BRPI0905514A2 - chitosan and hydroxyapatite (cnhap) biomaterial for bone filling and process for bone production - Google Patents
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Abstract
BIOMATERIAL DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA (CNHAP) PARA PREENCHIMENTO óSSEO E PROCESSO PARA PRODUçãO DO MESMO Processo para a obtenção do scaffold de um biomaterial hidrogel compósito (CNHAP) à base de quitosana (CN) e hidroxiapatita (HA), com grande potencial de aplicação na área médica-odontológica, demonstrando características de biocompatibilidade evidenciadas por ensaios clássicos in vitro. Estas características estão associadas à combinação de propriedadesfísico-químicas e biológicas dos materiais que o compõem. CNHAP foi obtido na forma de hidrogel com boas características mecânicas, de fácil manuseio e modelagem, com alta porosidade, o que o torna promissor como material de preenchimento ósseo. A produção do scaffold hidrogel compósito CNHAP foi efetuadapor um procedimento de mineralização ín situ do hidrogel polimérico de CN, por HA. Este método de mineralização in situ promoveu características mecânicas e de bioatividade ao CNHAP, adequadas à aplicação médico-odontológico. Além da biocompatibilidade, materiais de preenchimento de tecidos devem ser capazes de promover adesão, proliferação e diferenciação celular, requisitos essenciais à bioengenharia de tecidos, a qual vem sendo cada vez mais explorada, dentro da prática clínica.BIOMATERIAL OF CHITOSAN AND HYDROXIAPATITE (CNHAP) FOR BONE FILLING AND PROCESS FOR THE PRODUCTION OF THE SAME Process for obtaining the scaffold of a composite hydrogel biomaterial (CNHAP) based on chitosan (CN) and hydroxyapatite (HA), with great potential for application in medical-dental area, demonstrating biocompatibility characteristics evidenced by classic in vitro assays. These characteristics are associated with the combination of physical-chemical and biological properties of the materials that compose it. CNHAP was obtained in the form of hydrogel with good mechanical characteristics, easy to handle and model, with high porosity, which makes it promising as a bone filling material. The production of the CNHAP composite hydrogel scaffold was carried out by an in situ mineralization procedure of the polymeric hydrogel of CN, by HA. This in situ mineralization method promoted CNHAP mechanical and bioactivity characteristics, suitable for medical and dental applications. In addition to biocompatibility, tissue filling materials must be able to promote cell adhesion, proliferation and differentiation, essential requirements for tissue bioengineering, which has been increasingly explored within clinical practice.
Description
"BIOMATERIAL DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA (CNHAP) PARAPREENCHIMENTO ÓSSEO E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DO MESMO""Chitosan and Hydroxyapatite (CNHAP) BIOMATERIAL BONE FILLING AND PROCESS FOR PRODUCTION"
CAMPO DA INVENÇÃOFIELD OF INVENTION
A presente invenção refere-se a um biomaterial constituído dequitosana e hidroxiapatita (CNHAP) com aplicação em reconstrução tecidualóssea. Destaca-se neste biomaterial a ausência da possibilidade detransmissão de doenças infecto-contagiosas e de reações imunogênicas; alémde reações imunogênicas, infecções, inflamações devido à composição decomponentes bioativos, biodegradáveis e estéreis, além da capacidade de seabsorver substâncias como fármacos ou substâncias endógenas, por exemplo,células tronco.The present invention relates to a biomaterial consisting of chitosan and hydroxyapatite (CNHAP) with application in bone tissue reconstruction. This biomaterial highlights the absence of the possibility of transmission of infectious diseases and immunogenic reactions; in addition to immunogenic reactions, infections, inflammations due to the composition of bioactive, biodegradable and sterile components, as well as the ability to absorb substances such as drugs or endogenous substances, eg stem cells.
