BRPI0904892A2 - bactéria produtora de l-arginina da famìlia de enterobacteriaceae, e, método para produzir l-arginina - Google Patents

Abstract

BACTéRIA PRODUTORA DE L-ARGININA DA FAMìLIA DE ENTEROBACTERIACEAE, E, METODO PARA PRODUZIR L-ARGININA. A presente invenção provê um método para produzir L-arginina usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria pertencendo ao gênero Escherichia ou Pantoea, que foi modificada para atenuar a expressão de um ou vários genes codificando um transportador de L-arginina.

Description

"BACTÉRIA PRODUTORA DE L-ARGININA DA FAMÍLIA DEENTEROBA CTERIA CEAE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR L-ARGININ A"

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à indústria microbiológica, eespecificamente a um método para produzir L-arginina. O método usa umabactéria da família Enterobacteriaceae que foi modificada para atenuar aexpressão de um ou vários genes codificando um transportador de L-arginina.

Descrição da Técnica Relacionada

Convencionalmente, L-aminoácidos são industrialmenteproduzidos por métodos de fermentação utilizando cepas de microorganismosde fontes naturais, ou mutantes das mesmas. Tipicamente, osmicroorganismos são modificados para melhorar os rendimentos de produçãode L-aminoácidos alvo.

Muitas técnicas para melhorar os rendimentos de produção deL-aminoácidos foram relatadas, incluindo a transformação demicroorganismos com DNA recombinante (ver, por exemplo, patente US 4278 765). Outras técnicas para melhorar os rendimentos de produção incluemaumentar atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácidose/ou dessensibilizar as enzimas alvo da inibição de realimentação pelo L-aminoácido produzido (ver, por exemplo, WO 95/16042 ou patente US 4 346170; 5 661 012 e 6 040 160).

Outros modos para melhorar os rendimentos de produção deL-aminoácido consistem em atenuar a expressão de um gene ou vários genesque estão envolvidos na degradação do L-aminoácido alvo, genes quedesviam os precursores do L-aminoácido alvo da via biossintética de L-aminoácido, genes envolvidos na re-distribuição dos fluxos de carbono,nitrogênio e fosfato, e genes codificando para toxinas, etc.Um sistema de transporte dependente em uma proteína deligação em Escherichia coli específica para L-arginina foi caracterizado pormeios genéticos e bioquímicos. O sistema é feito de cinco genes adjacentes,artPIQMJ ("art" refere-se a transporte de arginina), que são organizados emduas unidades transcripcionais (artPIQMJe artJ). Os produtos de genes artl eartJ, ArtI e ArtJ, são proteínas de ligação periplásmica com similaridade deseqüência para proteínas de ligação para aminoácidos polares ou básicos. Osprodutos artQ, ArtM e ArtP são similares a proteínas de transmembranaconhecidas e a ATPase de veículos dependentes de proteína de ligação. Asproteínas maduras ArtI e ArtJ estão localizadas no periplasma e falta umpeptídeo de sinal de 19 resíduos de aminoácidos. ArtI e ArtJ foram isoladosde cepas super produção. ArtJ especificamente liga L-arginina com altaafinidade e super-produção de ArtJ estimulada por absorção de L-argininapela bactéria. O substrato para ArtI não é conhecido, e ArtI isolado não ligaaminoácidos comuns, vários aminoácidos incomuns ou aminas. Foi concluídoque os genes artJ de artPIQM codificam um terceiro sistema de absorção dearginina além do sistema conhecido argT hisJQMP de Salmonellatyphimurium e E. coli e o veículo arginina (-ornitina) (aps) de E. coli(Wissenbach U. et al, Mol Microbiol., 17(4): 675-86 (1995)).

Mas atualmente, não se encontram relatórios de atenuação daexpressão de um gene codificando um transportador de L-arginina para aprodução de L-arginina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um aspecto da presente invenção inclui otimizar aprodutividade de cepas produzindo L-arginina e provendo um método para aprodução de ácido de L-arginina usando estas cepas.

A presente invenção provê uma bactéria da famíliaEnterobaeteriaeeae tendo uma capacidade aumentada para produzir L-arginina.E um aspecto da presente invenção prover uma bactériaprodutora de L-arginina da família Enterobacteriaceae, em que a bactéria foimodificada para atenuar a expressão de um ou vários genes codificando umtransportador de L-arginina.

