BRPI0812346B1

BRPI0812346B1 - célula hospedeira, método para a produção de um polipeptídeo isolado, composição, vacinas, método de atenuação da virulência de uma bactéria, método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno e uso da célula hospedeira, das vacinas ou da bactéria

Info

Publication number: BRPI0812346B1
Application number: BRPI0812346A
Authority: BR
Inventors: Leslie Keyburn Anthony; Ian Rood Julian; John Moore Robert
Original assignee: Australian Poultry Crc Pty Ltd
Priority date: 2007-06-08
Filing date: 2008-06-06
Publication date: 2019-01-22
Also published as: CN101903399B; AU2008258277B2; JP2010529838A; EP2980100A1; US20100291131A1; CA2689302C; RU2009149378A; EP2164862A4; AU2008258277A1; JP2014221046A; PT2164862E; PL2164862T3; WO2008148166A1; RU2474587C2; JP5901115B2; ES2550685T3; EP2164862B1; US8263088B2; BRPI0812346A2; EP2164862A1

Abstract

célula hospedeira, método para a produção de um polipeptídeo isolado, composição, vacinas, método de atenuação da virulência de uma bactéria, método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno e uso da célula hospedeira, das vacinas ou da bactéria a presente invenção está relacionada a uma toxina à base de polipeptídeo que se origina de clostridium perfringens. a invenção ainda está relacionada às composições imunogênicas que compreendem a toxina e aos métodos para a vacinação de animais, por exemplo, galinhas, de tal forma que eles fiquem menos suscetíveis às doenças por clostrídios. também são revelados métodos para determinar se um animal foi exposto à toxina, polinucleotídeos que codificam a toxina e bactérias atenuadas que expressam uma forma reduzida ou menos ativa da toxina.

Description

CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO, VACINAS, MÉTODO DE ATENUAÇÃO DA VIRULÊNCIA DE UMA BACTÉRIA, MÉTODO PARA DETERMINAR SE UM INDIVÍDUO FOI EXPOSTO A UM PATÓGENO E USO DA CÉLULA HOSPEDEIRA, DAS VACINAS OU DA BACTÉRIA CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção está relacionada a uma nova toxina. A invenção ainda está relacionada às composições

imunogênicas	que	compreendem a toxina	e método	s de
vacinação de	animais, por exemplo, galinhas	, de tal	forma
que elas	fiquem	menos suscetíveis às	doenças	por
clostridios.
	FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] 0	gênero	Clostridium consiste em	bacilos	gram-

positivos, anaeróbicos, formadores de esporos. O habitat natural desses organismos é o meio ambiente e os tratos intestinais de seres humanos e de outros animais. Apesar da identificação de aproximadamente 100 espécies de Clostridium, apenas um pequeno número foi reconhecido como agentes etiológicos de importância médica e veterinária. No entanto, essas espécies estão associadas a doenças sérias, incluindo botulismo, tétano, celulite anaeróbica, gangrena gasosa, bacteremia, colite pseudomembranosa e gastrenterite por clostridios.

[003] Clostridium perfringens é o agente etiológico de várias doenças causadas por clostridios encontradas em animais domésticos economicamente valiosos. A enterite necrótica (NE) é um exemplo de uma doença entérica por clostridio causada por C. perfringens. A enterite necrótica leva ao desenvolvimento de lesões necróticas na parede do

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2/88 criação. Ela também é uma doença multifatorial com epidemiologia e patogênese complexas e parcialmente desconhecidas (Kaldhusdal, 1999). A bactéria, C. perfringens, é encontrada comumente no trato gastrointestinal de aves de criação (Tschirdewahn e cols.,

1991) ;

a ocorrência de enterite necrótica, no entanto, é

esporádica (Cowen e cols., 1987). No entanto, ração contaminada com C. perfringens foi implicada em surtos de enterite necrótica em galinhas (Kaldhusdal, 1999). Estudos também demonstraram que galinhas saudáveis possuem um número relativamente baixo de C. perfringens em seus tratos gastrointestinais, enquanto um aumento na concentração das bactérias pode resultar em uma condição de enterite necrótica (Craven e cols., 1999).

[004] Acredita-se que a enterite necrótica clínica ocorra quando C. perfringens prolifera até números elevados no intestino delgado e produza toxinas extracelulares que danificam o intestino.

que esteja envolvida

Acredita-se que a principal toxina seja a toxina alfa, mas seu papel preciso no processo de doença não é completamente compreendido. A toxina alfa é uma zinco-metaloenzima secretada que possui atividade tanto de fosfolipase C quanto de esfingomielinase, e principal toxina envolvida na cols., 1995;

patogênese da gangrena gasosa humana (Awad, e

Songer, 1997). Todos os cinco tipos de toxina de C. perfringens (A a E) carregam e expressam o gene estrutural da toxina alfa, plc.

[005] Até hoje, nenhuma outra toxina foi identificada como um fator de virulência essencial na enterite

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3/88 necrótica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Os presentes inventores identificaram uma nova toxina de clostridios. Os inventores denominaram esse polipeptideo NetB.

[007] Consequentemente, a presente invenção fornece um polipeptideo substancialmente purificado ou recombinante, em que o polipeptideo compreende:

i) uma sequência de aminoácidos, como fornecida no ID.

DE SEQ. N°: 2 ou ID. DE SEQ. N°: 3, ii) uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3, ou

iii) um fragmento biologicamente ativo e/ou antigênico de i) ou ii).
[008] Em	uma modalidade,	o	polipeptideo	possui
atividade de	toxina.
[009] Em	outra modalidade,	o	polipeptideo	possui
atividade de	toxina reduzida,	quando	comparado	com um
polipeptideo	codificado pelo ID.	DE SEQ.	N°: 2 e/ou	ID. DE

SEQ. N°: 3.

[010] Em uma modalidade preferida, o polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 ou ID. DE SEQ. N°: 3.

[011] Em uma modalidade, o polipeptideo pode ser purificado de uma bactéria do gênero Clostridium. De preferência, o polipeptideo pode ser purificado de Clostridium perfringens.

[012] Em outra modalidade da presente invenção, o polipeptideo é um toxóide.

[013] Ainda em outra modalidade, o polipeptideo é uma

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4/88 proteína de fusão que compreende pelo menos outra sequência polipeptídica.

[014] O (pelo menos um) outro polipeptídeo pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que aumenta a estabilidade de um polipeptídeo da presente invenção, ou um polipeptídeo que auxilia na purificação da proteína de fusão, ou um polipeptídeo que aumenta as propriedades imunológicas do polipeptídeo da presente invenção.

[015] Ainda em outra modalidade, o polipeptídeo da invenção é um polipeptídeo sintético.

[016] A presente invenção ainda fornece um polinucleotídeo isolado e/ou recombinante que compreende:

i) uma sequência de nucleotídeos como fornecida no ID. DE SEQ. N°: 1, ii) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, iii) uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1, e/ou iv) uma sequência que hibridiza com qualquer um de i) a iii) sob condições estringentes ou o complemento reverso desta.

[017] Em uma modalidade, o polinucleotídeo isolado ou recombinante compreende uma sequência de nucleotídeos pelo menos 40% idêntica aos nucleotídeos 226 a 1194 do ID. DE SEQ. N°: 1.

[018] A presente invenção ainda fornece um vetor que compreende o polinucleotídeo da invenção.

[019] De preferência, o polinucleotídeo no vetor está ligado operacionalmente a um promotor.

[020] Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral ou um

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5/88 vetor de plasmídeo.

[021] A presente invenção ainda fornece uma célula hospedeira que compreende o polipeptídeo da invenção, o polinucleotídeo da invenção e/ou o vetor da invenção.

[022] As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos um polipeptídeo da presente invenção, e incluem células animais, de plantas, bacterianas, fúngicas (incluindo de leveduras), de parasitas e de artrópodes.

[023] De preferência, a célula hospedeira é uma bactéria.

[024] Em uma modalidade, a bactéria é E. coli. Em uma modalidade mais preferida, a bactéria é E. coli selecionada de CCEC22, CCEC31 e CCEC59.

[025] A presente invenção ainda fornece um método para a produção de um polipeptídeo de acordo com a invenção, o método compreendendo o cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a invenção, ou de um vetor da invenção que codifica o referido polipeptídeo, sob condições que permitem a expressão do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo.

[026] De preferência, o método ainda compreende o isolamento do referido polipeptídeo.

[027] A presente invenção ainda fornece um anticorpo substancialmente purificado, ou fragmento deste, que se liga especificamente a um polipeptídeo da invenção.

[028] A presente invenção ainda fornece uma composição que compreende o polipeptídeo da invenção, o polinucleotídeo da invenção, o vetor da invenção, a célula hospedeira da invenção e/ou o anticorpo da invenção.

[029] Em uma modalidade, a composição é uma composição

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6/88 imunogênica.

[030] Em uma modalidade, a composição imunogênica ainda compreende um adjuvante e/ou um veiculo farmaceuticamente aceitável.

[031] A presente invenção ainda fornece uma vacina que compreende um antigeno, em que o antigeno compreende um polipeptideo de acordo com a invenção.

[032] Em uma modalidade, a vacina compreende um adjuvante e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.

[033] Em uma modalidade, a vacina ainda compreende um ou mais antígenos adicionais.

[034] A presente invenção ainda fornece uma vacina de DNA que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo de acordo com a invenção, em que, mediante a administração a um indivíduo, o polipeptideo é expresso e uma resposta imunológica ao polipeptideo é produzida.

[035] A presente invenção ainda fornece uma bactéria atenuada que produz um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3, em que a bactéria produz uma quantidade reduzida do polipeptideo comparada com uma bactéria do tipo selvagem, e/ou possui atividade de

toxina reduzida, comparado com	o polipeptideo em	uma
bactéria do tipo selvagem.
[036] Em uma modalidade, a	bactéria	atenuada	não
expressa o polipeptideo.
[037] Em outra modalidade, a	bactéria	atenuada	foi

ainda modificada para expressar um polipeptideo heterólogo.

polipeptideo heterólogo pode ser, por exemplo, um polipeptideo biologicamente ativo ou um antigeno. Exemplos

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7/88 de polipeptideos biologicamente ativos incluem citocinas, fatores de crescimento e enzimas. 0 antígeno pode ser, por exemplo, de um agente de doença bacteriana, fúngica, parasítica ou viral.

[038] De preferência, a bactéria atenuada pertence ao gênero Clostridium. Na modalidade mais preferida, a bactéria é Clostridium perfringens.

[039] A presente invenção ainda fornece um método de atenuação da virulência de uma bactéria que expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N° : 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3, o método compreendendo a mutação de uma sequência de polinucleotídeos para reduzir a expressão e/ou a atividade de toxina do polipeptídeo, em que a bactéria atenuada possui atividade de toxina reduzida, comparada com a bactéria não atenuada.

[040] A presente invenção ainda fornece um método para despertar uma resposta imunológica em um indivíduo, o método compreendendo a administração ao indivíduo do polipeptídeo da invenção, do polinucleotídeo da invenção, do vetor da invenção, da composição da invenção, da vacina da invenção, da célula hospedeira da invenção e/ou da bactéria da invenção.

[041] Em uma modalidade, a célula hospedeira ou bactéria está viva.

[042] Em outra modalidade, o polipeptídeo, polinucleotídeo, composição, vetor, célula hospedeira ou bactéria é liberada in ovo.

[043] A presente invenção ainda fornece um método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno que

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8/88 expressa um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3, em que o método compreende a determinação da presença ou ausência do polipeptideo em uma amostra obtida do indivíduo, em que a presença do polipeptideo é indicativa de exposição ao patógeno.

[044] A presente invenção ainda fornece um método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno que expressa um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3, em que o método compreende a determinação da presença ou ausência de anticorpos na amostra que se ligam especificamente a um polipeptideo de acordo com a invenção, em que a presença dos anticorpos é indicativa de exposição ao patógeno.

[045] A presente invenção ainda fornece um método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno que expressa um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 1, em que o método compreende a determinação da presença ou ausência do polinucleotídeo em uma amostra obtida do indivíduo, em que a presença do polinucleotídeo é indicativa de exposição ao patógeno.

[046] Qualquer técnica adequada para determinação da presença ou ausência do polinucleotídeo pode ser usada. Por exemplo, a presença ou ausência do polinucleotídeo pode ser detectada por hibridização, por exemplo, por Southern blot, ou por amplificação do polinucleotídeo, por exemplo, por PCR.

[047] Em uma modalidade, o patógeno é do gênero

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9/88

Clostridium. Em uma modalidade preferida, o patógeno é

Clostridium perfringens.

[048] Em uma modalidade dos métodos da invenção, o indivíduo é uma ave.

[049] De preferência, o indivíduo é uma ave de criação. Por exemplo, o indivíduo pode ser uma galinha, um peru, um faisão, uma codorna, um pato, um avestruz ou outras aves de criação comumente criadas em quantidades comerciais.

[050]	Na	modalidade mais	preferida, o	indivíduo é	uma
galinha.
[051]	A	presente invenção	ainda fornece um método	de
seleção	de	um agonista ou	antagonista	que modula	a

atividade de um polipeptídeo da invenção, o método compreendendo o contato do polipeptídeo da invenção com um composto candidato, e a determinação se o referido composto aumenta ou diminui a atividade de toxina do polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade, o composto é um antagonista. De preferência, o composto é um anticorpo.

[052] A presente invenção ainda fornece um método de teste de uma amostra quanto à atividade de toxina, o método compreendendo:

(a) a divisão de uma amostra suspeita de conter um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em pelo menos uma primeira e segunda subamostras, (b) o contato da primeira subamostra com um antagonista de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e (c) determinação se a primeira e segunda subamostras possuem atividade de toxina, em que a ausência de atividade de toxina na primeira

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10/88 subamostra e a presença de atividade de toxina na segunda amostra são indicativas da presença de um polipeptídeo que é pelo menos 40% idêntico ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE

SEQ. N°: 3.

[053] Em uma modalidade, a etapa (c) compreende a incubação independente da primeira e da segunda subamostras com células animais sob condições, e por um período, suficientes para que o polipeptídeo exerça um efeito citopático e a determinação da presença ou ausência de um efeito citopático sobre as células.

[054] Em uma modalidade preferida, o antagonista é um anticorpo.

[055] A presente invenção ainda fornece ração e/ou bebida que compreende um antagonista do polipeptídeo de acordo com a invenção.

[056] De preferência, o antagonista é um anticorpo de acordo com a invenção.

[057] A presente invenção ainda fornece o uso da ração e/ou bebida da invenção para reduzir infecção e/ou colonização de um animal por uma bactéria que expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3.

[058] A presente invenção ainda fornece um organismo transgênico não humano que compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica o polipeptídeo de acordo com a invenção. De preferência, o organismo transgênico não humano é uma planta.

[059] A presente invenção ainda fornece uma ração e/ou bebida que compreende o polipeptídeo da invenção.

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11/88 [060] De preferência, o polipeptideo desperta uma resposta imunológica contra um patógeno bacteriano quando o organismo transgênico não humano e/ou a ração e/ou bebida é administrada oralmente a um indivíduo. O patógeno bacteriano pode ser do gênero Clostridium, por exemplo, Clostridium perfringens. De preferência, o indivíduo é uma ave, por exemplo, uma galinha, peru ou pato.

[061] Como seria entendido por aqueles habilitados na técnica, o organismo transgênico não humano e/ou a ração e/ou bebida da invenção poderia ser usada para administrar o polipeptideo da invenção a um indivíduo, de tal forma que uma resposta imunológica contra o polipeptideo seja despertada no indivíduo.

