCLP™; conjunto de filtro 71007a™ Chroma Technology, Rockingham, VT). Roda de filtro, obturador e câmera COOLSNAP™ CCD da Photomerics (Roper Scientific, Alemanha) foram controlados com o software METAFLUOR™ (MDS, Inc., Toronto, Canadá).

Epiderme de folhas intactas de plantas transgênicas pGCl::YC3.60 foram preparadas para microscopia conforme descrito em Mori e colaboradores (2006)[ll]. Sob o microscópio, epiderme intacta foi perfundida com tampão de despolarização (tampão de MES-Tris a 10 mM, pH de 6,1 contendo iminodiacetato de dipotássio a 25 mM e BAPTA a 100 μΜ) durante 10 minutos a fim de obter uma base. Subsequentemente, tampão de hiperpolarização contendo Ca²⁺ (tampão de MES-Tris a 10 mM, pH de 6,1, iminodiacetato de dipotássio a 1 mM e CaCfi a 1 mM) foi aplicado em intervalos de 2 minutos, seguido por 4 minutos de tampão de despolarização.

Formação de imagem de cálcio em células-guarda de plantas intactas

Folhas intactas e plantas intactas foram usadas nesse estudo. Adesivo médico (Hollister Inc., Libertyville, IL) foi usado para fixar as folhas

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134 a lamínulas de vidro para microscópio. Uma escova foi usada para comprimir gentilmente a folha à lamínula. No caso de plantas intactas, dois métodos diferentes foram seguidos. O primeiro método foi usado para submergir apenas a raiz com água, enquanto o broto foi deixado em ar. O segundo 5 método foi submergir completamente mudas inteiras em água. Algumas vezes, submersão apenas da raiz, mas não do broto, fez com que a folha se prendesse à lamínula para mostrar murchamento em menos de 10 minutos, com subsequente fechamento do estômato. A maioria dos experimentos de formação de imagem de planta intacta foi, portanto, realizado através de 10 submersão do broto (folhas) e da raiz em água. A submersão da planta inteira impediu a folha de secar e nenhum fechamento estomatal foi observado durante mais de 50 minutos. O protocolo de formação de imagem foi o mesmo conforme em Mori e colaboradores, 2006 [11].

Estimativa da concentração de yellow cameleon em células15 guarda

Proteína yellow cameleon recombinante foi isolada após expressão em E coli. Proteína cameleon amarela foi, então, adicionada em concentrações definidas a uma lamínula de cobertura de vidro para formação de imagem por fluorescência. Então, mais duas lamínulas adicionais foram 20 usadas para criar um gradiente oblíquo de espessuras de solução de cameleon. Isso permitiu a análise de várias espessuras de solução na faixa das espessuras de células-guarda estomatais. Soluções de proteína yellow cameleon diluídas em diferentes concentrações foram analisadas e a intensidade de fluorescência foi medida para cada concentração em cada uma das várias espessuras. 25 Curvas de calibração foram geradas para as concentrações de proteína em células-guarda de plantas transgênicas pGCl::YC3.6.

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63. MIAMExpress, from the European Bioinformatics Institute (EBI), a non-profit academic organization that forms part of the European Molecular Biology Laboratory, Cambridge, Great Britain.

64. von Amim AG, Deng XW, Stacey MG: Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene 1998, 221: 35-43.

65. Clough SJ, Bent AF: Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J 1998, 16: 735-743.

66. Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers

SG, Fraley RT: A simple and general method for transferring genes into plants. Science 1985, 227: 1229-1231.

67. Image J, Centre de Recherche Public Henri Tudor, Luxembourg.

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Tabela I. Sumário de formação de imagem de cálcio em células-guarda de plantas Arabidopsis transgênicas pGCl::YC3.60 intactas.

Experimentos	plantas	GCs analisadas	GCs com transientes de Ca2+ espontâneos	Percentual %
I	5	24	18	75
Π	11	52	36	62,23
ΠΙ	11	55	36	65,45
IV	9	54	24	44,44

Total	36	185	114	61,78%

Apenas raízes foram submersas em água no experimento 1. Folhas e raízes foram submersas em água nos experimentos II, III e IV.

Exemplo 4; Caracterização de receptores de CO2 que controlam a captação de CO2 pela planta e eficiência de uso de água

A invenção proporciona composições e métodos para regulação negativa ou diminuição de dióxido de carbono (CO2) e/ou troca de água em uma célula-guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo inter alia use de um polipeptídeo tendo uma atividade de anidrase carbônica (carbonato desidratase) ou uma atividade de anidrase β-carbônica ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de anidrase carbônica; e, expressão de ou superexpressão de, a CO2Sen (CO2 sensor) ácido nucleico expressando proteína e/ou a CChSen gene ou transcrição (mensagem) e/ou a anidrase carbônica ou a β-anidrase carbônica na célula-guarda. A invenção proporciona composições e métodos para regulando positivamente ou aumentando o dióxido de carbono (CO2) e/ou troca de água em uma célulaguarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo inter alia use de um ácido nucleico antissenso a ou, de outro modo, inibitório to um ácido nucleico que codifica uma anidrase carbônica de planta (carbonato desidratase) ou uma anidrase βcarbônica de planta; e expressão do ácido nucleico antissenso ou inibitório na

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144 célula-guarda.

A invenção proporciona composições e métodos para controle de células-guarda in vivo, incluindo sua capacidade de formar poros estomatais ajustáveis na epiderme de uma planta; assim, a invenção proporciona composições e métodos para controle do influxo de CO2 para fotossíntese e perda de água das plantas através da transpiração para a atmosfera.

A invenção proporciona composições e métodos para controle de elevação diurna da concentração de CO2 na folha durante a fase noturna, bem como a elevação contínua de [CO2] atmosférico que causa fechamento dos poros estomatais de troca de gás; e, assim, a invenção pode afetar a fixação de carbono e eficiência de uso de água de plantas. A invenção proporciona composições e métodos para controle dos mecanismos de transdução de sinal que controlam os movimentos estomatais induzidos por CO2, incluindo sensores de CO2 que controlam essa resposta.

Usando microarranjos específicos para célula-guarda e célula de mesófilo, nós identificamos genes de anidrase β-carbônica altamente expressos, por exemplo, conforme designado CAI e CA4 aqui, também denominados no presente pedido SEQ ID NO: 3 (codificado, por exemplo, por SEQ ID NO: 1 ou “CA4” ou “CORP2”) ou SEQ ID NO: 9 (codificado, por exemplo, por SEQ ID NO: 7 ou “CAI” ou “CORP1”); e também incluindo SEQ ID NO: 6 (codificado, por exemplo, por SEQ ID NO: 4 ou “CA6”).

A presente invenção demonstra que plantas mutantes duplas com knockout (para os ácidos nucleicos da invenção CAI e CA4) mostram uma redução dramática na regulação de CO2 de troca de gás e movimentos estomatais da planta. Plantas mutantes duplo calca4 exibem respostas funcionais a outros estímulos fisiológicos, incluindo luz azul, transições de claro-escuro e o fito-hormônio ácido abscísico. Adição a curto prazo de um

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145 inibidor de enzima anidrase carbônica (CA) à epiderme de folhas do tipo silvestre imita a insensibilidade ao CO2 de cal ca4, consistente com o papel demonstrado na presente invenção para anidrases carbônicas em sinalização de CO₂.

Expressão célula-guarda objetivada de qualquer gene de CA da presente invenção complementa a percepção de CO2 e sinalização em plantas mutantes calca4, demonstrando que essa resposta ao CO2 se origina de células-guarda. Análises de fotossíntese de folhas mutantes intactas mostram que a mutação calca4 não afeta a fluorescência de clorofila ou a taxa de assimilação de CO2. Além disso, folhas do tipo silvestre alvejadas com norflurazon mostram movimentos estomatais induzidos por CO2 intactos, sugerindo que a via de sinalização CA-mediada que controla a troca de gás não está, a princípio, relacionada à fotossíntese.

Análises de epistase com o mutante de quínase htl (por exemplo, veja Hashimoto e colaboradores, 2006) ainda fornece evidência genética de que CAI e CA4 funcionam a montante na via de sinalização de CO2 em células-guarda.

Superexpressão objetivada de CAI ou CA4 em células-guarda intensifica grandemente a eficiência de uso de água de plantas Arabidopsis, consistente com um papel vital para essas CAs na regulação de troca de gás CO2 pela planta. Juntas, essas descobertas demonstram, pela primeira vez, uma função essencial dessas anidrase carbônicas expressas em célula-guarda, incluindo polipeptídeos da presente invenção, na regulação, pelo CO2, do influxo de CO2 e eficiência de uso de água de plantas e também demonstram que a função de CAI e CA4 dentro da maquinaria sensória de CO2 de sinalização ao CO2.

As composições e métodos da presente invenção podem ser usados para aliviar a elevação contínua no [CO2] atmosférico que é prevista como afetando ecossistemas naturais e agrícolas em um nível global.

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Resultados:

A invenção proporciona composições e métodos para super- e sub- expressão de genes de anidrase β-carbônica, por exemplo, genes da invenção, conforme designado CAI e CA4 aqui, também denominadas, no 5 presente pedido SEQ ID NO: 3 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 1 ou “CA4” ou “CORP2” ou Atlg70410) ou SEQ ID NO: 9 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 7 ou “CAI” ou “CORP1” ou At3g01500); e também incluindo SEQ ID NO: 6 (codificada, por exemplo, por SEQ ID NO: 4 ou “CA6” ou Atlg58180).

Dentre as diferentes classes de anidrase carbônica (CAs) que catalisam a hidratação reversível de CO2, os membros de CA da classe β, CAI (At3g01500), CA4 (Atlg70410) e CA6 (Atlg58180), mostraram altos níveis de expressão em células-guarda de acordo com análises de microarranjos célula-específicos; veja Figura 22, conforme descrito, por exemplo, por

Leonhardt e colaboradores, 2004; Yang e colaboradores, 2008. A Figura 22 ilustra a árvore filogenética de anidrase carbônicas (CAs) de Arabidopsis; veja por exemplo, Fabre e colaboradores, 2007 e correspondendo a dados de expressão de célula-guarda específica entre parênteses; Esquerda, 8K dados de microarranjo de Leonhardt e colaboradores, 2004; Direita, 23K dados de microarranjo de Yang e colaboradores, 2008. Conforme notado na Figura 22, CAI, CA4 e CA6 (em negrito) mostram os maiores valores de expressão dentre as CAs em células-guarda.

A Figura 9 ilustra que a ruptura de anidrases carbônicas CAI e CA4 expressas em célula-guarda prejudicam os movimentos estomatais CO225 induzidos. Por exemplo, expressão de CAI, CA4 e CA6 em célula-guarda foi confirmada através de RT-PCR, junto com os genes marcadores ΚΑΤΙ (At5g46240) específico para célula-guarda e CBP (At4g33050) específico para mesófilo (Mori e colaboradores, 2006), conforme ilustrado na Figura 9A.

RT-PCR foi usada para confirmar a expressão de CAI e CA4

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147 em células-guarda e células de mesófilo comparado com o marcador de célula-guarda, ΚΑΤΙ (At5g46240) e marcador de célula de mesófilo, CBP (At4g33050); veja, por exemplo, Nakamura e colaboradores, 1995; Mori e colaboradores, 2006. As Figuras 9B e 9C ilustram análise por RT-PCR de folhas do mutante duplo calca4-, os dados mostram falta de transcriçãos de CAI e CA4.

