BRPI0901502A2 - usos de um polinucleotìdeo e de um polipeptìdeo, método para detectar a capacidade de um agente de teste, domìnios extracelulares ipt-3 e ipt-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito, e, vetor - Google Patents
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Abstract
USOS DE UM POLINUCLEOTìDEO E DE UM POLIPEPTìDEO, MéTODO PARA DETECTAR A CAPACIDADE DE UM AGENTE DE TESTE, DOMìNIOS EXTRACELULARES IPT-3 E IPT-4 DE RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATóCITO, E, VETOR. Uso de um polinucleotídeo codificador ou de um polipeptídeo compreendendo pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito para a triagem e/ou o desenvolvimento de agentes farmacologicamente ativos úteis no tratamento de câncer, preferivelmente um câncer com desregulação de receptor de fator de crescimento de hepatócito.
Description
"USOS DE UM POLINUCLEOTÍDEO E DE UM POLIPEPTIDEO, MÉTODO PARA DETECTAR A CAPACIDADE DE UM AGENTE DE TESTE, DOMÍNIOS EXTRACELULARES IPT-3 E IPT-4 DE RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO DE HEPATÓCITO, E, VETOR"
Campo técnico da invenção
A presente invenção refere-se à área da proteína receptor de fator de crescimento de hepatócito (HGFR). Mais especificamente, a presente invenção refere-se à identificação do sítio de ligação de afinidade alta de HGFR por seu ligante, ao fator de crescimento de hepatócito (HGF), e aos métodos para a identificação de antagonistas de HGFR selecionando o sítio de ligação de afinidade alta de HGFR.
Fundamentos da invenção
O receptor de fator de crescimento de hepatócito (também conhecido como Met) é uma tirosina cinase e é o produto do proto-oncogene c-met. Consiste de uma a-subunidade de 50 kDa e de uma P-subunidade de 145 kDa, que são ligadas por uma ligação de dissulfeto, a a-subunidade sendo completamente extracelular, enquanto que a p-subunidade inclui (de terminação-N para terminação-C) uma região extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de tirosina cinase citoplásmica. O receptor hetero-dimérico a/p maduro é gerado por processamento proteolítico e glicosilação terminal de um precursor de cadeia única de 170 kDa.
HGF, também conhecido como Fator de espalhamento, é uma glicoproteína ligante de heparina com um espectro amplo de atividades biológicas incluindo proliferação, motilidade, sobrevivência e morfogênese celulares. E sintetizado e secretado como um precursor de cadeia única inativo (pro-HGF) que é armazenado na matriz extracelular devido à sua afinidade alta por proteoglicanos. Pro-HGF sofre clivagem proteolítica em resíduos R494-V495 para originar a forma biologicamente ativa, um hetero-dímero a/p dissulfeto-ligado, onde a cadeia-a consiste de um domínio N-terminal seguido por quatro domínios kringle e cadeia-P compartilha homologia estrutural com a família quimotripsina de serina proteases. A cadeia-P, contudo, é faltante de atividade proteolítica porque dois dos três resíduos críticos que formam a tríade catalítica típica de serina proteases não estão conservadas em HGF. Não obstante sua incapacidade para sinalizar, pro-HGF liga-se em Met com afinidade alta e exibe HGF ativo.
Recentemente, numerosos estudos de estrutura-função têm emitido alguma luz sobre as interações entre a porção extracelular de Met e HGF.
A região extracelular de Met tem uma estrutura modular, que inclui três domínios funcionais: o domínio Sema (presente também em Semaforinas e plexinas) que inclui os primeiros 500 resíduos na terminação-N da proteína e tem uma estrutura de hélice-P de sete lâminas, o domínio PSI (também encontrado em Plexinas, Semaforinas e Integrinas) que cobre cercade 50 resíduos e contém quatro ligações de dissulfeto conservadas, e 400 resíduos adicionais que ligam o domínio PSI na hélice de transmembrana e são ocupados por quatro domínios IPT (domínios relacionados à Imunoglobulina presentes em Plexinas e fatores de Transcrição).
HGF é um ligante bivalente, contendo um sítio de ligação de afinidade alta por Met na cadeia-a e um sítio de ligação de afinidade baixa na cadeia-p. Cooperação entre as cadeias-a e -P é exigida para a atividade biológica de HGF; enquanto que a cadeia-a, e mais precisamente o N-domínio e o primeiro kringle, é suficiente para ligação de Met, a cadeia-p é necessária para ativação de Met.
Resolução da estrutura de cristal dos domínios SEMA e PSI de Met em complexo com a cadeia-p de HGF (veja i.a. WO-A-2005/108424) revelou que o sítio de ligação de afinidade baixa por HGF está localizado em lâminas 2-3 da hélice-P, e que a porção de HGF-P que se liga em Met é a mesma região que serina proteases usam para se ligarem em seus substratosou inibidores. Significativamente, determinação de estrutura de cristal de cadeia-P de HGF em resolução de 0,253 nm e análise de mutagênese específica revelaram que os resíduos envolvidos em ligação de Met na bolsa de ativação de cadeia-P de HGF são expostos apenas após conversão proteolítica de pro-HGF, explicando assim o porquê pro-HGF liga-se em Met com afinidade alta sem ativá-lo. Embora a interação de afinidade baixa entre a cadeia-P de HGF e o domínio Sema de Met esteja bem caracterizada tanto estrutural quanto funcionalmente, no momento não está claro qual região de Met se liga na cadeia-a de HGF com afinidade alta. Assim, o mecanismo principal pelo qual HGF ativa Met ainda permanece insatisfatoriamente entendido. Isto é um pouco surpreendente quando se considera a grande importância biológica e terapêutica desta rota.
Sinalização de HGF-Met é essencial durante embriogênese e em regeneração de tecido na vida adulta. Significativamente, sinalização de HGF-Met desregulada desempenha um papel chave em tumorigênese e metástase. Inativação de Met inapropriada por mecanismos diferentes incluindo estimulação autócrina de HGF, sobre-expressão de receptor, amplificação de gene e mutação pontual é descrita em uma ampla variedade de malignidades de humano e correlaciona-se com prognose insatisfatória.
Estas descobertas resultaram em um interesse crescente na rota de HGF-Met como um alvo para terapia do câncer, levando ao desenvolvimento de uma variedade de inibidores de Met/HGF. Estes incluem compostos de molécula pequena selecionando atividade de Met cinase, neutralizando anticorpos anti-Met ou anti-HGF, receptores chamariz e fatores derivados de HGF. Contudo, se tais moléculas selecionam o sítio de ligação de afinidade alta por HGF e qual é o mecanismo molecular exato na base de ligação de HGF em Met com afinidade alta, permanece ainda desconhecido. Isto pode evitar o isolamento de agentes terapêuticos mais seletivos, com sensibilidade aumentada e menos efeitos colaterais. O conhecimento exato do sítio de ligação de afinidade altaMet por HGF certamente ajudará a planejar antagonistas elevadamente específicos de Met. Sumário da invenção
A necessidade é portanto sentida por soluções melhoradas permitindo a identificação de antagonistas de Met com sensibilidade aumentada e menos efeitos colaterais para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes para o tratamento de cânceres.
O objetivo desta descoberta é proporcionar tais soluções melhoradas.
De acordo com a presente invenção tais objetivos são alcançados graças à solução tendo características referidas especificamente às reivindicações resultantes. As reivindicações formam parte integral do ensinamento técnico aqui proporcionado em relação à presente invenção.
Assim, objetivo da presente descoberta é a identificação do sítio de ligação de afinidade alta de HGF pelo receptor de fator de crescimento de hepatócito (HGFR), i.e. os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR. Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar meio para a identificação de antagonistas de HGFR selecionando o sítio de ligação de afinidade alta de HGFR por HGF para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de cânceres.
Em uma modalidade, a presente invenção proporciona o uso de um polipeptídeo compreendendo, ou um polinucleotídeo codificando pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito para a triagem e/ou o desenvolvimento de agentes farmacologicamente ativos úteis no tratamento de câncer, em particular um câncer com desregulação de atividade de receptor de fator de crescimento de hepatócito.
Em uma modalidade, o agente farmacologicamente ativo é um antagonista e/ou inibidor de receptor de fator de crescimento de hepatócito epode ser selecionado dentre inibidores de molécula pequena, aptâmeros, nucleotídeos de anti-senso, inibidores baseados em RNA, siRNAs, anticorpos, peptídeos, fatores negativos dominantes.
Em uma outra modalidade, a presente invenção ocupa-se com um método para detectar a capacidade de um agente de teste para atuar como um inibidor/antagonista de receptor de fator de crescimento de hepatócito útil no tratamento de câncer, preferivelmente um câncer com desregulação de atividade de receptor de fator de crescimento de hepatócito, compreendendo as etapas de:
(a) por em contato um agente de teste com pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito, ou células expressando pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito,
(b) medir atividade, função, estabilidade e/ou expressão de receptor de fator de crescimento de hepatócito, e
(c) selecionar o agente que reduz atividade, função, estabilidade e/ou expressão de receptor de fator de crescimento de hepatócito.
Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção ocupa-se com o uso dos domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito como um medicamento para tratar câncer. Descrição detalhada da invenção
A presente invenção agora será descrita em detalhe com relação algumas modalidades preferidas por meio de exemplos não-limitantes com referência aos desenhos anexados, nos quais:
- Figura 1 mostra a engenharia e a purificação de subdomínios Met e HGF. (A) Representação esquemática de proteínas engenhadas usadas neste estudo. Painel esquerdo: receptores engenhados. W.T. MET, Met de tipo selvagem; EXTRA, porção extracelular; INTRA, porção intracelular; SP, peptídeo de sinal; SEMA, domínio de homologia de semaforina; PSI, domíniode homologia de plexina-semaforina-integrina; IPT 1-4, domínio 1-4 de homologia de plexina-imunoglobulina-fator de transcrição; TM, domínio de transmembrana; JM, domínio de justa-membrana; KD, domínio de cinase; CT, cauda C-terminal; E, epitopo FLAG ou MYC; H, etiqueta poli-histidina. O triângulo vermelho indica o sítio de clivagem proteolítica entre cadeia-a e cadeia-p. Painel direito: ligantes engenhados. W.T. HGF, HGF de tipo selvagem; ND, domínio-N; K 1-4, kringle 1-4; PLD, domínio protease-semelhante; UNCL. HGF, HGF não-clivável. O asterisco indica a substituição de aminoácido R494Q no sítio proteolítico. (B) Coloração com Coomassie de ligantes e receptores purificados por afinidade. Cada grupo de proteínas (Sema, Sema-PSI, Met chamariz; PSI-IPT, IPT; HGF-a, HGF não-clivável, HGF; HGF NK1, HGF-p) tem sido resolvido por SDS-PAGE em condições não-redutoras e é quantificado contra uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA). MW, marcador de peso molecular; kDa, quilo-Dalton.