[062] Dessa forma, em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para despertar uma resposta imunológica contra o polipeptideo da invenção, o método compreendendo a administração ao indivíduo por via oral do organismo transgênico não humano da invenção e/ou da ração e/ou bebida da invenção.

[063] A presente invenção ainda fornece um método de geração de imunidade passiva à prole de uma ave fêmea, o método compreendendo a administração do polipeptideo da invenção, do polinucleotídeo da invenção, do vetor da invenção, da célula hospedeira da invenção, da composição da invenção, da vacina da invenção, da bactéria atenuada da invenção, do organismo transgênico não humano da invenção e/ou da ração e/ou bebida da invenção à ave fêmea, antes que a ave fêmea ponha os ovos que compreendem a prole, pela qual a prole adquire imunidade passiva para uma bactéria que expressa um polipeptideo que compreende uma sequência

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12/88 de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ.

N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3.

[064] A presente invenção ainda fornece o uso do polipeptideo da invenção, do polinucleotideo da invenção, do vetor da invenção, da composição da invenção, da vacina da invenção, da célula hospedeira da invenção, da bactéria da invenção, do animal transgênico não humano da invenção e/ou da ração e/ou bebida da invenção na fabricação de um medicamento para despertar uma resposta imunológica em um indivíduo.

[065] A presente invenção ainda fornece o uso do polipeptideo da invenção, do polinucleotideo da invenção, do vetor da invenção, da composição da invenção, da vacina da invenção, da célula hospedeira da invenção, da bactéria da invenção, do animal transgênico não humano da invenção e/ou da ração ou bebida da invenção como um medicamento para despertar uma resposta imunológica em um indivíduo.

[066] Como ficará evidente, recursos e características preferidas de um aspecto da invenção são aplicáveis a muitos outros aspectos da invenção.

[067] Ao longo dessa especificação, a palavra compreendendo, ou variações como, por exemplo, compreende ou que compreende, será subentendida como implicando na inclusão de um elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas definidos, mas não na exclusão de qualquer outro elemento, número inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, números inteiros ou etapas.

[068] A invenção será agora descrita por meio dos exemplos não limitantes seguintes e com referência às

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13/88 figuras que os acompanham.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [069] Figura 1. Alinhamento ClustalW de NetB e toxina beta de C. perfringens; significa que os resíduos ou nucleotídeos naquela coluna são idênticos em todas as sequências no alinhamento; significa que foram observadas substituições conservadas; significa que são observadas substituições semi-conservadas.

[070] Figura 2. Diagrama esquemático de região cromossômica NE18-ÁnetB. Os mutantes de netB foram construídos por troca alélica usando um plasmídeo suicida

que contém um gene	netB inativado	por	inserção	com
aproximadamente 2	kb	de DNA homólogo	em um	dos lados	do
gene e introduzido	em	EHE-NE18.
[071] Figura	3.	Ensaio de	citotoxicidade	de

sobrenadante de cultura de C. perfringens EHE-NE18 em células LMH. a. meio de cultura TPG (puro); b. sobrenadante de cultura de C. perfringens EHE-NE18 (diluição de 1:16); c. sobrenadante de cultura de C. perfringens JIR325 (Cepa 13 - cepa de enterite não necrótica) (diluição de 1:2); sobrenadante de cultura de C. perfringens NE18-M1 (mutante plc) (diluição de 1:16).

[072] Figura 4. Ensaio de citotoxicidade de derivados negativos para netB de sobrenadante de cultura de EHE-NE18 em células LMH. a. sobrenadante de cultura de EHE-NE18 (diluição de 1:16); b. sobrenadante de cultura de netBl com NE18 deletado (diluição de 1:2); c. sobrenadante de cultura de netBl + pJIR1457 NE18-deletado (plasmídeo shuttle) (diluição de 1:2); d. sobrenadante de cultura de netBl + pALK20 NE18-deletado (plasmídeo de complementação de netB)

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14/88 (diluição de 1:16); e. meio de cultura TPG (puro); f. NetB recombinante purificado em coluna (diluição de 1:8).

[073] Figura 5. Ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenase de células LMH tratadas com NetB. LDH (lactato desidrogenase) liberada no sobrenadante foi medida como um indicador de citólise com um kit Cyto-Tox (Promega) e apresentada como uma percentagem de citotoxicidade. Cada diluição foi feita em triplicata e SEM calculada para cada diluição.

[074] Figura	6.	Seleção	por	PCR	de	cepas de C.
perfringens NE e	não	NE quanto	à presença	de	netB. a. cepas
NE; b. cepas não	NE.
[075] Figura	7.	Pesquisa	por	Western	blot quanto à
presença de proteína	em diversas	cepas	de	C. perfringens

(NE e não NE). Análise por Western blot da seleção de cepas

cepas	NE	e não	NE	de C. perfringens quanto à expressão	de
NetB.	As	cepas	de	C. perfringens foram desenvolvidas	em
meio	TPG	até que	alcançassem uma OD600 nm de 0,6 e,	os
sobrenadantes	de	cultura separados por SDS-PAGE.	As

proteínas separadas foram transferidas para membrana de

PDVF e sondadas com anti-soro rNetB de coelhos. Parênteses indicam cepas NE e não NE de C. perfringens.

[076] Figura 8. Análise por Western blot de soros de galinhas vacinadas com NetB. Raia 1: marcador de peso molecular (padrão pré-corado SeeBlue® Plus2 de Invitrogen); Raias 2- 14: soro de pássaros vacinados # 1-#

13.

DEFINIÇÕES PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [077] ID. DE SEQ. N°: 1 - Sequência de nucleotídeos que codifica toxina NetB de Clostridium perfringens.

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15/88 [078] ID. DE SEQ. N° : 2 - Sequência de aminoácidos madura de toxina NetB de Clostridium perfringens.

[079] ID. DE SEQ. N° : 3 - Sequência de aminoácido de toxina NetB de Clostridium perfringens, incluindo sequência peptidica sinalizadora.

[080] ID. DE SEQ. N° : 4 - Sequência de aminoácido de toxina beta de Clostridium perfringens.

[081] IDS. DE SEQ. N^os: 5 a 10 - Iniciadores de oligonucleotideos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Técnicas gerais e definições [082] A menos que especificamente definido de forma diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados devem ser considerados como tendo o mesmo significado como comumente entendido por aqueles habilitados na técnica (por exemplo, em microbiologia, cultura de células, genética molecular, imunologia, imunoistoquímica, química de proteínas e bioquímica).

[083] A menos que indicado de forma diferente, a proteína recombinante, a cultura de células, as técnicas microbiológicas e imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos-padrão, bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Estas técnicas estão descritas e explicadas com detalhes na literatura em fontes como, por exemplo, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook e cols., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical

Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e

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16/88

B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996) e F.M. Ausubel e cols., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente momento), Ed Harlow e David Raia (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan e cols., (editores) Current Protocols in

Immunology,	John	Wiley e Sons	(incluindo	todas as
atualizações	até	o presente momento), e	são aqui
incorporadas	por referência.
[084] Como aqui	usado, o termo	indivíduo	refere-se a

um animal, por exemplo, um pássaro ou mamífero. Em uma modalidade preferida, o indivíduo é uma ave, por exemplo, uma galinha. Em outra modalidade, o indivíduo é um ser humano. Outras modalidades preferidas incluem animais de companhia como, por exemplo, gatos e cães, bem como animais de criação como, por exemplo, cavalos, gado, carneiros e cabras.

[085] O termo aviário, como aqui usado, refere-se a qualquer espécie, subespécie ou raça de organismo da classe taxonômica Aves, por exemplo, sem limitação, organismos como galinha, peru, pato, ganso, codorna, faisões, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e ratitas, incluindo avestruz, ema e casuares. O termo inclui as várias cepas conhecidas de Gallus gallus, ou galinhas, (por exemplo, VJhite Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Cornish, Minorca, Amrox, Califórnia Gray, Italian Partidge-colored), bem ckmo as cepas de perus, faisões, codornas, patos, avestruzes e

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17/88 outras aves de criação comumente criadas em quantidades comerciais.

[086] Como aqui usado, o termo atividade de toxina refere-se à habilidade de um polipeptideo ou peptídeo (por exemplo, toxina NetB) para matar, ou causar um efeito citopático, em células animais. Em alguns casos, pode ser desejável que um polipeptideo tenha atividade de toxina reduzida comparado com a toxina NetB. A redução da atividade de toxina é preferivelmente pelo menos de 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 99%. A redução da atividade de toxina pode ser medida, por exemplo, como uma diminuição no efeito citopático.

[087] Os termos efeito citopático ou CPE, como aqui usados, descrevem alterações na estrutura celular em consequência da atividade de uma toxina celular (ou seja, um efeito patológico) . Efeitos citopáticos comuns incluem destruição da célula, arredondamento da célula, formação de sincícios (ou seja, células gigantes fundidas), formação de vacúolos e formação de corpos de inclusão. O CPE resulta das ações de uma toxina nas células que afetam negativamente a habilidade das células para realizar suas funções necessárias para permanecerem viáveis. Em sistemas de cultura de células in vitro, CPE é evidente quando as células, como parte de uma monocamada confluente, exibem regiões de não confluência após contato com uma amostra que contém uma toxina. Os efeitos citopáticos são facilmente discerníveis e distinguíveis por aqueles habilitados na técnica.

[088] Como aqui usado, o termo toxóide refere-se a qualquer toxina pelo menos parcialmente inativada, mas não

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18/88 visa limitar de forma alguma o meio de inativação específico de uma toxina para produzir um toxóide. Estas tecnologias de inativação incluem: (i) métodos químicos que modificam a toxina intacta, por exemplo, tratamento com formaldeído ou glutaraldeído; (ii) métodos físicos como, por exemplo, aquecimento, (iii) métodos enzimáticos que alteram a toxina, por exemplo, uma protease que cliva a toxina em fragmentos; (iv) métodos recombinantes, por exemplo, engenharia genética do gene da toxina para remover ou alterar as regiões enzimáticas da toxina, mas retendo um ou mais epitopos antigênicos.

[089] O termo do tipo selvagem, como aqui usado em relação às bactérias, refere-se às bactérias de ocorrência natural que produzem um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 40% idêntica, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 2 ou ID. DE SEQ. N°: 3, que possui atividade de toxina.

[090] Como aqui usados, os termos que trata, trata ou tratamento incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, composição, vacina e/ou bactéria atenuada da invenção suficiente para reduzir ou eliminar pelo menos um sintoma de uma doença causada por infecção com uma bactéria que expressa um polipeptídeo que possui atividade de toxina.

[091] O termo prevenção refere-se à proteção de um indivíduo que pode estar exposto a uma bactéria contra o desenvolvimento de pelo menos um sintoma resultante da infecção e/ou colonização pelas bactérias, ou redução da gravidade de um sintoma de infecção e/ou colonização em um

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19/88 indivíduo exposto às bactérias.

Polipeptídeos/peptídeos [092] Os termos polipeptídeo e proteína são geralmente usados de forma intercambiável e referem-se a uma cadeia polipeptídica simples que pode ou não ser modificada por adição de grupos não aminoácidos. Deve-se entender que essas cadeias polipeptídicas podem se associar a outros polipeptídeos ou proteínas ou a outras moléculas como, por exemplo, co-fatores. Os termos proteínas e polipeptídeos, como aqui usados, também incluem variantes, mutantes, fragmentos biologicamente ativos, modificações, análogos e/ou derivados dos polipeptídeos aqui descritos.

[093] O termo polipeptídeo substancialmente purificado ou polipeptídeo isolado significa um polipeptídeo que geralmente foi separado dos lipídeos, ácidos nucléicos, outros peptídeos e outras moléculas contaminantes com as quais está associado em seu estado nativo. De preferência, polipeptídeo substancialmente purificado é pelo menos

60% livre, mais preferivelmente pelo menos

75% livre e, mais preferivelmente, pelo menos

90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado.

[094] O termo recombinante, no contexto de um polipeptídeo, refere-se ao polipeptídeo quando produzido por uma célula, ou em um sistema de expressão livre de células, em uma quantidade alterada ou em uma taxa alterada, comparado com seu estado nativo.

Em uma modalidade, a célula é uma célula que não produz naturalmente o polipeptídeo.

No entanto, a célula pode ser

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20/88 uma célula que compreende um gene não endógeno que faz com que seja produzida uma quantidade alterada, preferivelmente aumentada, do polipeptideo. Um polipeptideo recombinante da invenção inclui polipeptideos que não foram separados dos outros componentes da célula transgênica (recombinante), ou sistema de expressão livre de células, na qual é produzido, e polipeptideos produzidos nestas células ou sistemas livres de células que são subseqüentemente purificados removendo pelo menos alguns outros componentes.

[095] O % de identidade de um polipeptideo é determinado por análise GAP (programa GCG) (Needleman e Wunsch, 1970) com uma penalidade de criação de lacuna (gap) = 5 e uma penalidade de extensão de lacuna = 0,3. A sequência interrogada possui pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de pelo menos 15 aminoácidos. Mais preferivelmente, a sequência interrogada possui pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de pelo menos 50 aminoácidos. Mais preferivelmente, a sequência interrogada

possui	pelo	menos	100	aminoácidos de	comprimento	e a
análise	GAP	alinha	as	duas sequências	ao	longo de	uma
região	de	pelo	menos	100 aminoácidos.	Ainda	mais

preferivelmente, a sequência interrogada possui pelo menos 250 aminoácidos de comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Mais preferivelmente, as duas sequências são alinhadas ao longo de todo o comprimento.

[096] Com relação a um polipeptideo definido, será observado que números de % de identidade maiores do que

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21/88 aqueles fornecidos acima englobarão modalidades preferidas. Dessa forma, quando aplicável, à luz dos números mínimos do % de identidade, prefere-se que o polipeptídeo compreenda uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 4 0%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 76%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99,9% idêntica ao N° DO ID. DE SEQ. determinado relevante.

[097] Mutantes da sequência de aminoácido dos polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados por introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas em um ácido nucléico da presente invenção, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado. Esses mutantes incluem, por exemplo, eliminações, inserções ou substituições de

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22/88 resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Pode ser feita uma combinação de eliminação, inserção e substituição para se chegar à construção final, desde que o produto peptídico final possua as características desejadas.

[098] Polipeptídeos mutantes (alterados) podem ser preparados com o uso de qualquer metodologia adequada conhecida na técnica. Por exemplo, um polinucleotídeo da invenção pode ser submetido à mutagênese in vitro. Essas técnicas de mutagênese in vitro incluem subclonagem do polinucleotídeo em um vetor adequado, transformação do vetor em uma cepa mutadora como, por exemplo, a E. coli XL-1 red (Stratagene) e propagação das bactérias transformadas por um número adequado de gerações. Em outro exemplo, os polinucleotídeos da invenção são submetidos às técnicas de embaralhamento de DNA, como descritas de forma ampla por Harayama (1998). Essas técnicas de embaralhamento de DNA podem incluir genes que codificam toxinas relacionadas àquelas da presente invenção, por exemplo, aquelas de bactérias diferentes de Clostridium perfringens. Os produtos derivados de DNA mutado/alterado podem facilmente ser pesquisados usando técnicas aqui descritas para determinar se possuem a atividade de toxina.

[099] Quando se projetam mutantes da sequência de aminoácidos, a localização do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão das características a serem modificadas. Esses sítios para mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, por (1) substituição inicial com escolhas conservadoras de aminoácidos e depois com seleções mais radicais, dependendo dos resultados obtidos, (2) eliminação do resíduo-alvo, ou

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 30/102 (3) inserção de outros resíduos adjacentes ao sítio

23/88 localizado.

