BRPI0823046B1 - Método para purificar um anticorpo monoclonal de uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal e pelo menos uma proteína de ovário de hamster chinês (chop) - Google Patents

Abstract

métodos para purificar um polipeptídeo de uma composição compreendendo o polipeptídeo e pelo menos um contaminante. a presente invenção refere-se aos métodos para purificar um polipeptídeo de uma composição compreendendo o polipeptídeo e pelo menos um contaminante, os tais métodos compreendem a etapa sequencial de: (a) passagem da composição através de uma membrana de troca iônica, onde o polipeptídeo e a membrana têm a carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um ph suficientemente distinto do pl do polipeptídeo para realçar a carga do polipeptídeo e uma força iônica baixa eficaz para evitar a proteção de cargas por íons tampões, que fazem com que a membrana se ligue ao polipeptídeo e a pelo menos um contaminante, e (b) recuperando o polipeptídeo purificado do efluente.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se geralmente à purificação de proteína. Particularmente, a invenção refere-se a métodos para remoção de um contaminante usando cromatografia em membrana de troca iônica por deslocamento de proteína nativa.

Antecedentes da Invenção

[002] A purificação econômica de proteínas em grande escala é um problema cada vez mais importante da indústria de biotecnologia. Geralmente, as proteínas são produzidas por cultura de célula, usando ou linhagens de células eucarióticas ou procarióticas projetadas para produzir a proteína de interesse pela inserção de um plasmídeo re- combinante contendo o gene daquela proteína. Como as células tipicamente usadas são organismos vivos, elas devem ser alimentadas com um meio de crescimento complexo, contendo açúcares, aminoá- cidos, e fatores de crescimento, normalmente fornecidos a partir de preparações de soro animal. A separação da proteína desejada da mistura de compostos alimentados às células e dos subprodutos das próprias células com uma pureza suficiente para uso como um produto terapêutico humano, envolve um desafio formidável.

[003] Os procedimentos para purificação de proteínas a partir dos detritos celulares inicialmente dependem do sítio de expressão da proteína. Pode-se fazer com que algumas proteínas sejam secretadas diretamente da célula para o meio de crescimento circundante; as outras são feitas de modo intracelular. Para as últimas proteínas, a primeira etapa de um processo de purificação envolve a lise da célula, que pode ser feita por vários métodos, incluindo cisalhamento mecânico, choque osmótico, ou tratamentos enzimáticos. Tal perturbação libera os conteúdos totais da célula no homogenato, e, além disso, produz fragmentos subcelulares que são difíceis de remover devido aos seus pequenos tamanhos. Estes são geralmente removidos pela centrifugação diferencial ou pela filtração. O mesmo problema surge, embora em uma escala menor, com proteínas diretamente secretadas devido à morte natural das células e a liberação intracelular das proteínas da célula hospedeira no decorrer da corrida de produção de proteína.

[004] Uma vez que uma solução clarificada contendo a proteína de interesse tenha sido obtida, a separação de outras proteínas produzidas pela célula é normalmente tentada usando uma combinação de técnicas de cromatografia diferentes. Estas técnicas separam misturas de proteínas com base na carga, no grau de hidrofobicidade, ou tamanho. Várias resinas de cromatografia diferentes estão disponíveis para cada uma destas técnicas, permitindo corte exato do esquema de purificação para determinada proteína envolvida. A essência de cada um desses métodos de separação é que as proteínas podem ser colocadas em movimento em diferentes taxas descendo uma coluna longa, atingindo uma separação física que aumenta conforme elas passam adicionalmente para baixo na coluna, ou aderir seletivamente ao meio de separação, que é então diferencialmente eluído por solventes diferentes. Em alguns casos, a proteína desejada é separada da impureza quando a impureza especificamente adere à coluna, e a proteína de interesse não o faz, isto é, a proteína de interesse está presente "no escoamento direto".

[005] As publicações acerca da purificação de proteína incluem Fahrner et al., Biotechnol Genet Eng Rev. 2001; 18:301-27.

[006] Um processo de purificação amplo típico muitas vezes é construído em volta do emprego da proteína A imobilizada como a captura primária e etapa de purificação em combinação com outras operações da coluna. As operações da coluna de proteína A em geral liberam uma pureza relacionada ao produto acima de 98 % com a maior parte da impureza de processo retirada por lavagem na fração de escoamento direto. Por causa disso, as unidades de processo operacional seguintes são consideradas como sendo etapas de concen-tração, purificação ou refinamento, responsáveis pela separação de isômeros relacionados ao produto e à remoção das quantidades restantes de proteínas da célula hospedeira/DNA, proteína A lixiviada, e vírus.

Sumário da Invenção

[007] A invenção aqui refere-se a métodos para purificar um poli- peptídeo de uma composição compreendendo o polipeptídeo e pelo menos um contaminante, os tais métodos compreendem a etapa sequencial de: (a) passagem da composição através de uma membrana de troca iônica, onde o polipeptídeo e a membrana têm uma carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um pH suficientemente distinto do pI do polipeptídeo para realçar a carga do polipeptídeo e uma força iônica baixa eficaz para evitar o bloqueio das cargas pelos íons tampões, que fazem com que a membrana se ligue ao polipeptídeo e a pelo menos um contaminan- te, e (b) recuperando o polipeptídeo purificado do efluente.

[008] Em uma alternativa, a invenção refere-se a um método para purificar um polipeptídeo de uma composição compreendendo o poli- peptídeo e pelo menos um contaminante, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) passagem da composição através de uma membrana de troca catiônica, onde o polipeptídeo e a membrana têm a carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH abaixo do pI do polipeptídeo e uma condutividade menor ou igual a aproximadamente 40 mS/cm, que fazem com que a membrana se ligue ao polipeptídeo e a pelo menos um contaminante, e (b) recuperação do polipeptídeo purificado do efluente.

[009] Em outra alternativa, a invenção refere-se um método para purificar um polipeptídeo de uma composição compreendendo o poli- peptídeo e pelo menos um contaminante, cujo método compreende as etapas sequenciais de: (a) passagem da composição através de uma membrana de troca aniônica, onde o polipeptídeo e a membrana têm a carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH acima do pI do polipeptídeo e uma condutividade menor ou igual a_aproximadamente 40 mS/cm, que fazem com que a membrana se ligue ao polipeptídeo e a pelo menos um contaminante, e (b) recuperação do polipeptídeo purificado do efluente.

[0010] Em um aspecto, o contaminante é uma Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP). Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende uma região CH2/CH3. Em ainda outro aspecto, o polipeptídeo é um anticorpo. Em ainda outro aspecto, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0011] Em outros aspectos, os métodos também compreendem submeter à composição compreendendo o polipeptídeo a uma ou mais etapas adicionais de purificação antes, durante, ou após etapa de a para b, a etapa de purificação sendo, em uma alternativa, a cromato- grafia de afinidade da proteína A e, em outra alternativa, a cromato- grafia de troca iônica, usando uma coluna ou membrana funcionando nos modos de ligar/eluir, de escoamento direto, ou de deslocamento de proteína nativa.

[0012] Além disso, a invenção fornece a preparação de uma com posição farmacêutica combinando o polipeptídeo purificado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

Breve Descrição dos Desenhos

[0013] Figura 1. Depuração de CHOP para o conjunto de troca aniônica mAb 1 em pH 5,5; 6,0 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV, 667 MV/hora) (Rendimento: 101% a 5.000 g/L).

[0014] Figura 2. Depuração de CHOP para o conjunto de troca aniônica mAb 2 em pH 5,5 e 6,4 mS/cm e em pH 8,0 e 5,0 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV, 667 MV/hora).

[0015] Figura 3. Rendimento para o conjunto de troca aniônica mAb 2 em pH 5,5 e 6,4 mS/cm e em pH 8,0 e 5,0 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV, 667 MV/hora).

[0016] Figura 4. Depuração de CHOP para o conjunto de Proteína A mAb 1 em pH 5,5; 3,2 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV, 1333 MV/hora).

[0017] Figura 5. CHOP (barras) e capacidade de ligação do anti corpo (linhas) para mAb 3 em pH 8,0, Mustang® Q (pequena escala, 0,35 mL MV, 600 MV/hora).

[0018] Figura 6. Rendimento para o conjunto de troca catiônica mAb 3 em pH 8,0, Mustang® Q (pequena escala, 0,35 mL MV, 600 MV/hora).

[0019] Figura 7. Níveis de CHOP de mAb 4 em pH 8,0 e 4,0 mS/cm, Mustang® Q (pequena escala, 0,18 mL MV, 1333 MV/hora) e depois pH 5,5 e 6,1 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV, 1333 MV/hora).

[0020] Figura 8. Depuração de CHOP de mAb 1 em pH 8,0 e 4,7 mS/cm em uma coluna Sepharose Q de fluxo rápido corrida em modo de escoamento direto em 100 cm/hora (faixas) e depois adicionalmente purificado em uma Mustang® S nos modos em batelada (losangos) e contínuo (cinza sólido) em aproximadamente pH 5,5 e 6 mS/cm (pequena escala, 0,18 mL MV, 538 MV/hora).

[0021] Figura 9. Depuração de CHOP de mAb 1 em pH 5,5 e 6 mS/cm, Sartobind® S (pequena escala, 0,14 mL MV, 857 MV/hora).

[0022] Figura 10. Depuração de CHOP de mAb 1 em pH 5,5 e 6 mS/cm, Mustang® S (pequena escala, 0,18 mL MV).

[0023] Figura 11. Depuração de CHOP de mAb 1 em pH 5,5 e 6 mS/cm, Mustang® S (Escala piloto, 10 mL MV, 546 MV/hora) (Rendimento ciclo 1 = 98%; Rendimento ciclo 2 = 100%).

[0024] Figura 12. Esboço da produção de proteína na qual a cro- matografia de troca catiônica é corrida em modo ligar/eluir.

[0025] Figura 13. Esboço de produção de proteína que substitui a cromatografia de troca catiônica corrida em modo ligar/eluir com uma membrana de troca catiônica corrida em modo por deslocamento de proteína nativa.

Descrição Detalhada da Modalidade Preferida Definições:

[0026] Aqui, as faixas de variação numéricas ou as quantidades prefaciadas pelo termo "aproximadamente" expressamente incluem o faixa de variação exata ou uma quantidade numérica exata.

[0027] A "composição" a ser purificada aqui compreende o poli- peptídeo de interesse e uma ou mais contaminantes. A composição pode ser "parcialmente purificada" (isto é, possuindo sido submetido a uma ou mais etapas de purificação, tal como proteína A cromatografia) ou pode ser obtido diretamente de uma célula hospedeira ou organismo que produz o anticorpo (por exemplo, a composição pode compreender o fluido colhido da cultura de célula).

[0028] Tal como aqui utilizado, o "polipeptídeo" refere-se geral mente a peptídeos e proteínas possuindo mais de aproximadamente dez aminoácidos. Preferivelmente, o polipeptídeo é uma proteína de mamífero, os exemplos da qual incluem: renina; um hormônio de crescimento, incluindo hormônio de crescimento humano e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação do hormônio do crescimento; hormônio da paratiroide; hormônio estimulante da tireoide; lipoproteí- nas; alfa-1-antitripsina; cadeia A da insulina; cadeia B da insulina; pro- insulina; hormônio estimulante de folículo; calcitonina; hormônio lutei- nizante; glucagon; fatores coagulantes, tal como fator VIIIC, fator IX, fator tissular, e fator de von Willebrands; fatores anti-coagulantes, tal como Proteína C; fator de natriurético atrial; tensoativo de pulmão; um ativador de plasminogênio, tal como uroquinase ou urina humana ou ativador de plasminogênio do tipo de tecido (t-PA); bombesina; trombi- na; fator de crescimento hemopoiético; fator alfa e beta de necrosa tumoral; encefalinase; RANTES (regulado na ativação normalmente expressado e secretado pela célula T); proteína inflamatória de macró- fago humano (MIP-1-alfa); uma albumina de soro, tal como albumina de soro humana; substância de inibição Muellerian; cadeia A da relaxi- na; cadeia B da relaxina; prorrelaxina; peptídeo associado com gona- dotropina de rato; uma proteína microbiana, tal como beta-lactamase; DNase; IgE; um linfócito T associado ao antígeno citotóxico (CTLA), tal como CTLA-4; inibina; ativina; fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); receptores de hormônios ou fatores de crescimento; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico, tal como fator neu- rotrófico derivado do osso (BDNF), neutrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo, tal como NGF- ; fator de crescimento derivado da plaqueta (PDGF); fator de crescimento de fibroblasto, tal como aFGF e bFGF; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF), tal como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, ou TGF-β5; fatores I e II de crescimento parecidos com a insulina (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de ligação do fator de crescimento semelhante à insulina (IG- FBPs); proteínas CD, tal como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritri- poietina; fatores osteoindutivos; imunotoxinas; uma proteína morfoge- nética de osso (BMP); um interferon, tal como interferon alfa, beta, e gama; fatores estimulantes de colônia (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleucinas (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-10; su- peróxido dismutase; receptores de célula T; proteínas da superfície de membrana; fator de aceleração de decadência; antígeno viral tal como, por exemplo, uma porção do envelope da Aids; proteínas de transporte; receptores de homing; adressinas; proteínas reguladoras; integri- nas, tal como CD11a, CD11b, CD11c, CD18, um ICAM, VLA-4 e VCAM; um tumor associado ao antígeno, tal como HER2, HER3 ou receptor HER4; e os fragmentos e/ou as variantes de qualquer dos po- lipeptídeos listados acima bem como anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo, ligam a qualquer dos polipeptídeos listados acima.