A Figura 9C, Figura 9D, Figura 9E e Figura 23 ilustram as respostas de condutância estomatal ao CO2, transições de luz azul e escuroclaro em plantas do tipo silvestre, mutantes calca4 ou calca4ca6 (d, e,n = l; n = 5). As folhas do mutante duplo calca4 mostram forte insensibilidade ao fechamento induzido por alto nível de CO2 (Figura 9C, Figura 9C, Figura 9C) e, consistente com esse fenótipo, mostram condutância estomatal elevada em [CO2] ambiente (365-400 ppm) (Figura 9C, Figura 9E); enquanto que plantas mutantes ca mostraram respostas estomatais robustas à luz azul e transição de claro-escuro (Figura 23). Os valores em d foram normalizados para o último ponto de dados antes da transição para 365-800 ppm de CO2.

A Figura 10A ilustra que estômatos em folhas do mutante duplo calca4 se fecham em resposta ao ácido abscísico; n = 3 experimentos, 30 estômatos/experimento e condições. As barras de erro representam a média ± s.e.m. A Figura 10B ilustra que os movimentos estomatais induzidos por CO2 são defectivos em folhas do mutante duplo calca4 e na epiderme de folhas do tipo silvestre tratadas com o inibidor de anidrase carbônica, 6-etóxi2-benzotiazola-sulfonamida (EZA) (n = 6, 30 estômatos/amostra); veja por exemplo, Becker e colaboradores, 2007.

Um mutante com inserção de T-DNA sequência-indexada (DNA de transferência) foi obtido do The Arabidopsis Information Resource (TAIR) Center para cada um dos três genes CAs e referidos como cal (SALK_106570), ca4 (WiscDsLox508Dll) e caó (SALK_044658). Em virtude do fato de os dados iniciais indicarem que todos os mutantes simples

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148 retinham sensibilidade normal ao CO2, os mutantes duplos calca4, ca4caó, calcaó, bem como o mutante triplo calca4caó, foram subsequentemente gerados para avaliação de sensibilidade ao CO2. Expressão de CAI e CA4 não foi detectada em folhas do mutante duplo calca4, conforme ilustrado na Figura 9B e a falta adicional de transcrição de CA6 em calca4ca6 foi também confirmada, conforme ilustrado na Figura 24A. A Figura 24A ilustra dados mostrando que os mutantes duplos ca4ca6 exibem respostas intactas ao CO2, enquanto que calca4 e calca4caó mostram a mesma deficiência na percepção de CO2. A Figura 24B, Figura 24C, Figura 24D e Figura 24E ilustram graficamente a condutância estomatal, em moles de água rn ² seg¹.

Análises de condutância estomatal em resposta a alterações de [CO2] mostraram uma forte insensibilidade ao CO2 nas plantas mutante duplo calca4, conforme ilustrado na Figura 9C, Figura 9D, Figura 9E; e no mutante triplo calca4caó, conforme ilustrado na Figura 24B, Figura 24C, Figura 24D e Figura 24E, enquanto que as plantas calcaó e ca4caó se comportaram semelhante ao tipo silvestre.

A Figura 9C ilustra que as plantas mutantes ca mostraram uma maior condutância estomatal em [CO2] ambiente (365-400 ppm). Em contraste à deficiência nas respostas ao CO2, conforme ilustrado na Figura 9C, Figura 9D, Figura 9E e Figura 24D, Figura 24E e Figura 24F, plantas calca4caó mostraram respostas robustas induzidas por luz azul e transições de claro-escuro, a despeito de maior condutância estomatal inicial das plantas mutantes ca, conforme ilustrado na Figura 23.

Para determinar se as respostas defectivas ao CO2 em folhas intactas (veja Figura 9C, Figura 9D, Figura 9E) estão relacionadas aos movimentos estomatais, as respostas ao CO2 foram analisadas na epiderme de folhas. Movimentos estomatais induzidos por CO2 eram defectivos em calca4 quando comparado com o tipo silvestre, conforme ilustrado na Figura 10B.

Além disso, quando a epiderme da folha do tipo silvestre foi tratada durante

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149 min com o inibidor de CA permeável à membrana, EZA (veja, por exemplo, Becker e colaboradores, 2007), a abertura e fechamento estomatal CO2-induzidos foram inibidos, o que se correlaciona com um papel para as anidrases carbônicas na percepção de CO2, ao invés de um efeito a longo prazo sobre o desenvolvimento de ruptura do gene CA sobre a resposta rápida ao CO2, conforme ilustrado na Figura 10B. Em contraste, fechamento estomatal induzido por ácido abscísico (ABA) era completamente funcional na epiderme de folhas calca4, conforme ilustrado na Figura 10A.

Quando construtos genômicos (aproximadamente 4,5 Kb) contendo apenas o gene CAI ou CA4 do tipo silvestre e sequências de flanqueamento foram introduzidos no mutante calca4, expressão de CAI ou CA4 foi restaurada em folhas de várias linhagens transgênicas independentes, conforme ilustrado na Figura 1 IA e Figura 11B. Em contraste à calca4, todas as linhagens transgênicas exibiram resposta semelhante ao tipo silvestre à alterações de [CO2], conforme ilustrado na Figura 11C e Figura 11D e Figura 25. Esses dados, portanto, demonstram que ruptura de CAI e CA4 é, na verdade, responsável pelos fenótipos observados em plantas calca4 e que expressão de qualquer gene é suficiente para complementação.

Em resumo, a Figura 11 ilustra que introdução de cópias genômicas do tipo silvestre de CAI ou CA4 complementa os fenótipos CO2insensíveis de calca4. Figura 11A e Figura 11B: ilustram dados de análises de RT-PCR (29 ciclos) que confirmam a restauração de expressão de CAI (Figura 11A) e CA4 (Figura 11B) em folhas do mutante duplo calca4 transformado com construtos genômicos de CAI (Figura 11 A) ou CA4 (Figura 11B). Três linhagens transgênicas independentes por construto genômico foram analisadas. Actina (At2g37620) foi usada como um controle. Figura 11C e Figura 11D: em contraste à calca4, as linhagens CA7#1 (Figura 11C) e CA4#1 (Figura 11D) complementadas exibem recuperação de alterações de condutância estomatal regulada por [CO2] (n = 8 folhas para

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150 calca4, n = 10 para tipo silvestre e n = 4 para qualquer uma das linhagens complementadas). As barras de erro representam a média ± s.e.m. Veja também Figura 25 para dados de outras linhagens transgênicas independentes.

Em resumo, a Figura 25 ilustra dados demonstrando que várias linhagens transgênicas independentes de calca4 transformado com uma cópia do tipo silvestre de CAI ou CA4 exibem recuperação de respostas induzidas por alterações de [CO2]. Duas linhagens adicionais complementadas com CAI, CA1#2 (Figura 25A) e CA1#3 (Figura 25B) ou CA4, CA4#2 (Figura 25C) e CA4#3 (Figura 25D) mostram aumento e diminuição normais de condutância em resposta a alterações de [CO2]. n = 4 folhas para cada uma das linhagens complementadas. Tipo silvestre (n = 10) e calca4 (n = 8) mostrados aqui são os mesmos conforme aqueles representados na Figura 11, discutida acima. As barras de erro representam a média ± s.e.m.

Para examinar a localização subcelular de CAI e CA4, a proteína fluorescente amarela (YFP) fundida ao C-término de CAI ou CA4 foi transitoriamente expressa em protoplastas de tabaco, conforme ilustrado na Figura 26, a qual ilustra fotografias fluorescentes (formação de imagem confocal) de células com diferentes padrões de localização de CAI-YFP e CA4-YFP em protoplastas de tabaco. Conforme notado na Figura 26, plasmídeos que codificam YFP, FLS2-YFP, CAI-YFP e CA4-YFP foram transitoriamente expressos em protoplastas de tabaco; filtros são indicados na parte superior da figura, enquanto que as fusões são indicadas à esquerda da figura; fotografias à direita da Figura 26 mostram uma sobreposição de imagens de YFP e clorofila. Similar à fusão FLS2-YFP localizada na membrana plasmática, esses dados demonstram que CA4-YFP se localiza na periferia da célula, enquanto que a fluorescência de CAI-YFP parece se colocalizar com os cloroplastos.

Formação de imagem confocal de CA4-YFP mostrou um padrão de expressão em célula periférica idêntico ao padrão de fusão de

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151 quinase do receptor transmembrana rico em Leu repetido FLS2-YFP (FLAGELLIN SENSITIVE2) (veja por exemplo, Robatzek e colaboradores,

2006), conforme ilustrado na Figura 26. Em contraste, a fluorescência da fusão CA1-YFP parecia cobrir a auto-fluorescência da clorofila, sugerindo que CAI pode estar localizada nos cloroplastos, conforme ilustrado na Figura

26. Esse padrão de expressão diferencial das fusões CA1-YFP e CA4-YFP está de acordo com outro estudo de localização de CA (veja, por exemplo, Fabre e colaboradores, 2007.

Uma vez que CA4 parece estar localizada em cloroplastos, nós avaliamos, então, se o papel de CAs na percepção de CO2 é dependente da fotossíntese comparando a fluorescência de clorofila do tipo silvestre e do mutante calca4ca6, no qual os três principais genes CA expressos em célulasguarda (veja Figura 22) sofreram knockout. A eficiência máxima do fotosistema II (Fv/Fm) em folhas adaptadas ao escuro não foi afetada por expressão errônea de CA, conforme ilustrado na Figura 12A. Similarmente, nenhuma diferença entre o rendimento quantum do foto-sistema II (PSII, 0psn) em folhas do tipo silvestre e calca4ca6 pré-adaptadas em baixa (50 pmoles m^s’¹) ou alta (2000 pmoles m^s’¹) radiação fotossinteticamente ativa foi detectada, conforme ilustrado na Figura 12B e Figura 12C. Se o papel de

CAs na percepção de CO2 é mediado através de atividades fotossintéticas, o início de fotossíntese na transição de escuro para iluminação com luz vermelha fotossinteticamente ativa seria afetado. Análise da taxa de assimilação de CO2 em calca4ca6 e no tipo silvestre mostraram que ambos os genótipos atingiram sua atividade fotossintética em estado uniforme na mesma estrutura de tempo sob 300 pmoles mV de irradiação com luz vermelha, conforme ilustrado na Figura 12D.

Para analisar adicionalmente se fotossíntese intacta é requerida para regulação de movimentos estomatais por CO2, outra abordagem foi realizada. As atividades fotossintéticas foram bloqueadas em folhas que

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152 emergiram recentemente regando plantas Arabidopsis thaliana do tipo silvestre de 3 a 4 semanas de idade com o inibidor de biossíntese de carotenóide Norflurazon (Nf), proporcionando folhas do tipo silvestre deficientes de clorofila albinas desprovidas de cloroplastos funcionais, 5 conforme ilustrado na Figura 13A (veja, por exemplo, Roelfsema e colaboradores, 2006). A ausência de cloroplastos funcionais nas plantas tratadas com Nf foi confirmada através de visualização, conforme ilustrado na Figura 13B e quantificação, conforme ilustrado na Figura 13C, da fluorescência de clorofila com microscopia confocal. Conforme ilustrado na 10 Figura 13D, a resposta estomatal ao CO₂ em baixo e alto nível de [CO₂] em folhas intactas não foi afetada pela ausência de cloroplastos funcionais (albinas 0 ppm de [CO₂], comparado com albinas 800 ppm de [CO₂], P = 8,9E-21, n = 6). Assim, nossos dados demonstram que as atividades fotossintéticas não são rompidas em plantas mutantes ca as quais mostraram 15 percepção defectiva de CO₂ e não são requeridas para uma resposta estomatal ao CO₂ funcional em Arabidopsis (conforme ilustrado nas Figuras 12 e 13), conforme previamente reportado em Vicia faba (veja, por exemplo, Roelfsema e colaboradores, 2006). Contudo, notando que a presente invenção não está limitada por qualquer mecanismo de ação em particular, essas 20 descobertas não excluem mecanismos CA-independentes adicionais pelos quais a fotossíntese pode estar relacionada aos movimentos estomatais (veja, por exemplo Messinger e colaboradores, 2006).