E um outro aspecto da presente invenção prover uma bactériacomo descrito acima, em que a referida bactéria foi modificada para atenuar aexpressão de gene artl.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactériacomo descrito acima, em que a expressão do gene artl é atenuada porinativação de gene artl.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactériacomo descrito acima, em que referida bactéria foi modificada para atenuar aexpressão de agrupamento artPIQM- artJ.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactériacomo descrito acima, em que a expressão do agrupamento artPIQM- artJéatenuada pela inativação do agrupamento artPIQM - artJ.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactériacomo descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Eseheriehia.

E um outro aspecto da presente invenção prover a bactériacomo descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

É um outro aspecto da presente invenção prover um métodopara produzir L-arginina compreendendo:

- cultivar a bactéria como descrito acima, e

- coletar a L-arginina do meio.

A presente invenção é descrita em detalhes abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra as posições relativas de pares de iniciadoresPl e P2 e P5 e P6 em plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR.

A figura 2 mostra a construção de fragmento de DNAcromossômico compreendendo o gene artl ou agrupamento artPIQM-artJinativado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

EXEMPLARES

1. Bactéria da presente invenção

A bactéria é uma bactéria produtora de L-arginina de famíliaEnterobacteriaceae, em que a bactéria foi modificada para atenuar aexpressão de um ou vários genes codificando um transportador de L-arginina.

O termo "bactéria produtora de L-arginina" significa umabactéria que é capaz de produzir e secretar L-arginina em um meio, em que abactéria é cultivada no meio.

O termo "bactéria produtora de L-arginina" também podesignificar uma bactéria que é capaz de produzir e causar o acúmulo de L-arginina em um meio de cultiva em uma quantidade maior do que uma cepade tipo selvagem ou parental de uma bactéria da família Enterobaeteriaeeae,por exemplo E. eoli, como E. eoli K-12, e preferivelmente significa que abactéria é capaz de causar o acúmulo em um meio de uma quantidade nãomenor do que 0,5 g/L, mais preferivelmente não menor do que 1,0 g/L de L-arginina.

A família Enterobaeteriaeeae inclui bactérias pertencendo aogêneros Eseheriehia, Enterobaeter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea,Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella eYersinia, etc. Especificamente, as classificadas como Enterobaeteriaeeae deacordo com a taxonomia usada na base de dados de NCBI (National Centerfor Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id = 91347) pode ser usado. Umabactéria pertencendo ao gênero Eseheriehia ou Pantoea é preferida.

A expressão "uma bactéria pertencendo ao gêneroEseheriehia" significa que a bactéria é classificada no gênero Eseheriehia deacordo com a classificação conhecida do versado na técnica de microbiologia.

Um exemplo de bactéria pertencendo ao gênero Escherichia é, mas nãolimitado, a Eseheriehia eoli (E. eoli).

A bactéria pertencendo ao gênero Eseheriehia não éparticularmente limitada, no entanto, por exemplo, bactérias descritas porNeidhardt, F.C. et al (Eseheriehia eoli e Salmonella typhimurium, AmericanSociety for Microbiology, Washington, DC, 1208, Tabela 1) são englobadas.

A frase "bactéria pertencendo ao gênero Pantoea" significaque a que a bactéria é classificada no gênero Pantoea de acordo com aclassificação conhecida do versado na técnica de microbiologia. Algumasespécies de Enterobaeter agglomerans foram recentemente re-classificadasem Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii ousemelhantes, com base na análise de seqüência de nucleotídeos de 16S rRNA,etc.

A frase "bactéria foi modificada para atenuar a expressão deum ou vários genes codificando um transportador de L-arginina" podesignificar que a bactéria foi modificada em tal modo que a bactériamodificada contém uma quantidade reduzida de transportador de L-argininaou qualquer subunidade da mesma como comparado com uma bactéria nãomodificada, ou pode também significar que a bactéria é incapaz de sintetizar otransportador de L-arginina ou qualquer subunidade do mesmo.

