BRPI0815761B1

BRPI0815761B1 - Transportador celular contendo colágeno

Info

Publication number: BRPI0815761B1
Application number: BRPI0815761-8A
Authority: BR
Inventors: Lothar Just; Timo Schmidt; Franz Maser
Original assignee: Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2022-04-12
Also published as: JP5638950B2; DE102007040370B4; IL203762A0; RU2511426C2; ES2710280T3; RU2010109992A; WO2009024280A2; ES2597434T3; KR101685751B1; IL203762A; TWI432571B; RU2577974C2; DK2185684T3; IL230453A; HRP20161252T1; KR20130100212A; EP2185684B1; CA2842980A1; PL2185684T3; CA2696580A1

Abstract

TRANSPORTADOR CELULAR CONTENDO COLÁGENO. A presente invenção refere-se ao uso de uma composição contendo colágeno para o cultivo de células biológicas, um método para o cultivo de células biológicas, um método para o implante de material biológico em um organismo e um método para o aprimoramento de uma composição em sua adequação para o cultivo de células biológicas.

Description

A presente invenção refere-se ao uso de uma composição contendo colágeno para o cultivo de células biológicas, um método para o cultivo de células biológicas, um método para o implante de material biológico em um organismo e um método para o aprimoramento de uma composição em sua adequação para o cultivo de células biológicas.

Transportadores para o cultivo de células biológicas são conhecidos de maneira geral pelos especialistas na área. Esses transportadores são normalmente chamados de matrizes ou esqueletos (scaffolds). Os transportadores proporcionam a base de cultura ou, em geral, a base na qual as células crescem na cultura celular. Compostos contendo colágeno representam o tipo mais conhecido de transportadores celulares. O colágeno, sendo uma proteína animal da matriz extracelular, pertence às escleroproteínas, geralmente é insolúvel em água e possui estrutura fibrosa. É um dos componentes principais da estrutura de tecidos conectivos, tais como a pele, os vasos sanguíneos, ligamentos, tendões e cartilagem, e da estrutura de ossos e dentes. Por causa de suas propriedades, biomateriais baseados em colágeno de origem animal têm sido usados na medicina há muitos anos. Especialmente nos produtos para hemostase de aplicação clínica, como substituto da dura mater, ou em diferentes áreas da cirurgia plástica, os colágenos foram capazes de se estabelecer como material transportador. Esses colágenos, dos quais 28 tipos diferentes foram identificados e pelo menos 10 proteínas adicionais com domínios semelhantes ao colágeno foram registradas, apresentam apenas uma diferença marginal com relação as espécies individuais. Como não se descobriu um padrão distinto para identificação e sua degradação baseada em enzima não produz nenhum produto de degradação tóxico, os colágenos são considerados biocompatíveis.

As matrizes de colágeno oferecidas no mercado até o momento apresentam uma variação muito grande no que diz respeito a suas propriedades. Assim, descobriu-se que, quando usadas in vitro, algumas das matrizes de colágeno usadas para cultivo de células biológicas causam reações inflamatórias em processos de metabolismo metabólico. Outra desvantagem das matrizes de colágeno atualmente disponíveis é que são muito espessas - geralmente excedendo 200 μm - e não podem, portanto, ser examinadas sob o microscópio. Além disso, as matrizes de colágeno oferecidas para cultivo de células biológicas mostram-se, até agora, muito caras.

Um transportador alternativo para o cultivo de células são os chamados hidrogeis. Um hidrogel é um polímero que contem água mas é insolúvel nesta, e cujas moléculas são quimicamente (ou seja, através de ligações covalentes ou iônicas) ou fisicamente (por meio de interligação das cadeias poliméricas) ligadas para produzir uma rede tridimensional. Devido aos componentes hidrofílicos que integram o polímero, eles se expandem na água por meio de uma absorção considerável de volume, sem perder a coesão do material. No entanto, a desvantagem dos hidrogeis é que, dada sua enorme capacidade de retenção de água, são mecanicamente instáveis.

Além disso, os hidrogeis geralmente se condensam durante a colonização com células. Assim, o uso dos hidrogeis é muito limitado.

O chamado ácido hialurônico representa outra célula adequada para a colonização com células biológicas. A matriz consiste em macromoléculas da matriz de cartilagem. Por isso, na forma não modificada, apresenta alta biocompatibilidade. As cadeias moleculares precisam ser ligadas de forma a gerar uma estrutura adequada, com resiliência mecânica suficiente. Isso se consegue por meio de esterificação com álcool, que pode causar uma redução na biocompatibilidade.

O chamado alginato representa outro esqueleto. Refere-se a um copolímero obtido a partir da alga marrom, composto por ácido L-gulurônico e ácido D-manurônico. Adicionando-se EDTA e/ou citrato de sódio, o produto pode ser gelatinizado ou liquefeito, o que dá ao alginato propriedades para o cultivo de células semelhantes às já descritas para os geis baseados em colágeno, mas com melhores possibilidades de ressuspensão para análises biológicas celulares e moleculares. Apesar das vantagens sobre outras matrizes transportadoras e das boas propriedades do material in vitro, não obteve sucesso quando usado in vivo. In vivo, a substância é difícil de absorver e causa consideráveis reações imunes e de corpo estranho. Portanto, o alginato ainda não é adequado para uso como material transportador para implantes humanos.

