ES2276448T3 - Vacuna contra clostridium perfringens. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A DERIVADOS INMUNOGENICOS DESTOXIFICADOS DE LA BE - TOXINA DEL CLOSTRIDIUM PERFRINGENS O DE UN FRAGMENTO INMUNOGENICO DEL MISMO QUE TIENEN, COMO CARACTERISTICA, EL DE CONTENER UNA MUTACION EN LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LA BE - TOXINA, QUE NO SE ENCUENTRA EN LA SECUE NCIA DE AMINOACIDOS DE LA BE - TOXINA DE TIPO NATURAL. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE A GENES QUE CODIFICAN DICHAS BE - TOXINAS, ASI COMO A SISTEMAS DE EXPRESION QUE PERMITEN EXPRESAR TALES BE - TOXINAS. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE A S ISTEMAS DE EXPRESION BACTERIANA QUE EXPRESAN UNA BE - TOXINA NATIVA. POR ULTIMO, LA INVENCION SE REFIERE A VACUNAS BASADAS EN DERIVADOS INMUNOGENICOS DESTOXIFICADOS DE LA BE - TOXINA DEL CLOSTRIDIUM PERFRINGENS Y A LOS PROCEDIMIENTOS PARA LA PREPARACION DE DICHAS VACUNAS.

Description

Vacuna contra Clostridium perfringens.

La presente invención se refiere a derivados inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium perfringens, alADN que codifica tales derivados, a la bacteria Clostridium perfringens que comprende el ADN que codifica tales derivados, a sistemas de expresión bacterianos Gram positivos que comprenden el ADN que codifica tales derivados, a sistemas de expresión bacterianos Gram positivos que no están basados en Clostridium perfringens que expresan la toxina \beta de tipo salvaje, a las vacunas para combatir Clostridium perfringens basadas en ellos, a los métodos para la preparación de la toxina \beta de Clostridium perfringens natural, a los métodos para la preparación de derivados inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium perfringens y a los métodos para la preparación de vacunas para combatir Clostridium perfringens. El Clostridium perfringens (también conocido como C. welchii) es una especie del gran género Clostridium. Todas las bacterias pertenecientes a este género son bacilos Gram positivos anaerobios formadores de esporas. La especie C. perfringens puede ser subdividida en subespecies. Se han descrito cinco subespecies. Estas subespecies son conocidas generalmente como "tipos" A-E. Todas las subespecies producen numerosas toxinas, tanto principales como secundarias. Las cuatro toxinas principales son las toxinas \alpha, \beta, \varepsilon y \tau. Todos los tipos de C. perfringens producen la toxina \alpha. La toxina \beta es producida por C. perfringens de los tipos B y C. Además, una gama de toxinas secundarias es producida por todos los tipos de C. perfringens. Esto se debe principalmente a la presencia de una o más de estas diversas toxinas en los cinco tipos de C. perfringens, ya que todas las especies de C. perfringens son patogénicas.

Se sabe que el tipo A es patogénico tanto para hombres como para cerdos. El tipo B es principalmente patogénico para corderos, ovejas y cabras, y ocasiona la "disentería de los corderos" y la enteritis hemorrágica. El tipo C es patogénico para el hombre, las ovejas, los terneros, los corderos, los cerdos, y las aves. Es la causa de la "enterotoxemia de los lanares", la enteritis hemorrágica, la enteritis necrótica y la enterotoxemia.

Como se ha mencionado antes, se sabe que tanto el tipo B como el tipo C de C. perfringens producen la toxina \beta. Se sabe que la toxina \beta juega un papel principal en la patogénesis de la enteritis necrótica tanto en hombres como en animales. En el hombre, esta enfermedad de se ha denominado pigbel (Johnson y col.: Lancet ii: 496-500, (1987)). En animales, se ha descrito la enteritis necrótica en terneros, corderos y cerdos (Hauschild, A.H.W. in S. Kadis, T.C. Montie, (ed.) Microbial toxins, p. 159-188. Academic press, Inc, New York (1971) y Willis, T.A. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice, 3^{rd} ed. Butterworths, London (1977).

La toxina \beta de Clostridium perfringens ha sido aislada en forma pura (Sakurai y col., infect. & Immun. 18: 741-745 (1977), Sakurai y col., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)). Todavía queda mucho por saber acerca de las propiedades biofísicas de la toxina y por tanto acerca de su modo de acción. No obstante debido al hecho de que podía ser obtenida en una forma purificada se podía demostrar claramente la toxicidad de la toxina \beta en animales. La toxicidad letal de la toxina \beta purificada v.g. para ratones y cobayas fue demostrada por Sakurai y col. (infect. & Immun. 21: 678-680 (1978), Sakurai y col., Toxicon 25: 1301-1310 (1987)).

Recientemente, ha sido elucidada la secuencia de ácido nucleico de la toxina \beta de Clostridium perfringens por Hunter y col. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)). La secuencia de ácido nucleico reveló que el tamaño de la proteína toxina \beta era de aproximadamente 35 kD.

Debido al hecho de que el papel de la toxina \beta de Clostridium perfringens del tipo B y C en la patogénesis es de suprema importancia, se ha realizado un gran esfuerzo en el desarrollo de inmunidad contra esta toxina. La inmunidad contra la toxina \beta es suficiente para proteger contra la infección por Clostridium perfringens de tipo B y de tipo C. El único modo de inducir inmunidad contra la toxina \beta consiste en administrar la toxina al animal que va a ser protegido. No obstante resulta obvio que la toxina debe ser administrada en una forma destoxificada, puesto que la administración de otro modo conduciría a una grave enfermedad o a la muerte del animal que se va a vacunar.

Las vacunas basadas en la toxina \beta destoxificada, también denominada toxoide \beta, ya estaban disponibles alrededor de 1960 (v.g. Patente Británica Núm. 901.433. y Patente de los Estados Unidos Núm. 3.288.680). Todas las vacunas disponibles en la actualidad basadas en la toxina \beta de Clostridium perfringens inactivada tienen sin embargo diversas desventajas importantes. En primer lugar, todas las vacunas basadas en la toxina \beta comprenden principalmente toxina \beta químicamente destoxificada, principalmente destoxificada con formalina, y se ha demostrado con el paso de los años que es muy difícil normalizar estos procedimientos de destoxificación química.

Un ejemplo de semejante vacuna de anti-Clostridium basada en la destoxificación con formalina se da en la Solicitud de Patente Británica GB 2 020 51. Los métodos químicos clásicos para la destoxificación de proteínas tienen la desventaja de que alteran la estructura global de la proteína de una manera bastante al azar. Como resultado, durante el procedimiento de destoxificación química las propiedades inmunogénicas de la toxina \beta también disminuyen rápidamente. Esto se puede observar v.g., en el gráfico 1 y 2: en el gráfico 2 se muestra, que se necesita formalina al menos al 1%, un compuesto de inactivación utilizado muy comúnmente, para destoxificar la toxina \beta en ciertas condiciones normalizadas. A partir de los gráficos 1 y 2, se puede observar, no obstante, que el título de antigenicidad disminuye espectacularmente con una

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cantidad creciente de formalina. En cualquier caso no se puede obtener un título completo, puesto que incluso la cantidad más baja de formalina necesaria para la destoxificación (gráfico 2) ya produce un descenso del título. Esto implica que solamente hay una banda muy estrecha, en la cual se puede obtener tanto de destoxificación como un título razonable y por tanto inmunogenicidad. Dada esta banda muy estrecha, y el hecho de que existen al menos tres variables; tiempo de destoxificación, temperatura y concentración de formalina precisa, está claro que es muy difícil producir toxina \beta destoxificada reproduciblemente. Por lo tanto se desea fervientemente otro enfoque para la destoxificación de la toxina \beta. Hasta ahora no se ha encontrado una alternativa aceptable, por la siguiente razón: el delicado equilibrio entre un nivel suficiente de destoxificación y la inmunogenicidad remanente implica una íntima conexión entre, por una parte, la estructura de la proteína y, por otra parte, las propiedades biológicas de la proteína. No se debería esperar por lo tanto que fuera posible cambiar la estructura de la proteína destoxificando de ese modo la proteína, sin deteriorar al mismo tiempo significativamente las características inmunogénicas de la proteína.