O sistema de transportador de L-arginina é feito de produtosde cinco genes adjacentes, artPIQMJ, que são organizados em duas unidadestranscripcionais, artPIQM e artJ. Os produtos de gene artl e artJ, ArtI e ArtJ,são proteínas de ligação periplásmicas com similaridade de seqüência paraproteínas de ligação para aminoácidos polares, ou básicos. Os produtos artQ,artM, e ArtP são similares às proteínas de transmembranas e a ATPase deveículos dependentes de proteína de ligação.

A frase "inativação de um gene" significa que o genemodificado codifica uma proteína completamente não funcional. Também épossível que a região de DNA modificada seja incapaz de expressarnaturalmente o gene devido à deleção de uma parte do gene ou o genecompletamente, um deslocamento da matriz de leitura do gene, a introduçãode mutação(ões) sentido incorreto/ não sentido, ou a modificação de umaregião adjacente do gene, incluindo as seqüências controlando a expressão dogene, como o promotor, melhorador, atenuador, sítio de ligação de ribossoma,etc.

A presença ou ausência de um gene no cromossomo de umabactéria pode ser detectada por métodos bem conhecidos, incluindo PCR,Southern blotting, e outros. Além disso, o nível de expressão de gene pode serestimado por medida da quantidade de mRNA transcrito do gene usandovários métodos bem conhecidos, incluindo Northern blotting, RT-PCRquantitativo, e outros. A quantidade da proteína codificada pelo gene pode sermedida por métodos bem conhecidos, incluindo SDS-PAGE seguido por testede imunoblotting (análise de Western blotting) e outros.

O gene artP (sinônimos: ECK0855, b0864) codifica asubunidade da proteína ArtP do transportador ABC de arginina (sinônimoB0864) localizado no citoplasma. O gene artP (nucleotídeos complementaresa nucleotídeos 902,229 a 902,957 no GenBank número de acessoNC 000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 1) está localizado entre os genesybjP e artl no cromossomo de E. coli cepa K-12. A seqüência de nucleotídeodo gene artP e a seqüência de aminoácido da proteína ArtP codificada pelogene artP são mostrados em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2,respectivamente.

O gene artl (sinônimos: ECK0854, b0863) codifica asubunidade da proteína ArtI do transportador ABC de arginina (sinônimoB0863) localizado no espaço periplásmico. O gene artl (nucleotídeoscomplementares a nucleotídeos 901,480 a 902,211 no GenBank número deacesso NC_000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 3) está localizado entre osgenes artQ e artP no cromossomo de E. coli cepa K-12. A seqüência denucleotídeo do gene artl e a seqüência de aminoácido da proteína ArtIcodificada pelo gene artl são mostrados em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4,respectivamente.

O gene artQ (sinônimos: ECK0853,, b0862) codifica asubunidade da proteína ArtQ do transportador ABC de arginina (sinônimoB0862) localizado na membrana interna. O gene artQ (nucleotídeoscomplementares a nucleotídeos 900,757 a 901,473 no GenBank número deacesso NC 000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 5 está localizado entre osgenes artl e artM no cromossomo de E. coli cepa K-12. A seqüência denucleotídeo do gene artQ e a seqüência de aminoácido da proteína ArtQcodificada pelo gene artl são mostrados em SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6,respectivamente.

O gene artM (sinônimos: ECK0852, b0861) codifica asubunidade da proteína ArtM do transportador ABC de arginina (sinônimoB0861) localizado na membrana interna. O gene artl (nucleotídeoscomplementares a nucleotídeos 900,089 a 900,757 no GenBank número deacesso NC_000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 7) está localizado entre osgenes artQ e artJ no cromossomo de E. coli cepa K-12. A seqüência denucleotídeo do gene artM e a seqüência de aminoácido da proteína ArtMcodificada pelo gene artM são mostrados em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8,respectivamente.

O gene artJ (sinônimos: ECK0851, b0860) codifica asubunidade da proteína ArtJ do transportador ABC de arginina (sinônimoB0860) localizado no espaço periplásmico. O gene artJ (nucleotídeoscomplementares a nucleotídeos 899,067 a 899,798 no GenBank número deacesso NC_000913.2; gi:49175990; SEQ ID NO: 9) está localizado entre osgenes artM e rlmC no cromossomo de E. coli cepa K-12. A seqüência denucleotídeo do gene artJ e a seqüência de aminoácido da proteína ArtJcodificada pelo gene artJ, são mostrados em SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO:10, respectivamente.