Outro material transportador para células biológicas é a agarose. Seu comportamento é semelhante ao do alginato. A agarose consiste em duas cadeias de sacarídeo e é obtida a partir das paredes celulares de algas vermelhas. Como o alginato, também causa reações imunes e de corpo quando usada in vivo, de modo que a agarose ainda não pode ser usada para implantes humanos.

Outros esqueletos são baseados em fibrina. Ela se refere a uma proteína globular plasmática que, devido à sua capacidade de polimerização em “malha”, dentre outras coisas causa a coagulação do sangue. No entanto, até o momento a fibrina não resistiu ao teste para uso in vivo. O uso da fibrina como transportador celular é amplamente inexplorado e ainda deve ser extensamente avaliado. Além disso, a fibrina é muito cara. ’

Outras matrizes usadas para o cultivo de células biológicas se baseiam em quitina ou quitosana. A quitina forma o material básico para a produção de quitosana. Para isso, os grupos acetil da quitina são química ou enzimaticamente quebrados. Tanto a quitina quanto a quitosana são biopolímeros que não são separados por um cruzamento precisamente definido. Geralmente fala-se em quitosana quando o grau de desacetilação é superior a 40 - 50% e o composto é solúvel em ácidos orgânicos. No entanto, a quitina e a quitosana apresentam aplicabilidade muito limitada e, da mesma forma, ainda não se provaram quando usadas para o cultivo de células. A quitina não é um material produzido dentro do corpo e, portanto, é constantemente um corpo estranho no organismo. O uso da quitina como transportador celular ainda precisa ser fundamentalmente pesquisado.

No momento, existe, vários esqueletos sintéticos em teste. Incluem-se os polímeros de polilactídeo (PLA) e de poliglicolídeos (PGA), assim como ácido poli-L-lático (PPLA), também chamado de “biovidro”. Uma característica especial do PLA e do PGA é sua baixa solubilidade em meio aquoso, que melhora apenas com a degradação da cadeia polimérica, ou seja, hidrólise, em oligômeros ou polímeros de baixo peso molecular, levando à erosão desses materiais. Demonstrou-se, porém, que esses polímeros não são adequados para o cultivo de material biológico. Os polímeros absorvíveis desintegram-se através de hidrólise espontânea e produzem ácidos orgânicos. Os osteoblastos se diferenciam em ambiente ácido, de forma que uma maior quantidade desses polímeros pode causar a destruição óssea, em vez de desenvolver os ossos.

Considerando-se esse histórico, o objetivo subjacente da invenção é fornecer uma nova composição para o cultivo de células biológicas que evite as desvantagens conhecidas dos transportadores celulares da área. Em particular, deve ser fornecida uma composição que possa ser produzida economicamente em grande escala e com alta qualidade constante.

Este objetivo é resolvido pelo uso de uma composição para o cultivo de células biológicas contendo os seguintes parâmetros:

Essa composição já foi comercializada na forma de filme por Naturin GmbH &Co. KG, Badeniastrasse 13, Weinheim. Os números de referência atribuídos a esses filmes pela Naturin são, por exemplo: 400011899, 400023747, 400024203, 400026193, 400019485, 400000084 e 400000109.

Essa descoberta foi surpreendente. Até agora, esse composto foi usado exclusivamente na indústria alimentícia, por exemplo na área de produção de presunto, como filme de separação entre a rede e a carne. Acima de tudo, não se espera que essas composições sejam particularmente adequadas para o cultivo de material biológico.

A composição consoante a invenção pode ser reproduzida em larga escala e apresenta alta qualidade constante. Destaca-se devido à sua boa biocompatibilidade, à espessura muito fina de seu filme, à sua transparência relativamente alta e à sua estabilidade mecânica alta, resultando em uma ampla gama de aplicações.

Além disso, é preferível quando são usados glicerina ou sorbita como poliol, fornecido em uma concentração de 0 a 50% em peso (glicerina) e/ou 0 a 40% em peso (sorbita).

Esta medida tem a vantagem adicionar de usar poliois que foram comprovados como agente umedecedor ou agente de ligação com água, para evitar a secagem, na concentração especificada. De acordo com uma configuração particular, a composição apresenta os seguintes parâmetros:

A concentração de cada ingrediente foi otimizada com este método, de modo que a composição seja aprimorada em sua adequação para o cultivo de células biológicas. Para isso, é preferível que a gordura seja essencialmente um óleo vegetal.

O uso de óleo vegetal para preservar a composição consoante a invenção mostrou- se particularmente vantajoso. Devido à maior elasticidade, o óleo vegetal claramente amplia a gama de aplicações da composição. O uso de óleos vegetais também pode evitar o ranço, facilitando assim a fabricação e o armazenamento da composição. Fica claro que uma quantidade mínima de gordura animal residual não prejudica as vantagens do óleo vegetal.

