BRPI0901303B1

BRPI0901303B1 - Micro-organismo e método para produzir o-succinilhomosserina

Info

Publication number: BRPI0901303B1
Application number: BRPI0901303-2A
Authority: BR
Inventors: Young Uk Shin; So Young Kim; Jin Sook Chang; Young Wook Cho; Han Jin Lee; In Kyung Heo; Kwang Ho Na; Chang Ii Seo; Chul Ha Kim; Hye Won Um
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2020-09-29
Also published as: HUE044353T2; US7851180B2; TR201910311T4; CN101555464A; EP3081649B1; CN101555464B; JP2009247354A; PL2128264T3; BRPI0901303A2; PL3081649T3; EP2128264A1; ES2599911T3; DK3081649T3; EP3081649A1; EP2128264B1; ES2736529T3; US20090253187A1; JP5525746B2

Abstract

micro-organismo que produz de precursor de l-metionina e método de produção de precursor de l-metionina usando o micro-organismo. a presente invenção refere-se a um micro-organismo que produz precursor de l-metionina, o-succinilhomosserina, e a um método de produção de precursor de l-metionina usando o micro-organismo.

Description

Antecedentes

[0001] A metionina é um dos aminoácidos essenciais do corpo humano que foi amplamente usada como alimento e aditivos de alimentação e adicionalmente usada como uma matéria-prima sintética para soluções médicas e supridores médicos. A metionina age como um precursor de tais compostos como colina (lecitina) e creatina e, ao mesmo tempo, é usada como uma matéria-prima sintética para cisteí- na e taurina. A metionina pode também proporcionar enxofre. S- adenosil-metionina é derivada de L-metionina e desempenha um certo papel na provisão de grupo metila no corpo humano e também é envolvida na síntese de vários neurotransmissores no cérebro. A metionina e/ou S-adenosil-L-metionina (SAM) inibe o acúmulo de gordura no fígado e artéria e alivia depressão, inflamação, doença do fígado, e dor muscular, etc.

[0002] As funções in vivo de metionina e/ou S-adenosil-L- metionina conhecidas há muito são como segue. 1) Ela inibe acúmulo de gordura no fígado e artéria e promove metabolismo de lipídio e aperfeiçoa a circulação do sangue no cérebro, coração e rim (J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401). 2) Ela promove digestão, desintoxicação e excreção de substâncias tóxicas e excreção de metais pesados tal como Pb. 3) Ela pode ser administrada como um agente anti- depressão na dosagem de 800 - 1.600 mg/dia (Am J Clin Nutr. Mis- choulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S). 4) Ela aumenta as funções do fígado (FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26) e, particularmente, é efetiva na doença de fígado causada pelo álcool (Cochrane Database Syst Rev., Ram- baldi A., 2001; (4): CD002235). 5) Ela tem efeito anti-inflamatório em doenças de osso e junta e promove recuperação de junta (ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract, Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30). 6) Ela é um nutriente essencial para o cabelo. Ela proporciona nutrição ao cabelo e, desse modo, impede perda de cabelo (Au- diol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266).

[0003] A metionina pode ser quimicamente ou biologicamente sintetizada para ser aplicada a alimento, alimentação e remédios.

[0004] Na síntese química, a metionina é muito mais produzida por hidrólise de 5-((β-metihylmercaptoetihyl)-hiydantoina. . A metionina quimicamente sintetizada tem uma vantagem de somente ser produzida como uma forma misturada de tipo-L e tipo-D.

[0005] Na síntese biológica, a metionina é produzida pelo método que usa proteínas envolvidas na síntese de metionina. L-metionina é biossintetizada de homosserina pela ação da enzima expressa por tais genes como metA, metB, metC, metE e metH em Escherichia coli. Particularmente, metA é o gene que codifica homosserina O- succiniltransferase que é a primeira enzima necessária para biossínte- se de metionina, e converte homosserina em O-succinil-L- homosserina. O-succinilhomosserina liase ou cistationina gama sintase codificada pelo gene metB converte O-succinil-L-homosserina em cistationina. Cistationina beta liase codificada por gene metC converte cistationina em L-homocisteína. MetE codifica metionina sintase independente de cobalamina, e metH codifica metionina sintase dependente de cobalamina, ambas das quais convertem L-homocisteína em L- metionina. Neste momento, 5,10-metilenotetrahidrofolato reductase codificada por metF e serina hidroximetitransferase codificada por glyA operam juntas para sintetizar N(5)-metiltetrahidrofolato, proporcionando grupo metila necessário para síntese de L-metionina.

[0006] A L-metionina é sintetizada por uma série de reações orgânicas pelas enzimas acima. A modificação genética nas proteínas acima ou outras proteínas que afetam as proteínas acima pode resultar no aumento de síntese de L-metionina. Por exemplo, A Publicação de patente Japonesa aberta à inspeção pública N°. 2000/139471 descreve um método de produção de L-metionina com a Escherichia sp. da qual genes thrBC e metJ no genoma são anulados, metBL é sobre- expresso e metK é substituído por um mutante avariado. Também, a Publicação de patente U.S. N° US2003/0092026 A1 descreve um método usando um micro-organismo de eliminação de metD (inibidor de síntese de L-metionina) que pertence a sp. Corynerbacterium. A Publicação de patente U.S. N° US2002/0049305 descreve um método para aumentar produção de L-metionina pelo aumento da expressão de 5,10-metilenotetra-hidrofolato reductase (metF).

[0007] A metionina produzida pelo método biológico é tipo-L, que tem vantagens, mas a quantidade de produção é muito pequena. Isto é porque a trajetória biossintética de metionina tem sistemas de regulação de realimentação estanque. Uma vez que a metionina é sintetizada a um certo nível, a metionina de produto final inibe a transcrição de gene metA que codifica a proteína primária para iniciação de biossín- tese de metionina. A sobre-expressão do próprio gene metA não pode aumentar produção de metionina porque o gene metA é suprimido por metionina no estágio de transcrição e, em seguida, degradado por proteases intracelulares no estágio de translação (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan e Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Portanto, muitas patentes anteriores foram focalizadas em como livrar o gene metA de seu sistema de regulação de realimenta- ção (W02005/108561, WO1403813).

