BRPI0815263A2 - "método para o tratamento da biomassa, biomassa tratada e hidrolisado" - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA BIOMASSA, BIOMASSA TRATADA E HIDROLISADO A presente invenção apresenta um método para o tratamento da biomassa que utiliza um equipamento que move uma mistura de biomassa e amônia aquosa diluída através das câmaras de reação sem compactação. O equipamento move a biomassa utilizando um pistão de não compressão. A biomassa tratada resultante é sacarificada para produzir açúcares fermentáveis.

Description

“MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA BIOMASSA, BIOMASSA TRATADA E i HIDROLISADO” ' CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta um método para o tratamento da | 5 biomassa que inclui um equipamento específico. O método que utiliza o | equipamento move a biomassa para o reator e através do mesmo em um estado não compactado, em que é realizado um método de tratamento de | impregnação e reação da biomassa com amônia aquosa diluída a temperatura e pressão moderada.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO | As matérias-primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, tais como resíduos agrícolas, madeira, resíduos de silvicultura, lodo da fabricação de papel e resíduos sólidos industriais e municipais, fornecem uma matéria-prima de grande potencial de renovação para a produção de produtos de valor, tais como combustíveis e outras substâncias químicas. As matérias- primas e os resíduos celulósicos e lignocelulósicos, compostos de polímeros de carboidratos que compreendem a celulose, hemicelulose, glicanos e a lignina são, em geral, tratados por uma variedade de meios químicos, mecânicos e enzimáticos para liberar principalmente os açúcares de hexose e de pentose, que podem ser fermentados em produtos úteis.

Em primeiro lugar, as fontes de biomassa são tratadas de forma a tornar os polímeros de carboidratos de materiais celulósicos e lignocelulósicos mais facilmente acessíveis às enzimas de sacarificação, que é muitas vezes denominado pré-tratamento. O pré-tratamento da biomassa é, então, —hidrolisado na presença das enzimas de sacarificação para a liberação dos oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em um hidrolisado. As enzimas de sacarificação utilizadas para a produção de açúcares fermentáveis a partir da biomassa pré-tratada normalmente incluem uma ou mais glicosidases, tais

: como as glicosidases que hidrolisam a celulose, as glicosidases que hidrolisam a hemicelulose e as glicosidases que hidrolisam o amido, bem como as : peptidases, lipases, ligninases e/ou esterases de feruloíla. As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa são revistos por Lynd/LR,etal, (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506 a 577).

É desejável possuir um sistema e/ou método para o tratamento da biomassa, que seja eficaz e econômico para o uso em larga escala. O tratamento da biomassa como um material concentrado de elevado peso seco é necessário para produzir altas concentrações de açúcares fermentáveis necessários para a fermentação em produtos econômicos. Assim, o movimento de material, incluindo uma fração de elevado peso seco da biomassa através de um reator, mantendo a capacidade dos reagentes de tratamento de penetrar e preparar da melhor forma a biomassa para a sacarificação, além de utilizar produtos químicos e consumos de energia mínimos, é um desafio para os processos de tratamento da biomassa. Também é desejado um método que inclua um equipamento de baixo custo de capital. Os métodos, incluindo os reatores sem exigência de agitação ou reatores de rotação, poderão fornecer | menor custo de capital para o equipamento e menor consumo de energia. | Os sistemas que não requerem agitação ou reator de rotação e os | 20 meios específicos para mover a biomassa através de um reator foram | descritos. O documento US 4.186.658 descreve um equipamento para o transporte de material particulado, tais como aparas de madeira, palha, bagaço e outros materiais fibrosos, que compacta o material em um estado de “plugue” sólido. Um transportador de fuso compacta previamente o material, com — compactação adicional por um pistão alternativo. O plugue compacto é tão denso que é capaz de prevenir eficazmente o retorno de ar dentro do sistema. | O plugue pode ser então alimentado em um meio para o processamento do material. O plugue denso de material de biomassa não estaria acessível do melhor modo através dos reagentes de pré-tratamento. Da mesma forma, o documento US 4.136.207 descreve um . processo para a preparação do material celulósico com melhor digestibilidade pelos ruminantes que começa com a compactação mecânica do material. Em — seguida, ele é submetido à alta pressão de vapor na ausência de reagentes químicos, e é ainda compactado para formar um plugue sólido de biomassa, o que impede a fuga de vapor através da entrada. Pequenas porções do material são então descarregadas, submetendo-as à rápida redução da pressão. A compactação da biomassa em um plugue não permitiria uma acessibilidade ótima aos reagentes químicos utilizados no pré-tratamento.

O documento US 6.176.176 descreve um equipamento para o tratamento de materiais celulósicos, que utiliza um fuso rotativo montado em um tambor de uma extrusora. A amônia líquida sob pressão é alimentada no tambor e misturada com materiais lignocelulósicos no tambor, então, o material —lignocelulósico contendo a amônia é expandido de forma explosiva através da mudança da amônia líquida a um gás que sai do tambor através de um molde aquecido. A utilização de uma extrusora em um processo comercial de grande escala seria muito cara e, portanto, não fornece um processo econômico.

Um método para o tratamento de biomassa, para a produção de açúcares fermentáveis que utiliza a amônia aquosa de baixa força para tratar previamente a biomassa de alta concentração, é descrito no documento de co- propriedade e provisório US NA 11/402757.

Ainda permanece uma necessidade por um sistema e/ou método de baixo custo para o tratamento da biomassa que move o elevado peso seco da biomassa através de um reator, permitindo acessibilidade máxima aos reagentes químicos, para preparar a biomassa para a sacarificação.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção apresenta um método para o tratamento da i A ' biomassa antes da sacarificação, uma biomassa pré-tratada produzida pelo presente método, bem como açúcares fermentáveis contendo hidrolisado . produzidos pela sacarificação posterior da biomassa pré-tratada.

Em um aspecto, um método para o tratamento da biomassa compreende: (a) fornecer a biomassa;

(b) carregar a biomassa de (a) utiizando um alimentador não compacto no equipamento que compreende:

(i) um tambor cilíndrico que possui uma primeira extremidade | equipada com um pistão e uma segunda extremidade equipada com uma válvula de descarga;

(ii) opcionalmente, uma compensação ligada em uma extremidade da compensação no tambor cilíndrico próxima à primeira extremidade do tambor cilíndrico e possuindo uma válvula de vedação na extremidade da compensação não ligada;

(iii) pelo menos 2 portas de vedação no tambor cilíndrico ou na compensação;

(iv) opcionalmente, uma válvula no tambor cilíndrico dividindo o tambor em uma primeira e segunda câmara separada, dita primeira câmara possui a primeira extremidade do tambor equipada com dito pistão, e dita segunda câmara possuí a segunda extremidade do tambor com a válvula de descarga; e

(v) um tanque de expansão ligado à válvula de descarga na segunda extremidade do tambor;

em que dita biomassa é carregada no: tambor cilíndrico ou,

opcionalmente, em dita compensação ligada a dito tambor cilíndrico; (c) fechar dito tambor cilíndrico e compensação, se houver;

(d) aplicar, opcionalmente, vácuo através de pelo menos uma porta no tambor cilíndrico;

(e) adicionar através de pelo menos uma porta no tambor cilíndrico ou compensação uma solução aquosa que compreende a amônia em f uma quantidade inferior a cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa no tambor, criando uma mistura de biomassa e amônia aquosa, e 5 ainda, em que o peso seco da biomassa está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos cerca de 15% em peso relação ao peso da mistura da biomassa e da amônia aquosa, e adicionar vapor através de dita segunda porta no tambor cilíndrico ou compensação, se houver, para atingir uma temperatura dentro do tambor entre cerca de 85º C e cerca de 180º C; (f) fechar as portas no tambor cilíndrico e compensação, se houver, para fornecer uma câmara impermeável; (9) manter a mistura de biomassa e amônia aquosa na câmara impermeável na temperatura adequada por um período de tempo entre cerca de 30 segundos a cerca de 4 horas; (h) opcionalmente, mover a mistura de biomassa e amônia aquosa para uma segunda câmara no tambor cilíndrico, se houver, pelo deslocamento com dito pistão, em que a biomassa não é compactada, e mantê-lo por um tempo entre cerca de 2 minutos a 4 horas; e (i) mover a mistura de biomassa amônia aquosa com o dito pistão através do tambor cilíndrico impermeável de (g) ou (h) através da válvula de descarga para dentro do tanque de expansão; onde que a biomassa tratada é produzida.

Em outro aspecto, um método para o tratamento da biomassa | compreende: | 25 (a) fornecer uma mistura de biomassa e uma solução aquosa que compreende amônia, em que o peso seco da biomassa é de pelo menos cerca de 15% em peso em relação ao peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa, e a amônia aquosa está em uma quantidade que é inferior a cerca de

DD A A | . | | - 6 | | . 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa; (b) carregar a mistura de biomassa e amônia aquosa de (a) | | 7 utilizando um alimentador não compacto no equipamento que compreende: | | : (i) um tambor cilíndrico que possui uma primeira extremidade | | 5 equipada com um pistão e uma segunda extremidade equipada com uma válvula de descarga; | (li) opcionalmente, uma compensação ligada em uma extremidade da compensação no tambor cilíndrico próximo à primeira extremidade do | tambor cilíndrico e possuindo uma válvula de vedação na extremidade da compensação não ligada; (iii) pelo menos 2 portas de vedação no tambor cilíndrico ou na compensação; (iv) uma válvula no tambor cilíndrico dividindo o tambor em uma primeira e segunda câmara separada, dita primeira câmara possui a primeira extremidade do tambor equipada com dito pistão, e dita segunda câmara possui a segunda extremidade do tambor com a válvula de descarga; e (v) um tanque de expansão ligado à válvula de descarga na segunda extremidade do tambor; em que dita biomassa é carregada na primeira câmara do tambor cilíndrico ou, opcionalmente, em dita compensação ligada a dito tambor cilíndrico; (c) fechar dita primeira câmara no tambor cilíndrico e na compensação, se houver; (d) aplicar, opcionalmente, vácuo através de pelo menos uma porta; (e) adicionar através de pelo menos uma porta na primeira câmara ou compensação, se presente, vapor para atingir uma temperatura dentro da câmara entre cerca de 85º C e cerca de 180º C;

(f) fechar as portas na primeira câmara e compensação, se | houver, para fornecer uma câmara impermeável; . (g) manter a mistura de biomassa e amônia aquosa na primeira câmara impermeável na temperatura adequada por um período de tempo entre —cercade 30 segundos a cerca de 4 horas; (h) opcionalmente, mover a mistura de biomassa e amônia aquosa através de uma válvula aberta para a segunda câmara do tambor cilíndrico pelo deslocamento com um pistão, pela primeira câmara impermeável, em que a biomassa não é compactada; (i) opcionalmente, fechar a válvula aberta para formar uma segunda câmara impermeável e manter a mistura de biomassa e amônia aquosa por um período de tempo entre cerca de 2 minutos e cerca de 4 horas; e ()) mover a mistura de biomassa amônia aquosa pelo — deslocamento com um pistão depois da etapa (g) ou etapa (i) através da válvula de descarga para dentro do tanque de expansão; em que a biomassa tratada não é compactada e onde a biomassa tratada é produzida.

Ainda, os aspectos adicionais da presente invenção estão direcionados para a biomassa tratada que foi preparada de acordo com o presente método, e o hidrolisado contendo açúcares fermentáveis produzidos pela sacarificação da biomassa que foi tratada pelo presente método.

A biomassa se refere a qualquer material celulósico e/ou lignocelulósico que pode incluir as culturas de bioenergéticas, os resíduos agrícolas, os resíduos sólidos urbanos, os resíduos sólidos industriais, os resíduos de depósitos, madeira, resíduos florestais ou suas combinações. À energia pode ser aplicada à biomassa antes (a), a fim de reduzir o tamanho, aumentar a área de superfície exposta e/ou aumentar a acessibilidade da celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS º A Figura 1 é um desenho esquemático de uma realização de um equipamento para a utilização na presente invenção. A Figura 2 é um desenho esquemático de uma segunda realização de um equipamento para a utilização na presente invenção. A Figura 3 é um desenho esquemático de uma realização de um venturi de expansão gradual utilizado como uma válvula de descarga, com a válvula fechada. | 10 A Figura 4 é um desenho esquemático da realização do Venturi | de expansão gradual da Figura 3, com a válvula aberta. A Figura 5 é um desenho esquemático de uma realização de um venturi de expansão gradual de válvula de porta V. A Figura 6 é um desenho esquemático de uma realização de um Venturide expansão gradual de válvula anti-retorno, com a válvula fechada em Ae abertaem B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O Depositante incorpora especificamente todo o conteúdo de todas as referências citadas no preserite relatório descritivo. Além disso, quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalo preferido ou uma lista de valores superiores preferíveis e valores inferiores preferíveis, este deve ser entendido como a descrição especifica de todos os intervalos formados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalo ou valor superior preferido e qualquer limite de intervalo ou valor inferior preferido, independentemente se os intervalos são descritos separadamente. Quando um intervalo de valores numéricos é citado neste documento, salvo indicação em contrário, o intervalo pretende incluir seus pontos finais, e todos os números inteiros e frações dentro do intervalo.

Não se pretende que o escopo da presente invenção seja limitado aos valores específicos citados na definição de um intervalo. º A presente invenção apresenta um método para o tratamento da biomassa para prepará-la de modo a sofrer sacarificação para produzir açúcares fermentáveis. Os açúcares podem ser fermentados para produzir produtos de valor, tais como combustíveis e outros produtos químicos. Através das etapas de pré-tratamento, sacarificação e fermentação, a biomassa renovável, incluindo os resíduos de biomassa, pode ser utilizada para produzir produtos químicos de valor que podem diminuir a necessidade do petróleo.