Neste material a ausência da possibilidade de transmissão dedoenças infecto-contagiosas e de reações imunogênicas são importantes deserem destacadas; não proporciona infecções nem inflamações, porqueCNHAP é a união de dois componentes bioativos e biodegradáveis; estéril;permite fácil aplicação e manuseio, bastando manter devidamenteacondicionado à fratura. Este material é totalmente identificávelradiologicamente.In this material the absence of the possibility of transmission of infectious diseases and immunogenic reactions are important to be highlighted; does not provide infections or inflammations, because CNHAP is the union of two bioactive and biodegradable components; sterile, allows easy application and handling, simply keeping properly conditioned to the fracture. This material is fully radiologically identifiable.
Atualmente, o processo de preenchimento ósseo é realizado coma utilização de cimentos ósseos, misturas simples, composição na forma de póe pasta, que apresentam limitações, como a impossibilidade de mineralizaçãoin situ, além do alto custo. A presente invenção permite contornar taislimitações e possibilitam agregar valor ao produto.Currently, the bone filling process is performed using bone cement, simple mixtures, powder and paste composition, which have limitations, such as the impossibility of mineralization in situ, besides the high cost. The present invention allows circumventing such limitations and makes it possible to add value to the product.
FUNDAMENTO DA INVENÇÃOBACKGROUND OF THE INVENTION
As doenças degenerativas e inflamatórias de ossos e articulaçõesafetam milhões de pessoas no mundo inteiro, representando cerca metade detodas as doenças crônicas em pessoas com mais de 50 anos de idade nospaíses desenvolvidos. A previsão é que a percentagem de pessoas com maisde 50 anos de idade afetadas por doenças ósseas irá dobrar até o ano de2020. Essas doenças freqüentemente exigem procedimentos cirúrgicos,incluindo substituição total ou parcial do tecido danificado nos casos dedoenças degenerativas ou fraturas por acidentes.Degenerative and inflammatory bone and joint diseases affect millions of people worldwide, accounting for about half of all chronic diseases in people over 50 in developed countries. It is predicted that the percentage of people over 50 affected by bone disease will double by the year 2020. These diseases often require surgical procedures, including total or partial replacement of damaged tissue in cases of degenerative diseases or fractures due to accidents.
Os biomateriais destinam-se à implantação no corpo humanocomo constituintes de dispositivos que são designados a realizar certasfunções bioiógicas através da substituição ou guiando o reparo ósseo quandonecessário.Biomaterials are intended for implantation into the human body as constituents of devices that are designed to perform certain biological functions by replacing or guiding bone repair as required.
Os biomateriais são descritos como materiais (implantes)especificamente desenvolvidos para obter compatibilidade com o sistemabiológico. Além disso, um biomaterial pode ser entendido como um material denatureza sintética ou natural com finalidade de melhorar, aumentar ou substituirtecidos ou órgãos. O critério para a escolha de um biomaterial é feito de acordocom a similaridade química e física deste, em relação ao tecido ou órgão a sersubstituído.Biomaterials are described as materials (implants) specifically developed for compatibility with the biological system. In addition, a biomaterial can be understood as a synthetic or natural nature material for the purpose of enhancing, augmenting or replacing organs or organs. The criterion for choosing a biomaterial is made according to its chemical and physical similarity in relation to the tissue or organ to be replaced.
Existem requisitos necessários para que um biomaterial sejaadequado, como: não causar danos locais ou sistêmicos (tóxicos,carcinogênicos ou radioativos) e ser biocompatível. A biocompatibilidade é umfator de suma importância para o sucesso dos biomateriais e pode ser definidacomo um material que provoca reações desejadas ao organismo. Além disso,características como composição e morfologia similar ao tecido a serreconstituído, vem sendo um aspecto diferencial e inovador nodesenvolvimento dos biomateriais. Até os dias de hoje não há um substitutoideal desenvolvido para substituição de tecidos ósseos.There are necessary requirements for a biomaterial to be suitable, such as: not causing local or systemic damage (toxic, carcinogenic or radioactive) and being biocompatible. Biocompatibility is a very important factor for the success of biomaterials and can be defined as a material that causes desired reactions to the organism. In addition, characteristics such as composition and morphology similar to the tissue to be reconstituted, has been a differential and innovative aspect in the development of biomaterials. To date there is no ideal substitute developed for bone tissue replacement.