[0008] A publicação de patente patente U.S. N° US2005/0054060A1 descreve um método para sintetizar homocisteína ou metionina por cistationine sintase modificada (O- succinilhomosserina liase) que usa metilmercaptana (CH3SH) ou sulfeto de hidrogênio (H2S) diretamente como uma fonte de enxofre, não cisteína. Contudo, é bem compreendido por aqueles técnicos no assunto que cistationina sintase pode se ligar a vários precursores de metionina nas células e, desse modo, produz subproduto em nível alto. Por exemplo, foi reportado que cistationina sintase acumula altos níveis de homolantionina por reação lateral de O-succinilhomosserina e homocisteína (J. Bacteriol (2006) vol 188:p609-618). Portanto, sobre- expressão de cistationina sintase pode reduzir a eficiência de reação Intracelular devido ao aumento de sua reação lateral. Em adição, este método tem muitas desvantagens. Este processo usa trajetórias metabólicas intracelulares que têm reações laterais e sistemas de regulação de realimentação. Também este processo usa H2S ou CH3SH que tem uma citotoxicidade severa às células. Consequentemente, 0 rendimento de produção de metionina é comparativamente pequeno.

[0009] Para solucionar estes problemas, 0 presente inventor desenvolveu um processo de duas etapas compreendendo; primeira etapa de produção de precursor de L-metionina por fermentação de E.coli; e segunda etapa de conversão de precursor de L-metionina em L-metionina por reação de enzima (PCT/KR2007/003650). Este processo de duas etapas pode solucionar os problemas acima, tais como citotoxicidade de sulfetos, regulação de realimentação por metionina e SAMe, decomposição de produto intermediário por enzimas intracelulares (por exemplo, cistationina gama sintase, O-succinilhomosserina sulfidrilase e O-acetilhomosserina sulfidrilase). Além disso, contra 0 método sintético de metionina químico que produz forma misturada de D-metionina e L-metionina, o processo de duas etapas é muito eficiente para produzir somente L-metionina seletivamente.

[00010] Neste processo de duas etapas, o rendimento de produção de precursor de metionina é um fator-chave para o aumento de rendimento de produção de metionina. Para aumentar o rendimento sintético de precursor de metionina, O-succinil homosserina, boa combinação de aspartocinase forte, homosserina transferase e O-succinil homosserina transferase resistente à realimentação é realmente importante. Nos antecedentes acima mencionados, os presentes inventores produziram um micro-organismo que pode produzir O- succinilhomosserina caracterizada pelos seguintes: 1) a atividade de homosserina O-succiniltransferase é introduzida e aumentada, no qual a atividade de homosserina O-succiniltransferase é resistente à realimentação à metionina; e 2) a atividade de aspartocinase ou homosserina desidrogenase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3 ) é aumentada. Esta cepa é capaz de produzir altas concentrações de precursor de L-metionina indiferente da concentração de metionina no meio de cultura e produ-ção de precursor de L-metionina pode ser marcadamente aumentada. Sumário

[00011] A presente invenção proporciona um micro-organismo que produz precursor de L-metionina e um método de produção de precursor de L-metionina usando o micro-organismo.

[00012] Mais particularmente, a presente invenção proporciona um micro-organismo que pode produzir O-succinilhomosserina caracterizada pelos seguintes: 1) a atividade de homosserina O- succiniltransferase é introduzida e aumentada, no qual a atividade de homosserina O-succiniltransferase é resistente à realimentação a metionina; e 2) a atividade de aspartocinase ou homosserina desidrogenase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3 ) é aumentada e método de produção de precursor de L-metionina usando a cepa.

Breve descrição dos desenhos

[00013] A aplicação das concretizações preferidas da presente invenção é melhor compreendida com referência aos desenhos acompanhantes, nos quais:

[00014] Figura 1 é um diagrama ilustrando manipulação genética da cepa de produção de precursor de metionina.

[00015] Figura 2 é um diagrama ilustrando estruturas químicas de processo de 2 etapas para a produção de metionina.

[00016] Figura 3 é um diagrama esquemático de pMetA-CL para a expressão de gene metA resistente à realimentação.

Descrição detalhada

[00017] De acordo com um aspecto desta, a presente invenção é dirigida a um micro-organismo que pode produzir precursor de L- metionina pelos seguintes: 1) a atividade de homosserina O- succiniltransferase é introduzida e aumentada, no qual a atividade de homosserina O-succiniltransferase é resistente à realimentação à metionina ; e 2) a atividade de aspartocinase ou homosserina desidroge- nase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3 ) é aumentada.

[00018] O termo "precursor de L-metionina" é definido como metabolites que são parte da trajetória metabólica específica de metionina, ou pode ser derivado destes metabólitos. Particularmente, o precursor de L-metionina conforme aqui usado se refere a uma O- succinil homosserina.

[00019] O termo "cepa de produção de precursor de L-metionina", conforme aqui usado, se refere a uma cepa de micro-organismo proca- riótico ou eucariótico que é capaz de acumular precursor de L- metionina por manipulação de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a cepa pode ser selecionada a partir do grupo consistindo em micro-organismos Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Provi- dencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp , Chromobacterium sp. e Norcardia sp., ou fungos ou leveduras. Preferivelmente, os micro-organismos de Escherichia sp., Corynebacterium sp., Leptospira sp., e leveduras podem ser usados para produzir O- Succinilhomosserina. Mais preferivelmente, os micro-organismos de Escherichia sp., podem ser usados, e, mais preferivelmente, Escherichia coli (daqui por diante referidos como "E.coli") podem ser usados.

[00020] Em várias concretizações, a presente invenção proporciona uma cepa de produção de precursor de L-metionina na qual um gene envolvido na decomposição de O-succinilhomosserina autêntica ou O- acetil homosserina é anulada ou enfraquecida e ao invés um gene envolvido na síntese de O-succinilhomosserina que é resistente à realimentação é introduzido ou aumentado. A presente invenção também proporciona seletivamente uma cepa na qual trajetória de biossíntese de treonina é bloqueada ou enfraquecida para aumentar produção de O-succinilhomosserina. A presente invenção proporciona adicionalmente uma cepa na qual aspartocinase ou homosserina desidroge- nase é sobre-expressa ou de atividade aumentada. A presente invenção também proporciona uma cepa na qual homosserina O- succiniltransferase livre de sistema de regulação de realimentação é introduzida, sobre-expressa e de atividade aumentada, e aspartocinase ou homosserina desidrogenase é sobre-expressa ou de atividade aumentada.