[0100]

As eliminações de sequência de aminoácidos geralmente variam de cerca de a 15 resíduos, mais preferivelmente cerca de 1 a 10 resíduos e, tipicamente, cerca de 1 a 5 resíduos contíguos.

[0101] Mutantes por substituição possuem pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de polipeptideo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese por substituição incluem sítios identificados como os sítios ativos. Outros sítios de interesse são aqueles nos quais resíduos particulares obtidos de várias cepas ou espécies são idênticos. Essas posições podem ser importantes para a atividade biológica. Esses sítios, especialmente aqueles que caem dentro de uma sequência de pelo menos três outros sítios identicamente conservados, são preferivelmente substituídos de forma relativamente conservadora. Essas substituições conservadoras são mostradas in Tabela 1 sob o cabeçalho de substituições exemplares.

Tabela 1 - Substituições exemplares.

Resíduo original	Substituições exemplares
Ala (A)	vai; leu; ile; gly
Arg (R)	lys
Asn (N)	gin; his
Asp (D)	glu
Cys (C)	ser
Gin (Q)	asn; his
Glu (E)	asp
Gly (G)	pro, ala

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24/88

His (H)	asn; gin
Ile (I)	leu; vai; ala
Leu (L)	ile; vai; met; ala; phe
Lys (K)	arg
Met (M)	leu; phe
Phe (F)	leu; vai; ala
Pro (P)	gly
Ser (S)	thr
Thr (T)	ser
Trp (W)	tyr
Tyr (Y)	trp; phe
Vai (V)	ile; leu; met; phe, ala

[0102] Também estão incluídos dentro do escopo da invenção fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos da presente invenção. Como aqui usado, o termo fragmento biologicamente ativo é uma porção de um polipeptideo da invenção que mantém uma atividade definida do polipeptideo de comprimento total. Fragmentos biologicamente ativos podem ser de qualquer tamanho, desde que mantenham a atividade definida. De preferência, o fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 10% da atividade da proteína de comprimento total. Como seria do conhecimento daqueles habilitados na técnica, as metodologias para a identificação de um fragmento biologicamente ativo de um polipeptideo são conhecidas na técnica. Por exemplo, um fragmento do polipeptideo da invenção pode ser testado em um ensaio adequado para determinar se o fragmento possui atividade de toxina, por exemplo, determinando-se se o fragmento é capaz de induzir um efeito citopático em uma

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25/88 célula. Em uma modalidade, o fragmento biologicamente ativo possui pelo menos 100 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 110 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 120 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 130 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 140 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 150 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 175 aminoácidos de comprimento ou, mais preferivelmente, 200 ou mais aminoácidos de comprimento.

[0103] Os termos antigeno e antigênico são bem conhecidos na técnica e referem-se à porção de uma macromolécula que é reconhecida especificamente por um componente do sistema imunológico, por exemplo, um anticorpo ou um receptor de antigeno de célula T. O termo antigeno refere-se a um peptideo, um polipeptídeo ou a outra macromolécula contra a qual uma resposta imunológica pode ser induzida em um hospedeiro. Dessa forma, a invenção inclui um fragmento antigênico de um polipeptídeo da invenção. De preferência, o fragmento antigênico é capaz de despertar uma resposta imunológica contra um patógeno bacteriano, por exemplo, uma bactéria do gênero Clostridium incluindo, sem limitação, Clostridium perfringens. Em uma modalidade, o antigeno é um epitopo do polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade, o fragmento antigênico possui 6 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 7 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 8 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente 9 aminoácidos de comprimento, mais preferivelmente pelo menos 10 aminoácidos de comprimento. Alternativamente, o

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 33/102 fragmento antigênico possui pelo menos 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100 ou mais aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o antigeno, quando administrado a um indivíduo, é capaz de despertar uma resposta imunológica contra um

26/88 polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos, como fornecida no ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou ID. DE SEQ. N°: 3.

[0104] Além disso, se desejado, aminoácidos naturais ou análogos químicos de aminoácidos podem ser introduzidos como substituição ou adição aos polipeptídeos da presente invenção. Esses aminoácidos incluem, sem limitação, os isômeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4diaminobutirico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4aminobutirico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cistéico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, flúor-aminoácidos, aminoácidos projetados como, por exemplo, β-metil aminoácidos, Ca-metil aminoácidos, Να-metil aminoácidos, e análogos de aminoácidos em geral.

[0105] Também estão incluídos no escopo da invenção polipeptídeos da presente invenção que são modificados diferencialmente durante ou após a síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/ bloqueio conhecidos, divagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou a outro ligante celular etc. Essas modificações podem servir para aumentar a estabilidade e/ou bioatividade do polipeptídeo da

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27/88 invenção .

[0106] Os polipeptideos da presente invenção podem ser produzidos de diversas formas, incluindo produção e recuperação de polipeptideos naturais, produção e recuperação de polipeptideos recombinantes e síntese química dos polipeptideos. Em uma modalidade, um polipeptideo isolado da presente invenção é produzido por cultivo de uma célula capaz de expressar o polipeptideo sob condições eficazes para produzir o polipeptideo, e a recuperação do polipeptideo. Uma célula preferida para a cultura é uma célula hospedeira da presente invenção. Condições de cultura eficazes incluem, sem limitação, meios eficazes, biorreator, temperatura, pH e condições de oxigênio que permitam a produção do polipeptideo. Um meio eficaz refere-se a qualquer meio no qual uma célula seja cultivada para produzir um polipeptideo da presente invenção. Este meio tipicamente compreende um meio aquoso que possui fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fosfato, e sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados como, por exemplo, vitaminas. As células da presente invenção podem ser cultivadas em biorreatores de fermentação convencionais, frascos de agitação, tubos de ensaio, placas de microtitulação e placas de petri. O cultivo pode ser realizado em uma temperatura, pH e teor de oxigênio adequados a uma célula recombinante. Estas condições de cultivo fazem parte dos conhecimentos daqueles habilitados na técnica.

Anticorpos [0107] O termo anticorpo, como usado nessa invenção, inclui anticorpos policlonais, anticorpos

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 35/102 monoclonais, anticorpos biespecíficos, diabodies, triabodies, quiméricos, fragmentos capazes de

28/88 anticorpos heteroconjugados, incluindo moléculas destes, por exemplo, Fab, se ligar ao determinante intactas, epitópico anticorpos além de

Fv, que são e a outras moléculas anticorpo-like.

[0108]

Fragmentos de anticorpos retêm um pouco da habilidade para se ligar seletivamente com seu antígeno ou receptor, e são definidos da seguinte forma:

(D

Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo pode ser produzido por digestão do anticorpo inteiro com a enzima papaína para gerar uma cadeia leve intacta uma porção de uma cadeia pesada;

(2)

Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo pode ser obtido por tratamento do anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para gerar uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; são obtidos dois fragmentos Fab' por molécula de anticorpo;

(3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo pode ser obtido por tratamento do anticorpo inteiro com a enzima pepsina, sem redução subseqüente;

F(ab)2 é um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações dissulfeto;

(4) Fv, definido como um fragmento geneticamente projetado que contém a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e (5) Anticorpo de cadeia única (SCA), definido como uma molécula geneticamente projetada que contém a região

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29/88 variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um vinculador polipeptidico adequado como uma molécula de cadeia única fundida geneticamente. Métodos para a produção desses fragmentos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Harlow e Raia, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York (1988) , aqui incorporado por referência) .

(6) Anticorpo de domínio único, tipicamente um domínio variável pesado desprovido de uma cadeia leve.

Anticorpos policlonais [0109] Um anticorpo da presente invenção pode ser um anticorpo policlonal. Métodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Anticorpos policlonais podem ser desenvolvidos em um mamífero ou uma ave, por exemplo, por uma ou mais injeções das células que expressam o polipeptídeo e, se desejado, um adjuvante. Tipicamente, as células e/ou adjuvante serão injetados no mamífero ou na ave por múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais. Exemplos de adjuvantes que podem ser empregados incluem adjuvante completo de Freund e adjuvante MPL-TDM (monofosforil Lipídeo A, trehalose dicorinomicolato sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por aqueles habilitados na técnica sem experimentação desnecessária.

Anticorpos monoclonais [0110]

Os anticorpos produzidos pelo método da invenção podem, alternativamente, ser anticorpos monoclonais.

Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos

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30/88 por Kohler e Milstein, (1975). Em um método de hibridoma, um camundongo, hamster ou outro animal hospedeiro apropriado, é tipicamente imunizado com as células que expressam o polipeptideo da primeira espécie derivada do mamífero transgênico para o desenvolvimento de linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao polipeptideo da primeira espécie.

[0111] Geralmente são usados linfócitos do sangue periférico (PBLs), se são desejadas células de origem humana, ou células esplênicas ou células de linfonodo, se são desejadas fontes de mamíferos não humanos. Os linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células imortalizadas usando um agente de fusão adequado como, por exemplo, polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Linhagens de células imortalizadas são normalmente células mamíferas transformadas, particularmente células de mieloma originárias de roedores, bovinos e de origem humana. Normalmente, são empregadas linhagens de células de mieloma de rato ou camundongo. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida das células imortalizadas, não fundidas. Por exemplo, caso as células parentais não possuam a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT) , o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), as quais evitam o crescimento de

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31/88 células deficientes em HGPRT.

[0112] Linhagens de células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficazmente, suportam expressão de anticorpo estável de alto nível pelas células produtoras de anticorpo selecionadas e são sensíveis a um meio como, por exemplo, meio HAT. Linhagens de células imortalizadas mais preferidas são linhagens de mieloma murídeo, que podem ser obtidas, por exemplo, do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. e do American Type Culture Collection, Manassas, Va. Também foram descritas linhagens de células de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, 1985; Brodeur e cols., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcei Dekker, Inc., Nova York, 1987 pp. 5163) .

[0113] O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadas pode então ser testado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra o polipeptideo da primeira espécie. De preferência, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, por exemplo, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Estas técnicas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise de Scatchard de Munson e Pollard, (1980).

[0114] Após a identificação das células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por

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32/88 procedimentos de diluição limitante, e desenvolvidos por métodos-padrão. Meios de cultura adequados para esta finalidade incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado por Dulbecco e meio RPM-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser desenvolvidas in vivo como ascite em um mamífero.

[0115] Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura ou do líquido ascítico por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

[0116] Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na Pat. U.S. N° 4.816.567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser facilmente isolado e seqüenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, pela utilização de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murídeos). As células de hibridoma da invenção servem como uma fonte preferida deste DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como, por exemplo, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outro modo, não produzem a proteína de imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também ser modificado, por

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 40/102 exemplo, por substituição da sequência codificadora por domínios constantes da cadeia pesada e leve humanas no

33/88

lugar das	sequências murídeas homólogas (Pat. U.S. N°
4.816.567)	ou por ligação covalente à sequência que
codifica a	imunoglobulina da sequência codificadora de um

polipeptídeo não imunoglobulina, ou de parte dela. Este polipeptídeo não imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um sítio de

combinação

de antígeno de um anticorpo da invenção para

criar um anticorpo bivalente quimérico.

[0117]

Os anticorpos podem ser anticorpos

monovalentes. Métodos para a preparação de anticorpos monovalentes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve e da cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada

é truncada

geralmente em qualquer ponto na região Fc de

modo a evitar o entrecruzamento da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácido ou são

eliminados,	de modo a evitar o entrecruzamento.
[0118]	Métodos in vitro também são adequados à
preparação	de anticorpos monovalentes. A digestão de
anticorpos	para produzir fragmentos destes,

particularmente, fragmentos Fab, poder ser obtida com a utilização de metodologias de rotina conhecidas na técnica.

[0119]

Os anticorpos também podem ser amadurecidos

por afinidade usando métodos conhecidos de seleção e/ou

mutagênese,

como são conhecidos na técnica. Anticorpos

amadurecidos por afinidade preferidos possuem uma afinidade

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34/88 que é cinco vezes, mais preferivelmente 10 vezes, ainda mais preferivelmente 20 ou 30 vezes maior do que a do anticorpo de partida a partir do qual o anticorpo amadurecido é preparado.

Anticorpos biespecificos [0120] Anticorpos biespecificos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação por pelo menos dois antigenos diferentes. Por exemplo, uma das especificidades de ligação pode ser por um polipeptideo da invenção, e a outra pode ser por qualquer outro antigeno e, preferivelmente, por uma proteína da superfície celular ou por um receptor ou subunidade do receptor.

[0121] Métodos para a produção de anticorpos biespecificos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecificos se baseia na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, 1983) . Por causa da distribuição aleatória das cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta normalmente é obtida por etapas cromatografia por afinidade. Procedimentos similares de são revelados em

WO 93/08829 e em Traunecker (1991).

[0122]

Anticorpos biespecificos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecificos F(a')2). Foram descritas na literatura

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35/88 técnicas para a geração de anticorpos biespecificos a partir de fragmentos de anticorpo. Por exemplo, anticorpos biespecificos podem ser preparados usando ligação química. Várias técnicas para a produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecificos diretamente de cultura de células recombinantes também foram descritas.

[0123] Hollinger e cols. (1993) forneceram um mecanismo alternativo para a produção de fragmentos de anticorpos biespecificos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) por um vinculador que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento formando, dessa forma, dois sítios de ligação de antigeno. Outra estratégia para a produção de fragmentos de anticorpos biespecificos pelo uso de dímeros de cadeia única Fv (sFv) também foi relatada por Gruber e cols. (1994).

[0124] Anticorpos com mais de duas valências também são contemplados. Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tutt e cols. (1991).

Anticorpos heteroconjugados [0125] Anticorpos heteroconjugados também estão incluídos no escopo da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para direcionar células do sistema imunológico às células indesejadas (Pat. U.S. N° 4.676.980), e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360; WO 92/200373;

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EP 03089).

Contempla-se que os anticorpos podem ser

36/88 preparados in vitro com o uso de métodos conhecidos em química de proteína sintética, incluindo aqueles que envolvem agentes de entrecruzamento. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas usando uma reação de troca de dissulfeto ou por formação de uma ligação tioéter.

Exemplos de reagentes adequados a essa finalidade incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles revelados, por exemplo, na Pat. U.S. N°

4.676.980.

Polinucleotídeos [0126]

O termo polinucleotídeo isolado significa um polinucleotídeo que geralmente foi separado das sequências de polinucleotídeos com as quais está associado ou ligado em seu estado nativo.

De preferência, o polinucleotídeo isolado é pelo menos

60% livre, mais preferivelmente pelo menos

75% livre e, mais preferivelmente, pelo menos 90% livre de outros componentes com os quais está naturalmente associado. Além disso, o termo polinucleotídeo aqui usado de forma intercambiável com os termos molécula de ácido nucléico, gene e mRNA.

[0127]

O termo recombinante, no contexto de um polinucleotídeo, refere-se ao polinucleotídeo quando presente em uma célula, ou em um sistema de expressão livre de células, em uma quantidade alterada, comparado com seu estado nativo. Em uma modalidade, a célula é uma célula que não compreende naturalmente o polinucleotídeo. No entanto, a célula pode ser uma célula que compreende um polinucleotídeo não endógeno que resulta em uma quantidade de produção alterada, preferivelmente aumentada, do

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37/88 polipeptideo codificado. Um polinucleotideo recombinante da invenção inclui polinucleotideos que não foram separados de outros componentes da célula transgênica (recombinante) ou do sistema de expressão livre de células, nos quais está presente, e polinucleotideos produzidos nestas células ou sistemas livres de células que são subseqüentemente purificados de pelo menos alguns outros componentes.