- Figura 2 mostra uma análise por ELISA de interações de HGF-Met. (A) Ligação de subdomínios de Met para ativar HGF. Receptores engenhados foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de HGF ativo em fase líquida. Ligação foi revelada usando anticorpos anti-HGF. Ligação não-específica foi medida pelo uso de BSA emvez de receptores purificados em fase sólida. (B, C, D) Ligação de Met chamariz, Sema-PSI, e IPT em formas diferentes de HGF. Receptores engenhados foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de HGF ativo MYC-etiquetado, pro-HGF, HGF-a ou HGF NK1 em fase líquida. Liquidação foi revelada usando anticorpos anti-MYC.
Ligação não-específica foi medida pelo uso de angiostatina (AS) MYC-etiquetada em fase líquida.
- Figura 3 mostra que domínios IPT 3 e 4 são suficientes para ligação em HGF-a com afinidade alta. (A) Representação esquemática de variantes de IPT deletadas. Código de cor e legenda como em Figura IA. (B)Análise ELISA de interações entre variantes de IPT e HGF-a. IPTs engenhados foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de HGF-a em fase líquida. Ligação foi revelada usando anticorpos anti-HGF.
- Figura 4 mostra que domínios IPT 3 e 4 são suficientes para ligação em HGF em células vivas. (A) Representação esquemática de receptor MetA25-741 deletado. Código de cor e legenda como em Figura IA. (B) Análise de biotinilação de superfície. Proteínas celulares foram imunoprecipitadas (IP) usando anticorpos direcionados contra a porção C-terminal de Met e analisadas por Western blotting (WB) usando estreptavidina (SA) conjugada com peroxidase de rábano picante. Os mesmos blots foram re-sondados com anticorpos anti-Met. W.T., tipo selvagem; A549, células de carcinoma de pulmão de humano A549; MDA, células de melanoma de humano MDA-MB-435; TOV, células de carcinoma de ovário de humano TOV-112D; V. Vazio, vetor vazio. A banda pl70 corresponde a Met não processado; pl45 é a forma madura do receptor. (C) Análise de ligação química cruzada. Células TOV-112D expressando MetA25-74i (Met A25-741) e células TOV-112D de tipo selvagem (W.T. TOV) foram incubadas com HGF e então submetidas à ligação química cruzada. Lisados de célula foram imunoprecipitados usando anticorpos anti-Met e analisados por Western blotting usando anticorpos anti-HGF. Seta indica complexos de HGF-MetA25.74i- (D) Análise de fosforilação de Met. Células TOV-112D expressando MetA25-74i foram estimuladas com FBS 1% como um controle negativo e com quantidades iguais de HGF, pro-HGF, HGF NK1 ou NK1- NK1. Fosforilação de receptor foi determinada por imunoprecipitação com anticorpos anti-Met e Western blotting com anticorpos anti-fosfotirosina (anti-pTyr). Os mesmos blots foram re-sondados usando anticorpos anti-Met. Setas indicam bandas correspondendo a MetA25-74i ou imunoglobulinas (Ig). (E) Representação esquemática de NK1-NK1. Da terminação-N paraterminação-C: SP, peptídeo de sinal; ND, domínio-N; Kl, kringle 1; H, etiqueta poli-histidina.
- Figura 5 mostra que IPT solúvel inibe crescimento invasivo induzido por HGF in vitro. (A) Células MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral foram estimuladas HGF recombinante e fosforilação de Met foi determinada por immunoblotting usando anticorpos anti-fosfotirosina (painel superior). O mesmo blot foi re-sondado usando anticorpos anti-Met (painel inferior). V. Vazio, Vetor Vazio. (B) Ensaio de morfogênese de ramificação. Esferóides pré-formados de células MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral foram embebidas em colágeno e então estimuladas com HGF recombinante para formar túbulos ramificados. Invasão de colágeno foi quantificada por determinação de escore do número médio de túbulos brotando de cada esferóide. EV, Empty Vector; DM, Met chamariz; SP, Sema-PSI. (C) Imagens representativas do experimento descrito em B. Amplitude: 200X.
- Figura 6 mostra que IPT solúvel exibe atividade anti-tumor e anti-metastática em camundongos. Camundongos CD-1 nu-/- foram injetados subcutaneamente com células MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral, e crescimento de tumor foi monitorado no decorrer do tempo. (A) Plotagens Kaplan-Meier-semelhantes de latência de tumor (eixo X, tempo em dias; eixo Y, percentagem de animais livres de tumor). V. Vazio, vetor vazio. (B) Volume médio de tumor no decorrer do tempo. (C) Análise imuno-histoquímica de seções de tumor usando anticorpos anti-INDICADOR. Amplitude: 400X. (D) Análise de vaso de tumor. Seções de tumor foram coradas com anticorpos anti-fator de Von Willebrand. O número de vasos por mm quadrado de seção de tumor foi determinado por microscopia. EV, Vetor vazio; DM, Met chamariz; SP, Sema-PSI. (E) Análise de incidência de metástase. Sob autópsia, seções seriais de pulmão foram analisadas por microscopia para determinar a presença de micrometástase. Incidência demetástase - i.e. o número de camundongos com metástase sobre o total - é indicada em ambas percentagem (barras) e fração (na extremidade das barras). (F) Imagens representativas de micrometástase do grupo de vetor vazio. Seções de pulmão foram coradas com hematoxilina e eosina. Linhas tracejadas identificam as paredes de vasos sanguíneos(vs). Células metastáticas (mc) podem ser encontradas dentro dos vasos como um embolo ou no parênquima. Amplitude: 400X.
Os dados apresentados na presente descoberta sugerem que a cadeia-a de HGF liga-se na região IPT de Met com afinidade alta, e que ocorre também independentemente do processamento proteolítico do ligante. Também sugerem que ligação de HGF em IPT no contexto de um Met de transmembrana faltante de domínio Sema é suficiente para transmitir o sinal para ativação de receptor no domínio de cinase citoplásmica, embora sem distinção entre a forma inativa e ativa do ligante. Finalmente, proporcionam evidência de que proteínas engenhadas derivadas da região IPT e domínio Sema de Met são capazes de neutralizar a atividade pró-invasiva de HGF tanto in vitro quanto in vivo.
Tem sido conhecido há longo tempo que HGF é um fator bivalente. Estudos iniciais de engenharia de proteína identificaram um sítio de ligação-Met de afinidade alta no domínio N e primeiro kringle de HGF. Subseqüentemente, análise biológica e bioquímica combinada demonstrou que o domínio serina protease-semelhante de HGF (cadeia-(3), embora não necessário para ligação, desempenha um papel chave na medição de ativação de receptor. Mais recentemente, dados de mutagênese e cristalográficos detalhados têm caracterizado inteiramente tanto estrutural quanto funcionalmente o sítio de ligação-Met de afinidade baixa sobre a cadeia-|3 de HGF e sua interação com o domínio Sema de Met. A interface entre a cadeia-a de HGF e Met havia permanecido contudo indefinida. Estudos de microscopia crioeletrônica e de espalhamento de raios-X de ângulo pequenosugeriram a presença de contatos entre o domínio N-terminal e de primeiro kringle de HGF e o domínio Sema de Met. Contudo, análise de ressonância de plasmon revelou que esta interação tem uma afinidade muito baixa (cerca de 2 vezes menor do que aquela de HGF-0 para Sema e 100 vezes menor do que aquela de HGF-a para o receptor intacto). Visto que esta interação fraca não pode ser responsabilizada pela ligação forte entre HGF e Met, o sítio de ligação-HGF de afinidade alta sobre Met tinha ainda que ser identificado.
Os resultados apresentados aqui contribuem para preencher esta lacuna e sugerem que este sítio de ligação-HGF longamente procurado jaz na região IPT de Met e mais precisamente nos últimos dois domínios semelhantes à imunoglobulina próximos da membrana celular. Várias evidências experimentais distintas proporcionadas na presente descoberta sugerem que este é o caso. Em primeiro lugar, um receptor Met deletado, solúvel, contendo apenas os quatro domínios IPT (IPT) liga-se em HGF com substancialmente a mesma afinidade que a porção extracelular inteira de Met. De modo inverso, Sema exibe afinidade muito baixa por HGF. Em segundo lugar, IPT liga-se em HGF ativo, pro-HGF ou HGF-a com força não modificada. Em terceiro lugar, deleção de IPT 1 e IPT 2 não afeta a afinidade de IPT por qualquer forma de HGF. Em quarto lugar, um receptor Metengenhado trazendo uma deleção grande em seu ectodomínio correspondendo ao domínio Sema, o módulo PSI e os primeiros dois domínios imunoglobulina-semelhantes (MetA25-74i) retém a capacidade de ligar em HGF e de transduzir o sinal para ativação de cinase para dentro da célula, embora não possa distinguir entre HGF ativo e Pro-HGF. Finalmente, uma forma dimérica de HGF NK1, que conhecidamente contém o domínio de ligação Met mínimo de HGF-a, é capaz de induzir ativação de MetA25-74i tão eficientemente quanto se não mais poderosamente do que HGF, assim identificando em IPT 3-4 o sítio de ligação-NKl de HGF.
Embora estes dados apontem para um papel chave de IPT emligação de HGF, é digno de nota que dois estudos de estrutura/função prévios sobre a porção extracelular de Met falharam em identificar qualquer sítio de ligação de ligante nesta região. Um primeiro esboço de mapa de ectodomínio de Met sugeriu que o domínio Sema é necessário e suficiente para ligação de HGF baseado em ensaios ELISA. Um segundo estudo analisou o papel do domínio Sema em dimerização de receptor e sugeriu que uma forma engenhada da porção extracelular de Met contendo uma deleção no domínio Sema não foi capaz de co-precipitar HGF.