[00021] Mais particularmente, a presente invenção proporciona uma cepa de produção de precursor de L-metionina pela anulação do gene metB envolvido na decomposição de precursor de L-metionina, gene thrB envolvido na trajetória de biossíntese de treonina, e gene metJ de regulação da transcrição de genes de produção de precursor de L- metionina. A presente invenção também proporciona uma cepa de produção de precursor de L-metionina por eliminação de gene metA ou gene metX autênticos envolvidos na síntese de precursor de metionina, e pela introdução de um metA resistente à realimentação. A presente invenção também proporciona uma cepa de produção de precursor de L-metionina pelo aumento da atividade codificada pelo gene thrA.

[00022] Mais preferivelmente, a presente invenção também proporciona uma cepa de produção de precursor de L-metionina por eliminação de gene metA ou gene metX autênticos, introduzindo um gene metA resistente à realimentação, e pelo aumento do gene thrA. Os genes metA que são resistentes à realimentação são introduzidos e confirmados na primeira patente (PCT/KR2007/003650).

[00023] Na presente invenção, "inativação" conforme aqui usado se refere a uma anulação ou uma atenuação do gene. Uma anulação do gene é realizada pelo corte de uma região do gene, ou modificação da sequência de proteína pela introdução de uma sequência de gene específica no cromossomo. O termo "atenuação" ou "enfraquecimento" nesta conexão descreve a redução ou eliminação da atividade intracelular de uma ou mais enzimas (proteínas) em um micro-organismo que são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo, pela redução da atividade da proteína pela modificação de uma região promotora do gene, e da sequência de nucleotídeo de 5’-UTR, ou pela introdução da mutação na região de ORF do gene-alvo. Pelas medições de atenuação, a atividade ou concentração da proteína correspondente é, em geral, reduzida para 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10%, ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína tipo selvagem, ou da atividade ou concentração da proteína no micro-organismo de partida. Para alcançar uma atenuação, por exemplo, expressão do gene ou as propriedades catalíticas das proteínas de enzima podem ser reduzidas ou eliminadas. As duas medições podem ser opcionalmente combina- das.

[00024] A redução na expressão de gene pode ocorrer por cultura adequada, por modificação genética (mutação) das estruturas de sinal de expressão de gene ou também pela técnica de RNA-anti-sentido. As estruturas de sinal de expressão de gene são, por exemplo, genes repressores, genes ativadores, operadores, promotores, atenuadores, locais de ligação de ribossomo, o códon de partida, e terminadores. O perito pode encontrar informação neste respeito, entre outras, por exemplo, em Jensen and Hammer (Biotechnology e Bioengineering 58: 191 195 (1998)), em Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)), e nos livros textos conhecidos de genéticas e biologia molecular, tais como, por exemplo, o livro texto de Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995), ou aquele de Winnacker ("Genes e Clones", 1990).

[00025] Mutações que conduzem a uma mudança ou redução nas propriedades catalíticas de proteínas de enzima são conhecidas a partir da técnica anterior. Exemplos que podem ser mencionados são os trabalhos de Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)), e Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991)). Descrições resumidas podem ser encontradas em livros textos conhecidos de ge-néticas e biologia molecular, tais como, por exemplo, aquele por Ha- gemann ("General Genetics", 1986).

[00026] Mutações possíveis são transições, transversões, inserções e anulações. Dependendo do efeito da troca de aminoácido na atividade de enzima, "mutações missense" ou mutações nonsense são referidas. Inserções ou anulações de pelo menos um par de base em um gene conduzem a "mutações de alteração de estrutura", que condu- zem a aminoácidos incorretos sendo incorporados, ou translação sendo interrumpida prematuramente. Se um códon de parada é formado na região de codificação como uma consequência da mutação, isto também conduz a uma terminação prematura da translação. Anulações de vários códons conduzem tipicamente a uma perda completa da atividade de enzima. Instruções na geração de tais mutações é técnica anterior, e podem ser encontradas em livros textos conhecidos de genéticas e biologia molecular, tais como, por exemplo, o livro texto de Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995), aquele de Winnac- ker ("Genes e Clones", 1990), ou aquele de Hagemann ("General Genetics", 1986).

[00027] Mutações adequadas nos genes, tais como, por exemplo, mutações de anulação, podem ser incorporadas nas cepas adequadas por substituição de gene ou alelo.

[00028] Na presente invenção, o termo "intensificação" descreve o aumento na atividade intracelular de uma enzima que é codificada pelo DNA correspondente. A intensificação de atividade intracelular de uma enzima pode ser alcançada pela sobre-expressão do gene. A sobre- expressão do gene-alvo pode ser alcançada pela modificação da região promotora do gene, ou da sequência de nucleotídeo da região 5’- UTR. A sobre-expressão do gene-alvo pode também ser alcançada pela introdução da cópia extra do gene-alvo no cromossomo, pela transformação da cepa hospedeira com o vetor contendo o gene-alvo com um promotor, ou pela introdução da mutação que pode aumentar a expressão no gene-alvo. A intensificação da atividade intracelular de uma enzima pode também ser alcançada pela introdução da mutação na região de ORF do gene-alvo. Pelas medições da intensificação, a atividade ou concentração da proteína correspondente é, em geral, aumentada por pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, baseado naquela da proteína tipo selvagem ou a atividade ou concentração da proteína no micro-organismo de partida.

[00029] Em uma concretização preferida da presente invenção, o método para preparação de uma cepa de produção de precursor de L- metionina é conforme segue; na etapa 1, um gene que codifica tais proteínas como cistationina gama sintase, O-succinilhomosserina sulfidrilase ou O-acetilhomosserina sulfidrilase é anulado ou enfraquecido em uma cepa de modo a acumular precursor de L-metionina, tais como O-succinilhomosserina ou O-acetil homosserina.

