BRPI0902426A2 - processo de tratamento de tecidos de carbono para obtenção de biocatodo ou bioanodo - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE TRATAMENTO DE TECIDOS DE CARBONO PARA OBTENçãO DE BIOCATODO OU BIOTODO. A presente invenção se refere ao processo de tratamento dos tecidos de carbono (TCs) carboxilados previamente em ácido nítrico em refluxo para a preparação de monocamada de azul de metileno ou seu derivado (azure A, B ou C) adsorvido ou ligado com carbodimida, seguido da deposição da enzima e sua imobilização com glutaraldeido na presença de solvente polar. Nesta invenção são utilizados os extratos enzimáticos de lacase do cogumelo Shiitake (Lentinula edodes), peroxidase (Curcubita pepo) e álcool desidrogenase da levedura (Saccharomices cerevisae) . A densidade de energia da biocélula a combustível se encontra preferencialmente entre 0,1 e 5,0mW.cm^-2^ e a densidade de corrente elétrica se encontra preferencialmente entre 0,1 e 20,0mA.cm^-2^.
Description
PROCESSO DE TRATAMENTO DE TECIDOS DE CARBONO PARA OBTENÇÃO DEBIOCATODO OU BIOANODO
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere ao tratamento dos tecidosde carbono (TCs) carboxilados previamente em ácido nitricosob refluxo, seguido de deposição e imobilização de enzimapara a obtenção de biocatodo ou bioanodo de biocélula acombustível.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A necessidade mundial de novas fontes renováveis deenergia está provocando uma evolução na área de células acombustível com uso de platina ou outros metais raros. Apesarde serem eficientes geradores de energia elétrica a partir deprocessos químicos, esse tipo de célula a combustível possuialguns problemas dificílimos de resolver que são: 1) altocusto da platina, 2) envenenamento da platina com CO e H2S,3) a não seletividade da platina e 4) alto custo e baixaquantidade de minério da platina.
A biocélula a combustível é uma classe especial decélulas a combustível onde se usa um biocatalisador, tal comomicroorganismos ou enzimas, ao invés de metais inorgânicoscomo catalisador das reações. Neste tipo de biocélula, obiocatalisador está diretamente envolvido na reação de óxido-redução ou na cadeia para geração de eletricidade.Preferivelmente, nos biocatalisadores, as enzimas sãoimobilizadas em eletrodos para facilitar o uso repetido doscatalisadores. 0 combustível é oxidado enzimaticamente peloanodo, produzindo prótons e elétrons. No catodo, o oxidante(geralmente oxigênio ou peróxidos) reage com elétrons eprótons. Um desafio crítico no desenvolvimento deste tipo debiocélula direta é a ineficiente condução de elétrons entre obiocatalisador e eletrodos, e prótons da membrana protônicaao biocatalisador.
As biocélulas a combustível enzimáticas têm as seguintescaracterísticas: (1) Enzimas são catalisadores totalmenterenováveis, e sua produção pode atender uma demanda crescentede biocélulas a combustível; (2) A produção em massa dessasenzimas pode reduzir muito mais que a platina; (3) Eletrodosenzimáticos não podem ser envenenados por contaminantes comomonóxido de carbono (CO) e sulfeto de hidrogênio (H2S)presentes em combustíveis baratos; (4) Essas enzimascatalisam somente suas reações específicas, o vazamentoinevitável dos gases ou reagentes na parte oposta dabiocélula a combustível não reduz sua eficiência; e (5)existem nessas enzimas alguns poucos sítios de entrada ousaída de elétrons, assim como do(s) substrato(s) e do(s)produto (s) para chegar ao centro da reação enzimática. Asenzimas ou biocatalisadores preferem principalmente atemperatura ambiente ao passo que reações de catalisadoresmetálicos numa célula a combustível geralmente requertemperaturas elevadas (>80°C).