A presente descoberta adicionalmente demonstra que cooperação entre Sema e IPT é observada também quando a porção extracelular e Met é usada como uma ferramenta biotecnológica para inibir crescimento invasivo induzido por HGF. Na análise in vitro e em xenoenxertos de camundongo ambas as proteínas solúveis IPT e Sema-PSI exibiram um efeito inibitório significativo. Contudo, nenhuma delas pôde alcançar a inibição poderosa exibida pelo ecdomínio Met inteiro, que contém ambos os sítios de ligação-HGF de afinidade alta e de afinidade baixa. Isto implica que ambas estas interações contribuem para controlar a atividade de Met. Embora o contato de HGF-P-Sema já tivesse sido identificado como um alvo pra terapia, os resultados apresentados aqui revelam uma segunda interface que oferece oportunidades para intervenção farmacológica. Anticorpos ou proteínas recombinantes que se ligam na região IPT no lugar de HGF autêntico têm uma aplicação como inibidores elevadamente competitivos de Met para o tratamento de cânceres dependentes de HGF/Met.
MATERIAIS E MÉTODOS
Engenharia de proteína
Ligantes engenhados e receptores de transmembrana ou solúveis descritos neste trabalho têm sido gerados por técnicas de engenharia genética e PCR padrão. Todos fatores conservam a seqüência líder de sua proteína parental na terminação-N. As seqüências de aminoácidos (aa) deproteínas Met solúveis (Gene Bank N. X54559) correspondem aos aa 1-24 (peptídeo de sinal) mais: Met chamariz, aa 25-932; Sema, aa 25-515; Sema-PSI, aa 25-562; PSIEPT, aa 516-932; IPT, aa 563-932; IPT Al, aa 657-932; IPT A1-2, aa 742-932; IPT-3, aa 742-838; IPT-4, aa 839-932. Na terminação-C de cada molécula uma seqüência de epitopo de duplo INDICADOR (SDYKDDDDK - SEQ ID No.: 19) ou único MYC (EQKLISEEDLN - SEQ ID No.:20) e uma etiqueta poli-histidina (HHHHHHH - SEQ ID No.:21) foram adicionados para purificação e detecção de proteína. O MetA25-741 engenhado de transmembrana é idêntico ao Met de tipo selvagem exceto pela região deletada (aa 25-741). As seqüências de aminoácidos de proteínas HGF engenhadas HGF (Gene Bank N. M73239) correspondem aos 1-31 (peptídeo de sinal) mais: HGF, aa 32-728; HGF-a, aa 32-473; HGF NK1, aa 32-205; HGF-p, aa 495-728. O epitopo MYC ou INDICADOR acima e a etiqueta poli-histidina foram adicionados na terminação-C. HGF não-clivável tem sido descrito antes (Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432). NK1-NK1 é uma forma dimérica de HGF NK1 consistindo da mesma região N-terminal HGF repetida em tandem (aa 1-205 diretamente ligados em aa 32-205 sem espaçador). Os cDNAs codificadores de todas as proteínas engenhadas foram subclonados no vetor de transferência lentiviral pRRLsin.PPT.CMV.eGFP. Wpre (SEQ ID No.: 1) no lugar de gfp cDNA como mostrado em Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25(2), 217-222. A seqüência codificadora de GFP foi substituída pelos seguintes cDNAs: Met chamariz FLAG.his (SEQ ID No.:2), Sema FLAG.his (SEQ ID No.:3), Sema-PSI FLAG.his (SEQ ID No.:4), PSI-IPT FLAG.his (SEQ ID No.:5), IPT FLAG.his (SEQ ID No.:6), IPT Al FLAG.his (SEQ ID No.:7), IPT A1-2 FLAG.his (SEQ ID No.:8), IPT 3 FLAG.his (SEQ ID No.:9), IPT 4 FLAG.his (SEQ ID No.:10), Met A25-741 (SEQ ID No.:ll), HGF MYC his (SEQ ID No.:12), HGF-a MYC his (SEQ ID No.:13), HGF-NK1 MYC his (SEQ ID No.: 14), HGF-p MYC his (SEQ ID No.: 15), HGF MYC his não-clivável(SEQ ID No.: 16), NK1-NK1 his (SEQ ID No.: 17), angiostatina MYC his(SEQIDNo.:18).
Ensaios imunossorventes ligados à enzima
Todos os fatores e receptores engenhados foram colhidos do meio condicionado de células de melanoma de humano MDA-MB-345 transduzidas com vetor lentiviral na ausência de soro. Purificação de fator foi realizada por cromatografia de afinidade por metal imobilizado como previamente descrito em Michieli P. et al. (2002) Nat Biotechnol. 20(5), 488-495. Conversão de pro-HGF em HGF ativo foi realizada por incubação de pro-HGF purificado (concentração máxima 100 ng/ul) com FBS 2-10% (Sigma, St. Louis, Missouri) a 37°C por 24 horas. Conversão de fator foi analisada por Western blotting usando anticorpos anti-HGF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota). HGF não-clivável submetido à mesma incubação com FBS foi usado como pro-HGF em todos os ensaios que compararam HGF ativo com HGF não processado. Ligação de ligantes engenhados em receptores solúveis foi medida por ELISA usando receptores solúveis Etiquetados com INDICADOR em fase sólida e ligantes engenhados MYC-etiquetados em fase líquida. Uma concentração fixa de receptor solúvel purificado (100 ng/cavidade) foi adsorvida em placas ELISA de 96 cavidades.
Placas revestidas com proteína foram incubadas com concentrações crescentes de ligantes engenhados, e ligação foi revelada usado anticorpos anti-HGF biotinilados (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) ou anticorpos anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Califórnia). Dados de ligação foram analisados e ajustados usando programa de computador Prism(Graph Pad Software, San Diego, Califórnia).
Cultura de célula
Células de melanoma de humano MDA-MB-435 foram adquiridas da Georgetown University Tissue Culture Shared Resource (Washington, District of Columbia). Células foram mantidas em DMEMsuplementado com FBS 10% (Sigma). Células de carcinoma de ovário de humano TOV-112D foram obtidas de ATCC (Rockville, Maryland; ATCC N. CRL-11731) e foram cultivadas usando uma mistura 1:1 de Meio MCDB 105 e Meio 199 suplementado com FBS 15% (todos da Sigma). Células de carcinoma de pulmão de humano A549 também foram obtidas de ATCC (ATCC N. CCL-185) e mantidas em RPMI suplementado com FBS 10%.
Vetores lentivirais
Estoques de vetor foram produzidos por transfecção transiente de células 293T como previamente descrito em Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25 (2), 217-222. Resumidamente, a mistura de DNA plasmídeo para transfecção foi preparada como segue: plasmídeo ENV (VSV-G), 9 ug; PACOTE plasmídeo pMDLg/pRRE 16,2 ug; REV plasmídeo, 6.25 ug; VETOR DE TRANSFERÊNCIA VECTOR (plasmídeo #2-18), 37,5 ug. Os plasmídeos foram diluídos em uma solução de TE/CaCl2, na qual uma soluçãode HBS foi adicionada enquanto era agitada na velocidade máxima. A mistura de DNA/CaCLTHBS foi imediatamente adicionada em gotas nas placas de célula que foram então incubadas a 37°C. Após 14-16 horas o meio de cultura foi substituído por um fresco. Sobrenadantes de cultura celular contendo as partículas de vetor foram colhidos cerca de 36 horas após a troca de meio. Após coleção, os sobrenadantes foram filtrados através de membranas de poro de 0,2 um e armazenados a -80°C. Concentração de antígeno p24 viral foi determinada pelo Kit ELISA de perfil de núcleo p24 para HTV-1 (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts) de acordo com as instruções do fabricante. Células foram transduzidas em placas de seis cavidades (105 células/cavidade em 2 ml de meio) usando 40 ng/ml de p24 na presença de 8 ug/ml de polibreno (Sigma) como descrito em Vigna, E. e Naldini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308-316. Meio foi trocado cerca de 18 horas após transdução. Crescimento de células e produção de proteína foram monitorados no decorrer do tempo. Linhagens de células transduzidas foram entãosemeadas em placas de 15 cm, crescidas para confluência de 80% e incubadas em meio sem soro. Após 72 horas, os sobrenadantes contendo as proteínas solúveis recombinantes foram colhidos, filtrados e purificados por cromatografia de afinidade ou armazenados a -30°C.
Imunoprecipitação e análise por Western blot
Lise de célula, imunoprecipitação e análise por Western blot foram realizadas usando tampão de extração (EB) como descrito em Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57. Sinal foi detectado usando sistema ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, Nova Jérsei) de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos anti-Met para imunoprecipitação têm sido descritos por Ruco, L.P. et al. (1996) JPathol. 180(3), 266-270 e foram adquiridos de UBI (Lake Placid, New York). Anticorpos anti-Met para Western blot foram adquiridos de Santa Cruz. Anticorpos anti-INDICADOR foram obtidos de Sigma. Análise de fosforilação de Met em células MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral foi realizada como previamente descrito em Michieli, P. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73. Ligação cruzada em HGF e análise de ativação de Met
Células TOV-112D expressando MetA25-74i transduzidas com vetor lentiviral foram submetidas à análise de biotinilação de superfície usando um ECL™ Surface Biotinylation Module kit (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Ligação química cruzada foi realizada como previamente descrito em Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432. Resumidamente, células foram privadas de fatores de crescimento de soro por 3 dias e então incubadas com HGF 1 nM por 3 horas. Lisados de célula foram imunoprecipitados usando anticorpos direcionados contra a porção C-terminal de Met como mostrado em Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol 180(3), 266-270, resolvidos por SDS-PAGE usando um gradiente de poliacrilamida de 3-10% e analisados por Western blotting usando anticorpos anti-HGF (R&D). Para análise de ativação dereceptor, células TOV-112D expressando MetA25-74i foram privadas de fatores de crescimento de soro por 3 dias e então estimuladas com HGF 1 nM, HGF Não-clivável, HGF NK1 ou NK1-NK1 por 10 minutos. Células foram lisadas usando EB como descrito em Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57. Proteínas celulares foram imunoprecipitadas com anticorpos anti-Met como acima e analisadas por Western blotting usando anticorpos anti-fosfotirosina (UBI). Os mesmos blots foram re-sondados com anticorpos anti-Met (Ruco, L.P. et al. (1996) JPathol. 180(3), 266-270).
