ES2368603T3 - Sitio de unión de alta afinidad hgfr y procedimientos para la identificación de antagonistas del mismo. - Google Patents
Sitio de unión de alta afinidad hgfr y procedimientos para la identificación de antagonistas del mismo. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer.
Description
Sitio de unión de alta afinidad de HGFR y procedimientos para la identificación de antagonistas del mismo
La presente invención se refiere al área de la proteína del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGFR). Más específicamente, la presente invención se refiere a la identificación del sitio de unión de alta afinidad del HGFR por su ligando, el factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF), y procedimientos para la identificación de antagonistas de HGFR que se dirigen al sitio de unión de alta afinidad de HGFR.
El receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (también conocido como Met) es una tirosina quinasa y es el producto del oncogen c-met proto. Está constituido por una subunidad α de 50 kDa y una subunidad β de 145 kDa, que están unidos mediante enlace disulfuro, siendo la subunidad α completamente extracelular, mientras que la subunidad β incluye (desde el extremo N al C) una región extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa citoplásmico. El receptor dimérico α/β hetero maduro se genera mediante procesamiento proteolítico y glicosilación terminal de un precursor de una sola cadena de 170 kDa.
El HGF, también conocido como Factor Scatter, es una glicoproteína de unión a heparina con un amplio espectro de actividades biológicas que incluyen proliferación celular, motilidad, supervivencia y morfogénesis. Se sintetiza y secreta como un precursor de una sola cadena inactivo, (pro-HGF) que se almacena en la matriz extracelular debido a su alta afinidad por los proteoglicanos. Pro-HGF experimentan escisión proteolítica en los restos R494-V495 para dar lugar a la forma activa de, un dímero α/β hetero ligado a disulfuro, donde la cadena α está constituido por un dominio N-terminal seguido de cuatro dominios kringle y la cadena β comparte homología estructural con la familia quimotripsina de las serina proteasas. Sin embargo, la cadena β, carece de actividad proteolítica ya que dos de los tres restos críticos que forman la triada catalítica típica de las serina proteasas no se conservan en HGF. A pesar de su incapacidad para la señal, pro-HGF se une a Met con alta afinidad alta afinidad y desplaza el HGF activo.
Recientemente, una serie de estudios de estructura -función han vertido alguna luz en las interacciones entre la parte extracelular de Met y HGF.
La región extracelular Met tiene una estructura modular que abarca tres regiones funcionales: el dominio Sema (presente también en Semaforinas y Plexinas) que se extiende sobre los primeros 500 restos del extremo N de la proteína y tiene una estructura de hélice β de siete hojas propulsor, el dominio PSI (también encontrado en Plexinas, Semaforinas e Integrinas) que cubre aproximadamente 50 restos y contiene cuatro enlaces disulfuro conservados, y 400 restos adicionales que unen el dominio PSI a la hélice transmembrana y están ocupados por cuatro dominios IPT (dominios relacionados con Inmunoglobulina presentes en Plexinas y factores de Transcripción).
El HGF es un ligando bivalente que contiene un sitio de unión de alta afinidad para Met en las cadenas α y un sitio de unión de baja afinidad en la cadena β. La cooperación entre la cadena α-y β se requiere para la actividad biológica de HGF; mientras la cadena α, y más precisamente el dominio N y el primer kringle, es suficiente para la unión de Met, la cadena β es necesaria para la activación de Met.
La resolución de la estructura cristalina de los dominios SEMA y PSI de Met en complejo con la cadena β de HGF (véase i.a. WO-A-2005/108424) reveló que el sitio de unión de baja afinidad para HGF se encuentra en las hojas 2 3 de la hélice β, y que la parte de HGF-βque se une a Met es la misma región que las serina proteasas usan para unirse a sus sustratos o inhibidores. De manera importante, la determinación de la estructura cristalina de la cadena β de HGF a resolución de 2,53 Å y análisis de mutagénesis específica desvelaban que los restos implicados en la unión de Met en el bolsillo de activación de la cadena β de HGF se exponen a solamente después de la conversión proteolítica de pro-HGF, explicando de esta manera porque pro-HGF se une a Met con alta afinidad sin activarlo. Mientras que la interacción de baja afinidad entre la cadena β de HGF y el dominio Sema de Met está bien caracterizado estructuralmente y funcionalmente, por el momento no está claro qué región de Met se une a las cadenas α de HGF con alta afinidad. De este modo, el principal mecanismo por el que HGF activa Met todavía permanece escasamente entendido. Esto es algo sorprendente cuando se considera la gran importancia biológica y terapéutica de esta ruta.
La señalización de HGF-Met es esencial durante la embriogénesis y en la regeneración de tejidos en la vida del adulto. De manera importante, la señalización dis regulada de HGF-Met juega un papel clave en la tumorigénesis y metástasis. La activación inapropiada de Met por diferentes mecanismos incluyendo estimulación autocrina de HGF, sobreexpresión del receptor, amplificación génica y mutación puntual se describe en una amplia diversidad de neoplasias humanas y se correlaciona con escasa prognosis. Estos hallazgos dieron como resultado un interés creciente en la ruta HGF-Met como una diana para terapia de cáncer como se describe i.a. en Michieli et al., Cancer Cell 2004, 6 (1), 61 -73; Xueyan et al., Molecular Cancer Therapeutics 2003, 2 (11), 1085 -92; documento EP-A-0 520 158; Kaji et al., Cancer Gene Therapy 1996, 3(6), 393 -404 y Kong-Beltram et al., Cancer Cell, 2004, 6(1), 75 84, que conduce al desarrollo de una diversidad de inhibidores de Met/HGF. Éstos incluyen compuestos de molécula pequeña que dirigen la actividad quinasa de Met, neutralizando los anticuerpos anti-Met o anti-HGF, receptores Decoy y factores derivados de HGF. No obstante, si tales moléculas se dirigen al sitio de unión de alta afinidad para HGF y cual es el mecanismo molecular exacto en base a la unión de HGF a Met con alta afinidad, permanece todavía desconocido. Esto puede evitar el aislamiento de agentes terapéuticos más selectivos, con sensibilidad aumentada y pocos efectos secundarios. El conocimiento exacto del sitio de unión de alta afinidad de Met para HGF ciertamente ayudará a diseñar antagonistas altamente específicos de Met.
Por lo tanto se siente la necesidad de soluciones mejoradas que permitan la identificación de antagonistas Met con sensibilidad aumentada y pocos efectos secundarios para el desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces para el tratamiento de cánceres.
El objetivo de esta descripción es proporcionar tales soluciones mejoradas.
De acuerdo con la presente invención tales objetivos se logran gracias a la solución que tiene las características mencionadas específicamente en las reivindicaciones siguientes. Las reivindicaciones forman parte integral en la enseñanza técnica en el presente documento proporcionada en relación con la presente invención.
De este modo, el objetivo de la presente descripción es la identificación del sitio de unión de alta afinidad HGF al receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos (HGFR), es decir, los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar medios para la identificación de antagonistas de HGFR que se dirijan el sitio de unión de alta afinidad de HGFR para HGF para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de cánceres.
En una realización, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido constituido por, o un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección y / o desarrollo de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer, en particular un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
En una realización, el agente farmacológicamente activo es un inhibidor y / o antagonista del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos y se puede seleccionar entre inhibidores de moléculas pequeñas, aptámeros no codificantes, nucleótidos, inhibidores a base de ARN, ARNsi, anticuerpos, péptidos, factores negativos dominantes.
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la capacidad de un agente de ensayo para actuar como un antagonista/inhibidor del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos útil en el tratamiento de cáncer, preferiblemente un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un agente de ensayo con los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, o células que expresan los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4, la hélice transmembrana y la región citoplásmica completa del receptor factor de crecimiento de los hepatocitos,
- (b)
- medir la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, y
- (c)
- seleccionar el agente que reduce la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
En todavía una realización adicional, la presente invención se refiere al uso de los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos como un medicamento para tratamiento de cáncer.