[0029] Um "contaminante" é um material que é diferente do produ to de polipeptídeo desejado. O contaminante inclui, sem restrição: materiais de célula hospedeiros, tal como Proteínas de Ovário de Hamster Chinês (CHOP); lixívia de proteína A; ácido nucleico; uma variante, fragmento, agregado, isômero ou derivado do polipeptídeo desejado; outro polipeptídeo; endotoxina; contaminante viral; componente de meio de cultura de célula (por exemplo, garamicina; GENTAMICINA®) etc.

[0030] Um polipeptídeo de interesse aqui é aquele compreenden do uma região CH2/CH3 e por isso é acessível à purificação por cro- matografia de afinidade à proteína A. O termo "região de CH2/CH3" quando usado aqui refere-se àqueles resíduos de aminoácido na região Fc de uma molécula de imunoglobulina que interagem com a proteína A. Em modalidades preferidas, a região de CH2/CH3 compreende uma região CH2 intacta seguida por uma região CH3 intacta, e mais preferivelmente uma região Fc de uma imunoglobulina. Os exemplos da região de CH2/CH3 contendo polipeptídios incluem anticorpos, imu- noadesinas e proteínas de fusão compreendendo um polipeptídeo de interesse fundido a, ou conjugado com, uma região CH2/CH3.

[0031] Nas modalidades preferidas da invenção, o anticorpo a ser purificado aqui é um anticorpo recombinante. Um "anticorpo recombi- nante" é aquele que foi produzido em uma célula hospedeira que foi transformada ou transfectada com o ácido nucleico que codifica o anticorpo, ou produz o anticorpo em consequência da recombinação homóloga. "Transformação" e "transfecção" são usadas de modo trocável para referir-se ao processo de introduzir o ácido nucleico em uma célula. Seguindo a transformação ou transfecção, o ácido nucleico pode integrar-se no genoma da célula hospedeira, ou pode existir como um elemento extracromossômico. A "célula hospedeira" inclui uma célula na cultura de célula in vitro bem como uma célula dentro de um animal hospedeiro. Os métodos para produção de polipeptídeos recombinan- tes são descritos na Patente dos Estados Unidos N° 5.534.615, expressamente incorporada aqui pela referência, por exemplo.

[0032] O termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e espe cificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos mo- noclonais de comprimento total), os anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos bioespecíficos), e fragmentos de anticorpo contanto que eles conservem, ou sejam modificados para compreender, uma região CH2/CH3 como aqui definido.

[0033] O anticorpo aqui é dirigido contra um "antígeno" de interes se. Preferivelmente, o antígeno é um polipeptídeo biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de uma doença ou o distúrbio pode resultar em um benefício terapêutico para aquele mamífero. Contudo, anticorpos dirigidos contra antígenos não polipeptídeos (tal como antígenos de glicolipídio associados a tumor; ver a Patente dos Estados Unidos N° 5.091.178) também são contemplados. Onde o antígeno é um polipeptídeo, ele pode ser uma molécula da transmembrana (por exemplo, um receptor) ou ligante, tal como um fator de crescimento. Os antígenos de exemplo incluem aqueles polipeptídeos discutidos acima. Os objetivos moleculares preferidos dos anticorpos abrangidos pela presente invenção incluem os polipeptídeos da CD, tal como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 e CD34; membros da família de receptor HER, tal como o receptor de EGF (HER1), HER2, HER3 ou receptor HER4; moléculas de adesão de célula, tal como LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM e av/b3 integrina incluindo as subunidades a ou b da mesma (por exemplo, anti-CD11a, anti-CD18 ou anticorpos anti-CD11b); fatores de crescimento, tal como VEGF; IgE; antígenos de grupo de sangue; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); receptor de mpl; CTLA-4; poli- peptídeo C etc. Antígenos solúveis ou fragmentos do mesmo, opcionalmente conjugado a outras moléculas, pode ser usado como imunó- genos para gerar anticorpos. Para moléculas da transmembrana, tal como receptores, os fragmentos destas (por exemplo, o domínio ex- tracelular de um receptor) podem ser usados como imunógeno. Alternativamente, células que expressam a molécula da transmembrana podem ser usadas como o imunógeno. Tais células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens de células de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas re- combinantes para expressar a molécula da transmembrana.

[0034] Os exemplos de anticorpos a serem purificados aqui inclu em, mas não são limitados a: anticorpos de HER2 incluindo trastuzumab (HERCEPTINA®) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:4285-4289 (1992), Patente dos Estados Unidos No. 5.725.856) e pertuzumab (OMNITARG®) (WO 01/00245); anticorpos de CD20 (veja abaixo); anticorpos de IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993), e a Publicação Internacional da WO N° 95/23865); anticorpos VEGF ou receptor de VEGF incluindo anticorpos VEGF humanizados e/ou de afinidade maduro, tal como o anticorpo VEGF humanizado huA4.6.1 bevacizumab (AVASTIN®) e ranibizumab (LUCENTIS®) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicação Internacional da WO N°96/30046, e WO 98/45331, publicadas em 15 de outubro de 1998); anticorpos da PSCA (WO 01/40309); anticorpos da CD11a incluindo efalizumab (RAPTIVA®) (Patente dos Estados Unidos N°. 5.622.700, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), e Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); os anticorpos que ligam IgE incluindo omalizumab (XOLAIR®) (Presta et al., J. Immunol. 151:26232632 (1993), e Publicação Internacional do WO N°95/19181; Patente dos Estados Unidos N°. 5.714.338, emitida em 3 de fevereiro de 1998 ou a Patente dos Estados Unidos N°. 5,091.313, emitida em 25 de fevereiro de 1992, WO 93/04173 publicada em 4 de março de 1993, ou Pedido Internacional N° PCT/US98/13410 depositado em 30 de junho de 1998, Patente dos Estados Unidos N°. 5.714.338); anticorpos de CD18 (Patente dos Estados Unidos N°. 5.622.700, emitida em 22 de abril de 1997, ou como na WO 97/26912, publicada em 31 de julho de 1997); anticorpos do anticorpo do receptor Apo-2 (WO 98/51793 publicada em 19 de novembro de 1998); anticorpos do fator tissular (TF) (Patente Europeia N°. 0 420937 B1 concedida em 9 de novembro de 1994); anticorpos de integrina α4-α7 (WO 98/06248 publicada em 19 de fevereiro de 1998); anticorpos de EGFR (por exemplo, quimerizado ou humanizado 225 anticorpo, cetuximab, ERBUTIX como em WO 96/40210 publicada em 19 de dezembro de 1996); Anticorpos de CD3, tal como OKT3 (Patente dos Estados Unidos N°. 4,515.893 emitida em 7 de maio de 1985); CD25 ou anticorpos Tac, tal como CHI-621 (SI- MULECT®) e ZENAPAX® (Ver Patente dos Estados Unidos N°. 5.693.762 emitida em 2 de dezembro de 1997); anticorpos de CD4, tal como o cm 7412 anticorpo (Choy et al., Arthritis Rheum 39 (1):52-56 (1996)); anticorpos de CD52, tal como CAMPATH-1H (ILEX/Berlex) (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); anticorpos de receptor de Fc, tal como o anticorpo M22 dirigido contra Fc (RI como em Graziano et al., J. Immunol. 155 (10):4996-5002 (1995)); antígeno carci- noembriogênico (CEA) anticorpos, tal como hMN-14 (Sharkey et al., Cancer Res. 55 (23Suppl): 5935s a 5945s (1995)); os anticorpos diri gidos contra as células epiteliais da mama incluindo huBrE-3, huMc 3 e CHL6 (Ceriani et al., Cancer Res. 55 (23): 5852s a 5856s (1995); e Richman et al., Cancer Res. 55 (23 Supp): 5916s a 5920s (1995)); os anticorpos que ligam a células de carcinoma do cólon, tal como C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26 (1):1-9 (1996)); anticorpos de CD38, por exemplo, em 13/5 (Ellis et al., J. Immunol. 155 (2):925-937 (1995)); anticorpos de CD33, tal como Hu M195 (Jurcic et al., Cancer Res 55 (23 Suppl):5908s-5910 (1995)) e CMA-676 ou CDP771; anticorpos de EpCAM tal como 17-1A (PANOREX®); GpIIb/anticorpos de IIIa, tal como abciximab ou Fab c7E3 (REOPRO®); anticorpos de RSV, tal como MEDI-493 (SYNAGIS®); anticorpos de CMV, tal como PROTOVIR®; anticorpos de VIH, tal como PRO542; anticorpos de hepatite, tal como o Hep B anticorpo OSTAVIR®; CA125 anticorpo OvaRex; anticorpo de epítopo GD3 idiotípico BEC2; anticorpo de αvβ3 (por exemplo, VITA- XIN®; Medimmune); anticorpo de carcinoma da célula renal humano, tal como ch-G250; ING-1; anticorpo 17-1An anti-humano (3622W94); anticorpo de tumor colorretal anti-humano (A33); o anticorpo de melanoma anti-humano R24 dirigido contra o gangliosídio GD3; carcinoma de célula escamosa anti-humana (SF-25); antígeno de leucócito humano (HLA) anticorpo, tal como ID10 Inteligente e o anticorpo de DOUTOR anti-HLA Oncolym (Lym-1); anticorpo de CD37, tal como TRU 016 (Trubion); anticorpo de IL-21 (Zymogenetics/Novo Nordisk); anticorpo de anti-célula B (Impheron); B célula direcionada para MAb (Imunogen/Aventis); 1D09C3 (Morphosys/GPC); LymphoRad 131 (HGS); anticorpo de Lym-1, tal como Lym-1Y-90 (USC) ou anti-Lym-1 Oncolym (USC/Peregrine); LIF 226 (Lifesci Realçado.) ; Anticorpo de BAFF (por exemplo, WO 03/33658); o anticorpo de receptor de BAFF (ver por exemplo, WO 02/24909); anticorpo de BR3; anticorpo de Blys, tal como belimumab; LYMPHOSTAT-B®; ISF 154 (UCSD/Roche/Tragen); gomilixima (Idec 152; Biogen Idec); anticorpo de receptor de IL-6, tal como atlizumab (ACTEMRA®; Chugai/Roche); anticorpo de IL-15, tal como HuMax-Il-15 (Genmab/Amgen); anticorpo do receptor de quimiocina, tal como um anticorpo CCR2 (por exemplo, MLN1202; Millieneum); anticorpo do anti-complemento, tal como anticorpo de C5 (por exemplo, eculizumab, 5G1.1; Alexion); formulação oral de imunoglobulina humana (por exemplo, IgPO; Protein Terapeu- tics); anticorpo de IL-12, tal como ABT-874 (CAT/Abbott); Teneliximab (BMS-224818; BMS); anticorpos de CD40, incluindo S2C6 e variantes humanizadas do mesmo (WO 00/75348) e TNX 100 (Chiron/Tanox); Anticorpos de TNF-α incluindo cA2 ou infliximab (REMICADE®), CDP571, MAK-195, adalimumab (HUMIRA®), fragmento peg-lado de anticorpo de TNF-α, tal como CDP-870 (Celltech), D2E7 (Outeiro), an- ti-TNF-α anticorpo policlonal (por exemplo, PassTNF; Verigen); anticorpos de CD22, tal como LL2 ou epratuzumab (LYMPHOCIDE®; Immunomedics), incluindo epratuzumab Y-90 e epratzumab I-131, o anticorpo CD22 de Abiogen (Abiogen, Itália), CMC 544 (Wyeth/Celltech), combotox (UT Soutwestern), BL22 (NIH), e LympoS- can Tc99 (Immunomedics).