Ensaios biológicos
Ensaios de invasão de colágeno usando células MDA-MB-435 foram realizados usando esferóides pré-formados como descrito em Michieli, P. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73. Resumidamente, esferóides foram gerados por incubação de células durante a noite (700 células/cavidade) em placas de 96 cavidades não-aderentes (Greiner, Frickenhausen, Alemanha) napresença de 0,24 g/ml de metil-celulose (Sigma). Esferóides foram embebidos em uma matriz de colágeno contendo 1,3 mg/ml de colágeno de tipo I de cauda de rato (BD Biosciences, Bedford, Massachusetts) e FBS 10% usando placas de 96 cavidades (40 esferóides/cavidade). Esferóides embebidos foram cultivados a 37°C por 24 horas, e então estimulados com 30 ng/ml de HGF (R&D) ou nenhum fator por 24 horas adicionais. O número de túbulos brotando de cada esferóide foi contado por microscopia. Pelo menos 12 esferóides por ponto experimental foram analisados.
Ensaio de tumorigênese
Células de tumor MDA-MB-435 induzidas por vetor lentiviral (3-IO6 células/camundongo) em 0,2 ml de DMEM foram injetadas subcutaneamente no flanco posterior direito de camundongos fêmeas imunodeficientes nu-/- de seis semanas de idade em experiência Suíça CD-1 (Charles River Laboratories, Calco, Itália). Tamanho de tumor foi avaliado cada 2 dias usando um compasso de calibre. Volume de tumor foi calculado usando afórmula V=4/37tx2y/2 onde x é o eixo menor de tumor e y o eixo maior de tumor. Uma massa de 15 mm3 - correspondendo aproximadamente ao volume inicial ocupado pelas células injetadas - foi escolhida como limite para positividade de tumor. Camundongos cujos tumores estiveram abaixo deste limite foram considerados livres de tumor. Após aproximadamente 4 semanas, camundongos foram mortos e tumores foram extraídos para análise. Animais foram submetidos a autópsia. Tumores e pulmões foram embebidos em parafina e processados para histologia. Análise de micrometástase foi realizada por microscopia sobre seções seriais de pulmão coradas com hematoxilina e eosina. Seções de tumor foram coradas com hematoxilina e eosina e analisadas por um patologista independente não informado sobre a identidade da amostra. Expressão de transgene foi determinada sobre seções de tumor por imuno-histoquímica usando anticorpos anti-INDICADOR (Sigma). Seções foram contra-coradas com hematoxilina de Meyer (Sigma). Angiogênese de tumor foi analisada por imuno-histoquímicausando anticorpos anti-fator de Von Willebrand (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Seções foram contra-coradas como acima. Densidade de vaso foi avaliada por microscopia. Pelo menos 12 campos por animal foram analisados. Todos os procedimentos em animal fora aprovados pela Comissão de Ética da Universidade de Turin, Itália, e pelo Ministério da Saúde Italiano.
Análise estatística
Significância estatística foi determinada usando um Teste-t de Student homoscedástico bivariado (arranjo 1, grupo dê controle; arranjo 2, grupo experimental). Para todos os dados analisados, foi assumido um limite de significância de p < 0,05. Em todas as figuras, valores são expressados como média ± desvio padrão, e significância estatística está indicada por um asterisco único (p <0,05) ou asterisco duplo (p < 0,01).
RESULTADOS
Engenharia de domínios funcionais HGF/Met
Uma representação dos domínios funcionais contidos em Mete HGF é mostrada em Figura IA. A porção extracelular de Met inclui um domínio Sema, uma dobradiça PSI, e quatro módulos IPT (painel esquerdo). HGF é composto de uma cadeia-a e uma cadeia-P unidas por uma ponte de dissulfeto na proteína madura. A cadeia-a por sua vez compreende um domínio N-terminal e quatro kringles (painel direito). Para analisar as interações entre Met e HGF, os inventores expressaram todos estes domínios funcionais como proteínas individuais, solúveis. Domínios funcionais foram engenhados para conter o peptídeo de sinal da proteína parental em sua terminação-N, de modo que pudessem ser apropriadamente secretados. Na terminação-C, um epitopo exógeno (INDICADOR ou MYC) para reconhecimento de anticorpo e uma etiqueta poli-histidina para purificação de proteína foram adicionados. Todos os cDNAs codificadores de fatores engenhados foram subclonados no vetor lentiviral pRRLsin.PPT.CMV.Wpre, e partículas lentivirais recombinantes foram produzidas como descrito em Materiais e Métodos. Proteínas recombinantes foram colhidas do meio condicionado de células de melanoma de humano MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral e purificadas para homogeneidade por cromatografia de afinidade. Proteínas purificadas foram quantificadas contra padrões por SDS-PAGE (Figura 1B).
Análise por ELISA de interações de Met-HGF
A capacidade de ectodomínios de Met para interagirem com HGF foi testada em ensaios de ligação por ELISA. Receptores solúveis (Met chamariz, Sema-PSI, Sema, PSI-IPT, IPT) foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de HGF ativo. Ligação foi revelada usando anticorpos anti-HGF biotinilados. Ligação não-específica em HGF foi determinada usando albumina de soro bovino(BSA) em fase sólida em vez de domínios solúveis de Met. Afinidade de ligação foi determinada por análise de regressão não-linear como descrito em Materiais e Métodos. Nestas condições, Met chamariz ligou em HGF com uma KD de aproximadamente0,2-0,3 nM. Consistente com medições prévias, Sema-PSI e Sema ligaram-se em HGF com uma afinidade de pelo menos um log mais baixa comparado com Met chamariz. Surpreendentemente, ambos PSI-IPT e IPT ligaram-se muito eficientemente em HGF, com quase a mesma afinidade que a de Met chamariz (Figura 2A). A presença ou ausência do domínio PSI não afetou a afinidade de ligação por HGF quer de Sema quer de IPT. Visto que quase todos os domínios Sema encontrados até agora na natureza têm um módulo PSI em sua terminação-C, os inventores portanto continuaram os ensaios de ligação usando Met chamariz, Sema-PSI, e IPT.
Para determinar a afinidade de cada módulo Met por pro-HGF, HGF-a, HGF NK1 e HGF-0 e para compará-la com aquela por HGF ativo, receptores engenhados foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de ligantes MYC-etiquetados. Ligação foi revelada usando anticorpos anti-MYC. Ligação não-específica foi determinada usando a proteína contendo- kringle angiostatina (AS) -também etiquetada com um epitopo MYC - em fase líquida. Pro-HGF, cadeia-a de HGF e HGF NK1, que representa o módulo de ligação-Met mínimo de cadeia-a de HGF, ligaram em Met chamariz com uma afinidade reduzida em 3-, 4- e 10-vezes comparado com HGF ativo, respectivamente (Figura 2B). Ligação de HGF-P em Met chamariz (ou em qualquer outro domínio Met) foi muito baixa para ser detectada neste tipo de ensaio. Sema-PSI ligou com uma afinidade significativa em apenas HGF ativo, enquanto que ligação em pro-HGF, HGF-a ou HGF NK1 foi indistinta da ligação não-específica (Figura 2C). Em contraste, IPT ligou em HGF ativo, pro-HGF e HGF-a com a mesma afinidade alta (Figura 2D). HGF NK1 ligou em IPT 10 vezes menos firmemente do que em HGF ativo, i.e. com a mesma afinidade que ligou em Met chamariz. Estes dados sugerem que a região IPT de Met liga-se na cadeia-a de HGF com afinidade alta independentemente de processamento proteolítico doligante.
A cadeia-a de HGF liga-se em domínios IPT 3 e 4 com afinidade alta
A região IPT de Met se estende por cerca de 400 aminoácido e contém quatro domínios IPT. Para mapear mais finamente a interface de IPT-HGF, foi engenhada uma série de variantes de IPT que foram deletadas em um ou mais domínios (Figura 3A). IPT Al e IPT A1-2 são duas formas N-terminal deletadas de IPT faltante do primeiro ou dos primeiros dois domínios imunoglobulina-semelhantes, respectivamente. IPT-3 e IPT-4 corresponde, aos dois domínios imunoglobulina-semelhantes C-terminais expressados como proteínas individuais. Produção e purificação de proteína foram realizadas como descrito acima. A capacidade dos IPTs engenhados para interagirem com a cadeia-a de HGF foi investigada em ensaios de ligação por ELISA usando a região inteira de IPT como um controle. IPT, IPT Al, IPT A1-2, IPT-3 e IPT-4 foram imobilizados em fase sólida e expostos às concentrações crescentes de HGF-a. Ligação foi revelada usando anticorpos anti-HGF. Ligação não-específica foi medida usando BSA como acima. Como mostrado em Figura 3B, deleção dos primeiros dois domínios imunoglobulina-semelhantes não afetou substancialmente a ligação em HGF.
De fato, IPT A1-2, uma proteína correspondendo aos últimos dois domínios imunoglobulina-semelhantes de Met, ligou na cadeia-a de HGF com força igual se não maior do que IPT. Contudo, outra deleção quer do terceiro quer do quarto domínio imunoglobulina-semelhante quase completamente prejudicou a ligação em HGF-a. Resultados similares foram obtidos usando HGF ativo ou pro-HGF em vez de HGF-a. Estes dados sugerem que os últimos dois domínios imunoglobulina-semelhantes de Met, que jazem próximos da hélice de transmembrana no contexto de um Met autêntico, são suficientes para ligação da cadeia-a de HGF com afinidade alta. Domínios IPT 3 e 4 são suficientes para ligação em HGF em células vivas.
Para determinar se HGF poderia ligar em IPT 3 e 4 nocontexto de um receptor ancorado em membrana, uma proteína Met trazendo uma deleção grande na região extracelular foi engenhada. Aminoácidos 25-741, correspondendo ao domínio Sema (aa 25-515), ao domínio PSI (aa 516-562) e aos primeiros dois domínios IPT (IPT 1 e 2, aa 563-741) foram deletados, gerando um receptor recombinante contendo domínios IPT 3 e 4, a hélice de transmembrana e a região citoplásmica inteira (Figura 4A). O cDNA codificador de receptor engenhado MetA25-741 foi subclonado no mesmo vetor lentiviral descrito acima. Partículas lentivirais recombinantes foram usadas para transduzir a linhagem de célula de carcinoma de ovário de humano TOV-10 112D, que é faltante de expressão de Met endógeno como determinado por análise por RT-PCR (Michieli, P., et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73). Análise de biotinilação de superfície revelou que MetA25-741 foi apropriadamente expressado e exposto à membrana de células TOV-112D (Figura 4B).