Porque podem existir algumas diferenças nas seqüências deDNA entre os gêneros ou cepas da família de Enterobacteriaceae , o gene aser inativado no cromossomo não é limitado aos genes mostrados em SEQ IDNO: 1, 3, 5, 7 ou 9, mas podem incluir genes homólogos a SEQ ID NO: 1, 3,5, 7 e 9, que codificam uma proteína variante de proteína correspondente. Aexpressão "proteína variante" significa uma proteína que tem mudanças naseqüência, sejam elas deleções, inserções, adições ou substituições deaminoácidos, mas ainda mantém a atividade do produto como a proteína.

O número de mudanças na proteína variante depende daposição na estrutura tri-dimensional da proteína ou o tipo de resíduos deaminoácido. Pode ser 1 a 30, preferivelmente 1 a 15, e mais preferivelmente 1a 5. Estas mudanças nas variantes são mutações conservativas que conservama função da proteína. Em outras palavras, estas mudanças nas variantespodem ocorrer em regiões da proteína que não são críticas para a função daproteína. Isto é porque alguns aminoácidos tem uma elevada homologia umpara o outro, de modo que a estrutura tri-dimensional ou atividade não éafetada por tal mudança. Uma mutação conservativa é uma mutação em que asubstituição ocorre mutuamente dentre Phe, Trp, Tyr, se o sítio desubstituição for um aminoácido aromático, dentre Leu, lie, Vai, se o sítio desubstituição for um aminoácido hidrofóbico; entre Gln, Asn5 se for umaminoácido polar; entre Lys, Arg, His, se ele for um aminoácido básico; entreAsp, Glu, se for um aminoácido ácido; e entre Ser, Thr, se for um aminoácidotendo um grupo hidroxila. As mutações conservativas típicas são substituiçõesconservativas. Os exemplos de substituições conservativas incluemsubstituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg,substituído de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ouGln por Asp5 substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu,Lys5 His5 Asp ou Arg por Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu,substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr porHis, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie, substituição de lie, Met,Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys,substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met,Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por Ser, substituição de Ser ouAla por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ouTrp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai. As substituições,deleções, inserções, adições ou inversões e outros dos aminoácidos acimamencionados incluem mutações de ocorrência natural (mutante ou variante)dependendo em diferenças em espécies ou diferenças individuais demicroorganismos que retém o gene artl. Este gene pode ser obtido pormodificação da seqüência de nucleotídeo mostrada em SEQ ID NO: 1,usando, por exemplo, mutagênese sítio-dirigida , de modo que o resíduo deaminoácido sítio-específico na proteína codificada inclui substituições,deleções, inserções ou adições. A variante de proteína codificada pelo genepode ter uma homologia de não menos que 80%, preferivelmente não menosque 90% e mais preferivelmente não menos do que 95%, com relação àseqüência completa de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 ou10, desde que a proteína antes da inativação seja capaz de funcionar como umtransportador ABC de arginina quando complexada com o resto das 4subunidades de 5 proteínas de tipo selvagem que compõem o transportador deL-arginina.

Homologia entre duas seqüências de aminoácido pode serdeterminada usando métodos bem conhecidos, por exemplo, o programa decomputador BLAST 2.0, que calcula três parâmetros: contagem, identidade, esimilaridade.

Além disso, qualquer um dos genes artP, artl, artQ, artM ouart J pode ser uma variante que hibridiza com a seqüência de nucleotídeocomplementar à seqüência mostrada em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 ou 9,respectivamente, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da seqüênciade nucleotídeo, sob condições estringentes, desde que ela codifique umaproteína funcional antes da inativação. "Condições estringentes" incluemaquelas sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendohomologia não menor que 60%, preferivelmente não menor que 70%, maispreferivelmente não menor que 80%, ainda mais preferivelmente não menorque 90%, e o mais preferível, não menor que 95%, é formado e um híbridonão específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia menor que a acima,não é formado. Por exemplo, condições estringentes são exemplificadaslavando-se uma vez, preferivelmente duas ou três vezes em concentração desal correspondendo a lxSSC, 0,1% SDS, preferivelmente lxSSC, 0,1% SDS a60°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usada parablotting e, conforme uma regra, pode ser a que é recomendada pelofabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para amembrana de náilon Hybond™N+ (Amersham) sob condições estringentes é15 minutos. Preferivelmente, a lavagem pode ser realizada 2 ou 3 vezes. Ocomprimento da sonda pode ser adequadamente selecionado dependendo dascondições de hibridização, e é geralmente de 100 bp a 1 kbp.