Em resumo, nas Figuras 12 e 13: atividades relacionadas à fotossíntese não estão diretamente ligadas à resposta estomatal CO₂-induzida 25 CA-mediada. A Figura 12A, Figura 1B e Figura 12C ilustram graficamente a análise de fluorescência de clorofila, que não revelou diferenças entre plantas do tipo silvestre e mutantes calca4ca6 com relação à eficiência máxima do foto-sistema II (PSII) - Fv/Fm, em folhas adaptadas ao escuro (n = 10) (Figura 12A) ou o rendimento quantum de PSII-0psn em folhas (n = 6) préPetição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 166/196

153 adaptadas a 50 pmoles rnV¹ (Figura 12B) ou 2000 pmoles mV (Figura

12C) de radiação fotossinteticamente ativa. A Figura 12D ilustra que a atividade fotossintética induzida por luz vermelha de folhas intactas não era defectiva em calca4ca6 (n = 6).

A Figura 13A ilustra uma imagem de folhas do tipo silvestre albinas clorofila-deficientes desprovidas de cloroplastos funcionais que foram geradas através de aplicação do inibidor de biossíntese de carotenóide norflurazon. A ausência de clorofila em células-guarda albinas, comparado com o tipo silvestre, foi visualizada através de microscopia confocal (a Figura 13B ilustra graficamente os dados) e quantificada através de análise de imagem da intensidade de fluorescência de clorofila (a Figura 13C ilustra graficamente os dados) (n = 3, 12 estômatos/amostra). A Figura 13D ilustra graficamente dados mostrando movimentos estomatais induzidos por CO2 em folhas de plantas albinas versus de controle (n = 7, 50 estômatos/amostra). As barras de erro representam a média ± s.e.m.

CAI e CA4 são expressos em células-guarda e células de mesófilo (veja Figura 9A) e plantas mutantes knock-out mostram respostas defectivas ao CO2. Em seguida, nós analisamos se expressão de CAI ou CA4 objetivada à células-guarda é suficiente para complementar os fenótipos de resposta ao CO2 do mutante calca4.

Os cDNAs de CAI ou CA4 acionados por um promotor forte de célula-guarda da presente invenção, conforme descrito no Exemplo 3, acima, foram transformados em plantas mutantes duplas calca4 e sua expressão célula-guarda preferencial foi confirmada através de RT-PCR em várias linhagens transgênicas independentes, conforme ilustrado na Figura 27A e Figura 27B, usando um marcador célula-guarda específico, ΚΑΤΙ (veja, por exemplo, Nakamira e colaboradores, 1998) e o marcador de células de mesófilo, CBP (veja, por exemplo, Mori e colaboradores, 2006). Plantas transgênicas calca4 expressando preferencialmente CAI ou CA4 em célulasPetição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 167/196

154 guarda mostraram alterações mais fortes na condutância estomatal em resposta a desvios de [CO₂], conforme ilustrado na Figura 27C, Figura 27D; e Figura 28; quatro linhagens transgênicas independentes foram analisadas no total. Esses resultados demonstram que a geração de expressão de genes 5 sensores de CO₂ da presente invenção, incluindo expressão de CAI ou CA4, em células-guarda é suficiente para complementar a resposta defectiva ao CO₂do mutante duplo calca4 e que essas anidrases carbônicas (CAs) funcionam em percepção de CO₂ primariamente em células-guarda. Assim, esses resultados demonstram que expressão de genes sensores de CO₂ da presente 10 invenção, incluindo expressão de CAI ou CA4, em células-guarda pode manipular as respostas ao CO₂ de plantas.

O componente mais precoce de sinalização ao CO₂ assim identificado em células-guarda é a quinase HT1, um regulador negativo da via (veja, por exemplo, Hashimoto e colaboradores, 2006). O alelo forte htl-2 15 exibe uma alta resposta constitutiva ao [CO₂J. Para investigar se as anidrases carbônicas (CAs) funcionam a montante ou a jusante de HT1, o mutante triplo calca4htl-2 foi gerado e sua condutância estomatal foi analisada em resposta a alterações de [CO₂J. Conforme claramente representado na Figura 27E e em evidente contraste com o mutante duplo calca4 ou o tipo silvestre, plantas 20 calca4htl-2 exibiram um fenótipo indistinguível do mutante simples htl-2.

Esses dados fornecem evidência genética de que CAI e CA4 atuam a montante do componente de sinalização mais precoce ao CO₂ conhecido até o momento, consistente com uma função sensora de CO₂ para essas anidrases carbônicas (CAs).

Em resumo, as Figuras 27A a G e Figura 14C ilustram graficamente dados mostrando que expressão célula-guarda preferencial acionada de cDNAs de CAI ou CA4 restaura a percepção de CO₂ em plantas superexpressando calca4 e CA e exibem eficiência de uso de água aprimorada. A Figura 27A e Figura 27B ilustram graficamente uma análise

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155 por RT-PCR de expressão de CAI e CA4 em protoplastas de células-guarda e células de mesófilo de plantas complementadas com CAI ou CA4 acionados por um promotor célula-guarda objetivado da presente invenção, pGCl (veja Exemplo 3, acima). GC, célula-guarda; MC, célula de mesófilo. CAlgc # n, linhagem de complementação n com cDNA de CAI acionado por um promotor de célula-guarda. ΚΑΤΙ, At5g46240, marcador de célula-guarda (Nakamura e colaboradores, 1998); CBP, At4g33050, marcador de célula de mesófilo (Mori e colaboradores, 2006).

A Figura 27C e Figura 27D ilustram graficamente a alteração na condutância estomatal induzida por CO2 de linhagens célula-guarda objetivadas, o mutante duplo calca4 e plantas do tipo silvestre (WT) em resposta a desvios indicados de [CO2] (em ppm, n = 4,± s.e.m.). Expressão de CAI ou CA4 em células-guarda é suficiente para restauração da resposta ao CO2. A Figura 27E ilustra graficamente a condutância estomatal de folhas calca4 (n = 4), tipo silvestre (n = 4), htl-2 (n = 7) e mutante triplo calca4htl-2 (n = 7) em resposta às alterações de [CO2] indicadas (em ppm, ± s.e.m.). A Figura 27F e Figura 27G ilustram graficamente a condutância estomatal de linhagens superexpressando CA e plantas do tipo silvestre (WT) em resposta às alterações de [CO2] indicadas (em ppm, n = 4,± s.e.m.).

A Figura 14C ilustra graficamente que plantas superexpressando CAI e CA4 mostram eficiência de uso de água aprimorada (WUE, pmol de CO2 / mmol de H2O¹) (n = 5, ± s.e.m.). A Figura 14D ilustra fotografias de linhagens do tipo silvestre, superexpressando calca4 e CA crescidas sob condições padrões.

Em resumo, as Figuras 28A a F ilustram graficamente que a complementação célula-guarda específica de CAI ou CA4 restaura as respostas estomatais ao CO2 em calca4. Dados de resposta ao CO2 de uma linhagem adicional complementada com expressão célula-guarda objetivada de CAI ou CA4, conforme graficamente ilustrado na Figura 28A e Figura 28B

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156 (η = 4) e a resposta de condutância estomatal relativa ao CO2 de 4 linhagens célula-guarda objetivadas complementadas independentes analisadas (duas na Figura 27C e Figura 27D; duas na Figura 28A e Figura 28B). As Figuras 28C a F ilustram graficamente que os valores de condutância estomatal relativa 5 foram normalizados para o último ponto de dados antes da troca de 365-800 ppm de CO2. As barras de erro representam a média ± s.e.m.

Nós também analisamos se superexpressão de CAI ou CA4 em células-guarda de plantas do tipo silvestre poderia ser uma boa estratégia para intensificar a resposta da planta a alterações de [CO2] atmosférico. Plantas 10 transgênicas superexpressando CAI ou CA4 sob o controle de um promotor de célula-guarda forte da presente invenção (conforme descrito no Exemplo 3, acima) foram geradas na base do tipo silvestre e confirmadas através de RTPCR, conforme ilustrado na Figura 14A e Figura 14B. Quatro linhagens superexpressando CAI e CA4s independentes mostraram uma condutância 15 estomatal reduzida em todas as concentrações de CO2 testadas, consistente com uma resposta intensificada ao CO2, conforme ilustrado na Figura 27F e Figura 27G. De modo interessante, uma diferença significativa na eficiência de uso de água (WUE) entre o mutante duplo calca4, superexpressando CA e plantas do tipo silvestre foi consistentemente percebida. Superexpressão do 20 gene CAI ou CA4 gene no tipo silvestre melhorou substancialmente a eficiência de uso de água em 50% em [CO2] ambiente, conforme ilustrado na Figura 14C, onde p<0,01. Sob a condição padrão imposta, nenhuma outra diferença fenotípica foi observada entre plantas do tipo silvestre e superexpressando CA, conforme na foto ilustrada na Figura 14D. Esses dados 25 demonstram que superexpressão célula-guarda objetivada de anidrases carbônicas (CAs), incluindo os genes de CA da presente invenção, proporciona uma abordagem eficiente e eficaz para melhorar a eficiência de uso de água de plantas. Esses dados demonstram que as composições e métodos da presente invenção podem ser usados para se dirigir a e aliviar o

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157 aumento nas concentrações de CO2 atmosférico.

Em resumo, a Figura 29 ilustra graficamente dados mostrando que a superexpressão de CAI ou CA4 em células-guarda do tipo silvestre diminui a condutância estomatal global e aumenta ligeiramente a magnitude da resposta estomatal ao CO2. A Figura 29C e Figura 29D ilustram graficamente a análise por RT-PCR de CAI ou CA4 em folhas de linhagens de superexpressão acionadas pelo promotor célula-guarda preferencial pGCl. Medições de condutância estomatal de uma linhagem de superexpressão adicional do gene CAI, conforme ilustrado na Figura 29A e a linhagem de superexpressão adicional do gene CA4, conforme ilustrado na Figura 29B. Valores de condutância estomatal relativos, conforme ilustrado na Figura 29C, Figura 29D, Figura 29E e Figura 29F, foram normalizados para o último ponto de dados antes de troca de 365-800 ppm de CO2. As barras de erro representam a média ± s.e.m. Figura 29A, Figura 29C, Figura 29D e Figura 29E, n = 4; Figura 29B, Figura 29F, n = 3.

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Exemplo 5; Enzimas PEPC e Rubisco exemplificativas para controlar a captação de CO2 e eficiência de uso de água pela planta

A invenção proporciona composições e métodos para regulação da troca de dióxido de carbono (CO2) e uso e captação de CO2 em uma planta ou parte de planta, por exemplo, a folha, através de manipulação de expressão de uma proteína de ligação a CO2 “Carboxilase de Fosfoenolpiruvato (PEP)” (ou carboxilase de PEP ou PEPC) e/ou a enzima carboxilase/oxigenase de ribulose-l,5-bisfosfato ou Rubisco; assim, a invenção também proporciona composições e métodos para manipulação de transdução de sinal de CO2 e regulação de troca de gás em uma planta ou parte de planta, por exemplo, um órgão de planta, folha e semelhantes. Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona composições e métodos para manipulação de uma quantidade aumentada de PEPC (para facilitar a abertura estomatal) e/ou manipulação da quantidade de enzima “Rubisco”.