La presente invención se describirá ahora en detalle con relación a las realizaciones preferidas a modo de ejemplos no limitantes con relación a los dibujos anexos, en la que:
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- Figura 1 muestra la modificación por ingeniería genética y purificación de los subdominios Met y HGF. (A) Representación esquemática de las proteínas modificadas por ingeniería genética usadas en este estudio. Panel izquierdo: receptores modificados por ingeniería genética. W.T. MET, Met natural; EXTRA, parte extracelular; INTRA, iparte intracelular; SP, péptido de señal; SEMA, dominio de homología de semaforina; PSI, dominio de homología de plexina-semaforina-integrina; IPT 1-4, dominio 1 -4 de homología del factor de transcripción inmunoglobulina-plexina; TM, dominio transmembrana; JM, dominio yuxta-membrana; KD, dominio quinasa; CT, cola C-terminal; E, epítopo FLAG o MYC; H, marca poli-histidina. El triángulo rojo indica el sitio de escisión proteolítica entre la cadena α y β. Panel derecho: ligandos modificados por ingeniería genética. W.T. HGF, HGF natural; ND, dominio N; K 1-4, kringle 1-4; PLD, dominio de tipo proteasa; UNCL. HGF, HGF no escindible. El asterisco indica la sustitución de aminoácido R494Q en el sitio proteolítico. (B) Tinción con azul Coomassie de receptores y ligandos purificados por afinidad. Cada grupo de proteínas (Sema, Sema-PSI, Met Decoy ; PSI-IPT, IPT; HGF-α, HGF no escindible, HGF; HGF NK1, HGF-β) se han resuelto por SDSPAGE en condiciones no reductoras y se cuantificó contra una curva estándar de albúmina sérica bovina (BSA). MW, marcador de peso molecular; kDa, kilo-Dalton.
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- Figura 2 muestra un análisis ELISA de interacciones HGF-Met. (A) Unión de los sub-dominios Met para activar HGF. Se inmovilizaron receptores modificados por ingeniaría genética en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de HGF activo en fase líquida. La unión se reveló usando anticuerpos anti-HGF. La unión no específica se midió usando BSA en lugar de receptores purificados en fase sólida. (B, C, D) Unión de Met Decoy, Sema-PSI, e IPT a diferentes formas de HGF. Receptores modificados por ingeniería genética se inmovilizaron en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de HGF activo marcado con MYC, pro-HGF, HGF-α o HGF NK1 en fase líquida . La unión se reveló usando anticuerpos anti-MYC. La unión no específica se midió mediante el uso de angiostatina (AS) marcada con MYC en fase líquida.
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- Figura 3 muestra que los dominios de IPT 3 y 4 son suficientes para unirse a HGF-α con alta afinidad. (A) Representación esquemática de variantes de IPT suprimidas. El código de color y la leyenda como en la Figura 1A.
(B) análisis ELISA de interacciones entre las variantes IPT y HGF-α. Los IPT modificados por ingeniería genética se inmovilizaron en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de HGF-αen fase líquida. La unión se reveló usando anticuerpos anti-HGF.
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- Figura 4 muestra que los dominios de IPT 3 y 4 son suficientes para unirse a HGF en células vivas. (A) Representación esquemática del receptor Met∆25-741 suprimido. El código de color y la leyenda como en la Figura 1A. (B) Análisis de biotinilización de superficie. Las proteínas celulares se inmunoprecipitaron (IP) usando anticuerpos dirigidos contra la parte C-terminal de Met y se analizaron mediante transferencia de Western (WB) usando estreptavidina (SA) conjugada con peroxidasa de rábano picante. Las mismas transferencias se volvieron a sondar con anticuerpos anti-Met. W.T., naturales; A549, células de carcinoma de pulmón humanas A549; MDA, células de melanoma humanas MDA-MB-435; TOV, células de carcinoma de ovario humanas TOV-112D; V. vacío, vector vacío. La banda p170 corresponde a Met no procesado; p145 es la forma madura del receptor. (C) Análisis de reticulación química. Células TOV-112D que expresan Met∆25-741 (Met ∆25-741) y células TOV-112D naturales
(W.T. TOV) se incubaron con HGF y después se sometieron a reticulación química. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron usando anticuerpos anti-Met y se analizaron mediante transferencia de Western. usando anticuerpos anti-Met. La flecha indica complejos HGF-Met∆25-741 (D) análisis de Metfosforilación. Células TOV-112D que expresan Met∆25-741 se estimularon con FBS al 1% como un control negativo y con cantidades iguales de HGF, pro-HGF, HGF NK1 o NK1-NK1. La fosforilación del receptor se determina mediante inmuno-precipitación con anticuerpos anti-Met y transferencia de Western con anticuerpos anti-fosfotirosina (anti-pTyr). Se volvieron a sondar las mismas transferencias usando anticuerpos anti-Met. Las flechas indican las bandas correspondientes a Met∆25741 o inmunoglobulinas (Ig). (E) Representación esquemática de NK1-NK1. Del extremo N al C: SP, péptido de señal; ND, dominio N; K1, kringle 1; H, marca de poli-histidina.
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- Figura 5 muestra que IPT soluble inhibe el crecimiento invasivo inducido por HGF in vitro. (A) Células MDA-MB435 transducidas por vector lentiviral se estimularon con HGF recombinante y se determinó la fosforilación de Met mediante inmunotransferencia usando anticuerpos anti-fosfotirosina (panel superior). La misma transferencia se volvió a sondar usando anticuerpos anti-Met (panel inferior). V. vacío, Vector vacío. (B) Ensayo de morfogénesis de ramificación. Esferoides preformados de células MDA-MB-435 transducidas por vector lentiviral se embebieron en colágeno y después se estimularon con HGF recombinante para formar túbulos ramificados. La invasión de colágeno se cuantificó mediante puntuación del número medio de túbulos que surgen de cada esferoide. EV, Vector vacío; DM, Met Decoy; SP, Sema-PSI. (C) Imágenes representativas del experimento descrito en B. Ampliación: 200X.
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- Figura 6 muestra que IPT soluble muestra actividad anti-tumoral y anti-metastásica. Ratones CD-1 nu-/-se inyectaron por vía subcutánea con células MDA-MB-435 transducidas con vector lentiviral, y se controló el crecimiento tumoral con el tiempo. (A) Representación gráfica de tipo Kaplan-Meier de latencia de tumor (eje X, tiempo en días; eje Y, porcentaje de animales sin tumor). V. vacío, vector vacío. (B) Volumen de tumor medio. (C) análisis Inmuno-histoquímico de secciones de tumores usando anticuerpos anti-FLAG. Ampliación: 400X. (D) Análisis de vasos de tumores. Se tiñeron secciones de tumor con anticuerpos del factor anti-Von Willebrand. El número de vasos de tumor por mm cuadrado de sección de tumor se determinó mediante microscopía. EV, Vector vacío; DM, Met Decoy; SP, Sema-PSI. (E) Análisis de incidencia de Metástasis. Tras la autopsia, secciones de pulmón en serie se analizaron mediante microscopía para determinar la presencia de micrometástasis. Incidencia de metástasis -es decir, el número de ratones con metástasis sobre el total -se indica tanto en porcentajes (barras) como en fracción (en el extremo de las barras). (F) Imágenes representativas de micrometástasis del grupo del vector vacío. Se tiñeron secciones de pulmón con hematoxilina y eosina. Las líneas de puntos identifican las paredes de vasos sanguíneos (vs). Células metastásicas (mc) se pueden encontrar dentro de los vasos como un émbolo o en el parénquima. Ampliación: 400X.
Los datos presentados en la presente descripción sugieren que la cadena α de HGF se une a la región IPT de Met con alta afinidad, y que se hace así independientemente del procesamiento proteolítico del ligando. También sugieren que la unión de HGF a IPT en el contexto de un Met que carece del dominio Sema es suficiente para transmitir la señal para la activación del receptor al dominio citoplásmico quinasa, aunque sin distinción entre la forma inactiva y activa del ligando. Finalmente, proporcionan evidencia de que las proteínas modificadas por ingeniería genética derivadas de la región IPT y dominio Sema de Met son capaces de neutralizar la actividad proinvasiva de HGF tanto in vitro como in vivo.