A expressão de um gene pode ser atenuada por introdução deuma mutação no gene no cromossomo de modo que atividade intracelular daproteína codificada pelo gene é diminuída como comparada com uma cepanão modificada. Mutações que resultam em atenuação de expressão de geneincluem a substituição de uma base ou mais para causar uma substituição deaminoácido na proteína codificada pelo gene (mutação de sentido errado),introdução de um códon de parada (mutação não sentido), deleção ou inserçãode uma ou mais bases para causar um deslocamento da estrutura, inserção deum gene resistente ao fármaco, ou deleção de uma parte do gene ou do geneinteiro (Qiu, Ζ. and Goodman, M.F, J Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997);Kwon, D.H. et al, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (200)). Expressãodo gene artl pode também ser atenuada modificando uma seqüência deregulação de expressão tal como o promotor, a seqüência Shine-Dalgarmo(SD), etc. (W095/34672, Carrier, T.A. e Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15,k58-64(1999)).

Por exemplo, os seguintes métodos podem ser empregadospara introduzir uma mutação por recombinação de genes. Um gene mutantecodificando uma proteína mutante com atividade diminuída é preparado, e abactéria a ser modificada é transformada com um fragmento de DNAcontendo o gene mutante. Então, o gene nativo no cromossomo é substituídocom o gene mutante por recombinação homóloga, e a cepa resultante éselecionada. Substituição de gene usando recombinação homóloga pode serconduzida empregando um DNA linear, o que é conhecido como "IntegraçãoRed-driven" (Datsenko, K.A. e Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,97,12, p6640-6645 (2000)), ou empregando um plasmídeo contendo umaorigem de replicação sensível à temperatura (patente U.S 6.303.383 ou JP 05-00749IA). Além disso, a mutação sítio específica por substituição de genepode ser incorporada usando recombinação homóloga como definido tambémacima usando um plasmídeo que é incapaz de replicar no hospedeiro.

A expressão do gene pode também ser atenuada inserindo umtransposon ou um fator IS na região de codificação do gene (Patente U.S5.175.107), ou por métodos convencionais, tais como por mutagênese comirradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina).

O gene pode também ser inativado por métodosconvencionais, tais como por mutagênese usando irradiação UV ounitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese sitiodirigida, ruptura de genes usando recombinação homóloga, e/ou mutagênesede inserção-deleção (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000,97:12:5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 2000, 97:12:6640-45), também chamada "integração Red-driven".

Métodos para a preparação de DNA de plasmídeo, digestão eligação de DNA, transformação, seleção de oligonucleotídeos comoiniciadores, e semelhantes podem ser métodos comuns bem conhecidos doversado na técnica. Estes métodos estão descritos, por exemplo, emSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2a. ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Bactérias produtoras de L-arginina

Bactérias que são modificadas para atenuar a expressão de umou vários genes codificando um transportador de L-arginina e que são capazesde produzir L-arginina podem ser empregadas.

A bactéria pode ser obtida desativando-se um ou vários genescodificando transportador de L-arginina em uma bactéria que tem umacapacidade nativa ou inerente para produzir L-arginina. Alternativamente, abactéria pode ser obtida transmitindo a capacidade para produzir L-arginina auma bactéria já tendo um ou vários genes inativado s codificando umtransportador de L-arginina.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas paraderivar as bactérias produzindo L-arginina incluem, mas não estão limitadosa, cepas pertencendo ao gênero Escherichia, tais como cepa de E.coli 237(VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S 2002/058315 Al) e suas cepasderivadas abrigando a N-acetilglutamato sintase mutante (Pedido de PatenteRussa 2001112869), cepa de E.coli 382 (VKPM B-7926) (EPl 170358A1),uma cepa produzindo arginina em que o gene argA codificando N-acetilglutamato sintetase foi introduzido (EP1170361Al), e semelhantes.