De acordo com uma configuração particularmente preferível, o valor do pH da composição consoante a invenção é de aprox. 5,0 a 8,0, preferivelmente 6,8 a 8,0, 5 mais preferivelmente 7,0 a 8,0, com preferência máxima por aprox. 7,2 a 7,5.

Os inventores descobriram que o cultivo de células biológicas é particularmente bem-sucedido nos valores de pH especificados. Assim, a composição apresenta um valor de pH dentro da área fisiológica e, portanto, oferece um ambiente que lembra muito o ambiente das células biológicas. As composições disponíveis 10 comercialmente de, por exemplo, Naturin GmbH & Co. KG, geralmente apresentam um valor de RH de aprox. 4,8. Nesses ambientes ácidos, por exemplo, o cultivo de material biológico sensível a ácidos não é possível. O valor de pH desejado pode ser ajustado pela incubação da composição em, por exemplo, tampões de fosfato contendo cálcio ou magnésio, embora outros tampões tradicionais conhecidos pelos 15 especialistas também sejam igualmente adequados.

Considerando-se esse histórico, outro objeto da presente invenção também se refere a um método para aprimorar uma composição com os seguintes parâmetros:

Resistência à tensão [N/mm2]: aprox. 0,5 a 100 ou 20 a 100, em sua adequação para o cultivo de células biológicas, que inclui as seguintes etapas: (1) Fornecimento da composição, e (2) Ajuste do valor do pH para aprox. 5,0 a 8,0, preferivelmente para 6,8 a 8,0, mais preferivelmente para 7,0 a 7,8, com preferência máxima por aprox. 7,2 a 7,5.

Graças a este “método e otimização”, filmes disponíveis comercialmente como, por exemplo, os oferecidos pela Naturin GmbH & Co. KG, demonstram uma adequação claramente maior para o uso como transportadores de culturas celulares. A etapa (2) é preferivelmente realizada na forma de uma incubação da composição em uma solução tampão com valor de pH de aprox. 7,2 a 7,5.

O método de otimização compreende preferencialmente uma etapa adicional (3), durante a qual a composição é incubada com substâncias altamente solúveis em gordura.

Esta medida tem a vantagem adicional de que, por exemplo, substâncias solúveis em gorduras são extraídas usando-se acetona a 100%. A qualidade da composição para o cultivo de materiais biológicos pode, assim, ser mais aprimorada.

Além disso, durante o método de otimização consoante a invenção, é preferível que a etapa (3) inclua uma etapa (3.1), durante a qual a composição é lavada na solução tampão.

Durante esta etapa (3.1), as substâncias altamente solúveis em gordura restantes e, se necessário, outros resíduos contaminantes, são removidas, de modo que a membrana esteja pronta para uso ou possa ser adicionalmente processada ou tratada.

Preferivelmente, o método de otimização consoante a invenção compreende ainda uma etapa adicional (4), durante a qual ocorre a secagem da composição.

Esta medida tem a vantagem de servir para obter um produto de manuseio simples e que pode ser armazenado quase que indefinidamente. Seguindo uma configuração preferível, a composição consoante a invenção é configurada na forma de filme plano.

Graças a esta medida, a composição é fornecida em uma forma particularmente adequada para aplicações de cultivo celular e implantação de material biológico em um organismo. A composição consoante a invenção, configurada como filme, pode ser facilmente cortada ou prensada em qualquer forma ou tamanho.

Considerando-se esse histórico, a composição é preferencialmente configurada como transportadora ou matriz ou “esqueleto”, respectivamente, para aplicações de cultivo celular ou como transportador para a implantação de material biológico em um organismo, preferencialmente de células-tronco ou precursoras ou tecidos celulares específicos. Devido à sua biocompatibilidade e suas propriedades de aderência-suporte, pode ser usada para imobilizar células. Isso pode ter grande relevância no campo da medicina regenerativa, por exemplo no desenvolvimento de cultura celulares para ligamentos, tendões, ossos e cartilagens. Pode ser usada, também, para outros tecidos. Portanto, é adequada também para uso como curativo em ferimentos. Adicionalmente, a composição pode ser usada, por exemplo, no campo cosmético como tratamento para a pele. Além disso, devido à composição química dos colágenos, é especialmente útil para interligar componentes que afetam as células, como por exemplo os fatores de crescimento.

Uma vantagem particular é o fato de que o filme plano consoante a invenção adere a superfícies sintéticas planas depois de seco sem qualquer ajuda extra. Como resultado, o filme, por exemplo com a superfície plástica da cultura celular, produz uma unidade livre de bolhas que se mantém intacta mesmo durante o cultivo de células com poucas cepas. Assim, os auxiliares para colagem e fixação das células na cultura celular podem ser eliminados. Para aplicações específicas, contudo, essa ligação pode ser dissolvida usando-se ferramentas mecânicas, como por exemplo pinças, sem causar danos e o filme pode ser removido da placa de cultura celular juntamente com as células que nele crescem. Alternativamente, a composição consoante a invenção é configurada como um revestimento tubular.