Uno de los méritos de la presente invención es que describe por primera vez un modo de evitar el problema mencionado antes: utilizando mecanismos de manipulación genética, se encontraron sorprendentemente regiones de aminoácidos específicas y relativamente grandes, que se pueden mutar para proporcionar los derivados no tóxicos deseados de la toxina \beta sin deteriorar significativamente sus propiedades inmunogénicas necesarias.

De este modo, en una realización, la invención hace referencia a derivados inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento imunogénico de la misma, llevando a cabo al menos una mutación en su secuencia de aminoácidos, no encontrada en la toxina \beta de tipo salvaje definida en las reivindicaciones. Se entiende que un fragmento inmunogénico de la misma, aunque no comprende la secuencia de aminoácidos completa del derivado de la toxina \beta, todavía comprende aquellas regiones del derivado que son capaces de inducir una respuesta inmunitaria protectora en el animal huésped y comprende la mutación definida en las reivindicaciones. Se entiende que una mutación es un cambio en la secuencia de aminoácidos del derivado de la toxina \beta en comparación con la secuencia de aminoácidos de la toxina \beta de tipo salvaje.

La mutación es una sustitución, deleción, inserción o inversión, o una combinación de las mismas. Una mutación puede ser v.g. de tal manera que uno o más aminoácidos de la toxina \beta sean remplazados por otros aminoácidos, con diferentes características. Una reposición adecuada es v.g. la reposición de un aminoácido cargado negativamente con uno cargado positivamente, tal como la reposición de Aspartato con Lisina. Otra reposición adecuada es la de un aminoácido aromático con uno alifático: v.g. Triptófano \Rightarrow Glicina. También es adecuada la reposición de un aminoácido hidrófobo con uno hidrófilo, tal como v.g. Isoleucina con Aspartato.

Por lo tanto la invención en una forma preferida hace referencia a derivados de toxina \beta según la invención, donde al menos una mutación es una mutación de reposición. Esta claro que después de la reposición, las mutaciones que implican la inserción y/o deleción de uno o más aminoácidos que proporcionan derivados de toxina \beta no tóxicos, capaces todavía de inducir una respuesta inmunológica también son parte de la invención. Por lo tanto en una forma igualmente preferida, la invención hace referencia a derivados de toxina \beta según la invención, donde al menos una mutación es una deleción o inserción. Cuando se realizan dos o más mutaciones, son igualmente posibles combinaciones de mutaciones por reposición y/o deleción/inserción.

Se considera que un derivado de la toxina \beta es no tóxico si su DL50 (dosis letal que acaba con un 50% de todos los animales en un experimento) en ratones es al menos diez veces superior que la DL50 de la toxina \beta natural. La DL50 de la toxina \beta natural es de aproximadamente 0,15 \mug/ratón.

Como se ha mencionado antes, uno de los méritos de esta invención es que, al contrario de lo que se suponía en la técnica, se encontró que era posible alterar genéticamente la secuencia de aminoácidos de la toxina \beta de manera que se obtuviera un toxoide no tóxico y todavía inmunogénico. No todas las mutaciones conducirán no obstante a los derivados de toxina \beta no tóxicos y todavía inmunogénicos deseados. Por lo tanto, se ha desarrollado un ensayo para el rápido rastreo y la selección de mutantes que produzcan un derivado no tóxico de toxina \beta que todavía es inmunogénico. Este ensayo permite rastrear grandes números de mutantes que producen derivados de toxina \beta no tóxicos y todavía inmunogénicos. Este ensayo se describirá más abajo.

También se ha descubierto que aquellas regiones que forman un dominio de transición entre las partes neutra e hidrófila de la toxina \beta son adecuadas como regiones diana para introducir mutaciones que proporcionan derivados no tóxicos de la toxina \beta con las características deseadas. Estas regiones pueden ser fácilmente localizadas aplicando el algoritmo de Hopp-Woods para la secuencia de la toxina \beta (Hopp y Woods; Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981)). Por lo tanto, en una forma más preferida de esta realización, la invención hace referencia a derivados de toxina \beta que
tienen una mutación que está localizada en un dominio de transición entre las partes neutra e hidrófila de la toxina \beta.

Las regiones que son muy adecuadas como regiones diana para las mutaciones se localizan en la posición 62, en la posición 182, en la posición 197, entre el aminoácido número 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 en relación con el péptido líder metionina y la región aguas abajo de la cisteína única en la posición del aminoácido 292.

Por lo tanto en una forma aún más preferida, la invención hace referencia a derivados de toxina \beta que tienen una mutación que está localizada al menos en una de las regiones de la posición 62, 182, 197 y entre los aminoácidos número 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 y/o la región aguas abajo de la posición del aminoácido 292 en relación con el péptido líder metionina. En una forma aún más preferida, las mutaciones se localizan en la posición 62, en las posiciones 80-82, en las posiciones 95-97, en las posiciones 101-103, en las posiciones 145-147, en la posición 182, en la posición 197, en la posición 287-291, en la posición 295-299.

Los derivados inmunogénicos no tóxicos de la toxina \beta según la invención pueden ser elaborados remplazando o modificando químicamente aminoácidos de la proteína. También pueden ser elaborados introduciendo mutaciones en fragmentos de ADN del gen que codifica la toxina \beta. Los métodos para introducir mutaciones en fragmentos de ADN se describen más abajo. Los fragmentos de ADN mutados se pueden clonar después v.g. en una secuencia de nucleótidos tal como un plásmido de expresión adecuado y se pueden expresar con posterioridad.

Por lo tanto, en otra realización, la invención hace referencia a secuencias de nucleótidos que comprenden un fragmento de ADN mutado que tiene la característica de que codifica un derivado inmunogénico genéticamente destoxificado de la toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención o un fragmento inmunogénico del mismo.

Como se ha mencionado antes, en una forma preferida de esta realización la invención hace referencia a derivados de toxina \beta que tienen una mutación que está localizada en un dominio de transición entre las porciones neutra e hidrófila de la toxina \beta. Semejante derivado de toxina \beta puede ser elaborado expresando un fragmento de ADN que codifica semejante derivado de toxina \beta.

Por lo tanto en una forma preferida el fragmento de ADN mutado que codifica los derivados de la toxina \beta tiene una mutación en al menos una región de ADN que codifica un dominio de transición entre las porciones neutra e hidrófila de los derivados de la toxina \beta.

Los derivados inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención pueden ser obtenidos v.g. por medio de mutagénesis al azar del gen que codifica la toxina \beta. Se conocen en la técnica muchos modos de inducir la mutagénesis al azar, tal como v.g., la mutagénesis inducida químicamente utilizando agentes químicos mutagenizantes, la mutagénesis por radiación U.V. o radiación \gamma o la mutagénesis al azar utilizando la tecnología del ADN recombinante.

Las mutaciones a nivel de ADN también pueden ser realizadas en sitios específicos: mutagénesis dirigida al sitio. Esta se realiza con la ayuda de mecanismos de ingeniería genética conocidos. Es posible, v.g., utilizar enzimas de restricción para cortar fragmentos de ADN de o que abarcan regiones diana, y remplazar estos fragmentos por fragmentos sintéticos que tienen una secuencia mutada. La mutagénesis dirigida al sitio también es una técnica muy conveniente para introducir mutaciones en las regiones diana. Si la mutación tiene que ver con una mutación por reposición, el marco de lectura quedará por supuesto inalterado. También es posible una combinación de mutaciones por deleción y/o inserción y mutaciones por reposición.