Em aspectos alternativos da presente invenção, ácidos nucleicos de PEPC e Rubisco são expressos em células de planta, por exemplo, em células-guarda de planta e células de mesófilo; e, em um aspecto, eles são expressos em altos níveis (maior do que os níveis do tipo silvestre); ou a expressão de ácidos nucleicos de PEPC e Rubisco é inibida, diminuída ou reprimida em células de planta, por exemplo, em células-guarda de planta e células de mesófilo; e, em um aspecto, eles são expressos em menores níveis (menores do que o tipo silvestre). Células de planta manipuladas nessas modalidades alternativas incluem plantas e células de

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161 planta isoladas, cultivadas ou transgênicas da presente invenção.

Os seguintes ácidos nucleicos e subsequências dos mesmos exemplificativas de PEPC e Rubisco, incluindo sequências de codificação senso e através de (tais como siRNA, miRNA e semelhantes) podem ser usados para praticar as composições e métodos e métodos da presente invenção:

Nome atividade	SEQ ID NO: e Genbank No.	sequência
PPC1	SEQ ID NO: 12 Atlg53310	gttatgtatctctgaaatctgaatctgactgacttcaaaggacacagcttttacttct ataactgagcgaagcaggtgaaaaaatggcgaatcggaagttagagaagatg gcatcgattgatgttcatcttcgtcaactggttcctggcaaagttagtgaagacga caagcttgttgagtatgatgctttgcttctagatcggtttctcgatatcctccaggatt tgcacggtgaagatctccgtgaaactgttcaagagctttatgagcattctgcagaa tacgaagggaagcatgaacctaagaagctagaggagctagggagtgtgctaa cgagtttagatccaggagattccattgttatcgctaaagctttctctcatatgcttaa cttagccaatttggctgaggaagtgcagattgcttatcgccgtaggatcaagaag ctgaagaaaggtgattttgttgatgagagctctgctactactgaatctgatcttgaa gaaactttcaagaagcttgttggagatctgaacaagtctcctgaagagatctttga tgctctcaagaatcagactgtggatttggttttgactgctcatcctactcagtctgtg agaagatcattgcttcagaaacatgggaggataagagactgtctggctcaactat atgctaaggatattactcctgatgacaagcaagagctcgatgaggctcttcagag agagattcaagctgcattccgaacagatgaaatcaaaagaacaccacctactcc tcaagatgagatgagagcgggaatgagttatttccatgaaactatctggaaaggt gttcctaagtttctgcgccgtgttgacacggctttgaaaaacatagggatcgaag aacgtgttccatataatgctccattgattcagttctcttcttggatgggtggtgatcgt gacggtaacccaagggttacacctgaagtcaccagagatgtttgcttgttagcta gaatgatggctgctactatgtactttaaccaaatcgaagatcttatgtttgagatgtc tatgtggcgttgcaatgacgagctgcgtgcgcgagctgatgaagttcatgcaaat tcgaggaaagatgctgcaaaacattacatagaattctggaagtcaattcctacaa ctgagccataccgtgtgattcttggcgatgtaagggacaagctttatcacacacgt gaacgcgctcatcaactgctcagcaatggacactctgatgtccctgtagaggcta ctttcattaacttggaacagttcttggaacctcttgagctctgttaccgatctctgtgt tcatgtggtgatcgtccaatagcagatggaagccttcttgatttcttgaggcaagtc tcaacctttgggctctctcttgtgagacttgacataaggcaagaatctgaccgcca cactgatgtattggatgctatcaccacgcatttagatatcggatcctacagagagt ggtctgaagaacgccgccaagaatggcttttatctgagctaagtggcaaacgtc cgcttttcggttctgatcttcctaaaaccgaagaaatagctgatgttctggacacgt ttcatgtcatagccgagctaccagcagatagctttggtgcttacattatctctatgg caactgcaccttctgatgtattagctgttgagcttttacagcgtgaatgccgagtga aacagcctttgagagttgttccgctctttgagaagctagcagatctggaagcagc tcctgctgcagttgctaggctcttttctgttgattggtacaaaaaccgaattaacggt aagcaagaggttatgattggttattcggattcaggaaaagatgctggacggttatc tgctgcttggcagttatacaaagctcaagaagagcttgtgaaggttgctaaagag tacggtgtgaagctaacaatgtttcacggtcgtggtggcacggtcggaagagga ggtggaccaacccatcttgctatattgtctcagcctccggatactattaacggttcc ctccgtgtcacagttcaaggtgaagtcatcgagcaatcgtttggtgaagagcact tatgctttagaacacttcagcgtttcacagctgctacactcgagcacggtatgcgt

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		aatttggttcttggatgggaggtgatagagatggaaatccaaatgtcacggcaaa ggtcacgaaagaagtatctctcttgtctagatggatggctattgatttgtacataag agaggttgatagcttaagatttgaattatctacggatcgatgcagtgataggttttc aagattagctgataaaattcttgaaaaggattatgatagaggaaaatcaaatttcc aaaagcaacaaagttcatcatgcttgccaacacaacttccagctagagctcacct tcctgcttgcattgactttggtgaatcacgacataccaaatttgaaattgcgacgac agattatatgccacccaatctccagaagcagaatgaacaagacttttcggaaagc gactgggagaaaattgacaatggttcgcggtccggtcttacttctcgaggttcttt ctcatctacttctcaacttcttctccagagaaaactatttgaggaatctcaggttggg aagactagtttccaaaagctactagaaccacctccacttaaacgagctggaagtg ctccttatcgtattgttcttggagaagtaaaagaaaagcttgtgaagacaagaaga cttcttgaacttcttattgagggtcttccttgtgagtatgaccctaaaaactcctatga aacatcagatcagcttcttgaaccattgctcctctgttacgaatctctgcaatcatc gggtgctagggtactagctgatggacgacttgctgatctgattcgtagagtttcta cctttggaatggttttggtgaaactcgacttacgccaggaagctgcaagacattct gaagctttggatgcaattacaacatacttggatatgggtacttatagtgaatgggat gaagagaagaaattagaatttttgacaagagaactaaaagggaaacgacctctt gttcctcaatgtattaaggttggtcctgacgtcaaagaagtattggacacattccg agtcgctgctgaacttggaagtgaatcacttggcgcttacgttatttctatggcttc aaatgcaagtgatgtcctcgctgtggaacttcttcaaaaagatgctcgacttgcttt aactagcgaacatggaaaaccatgtcctggtggaacgctacgagtggtacctct ttttgaaacggtgaatgatttaagagccgctggtccttcgataaggaaattgctctc aatcgattggtatagggaacacatccaaaagaaccacaacggtcaccaagagg tgatggttggatactctgattctggaaaagatgctggacgttttactgcagcatgg gaactctacaaagctcaagaaaatgttgttgctgcttgtaatgaatttggaatcaaa ataacattatttcatggacgaggaggaagcattggtcgtggtggtggtccaacct atctcgctattcagtcccaaccaccaggctctgtaatgggctctttgcgttcaactg agcaaggtgagatggttcaagctaagtttgggataccacaaacggctgttaggc aactagaggtatacacaaccgcggttctactcgctaccttaaagcctcctcagcc acctcgagaggaaaaatggcgaaacctaatggaagaaatctctggaatcagttg ccaacactatagaagcacagtgtatgaaaacccagagtttctatcttattttcatga ggcaacaccgcaagcagaacttggtttcctcaatataggaagccgaccaacac gaagaaagagctctagtggaataggacatctccgagctatcccttgggtctttgc ttggactcaaacaaggtttgttcttccagcttggcttggtgtaggggctggtttaaa gggagtttctgagaagggtcatgcggatgatcttaaagagatgtacaaagaatg gccattttttcagtccacccttgaacttatagagatggtgttagctaaagcagacat tccaatgaccaaacactacgacgaacaacttgtgtctgagaaaagaagaggact tggcactgagctaagaaaagaactaatgactactgagaagtacgttcttgtgata agtggtcacgagaaactcttgcaggacaataagagcttgaagaaactcattgata gtagacttccgtatctcaacgcaatgaacatgttacaagttgaaattcttaagagg ctaagacgtgatgaagataacaataagctaagagatgctttgcttatcacaatcaa tggtattgctgcaggaatgagaaataccggttaa
RBCS- 1A	SEQ ID NO: 16 Atlg67090	tcagtcacacaaagagtaaagaagaacaatggcttcctctatgctctcttccgcta ctatggttgcctctccggctcaggccactatggtcgctcctttcaacggacttaag tcctccgctgccttcccagccacccgcaaggctaacaacgacattacttccatca caagcaacggcggaagagttaactgcatgcaggtgtggcctccgattggaaag aagaagtttgagactctctcttaccttcctgaccttaccgattccgaattggctaag gaagttgactaccttatccgcaacaagtggattccttgtgttgaattcgagttggag cacggatttgtgtaccgtgagcacggtaactcacccggatactatgatggacggt actggacaatgtggaagcttcccttgttcggttgcaccgactccgctcaagtgttg aaggaagtggaagagtgcaagaaggagtaccccaatgccttcattaggatcatc

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 179/196

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		ggattcgacaacacccgtcaagtccagtgcatcagtttcattgcctacaagccac caagcttcaccggttaatttccctttgcttttgtgtaaacctcaaaactttatccccca tctttgattttatcccttgtttttctgcttttttcttctttcttgggttttaatttccggactta acgtttgttttccggtttgcgagacatattctatcggattctcaactgtctgatgaaat aaatatgtaatgttctataagtctttcaatttgatatgcatatcaacaaaaagaaaat aggacaatgcggctacaaatatgaaatttacaagtttaagaaccatgagtcgcta aagaaatcattaagaaaattagtttcac
RBCS1B	SEQ ID NO: 17 At5g38430	attaggcaaaagaagaagaagaagaagtaatggcttcctctatgctctcctctgc cgctgtggttacctccccggctcaagccaccatggtcgctccattcactggtttga agtcatccgcttctttcccggtcacccgcaaggccaacaacgacattacttccatc acaagcaatgggggaagagttagctgcatgaaggtgtggccaccaatcggaa agaagaagtttgagactctatcttacctccctgaccttactgacgtcgaattggcta aggaagttgactaccttctccgcaacaaatggattccttgtgttgaattcgagttgg agcacggatttgtgtaccgtgagcacggaaacactcccggatactacgatggac ggtactggacaatgtggaagcttccattgttcggatgcaccgactccgctcaagt gttgaaggaagttgaagaatgcaagaaggagtacccgggcgccttcattaggat catcggattcgacaacacccgtcaagtccaatgcatcagtttcattgcctacaag cccccaagcttcactgatgcttaaatccttttctggaatattcaatgttgactatccg gaacccaattttgtatggtcaatgtaaatttaagtaattattttgccaaagtgaaaaa actgaaggtttgtttttctatcgtttcctctataaaaatctctattcatatcacttcatttc tgctcttatcacttttaactctttttattcgttttatctcttttaactaacattttagttccttt aaatttctctccta
RBCS2B	SEQIDNO: 18 At5g38420	caagtaagtaagagaaaaaccaaaagaagaagagaaacaacaagaagaagt aatggcttcctctatgttctcctccaccgctgtggttacctccccggctcaagcca ccatggtcgctccattcaccggcttgaagtcatccgcttctttcccggtcacccgc aaggccaacaacgacattacttccatcacaagcaacggaggaagagttagctg catgaaggtgtggccaccaatcggaaagaagaagtttgagactctatcttacctc cctgaccttagtgacgttgaattggctaaggaagttgactaccttctccgcaacaa gtggattccttgtgttgaattcgagttggagcacggatttgtgtaccgtgagcacg gaaacactcccggatactatgatggacgatactggacaatgtggaagcttccatt gttcggatgcaccgactccgctcaagtgttgaaggaagttgaagaatgcaagaa ggagtaccctggcgccttcattaggatcatcggattcgacaacacccgtcaagtc caatgcatcagtttcattgcctacaagcccccaagcttcaccgaagcttaatcccc tttctggaatattcagcgttgattattctggaacccatttctatgtggtcaatgcaaat ttaagaaattatttgccgacttaacagttgaggaactattgtttgaaagtgaaaatgt tattcctatcagtttctctataattatagttatcatttcatttcatttttgcccttaaatcttt gaaatcttatttttcgtttagctcctttaaacaacattgtggctcctttaaattatcctca taattcttgct
RBCS3B	SEQ ID NO: 19 At5g38410	gggcttttcgcctttagggggttctcattatataaagatgacaacaccagtaggaa aacaagtcagtaagtaaacgagcaaaagaagaagagaaacaacaagaagtag taatggcttcctctatgctctcctccgccgctgtggttacatccccggctcaggcc accatggtcgctccattcaccggcttgaagtcatccgctgcattcccggtcaccc gcaagaccaacaaggacatcacttccatcgcaagcaacgggggaagagttag ctgcatgaaggtgtggccaccaattggaaagaagaagtttgagactctatcttac ctccctgaccttagtgacgtcgaattggctaaggaagttgactaccttctccgcaa caagtggattccttgtgttgaattcgagttagagcacggaaacactcccggatact acgatggacggtactggacaatgtggaagcttccattgttcggatgcaccgactc cgctcaagtgttgaaggaagttgaagaatgcaagaaggagtacccgggcgcct tcattaggatcatcggattcgacaacacccgtcaagtccaatgcatcagtttcatt gcctacaagcccccaagcttcaccgaagcttaatttcttttctaaaacattcttatga attatctctgctcatttcatttcctattgtctgtgttctttttctctttatgagacaatttcta