Esta configuração é particularmente adequada para uso como reservatório para células e substâncias, para testes de implante.

Em condições secas, o filme plano ou o revestimento tubular consoante a invenção compreende uma espessura de aproximadamente 5 a 200 μm, preferivelmente de 10 a 100 μm, mais preferivelmente de 15 a 30 μm, mais preferivelmente aprox. 20 μm, com preferência máxima por aproximadamente 15 μm.

Esta medida tem a vantagem de fornecer um filme ou revestimento fino particularmente transparente e que pode também ser examinado sob o microscópio. Este não é o caso dos transportadores celulares à base de colágeno conhecidos hoje na tecnologia da área. De acordo com a invenção, a espessura é determinada em condição seca. O termo “seco”, aqui, é equivalente a seco ao ar, de forma que permaneça uma umidade residual absoluta de cerca de 10 a 15%.

De acordo com um desenvolvimento preferível, a composição é esterilizada por radiação, que é preferivelmente realizada por meio de radiação ionizante ou, mais preferivelmente, por meio de radiação beta e/ou gama.

Esta medida apresenta a vantagem de que os organismos contaminantes são eliminados e as contaminações do material biológico a ser cultivado são amplamente evitadas. O método de esterilização com radiação oferece a vantagem de que o colágeno, sensível ao calor, não é danificado.

Considerando-se este histórico, o método de otimização consoante a invenção compreende a etapa adicional (5), durante a qual ocorre a esterilização do composto por radiação.

Além disso, é preferível que a composição consoante a invenção seja também fornecida com corante, preferivelmente um corante que absorva fluorescência.

Para os fins de diagnóstico in vitro, a composição pode ter diferentes cores. No processo, as células com coloração fluorescente que penetraram através do filme podem ser estabelecidas durante os chamados testes de penetração para testes farmacológicos, fisiológicos ou celulares-biológicos porque, por exemplo, uma cor que absorva a fluorescência da coloração cobre as células fluorescentes que não penetraram. Assim, apenas as células que penetraram brilham durante o teste microscópico de fluorescência.

Outro objeto da presente invenção é um método para o cultivo de material biológico, usando as seguintes etapas: (1) Fornecimento de uma composição adequada para uso como transportador para material biológico, (2) Contato do material biológico com a composição, e (3) Incubação da composição com material biológico sob condições de cultivo, onde a composição supramencionada em conexão com a aplicação consoante a invenção descrita é usada como composição.

Outro objeto da presente invenção refere-se a um método para o implante de material biológico em um organismo, compreendendo as seguintes etapas: (1) Fornecimento de uma composição adequada para uso como transportador para material biológico, (2) Contato do material biológico com a composição, e (3) Introdução do material biológico em contato com a composição em urn organismo, onde a composição supramencionada em conexão com a aplicação consoante a invenção descrita é usada como composição.

Outro objeto da presente invenção refere-se ao uso da composição consoante a invenção para a determinação do potencial de invasão e metástase de células tumorais.

Métodos comuns para teste in vitro para o potencial de invasão e metástase de células tumorais se baseiam nos seguintes princípios: a capacidade de penetração de células tumorais é medida através de um filme sintético perfurado e não degradável. Em testes in vitro, este sistema, por exemplo, serve para medir o efeito de produtos farmacêuticos anticarcinogênicos sobre a capacidade de penetração das células. A invasividade de uma célula tumoral, no entanto, não depende apenas da capacidade de migração através de lacunas (poros) no tecido conectivo, mas também da capacidade das células de degradar enzimaticamente ou reconstruir os componentes do tecido conectivo, que se compõe principalmente de colágenos. Devido à sua pequena espessura, homogeneidade e produção padronizada, o filme de colágeno biológico poderia servir para a determinação da capacidade proteolítica de células cultivadas. Para este sistema, as células são cultivadas em um sistema de suas câmaras. As duas câmaras são separadas usando-se um filme de colágeno. As células a serem examinadas são cultivadas na câmara superior do filme. Após um período de cultivo correspondente, o número de células que migraram através da membrana de colágeno para o lado inferior da membrana é quantificado. Portanto, o uso da composição consoante a invenção abre uma nova área no diagnóstico in vitro.

A composição consoante a invenção também pode ser usada para determinar a atividade proteolítica de células não tumorais e sua potencial invasão, como por exemplo como teste de vitalidade para células-tronco.

Fica claro que as características supramencionadas e explicadas a seguir são se aplicam apenas na respectiva combinação dada, mas também em outras combinações ou em uma abordagem isolada, sem deixar o escopo da presente invenção.