A transferência direta de elétrons (Direct ElectronTransfer, DET) entre uma enzima e o eletrodo pode serobservada em várias enzimas, tais como citocromo c, lacase,hidrogenase e inúmeras peroxidases, incluindomicroperoxidases (Varfolomeev et al., 1996; Ghindilis et al.,1997; Schuhmann et al., 2003). O contato próximo dos sítiosativos da enzima com a superfície do eletrodo é crítico paraa DET. Para a lacase catalisar diretamente o oxigênio naeletroredução, a distância crítica entre os sítios ativos daenzima e a superfície do eletrodo deve ser em torno de 20Â(Yaropolov et al., 1981). Uma separação superior a essadistância crítica atenua a reação global, que é determinadapela taxa de condução eletrônica; ao passo que a umadistância mais próxima, a condução eletrônica se torna tãoeficiente que a cinética da reação enzimática torna-se umamedida fundamental. Um fenômeno similar refere-se àperoxidase de rabanete, onde a distância crítica é de 18Â(Kulys and Smalius, 1984).
No entanto, em alguns outros casos, a DET é determinadapela espessura e não pela condutividade da membrana protéicaonde se localizam os sítios ativos de uma enzima. Paratranspor essa barreira, as enzimas podem ser transformadaspara torná-las condutoras através de uma modificação química(Willner et al., 1996; Guiseppi-Elie et al., 2002; Zhao etal., 2002; Cai e Chen, 2004). Outra estratégia conhecida é ouso de mediadores para reação de redução, que facilita otransporte de elétrons por transferências (shuttling) entreos sítios ativos da enzima e a superfície do eletrodo. Essaabordagem tem sido relatada para ambas biocélulas, microbianae enzimática (Lewis 1966; Govil e Saran, 1982; Palmore eWhitesides 1994; Katz et al., 2003). Apesar dos mediadoresintroduzirem mais um passo na reação de redução do"combustível" para a geração de elétrons, uma melhoreficiência da biocélula a combustível geralmente pode serobservada. Um dos desafios para o uso de um mediador, quegeralmente são pequenos e difusos, é a forma de conservá-lona biocélula a combustível onde é necessária uma alimentaçãocontínua do sistema.
A fraca densidade de carga e o curto tempo de vida sãodois problemas adicionais para a real aplicação dasbiocélulas a combustível. Para solucionar esses problemas,muito esforço e significantes melhoras foram realizados naúltima década. Por exemplo, a glicose oxidase (GOx) e amicroperoxidase-11 foram colocadas em monocamadas em umeletrodo de ouro em discos de 0,4 cm de diâmetro aplicadosnuma biocélula a combustível de glicose/peróxido de cumeno(Katz et al., 1999). Uma potência de 520 μΐΐ foi produzida,que corresponde a 4,1 W/cm2, baseando-se na área projetada doeletrodo. Uma melhora da densidade de carga por volume oupeso foi obtida com a miniaturização da biocélula deGlicose/02 (Heller, 2004). Neste trabalho, enzimas como GOx ebilirubina oxidase (BOd) foram introduzidas no ósmio (Os) -contendo polímeros redutores na superfície de duas fibras decarbono de 7μπι. Isto gerou uma potência de 4,3μ!/\/, num volumetotal de fibras de 0, 0026 mm3, representando 1,65 μΐΛ//ιηιη3. Emoutro estudo, verificou-se um aumento do tempo de vida de 45dias com enzimas introduzidas em uma membrana de Nafion®modificada (Minteer et al., 2004; Moore et al., 2004).
Notavelmente ocorreram melhorias, principalmente atravésda escolha adequada do material dos eletrodos e nos meios deimobilização enzimática para promover a comunicação entreenzimas e eletrodos. Estudos continuam sendo realizados paradesenvolver biocélulas a combustível mais eficientes. Estima-se que o desempenho catalítico de biocatalisadores pode vir ase tornar a questão mais importante para o êxito da aplicaçãode biocélulas a combustível.
A imobilização de enzimas pode ser química ou física. Amaioria das biocélulas enzimáticas é construída comimobilização física de enzimas, que é um método comum paraadsorver a enzima em partículas condutoras, tais como negrode carbono ou pó de grafite. As hidrogenases e as lacases têmsido adsorvidas fisicamente em partículas de negro de carbonopara construir o eletrodo composto (Tarasevich et al., 2002).Pizzarielo et al. (2002) demonstraram uma biocélula acombustível Glicose/H202 usando ferrocianeto - eletrodomodificado. GOx e peroxidase de rabanete (horseradishperoxidase, HRP) foram primeiras adsorvidas em partículas degrafite sintético, e essas enzimas adsorvidas foram suspensasem 2-hexadecano e ferrocianeto, numa solução de clorofórmio.0 eletrodo foi preparado por borrifamento de impressão emsuspensão no substrato de poliéster. A biocélula ficoutrabalhando continuamente durante 30 dias com uma quedadesprezível na tensão, ainda que a potência fosse baixa.