[0035] Os exemplos de anticorpos CD20 incluem: "C2B8", que é chamado agora "rituximab" ("RITUXAN®") (Patente dos Estados Unidos N°. 5.736.137); o anticorpo 2B8 marcado com ítrio-90 de murina denominado "Y2B8" ou "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponível de IDEC Pharmaceuticals, Inc (Patente dos Estados Unidos N° 5.736.137; 2B8 depositado no ATCC sob n° de acesso HB11388 no dia 22 de junho de 1993); IgG2a de murina "B1", também chamado "Tositumomab", opcionalmente marcado com 131I para gerar o "131I-B1" ou "iodo I131 tositumomab" anticorpo (BEXXAR®) comercialmente disponível de Corixa (ver, também, Patente dos Estados Unidos No 5.595.721); anticorpo monoclonal de murina "1F5" (Prensa et al., Blood 69 (2):584-591 (1987)) e variantes do mesmo incluindo "armação remendada" ou humanizado 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; depósito de ATCC HB-96450); anticorpo de murina 2H7 e quimérico 2H7 (Patente dos Estados Unidos N°. 5.677.180); humanizado 2H7 (WO 2004/056312, Lowman et al.,); 2F2 (HuMax-CD20), um totalmente humano, anticorpo de alta afinidade visado na molécula CD20 na membrana de célula das células B (Genmab, Dinamarca; ver, por exemplo, Glennie e van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003) e Cragg et al., Blood 101: 1045-1052 (2003); WO 2004/035607; US2004/0167319); os anticorpos monoclonais humanos enunciados em 2004 WO/035607 e US2004/0167319 (Teeling et al.,); os anticorpos cadeias de açúcar complexas ligadas ao N-glicosídio possuindo ligadas à região Fc descrita na US 2004/0093621 (Shitara et al.,); os anticorpos monoclonais e os fragmentos ligações pelo antígeno ligam a CD20 (WO 2005/000901, Tedder et al.,), tal como HB20-3, HB20-4, HB20-25, e MB20-11; moléculas de ligação de CD20, tal como a série AME de anticorpos, por exemplo, AME 33 anticorpos como enunciado em 2004 WO/103404 e US2005/0025764 (Watkins et al., Eli Lilly/Applied Molecular Evolution, AME); moléculas de ligação de CD20 tal como aqueles descrito na US 2005/0025764 (Watkins et al.,); Anticorpo de A20 ou variantes do mesmo, tal como anticorpo A20 quimérico ou humanizado (cA20, hA20, respectivamente) ou IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics); anticorpos ligando o CD20, incluindo Leu-16 esgotado pelo epítopo, 1H4, ou 2B8, opcionalmente conjugado com IL-2, como na US 2005/0069545A1 e 2005 WO/16969 (Carr et al.,); o anticorpo bioespecífico ligando CD22 e CD20, por exemplo, hLL2xhA20 (WO2005/14618, Chang et al.,); anticorpos monoclonais L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 ou NU-B2 disponível do Workshop Internacional de Tipificação de Leucócito (Valentim et al., em: Leukocyte Typing III (McMichael, editor, p. 440, universidade de Oxford Prensa (1987)); 1H4 (Haisma et al., Blood 92:184 (1998)); anti-CD20 auristati- na E conjugado (Seattle Genetics); anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/Cidade de Esperança); anti-CD20 terapia de MAB (EpiCyte); anticorpo de anti-CD20 TRU 015 (Trubion).

[0036] O termo "anticorpo monoclonal" tal como aqui utilizado refe re-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto mutações possíveis de ocorrência natural que podem ser apresentados em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigido contra um sítio antigênico único. Além disso, em contraste com preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes diferentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um determi-nante único no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerimento da produção do anticorpo por nenhum determinado método. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a ser usado de acordo com a presente invenção pode ser feito pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou pode ser feito pelo recombinante métodos de DNA (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 4.816,567). Em um modalidade adicional, "os anticorpos monoclonais" podem ser isolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas ao uso das técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos de murina e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. As publicações subsequentes descrevem a produção da alta afinidade (faixa de variação de nM) anticorpos humanos pelo arraste de cadeia (Markset al., Bio/Tecnologia, 10:779-783 (1992)), bem como infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para construir bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al. Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicional do isolamento de anticorpos monoclo- nais. Alternativamente, é possível agora produzir animais transgênicos (por exemplo, ratos) que são capazes, quando da imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a eliminação de homozigotos da região de junção de cadeia pesada do gene do anticorpo (JH) em ratos mutantes quiméricos e germinativos resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do vetor genético germinativo da imunoglobulina humana em tais ratos mutantes germinativos resultará na produção de anticorpos humanos durante o desafio de antígeno. Ver, por exemplo, Jako- bovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992).

[0037] Os anticorpos monoclonais aqui especificamente incluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nas quais uma porção da caeia pesada e/ou da leve é idêntica a, ou homóloga a, sequências correspondentes no derivado de anticorpos de uma determinada espécie ou pertencendo a uma determinada classe ou subclasse de anticorpo, enquanto o resto da cadeia (s) é idêntico a, ou homólogo a, sequências correspondentes no derivado de anticorpos de outras espé- cies ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exponham a atividade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81:6851-6855 (1984)).

[0038] O termo "região hipervariável" quando usado aqui refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de "uma região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio de variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio de variável de cadeia pesado; Kabat et al., Sequences of Polypeptides of Immunological Interest, 5a edição. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland. (1991)) e/ou aqueles resíduos de "um laço hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio de variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio de variável de cadeia pesado; Chothia e J. Mol. Biol Lesk. 196:901-917 (1987)). A "armação" ou os resíduos de "FR" são resíduos de domínio aqueles variáveis outros do que os resíduos de região hipervariáveis como aqui definido.

[0039] As formas "humanizadas" do não humano (por exemplo, murina) os anticorpos são anticorpos quiméricos contendo o derivado de sequência mínimo da imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) no qual os resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, região de estruturação de Fv (FR) os resíduos da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são considerados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Considera-se que estas modificações refinem também o desempenho de anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos dos laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todas das regiões de FR são aqueles de uma sequência de imunoglo- bulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma imunoglobulina região constante (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana.

[0040] A escolha de domínios variáveis humanos, ambos leve e pesado, para ser usado na criação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método "melhor e próprio", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é avaliada contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é muito próxima àquele do roedor então é aceita como a armação humana (FR) do anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)).

[0041] Outro método uso um determinado derivado de armação da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um determinado subgrupo de cadeias leves ou pesadas. A mesma armação pode ser usado para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

[0042] É adicional importante que anticorpos ser humanizado com a retenção da alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esta meta, de acordo com um método preferencial, os anticorpos humanizados estão preparados por um processo da análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais usando os modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles versado na técnica. Os programas de computador estão disponíveis que ilustram e expõem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina de candidato selecionadas. A inspeção destas exposições permite a análise do papel pro-vável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina de candidato, isto é, análise de resíduos que influem na capacidade da imunoglobulina de candidato de ligar o seu antígeno. Deste modo, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados do recipiente e sequências de importação para que a característica de anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antígeno alvo, seja atingida. Em geral, os resíduos de CDR são diretamente e o mais substancialmente envolvidos na influência em antígeno de ligação.

[0043] Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento total, geralmente o antígeno de ligação ou região variável do mesmo. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos de Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; e os anticorpos multiespecíficos formaram-se de fragmentos de anticorpo. Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem ser produzidos agora diretamente por células de hospedeiro de recombinante. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alter-nativamente, Fab fragmentos de '-SH pode ser diretamente recuperado de E. coli e quimicamente ligado para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al. Bio/Tecnologia 10:163-167 (1992)). Em outra modalidade, o F(ab')2 é formado uso o zíper de leicina GCN4 para promover a reunião da molécula de F(ab')2. De acordo com outra aproximação, os fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura de célula de hospedeiro de recombinante. Outras técnicas da produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o médico versado.

[0044] Em outras modalidades, o anticorpo da escolha é uma ca deia única fragmento de Fv(scFv). Ver WO 93/16185. a "cadeia única Fv" ou os fragmentos de anticorpo "sFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios está presente em uma cadeia de polipeptídeo única. Geralmente, o polipeptídeo de Fv também compreende um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada do antígeno de ligação. Para uma revisão sobre sFv ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, volume 113, Rosenburg e eds. SpringerVerlag Moore, Nova Iorque, páginas 269-315 (1994).

[0045] O termo "diacorpo" refere-se a pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios ligações pelo antígeno, que fragmentos com-preendem um domínio de variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio de variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de poli- peptídeo (VH - VL). Ao uso de um ligante que é demasiado curto para permitir a junção entre os dois domínios na mesma cadeia, força-se que os domínios se juntem com os domínios complementares de outra cadeia e criem dois sítios ligações pelo antígeno. Diacorpos são descritos mais totalmente em, por exemplo, EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:6444-6448 (1993).

[0046] A expressão "anticorpos lineares" quando uso em todas as partes do presente Pedido refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al., Polypeptide Eng. 8 (10):1057-1062 (1995). Resumidamente, estes anticorpos compreendem um par do tandem segmentos de Fd (VH-CH1-VH-CH1) que formam um par do antígeno regiões de ligação. Os anticorpos lineares podem ser bioespecíficos ou monoes- pecíficos.

[0047] Os "anticorpos multiespecíficos" têm a especificidade de ligação de pelo menos dois epítopos diferentes, onde os epítopos são normalmente de antígenos diferentes. Enquanto tais moléculas normalmente só ligarão dois antígenos (isto é, anticorpos bioespecíficos, BsAbs), os anticorpos com a especificidade adicional, tal como anticorpos de triespecífico são abrangidos por esta expressão quando usado aqui. Os exemplos de BsAbs incluem aqueles de um braço dirigido contra um antígeno de célula de tumor e outro braço dirigido contra uma molécula mais asseada citotóxica, tal como anti-FcaRI/anti- CD15, anti-p185H:R2/Fc RIII (CD16), anti-CD3/anti-célula-B-maligno (1D10), anti-CD3/anti-p185HER2, anti-CD3/anti-p97, anti-CD3/anti- carcinoma-da-célula-renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-carcinoma-do-cólon), anti-CD3/anti-melanócito análogo hormonal estimulante, anti-receptor-de-:GF/anti-CD3, anti-CD3/anti-CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, anti-molécula-de-adesão-de- célula-neural (NCAM)/anti-CD3, anti-folato proteína de ligação (FBP)/anti-CD3, anti-pan-antígeno-associado-a-carcinoma (AMOC- 31)/anti-CD3; BsAbs de um braço que liga especificamente a um antí- geno de tumor e um braço que liga a uma toxina, tal como antissapori- na/anti-Id-1, anti-CD22/antissaporina, anti-CD7/antissaporina, anti- CD38/antissaporina, anti-C:A/anti - cadeia A da ricina, anti-interferon - (IFN- )/anti-idiotipo-de-hibridoma, anti-CEA/anti-alcaloide-da-vinca; BsAbs para converter a enzima ativou profármacos, tal como anti- CD30/anti-fosfatase-alcalino (que catalisa a conversão da profármaco de fosfato de mitomicina ao álcool de mitomicina); BsAbs que pode ser usado como agentes fibrinolíticos, tal como anti - fibrina/ativador de plasminogênio de antitecido (tPA), anti - fibrina/antiativador de plasmi- nogênio tipo uroquinase (uPA); BsAbs para visar complexos imunes à célula alisam receptores, tal como lipoproteína de densidade anti-baixa (LDL)/anti-Fc receptor (por exemplo, FcαRI, ou Fc RIII); BsAbs para uso em terapia de doenças contagiosas, tal como anti-CD3/anti-vírus- da-herpes-simples (HSV), anticélula T receptor:CD3 complexo/anti- influenza, anti-Fc R/anti-VIH; BsAbs de detecção de tumor in vitro ou in vivo, tal como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti- p185HER2/anti-hapteno; BsAbs como adjuvantes de vacina; e BsAbs como instrumentos diagnósticos, tal como anti-coelho IgG/anti-ferritin, antiperoxidase de rábano silvestre (HRP)/anti-hormônio, antissomatos- tatina/antissubstância P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti- - galactosidase. Os exemplos de anticorpos de triespecífico incluem an- ti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti- CD3/anti-CD8/anti-CD37. Os anticorpos bioespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, F(ab')2 anticorpos bioespecíficos).

[0048] Um "anticorpo nu" com os objetivos aqui é um anticorpo que não é conjugado a uma parte citotóxica ou radiomarcação.

[0049] Os anticorpos com mais de duas valências são contempla dos. Por exemplo, os anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

[0050] Um "anticorpo intacto" aqui é aquele compreendendo duas regiões de ligação com antígeno, e uma região Fc. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma região Fc funcional.

[0051] O "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico co mo a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles na necessidade do tratamento incluem aqueles já com o distúrbio bem como aqueles no qual o distúrbio deve ser prevenido.

[0052] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com o anticorpo purificado como descrito aqui. Isto inclui tanto distúrbios crônicos como agudos e doenças e aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

[0053] A frase "cromatografia de troca iônica" refere-se a uma téc nica de separação na qual o composto é separado baseado na sua carga líquida. As moléculas são classificadas como qualquer ânion (possuindo uma carga negativa) ou cátions (possuindo uma carga positiva). Algumas moléculas (por exemplo, polipeptídeos) podem ter tanto aniônico como grupos catiônicos.

[0054] Uma membrana de cromatografia de troca iônica ligará um composto com uma carga positiva ou negativa total. Os sítios de ligação são localizados ao longo dos poros do adsorvedor. O composto é transportado ao sítio de ligação pela convecção. Uma membrana positivamente carregada (tocador de ânion) ligará um composto com uma carga negativa total. De modo inverso, uma membrana negativamente carregada (trocador de cátion) ligará um composto com uma carga positiva total.

[0055] As membranas de troca iônica podem ser também catego rizadas como fortes ou fracas. As membranas de troca iônica fortes são carregadas (ionizados) através de uma ampla faixa de variação de níveis de pH. As membranas de troca iônica fracas são ionizadas dentro de um faixa de variação de pH estreita. As quatro composições químicas de troca iônica mais comuns são:

[0056] Em geral, as membranas de troca iônica têm tamanhos de poro de 0,1 a 100 μm. Como uma referência, Sartobind Q (Sartorius AG) é uma membrana de troca aniônica forte possuindo um tamanho de poro nominal de 3-5 μm e está comercialmente disponível em formato de camada única ou múltipla, e Mustang Q (Pall Corporation) é uma membrana de troca aniônica forte possuindo um tamanho de poro nominal de 0,8 μm e está de mesmo modo comercialmente disponível em formato de camada único ou múltiplo. Como outra referência, Sartobind S (Sartorius AG) é uma membrana de troca catiônica forte possuindo um tamanho de poro nominal de 3-5 μm e está comercialmente disponível em formato de camada único ou múltiplo, e Mustang S (Pall Corporation) é uma membrana de troca catiônica forte possuindo um tamanho de poro nominal de 0,8 μm e está de mesmo modo comercialmente disponível em formato de camada único ou múltiplo.