Para examinar se MetA25-741 poderia ligar em HGF, células transduzidas com vetor lentiviral foram incubadas na presença ou ausência de HGF recombinante e subseqüentemente tratadas com agente de ligação cruzada BS3. Lisados de célula foram imunoprecipitados com um anticorpo produzido contra a porção C-terminal de Met, resolvidos por SDS PAGE e analisados por Western blotting usando anticorpos biotiniladps anti-HGF. Como um controle, a mesma análise foi realizada em células TOV-112D de tipo selvagem. Immunoblots mostraram uma banda distinta com um peso molecular de aproximadamente 180 kD na pista correspondendo às células expressando MetA25_741 tratadas com HGF mas não nas pistas correspondendo às mesmas células sem HGF ou às células TOV-112D de tipo selvagem, quer na presença quer na ausência do ligante (Figura 4C). Considerando que ambos MetA25-741 e HGF têm um peso molecular de aproximadamente 90 kDa, a proteína cruzadamente ligada imunoprecipitada é compatível com um complexo formado por HGF mais MetA25-74.Ligação de HGF em domínios IPT 3 e 4 resulta em ativação de Met em células vivas.
O inventores a seguir testaram se ligação de HGF em MetA25. 741 poderia induzir ativação de Met cinase. Para este fim, células TOV-112D transduzidas com vetor lentiviral foram estimuladas com pro-HGF ou HGF ativo, e Usados de célula foram imunoprecipitados com anticorpos anti-Met como acima. Ativação de receptor foi determinada por análise Western blot usando anticorpos anti-fosfotirosina. Os mesmos blots foram re-sondados com anticorpos anti-Met para normalizar a quantidade de receptor imunoprecipitado. Notavelmente, ambos pro-HGF e HGF ativo foram capazes de induzir fosforilação robusta de MetA25-741 (Figura 4D). Visto que ligação de pro-HGF em Met de tamanho total não induz ativação de cinase, isto sugere que o domínio Sema exerce de algum modo um efeito auto-inibitório sobre atividade catalítica de Met que é liberada sob ligação em HGF ativo. Estimulação de receptor também foi realizada usando HGF NK1 e um ligante dimérico engenhado consistindo de dois fragmentos NK1 repetidos em tandem (NK1-NK1; Figura 4E). Como mostrado em Figura 4D, estimulação NK1-NK1 de células TOV-112D transduzidas com vetor resultou em fosforilação potente de MetA25-741, enquanto que estimulação com NK1 monomérico não teve efeito. Estes resultados sugerem que os dois domínios IPT C-terminais de Met (IPT 3 e 4) são suficientes para ligar em HGF (e mais precisamente em HGF NK1 que representa o módulo de ligação-Met mínimo na cadeia-a de HGF) e para transmitir o sinal para ativação de receptor no domínio de cinase citoplásmica, presumivelmente após dimerização de receptor induzida por ligante. Contudo, também sugerem que IPT 3 e 4 apenas não são suficientes para distinguir a forma biologicamente ativa de HGF de seu precursor inativo, pro-HGF.
IPT solúvel inibe crescimento invasivo induzido por HGF in vitro.
Em um estudo prévio, tem sido demonstrado que a porçãoextracelular de Met expressada como uma proteína solúvel (Met chamariz) inibe crescimento invasivo induzido por HGF tanto in vitro quando em modelos de câncer em camundongo (Michieli P. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73). Também foi mostrado que Sema-PSI solúvel recombinante inibe fosforilação de Met tanto dependente de ligante quanto independente de ligante (Kong-Beltran M. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 75-84). Baseado nestes resultados, tem sido testado se IPT solúvel exibiu atividade antagonística de HGF/Met em células vivas. Células de melanoma MDA-MB-435 de humano, que expressam Met e são um sistema modelo estabelecido para análise de crescimento invasivo mediado por HGF, foram transduzidas com vetores lentivirais codificadores de Met chamariz, Sema-PSI ou IPT solúvel. Células transduzidas com um vetor vazio foram usadas como controle. Células transduzidas com vetor lentiviral secretando níveis comparáveis de fatores solúveis (aproximadamente 50 pmol/106 células/24 horas) foram privadas de soro por vários dias, permitindo o acúmulo de fatores recombinantes no meio, e então estimuladas com HGF recombinante. Fosforilação de tirosina de Met foi determinada por immunoblotting com anticorpos anti-fosfotirosina como descrito acima. Como mostrado em Figura 5A, ambos IPT e Sema-PSI parcialmente inibiram fosforilação de Met induzida por HGF, enquanto que Met chamariz completamente neutralizou a capacidade de HGF para induzir ativação de Met. Re-sondagem dos mesmos immunoblots com anticorpos direcionados contra a cauda C-terminal de Met revelou nenhuma diferença substancial nas quantidades de proteína imunoprecipitada.
Para testar o potencial inibitório de ectodomínios de Met em um ambiente mais biológico, as mesmas células foram utilizadas para realizar um ensaio de morfogênese de ramificação dependente de HGF. Esferóides celulares pré-formados foram semeados em uma matriz de colágeno tridimensional e então estimulados com HGF recombinante para formarestruturas tubulares. Ramificação foi quantificada pela contagem do número médio de túbulos brotando de cada colônia. Como mostrado em Figura 5B, ambos IPT e Sema-PSI solúveis inibiram ramificação de colônia induzida por HGF (Vetor vazio, 17,5 túbulos/colônia; IPT, 4,0 túbulos/colônia; Sema-PSI, 6,7 túbulos/colônia). Contudo, consistente com os resultados obtidos em experimentos de fosforilação, Met chamariz foi um inibidor-HGF muito mais potente do que qualquer um de seus subdomínios (2,5 túbulos/colônia). Imagens representativas de morfologia de colônia são mostradas em Figura 5C.
IPT solúvel exibe atividade anti-tumor e anti-metastática em camundongos.
Os resultados acima inspiraram os presentes inventores para explorarem o potencial terapêutico de IPT solúvel em modelos de câncer em camundongo. Células de melanoma MDA-MB-435 transduzidas com vetor lentiviral foram injetadas subcutaneamente em camundongos CD-1 nu-/-, e crescimento de tumor foi monitorado no decorrer do tempo. Após aproximadamente três semanas, tumores foram extraídos para análise, e camundongos foram submetidos a autópsia. Em uma análise Kaplan-Meier-semelhante, onde a percentagem de animais livres de tumor é plotada contra tempo e latência de tumor é quantificada calculando a mediada em dias, todos os receptores solúveis engenhados solúveis atrasaram o aparecimento de tumores experimentais. Contudo, IPT foi ligeiramente mais efetivo do que Sema-PSI e Met chamariz foi mais potente do que quer IPT quer Sema-PSI (Figura 6A). Análise de carga de tumor no decorrer do tempo revelou que IPT foi apenas ligeiramente menos eficaz do que Met chamariz, enquanto que Sema-PSI inibiu crescimento neoplástico apenas durante os estágios muito iniciais experimento (Figura 6B). Análise imuno-histoquímica de expressão transgênica mostrou que Met chamariz, Sema-PSI e IPT alcançaram distribuição e níveis similares em tumores (Figura 6C).
Como HGF é um fator pró-angiogênico potente, tem sidodeterminado se inibição de HGF/Met em tumores resultou em dano deangiogênese. Seções de tumor foram analisadas por imuno-histoquímicausando anticorpos contra fator de Von Willebrand, e densidade de vaso foiavaliada por microscopia (Figura 6D). IPT diminuiu densidade de vaso detumor em 1,5 vezes, enquanto que Met chamariz alcançou uma inibição muitomais forte (aproximadamente 4 vezes); Sema-PSI não afetousignificativamente angiogênese de tumor. Sob autópsia, pulmões decamundongos descritos acima foram extraídos e processados para histologia.Seções seriais de pulmão foram coradas com hematoxilina e eosina, eanalisadas por microscopia para determinar a presença de micrometástases.Os resultados são mostrados em Figura 6A. No grupo de controle, 4 de 6camundongos (67%) estavam apresentando micrometástases. No grupo IPT eSema-PSI, micrometástases podiam ser encontradas em apenas 1 de 6camundongos (17%), enquanto que nenhuma metástase pôde ser encontradano grupo Met chamariz. Lesões metastática foram tanto parenquimais(extravasculares) quanto embólicas (intravasculares; veja Figura 6F paraimagens representativas).
A identificação de sítio de ligação de HGF de afinidade alta noHGFR proporcionada pela presente descoberta permite planejamento deprocedimentos novos levando à geração de antagonistas/inibidores maisespecíficos de HGF e de HGFR. Os seguintes são exemplos não-limitantes demétodos novos para a identificação de inibidores/antagonistas de HGF/HGFRselecionando o sítio de ligação de afinidade alta de HGFR ou utilizando osítio de ligação de afinidade alta de HGFR como uma ferramenta para gerarnovos inibidores/antagonistas.
Desenvolvimento de um anticorpo monoclonal que se liga em domíniosextracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR prevenindo ligação de HGF
Dado que interação de HGF com os domínios extracelularesIPT-3 e IPT-4 é essencial para ligação de HGF de afinidade alta, pode-segerar anticorpos monoclonais específicos que se ligam em IPT-3 e IPT-4 ecompetem com HGF pela ligação de HGFR. Isto pode ser alcançado porvárias estratégias.