Os biomateriais existentes no mercado variam muito de preço,sendo assim a melhor escolha seria o mais econômico a longo prazo. Comisso, os biomateriais que são substituídos pelo tecido ósseo novo reconstruídono local possuem custo mais elevado, entretanto o uso de biomateriais que nãosão substituídos resulta em uma nova intervenção cirúrgica para a troca por umnovo dispositivo com o passar do tempo, resultando num custo final dotratamento mais elevado.The existing biomaterials vary widely in price, so the best choice would be the most economical in the long run. As a result, biomaterials that are replaced by new local reconstructed bone tissue have a higher cost, however, the use of unsubstituted biomaterials results in a new surgical intervention to replace a new device over time, resulting in a higher final cost of treatment. high.
O biomaterial scaffold hidrogel compósito constituído dequitosana/hidroxiapatita, CNHAP, possui aplicação na área de preenchimentoósseo devido à união das características peculiares dos componentesenvolvidos, quitosana e hidroxiapatita. Entende-se por scaffold uma estruturade suporte, no caso da presente invenção uma matriz porosa que compreendebiomaterias com finalidade de preenchimento ósseo.The composite scaffold hydrogel hydrogel composed of chitosan / hydroxyapatite, CNHAP, has application in the bone filling area due to the union of the peculiar characteristics of the involved components, chitosan and hydroxyapatite. Scaffold is a support structure in the case of the present invention a porous matrix comprising bone filling materials.
A quitosana, um polissacarídeo, é obtida por desacetilaçãoalcaíina de ligações N-acetil presentes na quitina, as quais são rompidasformando a D-glicosamina, que contém um grupo amino livre, como ilustradana Figura 2. A diferença entre a quitina e a quitosana está na quantidade degrupos acetil. Quando o número de grupos acetil é maior que 50% (70-90%) obipolímero é determinado por quitina. Na terminologia da quitina, o número degrupos acetoamido é determinado pelo grau de acetilação (DA). Por outro lado,quando o grau de desacetilação (DD) ou o grupo amino é predominante, obiopolímero é determinado como quitosana. Logo, a quitosana é constituída porum conjunto de cadeias poliméricas parcialmente desacetiladas. As aplicaçõese características da quitosana dependem fundamentalmente do grau dedesacetilação e do tamanho das cadeias poliméricas. É um polímeroparcialmente cristalino, e o grau de cristalinidade depende do grau dedesacetilação.Chitosan, a polysaccharide, is obtained by deacetylation of the N-acetyl bonds present in chitin, which are broken down into D-glycosamine, which contains a free amino group, as illustrated in Figure 2. The difference between chitin and chitosan is in amount of acetyl groups. When the number of acetyl groups is greater than 50% (70-90%) the dipolymer is determined by chitin. In chitin terminology, the number of acetoamido groups is determined by the degree of acetylation (AD). On the other hand, when the degree of deacetylation (DD) or amino group is predominant, obiopolymer is determined as chitosan. Thus, chitosan is constituted by a set of partially deacetylated polymer chains. The applications and characteristics of chitosan depend fundamentally on the degree of acetylation and the size of the polymeric chains. It is a partially crystalline polymer, and the degree of crystallinity depends on the degree of acetylation.
Estudos comprovaram que a quitosana é segura para o consumohumano e tem sido utilizada em numerosas aplicações industriais, na área desaúde e em produtos alimentícios. É descrito que a toxicidade da quitosana émenor que a glicose (açúcar comum) ou sacarose.Studies have shown that chitosan is safe for human consumption and has been used in numerous industrial, health and food applications. Chitosan toxicity is reported to be lower than glucose (common sugar) or sucrose.
