ES2736529T3 - Microorganismo productor de precursor de L-metionina y el procedimiento de producción del precursor de L-metionina usando el microorganismo - Google Patents
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Abstract
Un microorganismo para producir O-succinilhomoserina, comprendiendo dicho microorganismo: (i) una homoserina O-succiniltransferasa resistente a la inhibición por retroalimentación de metionina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 o 22; (ii) una actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.2.4 o 1.1.1.3) incrementada basada en la de una proteína natural; y (iii) una actividad de cistationina gamma sintasa reducida o inactivada basada en la de una proteína natural.
Description
DESCRIPCIÓN
Microorganismo productor de precursor de L-metionina y el procedimiento de producción del precursor de L-metionina usando el microorganismo
Antecedentes
La metionina es uno de los aminoácidos esenciales del cuerpo humano que se ha usado ampliamente como aditivos de piensos y alimentos y se ha usado además como material de partida sintético para soluciones médicas y suministros médicos. La metionina actúa como un precursor de compuestos tales como colina (lecitina) y creatina y, al mismo tiempo, se usa como materia prima de síntesis para cisteína y taurina. La metionina también puede proporcionar azufre. La S-adenosil-metionina se deriva de L-metionina y desempeña un determinado papel en proporcionar grupo metilo en el cuerpo humano y también está implicada en la síntesis de diversos neurotransmisores en el cerebro. La metionina y/o S-adenosil-L-metionina (SAM) inhiben la acumulación de grasa en el hígado y las arterias y alivian la depresión, inflamación, hepatopatía y dolor muscular, etc.
Las funciones in vivo de la metionina y/o S-adenosil-L-metionina conocidas hasta la fecha son como sigue.
1) Inhibe la acumulación de grasa en el hígado y las arterias promoviendo el metabolismo lipídico y mejora la circulación sanguínea en el cerebro, corazón y riñón (J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401).
2) Promueve la digestión, desintoxicación y excreción de sustancias tóxicas y la excreción de metales pesados tales como Pb.
3) Se puede administrar como un agente contra la depresión en una dosificación de 800 a 1.600 mg/día (Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., noviembre de 2002; 76(5): 1158S-61S).
4) Potencia las funciones hepáticas (FASEB J. Mato JM., enero de 2002; 16(1): 15-26) y es en particular eficaz en la enfermedad hepática causada por el alcohol (Base de datos Cochrane Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).
5) Tiene efecto antiinflamatorio en enfermedades óseas y articulares y promueve la recuperación de las articulaciones (ACP J Club. Sander O., enero-febrero de 2003; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., mayo de 2002; 51(5): 425-30).
6) Es un nutriente esencial para el cabello. Proporciona nutrición al cabello y, de este modo, previene la alopecia (Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., septiembre-octubre 2000; 5(5): 263-266).
La metionina se puede sintetizar química o biológicamente para aplicarse a piensos, alimentos y medicamentos. En la síntesis química, la metionina se produce principalmente por hidrólisis de 5-(p-metilmercaptoetil)-hidantoína. La metionina sintetizada químicamente tiene la desventaja de que solo se produce como una forma mixta de tipo L y tipo D.
En la síntesis biológica, la metionina se produce mediante el procedimiento de uso de proteínas implicadas en la síntesis de metionina. La L-metionina se biosintetiza a partir de homoserina por la acción de la enzima expresada por genes tales como metA, metB, metC, metE y metH en Escherichia coli. En particular, metA es el gen que codifica la homoserina O-succiniltransferasa, que es la primera enzima necesaria para la biosíntesis de la metionina, y convierte la homoserina en O-succinil-L-homoserina. La O-succinilhomoserina liasa o cistationina gamma sintasa codificada por el gen metB convierte la O-succinil-L-homoserina en cistationina. La cistationina beta liasa codificada por el gen metC convierte la cistationina en L-homocisteína. MetE codifica la metionina sintasa independiente de cobalamina y metH codifica la metionina sintasa dependiente de cobalamina, convirtiendo ambas la L-homocisteína en L-metionina. En este momento, la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa codificada por metF y la serina hidroximetiltransferasa codificada por glyA funcionan en conjunto para sintetizar N(5)-metiltetrahidrofolato que proporciona el grupo metilo necesario para la síntesis de L-metionina.
La L-metionina se sintetiza mediante una serie de reacciones orgánicas por las enzimas anteriores. La modificación genética en las proteínas anteriores u otras proteínas que afectan a las proteínas anteriores podría dar como resultado el incremento de la síntesis de L-metionina. Por ejemplo, la publicación de patente japonesa abierta a inspección pública n.° 2000/139471 describe un procedimiento de producción de L-metionina con Escherichia sp. de la que se delecionan los genes thrBC y metJ en el genoma, se sobreexpresa metBL y se reemplaza metK por un mutante permeable. Además, la publicación de patente de EE. UU. n.° US2003/0092026 A1 describe un procedimiento que usa un microorganismo con desactivación de metD (inhibidor de la síntesis de L-metionina) que pertenece a Corynebacterium sp. La publicación de patente de EE. UU. n.° US2002/0049305 describe un procedimiento para incrementar la producción de L-metionina incrementando la expresión de 5,10-metilenotetrahidrofolato reductasa (metF).
La metionina producida por el procedimiento biológico es de tipo L, lo que tiene ventajas, pero la cantidad de producción es demasiado pequeña. Esto se debe a que la vía biosintética de la metionina tiene sistemas de
regulación por retroalimentación muy estrictos. Cuando la metionina se sintetiza a un determinado nivel, la metionina como producto final inhibe la transcripción del gen metA que codifica la proteína primaria para el inicio de la biosíntesis de la metionina. La sobreexpresión del gen metA en sí no puede incrementar la producción de metionina debido a que el gen metA se suprime por la metionina en la fase de transcripción y, a continuación, se degrada por las proteasas intracelulares en la fase de traducción (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan y Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Por lo tanto, muchas de las patentes previas se centraron en cómo liberar el gen metA de su sistema de regulación por retroalimentación (documentos WO2005/108561, WO1403813).