[0057] Uma avaliação de tamanho de poro "nominal" descreve a capacidade da membrana de conservar a maioria absoluta de particu- lados em 60 para 98 % o tamanho de poro nominal.

[0058] O "pH" de uma solução mede a acidez ou alcalinidade em relação a ionização de uma amostra de água. O pH da água é neutro, isto é, 7. A maior parte de leituras de pH percorrem de 0 a 14. As soluções com um mais alto [H+] do que a água (pH menos de 7) são ácido; as soluções com um inferior [H+] do que a água (pH maior do que 7) são básicas ou alcalinas. o pH pode ser medido uso um metro de pH. O pH tampão pode ser ajustado com o uso de um ácido ou base como HCl ou NaOH.

[0059] O "pI" ou o "ponto isoelétrico" de uma molécula, tal como um polipeptídeo referem-se ao pH no qual o polipeptídeo contém um número igual de cargas positivas e negativas. O pI pode ser calculado da carga líquida dos resíduos de aminoácido do polipeptídeo ou pode ser determinado pela focagem isoelétrica. A natureza anfotérica de polipeptídeos para ter tanto aniônico como grupos catiônicos pode ser manipulados. O pH de um polipeptídeo pode ser baixado ao ponto onde o polipeptídeo desejado se comporta como um cátion (possuindo uma carga positiva). Alternativamente, o pH de um polipeptídeo pode ser aumentou ao ponto onde o polipeptídeo desejado se comporta como um ânion (possuindo uma carga negativa).

[0060] O termo "condutividade" refere-se à capacidade de uma solução de conduzir uma corrente elétrica entre dois eletrodos. A unidade básica da condutividade é o siemens (S), anteriormente chamado o mho. A condutividade é comumente expressada em unidades de mS/cm. Desde a carga em íons em facilidades de solução a condutân- cia da corrente elétrica, a condutividade de uma solução é proporcional à concentração de íon. Ambas estas medições estão em correlação bem com a força iônica. A força iônica está estreitamente relacionada à concentração de eletrólitos e indica como efetivamente a carga em um determinado íon é protegida ou estabilizada por outros íons em um eletrólito. A diferença principal entre força iônica e concentração de eletrólito é que o anterior é mais alto se alguns íons forem mais altamente carregados. Outra diferença entre os dois é que a força iônica reflete a concentração de íons livres, e não somente de quanto sal foi acrescentado a uma solução. A condutividade pode ser medida uso um medidor de condutividade, tal como vários modelos de medidores de condutividade Orion. Condutividade de uma solução pode ser alterada modificando a concentração de íons na mesma. Por exemplo, a concentração de um agente tamponante e/ou a concentração de um sal (por exemplo, cloreto de sódio, acetato de sódio, ou cloreto de potássio) na solução pode ser alteraram-se para atingir a condutividade desejada. Preferivelmente, a concentração de sal de vários tampões é modificada para atingir a condutividade desejada.

[0061] Para a cromatografia de membrana, a "taxa de fluxo" é normalmente descrita como volumes de membrana por hora (MV/h).

[0062] Para a cromatografia de membrana, a "densidade de carga" muitas vezes é expressada como os gramas da composição processada por litro da membrana.

[0063] Um "tampão" é uma solução que resiste modificações em pH pela ação dos seus componentes conjugados ácidos e baseados. Vários tampões que podem ser empregados dependendo, por exemplo, em pH desejado do tampão são descritos em Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., Corporação de editor Calbiochem (1975).

[0064] "Purificando" um anticorpo de uma composição compreen dendo o anticorpo e uma ou mais contaminantes que se deseja significar aumentam o grau de pureza do anticorpo na composição removendo (completamente ou parcialmente) pelo menos um contaminante da composição. "Uma etapa de purificação" pode ser a parte de um processo de purificação total que resulta em uma composição "homogênea". "Homogêneo" é usado aqui para referir-se a uma composição compreendendo pelo menos aproximadamente 70 % em peso do anticorpo de interesse, baseado no peso total da composição, preferivelmente pelo menos aproximadamente 80 % em peso, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90 % em peso, mesmo mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 95 % em peso.

[0065] Por "ligação" de uma molécula a uma membrana de troca iônica se deseja significar expor a molécula à membrana de troca iôni- ca sob condições adequadas (pH e/ou condutividade) de tal modo que a molécula é reversivelmente imobilizada em ou na membrana de troca iônica em virtude de interações eletrostáticas entre a molécula e um grupo carregado ou grupos carregados da membrana de troca iônica.

[0066] "Lavando" a membrana de troca iônica que se deseja signi ficar passar um tampão apropriado através de uma ou mais membranas de troca iônica.

[0067] "Eluindo" uma molécula (por exemplo, anticorpo ou conta- minante) de uma membrana de troca iônica se deseja significar remover a molécula da mesma.

[0068] Para a cromatografia de membrana, o "escoamento direto" refere-se à ligação de impureza à membrana enquanto o composto não é conservado.

[0069] A frase "modo de mistura" refere-se a um sorbente que tem a capacidade de separar o composto baseado em dois mecanismos diferentes, por exemplo, uma separação baseada nas diferenças de hidrofilicidade/ hidrofobicidade entre polipeptídeos recobertos em uma separação baseada pela carga líquida. Isto muitas vezes é realizado ao uso de um ligante multimodal que pode interagir com uma molécula desejada em vários modos diferentes de incluir a interação iônica e a ligação de hidrogênio ou a interação hidrofóbica. Os sorbentes como GE Healthcare Capto® MMC e Capto® Adhere são os exemplos do "modo de mistura" de resinas de cromatografia. Modos para Executar a Invenção

[0070] A invenção aqui fornece métodos para purificar um polipep- tídeo de uma composição (por exemplo, uma solução aquosa) compreendendo do polipeptídeo e um ou mais contaminantes. A composição é geralmente um resultando da produção recombinante do poli- peptídeo, mas pode ser que resultando de produção do polipeptídeo pela síntese de peptídeo (ou outros meios sintéticos) ou o polipeptídeo pode ser purificou de uma fonte nativa do polipeptídeo. Preferivelmente o polipeptídeo é um polipeptídio contendo da região de CH2/CH3. Em modalidades preferidas, o polipeptídio contendo a região de CH2/CH3 é um anticorpo. Produção Recombinante de Anticorpos

[0071] Para a produção recombinante do anticorpo, o ácido nuclei- co que o codifica é isolado e inserido em um vetor de replicável do clone adicional (a amplificação do DNA) ou para a expressão. DNA que codifica o anticorpo é prontamente isolado e sequenciou procedimentos convencionais de uso (por exemplo, ao uso de sondas de oli- gonucleotídeo que são capazes da ligação especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes de vetor geralmente incluem, mas não são limitados a, uma ou mais do seguinte: uma sequência de sinal, uma origem de réplica, uma ou mais genes de marcador, um elemento de melhorador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição (por exemplo, como descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.534.615, especificamente incorporado aqui por referência).

[0072] As células hospedeiras convenientes para clonar ou ex pressar o DNA nos vetores aqui são procariotas, leveduras, ou células eucarióticas superiores. As procariotas convenientes com esta finalidade incluem eubacteria, tal como organismos Gram-negativo ou Gram-positivo, por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgado na DD 266.710 publicada em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clone de E. coli preferencial é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outra cepa, tal como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27.325) seja conveniente. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitan- tes.

[0073] Além de procariotas, os micróbios eucarióticos, tal como fungos filamentosos ou levedura são clones ou hospedeiros convenientes para expressão de vetores de codificação de anticorpo. Saccha- romyces cerevisiae, ou levedura de padeiro comum, é o mais comu- mente usado entre os micro-organismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Contudo, diversos outros gêneros, espécies, e cepa estão co- mumente disponíveis e são úteis aqui, tal como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces tal como, por exemplo, K. lac- tis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wicke- ramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos tal como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus, tal como A. nidulans e A. niger.

[0074] As células hospedeiras convenientes para expressão do anticorpo glicado são derivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem células de inseto e planta. A cepa baculoviral numerosa e as variantes e as células de hospedeiro de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros, tal como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes al- bopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, a variante l-1 de Autographa californica NPV e a cepa de Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus pode ser usado como o vírus aqui de acordo com o presente invenção, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de célula de planta de algodão, milho, batata, feijão-soja, petúnia, tomate, e fumo também podem ser utilizadas como hospedeiros.

[0075] Contudo, o interesse foi maior em células de vertebrados, e a propagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento regular. Os exemplos dos úteis de mamífero apresentam linhagens de células incluem, mas não são limitados a, rim de macaco células de CV1 transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); as células de rim embrionárias humanas (293 ou 293 células subclone para o crescimento na cultura de suspensão, Graham et al., J. O general Virol. 36:59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chi- nês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 77:4216 (1980)); células sertolis de rato (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervicais humanas (HELA, ATCC CCL 2); células de rim caninas (MDCK, ATCC CCL 34); intimide células de fígado de rato (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); rato tumor mamário (MMT 060562, ATCC CCL51); células de TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células de MRC 5; células de FS4; e células hepatoma humanas (Hep G2). Muitas vezes, as células de CHO são preferidas para a expressão de anticorpos, e podem ser vantajosamente usadas para produzir os anticorpos purificados de acordo com a presente invenção.

[0076] As células hospedeiras são transformadas com a expres são descrita acima ou vetores de clonagem para a produção de anticorpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado como apropriado para induzir promotores, selecionando transformante, ou amplificando os genes que codificam as sequências desejadas.

[0077] As células hospedeiras usadas para produzir o anticorpo da presente invenção podem ser cultivadas em vários meios. O meio co-mercialmente disponível, tal como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), o RPMI-1640 (Sigma), e o Meio Eagle's Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são convenientes para o cultivo as células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito por Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Bio- chem.102:255 (1980), as Patentes dos Estados Unidos Números 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Re Patente dos Estados Unidos N°. 30.985 pode ser usado como meio de cultura das células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser complementado segundo a necessidade com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucelotídeos (tal como adenosina e timidina), antibióticos (tal como garamicina; a GENTAMICINA®), elementos de traço (definido como o composto inorgânico normalmente presente em concentrações finais na faixa de variação de micromolar), e a glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário também pode estar incluído em concentrações apropriadas que seriam conhecidas àqueles versado na técnica. As condições de cultura, tal como temperatura, pH, e assim por diante, são aqueles anteriormente uso com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão evidentes para o técnico ordinariamente versado.

[0078] Com o uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, o detrito de particulado, células hospedeiras ou células lisadas (por exemplo, resultando de homogeneização), é removido, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Onde o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão pode ser concentraram o uso de um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, um Amicon ou uni- dade de ultrafiltração de Millipore Pellicon. Método de Cromatografia de Troca iônica de Membrana da Invenção

[0079] Na modalidade preferida da invenção, a composição a ser submetida ao método de purificação aqui é o anticorpo produzido de um recombinantemente, preferivelmente um anticorpo intacto, expressado por um Ovário de Hamster Chinês (CHO) cultura de célula de hospedeiro de recombinante. Opcionalmente, a composição foi submetida a pelo menos uma etapa de purificação antes da cromatografia de troca iônica de membrana. A composição contém o anticorpo de interesse e uma ou mais contaminantes, tal como Proteínas de Ovário de Hamster Chinês (CHOP); lixívia proteína A; ácido nucleico; uma variante, fragmento, agregado ou derivado do anticorpo desejado; outro polipeptídeo; endotoxina; contaminante viral; componente de meio de cultura de célula (por exemplo, garamicina; GENTAMICINA®), etc.

[0080] Os exemplos de procedimentos de purificação adicionais que pode ser executaram antes de, durante, ou depois do método de cromatografia de troca iônica de membrana incluem o fracionamento em uma cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, no FE- NIL-SEPHAROSE®), precipitação em etanol, precipitação térmica, precipitação por polietileno glicol (PEG), focagem isoelétrica, HPLC de Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em HEPARINA SEPHAROSE®, a cromatografia de troca aniônica, cromatografia de troca catiônica, no modo de troca iônica mista, a cromatografia de foco, SDS-PAGE, a precipitação com sulfato de amônio, a cromatografia em hidroxiapatita, o eletroforese de gel, a diálise, a cromatografia de indução de carga hidrofílica, alto desempenho de filtração de fluxo tangencial (HPTFF), e cromatografia de afinidade (por exemplo, uso de proteína A, proteína G, um anticorpo, ou um substrato específico, ligante ou antígeno como o reagente de captura).

[0081] No uso de técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, o detrito particulado, ou fragmentos células hospedeiras lisadas, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou filtração. Quando o anticorpo é secretado no meio, as células hospedeiras recombinantes podem ser separadas do meio de cultura de célula por centrifugação ou filtração, por exemplo.