A quitosana além de biocompatível, bioativa e biodegradávelapresenta interessante propriedades biológicas, tais como atividadesbactericida, osteogênica, fungicida, hemostática, osteocondutiva, antitumor,imuno-adjuvante e ainda promove a osteointegração de um biomaterial aotecido ósseo.Besides being biocompatible, bioactive and biodegradable, chitosan presents interesting biological properties, such as bactericidal, osteogenic, fungicidal, hemostatic, osteoconductive, antitumor, immunoadjuvant activities and also promotes the osseointegration of a bone-enhanced biomaterial.
Biomateriais à base de quitosana tiveram utilização comobioadesivo, agente cicatrizante, agente antimicrobiano, material de bandagem,suporte para enxerto de pele, agente hemostático, material para sutura, e atémesmo material para lentes de contato, nas formas de filmes, géis, cápsulas,micro cápsulas ou soluções. Além disso, a quitosana apresenta açãobacteriostática, provavelmente pela ação dos grupos amino catiônicos daquitosana sobre os grupos aniônicos da parede celular de microorganismos.Biomateriais de quitosana também têm sido considerados como acelerador dareparação tecidual, capazes de aumentar a produção de matriz extracelularatravés do aumento de produção de fatores de crescimento. Tambémacelerariam a infiltração de linfócitos polimorfonucleares nas fases iniciais decicatrização tecidual, aumentando consideravelmente a osteopontina, umafosfoproteína capaz de aumentar a ligação celular na ferida em cicatrização.Alguns autores citam que a quitosana fomenta o crescimento celular, porque ascélulas aderem fortemente ao polímero e proliferam mais rapidamente. Estecomportamento tem sido aproveitado para os estudos em engenharia detecidos, sendo a quitosana utilizada em trabalhos de regeneração da pele, dotecido ósseo e cartilaginoso e na preparação de pele artificial. Atua tambémcomo material substituto ósseo que, ao longo do tempo, vai sendo substituídopor osso natural. Biomateriais à base de quitosana não reportaram nenhumareação alérgica ou inflamatória após sua implantação, injeção, aplicação tópicaou ingestão pelo corpo humano. Nesse âmbito, uma das possibilidades maispromissoras dos biomateriais obtidos da quitosana é sua capacidade emformar estruturas porosas, contendo fatores de crescimento, como proteínasmorfogenéticas ósseas ou fatores de crescimento vascular em suacomposição, e que podem ser utilizados como suportes para crescimentocelular. Recentemente, hidrogéis de quitosana foram utilizados comocarreadores para proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-2) e implantados emdefeitos ósseos críticos criados na calvária de ratos, proporcionandoregeneração tecidual otimizada, quando comparada ao uso dessas proteínasisoladamente.Chitosan-based biomaterials have been used as bioadhesive, healing agent, antimicrobial agent, bandage material, skin graft support, hemostatic agent, suture material, and even contact lens material in the form of films, gels, capsules, micro capsules or solutions. Moreover, chitosan has bacteriostatic action, probably due to the action of the cationic amino groups of thaitosan on the anionic groups of the microorganism cell wall. Chitosan materials have also been considered as accelerating tissue separation, capable of increasing extracellular matrix production through increased production. of growth factors. It would also accelerate the infiltration of polymorphonuclear lymphocytes in the early stages of tissue healing, significantly increasing osteopontin, a phospoprotein capable of increasing cell binding in the healing wound. . This behavior has been used for engineering studies, being the chitosan used in skin regeneration, bone and cartilaginous work and in the preparation of artificial skin. It also acts as bone substitute material that over time is replaced by natural bone. Chitosan-based biomaterials reported no allergic or inflammatory reactions after their implantation, injection, topical application or ingestion by the human body. In this context, one of the most promising possibilities of biomaterials obtained from chitosan is its ability to form porous structures containing growth factors, such as bone morphogenetic proteins or vascular growth factors in their composition, which can be used as support for cell growth. Recently, chitosan hydrogels have been used as bone morphogenetic protein (BMP-2) carriers and implanted in critical bone defects created in rat calvaria, providing optimal tissue regeneration when compared to the use of these proteins alone.