La publicación de patente de EE. UU. n.° US2005/0054060A1 describe un procedimiento para sintetizar homocisteína o metionina mediante cistationina sintasa modificada (O-succinilhomoserina liasa) que usa metilmercaptano (CH3SH) o sulfuro de hidrógeno (H2S) directamente como fuente de azufre, no cisteína. Sin embargo, los expertos en la técnica entienden bien que la cistationina sintasa puede unirse a diversos precursores de metionina en las células y de este modo producir subproductos a alto nivel. Por ejemplo, se informó que la cistationina sintasa acumula altos niveles de homolantionina por reacción secundaria de O-succinilhomoserina y homocisteína (J. Bacteriol (2006) vol. 188:p609-618). Por lo tanto, la sobreexpresión de cistationina sintasa puede reducir la eficacia de la reacción intracelular debido al incremento de su reacción secundaria. Además, este procedimiento tiene muchas desventajas. Este procedimiento usa rutas metabólicas intracelulares que tienen reacciones secundarias y sistemas de regulación por retroalimentación. Además, este procedimiento usa H2S o CH3SH, que tienen una gran citotoxidad para las células. Por lo tanto, el rendimiento de la producción de metionina es comparativamente pequeño.
Para resolver estos problemas, el autor de la presente invención había desarrollado un procedimiento de dos etapas que comprende: una primera etapa de producción de un precursor de L-metionina por fermentación de E. coli; y una segunda etapa de conversión del precursor de L-metionina en L-metionina por reacción enzimática (PCT/KR2007/003650). Este procedimiento de dos etapas puede resolver los problemas anteriores, tales como la citotoxicidad de los sulfuros, la regulación por retroalimentación mediante metionina y SAMe, descomposición del producto intermedio por enzimas intracelulares (por ejemplo, cistationina gamma sintasa, O-succinilhomoserina sulfhidrilasa y O-acetilhomoserina sulfhidrilasa). Además, en contraposición con el procedimiento de síntesis química de metionina que produce una forma mixta de D-metionina y L-metionina, el procedimiento de dos etapas es muy eficaz produciendo solo L-metionina de forma selectiva.
En este procedimiento de dos etapas , el rendimiento de producción del precursor de metionina es uno de los factores clave para el incremento del rendimiento de la producción de metionina. Para incrementar el rendimiento de la síntesis del precursor de metionina, O-succinil-homoserina, es realmente importante una buena combinación de aspartocinasa fuerte, homoserina transferasa y O-acetilhomoserina transferasa. Con los antecedentes mencionados anteriormente, los autores de la presente invención produjeron un microorganismo que puede producir O-succinilhomoserina caracterizada por lo siguiente: 1) la actividad homoserina O-succiniltransferasa se introduce y potencia, en la que la actividad homoserina O-succiniltransferasa es resistente a la retroalimentación de metionina; y 2) la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.2.4 o 1.1.1.3) se potencia. Esta cepa es capaz de producir altas concentraciones de precursor de L-metionina independientemente de la concentración de metionina en el medio de cultivo y la producción de precursor de L-metionina puede incrementar extraordinariamente.
El documento WO2008127240 divulga microorganismos que producen metionina y productos relacionados, el documento WO2007077041 divulga un procedimiento para la producción de metionina o sus derivados mediante el cultivo de un microorganismo en un medio de cultivo apropiado, el documento WO2008013432 divulga un procedimiento para la producción de L-metionina y ácido orgánico que comprende etapas específicas, el documento WO200403535617 divulga una homoserina transuccinilasa y el documento Jp 2000139471 divulga un procedimiento de producción de L-metionina criando un microorganismo capaz de producir la L-metionina y mediante fermentación usando el propio microorganismo.
Sumario
La presente invención proporciona un microorganismo para producir O-succinilhomoserina, comprendiendo dicho microorganismo:
i) una homoserina O-succiniltransferasa resistente a la inhibición por retroalimentación de metionina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 o 22;
ii) una actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.2.4 o 1.1.1.3) incrementada basada en la de una proteína natural; y
iii) una actividad de cistationina gamma sintasa reducida o inactivada basada en la de una proteína natural.
La presente invención también proporciona un procedimiento de producción de O-succinilhomoserina, comprendiendo el procedimiento:
a) cultivar los microorganismos de acuerdo con la invención en un medio;
b) acumular la O-succinilhomoserina en el medio o en los microorganismos; y
c) aislar la O-succinilhomoserina del medio o en los microorganismos.
En el presente documento se divulga un microorganismo que puede producir O-succinilhomoserina caracterizado por lo siguiente: 1) la actividad homoserina O-succiniltransferasa se introduce y potencia, en la que la actividad homoserina O-succiniltransferasa es resistente a la retroalimentación de metionina; y 2) la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.2.4 o 1.1.1.3) se potencia y el procedimiento de producción del precursor de L-metionina usando la cepa.
Breve descripción de los dibujos
La aplicación de los modos de realización preferentes de la presente invención se entiende mejor con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 es un diagrama que ilustra la manipulación genética de la cepa productora de precursor de metionina. La Fig. 2 es un diagrama que ilustra estructuras químicas de un procedimiento de 2 etapas para la producción de metionina.
La Fig. 3 es un diagrama esquemático de pMetA-CL para la expresión del gen metA resistente a la retroalimentación.
Descripción detallada
En el presente documento se divulga un microorganismo que puede producir precursor de L-metionina caracterizado por lo siguiente: 1) la actividad homoserina O-succiniltransferasa se introduce y potencia, en la que la actividad homoserina O-succiniltransferasa es resistente a la retroalimentación de metionina; y 2) la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.2.4 o 1.1.1.3) se potencia.
El término "precursor de L-metionina" se define como metabolitos que forman parte de la vía metabólica específica de la metionina o que se pueden derivar de estos metabolitos. En particular, el precursor de L-metionina, como se usa en el presente documento, se refiere a una O-succinil-homoserina.