Outra abordagem para a imobilização física é oaprisionamento de enzimas em matrizes poliméricas, quegeralmente retém melhor a enzima do que a adsorção nasuperfície do eletrodo. 0 documento US2004/0101741, publicadoem 27 de maio de 2004, para Minteer et al., "Enzymeimmobilization for use in biofuel cells and sensors, revelaum método para aprisionar a enzima na membrana de Nafion®. Deacordo com este método, a desidrogenase dependente de NAD+(tais como, álcool desidrogenase, aldeído desidrogenase,formaldeido desidrogenase, glicose desidrogenase e lactodesidrogenase) foi misturada fisicamente com brometo detetralquilamônio - solução.de Nafion® modificado, ao qual foientão adicionado o verde-metileno e colocado sobre o eletrodode carbono vitreo. A imobilização da enzima foi feita a 140°Cpor 25 min. 0 cofator NAD+ foi co-imobilizado através datroca iônica na membrana de Nafion®, modificando o eletrodode carbono vitreo. Curiosamente, não houve diferença daatividade enzimática antes e depois do tratamento com calor.Uma biocélula a combustível de Et0H/02 foi construída usandoeste método gerando uma densidade de carga tão elevada quanto2,04 pW.cm-2. Medidas de voltametria cíclica indicaram que atransferência de massa, não a cinética de reação, é o fatorlimitante em tal biocélula a combustível.
O documento US 2005/00954 66, publicado em 05 de Maio de2005, para Minter et al. , "Immobilized enzymes inbiocathodes", revela o aprimoramento de uma biocélula acombustível que contém um cátodo compreendendo uma membranacom dupla função, estas compreendendo uma enzima oxigêniooxidoredutase imobilizada em compartimento tamponado damembrana e um mediador de transporte de elétrons a partir deum eletrodo condutor de . elétrons para uma reação redoxcatalisada por uma enzima oxigênio oxidoredutase. Essabiocélula a combustível aprimorada também possui um anodo oqual contém uma enzima oxidoredutase que utiliza umcombustível orgânico como, por exemplo, o álcool comosubstrato.
Diversos fatores regulam o tempo de vida de umabiocélula a combustível, os quais tem sido sempre umapreocupação para a sua aplicação prática. Os mediadores dereação de redução e o tempo de vida também são outraspreocupações (Allen e Bennetto, 1993; Barton et al. , 2004).Em muitos casos, a estabilidade dos biocatalisadoresdetermina o tempo de vida da biocélula. Geralmente aestabilidade enzimática diminui depois de alguns dias(Willner et al., 1998; Katz et al., 1999; Kang et al., 2004).A imobilização pode ajudar a estender o tempo de vida dasenzimas. Uma miniatura de biocélula a combustível com GOx eBOd imobilizados em ósmio (Os) - contendo polímerosredutores, teve tempo de vida de 20 dias a 37°C (Mano et al.,2002). Moore et al. (2004) demonstraram resultadospromissores usando brometo de tetrabutilamônio, modificando amembrana de Nafion® para aprisionar a desidrogenase. A meiavida de enzimas puras é somente de 7~8 h em solução, masdepois de imobilizar a enzima, o tempo de vida aumenta emmais de 45 dias. Além disso, as biocélulas a combustívelbaseadas na técnica de imobilização não mostraram qualquerredução significativa na energia durante várias semanas defuncionamento contínuo (Winder, 2003).