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tcggattgtcaaatgtctgatttatgaatatgtaatttatatatccgtgcgtcttgatttt ttccgatggttaactagtttgaaaatttccgatgagataagacaacatacaaaaaat cgaataaattgtgtaaatatagataatagtgacatatggatttgtattcatatttgtcc attgttttaagaggaaaaaagttacaaaatcttattttcttaataataagtaaatttact tt

Exemplo 6: Enzima anidrase carbônica exemplificativa para controlar a captação de CO2 e eficiência de uso de água pela planta

A invenção proporciona composições e métodos para regulação negativa ou diminuição da troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célula-guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta compreendendo, inter alia, uso de um polipeptídeo tendo atividade de anidrase carbônica. Ácidos nucleicos que codificam anidrase carbônica de qualquer gene de anidrase carbônica, por exemplo, incluindo genes de planta e bacterianos, podem ser usados para 10 praticar a presente invenção; por exemplo, um ácido nucleico de qualquer gene de anidrase carbônica de qualquer planta pode ser usado, incluindo qualquer sequência de ácido nucleico que codifica anidrase carbônica de qualquer família de gene de Arabidopsis, por exemplo, qualquer sequência de ácido nucleico que codifica anidrase carbônica de uma família Arabidopsis, 15 por exemplo, de Arabidopsis thaliana, pode ser usado para praticar as composições e métodos da presente invenção, tais como as sequências de ácido nucleico que codificam anidrase carbônica exemplificativas:

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Nome atividade	SEQ ID NO: e Genbank No.	sequência
CA2 AtpCA2 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 20 At5gl4740	aaatagagaagctcttcaagtatccgatgtttttgtttaatcaacaagaggcggaga tacgggagaaattgcatgtgtaatcataaaatgtagatgttagcttcgtcgtttttact atagtttagttctcttcttcttcttttttcgtcattacaatctctttcttaatttacttcttcttg atagtataattaagttgtttgtaataatctgtacaaagatgttgtgttctcataaaaaatt caattttgtaaagaagctctacatgttccttgctctgtaaacatggtccccttttggact acagtttctcgaaatggctcatcagactcagagacgactctccaatctgcttcaaaa gccacaaaacagtataaatatccttctcttcgtccctctcatcgcctgtctctcctctt cctcttcccgttccatttatccgcaaacggagcttgttttcggtgcacctgcttcagc cacttcaaacttgaactgagaaggatgggaaacgaatcatatgaagacgccatcg aagctctcaagaagcttctcattgagaaggatgatctgaaggatgtagctgcggc caaggtgaagaagatcacggcggagcttcaggcagcctcgtcatcggacagca aatcttttgatcccgtcgaacgaattaaggaaggcttcgtcaccttcaagaaggag aaatacgagaccaatcctgctttgtatggtgagctcgccaaaggtcaaagcccaa agtacatggtgtttgcttgttcggactcacgagtgtgcccatcacacgtactagactt ccatcctggagatgccttcgtggttcgtaatatcgccaatatggttcctccttttgaca aggtcaaatatgcaggagttggagccgccattgaatacgctgtcttgcaccttaag gtggaaaacattgtggtgatagggcacagtgcatgtggtggcatcaaggggctta tgtcatttcctcttgacggaaacaactctactgacttcatagaggattgggtcaaaat ctgtttaccagcaaagtcaaaagttttggcagaaagtgaaagttcagcatttgaaga ccaatgtggccgatgcgaaagggaggcagtgaatgtgtcactagcaaacctattg acatatccatttgtgagagaaggagttgtgaaaggaacacttgctttgaagggag gctactatgactttgttaatggctcctttgagctttgggagctccagtttggaatttcc cccgttcattctatatgaactaacacatcaccatcaccatcgctaccaccaccatca caaacatcatcatcgtcgtcatcatcatgatcagcatcttcatatataaatgttttactc ttatttaattgctacttgtaatggtatacatttacttgcgatgagcttcttttccttcattat ccagttataaaataaataaataaatcatgtttactttcacagatatcgttttgctgaagt tgctttgattt
At aCAl de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 21 AtaCAl (At3g52720)	ATGCAGTAATCTGATAAAACCCTCCACAGAGATT TCCAACAAAACAGGAACTAAAACACAAGATGAA GATTATGATGATGATTAAGCTCTGCTTCTTCTCCA TGTCCCTCATCTGCATTGCACCTGCAGATGCTCAG ACAGAAGGAGTAGTGTTTGGATATAAAGGCAAA AATGGACCAAACCAATGGGGACACTTAAACCCTC ACTTCACCACATGCGCGGTCGGTAAATTGCAATC TCCAATTGATATTCAAAGGAGGCAAATATTTTAC AACCACAAATTGAATTCAATACACCGTGAATACT ACTTCACAAACGCAACACTAGTGAACCACGTCTG TAATGTTGCCATGTTCTTCGGGGAGGGAGCAGGA GATGTGATAATAGAAAACAAGAACTATACCTTAC TGCAAATGCATTGGCACACTCCTTCTGAACATCA CCTCCATGGAGTCCAATATGCAGCTGAGCTGCAC ATGGTACACCAAGCAAAAGATGGAAGCTTTGCTG TGGTGGCAAGTCTCTTCAAAATCGGCACTGAAGA GCCTTTCCTCTCTCAGATGAAGGAGAAATTGGTG AAGCTAAAGGAAGAGAGACTCAAAGGGAACCAC ACAGCACAAGTGGAAGTAGGAAGAATCGACACA AGACACATTGAACGTAAGACTCGAAAGTACTACA

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		GATACATTGGTTCACTCACTACTCCTCCTTGCTCC GAGAACGTTTCTTGGACCATCCTTGGCAAGGTGA GGTCAATGTCAAAGGAACAAGTAGAACTACTCA GATCTCCATTGGACACTTCTTTCAAGAACAATTC AAGACCGTGTCAACCCCTCAACGGCCGGAGAGTT GAGATGTTCCACGACCACGAGCGTGTCGATAAAA AAGAAACCGGTAACAAAAAGAAAAAACCCAATT AAAATAGTTTTACATTGTCTATTGGTTTGTTTAGA ACCCTAATTAGCTTTGTAAAACTAATAATCTCTTA TGTAGTACTGTGTTGTTGTTTACGACTTGATATAC GATTTCCAAAT
AtaCA2 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 22 AtaCA2 (At2g28210)	ATGGATGAATATGTAGAGGATGAACACGAATTCA GCTACGAATGGAACCAAGAGAACGGGCCAGCGA AATGGGGAAAGCTAAGACCGGAATGGAAAATGT GCGGAAAAGGAGAAATGCAATCGCCTATTGATCT TATGAACAAAAGAGTTAGACTTGTTACTCATCTT AAAAAGCTTACTAGACACTACAAACCTTGTAACG CCACTCTCAAAAATAGAGGCCATGATATGATGCT GAAATTTGGAGAAGAAGGGTCAGGGAGTATTAC GGTCAATGGAACTGAGTATAAACTCTTACAGCTT CATTGGCATTCTCCCTCTGAACATACTATGAATG GAAGAAGGTTTGCTCTCGAGCTACACATGGTTCA CGAAAACATTAACGGAAGTTTGGCTGTAGTCACA GTCCTCTACAAAATCGGAAGGCCAGATTCTTTTC TCGGATTGCTGGAAAATAAATTGTCGGCAATTAC AGATCAAAATGAGGCGGAGAAATATGTAGATGT GATTGACCCAAGGGATATTAAGATTGGGAGCAG AAAATTTTATAGATACATTGGATCACTTACTACTC CTCCTTGTACGCAAAATGTTATTTGGACCGTCGTT AAAAAGGTAAATACTCATCGTTATTTTCTTCTCTT TTTTACTTAATCAAACATAGCATTAATAGATCATT ACAAGGTACTAATAGTGTGAATATCCATATCCAA AAGGTTTATCCATCTACATGTTA
AtaCA3 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 23 AtaCA3 (At5g04180)	AAAACACATTCTGAGAAGAAGAAGAAGAAAATA AGAAAAAACAAAAGATGAAAACCATTATCCTTTT TGTAACATTTCTTGCTCTTTCTTCTTCATCTCTAGC CGATGAGACAGAGACTGAATTTCATTACAAACCC GGTGAGATAGCCGATCCCTCGAAATGGAGCAGTA TCAAGGCTGAATGGAAAATTTGCGGGACAGGGA AGAGGCAATCGCCAATCAATCTTACTCCAAAAAT AGCTCGCATTGTTCACAATTCTACAGAGATTCTTC AGACATATTACAAACCTGTAGAGGCTATTCTTAA GAACCGTGGATTCGACATGAAGGTTAAGTGGGA AGACGATGCAGGGAAGATCGTGATCAATGATAC CGACTATAAATTGGTTCAAAGCCACTGGCACGCA CCTTCAGAGCATTTTCTCGATGGACAGAGGTTGG CAATGGAACTTCACATGGTACACAAAAGTGTAGA AGGGCACTTGGCAGTGATTGGAGTTCTCTTCAGA GAAGGAGAACCAAATGCTTTCATTTCGCGGATCA TGGACAAGATCCATAAGATCGCAGACGTACAAG ATGGAGAGGTCAGCATCGGAAAGATAGATCCAA