O componente inorgânico que mais se assemelha à composiçãodo osso é os fosfato de cálcio, dentre os quais a mais difundida é ahidroxiapatita (HA), cuja estrutura química é representada pela fórmulaC10(PO4)6(OH)2. As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HA) sãobem documentadas na literatura. Ela é utilizada na correção de defeitos ósseosno homem e em várias espécies animais, com resultados satisfatórios. Évantajosa por causa de sua composição uniforme, alta biocompatibilidade,segurança (não é tóxica, nem alergênica ou carcinogênica) e pelo fato de suamicroestrutura (tamanho dos poros) ser completamente controlável. Ahidroxiapatita permite a junção, proliferação, migração e expressão fenotípicade células ósseas, o que resulta em formação de novo osso, em aposiçãodireta ao biomateriai.The inorganic component that most closely resembles bone composition is calcium phosphate, the most widespread of which is hydroxyapatite (HA), whose chemical structure is represented by the formula C10 (PO4) 6 (OH) 2. The biological properties of synthetic hydroxyapatite (HA) are well documented in the literature. It is used to correct bone defects in humans and in various animal species, with satisfactory results. It is advantageous because of its uniform composition, high biocompatibility, safety (non-toxic, allergenic or carcinogenic) and the fact that its microstructure (pore size) is completely controllable. Hydroxyapatite allows the joining, proliferation, migration and phenotypic expression of bone cells, which results in new bone formation in direct apposition to the biomaterial.
As biocerâmicas de fosfato de cálcio porosas com estruturastridimensionais utilizadas para preenchimento ósseo são bioativas e permite ocrescimento de tecido ósseo e revascularização da área do implante pelaligação química estabelecida entre a fase mineral dos ossos e o biomateriai. Adificuldade em relação ao uso de biocerâmicas está na má adaptação direta àfalha do tecido ósseo a ser reparado, pois são peças rígidas com tamanhosdefinidos devendo ser adaptados com um segundo material geralmente naforma de pasta ou pó particulado para o completo preenchimento do local, ou amigração de fragmentos ocasionando na não regeneração óssea.The porous calcium phosphate bioceramics with three-dimensional structures used for bone filling are bioactive and allow for bone tissue growth and revascularization of the implant area by the chemical bond established between the bone mineral phase and the biomaterial. The difficulty regarding the use of bioceramics is the direct misadjustment to the bone tissue failure to be repaired, since they are rigid pieces with defined sizes and must be adapted with a second material usually in the form of paste or particulate powder for the complete filling of the site, or friendliness. fragments causing non-bone regeneration.
É importante salientar que o conceito de material poroso, sob aóptica da biocompatibilidade, está fundamentado em dimensões de poroscompletamente diferentes do que é usual para a Química. Segundo IUPAC,materiais macroporos apresentam poros com dimensões maiores que 50 nm.Contudo, para que um biomateriai seja considerado macroporoso é necessárioque ele apresente poros da ordem do diâmetro Harvesiano (50 a 250 mm).It is important to note that the concept of porous material, under the biocompatibility approach, is based on pore dimensions that are completely different from what is usual for chemistry. According to IUPAC, macropore materials have pores larger than 50 nm. However, for a biomaterial to be considered macroporous, it must have pores of the Harvesian diameter (50 to 250 mm).
Como já foram discutidas anteriormente, as biocerâmicas defosfato de cálcio apresentam características físico-químicas e arquitetônicasimportantes que possibilitam respostas biológicas como osteocondutividade eosteoindutividade intrínseca. Por outro lado, os polímeros biodegradáveis têmsido utilizados como suportes na engenharia de tecidos, principalmente pelacinética previsível de biodegradação e plasticidade. No entanto, a formação decompósitos parece aperfeiçoar a resposta biológica reparadora. Todavia, aquitosana apresenta propriedades biológicas bastante favoráveis para areconstrução óssea.As discussed earlier, calcium phosphate bioceramics have important physicochemical and architectural characteristics that enable biological responses such as osteoconductivity and intrinsic osteosuctivity. On the other hand, biodegradable polymers have been used as supports in tissue engineering, mainly foreseeable biodegradation and plasticity kinetics. However, decomposition formation seems to improve the restorative biological response. However, aquitosan has very favorable biological properties for bone reconstruction.