[0082] A maioria absoluta da purificação ocorre durante a croma- tografia de afinidade à proteína A. A proteína A é uma proteína de parede da célula bacteriana que liga especificamente à região Fc de anticorpos. Quando imobilizada no meio de cromatografia, a proteína A fornece uma técnica para purificar anticorpos recombinantes porque elas podem se ligar seletivamente a anticorpos em soluções complexas, permitindo que a impureza escoe direto.

[0083] O protocolo básico da coluna de afinidade com proteína A é direto: ligar em pH aproximadamente neutro e eluir em pH ácido. Proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificar o poli- peptídio contendo a região de CH2/CH3. A fase sólida é preferivelmente uma coluna compreendendo um vidro, sílica, ou superfície de agarose para imobilizar a proteína A. Preferivelmente, a fase sólida é uma coluna de vidro de poro controlado, coluna de ácido silícico, ou coluna de agarose altamente reticulada. Uma coluna Mabselect SuRe®, comercialmente disponível da GE Healthcare, é um exemplo de uma coluna de agarose altamente reticulada à proteína A eficaz na purificação de anticorpos. Às vezes, a coluna é coberta de um reagente, tal como gli- cerol, em uma tentativa de evitar a aderência não específica à coluna. A coluna PROSEP A®, comercialmente disponível de Millipore Corporation, é um exemplo de uma coluna de vidro de poro controlado com proteína A que é revestida de glicerol. A fase sólida para a cromato- grafia com proteína A é equilibrada com um tampão conveniente.

[0084] O derivado de preparação contaminado das células recom- binantes de hospedeiro é carregado na fase sólida equilibrada usando um tampão de carga que pode ser o mesmo que o tampão de equilíbrio. Como os fluxos de preparação contaminada através da fase sólida, o polipeptídeo é adsorvido na proteína A imobilizada e os outros contaminantes (tal como Proteínas de Ovário de Hamster Chinês, CHOP, quando o polipeptídeo é produzido em uma célula de CHO) não se ligam especificamente à fase sólida.

[0085] A etapa seguinte executada em sequência implica na re moção dos contaminantes ligados à fase sólida lavando a fase sólida com uma solução contendo um sal, aminoácido, e/ou solvente de ele- trólito hidrofóbico em uma etapa intermediária de lavagem. Em modalidades preferidas, o sal de lavagem contido na mesma é o fosfato de potássio, o aminoácido é a arginina, e o eletrólito hidrofóbico é o TE- MAC e/ou TEAC. Embora um soluto único possa estar presente na lavagem, em certas modalidades, dois ou mais tais solutos podem ser usados. O soluto é preferivelmente acrescentado a uma solução tam- ponada possuindo um pH próximo da neutralidade.

[0086] Depois da etapa intermediária de lavagem do parágrafo precedente, o polipeptídeo de interesse é recuperado da coluna. Isto é normalmente atingido usando um tampão de eluição conveniente. O polipeptídeo, por exemplo, pode ser eluído da coluna usando um tampão de eluição possuindo um pH baixo, por exemplo, variando de aproximadamente 2 a 5, e preferivelmente variando de aproximadamente 2,5 até aproximadamente 3,5. Os exemplos de tampões de eluição com esta finalidade incluem tampões de acetato ou citrato.

[0087] A cromatografia de membrana de troca iônica é executada como afirmado aqui. Uma decisão é primeiro tomada quanto a se a membrana de troca catiônica ou ânion deve ser empregada. Embora o ponto isoelétrico (pI) de algumas faixas de variação de anticorpos de aproximadamente 6,7 a 9,4, o pI de muitos anticorpos seja alto (muitas vezes > 8 e às vezes > 9). Em geral, uma membrana de troca catiôni- ca pode ser usada para anticorpos com pI maior do que aproximadamente 8, e uma membrana de troca aniônica pode ser usada para anticorpos com pI menor do que aproximadamente 8.

[0088] Para a cromatografia de membrana de troca catiônica é corrida no modo de deslocamento de proteína nativa, o pH do material de carga é ajustado até de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 unidades de pH abaixo do pI do anticorpo, a condutividade do material de carga é ajustada a aproximadamente <40 mS/cm, dependendo do pH, e o anticorpo então é bombeado através da membrana. Em algumas modalidades, o pH do material de carga é ajustado até aproximadamente de aproximadamente 1 a 4 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH, ou aproximadamente 1 unidade de pH, abaixo do pI do anticorpo. Em outras modalidades, a con- dutividade do material de carga é ajustada a aproximadamente <20 mS/cm ou aproximadamente <10 mS/cm, dependendo do pH. Como o pH da carga é menor do que o pI do anticorpo, o anticorpo (que ficou positivamente carregado) não vai ter escoamento direto inicialmente. Melhor o anticorpo será eletrostaticamente ligado aos grupos funcionais negativos do trocador de cátion. Isto é porque o anticorpo (positivo) e membrana (negativa) têm a carga oposta. Como o pI de muitos contaminantes, por exemplo, as proteínas de célula hospedeiras, tal como CHOP, que eluem com o anticorpo durante cromatografia de afinidade à proteína A é apenas ligeiramente diferente do pI do anticorpo, isto é, a pI pode diferenciar-se por apenas de aproximadamente 0,05 até aproximadamente 0,2 unidade de pI, estes contaminantes, como os anticorpos "básicos", também se ligarão à membrana. Sem estar preso na teoria, parece que para a cromatografia de membrana de troca catiônica corre no modo por deslocamento de proteína nativa, em pH e condições de condutividade que induzem a carga com mínima de proteção iônica, os contaminantes preferencialmente se ligam à membrana, ou de outra maneira efetivamente "se desloca" o anticorpo da membrana (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), permitindo ao anticorpo "eluir" da matriz ou escoar direto após estar ligado e é recuperado no efluente.

[0089] Para a corrida de cromatografia de troca aniônica de mem brana no modo por deslocamento de proteína nativa, o pH do material de carga é ajustado até aproximadamente de 1 a aproximadamente 5 unidades de pH acima do pI do anticorpo, a condutividade do material de carga é ajustada a aproximadamente <40 mS/cm, dependendo do pH, e o anticorpo então é bombeado através da membrana. Em algumas modalidades, o pH do material de carga é ajustado até aproximadamente de 1 a aproximadamente 4 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 unidades de pH, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 unidades de pH, ou aproximadamente 1 unidade de pH, acima do pI do anticorpo. Em outras modalidades, a con- dutividade do material de carga é ajustada a aproximadamente <20 mS/cm ou aproximadamente <10 mS/cm, dependendo do pH. Como o pH da carga é maior do que o pI do anticorpo, o anticorpo (que ficou negativamente carregado) não vai o escoamento direto inicialmente. Melhor o anticorpo será eletrostaticamente ligado aos grupos funcionais positivos do tocador de ânion. Isto é porque o anticorpo (negativo) e de membrana (positivo) tem a carga oposta. Como o pI de muitos contaminantes, por exemplo, as proteínas de célula hospedeiras, tal como CHOP, que eluem com o anticorpo durante a cromatografia de afinidade à proteína A são só ligeiramente diferentes do pI do anticorpo, isto é, a pi pode diferenciar-se por só aproximadamente 0,05 até aproximadamente 0,2 unidades de pI, estes contaminantes, como os anticorpos "ácidos", também ligarão à membrana. Sem ser ligado pela teoria, parece que para a cromatografia de troca aniônica de membrana correu no modo por deslocamento de proteína nativa, em pH e condições de condutividade que induzem a carga com mínimo proteção iônica, os contaminantes preferencialmente ligam à membrana, ou de outra maneira efetivamente "deslocam" o anticorpo da membrana (RR Drager, FE Regnier, J Chromatogr. 359:147-55 (1986)), permitindo o anticorpo "para eluir" da matriz ou escoamento direto após liga e é recuperado no efluente.

[0090] Em um exemplo, a cromatografia em membrana é corrida em um sistema de cromatografia padrão ou em um sistema de croma- tografia alfandegário como um AKTA® Explorador (GE Healthcare) equipado de medidas de pressão, sensores, e bomba mais controladores de bomba. Neste exemplo, o dispositivo de membrana é instalado a jusante de uma medida de pressão. No dito exemplo, o pH e os detectores de condutividade são instalados a jusante do dispositivo de membrana. Continuando com este exemplo, o sistema é completamente lavado com a água e depois com o tampão de equilíbrio antes da instalação da membrana. Continuando também com o exemplo, o sistema com a membrana é lavado com água com o tampão de equilíbrio até que o pH de solução e a condutividade de saída combinem com a especificação de tampão de equilíbrio (aproximadamente cinco volumes de membrana) e uma base estável é observada. Continuando mesmo também com este exemplo, o material de alimentação é carregado por uma bomba em 333 a 2667 MV/hora, pH 5,5 (para a purificação de um anticorpo "básico" hipotético) ou pH 8,0 (para a purificação de um anticorpo "ácido" hipotético), em uma condutividade de aproximadamente 4 mS/cm. Continuando ainda com este exemplo, a operação de pressão reversa, e o pH e as modificações de condutividade durante a operação são registrados. Finalmente, neste exemplo, o po- lipeptídeo no efluente da membrana é coletado imediatamente quando traços de absorvância no ultravioleta (UV) em 280 nm for 0,2 unidades de absorvância maior que a base, a coleta do conjunto é parada assim que o traço de UV em 280 nm esteja abaixo de 0,2 unidade de absor- vância, e as amostras do conjunto na fração efluente de membrana são analisadas para a concentração de polipeptídeo, dímero/nível de agregação, proteínas celulares presentes, DNA, e lixívia de proteína A. A etapa de recuperação é tipicamente calculada usando o polipeptídeo carregado e o polipeptídeo no efluente de membrana. A membrana é tradicionalmente usada apenas uma vez.

[0091] Quanto a ensaios analíticos, os teores de polipeptídeo (concentração de anticorpo) podem ser determinados por absorvância em 280 nm usando um espectrofotômetro Beckman. A agregação de anticorpo pode ser determinada pela cromatografia de exclusão de tamanho. Os níveis de proteína de célula hospedeira, por exemplo, CHOP, podem ser analisados por um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA). A célula hospedeira DNA pode ser quantificada por emprego de PCR TaqMAN (reação de cadeia de polimerase). A lixívia de proteína A pode ser dosada usando o método à base de ELISA imunoquímica recomendado pelo fabricante da resina para a proteína A.

[0092] Os seguintes tampões são hipoteticamente projetados e testados para o uso com a membrana S: (1) ácido acético de 89 mm, 127 mM base de TRIS, ácido cítrico de 21 mm, pH 5,5, 6,0 mS/cm, (2) MES de 28 mm, NaCl de 95 mm, pH 6,0, 11 mS/cm, (3) NaOAc de 200 mm, pH 5,5, 12 mS/cm, (4) NaOAc de 100 mm, pH 5,5, 6,4 mS/cm, e (5) ácido acético de 96 mm, 65 mM TRIS, pH 5,0, 3.6 mS/cm.

[0093] Os seguintes tampões são hipoteticamente projetados e testados para o uso com a membrana Q: (1) 50 mM TRIS, NaCl de 15 mm, pH 8,0, 4.3 mS/cm, (2) 25 mM TRIS, pH 8,0, 1.3 mS/cm, (3) 60 mM TRIS, NaCl de 118 mm, pH 8,0, 15.7 mS/cm, (4) 50 mM TRIS, 50 mM NaOAc, pH 8,0, 7,0 mS/cm, (5) HEPES de 25 mm, NaOAc de 85 mm, pH 7,0, 6,5 mS/cm, e (6) ácido acético de 91 mm, 130 mM TRIS, pH 8,0, 5,0 mS/cm.

[0094] Adicionalmente, qualquer sistema tampão pode ter o pH ajustado acima ou abaixo com a adição de ácido acético, ácido cítrico, HEPES, ácido clorídrico, ácido fosfórico, hidróxido de sódio, TRIS, ou outros tais tampões ácidos e básicos para conseguir um pH conveniente. Qualquer sistema tampão também pode ter a condutividade ajustada acima ou abaixo de uso da água purificada, água da injeção (WFI), acetato de sódio, cloreto de sódio, fosfato de potássio, ou qualquer outro sal inferior ou superior contendo tampões para atingir uma condutividade conveniente.

[0095] O desenvolvimento da etapa de cromatografia em membra na por deslocamento de proteína nativa é direto. O material de carga é corrido através da membrana a vários níveis de pH e condutividade. A retenção do polipeptídeo, anticorpo ou contaminante, pode ser realçada quando a molécula tem uma grande interação eletrostática. As interações eletrostáticas podem ser realçadas fazendo a corrida sob condições onde os polipeptídeos são altamente carregados, isto é, pelo uso de um tampão possuindo com um pH suficientemente distinto do pI do polipeptídeo, realçando a carga do polipeptídeo, e uma força iô- nica baixa para prevenir a proteção das cargas por íons tampões. Ao contrário, as interações eletrostáticas podem ser reduzidas fazendo a corrida sob condições onde os polipeptídeos são fracamente carregados, isto é, pelo uso de um tampão possuindo um pH suficientemente perto do pI do polipeptídeo, reduzindo a carga do polipeptídeo, e uma alta força iônica para permitir a proteção das cargas por íons tampões. Por conseguinte, os polipeptídeos possuindo propriedades físico- químicas diferentes podem ser separados pela adsorção de membra- na otimizando a solução tamponadora. Algumas moléculas podem ser conservadas em uma dada membrana, enquanto outras escoam direto baseado na seleção apropriada do pH e da força iônica do tampão.