Exemplos de cepas parentais que podem ser usadas paraderivar as bactérias produzindo L-arginina também incluem as cepas em que aexpressão de um ou mais genes codificando enzimas biosintéticas de L-arginina é/são aumentada(s). Exemplos de tais genes incluem os genescodificando fosfato de N-acetilglutamil redutase (argC), acetil ornitinatransferase (argJ), N-acetilglutamato quinase (argB), acetilornitinatransaminase (argD), carbamoil ornitina transferase (argF), ácidoargininosuccínico sintetase (argG), ácido argininosuccínico liase (argH), efosfato de carbamoila sintetase (carAB). As abreviaturas em parenteses apósos nomes das enzimas representam os nomes dos genes.

2. Método da presente invenção

Métodos exemplares incluem produzir L-arginina cultivando abactéria como descrito aqui em um meio de cultura para produzir e secretar L-arginina no meio, e coletar L-arginina do meio.

O cultivo, coleta, e purificação de L-arginina a partir do meio esemelhantes podem ser realizados por métodos de fermentação convencionaisonde um aminoácido é produzido usando uma bactéria.

O meio usado para a cultura pode ser um meio sintético ounatural, enquanto o meio inclui uma fonte de carbono e uma fonte denitrogênio e minerais e, se necessário, quantidades apropriadas de nutrientesque a bactéria requer para crescimento. A fonte de carbono pode incluir várioscarboidratos tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos.Dependendo do modo de assimilação do microorganismo escolhido, álcool,incluindo etanol e glicerol, pode ser usado. Como a fonte de nitrogênio, váriossais de amônio tais como amônia e sulfato de amônio, outros compostos denitrogênio tais como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal comopeptona, soja hidrolisada, e microorganismo fermentativo digerido podem serusados. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio,cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, esemelhantes podem ser usados. Como vitaminas, tiamina, extrato de levedura,e semelhantes podem ser usados.

O cultivo é preferivelmente realizado sob condições aeróbicas,tais como uma cultura remexida, e uma cultura agitada com aeração, em umatemperatura de 20 a 40 °C, preferivelmente 30 a 48 0C. O pH da cultura estágeralmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura podeser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, etampões. Geralmente, cultivo de 1 a 5 dias conduz a acúmulo de L-argininano meio líquido.

Após cultivo, sólidos tais como células podem ser removidos apartir do meio líquido por centrifugação ou filtragem de membrana, e entãoL-arginina pode ser coletada e purificada por métodos de troca iônica,concentração, e/ou de cristalização.

Exemplos

A presente invenção será explicada mais concretamente abaixocom referência aos seguinte exemplos não limitantes.

Exemplo 1. Construção de uma cepa com um gene artl inativado.

1. Deleção do gene artl.

O gene artl em uma cepa bacteriana foi deletado pelo métodoinicialmente desenvolvido por Datsenko, K.A. e Wanner, B.L. (Proc. Natl.Acad. Sei. USA,2000, 97(12), 6640-6645) chamado "integração tipo Red-driven". De acordo com este procedimento, os iniciadores de PCR Pl (SEQID NO: 11) e P2 (SEQ ID NO: 12), que são homólogos a ambos, a regiãoadjacente ao gene artl e o gene que confere resistência a antibiótico aoplasmídeo de modelo, foram construídos. O plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR (WO 05/010175) foi usado como um modelo na reação PCR. Condiçõespara PCR foram como a seguir: desnaturação de DNA inicial durante 5minutos a 95°C, seguido por 25 ciclos de desnaturação a 95°C por 3Os,anelamento a 54°C por 3Os, alongamento a 72°C por 40s, e o alongamentofinal por 5 minutos a +72°C.