DEFINIÇÕES No presente relatório descritivo, uma série de termos são utilizados. As seguintes definições são fornecidas: “Biomassa” se refere a qualquer material celulósico ou lignocelulósico e inclui os materials que compreendem celulose e, opcionalmente, ainda compreendem a hemicelulose, ligninay amido, oligossacarídeos e/ou monossacarídeos. A biomassa também pode compreender os componentes adicionais, tais como proteína e/ou lipídio. De acordo com a presente invenção, a biomassa pode ser derivada a partir de uma única fonte, ou a biomassa pode compreender uma mistura derivada de mais de uma fonte; por exemplo, a biomassa poderia compreender uma mistura de espigas de milho e forragem ou fibra de milho ou uma mistura de grama e folhas. A biomassa inclui, mas não está limitada a, culturas bioenergéticas, resíduos agrícolas, resíduos sólidos municipais, resíduos sólidos industriais, lodo da fabricação de papel, resíduos de depósitos, — resíduos de madeira e de silvicultura. Os exemplos de biomassa incluem, mas não estão limitados a, grãos de milho, espigas de milho, resíduos de plantação, tais como cascas de milho, forragem de milho, fibra de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, palha de arroz, grama do gênero Panicum, resíduos de papéis, bagaço da cana de açúcar, caule de sorgo, casca ou caule de soja, i componentes obtidos a partir do processamento de grãos, árvores, galhos, . raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco de animal ruminante. Em uma realização, a biomassa que é útil paraa presente invenção inclui a biomassa que possui um valor de carboidrato relativamente alto, é relativamente denso, e/ou é relativamente fácil de coletar, | transportar, armazenar e/ou manipular. Em uma realização da presente invenção, a biomassa que é útil inclui as espigas de milho, as forragens de | milho, as fibras de milho e o bagaço da cana de açúcar.

O termo “açúcar fermentável' ou “açúcares” se refere aos oligossacarídeos e monossacarídeos que podem ser facilmente fermentados nos produtos químicos desejados.

O termo “lignocelulósico” se refere ao material que compreende tanto a lignina e a celulose. O material lignocelulósico também pode compreender a hemicelulose.

O termo “celulósico” se refere ao material que compreende a celulose.

O termo “sacarificação” se refere à produção de açúcares fermentáveis a partir dos polissacarídeos.

Por “peso seco” de biomassa entende-se o peso da biomassa que possui toda ou essencialmente toda a água retirada. O peso seco é normalmente medido de acordo com a American Society for Testing and Materials (ASTM) Norma E1756-01 (Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass) ou Technical Association of the Pulp and Paper Industry, Inc. (TAPPI) Norma T412 om-02 (Moisture in Pulp, Paper and Paperboard).

Uma “solução aquosa que compreende amônia” se refere ao uso do gás amônia (NH;3), os compostos compreendem íons amônio (NH*), tal

| : como o hidróxido de amônio ou o sulfato de amônio, os compostos que liberam | amônia na degradação, tais como uréia, e suas combinações, em um meio | ' aquoso. | O termo “tratamento” se refere a um processo de um reagente | 5 que age em um material, em que as propriedades físicas e/ou químicas do | material são alteradas. O termo “reagente” se refere a uma composição que é capaz de alterar as propriedades físicas e/ou químicas de um material alvo nas condições utilizadas em um processo de tratamento. | Um “consórcio de enzima” para sacarificação é uma combinação | de enzimas que são capazes de agir em uma mistura de biomassa para | produzir açúcares fermentáveis. Normalmente, um consórcio de enzima de | sacarificação pode compreender uma ou mais glicosidases; as glicosidases podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em glicosidases que | 15 hidrolisam a celulose, glicosidases que hidrolisam a hemicelulose e glicosidases que hidrolisam o amido. Outras enzimas no consórcio de enzima de sacarificação podem incluir peptidases, lipases, ligninases e esterases de feruloíla. | Os termos “tratar” e “pré-tratar” em relação à biomassa estão | 20 relacionados da seguinte maneira. A biomassa é tratada com o reagente para formar um produto de biomassa tratada, que também pode ser referido como tratamento para formar a biomassa pré-tratada ou pré-tratamento para formar a | biomassa pré-tratada. A utilização do “pré” distingue o tratamento da biomassa, que é anterior à sacarificação da biomassa. :

MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DA BIOMASSA Um método para o tratamento da biomassa para produzir açúcares fermentáveis, que inclui a utilização de amônia aquosa de baixa força para o pré-tratamento da biomassa de concentração elevada é descrito no | ess— e nn

: pedido de patente de co-propriedade e provisório US NA % 11/402757. Os Depositantes desenvolveram um novo método para tratar eficientemente a ' biomassa utilizando condições de amônia aquosa de baixa força e alta concentração de biomassa.

Os Depositantes descobriram que o presente —métodoé surpreendentemente bem sucedido, devido ao aspecto de prevenção | da compactação da biomassa em qualquer fase, e assim permitindo um melhor | acesso dos reagentes de tratamento à biomassa com relação àquela que | ocorre em um sistema que inclui a compactação da biomassa.

Nos sistemas em que a biomassa é compactada, a biomassa pode ser descompactada para a melhor reação com os reagentes de tratamento, mas isso exige grande consumo de energia e, consequentemente, eleva o custo do sistema.

No método da presente invenção, a etapa ou processo de descompactação não é necessária.

Para reduzir o custo para o tratamento da biomassa em larga escala, o presente método foi desenvolvido, em que a biomassa é adicionada a um equipamento estacionário, sem compactação, e é movida através do equipamento sem compactação.

Ao manter a biomassa em um estado não compactado, os poros naturais e os canais do material da biomassa não são esmagados.

Os reagentes de tratamentos utilizados no presente método incluem a amônia aquosa e vapor.

Estes reagentes são capazes de penetrar através dos poros e canais da biomassa natural não-compactada fornecendo efeitos rápidos e eficientes sobre o material celulósico ou lignocelulósico da biomassa.

Este método de tratamento é altamente eficaz na produção da biomassa tratada, que sofre uma sacarificação eficiente para produzir açúcares —fermentáveis, na medida em que isto leva a uma alta conversão de carboidratos da biomassa em açúcares despolimerizados por dosagem de enzimas e tempo de reação. : O presente método de tratamento da biomassa pode ser melhor

. compreendido ao fazer referência aos desenhos esquemáticos das Figuras 1 e 2, que mostram duas realizações de um equipamento do tipo pistão/ tambor, e . a seguinte descrição de utilização dos equipamentos no presente método de tratamento. Estas figuras são simplificadas para maior clareza de ilustração, em que alguns elementos são omitidos, tais como as flanges mostradas nas Figuras 3 e 4. O equipamento na Figura 1 é um reator de escala de teste. Ele compreende uma câmara cilíndrica horizontal (10) com uma primeira | extremidade aberta para a adição de biomassa (11) que é então selada após o carregamento da biomassa através da inserção de um plugue móvel (12), que é utilizado como um tipo de pistão. A câmara cilíndrica possui uma primeira porta de vedação (13) para a adição da solução aquosa que compreende amônia, uma segunda porta de vedação (14) para a adição do vapor na biomassa na câmara cilíndrica e uma terceira porta (15) para aplicar um vácuo. O vapor é injetado para aumentar a temperatura da mistura de biomassa e amônia aquosa para uma reação de tratamento. Uma camisa de isolamento (16) cobre a câmara cilíndrica.

Na sequência do carregamento da biomassa, da aplicação de vácuo e da adição da solução aquosa que compreende amônia e vapor, as portas (13, 14 e 15) são vedadas e uma temperatura desejada é mantida. Após um período de tempo, uma válvula de descarga previamente fechada (17) é aberta na segunda extremidade cilíndrica (18), ao mover o eixo da válvula (19). O eixo da válvula se estende através de um buraco em um cotovelo de separação interna direcionado para baixo (20) no tanque de expansão adjacente (21) e através de uma junta de vedação (22) do outro lado do tanque de expansão até um ativador (23). A mistura de biomassa e amônia aquosa é empurrada através da válvula de descarga (17), movendo o plugue na primeira extremidade do tambor cilíndrico em direção à segunda extremidade. A biomassa passa através da válvula de descarga e dentro do tanque de

. expansão (21) através do cotovelo (20). Uma tampa (24) sobre uma abertura no fundo do tanque de expansão permite o acesso à biomassa pré-tratada. ' Uma porta (25) na parte superior do tanque de expansão permite a saída de vapores e está conectada através de uma tubulação (26) a um condensador (27).

A descrição adicional de uma realização do equipamento da Figura 1 e a sua utilização no presente método de tratamento nos exemplos do presente documento são conforme segue. Este reator de tambor com pistão consistia em um tambor de aço inoxidável 5,1 cm x 68,6 cm equipado com um pistão, orientado horizontalmente. O pistão foi selado ao tambor com quatro anéis O e foi pressurizado com nitrogênio (até cerca de 5.600 kPa) na parte posterior do pistão durante o curso da descarga. O tambor de 68,6 cm foi equipado com oito portas de múltiplo uso, cada 4 ao longo das superfícies superiores e inferiores, permitindo a aplicação de vácuo, injeção de amônia aquosa, injeção de vapores e inserção de termopares para a medição da temperatura no interior do tambor. O tambor do reator foi equipado com uma camisa de vapor para um aquecimento regular do tambor. O tambor do reator estava diretamente ligado a um tanque de expansão de aço inoxidável de 15,2 cem x 61 cm, orientado verticalmente. O tambor foi isolado do tanque de expansão por um bocal cônico e um arranjo da válvula de cisalhamento do assento final. O diâmetro do molde de cisalhamento da válvula final era de 3,5 em. A contrapressão sobre o bocal cônico e o assento era regulável, com a maioria dos testes realizados utilizando cerca de 138 kPa (pressão manométrica) de contrapressão em um cilindro de ar de 10,2 cm de diâmetro ligado ao cone da válvula de cisalhamento final. O cone da válvula de cisalhamento final poderia recuar até 1,6 cm para permitir a descarga de partículas no tanque de expansão. Um cotovelo na saída dá válvula de cisalhamento final direcionou os sólidos tratados previamente para baixo no

, fundo do tanque de expansão, onde os sólidos foram facilmente removidos ao abrir um flange de extremidade convexa no fundo do tanque. Um flange 7 convexo superior no tanque de expansão incorporou uma montagem especial adaptada com ranhuras perpendiculares ao eixo do tanque de expansão, o que fez com que os vapores liberados viajassem em torno de um caminho curvo até uma saída adaptada, ajudando a evitar o transporte das partículas de biomassa arrastadas e as gotículas de água em um condensador de ventilação. Três aquecedores de banda elétrica (fixados em 60º C) e isolamento foram adicionados ao longo do tanque de expansão para permitir que os sólidos tratados a quente se expandam em um recipiente aquecido, simulando melhor um processo de escala comercial.

Em outra realização, um reator de tambor pequeno com pistão foi construído conforme descrito acima, exceto possuindo um tambor de 45,7 em, sem camisa de vapor, três aquecedores de banda elétrica, um colchão de fibra de vidro de 2,5 cm de espessura coberto com uma camisa de fibra vidro impregnada de silicone como isolamento, e três portas de múltiplo uso. Outras características, incluindo o tanque de expansão, a válvula de cisalhamento e o cotovelo foram descritos para o reator de tambor grande com pistão.

O equipamento na Figura 2 é um projeto do reator em escala comercial. Ele compreende um tambor cilíndrico horizontal equipado com um .pistão (34) na primeira extremidade (33) e uma válvula de descarga (40), na segunda extremidade (41). O tambor é isolado e possui paredes impermeáveis. Uma compensação (31) é ligada perto da primeira extremidade e uma válvula (35), que é uma válvula de alimentação, está localizada na extremidade livre da compensação. Um distribuidor (30) é ligado na extremidade da válvula da compensação. A biomassa é adicionada através do distribuidor. Pode haver meios indutores do fluxo não compactantes para controlar a adição da biomassa a partir do distribuidor (30) para a compensação (31). A compensação possui uma primeira porta de vedação (36) e uma segunda porta i de vedação (37) para a adição de amônia aquosa e vapor na biomassa na * compensação a medida que eles se movem no tambor cilíndrico.

Uma segunda | válvula (38) separa o tambor em uma primeira câmara cilíndrica (32) e uma segunda câmara cilíndrica (39). A mistura de biomassa e amônia aquosa passa através da compensação para a primeira câmara, onde uma temperatura e pressão desejada são obtidas pela adição de vapor.

O movimento do pistão através do tambor impermeável empurra a mistura de biomassa e amônia aquosa a partir da primeira câmara para dentro da segunda câmara, através da segunda válvula aberta (38), e desloca os conteúdos na segunda câmara (39) através da válvula de descarga aberta (40) em um tanque de expansão (42). O conteúdo da segunda câmara é a mistura de biomassa e amônia aquosa que foi previamente transferida para esta câmara e mantida pelo tempo necessário para a reação de tratamento, nas condições utilizadas.

A segunda válvula (38) é então fechada e o pistão (34) é retraído de modo a preparar a primeira câmara cilíndrica (32) para ser recarregada e o ciclo do processo repetido.

No tanque de expansão (42), a biomassa se move através de um cotovelo direcionado para baixo (43). Uma tampa (44) sobre uma abertura no fundo do tanque de expansão permite o acesso à biomassa pré-tratada.

Uma porta (45) na parte superior do tanque de expansão permite a saída dos vapores e está conectada através de uma tubulação (46) a um condensador (47). O equipamento pode ser construído utilizando aço carbono ou aço inoxidável. .O tambor cilíndrico pode ser horizontal, conforme ilustrado nas Figuras 1 e 2, ou pode ser vertical.

Com um tambor vertical, a compensação e o distribuidor conforme mostrado na Figura 2 seriam reconfigurados para permitir o carregamento de biomassa na câmara do tambor, tal como em um ângulo inferior a 90 graus.