Los mecanismos de mutación de ADN descritos antes son bien conocidos en la técnica y han sido descritos, i.a. en Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-309-6 (1989).

Un sistema de expresión bacteriano adecuado para expresar los derivados de toxina \beta según la invención es la propia bacteria Clostridium perfringens. El gen de la toxina \beta natural puede ser remplazado fácilmente por el fragmento de ADN mutado que codifica los derivados de la toxina \beta según la invención utilizando la recombinación homóloga. La recombinación homóloga es un mecanismo bien conocido en la técnica.

La bacteria Clostridium perfringens recombinante obtenida de este modo produce después el derivado inmunogénico destoxificado genéticamente de la toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención.

Por lo tanto, en otra realización más, la invención hace referencia a una bacteria Clostridium perfringens que comprende una secuencia de nucleótidos con un fragmento de ADN mutado como se ha descrito antes.

No obstante se han encontrado varios problemas adicionales durante el aislamiento de los derivados de la toxina \beta de Clostridium perfringens tanto tóxicos como no tóxicos alterados genéticamente a partir de Clostridium perfringens. En primer lugar, el Clostridium es una bacteria peligrosa de desarrollar, visto desde el punto de vista de la salud de los trabajadores. El crecimiento de las especies de Clostridium para la producción de toxina \beta debe tener lugar en condiciones muy seguras que dificultan la producción a gran escala. En segundo lugar como se ha mencionado antes, junto con la toxina \beta se elaboran otras toxinas principales/secundarias. El aislamiento y la purificación de la toxina \beta entre estas otras toxinas, que son necesarios v.g. para la producción de vacunas, son difíciles y llevan tiempo. En tercer lugar, las especies de Clostridium son formadoras de esporas. Es necesario pero difícil eliminar todas las esporas de la preparación de la toxina \beta y al mismo tiempo conservar las características inmunogénicas de la toxina \beta, puesto que estas esporas son muy resistentes al calor y a los agentes químicos.

Por lo tanto, existe claramente la necesidad de métodos para proporcionar toxina \beta libre de otras toxinas de Clostridium y libre de esporas de Clostridium.

Los sistemas de expresión distintos de Clostridium basados en la bacteria Gram negativa E. coli para la expresión de la toxina \beta de Clostridium han sido descritos con anterioridad. Los sistemas de E. coli han sido utilizados por Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) para la expresión del gen de la toxina \beta. Solamente se encontró una pequeña banda correspondiente a la proteína de 34 kD esperada a la vez que se encontró con mucho la mayoría de la proteína toxina \beta en formas multiméricas de 118 kD grandes. Steinporsdottir et al. (FEMS Microbiology Letters 130: 273-278 (1995)) intentaron expresar el gen de la toxina \beta en E. coli como una proteína de fusión fusionada a la glutation-S-transferasa. Asimismo, como Hunter, encontraron solamente toxina \beta no natural de elevado peso molecular. Se concluyó en esta publicación, que la proteína producida en E. coli tenía una conformación diferente de la de la toxina \beta natural. Por lo tanto parece probable que otras proteínas codificadas por Clostridium jueguen un papel adicional en el plegamiento conformacional y la excreción de la toxina \beta natural. Se sabe que este es el caso para muchas otras proteínas bacterianas excretadas. Por esta razón, puesto que como se ha mencionado antes existe un delicado equilibrio entre estructura e inmunogenicidad, no se puede esperar que la toxina \beta obtenida a partir de fuentes distintas de Clostridium perfringens y por tanto en una forma no natural sea una base eficaz para una vacuna, con independencia del sistema de expresión utilizado.

Flaxman, D. T. et al., (Medical Microbiology and Immunology 185:113/33 (1996)) mencionaron que ellos habían expresado la toxina \beta monomérica en Bacillus subtilis. No obstante, no estudiaron las herramientas de expresión que utilizaron, sin tomar en cuenta que mencionaron el plegamiento conformacional, y por lo tanto la inmunogenicidad de la toxina \beta expresada de este modo.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente, que la expresión del gen de la toxina \beta natural en bacterias Gram positivas distintas de Clostridium perfringens proporciona una toxina \beta natural con todas las características y actividades biológicas y biofísicas de la toxina \beta natural producida en Clostridium perfringens, pero que tiene numerosas ventajas muy deseables sobre la toxina \beta producida en Clostridium perfringens o E. coli: a) no es contaminada con esporas de Clostridium perfringens, b) es producida libre de lipopolisacáridos contaminantes, c) es producida libre de otras toxinas de Clostridium principales/secundarias y d) se encuentra en su conformación natural.

La toxina \beta obtenida de este modo puede ser inactivada con formalina más ventajosamente que la toxina \beta obtenida a partir de Clostridium, puesto que el único material biológico a tener en consideración durante la inactivación es la propia toxina \beta: no es necesario tener precaución con las esporas, lipopolisacáridos y otras toxinas de Clostridium principales/secundarias, puesto que están ausentes per se.

Por lo tanto, en otra realización más, la invención se refiere a sistemas de expresión bacterianos Gram positivos en los que la bacteria Gram positiva no es Clostridium perfringens, comprendiendo dicho sistema de expresión el gen que codifica la toxina \beta de Clostridium perfringens de tipo salvaje.

El gen de la toxina \beta puede estar bajo el control de su promotor natural. También se puede poner bajo el control de un promotor heterólogo. Semejante promotor puede ser v.g. el promotor Lac (Chang et al., Nature 275: 615 (1978)) o el promotor Trp (Goeddel et al., N.A.R. 8: 4057 (1980)).

Semejante promotor puede ser un promotor fuerte, que conduzca a la sobreexpresión de la toxina \beta, o puede ser un promotor inducible. Ambas clases de promotores son conocidas en la técnica.

Se han descrito diversos sistemas de expresión para bacterias Gram positivas, y los plásmidos de expresión versátiles para su uso en diversas familias de bacterias Gram positivas son conocidos en la técnica. Pueden servir como ejemplo los sistemas de expresión basados en el replicón de amplia gama de huésped Gram positivos Enterocócicos de pAM\beta1 descrito por Simon y Chopin (Biochimie 70: 559-567 (1988)). Se pueden utilizar derivados de este plásmido para la expresión de genes foráneos v.g., en especies de Streptococcus, Lactobacillus, y Bacillus.

En el grupo de las bacterias Gram positivas distintas de Clostridium, aquellas bacterias cuyo genoma tiene un contenido en AT relativamente elevado son las más adecuadas para la clonación y la expresión de genes del género Clostridium. Por lo tanto, en una forma más preferida, la bacteria Gram positiva utilizada para la preparación de la toxina \beta natural o el derivado de la toxina \beta según la presente invención se selecciona del grupo formado por Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus, Bacillus, Sarcina, Ruminococcus o Listeria.

Por supuesto resulta incluso más ventajoso expresar un gen de toxina \beta mutado según la invención en una bacteria Gram positiva distinta de Clostridium: es ese caso el tratamiento de destoxificación con formalina puede ser completamente omitido. El derivado no tóxico así obtenido, además de estar libre de esporas, libre de lipopolisacáricos, libre de otras toxinas de Clostridium principales/secundarias y de estar en forma natural, tiene la ventaja adicional de que no es tóxico per se.

Por lo tanto, en una forma más preferida, la invención hace referencia a un sistema de expresión bacteriano Gram positivo, no siendo dicha bacteria Gram positiva Clostridium perfringens, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un gen de toxina \beta derivado según la invención o un fragmento inmunogénico del mismo.