[00030] O gene que codifica cistationina gama sintase é indicado como metB, o gene que codifica O-succinilhomosserina sulfidrilase é indicado como metZ, e o gene que codifica O-acetilhomosserina sulfidrilase é indicado como metY. Um gene que codifica a proteína tendo a atividade acima mencionada é exemplificado por metB em Escherichia coli. A sequência genômica do gene pode ser obtida a partir da sequência genômica de E. coli (n° de Acesso AAC75876) informada no relatório anterior (Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997)). A sequência genômica acima também pode ser obtida de NCBI (National Center for Biotechnology Information) e DDBJ (DNA Data Bank Japan). Outros genes tendo a mesma atividade são exemplificados por metB e metY derivados de Corynebacterium, e metZ derivado de Pseudomonas.

[00031] Cistationina gama sintase ou O-succinilhomosserina sulfidrilase ou O-acetilhomosserina sulfidrilase têm a atividade de converter O-succinilhomosserina ou O-acetilhomosserina em cistationina ou homocisteína conforme mostrado nas fórmulas de reação seguintes. Portanto, onde um gene tendo esta atividade é anulado ou enfraquecido, O-succinilhomosserina ou O-acetilhomosserina é excessivamente acumuladas na solução de cultura. L-cisteína + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + cistationina L-cisteína + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + cistationina HS‘ + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + homocisteína HS’ + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + homocisteína

[00032] Na etapa 2, gene thrB de codificação de homosserina ci- nase na cepa preparada na etapa 1 é anulado ou enfraquecido. O gene thrB é envolvido na síntese de O-fosfohomosserina de homosserina, que é, em seguida, convertido em treonina pelo gene thrC. O gene thrB é anulado ou enfraquecido de modo a usar toda a homosserina intracelular para a síntese de precursor de metionina.

[00033] Na etapa 3, uma trajetória sintética de regulador de transcrição de metionina é anulada ou enfraquecida. O gene metA, metB, metC, metE, e metF envolvido na síntese de metionina é reprimido pelo sistema de regulação de realimentação. O gene metJ é um gene regulador transcritor típico em E.coli. Para deixar o gene metA ou metX ser sobre-expresso para sintetizar precursor de metionina, metJ necessita ser eliminado. Portanto, se o gene metJ é eliminado em E. coli, a expressão de gene de metA ou metX é sempre aumentada, conduzindo a produção de massa de precursor de L-metionina.

[00034] As etapas 2 e 3 acima podem ser modificadas ou eliminadas de acordo com uma cepa de produção de precursor. Contudo, elas podem ser mais preferivelmente executadas para aumentar a trajetória de produção de precursor no micro-organismo de Escherichia sp.

[00035] Na etapa 4, homosserina O-succiniltransferase resistente à realimentação, que efetua medição do primeiro processo de trajetória de biossíntese de metionina é introduzida. metA é uma designação comum de gene que codifica a proteína tendo atividade de homosserina O-succiniltransferase. A atividade de homosserina O-succinil resistente à realimentação é resultada do gene metA resistente à realimentação mutante. PCT/US2007/ 009146 descreve o método para prepa- ração de gene metA resistente à realimentação. A informação geral contida na Patente Internacional acima pode ser incluída no escopo da presente invenção pelas reivindicações. Na presente invenção, a sequência de aminoácido que codifica por gene metA 10 resistente à realimentação é representada em SEQ. ID. NO: 14, pelo gene metA 11 é representada em SEQ. ID. NO: 16, pelo gene metA 32 é representada em SEQ. ID. NO: 18, pelo gene metA 37 é representada em SEQ. ID. NO: 20, pelo gene metA 41 é representada em SEQ. ID. NO: 22 (PCT/US2007/ 009146). Também, a presente invenção compreende homosserina O-succiniltransferase peptídeo com Acesso no Banco de Gene No: AP 004514 que tem mutações na posição de aminoácido 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291, 295, 297, 304, 305, ou combinações destas.

[00036] A introdução ou intensificação do gene metA é realizada pela introdução do gene, ou pela modificação de uma região promotora do gene e a sequência de nucleotídeo de 5’-UTR, ou pela introdução da mutação na região de ORF do gene-alvo. A introdução de um gene metA mutante que é livre de sistema de regulação de realimentação resulta no aumento de síntese de precursor de L-metionina, indiferente da concentração de metionina no meio de cultura.

[00037] Além disso, a produção de O-succinilhomosserina pode ser mais aumentada pela anulação do gene metA autêntico no cromossomo e, em seguida, introduzindo um gene metA mutante neste. Um gene metA resistente à realimentação sob o promotor de metA que intensifica pela anulação de gene metJ pode produzir mais O- succinilhomosserina.

[00038] Na etapa 5, aspartocinase ou homosserina desidrogenase é de atividade aumentada para aumentar a síntese de homosserina, precursor de O-succinilhomosserina. O thrA é uma designação comum de gene que codifica o peptídeo tendo atividade de aspartocinase e homosserina desidrogenase. A intensificação de atividade de thrA é realizada pela introdução da mutação no gene thrA, ou pela integração múltipla do gene thrA no cromossomo, ou pela introdução do plasmí- deo contendo o gene thrA.

[00039] Preferivelmente, uma aspartocinase e homosserina desidrogenase é codificada pelo gene de base de dados llnipro No: AP_000666 (E.coli thrA). Mais preferivelmente, a sequência de amino- ácido que codifica pelo gene thrA é representada em SEQ. ID. NO: 29 que tem mutação na posição de aminoácido 345. A modificação e intensificação do thrA são realizadas pela introdução da mutação no gene thrA ou pela introdução adicional do gene-alvo no cromossomo, ou pela introdução adicional de plasmídeo processado.

[00040] O-succinilhomosserina que é precursor de L-metionina, pode ser acumulada em uma cepa levando-se a vantagem de uma parte ou processo total da etapa 1 a etapa 5 acima.

[00041] A cepa de produção de precursor de L-metionina pode ser preparada a partir da cepa de produção de L-lisina, L-treonina ou L- isoleucina. Preferivelmente, ela pode ser preparada pelo uso da cepa de produção de L-treonina. Com esta cepa, síntese de homosserina ocorre mais facilmente, e a produção de precursor de metionina é resultantemente aumentada. Desse modo, o precursor de metionina pode ser acumulado pela anulação ou enfraquecimento de um gene envolvido na trajetória de biossíntese de treonina e, em seguida, gene metA ou metY ou metZ, usando a cepa de produção de L-treonina. É mais preferido anular ou enfraquecer o gene thrB primeiro e, em seguida, metB, metY ou metZ para sintetizar o precursor de metionina.