A invenção é agora explicada em mais detalhes, com base nas configurações a partir das quais podem surgir critérios e vantagens adicionais, além de características da invenção. É feita referência às figuras anexas, que trazem: A fig. 1 apresenta uma camada interna de colágeno com espessura de 20 μm para um painel de cultura celular com 6 cavidades (A), um revestimento tubular consoante a invenção como reservatório de células para testes de implantação (B, B). A figura 2 apresenta o resultado de um ensaio de proliferação BrdU em células- tronco mesenquimais humanas (hMSC). Análise imunocitoquímica das células BrdU positivas. As células foram cultivadas em uma superfície de cultura sintética convencional (A, A) e na matriz de colágeno consoante a invenção e incubadas com BrdU por uma hora. A figura 3 traz o resultado do ensaio de proliferação de BrdU (A) e do teste MTT (B) em células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) que foram cultivadas em uma matriz de colágeno e em uma superfície de cultura sintética convencional. Os valores médios são apresentados com os respectivos desvios padrão. A figura 4 apresenta uma visão superior de uma matriz de colágeno mineralizado que foi cultivada com hMSCs sob condições de diferenciação osteogênica (A, A); atividade de fosfato alcalino de osteoblastos murinos embrionários (E18) da calota craniana depois de uma fase de cultivo de duas semanas na matriz de colágeno (B, B). A figura 5 traz uma seção transversal de parafina através da matriz de colágeno que foi cultivada com progenitores osteogênicos murinos embrionários (E18) da calota craniana sob condições de proliferação (A, A) e condições de diferenciação osteogênica (B, B). As figuras B e B esclarecem a contínua mineralização da matriz tridimensional. As capacidades de integração e penetração dependem do tipo de célula. A figura 6 mostra a implantação de um revestimento tubular livre de células consoante a invenção em um murino C57/BL6 (A) e a matriz implantada após 6 semanas em um murino nu (B). A figura 7 apresenta um filme tubular consoante a invenção diretamente antes da implantação que foi colonizada por um dia com hMSCs (A), assim como o crescimento do implante explantado no tecido conectivo após 6 semanas (B). A figura 8 traz o filme tubular consoante a invenção depois da explantação após 6 semanas em um murino C57/BL6 em apresentação maior. Os vasos sanguíneos que permeiam o filme de colágeno são claramente reconhecíveis. A figura 9 apresenta a coloração com HE em um corte de parafina feito a partir de um implante explantado.

Configurações 1. Composição contendo colágeno

Os inventores usaram sete filmes disponíveis comercialmente da Naturin GmbH & Co. KG e descobriram que eram adequados para a aplicação consoante a invenção.

Os parâmetros dos filmes disponíveis comercialmente testados estão listados na Tabela 1 abaixo:

Tabela 1: parâmetros dos filmes com base de colágeno comercializados pela Naturin

1.1 Produção de composições na forma de filme consoante a invenção

Cortes de pele bovina são o material inicial para a produção da composição consoante a invenção na forma de filme que, com relação à rastreabilidade e aos padrões de higiene, atendem às exigências definidas no regulamento (EC) 853/2004.

Esses cortes de pele bovina são pré-cortados mecânica e grosseiramente e, em várias etapas do método, primeiramente lavados com água e posteriormente decompostos usando álcalis. O nível de decomposição pode variar, dependendo de fatores como a duração do tratamento, a concentração do meio alcalino (valor do pH) e a temperatura. Água com cal, solução de hidróxido de sódio ou uma combinação desses dois componentes são normalmente usados para compor o meio alcalino. Outras combinações alcalinas, no entanto, são igualmente adequadas. O tratamento alcalino é realizado a um valor de pH de, por exemplo, 12,5 e pode variar, por exemplo, de 15 até mais de 150 horas, dependendo da intensidade desejada para a decomposição da pele. O nitrogênio amida mostrou-se um parâmetro possível para o rastreamento analítico do nível de decomposição do tecido com colágeno: quanto mais intensa a decomposição, menor o nível de nitrogênio amida.

Depois de atingido o nível desejado de decomposição adiciona-se ácido e, na sequência, usa-se água repetidamente para enxágue. A acidulação geralmente é obtida usando-se ácido clorídrico por um período de 6 a 10 horas, atingindo um pH < 2, preferencialmente <1.0 uso de outros ácidos também é possível. O valor do pH é posteriormente elevado de 2,6 para 3,3 por meio de numerosos procedimentos de lavagem com água.

As “calosidades de colágeno” resultantes são então processadas mecanicamente por meio de trituração e do pressionamento do material triturado através de discos perfurados com aberturas gradualmente menores em um material viscoelástico semelhante a gel.

1.1.1 Desenvolvimento como filme plano (composição n° 1)

Esta massa de colágeno “concentrada” é transferida para um agitador ao qual são adicionados glicerina, água e ácido. Ao mesmo tempo, o valor do pH é ajustado pata preferivelmente 2,6 - 3,2 e o percentual de colágeno seco é ajustado entre 1,6 e 2,5% em peso. A mistura posteriormente passa através de um homogeneizador, é areada e depois colocada através de um bocal com fenda em uma esteira transportadora, na qual o filme gel resultante passa através de um secador de túnel. Antes de entrar no secador, é fumigado preferencialmente com gás amónia, elevando o pH do gel. Ao final do secador, o filme seco passa através de uma zona de reidratação antes de ser embalado. 1.2 Desenvolvimento de um revestimento tubular (composições 2 a 7)

A massa de colágeno viscoelástica é transferida de 1.1 é transferida para um misturador com molde ao qual a glicerina é adicionada, dependendo da fórmula. O valor do pH e o percentual de matéria seca são ajustados ao mesmo tempo em que são adicionados água e ácido.