[0096] A preparação do anticorpo obtido de acordo com o método de cromatografia de troca iônica de membrana aqui pode ser submetida à etapa de purificação adicional, se necessário. A etapa de purificação adicional, como exemplo, foi discutida acima.

[0097] Referindo-se à figura 12, um exemplo de um esquema de purificação bem-sucedido é um processo de recuperação que implica uma etapa de fracionamento inicial de cromatografia de afinidade à proteína A, uma etapa de purificação intermediária por cromatografia de troca catiônica corrida em modo ligar/eluir, e uma etapa de acabamento final por cromatografia de troca aniônica corrida em um modo de escoamento direto.

[0098] Referindo-se à figura 13, um exemplo de um esquema de purificação melhorado é um processo de recuperação que implica na etapa de fracionamento inicial de cromatografia de afinidade à proteína A, mas substitui a corrida de cromatografia em coluna de troca catiôni- ca no modo ligar/eluir por uma membrana de troca catiônica corrida no modo por deslocamento de proteína nativa. Isto seria vantajoso por muitas razões, uma razão que é que a etapa intermediária e o acabamento podem ser combinados em uma operação contínua, isto é, uma única etapa.

[0099] Opcionalmente, o anticorpo é conjugado a uma ou várias moléculas heterólogas como desejado. A molécula heteróloga, por exemplo, pode ser aquele que aumenta a meia-vida do anticorpo no soro (por exemplo, polietileno glicol, PEG), ou ela pode ser marcada (por exemplo, uma enzima, um marcador fluorescente e/ou radionuclí- deo), ou uma molécula citotóxica (por exemplo, uma toxina, fármaco quimioterapêutica, ou isótopo radioativo etc.).

[00100] Uma formulação terapêutica compreendendo o anticorpo, opcionalmente conjugado com uma molécula heteróloga, pode ser preparada misturando o anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com veículoes farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Oslo, A. Editor (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. "Farmaceuticamente aceitáveis" veículos, excipientes, ou estabilizadores são não tóxicos aos pacientes nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões, tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, tal como metil ou propril parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímero hidrofílico, tal como polivinilpir- rolidona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, histidi- na, arginina, ou lisina; monossacarídios, dissacarídios, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; açúcar, tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formam o sal, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tal como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).

[00101] Os ingredientes ativos também podem ser apanhados com laço na microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacer- vação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulo- se ou microcápsula da gelatina e poli - (metacrilaro de metila) micro- cápsula, respectivamente, em sistemas de entrega de droga coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Editor (1980).

[00102] A formulação a ser usada para a administração in vivo deve ser estéril. Isto é prontamente realizado pela filtração através de filtração por membranas estéreis.

[00103] As preparações de retenção e liberação podem ser preparadas. Os exemplos convenientes de preparações de retenção- liberação incluem matrizes semipermeáveis do polímero hidrofóbico sólido contendo o anticorpo, tais matrizes estando na forma de artigos formados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de retenção-liberação incluem o poliéster, hidrogéis (por exemplo, poli (metacrilato de 2-hidroxietila), ou poli (álcool vinílico)), polilac- tídios (Patente dos Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de L- ácido-glutâmico e Y—etil—L—glutamato, acetato de vinil-etileno não de- gradável, copolímeros ácidos lácticos e ácidos glicólicos degradávéis, tal como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolídio), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

[00104] O anticorpo purificado como aqui divulgado ou a composição compreendendo o anticorpo e um veículo farmaceuticamente aceitável então é utilizado para vários usos diagnóstico, terapêutico ou outros conhecidos por tais anticorpos e composições. Por exemplo, o anticorpo pode ser usado para tratar um distúrbio em um mamífero administrando uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ao mamífero.

[00105] Os seguintes exemplos são oferecidos como forma de ilustração e não como limitação. As descrições de todas as citações no presente Relatório Descritivo são expressamente incorporadas aqui pela referência. Exemplos Introdução

[00106] Os títulos de biorreator de anticorpos monoclonais (mAbs) estão aumentando conforme melhoram as condições de cultura de célula. As maiores bateladas do mAbs podem ser difíceis de purificar por cromatografia de coluna de uso tradicional. As novas resinas com capacidades de ligação aumentadas podem não ser suficientes para evitar a necessidade de repetir ciclicamente ou correr múltiplas colunas em paralelo. A incapacidade de tratar eficientemente maiores bateladas pode comprimir negativamente o preço de capacidade da planta e das mercadorias. Adicionalmente, as necessidades da indústria de bi- oprocessamento por instrumentos mais adequados, com eficiência de custo para reduzir o preço de mercadorias. As pequenas tecnologias de purificação, disponíveis que podem reduzir simultaneamente os custos de validação e de trabalho, são desejáveis. Conforme evolua a indústria, as membranas de troca iônica podem se tornar mais vantajosas para o processamento de mAb.

[00107] Embora os métodos de cromatografia de coluna sejam robustos e fiáveis, eles geralmente têm uma baixa quantidade tratada de massa porque o desempenho de separação é dependente da difusão de poro. O produto e a impureza devem difundir lentamente pelos poros para acessar os sítios de ligação. Em contraste, as membranas não são limitadas pela difusão de poro. O desempenho de separação é independente da taxa de fluxo e por isso as membranas são capazes de tratar quantidades de massa muito mais altas em comparação com resinas. As membranas são também mais convenientes do que as resinas porque elas não necessitam corpos de coluna, empacota- mento/desempacotamento de coluna, ou qualificação. As membranas de escala industriais estão disponíveis em cartucho ou formatos auto- encapsulados que podem ser desfeitos após um uso único, também eliminando preços de revalidação associados com a reutilização e o armazenamento. As membranas são também menores e significativamente mais leves do que as colunas cheias de resina, o que facilita o tratamento dentro de uma unidade de fabricação.

[00108] As membranas realmente têm algumas limitações. Em comparação com as resinas eles são uma tecnologia relativamente nova que ainda tem de experimentar a integração comum em escala industrial. Os tipos de membranas comercialmente disponíveis e a seleção de ligantes bem caracterizados são limitados. As membranas são também significativamente mais caras do que as resinas de troca iônica. Adicionalmente, eles não são um meio ótimo para executar a cromatografia de ligar e eluir em escala industrial. As membranas têm capacidades de ligação relativamente baixas que são difíceis de compensar economicamente através da ciclização. Muitas destas questões serão provavelmente resolvidas conforme as novas gerações de membranas sejam desenvolvidas.

[00109] Apesar das limitações, as membranas estabeleceram um nicho na purificação a jusante. As membranas de troca iônica provaram ser bem-sucedidas como acompanhamento de uma etapa de captura da Proteína A mAb. As membranas são ideais nesta posição porque os níveis de impureza são baixos e, quando usadas no modo de escoamento direto, a capacidade de ligação não está mais limitando. A cromatografia de escoamento direto é definida como uma operação cromatográfica onde a proteína desejada flui através do meio sorbente sem ligação, enquanto a impureza apropriadamente carregada é ad- sorvida. Estendida à cromatografia de membrana, está uma técnica que se capitaliza com uma força repulsiva estabelecida entre a mem-brana e a mAb para que a maioria absoluta de sítios de ligação permaneçam disponível para a adsorção das espécies CHOP opostamen- te carregadas.

[00110] Este estudo concentra-se na purificação de anticorpos mo- noclonais usando membranas de troca iônica no modo por deslocamento de proteína nativa. A aproximação diferencia-se do escoamento direto porque mAb é processado através da membrana em pH e condições de condutividade que causam a adsorção daquele produto. Isto é realizado correndo com força iônica baixa e em um pH acima do pI da mAb durante a troca aniônica, e abaixo do pI mAb durante a troca catiônica. Nestas condições, uma força de atração é estabelecida entre a membrana e mAb resultando na adsorção de produto. A carga de fluxo de alimentação continua além da capacidade de ruptura e o efluente de membrana é coletado em uma forma purificada. Os dados experimentais do modo por deslocamento de proteína nativa mostram alta purificação e alto rendimento, que não foram óbvios devido à interação eletrostática forte entre a membrana e a mAb.

[00111] Quatro DNA recombinantes derivados da mAbs foram selecionados para a análise baseada na sua faixa de variação de pontos isoelétricos (pI 6,7 - 9,3, calculado baseado na sequência de aminoá- cido). Os quatro mAbs foram produzidos em culturas de célula de CHO na Genentech Inc e foram parcialmente purificados com uma ou mais etapas de cromatografia de coluna (Proteína A ou Proteína A & troca iônica). Os fluxos de alimentação foram escolhidos baseados a níveis residuais da proteína de ovário de hamster chinês (CHOP).

[00112] Este estudo explora a capacidade de membranas de troca iônica Mustang® S, Mustang® Q, e Sartobind® S para retificar CHOP em pH e condições de condutividade que também causam a adsorção da mAb. A purificação da CHOP e o rendimento foram investigados como uma função de pH, condutividade, densidade de carga, taxa de fluxo e tipo de membrana. O aumento de escala de membrana e a regeneração também foram estudados, e a viabilidade do processamento contínuo foi explorada. Materiais e Métodos. Fluxo de alimentação.

[00113] Os fluxos de alimentação foram tomados de bateladas de cultura de célula industriais, experimentais, ou pequena escala (Ge- nentech Inc, São Francisco do Sul, Califórnia) inicialmente produzido para objetivos comerciais ou de pesquisa. Cada fluxo de alimentação foi parcialmente purificado, significando que as células foram separadas e o fluido clarificado foi purificado mais de pelo menos uma etapa de cromatografia de coluna (Proteína A ou Proteína A & troca iônica). Cada fluxo de alimentação continha um anticorpo monoclonal terapêutico alvo (IgG1 ou IgG4) e um nível quantificável de impureza de célula hospedeira. A composição de cada fluxo de alimentação variou dependendo do processo de mAb individual e o nível da purificação. Em geral, o pH de fluxo de alimentação foi 5,5 - 8,0, a condutividade foi 3,2 - 9,0 mS/cm, e a concentração de produto foi 3,5 - 6.9 mg/mL. A tabela 1 mostra características de fluxo de alimentação de cada um dos mAbs usados neste estudo. Quantificação de mAb

[00114] A concentração de mAb foi determinada pelo uso de UV espectrofotométrico de varredura em 280 e 320 nm. Os níveis da CHOP foram muito baixos para ter um efeito apreciável sobre a absor- vância de UV. As amostras contendo mAb foram diluídas com o dilu- ente apropriado que não interferiu na faixa de variação de 0,1 a 1,0 AU. A preparação de mostra e as leituras de varredura de avaliação foram executadas em duplicata e o valor médio foi registrado. O coeficiente de absorção do mAbs testado foi 1,45 - 1,70 (mg/mL)-1cm-1. A absorvância em 280 nm e 320 nm, fator de diluição, comprimento de caminho (1 cm), e coeficiente de absorção foi usado para calcular a concentração mAb usando a equação conhecida como a Lei de Lambert-Beer.

Quantificação das Proteínas de Célula Hospedeira do CHO (CHOP)

[00115] Um ensaio imunossorbente de ligação enzimática (ELISA) foi usado para quantificar os níveis de CHOP. Anticorpos de afinidade anti-CHOP purificados de cabra foram imobilizados em poços de placa de microtitulação. As diluições das amostras contendo CHOP, os padrões, e os controles, foram incubados nos poços, seguidos pela incubação com anticorpos de cabra anti-CHOP conjugados com peroxidase de rábano silvestre. A atividade enzimática da peroxidase de rábano silvestre foi detectada com o dicloridrato de o-fenilenodiamina. O CHOP foi quantificado lendo absorvância em 492 nm em um leitor de placa de microtitulação. Um programa de computador para ajuste de curva foi usado para gerar a curva padrão e automaticamente calcular a concentração da amostra. O faixa de variação do ensaio de ELISA foi tipicamente de 5 ng/ml a 320 ng/ml. Para cada amostra, 2-4 diluições foram analisadas e calculadas a média dos valores. Os valores da CHOP foram divididos pela concentração mAb e os resultados foram informados em unidades de ppm (ng CHOP/mg mAb).