[00042] O termo "cepa de produção de L-treonina" da invenção se refere à cepa de micro-organismo procariótico ou eucariótico que é capaz de produzir L-treonina in vivo. Por exemplo, a cepa pode estar incluída com cepas de micro-organismo de produção de L-treonina per- tencentes a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. e Brevibacterium sp.. Entre estas, microorganismo de sp. Escherichia é preferido, e Escherichia coli é mais preferido.

[00043] Em uma concretização preferida da presente invenção, CJM002, a cepa de produção de L-treonina e independente de L- metionina transformada de TF4076 (KFCC 10718, Patente Coreana No. 92-8365), a cepa mutante de E. coli de produção de L-treonina foi usada. TF4076 tem um requerimento para metionina, e é resistente a análogos de metionina (ex, α-amino-(βhidroxi ácido valérico, AHV), análogos de lisina e analogos (ex, S-(2-aminoetil)-L-cisteína, AEC), e análogos de isoleucina (ex, ácido a-aminobutílico). O TF4076 não é capaz de sintetizar metionina in vivo porque ele é a cepa que tem um requerimento para metionina. Para usar esta cepa como a cepa de produção de precursor de metionina da invenção livre de um requerimento para metionina, os presentes inventores prepararam a cepa de produção de L-treonina E.coli CJM002 livre do requerimento para metionina por mutação artificial usando NTG. O E. coli CJM002 foi denominado como Escherichia coli MF001 e depositado em KCCM (Korean Culture Center of Micro-organism, Eulim Buld., Hongje-1-Dong, Seo- daemun-Ku, Seoul, 361-221, Korea), em 9 de abril de 2004 (N° de Acesso: KCCM-10568). Na presente invenção, os genes metB, thrB, metJ e metA do E.coli CJM002 foram anulados, em seguida o gene metA resistente à realimentação foi introduzido. A cepa de produção de precursor de L-metionina resultante construída usando-se E.coli CJM002 foi denominada CJM-A11. A cepa CJM-A11 foi transformada com o vetor de expressão de thrAr, e foi denominada CJM-A11 (pthrA(M)-CL). O Escherichia coli CJM-A11, cepa de produção de O- succinil homosserina, preparado pelo método acima foi depositada em 23 de janeiro de 2008, com o No. de Acesso KCCM 10922P.

[00044] Em outra concretização preferida da presente invenção, FTR2533, que é a cepa de produção de L-treonina descrita no PCT/KR2005/ 00344, foi usada. FTR2533 foi derivada de Escherichia coli TFR7624 que foi derivado de Escherichia coli No. de Acesso KCCM10236. E Escherichia coli N° de Acesso KCCM 10236 que foi derivado de Escherichia coli TF4076. Escherichia coli N° de Acesso KCCM 10236 é capaz de expressar níveis mais altos dos genes ppc catalisando o oxaloacetato de formação de PEP e as enzimas necessárias para biossíntese de treonina de aspartato, por exemplo, thrA: aspartocinase 1- homosserina desidrogenase, thrB: homosserina ci- nase, thrC: treonina sintase, capacitando, desse modo, um aumento na produção de L-treonina. E Escherichia coli FTR7624 (KCCM10538) tem um gene tyrR inativado que regride a expressão de gene tyrB necessário para biossíntese de L-treonina. E Escherichia coli FTR2533 (KCCM10541) é a cepa de produção de L-treonina tendo um gene gaIR inativado, a cepa mutante E. coli de produção de L-treonina.

[00045] Na presente invenção, os genes metB, thrB, metJ e metA do E.coli FTR2533 foram anulados, em seguida o gene metA resistente à realimentação foi introduzido. A cepa de produção de precursor de L-metionina resultante construída usando E.coli FTR2533 foi denominada CJM2-A11. A cepa CJM2-A11 cepa foi transformada com o vetor de expressão de thrA, e foi denominada CJM2-A11 (pthrA(M)-CL).

[00046] O Escherichia coli CJM2-A11 (pthrA(M)-CL) foi depositado em 12 de fevereiro de 2008, com o No. de acesso KCCM 10924P.

[00047] Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método de produção de precursor de L-metionina, o método compreendendo: a) fermentação dos micro-organismos acima; b) enriquecimento do precursor de L-metionina no meio ou nos micro-organismos; e c) isolamento do precursor de L-metionina.

[00048] A cultura da cepa de produção de L-metionina preparada acima pode ser realizada por um meio próprio e condições conhecidas àquele técnico no assunto. É bem compreendido por aqueles na técnica que o método de cultura pode ser usado facilmente por ajuste, de acordo com a cepa selecionada. Por exemplo, o método de cultura inclui, mas não é limitado a, batelada, cultura contínua e alimentado por batelada. Uma variedade de métodos de cultura são descritos na referência seguinte: "Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prenti- ce-Hall International Editions, pp 138-176.

[00049] O meio tem que encontrar as condições de cultura para uma cepa específica. Uma variedade de meios de cultura de micro- organismo é descrita nas seguintes referências: "Manual of Methods for General Bacteriology" pela American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981. Estes meios incluem várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e elementos de traço. A fonte de carbono é exemplificada por carboidrato, tal como glicose, sacarose, lactose, fru- tose, maltose, amido, celulose; gordura tal como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácido graxo tal como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolêico; álcool tal como glicerol e etanol; e ácido orgânico tal como ácido acético. Um destes compostos ou uma mistura destes pode ser usado como uma fonte de carbono. A fonte de nitrogênio é exemplificada por tal fonte de nitrogênio orgânica como peptona, extrato de levedura, caldo de carne, extrato de malte, licor de impregnação de milho (CSL) e farinha de feijão, e tal fonte de nitrogênio inorgânica como uréia, sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, carbonato de amónio e nitrato de amónio. Um destes compostos ou uma mistura destes pode ser usado como uma fonte de nitrogênio. O meio aqui pode incluir adicionalmente potássio dihidrogênio fosfato, dipotássio hidrogênio fosfato e sais contendo sódio correspondentes como uma fonte de fosfato. O meio também pode incluir um sal de metal tal como sulfato de magnésio ou sulfato de fer- ro. Em adição, amino ácidos, vitaminas e precursores próprios podem ser adicionados também. Os meios ou os precursores podem ser adicionados à cultura por tipo batelada ou tipo contínuo.