Durante mucho tiempo se ha sabido que el HGF es un factor bivalente. Estudios de modificación por ingeniería genética de proteínas tempranos identificaron un sitio de unión a Met de alta afinidad Met en el dominio N y primer kringle de HGF. Posteriormente, el análisis bioquímico y biológico combinado demostró que el dominio de tipo HGF serina proteasa (cadena β), aunque no necesariamente para la unión, juega un papel clave en la mediación de la activación del receptor. Más recientemente, datos cristalográficos y de mutagénesis detallados han caracterizado completamente tanto estructuralmente como funcionalmente el sitio de unión de Met de baja afinidad sobre la cadena β de HGF y su interacción con el dominio Sema de Met. La interface entre las cadenas α de HGF y Met han permanecido sin embargo difíciles de encontrar. Estudios de dispersión de rayos x de ángulo pequeño y microscopía crio-electrónica sugirieron la presencia de contactos entre el dominio N-terminal y el primer kringle de HGF y el dominio Sema de Met. Sin embargo, análisis de resonancoa de plasmón reveló que esta interacción tiene muy poca afinidad (aproximadamente 2 veces menor que la de HGF-βpara Sema y 100 veces menor que la de HGF-αpara el receptor que interactúa). Ya que esta interacción débil no puede ser responsable por sí para el enlace estrecho entre HGF y Met, el sitio de unión de alta afinidad HGF sobre Met todavía tiene que identificarse.
Los resultados presentados en el presente documento contribuyen a llenar este hueco y sugerir que este largo sitio de unión de HGF buscado cae en la región IPT de Met y más precisamente en los dos últimos dominios de tipo inmunoglobulina cerca de la membrana celular. Varias evidencias experimentales diferentes proporcionadas en la presente descripción sugieren que este es el caso. En primer lugar, un receptor de Met soluble, suprimido que no contiene nada excepto los cuatro dominios IPT (IPT) se une a HGF con sustancialmente la misma actividad que la parte entera extracelular de Met. De manera inversa, Sema muestra muy baja afinidad hacia HGF. En segundo lugar, IPT se une a HGF, pro-HGF o HGF-α activos con resistencia no cambiada. En tercer lugar, la supresión de IPT 1 e IPT 2 no afecta a la afinidad de IPT para cualquier forma de HGF. En cuarto lugar, un Met receptor modificado por ingeniería genética que lleva una gran supresión en su ectodominio correspondiente al dominio Sema, el módulo PSI y los primeros dos dominio de de tipo inmunoglobulina (Met∆25-741) retiene la capacidad de unirse a HGF y para translucir la señal para la activación de la quinasa al interior de la célula, aunque no se puede distinguir entre HGF y Pro-HGF activo. Finalmente, una forma dimérica de HGF NK1, que se sabe que contiene dominio de unión de Met mínimo de HGF-α, es capaz de inducir la activación de Met∆25-741 tanto eficazmente como más potente que HGF, de este modo identificando en IPT 3-4 el sitio de unión de HGF NK1-.
Aunque estos datos señalan a un papel clave de IPT en la uinón de HGF, es digno de mención que dos estudios previos de estructura/función en la parte extracelular de Met no identificaba ningún sitio de unión al ligando en esta región. Un primer diseño de mapa de ectodominio Met sugería que el dominio Sema es necesario y suficiente para la unión de HGF basándose en ensayos ELISA. Un segundo eanalizó el papel del dominio Sema en la dimerización del receptor y sugirió que una forma modificada por ingeniería genética de la parte extracelular Met que contenía una supresión en el dominio Sema no era capaz de precipitar conjuntamente HGF.
La presente descripción además demuestra que la cooperación entre Sema e IPT se observa también cuando la parte extracelular de Met se usa como una herramienta biotecnológica para inhibir el crecimiento invasivo inducido por HGF. En el análisis in vitro y en heterotransplantes de ratón tanto las proteínas solubles de IPT como Sema-PSI mostraron un efecto inhibidor significativo. Sin embargo, ninguno de ellos podría lograr la potente inhibición mostrada por el ectodominio de Met completo, que contiene tanto el sitio de unión de baja afinidad como de alta afinidad de HGF. Esto implica que ambas interacciones contribuyen a controlar la actividad de Met. Mientras que el contacto HGF-β-Sema ya se ha identificado como una diana para terapia, los resultados presentados en el presente documento descubren una segunda interfase que ofrece oportunidades para la intervención farmacológica. Las proteínas o anticuerpos recombinantes que se unen a la región IPT en lugar de HGF auténtico tienen una aplicación como inhibidores altamente competitivos de Met para el tratamiento de cánceres dependientes de HGF/Met.
Materiales y procedimientos
Modificación por ingeniería genética de proteínas
Receptores solubles o transmembrana y ligandos modificados por ingeniería genética descritos en este trabajo se han generado mediante PCR estándar y técnicas de modificación por ingeniería genética. Todos los factores conservan la secuencia guía de su proteína parental en el extremo N. Las secuencias de aminoácido (aa) de proteínas de Met solubles (Gene Bank N. X54559) corresponden a aa 1-24 (péptido de señal) más: Met Decoy, aa 25 -932; Sema, aa 25 -515; Sema-PSI, aa 25 -562; PSIIPT, aa 516 -932; IPT, aa 563 -932; IPT ∆1, aa 657 -932; IPT ∆1-2, aa 742 -932; IPT-3, aa 742 -838; IPT-4, aa 839 -932. en el extremo C de cada molécula una secuencia de epítopo doble FLAG (SDYKDDDDK -SEC ID No.:19) o individual MYC (EQKLISEEDLN -SEC ID No.:20) y una marca poli-histidina (HHHHHHH -SEC ID No.:21) se añadieron para la detección y purificación de proteínas. El Met∆25-741 transmembrana modificado por ingeniería genética es idéntico a Met natural excepto para la región suprimida (aa 25 -741). Las secuencias de aminoácido de proteínas de HGF modificadas por ingeniería genética (Gene Bank N. M73239) corresponden a aa 1-31 (péptido de señal) más: HGF, aa 32 -728; HGF-α, aa 32 -473; HGF NK1, aa 32 -205; HGF-β, aa 495 -728. Se añadieron el MYC o epítopo FLAG y marca poli-histidina en el extremo C. Se ha descrito antes HGF no escindible (Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114(10), 1418-1432). NK1-NK1 es una forma dimérica de HGF NK1 constituido por la misma región N-terminal HGF repetida en tándem (aa 1 -205 directamente unidos a aa 32 -205 sin espaciador). Los ADN que codifican todas las proteínas modificadas por ingeniería genética se subclonaron en el vector de transferencia lentiviral pRRLsin.PPT.CMV.eGFP.Wpre (SEC ID No.:1) en lugar del gfp ADNc como se describe en Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25(2), 217-222. La secuencia de codificación de GFP se reemplazó por los siguientes ADNc: Met Decoy FLAG.his (SEC ID No.:2), Sema FLAG.his (SEC ID No.:3), Sema-PSI FLAG.his (SEC ID No.:4), PSI-IPT FLAG.his (SEC ID No.:5), IPT FLAG.his (SEC ID No.:6), IPT ∆1 FLAG.his (SEC ID No.:7), IPT ∆1-2 FLAG.his (SEC ID No.:8), IPT 3 FLAG.his (SEC ID No.:9), IPT 4 FLAG.his (SEC ID No.:10), Met ∆25-741 (SEC ID No.:11), HGF MYC his (SEC ID No.:12), HGF-αMYC his (SEC ID No.:13), HGF-NK1 MYC his (SEC ID No.:14), HGF-βMYC his (SEC ID No.:15), HGF MYC his no escindible (SEC ID No.:16), NK1-NK1 his (SEC ID No.: 17), angiostatina MYC his(SEC ID No.:18).
Ensayos Inmunoabsorbentes Ligados a Enzima
Todos los receptores y factores modificados por ingeniería genética se recogieron del medio acondicionado de células de melanoma humano MDA-MB-345 transducidas por el vector lentiviral en la ausencia de suero. La purificación del factor se realizó mediante cromatografía de de afinidad de metal inmovilizada como se ha descrito previamente en Michieli P. et al. (2002) Nat Biotechnol. 20(5), 488 -495. Conversión de pro-HGF en HGF activo se realizó mediante la incubación de pro-HGF purificado (concentración máxima 100 ng/µl) con FBS al 2 -10% (Sigma, St. Louis, Missouri) a 37°C durante 24 horas. La con version del factor se analizó mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-HGF (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota). HGF no escindible sometido a la misma incubación con FBS se usó como pro-HGF enn todos los ensayos que comparaban HGF activo con HGF no procesado. La unión de ligandos modificados por ingeniería genética a receptores solubles se midió mediante ELISA usando receptores solubles marcados con FLAG en fase sólida y ligandos marcados con MYC modificado por ingeniería genética en fase líquida. Una concentración fija de receptor soluble purificado (100 ng/pocillo) se absorbió a placas ELISA de 96 pocillos. Las placas recubiertas de proteína se incubaron con concentraciones crecientes de ligandos modificados por ingeniería genética, y la unión se reveló usando anticuerpos anti-HGF biotinilados (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) o anticuerpos anti-MYC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California). Se analizaron los datos de unión y se ajustaron usando software Prism (Graph Pad Software, San Diego, California).