Otra realización más de la presente invención hace referencia a vacunas para combatir las infecciones por Clostridium perfringens, basadas en derivados inmunogénicos destoxificados genéticamente de la toxina \beta de Clostridium perfringens. Tales vacunas pueden ser elaboradas v.g. mezclando una cantidad inmunológicamente suficiente de derivados inmunogénicos destoxificados de la toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención y un portador fisiológicamente aceptable. Se entiende que una cantidad inmunológicamente suficiente es la cantidad de toxina \beta de Clostridium perfringens inmunogénica destoxificada que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal huésped. De este modo otra realización de la invención hace referencia a vacunas para combatir la infección por Clostridium perfringens que comprenden un derivado del toxoide \beta de Clostridium perfringens según la invención o un fragmento inmunogénico del mismo, y un portador fisiológicamente aceptable.

Un portador fisiológicamente aceptable es v.g. agua o una solución salina fisiológica. A menudo, la vacuna se mezcla adicionalmente con estabilizadores, v.g., para proteger los polipéptidos propensos a la degradación de ser degradados, para aumentar la vida útil o para mejorar la eficacia de liofilización. Los estabilizadores útiles son i.a. SPGA (Bovamik et al; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos v.g. sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o los productos de la degradación de los mismos, y tampones, tales como los fosfatos de metales alcalinos. Ni que decir tiene, que se pueden utilizar otros modos de estabilizar la vacuna añadiendo compuestos que también se incorporan a la presente invención.

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Opcionalmente, se pueden añadir a la vacuna, uno o más compuestos que tengan actividad coadyuvante. Los coadyuvantes son estimuladores no específicos del sistema inmunitario. Intensifican la respuesta inmunitaria del huésped al que se administran inmunógenos. Por lo tanto, en una forma más preferida, las vacunas según la presente invención comprenden un coadyuvante.

Los ejemplos de coadyuvantes conocidos en la técnica son el coadyuvante Completo e Incompleto de Freund, la vitamina E, los polímeros de bloques no iónicos, los muramildipéptidos, los ISCOM (complejos inmunoestimuladores, véase por ejemplo la Patente Europea EP 109942), las Saponinas, el aceite mineral, el aceite vegetal, y Carbopol (un homopolímero).

Los coadyuvantes, especialmente adecuados para la aplicación a las mucosas son v.g. la toxina termo-lábil de E. coli (LT) o la toxina del Cólera (CT).

Otros coadyuvantes adecuados son por ejemplo el hidróxido, fosfato u óxido de aluminio, las emulsiones en aceite (v.g. de Bayol F (R) o Marcol 52 (R), las saponinas o el producto solubilizado de vitamina E.

La vacuna según la presente invención puede ser mantenida almacenada utilizando métodos conocidos en la técnica para almacenar vacunas vivas. El almacenamiento se puede realizar v.g. a temperaturas por debajo de cero.

La liofilización también es un método conocido y adecuado para la conservación de vacunas. La liofilización tiene la ventaja, de que estabiliza la vacuna de manera que puede mantenerla en reserva a temperaturas bastante por encima de las necesarias para mantener las reservas no liofilizadas. La vacuna según la presente invención puede ser liofilizada muy eficazmente, especialmente cuando se mezcla con estabilizadores tales como los mencionados más arriba antes de la liofilización.

La vacuna puede ser administrada a todos los huéspedes sensibles a la infección por Clostridium perfringens tipo B o C, tales como el ser humano, los corderos, las ovejas, las cabras, los cerdos, las aves y los terneros.

La vacuna puede ser administrada tan pronto como el día del nacimiento, pero también puede ser administrada en cualquier fase más tardía.

Las dosis de la vacuna están preferiblemente entre 1 y 100 \mug del derivado por animal, dependiendo parcialmente del tamaño del animal. Para cerdos, v.g. una dosis muy adecuada oscila entre 20 y 80 \mug.

Aunque en principio se pueden utilizar todas las rutas comunes de administración, la vacuna se administra preferiblemente intraperitonealmente, intranasalmente, intramuscularmente, subcutáneamente, oralmente o intradérmicamente.

Otra realización más de la invención hace referencia a un modo alternativo de elaborar una vacuna para combatir las infecciones por Clostridium perfringens. Se pueden utilizar bacterias y virus vivos atenuados o no patogénicos que tengan un animal o humano sensible a Clostridium perfringens tipo B o C como huésped, como portadores del gen de la toxina \beta mutado según la invención como se ha descrito antes. Estas denominadas vacunas portadoras recombinantes vivas se pueden administrar de un modo seguro al animal-huésped junto con un portador fisiológicamente aceptable: se comportan no patogénicamente y expresan un derivado de la toxina \beta no tóxico. Las vacunas basadas en portadores recombinantes vivos tienen la ventaja de que producen y o presentan derivados de la toxina \beta de Clostridium perfringens directamente en el huésped.

Los animales vacunados con semejante bacteria o virus recombinante producirán una respuesta inmunogénica no solamente contra los inmunógenos del vector, sino también contra las porciones inmunogénicas del polipéptido o los polipéptidos para los cuales el código genético es clonado adicionalmente en el portador recombinante. Esto tiene la ventaja de que administrando semejante portador recombinante se puede obtener protección contra dos o más enfermedades.

Muchos virus y bacterias portadores recombinantes vivos son conocidos actualmente en la técnica.

Las bacterias portadoras recombinantes vivas adecuadas son v.g. las especies de Salmonella y las especies de E. coli. Los virus utilizados frecuentemente en la técnica como portadores recombinantes vivos son los adenovirus, retrovirus, virus vaccinia y herpesvirus. También es adecuado como portador aplicable oralmente específico el Parvovirus Porcino. Otro virus que es útil como virus portador recombinante vivo para llevar el gen que codifica el \beta-toxoide es el herpesvirus virus de la Pseudorrabia (PRV) (v.g. como se describe en la Patente Europea Núm. 606.437). Semejante PRV que porta el gen del toxoide \beta protegería a los cerdos de la infección por PRV y por Clostridium perfringens
tipo C.

De este modo, las vacunas para combatir la infección por Clostridium perfringens que comprenden un organismo portador recombinante vivo que porta el gen de la toxina \beta mutado según la invención también son por lo tanto parte de la invención.

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Esta claro que la toxina \beta natural es un importante factor, si no el más importante factor de virulencia en Clostridium perfringens. Por lo tanto, una cepa de Clostridium en la cual el gen de la toxina \beta natural es remplazado por un gen de toxina \beta mutante según la invención como se ha descrito antes ha perdido por consiguiente un importante factor de virulencia. Semejante cepa puede ser utilizada como vacuna atenuada viva, puesto que la toxina \beta no es elaborada en su forma tóxica sino en forma de un derivado no tóxico. La ventaja de semejante vacuna atenuada viva es que produce una forma no tóxica pero todavía inmunogénica de la toxina \beta, a la vez que tiene además todos los demás antígenos inmunogénicos de la cepa de Clostridium perfringens natural.

Por lo tanto, las vacunas que comprenden una cepa de Clostridium perfringens viva atenuada en la cual el gen de la toxina \beta natural es remplazado por un gen de la toxina \beta mutada según la invención también están incluidas en esta invención.

También son abarcadas por la invención las vacunas que comprenden, además de un derivado de la toxina \beta según la invención, inmunógenos de otros patógenos. Esto permite vacunar contra diversas enfermedades en una única etapa de administración de la vacuna.

En una forma más preferida de esta realización, la vacuna según la presente invención comprende inmunógenos adicionales, seleccionados del grupo formado por Actinobacillus pleuropneumoniae, virus de la Pseudorrabia, Virus de la Influenza Porcina, Parvovirus Porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Salmonella species, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis y bacterias de tipo Helicobacter.

La presente invención también hace referencia a los métodos para la preparación de la toxina \beta de Clostridium perfringens natural, cuyos métodos están basados en la expresión de una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de ADN que codifica dicha toxina \beta en bacterias Gram positivas diferentes de Clostridium perfringens.

Además, la invención presenta métodos para la preparación de derivados no tóxicos de toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención. Estos métodos están basados en la expresión de secuencias de nucleótidos que comprenden un fragmento de ADN que codifica un derivado de la toxina \beta, en una bacteria Gram positiva.