[00050] O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo pela adição no modo correto tal como um composto de hidróxido de amónia, hidróxido de potássio, amónio, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A geração de bolhas de ar pode ser inibida durante o cultivo pelo uso de um agente antiespumante tal como ácido graxo poliglicol éster. Para manter a condição aeróbica da cultura, oxigênio ou gás contendo oxigênio (ex, ar) pode ser injetado na cultura. A temperatura da cultura é convencionalmente 20 - 45°C, preferivelmente 25 - 40°C. O período de cultivo pode ser continuado até que a produção de precursor de L- metionina alcance um nível desejado, e o tempo de cultivo preferível é 10-160 horas.

Exemplificação

[00051] Concretizações práticas e atualmente preferidas da presente invenção são ilustrativas conforme mostrado nos Exemplos seguintes que são colocados para ilustrar, mas não são construídos como limitando a presente invenção. Será apreciado que aqueles técnicos no assunto, em consideração desta descrição, podem fazer modificações e aperfeiçoamentos dentro do espírito e escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Construção de uma cepa de produção de precursor de metionina <1-1 > Anulação de gene metB

[00052] Para anular o gene metB que codifica cistationina sintase em cepa E. coli, anulação de PCR de FRT de uma etapa foi realizada (PNAS (2000) vol97: P6640-6645). Iniciadoress de SEQ. ID. NO: 1 e NO: 2 foram usados para PCR usando-se vetor pKD3 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) como um gabarito, resultando na construção de cassete de anulação. PCR foi realizada conforme segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto.

[00053] O produto de PCR foi submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose, seguido por purificação de DNA obtido de banda de 1,2 Kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado em E. coli (K12) W3110 transformado com vetor de pKD46 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645). Antes da eletroporação, W3110 transformado com pKD46 foi cultivado em 30°C em meio de LB contendo 100 pg/L de ampicilina e 5 mM de L-arabinose até que ODeoo alcançasse 0,6. Em seguida, a cepa cultivada foi lavada duas vezes com água destilada esterilizada e uma ou mais vezes com 10% de glicerol. A eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi colocada no meio de placa LB contendo 25 (g/L de cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante a noite. Em seguida, uma cepa exibindo resistência a cloranfenicol foi selecionada.

[00054] PCR foi realizado pelo uso da cepa selecionada como um gabarito com os iniciadores N° 1 e 2 sob a mesma condição. A anulação de gene metB foi identificada pela confirmação de gene de dimensão de 1,2 kb em 1,0% de gel de agarose. A cepa foi, em seguida, transformada com vetor de pCP20 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645), e cultivada em meio de LB para eliminar o gene marcador de cloranfenicol. A cepa de eliminação de metB final foi construída na qual o ta-manho do gene metB reduz para 150 bp em 1,0% de gel de agarose por PCR sob as mesmas condições. A cepa construída foi denominada W3-B.

<1-2> Anulação do gene thrB

[00055] Os inventores tentaram aumentar a síntese de O-succinilhomosserina de homosserina por anulação de gene thrB que codifica homosserina cinase. Particularmente, quando a cepa de produção de treonina é usada como um hospedeiro de produção de O- succinilhomosserina, anulação de gene thrB é necessária porque a conversão de homosserina em O-fosfohomosserina por este gene é muito forte. Para anular o gene thrB na cepa W3-B construída acima, anulação de PCR de FRT de uma etapa foi realizada pela mesma maneira conforme descrito acima para a anulação de gene metB.

[00056] Para construir o cassete de anulação de thrB, PCR foi realizada pelo uso de vetor de pKD4 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645) como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 3 e NO: 4 conforme segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, reco- zimento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto. O produto de PCR foi submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose, seguido por purificação de DNA obtido de banda de 1,6 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3-B transformada com vetor de pKD46. A cepa recuperada foi colocada no meio de placa LB contendo 50 (g/L de kanamicin, seguido por cultura a 37°C durante a noite. Em seguida, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

[00057] PCR foi realizado pelo uso da cepa selecionada como um gabarito com prímeres de SEQ. ID. NO: 3 e NO: 4 sob as mesmas condições conforme acima. A anulação de gene ThrB foi identificada pela seleção da cepa cujo tamanho é 1,6 kb em 1,0% de gel de agarose. A cepa foi, em seguida, transformada com vetor de pCP20 e cultivada em meio de LB. A cepa de eliminação de thrB final foi construída na qual o tamanho de gene thrB reduz para 150 kb em 1,0% de gel de agarose por PCR sob as mesmas condições. Marcador de canamicina foi confirmado ser eliminado. A cepa construída foi denominada W3- BT.

<1-3> Anulação de gene metJ

[00058] Para anular o gene metJ que é o gene regulador do gene metA envolvido na síntese de precursor de metionina, anulação de PCR de FRT de uma etapa foi realizada pela mesma maneira conforme usado para a anulação de gene metB.

[00059] Para construir cassete de anulação de metJ, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ. ID. NO: 5 e NO: 6 conforme segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto.

[00060] O produto de PCR foi submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose, seguido por purificação de DNA obtido de banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3- BT transformada com vetor de pKD46. A cepa recuperada foi colocada em meio de placa de LB contendo cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C por toda a noite. Em seguida, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

[00061] PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 7 e NO: 8 sob as mesmas condições conforme acima. As anulações de metJ foram identificadas pela confirmação do gene dimensionado 1,6kb em 1,0% de gel de agarose. A cepa foi, em seguida, transformada com vetor de pCP20, e cultivada no meio de LB. A cepa de eliminação de metJ final foi construída na qual o tamanho de gene metJ reduz para 600 kb em 1,0% de gel de agarose por PCR sob as mesmas condições, e o marcador do Cloranfenicol de cepa foi confirmado ser eliminado. A cepa construída foi denominada W3-BTJ.

<1-4> Anulação de gene metA

[00062] Para introduzir um gene metA resistente a realimentação no cromossomo, gene metA cromossomal autêntico foi anulado na cepa W3-BTJ.

[00063] Para anular o gene metA, anulação de PCR de FRT de uma etapa foi realizada.

[00064] Para construir cassete de anulação de metA, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10 conforme segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto.