Cultivo de células
Se compraron células de melanoma humano MDA-MB-435 en la Fuente de Compartida de Cultivo de Tejidos de la Universidad de Georgetown (Washington, Distrito de Columbia). Las células se mantuvieron en DMEM complementado con FBS al 10%(Sigma). Células de carcinoma de ovario humano TOV-112D se obtuvieron de ATCC (Rockville, Maryland; ATCC N. CRL-11731) y se cultivaron usando una mezcla 1:1 de Medio MCDB 105 y Medio 199 complementado con FBS al 15% (todos de Sigma). Células de carcinoma de pulmón humano A549 también se obtuvieron de ATCC (ATCC N. CCL-185) y se mantuvieron en RPMI complementado con FBS al 10%.
Vectores lentivirales
Se produjeron reservas de vector mediante transfección transitoria de células 293T como se ha descrito previamente en Follenzi, A. et al. (2000) Nat Genet. 25 (2), 217 -222. En resumen, la mezcla de ADN de plásmido para la transfección se preparó como sigue: plásmido ENV (VSV-G), 9 µg; plásmido DE ENVASE pMDLg/pRRE 16,2 µg; plásmido REV, 6,25 µg; VECTOR DE TRANSFERENCIA (plásmido nº 2 -18), 37,5 µg. Los plásmidos se diluyeron en una solución de TE/CaCl2, a la que se añadió una solución de HBS mientras se sometía a agitación con aparato Vortex a la máxima velocidad. La mezcla ADN/CaCl2/HBS se añadió gota a gota inmediatamente a las placas de células que después se incubaron a 37°C. Después de 14 -16 horas se reemplazó el medio de cultivos con uno reciente. Los sobrenadantes del cultivo celular que contenían partículas del vector se recogieron aproximadamente 36 horas después del cambio del medio. Después de la recogida, los sobrenadantes se filtraron a través de membranas de poro de 0,2 µm y se almacenaron a -80°C. Se determinó la concentr ación de antígeno viral p24 por el kit ELISA de perfil de núcleo HIV-1 p24 (NEN Life Science Products, Boston, Massachusetts) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se transdujeron las células en placas de seis pocillos (105 células/pocillo en 2 ml de medio) usando 40 ng/ml de p24 en la presencia de 8 µg/ml de polibreno (Sigma) como se describe en Vigna, E. y Naldini, L. (2000) J Gene Med. 2(5), 308 -316. Se cambió el medio aproximadamente 18 horas después de la transducción. Se controló el crecimiento celular y la producción de proteína con el tiempo. Líneas celulares transducidas se sembraron después en placas de 15 cm, se desarrollaron hasta 80% de confluencia y se incubaron en medio sin suero. Después de 72 horas, se recogieron los sobrenadantes que contenían las proteínas solubles recombinantes, se filtraron y se recombinaron por cromatografía de afinidad y se almacenaron a -30°C.
Análisis de Inmuno-precipitación y transferencia de Western
Se realizaron análisis de lisis celular, inmuno-precipitación y transferencia de Western usando tampón de extracción (EB) como se describe en Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9 (1), 49 -57. Se detectó la señal usando el sistema ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se han descrito los anticuerpos anti-Met para inmunoprecipitación por Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270 y se compraron en UBI (Lake Placid, New York). Los anticuerpos anti-Met para transferencia de Western se compraron en Santa Cruz. Los anticuerpos anti-FLAG se obtuvieron de Sigma. El análisis de fosforilación de Met en células MDA-MB-435 transducidas por vector lentiviral se realizó como se ha descrito previamente en Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61 -73.
Reticulación de HGF y análisis de activación de Met
Células TOV-112D transducidas por el vector lentiviral que expresan Met∆25-741 se sometieron a análisis de biotinilación de superficie usando un kit ECL™ Surface Biotinylation Module (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la reticulación química como se ha descrito previamente en Mazzone, M. et al. (2004) J Clin Invest. 114 (10), 1418 -1432. En resumen, células se desproveyeron de factores de crecimiento en suero durante 3 días y después se incubaron con 1 nM HGF durante 3 horas. Los lisados de células se inmuno-precipitaron usando anticuerpos usados contra la parte C-terminal de Met como se describe en Ruco,
L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266 -270, se resolvieron mediante SDS-PAGE usando un gradiente de poliacrilamida al 3-10% y se analizaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-HGF (R&D). para análisis de activación de receptor, células TOV-112D que expresan Met∆25-741 se privaron de factores de crecimiento en suero durante 3 días y después se estimularon con 1 nM HGF, HGF no escindible, HGF NK1 o NK1-NK1 durante 10 minutos. Las células se lisarond usando EB como se describe en Longati, P. et al. (1994) Oncogene 9(1), 49-57. Las proteínas celulares se inmuno-precipitaron con anticuerpos anti-Met como se ha descrito y se analizaron mediante transferencia de Western usando anticuerpos anti-fosfotirosina (UBI). Las mismas transferencias se volvieron a sondar con anticuerpos anti-Met (Ruco, L.P. et al. (1996) J Pathol. 180(3), 266-270).
Ensayos biológicos
Ensayos de invasión de colágeno que usan células MDA-MB-435 se realizaron usando esferoides preformados como se describe en Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6 (1), 61 -73. En resumen, se generaron esferoides mediante incubación de las células durante toda una noche (700 células / pocillo) en placas de 96 pocillos no adherentes (Greiner, Frickenhausen, Alemania) en la presencia de 0,24 g/ml de metilcelulosa (Sigma). Se embebieron los esferoides en una matriz de colágeno que contenía 1,3 mg/ml de colágeno de tipo I de cola rata (BD Biosciences, Bedford, Massachusetts) y FBS al 10% usando placas de 96 pocillos (40 esferoides / pocillo). Los esferoides embebidos se cultivaron a 37°C durante 2 4 horas, y después se estimularon con 30 ng/ml de HGF (R&D)
o sin factor durante 24 horas adicionales. El número de túbulos que surgen de cada esferoide se puntuó mediante microscopía. Al menos se analizaron 12 esferoides por punto experimental.
Ensayos de tumorigénesis
Células tumorales MDA-MB-435 transducidas por el vector lentiviral (3,106 células/ratón) en 0,2 ml de DMEM se inyectaron por vía subcutánea en el flaco posterior derecho de ratones hembra de seis semanas de edad nu-/sobre fondo Swiss CD-1 (Charles River Laboratories, Calco, Italia). Se evaluó el tamaño de tumor cada 2 días usando un calibre. Se calculó el volumen de tumor usando la fórmula V = 4/3nx2y/2 en la que x es el eje de tumor menor e y el eje de tumor mayor. Una masa de 15 mm3 -correspondiente aproximadamente al volumen inicial ocupado por las células inyectadas -se eligió como umbral para la positividad de tumor. Los ratones cuyos tumores estaban por debajo de estaban por debajo de este umbral se consideraron sin tumor. Después de aproximadamente 4 semanas, se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tumores para análisis. Los animales se sometieron a autopsia. Los tumores y pulmones se embebieron en parafina y se procesaron para histología. Se realizó análisis de micrometástasis por microscopía sobre secciones de pulmón en serie teñidas con hematoxilina y eosina. Las secciones de tumores se tiñeron con hematoxilina y eosina y se analizaron por un patólogo independiente no informado de la identidad de la muestra. TSe determine la expresión transgénica sobre secciones de tumores por inmuno-histoquímica usando anticuerpos anti-FLAG (Sigma). Las secciones se tiñeron por contraste con hematoxilina Meyer (Sigma). Se analizó la angiogénesis de tumor mediante inmuno-histoquímica usando anticuerpos de factor anti-Von Willebrand (DAKO, Glostrup, Dinamarca). Las secciones se tiñeron por contraste como antes. Se determinó la densidad de los vasos por microscopía. Se analizaron al menos 12 campos por animal. Se aprobaron todos los procedimientos de animal por la Comisión Ética de la Universidad de Turin, Italia, y por el Ministerio de Salud italiano.