[0128] Polinucleotideo refere-se a um oligonucleotideo, polinucleotideo ou qualquer fragmento destes. Ele pode ser DNA ou RNA de origem genômica ou sintética, de fita dupla ou de fita simples, e combinado com carboidrato, lipideos, proteína ou outros materiais para realizar uma atividade em particular aqui definida.

[0129] O % de identidade de um polinucleotideo é determinado por análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970) (programa GCG) com uma penalidade de criação de lacuna = 5 e uma penalidade de extensão de lacuna = 0,3. A sequência interrogada possui pelo menos 45 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de pelo menos 45 nucleotídeos. De preferência, a sequência interrogada possui pelo menos 150 nucleotídeos de comprimento, e a análise GAP alinha as duas sequências ao longo de uma região de pelo menos 150 mais preferivelmente, a sequência nucleotídeos. Ainda

interrogada possui	pelo	menos	300
comprimento e a análise	GAP	alinha	as
longo de uma região	de	pelo	menos	300
preferivelmente, as	duas	sequências	são

alinhadas ao longo duas sequências ao nucleotídeos. Mais nucleotídeos de de todo o seu comprimento.

[0130] Com relação aos polinucleotideos definidos,

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38/88 será observado que números de % de identidade maiores do que aqueles fornecidos acima englobarão modalidades preferidas. Dessa forma, quando aplicável, à luz dos números mínimos do % de identidade, prefere-se que o polipeptídeo compreenda uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 45%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 76%, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 91%, mais preferivelmente pelo menos 92%, mais preferivelmente pelo menos 93%, mais preferivelmente pelo menos 94%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,1%, mais preferivelmente pelo menos 99,2%, mais preferivelmente pelo menos 99,3%, mais preferivelmente pelo menos 99,4%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais preferivelmente pelo menos 99,6%, mais preferivelmente pelo menos 99,7%, mais preferivelmente pelo menos 99,8% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99,9% idêntica ao N° DO ID. DE SEQ. determinado.

[0131] Os polinucleotídeos da presente invenção podem possuir, quando comparados com moléculas de ocorrência natural, uma ou mais mutações que são eliminações, inserções ou substituições de resíduos de nucleotídeos. Os mutantes podem ser de ocorrência natural

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39/88 (ou seja, isolados de uma fonte natural) ou sintéticos (por exemplo, por realização de mutagênese sitio-dirigida ou embaralhamento de DNA no ácido nucléico, como descrito acima). Fica evidente, dessa forma, que os polinucleotideos da invenção podem ser de ocorrência natural ou recombinantes.

[0132] Os polinucleotideos da invenção incluem aqueles que hibridizam sob condições estringentes para um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 40% idêntica, mais preferivelmente pelo menos 90% idêntica, ao ID. DE SEQ. N°:

1. O termo condições de hibridização estringentes e semelhantes, como aqui usado, refere-se aos parâmetros com os quais a técnica está familiarizada, incluindo a variação da temperatura de hibridização com o comprimento de um oligonucleotídeo. Os parâmetros de hibridização de um ácido nucléico podem ser encontrados nas Referências que compilam estes métodos, Sambrook, e cols. (supra), e Ausubel, e cols. (supra) . Por exemplo, o termo condições de hibridização estringentes, como aqui usado, pode se referir à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5 x SSC, Ficoll 0,02%, polivinil pirrolidona 0,02%, 0,02% Albumina Sérica Bovina, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM).

Vetores células hospedeiras [0133] Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante que compreende pelo menos uma molécula de polinucleotídeo isolado da presente invenção, inserida em qualquer vetor capaz de liberar a molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Um vetor desse

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40/88 tipo contém sequências de polinucleotideos heterólogas, ou seja, sequências de polinucleotideos que não são encontradas naturalmente adjacentes às moléculas de polinucleotídeo da presente invenção e que preferivelmente são derivadas de uma espécie diferente da espécie da qual as moléculas de polinucleotídeo são derivadas. O vetor pode ser RNA ou DNA, procariótico ou eucariótico, e tipicamente é um transposon (como descrito na Patente U.S. 5.792.294), um vírus ou um plasmídeo.

[0134] O termo ligado operacionalmente, como aqui usado, refere-se a um relacionamento funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucléico (por exemplo, DNA) . Tipicamente, ele se refere ao relacionamento funcional de um elemento regulador da transcrição como uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor está ligado operacionalmente a uma sequência codificadora, por exemplo, um polinucleotídeo aqui definido, se ele estimula ou modula a transcrição da sequência codificadora em uma célula apropriada. Geralmente, elementos promotores reguladores da transcrição que estão ligados operacionalmente a uma sequência transcrita estão fisicamente contíguos à sequência transcrita, ou seja, são de atuação cis. No entanto, alguns elementos reguladores da transcrição, por exemplo, intensificadores, não precisam estar fisicamente contíguos ou localizados próximos das sequências codificadoras cuja transcrição eles intensificam.

[0135] Como aqui usado, um vetor de expressão é um vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efetuar a expressão de uma molécula especificada de polinucleotídeo. De preferência, o vetor de

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41/88 expressão também é capaz de se replicar dentro da célula hospedeira. Vetores de expressão podem ser procarióticos ou eucarióticos, e são tipicamente vírus ou plasmídeos. Os vetores de expressão da presente invenção incluem quaisquer vetores que funcionam (ou seja, dirigem a expressão gênica) em células recombinantes da presente invenção, incluindo em células bacterianas, fúngicas, de endoparasitas, artrópodes, animais e de plantas.

[0136] Em particular, os vetores de expressão da presente invenção contêm sequências reguladoras como, por exemplo, sequências de controle da transcrição, sequências de controle da tradução, origens de replicação, e outras sequências reguladoras que sejam compatíveis com a célula recombinante e que controlem a expressão de moléculas do polinucleotideo da presente invenção. Em particular, as

moléculas	recombinantes	da	presente	invenção incluem
sequências	de controle	da	transcrição	Sequências de
controle da transcrição	são	sequências	que controlam a
iniciação,	alongamento	e	terminação	da transcrição.
Sequências	de controle	da	transcrição	particularmente
importantes	são aquelas	que controlam	a iniciação da

transcrição, sequências promotoras, por exemplo, intensificadoras, operadoras e repressoras.

Sequências de controle da transcrição adequadas incluem qualquer sequência de controle da transcrição que possa funcionar em

pelo menos	uma	das células recombinantes da	presente
invenção.	Várias	destas	sequências de controle da
transcrição	são	conhecidas	por aqueles habili	tados na
técnica.
[0137]	As	moléculas	recombinantes da	presente

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42/88 invenção também podem (a) conter sinais secretores (ou seja, sequências de ácidos nucléicos de segmento sinalizador) para permitir que um polipeptideo expresso da presente invenção seja secretado pela célula que produz o polipeptideo e/ou (b) conter sequências de fusão que levam à expressão de moléculas de ácido nucléico da presente invenção como proteínas de fusão. Exemplos de segmentos sinalizadores adequados incluem qualquer segmento sinalizador capaz de dirigir a secreção de um polipeptideo da presente invenção. Moléculas recombinantes também podem incluir sequências intervenientes e/ou não traduzidas que circundam e/ou dentro das sequências de ácidos nucléicos de moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

[0138] Outra modalidade da presente invenção inclui uma célula hospedeira que compreende uma ou mais moléculas recombinantes da presente invenção. A transformação de uma molécula de polinucleotídeo em uma célula pode ser feita por qualquer método pelo qual uma molécula de polinucleotídeo possa ser inserida na célula. As técnicas de transformação incluem, sem limitação, transfecção, eletroporação, microinjeção, lipofecção, adsorção e fusão de protoplasto. Uma célula recombinante pode permanecer unicelular ou pode crescer em um tecido, órgão ou um organismo multicelular. As moléculas transformadas de polinucleotídeo da presente invenção podem permanecer extracromossômicas ou podem se integrar em um ou mais sítios dentro de um cromossomo da célula transformada (ou seja, recombinante) de tal forma que sua habilidade para ser expressa seja retida.

[0139]

Células hospedeiras adequadas

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 50/102 transformação incluem qualquer célula que possa ser

43/88 transformada com um polinucleotideo da presente invenção.

As células hospedeiras da presente invenção podem ser capazes de produzir de forma endógena (ou seja, naturalmente) os polipeptideos da presente invenção, ou podem ser capazes de produzir estes polipeptideos após serem transformadas com pelo menos uma molécula de polinucleotideo da presente invenção. As células hospedeiras da presente invenção podem ser qualquer célula capaz de produzir pelo menos uma proteína da presente invenção, e incluem células animais, de plantas, bacterianas, fúngicas (incluindo de leveduras) , de parasitas de artrópodes. De preferência, a célula hospedeira uma célula bacteriana.

Em uma modalidade preferida, célula hospedeira é uma cepa de E. coli que possui o antígeno do sorotipo Η, H10.

Exemplos de cepas de

E. coli adequadas incluem

CCEC22, CCEC31 e CCEC59, como descrito em WO 2007/025333.

[0140]

Podem ser usadas tecnologias de DNA recombinante para aumentar a expressão de uma molécula de polinucleotideo transformada por manipulação, por exemplo, do número de cópias da molécula de polinucleotideo dentro de uma célula hospedeira, da eficiência com a qual aquelas moléculas de polinucleotideos são transcritas, da eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e da eficiência de modificações pós-tradução.

Técnicas recombinantes úteis para o aumento da expressão de moléculas de polinucleotideos da presente invenção incluem, sem limitação, a ligação operacional de moléculas de polinucleotideos aos plasmídeos com número de cópias

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44/88 elevado, integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adição de sequências de estabilidade do vetor aos plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle da transcrição (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinais de controle da tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, sequências de Shine-Dalgarno), modificação de moléculas de polinucleotídeos da presente invenção para corresponder ao uso de códons da célula hospedeira e a eliminação de sequências que desestabilizam os transcritos.

Detecção de polinucleotídeos [0141] Qualquer técnica adequada que permita a detecção de um polinucleotídeo da invenção pode ser usada, incluindo aquelas que permitem a avaliação quantitativa do nível de expressão do polinucleotídeo em um tecido e/ou uma célula. Por exemplo, a presença ou os níveis de um gene transcrito podem ser determinados por Northern blotting e/ou por amplificação do polinucleotídeo como, por exemplo, por PCR. Pode ser feita uma comparação por referência a um controle-padrão. Por exemplo, os níveis de um gene transcrito podem ser determinados por Northern blotting e/ou RT-PCR. Com o advento da PCR quantitativa (em tempo real), a análise quantitativa da expressão gênica pode ser obtida pela utilização de iniciadores apropriados para o gene de interesse. O ácido nucléico pode ser marcado e hibridizado em um arranjo gênico, quando então a concentração do gene será diretamente proporcional à intensidade do sinal radioativo ou fluorescente gerado no arranj o.

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45/88 [0142] A reação em cadeia de polimerase (PCR) é uma reação na qual são feitas cópias replicadas de um polinucleotideo-alvo usando um par de iniciadores ou conjunto de iniciadores que consiste no iniciador upstream e em um iniciador downstream, e um catalisador de polimerização, por exemplo, uma DNA polimerase, e tipicamente uma enzima polimerase termicamente estável. Métodos para PCR são conhecidos na técnica, e são ensinados, por exemplo, em PCR (Ed. M.J. McPherson e S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford). A PCR pode ser realizada em cDNA obtido a partir da transcrição reversa de mRNA isolado de amostras biológicas. No entanto, será geralmente mais fácil se a PCR for realizada em DNA genômico.

[0143] Um iniciador é um oligonucleotideo, normalmente com comprimento de cerca de 20 nucleotídeos, com um mínimo de cerca de 15 nucleotídeos, que é capaz de hibridizar com especificidade de sequência para a sequência-alvo, e de ser estendido durante a PCR. Amplicons ou produtos de PCR ou fragmentos de PCR ou produtos de amplificação são produtos de extensão que compreendem o iniciador e as cópias recém sintetizadas das sequênciasalvo. Sistemas de PCR Multiplex contêm múltiplos conjuntos de iniciadores que resultam na produção simultânea de mais de um amplicon. Os iniciadores podem ser perfeitamente combinados com a sequência-alvo ou podem conter bases internas não combinadas que podem resultar na indução de sítios de enzima de restrição ou sítios catalíticos de reconhecimento/clivagem de ácido nucléico em sequênciasalvo específicas. Os iniciadores também podem conter

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46/88 sequências adicionais e/ou nucleotídeos modificados ou marcados para facilitar a captura ou detecção de amplicons. Ciclos repetidos de desnaturação por aquecimento do DNA, anelamento de iniciadores às suas sequências complementares e extensão dos iniciadores anelados com polimerase resultam na amplificação exponencial da sequência-alvo. Os termos alvo ou sequência-alvo ou modelo referem-se às sequências de ácidos nucléicos que são amplificadas.

[0144] Aqueles habilitados na técnica saberão que há várias técnicas alternativas para a amplificação de um polinucleotídeo da presente invenção. Exemplos de outras técnicas de amplificação incluem transcrição reversa-reação em cadeia de polimerase (RT-PCR), reação em cadeia de ligase (LCR), e também incluem técnicas de amplificação isotérmica como, por exemplo, amplificação por deslocamento de fita (SDA), amplificação de DNA isotérmica mediada por alça (LAMP).

[0145] Alternativamente, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser detectados em uma amostra com o uso de técnicas de hibridização adequadas, por exemplo, hibridização por Southern blot com sondas marcadas adequadamente. Uma sonda é uma molécula de DNA ou RNA de fita simples de sequência definida que pode ter suas bases pareadas com uma segunda molécula de DNA ou RNA que contém uma sequência complementar (o alvo). A estabilidade da molécula híbrida resultante depende da extensão do pareamento de bases que ocorre, e é afetada por parâmetros como, por exemplo, o grau de complementaridade entre a sonda e a molécula-alvo, e o grau de estringência das condições de hibridização. Sondas específicas para os

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47/88 polinucleotideos aqui descritos, ou porções destes, podem variar em termos de comprimento por qualquer número inteiro de pelo menos 8 nucleotideos até mais de 500 nucleotideos, incluindo qualquer valor entre estes, dependendo da finalidade para a qual, e das condições sob as quais, a sonda é usada. Por exemplo, uma sonda pode ter pelo menos 8, 10, 15, 20 ou 25 nucleotideos de comprimento, ou pode ter pelo menos 30, 40, 50 ou 60 nucleotideos de comprimento, ou pode ter mais de 100, 200, 500 ou 1.000 nucleotideos de comprimento. Sondas específicas para os polinucleotideos aqui descritos são geralmente pelo menos 40%, 50%, 55% ou 60% ou pelo menos 65%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou até mesmo 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências de ácidos nucléicos aqui descritas, usando, por exemplo, o programa Align (Myers e Miller, 1989).

[0146] O termo hibridização, como aqui usado, refere-se à associação de duas moléculas de ácido nucléico entre elas por ligação de hidrogênio. Fatores que afetam essa ligação incluem: o tipo e volume de solvente; a temperatura de reação; o tempo de hibridização; agitação; agentes para bloquear a adesão não específica da molécula de fase líquida ao suporte sólido (reagente de Denhardt ou BLOTTO); a concentração das moléculas; o uso de compostos para aumentar a taxa de associação de moléculas (sulfato de dextrana ou polietileno glicol) ; e a estringência das condições de lavagem após a hibridização (veja Sambrook e cols., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição (1989)). De acordo com esses princípios, a inibição da hibridização de uma molécula complementar para uma molécula-alvo pode ser examinada usando um ensaio de

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48/88 hibridização; uma molécula substancialmente homóloga que possui um grau maior de homologia irá então competir pela e inibir a ligação de uma molécula completamente homóloga para a molécula-alvo sob várias condições de estringência, como ensinado em Wahl e cols., (1987).