[00065] O produto de PCR foi submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose, seguido por purificação de DNA obtido de banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa E. coli W3-BTJ transformada com vetor de pKD46. A cepa recuperada foi colocada em meio de placa de LB contendo cloranfenicol, seguido por cultura a 37°C durante a noite. Em seguida, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

[00066] PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um gabarito com iniciadores of SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10 sob as mesmas condições conforme acima. A anulação de gene metA foi identificada pela confirmação de gene dimensionado de 1,1 kb em 1,0% de gel de agarose. A cepa foi, em seguida, transformada com vetor de pCP20, e cultivada em meio de LB. A cepa de eliminação de metA final foi construída na qual o tamanho de gene metA reduz para 100 kb em 1,0% de gel de agarose por PCR sob as mesmas condições. Marcador de cloranfenicol foi confirmado ser eliminado. A cepa construída foi denominada W3-BTJA.

<1-5> introdução de gene metA resistente a realimentação

[00067] Para aumentar a produção de O-succinilhomosserina que é precursor de L-metionina, sobre-expressão de gene metA resistente à realimentação que codifica homosserina O-succiniltransferase foi realizada. PCT/US2007/009146 descreve o método para preparação de gene metA resistente à realimentação e atividade deste.

[00068] A sequência do gene metA 10 resistente à realimentação é representada em SEQ. ID. NO: 13, e a sequência de aminoácido que codifica pelo gene é representada em SEQ. ID. NO: 14. A sequência de gene metA 11 é representada em SEQ. ID. NO: 15, e a sequência de amino ácido que codifica pelo gene é representada em SEQ. ID. NO: 16. A sequência de gene metA 32 é representada em SEQ. ID. NO: 17, e a sequência de aminoácido que codifica pelo gene é representada em SEQ. ID. NO: 18. A sequência de gene metA 37 é representada em SEQ. ID. NO: 19, e a sequência de aminoácido que codifica pelo gene é representada em SEQ. ID. NO: 20. A sequência de gene metA 41 é representada em SEQ. ID. NO: 21, e a sequência de aminoácido que codifica pelo gene é representada em SEQ. ID. NO: 22 (PCT/US2007/009146 ).

[00069] PCR foi realizada pelo uso dos genes acima como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 11 e NO: 12 conforme segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, recozimento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

[00070] O produto de PCR foi submetido à eletroforese em 1,0% de gel de agarose, seguido por purificação de DNA obtido de banda de 1,2 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor de pCL1920 foi clivado com a enzima de restrição Smal e ligado ao fragmento de DNA isolado. O E.coli foi transformado com o vetor, e células de condução de plasmídeo foram selecionadas em LB ágar contendo 50 (g/L de espectinomicina. O vetor construído mostrado na figura3.

[00071] O vetor foi eletroporado em cepa de W3-BTJA, e a capacidade de produção da cepa foi verificada usando-se cultura de frasco Erlenmeyer conforme descrito no Exemplo 2-1. Produção de O- succinilhomosserina de cepa modificada é medida, baseado em 100% de produção de O-succinilhomosserina de cepa tipo selvagem. Como um resultado, a produção de O-succinilhomosserina de todas as cepas modificadas foi significantemente aumentadas do que aquelas de cepas tipo selvagem, em particular, metA 11, metA 10 e metA 32 mostram a produção mais efetiva. Tabela 1. Resistência à realimentação de metA mutante na presença de WOmM de metionina.

[00072] Tabela 2. Produção de O-succinilhomosserina de metA resistente à realimentação em cepa W3-BTJAcepa.

[00073] Para a expressão estável do pMetA10-CL, pMetA11-CL e pMetA32-CL mostrando a produção mais eficiente, estes genes foram inseridos no cromossomo de E.coli.

[00074] Primeiro de tudo, gene de marcador de cloranfenicol foi amplificado por PCR pelo uso de vetor de pKD3 como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 23 e NO: 24. O fragmento de PCR foi isolado por eluição de gel. O gene metA foi amplificado com PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10, e região de 3’UTR de gene metA foi amplificada por PCR pelo uso de cromossomo W3110 wt como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 25 e NO: 26. Cada fragmento de PCR foi isolado por eluição de gel, e a mistura de fragmento foi amplificada por PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 9 e NO: 26; desse modo, o fragmento de gene metA contendo marcador de croranfenicol foi produzido. O fragmento de DNA recuperado foi ele- troporado em cepa de W3BTJA transformada com vetor de pKD46, e cepas resistentes a cloranfenicol foram selecionadas, e clonagem bem-sucedida de gene metA foi detectada usando-se SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10. As cepas identificadas que introduziram genes metA 10, 11, 32, modificados foram denominadas W3BTJ-A10, 11 e 32, respectivamente. A produção de O-succinilhomosserina de cada cepa foi similar àquela da cepa W3-BTJA abrigando cada plasmídeo metA.

< 1-6> sobre-expressão de gene thrA

[00075] Para aumentar a produção de O-succinilhomosserina mais eficientemente, a sobre-expressão de gene thrA foi realizada.

[00076] Para isto, o gene thrA foi amplificado por PCR pelo uso de cromossomo de E.coli CJM002 (KCCM10568), a cepa de produção de L-treonina, como um gabarito com iniciadores de SEQ. ID. NO: 27 e NO: 28. O fragmento de DNA amplificado foi isolado por eluição de gel e ligado com promotor CJ1 em vetor pCL1920 usando-se a enzima de restrição EcoRV. O E.coli foi transformado com o vetor ligado e células de transporte de plasmídeo foram selecionadas em LB agar contendo 50pg/L de espectinomicina. O vetor foi denominado pCJ-thrA(M)-CL. A sequência de aminoácido que codifica pelo gene thrA é representada em SEQ. ID. NO: 29 que tem uma mutação na posição de aminoácido 345. Também, o gene thrA de tipo selvagem de cepa E.coli W3110 foi amplificado por PCR pela mesma maneira conforme descrito acima e clonado no vetor denominado pCJ-thrA-CL. Os vetores foram eletropo- rados em W3BTJ-A11 respectivamente, e a produção de O- succinilhomosserina de cada cepa foi verificada usando-se método de cultura de frasco conforme descrito no Exemplo 2-1. Como um resultado, a cepa transforma d com o vetor contendo o gene thrA de forma mutante acumula significantemente níveis altos de O- succinilhomosserina.