Análisis estadístico
Se determinó la significación estadística usando un ensayo de t de Student de dos colas homoscedástico (disposición 1, grupo de control; disposición 2, grupo experimental). Para todos los datos analizados, se asumió un umbral de significación de p < 0,05. En todas las figuras, los valores se expresan como media ± desviación estándar, y la significación estadística se indica por un solo (p <0,05) o doble (p < 0,01) asterisco.
Modificación por ingeniería genética de dominios funcionales HGF/Met
Una representación esquemática de los dominios funcionales contenidos en Met y HGF se muestra en la Figura 1A. La parte extracelular de Met incluye un dominio Sema, una articulación PSI, y cuatro módulos IPT (panel izquierdo). HGF se compone de una cadena α y una β unidas por un puente disulfuro en la proteína madura. La cadena α a su vez comprende un dominio N-terminal y cuatro kringles (panel derecho). Para analizar las interacciones entre Met y HGF, los inventores expresaron todos los dominios funcionales como proteínas individuales, solubles. Los dominios funcionales se modificaron por ingeniería genética para que contuviera el péptido de señal de la proteína parental en su extremo N, de manera que se puedan secretar apropiadamente. En el extremo C, se añadieron un epítopo exógeno (FLAG o MYC) para reconocimiento de anticuerpo y una marca poli-histidina para purificación de proteína. Todos los ADNc que codifican los factores modificados por ingeniería genética se subclonaron en el vector lentiviral pRRLsin.PPT.CMV.Wpre, y se produjeron partículas lentivirales recombinantes como se describe en Materiales y Procedimientos. Las proteínas recombinantes se recogieron del medio acondicionado de células de melanoma humano MDA-MB-435 transducidas por el vector lentiviral y se purificaron hasta homogeneidad por cromatografía de afinidad. Las proteínas purificadas se cuantificaron contra patrones por SDS-PAGE (Figura 1B).
Análisis ELISA de interacciones Met-HGF
Se ensayo la capacidad de ectodominios Met para interactuar con HGF en ensayos de unión de ELISA. Se inmovilizaron receptores solubles (Met Decoy, Sema-PSI, Sema, PSI-IPT, IPT) en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de HGF activo. La unión se reveló usando anticuerpos anti-HGF biotinilados. Se determine la unión de HGF no específica usando albúmina sérica bovina (BSA) en fase sólida en lugar de dominios Met solubles. La afinidad de unión se determinó mediante análisis de regresión no lineal como se describe en Materiales y Procedimientos. En estas condiciones, Met Decoy unido a HGF con un valor de KD de aproximadamente 0,2 -0,3 nM. Consistente con las mediciones previos, Sema-PSI y Sema unidos a HGF con una afinidad al menos un log menor comparada con Met Decoy. Sorprendentemente, tanto PSI-IPT como IPT unidos a HGF de manera muy eficaz, con casi la misma afinidad que Met Decoy (Figura 2A). La presencia o ausencia del dominio PSI no afectó a la afinidad de unión para HGF de o bien Sema o IPT. Ya que casi todos los dominios Sema encontrados hasta ahora en la naturaleza tienen un módulo PSI en su extremo C, por lo tanto los inventores continuaron el análisis de unión usando Met Decoy, Sema-PSI, e IPT.
Para determinar la afinidad de cada módulo Met para pro-HGF, HGF-α , HGF NK1 y HGF-βy para compararla con la de HGF activo, receptores modificados por ingeniaría genética se inmovilizaron en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de ligandos marcados con MYC. La unión se reveló usando anticuerpos anti-MYC. La unión no específica se determinó usando la proteína angiostatina (AS) que contenía kringle también marcada con epítopo MYC en fase líquida. Pro-HGF, cadena α de HGF y HGF NK1, que representa el modulo de unión Met mínima de la cadena α de HGF, que se une a Met Decoy con una afinidad 3-, 4-y 10-veces reducida comparada con HGF activo, respectivamente (Figura 2B). La unión de HGF-βa Met Decoy (o a cualquier otro dominio Met) era demasiado bajo para detectarse en este tipo de ensayo. Sema-PSI unido a una afinidad significativa para activar HGF solamente, mientras que la unión a pro-HGF, HGF-αo HGF NK1 era indistinguible de la unión no específica (Figura 2C). Por el contrario, IPT unido a HGF activo, pro-HGF y HGF-αcon la mismcon alta afinidad (Figura 2D). HGF NK1 unido a IPT 10 veces menos firmemente que HGF activo, es decir, con la misma afinidad que se une a Met Decoy. Estos datos sugieren que la región IPT de Met se une a la cadena α de HGF con alta afinidad independientemente del procesamiento proteolítico del ligando.
La cadena α de HGF se une a los dominios ITP 3 y 4 con alta afinidad
La región IPT de Met se extiende por aproximadamente 400 aminoácidos y contiene cuatro dominios IPT. Para mapear más exactamente la interfase IPT-HGF, se modificaron por ingeniería genética una serie de variantes de IPT que se suprimieron en uno o más dominios (Figura 3A). IPT ∆1 e IPT ∆1-2 son dos formas suprimidas Nterminal de IPT que carecen del primer o o de los dos primeros dominios de tipo inmunoglobulina, respectivamente. IPT-3 e IPT-4 corresponden a los dos dominios de tipo inmunoglobulina C-terminales expresados como proteínas individuales. La producción y purificación de proteínas se realizó como se ha descrito anteriormente. Se investigó la capacidad de los IPT modificados por ingeniería genética interaccionan con la cadena α de HGF en ensayos de unión de ELISA usando la región completa de IPT como un control. IPT, IPT ∆1, IPT ∆1-2, IPT-3 e IPT-4 se inmovilizaron en fase sólida y se expusieron a concentraciones crecientes de HGF-α . La unión se reveló usando anticuerpos anti-HGF. La unión no específica se midió usando BSA como antes. Como se muestra en la Figura 3B, la supresión de los dos primeros dominios de tipo inmunoglobulina no afectaron sustancialmente a la unión de HGF.
De hecho, IPT ∆1-2, una proteína que corresponde a los dos últimos dominios de tipo inmunoglobulina de Met, unidos a la cadena α de HGF con resistencia igual si no más alta que IPT. Sin embargo, la supresión adicional de
o bien el tercero o cuarto dominio de tipo inmunoglobulina casi alteraban completamente la unión de HGF-α. Resultados similares se obtuvieron usando HGf activo o pro-HGF en lugar de HGF-α . Estos datos sugieren que los dos últimos dominios de tipo inmunoglobulina de Met, que caen cerca de la hélice transmembrana en el contexto de un auténtico Met, son suficientes para la unión de la cadena α de HGF con alta afinidad.
Los dominios IPT 3 y 4 son suficientes para la unión a HGF en células vivas.
Para determinar si HGF se puede unir a IPT 3 y 4 en el contexto de un receptor anclado a membrana, una proteína Met que lleva una gran supresión en la región extracelular se modificó por ingeniería genética. Los aminoácidos 25 741, que corresponden al dominio Sema (aa 25 -515), el dominio PSI (aa 516 -562) y los dos primeros dominios IPT (IPT 1 y 2, aa 563 -741) se suprimieron generando un receptor recombinante que contiene los dominios 3 y 4 de IPT, la hélice transmembrana y la región citoplásmica completa (Figura 4A). El ADNc que codifica el receptor Met∆25-741 modificado por ingeniería genética se subclonó en el mismo vector lentiviral descrito anteriormente. Se usaron partículas lentivirales recombinantes para transducir la línea celular de carcinoma de ovario TOV-112D, que carece de expresión endógena de Met como se determina por análisis de RT-PCR (Michieli, P., et al. (2004) Cancer Cell 6 (1), 61 -73). El análisis de biotinilación de superficie reveló que Met∆25-741 se expresó apropiadamente y se expresó sobre la membrana de células TOV-112D (Figura 4B).