El término "cepa productora de precursor de L-metionina", como se usa en el presente documento, se refiere a una cepa de microorganismo procariota o eucariota que puede acumular precursor de L-metionina por manipulación. Por ejemplo, la cepa se puede seleccionar del grupo que consiste en microorganismos de Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. y Norcardia sp. u hongo o levaduras. Preferentemente, los microorganismos de Escherichia sp., Corynebacterium sp., Leptospira sp. y las levaduras se pueden usar para producir O-succinilhomoserina. Más preferentemente, se pueden usar los microorganismos de Escherichia sp., y lo más preferentemente se puede usar Escherichia coli (en lo sucesivo referido como "E. coli").
En el presente documento se divulga una cepa productora de precursor de L-metionina en la que se deleciona o debilita un gen implicado en la descomposición de la O-succinilhomoserina u O-acetilhomoserina original y, en cambio, se introduce o potencia un gen implicado en la síntesis de O-succinilhomoserina que es resistente a la retroalimentación. También se divulga una cepa en la que la vía de biosíntesis de treonina se bloquea o debilita para potenciar la producción de O-succinilhomoserina. También se divulga una cepa en la que se sobreexpresa o potencia la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa. También se divulga una cepa en la que se introduce, sobreexpresa y potencia la actividad homoserina O-succiniltransferasa libre de un sistema de regulación por retroalimentación, y se sobreexpresa o potencia la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa.
En el presente documento se divulga una cepa productora de precursor de L-metionina mediante la deleción del gen metB implicado en la descomposición del precursor de L-metionina, el gen thrB implicado en la vía de biosíntesis de treonina y el gen metJ que regula la transcripción de los genes de producción del precursor de L-metionina. También se divulga una cepa productora de precursor de L-metionina desactivando el gen metA o metX original implicado en la síntesis de precursor de metionina e introduciendo un metA resistente a la retroalimentación. También se divulga una cepa productora de precursor de L-metionina potenciando la actividad codificada por el gen thrA.
También se divulga una cepa productora de precursor de L-metionina desactivando el gen metA o metX original, introduciendo un gen metA resistente a la retroalimentación y potenciando el gen thrA. Los genes metA que son resistentes a la retroalimentación se introducen y confirman en la patente anterior (PCT/KR2007/003650).
En la presente invención, la "inactivación", como se usa en el presente documento, se refiere a una deleción o una atenuación del gen. Una deleción del gen se realiza cortando una región del gen o modificando la secuencia de la proteína introduciendo una secuencia de genes específica en el cromosoma. El término "atenuación" o "debilitamiento" a este respecto describe la reducción o eliminación de la actividad intracelular de una o más
enzimas (proteínas) en un microorganismo que están codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo reduciendo la actividad de la proteína, modificando una región promotora del gen y la secuencia de nucleótidos de 5'-UTR o introduciendo la mutación en la región ORF del gen diana. Mediante medidas de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce en general a de un 0 a un 75 %, de un 0 a un 50 %, de un 0 a un 25 %, de un 0 a un 10 % o de un 0 a un 5 % de la actividad o concentración de la proteína natural o de la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Para lograr una atenuación, por ejemplo, la expresión del gen o las propiedades catalíticas de las proteínas de la enzima se pueden reducir o eliminar. Las dos medidas se pueden combinar opcionalmente.
La reducción de la expresión génica puede tener lugar mediante un cultivo adecuado, mediante modificación genética (mutación) de las estructuras de señal de la expresión génica o también mediante la técnica de ARN antisentido. Las estructuras de señal de la expresión génica son, por ejemplo, genes represores, genes activadores, operadores, promotores, atenuadores, sitios de unión a ribosomas, el codón de inicio y los terminadores. El experto puede encontrar información al respecto, entre otros, por ejemplo, en Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), en Carrier y Keasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999)), Franch y Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000)) y en libros de texto conocidos de genética y biología molecular, tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molecular Genetics", 6a edición, 1995) o el de Winnacker ("Genes and Clones", 1990).
Las mutaciones que dan lugar a un cambio o reducción en las propiedades catalíticas de proteínas enzimáticas son conocidas de la técnica anterior. Ejemplos que se pueden mencionar son los trabajos de Qiu y Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511-5515 (1998)), y Wente y Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991)). Descripciones resumidas se pueden encontrar en libros de texto de genética y biología molecular conocidos, tales como por ejemplo el de Hagemann ("General Genetics", 1986).
Las posibles mutaciones son transiciones, transversiones, inserciones y deleciones. Dependiendo del efecto del intercambio de aminoácidos sobre la actividad de la enzima, se hace referencia a "mutaciones de aminoácido" o mutaciones finalizadoras. Las inserciones o deleciones de al menos un par de bases en un gen dan lugar a "mutaciones de desplazamiento del marco de lectura", que dan lugar a la incorporación de aminoácidos incorrectos o interrupción prematura de la traducción. Si se forma un codón finalizador en la región de codificación como consecuencia de la mutación, esto también da lugar a una terminación prematura de la traducción. Las deleciones de diversos codones típicamente dan lugar a una pérdida completa de la actividad enzimática. Las instrucciones sobre la generación de dichas mutaciones forman parte del estado de la técnica anterior y se pueden encontrar en libros de texto de genética y biología molecular conocidos, tales como, por ejemplo, el libro de texto de Knippers ("Molecular Genetics", 6a edición, 1995), el de Winnacker ("Genes and Clones", 1990) o el de Hagemann ("General Genetics", 1986).
Las mutaciones adecuadas en los genes, tales como, por ejemplo, mutaciones por deleción, se pueden incorporar en cepas adecuadas por reemplazo de genes o alelos.