(A) Uma proteína recombinante ou um peptídeo recombinantederivada(o) de IPT-3 e IPT-4 é gerada(o) por síntese química ou tecnologia deengenharia genética padrão. Esta proteína ou este peptídeo é injetada(o) emum animal de laboratório apropriado (normalmente um camundongo o umrato) para causar uma reação imune. Esplenócitos são então isolados doanimal imunizado e fusionado em uma linhagem de célula de mieloma, eclones de hibridoma produtores de anticorpo são selecionados por tecnologiade anticorpo monoclonal padrão. Anticorpos direcionados contra IPT-3 e IPT-4 são então selecionados por um método de ELISA similar àquele descritonesta descoberta que utiliza IPT-3 e IPT-4 recombinante em fase sólida eanticorpos produzidos por hibridoma em fase líquida. Ligação é reveladausando anticorpos imunoglobulina anti-camundongo que estão disponíveiscomercialmente. Alternativamente, anticorpos são selecionados por suacapacidade para exibir HGF recombinante (em fase líquida) de IPT-3 e IPT-4(em fase sólida), ou para sua capacidade de imunoprecipitar proteínasrecombinantes IPT-3 e IPT-4.
(B) Uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de IPT-3 eIPT-4 inserida em um vetor de expressão apropriado é injetado diretamenteem um animal de laboratório para causar uma resposta imune contra oproduto de gene. Anticorpos direcionados contra IPT-3 e IPT-4 são entãoisolados e selecionados como descrito acima.
(C) Uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de IPT-3 eIPT-4 inserida em um vetor de expressão apropriado é transferido para dentrode uma linhagem de célula de mamífero não expressando HGFR para obterexpressão de IPT-3 e IPT-4 sobre a superfície de célula. Células expressandoIPT-3 e IPT-4 são então injetadas em um animal de laboratório para causaruma resposta imune, e anticorpos direcionados contra IPT-3 e IPT-4 sãoisolados e selecionados como descrito acima.
(D) Uma biblioteca de anticorpos nativos gerados por técnicasde engenharia genética padrão (por exemplo pela tecnologia conhecida comoexibição de fago) de linfócitos de mamífero (preferivelmente humano, porexemplo de linfócitos infiltrando um tumor expressando HGFR) é selecionadausando proteínas recombinantes IPT-3 e IPT-4. Clones positivos (i.e. aquelesclones que se ligam em IPT-3 e IPT-4 com afinidade alta) são então isolados,expandidos, e o anticorpo é bioquimicamente caracterizado.
(E) Células B de memória de humano são isoladas do sangueperiférico de um paciente hospedando um tumor expressando HGFR comomostrado por vários estudos incluindo Traggiai E. et al. (2004) Nat Med.10(8), 871-875. Uma vez estabelecidas culturas de células B de memóriaimortalizadas, um técnico experiente no campo pode selecionar célulassecretando um anticorpo direcionado contra IPT-3 e IPT-4 usando os métodosdescritos aqui acima em (A). Tendo identificado células produtoras deanticorpo, o anticorpo desejado pode ser clonado por reação em cadeia dapolimerase e procedimentos de engenharia genética padrão.Identificação de um composto de teste que se liga em domínios extracelularesIPT-3 e IPT-4 de HGFR inibindo atividade de HGFR
Com uma abordagem diferente, é possível isolar compostos deteste de origem diversa que se ligam no sítio de ligação de HGFR de afinidadealta de HGFR e interferem com ativação de HGFR induzida por HGF. Istopode ser realizado por várias estratégias.
(A) Usando ensaios ELISA similares àqueles descritos nestadescoberta, um técnico experiente no campo pode selecionar uma bibliotecade compostos (incluindo mas não limitada a uma biblioteca química sintética,uma biblioteca de compostos naturais, uma biblioteca de moléculas pequenas,uma biblioteca de peptídeos) para agentes que exibem interação de HGF comIPT-3 e IPT-4. Neste tipo de ensaios, proteína recombinante IPT-3 e IPT-4 éimobilizada em fase sólida e incubada com uma quantidade fixa de HGF emfase líquida. Após exposição aos compostos de biblioteca, ligação de HGF émedida com anticorpos anti-HGF comercialmente disponíveis.
(B) Usando uma linhagem celular expressando uma formaengenhada do HGFR contendo apenas os domínios e IPT-3 e IPT-4 naparte extracelular similar àquela descrita nesta descoberta (MetA25-74i), unitécnico experiente no campo pode selecionar um a biblioteca decompostos (incluindo mas não limitada a uma biblioteca químicasintética, uma biblioteca de moléculas pequenas, uma biblioteca depeptídeos) para agentes que exibem interação de HGF com IPT-3 e IPT-4ou inibem ativação de HGFR induzida por HGF. Isto pode ser realizadoao se por as células engenhadas em contato com a biblioteca e entãomedindo a fosforilação de HGFR induzida por HGF como descrito nopresente estudo, ou por outro meio que revela ativação de HGFRincluindo um ensaio de espelhamento, um ensaio de invasão de matrizreconstituída, um ensaio de morfogênese de ramificação, um ensaio desobrevivência celular ou outros testes biológicos in vitro como descritoem Michieli, P. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73.
(C) Usando a linhagem de célula engenhada descrita acima,um técnico experiente no campo pode selecionar uma biblioteca genética(incluindo mas não limitada a uma biblioteca de expressão de cDNA, umabiblioteca de RNA grampo de cabelo curto, uma biblioteca de RNA de anti-senso, uma biblioteca de nucleotídeos aleatórios) para polinucleotídeos ouprodutos de gene que exibem interação de HGF com IPT-3 e IPT-4 ou inibemativação de HGFR induzida por HGFR. Isto pode ser realizado portransfecção, transdução ou de qualquer maneira introdução da biblioteca denucleotídeos em ditas células e então teste da capacidade de HGF para ativara forma deletada de HGFR expressado pelas mesmas células. Ativação deHGFR é medida como descrito em (B).
Ensaios funcionais exemplares que medem a atividade biológica decompostos que se ligam em domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFRQualquer que seja a estratégia utilizada para gerar anticorposanti-IPT ou compostos ligantes de IPT, o produto final {i.e. anticorposmonoclonais direcionados contra IPT-3 e IPT-4 ou compostos naturais ousintéticos que se ligam em IPT-3 e IPT-4) é então submetido aos ensaiosbiológicos almejados para determinar se estes agentes têm a capacidade parainterferirem com a atividade de HGFR. Estes ensaios podem ser realizados invitro usando células de mamífero cultivadas ou in vivo usando animais delaboratório.
(A) Ensaio de espalhamento. Células epiteliais crescendo emcolônias compactas em uma placa de Petri e expressando HGFR sãoinduzidas para 'espalhar' por estimulação com HGF. Como um resultado deestimulação com HGF, células na placa de Petri parecem mais separadas edispersadas. Este ensaio pode ser realizado na presença de vários compostosde teste. Dentre os compostos testados, um inibidor/antagonista deHGF/HGFR pode ser identificado pela ausência de um fenótipo espalhado emresposta à estimulação com HGF.
(B) Ensaio de migração de célula. Células expressando HGFRtêm a capacidade para migrarem na direção de um gradiente de HGF. Emoutras palavras, células atraídas por quimiotaxia na direção de concentraçõesmais altas de HGF. Esta capacidade pode ser explorada para selecionarinibidores de HGF em um ensaio em câmara de Boyden. Células sãosemeadas na primeira câmara e HGF é aplicado na segunda câmara que estáseparada da primeira por uma membrana porosa. Células migram através damembrana e alcançam a segunda câmara onde HGF está mais concentrado.Agentes que inibem este processo são identificados comoinibidores/antagonistas de HGF/HGFR.(C) Ensaio de invasão de matriz reconstituída ou ensaio demigração Transwell™. Este é uma variação do ensaio descrito em (B) no quala membrana porosa está coberta com uma camada de colágeno, Matrigel™,ou outras matrizes orgânicas reconstituída. Células têm que digerir a matrizorgânica com o propósito de migrarem através dela. Este é um ensaio maisrigoroso que mede invasão do que simples migração de células.
(D) Ensaio de invasão de colágeno ou ensaio de morfogênesede ramificação. Neste caso, células de mamífero expressando HGFR(preferivelmente células epiteliais ou células de carcinoma) são semeadas emuma camada tridimensional de colágeno e então permitidas crescerem até queformem esferóides de aproximadamente 1.000 células cada. Alternativamente,esferóides podem ser pré-formados antes por incubação das células durante anoite em placas de 96 cavidades não-aderentes na presença de metil-celulosecomo mostrado em Michieli, P. et al. (2004) Câncer Cell 6(1), 61-73. Umavez estando embebidos os esferóides na camada de colágeno, eles sãoestimulados com HGF e incubados a 37°C. Isto resulta no brotamento detúbulos ocos a partir dos esferóides; cada túbulo é formado por várias célulasorganizadas em uma estrutura tubular e polarizado de tal modo que haja umlado da célula que vê o lúmen e um segundo lado que vê o lado externo domeio. A medida que o ensaio prossegue os túbulos tendem a se ramificar e aformar uma arquitetura mais complexa. Este ensaio é elevadamente específicopara HGF. Agentes que inibem este processo têm uma probabilidade alta pararepresentarem antagonistas de HGF/HGFR muito específicos.
(E) Ensaio mitogênico. HGF tem a capacidade para induzirreplicação de DNA e divisão celular em alguma célula expressando HGFR.
As células mais responsivas são certamente hepatócitos primários,normalmente de camundongo ou rato. Para testar replicação de DNA induzidacom HGF, células são privadas de fatores de crescimento de soro e entãoestimuladas com concentrações crescentes de HGF. Imediatamente depois,timidina radioativa é adicionada e as células são incubadas a 37°C poraproximadamente um dia. Após lavagem e fixação extensivas, timidinaradioativa incorporada no DNA de célula é medida por contagem decintilação líquida ou métodos padrão que permitem quantificação de radiação.
(F) Ensaio de sobrevivência. HGF tem a capacidade paraproteger células expressando HGFR contra apoptose ou morte celularprogramada. Isto pode ser explorado para medir a atividade de HGFR em umensaio de sobrevivência. Células são pré-incubadas com HGF e o compostode teste (inibidor de HGFR potencial), e então submetidas a um estímuloapoptótico tal como uma droga tóxica, ausência de aderência, hipoxia, choquetérmico, radiação, ou dano de DNA. Após um intervalo de tempo apropriado,morte celular é medida por métodos padrão incluindo TÚNEL (Marcação deExtremidade de Falha de desóxinucleotidil-transferase biotina-dUTPTerminal), nucleossomos, escada DNA, atividade de caspase, coloração comcorante vital ou qualquer variação dos mesmos.