Para examinar si Met∆25-741 se puede unir a HGF, células transducidas por el vector lentiviral se incubaron en presencia o ausencia de HGF recombinante y posteriormente se trataron con el agente de reticulación BS3. Los lisados celulares se inmuno-precipitaron con un anticuerpo inducido contra la parte C-terminal de Met, se resolvieron por SDS PAGE y se analizaron por transferencia de Western usando anticuerpos anti-HGF biotinilados. Como control, se realizó el mismo análisis sobre células TOV-112D naturales. Las inmunotransferencias mostraron una banda distinta con un peso molecular de aproximadamente 180 kD en la banda correspondiente a células que expresan Met∆25-741 tratadas con HGF pero no en las bandas que corresponden a las mismas células sin HGF o para las células TOV-112D naturales, o bien en la presencia o ausencia del ligando (Figura 4C). Considerando que tanto Met∆25-741 como HGF tienen un peso molecular de aproximadamente 90 kDa, la proteína reticulada inmunoprecipitada es compatible con un complejo formado por HGF más Met∆25-741.
La unión de HGF a los dominios ITP 3 y 4 da como resultado activación de Met en células vivas.
Los inventores a continuación ensayaron si la unión de HGF a Met∆25-741 puede inducir la activación de quinasa de Met. Con este fin, células TOV-112D transducidas por vector lentiviral se estimularon con pro-HGF o HGf activo, y los lisados de células se inmunoprecipitaron con anticuerpos anti-Met como antes. La activación del receptor se determinó por análisis de transferencia de Western usando anticuerpos anti-fosfotirosina. Las mismas transferencias se volvieron a sondar con anticuerpos anti-Met para normalizar la cantidad de receptor inmunoprecipitado. De manera notable, tanto pro-HGF como HGf activo eran capaces de inducir la fosforilación robusta de Met∆25-741 (Figura 4D). Ya que la unión de pro-HGF a Met de tamaño completo no induce la activación de quinasa, esto sugiere que el dominio Sema ejerce de alguna manera un efecto auto-inhibidor sobre la actividad catalítica de Met que se libera tras la unión a HGf activo. La estimulación del receptor también se realizó usando HGF NK1 y un ligando dimérico modificado por ingeniería genética constituido por dos fragmentos NK1 repetidos en tándem (NK1-NK1; Figura 4E). Como se muestra en la Figura 4D, NK1-NK1 la estimulación de células TOV-112D transducidas por el vector lentiviral dio como resultado una fosforilación potente de Met∆25-741, mientras que la estimulación NK1 monomérica no tenía efecto. Estos resultados sugieren que los dos dominios de IPT C-terminal de Met (IPT 3 y 4) son suficientes para unirse a HGF (y más precisamente a HGF NK1 que representa el módulo de unión de Met mínima en la cadena α de HGF) y para transmitir la señal para la activación del receptor al dominio quinasa citoplasmático, presumiblemente después de la dimerización del receptor inducido por ligando. Sin embargo, también sugieren que IPT 3 y 4 solos no son suficientes para distinguir la forma biológicamente activas de HGF de su precursor inactivo, pro-HGF.
IPT soluble inhibe el crecimiento invasivo inducido por HGF in vitro.
En un estudio previo, se ha demostrado que la parte extracelular de Met expresada como una proteína soluble (Met Decoy) inhibe el crecimiento invasivo inducido por HGF tanto in vitro como en modelos de ratón de cáncer (Michieli
P. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 61-73). También se mostró que Sema-PSI inhibe la fosforilación de Met tanto dependiente como independiente de ligando (Kong-Beltran M. et al. (2004) Cancer Cell 6(1), 75-84). Basándose en estos resultados, se ha ensayado si IPT soluble mostró actividad antagonista HGF/Met en células vivas. Células de melanoma humano MDA-MB-435, que expresan Met y son un modelo de sistema establecido para análisis de crecimiento invasivo mediado por HGF, se transdujeron con vectores lentivirales que codifican Met Decoy soluble, Sema-PSI o IPT. Las células transducidas con un vector vacío se usaron como control. Células transducidas por el vector lentiviral que secretan niveles comparables de factores solubles (aproximadamente 50 pmol/106 células/24 horas) se privaron de suero durante varios días, permitiendo que los factores recombinante se acumulen en el medio, y después se estimularon con HGF recombinante. La fosforilación de Met tirosina se determine mediante inmunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Figura 5A, tanto de IPT como Sema-PSI inhibían parcialmente la fosforilación de Met inducida por HGF, mientras Met Decoy neutralizaban completamente la capacidad de HGF para inducir la activación de Met. El vovel a sondar las mismas inmunotransferencias con anticuerpos dirigidos contra la cola C-terminal de Met no reveló diferencia sustancial en las cantidades de proteína inmunoprecipitada.
Para ensayar la capacidad inhibidora de ectodominios Met en un planteamiento más biológico, se emplearon las mismas células para realizar un ensayo de morfogénesis de ramificación dependiente de HGF. Los esferoides de células formados previamente se sembraron en una matriz de colágeno de tres dimensiones y después se estimularon con HGF recombinante para formar estructuras tubulares. La ramificación se cuantificó mediante puntuación del número medio de túbulos que brotan de cada colonia. Como se muestra en la Figura 5B, tanto IPT soluble como Sema-PSI inhibían la ramificación de las colonias inducidas por HGF (Vector vacío, 17,5 túbulos/colonia; IPT, 4,0 túbulos/colonia; Sema-PSI, 6,7 túbulos/colonia). Sin embargo, consistente con los resultados obtenidos en los experimentos de fosforilación, Met Decoy era un inhibidor más potente de HGF que cualquiera de sus subdominios (2,5 túbulos/colonia). Imágenes representativas de la morfología de colonia se muestran en la Figura 5C.
IPT soluble muestra actividad anti-tumor y anti-metastática en ratones.
Los resultados anteriores sugirieron a los presentes inventores explorar el potencial terapéutico de IPT soluble en modelos de ratón de cáncer. Células de melanoma MDA-MB-435 transducidas por el vector lentiviral se inyectaron por vía subcutánea en ratones CD-1 nu-/-, y se controló el crecimiento del tumor con el tiempo. Después de aproximadamente tres semanas, se extrajeron tumores para análisis, y se sometieron los ratones a autopsia. En un análisis de tipo Kaplan-Meier, cuando el porcentaje de animales sin tumor se representa gráficamente frente al tiempo y la latencia de tumor se cuantifica calculando la mediana en días, todos los receptores solubles modificados por ingeniería genética retrasaron la aparición de tumores experimentales. Sin embargo, IPT era ligeramente más eficaz que Sema-PSI y Met Decoy era más potente que o bien IPT o Sema-PSI (Figura 6A). El análisis de la masa tumoral con el tiempo reveló que IPT era solamente menos eficaz que Met Decoy, mientras Sema-PSI inhibía el crecimiento neoplásico solamente durante las etapas muy tempranas del experimento (Figura 6B). El análisis inmuno-histoquímico de la expresión transgénica mostró que Met Decoy, Sema-PSI e IPT alcanzaron niveles y distribución similares en tumores (Figura 6C).
Como el HGF es un potente factor pro-angiogénico, se ha determinado si la inhibición de HGF/Met en tumores da como resultado una alteración en la angiogénesis. Se analizaron secciones de tumor por inmuno-histoquímica usando anticuerpos contra factor Von Willebrand, y se determinó la densidad de vasos por microscopía (Figura 6D). IPT disminuyó la densidad de vasos de tumores en 1,5 veces, mientras que Met Decoy logró una inhibición más fuerte (aproximadamente 4 veces); Sema-PSI no afectaba significativamente a la angiogénesis de tumor. Tras la autopsia, se extrajeron los pulmones de los ratones descritos anteriormente y se procesaron para histología. Las secciones de pulmón en serie se tiñeron con hematoxilina y eosina, y se analizaron por microscopía para determinar la presencia de micrometástasis. Los resultados se muestran en la Figura 6A. En el grupo de control, 4 de 6 ratones (67%) tenían micrometástasis. En el grupo IPT y Sema-PSI, se puede encontrar micrometástasis en solamente 1 de 6 ratones (17%), mientras no se puede encontrar metástasis en el grupo Met Decoy. Las lesiones metastásicas eran tanto parenquimales (extravasculares) como embolicas (intravasculares; véase la Figura 6F para las imágenes representativas).