[0147] Como aqui usadas em relação à hibridização, as condições estringentes são aquelas que: (1) empregam potência iônica baixa e temperatura alta para lavagem, por exemplo, NaCl 0,015 M/ citrato de sódio 0,0015 M/NaDodSCk 0,1% a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante como, por exemplo, formamida, por exemplo, formamida 50% (vol/vol) com albumina sérica bovina 0,1%, Ficoll 0,1%, polivinilpirrolidona 0,1%, tampão de fosfato de sódio 50 mM a pH 6,5 com NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42 °C; ou (3) empregam formamida 50%, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M) , fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonificado (50 g/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextrana 10% a 42 °C em 0,2 x SSC e SDS 0,1%.

Bactérias atenuadas [0148] Métodos de atenuação da virulência de patógenos bacterianos são conhecidos na técnica. Tipicamente, são introduzidas mutações em um genoma bacteriano para evitar ou reduzir a expressão de toxinas ou de outros genes de virulência para eliminar ou inativar o gene. Em alguns casos, elas eliminam a função do gene completamente. Isso pode ser obtido por abolição da sintese de qualquer polipeptideo pelo gene ou por produção de uma mutação que resulta na sintese de polipeptideo não

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49/88 funcional. A fim de abolir a síntese do polipeptideo, todo o gene ou sua extremidade 5' pode ser eliminado. Uma eliminação ou inserção dentro da sequência codificadora de um gene pode ser usada para criar um gene que sintetiza apenas polipeptideo não funcional (por exemplo, polipeptideo que contém apenas a sequência do terminal N da proteína do tipo selvagem). No caso de um gene de toxina, a mutação pode tornar o produto gênico atóxico.

[0149] Uma mutação inclui qualquer alteração na sequência de DNA, ou seja, no genoma, de um organismo, quando comparada com a cepa parental. As alterações podem surgir por exposição do organismo a um estímulo mutagênico, por exemplo, uma substância química mutagênica, energia, radiação, técnicas recombinantes, emparceiramento ou qualquer outra técnica usada para alterar DNA. Uma mutação pode incluir uma alteração em qualquer uma das sequências de nucleotídeos aqui descritas, ou pode incluir uma alteração em uma sequência de nucleotídeos que codifica qualquer um dos polipeptídeos aqui descritos.

[0150] Uma mutação pode atenuar a virulência se, em consequência da mutação, o nível de virulência da célula mutante é diminuído por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, quando comparado com a cepa parental. A diminuição da virulência também pode ser medida por uma diminuição de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% na expressão e/ou atividade de toxina de um polipeptideo, por exemplo, um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos substancialmente idêntica à sequência de ID. DE SEQ. N° : 2 ou ID. DE SEQ. N°: 3, ou um fragmento ou variante desta, na cepa mutante,

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50/88 quando comparada com a cepa parental.

[0151] Aqueles habilitados na técnica observarão que um patógeno bacteriano atenuado da presente invenção pode ser adequado à liberação de um ou mais polipeptideos biologicamente ativos a um indivíduo. Exemplos de polipeptideos biologicamente ativos adequados à liberação por uma bactéria atenuada da invenção incluem aqueles que são capazes de funcionar local ou sistemicamente, por exemplo, é um polipeptídeo capaz de exercer atividades endócrinas que afetam o metabolismo local ou de todo o corpo.

[0152] Em uma modalidade, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser um polipeptídeo heterólogo. 0 termo polipeptídeo heterólogo é bem compreendido na técnica e refere-se a um polipeptídeo que não é endógeno a uma célula. A molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de interesse pode se originar de qualquer organismo capaz de produzir o polipeptídeo de interesse ou pode ser um gene completamente sintético. A molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo pode ser adicionada à célula, por exemplo, por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou semelhantes.

[0153] Como exemplo, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser aquele que é capaz de regular o sistema imuno-hematopoiético. Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser aquele que é capaz de afetar a viabilidade, o crescimento e a diferenciação de diversas células normais ou neoplásicas no corpo. Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser aquele que é

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51/88 capaz de afetar a regulação imune ou a indução de respostas inflamatórias da fase aguda às lesões e à infecção. Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser aquele que é capaz de aumentar ou induzir resistência à infecção de células e tecidos mediada por quimiocinas que atuam em seus receptores celulares-alvo, ou a proliferação de células epiteliais ou a promoção da cicatrização de feridas.

[0154] Exemplos específicos destes polipeptídeos incluem insulina, hormônio do crescimento, prolactina, calcitonina, hormônio luteinizante, hormônio da paratireóide, somatostatina, hormônio estimulante da tireóide, polipeptídeo intestinal vasoativo, uma citocina estrutural do grupo 1 como, por exemplo, IL-Ιβ, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-32, cMGF, LT, GM-CSF, M-CSF,

SCF, IFN-γ, IFN-λ, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL ou IFNa/β, uma citocina estrutural do grupo 2 como, por exemplo, a família de citocinas TNF, por exemplo, ligantes de TNFa, ΤΝΞβ, CD40, CD27 ou FAS, a família de citocinas IL-1, a família do fator de crescimento de fibroblastos, os fatores de crescimento derivados de plaquetas, fator de transformação do crescimento β e fatores de crescimento de nervos, uma citocina estrutural do grupo 3, por exemplo, a família de citocinas do fator de crescimento epidérmico, as quimiocinas, as citocinas relacionadas à insulina, uma citocina estrutural do grupo 4 como, por exemplo, as heregulinas ou neuregulinas, por exemplo, EGF.

[0155] Alternativamente, o polipeptídeo

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52/88 biologicamente ativo pode ser um receptor ou antagonista para os polipeptideos biologicamente ativos definidos acima.

[0156] Em outra modalidade da invenção, o polipeptideo biologicamente ativo é um anticorpo, preferivelmente um anticorpo recombinante.

[0157] Alternativamente, o polipeptideo biologicamente ativo pode ser um peptideo antimicrobiano ou uma variante sintética deste. Peptideos antimicrobianos incluem cecropinas, magaininas e defensinas. Cecropinas constituem a primeira família bem caracterizada de peptideos antimicrobianos estruturalmente relacionados, e são encontradas em uma ampla distribuição de insetos (Boman, 2003). Em vertebrados, a família de peptideos antimicrobianos de magainina foi isolada das glândulas da pele e do trato gastrointestinal de Xenopus laevis, e acredita-se que forme a base para o sistema de defesa das superfícies mucosas de anfíbios contra infecção (Soravia e cols., 1988) [0158]

Defensinas são peptideos antimicrobianos encontrados em células fagocíticas isoladas de várias espécies de mamíferos, incluindo o homem, e podem ser caracterizadas por oito resíduos invariantes dentro da sequência (Gabay e cols.,

1989). O mecanismo da atividade antimicrobiana de peptideos como as defensinas é por meio de uma ruptura seletiva da membrana que leva a um amplo espectro característico de atividade antibiótica (Boman,

1995) . O espectro antimicrobiano das defensinas inclui bactérias gram-positivas e gram-negativas, micobactérias, muitos fungos, e alguns vírus envelopados.

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53/88 [0159] Os peptideos antibacterianos de origem bacteriana são conhecidos como microcinas, colicinas e bacteriocinas (Jack e cols., 1995; Ingham e cols., 2003). Sabe-se que a sequência, a estrutura e os mecanismos da atividade de bacteriocinas são diversos. As bacteriocinas mais abundantes e mais detalhadamente estudadas incluem bacteriocinas da classe I (lantibióticos) e da classe II (pequenos peptideos termoestáveis que não contêm lantionina) (Ennahar e cols., 2000) . As bacteriocinas da classe II formam um subgrupo importante, por causa de suas atividades e aplicações potenciais. As bacteriocinas da classe lia incluem Piscicolina 126, leucocina A e enterocina P, entre outras. As bacteriocinas da classe lia possuem o motivo do terminal N comum: YGNGVXaaCXaa(K/N) XaaXaaCXaaV(N/D)(W/K/R)Xaa-(G/A/S)(A/N), em que os resíduos com variabilidade maior são representados por Xaa (Bhugaloo-Vial, e cols., 1996) . Em um exemplo que demonstra as propriedades antimicrobianas de bacteriocinas, Piscicolina 126, quando injetada em camundongos, demonstrou que exibe atividade antimicrobiana in vivo e reduziu significativamente a carga de listeria no fígado e no baço (Ingham e cols., 2003).

[0160] Alternativamente, o polipeptídeo biologicamente ativo pode ser uma enzima. A enzima pode ser qualquer enzima que possua uma atividade desejada. Por exemplo, pode ser desejável liberar uma enzima que tenha um papel no aumento da digestibilidade de alimentos ou na remoção de compostos antinutritivos. Por exemplo, enzimas de degradação de polissacarídeos e fibrolíticas como, por exemplo, xilanases (Liu e cols., 2005), glucanases (Cho e

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 61/102 cols., 2000), celulases (Liu e cols., 2005), amilases,

54/88 levansucrases e inulosucrases, podem ser liberadas para aumentar a digestibilidade de alimentos. Proteinases, peptidases e lipases também podem ser liberadas a fim de aumentar o valor nutritivo de alimentos ingeridos. Fitases (Vohra e Satyanarayana, 2003; Nahashon e cols., 1994) e fosfatases ácidas (Palacios e cols., 2005) podem ser liberadas para reduzir os efeitos antinutritivos de fitato que é encontrado em sementes de plantas.

[0161] Em outra modalidade, o patógeno bacteriano atenuado da invenção pode expressar um antigeno. Se o antigeno for, por exemplo, de um agente de doença bacteriana, fúngica, parasitica ou viral, a cepa bacteriana atenuada poderá ser usada para vacinar um indivíduo contra doenças causadas por esses agentes. Por exemplo, a cepa bacteriana atenuada poderia ser usada para liberar um antigeno de um microorganismo patogênico aviário. Esses microorganismos incluem, sem limitação, espécies de Corynebacteria , Mycoplasma, Listeria, Borrelia, Chlamydia, Clostridia, Coxiella, Eysipelothrix, Flavobacteria,

Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Campylobacter e

Streptococcus. Exemplos de patógenos aviários fúngicos e parasíticos que sabidamente infectam aves de criação são espécies de

Amoebotaenia, Aproctella,

Ascaridia,

Aspergillus,

Candida,

Capillaria,

Cryptosporidium,

Cyathostroma,

Dispharynx,

Eimeria,

Fimbriaria ,

Gon gyl on emi a ,

Heterakis,

Histomonas,

Oxyspirura,

Plasmodium, Raillietina, Strongyloides, Subulura, Syngamus,

Tetrameres e Trichostrongylus. Vírus que sabidamente infectam aves de criação incluem adenovírus (por exemplo,

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55/88 vírus da enterite hemorrágica), astrovírus, coronavírus (por exemplo, vírus da bronquite infecciosa), paramixovírus (por exemplo, vírus da doença de Newcastle), picornavírus (por exemplo, vírus da encefalomielite aviária), poxvírus, retrovírus (por exemplo, vírus da leucose/sarcoma aviário), reovírus e rotavírus. Exemplos específicos incluem o vírus da gripe aviária, o vírus da doença de Marek e o vírus da anemia de galinhas. Produtos gênicos preferidos para uso como antígenos são polipeptídeos e peptídeos, incluindo glicoproteínas e lipoproteínas. Genes que codificam antígenos desses organismos procarióticos e eucarióticos podem ser clonados e expressos nas bactérias atenuadas com o uso de técnicas padronizadas.

Composições e administração [0162] Uma composição imunogênica refere-se a uma composição que compreende materiais que despertam uma resposta imunológica desejada e inclui uma vacina. O termo vacina engloba qualquer composição que induza uma resposta imunológica pelo menos parcialmente protetora contra o patógeno visado ou que proteja eficazmente contra o patógeno; por exemplo, após administração ou injeção no animal (por exemplo, uma ave como, por exemplo, galinhas, ou suínos, como porcos), desperta uma resposta imunológica pelo menos parcialmente protetora contra o patógeno visado ou fornece proteção eficaz contra o patógeno (por exemplo, C. perfringens) . Uma subunidade de um patógeno, por exemplo, um antígeno ou imunógeno ou epitopo isolado do patógeno, e uma composição de subunidade compreende ou consiste basicamente em um ou mais antígenos, imunógenos ou epitopos isolados do patógeno. O termo indução de uma

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56/88 resposta imunológica pelo menos parcialmente protetora significa que uma vacina reduz a infecção e/ou a colonização por uma bactéria que expressa um polipeptideo da invenção ou reduz pelo menos um sintoma causado por infecção com uma bactéria que expressa um polipeptideo da invenção.

[0163] Uma composição imunogênica pode selecionar, ativar ou expandir células do sistema imunológico, incluindo células B e T de memória, para, por exemplo, permitir a eliminação de agentes infecciosos, por exemplo, patógenos bacterianos que expressam um polipeptideo que compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 2 e/ou do ID. DE SEQ. N° : 3, ou fragmentos antigênicos destes.

[0164] Em algumas modalidades, uma composição imunogênica inclui um veículo adequado, por exemplo, um adjuvante, que é um agente que atua de forma inespecífica para aumentar a resposta imunológica a um antígeno específico, ou a um grupo de antígenos, permitindo a redução da quantidade de antígeno em certa dose, ou a redução da freqüência de dosagem necessária para gerar a resposta imunológica desejada. Uma resposta imunológica desejada pode incluir, por exemplo, proteção total ou parcial contra a disseminação (presença nas fezes animal infectado, por exemplo, mamífero ou ave) ou colonização (presença no intestino de um animal infectado, por exemplo, mamífero ou ave) por um patógeno bacteriano. Por exemplo, uma resposta imunológica desejada pode incluir qualquer valor entre 10% a 100%, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%,

50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, proteção contra disseminação

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57/88 ou colonização por um patógeno bacteriano em um animal vacinado quando comparado com um vacinado não animal.

[0165] Adjuvantes são úteis para aumentar a resposta imunológica e/ou para aumentar a estabilidade de preparações de vacina. Adjuvantes são tipicamente descritos como estimuladores inespecificos do sistema imunológico, mas também podem ser úteis para o direcionamento de braços específicos do sistema imunológico. Um ou mais compostos que possuem essa atividade podem ser adicionados à vacina. Portanto, vacinas particulares da presente invenção ainda compreendem um adjuvante. Exemplos de compostos químicos que podem ser usados como adjuvantes incluem, sem limitação, compostos de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio), óleos metabolizáveis e não metabolizáveis, óleos minerais, incluindo derivados de oleato de manida em solução de óleo mineral (por exemplo, MONTANIDE

ISA 70 de

Seppic SA,

França), e óleos minerais leves como, por exemplo, DRAKEOL 6VR, polímeros em bloco, ISCOMs (complexos estimulantes imunes), vitaminas minerais (incluindo, sem limitação: vitamina E, vitamina

A, selênio e vitamina B12) e CARBOPOL®.

[0166]

Outros adjuvantes adequados que, algumas vezes, foram citados como estimulantes imunes, incluem, sem limitação; citocinas, fatores de crescimento, quimiocinas, sobrenadantes de culturas de células de linfócitos, monócitos, células de órgãos linfóides, preparações e/ou extratos de células de plantas, bactérias ou parasitas (preparações de

Staphylococcus aureus ou lipopolissacarídeos) ou mitógenos.