[00116] As amostras de filtrado que expõem níveis da CHOP abaixo do limite da quantificação (LOQ) foram posteriormente concentradas para obter resultados quantificáveis. As amostras foram concentradas 10 vezes usando uma centrífuga Amicon® ultra15, filtro 10 kD MWCO (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts), e centrifugadora Ep- pendorf 5810R (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha) em 5 - 25°C, e 3200 - 4000 rpm por 10 - 20 minutos. Membranas

[00117] As membranas testadas foram o Mustang® S e Q (Pall Corporation, Colinas do Leste, Nova Iorque) e Sartobind® S (Sartorius- Stedim Biotech S.A., Aubagne, a França). O Mustang® S e Sartobind® S são membranas de troca catiônica fortes e o Mustang® Q é uma membrana de troca aniônica forte. O Mustang® S e Sartobind® S são modificados com uma forma de ácido sulfônico e o Mustang® Q é modificado com uma forma da amina quaternária. O Mustang® S e Q são feitos da polietersulfona (PES) com poros de 0,8 μm e o Sartobind® S é feito da celulose regenerada com poros de 3-5 μm. Para aumentar a capacidade de ligação cada fabricante combina múltiplas camadas da membrana em cada dispositivo. O número total de camadas e a espessura variam dependendo do fabricante e o tamanho do dispositivo que é fabricado. O volume de membrana (MV) é o volume físico da membrana (sólidos e vazios) e é medido em unidades de mL. Vários dispositivos de membrana que representam múltiplas escalas foram usados neste estudo. A tabela 2 lista as especificações pertinentes de cada membrana testada. Sistemas de Filtração

[00118] Os testes de pequena escala foram executados com um AKTA Explorer® 100 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut), que é um sistema de purificação de processo programável incluindo uma bomba de medição integrada, sensor de pressão, e pH ligado em série, con- dutividade, e sensor de UV. O sistema Explorer foi programado e controlado através de um computador que roda o software da UNICORN® v5.10 (GE Healthcare, Fairfield, Connecticut). Os testes de pequena escala também foram executados usando um sistema manual consistindo de uma bomba peristáltica Masterflex® L/S® de acionamento digital econômico (Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois), sensor de pressão de DTX® Plus TNF-R ligado em série (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), e uma balança da AND EK-1200i (A&D Company, Ltd., Tóquio, Japão). A balança foi usada para monitorar fisicamente a taxa de fluxo da bomba medindo o acúmulo de massa. A massa foi convertida no volume que assume uma densidade de fluxo de alimentação de 1,0 g/mL. A pressão dos transformadores ligados em série e a massa da balança foram continuamente monitoradas usando um sistema de aquisição de dados de rede NetDAQ® 2640A/41A (Fluke, Everett, Washington) que foi ligado a um computador que corre Trendlink® a versão 3.1.1 (Canary Labs Inc, Martinsburg, a Pensilvânia) e a versão 2.40 RsCom (A&D Company, Ltd., Tóquio, o Japão) software de pressão e coleta de massa, respectivamente. Os estudos de aumento de escala foram executados uso um AKTA Pilot® (GE Healthcare, Fairfield, o Connecticut) que roda o software de UNICORN® v5.10. O Pilot foi equipado de uma bomba maior, mas foi funcionalmente equivalente ao Explorer. Técnicas de Coleta de Mostra de Filtrado

[00119] O filtrado foi coletado de três modos diferentes. As amostras de aprisionamento e as frações foram as mais comuns. Uma amostra de aprisionamento é uma pequena parte alíquota instantânea do filtrado tomado em uma quantidade tratada específica. As frações são maiores amostras de filtrado e são definidas por faixas de variação de quantidade tratada. O filtrado também foi coletado como um grande conjunto único. A análise do conjunto é eficaz, mas amostras de aprisionamento e as frações são geralmente mais úteis para monitorar mAb e níveis da CHOP porque as amostras consecutivas podem ser combinadas para mostrar tendências. Experimento

[00120] A matéria-prima foi removida do armazenamento frio (2-8oC ou <-70oC) e deixada equilibrar à temperatura ambiente. Foram então opcionalmente ajustados o pH e/ou a condutividade nas condições mostradas na Tabela 1 usando agente titulante apropriado (isto é, 1,5 M tris base ou ácido cítrico 1 M) ou diluente (água purificada ou cloreto de sódio a 5 M). Ela então foi filtrada fora de linha usando uma Milli- pak-20 de 0,2 μm (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts), AcroPak® 20 (Pall Corporation, East Hill, Nova Iorque) ou filtro de vá- cuo de 1000 mL (Thermo Fisher Scientific, Rochester, Nova Iorque) para remover qualquer precipitado que possa ter se formado durante o armazenamento frio ou o condicionamento.

[00121] O sistema de filtração foi preparado lavando com água a carga e as linhas de filtrado usando água purificada ou tampão apropriado. A membrana foi colocada ligada em série a jusante da bomba de alimentação e o sensor de pressão e depois foi lavada com água com 50 - 500 MV de água purificada ou tampão de equilíbrio. Após enxágue, a alimentação foi dirigida à membrana em uma quantidade variável e foi carregada em uma taxa de fluxo constante de 333 a 2667 MV/hora. Durante a fase da carga o filtrado foi escolhido segundo a necessidade. A membrana então foi opcionalmente lavada com o tampão para coletar qualquer produto residual. Para manter a retenção de impureza na membrana, a lavagem (tampão de lavagem a.k.a) com tampão foi geralmente semelhante em pH e igual a, ou mais baixa, em condutividade em relação à alimentação.

[00122] Em alguns casos, o adsorvedor de membrana foi eluído. A eluição da membrana só foi executada usando o Explorer ou Pilot para que o acúmulo pudesse ser facilitado pelo sensor de UV ligado em série. A membrana foi eluída usando um tampão de sal superior (acetato de sódio de 20 mM e cloreto de sódio de 350 mM, pH 5,5 ou 25 mM tris e cloreto de sódio de 250 mM, pH 8,0) em uma taxa de fluxo constante de 333 - 2667 MV/hora e foi acumulada com DO de 0,5 - 0,5. Processamento Contínuo

[00123] Os experimentos de processamento contínuos foram executados no Explorador AKTA. Durante estes experimentos, a coluna Q de escoamento direto foi ajustada no pH ligado em série e imediatamente carregada para a membrana de Mustang® S. A coluna Q foi empacotada com resina Q Sepharose de fluxo rápido (diâmetro x comprimento: 1.1 cm x 20 cm). A saída de coluna foi ligada à entrada de uma conexão T e o ajuste de pH foi realizado ligado em série acionando a bomba B na entrada oposta da conexão T. A conexão T forneceu a mistura adequada e a solução ajustada do pH foi dirigida à entrada da membrana de Mustang® S. A taxa de fluxo através da coluna foi mantida em 100 cm/hora (1,58 mL/minuto). A taxa de fluxo através da membrana foi ligeiramente mais alta (aproximadamente 2,2 %) devido ao fluido acrescentado para ajuste de pH ligado em série. Resultados Desempenho de Membrana de Troca Catiônica de Pequena Escala (CEX)

[00124] Conjunto de troca aniônica de MAb 1 em pH 5,5 e 6,0 mS/cm foi processada em membrana de Mustang® S 0,18 mL de pe-quena escala em uma taxa de fluxo constante de 667 MV/hora. O pH de mAb 1 foi 3,4 unidades de pH abaixo do pI e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. A alimentação e as amostras de aprisiona-mento de filtrado foram analisados para mAb e impureza de célula hospedeira. A figura 1 mostra que o Mustang® S inicialmente reduziu CHOP de 38 a 4.3 ppm. CHOP aumentou ligeiramente a 5.7 ppm como a densidade de carga aumentou a 16,000 g/L. Os resultados também mostram que o alto rendimento foi atingido, conseguindo aproxi-madamente 100 % após 5000 g/L.

[00125] Para identificar mAb e dependências de carga, o conjunto de troca aniônica de mAb 2 foi adicionalmente processado em uma Mustang® S em pH 5,5 e 8,0, O fluxo de alimentação de mAb 2 foi partido em porções iguais, o primeiro foi mantido em pH 8,0 e 5,0 mS/cm, e o segundo foi ajustado ao pH 5,5 e 6,4 uso de mS/cm 1M ácido cítrico. Ambos os fluxos de alimentação foram processados em 0,18 mL pequena escala de membrana Mustang® S na taxa de fluxo constante de 667 MV/hora. O mAb 2 em pH 5,5 e 8,0 foi abaixo do pI e por isso positivamente carregado. A alimentação e as amostras de aprisiona- mento de filtrado foram analisadas e os resultados da CHOP são mos-trados na figura 2. Em pH 5,5 o Mustang® S inicialmente reduziu CHOP de 51 a 3,0 ppm, e semelhante a mAb 1, os níveis aumentaram com a densidade de carga. O desempenho de membrana diminuiu substancialmente em pH 8,0, claramente demonstrando que a adsor- ção da CHOP é dependente de pH. A figura 3 mostra que o rendimento é semelhante em ambas as condições de pH, com rendimento maior ou igual a 96 % sendo atingido após uma densidade de carga de aproximadamente 5.000 g/L.

[00126] Para avaliar o desempenho do adsorvedor em um fluxo de alimentação mais bruto, o conjunto de Proteína A mAb 1 em pH 5,5 e 3,2 mS/cm foi processado em 0,18 mL pequena escala de membrana Mustang® S em uma taxa de fluxo constante de 1.333 MV/hora. A carga de mAb 1 foi 3,4 unidades abaixo do pI calculado e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. A carga, as frações de filtrado, e as amostras de eluição foram analisadas e os resultados da CHOP são mostrados na figura 4. Os dados mostram que o Mustang® S inicialmente reduziu CHOP de 438 a 109 ppm. CHOP aumentou a 318 ppm como a densidade de carga aproximou 55.300 g/L. A membrana foi eluída uso uma solução contendo alto sal. Os íons de sal são usados para proteger as cargas, interrompendo assim as interações eletrostáticas e causando a dessorção das proteínas da superfície de membrana e o movimento livre na fase móvel. A análise do conjunto de eluição mostra um enriquecimento de impureza que confirma que CHOP liga à membrana devido a forças eletrostáticas. Desempenho de Membrana de Troca Aniônica de Pequena Escala (AEX)

[00127] Com objetivos de comparação MAb 3 foi selecionada para testar o uso de uma membrana de troca aniônica acima o ponto isoelé- trico de 7,7. As proteínas são propensas a desamidação e agregação em pH alto e portanto os testes semelhantes não foram executados em mAbs 1 e 2. O conjunto de troca catiônica em pH 5,5 e 9 mS/cm foi pH ajustado a 8,0 usando tris base 1,5 M. A matéria-prima então foi partida em três conjuntos separados e a condutividade foi ajustada usando água purificada. O primeiro conjunto foi em 10 mS/cm, os segundos e terceiros conjuntos foram ajustados a 7 mS/cm e 4 mS/cm, respectivamente. Os três conjuntos foram mantidos em pH 8,0, Cada fluxo de alimentação então foi processado em 0,35 mL pequena escala Mustang® Q na taxa de fluxo constante de 600 MV/hora. O mAb 3 em pH 8,0 esteve 0,3 unidades de pH acima do pI e por isso o anticor-po foi negativamente carregado. A carga e os conjuntos de filtrado foram analisados e os resultados da CHOP são mostrados na figura 5. Os dados mostram que em 4 mS/cm o Mustang® Q reduziu CHOP de 180 a 0,6 ppm e que a depuração de impureza diminuiu em condutivi- dades mais altas, presumivelmente devido a proteção iônica. A figura 5 mostra que embora o pH estivesse só 0,3 unidade acima o pI, a carga em mAb 3 foi bastante forte para permitir de ligação maior do que 10 mg/mL. Como depuração de CHOP, mAb 3 de ligação também reduzido em condutividades mais altas. A figura 6 mostra o rendimento de mAb 3 aumentado rapidamente, 96 % excessivos após aproximadamente 1000 g/L. Processo Combinando Membranas AEX e CEX

[00128] A MAb 4 foi usada para testar a viabilidade de empregar a etapa por deslocamento de proteína nativa consecutiva usando tanto membranas de troca aniônica quanto catiônica. MAb 4 foi desejável porque o seu pI de 6,7 foi bastante baixo para permitir processar em condições de pH tanto acima como abaixo do ponto isoelétrico. O conjunto de Proteína A em pH 5,0 e 3,5 mS/cm foi ajustado ao pH 8,0 e 4 mS/cm usando 1,5 M tris base. A matéria-prima então foi processada em membrana de Mustang® Q 0,18 mL pequena escala em uma taxa de fluxo constante de 1333 MV/hora. O mAb 4 em pH 8,0 esteve 1,3 unidades acima do pI e por isso o anticorpo foi negativamente carregado. As frações de filtrado de Mustang® Q foram escolhidas e depois recombinadas e ajustadas ao pH 5,5 e 6,1 mS/cm usando ácido cítrico de 1 M. O conjunto recombinado então foi processado em 0,18 mL pequena escala de membrana Mustang® S em uma taxa de fluxo constante de 1333 MV/hora. O mAb 4 em pH 5,5 foi 1,2 unidades de pH abaixo do pI e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. A carga e as frações de filtrado foram analisadas e os resultados da CHOP de ambas as membranas são mostrados na figura 7. Os dados mos-tram que Mustang® Q inicialmente reduziu CHOP desde 1215 a 555 ppm, e os níveis firmemente aumentados a 726 ppm como a densidade de carga aproximou 1700 g/L. Os resultados também mostram que o CHOP diminuiu a 375 ppm após as frações de filtrado de Mustang® Q recombinadas foram pH ajustado a 5,5. A causa exata da redução em CHOP não é conhecida. Os resultados da prova subsequente usando o Mustang® S mostram que os níveis da CHOP foram também reduzidos a 143 ppm, e novamente e firmemente aumentaram a aproximadamente 168 ppm como a densidade de carga aproximou 1500 g/L. Além de tudo, os resultados demonstram que é fatível combinar a etapa de membrana para reduzir também a impureza de célula hospedeira. Processo Contínuo Combinando Colunas e Membranas