[00077] Tabela 3. Produção de O-succinilhomosserina na presença de vetor de expressão de thrA.

<1-7> Conversão de cepa de produção de L-treonina

[00078] Cepa de produção de O-succinilhomosserina foi construída usando E.coli CJM002(KCCM10568) que é a cepa de produção de L- treonina e independente de L-metionina, conforme descrito no Exemplo 1-1 a 1-5. A cepa contendo o gene metA mutante no cromossomo foi denominada CJM-A10, CJM-A11, e CJM-A32, respectivamente. E outra cepa de produção de precursor de L-metionina foi construída usando-se a cepa FTR2533 (KCCM10541) descrita no PCT/KR2005/00344 pelo Exemplo 1-1 a 1-5 acima, e denominada como CJM2-A11. Cada cepa foi transformada com o vetor de expressão de thrA conforme descrito no Exemplo 1-6. A produção de precursor de metionina destas cepas foi medida pelo método de cultura de frasco descrito no Exemplo 2-1. Como um resultado, CJM-A11 abrigando plasmídeo pCJ-thrA(m)-CL mostrou significantemente produção mais alta de O-succinilhomosserina. Tabela 4 - Produção de precursor de metionina (O-succinilhomosserina) por cultura de frasco

Exemplo 2: Fermentação para a produção de precursor de L-metionina < 2-1 > Experimento de cultura de frasco

[00079] Para medir a produção de precursor de metionina de cada cepa construída no Exemplo 1, cultura de frasco Erlenmeyer foi realizada. Cada cepa foi cultivada no meio de placa LB a 31°C durante a noite. Uma colônia simples foi inoculada em 3 ml of meio de LB, seguido pela cultura a 31°C por 5 horas. A solução de cultura foi 200 vezes diluída em frasco Erlenmeyer de 250 ml contendo 25 ml de meio de produção de precursor de metionina, seguido por cultura a 31°C por 64 horas. HPLC foi realizada para comparar com a capacidade de produção de precursor de metionina (Tabela 2 e Tabela 3). Como um resultado, a capacidade de produção de metionina foi significantemente aumentada na cepa de produção de precursor de metionina preparada a partir da cepa de produção de L-treonina livre do requerimento para metionina. Tabela 1 Composição de meio de frasco para produção de precursor de metionina

< 2-2> Fermentação em grade escala

[00080] Umas poucas cepas exibindo capacidade de produção mais alta de O-succinilhomosserina foram selecionadas e cultivadas em um fermentador de 5 L para produzir massa de O-succinilhomosserina. Cada cepa foi inoculada em meio de LB contendo espectinomicina, seguido por cultura a 31°C por toda a noite. Em seguida, uma colônia simples foi inoculada em 10 ml de meio de LB contendo espectinomicina, que foi cultivada a 31°C por 5 horas. A solução de cultura foi 100 vezes diluída em frasco Erlenmeyer de 1000 ml contendo 200 ml de meio de semente de precursor de metionina, seguido por cultura a 31°C, 200 rpm, por 3 - 10 horas. A solução de cultura foi inoculada em um fermentador de 5 L, seguido por cultura adicional por 20 - 100 horas por fermentação alimentada por batelada. A concentração de precursor de metionina na solução fermentada foi medida por HPLC, e os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 3 Composição de meio de fermentador para produção de precursor de metionina

Tabela 4 - Produção de precursor de mel tionina em um fermentador

Aplicabilidade Industrial

[00081] Conforme descrito até aqui, usando-se a cepa de produção de precursor de metionina na presente invenção, a metionina pode ser produzida em ambiente propício do que o método sintético de metionina químico convencional. E a L-metionina convertida de 0- succinilhomosserina produzida a partir da cepa de acordo com a presente invenção pode ser amplamente usada na produção de alimentação animal ou aditivos de alimentação de animal, em adição a alimen-tação humana ou aditivos de alimentação. TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMATO INTERNACIONAL CJ cheiljedang corporation 500, 5-GA NAMDAEMUN-RO CHUNG-GU, SEOUL REPUBLICA DA CORÉIA RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o sta tus na Autoridade Internacional de depósito foi obtido. Formato DSMZ-BP/4 TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE PATENTES FORMATO INTERNACIONAL CJ cheiljedang corporation 500, 5-GA NAMDAEMUN-RO CHUNG-GU, SEOUL REPUBLICA DA CORÉIA RECIBO NO CASO DE DEPOSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

1 Quando aplicável a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o sta tus na Autoridade Internacional de depósito foi obtido. Formato DSMZ-BP/4

Claims

1. Micro-organismo para produzir O-succinilhomosserina, caracterizado pelos seguintes: (1) a autêntica atividade de homoserina O-succiniltransferase é enfraquecida ou inativada e, então, a atividade de homosserina O-succiniltransferase mutada (EC2.3.1.46) é aumentada, em que a atividade de homosserina O-succiniltransferase mutada é resistente à realimentação para metionina e o peptídeo de homosserina O-succiniltransferase mutado possui SEQ ID NOs: 14, 16, 18, 20 ou 22; e (2) a atividade de aspartocinase ou homosserina desidroge- nase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3 ) é aumentada, e (3) o gene metB que codifica cistationina gama sintase, o gene thrB que codifica a homoserina cinase e o gene metJ, que é regulador da transcrição do gene metA, são enfraquecidos ou inativados, em que o micro-organismo é uma Escherichia sp.

2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de aspartocinase ou homosserina desidrogenase tem uma SEQ ID NO 29.

3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli.

4. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo antes da modificação é Escherichia coli MF001, depositada sob o número de acesso: KCCM 10568.

5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo antes da modificação é Escherichia coli FTR2533, depositada sob o número de acesso: KCCM 10541.

6. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli CJM-A11(pthrA(m)-CI), depositada sob o número de acesso: KCCM 10922P.

7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli CJM2-A11(pthrA(m)-CI), depositada pelo número de acesso: KCCM 10924P.

8. Método para produzir O-succinilhomosserina, caracterizado por: (a) fermentação com o micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; (b) enriquecimento de O- succinilhomosserina no meio ou nos micro-organismos; e (c) isolamento de O-succinilhomosserina.