Um técnico no assunto seria capaz de configurar facilmente o equipamento com um tambor vertical.

Por exemplo, o barril vertical

. pode estar localizado acima do tanque de expansão e ser conectado sem um cotovelo direcionando o fluxo para baixo, uma vez que o fluxo através da ' válvula de descarga já seria direcionado para baixo.

Também está dentro da capacidade de um técnico no assunto orientar o tanque de expansão de forma —verticalou horizontal.

Um tanque vertical é mais adequado no presente método | com tratamento de amônia para facilitar a remoção e captura do gás amônia | liberado no tanque de expansão.

As duas realizações das Figuras 1 e 2 funcionam de forma | semelhante, em que a biomassa é adicionada e movida através dos reatores sem compactação.

A realização da Figura 1, com uma câmara, é um sistema em batelada para o processamento de uma amostra de biomassa de cada vez.

A realização da Figura 2, com duas câmaras que são separadas por uma válvula, permite que uma operação semi-contínua ou de alimentação em batelada, em que diversos carregamentos de biomassa são processados simultaneamente.

Nesta segunda realização, cada ciclo de deslocamento do pistão, em que cada carrégamento sucessivo de biomassa entra na segunda câmara, é acompanhado pela descarga do volume correspondente através do orifício de descarga uma vez que a segunda câmara está totalmente carregada.

O número de ciclos de deslocamento do pistão na segunda câmara deuma só veze, portanto, o tamanho da segunda câmara, está relacionado ao tempo de residência requerido para cada amostra de biomassa.

O tempo de residência é discutido mais adiante em relação à temperatura e ao tempo para o tratamento no presente método.

O presente método de tratamento é particularmente adequado —para'io tratamento da biomassa em um elevado peso seco da biomassa em relação ao peso da mistura de biomassa, amônia aquosa e vapor da reação de tratamento.

É desejável tratar a biomassa em uma concentração de elevado | peso seco para fornecer a biomassa que irá produzir um hidrolisado de alta |

18 a

' concentração de açúcares seguinte à sacarificação.

As características do presente método que determinam que a biomassa não é compactada permitem : um tratamento eficaz da concentração de elevado peso seco da biomassa.

O peso inicial seco da biomassa utilizada no presente método é de pelo menos cercade 15% em peso total da mistura de biomassa e amônia aquosa.

Tipicamente, o peso seco da biomassa é de pelo menos cerca de 20% e pode ser de pelo menos cerca de 30%, 45%, 50%, ou mais.

A porcentagem em peso | seco da biomassa pode variar e a porcentagem ótima pode ser diferente para | os diferentes tipos de biomassa.

Por exemplo, a biomassa de pelo menos cerca de 24% é desejada ao utilizar a espiga de milho, para fornecer a biomassa pré-tratada que é sacarificada para produzir açúcares fermentáveis concentrados suficientemente para uma fermentação custo-eficaz em etanol.

Mais adequada é a biomassa de espiga de milho que é de pelo menos cerca de 30%. A porcentagem preferida em peso seco de um tipo específico de biomassa para utilização nos presentes métodos para a produção de um hidrolisado de alto teor de açúcares é facilmente determinada por um técnico no assunto. : A biomassa pode ser utilizada diretamente conforme obtida a partir de uma fonte ou a energia pode ser aplicada à biomassa para reduzir seu tamanho, aumentar a área de superfície exposta e/ou aumentar a disponibilidade da celulose, hemicelulose e/ou oligossacarídeos presentes na biomassa.

Os meios de energia úteis para este propósito incluem aqueles que não esmagam ou compactam a biomassa, tal que a ultra-estrutura da biomassa não é destruída.

Por exemplo, a biomassa pode ser desfiada, picada ou —lascada.

Um triturador também pode ser utilizado, quando feito de forma que cisalha a biomassa sem esmagar a ultra-estrutura.

Um refinador de disco dentado também é útil para reduzir o tamanho da biomassa antes do pré-

tratamento nos presente métodos.

a pa o 19 | : | , Nos presentes métodos de tratamento, a biomassa é transferida para um tambor cilíndrico utilizando um alimentador de não-compactação.

No ' caso mais simples, um alimentador de não-compactação se refere ao | carregamento de biomassa manual em uma primeira extremidade aberta do | 5 — tambor cilíndrico.

Se houver duas câmaras no tambor, o carregamento é dentro da primeira câmara.

Este método é descrito nos exemplos do presente | utilizando um equipamento conforme definido na Figura 1. O alimentador de | não compactação exemplificado no reator da Figura 2 é um distribuidor.

O | distribuidor pode ser auto-descarregado e/ou pode ser equipado com um | 10 dispositivo indutor do fluxo que não fornece força de compactação.

Por | exemplo, vários tipos de indutores do fluxo do silo de fundo móvel seguido pelos transportadores de medição do fluxo, tais como diversos tipos de cadeias de arraste, elevadores de caçamba ou hélices giratórias (tais como os dispositivos Acrisonº) podem ser utilizados.

A quantidade de biomassa carregada na primeira câmara cilíndrica é limitada tal que é deixado um espaço | para a expansão da biomassa, que pode ocorrer com a adição de amônia aquosa e vapor. : mo ' Um vácuo pode ser aplicado ao tambor cilíndrico contendo | biomassa.

Se houver duas câmaras no tambor, o vácuo será aplicado à | 20 primeira câmara contendo biomassa.

Normalmente, se aplicado, o vácuo reduz | a pressão a menos de cerca de 20 kPa.

Uma solução aquosa que compreende amônia é adicionada através de uma ou mais portas no tambor cilíndrico, ou | sua compensação, em uma quantidade para que a amônia seja inferior a cerca de 12% em peso com relação ao peso seca da biomassa na câmara.

É mais apropriado utilizar mais de uma porta, com as portas sendo distribuídas, tal que | o contato com a solução de amônia é substancialmente distribuída de modo | uniforme pela biomassa.

Se houver mais de duas câmaras no: tambor, a solução de amônia será adicionada na primeira câmara contendo biomassa.

| | 20 | , Também é mais apropriado que a amônia esteja em uma quantidade entre cerca de 4% e cerca de 6% em relação ao peso seco da biomassa na câmara. " A solução de amônia pode ser pré-aquecida, o que contribuirá para elevar a temperatura da biomassa.

Em uma realização alternativa, a solução de amônia aquosa é misturada com a biomassa antes do carregamento na primeira câmara cilíndrica.

A biomassa e a amônia aquosa podem ser misturadas previamente em um recipiente que alimenta a primeira câmara cilíndrica.

Por exemplo, a amônia aquosa pode ser bombeada através de um aquecedor interno e em um misturador de pás contendo biomassa.

A mistura de biomassa e amônia aquosa é, então, alimentada na primeira câmara cilíndrica, onde o vapor é injetado após o fechamento da câmara.

Alternativamente, a biomassa, a amônia e o vapor podem ser misturados previamente e adicionados na primeira câmara cilíndrica.

Nas temperaturas e pressões descritas abaixo, grande parte da amônia aquosa irá evaporar a vapor que permeia a biomassa sendo pré-tratada.

Além disso, o vapor de amônia reciclado úmido que é coletado a partir do tanque de expansão pode ser injetado para formar uma parte do total de amônia adicionada.

No presente método, a solução aquosa que compreende amônia pode compreender, opcionalmente, pelo menos uma base adicional, tal como o hidróxido de sódio, carbonato de sódio, hidróxido de potássio e carbonato de potássio.

Pelo menos uma base adicional poderá ser adicionada em até 10% em peso em relação ao peso seco da biomassa.

A(s) base(s) adicional(is) pode(m) ser utilizada(s), por exemplo, para neutralizar os ácidos na biomassa, para fornecer íons metálicos para as enzimas sacarificação ou para fornecer íons metálicos para o meio de crescimento da fermentação.

Uma vez que a biomassa não é compactada no presente método, ela não pode bloquear a passagem de vapor, como ocorre em sistemas com biomassa compactada.: Portanto, a câmara à qual o vapor é adicionado é

. fechada antes da injeção de vapor.

As portas, exceto uma ou mais através das | quais o vapor está sendo adicionado, são vedadas.

A primeira extremidade do | ' tambor com pistão, ou plugue que funciona como um pistão, é colocada no | lugar e as válvulas estão fechadas.

As válvulas utilizadas podem ser de —qualquertipode abertura e fechamento de válvulas, tais como válvulas de alça ou válvulas acionadas por facas rotativas.

O vapor é adicionado através de uma ou mais portas no tambor cilíndrico, ou na compensação, em uma quantidade que é necessária para elevar a temperatura da mistura de biomassa e amônia aquosa no ponto desejado.

Se houver duas câmaras no tambor, o vapor é adicionado à primeira câmara contendo a biomassa.

É mais apropriado utilizar mais de uma porta, com as portas sendo espaçadas de modo que o contato do vapor seja distribuído pela biomassa.

O vapor é adicionado para aumentar a temperatura da mistura de biomassa e amônia aquosa entre cerca de 85º C e cerca de 180º C.O vapor adicional pode ser adicionado através de uma porta na segunda câmara cilíndrica, se houver, caso necessário para manter a temperatura desejada.

O equipamento pode incluir uma camisa de aquecimento, camisa de vapor, aquecedores de banda ou camisa de isolamento para contribuir para o aumento e/ou manutenção da temperatura.

As camisas de aquecimento ou de vapor são particularmente adequadas para reatores de pequena escala, enquanto as camisas de isolamento são adequadas para reatores de larga escala.

O aquecimento pode ocorrer em diferentes fases, incluindo o pré- aquecimento do tambor antes do tratamento ou pré-tratamento.

Em temperaturas abaixo de 85º C, o tempo necessário para o tratamento com amônia aquosa de baixa força seria proibitivamente longo.

O tempo necessário para o tratamento diminui com o aumento da temperatura.

Por exemplo, o tratamento a 85º C pode ser entre cerca de duas a cerca de quatro horas, enquanto o tratamento a 180º C pode ser de apenas alguns

. minutos. A função do ciclo de alimentação em batelada utilizado no equipamento da Figura 2 requer um tempo adequado para carregamentos ' múltiplos. Por conseguinte, é conveniente escolher uma combinação de tempo e temperatura que possui tempo limitado, que é longo o suficiente para a função da realização do reator utilizado, mas com uma temperatura moderada para fornecer um processo econômico. Com temperaturas moderadas, uma menor pressão de vapor, que possui um menor custo, pode ser utilizada. As condições mais adequadas são tratamentos dentre cerca de 120º C e cerca de 160º C por entre cerca de 60 minutos e cerca de 5 minutos, cujo tempo diminui como aumento da temperatura. As condições particularmente adequadas são o tratamento entre cerca de 140º C e cerca de 150º C por entre cerca de 30 minutos e cerca de 10 minutos, cujo tempo diminui com o aumento da temperatura. O tipo de biomassa sendo pré-tratada também pode afetar o tempo e a temperatura ideal para o tratamento no presente método, como pode —serfacilmente avaliada por um técnico no assunto.

O tempo que a biomassa é mantida à temperatura desejada dentro de uma câmara do reator é o tempo de residência. Ao utilizar um reator com apenas uma primeira câmara, o tempo de residência ocorre na primeira câmara. Ao utilizar um reator com uma primeira câmara e uma segunda câmara, o tempo na primeira câmara pode ser apenas longo o suficiente para combinar a biomassa com os reagentes antes de mover a mistura para a segunda câmara, com o tempo de residência ocorrendo na segunda câmara. Neste caso o tempo na primeira câmara pode ser de apenas cerca de 30 segundos, e o tempo na segunda câmara pode estar entre cerca de 2 minutos ed4áhoras.

Trazer a biomassa para as temperaturas descritas utilizando vapor no presente método resulta em pressões dentro da câmara do reator que estão entre cerca de 60 kPa e cerca de 750 kPa. Mais tipicamente, a pressão

| | 23 | : está entre cerca de 300 kPa e 600 kPa.

Estas são pressões relativamente | baixas com relação aos outros métodos de pré-tratamento conhecidos, tal | " como o método AFEX descrito no documento US 5.037.663, em que as | pressões de 1.150 kPa a 4.250 kPa são utilizadas, ou métodos que utilizam uma pistola de vapor, conforme descrito no documento US 4.461.648, em que as pressões de cerca de 1.800 kPa a cerca de 5.600 kPa são apresentadas na Figura 1 no presente.

A operação do presente método em pressões mais moderadas fornece um sistema de baixo custo, desde que um vapor de menor pressão pode ser utilizado.

No presente método, a biomassa é movida através da primeira câmara e, caso presente, da segunda câmara, sem compactação.

Isto pode ser obtido utilizando um pistão e uma câmara cilíndrica impermeável.

Para os propósitos do presente relatório descritivo, um pistão pode incluir qualquer artigo que pode ser utilizado como um pistão, tal como um plugue que é empurrado para dentro da câmara, bem como qualquer tipo de pistão padrão.

O plugue de um tipo de reator, conforme exemplificado na Figura 1, pode ser empurrado para dentro da câmara utilizando qualquer método que se aplica à pressão necessária para mover a biomassa.

Um método particularmente adequado é fornecer um fechamento estático na extremidade da câmara depois de inserir o plugue, como um cabeçote aparafusado, em seguida, introduzir nitrogênio entre o fechamento e o plugue para criar pressão e mover o plugue.

O plugue pode ser movido por outros meios, tal como a utilização de uma haste conectada a um ativador hidráulico, pneumático ou elétrico.

O tambor do equipamento é impermeável (com todas as portas e — válvulas fechadas) em que não há penetrações não vedadas na parede, tal que o líquido não sai do tambor.

A retenção de líquido permite que o pistão mova a | biomassa sem compactá-la.