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		GAGAATTTGGATGGGATCTTACAAAGTTTTATGA ATACAGAGGTTCTCTCACGACTCCTCCTTGCACG GAAGATGTCATGTGGACCATCATCAACAAGGTGG GGACTGTTTCACGTGAGCAAATTGATGTATTGAC AGATGCTCGTCGCGGTGGTTATGAGAAGAACGCG AGACCAGCTCAACCTCTGAACGGACGTCTGGTTT ATTTAAACGAGCAGTCCAGTCCAAGTCCAACTCC ACGGCTAAGAATACCACGAGTTGGTCCGGTCTAA GACAGTCTTATAGGACAAGGCAACTCCGAGCCCT AATTTCCATACAAAGAAAATTCGGAAAAGAATTT TGAAGATGTATGAAAATTGGGAGCCATAACTATT TTTTTTTAACTATTCTTTT_GATTAAAA_GATAAAAC TAC_GCAATATTATAT_GCATAAA_GTTTTTCTTTTAT ACAT_GTATTCCAATAAACAA_GAT_GTAATAATATC CAACCATAAT_GA_GTT_GTTT_GATTATTTTATAACAC AACjATCTCTCAC
AtaCA4 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 24 AtaCA4 (At4g20990)	AT_GGATACCAAC_GCAAAAACAATTTTCTTCAT_GGCTAT_GT_GTTTCATCTATCTATCTTTCCCTAATATTT CACAC_GCTCATTCT_GAA_GTC_GAC_GAC_GAAACTCC ATTTACTTAC_GAACAAAAAAC_GGAAAA_GGGACC A_GA_GGGAT_GGGGCAAAATAAATCC_GCACT_GGAA A_GTTT_GTAACACC_GGAA_GATATCAATCCCC_GATC _GATCTTACTAAC_GAAA_GA_GTCA_GTCTTATTCAT_GATCAA_GCAT_GGACAA_GACAATATAAACCA_GCTCC _GGCT_GTAATTACAAACA_GA_GGCCAT_GACATTAT_{G G}TATCAT_GGAAA_GGA_GAT_GCT_GGGAA_GAT_GACA ATAC_GGAAAAC_GGATTTTAATTT_GGT_GCAAT_GCC ATT_GGCATTCACCTTCT_GA_GCATACC_GTTAAC_GGAACTA_GGTAC_GACCTA_GA_GCTTCACAT_GGTTCAC AC_GA_GT_GCAC_GA_GGCA_GAACT_GC_GGTTATC_GGA _GTTCTTTACAAATTA_GGC_GAACCTAAT_GAATTCC TCACCAA_GCTACTAAAT_GGAATAAAA_GCA_GT_{GG G}AAATAAA_GA_GATAAATCTA_GGGAT_GATT_GATCC AC_GA_GA_GATTA_GGTTTCAAACAA_GAAAATTCTAT A_GATACATT_GGCTCTCTCACT_GTTCCTCCTT_GCAC T_GAA_GGC_GTCATTT_GGACT_GTC_GTCAAAA_GGGT_GAACACAATATCAAT_GGA_GCAAATTACA_GCTCTTA _GGCAA_GCC_GTT_GAC_GAT_GGATTT_GA_GACAAATTC AA_GACC_GGTTCAA_GACTCAAA_GGGAA_GATCA_GT TT_GGTTCTAT_GATCCAAAT_GTTT_GA
AtaCA5 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 25 AtaCA5 (Atlg08065)	_GATCAACATCTCCTT_GAA_GTT_GTTTCATAA_GAAT AA_GA_GCTATAAAA_GA_GGATAAAACCAAAATTT_{G AATTTTTTTCTTCTATCTCTCTCCCCAAGATATAT}A_GCACAA_GAAAAT_GAA_GATACCATCAATT_GGCT AT_GTCTTTTTCCTTATCTTCATCTCTATTACAATT_GTTTC_GA_GTTCACCA_GATCAT_GGA_GAA_GTT_GA_GGA C_GAAAC_GCA_GTTTAACTAC_GA_GAA_GAAA_GGA_GA _GAA_GGGGCCA_GA_GAACT_GGGGAA_GACTAAA_GCC A_GA_GT_GGGCAAT_GT_GT_GGAAAA_GGCAACAT_GCA _GTCTCC_GATT_GATCTTAC_GGACAAAA_GA_GTCTT_GATT_GATCATAATCTT_GGATACCTTC_GTA_GCCA_GT

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		ATTTACCTTCAAATGCCACCATTAAGAACAGAGG CCATGATATCATGATGAAATTTGAAGGAGGAAAT GCAGGTTTAGGTATCACTATTAATGGTACTGAAT ATAAACTTCAACAGATTCATTGGCACTCTCCTTCC GAACACACACTCAATGGCAAAAGGTTTGTTCTTG AGGAACACATGGTTCATCAGAGCAAAGATGGAC GCAACGCTGTTGTCGCTTTCTTTTACAAATTGGGA AAACCTGACTATTTTCTCCTCACGTTGGAAAGAT ACTTGAAGAGGATAACTGATACACACGAATCCCA GGAATTTGTCGAGATGGTTCATCCTAGAACATTC GGTTTTGAATCAAAACACTATTATAGATTTATCG GATCACTTACAACTCCACCGTGTTCTGAAAATGT GATTTGGACGATTTCCAAAGAGATGAGGACTGTG ACATTAAAACAATTGATCATGCTTCGAGTGACTG TACACGATCAATCTAACTCAAATGCTAGACCGCT TCAGCGTAAAAATGAGCGTCCGGTGGCACTTTAC ATACCAACATGGCATAGTAAACTATATTAAATAT TTAAGTTTGGTTTATATTCTTTCTAGTAATCTTTG AAATATTGTAAGAGATAATGCTTCTAATAAATAA CATTGGATTTATTGGAATTAATGTATTGAAAAAA CTATGCAAATACTACAGTGTATTTTGGAACGACC
AtaCAó de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 26 AtaCAó (At4g21000)	ATGGATGCCAACACAAAAACAATTTTATTTTTTG TAGTGTTCTTCATCGATTTATTTTCCCCTAATATTT TATTCGTTTATGCTCGTGAAATCGGCAACAAACC GCTATTTACATACAAACAAAAAACAGAGAAAGG ACCAGCGGAATGGGGCAAATTAGACCCTCAATG GAAAGTTTGTAGCACCGGAAAAATTCAATCTCCG ATTGATCTCACTGACGAAAGAGTCAGTCTTATTC ATGATCAAGCCTTGAGTAAACATTACAAACCAGC TTCGGCTGTAATTCAAAGTAGAGGACATGACGTT ATGGTATCGTGGAAAGGAGATGGTGGGAAAATA ACAATACATCAAACGGATTATAAATTGGTGCAGT GCCATTGGCATTCACCGTCTGAGCATACCATTAA CGGAACTAGCTATGACCTAGAGCTTCACATGGTT CACACGAGTGCTAGTGGCAAAACCACTGTGGTTG GAGTTCTTTATAAATTAGGTGAACCTGATGAATT CCTCACAAAGATACTAAATGGAATAAAAGGAGT AGGGAAAAAAGAGATAGATCTAGGAATCGTGGA TCCTCGAGATATTAGATTTGAAACCAACAATTTC TATAGATACATTGGCTCTCTCACTATTCCTCCATG CACCGAAGGCGTTATTTGGACCGTCCAGAAAAGG GTATTATATTTTTTTTGTTTCTGTTATAGATTAATT ATCTTCGTTACACCTTACATAAACATTTTTTGGAT TTTTGTTTTTGTATTTTGGTGTATGCTAATGTAA
AtaCA7 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 27 AtaCA7 (Atlg08080)	ATGGTGAACTACTCATCAATCAGTTGCATCTTCTT TGTGGCTCTGTTTAGTATTTTCACAATTGTTTCGA TTTCGAGTGCTGCTTCAAGTCACGGAGAAGTTGA GGACGAACGCGAGTTTAACTACAAGAAGAACGA TGAGAAGGGGCCAGAGAGATGGGGAGAACTTAA ACCGGAATGGGAAATGTGTGGAAAAGGAGAGAT GCAATCTCCCATAGATCTTATGAACGAGAGAGTT

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 185/196

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		AACATTGTTTCTCATCTTGGAAGGCTTAATAGAG ACTATAATCCTTCAAATGCAACTCTTAAGAACAG AGGCCATGACATCATGTTAAAATTTGAAGATGGA GCAGGAACTATTAAGATCAATGGTTTTGAATATG AACTTCAACAGCTTCACTGGCACTCTCCGTCTGA ACATACTATTAATGGAAGAAGGTTTGCACTTGAG CTGCATATGGTTCACGAAGGCAGGAATAGAAGA ATGGCTGTTGTGACTGTGTTGTACAAGATCGGAA GAGCAGATACTTTTATCAGATCGTTGGAGAAAGA ATTAGAGGGCATTGCTGAAATGGAGGAGGCTGA GAAAAATGTAGGAATGATTGATCCCACCAAAATT AAGATCGGAAGCAGAAAATATTACAGATACACT GGTTCACTTACCACTCCTCCTTGCACTCAAAACGT TACTTGGAGCGTCGTTAGAAAGGTTAGGACCGTG ACAAGAAAACAAGTGAAGCTCCTCCGCGTGGCA GTGCACGATGATGCTAATTCGAATGCGAGGCCGG TTCAACCAACCAACAAGCGCATAGTGCACTTATA CAGACCAATAGTTTAATATATGAAGATACTGAAA GCTTTTACTAATC
AtaCA8 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 28 AtaCA8 (At5g56330)	ATGAAGATATCATCACTAGGATGGGTCTTAGTCC TTATCTTCATCTCTATTACCATTGTTTCGAGTGCA CCAGCACCTAAACCTCCTAAACCTAAGCCTGCAC CAGCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCACACC AGCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCAAACCA GCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCTGCACCAG CACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCGCACCAGC ACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCAAACCAGCA CCTACACCTCCTAATCCTAAGCCCACACCAGCAC CTACACCTCCTAAACCTAAGCCTGCACCAGCACC AGCACCAACACCAGCACCGAAACCTAAACCTGC ACCTAAACCAGCACCAGGTGGAGAAGTTGAGGA CGAAACCGAGTTTAGCTACGAGACGAAAGGAAA CAAGGGGCCAGCGAAATGGGGAACACTAGATGC AGAGTGGAAAATGTGTGGAATAGGCAAAATGCA ATCTCCTATTGATCTTCGGGACAAAAATGTGGTA GTTAGTAATAAATTTGGATTGCTTCGTAGCCAGT ATCTGCCTTCTAATACCACCATTAAGAACAGAGG TCATGATATCATGTTGAAATTCAAAGGAGGAAAT AAAGGTATTGGTGTCACTATCCGTGGTACTAGAT ATCAACTTCAACAACTTCATTGGCACTCTCCTTCC GAACATACAATCAATGGCAAAAGGTTTGCGCTAG AGGAACACTTGGTTCATGAGAGCAAAGATAAAC GCTACGCTGTTGTCGCATTCTTATACAATCTCGGA GCATCTGACCCTTTTCTCTTTTCGTTGGAAAAACA ATTGAAGAAGATAACTGATACACATGCGTCCGAG GAACATATTCGCACTGTGTCAAGTAAACAAGTGA AGCTTCTCCGTGTGGCTGTACACGATGCTTCAGA TTCAAATGCCAGGCCGCTTCAAGCAGTCAATAAG CGCAAGGTATATTTATACAAACCAAAGGTTAAGT TAATGAAGAAATACTGTAATATAAGTTCTTACTA G