O produto de PCR de 1,7 kb (Figura 1) foi purificado a partirde um gel de agarose e usado para eletroporação de uma cepa E.coli MGl 655(ATCC 700926), que contém o plasmídeo pKL>46. O plasmídeo pKD46(Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,2000, 97:12,6640-6645) contém uma origem de replicação sensível à temperatura, e inclui2.154 fragmentos de DNA de nucleotídeo de fago λ (posições de nucleotídeo31088 a 33241, n° de acesso GenBank J02459), bem como os genes dosistema de recombinação homóloga λ Red (γ,β, exo genes) que estão sob ocontrole do promotor ParaB indutível a arabinose. O plasmíveo pKD46 énecessário para a integração do produto de PCR no cromossomo da cepaMG1655. A cepa MG1655 pode ser obtida a partir de American Type CultureCollection (P.O Box 1549 Manassas, VA 20108, U.S.A).

Células eletrocompetentes foram preparadas como a seguir:células de E.coli MG1645/pKD46 foram cultivadas durante a noite a 30°C emum meio de LB contendo ampicilina (100 mg/l), e a cultura foi diluída 100vezes com 5 ml de meio de SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning ALaboratory Manual, 2a. ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)contendo ampicilina e L-arabinose (InM). As células foram cultivadas comaeração a 30°C e um OD6OO de ~ 0,6 e então foram tornadaseletrocompetentes concentrando 100 vezes e lavando três vezes com H2Odesionizada gelada. Eletroporação foi realizada usando 70 μΐ de células e ~100 ng do produto de PCR. Células após eletroporação foram incubadas com1 ml de meio SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning A LaboratoryManual, 2a. ed.", Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) a 37° C durante2,5 horas e então foram colocadas em placas de L-ágar contendo cloranfenicol(30μg/ml) e cultivadas a 37°C para selecionar recombinantes de CmR. Então,para eliminar o plasmídeo pKD46, duas passagens no L-ágar com Cm a 42°Cforam realizadas e as colônias foram testadas para sensibilidade a ampicilina.

2.Verificação da deleção de gene artl por PCR

Os mutantes em que o gene artl foi deletado, em que forammarcados com gene de resistência de Cm, foram verificados por PCR usandoos iniciadores Ρ3 específicos de locus (SEQ ID NO: 13) e P4 (SEQ ID NO:14). Para este fim, uma colônia recentemente isolada foi colocada emsuspensão em 20μ1 de água e então 1 μΐ da suspensão foi usado para PCR. Operfil de temperatura é o seguinte: desnaturação de DNA inicial durante 5minutos a 95°C; então 30 ciclos de desnaturação a 95°C durante 30 s,anelamento a 55°C durante 30 s e alongamento a 12°C por 1 minuto; oalongamento final por 5 minutos a 12°C. O produto de PCR obtido na reaçãode PCR usando as células da cepa MGl 655 de atrl+ parental como o modelotinha 803 bp de comprimento. O produto de PCR obtido na reação PCRusando as células do cepa Aartl::cat MG1655 como o modelo foi 1453nucleotídeos em comprimento (Figura 2). A cepa mutante foi denominadaMG1655AartI.

Exemplo 2. Construção de uma cepa com um agrupamento artPIOM-artJinativado .

1. Deleção do agrupamento artPIQM-artJ

O agrupamento artPIQM-artJ em cepa bacteriana foi deletadopor integração Red-driven. De acordo com este procedimento, os iniciadoresPCR P5 (SEQ ID NO: 15) e P6 (SEQ ID NO: 16), que são homólogos aambos, a região adjacente ao agrupamento artPIQM-artJ, e o gene queconfere resistência a antibiótico no plasmídeo de modelo, foram construídos.

O plasmídeo pMWl 18-attL-Cm-attR (WO 05/010175) foi usado como omodelo na reação de PCR. Condições para PCR foram como decritas acima.

O produto de PCR de 1,7 kb (Figura 1) foi purificado a partirde um gel de agarose e usado para eletroporação da cepa E.coli MGl655(ATCC 700926), que contém o plasmídeo pKD46.

Células eletrocompetentes foram preparadas como descritoacima. Eletroporação foi realizada usando 70 μΐ de células e ~ 100 ng doproduto de PCR. Células após eletroporação foram incubadas com 1 ml demeio de SOC a 37°C para 2,5 horas e então foram colocadas em placas em L-ágar contendo cloranfenicol (30 μ§/ηι1) e cultivadas a 37°C para selecionarrecombinantes de CmR. Então, para eliminar o plasmídeo pKD46, duaspassagens em L-ágar com Cm a 42°C foram realizadas e as colônias foramtestas para sensibilidade a ampicilina.