A massa homogênea é posteriormente extrudada através de um bocal anelar com fenda, produzindo assim um revestimento tubular sem fim. Uma injeção simultânea de ar de suporte protege o revestimento tubular do colapso.

O transporte do revestimento tubular soprado através da linha de extrusão ocorre de maneira ligeiramente diferente, dependendo do tipo de intestino a ser produzido. Em princípio, existe a possibilidade de passar através de duchas contendo produtos químicos e segmentos secantes em uma sequência variável. Ao final da linha de extrusão, o revestimento tubular seco é deitado entre rolos e embalado em bobinas nessa condição.

Os filmes tubulares obtidos recebem então tratamento térmico, onde adquirem a estabilidade mecânica necessária para seu uso posterior. As composições consoante a invenção, na forma tubular ou de filme, podem também ser produzidas com base em outras fontes de colágeno, onde o processamento do gel de colágeno pode diferir ligeiramente das descrições anteriores. Com base em colágeno de pele de porco, por exemplo, descobriu-se uma forma de reduzir o teor de gordura que, por exemplo, é descrito em DE 100 60 643 e EP 1 423 016. O uso de intestinos naturais para produzir material colágeno é, por exemplo, descrito em ES 2 017 564. Esses documentos são incorporados na apresentação do presente pedido para referência.

1.3 Ajuste do pH

O pH é ajustado com o uso de um tampão de fosfato contendo cálcio e magnésio [solução salina tamponada com fosfato (PBS) com Ca++ e Mg++ (PAA H15-001)] que ajusta o valor do pH do filme com base de colágeno na área fisiológica de pH 7,2 a 7,5. Para isso, o filme de colágeno é lavado com o sistema tampão por meio de agitação por 5 dias. O tampão é trocado duas vezes ao dia.

Alternativamente, a membrana de colágeno também pode ser imersa por uma hora em um tampão de fosfato contendo glicerina com um pH de 7,3 (tampão de fosfato: 15,6 g de KH2PO4, 71,3 g de Na2HPO4 x 2 H2O e 492,9 g de glicerina são dissolvidos em 7722 g de água destilada). Em seguida, o filme processado é drenado e colocado em uma estrutura de varal, onde seca até o dia seguinte em temperatura ambiente.

1.4 Processamento adicional opcional

Depois de um breve equilíbrio em água destilada, a membrana de colágeno é processada com acetona 100% para extração das substâncias lipossolúveis e quebra das proteínas hidrossolúveis. Após a remoção da acetona, a membrana seca é lavada em pressão negativa 3 vezes, por uma hora a cada vez, usando o tampão de fosfato contendo cálcio e magnésio (em g/l: KCI 0,2; KH2PO4 0,2; NaCI 8,0; Na2HPO4 anidro 1,15; CaCI2-2H2O em H15-001 0,132; MgCI2-2H2O em H15-001 0,1). Para eliminar o sal do tampão, o procedimento de lavagem é repetido 3 vezes, por uma hora a cada vez, em água destilada.

1.5 Secagem

A membrana ou filme disponível é seco. Isso pode ser obtido em um gabinete de secagem a 60°C, onde se pode atingir uma umidade de < 5%, por exemplo. A membrana também pode ser seca à temperatura ambiente, simplesmente permitindo-se que seque ao ar de modo que ao fim se ajuste à umidade do ar relativa, dependendo da umidade de equilíbrio da membrana ou filme, que geralmente é de cerca de 8% e 13% em peso.

1.6 Definição da forma e esterilização com radiação

As membranas ou filmes de colágeno obtidos podem ser cortados de qualquer 5 maneira ou prensados, por exemplo em folhas tamanho DIN A5. Essas folhas são então esterilizadas por meio de irradiação beta ou gama a 25 kGy ou 50 kGy.

O filme de colágeno pode, por exemplo, ser acabado como inserção para copos de aprofundamento sintético de qualquer tipo de construção, por exemplo placas de microtitulação, ou produzido como revestimentos tubulares preferivelmente sem 10 emendas com um diâmetro de < 2 mm, aprox. 12 mm a vários centímetros. Também é possível a soldagem térmica ou colagem do filme.

1.7 Parâmetros da composição produzida consoante a invenção na forma de filme

Os parâmetros de diferentes filmes de colágeno são apresentados na tabela 2 15 abaixo. Foram obtidos de acordo com os procedimentos descritos em 1.1.1, no qual as etapas descritas de acordo com a seção 1.3 não foram executadas.