Um dos maiores problemas em desenvolver biocélulas é adensidade de carga, que geralmente é medida pela geração depotência com relação à área da superfície do eletrodo, ou porpeso ou volume da célula. A alta concentração da enzima écrítica para a alta produção da densidade de corrente. Porexemplo, quando GOx foi aleatoriamente colocada na forma deuma monocamada em uma superfície plana, a carga da enzima foisomente de 1,7x10-12 mol.cm-2 (0, 27pg.cm-2), que foideterminada pelo número físico de enzimas. Assumindo quetodas as enzimas são tão ativas como em soluções aquosas comum número típico que gira em torno de 600s-l, o limite máximoda densidade de corrente foi calculado para ser somente emtorno de 0,2 mA.cm-2 (Willner et al. , 1996). GOx é conhecidocomo um dos mais eficientes redutores enzimáticos. Paraoutras enzimas com baixa atividade específica, a densidade decorrente teórica pode ser ainda menor. Desde que asbiocélulas a combustível tipicamente trabalham com voltagensabaixo de IV, teoricamente essa densidade de corrente podesomente proporcionar menos de 0,2mW.cm-2.
OBJETO DA INVENÇÃO
Portanto, é um objetivo da presente invenção realizar otratamento de tecidos de carbono previamente carboxilados,deposição e imobilização de enzima para a obtenção debiocatodo ou bioanodo.É também objetivo dessa invenção a utilização deextratos enzimáticos de lacase do cogumelo Shiitake(Lentinula edodes) , peroxidase (Curcubita pepo) e álcooldesidrogenase de levedura (Saccharomices cerevisae) com ointuito de reduzir o custo de produção de biocélulas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 representa uma biocélula a combustívelenzimática.
A Figura 2 é a representação esquemática dos componentesde uma célula a combustível unitária de eletrólito poliméricosólido.
A Figura 3 é a representação esquemática das etapastratamento dos tecidos de carbono para a obtenção de umbiocatodo ou bioanodo de uma biocélula a combustível.
A Figura 4 representa os resultados das curvas depolarização (a), potencial vs. corrente, e de potência deenergia vs. corrente (b) do biocatodo contendo lacaseimobilizada utilizando bioanodo de Pt obtidas na célula acombustível descrita na Figura 2;
A Figura 5 representa as curvas de polarização (a),potencial vs corrente, e de potência de energia vs. corrente(b) do biocatodo contendo peroxidase imobilizada utilizandobioanodo de Pt obtidas na célula a combustível descrita naFigura 2;
A Figura 6· representa as curvas de polarização (a),potencial vs. corrente, e de potência de energia vs. corrente(b) do bioanodo contendo álcool desidrogenase ligada,utilizando biocatodo de Pt obtidas na célula a combustíveldescrita na Figura 2.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção será agora descrita com referênciaaos desenhos em anexo.
A Figura 1 representa uma biocélula a combustívelenzimática. Nesta Figura 1 tem-se no lado direito a enzimaredutora de oxigênio adsorvida ou imobilizada no catodo comenzima redutora CER e no lado esquerdo a enzima oxidanteadsorvida ou imobilizada no anodo com enzima oxidante AEO,isolando os dois eletrodos CER e AEO tem-se a membranapolimérica condutora de prótons MP. No anodo com enzimaoxidante AEO o combustível C se transforma em resíduo R. Nocatodo com enzima redutora CER o oxigênio 02 se transforma emágua H20.
A presente invenção se refere ao tratamento de tecidosde carbono (TCs) carboxilados previamente em ácido nítricoentre 4 e 10 mol.L-1 sob refluxo por 0 - 140h. Após ostecidos de carbono serem lavados com água 3 vezes, os TCs sãocongelados e liofilizados até suas securas ou apenas secos emestufa a 90°C. Esses tecidos são adicionados em solução declorofórmio (CHC13), contendo azul de metileno ou seuderivado (azure A, B ou C) a 1,0-2,0% (m/v) e N,N-diciclohexilcarbodiimida a 2,0 - 4 mmol.L-1 por 12 - 24h sobagitação a 25°C. Após este período, os TCs são retirados esecos em fluxo de ar para retirada do CHC13 e lavados 3 vezescom água por 30min. A seguir os TCs são mergulhados emsolução de tampão fosfato a pH7,0 e OfOlmol.L-I por 12h e aseguir adicionados extratos de lacase, peroxidase ou álcooldesidrogenase a 10,0-100,Omg.mL-1 nessa solução. Apósdesaeração até a retirada das pequenas bolhas e agitação por2h, é adicionado etilenoglicol nas amostras mergulhadas emsolução de lacase ou peroxidase na proporção 3:1 (extrato ouenzima:solvente orgânico) sob agitação por 30min sendodeixadas a 4°C sem agitação por 12-24h. No caso das amostrasmergulhadas em solução de álcool desidrogenase é adicionadaacetona na mesma proporção. A seguir são retirados os TCs,congelados em nitrogênio líquido e liofilizados até ficaremsecos. Os TCs secos são mergulhados imediatamente em soluçãode acetona com glutaraldeído (GA) a 0,5% por 30min, lavados 3vezes com água e novamente congelados em nitrogênio eliofilizados até secura. Na montagem da célula a combustível,os biocatodos são borrifados com solução de Nafion emisopropanol a 0-30% (m/v).