O líquido no presente métodos de tratamento é | limitado, e seu conteúdo pode servir para lubrificar as paredes da câmara para

. permitir um fluxo de não compactação em resposta à pressão do pistão. Na verdade, a pressão do pistão pode, temporariamente, apertar levemente a ' biomassa, assim como uma esponja, sem ser apertada o suficiente para que os poros e canais da biomassa entrem em colapso. Após a remoção da pressão do pistão, a biomassa pode reabsorver o líquido nos poros e canais que não tenham sido esmagados. Para auxiliar no fluxo de biomassa, um lubrificante líquido, tal como um sabão de óleo vegetal, pode ser introduzido na câmara. O fluxo pode ser aumentado por estrias na parede da câmara interna, em que a adição de descontinuidades, tais como ranhuras angulares, pode reduzir o atrito, reduzindo a tensão de rendimento e melhorando o fluxo de biomassa. O movimento da biomassa sem compactação mantém os poros preenchidos com líquido inchados, gerados pelo tratamento, o que aumenta a sacarificação subsequente.

No presente método, depois do tratamento pelo tempo desejado à temperatura desejada, a mistura de biomassa e amônia aquosa é movida através de uma válvula de descarga na extremidade do tambor cilíndrico em um tanque de expansão. A válvula de descarga é fechada durante a reação da biomassa com amônia aquosa à temperatura desejada, em seguida, aberta para a passagem da biomassa. Em um reator de duas câmaras, conforme exemplificado na Figura 2, a válvula de descarga abre em sincronismo com a abertura da válvula entre a primeira e a segunda câmara, após o pistão ter formado a pressão na primeira câmara, a fim de substituir todo o conteúdo da segunda câmara pelo volume do conteúdo da primeira câmara. As válvulas de descarga que podem ser utilizadas são —exemplificadas pelas válvulas de porta V giratórias, válvulas anti-retorno e válvulas de descarga de alça. Particularmente útil em um reator de menor escala, conforme exemplificado na Figura 1, é uma válvula de descarga do tipo alça operada por pistão, em que o lado a montante de face rígida do assento

. da válvula é o orifício de descarga, e o lado mais macio a jusante do assento da válvula sela contra um êmbolo da válvula de face rígida, com a área de fluxo ' crescente continuamente além do assento da válvula quando o êmbolo da válvula é retraído para abrir. | Mais apropriadamente a válvula de descarga do tipo alça incorporaria um venturi de expansão gradual.

Uma realização de uma válvula do tipo alça Venturi de expansão gradual que é adequada para um reator de pequena escala, conforme exemplificado na Figura 1, está representada na Figura 3. Esta válvula incorpora um bocal cônico e uma disposição da válvula de cisalhamento final do assento.

Para evitar a obstrução, o Venturi de expansão gradual, conforme exemplificado na Figura 3 (posição fechada) e na Figura 4 (posição aberta), foi projetado para acelerar os sólidos através de uma fenda gradualmente maior, entre o cone externo estacionário do venturi (50) e o cone interno móvel do venturi (51) que é montado na extremidade de um eixo da válvula (52). O cone externo do venturi está na forma de um Venturi . geralmente toroidal fixado entre um flange (53) na câmara do reator (54; equivalente a 10 na Figura 1) e uma saída de expansão do flange de entrada do tanque (55). O cone interno do Venturi (51) é o nariz na extremidade do eixo da válvula de saída reator (52). O venturi dentro do cone e o eixo da válvula estão dentro do cotovelo de descarga (56; equivalente a 20 na Figura 1) que está dentro do tanque de expansão (57; equivalente a 21 na Figura 1). O eixo da válvula está ligado a um ativador (58) para o controle de movimento.

O ativador pode ser qualquer dispositivo que é capaz de mover o eixo da válvula e para trás e para frente em um movimento horizontal, como um motor elétrico, pneumático ou hidráulico, ativador de válvula pneumática, ou pistão hidráulico.

Quando o eixo da válvula está na sua posição extrema à esquerda, a borda externa do cone interno assenta contra a borda interna do cone externo para selar a extremidade de descarga do reator durante o tratamento.

Quando é

' 26 . hora de descarregar o reator, o eixo da válvula é deslocado para a direita para fornecer o tamanho de abertura que se deseja para o venturi de expansão. ' Este projeto prevê uma região de expansão de algum comprimento que se expande suavemente no sentido do fluxo. Neste projeto, os sólidosda biomassa são acelerados para baixo no eixo do cone anelar de abertura gradual, o que evita a permissão de uma expansão radial súbita levando à obstrução. Outra realização de um venturi de expansão gradual, que é apropriado como uma válvula de descarga, particulammente em um equipamento de grande escala, conforme exemplificado na Figura 2, está representado na Figura 5. Esta é uma realização de uma porta da válvula macho V onde a expansão do venturi de expansão é usinada dentro do corpo da válvula. Dentro do corpo estacionário do Venturi de expansão (70) há um estreitamento (71) a partir da extremidade de saída da câmara de reação (72) e uma expansão (73) na entrada do tanque de expansão (74). No núcleo rotativo (75) da válvula macho está uma abertura angular (76) que se alinha com o estreitamento da câmara do reator (71) e a expansão no tanque de expansão (73) quando na posição aberta. O núcleo rotativo (75) se transformou em metade de uma rotação completa para bloquear o alinhamento da válvula macho que fecha a válvula. Uma realização adicional de um Venturi de expansão gradual, que é apropriado como uma válvula de descarga, especialmente em um reator de maior escala, conforme exemplificado na Figura 2, está representada na Figura

6. Esta é uma realização de uma válvula anticretorno que possui um cone (80) que se encaixa na junção estreitada (81) entre a câmara do reator (72) e a entrada do tanque de expansão (74) (Figura 6A). O cone está em um braço (82) que está anexado a um eixo (83) que se estende através de uma junta de vedação até um ativador de válvula rotativa. O eixo é girado na direção da seta

. pontilhada para mover o braço para a esquerda para abrir a junção, formando um Venturi de expansão gradual (Figura 6B). Em outra realização de uma : válvula anti-retorno utilizada para uma expansão gradual do Venturi, o cone pode ser de vários centímetros de diâmetro, com a distância movida para a esquerda para abrir a válvula sendo de apenas poucos centímetros, que é inferior a 8 cm.

A mistura de biomassa e amônia que se move através da válvula de descarga entra em um tanque de expansão, que é capaz de manter um vácuo. No tanque de expansão, a amônia é liberada a partir da biomassa tratadae a biomassa é resfriada, na preparação para a sacarificação. Qualquer tanque de expansão típico pode ser utilizado, possuindo uma entrada tangencial ou voluta que fornece a função de um cotovelo de separação mais adequado. É particularmente adequado impor a expansão várias vezes, em sequência, em diferentes pressões para' a liberação da amônia da biomassa pré-tratada. Por exemplo, uma primeira expansão a uma pressão geralmente perto da atmosférica remove a maioria da amônia livre e resfria o material em cerca de 100º C. Uma segunda expansão a uma pressão inferior a cerca de 20 kPa remove a amônia livre restante e resfria o material a uma temperatura de cerca de 50º C, o que é desejado para a sacarificação.

O vapor de amônia liberado no tanque de expansão a partir da mistura de biomassa e amônia passada pela válvula de descarga pode ser recuperado a partir do tanque de expansão, e pode ser reciclado. O vapor de expansões de baixa pressão pode ser reciclado através de um equipamento de recompressão de vapor padrão (tal como uma turbina ou uma bomba de vapor a jato), sem refrigeração. Portanto, o vapór de amônia pode ser reciclado diretamente para o tratamento sem condensação, ou pode ser condensado antes de ser reutilizado. Neste último caso, o vapor coletado é alimentado em um condensador, tal como na Figura 1.

| 28 | . A redução da amônia na biomassa tratada irá diminuir o pH e reduzir a quantidade de ácido necessária para atingir um pH que é satisfatório ] para a atividade das enzimas de sacarificação.

Isso é desejável uma vez que a grande adição de ácido pode resultar na formação de sais em concentrações que inibem as enzimas de sacarificação ou o crescimento microbiano.

Por outro lado, a amônia deixada na biomassa pode servir como uma fonte de nitrogênio para auxiliar o crescimento de microrganismos durante a fermentação.

Portanto, a amônia remanescente pode reduzir ou eliminar a necessidade de suplementar o meio de crescimento utilizado durante a fermentação com uma fonte de nitrogênio.

Normalmente, pelo menos uma porção da amônia é removida, o que reduz o pH, mas deixa alguns nitrogênio que fornece este nutriente para utilização na fermentação subsequente.

A medida que a biomassa pré-tratada se acumula no fundo do tanque de expansão, ela pode ser agitado por um misturador de pá que pode ser fixado na parte inferior do tanque de expansão.

A biomassa pré-tratada é retirada do tanque de expansão, normalmente, abrindo uma tampa no fundo do tanque.

Os meios mecânicos de fundo móvel para a extração contínua da biomassa pré-tratada são particularmente apropriados.

Para o processamento de múltiplas bateladas de biomassa no presente equipamento, uma batelada de biomassa e amônia pode estar na câmara do tambor, enquanto a outra batelada está no tanque de expansão.

No equipamento de duas câmaras, as bateladas podem estar simultaneamente em ambas as câmaras e no tanque de | expansão.

Além disso, diversas bateladas de pré-tratamento da biomassa | podem ser coletadas no tanque de expansão antes da remoção.

Após o tratamento, o produto compreende tipicamente uma mistura de amônia, biomassa parcialmente degradada e alguns açúcares fermentáveis.

A biomassa total pré-tratada que compreende frações solúveis e insolúveis pode ser retirada do tanque de expansão e utilizada em uma reação

. de sacarificação. Como alternativa, algum líquido pode ser drenado da mistura da biomassa pré-tratada antes da sacarificação de modo que o peso seco da " biomassa permanece elevado na reação de sacarificação. O excesso de líquido pode estar presente após o tratamento, especialmente quando grandes — quantidades de vapor são necessárias para elevar e manter a temperatura da biomassa para o tratamento. Em outra alternativa, os sólidos da biomassa podem ser reciclados através de um tratamento no presente método.

SACARIFICAÇÃO A biomassa pré-tratada do presente equipamento é ainda hidrolisada na presença das enzimas de sacarificação, que podem ser referidas como um consórcio de enzima de sacarificação, para a liberação de oligossacarídeos e/ou monossacarídeos em um hidrolisado. As enzimas de sacarificação e os métodos para o tratamento da biomassa são revistos por Lynd,L.R. etal., (Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2002) 66: 506 a 577). Antes de sacarificação, a biomassa pré-tratada pode ser tratada | de modo a alterar o pH, a composição ou a temperatura de tal forma que as enzimas do consórcio de enzima de sacarificação serão ativas. O pH pode ser alterado por meio da adição de ácidos ou bases na forma sólida ou líquida. —Alternativamente, o dióxido de carbono (CO>z), que pode ser recuperado a partir da fermentação, pode ser utilizado para diminuir o pH. Por exemplo, o CO? pode ser coletado a partir de um fermentador e alimentado no headspace (espaço vazio) do produto de pré-tratamento no tanque de expansão ou borbulhado através da biomassa pré-tratada se o líquido adequado estiver presente enquanto monitora o pH, até o pH desejado ser obtido. A temperatura pode ser levada a uma temperatura que seja compatível com a atividade enzimática de sacarificação, tal conforme. indicado abaixo. Quaisquer co- fatores necessários para a atividade das enzimas utilizadas na sacarificação E rd

. podem ser adicionados. i - O consórcio da enzima de sacarificação. compreende uma ou ' mais enzimas selecionadas principalmente, mas não exclusivamente, a partir do grupo das “glicosidases”, que hidrolisam as ligações de éter di-, oligo- e —polissacarídeos e são encontradas na classificação da enzima EC 3.2.1.x (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego, Califórnia, com (1993) Suplemento 1, Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995, Suplemento 4 (1997) e Suplemento 5 [em Eur. J. Biochem. (1994) 223: 1 a 5, Eur. J. Biochem. (1995) 232: 1 a 6, Eur. J. Biochem. (1996) 237: 1 a 5, Eur. JJ. Biochem. (1997) 250: 1 a 6 e Eur. J. Biochem. (1999) 264: 610 a 650, respectivamente]) do grupo geral das “hidrolases” (EC 3). As glicosidases úteis no presente método podem ser classificadas pelo componente da biomassa que elas hidrolisam. As glicosidases úteis para o presente método incluem as glicosidases “que hidrolisam a celulose (por exemplo, celulases, —endoglicanases, exoglicanases, cellobiohidrolases, B-glicosidases), glicosidases que hidrolisam a hemicelulose (por exemplo, xilanases, endoxilanases, exoxilanases, B-xilosidases, arabinoxilanases, mannases, galactases, pectinases, glicuronidases), e glicosidases que hidrolisam o amido (por exemplo, amilase, a-amilase, B-amilasés, glicoamilases, a-glicosidases, | 20 isoamilases). Além disso, pode ser útil adicionar outras atividades no consórcio | de enzima de sacarificação, tais como as peptidases (CE 3.4.x.y), lipases (EC | 3.1.1x e 3.14.x), ligninases (CE 1.11.1.x) e esterases de feruloila (EC

3.1.1.73) para ajudar na liberação de polissacarídeos dos outros componentes da biomassa. É bem conhecido no estado da técnica que os microorganismos que produzem as enzimas que hidrolisam os polissacarídeo frequentemente apresentam uma atividade, tais como «de degradação da celulose, que é catalisada por várias enzimas, ou um grupo de enzimas com diferentes especificidades ao substrato. Portanto, uma “celulase” de um microorganismo Re

: pode compreender um grupo de enzimas, todas as quais podem contribuir para a atividade de degradação da celulose.

As preparações de enzimas comerciais 7 ou não comerciais, tais como celulases, podem compreender diversas enzimas, dependendo do esquema de purificação utilizado para obter a enzima.