En la presente invención, el término "potenciación" describe el incremento en la actividad intracelular de una enzima que se codifica por el ADN correspondiente. La potenciación de la actividad intracelular de una enzima se puede lograr mediante la sobreexpresión del gen. La sobreexpresión del gen diana se puede lograr modificando la región promotora del gen o la secuencia de nucleótidos de la región 5'-UTR. La sobreexpresión del gen diana también se puede lograr introduciendo la copia extra del gen diana en el cromosoma, transformando la cepa huésped con el vector que contiene el gen diana con un promotor, o introduciendo la mutación que puede incrementar la expresión en el gen diana. La potenciación de la actividad intracelular de una enzima también se puede lograr introduciendo la mutación en la región ORF del gen diana. Mediante medidas de potenciación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa en general en al menos un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 75 %, un 100 %, un 150 %, un 200 %, un 300 %, un 400 % o un 500 %, hasta a un máximo de un 1000 % o un 2000 %, basado en la de la proteína natural o en la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo de partida.
Un procedimiento divulgado para preparar una cepa productora de precursor de L-metionina es como sigue;
En la etapa 1, un gen que codifica proteínas tales como cistationina gamma sintasa, O-succinilhomoserina sulfhidrilasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa se deleciona o debilita en una cepa para acumular precursor de L-metionina tal como O-succinilhomoserina o O-acetilhomoserina.
El gen que codifica la cistationina gamma sintasa se indica como metB, el gen que codifica la O-succinilhomoserina sulfhidrilasa se indica como metZ y el gen que codifica la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa se indica como metY. Un gen que codifica la proteína que tiene la actividad mencionada anteriormente se ejemplifica por metB en Escherichia coli. La secuencia genómica del gen se puede obtener a partir de la secuencia genómica de E. coli (n.° de acceso AAC75876) informada en el informe previo (Blattner et al., Science 277: 1453-1462 (1997)). La secuencia genómica anterior también se puede obtener del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y del DDBJ (Banco de
Datos de ADN de Japón). Otros genes que tienen la misma actividad se ejemplifican por metB y metY derivados de Corynebacterium, y metZ derivado de Pseudomonas.
La cistationina gamma sintasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o O-acetilhomoserina sulfhidrilasa tiene la actividad de convertir O-succinilhomoserina u O-acetilhomoserina en cistationina u homocisteína como se muestra en las siguientes fórmulas de reacción. Por lo tanto, cuando un gen que tiene esta actividad se deleciona o debilita, la O-succinilhomoserina u O-acetilhomoserina se acumula excesivamente en la solución de cultivo.
L-cisteína O-succinil-L-homoserina <=> succinato cistationina
L-cisteína O-acetil-L-homoserina <=> acetato cistationina
HS' O-succinil-L-homoserina <=> succinato homocisteína
HS' O-acetil-L-homoserina <=> acetato homocisteína
En la etapa 2, el gen thrB de codificación de la homoserina cinasa en la cepa preparada en la etapa 1 se deleciona o debilita. El gen thrB está implicado en la síntesis de O-fosfohomoserina a partir de homoserina, que a continuación se convierte en treonina por el gen thrC. El gen thrB se deleciona o debilita para usar toda la homoserina intracelular para la síntesis del precursor de metionina.
En la etapa 3, un regulador de transcripción de la vía sintética de metionina se deleciona o debilita. El gen metA, metB, metC, metE y metF implicado en la síntesis de metionina se reprime mediante el sistema de regulación por retroalimentación. El gen metJ es un gen regulador de transcriptor típico en E. coli. Para permitir la sobreexpresión del gen metA o metX para sintetizar el precursor de metionina, se debe eliminar el metJ. Por lo tanto, si el gen metJ se elimina en E. coli, la expresión del gen metA o metX siempre incrementa, lo que da lugar a la producción en masa de precursor de L-metionina.
Las etapas 2 y 3 anteriores se pueden modificar o eliminar de acuerdo con una cepa productora de precursor. Sin embargo, se puede ejecutar más preferentemente para potenciar la vía de producción de precursor en el microorganismo de Escherichia sp.
En la etapa 4 se introduce la homoserina O-succiniltransferasa resistente a la retroalimentación, que media en el primer proceso de la vía de biosíntesis de la metionina. MetA es una designación común del gen que codifica la proteína que tiene actividad homoserina O-succiniltransferasa. La actividad homoserina O-succiniltransferasa resistente a la retroalimentación es el resultado del gen metA resistente a la retroalimentación mutante. El documento PCT/US2007/009146 divulga el procedimiento para preparar el gen metA resistente a la retroalimentación. En la presente invención, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen metA 10 resistente a la retroalimentación está representada en SEQ ID NO: 14, por el gen metA 11 está representada en SEQ ID NO: 16, por el gen metA 32 está representada en SEQ ID NO: 18, por el gen metA 37 está representada en SEQ ID NO: 20, por el gen metA41 está representada en SEQ ID NO: 22 (PCT/US2007/009146). También se divulga un péptido homoserina O-succiniltransferasa con número de acceso a GenBank: AP 004514 que tiene mutaciones en las posiciones de aminoácidos 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291,295, 297, 304, 305 o combinaciones de las mismas.
La introducción o potenciación del gen metA se realiza introduciendo el gen o modificando una región promotora del gen y la secuencia de nucleótidos de 5'-UTR o introduciendo la mutación en la región ORF del gen diana. La introducción de un gen metA mutante que está libre de un sistema de regulación por retroalimentación da como resultado el incremento de la síntesis del precursor de L-metionina independientemente de la concentración de metionina en el medio de cultivo.
Además, la producción de O-succinilhomoserina se puede incrementar más delecionando el gen metA original en el cromosoma y a continuación introduciendo un gen metA mutante en el mismo. El gen metA resistente a la retroalimentación bajo el promotor metA que se potencia al delecionar el gen metJ puede producir más O-succinilhomoserina.
En la etapa 5, la actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa se potencia para incrementar la síntesis de homoserina, precursora de O-succinilhomoserina. El thrA es una designación común del gen que codifica el péptido que tiene actividad aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa. La potenciación de la actividad de thrA se realiza introduciendo la mutación en el gen thrA o mediante la integración múltiple del gen thrA en el cromosoma o introduciendo el plásmido que contiene el gen thrA.