Asimismo, la invención proporciona métodos para la preparación de una vacuna para combatir la infección por Clostridium perfringens. Tales métodos comprenden v.g. mezclar un derivado de la toxina \beta de Clostridium perfringens según la invención y un portador fisiológicamente aceptable.

Ejemplo 1 Construcción de los plásmidos de expresión pKS90, pTREX1A, pTREX7 y pTREX14

El plásmido pKS90 es un plásmido gram positivo con replicación theta con un elevado número de copias (40-80 por célula) basado en el plásmido pTREX1, que es a su vez un derivado del plásmido pIL253 publicado previamente. pIL253 incorpora el replicón de amplia gama de huésped Gram positivo de pAMb1 (Simon, D., and A. Chopin. 1988. Construction of a vector plasmid family and its use for molecular cloning in Streptococcus lactis. Biochimie. 70: 59-567.) y no es movilizable por el factor sexual de L. lactis. pIL253 también carece de la función tra que es necesaria para la transferencia o movilización eficaz por los plásmidos parentales conjugativos ejemplificados por pIL501. El replicón pAMb1 Enterocócico ha sido transferido previamente a diversas especies incluyendo especies de Streptococcus, Lactobacillus y Bacillus así como a Clostridium acetobutylicum, (Gibson, E.M., N.M. Chace, S.B. London and J. London. 1979. J. Bacteriol. 137: 614-619. LeBlanc, D.J., R.J. Hawley, L.N. Lee and E.J. St. Martin. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75:3484-3487. Oultram, J.D., and M. Young. 1985. FEMS Micro. Lett. 27: 129-134.) indicando la potencial utilidad de la amplia gama de huésped. Si bien pTREX1(y pTREX1A) representan un vector de transcripción constitutivo básico, el derivado pKS90 utiliza el acoplamiento traduccional a una región de iniciación de la traducción lactocócica con el fin de incrementar el nivel de expresión. Los detalles de la construcción de pKS90 y su pTREX12 parental inmediato se dan más abajo.

pTREX1

Se creó un fragmento de ADN artificial que contenía una supuesta secuencia estabilizadora de ARN, una región de inicio de la traducción TIR), un sitio de clonación múltiple para la inserción de los genes diana y un terminador de la transcripción mediante apareamiento de 2 oligonucleótidos complementarios y prolongación con ADN polimerasa de Tfl. Los oligonucléotidos efectores y antisentido contenían los sitios de reconocimiento para NheI y BamHI en sus extremos 5' respectivamente para facilitar la clonación. Este fragmento fue clonado entre los sitios XbaI y BamHI en pUC19NT7, un derivado de pUC19 que contiene la casete de expresión T7 de pLET1 (Wells, J.M., P.W. Wilson and R.W.F. Le Page. 1993. J. Appl. Bact. 74:629-636.) clonada entre los sitios EcoRI y HindIII. El constructo resultante fue denominado pUCLEX. La casete de expresión completa de pUCLEX fue separada después cortando con HindIII y volviendo romos los extremos seguido de corte con EcoRI antes de la clonación en los sitios EcoRI y SacI (romos) de pIL253 para generar el vector pTREX. La supuesta secuencia estabilizadora de ARN y la TIR están derivadas de la secuencia del bacteriófago T7 de E. coli y modificadas en una posición de nucleótidos para intensificar la complementariedad del motivo de Shine Dalgarno (SD) con el ARN ribosómico 16s de Lactococcus lactis. Un promotor cromosómico de Lactococcus lactis MG1363 denominado P1 fue clonado entre los sitios EcoRI y BglII presentes en la casete de expresión, creando pTREX1. Este promotor había sido aislado previamente utilizando el vector sonda del promotor pSB292 y caracterizado por la prolongación del cebador y el análisis de secuenciación del ADN (Nick. R. Waterfield, R. W. F. Le Page, P.W. Wilson, and J.M. Wells. Gene. 165. 1995. 9-15.). El fragmento promotor fue amplificado mediante PCR utilizando la ADN polimerasa Vent. El fragmento de la PCR incluía toda la secuencia de ADN aguas arriba del promotor clonado y hasta 15 bases 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción. La secuencia de Shine-Dalgarno (SD) presente aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción de este promotor fue excluida deliberadamente del fragmento promotor amplificado mediante PCR para evitar el inicio de la traducción en sitios diferentes del codón de iniciación indicado en la casete de expresión. Asimismo se han creado dos vectores similares denominados pTREX7 y pTREX14 utilizando los promotores P7 y P14 más débiles, clonados entre los sitios EcoRI y BglII en lugar de P1. Los cebadores de la PCR utilizados para crear estos fragmentos promotores se ilustran en la figura 1.d. El plásmido pTREX1A representa una alternativa a pTREX1, en el cual la casete de expresión unida a XbaI es remplazada por el fragmento de la casete de expresión de T7 XbaI-SpeI de pET3A. Por lo tanto la secuencia SD no está optimizada para Lactococcus. La secuencia de pTREX1A completa y los esquemas que ilustran la casete de expresión se ilustran en la figura 1.

pKS90

El plásmido pKS90 es un derivado de pTREX1, que si bien utiliza el mismo promotor de la transcripción P1, tiene una TIR modificada que contiene la SD y los 20 primeros codones de un gen de la resolvasa derivado cromosómicamente de Lactococcus, p11, (Nick. R. Waterfield, R. W. F. Le Page, P.W. Wilson, and J.M. Wells. Gene. 165. 1995. 9-15.). Esto se logró clonando una secuencia de ADN artificial, que contenía la nueva TIR, entre los sitios BglII y BamHI de pTREX1. Las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en este procedimiento se presentan en la figura 2. Por medio de una selección cuidadosa de la secuencia del cebador de la PCR, se puede acoplar traduccionalmente un gen diana derivado de la PCR a esta TIR, que se ha demostrado que incrementa el nivel de expresión cuando se compara con el obtenido del plásmido parental pTREX1. La secuencia de pSK90 completa y un esquema que ilustra la casete de expresión se ilustran en la figura 2.

Construcción de cepas recombinantes de Lactococcus lactis que secretan toxina beta activa

El ADN de pJF2000 (suministrado por J. Frey, Institute for veterinary bacteriology, University of Berne, CH-3012 Beme, Switzerland) que comprende un gen que codifica la toxina\beta publicado por Hunter et al. (Infect. & Immun. 61: 3958-3965 (1993)) fue sometido a electroporación en E. coli SURE. El ADN plasmídico de seis transformantes independientes fue aislado, examinado mediante digestión con enzimas de restricción y reunido. Estas cepas fueron almacenadas a -70ºC en glicerol al 15%. El gen cpb con la región de inicio de la traducción asociada (y el bucle estabilizador de ARN aguas arriba) fue separado por corte de esta preparación reunida de ADN plasmídico mediante digestión con XbaI/BamHI o SmaI/BamHI. Los fragmentos del gen cpb purificados fueron ligados en sitios de clonación múltiples de los vectores de expresión pTREX1A, pTREX14 y pTREX7, que dirigen los niveles elevado, medio y bajo de expresión constitutiva respectivamente. Los fragmentos de cpb terminados en XbaI/BamHI fueron ligados en pTREX1ANEW digerido con XbaI/BamHI mientras el fragmento de cpb terminado en SmaI/BamHI fue ligado en el ADN de pTREX4 y pTREX7 con BamHI/BglII (con extremos romos). Estos constructos fueron sometidos a electroporación con éxito en la cepa especialmente inhabilitada de Lactococcus lactis pep5- acmA-, que carece de una peptidasa codificada cromosómicamente, pep5, que permite que el organismo utilice los péptidos liberados de la caseína. Además, también carece de una autolisina asociada a la pared celular, acmA. Cualquier otra cepa de Lactococcus lactis es adecuada no obstante para este fin. Se identificaron diez productos aislados correctos de cada tipo utilizando el análisis de digestión con enzimas de restricción y almacenaron a -70ºC en glicerol al 15%. Estos tipos de cepas se designaron L. lactis pep5- acmA- [pTREX1Acpb], L. lactis pep5- acmA- [pTREX14cpb] y L. lactis pep5-acmA- [pTREX7cpb]. Además, el gen cpb fue amplificado mediante PCR utilizando ADN polimerasa Vent y oligonucleótidos terminados en BamHI del plásmido pJF2000. Este producto de la PCR fue clonado en el sitio BamHI del vector de acoplamiento con TIR pKS90.