La identificación del sitio de unión de alta afinidad HGF en el HGFR proporcionada en la presente descripción permite el diseño de procedimientos novedosos que conducen a la generación de inhibidores/antagonistas más específicos de HGF y de HGFR. Los siguientes son ejemplos no limitantes de procedimientos novedosos para la identificación de inhibidores/antagonistas de HGF/HGFR que se dirigen el sitio de unión de alta afinidad de HGFR o la utilización del sitio de unión de alta afinidad de HGFR como una herramienta para generar inhibidores/antagonistas novedosos.
Desarrollo de un anticuerpo monoclonal que se une a los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR que evitan la unión de HGF
Dada que la interacción de HGF con los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 es esencial para la unión de alta afinidad de HGF, se pueden generar anticuerpos monoclonales que se unen a IPT-3 e IPT-4 y compiten con HGF para la unión de HGFR. Esto se puede lograr mediante varias estrategias.
(A) Una proteína o péptido recombinantes derivados de IPT-3 e IPT-4 se genera mediante tecnología de modificación por ingeniería genética convencional o síntesis química. Esta proteína o péptido se inyecta en un animal de laboratorio apropiado (usualmente un ratón o rata) para dar lugar a una reacción inmune. Después se aislaron esplenocitos del animal inmunizado y se fusionó a una línea celular de mieloma, y se seleccionaron clones de hibridoma que producen anticuerpo mediante tecnología de anticuerpos monoclonales. Después se seleccionan anticuerpos dirigidos contra IPT-3 e IPT-4 por un procedimiento ELISA similar a los descritos a en esta descripción que utiliza IPT-3 e IPT-4 recombinantes en fase sólida y anticuerpos producidos por hibridoma en fase líquida. Unión se revela usando anticuerpos de inmuno-globulina anti-ratón que están disponibles comercialmente. De manera alternativa, se seleccionan anticuerpos por su capacidad para desplazar HGF recombinante (en fase líquida ) de IPT-3 e IPT-4 (en fase sólida), o por su capacidad para inmunoprecipitar proteínas recombinantes IPT-3 e IPT
4.
- (B)
- Una secuencia de polinucleótidos que codifica IPT-3 e IPT-4 insertada en un vector de expresión apropiado se inyecta directamente en un animal de laboratorio para proporcionar una respuesta inmune contra el producto génico. Anticuerpos dirigidos contra IPT-3 e IPT-4 después se aíslan y se seleccionan como se ha descrito anteriormente.
- (C)
- Una secuencia de polinucleótidos que codifica IPT-3 e IPT-4 insertada en un vector de expresión apropiado se transfiere en una línea celular de mamífero que no expresa HGFR para obtener la expresión de IPT-3 e IPT-4 sobre la superficie celular. Las células que expresan IPT-3 e IPT-4 se inyectan después en un animal de laboratorio para dar lugar una respuesta inmune, y anticuerpos dirigidos contra IPT-3 e IPT-4 se aíslan y se seleccionan como se ha descrito anteriormente.
- (D)
- Una genoteca de anticuerpos nativos generada por técnicas de modificación por ingeniería genética convencionales (por ejemplo por tecnología conocida como despliegue en fago) de linfocitos de mamíferos (preferiblemente humanos, por ejemplo de linfocitos que infiltran un tumor que expresan HGFR) se selecciona usando proteínas IPT-3 e IPT-4 recombinantes. Los clones positivos (es decir, los clones que se unen a IPT-3 e IPT-4 con alta afinidad) después se aíslan, se expanden y el anticuerpo se caracteriza bioquímicamente.
- (E)
- Se aíslan linfocitos B de memoria humana de la sangre periférica de un paciente que alberga un tumor que expresa HGFR como se describe por diversos estudios que incluyen Traggiai E. et al. (2004) Nat Med. 10 (8), 871
875. una vez que los cultivos inmortalizados de los linfocitos B de memoria se han establecido, los expertos en la técnica pueden seleccionar linfocitos que secretan un anticuerpo dirigido contra IPT-3 e IPT-4 usando los procedimientos descritos en el presente documento anteriormente (A). Habiendo identificado tales linfocitos que producen anticuerpo, el anticuerpo deseado se puede clonar por la reacción en cadena de la polimerasa y procedimientos de modificación por ingeniería genética convencionales.
Identificación de un compuesto de ensayo que se une a dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR que inhiben la actividad de HGFR
Con un planteamiento diferente, es posible aislar los compuestos de ensayo de diverso origen que se une al sitio de unión de alta afinidad de HGF de HGFR e interfieren con la activación de HGFR inducida por HGF. Esto se puede lograr mediante varias estrategias.
- (A)
- Usando ensayos ELISA similares a los descritos en esta descripción, los expertos en la técnica pueden seleccionar una genoteca de compuestos (que incluye pero no se limita a una biblioteca química sintética, una genoteca de compuestos naturales, una genoteca de moléculas pequeñas, una biblioteca de péptidos) para agentes que desplazan la interacción de HGF con IPT-3 e IPT-4. En este tipo de ensayos, proteína de IPT-3 e IPT4 recombinante se inmoviliza en fase sólida y se incuba con una cantidad fija de HGF en fase líquida . Después de la exposición a los compuestos de la biblioteca, se mide la unión de HGF con anticuerpos anti-HGF comercialmente disponibles.
- (B)
- Usando una línea celular que expresa una forma modificada por ingeniería genética del HGFR que no contiene
nada excepto los dominios IPT-3 e IPT-4 en la parte extracelular similar a la descrita en esta descripción (Met∆25741), un experto en la técnica puede seleccionar una biblioteca de compuestos (que incluye pero no se limita a una biblioteca química sintética, una biblioteca de compuestos naturales, una biblioteca de moléculas pequeñas, una biblioteca de péptidos) para agentes que desplazan la interacción de HGF con IPT-3 e IPT-4 o inhiben la activación de HGFR inducida por HGF. Esto se puede lograr poniendo en contacto dichas células modificadas por ingeniería genética con la biblioteca y después midiendo la fosforilación de HGFR inducida por HGF como se describe en el presente estudio, o por otros medios que revelan la activación de HGFR incluyendo un ensayo de dispersión, un ensayo de invasión de matriz reconstituida, un ensayo de morfogénesis de ramificación, un ensayo de supervivencia de células u otros ensayos biológicos in vitro como se describe en Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6 (1), 61 -73.
- (C)
- Usando la línea celular modificada por ingeniería genética descrita anteriormente, un experto en la técnica puede seleccionar una genoteca (que incluye pero no se limita a una genoteca de expresión de ADNc, una genoteca de ARN de horquilla corta, una genoteca de ADN no codificante, una genoteca de nucleótidos al azar) para los polinucleótidos o productos génicos que desplazan la interacción de HGF con IPT-3 e IPT-4 o inhiben la activación de HGFR inducida por HGFR. Esto se puede lograr mediante transfección, transducción o de cualquier modo introducción de la genoteca de nucleótidos en dichas células y después el ensayo de la capacidad de HGF de activar la forma suprimida de HGFR expresada por las mismas células. La activación de HGFR se mide como se describe en (B).
Ensayos funcionales ejemplares que miden la actividad biológica de los compuestos que se unen a dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 de HGFR
Cualquiera que sea la estrategia empleada para generar anticuerpos anti-IPT o compuestos de unión de IPT, el producto final (es decir, anticuerpos monoclonales dirigidos contra IPT-3 e IPT-4 o compuestos naturales o sintéticos que se unen a IPT-3 e IPT-4) se somete después a ensayos biológicos con el deseo de determinar si estos agentes tienen la capacidad de interferir con la actividad de HGFR. Estos ensayos se pueden realizar in vitro usando células de mamífero cultivadas o in vivo usando animales de laboratorio.
- (A)
- ensayo de dispersión. Células epiteliales que crecen en colonias compactas en una placa Petri y que expresa HGFR se inducen para ’dispersión’ mediante estimulación con HGF. Como resultado de la estimulación de HGF, las células en la placa Petri parecen más separadas y dispersas. Este ensayo se puede realizar en la presencia de varios compuestos de ensayo. Entre los compuestos ensayados, se puede identificar un inhibidor / antagonista de HGF/HGFR por la ausencia de un fenotipo dispersado en la respuesta a la estimulación de HGF.