Assim, o consórcio de enzima de sacarificação do presente método pode compreender a atividade enzimática, tais como “celulase”, porém reconhece-se que essa atividade pode ser catalisada por mais de uma enzima.

As enzimas de sacarificação podem ser obtidas comercialmente, tal como a celulase Spezymeº CP (Genencor International, Rochester, NY) e a xilanase Multifectº (Genencor). Além disso, as enzimas de sacarificação podem ser produzidas biologicamente, incluindo o uso de microrganismos | recombinantes.

Um técnico no assunto saberia como determinar a quantidade eficaz de enzimas para o uso em consórcio e ajustar as condições para a atividade ideal da enzima.

Um técnico no assunto, também sabe como otimizar ! as classes de atividades das enzimas necessárias dentro do consórcio para obter a sacarificação ideal de um dado produto de pré-tratamento nas condições selecionadas.

De preferência, a reação de sacarificação é realizada em ou perto datemperatura e pH ótimo para as enzimas sacarificação.

A temperatura ótima utilizada com o consórcio da enzima de sacarificação nos intervalos do presente método de cerca de 15º C a cerca de 100º C.

Em outra realização, a temperatura ideal varia de cerca de 20º C a cerca de 80º C.

O pH ótimo pode variar de cerca de 2 até cerca de 11. Em outra realização, o pH ótimo utilizado como consórcio de enzima de sacarificação no presente método varia de cerca de 4 a cerca de 10. A sacarificação pode ser realizada por um período de tempo de cerca de alguns minutos a cerca de 120 h e, de preferência, de cerca de alguns a e E O

: minutos a cerca de 48 h. O tempo para a reação irá depender da concentração das enzimas e da atividade específica, bem como do substrato utilizado e das : condições ambientais, tais como temperatura e pH. Um técnico no assunto pode facilmente determinar as condições ideais de temperatura, pH e tempo para ser utilizado com um determinado substrato e consórcio de enzima(s) de sacarificação. A sacarificação pode ser realizada em bateladas ou como um processo contínuo. A sacarificação também pode ser realizada em uma etapa, ou em uma série de etapas. Por exemplo, diferentes enzimas necessárias para a sacarifcação podem apresentar diferentes pH ou temperatura ideal. Um | tratamento primário pode ser realizado com a(s) enzima(s) a uma temperatura e | pH, seguido dos tratamentos secundário ou terciário (ou mais) com diferente(s) | | enzima(s) em diferentes temperaturas e/ou pH. Além disso, o tratamento com enzimas diferentes em etapas sequenciais pode ser no mesmo pH e/ou temperatura, ou em diferentes pHs e temperaturas, tal como a utilização das hemicelulases estáveis e mais ativas em maiores pH e temperaturas seguida pelas celulases, que são ativas em pH e temperaturas mais baixas. O grau de solubilização dos açúcares a partir da biomassa depois da sacarificação pode ser monitorado através da medida da liberação dos | 20 monossacarídeos e oligossacarídeos. Os métodos para medir os monossacarídeos e oligossacarídeos são bem conhecidos no estado da | técnica. Por exemplo, a concentração dos açúcares redutores pode ser | determinada utilizando o teste do ácido 1,3-dinitrossalicílico (DNS) (Miller, G. L., Anal. Chem. (1959) 31: 426 a 428). Alternativamente, os açúcares. podem ser medidos por HPLC utilizando uma coluna adequada, tal conforme descrito | no presente, na seção dos Métodos Gerais.

FERMENTAÇÃO | Os açúcares fermentáveis liberados a partir da biomassa podem

: ser utilizados por microrganismos adequados para a produção de produtos químicos alvo. Seguinte à sacarificação, mas antes da fermentação, a mistura ] de sacarificação pode ser concentrada por evaporação, por exemplo, para aumentar a concentração dos açúcares fermentáveis. Opcionalmente, o líquido no produto de sacarificação pode ser separado dos sólidos em um método em batelada ou contínuo. Opcionalmente, o líquido ou o produto total de sacarificação pode ser esterilizado antes da fermentação. Dependendo do(s) | microorganismo(s) utilizado(s) durante a fermentação e do pH utilizado durante a sacarificação, o pH pode ser ajustado àquele adequado para a fermentação.

Além disso, a mistura de sacarificação pode ser suplementada com nutrientes adicionais necessários para o crescimento microbiano. Os suplementos podem incluir, por exemplo, extrato de levedura, aminoácidos específicos, fosfato, fontes de nitrogênio, sais e oligoelementos. Os componentes necessários para a produção de um produto específico criado por um biocatalisador específico também podem ser incluídos, tal como um antibiótico para manter um plasmídeo ou um co-fator necessário em uma reação catalisada por enzima.

Do mesmo modo, os açúcares adicionais podem ser incluídos para aumentar a concentração de açúcares totais. A mistura de sacarificação pode ser utilizada como um componente de um caldo de fermentação, por exemplo, compondo entrecerca de 100% e cerca de 10% do meio final.

A temperatura e/ou headspace do gás também podem ser ajustados, dependendo das condições úteis para a fermentação do(s) microorganismo(s). A fermentação pode ser aeróbia ou anaeróbia. A fermentação pode ocorrer após a sacarifcação, ou pode ocorrer —concomitantemente com sacarificação por sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). O SSF pode manter os níveis de açúcar produzido por baixa sacarificação, reduzindo assim a inibição do produto potencial das enzimas de sacarificação, reduzindo a disponibilidade de açúcar para a

. contaminação por microrganismos, e melhorando a conversão da biomassa pré-tratada em monossacarídeos e/ou oligossacarídeos. | : Os produtos químicos desejados que podem ser produzidos por | fermentação incluem, por exemplo, ácidos, alcoóis, alcanos, alcenos, aromáticos, aldeídos, cetonas, biopolímeros, proteínas, peptídeos, aminoácidos, vitaminas, antibióticos e produtos farmacêuticos. Os alcoóis incluem, mas não estão limitados a metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, etileno glicol, propanodiol, butanodiol, glicerol, eritritol, xilitol e sorbitol. Os ácidos incluem o ácido acético, ácido láctico, ácido propiônico, ácido 3- hidroxipropiônico, ácido butírico, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido cítrico, ácido succínico e ácido levulínico. Os aminoácidos incluem o ácido glutâmico, ácido aspártico, metionina, lisina, glicina, arginina, treonina, fenilalanina e tirosina. Os produtos químicos adicionais incluem o metano, etileno, acetona e enzimas industriais. A fermentação de açúcares nos produtos químicos desejados pode ser realizada por um ou mais biocatalisadores adequados em fermentações únicas ou de várias etapas. Os biocatalisadores podem ser microorganismos selecionados a partir de bactérias, fungos filamentosos e leveduras. Os biocatalisadores podem ser microorganismos do tipo selvagem ou microorganismos recombinantes, e incluem Escherichia, Zymomonas, Saccharomyces, Candida, Pichia, Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium. Em outra realização, os biocatalisadores podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacilus — stearothermophilus, Saccharomyces — cerevisiae, Clostridia thermocellum,y Thermoanaerobacterium' .saccharolyticum e Pichia stípitis recombinante. Muitos biocatalisadores utilizados na fermentação para a produção de produtos químicos desejados têm sido descritos e outros podem

RR

. ser descobertos, produzido através de mutação, ou manipulados através de meios recombinantes. Qualquer D biocatalisador que utilize os açúcares : fermentáveis, produzidos a partir da sacarificação da biomassa pré-tratada utilizando o presente método, pode ser utilizado para produzir o(s) produto(s) —químico(s) desejado(s) que é conhecido por produzir por fermentação. Os biocatalisadores particularmente interessantes são aqueles que produzem biocombustíveis, incluindo o etanol e o butanol. Por exemplo, a fermentação dos hidratos de carbono em acetona, butanol e etanol (fermentação ABE) por Clostridia solventogênica é bem conhecida (Jones e Woods (1986) Microbiol. Rev. 50: 484 a 524). Um processo de fermentação para a produção de altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, utilizando uma cepa mutante de Clostridium acetobutylicum é descrito no documento US 5.192.673. A utilização de uma cepa mutante de Clostridium beijerinckii para produzir altos níveis de butanol, que também produz acetona e etanol, é descrita no documento US 6.358.717. Os pedidos de patente de co- propriedade e provisórios WO 2007/041269 e WO 2007/050671, descrevem a produção do 1-butanol e do isobutanol, respectivamente, em hospedeiros microbianos geneticamente modificados. Os pedidos de patente de co- propriedade e provisórios US 11/741892 e US 11/741916 descrevem a produção do 2-butanol em hospedeiros microbianos geneticamente modificados. O isobutanol, o 1-butanol ou 2-butanol podem ser produzidos a partir da fermentação do hidrolisado produzido utilizando o presente método por um hospedeiro microbiano seguindo os métodos descritos.

As cepas geneticamente modificadas de E. coli também foram utilizadas como biocatalisadores para a produção de etanol (Underwood et al., (2002) Appl. Environ. Microbiol. 68: 6263 a 6272). Uma cepa geneticamente modificada de Zymomonas mobilis, que possui uma melhor produção de etanol é descrita no documento US 2003/0162271 A1. Uma cepa produtora de etanol

. modificada adicional de Zymomonas mobilis e a sua utilização para a produção de etanol são descritas nos pedidos de patente de co-propriedade e provisórios ] US 60/847813 e US 60/847856, respectivamente.

O etanol pode ser produzido a partir da fermentação do hidrolisado produzido utilizando o presente método porZymomonas mobilis seguindo os métodos descritos.

O ácido lático foi produzido nas fermentações por cepas recombinantes de E. coli (Zhou et al, (2003) Appl.

Environ.

Microbiol. 69: 399 a 407), cepas naturais de Bacillus (documento US 2005/0250192) e Rhizopus oryzae (Tay e Yang (2002) Biotechnol.

Bioeng. 80: 1 a 12). As cepas | 10 recombinantes de E. coli têm sido utilizadas como biocatalisadores na | fermentação para produzir o 1,3 propanodiol (documentos US 6.013.494, US | 6.514.733), e o ácido adípico (Niu et al, (2002) Biotechnol.

Prog. 18: 201 a 211). O ácido acético foi produzido por fermentação utilizando Clostridia recombinante (Cheryan et al., (1997) Adv.

Appl.

Microbiol. 43: 1 a 33), e cepas | 15 de leveduras recém-identificadas (Freer (2002) World J.

Microbiol.

Biotechnol. 18: 271 a 275). A produção do ácido succínico por E. coli recombinante e outras bactérias está descrita no documento US 6.159.738, e por E. coli mutante recombinante em Lin et al., (2005) Metab.

Eng. 7: 116 a 127). O ácido pirúvico foi produzido pela levedura de Torulopsis glabrata mutante (Li et al., (2001) Appl.

Microbiol.

Technol. 55: 680 a 685) e pela E. coli mutante (Yokota et al., (1994) Biosci.

Biotech.

Biochem. 58: 2.164 a 2.167). As linhagens recombinantes de E. coli têm sido utilizadas como biocatalisadores para a produção de ácido para-hidroxicinâmicos (documento US 2003/0170834) e ácido quínico (documento US 2006/0003429). Um mutante de Propionibacterium acidipropionici tem sido utilizado na fermentação para a produção do ácido propiônico (Suwannakham e Yang (2005) Biotechnol.

Bioeng. 91: 325 a 337), e o ácido butírico foi produzido pela Clostridium tyrobutyricum (Wu e Yang (2003) Biotechnol.

RN — OpPp— ==

| : Bioeng. 82: 93 a 102). O propionato e o propanol foram produzidos pela fermentação da treonina pela cepa de Clostridium sp. 17cr1 (Janssen (2004) º Arch. Microbiol., 182: 482 a 486). A Aureobasidium pullulans do tipo levedura | foi utilizada para produzir o ácido glucônico (Anantassiadis et al., (2005) —Biotechnol. Bioeng. 91: 494 a 501), por um mutante do Aspergillis niger (Singh ' et al., (2001) /ndian J. Exp. Biol., 39: 1.136 a 43). O 5-ceto-D-glucônico foi produzido por um mutante de Gluconobacter oxydans (Elfari et al., (2005) Appl. Microbiol. Biotech. 66: 668 a 674), o ácido itacônico foi produzido por mutantes de Aspergillus terreus (Reddy and Singh (2002) Bioresour. Technol. 85: 69 a | 10 71), o ácido cítrico foi produzido por uma cepa mutante de Aspergillus niger | (Ikram-Ul-Haq et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 645 a 648), e o xilitol foi produzido pela Candida guilliermondii FTI 20037 (Mussatto e Roberto (2003) J. Appl. Microbiol., 95: 331 a 337). Os biopoliésteres contendo 4-hidroxivalerato, que também contém quantidades significativas de ácido 3-hidroxibutírico, ácido 3-hidroxivalérico, foram produzidos por recombinantes de Pseudomonas putida e Ralstonia eutropha (Gorenflo et al., (2001) Biomacromolecules 2: 45 a 57). O | L-2,3-butanodiol foi produzido pela E. coli recombinante (Ui et al. (2004) Lett.

| Appl. Microbiol. 39: 533 a 537).