La proteína total extraída de las células semi-log y el sobrenadante fueron resueltos utilizando SDS-PAGE antes de transferirlos a filtros de nitrocelulosa. Estos filtros fueron sondeados con anticuerpos tanto monoclonales como policlonales para Cpb, utilizando toxina beta purificada con MAB (anticuerpo monoclonal) como control. Se detectó un único producto proteico del tamaño correcto (aproximadamente 30 kDA) en los sobrenadantes de cultivo de las cuatro cepas, mediante transferencia western y tinción con Azul de Coomasie de los geles SDS. La cantidad de toxina beta secretada por cada cepa coincidía con las fuerzas relativas de los promotores en los vectores de expresión utilizados. No se pudo detectar toxina intracelular, sugiriendo que la secuencia exportadora de Clostridium funciona eficazmente en Lactococcus. Se demostró que los sobrenadantes filtrados del expresante de pTREX1A, L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p3-1/5], y del expresante de pKS90 L. lactis MG1363 pep5- acmA- [p5-123], contenían toxina activa, proporcionando un control positivo para la toxina beta recombinante.

Los genes mutantes de cpb

Los genes cpb mutantes fueron creados mediante construcción génica in vitro utilizando fragmentos de PCR amplificados por la ADN polimerasa Vent a partir del gen cpb molde original (clonado a partir de C. perfringens tipo C) presente en el plásmiodo pJF2000 (suministrado por J. Frey). Los cebadores utilizados en esta construcción, y un ejemplo del procedimiento de construcción empleado, se dan en la figura 3. La inclusión de sitios BamHI en los extremos 5' de los cebadores de la PCR cpbF2 y cpbR terminales permitía clonar estos mutantes en el sitio BamHI del plásmido de expresión pKS90 (ver arriba). La elección de cebadores de la PCR que incorporaban un sitio BamHI adecuadamente distanciado con respecto al codón de iniciación ATG de cpb, permitía acoplar traduccionalmente los genes de cpb mutantes con la TIR P11 en pKS90. Se utilizó este método para generar una serie de cepas de expresión mutante. Las secuencias exactas de estos genes mutantes (tras la clonación en pKS90) fueron determinadas secuenciando automáticamente con una redundancia de 3-4 veces, que confirmaba tanto las secuencias génicas como la localización en los plásmidos de expresión. La clonación de los genes mutantes en estos vectores permitía la secreción del producto génico al sobrenadante de cultivo en virtud del líder de exportación N-terminal de cpb natural. El sobrenadante de cultivo fue esterilizado por filtración y utilizado directamente en bioanálisis con animales.

TABLA 1 Constructos de genes mutantes

3

Cepas de expresión mutante

Los plásmidos de expresión del toxoide basados en pKS90 se propagan en la cepa huésped Lactocócica especialmente deshabilitada, L. lactis MG1363 pep5- acmA-, pero también se pueden utilizar otras cepas de Lactococcus. Esta cepa representa un profago y una cepa curada de plásmido que es muy auxotrófica e incapaz de sobrevivir en el entorno lácteo natural. Además crece a una velocidad menor que otras cepas lactocócicas. Las cepas de expresión no tóxicas construidas como se ha indicado antes se representan en la tabla 1. En esta tabla, se indica qué aminoácidos están mutados y dónde están localizadas las mutaciones. Las cepas de expresión del toxoide se pueden hacer crecer en medio M17 (Difco número de cat. 1856-17) suplementado con glucosa al 0,5% p/v y 5 g/ml de eritromicina. No se requiere aireación, por supuesto se prefieren condiciones anóxicas aunque no es esencial. La temperatura de crecimiento óptimo es de 30ºC. Se ha demostrado que las diferentes proteínas toxoides producidas por todas estas cepas se acumulan en el medio de cultivo a niveles de menos de 5 g/ml. El análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos tanto monoclonales como policlonales confirmó que el monómero de la proteína de tamaño correcto es secretado al sobrenadante por todas las cepas denominadas expresantes enumeradas antes. La secuenciación N-terminal de una proteína mutante ejemplo, M4(4-3), confirmaba que el péptido líder es correctamente escindido durante la exportación desde el citoplasma lactocócico.

Protocolo para la mutagénesis al azar del gen cpb

La mezcla de reacción de PCR típica se ajusta como sigue:

Tris-HCl 10 mM (pH 8,7 a 25ºC)

KCI 50 mM, 5 \mug/ml seralbúmina bovina

0,5 \muM de cada uno de los cebadores de la PCR

(cpbf2: 5'-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3') (SEC ID NO : 3)

(cpbR: 5'-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3') (SEC ID NO : 4)

MgCl_{2} 4 mM

0,5 mM MnCl_{2}

dNTP forzado, otros 3 dNTP 3,4 mM y 0,2 mM (la concentración de dNTP puede oscilar entre 0,1 y 10 mM)

ADN molde 600 pM (clon de cpb pJF2000 u otro derivado de cpb)

2U de ADN polimerasa Taq

Las condiciones del ciclo térmico fueron las siguientes:

(94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 60 segundos, 72ºC durante 180 segundos) 30 ciclos, seguido de incubación a 72ºC durante 600 segundos.

Esta reacción se realizó utilizando cada uno de los 4 dNTP como nucleótido forzado y después reuniéndolos. Esto produce una mezcla de sustituciones adecuadamente al azar. Los fragmentos de PCR reunidos fueron digeridos con BamHI y ligados en pKS90 digerido con BamHI. Esta mezcla de ligadura fue transformada en Lactococus lactis MG1363. Los transformantes se hicieron crecer en cultivo líquido y los sobrenadantes filtrados se sometieron a ensayo en el análisis de la toxina beta in vitro descrito en el Ejemplo 3.

Ejemplo 2 Cultivo de Lactococcus lactis

Se hizo crecer L. lactis que producía el gen de la toxina \beta modificada en medio M17 (v.g. Difco cat. 1856-17), suplementado con glucosa al 0,5% p/v y 5 \mug/ml de eritromicina. No se requería aireación, eran preferibles condiciones anóxicas aunque no esenciales. La temperatura de crecimiento óptima es de 30ºC. La adición de glucosa es necesaria durante el crecimiento exponencial.

Preparaciones de antígenos

El sobrenadante de cultivo se separó de las células por medio de centrifugación. Después de la filtración estéril del sobrenadante los derivados fueron precipitados con sulfato de amonio (0,3 g/g). El producto precipitado se resuspendió en PBS. Como alternativa se puede concentrar el sobrenadante de cultivo en un filtro < 10.000 Da.