- (B)
- Ensayo de migración de células. Las células que expresan HGFR tienen la capacidad de migrar hacia gradiente de HGF. En otras palabras, las células se traen por quimiotaxis hacia mayores concentraciones de HGF. Esta capacidad se puede explotar para seleccionar inhibidores de HGF en un ensayo de cámara de Boyden. Las células se sembraron en la primera cámara y se aplicó HGF en la segunda cámara que está separada de la primera por una membrana porosa. Las células migran a través de la membrana y alcanzan la segunda cámara donde el HGF está más concentrado. Los agentes que inhiben este proceso se identifican como inhibidores/antagonistas de HGF/HGFR.
- (C)
- Ensayo de migración de Transwell™ o ensayo de matriz reconstituida. Este es una variación del ensayo descrito en (B) en el que la membrana porosa se cubre con una capa de colágeno, Matrigel™, u otras matrices orgánicas reconstituidas. Las células tienen que digerir la matriz orgánica con el fin de migrar a través de ella. Éste es un ensayo más riguroso que mide la invasión mejor que la simple migración de células.
- (D)
- Ensayo de invasión de colágeno o ensayo de morfogénesis de ramificación. En este ensayo, células de mamífero que expresan HGFR (preferiblemente células epiteliales o células de carcinoma) se siembran en una capa tridimensional de colágeno y después se dejan crecer hasta que forman esferoides de aproximadamente
1.000 células cada uno. De manera alternativa, se pueden formar previamente esferoides primero mediante incubación de las células durante toda una noche en placas de 96 pocillos no adherentes en la presencia de metilcelulosa como se describe en Michieli, P. et al. (2004) Cancer Cell 6 (1), 61 -73. Una vez que se embeben los esferoides en la capa de colágeno, se estimulan con HGF y se incuban a 37°C. Esto da como resultado el brote de túbulos huecos de los esferoides; cada túbulo está formado por varias células organizadas en una estructura tubular y polarizada de manera que exista un lado de la célula que ve el lumen y un segundo lado que mira el exterior del medio. A medida que el ensayo progresa los túbulos tienden a ramificarse y a formar una arquitectura más compleja. Este ensayo es altamente específico para HGF. Los agentes que inhiben este proceso tienen una alta probabilidad de representar antagonistas HGF/HGFR muy específicos.
(E) Ensayo mitogénico. El HGF tiene la capacidad de inducir la replicación del ADN y división celular en alguna célula que expresa HGFR. Las células más sensibles son ciertamente hepatocitos primarios, usualmente ratón o rata. Para ensayar la replicación de ADN inducida por HGF, células se privan de factores de crecimiento en suero y
después se estimulan con concentraciones crecientes de HGF. Poco tiempo después, se añade timidina radioactiva y las células se incuban a 37°C durante aproximadam ente un día. Después de un lavado extensivo y fijación, se mide la timidina radioactiva incorporada en el ADN de la célula mediante recuento por centelleo líquido u otros procedimientos convencionales que permiten la cuantificación de la radiación.
- (F)
- Ensayo se supervivencia. El HGF tiene la capacidad de proteger células que expresan HGFR contra la apoptosis o muerte celular programada. Esto se puede explotar para medir la actividad de HGFR en un ensayo de supervivencia. Células se incuban previamente con HGF y el compuesto de ensayo (inhibidor de HGFR potencial), y después se somete a un estímulo apoptótico tal como un fármaco tóxico, ausencia de adherencia, hipoxia, cloque térmico, radiación, o daño de ADN. Después de un intervalo de tiempo apropiado, se mide la muerte cellular mediante procedimientos convencionales que incluyen TUNEL (Marcado del extremo Nick biotina-dUTP desoxinucleotidil transferasa Terminal), nucleosomas, fragmentación de ADN, actividad caspasa, tinción por colorante vital o cualquiera de sus variaciones.
- (G)
- Ensayo de tumorigénesis en ratón. En este tipo de ensayo, la actividad de un inhibidor potencial de HGF/HGFR se ensaya directamente en un animal de laboratorio, preferiblemente un ratón o rata. Existen varios procedimientos para obtener un tumor en un ratón. La estrategia más utilizada es crear un heterotransplante, es decir, transplantar células tumorales (usualmente de origen humano) en un receptor animal (usualmente un ratón inmunodeficiente). Las células se pueden implantar por vía subcutánea (un procedimiento rápido y simple para obtener un tumor experimental) u ortotópicamente, es decir, en el mismo órgano en el que la célula tumoral se ha aislado (por ejemplo un carcinoma de mama en la almohadilla grasa mamaria, un carcinoma de colon en la mucosa del intestino, un hepatocarcinoma en el parénquima hepático y así sucesivamente). Cualquiera que sea el procedimiento empleado, inyección de células tumorales en un animal de laboratorio da lugar a un tumor experimental. Este animal que porta tumor se puede usar ahora para evaluar el potencial anti-tumor de los compuestos de ensayo. Los anticuerpos ati-HGF/HGFR o compuestos se pueden administrar a un animal que porta una lesión tumoral con señalización sin regulación de HGF/HGFR por el procedimiento existente más apropiado incluyendo inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, bomba osmótica, administración oral, supositorio, protocolo de terapia génica, administración local y así sucesivamente. Después de un período de tratamiento apropiado, el animal se sacrifica y su tumor y órganos se explantan para análisis.
- (H)
- Ensayo de metastogénesis en ratón. La metástasis experimental se puede inducir en un ratón mediante inyección sistémica de células tumorales. Éstas estaban atrapadas en los capilares pulmonares y posteriormente se extravasaron para dar lugar aa metástasis pulmonar. Éstas se pueden medir tras la autopsia mediante varios planteamientos incluyendo microscopía, análisis histológico, procedimientos inmuno-histoquímicos, formación de imágeens de cuerpo entero. Los compuestos de ensayo se se administran como se describe en (G).
- (I)
- Protocolo de terapia génica. En el caso que el inhibidor de HGF/HGFR sea un anticuerpo, una proteína recombinante, un péptido o un ARN pequeño de interferencia, la administración al animal que lleva un tumor se puede lograr mediante un planteamiento de terapia génica. Esto consiste en introducir el polinucleótido deseado en el vector de distribución adecuado que se puede elegir entre vectores lentivirales, vectores adenovirales, vectores retrovirales, ADN desnudo o cualquiera de sus variaciones. La preparación del vector se puede administrar sistémicamente o localmente al tumor dependiendo del sitio del tumor, sobre el vector o sobre el histotipo del tumor. Los efectos biológicos de la terapia génica se analizan como se ha descrito para otros compuestos en (G).
LISTADO DE SECUENCIAS
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<120> Sitio de unión de alta afinidad de HGFR y procedimientos para la identificación de antagonistas del mismo
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<212> ADN
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<220>
<223> Secuencia de codificación de Met Decoy_FLAGhis
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> Marca poli-histidina 15 <400> 21
LISTADO DE SECUENCIAS
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<400> 21
Claims (11)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Uso de un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer.
-
- 2.
- Uso de un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para la selección de agentes farmacológicamente activos útiles en el tratamiento de cáncer.
-
- 3.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente farmacológicamente activo interfiere con la actividad catalítica, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
-
- 4.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho agente farmacológicamente activo regula por disminución la actividad catalítica, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
-
- 5.
- Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente farmacológicamente activo es un inhibidor y / o antagonista del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
-
- 6.
- Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho agente farmacológicamente activo se selecciona entre inhibidores de moléculas pequeñas, aptámeros, nucleótidos no codificantes, inhibidores a base de ARN, ARNsi, anticuerpos, péptidos, negativos dominantes.
-
- 7.
- Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el cáncer es un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
-
- 8.
- Un procedimiento para detectar la capacidad de un agente de ensayo para actuar como un antagonista/inhibidor del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos útil en el tratamiento de cáncer, preferiblemente un cáncer con disregulación de la actividad del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, que comprende las etapas de:
- (a)
- poner en contacto un agente de ensayo con i) un polinucleótido que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, ii) un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, o iii) células que expresan los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4, la hélice transmembrana y la región citoplásmica completa del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos,
- (b)
- medir la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos, y
- (c)
- seleccionar el agente que reduce la actividad, función, estabilidad y / o expresión del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos.
-
- 9.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha medición de en la etapa b) comprende medir la señalización de las células, supervivencia celular, y proliferación celular.
-
- 10.
- Los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para uso como un medicamento para tratamiento de cáncer.
-
- 11.
- Vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido constituido por los dominios extracelulares IPT-3 e IPT-4 del receptor del factor de crecimiento de los hepatocitos para uso como un medicamento para tratamiento de cáncer.
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