[0167] Geralmente, um adjuvante é administrado ao

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58/88 mesmo tempo em que um antigeno da presente invenção. No entanto, os adjuvantes também ou alternativamente podem ser administrados em um período de até duas semanas antes da vacinação e/ou por um período de tempo após vacinação, ou seja, enquanto o antigeno, por exemplo, um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos, como fornecida no ID. DE SEQ. N° : 2 ou ID. DE SEQ. N° : 3 ou um fragmento antigênico desta, persiste nos tecidos.

[0168] As composições imunogênicas de acordo com a invenção podem incluir os polipeptídeos e as moléculas de ácido nucléico aqui descritas, ou fragmentos imunogênicos destes, e podem ser administradas com o uso de qualquer forma de administração conhecida na técnica ou aqui descrita. Em algumas modalidades da invenção, a composição imunogênica ou vacina pode incluir um patógeno bacteriano vivo, um patógeno bacteriano morto, ou componentes destes. Patógenos bacterianos vivos que podem ser administrados na forma de uma vacina oral podem ser atenuados de modo a reduzir a virulência do patógeno bacteriano, mas não sua indução de uma resposta imunológica. Uma vacina viva pode ser capaz de colonizar os intestinos do animal inoculado, por exemplo, uma ave.

[0169] Em algumas modalidades, os polipeptídeos e moléculas de ácido nucléico aqui descritos, ou fragmentos antigênicos destes, ou as bactérias mutada (por exemplo, bactérias atenuadas) aqui descritos podem ser administrados às aves de criação, por exemplo, galinhas, patos, perus etc., de modo a despertar uma resposta imunológica, por exemplo, o desenvolvimento de anticorpos, nas aves de criação. Os ovos, ou produtos destes, obtidos destas aves

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59/88 de criação que exibem uma resposta imunológica contra os polipeptídeos e moléculas de ácido nucléico aqui descritos, ou fragmentos imunogênicos destes, podem ser administrados a um animal, por exemplo, humanos, gado, cabras, carneiros etc., para despertar uma resposta imunológica aos polipeptídeos e às moléculas de ácido nucléico aqui descritos, ou fragmentos imunogênicos destes, no animal. Métodos para o desenvolvimento de anticorpos em aves de criação, e de administração destes anticorpos, são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. N° 5.750.113 e na Pat. U.S. N° 6.730.822.

[0170] As composições imunogênicas e vacinas de acordo com a invenção podem ainda ser suplementadas pela adição de outros antígenos recombinantes ou purificados que podem resultar na produção de anticorpos de várias especificidades quando administradas a um indivíduo animal. Nem todos esses anticorpos precisam ser protetores contra a doença. Em uma modalidade particular desse tipo, estes antígenos também são de C. perfringens. Dessa forma, uma vacina da presente invenção pode conter vários outros fatores patogênicos ativos ou inativados, juntamente com o polipeptídeo da invenção. Portanto, de acordo com a presente invenção, o polipeptídeo da invenção pode ser combinado com outras células, toxóides e extratos de clostrídios e de não clostrídios.

[0171] Os antígenos adicionais podem compreender um antígeno viral e/ou um antígeno bacteriano e/ou um antígeno de parasita. Por exemplo, o antígeno pode ser derivado de um microorganismo incluindo, sem limitação, espécies de

Corynebacteria, Mycoplasma, Listeria, Borrelia, Chlamydia,

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Clostridia, Coxiella, Eysipelothrix, Flavobacteria, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Campylobacter e Streptococcus. Exemplos de patógenos aviários fúngicos e parasiticos sabidamente infectam aves de criação são espécies de Amoebotaenia, Aproctella, Ascaridia, Aspergillus, Candida, Capillaria, Cryptosporidium, Cyathostroma, Dispharynx, Eimeria, Fimbriaria, Gongylonemia, Heterakis, Histomonas, Oxyspirura, Plasmodium, Raillietina, Strongyloides, Subulura, Syngamus, Tetrameres e Trichostrongylus. Virus que sabidamente infectam aves de criação incluem adenovírus (por exemplo, vírus da enterite hemorrágica), astrovírus, coronavírus (por exemplo, vírus da bronquite infecciosa), paramixovírus (por exemplo, vírus da doença de Newcastle), picornavírus (por exemplo, vírus da encefalomielite aviária), poxvírus, retrovírus (por exemplo, vírus da leucose/sarcoma aviário), reovírus e rotavírus.

[0172] Uma vacina multivalente da presente invenção também pode compreender um ou mais dos seguintes antígenos:

toxina beta de C. perfringens, toxina beta 2 de C. perfringens, enterotoxina de C. perfringens, toxina épsilon de C. perfringens, toxina iota de C. perfringens, toxina kappa de C. perfringens, toxina lambda de C. perfringens, toxina teta de C. perfringens, toxina hemorrágica de C. sordellii, toxina letal de C. sordellii, toxina A de C.

difficile, toxina B de C. difficile, toxina alfa deC.

septicum, toxina alfa de C. novyi e toxina beta deC.

novyi.

[0173] As composições imunogênicas e vacinasda presente invenção podem ser administradas como um líquido,

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61/88 uma emulsão, um pó seco e/ou em uma névoa através da via parenteral, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, por escarificação, subcutânea, intramuscular, ou inoculadas por uma via mucosa, por exemplo, por via oral, intranasal, como um aerossol, por colírios, por administração in ovo, ou implantadas como um pó liofilizado.

[0174] A administração do polipeptideo e das moléculas de ácido nucléico aqui descritos, ou fragmentos imunogênicos destes, das bactérias mutadas (por exemplo, bactérias atenuadas) e/ou das composições imunogênicas aqui descritas pode ser convenientemente obtida por injeção no ovo de uma ave (por exemplo, aves de criação) e geralmente injeção no saco aéreo. Apesar de o saco aéreo ser a via de administração in ovo preferida, outras regiões como, por exemplo, o saco vitelino ou o líquido do córion alantóico, também podem ser inoculadas por injeção. A taxa de eclosão pode diminuir ligeiramente quando o saco aéreo não é o alvo da administração, embora não necessariamente em níveis comercialmente inaceitáveis. O mecanismo de injeção não é crucial para a prática da presente invenção, embora seja preferido que a agulha não cause danos desnecessários ao ovo ou aos tecidos e órgãos do embrião em desenvolvimento ou às membranas extra-embriônicas que circundam o embrião.

[0175] Geralmente, uma seringa hipodérmica adaptada com uma agulha de aproximadamente 22 gauge é adequada. O método da presente invenção é particularmente bem adaptado para uso com um sistema de injeção automatizado, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes U.S. 4.903.635, U.S. 5.056.464, U.S. 5.136.979 e U.S. 20060075973.

[0176] A presente invenção também fornece métodos

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62/88 de geração de imunidade passiva à prole de um animal fêmea (por exemplo, uma fêmea prenha) que compreende a administração de uma vacina da presente invenção ao animal fêmea (por exemplo, à mãe) , antes do nascimento de sua prole. Imunidade passiva refere-se à transferência de imunidade da mãe para a prole e pode ser obtida, inter alia, por meio da ingestão de colostro, como ocorre em mamíferos, ou da absorção de anticorpo na corrente sangüínea pela gema do ovo, como ocorre em aves de criação.

[017 7] Em uma modalidade, a fêmea é uma ave e a vacina é administrada à fêmea da ave, antes que ela ponha os ovos que compreendem a prole. Dessa forma, sua prole receberá imunidade passiva. Em uma modalidade desse tipo, a ave é uma ave de criação. De preferência, a ave de criação é uma galinha, um peru ou um pato.

[0178] As composições imunogênicas e as vacinas da presente invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui um veículo aceitável para uso veterinário. Em uma modalidade específica, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopéia dos E.U.A. ou em outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em seres humanos. O termo veículo refere-se a um diluente, excipiente ou veículo com o qual a substância terapêutica é administrada. Estes veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, por exemplo, água e óleos, incluindo aqueles derivados do petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo deseja, óleo mineral, óleo

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63/88 de gergelim e semelhantes.

[0179] Geralmente, os ingredientes de formulações da invenção são fornecidos separadamente ou misturados em conjunto em forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó seco liofilizado ou um concentrado livre de água em um recipiente hermeticamente lacrado como, por exemplo, uma ampola ou sache que indica a quantidade de agente ativo.

[0180] Também são fornecidas composições que compreendem um polipeptídeo da invenção, um polinucleotídeo da invenção, um vetor da invenção e/ou uma célula hospedeira da invenção. Como seria observado por aqueles habilitados na técnica, as composições podem compreender veículos ou excipientes adequados.

Vacinas de DNA [0181] A vacinação de DNA envolve a introdução direta in vivo de DNA que codifica um antígeno em células e/ou tecidos de um indivíduo para expressão do antígeno pelas células do tecido do indivíduo. Essas vacinas são aqui denominadas vacinas de DNA ou vacinas à base de ácido nucléico. Exemplos de vacinas de DNA são descritos em U.S. 5.939.400, U.S. 6.110.898, WO 95/20660 e WO 93/19183. A habilidade para a injeção direta de DNA que codifica um antígeno para despertar uma resposta imunológica protetora foi demonstrada em vários sistemas experimentais (veja, por exemplo, Conry e cols., 1994; Cardoso e cols., 1996; Montgomery e cols., 1993; Yang e cols., 1997).

[0182] Um fator que sabidamente afeta a resposta imunológica despertada pela imunização com DNA é o método de liberação de DNA, por exemplo, vias parenterais podem

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64/88 gerar taxas baixas de transferência gênica e produzem variabilidade considerável da expressão gênica (Montgomery e cols., 1993). A inoculação de plasmideos em alta velocidade, usando uma arma gênica aumentou as respostas imunológicas de camundongos (Fynan e cols., 1993), presumivelmente por causa de uma maior eficiência da transfecção de DNA e de uma apresentação de antígeno mais eficaz por células dendríticas. Vetores que contêm a vacina à base de ácido nucléico da invenção também podem ser introduzidos no hospedeiro desejado por outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, transdução, fusão de célula, dextrana DEAE, precipitação de fosfato cálcio, lipofecção (fusão de lisossomo) ou um transportador de vetor de DNA.

Vacinas derivadas de plantas transgênicas [0183]

O termo planta refere-se às plantas inteiras, aos órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raízes sementes, células de plantas e semelhantes. As plantas contempladas para uso na prática da presente invenção incluem plantas tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. Dicotiledôneas exemplares incluem milho, tomate, batata, feijão, soja, e semelhantes. Tipicamente a planta transgênica é usada rotineiramente como uma fonte de ração para animais de criação, particularmente galinhas.

[0184] Plantas transgênicas, como definidas no contexto da presente invenção, incluem plantas (bem como partes e células das referidas plantas) e sua prole que foram geneticamente modificadas usando técnicas de DNA recombinante para causar ou aumentar a produção de pelo

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65/88 menos um polipeptídeo da presente invenção na planta ou órgão de planta desejado.

[0185] Existem várias técnicas para a introdução de material genético estranho em uma célula de planta e para a obtenção de plantas que mantêm e expressam estavelmente o gene introduzido. Essas técnicas incluem a aceleração de material genético revestido em micropartículas diretamente nas células (veja, por exemplo, U.S. 4.945.050 e U.S. 5.141.131). As plantas podem ser transformadas usando tecnologia de Agrobacterium (veja, por exemplo, U.S. 5.177.010, U.S. 5.104.310, U.S. 5.004.863, U.S. 5.159.135). A tecnologia de eletroporação também tem sido usada para a transformação de plantas (veja, por exemplo, WO 87/06614, U.S. 5.472.869, 5.384.253, WO 92/09696 e WO 93/21335). Além das várias tecnologias para a transformação de plantas, o tipo de tecido que é colocado em contato com os genes estranhos também pode variar. Esse tecido incluiría, sem limitação, tecido embrionário, tecido de calo tipo I e II, hipocotil, meristema, e semelhantes. Quase todos os tecidos de plantas podem ser transformados durante o desenvolvimento e/ou diferenciação usando técnicas apropriadas aqui descritas.

[0186] Diversos vetores adequados à transfecção estável de células de plantas ou para o estabelecimento de plantas transgênicas foram descritos, por exemplo, em Pouwels e cols., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supl. 1987; Weissbach e Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; e Gelvin e cols., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores de expressão de

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plantas incluem,	por exemplo, um ou mais genes clonados de
plantas sob o	controle de transcrição de sequências
reguladoras 5'	e 3' e de um marcador selecionável

dominante. Esses vetores de expressão de plantas também podem conter uma região reguladora do promotor (por exemplo, uma região reguladora que controla a expressão indutível ou constitutiva, regulada ambientalmente ou pelo desenvolvimento, ou célula- ou tecido-específica), um sítio

de	início	da	iniciação	da	transcrição,	um	sítio de	ligação
de	ribossomo,	um sinal	de	processamento	de	RNA, um	sítio de
terminação	da	transcrição	e/ou um sinal	de	poliadenilação.
	[0187]		Exemplos	de promotores	de	planta	incluem,

sem limitação pequena subunidade de ribulose-1,6-bisfosfato carboxilase, promotor de beta-conglicina, promotor de faseolina, promotor de ADH, promotores de choque térmico e promotores tecido-específicos. Os promotores também podem conter certos elementos intensificadores da sequência que podem aumentar a eficiência da transcrição. Intensificadores típicos incluem, sem limitação, Adh-íntron 1 e Adh-íntron 6.

[0188] Promotores constitutivos dirigem a expressão gênica contínua direta em todos os tipos de células e continuamente (por exemplo, actina, ubiqüitina, CaMV 35S) . Promotores tecido-específicos são responsáveis pela expressão gênica em tipos específicos de células ou de tecido, por exemplo, as folhas ou sementes (por exemplo, zeina, oleosina, napina, ACP, globulina e semelhantes) e esses promotores também podem ser usados. Os promotores também podem ser ativos durante certo estágio do desenvolvimento de plantas, bem como em tecidos e órgãos de

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 74/102 plantas. Exemplos desses promotores incluem, sem limitação, promotores específicos para pólen, específicos para

67/88 embrião, específicos para estigma de milho, para fibra de algodão, específicos para raiz, específicos específicos para endosperma de semente e semelhantes.

[0189] Sob certas circunstâncias, pode ser desejável usar um promotor indutível. Um promotor indutível é responsável pela expressão de genes em resposta a um sinal específico, por exemplo: estímulo físico (genes do choque térmico); luz (RUBP carboxilase); hormônio (Em) ;

metabólitos; e estresse. Outros elementos de transcrição e tradução desejáveis que funcionam em plantas podem ser usados.

[0190] Além dos promotores de plantas, promotores de diversas fontes podem ser usados eficazmente em células de plantas para a expressão de genes estranhos. Por exemplo, promotores de origem bacteriana, por exemplo, o promotor de octopina sintase, o promotor de nopalina sintase, o promotor de manopina sintase; promotores de origem viral, por exemplo, do vírus do mosaico da couveflor (35S e 19S) e semelhantes, podem ser usados.

[0191] Diversas vacinas comestíveis derivadas de plantas estão atualmente sendo desenvolvidas para patógenos tanto animais quanto humanos (Hood e Jilka, 1999). Respostas imunes também resultaram da imunização oral com plantas transgênicas que produzem partículas virus-like (VLPs), ou epitopos antigênicos que exibem vírus quiméricos de plantas (Modelska e cols., 1998; Kapustra e cols., 1999) . Foi sugerido que a forma particulada desses VLPs ou do vírus quimérico pode resultar em uma maior estabilidade

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68/88 do antigeno no estômago, aumentando eficazmente a quantidade de antigeno disponível para captação no intestino (Modelska e cols. 1998).