Tabela 2: parâmetros dos filmes produzidos com base em colágeno (*) Para cada amostra de 1 a 6, existem 5 subtestes: sem esterilização (a), radiação beta 25 kGy (b), radiação beta 50 kGy (c), radiação gama 25 kGy (d) e radiação gama 50 kGy (e) Foram aplicados os seguintes métodos de análise:

Colágeno por regulação de hidroxiprolina / análogo de nitrogênio amida EP1676595 (Geistlich Sõhne AG) / Glicerina por HPLC / óleo vegetal através de extração Soxhlet / Sorbita por HPLC / Cinza gravimétrica após incineração em um forno mufla por 5 horas a 600°C) / Teor de água gravimétrica após secagem no gabinete de secagem a 150°C / valor de pH pelo corte do filme em pedaços pequenos, inserindo os pedaços em uma solução de NaCI a 5% e medindo usando um eletrodo de vidro após 10 minutos / massa por unidade de área, pesando um pedaço de filme com 10 cm x 10 cm com umidade equilibrada / resistência à tensão ao longo do comprimento e da seção transversal por meio de uma máquina de teste UTS universal (modelo 3/205, UTS Testsysteme GmbH) depois de condicionamento de ar a 21°C/60% de umidade relativa do corpo de amostra coletado e uma velocidade transversal de 100 mm/min.

2. Cultivo de material biológico 2.1 Configuração da composição

A figura 1 apresenta um filme de colágeno consoante a invenção, com uma espessura de 20 μm, configurado como inserção para uma cavidade de painel de cultura celular (A). Um revestimento tubular é apresentado na ilustração parcial (B), que é esquematicamente apresentado na ilustração parcial (B). O revestimento tubular é mostrado na referência número 1. As células são apresentadas nas referência número 2, que pode ser posicionada no interior do revestimento. Uma substância ativa ou fatores de crescimento são apresentadas na referência número 3, que também pode ser posicionada no revestimento para influenciar as células biológicas.

2.2 Comportamento de proliferação de células humanas

O comportamento de proliferação de células humanas, as células-tronco mesenquimais MSC e a linhagem celular humana SaOS2 no filme de colágeno consoante a invenção não demonstrou nenhuma diferença em comparação com os procedimentos convencionais de cultivo na cavidade plástica para cultura; figura 2. As células foram cultivadas em uma superfície plástica convencional de cultura (A) e em um filme de colágeno consoante a invenção (B) e incubadas com BrdU por uma hora. A ilustração esquemática (B) traz o filme de colágeno em 1, as células em 2, as fibras de colágeno em 5 e as células positivas para BrdU em 6. A avaliação estatística do ensaio de proliferação de BrdU (A) e o teste de vitalidade de MTT (B) são apresentados na figura 3.

Depois disso, não foram observadas diferenças significativas entre o filme de colágeno consoante a invenção e as cavidades plásticas convencionais.

2.3 Biocompatibilidade

Os progenitores murinos embrionários da calota craniana e hMSCs foram cultivados nessa matriz sob condições de diferenciação osteogênica para a avaliação da biocompatibilidade do filme de colágeno consoante a invenção. O resultado é apresentado na figura 4.

A ilustração parcial (A) traz uma visão geral de uma matriz de colágeno mineralizada consoante a invenção, que foi cultivada juntamente com hMSCs sob condições de diferenciação osteogênica. A ilustração parcial (B) traz a atividade do fosfato alcalino dos osteoblastos murinos embrionários da calota craniana após um período de cultivo de 2 semanas no filme de colágeno consoante a invenção. As ilustrações esquemáticas parciais (A) e (B) trazem a membrana de colágeno em 1, as células em 2a e as células após a detecção da atividade celular no fosfato alcalino em 2b.

A detecção da atividade no fosfato alcalino e a mineralização induzida pelas células esclarece o potencial de diferenciação das células cultivadas e, assim, a biocompatibilidade da matriz consoante a invenção.

2.4 Cultivo de estruturas de tecido tridimensionais

Seções transversais em parafina são produzidas a partir de filmes de colágeno colonizados. As seções são analisadas histoquimicamente com relação à mineralização. O resultado é apresentado na figura 5. A ilustração parcial (A, A) apresenta a seção transversal de parafina sob condições de proliferação, a ilustração parcial (B, B) sob condições de diferenciação osteogênica. 1 refere-se ao filme de colágeno, 2 às células e 4 aos depósitos de nitrato de prata.

Por um lado, este experimento mostra o alto potencial de mineralização e, por outro lado, a capacidade de integração das células dentro do filme/matriz tridimensional. Com a ajuda desta matriz consoante a invenção, o cultivo de estruturas tridimensionais de tecido é possível.

2.5 Implantações

Os experimentos de implantação foram realizados em camundongos pelados e C57/ BL6. Para isso, revestimentos tubulares carregados com células consoante a invenção foram implantados na área entre a subcútis e o peritônio. O resultado deste experimento é apresentado na figura 6. A ilustração parcial (A) traz a implantação e a ilustração parcial (B) traz a matriz implantada consoante a invenção após 6 semanas no camundongo pelado. A seta desenhada indica o revestimento tubular carregado de células consoante a invenção. Com a ajuda dos pontos de fixação, o revestimento tubular com os filamentos não biodegradáveis inseridos também pode ser facilmente localizado na ilustração parcial (B); seta pontilhada. Na ilustração parcial (B), a preparação claramente mostra o revestimento tubular ainda existente consoante a invenção.