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 186/196

173

AtpCAl de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 27 AtpCAl (At3g01500)	ATGAAGATATCATCACTAGGATGGGTCTTAGTCC TTATCTTCATCTCTATTACCATTGTTTCGAGTGCA CCAGCACCTAAACCTCCTAAACCTAAGCCTGCAC CAGCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCACACC AGCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCAAACCA GCACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCTGCACCAG CACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCGCACCAGC ACCTACACCTCCTAAACCTAAGCCCAAACCAGCA CCTACACCTCCTAATCCTAAGCCCACACCAGCAC CTACACCTCCTAAACCTAAGCCTGCACCAGCACC AGCACCAACACCAGCACCGAAACCTAAACCTGC ACCTAAACCAGCACCAGGTGGAGAAGTTGAGGA CGAAACCGAGTTTAGCTACGAGACGAAAGGAAA CAAGGGGCCAGCGAAATGGGGAACACTAGATGC AGAGTGGAAAATGTGTGGAATAGGCAAAATGCA ATCTCCTATTGATCTTCGGGACAAAAATGTGGTA GTTAGTAATAAATTTGGATTGCTTCGTAGCCAGT ATCTGCCTTCTAATACCACCATTAAGAACAGAGG TCATGATATCATGTTGAAATTCAAAGGAGGAAAT AAAGGTATTGGTGTCACTATCCGTGGTACTAGAT ATCAACTTCAACAACTTCATTGGCACTCTCCTTCC GAACATACAATCAATGGCAAAAGGTTTGCGCTAG AGGAACACTTGGTTCATGAGAGCAAAGATAAAC GCTACGCTGTTGTCGCATTCTTATACAATCTCGGA GCATCTGACCCTTTTCTCTTTTCGTTGGAAAAACA ATTGAAGAAGATAACTGATACACATGCGTCCGAG GAACATATTCGCACTGTGTCAAGTAAACAAGTGA AGCTTCTCCGTGTGGCTGTACACGATGCTTCAGA TTCAAATGCCAGGCCGCTTCAAGCAGTCAATAAG CGCAAGGTATATTTATACAAACCAAAGGTTAAGT TAATGAAGAAATACTGTAATATAAGTTCTTACTA G
AtpCA3 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 29 ΑΐβΟΑ3 (Atlg23730)	CTAGAGAGCATCTTCTTATATCAACTAAACTTTGT ATTCATTTCCAAGTATCACTCTAAATCATCTTTTT CGAATTCGCCTCCCAAGATATGTCGACAGAGTCG TACGAAGACGCCATTAAAAGACTCGGAGAGCTTC TCAGTAAGAAATCGGATCTCGGGAACGTGGCAGC CGCAAAGATCAAGAAGTTAACGGATGAGTTAGA GGAACTTGATTCCAACAAGTTAGATGCCGTAGAA CGAATCAAATCCGGATTTCTCCATTTCAAGACTA ATAATTATGAGAAGAATCCTACTTTGTACAATTC ACTTGCCAAGAGCCAGACCCCCAAGTTTTTGGTG TTTGCTTGTGCGGATTCACGAGTTAGTCCATCTCA CATCTTGAATTTCCAACTTGGGGAAGCCTTCATC GTTAGAAACATTGCAAACATGGTGCCACCTTATG ACAAGACAAAGCACTCTAATGTTGGTGCGGCCCT TGAATATCCAATTACAGTCCTCAACGTGGAGAAC ATTCTTGTTATTGGACACAGCTGTTGTGGTGGAAT AAAGGGACTCATGGCCATTGAAGATAATACAGCT CCCACTAAGACCGAGTTCATAGAAAACTGGATCC AGATCTGTGCACCGGCCAAGAACAGGATCAAGC

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 187/196

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		AGGATTGTAAAGACCTAAGCTTTGAAGATCAGTG CACCAACTGTGAGAAGGAAGCCGTGAACGTGTCC TTGGGGAATCTTTTGTCTTACCCATTCGTGAGAGA AAGAGTGGTGAAGAACAAGCTTGCCATAAGAGG AGCTCACTATGATTTCGTAAAAGGAACGTTTGAT CTTTGGGAACTTGACTTCAAGACTACCCCTGCCTT TGCCTTGTCTTAAAAGATTCCTCCTACTCAAATAT TTTCTCTATGTTGTTTCTAATTATGTTCTTATAATC TTCTTCTGTTGCTTCTGTAATGTCATCTTTGCTACT TCTATTCCAATAGAAATGAATAAAGCTTTAAAGA GC
AtpCA5 de comp. total cDNA	SEQ ID NO: 30 ΑΐβΟΑ5 (At4g33580)	TTGTTGTGTAAAACTCTTGTTCCTCTTCCTCTTCA ACGTGAACACTTCTATTTCTCAGAGAACATTCAC CTATATGTCTTTCTTCAAGGAGAAGTCTTCCTCTT TCCAGATTTAGATGAACACTCTTCAGATGCCTTGT GCCTTATTGATCCAGATTCGAAGTACCCAACTTT ACTCTCTAGACCTTTTTCATGGCAGCCACTCCCAC ACACTTCTCTGTCTCCCATGATCCTTTTTCTTCCA CGTCTCTCCTTAATCTCCAAACTCAAGCGATCTTT GGTCCCAATCACAGTTTAAAGACAACCCAGTTGA GAATTCCAGCTTCTTTCAGAAGAAAAGCTACAAA CTTGCAAGTGATGGCTTCAGGAAAGACACCTGGA CTGACTCAGGAAGCTAATGGGGTTGCAATTGATA GACAAAACAACACTGATGTATTTGACGACATGAA ACAGCGGTTCCTGGCCTTCAAGAAGCTTAAGTAC ATCAGGGATGACTTTGAACACTACAAAAATCTGG CAGATGCTCAAGCTCCAAAGTTTCTGGTGATTGC TTGTGCAGACTCTAGAGTTTGTCCTTCTGCTGTCC TGGGATTCCAACCGGGTGACGCATTCACTGTTCG TAACATTGCAAATTTAGTACCTCCATATGAGTCT GGACCTACTGAAACCAAAGCTGCTCTAGAGTTCT CTGTGAATACTCTTAATGTGGAAAACATCTTAGT CATTGGTCATAGCCGGTGTGGAGGAATTCAAGCT TTAATGAAAATGGAAGACGAAGGAGATTCCAGA AGTTTCATACACAACTGGGTAGTTGTGGGAAAGA AGGCAAAGGAAAGCACAAAAGCTGTTGCTTCAA ACCTCCATTTTGATCATCAGTGCCAACATTGTGA AAAGGCATCGATAAATCATTCATTAGAAAGGCTG CTTGGGTACCCGTGGATAGAAGAGAAAGTGCGG CAAGGTTCACTGTCTCTCCATGGTGGATACTATA ATTTTGTTGATTGTACGTTCGAGAAATGGACAGT GGATTATGCAGCAAGCAGAGGTAAGAAGAAGGA AGGCAGTGGAATCGCTGTTAAAGACCGGTCAGTT TGGTCTTGACTTACGACTATCTCAATCTTCATAGA _G1^₁^₁^_{TTCATAATTTATAGAGAAACATCAAACC}CCTTTTGGTTGGGATTATCATGTGTTTGTTCCACT TGTGTGTTGAAGTCATTTTCCTTCTTCTGTCTTATT GAGGCAGGGACTAATGTTTGTTTTATCTTTCAGTT GTTTCGTTTAAATTCCACATTTGTGCAATGAACTG GTTGGTGTTTCTTTAAGATATAATCATTTTGCCAC TGTAGTGAGATCGGAGGCATGCAT

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 188/196

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cDNA AtyCAl de comp. total	SEQ ID NO: 31 AtyCAl (Atlgl9580)	ATATTAAACCACTGTAACTGTAATTTATTGTTTCG CCGTCCCGGAATGTTCCTGTTGAAATCCATTTTCG CTGATTTTTTTTCTTCCGTCTCTTCTTCAGCTTCGA CCATTTTCGTCTTCTTCATTCAGTGTTGAGTCCTC GTTTACCTGTGAGCTCGAAGAAAGTGACGATCAA TGGGAACCCTAGGCAGAGCATTTTACTCGGTCGG TTTTTGGATCCGTGAGACTGGTCAAGCTCTTGATC GCCTCGGTTGTCGCCTTCAAGGCAAAAATTACTT CCGAGAACAACTGTCAAGGCATCGGACACTGATG AATGTATTTGATAAGGCTCCGATTGTGGACAAGG AAGCTTTTGTGGCACCAAGCGCCTCAGTTATTGG GGACGTTCACATTGGAAGAGGATCGTCCATTTGG TATGGATGCGTATTACGAGGCGATGTGAACACCG TAAGTGTTGGGTCAGGAACTAATATTCAGGACAA CTCACTTGTGCATGTGGCAAAATCAAACTTAAGC GGGAAGGTGCACCCAACCATAATTGGAGACAAT GTAACCATTGGTCATAGTGCTGTTTTACATGGAT GTACTGTTGAGGATGAGACCTTTATTGGGATGGG TGCGACACTTCTTGATGGGGTCGTTGTTGAAAAG CATGGGATGGTTGCTGCTGGTGCACTTGTACGAC AAAACACCAGAATTCCTTCTGGAGAGGTATGGGG AGGAAACCCAGCAAGGTTCCTCAGGAAGCTCACT GATGAGGAAATTGCTTTTATCTCTCAGTCAGCAA CAAACTACTCAAACCTCGCACAGGCTCACGCTGC AGAGAATGCAAAGCCATTAAATGTGATTGAGTTC GAGAAGGTTCTACGCAAGAAGCATGCTCTAAAG GACGAGGAGTATGACTCAATGCTCGGAATAGTGA GAGAAACTCCACCAGAGCTTAACCTCCCTAACAA CATACTGCCTGATAAAGAAACCAAGCGTCCTTCT AATGTGAACTGATTTTTCAGGGGTATGTTTTCTGG CCGAAGCCCTACAGGGTGAGATACTCAAGGGGA TTATGTTTCGGTCTCTGGTTTGAATATGGCAGGTA GAGTACATTAGGGTAGACGGATTTACAGCTTTTG AAGAAGCTATGTTCAACATTTTTTCATGGTTTCTT AGGGAGTATTATTGTCTAATCAAACTTTGTATGTT ATCACTTCGGTCTTTTGAACGTAAGAATCAAGTT CATGAAACATGAGTGAATATTAGTCTGATGCATG TGCGTATGCAAAAATCCATGTGCGCCTATGTTGC TAGGCAAGCATGAAGAATAAAGATCCAAACTGG ATATATCATATATTTATCTTTTTATAATTACTGC
cDNA AtyCA2 de comp. total	SEQ ID NO: 32 AtyCA2 (Atlg47260)	CGAACTCACTCGAGTTAAAAAAAAAAATCCTCCC ATCAATACGCCTCCATAAACCTCTCTCTATCTGGT GGAGCGACACCAAAAACAACAAAGCCTTCTCATT TTCACACTTTGGGTAATCGGAGAATCACAAAAAA ATGGGAACCCTAGGACGAGCAATTTACACTGTGG GTAACTGGATTCGTGGAACTGGTCAAGCTCTTGA TCGCGTTGGTTCTCTTCTTCAAGGAAGTCACCGTA TCGAGGAACATCTGTCGAGGCATCGGACGTTGAT GAATGTGTTTGATAAATCACCATTGGTGGATAAA GATGTGTTTGTGGCTCCGAGTGCTTCTGTTATTGG TGATGTTCAGATCGGAAAAGGCTCGTCGATTTGG