Preferentemente, una aspartocinasa y homoserina deshidrogenasa está codificada por el gen con n.° en la base de datos Unipro: AP_000666 (E. coli thrA). Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen thrA está representada en SEQ ID NO: 29, que tiene mutación en la posición de aminoácido 345. La modificación y potenciación del thrA se realiza introduciendo la mutación en el gen thrA o introduciendo además el gen diana en el cromosoma o introduciendo además el plásmido procesado.
La O-succinilhomoserina, que es el precursor de L-metionina se puede acumular en una cepa aprovechando una parte o todo el procedimiento de la etapa 1 a la etapa 5 anteriores.
La cepa productora de precursor de L-metionina se puede preparar a partir de la cepa productora de L-lisina, L-treonina o L-isoleucina. Preferentemente, se puede preparar usando la cepa productora de L-treonina. Con esta cepa, la síntesis de homoserina es más fácil y la producción de precursor de metionina se incrementa como resultado. Así, el precursor de metionina se puede acumular delecionando o debilitando un gen implicado en la vía de biosíntesis de treonina y, a continuación, el gen metA o metY o MetZ, usando la cepa productora de L-treonina. Es más preferente delecionar o debilitar primero el gen thrB y a continuación el metB, metY o metZ para sintetizar el precursor de metionina.
El término "cepa productora de L-treonina" de la invención se refiere a una cepa de microorganismo procariota o eucariota que es capaz de producir L-treonina in vivo. Por ejemplo, la cepa puede incluir cepas de microorganismos productores de L-treonina que pertenecen a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. y Brevibacterium sp. Entre estos, el microorganismo Escherichia sp. es preferente y Escherichia coli es más preferente.
CJM002, la cepa productora de L-treonina e independiente de L-metionina transformada a partir de TF4076 (KFCC 10718, patente coreana n.° 92-8365), la cepa mutante de E. coli productora de L-treonina, se usó en los ejemplos. La cepa TF4076 tiene un requerimiento de metionina y es resistente a análogos de metionina (por ejemplo, ácido aamino-p-hidroxi valérico, AHV), análogos de lisina (por ejemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína, AEC) y análogos de isoleucina (por ejemplo, ácido a-aminobutílico). La cepa TF4076 no es capaz de sintetizar metionina in vivo porque es la cepa la que tiene un requerimiento de metionina. Para usar esta cepa como la cepa productora de precursor de metionina de la invención libre de requerimiento de metionina, los presentes inventores prepararon la cepa de E. coli productora de L-treonina CJM002 libre de requerimiento de metionina mediante mutación artificial usando NTG. La cepa E. coli CJM002 fue nombrada como Escherichia coli MF001 y fue depositada en KCCM (Korean Culture Center of Microorganism, Eulim Buld., Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku, Seúl, 361-221, Corea) el 9 de abril de 2004 (n.° de acceso: KCCM-10568). En la presente invención se delecionaron los genes metB, thrB, metJ y metA de la cepa E. coli CJM002 y, a continuación, se introdujo el gen metA resistente a la retroalimentación. La cepa productora de precursor de L-metionina resultante construida usando E. coli CJM002 se denominó CJM-A11. La cepa CJM-A11 se transformó con el vector de expresión de thrA y se denominó CJM-A11 (pthrA(M)-CL). La cepa productora de O-succinil-homoserina, Escherichia coli CJM-A11, preparada mediante el procedimiento anterior se depositó el 23 de enero de 2008, con n.° de acceso KCCM 10922P.
FTR2533, que es la cepa productora de L-treonina divulgada en PCT/KR2005/00344, se usó en los ejemplos. La cepa FTR2533 se derivó de Escherichia coli TFR7624 que se derivó de Escherichia coli con n.° de acceso KCCM 10236. Y la cepa de Escherichia coli con n.° de acceso KCCM 10236 que se derivó de Escherichia coli TF4076. La cepa de Escherichia coli con n.° de acceso KCCM 10236 es capaz de expresar niveles más altos de los genes ppc que catalizan la formación de oxaloacetato a partir de PEP y las enzimas necesarias para la biosíntesis de treonina a partir de aspartato, por ejemplo, thrA: aspartocinasa 1-homoserina deshidrogenasa, thrB: homoserina cinasa, thrC: treonina sintasa, permitiendo de este modo un incremento en la producción de L-treonina. Y la cepa de Escherichia coli FTR7624 (KCCM10538) tiene un gen tyrR inactivado que regresiona la expresión del gen tyrB necesario para la biosíntesis de L-treonina. Y la cepa de Escherichia coli FTR2533 (KCCM10541) es la cepa productora de L-treonina que tiene un gen galR inactivado, la cepa mutante de E. coli productora de L-treonina.
Se delecionaron los genes metB, thrB, metJ y metA de E. coli FTR2533 y, a continuación, se introdujo el gen metA resistente a la retroalimentación. La cepa productora de precursor de L-metionina resultante construida usando E. coli FTR2533 se denominó CJM2-A11. La cepa CJM2-A11 se transformó con el vector de expresión de thrA y se denominó CJM2-A11 (pthrA(M)-CL).
La cepa Escherichia coli CJM2-A11 (pthrA(M)-CL) se depositó el 12 de febrero de 2008, con el n.° de acceso KCCM 10924P.
Se divulga un procedimiento para producir precursor de L-metionina, comprendiendo el procedimiento: a) fermentación de los microorganismos anteriores; b) enriquecimiento del precursor de L-metionina en el medio o en los microorganismos; y c) aislamiento del precursor de L-metionina.
El cultivo de la cepa productora de precursor de L-metionina preparado anteriormente se puede realizar en un medio apropiado y con condiciones conocidas por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica entienden bien que el procedimiento de cultivo se puede usar ajustando fácilmente de acuerdo con la cepa seleccionada. Por ejemplo, el procedimiento de cultivo incluye, pero sin limitarse a, cultivo por lotes, cultivo continuo y cultivo por lotes alimentados. En la siguiente referencia se describe una variedad de procedimientos de cultivo: "Biochemical Engineering" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.