2. Verificação da deleção do agrupamento artPIOM-artJ por PCR-

Os mutantes em que o agrupamento artPIQM-artJ foi deletadoem que foram marcados com gene de resistência de Cm, foram verificadospor PCR usando os iniciadores P7 específicos de locus (SEQ ID NO: 17) e P8(SEQ ID NO: 18) como descrito acima. O produto de PCR obtido na reaçãode PCR usando a cepa MGl 655 AarPIQM::cat como o modelo foinucleotídeos de 1,5 kb de comprimento. A cepa mutante foi denominadaMG165 5AartPIQM-artJ.

Exemplo 3. Produção de L-arginida por E.coli 382AartI e E.coli2AartPIQM-artJ.

Para testar o efeito de inativação do gene artl ou agrupamentoartPIQM-artJ em produção de L-arginina, fragmentos de DNA docromossomo dos acima descritos 382AartI de E.coli 382AartPIQM-artJ deE.coli foram transferidos à L-arginina produzindo a cepa de E.coli 382 portransdução de Pl (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para obter cepas de E.coli382AartI e E.coli 382AartPIQM-artJ, respectivamente. A cepa 382 foidepositada junto ao Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM) (Rússia, 117545 Moscow, ) Dorozhny proezd, 1) em 10 de Abril de2000 sob número de acesso VKPM B-7926 e então convertida a um depósitosob o Tratado de Budapeste em 18 de Maio de 2001.

Cepas de E.coli, 382, 382AartI e 382AartPIQM-artJ, foramseparadamente cultivadas com agitação a 37°C por 18 horas em 3 ml de caldonutriente, e 0,3 ml das culturas foram inoculadas em 2 ml de um meio defermentação em tubos de teste de 20 χ 200 mm e cultivadas a 32°C por 48horas em um agitador rotatório.

Após o cultivo, a quantidade de L-arginina que se acumulouno meio foi determinada por cromatografia de papel usando a seguinte fasemóvel: butanol: ácido acético: água = 4:1:1 (em volume). Um solução deninidrina (2%) em acetona foi usada como um reagente de visualização. Umponto contendo L-arginina foi cortado, a L-arginina foi eluída com 0,5% desolução de água com CdCl2, e a quantidade de L-arginina foi estimadaespectrofotometricamente a 540 nm.

A composição do meio de fermentação (g/l) é como a seguir:

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente.

CaCO3 é esterilizada a calor seco a 180 0C por 2 horas. O pH é ajustado para 7,0.

Os resultados de fermentações em tubo de teste são mostradosna Tabela 1. Conforme pode ser visto a partir da Tabela 1, cepas com geneartl ou agrupamento artPIQM-artJ inativados causaram uma quantidade maiselevada de acúmulo de L-arginina como comparado com cepa de E.coli 282produzindo L-arginina.

Tabela 1

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Apesar da invenção ter sido descrita em detalhes comreferência a formas de realização preferidas da mesma, será aparente a umversado na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentesempregados sem sair do escopo da invenção. Todas referências citadas aquisão incorporadas como parte do pedido por referência.

Claims (9)

1. Bactéria produtora de L-arginina da família deEnterobacteriaceae, caracterizada pelo fato de que referida bactéria foimodificada para atenuar a expressão de um ou vários genes codificando umtransportador de L-arginina.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que referida bactéria foi modificada para atenuar a expressão de geneartl.

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelofato de que a expressão do gene artl é atenuado por inativação do gene artl.

4. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que referida bactéria foi modificada para atenuar a expressão doagrupamento artPIQM-artJ.

5. Bactéria de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelofato de que a expressão do agrupamento artPIQM-artJ é atenuada porinativação do agrupamento artPIQM-artJ.

6. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que referida bactéria pertence ao gênero Eseheriehia.

7. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que referida bactéria pertence ao gênero Pantoea.

8. Bactéria de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelofato de que referida bactéria é Eseheriehia eoli.

9. Método para produzir L-arginina, caracterizado pelo fato decompreender:- cultivar a bactéria como definida em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8 em um meio, e- coletar L-arginina do meio.