A Figura 2 é a representação esquemática dos componentesde uma célula a combustível unitária de eletrólito poliméricosólido. A célula a combustível representada nesta Figura 2compreende placa de alumínio 1; entrada para parafuso 2;entrada para aquecedores 3; aquecedores 4; placa de grafite5; distribuidor do fluxo de gás 6; guia de ajuste 7;espaçadores 8; membrana 9; eletrodo de difusão de gás 10;termopar 11; O-ring 12; tubo de teflon 13; conectores 14.Para as medições eletroquímicas é montada a célula acombustível eletroquímica da Figura 2, obtendo-se valores depotência entre 0,1 e 5,0mW.cm-2 com densidades de correnteelétrica entre 0,1 e 20,0mA.cm-2.
Estes biocatodos e bioanodos podem ser utilizados parabiossensores e marca-passos cardíacos.
A Figura 3 é a representação esquemática das etapas detratamento dos tecidos de carbono para a obtenção de umbiocatodo ou bioanodo de uma biocélula a combustível, onde emA ocorre o tratamento prévio do tecido de carbono com ácidonítrico (HN03) em refluxo; em B é preparada uma monocamada deazul de metileno ou seu derivado (A, B ou C) adsorvido ouligado com carbodiimida; em C é depositada enzima sobre amonocamada de azul de metileno e em D é imobilizada a enzimacom glutaraldeído na presença de solvente polar.
Para as medições eletroquímicas é montada a célula acombustível unitária,' obtendo-se valores de densidades deenergia e densidades de corrente elétrica (ver Figuras 4, 5 e 6).
A Figura 4 representa os resultados das curvas depolarização (a), potencial vs. corrente, e de potência deenergia vs. corrente (b) do biocatodo contendo lacaseimobilizada utilizando bioanodo de Pt obtidas na célulacombustível descrita na Figura 2;
A Figura 5 representa as curvas de polarização (a) ,potencial vs. corrente, e de potência de energia vs. corrente(b) do biocatodo contendo peroxidase imobilizada utilizandobioanodo de Pt obtidas na célula combustível descrita naFigura 2;A Figura 6 representa as curvas de polarização (a) ,potencial vs. corrente, e de potência de energia vs. corrente(b) do bioanodo contendo álcool desidrogenase ligada,utilizando biocatodo de Pt obtidas na célula combustíveldescrita na Figura 2.
Todas as preparações são realizadas em temperaturaabaixo de 30° C para não desnaturar as proteínas (enzimas).
Exemplo 1: Os tecidos de carbono (TCs) carboxiladospreviamente em ácido nítrico entre 4,0 e 8,-Omol. L-I sobrerefluxo por 0 - 140h. Após a lavagem com água 3 vezes, os TCssão congelados e liofilizados até suas securas ou apenassecos em estufa a 90°C. Esses tecidos são adicionados emsolução de clorofórmio (CHC13), contendo azul de metileno a1,0% (m/v) e N,N-diciclohexilcarbodiimida a 2,0 mmol.L-1 por12h sob agitação a 25°C. Após este período, os TCs sãoretirados e secos em fluxo de ar para retirada do CHC13 elavados 3 vezes com água por 30min. A seguir os TCs sãomergulhados em solução de tampão fosfato a pH7,0 e 0,01mol.L-1 por 12h e a seguir adicionado o extrato de lacase a10,0mg.mL-l. Após desaeração para retirada das bolhas eagitação por 30min, são adicionados etilenoglicol para asamostras tratadas com lacase e acetona para as amostrastratadas com álcool desidrogenase na proporção 3:1(extrato:solvente orgânico) sob agitação por 30min, a seguirdeixados a 4°C sem agitação por 12h. Logo depois, os TCs sãoretirados, congelados em nitrogênio líquido e liofilizados.Os TCs secos são mergulhados imediatamente em solução deacetona com GA a 0,5% por 30min, lavados 3 vezes com água enovamente congelados em nitrogênio e liofilizados.