Rações [0192] Em uma modalidade, uma composição da invenção é uma ração ou ração para animais. Para as finalidades da presente invenção, ração ou rações para animais incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano ou animal (por exemplo, gado, cavalos, cabras e carneiros) (incluindo para consumo enteral e/ou parenteral) que, quando captada pelo corpo, (a) serve para nutrir ou formar tecidos ou fornecer energia; e/ou (b) manter, restaurar ou suportar um estado nutricional ou uma função metabólica adequados.

[0193] As rações incluem substâncias nutricionais como, por exemplo, macro-nutrientes comestíveis, vitaminas e/ou minerais em quantidades desejadas para um uso em particular. As quantidades desses ingredientes irão variar, dependendo se a composição se destina ao uso em indivíduos normais ou p em indivíduos que possuem necessidades especializadas, por exemplo, indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e semelhantes.

[0194] Exemplos de substâncias com valor nutricional incluem, sem limitação, macro-nutrientes como, por exemplo, gorduras comestíveis, carboidratos e proteínas. Exemplos de gorduras comestíveis incluem, sem limitação, óleo de coco, óleo de borragem, óleo fúngico, óleo de groselha negra, óleo de soja, e mono- e diglicerídeos. Exemplos de carboidratos incluem (sem limitação): glicose, lactose comestível e amido

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69/88 hidrolisado. Adicionalmente, exemplos de proteínas que podem ser utilizadas na composição nutricional da invenção incluem (sem limitação) proteínas de soja, soro submetido à eletrodiálise, leite desnatado submetido à eletrodiálise, soro de leite ou os hidrolisados dessas proteínas.

[0195] Com relação às vitaminas e minerais, os seguintes podem ser adicionados às composições de ração da presente invenção: cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo, e Vitaminas A, E, D, C, e o complexo B. Outras vitaminas e minerais também podem ser adicionados.

[0196] Os componentes utilizados nas composições de ração da presente invenção podem ser de origem semipurifiçada ou purificada. O termo semipurifiçada ou purificada significa um material que foi preparado por purificação de um material natural ou por síntese de novo.

[0197] Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção é usado na produção da ração. Por exemplo, uma ração que compreende o polipeptideo da invenção pode ser usada para a vacinação de animais para fornecer proteção pelo menos parcial contra infecção e/ou colonização por um patógeno bacteriano que expressa um polipeptideo com atividade de toxina. De preferência, o patógeno bacteriano expressa um polipeptideo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40% idêntica ao ID. DE SEQ. N° : 2 e/ou ao ID. DE SEQ. N° : 3. Em uma modalidade, o patógeno bacteriano é do gênero Clostridium, por exemplo, o patógeno bacteriano é Clostridium perfringens.

[0198] Em outra modalidade, a ração compreende uma planta transgênica da invenção, e/ou uma parte da referida

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70/88 planta e/ou um extrato da referida planta.

Agonistas e antagonistas - ensaios e moléculas [0199] Os polipeptideos da invenção podem ser empregados em um processo de seleção para compostos que ativam (agonistas) ou inibem (antagonistas) a atividade de toxina do polipeptideo.

[0200]

Exemplos de antagonistas potenciais incluem anticorpos, oligossacarídeos e derivados destes. Um antagonista potencial inclui uma pequena molécula que se liga ao polipeptideo da invenção, tornando-o inacessível a um substrato do polipeptideo.

Exemplos de pequenas moléculas incluem, sem limitação, pequenos peptídeos ou moléculas peptideo-like. As pequenas moléculas podem mimetizar estrutura de um substrato do polipeptideo de acordo com a invenção.

[0201] A invenção também abrange ensaios de avaliação de alto rendimento (HTS) para identificar compostos que interagem ou inibem a atividade biológica (ou seja, afetam a atividade enzimática) de um polipeptideo que possui atividade de toxina. Os ensaios de HTS permitem a avaliação de grandes números de compostos de forma eficiente.

Os ensaios de HTS são projetados para identificar bits ou compostos-líderes que possuem a propriedade desejada, nos quais podem ser planejadas modificações para aprimorar a propriedade desejada. A modificação química do bit ou do composto-líder se baseia freqüentemente em um relacionamento estrutura/atividade identificável entre bit e o polipeptideo da toxina.

[0202]

Antagonistas do polipeptideo da invenção

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 78/102 podem ser utilizados para proteger animais de doenças por

71/88 sua adição à ração ou bebida dos animais. Esse tratamento pode reduzir a carga de organismos ativos derivados ambientalmente à qual o animal é exposto.

Consequentemente, a invenção fornece uma ração e/ou bebida que compreende um antagonista do polipeptídeo da invenção. 0 antagonista pode ser, por exemplo, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo da invenção. A presente invenção também fornece o uso de ração e/ou bebida que compreende esses antagonistas para reduzir a infecção e/ou colonização de um animal por uma bactéria que expressa um polipeptídeo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Toxina NetB de Clostridium perfringens

Sequenciamento do gene que codifica NetB [0203]

Dez gg de DNA genômico isolado de

Clostridium perfringens cepa EHE-NE18 foram usados para se obter leituras de sequências, contigs e pontuações de qualidade de sequência. Uma sequência de aminoácidos foi deduzida a partir da sequência de nucleotídeos.

A previsão de um peptídeo sinalizador foi realizada usando o programa

SignalP v

3.0 (Bendtsen e

2004) .

Sequências homólogas à sequência de aminoácidos deduzida foram pesquisadas usando o programa com lacunas BLAST (Altschul e cols., 1997).

[0204]

A sequência de nucleotídeos do gene que codifica NetB é fornecida como o ID. DE SEQ. N° : 1, e a sequência de aminoácidos de NetB, incluindo a sequência sinalizadora, é fornecida como o

ID. DE SEQ.

N°: 3. A sequência peptídica sinalizadora é clivada da proteína

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72/88 secretada madura (ID. DE SEQ. N° : 2) . Uma pesquisa BLAST identificou que a toxina beta de C. perfringens compartilha menos do que 39% de identidade com NetB (Figura 1). Purificação de NetB recombinante e geração de anti-soro de coelho anti-rNetB [0205] O gene netB foi amplificado por PCR e clonado em pENTR/SD/D-TOPO e subclonado, in frame, no vetor de expressão pDest41BA. A proteína foi purificada em uma coluna de afinidade de níquel, seguido por filtração gel em (S200). As frações de pico foram reunidas em pool e clivadas por TEV e re-carregadas em uma coluna de níquel para remover a proteína não clivada e o TEV. A proteína recombinante (aproximadamente 1,3 mg) foi enviada para Chemicon para a produção de anticorpo (Chemicon-Millipore, CA, EUA) . O anti-soro anti-rNetB foi usado na análise por Western blot de cepas de C. perfringens e para estudos de neutralização.

Purificação de NetB nativo [0206] C. perfringens EHE-NE18 foi desenvolvido em caldo TPG até OD600 nm de 0,6. O sobrenadante da cultura (3 1) foi obtido por centrifugação a 18.000 g por 15 min a 4°C. O sobrenadante foi concentrado 5 x usando ultrafiltração (Amicon 8400) através de uma membrana de 10 kDa (DIAFLO® YMI 0-76 mm, Amicon), seguido por precipitação de (NH4)2SO4 40% (p/v) a 4°C de um dia para o outro e separado por centrifugação a 18.000 g por 2 h a 4°C. O precipitante contendo a toxina foi concentrado 20 vezes (100 vezes no total) e dialisado contra Tris-HCl 10 mM pH 7,2 ao longo de 48 h a 4°C. As proteínas foram submetidas à cromatografia em resina de troca aniônica de Sefarose Q FF

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73/88 (GE) com tampão Tris (pH 8,5) e o fluxo coletado.

Exemplo 2. Geração de cepa mutante de C. perfringens desprovida da toxina [0207] As manipulações de DNA foram realizadas de acordo com técnicas-padrão. Os oligonucleotídeos usados na

construção do	plasmídeo suicida foram AKP60	(ID.	DE SEQ.
N° :	7), AKP61	(ID.	DE SEQ. N° : 8), AKP58 (ID.	DE	SEQ. N°:
9)	e AICP59	(ID.	DE SEQ. N°: 10). Todos	os	produtos

amplificados foram clonados no vetor de clonagem do sistema de vetor pGEM®-T Easy (Promega) e subseqüentemente subclonados como necessário. Um plasmídeo suicida marcado, com eliminação parcial, pALK16, foi construído por clonagem de fragmentos da região do gene netB em um dos lados do cassete de catP em pALKl e resultou em uma eliminação de 541 bp do gene netB. Primeiro, um fragmento de Mfel-Spel de 1.490 bp amplificado usando AKP60 e AKP61 foi clonado direcionalmente nos sítios EcoRI-Spel de pALKl, seguido por clonagem de um fragmento de BamHI-Nhel de 1.937 bp amplificado usando AKP58 e AKP59 nos sítios BamHI-Nhel do plasmídeo resultante. Finalmente, ermB e oriT amplificados de pJIR1457 foram clonados com extremidade romba no sítio Smal. O plasmídeo suicida final pALK16 foi introduzido na cepa de C. perfringens EHE-NE18 como descrito previamente (Scott e Rood, (1989)) . Após crescimento a 37°C em TSC suplementado com tianfenicol, as colônias foram espalhadas sobre TSC suplementado com eritromicina para confirmar um evento de cruzamento duplo que tenha ocorrido. As colônias que cresceram nos antibióticos apropriados foram selecionadas para análise posterior. O DNA cromossômico foi preparado, e a análise por PCR e Southern blot foi usada

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74/88 para confirmar que os mutantes eram derivados de eventos de cruzamento duplo dentro da região do gene netB. 0 plasmídeo de complementação, pALK20, foi construído por clonagem do gene netB de comprimento total no vetor shuttle de C. perfringens pJIR1457 e introduzido em ambos os mutantes. A complementação foi confirmada usando seleção por eritromicina e por testes em um ensaio de citotoxicidade. Um diagrama esquemático da região cromossômica NE18-ÁnetB é mostrado na Figura 2.

Exemplo 3. Ensaio de atividade de NetB [0208] Um ensaio de citotoxicidade foi realizado no sobrenadante de cultura de C. perfringens EHE-NE18. Células LMH foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 24 poços revestidas com gelatina 0,2% e desenvolvidas em meio EMEM a 37°C. O sobrenadante da cultura foi adicionado ao meio com diluição de 2 vezes através da placa até 1:32, e incubado por até 16 h a 37°C. As células LMH foram incubadas na presença de meio de cultura TPG puro (Figura 3a) ; sobrenadante de cultura de C. perfringens EHE-NE18, diluição de 1:16 (Figura 3b); sobrenadante de cultura de C. perfringens JIR325 cepa 13 de enterite não necrótica, diluição de 1:2 (Figura 3c); ou sobrenadante de cultura de C. perfringens NE18-M1 (mutante plc que não expressa a toxina alfa), diluição de 1:16 (Figura 3d) . Os efeitos citopáticos (CPE) foram observados sob um microscópio óptico com ampliação de 100 x.

[0209] As células normais (Figura 3a) pareciam saudáveis; no entanto, a adição de sobrenadante de cultura de uma cepa que produz NetB faz com que as células se arredondem e morram (Figura 3b). O sobrenadante de uma cepa

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75/88 que não expressa NetB não afetou as células (Figura 3c). A eliminação do gene da toxina alfa não afeta a habilidade do sobrenadante de cultura para matar as células (Figura 3d).

Exemplo 4. Complementação de mutantes da toxina netB de C.

perfringens [0210] A cepa netBl com NE18 eliminado (cepa netBnegativa) foi complementada com um plasmideo de complementação pALK20 netB. A cepa complementada de C. perfringens foi então testada quanto à atividade de toxina. Para o ensaio de citotoxicidade, células LMH foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 24 poços revestidas com gelatina 0,2%, e desenvolvidas meio EMEM a 37°C. O sobrenadante da cultura foi adicionado ao meio com diluição de 2 vezes através da placa até 1:32 e incubado por até 16 h a 37 °C. As células LMH foram incubadas com: sobrenadante de cultura de EHE-NE18, diluição de 1:16 (Figura 4a) ; sobrenadante de cultura de netBl com NE18 eliminado, diluição de 1:2 (Figura 4b); sobrenadante de cultura de netBl com NE18 eliminado + pJIR1457 (plasmideo shuttle) , diluição de 1:2 (Figura 4c); sobrenadante de cultura de netBl com NE18 eliminado + pALK20 (plasmideo de complementação netB), diluição de 1:16 (Figura 4d); meio de cultura TPG puro (Figura 4e) ; ou NetB recombinante purificado em coluna, diluição de 1:8 (Figura 4d).

[0211] A eliminação do gene netB aboliu a atividade de morte no ensaio de cultura de células. A complementação do mutante com o gene clonado em um plasmideo restaurou a atividade de morte. A proteína NetB recombinante mata as células cultivadas.

Exemplo 5. Ensaio quantitativo de morte de células por

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76/88 proteína de toxina [0212] Para determinar a habilidade de NetB para matar células, foi realizado um ensaio de citotoxicidade com lactato desidrogenase em células LMH tratadas com NetB. As células LMH foram cultivadas até 70% de confluência em placas de 96 poços revestidas com gelatina 0,2% e desenvolvidas em meio EMEM a 37°C. NetB semipurifiçado de NE18-M1 foi adicionado ao meio com diluição de 2 vezes através da placa até 1:128, e incubado por 4 h a 37 °C. A LDH liberada no sobrenadante foi medida como um indicador de citólise com um kit Cyto-Tox (Promega) e apresentada como uma percentagem de citotoxicidade. Cada diluição foi feita em triplicata e SEM calculada para cada diluição (Figura 5).

Exemplo 6. Cepas mutantes de netB em um modelo de doença de galinha [0213] Grupos de 11 pássaros foram atacados com a cepa de C. perfringens do tipo selvagem (NE18) ou mutantes com netB eliminado da cepa (NE18-NetB-Ml e NE18-NetB-M2) aos 20 e 21 dias de idade. Com 24 dias de idade, os pássaros foram submetidos à necropsia para classificar as lesões necróticas no intestino. Segmentos de íleo ou jejuno medindo aproximadamente 2-4 cm foram coletados em formalina 10% neutra tamponada com fosfato de sódio. As amostras de intestino delgado foram cortadas de forma transversa em intervalos de 4 mm e os segmentos foram processados em blocos embebidos em parafina para estudos histológicos de rotina e cortados em 4-5 pm e corados com hematoxilina e eosina (HE) . As lâminas histológicas foram examinadas por microscopia óptica. Os intestinos foram classificados de

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77/88 acordo com o número de lesões necróticas: 0 - Sem lesões; 1

- Intestinos com paredes finas e friáveis; 2 - Necrose ou ulceração focal (1-5 focos); 3 - Necrose ou ulceração (6-15 focos); 4 - Necrose ou ulceração focal (16 ou mais focos);

- Placas de necrose com 2-3 cm de comprimento; 6

Necrose difusa típica de casos de campo. A cepa do tipo selvagem mostrou um nível significativo de doença, enquanto nenhum dos mutantes isolados independentemente mostrou nenhum sinal de doença. Concluímos que NetB é um fator importante de virulência necessário para a patogênese da doença.