A produção de aminoácidos por fermentação foi realizada utilizando cepas auxotróficas e cepas resistentes análogas de aminoácidos de Corynebacterium, Brevibacterium e Serratia. Por exemplo, a produção de histidina utilizando uma cepa resistente a um análogo de histidina é descrita na patente JP 56.008.596 e utilizando uma cepa recombinante é descrita no | documento EP 136.359. A produção de triptofano que utiliza uma cepa | 25 resistente a um análogo de triptofano é descrita nas patentes JP 47.004.505 e | JP 51.019.037. A produção de isoleucina utilizando uma cepa resistente a um | análogo de isoleucina é descrita nas patentes JP 47.038.995, JP 51.006.237, JP 54.032.070. A produção de fenilalanina utilizando uma cepa resistente a um

| 38 ' | o | | . análogo de fenilalanina é descrita na patente JP 56.010.035. A produção de tirosina utilizando uma cepa que requer fenilalanina para o crescimento, ' resistentes à tirosina (Agr. Chem. Soc. Japão 50 (1) R79-R87 (1976), ou uma cepa recombinante (documentos EP 263.515, EP 332.234), e a produção de arginina utiizando uma cepa resistente a um análogo de L-arginina (Agr. Biol. Chem. (1972) 36: 1675 a 1684, patente JP 54.037.235 e publicação JP

57.150.381) foram descritos. A fenilalanina também foi produzida por fermentação em cepas de Escherichia coli ATCC 31882, 31883 e 31884. À produção de ácido glutâmico em uma bactéria corineforme recombinante é descrita no documento US 6.962.805. A produção de treonina por uma cepa mutante de E. coli é descrita em Okamoto e Ikeda (2000) J. Biosci Bioeng. 89: 87 a 79. A metionina foi produzida por uma cepa mutante de Corynebacterium lilium (Kumar et al., (2005) Bioresour. Technol. 96: 287 a 294). Os peptídeos, enzimas e outras proteínas úteis também têm sido produzidos por biocatalisadores (por exemplo, documentos US 6.861.237, US

6.777.207, US 6.228.630).

O pré-tratamento e à sacarificação da biomassa em açúcares fermentáveis, seguido pela fermentação dos açúcares a uma substância química desejada é exemplificado no Exemplo 5 no presente para a produção do etanol a partir das espigas de milho pré-tratadas com Z. mobilis assim como o biocatalisador para a fermentação dos açúcares em etanol. O método da presente invenção também pode ser utilizado para a produção do 1,3- propanodiol a partir da biomassa. A biomassa tratada utilizando o presente método pode ser sacarificada; seguinte à sacarificação, a E. coli é utilizada para produzir o 1,3-propanodiol, conforme descrito no Exemplo 10 do pedido de patente de co-propriedade e provisório US 11/403087.

Os produtos químicos desejados produzidos na fermentação pelos biocatalisadores podem ser recuperados utilizando vários métodos

. conhecidos no estado da técnica. Os produtos podem ser separados dos outros componentes da fermentação por centrifugação, filtração, microfiltração : e nanofiltração. Os produtos podem ser extraídos por troca iônica, extração com solvente ou eletrodiálise. Os agentes de floculação podem ser utilizados para auxiliarna separação de produtos. Como um exemplo específico, o 1- butanol bioproduzido pode ser isolado do meio de fermentação utilizando os métodos conhecidos no estado da técnica para as fermentações ABE (vide, por exemplo, Durre, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 639 a 648 (1998), Groot et al, Process. Biochem. 27: 61 a 75 (1992), e as referências citadas no mesmo). Por exemplo, os sólidos podem ser removidos do meio de fermentação por centrifugação, filtração, decantação, ou similares. Em seguida, o 1-butanol pode ser isolado do meio de fermentação através de métodos como a destilação, a destilação azeotrópica, extração líquido — líquido, adsorção, retirada de gás, a evaporação da membrana ou a pervaporação. A purificação do 1,3-propanodiol a partir do meio de fermentação pode ser obtida, por exemplo, submetendo a mistura de reação à extração com um solvente orgânico, à destilação e à cromatografia em coluna (documento US 5.356.812). Um solvente orgânico particularmente bom para este processo é o ciclohexano (documento US 5.008.473). Os aminoácidos podem ser coletados a partir do meio de fermentação pelos métodos tais como a adsorção de resina por troca iônica e/ou a cristalização.

EXEMPLOS

MÉTODOS GERAIS E MATERIAIS São utilizadas as seguintes abreviações: “HPLC” é Cromatografia Líquida de Alta Performance, "C” é centigrado, “kPa” é quiloPascal, “mn” é metro, “mm” é milímetro, “kW" é quilowatt, “um” é micrometro, “ul” é microlitro, “mL” é milímetro, “L” é litro, “min” é minuto, “MM” é milimolar, “cm” é centímetro, “g” é grama, “kg” é quilograma,

| 40 | : “p” é peso, “h” é hora, “temp” ou “T” é temperatura, “teori” é teórico, “trat. pr.” é tratado previamente, “DWB'" é o peso seco da biomassa, “ASME” é a American ' Society of Mechanicals Engineers, “s.s.” é aço inoxidável, “pol” ou ” é polegada. * O ácido sulfúrico, hidróxido de amônio, ácido acético, acetamida, extrato de levedura, glicose, xilose, sorbitol, MgSO4.7H2O, ácido fosfórico e ácido cítrico foram obtidos pela Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). O tratamento é referido como um pré-tratamento nos exemplos.

REATOR DE TAMBOR PEQUENO COM PISTÃO Um reator de tambor pequeno com pistão (pistão/ reator de tambor) foi construído, em que consistia em um tambor de aço inoxidável 5,1 em x 45,7 em equipado com um pistão, orientado horizontalmente. O pistão foi selado ao tambor, com quatro anéis O e foi pressurizado com nitrogênio na parte posterior do pistão durante o curso de descarga. O tambor de 45,7 cm foi equipado com três portas de uso múltiplo que permite .a aplicação de vácuo, injeção de amônia aquosa, injeção de vapor, e inserção de termopares para a medida da temperatura dentro do tambor. Para evitar o excesso de condensação de vapor na injeção de vapor, a parte externa do tambor foi aquecida com três aquecedores de banda e isolada com um colchão de fibra de vidro de 2,5 cm de espessura coberta com uma camisa de fibra de vidro impregnada com silicone. O tambor do reator estava diretamente ligado a um tanque de expansão de aço inoxidável de 15,2 cm x 61 cm, orientado verticalmente. O tambor foi isolado do tanque de expansão por um bocal cônico e um arranjo da válvula de cisalhamento do assento final. O diâmetro do molde da válvula de cisalhamento final era de 3,5 cm. A contrapressão sobre o bocal cônico e o assento foi ajustado para cerca de 138 kPa (pressão manométrica) de contrapressão em um cilindro de ar de 10,2 cm de diâmetro ligado ao cone da válvula de cisalhamento final. O cone da válvula de cisalhamento final poderia

. recuar até 1,6 cm para permitir a descarga de partículas no tanque de expansão.

Um cotovelo na saída da válvula de cisalhamento final direcionou os S sólidos pré-tratados para baixo no fundo do tanque de expansão, onde os sólidos foram facilmente removidos ao abrir um flange de extremidade convexa —nofundo do tanque.

Um flange convexo superior no tanque de expansão está incluído em uma saída especial adaptada com ranhuras perpendiculares ao eixo do tanque de expansão, o que fez com que os vapores liberados viajassem em torno de um caminho curvo até uma saída adaptada, ajudando a evitar o transporte das partículas de biomassa arrastadas e as gotículas de águaem um condensador de ventilação.

REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO | Um segundo tambor para o reator com pistão (código ASME | carimbado) foi fabricado com os mesmos 5,1 cm de diâmetro, mas com 68,6 cm de comprimento a mais para conter o volume da biomassa adicional.

O pistão foi selado no tambor, com quatro anéis O e foi pressurizado com nitrogênio na parte posterior do pistão durante o curso de descarga.

O tambor de 68,6 cm foi equipado com oito portas de uso múltiplo, cada 4 ao longo das superfícies superiores e inferiores, permitindo a aplicação de vácuo, injeção de amônia aquosa, injeção de vapor e inserção de termopares para a medição da temperatura no interior do tambor.

O tambor do reator foi equipado com uma camisa de vapor para um aquecimento regular do tambor.

O tambor do reator estava diretamente ligado a um tanque de expansão de aço inoxidável de 15,2 em x 61 cm, orientado verticalmente.

O tambor foi isolado do tanque de expansão por um bocal cônico e um arranjo da válvula de cisalhamento do assento final.

O diâmetro do molde de cisalhamento da válvula final era de 3,5 em.

A contrapressão sobre o bocal cônico e o assento era regulável, com a maioria dos testes realizados utilizando cerca de 138 kPa (pressão manométrica) de contrapressão em um cilindro de ar de 10,2 cm de diâmetro

42 | . ligado ao cone da válvula de cisalhamento final. O cone da válvula de | cisalhamento final poderia recuar até 1,6 cm para permitir a descarga de ] partículas no tanque de expansão. Um cotovelo na saída da válvula de cisalhamento final direcionou os sólidos pré-tratados para baixo no fundo do tanque de expansão, onde os sólidos foram facilmente removidos ao abrir um | flange de extremidade convexa no fundo do tanque. Um flange convexo superior no tanque de expansão está incluído em uma saída especial adaptada com ranhuras perpendiculares ao eixo do tanque de expansão, o que fez com que os vapores liberados viajassem em torno de um caminho curvo até uma saída adaptada, ajudando a evitar o transporte das partículas de biomassa arrastadas e das gotículas de água em um condensador de ventilação. Três aquecedores de banda elétrica (fixados em 60º C) e isolamento foram adicionados ao longo do tanque de expansão para permitir que os sólidos tratados a quente se expandam em um recipiente aquecido, simulando melhor um processo em escala comercial.

SISTEMA DE DIGESTÃO EM BATELADA DO REATOR DE PISTOLA DE VAPOR O reator de pistola de vapor de 4 litros (Autoclave Engineers, Erie, PA) é um reator com camisa de vapor que consiste em um comprimento de 102 milímetros de disposição 80 do tubo Hastelloy? fechado por duas válvulas de esfera. Os aquecedores elétricos adicionais foram colocados em todas as superfícies expostas, sem camisa do reator e controlados quanto à temperatura do ponto de ajuste do tratamento prévio. A injeção direta de vapor também foi utilizada para trazer rapidamente a biomassa até a temperatura de pré- tratamento. A pressão de vapor foi ajustada e controlada para manter a temperatura de pré-tratamento desejada. A parte inferior do reator foi estreitada até 51 mm. Todo o material pré-tratado saiu -através de um molde substituível no fundo do reator e foi coletado em uma bolsa de náilon (Hotfil?) de 0,21 mº apoiada dentro de um tanque de expansão de paredes pesadas, com camisa e

| . resfriado. REATOR DE PRÉ-TRATAMENTO E HIDRÓLISE ENZIMÁTICA (REATOR PEH) ' Um Reator PEH de 9 L (construído em NREL, Golden, CO; vide pedido de patente provisório US 11/402464) possui um vaso de reação de aço — inoxidável de cerca de 15 cm x 51 cm e o PEHReator de 3,2 L possui um vaso de reação de aço inoxidável de 15 cm x 18 cm. Cada vaso possui uma lança de injeção que se estende através do centro longitudinal do vaso de reação para a introdução dos reagentes de processamento. A lança de injeção é ligada através de uma junta rotativa a uma porta em uma tampa em uma extremidade do vaso, que possui uma porta adicional para o acesso dos vasos. Quatro defletores se estendem pelo comprimento da parede do vaso, e são ligados perpendicularmente à parede. Os defletores e os cilindros de meio de atrito de cerâmica de 3,2 cm X 3,2 cm (E.R. Advanced Ceramics, East Palestine, OH), que flutuam livremente no vaso, aplicam uma mistura mecânica da biomassa e do reagente a medida que o vaso é girado, promovendo a assimilação do reagente na biomassa. Sete cilindros são utilizados no reator pequeno e vinte e dois no reator grande. O PEHReator é colocado em um Equipamento Bellco Cell-Production Roller (Bellco Technology, Vineland, NJ), que fornece um mecanismo para a rotação e o reator com os equipamentos de rolagem é abrigado em uma câmara de temperatura controlada, que fornece calor. O vácuo e a pressão podem ser aplicados ao vaso de reação, anexando as fontes externas à porta ligado à lança na tampa.

REATOR DE SACARIFICAÇÃO DE ALIMENTAÇÃO EM BATELADA O reator de sacarifcação de alimentação em batelada é um —fermentador de 15 L (B. Braun Biotech International, Allentown, PA) controlado por uma unidade de controle de dados BioStat ED e módulo de controle associado contendo uma bomba de circulação, bombas de ácido e base, válvulas solenóides, trocadores de calor para o controle de temperatura, fornecimento de

. vapor, água de processo, válvulas de controle de abastecimento de ar e | filtração, válvulas de controle da pressão de retorno e filtros de descarga. O ' fermentador foi equipado com dois rotores de Ligntnin A-310 de alta eficiência | com três lâminas de 11,4 cm de diâmetro. O rotor inferior estava localizado a | 5 7,6cmdo fundo do reator (que não poderia estar localizado mais perto devido à presença de um arranjo de selo grande perto do fundo do eixo para a penetração do eixo direcionado para baixo) e o impulsor superior estava localizado a 22,9 cm a partir do fundo do reator. O vaso do fermentador possui um diâmetro de 19,0 cm e uma altura máxima de 55,9 cm. Quatro defletores removíveis foram instalados, cada qual possui uma largura de 1,6 em e um comprimento de 48,3 centímetros e prolongados a partir do fundo do vaso para dentro de cerca de 7,6 cm do topo. Prumado nas portas superiores e inferiores do sistema de fermentação estava uma alça ao redor da bomba que consistia de uma bomba de lóbulo APV (modelo M1/028/06), 1 % polegada (3,81cm)de mangueiras flexíveis e um indicador de fluxo de Teflon. A bomba ao redor da alça foi isolada do vaso de fermentação com 1 % polegada (3,81 cm) de válvulas de esfera de bola de porta total Valmicro e SVF com corpos CF8M, 316 s.s. e assentos de PTFE. Além disso, uma válvula de cisalhamento de porta V (Triac Controls) estava localizada a jusante da bomba de lobo, antes da válvula de esfera isolar a bomba da porta superior do fermentador. Durante os ciclos de recirculação, esta válvula foi fechada gradativamente até 60º para fornecer maior cisalhamento dos sólidos pré-tratados recirculantes.