[00129] MAb 1 foi usado para testar a viabilidade da cromatografia de coluna uso continuamente e em série com membranas de troca iô- nica corridos no modo por deslocamento de proteína nativa. Duas corridas foram executadas. Durante a Corrida 1 a coluna e a membrana foram analisadas separadamente (modo de batelada) e durante a Corrida 2 a coluna e a membrana foram corridas simultaneamente em série (modo contínuo). As operações de batelada da Corrida 1 são como se segue. A mAb 1 condicionada com Proteína A acumulada (pH 8,0 e 4,7 mS/cm) foi carregado para uma coluna Q Sepharose Fast Flow. O pH d carga de Q Seph FF foi 0,9 unidade de pH abaixo do pI portanto o anticorpo foi positivamente carregado, resultando em uma força repulsiva entre a resina e mAb. O modo da operação pode ser caracterizado como cromatografia de coluna de escoamento direto tradicional. As amostras de aprisionamento de escoamento direto foram coletadas em todas as partes da corrida. A coluna foi carregada a aproximadamente 136 g/L resina. O conjunto de Q Seph FF foi coletado e o pH ajustado a 5,5 e 6 mS/cm usando ácido cítrico de 1 M. Então foi processado em 0,18 mL pequena escala de membrana Mustang® S em 538 MV/hora a uma densidade de carga de aproximadamente 15,000 g/L membrana. O pH da carga de membrana foi aproximadamente 3,4 unidades abaixo do pI calculado e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. As amostras de aprisionamento efluentes de membrana foram coletadas em todas as partes da corrida. A membrana de Mustang® S uso foi descartada e a coluna de Q Seph FF foi regenerada usando 0,5M NaOH e depois guardado em 0,1N NaOH. A Corrida 2 foi executada em uma maneira semelhante da Corrida 1; contudo, o Q Seph FF de escoamento direto foi ajustada no pH ligado em série e depois imediatamente carregado para a membrana de Mustang® S. As carga e coluna/amostras de aprisionamento de membrana foram analisadas e os resultados da CHOP são resumidos para os experimentos da batelada (Corrida 1) e contínuo (Corrida 2) na figura 8. Os dados mostram que CHOP no conjunto de proteína A foi reduzido desde 1450 ppm a aproximadamente 16,8 ppm mais do que a coluna Q Sepharose. Deve observar-se que o valor do conjunto de Q de 16,8 ppm foi calculado baseado nos resultados de amostra de aprisionamento tomados em todas as partes da corrida. A batelada e os resultados de Mustang® S contínuos (12,7 e 11,1 ppm) mostram uma boa concordância. Além de tudo, os dados demonstram que a etapa de ligar coluna e membrana em um processo contínuo único é fatível e produz resultados comparáveis com operações de batelada tradicionais. Comparação entre Fabricantes de Membrana

[00130] A membrana de Sartobind® S foi testada usando mAb 1 para comparar o desempenho entre fornecedores de membrana. O conjunto de troca aniônica de mAb 1 em pH 5,5 e 6 mS/cm foi processado por 0,14 mL de membrana de Sartobind® S em pequena escala em uma taxa de fluxo constante de 857 MV/hora. O pH de carga de mAb 1 foi 3,4 unidades de pH abaixo do pI e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. A alimentação e as frações de filtrado foram analisadas para CHOP e os resultados são mostrados na figura 9. Os dados mostram que a Sartobind® S inicialmente reduziu CHOP de 29 a 3,3 ppm, e após aproximadamente 11.500 g/L os níveis aumentaram ligeiramente a 5,6 ppm. Os dados demonstram que a Sartobind® S e as membranas Mustang® S têm uma adsorção da CHOP semelhante. Efeito da Taxa de Fluxo

[00131] A depuração da CHOP com Mustang® S foi estudada em 333 - 2667 MV/hora para testar o impacto da taxa de fluxo. O conjunto de troca aniônica da MAb 1em pH 5,5 e 6 mS/cm foi processado por quatro separações de 0,18 mL em pequena escala de membranas de Mustang® S do mesmo lote de dispositivo. A carga de mAb 1 foi 3,4 unidades de pH abaixo do pI e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. A alimentação e as amostras de aprisionamento de filtrado foram analisadas para CHOP e os resultados são mostrados na figura 10, Os dados mostram que a Mustang® S inicialmente reduziu CHOP de 45 a aproximadamente 6,9 ppm. Após 16.000 g/L o CHOP aumentou em média de 8,7 ppm. Como esperado para um dispositivo de membrana não passível das limitações da difusão de poro, os resulta- dos mostram que a adsorção da CHOP é independente da taxa de fluxo. Aumento de Escala

[00132] Um escala piloto membrana de Mustang® S foi usada para verificar a depuração da CHOP e o rendimento para o aumento de escala. Um dispositivo de camada 16 de 10 mL foi selecionado porque foi o dispositivo totalmente representativo menor disponível. Foi considerado totalmente representativo porque o número de camadas de membrana, plissadas e o conjunto de dispositivo foi semelhante às cápsulas de escala industrial muito maiores. O dispositivo de 10 mL representou um aumento de 55 vezes na escala do dispositivo de pequena escala anteriormente estudado. O conjunto de troca aniônica de MAb 1 em pH 5,5 e 6 mS/cm foi processado mais de o adsorvedor de escala piloto usando o AKTA Pilot®. A carga de mAb 1 foi 3.4 unidades de pH abaixo do pI e por isso o anticorpo foi positivamente carregado. Para ganhar um sentido da reprodutibilidade a carga de mAb 1 foi testada no mesmo 10 dispositivo de mL duas vezes. Entre ciclos a membrana foi eluída com um alto tampão de sal (acetato de sódio de 20 mM, cloreto de sódio de 350 mM, pH 5,5) e regenerou o NaOH de 0,5 M usado. A taxa de fluxo de todas as fases foi 546 MV/hora. A alimentação e as amostras de aprisionamento de filtrado e o conjunto de eluição foram analisados para CHOP e os resultados são mostrados na figura 11. Os dados mostram a boa reprodutibilidade entre ciclos, indicando que a Mustang® S pode ser regenerada pelo menos uma vez. A análise da amostra de eluição mostrou o enriquecimento de impureza, confirmando pela segunda vez que a CHOP se liga à membrana devido a forças eletrostáticas. Uma comparação com resultados de mAb 1 de pequena escala anteriores mostra uma boa concordância da CHOP com o rendimento. Os dados demonstram que os dispositivos pequena escala são capazes de predizer o desempenho amplo. Conclusão

[00133] Mostrou-se que membranas de troca iônica eram eficazes na remoção da CHOP em um modo semelhante à cromatografia de modo de escoamento direto, mas em condições de pH e de condutivi- dade que causam a ligação da mAb. A técnica foi chamada a croma- tografia em membrana de troca iônica por deslocamento de proteína nativa. Os resultados demonstraram que esta técnica pode ser usada para retificar CHOP sem perda de rendimento substancial que ocorreria provavelmente com uma coluna tradicional cheia de resina a ajustada para manter o rendimento, a pureza, e tempo de processo. Os dados mostraram que a purificação parcial tendo sido anteriormente realizada na mAbs usando Proteína A e a cromatografia de coluna de troca iônica podem ser também purificadas a níveis da CHOP em menos de 10 ppm com rendimentos > 96 % usando Mustang® S, Sarto- bind® S, e Mustang® Q. Os níveis da CHOP baixos foram mantidos em altas densidades de carga, e em alguns exemplos, o desempenho foi mantido a 16,000 g/L. Os resultados mostraram que a depuração de impureza é dependente do pH da carga, e em geral, reduzem com a condutividade mais alta. Adicionalmente, os estudos de viabilidade demonstraram que múltiplas membranas podem ser usadas em combinação para reduzir também níveis de impureza e que a coluna, e a etapa de membrana podem estar integradas em um processo de purificação contínuo único. Uma comparação entre Mustang® S e Sarto- bind® S mostrou a depuração de impureza semelhante. Embora haja diferenças notáveis nas membranas, os resultados foram semelhantes e por isso o mecanismo da remoção de impureza não é membrana dependente. Resultados de experiência em taxas de fluxo nos limites de 333 - 2667 MV/a hora foram compatíveis com a teoria e a literatura afirma que o desempenho da membrana é independente da taxa de fluxo. Finalmente, a experimentação com um dispositivo intermediário que representa um aumento de 55 vezes na escala mostrou o desempenho semelhante a uma membrana em pequena escala. Os dados confirmam que os dispositivos em pequena escala são capazes de predizer o desempenho na escala da produção. Adicionalmente, o cloreto de sódio seguido pela limpeza de hidróxido de sódio do dispositivo de escala piloto entre corridas duplicadas mostrou que os adsorvedo- res de membrana podem ser regenerados e usados mais do que uma vez sem um declínio no desempenho.

[00134] A necessidade de melhores tecnologias de purificação é clara. O aumento dos títulos do biorreator pode sobrecarregar plataformas de purificação baseadas em colunas, e o desafio não pode ser contornado aumentando somente capacidade de ligação da resina. Adicionalmente, para abaixar o preço de mercadorias há necessidades de instrumentos mais convenientes, redução de custo na indústria. Os adsorvedores de membrana são pequenos e disponíveis e podem reduzir validação e preços de trabalho aumentando quantidade tratada de massa. Os resultados experimentais de membranas de troca iônica corridas no modo por deslocamento de proteína nativa mostraram uma alta depuração de impureza e alto rendimento, fazendo esta técnica uma opção atraente de bioprocessamento. Tabela 1: Características do Fluxo de Alimentação

[00135] As amostras de matéria-prima foram coletadas de processos industriais, experimentais, e de pequena escala. a Conjunto de pH e a condutividade foram anteriormente ajustados para assegurar a estabilidade adequada de produto. b o ponto isoelétrico (pI) foi calculado baseado na sequência de aminoácido de cada mAb. Tabela 2: Características das Membranas

Claims (25)

1. Método para purificar um anticorpo monoclonal de uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal e pelo menos uma Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de: a. passagem da composição através de uma membrana de troca catiônica, em que o anticorpo monoclonal e a membrana têm a carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um pH de 1 a 5 unidades de pH abaixo do pI do anticorpo monoclonal e uma condutividade < 40 mS/cm, que fazem com que a membrana se ligue ao anticorpo monoclonal e a pelo menos uma CHOP, e b. recuperação do anticorpo monoclonal purificado do efluente.

2. Método para purificar um anticorpo monoclonal de uma composição compreendendo o anticorpo monoclonal e pelo menos uma Proteína de Ovário de Hamster Chinês (CHOP), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas sequenciais de: a. passagem da composição através de uma membrana de troca aniônica, em que o anticorpo monoclonal e a membrana têm a carga oposta, em condições operacionais compreendidas de um tampão possuindo um pH de 1 a 5 unidades de pH acima do pI do polipeptídeo e uma condutividade < 40 mS/cm, que fazem com que a membrana se ligue ao anticorpo monoclonal e a pelo menos uma CHOP, e b. recuperação do anticorpo monoclonal purificado do efluente.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a membrana de troca iônica tem um tamanho de poro de 0,1 a 100 μm.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 4 unidades de pH abaixo do pI do anticorpo monoclonal.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 3 unidades de pH abaixo do pI do anticorpo monoclonal.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 2 unidades de pH abaixo do pI do anticorpo monoclonal.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH é 1 unidade de pH abaixo do pI do anticorpo monoclonal.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condutividade é < 20 mS/cm.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condutividade é < 10 mS/cm.

10. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 4 unidades de pH acima do pI do anticorpo monoclonal.

11. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 3 unidades de pH acima do pI do anticorpo monoclonal.

12. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH é de 1 a 2 unidades de pH acima do pI do anticorpo monoclonal.

13. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pH está 1 unidade de pH acima do pI do anticorpo monoclonal.

14. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a condutividade é < 20 mS/cm.

15. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a condutividade é < 10 mS/cm.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a membrana é um adsorvedor de modo variado.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente submeter a composição compreendendo o anticorpo monoclonal a uma ou mais etapas de purificação adicionais antes, durante, ou após a etapa de a para b, a dita etapa de purificação sendo uma cromatografia de afinidade à proteína A.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente submeter a composição compreendendo o anticorpo monoclonal a uma ou mais etapas de purificação adicionais antes, durante, ou após a etapa de a para b, a dita a etapa de purificação sendo cromatografia de troca iônica.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente submeter a composição compreendendo o anticorpo monoclonal a uma ou mais etapas de purificação adicional corrida continuamente durante a etapa de a para b, a dita etapa de purificação sendo uma cromatografia de troca iônica.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente o preparo de uma composição farmacêutica combinando o anticorpo monoclonal purificado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreendendo uma região C H 2/C H 3, é selecionado do grupo consistindo em anticorpos HER2, anticorpos EGFR, anticorpos CD20, anticorpos CD22, anticorpos VEGF, anticorpos receptores de VEGF, anticorpos IgE, anticorpos receptores de Apo-2, e anticorpos TNF-alfa.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo HER2 selecionado do grupo consistindo em trastuzumab e pertuzumab.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é o anticorpo CD20 rituximab.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é o anticorpo VEGF bevacizumab.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é o anticorpo IgE omalizumab.

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