Tabela 2 - Cepas mutantes de NetB possuem virulência reduzida em um modelo de doença de galinha.

N° do Pássaro	Cepa de ataque
NE 18	NE18-NetB-M 1	NE18-NetB-M2
1	3	0	0
2	2	0	0
3	0	0	0
4	0	0	0
5	0	0	0
6	4	0	0
7	2	0	0
8	3	0	0
9	0	0	0
10	3	0	0
11	0	0	0
Classificação média da lesão	1,55	0	0
N° de pássaros	6	0	0

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afetados no grupo
Classificação ponderada - Média X N°	9,3	0	0

Exemplo 7. Pesquisa de toxina em cepas de C. perfringens

Pesquisa por PCR de toxina em cepas de C. perfringens [0214] A presença do gene netB em cepas NE e não NE de C. perfringens foi investigada por PCR. Para cada uma das cepas de C. perfringens testadas, uma única colônia foi suspensa em 0,1 ml de água destilada e fervida por 10 min e depois centrifugada a 10.000 g por 10 min. Os sobrenadantes foram coletados e usados como DNAs-modelos em PCR. PCR foi realizada em uma mistura de reação total de 25 μΐ contendo: tampão de PCR lx (livre de Mg²⁺) ; MgC12 2,5 mM; mistura de dNTP 0,2 mM; 2,5 unidades de Go Taq DNA polimerase (Promega) ; 50 pM de iniciadores AKP78 e AKP79; e 5 μΐ de solução-modelo. As seguintes condições foram usadas na PCR: desnaturação a 94°C por 2 min; 35 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s; anelamento a 55°C por 30 s; e extensão a 72°C por 1 min; com a etapa de extensão final a 72°C por 12 min. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em géis de agarose 1,5%, como mostrado na Figura 6: a. Cepas NE; b. Cepas não NE. O fragmento de netB de 384 bp é observado na maioria das cepas de C. perfringens isoladas de galinhas doentes com enterite necrótica. O fragmento de PCR específico de netB não é observado en nenhuma outra cepa. Isso indicava que a presença do gene netB era um bom indicador da virulência de C. perfringens em galinhas e que um ensaio desse tipo poderia ser usado para detectar cepas potencialmente virulentas.

Pesquisa por Western quanto à presença de toxina em cepas

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79/88 de C perfringens [0215] Cepas de C. perfringens foram desenvolvidas em caldos TPG pré-fervidos até OD600 nm — 0,6. O sobrenadante da cultura foi obtido por centrifugação a 18.000 g por 10 min. Os sobrenadantes foram separados por SDS-PAGE (NuPAGE Novex gel de Bis-Tris 4-12%, Invitrogen) em tampão de execução MES SDS (NuPAGE IMES SDS Running Buffer, Invitrogen). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PDVF (Millipore) e sondadas com anticorpo policlonal de coelho anti-rNetB (Chemicon, EUA) . Os blots foram desenvolvidos com o kit ECL Western Blotting Kit (Amersham Biosciences, NJ, USA) e os resultados registrados em um filme de auto-radiografia, como mostrado na Figura 7. Os parênteses indicam cepas NE e não NE de C. perfringens. Os resultados do western blot confirmaram os resultados da pesquisa por PCR - o gene e a proteína estão presentes na maioria das cepas derivadas de NE, mas não em cepas não NE. Esse método de detecção baseado em anticorpo é outra forma de detectar cepas potencialmente virulentas.

Exemplo 8. Eficácia protetora de vacina de subunidade de NetB recombinante [0216] A eficácia da proteína NetB recombinante (ID. DE SEQ. N° : 2), quando liberada como uma vacina de subunidade, foi testada em um experimento de vacinação. Experimento de vacinação 1193-4 [0217] Frangos de corte Ross 308 (Aviagen) foram vacinados com 50 pg de NetB recombinante como antígeno por dose em 0,5 ml de adjuvante de hidróxido de alumínio. Os pássaros foram vacinados no 7^o dia e no 14° dia e atacados nos 20° e 21° dias com 1,5 ml de dose oral de Clostridium

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80/88 perfringens cepa EHE-NE18. Para aumentar a suscetibilidade dos pássaros à enterite necrótica, eles foram alimentados com uma dieta rica em proteínas contendo farelo de peixe durante o período de ataque. Os pássaros foram submetidos à eutanásia e à necropsia no 25° dia para classificar as lesões intestinais de enterite necrótica.

[0218] As lesões foram classificadas de acordo com o seguinte esquema:

- Sem lesões

- Intestinos com as paredes finas e friáveis

- Necrose ou

- Necrose ou ulceração focal ulceração focal ulceração focal (1-5 focos) (6-15 focos) (16 ou mais focos)

- Placas de necrose com 2-3 cm de comprimento

- Necrose difusa típica de casos de campo Resultados [0219] A classificação média das lesões de galinhas vacinadas com antígeno de NetB recombinante e galinhas de controle de adjuvante são fornecidos na Tabela 3.

Tabela 3. Classificação média das lesões de galinhas vacinadas com antígeno de NetB recombinante.

Grupo	Número de pássaros	Classif. média da lesão	Número afetado (normalizado para grupo de 10)	Média x número (normalizado para grupo de 10)
Controle de adjuvante (ataque com NE18)	27	1,74	5, 93	12,37

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Vacinado com NetB (ataque com NE18)

18

0,21

2,1

0,46

[0220] A análise estatística das classificações das lesões usando um teste de Mann-Whitney mostra que a diferença entre o grupo vacinado com NetB e o grupo de controle de adjuvante é estatisticamente significante em mais de 95% de confiança.

Exemplo 9. Análise por Western blot de soros de pássaros vacinados [0221] Soros de galinhas vacinadas foram analisados por Western blot para determinar se as galinhas produziram anticorpos séricos para a proteína NetB. Quatro pg de antigeno de NetB recombinante foram carregados por poço em um gel poliacrilamida e submetidos a SDS-PAGE. A proteína foi transferida para uma membrana de PVDF por Western Blot. Os soros de pássaros vacinados foram diluídos até 1:1.000 em leite desnatado 5% em TBS/Tween 20 0,5% e incubados com a membrana em temperatura ambiente por 1 hora. A membrana foi lavada 3 vezes com TBS/Tween 20 0,5% e subseqüentemente incubada com anticorpos de cabra anti-galinha HRP (KPL; N° de Catálogo 14-24-06; Lote # 050860) diluídos até 1:10.000 em leite desnatado 5% em TBS/Tween 20 0,5% por 1 hora em temperatura ambiente. Após a incubação, a membrana foi lavada 3 vezes com TBS/Tween 20 0,5%. Anticorpos secundários marcados com HRP foram detectados com reagentes de Western blotting GE Healthcare ECL (N° de Catálogo RPN2106) de acordo com as instruções do fabricante. A maioria dos pássaros vacinados com NetB recombinante produziu anticorpos séricos para a proteína NetB (Figura

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8) , indicando que a vacina usada foi capaz de induzir uma resposta imunológica significante para o antigeno de NetB.

Exemplo 10. Repetição da vacinação e do procedimento de ataque

Experimento de vacinação 1219-1 [0222] Os resultados produzidos no experimento

1193-4 foram testados quanto à reprodutibilidade repetindose a vacinação e o procedimento de ataque com um lote preparado independentemente de proteína NetB recombinante. Os resultados do experimento de repetição são fornecidos na Tabela 4.

Tabela 4. Grupo vacinado com NetB versus controle de adjuvante.

Grupo	Número de pássaros	Classif. média da lesão	Número afetado	Média x número (normalizado para grupo de 10)
Controle de adjuvante (ataque com NE18)	9	2,33	7	18,1
Vacinado com NetB (ataque com NE18)	11	0,64	3	1,74

[0223] A análise estatística das classificações das lesões usando um teste de Mann-Whitney mostrou que a diferença entre o grupo vacinado com NetB e o grupo de controle de adjuvante foi estatisticamente significante em mais de 95% de confiança.

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Experimento de vacinação 1250-1 [0224] Usando o mesmo protocolo de vacinação e de ataque que os experimentos prévios, os pesos vivos de pássaros foram medidos na necropsia. Os pesos médios do controle negativo, de controle positivo e de pássaros vacinados com NetB são fornecidos na Tabela 5.

Tabela 5. Peso vivo de pássaros vacinados com NetB versus grupo de controle positivo.

Grupo	Número de pássaros	Peso médio (g)	Desvio padrão (g)
Controle negativo (sem ataque)	23	930	105,5
Controle positive (ataque com NE18)	22	798	107,5
Vacinado com NetB (ataque com NE18)	22	914	85, 7

[0225] A análise estatística usando um teste T não pareado dos pesos dos pássaros mostra que a diferença de peso entre o grupo vacinado com NetB e o grupo de controle positivo é estatisticamente significante em mais de 99% de confiança (P = 0,0004685). Os pássaros vacinados foram protegidos da restrição do ganho de peso que afeta os pássaros atacados de controle positivo, não protegidos.

Exemplo 11. Eficácia protetora de vacinas alternativas à base de NetB [0226] No experimento de vacinação 1250-1, diversas

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84/88 vacinas alternativas foram testadas. As vacinas alternativas foram: Bacterin mais NetB; vetor vivo de E. coli que expressa NetB; e C. perfringens vivo (eliminação de netB). As vacinas alternativas são descritas abaixo e os pesos vivos de pássaros vacinados versus grupo de controle positivo são descritos na Tabela 6.

Bacterin mais NetB [0227] Uma cultura de um dia para o outro da cepa de C. perfringens EHE-NE18 (400 ml TPG) foi preparada. A cultura foi centrifugada e o pélete de células e frações do sobrenadante retidos. O pélete de células foi ressuspenso em 20 ml de solução salina tamponada com fosfato, sonificado para romper as células e depois tratado com formaldeido 0,3%. O sobrenadante foi concentrado por ultrafiltração até um volume de 20 ml, e depois tratado com formaldeido 0,3%. Volumes iguais do pélete de células tratado, sobrenadante e soluções de adjuvante foram combinados, e a proteína NetB recombinante foi adicionada até uma concentração final de 100 pg/ml. Meio ml dessa vacina formulada foi usado por via subcutânea por pássaro por vacinação.

Vetor vivo de E. coli que expressa NetB [0228] E. coli cepa CCEC31rn (como descrito em WO

2007/025333) foi transformada com um plasmídeo que expressa netB a partir de seu promotor nativo. NetB é expresso constitutivamente pelo plasmídeo. Cada pássaro foi dosado oralmente com 0,5 ml de uma cultura de um dia para o outro (caldo de Luria) no 2^o dia.

C. perfringens vivo (eliminação de netB) [0229] Um derivado mutante com netB eliminado de C.

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 92/102 perfringens EHE-NE18 foi desenvolvido em caldo líquido de tioglicolato, e 0,5 ml foi administrado oralmente em pássaros com 2 dias de idade.

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Tabela 6. Peso vivo de pássaros vacinados versus grupo de controle positivo.

Grupo	Número de pássaros	Peso médio (g)	Desvio padrão (g)
Bacterin mais NetB	21	895	97
Vetor vivo de E. coli que expressa NetB	23	877	127,5
C. perfringens vivo (eliminação de netB)	23	924	101

[0230] A análise estatística usando um teste T não pareado dos pesos dos pássaros mostra que a diferença de peso entre o grupo vacinado com Bacterin mais NetB e o grupo de controle positivo é estatisticamente significante em mais de 99% de confiança (P = 0,003879), a diferença de peso entre o grupo vacinado com vetor vivo de E. coli que expressa NetB e o grupo de controle positivo é estatisticamente significante em mais de 95% de confiança (P = 0,0217605), e a diferença de peso entre o grupo vacinado com a cepa de C. perfringens vivo com o gene netB eliminado e o grupo de controle positivo é estatisticamente significante em mais de 99% de confiança (P = 0,0003855) . Esses resultados indicam que todas as diferentes vacinas podem proteger os pássaros da restrição no ganho de peso que é observada nos pássaros atacados não vacinados.

[0231] Será observado por aqueles habilitados

Petição 870170103505, de 29/12/2017, pág. 93/102 técnica que podem ser feitas diversas variações e/ou

86/88 modificações à invenção, como mostrado nas modalidades específicas, sem se afastar do espírito ou escopo da invenção, como descrita de forma ampla. As modalidades apresentadas, portanto, devem ser consideradas em todos os aspectos como ilustrativas, e não restritivas.

[0232]

Todas as publicações aqui discutidas e/ou citadas são aqui incorporadas em sua totalidade.

[0233]

U.S. 60/942.858, presente pedido reivindica prioridade do cujo conteúdo integral é aqui incorporado por referência.

[0234] Qualquer discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou semelhantes que foi incluída na presente especificação tem a finalidade única de fornecer um contexto para a presente invenção. Ela não deve ser considerada como uma admissão de que qualquer uma ou todas essas matérias formassem parte da base da técnica estabelecida ou fossem de conhecimento comum no campo relevante para a presente invenção, como se existisse antes da data de prioridade de cada reivindicação desse pedido.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula hospedeira compreendendo um polinucleotideo recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotideos como fornecida na ID. DE SEQ. N°: 1, em que a célula hospedeira é uma cepa de E. Coli.
2. Método para a produção de um polipeptídeo isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos como fornecida na ID. DE SEQ. N° : 2, o método caracterizado por compreender o cultivo de uma célula hospedeira como definida na reivindicação 1, sob condições que permitem a expressão do polinucleotideo que codifica o polipeptídeo, e o isolamento do referido polipeptídeo.
3. Composição caracterizada por compreender a célula hospedeira como definida na reivindicação 1.
4. Vacina caracterizada por compreender um antigeno e um adjuvante, em que o antigeno compreende um polipeptídeo recombinante e/ou substancialmente purificado que compreende uma sequência de aminoácidos como fornecida na ID. DE SEQ. N°: 2.
5. Vacina de DNA caracterizada por compreender um polinucleotideo como definido na ID. DE SEQ. N° : 1 e um adjuvante, em que o polinucleotideo codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como fornecida na ID. DE SEQ. N° : 2, em que, mediante a administração a um indivíduo, o polipeptídeo é expresso e uma resposta imunológica ao polipeptídeo é produzida.
6. Método de atenuação da virulência de uma bactéria que expressa um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como fornecida na ID. DE SEQ. N° : 2, o

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2/2 método caracterizado por compreender deletar a sequência de polinucleotideos como definida na ID. DE SEQ. N° : 1 para reduzir a expressão e/ou a atividade de toxina do polipeptideo, em que a bactéria atenuada possui atividade de toxina reduzida quando comparada com a bactéria não atenuada.
7. Método para determinar se um indivíduo foi exposto a um patógeno que expressa um polipeptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos como fornecida na ID. DE SEQ. N°: 2, e/ou que expressa um polinucleotideo que compreende uma sequência de nucleotídeos como fornecida na ID. DE SEQ. N° : 1, o método caracterizado por compreender a determinação da presença ou ausência do polipeptideo em uma amostra obtida do indivíduo, a determinação da presença ou ausência de anticorpos na amostra que se ligam especificamente ao polipeptideo, e/ou a determinação da presença ou ausência do polinucleotideo em uma amostra obtida do indivíduo, em que a presença do polipeptideo, anticorpos e/ou polinucleotideo é indicativa de exposição ao patógeno.
8. Uso da célula hospedeira como definida na reivindicação 1, da composição como definida na reivindicação 3, da vacina como definida na reivindicação 4 ou 5, e/ou da bactéria produzida pelo método como definido na reivindicação 6, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para despertar uma resposta imunológica em um indivíduo.