MÉTODOS ANALÍTICOS

QUANTIFICAÇÃO DA CELULOSE A quantidade de celulose em cada amostra inicial de biomassa foi determinada utilizando métodos bem conhecidos no estado da técnica, tais como a norma ASTM E1758-01 “Standard method for the determination of

RR

. carbohydrates by HPLC". MEDIDA DO TEOR DE AÇÚCAR, ACETAMIDA, ÁCIDO LÁTICO E ÁCIDO AcÉTICO : Os açúcares solúveis (glicose, celobiose, xilose, galactose, arabinose e manose), ácido acético e de etanol em bebidas de sacarificação ou caldo de fermentação foram medidos por HPLC (Agilent modelo 1100, Agilent Technologies, Palo Alto, CA), utilizando colunas Bio-Rad HPX-87P e Bio-Rad HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com colunas de proteção adequadas.

O pH da amostra foi medido e ajustado para 5-6 com ácido sulfúrico, se necessário.

A amostra foi então passada por um filtro de seringa de 0,2 um diretamente em um frasco de HPLC.

As condições de execução do HPLC foram as seguintes: HPX-87P (para carboidratos): Volume de Injeção: 10 - 50 ul, dependente da concentração e dos limites de detecção.

Fase móvel: água para HPLC, 0,2 um filtrados e degaseificados Taxa de Fluxo: 0,6 mL/min * Temperatura da coluna: 80 — 85º C, temperatura da coluna de proteção <60º C , Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura da coluna principal Detector: índice de refração Tempo de execução: coleta de dados de 35 minutos mais 15 minutos após a execução (com ajuste possível para os compostos de eluição posterior) Biorad Aminex HPX-87H (para carboidratos, ácido acético e etanol) Volume de injeção: 5 a 10 ul, dependente da concentração e dos limitesdedetecção Fase móvel: 0,01 N de ácido sulfúrico, 0,2 um filtrados e degaseificados Taxa de fluxo: 0,6 mL/min

. — Temperatura da coluna: 55º C | Temperatura do detector: o mais próximo possível da temperatura ' da coluna Detector: índice de refração Tempo de execução: coleta de dados de 25 a 75 minutos Após a execução, as concentrações na amostra foram determinadas a partir das curvas padrão para cada um dos compostos. EXEMPLO 1 PRÉ-TRATAMENTO DA ESPIGA NO REATOR DE TAMBOR PEQUENO COM PISTÃO As espigas de milho inteiras foram processadas com um triturador (motor de 2,2 kW), com um espaçador do mordente de cerca de 0,95 cm, seguido por um desagrupador (delumper) (motor de 1,5 kW, | Franklin Miller Inc., Livingston, NJ), seguido por triagem com uma tela | Sweco equipada com uma tela de 1,9 centímetros padrão US para fraturar a espigainteira em pedaços menores. O reator de tambor pequeno com pistão (descrito no Método Geral) foi carregado com 115 g (base em peso seco) de espigas fraturadas, ao colocar manualmente as espigas na extremidade do reator com o pistão removido. O pistão foi recolocado para fechar a extremidade. Um vácuo foi aplicado ao corpo do reator para trazer a pressão doreatora<10kPa (0,1 bar) e a solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada para fornecer uma concentração de amônia ou de 4 g ou 6 g por 100 g de peso seco de biomassa (conforme apresentado na Tabela 1) e um peso seco da concentração de biomassa de 50 g por 100 g de mistura de biomassa e amônia aquosa total. Após a solução de amônia ser carregada, o vapor foi injetado para trazer a temperatura para 145º C dentro do reator. A biomassa foi mantida na temperatura por 20 minutos e depois descarregada no tanque de expansão ativando o pistão. Durante o pré- tratamento de 20 minutos, a temperatura foi monitorada e o vapor foi

RR

R adicionado conforme necessário para manter a temperatura. As espigas pré- tratadas foram colhidas através do fundo do tanque de expansão. O excesso ' de líquido livre foi removido e os demais sólidos foram utilizados na sacarificação.

Para a sacarificação, cerca de 470 g de biomassa pré-tratada foi adicionada ao reator PEHR de 3,2 L descrito nos Métodos Gerais. O pH dos conteúdos foi ajustado para cerca de 5,5 ao injetar tampão de ácido cítrico de 1 M em pH 4,8 adicionando ainda o monoidrato de ácido cítrico. Uma vez que o pH desejado foi obtido, 12,9 mg/g de celulose ou de 25,8 mg/g de celulose de celulase Spezymeº CP (Genencor International, Rochester, NY) e 4,2 mg de proteína ativa/ g celulose ou 8,4 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima hemicelulase (Diversa, San Diego, CA), que consiste em B- glicosidase, xilanase, B-xilosidase e arabinofuranosidase foram carregados no reator. O tampão, as enzimas e a água foram adicionados tal que a mistura final no reator consistiu em 23 g de biomassa seca/ 100 g da mistura de biomassa pré-tratada — consórcio de enzima de sacarificação. O reator permaneceu em uma incubadora a 50º C circulando a 19 rpm, durante 72 horas. Os rendimentos apresentados na Tabela 1 abaixo são a liberação como uma porcentagem do rendimento teórico. ; TABELA1 RENDIMENTOS SEGUINTES À SACARIFICAÇÃO DA ESPIGA PRÉ-TRATADA NO REATOR

DE TAMBOR PEQUENO COM PISTÃO (g/ 100g | CP (mg/ g | de enzima | de de glicose | de de xilose de de (Diversa) monômero | total (% | monômero | total (% DWB) celulose) |(mg/ g de | de glicose | teórica) de xilose | teórica) celulose) | (% teórica) (% teórica) 4 fase 8 Bo o so je | [6 des faro js ro as jr |

. EXEMPLO 2 PRÉ-TRATAMENTO NO REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO EM MOMENTOS ' DIFERENTES O vapor foi adicionado à camisa do tambor para pré-aquecer o — tambor do reator de tambor grande com pistão (descrito nos Métodos Gerais) a cerca de 130º C.

O receptor de expansão foi pré-aquecido a cerca de 60º C com aquecedores de banda.

As espigas fraturadas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. Estas espigas (175 g, base no peso seco) foram carregadas no reator de tambor grande, ao colocar manualmente as espigas no final do reator com o pistão removido.

O pistão foi recolocado para fechar a extremidade.

Um vácuo foi aplicado ao vaso do reator e ao receptor de expansão para baixar a pressão a < 10 kPa, e a solução diluída de hidróxido de amônio foi injetada no reator para fornecer uma concentração de amônia de 6 9/ 100 g em peso seco de biomassa e um peso seco da concentração de biomassa de 45 9g/ 100 g de mistura de biomassa total e amônia aquosa.

Uma vez que a amônia foi carregada, o vapor foi injetado no reator para trazer a temperatura a 145º C.-A mistura foi mantida nesta temperatura por 10 ou 20 minutos pela monitoração da temperatura e a adição de vapor, se necessário, e depois descarregada no tanque de expansão pré-aquecido pela ativação do pistão.

O vácuo foi retirado do tanque de expansão até que o receptor de expansão atingir cerca de 59º C.

Três pré-tratamentos de 10 minutos e seis pré-tratamentos de 20 minutos foram realizados, com todo o material pré- tratado pelo mesmo período de tempo agrupado no final.

Após a coleta a partir do receptor de expansão, o líquido livre foi separado dos sólidos pré-tratados e —não foi adicionado de volta para a sacarificação.

Uma amostra da espiga pré- tratada foi posteriormente sacarificada conforme descrito no Exemplo 1 no PEHReator pequeno.

Todas as sacarificações foram feitas com 12,9 mg/g de celulose de celulase Spezymeº CP e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do Ol lo A i

. consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa) contendo xilanase, B- xilosidase, arabinofuranosidase e B-glicosidase em 50º C e pH 5,5 por 72 h. Os ' rendimentos apresentados na Tabela 2 abaixo são a liberação como porcentagem do rendimento teórico. TABELA 2 RENDIMENTOS SEGUINTE À SACARIFICAÇÃO DA ESPIGA PRÉ-TRATADA NO REATOR

DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO Tempo de | Liberação do | Liberação da | Liberação do | Liberação da pré- monômero glicose total | monômero xilose total tratamento jde glicose |(% teórica) de xilose (% | (% teórica) (min) (% teórica) teórica) EXEMPLO 3 PRÉ-TRATAMENTO EM REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO EM COMPARAÇÃO — — COMA PISTOLADE VAPOR As espigas de tamanho reduzido foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. O pré-tratamento no reator de tambor grande com pistão foi realizado conforme descrito no Exemplo 2. Para o pré-tratamento na pistola de vapor, as espigas foram primeiro carregadas em um PEHReator de | 15 9L O reator foi resfriado a 4º C por rotação em contato com o gelo na superfície externa. Um vácuo foi aplicado no vaso e uma solução diluída de hidróxido de amônio, que foi pré-resfriada em câmara fria a 4º C e passada | através de tubos imersos em um banho de gelo, foi injetada para fornecer | uma concentração de amônia de 6 g/ 100 g em peso seco de biomassa e de | 20 um peso seco da concentração de biomassa de 45 g/ 100 g de mistura de | biomassa total — amônia aquosa. O PEHReator carregado com amônia e | espiga foi resfriado a 4º C pela aplicação de gelo na superfície do vaso do

EEE

. reator rotativo e girado a 4º C por 30 min. Neste momento, o conteúdo foi | transferido para o reator de pistola de vapor que é descrito nos Métodos | ' Gerais. Uma vez que o reator de pistola de vapor foi carregado com a mistura de amônia-espiga, a temperatura foi aumentada para 145º C por injeção diretade vapor. A mistura de espiga - amônia foi mantida nesta temperatura | por 20 min, e em seguida, a mistura foi descarregada em um tanque de expansão. | As amostras de espigas pré-tratadas foram obtidas, tanto do | reator de tambor grande com pistão e reator de pistola de vapor, e sacarificadas conforme descrito no Exemplo 1. As sacarificações foram realizadas com 12,9 mg/g de celulose de celulase Spezymeº CP (Genencor) e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa), que consiste em B-glicosidase, xilanase, B-xilosidase e arabinofuranosidase. O reator permaneceu na incubadora a 50º C e 19 rpm, durante 72 horas. Os rendimentos resultantes de glicose para o pré-tratamento em cada reator são apresentados na Tabela 3 abaixo. TABELA 3 RENDIMENTOS SEGUINTE À SACARIFICAÇÃO DAS ESPIGAS PRÉ-TRATADAS EM

REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO OU PISTOLA DE VAPOR Reator de | Conc Tempo de | Temperatura | Liberação Liberação Liberação Liberação pré- de DWB | pré- de pré- | do da glicose | do da xilose tratamento | no tratamento | tratamento monômero | total (% | monômero total (% reator (min) (o) de glicose | teórica) de xilose (% | teórica) (% teórica) teórica) Reator com | 50% 20 145 68,0 83,2 pistão Pistola de | 60% 40 77 48 e vapor '

. EXEMPLO 4 PRÉ-TRATAMENTO DA ESPIGA DE MILHO E AS MISTURAS DE FIBRAS NO REATOR DE ' TAMBOR GRANDE COM PISTÃO As espigas de milho fraturadas foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1. As espigas fraturadas apenas e as espigas fraturadas misturadas com Cargill! Bran 80 (Cargill, Minnetonka, MN) foram pré-tratadas no reator de tambor grande com pistão.

As espigas fraturadas e a fibra de milho Cargill Bran 80 foram combinadas de tal forma que a fibra era de cerca de 33% da biomassa seca total da amostra misturada.

Em cada caso, 175 g (base de peso seco) de matéria-prima foram adicionados ao reator.

O pré-tratamento foi realizado essencialmente conforme descrito no Exemplo 2. No entanto, nesses experimentos, após a adição da solução de amônia, o conteúdo do reator foi mantido por 10 minutos antes da injeção de vapor para trazer a temperatura a 145º C.

Após a injeção de vapor, a temperatura foi mantida durante 10 minutos a 145º C pela adição de vapor quando necessário.

Após o pré-tratamento, a amostra foi descarregada em um tanque de expansão com a ativação do pistão.

As amostras do milho pré-tratado e a mistura de fibra de espiga foram obtidas a partir do tanque de expansão do reator de tambor grande com pistão e sacarificadas em PEHReatores pequenos, conforme descrito no Exemplo 1. A biomassa foi adicionada de forma que 20% do volume do reator foram preenchidos.

As sacarificações foram realizadas com 12,9 mg/g de celulose de celulase Spezymeº CP (Genencor) e 15 mg/ g de celulose de xilanase Multifect (Genencor) Os PEHReatores permaneceram na incubadora a 50º C e 19 rpm, por 72 horas.

Os rendimentos de glicose e xilose resultantes para o pré-tratamento são apresentados na Tabela 4 abaixo. '

. TABELA 4 RENDIMENTOS SEGUINTE À SACARIFICAÇÃO DA ESPIGA E AMOSTRAS DE ESPIGA/ ' FARELO PRÉ-TRATADOS NO REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO Matéria- Conc Liberação Liberação Liberação Liberação prima de do da glicoseido da xilose DWB monômero | total (% | monômero | total (% no de glicose teórica) de xilose (% | teórica) reator | (% teórica) teórica) espiga farelo 80 Ú EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE ETANOL A PARTIR DAS ESPIGAS DE MILHO PRÉ-TRATADAS NO

REATOR DE TAMBOR GRANDE COM PISTÃO O pré-tratamento das espigas de milho foi realizado por 10 minutos, conforme descrito no Exemplo 2. Um total de 17 de tais pré- tratamentos foi realizado. As espigas pré-tratadas a partir de 4 pré-tratamentos foram agrupadas para a sacarificação para fornecer o hidrolisado inicial para a | sacarificação em batelada. As espigas pré-tratadas dos 13 testes restantes | foram agrupadas para a utilização na sacarificação de alimentação em | batelada. | Para iniciar a sacarificação de alimentação em batelada, o reator de sacarificação de alimentação em batelada descrito nos Métodos Gerais foi primeiro carregado com o hidrolisado para preencher o volume do reator até o | fundo do primeiro rotor. Este hidrolisado foi preparado por sacarificação das | espigas pré-tratadas em frascos de agitação de 2,8 L. Estes frascos de | agitação foram carregados com 465 g de sólidos pré-tratados, 1.000 mL de

RR

. água Dl, e enzimas a 28,4 mg de celulose Spezymeº CP/g e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa) ' compreendendo B-glicosidase, xilanase, B-xilosidase e arabinofuranosidase.