(G) Ensaio de tumorigênese em camundongo. Neste tipo deensaio, a atividade de um potencial inibidor de HGF/HGFR é testadadiretamente em um animal de laboratório, preferivelmente um camundongoou um rato. Há vários métodos para obter um tumor em um camundongo. Aestratégia mais utilizada é criar um xenoenxerto, i.e. para transplantar célulasde tumor (normalmente de origem humana) em um recipiente animal(normalmente um camundongo imunodeficiente). Células podem serimplantadas subcutaneamente (um método rápido e simples para obter umtumor experimental) ou ortotopicamente, i.e. no mesmo órgão onde a célulade tumor tem sido isolada (e.g. um carcinoma de mama na camada de gorduramamaria, um carcinoma de cólon na mucosa do intestino, umhepatocarcinoma no parênquima de fígado e assim por diante). Seja qual for ométodo empregado, injeção de células de tumor em um animal de laboratóriocausa um tumor experimental. Este animal hospedando tumor pode agora serusado para avaliar o potencial de anti-rumor dos compostos de teste.Composto ou anticorpos anti-HGF/HGFR podem ser liberados em um animaltrazendo uma lesão de tumor com sinalização de HGF/HGFR desreguladapelo método existente mais apropriado incluindo injeção intravenosa, injeçãointraperitoneal, bomba osmótica, administração oral, supositório, protocolo deterapia de gene, administração local e assim por diante. Após um período detratamento apropriado, o animal é morto e seus tumor e órgãos sãoexplantados para análise.
(H) Ensaio de metastogênese em camundongo. Metástasesexperimentais podem ser induzidas em um camundongo por injeção sistêmicade células de tumor. Estas são aprisionadas nos capilares de pulmão esubseqüentamente extravasam para causar metástases pulmonares. Estaspodem ser medidas sob autópsia por várias abordagens incluindo microscopia,análise histológica, métodos imuno-histoquímicos, imagem de corpo inteiro.Os compostos de teste são liberados como descrito em (G).
(I) Protocolo de terapia de gene. No caso de inibidor deHGF/HGFR ser um anticorpo, uma proteína recombinante, um peptídeorecombinante ou um RNA interferente pequeno, liberação para o animapossuindo tumor pode ser realizada por uma abordagem de terapia de gene.
Esta consiste da introdução do polinucleotídeo desejado em um vetor deliberação apropriado que pode ser escolhido dentre vetores lentivirais, vetoresadenovirais, vetores retrovirais, DNA nu, ou qualquer variação dos mesmos.A preparação de vetor pode ser liberada sistêmica ou localmente para o tumordependendo do sítio de tumor. Os efeitos biológicos de terapia de gene sãoanalisados como descrito para outros compostos em (G).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Metheresis Translational Research SA
<120> Sitio de ligação de afinidade alta de HGFR e métodos paraidenditicação de antagonistas do mesmo
<130> BEP10941-CF
<160> 21
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 7425
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> pRRLsin.PPT.CMV.eGPF.Wpre (a seqüência codificadora eGFP inicia emnúcleotideo 4 75 6 e termina em núcleotideo 54 75)
<400> 1
caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 4 80taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 54 0tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 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<210> 2
<211> 2886
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de Decoy Met_FLAGhis
<400> 2
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320tctatateca ccttcattaa aggagacctc accatageta atcttgggac atcagagggt 1380cgcttcatgc aggttgtggt ttetegatea ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680tgtctgcctg caatetacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg 1740ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa 1800actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat 1860acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt 1920tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca 1980agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat 2040tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa 2100agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt 2160gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa 2220gateccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gageacaata 2280acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat 2340gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct etaatteaga gataatctgt 2400tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt 2460ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg 2520tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt 2580aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag 2640agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg 2700ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt 2760ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat tteacageta gctctgacta caaggacgac 2820gatgacaaga gcgattacaa agacgatgat gataagctgc agcatcacca ccatcatcac 2880cattga 2886
<210> 3
<211> 1590
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de Seiua_FLAGhis
<400> 3
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt acaaagacga tgatgataag 1560ctgcagcatc accaccatca tcaccattag 1590
<210> 4
<211> 1779
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de Sema-PSI_FLAGhis
<400> 4
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag 120tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat 180cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag 240gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac 300tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta 360gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc 420tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc 480atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg 540ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc 600ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag 660gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag 720ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac 780ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg 840ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc 900acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg 960tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac 1020attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct 1080gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa 1140aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg 1200acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt 1260accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca 1320tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt 1380cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc 1440ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc 1500tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc 1560agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg 1620tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc 1680tgtctgggag ctagctctga ctacaaggac gacgatgaca agagcgatta caaagacgat 1740gatgataagc tgcagcatca ccaccatcat caccattga 1779
<210> 5
<211> 1458
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de PSI-IPT_FLAGhis
<400> 5
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg ggtacacact ggttatcact gggaagaaga tcacgaagat cccattgaat 120ggcttgggct gcagacattt ccagtcctgc agtcaatgcc tctctgcccc accctttgtt 180cagtgtggct ggtgccacga caaatgtgtg cgatcggagg aatgcctgag cgggacatgg 240actcaacaga tctgtctgcc tgcaatctac aaggttttcc caaatagtgc accccttgaa 300ggagggacaa ggctgaccat atgtggctgg gactttggat ttcggaggaa taataaattt 360gatttaaaga aaactagagt tctccttgga aatgagagct gcaccttgac tttaagtgag 420agcacgatga atacattgaa atgcacagtt ggtcctgcca tgaataagca tttcaatatg 480tccataatta tttcaaatgg ccacgggaca acacaataca gtacattctc ctatgtggat 540cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact 600ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca 660tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt 720tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt gacttagcca accgagagac aagcatcttc 780agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt 840gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc 900ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca 960gagataatct gttgtaccac tccttccctg caacagctga atctgcaact ccccctgaaa 1020accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc ctttccaaat actttgatct catttatgta 1080cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat 1140gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa 1200gttggaaata agagctgtga gaatatacac ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc 1260
cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag ctaaatatag agtggaagca agcaatttct 1320
tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa ccagatcaga atttcacagc tagctctgac 1380
tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac aaagacgatg atgataagct gcagcatcac 1440
caccatcatc accattag 1458
<210> 6
<211> 1290
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de IPT_FLAGhis
<400> 6
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatcc cctgcaatct acaaggtttt cccaaatagt 120gcaccccttg aaggagggac aaggctgacc'atatgtggct gggactttgg atttcggagg 180aataataaat ttgatttaaa gaaaactaga gttctccttg gaaatgagag ctgcaccttg 240actttaagtg agagcacgat gaatacattg aaatgcacag ttggtcctgc catgaataag 300catttcaata tgtccataat tatttcaaat ggccacggga caacacaata cagtacattc 360tcctatgtgg atcctgtaat aacaagtatt tcgccgaaat acggtcctat ggctggtggc 420actttactta ctttaactgg aaattaccta aacagtggga attctagaca catttcaatt 480ggtggaaaaa catgtacttt aaaaagtgtg tcaaacagta ttcttgaatg ttatacccca 540gcccaaacca tttcaactga gtttgctgtt aaattgaaaa ttgacttagc caaccgagag 600acaagcatct tcagttaccg tgaagatccc attgtctatg aaattcatcc aaccaaatct 660tttattagtg gtgggagcac aataacaggt gttgggaaaa acctgaattc agttagtgtc 720ccgagaatgg tcataaatgt gcatgaagca ggaaggaact ttacagtggc atgtcaacat 780cgctctaatt cagagataat ctgttgtacc actccttccc tgcaacagct gaatctgcaa 840ctccccctga aaaccaaagc ctttttcatg ttagatggga tcctttccaa atactttgat 900ctcatttatg tacataatcc tgtgtttaag ccttttgaaa agccagtgat gatctcaatg 960ggcaatgaaa atgtactgga aattaaggga aatgatattg accctgaagc agttaaaggt 1020gaagtgttaa aagttggaaa taagagctgt gagaatatac acttacattc tgaagccgtt 1080ttatgcacgg tccccaatga cctgctgaaa ttgaacagcg agctaaatat agagtggaag 1140caagcaattt cttcaaccgt ccttggaaaa gtaatagttc aaccagatca gaatttcaca 1200gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt acaaagacga tgatgataag 1260ctgcagcatc accaccatca tcaccattga 1290
<210> 7
<211> 1008
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de IPTdeltal_FLAGhis
<400> 7
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac 120ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat 180tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt 240cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt 300gacttagcca accgagagac aagcatcttc agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa 360attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac 420ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt 480acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca gagataatct gttgtaccac tccttccctg 540caacagctga atctgcaact ccccctgaaa accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc 600ctttccaaat actttgatct catttatgta cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag 660ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac 720cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa gttggaaata agagctgtga gaatatacac 780ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag 840ctaaatatag agtggaagca agcaatttct tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa 900ccagatcaga atttcacagc tagctctgac tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac 960aaagacgatg atgataagct gcagcatcac caccatcatc accattga 1008
<210> 8
<211> 753
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de IPTdeltal-2_FLAGhis
<400> 8
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt 180gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt 360gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca 420atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa 480ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc 540gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg 600aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc 660acagctagct ctgactacaa ggacgacgat gacaagagcg attacaaaga cgatgatgat 720aagctgcagc atcaccacca tcatcaccat tga 753
<210> 9
<211> 471
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de IPT3 FLAGhis<400> 9
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt 180gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt 360gatctcattt atgtacataa tgctagctct gactacaagg acgacgatga caagagcgat 420tacaaagacg atgatgataa gctgcagcat caccaccatc atcaccattg a 471
<210> 10
<211> 462
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de IPT4_FLAGhis
<400> 10
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cctgtgttta agccttttga aaagccagtg 120atgatctcaa tgggcaatga aaatgtactg gaaattaagg gaaatgatat tgaccctgaa 180gcagttaaag gtgaagtgtt aaaagttgga aataagagct gtgagaatat acacttacat 240tctgaagccg ttttatgcac ggtccccaat gacctgctga aattgaacag cgagctaaat 300atagagtgga agcaagcaat ttcttcaacc gtccttggaa aagtaatagt tcaaccagat 360cagaatttca cagctagctc tgactacaag gacgacgatg acaagagcga ttacaaagac 420gatgatgata agctgcagca tcaccaccat catcaccatt ga 462