El medio tiene que cumplir las condiciones de cultivo para una cepa específica. En la siguiente referencia se describe una variedad de medios de cultivo de microorganismos: "Manual of Methods for General Bacteriology" por la American Society for Bacteriology, Washington D.C., EE. UU., 1981. Dichos medios incluyen diversas fuentes de
carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. La fuente de carbono se ejemplifica por hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa; grasas tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Uno de estos compuestos o una mezcla de los mismos se puede usar como fuente de carbono. La fuente de nitrógeno se ejemplifica por una fuente de nitrógeno orgánica tal como peptona, extracto de levadura, salsa de carne, extracto de malta, licor de maíz fermentado (CSL) y harina de judía y por una fuente de nitrógeno inorgánico como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Uno de estos compuestos o una mezcla de los mismos se puede usar como fuente de nitrógeno. El medio en el presente documento puede incluir adicionalmente dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de dipotasio y las correspondientes sales de sodio como una fuente de fosfato. El medio también puede incluir una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Además, también se pueden añadir aminoácidos, vitaminas y precursores apropiados. Los medios o los precursores se pueden añadir al cultivo por lotes o de forma continua.
El pH del cultivo se puede ajustar durante el cultivo añadiendo de manera apropiada un compuesto tal como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico. La generación de burbujas de aire se puede inhibir durante el cultivo mediante el uso de un agente antiespumante tal como el éster de poliglicol de ácido graso. Para mantener la condición aeróbica del cultivo, se puede inyectar oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) al cultivo. La temperatura del cultivo es convencionalmente de 20 a 45 °C, preferentemente de 25 a 40 °C. El período de cultivo se puede mantener hasta que la producción de precursor de L-metionina alcance un nivel deseado, y el tiempo de cultivo preferente es de 10 a 160 horas.
Ejemplificación
Los modos de realización prácticos y actualmente preferentes de la presente invención son ilustrativos, como se muestra en los siguientes Ejemplos que se exponen para ilustrar, pero no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.
Ejemplo 1: Construcción de una cepa productora de precursor de metionina
<1-1> Deleción del gen metB
Para delecionar el gen metB que codifica cistationina sintasa en la cepa de E. coli, se realizó una deleción por PCR de FRT en una etapa (PNAS (2000) vol.97: P6640-6645). Se usaron cebadores de la SEQ ID NO: 1 y NO: 2 para la PCR usando el vector pKD3 (PNAS (2000) vol.97: P6640-6645) como plantilla, lo que da como resultado la construcción del casete de deleción. La PCR se realizó como sigue: 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido de la banda de 1,2 kbp. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en E. coli (K12) W3110 transformado con el vector pKD46 (PNAS (2000) vol.97: P6640-6645). Antes de la electroporación, W3110 transformado con pKD46 se cultivó a 30 °C en medio LB que contenía 100 pg/l de ampicilina y 5 mM de L-arabinosa hasta que OD600 alcanzó 0,6. A continuación, la cepa cultivada se lavó dos veces con agua destilada esterilizada y una vez más con glicerol al 10 %. La electroporación se realizó a 2500 V. La cepa recuperada se sembró en estrías en medio de placa LB que contenía 25 pg/l de cloranfenicol, seguido de cultivo a 37 °C durante la noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia al cloranfenicol.
La PCR se realizó usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores n.° 1 y 2 en las mismas condiciones. La deleción del gen metB se identificó confirmando el gen de 1,2 kb de tamaño en un gel de agarosa al 1,0 %. La cepa se transformó a continuación con el vector pCP20 (PNAS (2000) vol.97: P6640-6645) y se cultivó en medio LB para eliminar el gen marcador de cloranfenicol. Se construyó la cepa con metB desactivado final en la que el tamaño del gen metB se redujo a 150 pb en gel de agarosa al 1,0 % mediante PCR en las mismas condiciones. La cepa construida se denominó W3-B.
<1-2> Deleción del gen thrB
Los autores de la invención intentaron incrementar la síntesis de O-succinilhomoserina a partir de la homoserina mediante la deleción del gen thrB que codifica homoserina cinasa. En particular, cuando la cepa productora de treonina se usa como un huésped de producción de O-succinilhomoserina, la deleción del gen thrB es necesaria porque la conversión de homoserina en O-fosfohomoserina por este gen es muy fuerte. Para delecionar el gen thrB en la cepa W3-B construida anteriormente, la deleción por PCR de FRT en una etapa se realizó de la misma manera que como se describe anteriormente para la deleción del gen metB.
Para construir el casete de deleción de thrB, se realizó una PCR usando el vector pKD4 (PNAS (2000) vol.97: P6640-6645) como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 como sigue: 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto. El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0 %, seguido de purificación del ADN obtenido de la banda de 1,6 kbp. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-B
transformada con el vector pKD46. La cepa recuperada se sembró en estrías en medio de placa LB que contenía 50 |jg/l de kanamicina, seguido de cultivo a 37 °C durante toda la noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se realizó usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 en las mismas condiciones que anteriormente. La deleción del gen ThrB se identificó seleccionando la cepa cuyo tamaño es de 1,6 kb en gel de agarosa al 1,0 %. La cepa se transformó a continuación con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB. Se construyó la cepa con thrB desactivado final en la que el tamaño del gen thrB se redujo a 150 kb en gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de kanamicina se había eliminado. La cepa construida se denominó W3-BT.
<1-3> Deleción del gen metJ
Para delecionar el gen metJ que es el gen regulador del gen metA implicado en la síntesis del precursor de metionina, se realizó una deleción por PCR de FRT en una sola etapa de la misma manera que se usó para la deleción del gen metB.