Exemplo 2: repete-se o procedimento do exemplo 1, comextrato da lacase entre 20,0 e 100,Omg.mL-1;
Exemplo 3: repetem-se os procedimentos 1 e 2, sendo queas concentrações de N,N-diciclohexilcarbodiimida ficam entre0,0 e 4,Ommol.L-I;
Exemplo 4: repetem-se os procedimentos 1, 2 e 3, sendoque as concentrações de GA ficam entre 0,1 e 1,0% (v/v);Exemplo 5: repetem-se o procedimento 4 acima, sendoutilizando o extrato bruto de peroxidase da abobrinha(Curcubita pepo) no lugar do extrato da lacase;
Exemplo 6: repete-se o procedimento 4 acima, sendoutilizando o extrato bruto de álcool desidrogenase dalevedura (Saccharomices cerevisae) e solvente deprecipitação, a acetona;
Exemplo 7: é borrifado 0,1 a 0,5mL de uma solução deNafion® em isopropanol a 1-30% (m/v) por massa (g) de tecidode carbono junto com a enzima imobilizada em todos eles;
Exemplo 8: repetem-se todos os métodos acima utilizandoos derivados do azul de metileno, Azure A, B ou C, no lugardo mesmo.
Os materiais obtidos através dos métodos ora propostosmostram-se altamente satisfatórios para produção de energiaelétrica em marca-passos cardíacos ou como bioeletrodos embiossensores, sendo que em dimensões micrométricas.
As vantagens introduzidas pela presente invenção estãorelacionadas principalmente com o uso de extratos enzimáticosde vegetais ou microrganismos ou de enzimas puras, podendoreduzir o custo de produção das biocélulas sem uso damembrana de Nafion® como membrana de polieletrólito.
Claims (9)
1. Processo de tratamento de tecidos de carbono paraobtenção de biocatodo ou bioanodo, caracterizado pelo fato decompreender as seguintes etapas:- tratar os tecidos de carbono previamente carboxiladosem ácido nitrico (8, Omol. L-1) em refluxo;- preparar uma monocamada de azul de metileno ou seuderivado (azure A, B ou C) adsorvido ou ligado com NfN-diciclohexilcarbodiimida;- depositar enzima obtida de extratos enzimáticos devegetais ou de microorganismos sobre a monocamada de azul demetileno; e- imobilizar a enzima na presença de solvente polar,neste caso a acetona contendo glutaraldeido.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é utilizado clorofórmio(CHCI3) contendo W,N-diciclohexilcarbodiimida comconcentrações preferencialmente entre 0,5 e 4mmol.L"1 parafazer a ligação covalente amidica entre os gruposcarboxilicos dos tecidos de carbono carboxilados e o grupoaminico do azul de metileno ou seus derivados (azure A, B ouC) ou sua adsorção com concentração entre 0,5 e 2mg.mL_1 pormassa (g) do TC carboxilado.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as enzimas obtidas de extratosvegetais enzimáticos compreende a lacase e a peroxidase.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as enzimas obtidas de extratosenzimáticos de microorganismo compreende o álcooldesidrogenase.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende a deposição dalacase ou peroxidase em meio de solvente orgânicoetilenoglicol na proporção entre 1:1 e 3:1 (solução daenzima:etilenoglicol).
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pela deposição do álcool desidrogenase em meiode acetona na proporção entre 1:1 e 3:1 (solução daenzima:acetona).
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo uso do glutaraldeido a 0,1 -1,0% (v/v) emacetona por períodos entre 10 e 60min para imobilização daenzima precipitada.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de utilizar carbono vítreo oupirolítico, nanopartículas de carbono, carvão ativado eoutros materiais carbonáceos em lugar do tecido de carbono.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo borrifamento do Nafion® entre 1,0 e 30,0%(m/v) em isopropanol sobre o biocatodo ou bioanodo finalobtido seguido da secagem antes do seu uso na célula acombustível para gerar energia.
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