<210> 11
<211> 2040
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de Met delta 25-741
<400> 11
atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag 60aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa 120tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt 180gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa 240catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg 300caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt 360gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca 420atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa 480ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc 540gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg 600aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc 660acaggattga ttgctggtgt tgtctcaata tcaacagcac tgttattact acttgggttt 720ttcctgtggc tgaaaaagag aaagcaaatt aaagatctgg gcagtgaatt agttcgctac 780gatgcaagag tacacactcc tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca 840actacagaaa tggtttcaaa tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagatcag 900tttcctaatt catctcagaa cggttcatgc cgacaagtgc agtatcctct gacagacatg 960tcccccatcc taactagtgg ggactctgat atatccagtc cattactgca aaatactgtc 1020cacattgacc tcagtgctct aaatccagag ctggtccagg cagtgcagca tgtagtgatt 1080gggcccagta gcctgattgt gcatttcaat gaagtcatag gaagagggca ttttggttgt 1140gtatatcatg ggactttgtt ggacaatgat ggcaagaaaa ttcactgtgc tgtgaaatcc 1200ttgaacagaa tcactgacat aggagaagtt tcccaatttc tgaccgaggg aatcatcatg 1260aaagatttta gtcatcccaa tgtcctctcg ctcctgggaa tctgcctgcg aagtgaaggg 1320tctccgctgg tggtcctacc atacatgaaa catggagatc ttcgaaattt cattcgaaat 1380gagactcata atccaactgt aaaagatctt attggctttg gtcttcaagt agccaaaggc 1440atgaaatatc ttgcaagcaa aaagtttgtc cacagagact tggctgcaag aaactgtatg 1500ctggatgaaa aattcacagt caaggttgct gattttggtc ttgccagaga catgtatgat 1560aaagaatact atagtgtaca caacaaaaca ggtgcaaagc tgccagtgaa gtggatggct 1620ttggaaagtc tgcaaactca aaagtttacc accaagtcag atgtgtggtc ctttggcgtg 1680ctcctctggg agctgatgac aagaggagcc ccaccttatc ctgatgtaaa cacctttgat 1740ataactgttt acttgttgca agggagaaga ctcctacaac ccgaatactg cccagacccc 1800ttatatgaag taatgctaaa atgctggcac cctaaagccg aaatgcgccc atccttttct 1860gaactggtgt cccggatatc agcaatcttc tctactttca ttggggagca ctatgtccat 1920gtgaacgcta cttatgtgaa cgtaaaatgt gtcgctccat atccttctct gttgtcatca 1980gaagataacg ctgatgatga ggtggacaca cgaccagcct ccttctggga gacatcatag 2040
<210> 12
<211> 2259
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de HGF_MYChis
<400> 12
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca 1500acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160ttaacatata aggtaccaca gtcagctagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 2220aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac catcattga 2259
<210> 13
<211> 1494
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de HGF-alfa_MYChis
<400> 13
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320cgaaatccag atgatgacgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgataccg ctagcgaaca aaaactcatc 1440tcagaagagg atctgaatgg agggctcgag catcaccacc atcaccatca ttga 1494
<210> 14
<211> 705
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de HGF NKl__MYChis
<400> 14
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa gctagcgaac aaaaactcat ctcagaagag 660gatctgaatg gagggctcga gcatcaccac catcaccatc attga 705
<210> 15
<211> 903
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de HGF-beta__MYChis
<400> 15atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcgttg taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga 180tacagaaata aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca 240cgacagtgtt tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat 300gtccacggaa gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat 360ggccctgaag gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat 420tttgttagta cgattgattt acctaattat ggagccacaa ttcctgaaaa gaccagttgc 480agtgtttatg gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca 540catctctata taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg 600aatgagtctg aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat 660tatggtggcc cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt 720cctggtcgtg gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat 780gcaaaatgga tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcagc tagcgaacaa 840aaactcatct cagaagagga tctgaatgga gggctcgagc atcaccacca tcaccatcat 900tga 903
<210> 16
<211> 2259
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora de HGF_MYChis não clivável
<400> 16
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga 660ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca 720caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc 780cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg 840gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg 900gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt 960tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact 1020cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct 1080gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt 1140ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg 1200ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa 1260gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc 1320cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct 1380tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta 1440gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaactgc aggttgtaaa tgggattcca 1500acacgaacaa acataggatg gatggttagt' ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga 1560ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac 1620ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa 1680tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt 1740ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct 1800aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact 1860ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag 1920aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg 1980gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag 2040caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca 2100aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt 2160ttaacatata aggtaccaca gtcagctagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 2220aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac catcattga 2259<210> 17<211> 1197<212> DNA<213> artificial<220><223> Seqüência codificadora de NKl-NKl_his<400> 17
atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc 60ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat 120gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa 180accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt 240ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc 300ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa 360aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta 420tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac 480agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct 540cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc 600tgtgacattc ctcagtgttc- agaagttgaa gctagcgaat tcaaaaaatc agcaaagact 660accctaatca aaatagatcc agcactgaag ataaaaacca aaaaagtgaa tactgcagac 720caatgtgcta atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt 780tttgataaag caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg 840aaaaaagaat ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc 900atcattggta aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa 960tgtcagccct ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg 1020
ggtaaagacc tacaggaaaa ctactgtcga aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg 1080
tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa 1140
gttgaagcta gtgggggtgg tagtggagga gggcatcacc atcatcacca tcactga 1197
<210> 18
<211> 1218
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> Seqüência codificadora cie hAS_MYC
<400> 18
atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagtg 60tatctctcag agtgcaagac tgggaatgga aagaactaca gagggacgat gtccaaaaca 120aaaaatggca tcacctgtca aaaatggagt tccacttctc cccacagacc tagattctca 180cctgctacac acccctcaga gggactggag gagaactact gcaggaatcc agacaacgat 240ccgcaggggc cctggtgcta tactactgat ccagaaaaga gatatgacta ctgcgacatt 300cttgagtgtg aagaggaatg tatgcattgc agtggagaaa actatgacgg cáaaatttcc 360aagaccatgt ctggactgga atgccaggcc tgggactctc agagcccaca cgctcatgga 420tacattcctt ccaaatttcc aaacaagaac ctgaagaaga attactgtcg taaccccgat 480agggagctgc ggccttggtg tttcaccacc gaccccaaca agcgctggga actttgcgac 540atcccccgct gcacaacacc tccaccatct tctggtccca cctaccagtg tctgaaggga 600acaggtgaaa actatcgcgg gaatgtggct gttaccgttt ccgggcacac ctgtcagcac 660tggagtgcac agacccctca cacacataac aggacaccag aaaacttccc ctgcaaaaat 720ttggatgaaa actactgccg caatcctgac ggaaaaaggg c.cccatggtg ccatacaacc 780aacagccaag tgcggtggga gtactgtaag ataccgtcct gtgactcctc cccagtatcc 840acggaacaat tggctcccac agcaccacct gagctaaccc ctgtggtcca ggactgctac 900catggtgatg gacagagcta ccgaggcaca tcctccacca ccaccacagg aaagaagtgt 960cagtcttggt catctatgac accacaccgg caccagaaga ccccagaaaa ctacccaaat 1020gctggcctga caatgaacta ctgcaggaat ccagatgccg ataaaggccc ctggtgtttt 1080accacagacc ccagcgtcag gtgggagtac tgcaacctga aaaaatgctc aggaacagaa 1140gcggctagcg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atggagggct cgagcatcac 1200caccatcacc atcattga 1218
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Indicador na terminação C
<4Ò0> 19
Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
<210> 20<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Myc único na terminação C
<400> 20
Glu Gln Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> etiqueta poli-histidina
<400> 21
His His His His His His His1 5
Claims (11)
1. Uso de um polinucleotídeo codificador de pelo menos umdos domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimentode hepatócito, caracterizado pelo fato de ser para a triagem e/ou odesenvolvimento de agentes farmacoligicamente ativos úteis no tratamento decâncer.
2. Uso de um polipeptídeo compreendendo pelo menos um dosdomínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento dehepatócito, caracterizado pelo fato de ser para a triagem e/ou odesenvolvimento de agentes farmacoligicamente ativos úteis no tratamento decâncer.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que dito agente farmacologicamente ativo interfere com atividadecatalítica, função, estabilidade e/ou expressão de receptor de fator decrescimento de hepatócito.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadopelo fato de que dito agente farmacologicamente ativo regula negativamenteatividade catalítica, função, estabilidade e/ou expressão de receptor de fatorde crescimento de hepatócito.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito agente farmacologicamenteativo é um antagonista e/ou inibidor de receptor de fator de crescimento dehepatócito.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que dito agente farmacologicamenteativo é selecionado dentre inibidores de molécula pequena, aptâmeros,nucleotídeos de anti-senso, inibidores baseados em RNA, siRNAs, anticorpos,peptídeos, dominante negativo.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer comdesregulação de atividade de receptor de fator de crescimento de hepatócito.
8. Método para detectar a capacidade de um agente de testepara atuar como um antagonista/inibidor de receptor de fator de crescimentode hepatócito útil no tratamento de câncer, preferivelmente um câncer comdesregulação de atividade de receptor de fator de crescimento de hepatócito,caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) por em contato um agente de teste com i) umpolinucleotídeo codificador de pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 eIPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito, ii) um polipeptídeocompreendendo pelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 dereceptor de fator de crescimento de hepatócito, ou iii) células expressandopelo menos os domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator decrescimento de hepatócito,(b) medir atividade, função, estabilidade e/ou expressão dereceptor de fator de crescimento de hepatócito, e(c) selecionar o agente que reduz atividade, função,estabilidade e/ou expressão de receptor de fator de crescimento de hepatócito.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo fato de dita medição em etapa b) compreende medirsinalização celular, sobrevivência celular, e proliferação celular.
10. Domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fatorde crescimento de hepatócito, caracterizados pelo fato de serem para usocomo um medicamento para tratar câncer.
11. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender pelo menosuma seqüência de nucleotídeos codificadora dos domínios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de receptor de fator de crescimento de hepatócito para uso como ummedicamento para tratar câncer.
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