Para construir el casete de deleción de metJ, la PCR se realizó con cebadores de SEQ ID NO: 5 y NO: 6 como sigue: 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido de la banda de 1,2 kbp. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-BT transformada con el vector pKD46. La cepa recuperada se sembró en medio de placa LB que contenía cloranfenicol, seguido de cultivo a 37 °C durante la noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se realizó usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 en las mismas condiciones que anteriormente. La deleción del gen metJ se identificó confirmando el gen de 1,6 kb de tamaño en un gel de agarosa al 1,0 %. La cepa se transformó a continuación con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB. Se construyó la cepa con metJ desactivado final en la que el tamaño del gen metJ se redujo a 600 kb en gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones y se confirmó que la cepa de marcador de cloranfenicol se había eliminado. La cepa construida se denominó W3-BTJ.
<1-4> Deleción del gen metA
Para introducir un gen metA resistente a la retroalimentación en el cromosoma, el gen metA cromosómico original se eliminó en la cepa W3-BTJ. Para eliminar el gen metA, se realizó una deleción por PCR de FRT en una sola etapa. Para construir el casete de deleción de metA, la PCR se realizó con cebadores de SEQ ID NO: 9 y NO: 10 como sigue: 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido de la banda de 1,2 kbp. El fragmento de ADN recuperado sometió a electroporación en la cepa E. coli W3-BTJ transformada con el vector pKD46. La cepa recuperada se sembró en medio de placa LB que contenía cloranfenicol, seguido de cultivo a 37 °C durante la noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se realizó usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 9 y NO: 10 en las mismas condiciones que anteriormente. La deleción del gen metA se identificó confirmando el gen de 1,1 kb de tamaño en un gel de agarosa al 1,0 %. La cepa se transformó a continuación con el vector pCP20 y se cultivó en medio LB. Se construyó la cepa con metA desactivado final en la que el tamaño del gen metA se redujo a 100 kb en gel de agarosa al 1,0 % mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol se había eliminado. La cepa construida se denominó W3-BTJA.
<1-5> Introducción del gen metA resistente a la retroalimentación
Para incrementar la producción de O-succinilhomoserina, que es el precursor de L-metionina, se realizó la sobreexpresión del gen metA resistente a la retroalimentación que codifica homoserina O-succiniltransferasa. El documento PCT/US2007/009146 divulga el procedimiento para preparar el gen metA resistente a la retroalimentación y la actividad del mismo.
La secuencia del gen metA 10 resistente a la retroalimentación está representada en SEQ ID NO: 13 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en SEQ ID NO: 14. La secuencia del gen metA 11 está representada en SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en SEQ ID NO: 16. La secuencia del gen metA 32 está representada en SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en SEQ ID NO: 18. La secuencia del gen metA 37 está representada en SEQ ID NO: 19 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en SEQ ID NO: 20. La
secuencia del gen metA 41 está representada en SEQ ID NO: 21 y la secuencia de aminoácidos codificada por el gen está representada en SEQ ID NO: 22 (PCT/US2007/009146).
La PCR se realizó usando los genes anteriores como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 11 y NO: 12 como sigue: 25 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos, extensión a 72 °C durante 2 minutos
El producto de PCR se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido de la banda de 1,2 kbp. Después del aislamiento del fragmento de ADN, el vector pCL1920 se escindió con la enzima de restricción Smal y se ligó al fragmento de ADN aislado. La E. coli se transformó con el vector y las células portadoras de plásmidos se seleccionaron en agar LB que contenía 50 pg/l de espectinomicina. El vector construido se muestra en la Fig. 3.
El vector se sometió a electroporación en la cepa W3-BTJA y se verificó la capacidad de producción de la cepa usando el cultivo en matraz Erlenmeyer como se describe en el Ejemplo 2-1. Se midió la producción de O-succinilhomoserina de la cepa modificada, basada en el 100 % de producción de O-succinilhomoserina de la cepa natural. Como resultado, la producción de O-succinilhomoserina de todas las cepas modificadas fue significativamente mayor que la de las cepas naturales, en particular, metA 11, metA 10 y metA 32 muestran la producción más eficaz.
Tabla 1. Resistencia a la retroalimentación de metA mutante en presencia de metionina 100 mM.
Tabla 2. Producción de O-succinilhomoserina de metA resistente a la retroalimentación en la cepa W3-BTJA.
Para la expresión estable de pMetA10-CL, pMetA11-CL y pMetA32-CL que muestran la producción más eficaz, estos genes se insertaron en el cromosoma de E. coli.
En primer lugar, el gen con marcador de cloranfenicol se amplificó por PCR usando el vector pKD3 como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 23 y NO: 24. El fragmento de PCR se aisló por elución en gel. El gen metA se amplificó por PCR con cebadores de SEQ ID NO: 9 y NO: 10 y la región 3'UTR del gen metA se amplificó por PCR usando el cromosoma W3110 natural como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 25 y NO: 26. Cada uno de los fragmentos de PCR se aisló por elución en gel y la mezcla de fragmentos se amplificó por PCR con cebadores de SEQ ID NO: 9 y NO: 26, produciendo de este modo el fragmento del gen metA que contiene el marcador de cloranfenicol. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3BTJA transformada con el vector pKD46 y se seleccionaron las cepas resistentes al cloranfenicol y se detectó la clonación exitosa del gen metA usando SEQ ID NO: 9 y NO: 10. Las cepas identificadas que introdujeron el gen metA 10, 11, 32 modificado se denominaron W3BTJ-A10, 11 y 32, respectivamente. La producción de O-succinilhomoserina de cada cepa fue similar a la de la cepa W3-BTJA que alberga cada plásmido metA.
<1-6> Sobreexpresión del gen thrA
Para incrementar la producción de O-succinilhomoserina más eficazmente, se realizó la sobreexpresión del gen thrA.