A figura 7, ilustração parcial (A) traz o revestimento tubular consoante a invenção diretamente antes da implantação, que foi colonizado por um dia com hMSCs. A ilustração parcial (B) mostra o implante explantado crescido no tecido conectivo após 6 semanas. Assim, fica aparente que, mesmo 6 semanas após o implante, a integridade do revestimento tubular permanece intacta apesar do processo de absorção incipiente.

O implante claramente cresceu no tecido conectivo do animal e foi atravessado por vasos sanguíneos; consulte também a figura 8 (A, A). A ilustração esquemática (A) marca as membranas de colágeno (1), as células (2), as fibras de colágeno (5) e os vasos sanguíneos (7).

As análises imuno-histológicas de cortes de parafina coloridos com HE mostram que as células migraram para a folha consoante a invenção; consulte também a figura 9. Um vaso sanguíneo pode ser claramente estabelecido na área dos implantes (A, seta). Na ilustração esquemática (A), 1 refere-se ao revestimento tubular, 2 às células, 5 às fibras de colágeno, 7 a um vaso sanguíneo e 8 ao tecido conectivo.

3. Conclusão

Os inventores podem fornecer uma composição contendo colágeno, por exemplo na forma de filme ou revestimento, que é reprodutível em larga escala e especialmente adequado para o cultivo e a geração de materiais biológicos.

Claims

1. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, caracterizado por conter os seguintes parâmetros:

2. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o poliol ser selecionado dentre:

3. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pela composição compreender os seguintes parâmetros:

4. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela gordura compreender óleo vegetal.

5. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo o valor do Petição 87018001PH3, See6/02eo5,Oága^0, preferivelmente de 6,8 a 8,0, mais preferivelmente cie 7,0 a 7,8, com preferência máxima 7,2 a 7,5.

6. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser configurada como filme plano.

7. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser configurada como revestimento tubular.

8. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição, em condição seca, apresentar espessura de 5 a 200 μm.

9. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela composição, em condição seca, apresentar espessura de 5 a 100 μm, preferivelmente de 10 a 30 μm, com preferência máxima por 15 μm.

10. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser configurada como transportador para aplicações de cultivo celular.

11. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser configurada como transportador para a implantação de material biológico, preferencialmente de células precursoras ou células-tronco, diferente das células embrionárias humanas, em um organismo.

12. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição ser esterilizada por meio de radiação.

13. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela esterilização por radiação ser realizada usando-se radiação ionizante.

14. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pela radiação ionizante ser radiação beta e/ou radiação gama.

15. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pela composição conter um corante, preferivelmente um corante que absorva fluorescência.

16. USO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA DETERMINAR O POTENCIAL DE INVASÃO E METÁSTASE DE CÉLULAS TUMORAIS, caracterizado por a forma em que a Petição 870180015273, de 26/02/2018, pág. 8/10 composição é usada seja a composição do uso das reivindicações 1,2,5,6,8,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,7,8,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,6,9,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,7,9,10,11,12,13,14 ou 3,4,5,6,8,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,6,9,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,7,8,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,7,9,10,11,12,13,15.

17. MÉTODO PARA O CULTIVO DE MATERIAL BIOLÓGICO, caracterizado por ser composto pelas seguintes etapas: (1) Fornecimento de uma composição adequada para uso como transportador para material biológico, (2) Contato do material biológico com a composição, e (3) Incubação da composição com material biológico sob condições de cultivo, caracterizado de forma que a composição usada seja a composição do uso das reivindicações 1,2,5,6,8,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,7,8,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,6,9,10,11,12,13,14 ou 1,2,5,7,9,10,11,12,13,14 ou 3,4,5,6,8,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,6,9,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,7,8,10,11,12,13,15 ou 3,4,5,7,9,10,11,12,13,15.

18. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, seguintes parâmetros:

tal método compreende as seguintes etapas: (1) Fornecimento da composição, e (2) Ajuste do valor do pH para 5,0 a 8,0, preferivelmente para 6,8 a 8,0, mais preferivelmente para 7,0 a 7,8, com preferência máxima 7,2 a 7,5.

19. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela etapa 2 compreender a seguinte etapa: (2.(1) Incubação da composição na solução tampão com valor de pH de 7,2 a 7,5.

20. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com as reivindicações 18 ou 19, caracterizado pela etapa 2.1 compreender a seguinte etapa adicional: (3) Incubação da composição com substâncias fortemente solúveis em gordura.

21. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a eivindicação 20, caracterizado por compreender a seguinte etapa adicional: (3.(1) Lavagem da composição em solução tampão.

22. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 ou 20, caracterizado por compreende a seguinte etapa adicional: (4) Secagem da composição.

23. MÉTODO PARA APRIMORAR A ADEQUAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO PARA O CULTIVO DE CÉLULAS BIOLÓGICAS, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por compreender a seguinte etapa adicional: (5) Esterilização da composição com radiação.