Letalidad en ratón

Los derivados de la toxina \beta producida en L. lactis fueron sometidos a ensayo inicialmente mediante inyección de sobrenadante de cultivo filtrado estéril, intraperitonealmente, 0,5 ml en ratones NRMI que pesaban aproximadamente 20 g. Los derivados pM 6-1, 6-5, y 6-7 eran letales a un nivel similar al de la toxina natural. Los derivados pM 6-1, 6-5, y 6-7 han sido modificados en las posiciones de aminoácidos Cys_{292} \rightarrow Ala_{292}.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Ensayo de Letalidad en Ratón

4

En experimentos posteriores los sobrenadantes que contenían los derivados fueron precipitados con sulfato de amonio. Cada sedimento que contenía el derivado fue resuspendido en PBS en un volumen 10x más pequeño. Cada derivado fue inyectado intraperitonealmente en ratones. Los derivados pM 1-4, pM 1-10, pM 3-69 y pM 7-15 son todos no tóxicos a niveles a los cuales la toxina de tipo natural es letal. Solamente se vuelven tóxicos a concentraciones muy elevadas: 20-40 \mug/ml. Los derivados pM 4-18 y pM 6-16 tampoco son tóxicos a niveles a los cuales la toxina de tipo salvaje es letal. Ni siquiera son tóxicos a concentraciones superiores: 30-50 \mug/ml. Los 3 derivados restantes pM 2, pM 3-3 y pM 4-3 eran ligeramente tóxicos. (La DL_{50} de la toxina de tipo salvaje es de 0,15 \mug/ratón). Ver también Tabla 2.

Dermonecrosis en cobayas

Se depilaron cobayas albinas de cría propia, 300 g, en un área de 4 x 8 cm en ambos lados. Se inyectaron 0,2 ml de extracto intradérmicamente en 4 sitios de cada lado del animal. Los animales fueron examinados al cabo de 24, 48 y 72 horas y la lesión en los sitios de las inyecciones fueron puntuados. Necrosis obvia en el sitio de la inyección (++++), eritema grave (+++), eritema (+++), enrojecimiento (+), sin reacción (0).

Los derivados pM 1-4, 1-10, 3-3, 4-3, 6-16 y 7-15 no son dermo-necróticos ni siquiera a concentraciones muy elevadas.

Los derivados pM 6-1, 6-5, y 6-7 eran dermo-necróticos a un nivel de 5 \mug/ml. No eran dermo-necróticos a 0,5 \mug/ml. Tras la concentración el derivado pM 3-69 se volvía dermo-necrótico a dosis de 6 \mug/ml, lo que corresponde al menos a 60x menos dermo-necrótico que la toxina natural. El derivado pM 4-18 tiene un potencial 15x menos dermo-necrótico que la toxina natural. El derivado pM 2 no ha mostrado acción dermo-necrótica alguna por las concentraciones sometidas a ensayo de 1 \mug/ml y 2 \mug/ml respectivamente. Por lo tanto pM2 es al menos 20x menos tóxico que la toxina natural. Ver también la Tabla 3.

Preparación de Vacunas

Las preparaciones de antígeno fueron coadyuvadas con coadyuvante incompleto de Freund (50%), o Alhydrogen (20%), respectivamente.

TABLA 3 Dermonecrosis en cerdos

5

TABLA 3 (continuación)

6

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Inmunización de cerdos

El derivado 3-69 fue preparado a una concentración de aproximadamente 40 \mug/ml y coadyuvado a una concentración final de 20 \mug/ml. Se administraron 2 ml intramuscularmente a los cerdos a intervalos de 2 semanas. Se tomaron muestras de sangre antes de la 1ª vacunación, 2ª vacunación y 2 semanas después de la 2ª vacunación. Se observaron los cerdos en cuanto a efectos secundarios 24 horas después de la 1ª vacunación. No se observaron efectos secundarios.

Ejemplo 3 Ensayo de rastreo rápido para la detección de derivados no tóxicos de la toxina \beta obtenida de genes de toxina \beta mutagenizados al azar Procedimiento para el ensayo de células BT

Se transfirió un cultivo de células BT (Células de Cornete Nasal Bovino) tratadas con tripsina, 1,5 x 10^{5} células/ml, en medio de Eagle con suero de ternera al 5% a una placa de microtitulación de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo. Las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37ºC y CO_{2} al 3%. Las muestras de toxina \beta que se iban a someter a ensayo fueron diluidas en PBS al 20ºC pH 7,0 en placas de dilución. El medio fue descartado cuidadosamente de las células y se aplicaron 100 \mul de diluciones de toxina \beta por pocillo. Las células fueron incubadas después durante 30 minutos a 37ºC y CO_{2} al 3%. Las muestras fueron cuidadosamente descartadas y se añadió medio de Eagle de nueva aportación con suero de ternera al 5% a una temperatura de 37ºC. Las células se incubaron durante tres días en las mismas condiciones mencionadas antes. Después se descartó el medio de las placas de microtitulación y se añadió solución de tinción Giemsa de 5 \mul/pocillo. Al cabo de 10 minutos el agente de tinción fue descartado y la placa fue lavada 3x con agua y se dejó estar durante al menos 20 minutos para que se secara.

Todos los pocillos se verificaron en cuanto a la presencia de células multinucleadas e irregularidades en la monocapa. La carencia de estos signos en un pocillo específico es indicativa de la presencia en ese pocillo de un derivado de toxina \beta no tóxico. Aquellos derivados de toxina \beta que demostraron ser no tóxicos fueron sometidos a ensayo en cuanto a su inmunogenicidad en el ensayo ELISA semicuantitativo descrito más abajo.

ELISA Semi-cuantitativo

Se purificaron anticuerpos altamente específicos originados contra la toxina \beta de Clostridium perfringens natural en conejos sobre una columna de proteína A y las placas del ELISA se recubrieron con aproximadamente 2 \mug/ml de estos anticuerpos específicos. Los sobrenadantes que contenían los derivados de la toxina \beta fueron añadidos a las placas diluyendo tres veces. Después de la incubación durante 1 hora, se utilizaron anticuerpos anti-toxina \beta de C.p. de conejo policlonales conjugados con peroxidasa de rábano picante para la detección.

Se consideraba que aquellos derivados de toxina \beta que reaccionaban en el ELISA a un título no más bajo de 1.000 veces menor que la toxina \beta natural eran los derivados no tóxicos y todavía inmunogénicos deseados de la toxina \beta según la invención.

Ejemplo 4 Experimentos de vacunación en cerdos Preparación de la vacuna

El derivado pM 1-4 fue producido por la cepa pM 1-4 de Lactococcus lactis. Tras la fermentación las células fueron separadas por centrifugación (100.000 x g durante 35 minutos). Después, se añadieron 0,31 g de sulfato de amonio a cada g de sobrenadante. La mezcla se colocó a 4ºC durante 3 horas para la precipitación. Después de la centrifugación a 100.000 x g durante 45 minutos el producto precipitado se disolvió en 1/30 del volumen original y se sometió a diálisis frente a PBS. El contenido final del derivado pM 1-4 fue cuantificado mediante SDS-PAGE en relación con patrones de BSA. Finalmente la solución de derivado se mezcló con Diluvac Forte® a una razón 1:1. La concentración final de pM 1-4 en la vacuna era de 80 \mug/ml.

Vacunación

Se utilizaron cinco cerdos de 5 semanas de edad. Los cerdos fueron vacunados con 2 ml intramuscularmente los días 0 y 21.

Observaciones

Se registraron las condiciones generales de los animales durante la fase inicial tres horas después de la vacunación conforme a la siguiente escala:

0 = sin síntomas

1 = levemente deprimido, piel rugosa (durante menos de 1 hora)

2 = deprimido, con temblores (menos de 1 hora)

3 = deprimido, con temblores, tumbado y toma de agua limitada (menos de 1 hora)

4 = vómitos, gravemente deprimido (menos de 1 hora)

5 = deprimido durante más de una hora y no realiza la siguiente comida.

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Toma de muestras de sangre y determinación de los títulos

Se tomaron muestras de sangre antes de la 1ª vacunación (día 0), antes de la 2ª vacunación (día 21) y dos semanas después de la 2ª vacunación (día 35) y se analizaron en cuanto a los anticuerpos anti-toxina \beta mediante ELISA competitivo. Descrito brevemente, el anticuerpo monoclonal originado contra la toxina \beta natural se aplicó como recubrimiento sobre la placa de ELISA. Se permitió que una dilución seriada de suero reaccionara con una concentración fija de la toxina \beta en una placa separada. Las mezclas de toxina y sueros que contenían anticuerpos fueron transferidas a la placa recubierta con Mab y se determinaron los contenidos en toxina \beta natural restantes. Los títulos fueron calculados como la inhibición del 50% de la toxina \beta no inhibida, en relación con el patrón antitoxina WHO 1959.