Para ello, el gen thrA se amplificó por PCR usando el cromosoma de E. coli CJM002 (KCCM10568), la cepa productora de L-treonina, como una plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 27 y NO: 28. El fragmento de a Dn amplificado se aisló por elución en gel y se ligó con el promotor CJ1 en el vector pCL1920 usando la enzima de restricción EcoRV. La E. coli se transformó con el vector ligado y las células portadoras de plásmidos se seleccionaron en agar LB que contenía 50 pg/l de espectinomicina. El vector se denominó pCJ-thrA(M)-CL. La secuencia de aminoácidos codificada por el gen thrA está representada en SEQ ID NO: 29, que tiene mutación en la posición de aminoácido 345. Además, el gen thrA natural de la cepa E. coli W3110 se amplificó por PCR de la
misma manera que como se describe anteriormente y se clonó en el vector denominado pCJ-thrA-CL. Los vectores se sometieron a electroporación en W3BTJ-A11, respectivamente, y la producción de O-succinilhomoserina de cada cepa se verificó usando el procedimiento de cultivo en matraz como se describe en el Ejemplo 2-1. Como resultado, la cepa transformada con el vector que contiene la forma mutante del gen thrA acumuló niveles significativamente altos de O-succinilhomoserina.
Tabla 3. Producción de O-succinilhomoserina en presencia del vector de expresión de thrA.
<1-7> Conversión de la cepa productora de L-treonina
La cepa productora de O-succinilhomoserina se construyó usando E. coli CJM002 (KCCM10568), que es la cepa productora de L-treonina e independiente de L-metionina, como se describe en los Ejemplos 1-1 a 1-5. La cepa que contiene el gen metA mutante en el cromosoma se denominó CJM-A10, CJM-A11 y CJM-A32, respectivamente. Y se construyó otra cepa productora de precursor de L-metionina usando la cepa FTR2533 (KCCM10541) descrita divulgada en PCT/KR2005/00344 por los Ejemplos 1-1 a 1-5 anteriores y se denominó CJM2-A11. Cada cepa se transformó con el vector de expresión de thrA como se describe en el Ejemplo 1-6. La producción del precursor de metionina de estas cepas se midió mediante el procedimiento de cultivo en matraz descrito en el Ejemplo 2-1. Como resultado, la cepa CJM-A11 que alberga el plásmido pCJ-thrA(m)-CL mostró una producción de O-succinilhomoserina significativamente mayor.
[Tabla 4] Producción de precursor (O-succinilhomoserina) de metionina mediante cultivo en matraz
O-succinilhomoserina (%)
CJM-A10 100
CJM-A11 113
CJM-A32 80
CJM2-A11 94
CJM-A11 (pCJ-thrA(m)-CL) 127
Ejemplo 2: Fermentación para la producción de precursor de L-metionina
<2-1> Experimento de cultivo en matraz.
Para medir la producción de precursor de metionina de cada cepa construida en el Ejemplo 1 se realizó un cultivo en matraz Erlenmeyer. Cada cepa se cultivó en medio de placa LB a 31 °C durante la noche. Se inoculó una única colonia en 3 ml de medio LB, seguido de cultivo a 31 °C durante 5 horas. La solución de cultivo se diluyó 200 veces en un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 25 ml de medio productor de precursor de metionina, seguido de cultivo a 31 °C, 200 rpm durante 64 horas. Se realizó HPLC para comparar con la capacidad de producción de precursor de metionina (Tabla 2 y Tabla 3). Como resultado, la capacidad de producción de metionina se incrementó significativamente en la cepa productora de precursor de metionina preparada a partir de la cepa productora de L-treonina libre del requisito de metionina.
[Tabla 1]
<2-2> Fermentación a gran escala
Se seleccionaron algunas cepas que exhiben una mayor capacidad de producción de O-succinilhomoserina y se cultivaron en un fermentador de 5 l para producir O-succinilhomoserina en masa. Cada cepa se inoculó en medio LB que contenía espectinomicina, seguido de cultivo a 31 °C durante la noche. A continuación, se inoculó una única colonia en 10 ml de medio LB que contenía espectinomicina, que se cultivó a 31 °C durante 5 horas. La solución de cultivo se diluyó 100 veces en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml que contenía 200 ml de medio de siembra de precursor de metionina, seguido de cultivo a 31 °C, 200 rpm durante 3 a 10 horas. La solución de cultivo se inoculó en un fermentador de 5 l, seguido de cultivo adicional durante 20 a 100 horas mediante fermentación por lotes alimentados. La concentración de precursor de metionina en la solución fermentada se midió por HPLC y los resultados se muestran en la Tabla 4.
[Tabla 3]
[Tabla 4] Producción de precursor de metionina en un fermentador
Aplicabilidad industrial
Como se ha descrito hasta ahora, el uso de la cepa productora de precursor de metionina divulgada en el presente documento, la metionina se puede producir de forma más respetuosa con el medio ambiente que el procedimiento de síntesis química de metionina convencional. Y la L-metionina obtenida por conversión de O-succinilhomoserina producida a partir de la cepa divulgada en el presente documento se puede usar ampliamente en la producción de
Claims (7)
- REIVINDICACIONES1 Un microorganismo para producir O-succinilhomoserina, comprendiendo dicho microorganismo:(i) una homoserina O-succiniltransferasa resistente a la inhibición por retroalimentación de metionina que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 o 22;(ii) una actividad aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa (EC2.7.
- 2.4 o 1.1.1.3) incrementada basada en la de una proteína natural; y(iii) una actividad de cistationina gamma sintasa reducida o inactivada basada en la de una proteína natural.2 El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido aspartocinasa u homoserina deshidrogenasa tiene la secuencia de SEQ ID NO: 29.
- 3. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la actividad intracelular de homoserina cinasa se reduce o inactiva en base a la de una proteína natural.
- 4. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo es Escherichia sp. o Corynebacteria sp.
- 5. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el microorganismo es Escherichia coli.
- 6. El microorganismo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el microorganismo es Corynebacteria sp.
- 7. Un procedimiento de producción de O-succinilhomoserina, comprendiendo el procedimiento:a) cultivar los microorganismos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio; b) acumular la O-succinilhomoserina en el medio o en los microorganismos; yc) aislar la O-succinilhomoserina del medio o en los microorganismos.
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