Antes da adição da enzima, o pH foi ajustado para 5 com H3PO, a 8,5%. Os frascos de agitação foram mantidos a 50º C e 150 rom em um agitador rotativo por 48 horas, no momento em que o hidrolisado foi carregado no reator de alimentação em batelada.

Uma vez que o hidrolisado inicial foi carregado, a primeira alíquota da mistura de biomassa -— amônia pré-tratada (cerca de 700 9) foi adicionada ao reator.

O pH foi mantido em um valor nominal de 5,5 pela adição de H3;PO, a 8,5%. Uma vez que o pH reajustado para o ponto de ajuste, 28,4 mg de Spezymeº CP/ g de celulose e 4,2 mg de proteína ativa/ g de celulose do consórcio de enzima de hemicelulase (Diversa) compreendendo B- glicosidase, xilanase, B-xilosidase e arabinofuranosidase foram adicionados. —Alíquotas adicionais da mistura de biomassa — amônia pré-tratada, celulase Spezyme? CP e consórcio de enzima de hemicelulase foram adicionados a t = 4, 8,12, 22, 26, 30 e 34 horas.

A bomba ao redor do laço foi, em geral, iniciada cerca de 1 hora após a adição das enzimas e foi executada por cerca de 1 h | até 22 h da adição dos sólidos.

Após 26 h e 30 h das adições, a bomba foi iniciada cerca de 50 minutos após a adição de enzimas e executada por 30 minutos.

Após 34 h da adição, a bomba foi iniciada em cerca de 3 horas após a adição de enzima e executada por 30 minutos.

A bomba também foi executada por 30 minutos em t = 29, 33, 47 e 49 horas.

O tempo de sacarificação total foi de 120 horas.

Neste momento, o hidrolisado continha cerca de 60 g/L de —monômero de glicose, 25 g/L de monômero de xilose e 10 g/L de ácido acético.

Este hidrólisado foi utilizado para a fermentação da Zymomonas mobilis cepas ZW800 ou ZW658 (ATCC * PTA-7858). ZW658 é uma cepa de Zymomonas mobilis que foi modificada para a fermentação de xilose em etanol ERRRE————————

. e é descrita no pedido de patente de co-propriedade e provisório US 60/847813. O ZW658 foi construído através da integração de dois operons, ' PgaapXylAB e Praptaltkt, contendo quatro genes que utilizam xilose codificando a | xilose isomerase, xiluloquinase, transaldolase e transcetolase, no genoma de ZW1 (ATCC É 31821) através de eventos de transposição sequencial, e seguido pela adaptação em meio seletivo contendo xilose.

ZW800 é a cepa ZW658 com o gene que codifica a glicose-frutose oxidorredutase inativada, que é também descrita no pedido de patente de co-propriedade e provisório US 60/847813. As fermentações foram realizadas em fermentadores de 1 L esterilizados (sistema Biostatº B-DCU, Sartorius BBI System Inc., Bethlehem, Pensilvânia, USA.), com volume de trabalho inicial de 500 mL.

O inóculo foi adicionado ao fermentador em um nível de 10% (v/v) tal que o ODgo, era de cerca de 1 no caldo após a adição.

O hidrolisado estava presente em 80% ou 40% (vv), com o balanço em água.

A glicose e xilose adicionais foram adicionadas para trazer as concentrações finais no caldo a 92 g/L e 82 g/L, respectivamente.

O caldo de carne também foi suplementado com 10 mM de sorbitol e 1 g/L de MgSO4.7H2O.

A fermentação foi realizada por 72 horas a 33º C, pH 5,8, com agitação de 150 rpm.

Os títulos de etanol final para a cepa —ZWB800 foram de 8 g/L em 40% do hidrolisado e 7 g/L em 80% do hidrolisado.

Para ZW658, os títulos de etanol final eram de 8 g/L em 40% do hidrolisado e 6,5 g/L em 80% do hidrolisado.

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Claims (21)

RE A RE AA E tt tt DEE A E ADE RR RR E EEE E EEE EEREEERE3E E EEE oiii o | 1 | | . REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA BIOMASSA, que : compreende: ' (a) fornecer a biomassa (11); (b) carregar a biomassa (11) do passo (a) utilizando um alimentador não compacto em um equipamento que compreende: ()) um tambor cilíndrico que possui uma primeira extremidade (33) equipada com um pistão (34) e uma segunda extremidade (41) equipada com uma válvula de descarga (17, 40); (ii) opcionalmente, uma compensação (31) ligada em uma extremidade da compensação no tambor cilíndrico próxima à primeira extremidade (33) do tambor cilíndrico e possuindo uma válvula de vedação na extremidade da compensação não ligada; (iii) pelo menos 2 portas de vedação no tambor cilíndrico ou nacompensação; (iv) opcionalmente, uma válvula no tambor cilíndrico dividindo o tambor em uma primeira (32) e segunda câmara (39) separada, dita primeira câmara (32) possui a primeira extremidade (33) do tambor equipada com dito pistão (34), e dita segunda câmara (39) possui a segunda extremidade do tambor com a válvula de descarga (40); e (v) um tanque de expansão ligado à válvula de descarga (40) na segunda extremidade (41) do tambor; caracterizado pelo fato de que a dita biomassa (11) é carregada no tambor cilíndrico ou, opcionalmente, em dita compensação ligada a dito tambor cilíndrico, e pelo fato do método compreender adicionalmente os passos de: (c) fechar dito tambor cilíndrico e compensação, se houver; (d) aplicar, opcionalmente, vácuo através de pelo menos uma c"DP ... .. sas. uUPVP -R EEEF A A

. porta no tambor cilíndrico; (e) adicionar através de pelo menos uma porta (13, 14, 15) no Í tambor cilíndrico ou compensação uma solução aquosa que compreende a amônia em uma quantidade inferior a 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa (11) no tambor, criando uma mistura de biomassa (11) e amônia aquosa e em que o peso seco da biomassa (11) está em uma alta concentração de sólidos de pelo menos 15% em peso em relação ao peso da mistura da biomassa (11) e da amônia aquosa, e adicionar vapor através de dita segunda porta (14) no tambor cilíndrico ou compensação, se houver, para atingir uma temperatura dentro do tambor entre 85º C e 180º C; (f) fechar as portas no tambor cilíndrico e compensação, se | houver, para fornecer uma câmara impermeável; | (g) manter a mistura de biomassa (11) e amônia aquosa na câmara impermeável na temperatura adequada por um período de tempo entre 30 segundos e 4 horas; ' | (h) opcionalmente, mover a mistura de biomassa (11) e amônia aquosa para uma segunda câmara (39) no tambor cilíndrico, se houver, pelo deslocamento com dito pistão (34), em que a biomassa (11) não é compactada, e mantê-la por um tempo entre 2 minutos e 4 horas; e (i) mover a mistura de biomassa (11) amônia aquosa com o dito pistão (34) através do tambor cilíndrico impermeável do passo (g) ou (h) através da válvula de descarga (40) para dentro do tanque de expansão, no qual a biomassa (11) tratada é produzida.

2. MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA BIOMASSA, que compreende: ' (a) fornecer uma mistura de biomassa (11) e uma solução aquosa que compreende amônia, em que o peso seco da biomassa (11) é de pelo menos 15% em peso em relação ao peso total da mistura de biomassa (11) e RR .

B ; . amônia aquosa, e a amônia aquosa está em uma quantidade que é inferior a cerca de 12% em peso em relação ao peso seco da biomassa; | ' (b) carregar a mistura de biomassa (11) e amônia aquosa do | passo (a) utilizando um alimentador não compacto em um equipamento que | 5 compreende: | (6) um tambor cilíndrico que possui uma primeira | extremidade equipada com um pistão (34) e uma segunda extremidade equipada com uma válvula de descarga (17, 40); (li) opcionalmente, uma compensação ligada em uma extremidade da compensação no tambor cilíndrico próximo à primeira extremidade do tambor cilíndrico e possuindo uma válvula de vedação na extremidade da compensação não ligada; (iii) pelo menos 2 portas de vedação no tambor cilíndrico ou na compensação; (iv) uma válvula no tambor cilíndrico dividindo o tambor em uma primeira e segunda câmara (39) separada, dita primeira câmara (32) possui a primeira extremidade do tambor equipada com dito pistão (34), e dita segunda câmara (39) possui a segunda extremidade do tambor com a válvula de descarga (17, 40) e (v) um tanque de expansão ligado à válvula de descarga (17, 40) na segunda extremidade do tambor; caracterizado pelo fato de que dita biomassa (11) é carregada na primeira câmara (32) do tambor cilíndrico ou, opcionalmente, em dita compensação ligada a dito tambor cilíndrico, e pelo fato do método compreender adicionalmente os passos de: (c) fechar dita primeira câmara (32) no tambor cilíndrico e na compensação, se houver; (d) aplicar, opcionalmente, vácuo através de pelo menos uma

RN

. porta; (e) adicionar através de pelo menos uma porta na primeira : câmara (32) ou compensação, se presente, vapor para atingir uma temperatura dentro da câmara entre 85º C e 180º C; (f) fechar as portas na primeira câmara (32) e compensação, se ! houver, para fornecer uma câmara impermeável; | (9) manter a mistura de biomassa (11) e amônia aquosa na | primeira câmara impermeável na temperatura adequada por um período de tempo entre 30 segundos e 4 horas; (h) opcionalmente, mover a mistura de biomassa (11) e amônia aquosa através de uma válvula aberta para a segunda câmara (39) do tambor cilíndrico pelo deslocamento com um pistão (34), pela primeira câmara impermeável, em que a biomassa (11) não é compactada; (1) opcionalmente, fechar a válvula aberta para formar uma — segunda câmara impermeável e manter mistura de biomassa (11) e amônia aquosa por um período de tempo entre 2 minutos e 4 horas; e ()) mover a mistura de biomassa (11) amônia aquosa pelo deslocamento com um pistão (34) depois da etapa (g) ou etapa (i) através da válvula de descarga (17, 40) para dentro do tanque de expansão; em que a biomassa (11) tratada não é compactada e no qual a biomassa (11) tratada é produzida. '

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais etapas (a), (b), (oc), (d), (e), (f), (g) e (h) são repetidas pelo menos uma vez antes de (i).

4, MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma ou mais etapas (a), (b), (c), (d), (e), (fN), (g), (h) e (1) são repetidas pelo menos uma vez antes de ()).

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, EE o

. caracterizado pelo fato de que nenhuma etapa de descompactação está incluída. ' 6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a amônia aquosa está entre 4% e 6% com 5 —relaçãoao peso seco da biomassa (11).

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peso seco da biomassa (11) é de pelo menos 20% com relação ao peso da criação da mistura de biomassa (11) e amônia | aquosa. |

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o peso seco da biomassa (11) é de pelo menos 30% com relação ao peso da criação da mistura de biomassa (11) e amônia aquosa.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peso seco da biomassa (11) é de pelo menos 50% com relação ao peso da criação da mistura de biomassa (11) e amônia aquosa.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a temperatura apropriada está entre 120º C e 160º C.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fatode que a temperatura apropriada está entre 140º C e 150º C.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o alimentador não compactante de (b) é um distribuidor equipado com um indutor de fluxo não compactante.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a primeira câmara (32) cilíndrica é fechada com pelo menos uma válvula.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a primeira câmara (32) cilíndrica é fechada com uma primeira Mme É

. válvula para fechar o alimentador não compactante e uma segunda válvula para fechar a segunda câmara de (h). ' 15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a válvula de descarga (17, 40) é um Venturi de expansão gradual.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita biomassa (11) é selecionada a partir do grupo que consiste em grama do gênero Panicum, resíduos de papéis, lodo da fabricação de papel, grãos de milho, espigas de milho, cascas de milho, fibra de milho, forragem de milho, gramas, trigo, palha de trigo, feno, cevada, palha de cevada, palha de arroz, bagaço da cana de açúcar, sorgo, Soja, componentes obtidos a partir do processamento de grãos, árvores, galhos, raízes, folhas, aparas de madeira, serragem, arbusto e moitas, vegetais, frutas, flores e esterco de animal.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a biomassa (11) é selecionada a partir do grupo que consiste em espigas de milho, forragem de milho, fibras de milho, cascas de milho, bagaço da cana de açúcar, serragem, grama do gênero Panicum, palha de trigo, feno, palha de arroz e gramas.

18. "MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a biomassa (11) é selecionada a partir do grupo que consiste | em espigas de milho, forragem de milho, fibras de milho, serragem e bagaço da | cana de açúcar.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, | 25 caracterizado pelo fato de que dita biomassa (11) é derivada de múltiplas matérias-primas. '

20. BIOMASSA TRATADA, caracterizada pelo fato de ser produzida a partir do método tal como definido em qualquer uma das Re

. reivindicações 1 ou 2. -

21. —"HIDROLISADO, caracterizado pelo fato de ser produzido ' por sacarificação da biomassa (11) tratada, produzida pelos métodos conforme descritos nas reivindicações 1 ou 2. |