Resultados Observaciones

Los cerdos no mostraban ninguna reacción clínica debida a cualquiera de las vacunaciones: Ver tabla 4.

Serología

Un cerdo (Núm. 52) respondía a la 1ª vacunación. Después de la segunda vacunación los cuatro cerdos se seroconvertían y la media de título anti-toxina \beta era de 66 u.i. medido mediante ELISA. Los títulos individuales aparecen en la Tabla 4

TABLA 4 Respuesta de anticuerpos anti-toxina \beta en cerdos

7

Conclusión

Todos los cerdos respondían a la vacunación con toxina \beta modificada genéticamente produciendo anticuerpos anti-toxina \beta que inhibían la toxina \beta

Leyendas de las figuras

Figura 1.a: estructura del plásmido pTREX1ANEW. La secuencia codificadora del marcador de resistencia a antibióticos MLS se muestra en la caja sombreada. Ori pAMB1: origen de replicación del plásmido pAMB1, MLS: macrólidos, lincosamidas, gen de resistencia al antibiótico estreptogramina B. La estructura de la casete de expresión clonada entre los sitios EcoRI y SacI romo de pIL253 se muestra más abajo. Las diferentes regiones funcionales de la casete se muestran como cajas rayadas. Se indican los sitios de restricción únicos. SD: secuencia de Shine-Dalgarno complementaria al ARNr 16S de L. lactis, ATG: codón de inicio de la traducción servido por SD.

Figura 1.b: la secuencia de pTREX1A completa, incluyendo las posiciones de las enzimas de restricción. (SEC ID NO: 27).

Figura 1.c: rasgos de la casete de expresión pTREX1 muy similar. (SEC ID NO: 26).

Figura 1.d: oligonucleótidos utilizados para crear los fragmentos promotores derivados de la PCR en pTREX7, -14 y -1A (mostrados 5'-3') (SEC ID NO: 19, 20, 23, 24, 21, 22).

Figura 2.a: el vector de acoplamiento a TIR pKS90, representación esquemática de la casete de expresión pKS90.

Figura 2.b: la secuencia pKS90, incluyendo posiciones de las enzimas de restricción. (SEC ID NO: 25).

Figura 2.c: oligonucleótidos utilizados para crear la secuencia de ADN artificial formadora de la región TIR de pKS90. (SEC ID NO: 28, 1).

Figura 3.a: cebadores utilizados en la construcción de los mutantes de Cp\beta. (SEC ID NO: 7, 6, 9, 8, 11, 10, 13, 12, 14, 16, 15, 18, 17, 2, 4, 3).

Figura 3.b: ejemplo del procedimiento de construcción utilizado para Cp\beta M1.

Figura 4: Secuencia de aminoácidos de la toxina \beta de Clostridium perfringens. (SEC ID NO: 5).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Akzo Nobel N.V.

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(B)

CALLE: Velperweg 76

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(C)

CIUDAD: Amhem

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(E)

PAÍS: Holanda

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM

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(G)

TELÉFONO: 0412 666379

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(H)

TELEFAX: 0412 650592

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna de Clostridium Perfringens

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 28

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(iv)

FORMA LEGIBLE CON ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: Disco Flexible

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(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release Núm. 1.0, Versión Núm. 1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGATCCA AATGAATGAT ATAGGTAAAA CTACTACT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAGGATCCA AATGAAGAAA AAATTTATTT CATTAGTTAT AG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGATCCGT CTAAATAGCT GTTACTTTGT GAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 64 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGATGAATAT GCAGCAGCGA TAAATCT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATGACAA CTTTAATAAA CTTA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEQ ID NO. 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAGACATA TCATCATCTA AGTTTAT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAAAGAAG ATGTTATAAA AAAATAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTGCTGCT GCTGAAGACA TAAATCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTATAAAAA AATACAATTT GCAT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAATTGTA TCTTCATCAA TACTATC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAAAAACTG TATCCAATAC AATG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATACATTT GGGGTATCAA AAGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAATAAGCG TTTCTTTCAC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAATTGGA ATGGTGCTAA CTGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGTTTTGT TGCTGCTGCA TTTTAAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTATCTTA ATTGGAATGG TGCT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTCT AGCTTTGAGC TGTAATAGA

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAATTCAG TTGAACTACT TTTTTTAGTT TTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTGA TACTTGTATT ATAACATATC TAC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAATTCGA TTAAGTCATC TTACCTCTTT

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTGT AATGTTTCGC AACTCTACTA T

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGAATTCAG GACTAATTGA TGAAACTTTT CT

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5217 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5230 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

13

14

15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5231 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

18

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA EL SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 86 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CUALIDAD DE LA HEBRA: doble

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

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102

Claims (14)

1. Un derivado inmunogénico destoxificado de la toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo, caracterizado porque porta una mutación localizada en un dominio de transición entre las porciones neutra e hidrófila de la toxina \beta.

2. El derivado inmunogénico destoxificado de la toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo según la reivindicación 1, caracterizado porque porta una mutación localizada en la posición 62, 182, 197 o en una de las regiones entre el aminoácido número 80-103, 145-147, 281-291, 295-299 o aguas abajo de la posición del aminoácido 292 con respecto al péptido líder metionina.

3. El derivado de la toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la mutación se localiza en una de las regiones entre el aminoácido número 80-82, 95-97, 101-103 o 287-291.

4. Una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de ADN mutado codificando dicho fragmento de ADN mutado una toxina \beta de Clostridium perfringens inmunogénica destoxificada o un fragmento inmunogénico de la misma según las reivindicaciones 1-3.

5. La bacteria Clostridium perfringens que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4.

6. Un sistema de expresión basado en una bacteria Gram positiva, siendo dicha bacteria Gram positiva una especie de Lactococcus que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4.

7. Una vacuna para combatir la infección por Clostridium perfringens, caracterizada porque comprende un derivado de la toxina \beta de Clostridium perfringens o un fragmento inmunogénico del mismo según las reivindicaciones 1-3, y un portador fisiológicamente aceptable.

8. Una vacuna según la reivindicación 7, caracterizada porque comprende un coadyuvante.

9. Una vacuna para combatir la infección por Clostridium perfringens, caracterizada porque comprende un organismo portador vivo, portando dicho organismo un fragmento de ADN según la reivindicación 4.

10. Una vacuna para combatir la infección por Clostridium perfringens, caracterizada porque comprende una cepa de Clostridium perfringens atenuada viva en la cual el gen de la toxina \beta natural está remplazado por un nucleótido según la reivindicación 4.

11. Una vacuna según las reivindicaciones 7-10, caracterizada porque comprende adicionalmente inmunógenos de otros patógenos.

12. Una vacuna según la reivindicación 11, caracterizada porque los otros inmunógenos mencionados de otros patógenos se seleccionan del grupo formado por Actinobacillus pleuropneumoniae, virus de la Pseudorrabia, virus de la Influenza Porcina, Parvovirus Porcino, virus de la Gastroenteritis Transmisible, rotavirus, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Salmonella sp., Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis y bacterias de tipo Helicobacter.

13. Un método para la preparación de derivados de la toxina \beta de Clostridium perfringens según las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque una secuencia de nucleótidos que comprende un fragmento de ADN que codifica un derivado de la toxina \beta según la reivindicación 4 es expresado en una bacteria de la especie Lactococcus.

14. Un método para la preparación de una vacuna para combatir la infección por Clostridium perfringens, caracterizado porque dicho método comprende mezclar un derivado de la toxina \beta de Clostridium perfringens según las reivindicaciones 1-3 y un portador fisiológicamente aceptable.