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 189/196

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		TATGGCTGTGTTCTTCGAGGTGATGTGAATAACA TCAGTGTTGGATCTGGGACGAATATCCAAGATAA TACGCTTGTACATGTTGCAAAGACCAACATAAGT GGCAAGGTTCTACCTACTCTGATTGGGGACAATG TAACAGTAGGTCACAGTGCTGTCATTCATGGGTG TACTGTTGAGGATGATGCTTTTGTTGGTATGGGA GCAACACTACTTGATGGTGTGGTGGTTGAGAAAC ATGCCATGGTTGCTGCTGGTTCTCTTGTGAAACA GAACACGCGAATCCCTTCTGGAGAGGTGTGGGGA GGAAATCCAGCAAAGTTCATGAGAAAGTTAACA GATGAAGAGATAGTATACATCTCACAGTCAGCAA AGAATTACATCAATCTCGCACAGATTCACGCCTC AGAGAATTCAAAGTCATTTGAGCAGATCGAGGTT GAGAGAGCGCTTAGGAAGAAGTATGCACGCAAG GACGAGGATTACGATTCAATGCTTGGGATTACCC GTGAAACTCCACCGGAGTTGATTCTTCCCGACAA TGTCTTACCAGGTGGTAAACCCGTCGCCAAGGTT CCGTCTACTCAGTACTTCTAATTCCAATCTCAGGT TGTTTTTGTGTGTTGAAATCATTTCAAGACAGGAT TGATTCTCTGGAAGGTCAAGAGAGATATTATTTT GGTTTTAACTTTTCTTCCGAGCAAGCAGGAGATTT ATCATCCTTGCTCAATAATGTATGGTTGCATTATG AAGTCATTTCTTCGAGGAACAATTTGCAGAAAGA GAAACAAAGTTGGATTAATCTTTC
cDNA AtyCA3 de comp. total	SEQ ID NO: 33 AtyCA3 (At5g66510)	CAAAGACTGCACTCTCTCCTCTTCCTCTGGCTCCG GCGAAAAACCCCTTTTCGATTTCATTGATAAAAC GCAAATCGATCTCTCGTGTGGAAGAAGAAGAAG AACACGATGGGAACAATGGGTAAAGCATTCTAC AGCGTAGGATTCTGGATCCGTGAAACTGGTCAAG CACTTGATCGGCTCGGTTGTCGCCTCCAAGGGAA AAATCATTTCCGAGAACAGCTATCAAGGCACCGC ACACTCATGAATGTTTTTGACAAAACCCCTAATG TGGATAAGGGGGCTTTTGTGGCTCCTAACGCTTC TCTCTCTGGTGATGTCCATGTGGGAAGAGGTTCTT CCATTTGGTATGGATGTGTCTTGAGAGACATACC CTTTGATTTAATGACCGACTCTGCAGGAGATGCT AACAGCATTAGTGTTGGAGCTGGGACCAATATTC AGGACAACGCTCTTGTCCACGTTGCTAAGACCAA CTTAAGTGGGAAGGTCTTACCTACTGTCATTGGA GACAATGTCACCATTGGTCATAGTGCTGTTTTAC ATGGCTGCACTGTCGAGGATGAGGCCTATATTGG TACAAGTGCAACTGTCTTGGATGGAGCTCATGTT GAAAAACATGCCATGGTTGCTTCAGGAGCTCTTG TTAGGCAGAACACTAGAATTCCCTCTGGCGAGGT TTGGGGAGGCAACCCAGCTAAATTTCTGAGGAAG GTGACAGAAGAAGAAAGAGTCTTCTTCTCCAGTT CGGCTGTGGAGTACTCCAACTTAGCTCAAGCTCA CGCCACAGAGAACGCAAAGAACTTGGACGAGGC TGAGTTCAAGAAGCTTCTAAACAAGAAGAACGCT CGCGATACAGAATATGATTCAGTACTCGATGATC TCACGCTCCCTGAGAATGTACCAAAAGCAGCTTG

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 190/196

Υ1Ί

		AGGCGTTTAACCTGTGCCGCCTTGCGAATCTTGA TTTGTTTGGATTTGAAAAGTAAAAACAAAGAACT TGATTTCCTGCTTCTCCAATAAAGTTTTCTTGGGC GTAAAATCCATTGGCCAGTGCTCACTGGGAAAGT TTTCGGCTTAAAGGCATTCATTTCTCTGTTAAAGA TTGTGAGGGGTTTTGTTCTCTTGTAACTTGAGAAA GAAAAGTTGTAACCTTTTCTTCCTTTTTATGTCGT CTAATAAATTGTTGATCAGACAGACATTTAGGTT GACCTTTGCCCATAAAAAGATAGCTCTGCTTCAA TAA
cDNA At-yCALI de comp. total	SEQ ID NO: 34 At-yCALI (At5g63510)	ACTCTCTCTCTTTTCCTCTTTGCAAATCCTTGAAG AAATCCAAAATCCATAGCAATGGCGACTTCGATA GCTCGATTGTCTCGGAGAGGAGTCACTTCTAACC TGATCCGTCGTTGCTTCGCTGCGGAAGCGGCGTT GGCGAGGAAGACAGAGTTACCTAAACCGCAATT CACGGTGTCGCCGTCGACGGATCGTGTGAAATGG GACTACAGAGGCCAACGACAGATCATTCCTTTGG GACAGTGGCTTCCGAAGGTAGCCGTTGATGCTTA CGTGGCACCCAACGTTGTGCTGGCTGGTCAGGTC ACAGTCTGGGACGGCTCGTCTGTTTGGAACGGTG CCGTTTTGCGCGGCGATCTCAACAAAATCACTGT TGGATTCTGCTCGAATGTACAGGAACGGTGTGTT GTTCATGCCGCCTGGTCTTCCCCAACAGGATTAC CAGCAGCGACAATAATCGACAGGTATGTGACAGT AGGTGCCTACAGTCTTCTGAGATCATGTACCATC GAACCAGAGTGCATCATCGGTCAACACTCAATAC TAATGGAAGGCTCACTGGTTGAGACCCGGTCAAT CTTGGAAGCGGGTTCAGTTGTGCCGCCAGGAAGA AGGATCCCATCAGGTGAACTATGGGGAGGCAATC CAGCAAGATTCATTAGAACCCTAACCAACGAAGA AACCCTAGAGATCCCAAAACTCGCTGTAGCCATC AACCACTTAAGCGGAGATTACTTCTCTGAGTTCC TACCTTACTCAACTGTCTACTTAGAGGTAGAGAA GTTCAAGAAGTCCCTTGGGATCGCCGTTTAGAAG CTTCATCTTTTTCGTGATTCACTTTCATGTGTTTAT CTATCATATGAGGTCTTTCTCTCTGCATATTGCAA TAAGTAGCTGATGAACATCAAAACAAGTCCGGCT CTCTTTTTTGGTTCTAAAACGTTTGTCATTTCGTTT TTTGGGTTCTTTGTAAAATTCCATTTAAAACTGAT TTTGGCTGAATATTGTCTGAATGATAATGGCGAC GACTTCTGGTTTTGTT
cDNA AtyAL2 de comp. total	SEQ ID NO: 35 AryCAL2 (At3g48680)	CTCCCGACGACTCCTCTCTGTCTCCTCCTCCGGGA AGCTTTCTGTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACACAAG ACCTTGAAGAATCCGATTCCATAACAATGGCGAC TTCGTTAGCACGAATCTCTAAAAGAAGCATAACA TCGGCTGTTTCATCGAATCTGATTCGGCGTTACTT CGCCGCGGAAGCAGTAGCGGTGGCGACGACGGA AACACCTAAACCGAAATCGCAGGTGACGCCGTCG CCGGATCGGGTAAAATGGGACTACAGAGGCCAG AGACAGATAATTCCTCTGGGACAGTGGCTACCGA AGGTAGCTGTAGATGCTTACGTGGCACCTAACGT

Petição 870170075646, de 05/10/2017, pág. 191/196

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TGTGTTGGCTGGTCAGGTCACCGTCTGGGACGGC TCGTCTGTATGGAACGGTGCCGTTTTGAGAGGAG ATCTTAATAAGATCACCGTTGGATTCTGCTCAAA TGTCCAGGAACGGTGTGTTGTTCATGCTGCGTGG TCGTCGCCTACAGGATTACCAGCACAAACATTGA TCGATAGGTACGTGACAGTTGGTGCATACAGTCT TTTAAGATCATGCACTATCGAACCAGAATGCATC ATCGGGCAACACTCAATCCTAATGGAAGGTTCAC TGGTCGAAACCCGCTCAATCCTAGAAGCTGGTTC TGTTTTACCACCTGGCAGAAGAATCCCATCTGGT GAACTATGGGGAGGCAATCCAGCAAGGTTTATTC GAACACTCACCAATGAAGAAACCTTAGAGATCCC GAAACTTGCTGTTGCCATTAACCACCTAAGTGGA GATTACTTCTCAGAGTTCTTGCCTTACTCAACTAT CTATCTAGAGGTTGAGAAGTTCAAGAAATCCCTT GGAATCGCCATCTAGAAAGCTTCTTCCAGGTTTC TGGCTACTTCCCTCATTAAGAAAGCTTCTTCGTTT TCGGAATTTGATCTGAATAAGTAGCTGCGGAACA AGAAAAAGAGCAGAGCTGTGTTTCAAATGTTGTC TTCTCTGTTTGTTTTGTTTAAGTTCATATCCTTGTG TTCAAACTTTCTATGAAGATGATAATGGTGAAAA CTGGAAAGTGTAAAACTTCTTTCGTCTCCCCTCAC AATTGGAAAAGCTAATAATCTCGTAGTGTTATAG AA

Uma série de aspectos da invenção foram descritos. Todavia, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, outros aspectos estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de regulação negativa ou diminuição da troca de dióxido de carbono (CO2) e/ou água em uma célula-guarda de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta, caracterizado pelo fato de compreender:

(a) fornecimento de:

um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo anidrase carbônica tendo a sequência da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID

NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID

NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID

NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35, operacionalmente ligada a um promotor específico de célula-guarda consistindo de uma sequência como mostrada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11; e (b) expressão ou superexpressão do ácido nucleico na célulaguarda, planta, célula da planta, folha da planta, órgão da planta ou parte da planta, desse modo, regulando negativamente ou diminuindo a troca de dióxido de carbono (CO₂) e/ou água em uma célula-guarda.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifica uma sequência de aminoácidos tendo a sequência a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9.
3. Método de fechamento de um poro estomatal em uma célula-guarda na epiderme de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta ou de produção de uma célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta com eficiência de uso de água melhorado ou resistente à seca, caracterizado

Petição 870180125718, de 03/09/2018, pág. 7/9 pelo fato de compreender superexpressão ou expressão aumentada de:

(a) uma anidrase carbônica consistindo de uma sequência como definida na reivindicação 1, e/ou uma anidrase carbônica consistindo de uma sequência de aminoácidos como definida na reivindicação 2 na célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta sob controle de um promotor específico de célula-guarda de planta operacionalmente ligado consistindo de uma sequência como mostrada na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 11, fazendo com que o poro estomatal se feche na célula-guarda na epiderme de uma planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta, ou produzindo uma célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta com eficiência de uso de água melhorado ou resistente à seca.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, caracterizado pelo fato de que a célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta é, ou é derivada de, ou é parte de uma célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta transgênica.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico e/ou um gene está operacionalmente inserido em um cassete de expressão, um plasmídeo, um vírus recombinante, um vetor, um cosmídeo ou um cromossomo artificial.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

5, caracterizado pelo fato de que a célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta é, ou a célula-guarda, planta, célula de planta, folha de planta, órgão de planta ou parte de planta é derivada de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta dicotiledônea ou monocotiledônea é Triticum spp., Avena

Petição 870180125718, de 03/09/2018, pág. 8/9 sativa, Secale cereale, Hordeum vulgare, Oryza spp., Sorghum spp., Zea mays, Lupinus spp., Solanum spp., Beta vulgaris, Pisum sativum, Phaseolus spp., Glycine max, Brassica spp., Saccharum spp., Linum usitatissimum, Gossypium spp., Arecaceae spp., Arachis hypogaea, Populus spp., Bombax 5 spp., Chilopsis linear is, Larrea tridentata, Krascheninnikovia spp., Ochroma pyramidale, Boehmeria nivea, Hibiscus cannabinus, Cannabis sativa, Hibiscus sabdariffa, Corchorus spp. e Aguave sisalana.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta dicotiledônea ou monocotiledônea é uma espécie dos

10 gêneros Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, 15 Pannisetum, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorgo, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna ou Zea.
9. Molécula de ácido nucléico, caracterizado pelo fato de compreender um promotor específico de célula-guarda da SEQ ID NO: 10 ou

20 SEQ ID NO: 11 operacionalmente ligado a um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo anidrase carbônica, o dito ácido nucléico tendo a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, 25 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35 ou dito polipeptídeo anidrase carbônica tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 9.