Desse modo, apesar de existirem muitos biomateriais na forma descaffolds para a engenharia de tecidos, uma matriz para o crescimento ósseodeveria ser arquitetada para degradar (1) passivamente por dissolução no meiobiológico e (2) ativamente por reabsorção dos osteoclastos durante oremodelamento normal do tecido ósseo.Thus, although there are many decafolded biomaterials for tissue engineering, a bone growth matrix should be designed to degrade (1) passively by dissolution in the biological environment and (2) actively by resorption of osteoclasts during normal bone tissue remodeling. .
Entre os principais requisitos para o desenvolvimento de umbiomaterial scaffold para engenharia de tecidos óssea poderíamos citar: (1)fácil disponibilidade para o cirurgião; (2) promoção do crescimento ósseo; (3)não indução de crescimento de tecido mole na interface osso/implante; (4)diâmetro médio dos poros entre 200 e 400 mm; (5) absorção de uma maneiraprevisível de acordo com o crescimento ósseo e (6) propriedades mecânicas efísicas apropriadas para aplicação.Among the key requirements for developing a scaffold bone tissue engineering material could be: (1) easy availability for the surgeon; (2) promotion of bone growth; (3) no induction of soft tissue growth at the bone / implant interface; (4) average pore diameter between 200 and 400 mm; (5) absorption in a predictable manner according to bone growth; and (6) appropriate physical and mechanical properties for application.
Adicionalmente, o projeto de cada biomaterial scaffold devepermitir: (1) fácil manipulação na preparação e implementação do materialimplantado; (2) alta porosidade para permitir um rápido acesso e manutençãoda vasculatura, assim como apresentar espaço para deposição de matrizes ecomponentes estruturais; (3) capacidade de ser aparado ou esculpido paraencaixar-se perfeitamente ao sítio cirúrgico e (4) um rápido e reprodutívelprocesso de dissolução em cada sítio implantado.Additionally, the design of each scaffold biomaterial should allow: (1) easy handling in the preparation and implementation of the implanted material; (2) high porosity to allow quick access and maintenance of the vasculature, as well as to provide space for deposition of matrices and structural components; (3) the ability to be trimmed or sculpted to fit the surgical site perfectly and (4) a rapid and reproducible dissolution process at each implanted site.
Neste contexto, quitosana tem sido utilizada em combinação comdiferentes componentes inorgânicos bioativos, especificamente a hidroxiaptaita(HA) para regeneração de tecidos devido à osteocondutividade. A incorporaçãode HA com quitosana pode promover a bioatividade e a osteointegração dobiomaterial e o osso. Os pesquisadores têm dado muita atenção aoscompósitos de quitosana e hidroxiapatita em diferentes proporções, na formade pó, pasta e ainda na forma de scaffold para regeneração óssea.In this context, chitosan has been used in combination with different bioactive inorganic components, specifically hydroxyaptaite (HA) for tissue regeneration due to osteoconductivity. Incorporating HA with chitosan may promote bioactivity and osteointegration of the material and bone. Researchers have been paying close attention to chitosan and hydroxyapatite composites in different proportions, in powder, paste and scaffold form for bone regeneration.
Os métodos convencionais para a preparação de compósitos dequitosana e hidroxiapatita são realizados pela mistura mecânica da HAP emquitosana dissolvida em soluções de ácido acético, e então a mistura é secaem temperatura ambiente ou liofilizada. O material final é heterogêneo e opacocom estrutura compacta ou porosa. Entretanto, o método de liofilização para aobtenção de material poroso, não mantém a integridade da estrutura domaterial, fazendo com que o material se rompa pela velocidade de evaporaçãodo solvente.Um compósito de quitosana e hidroxiapatita pode ser preparadopelo método de precipitação simultânea na forma de bastão (Hu ecolaboradores [18]). Sendo assim, é preparado um gel de quitosana dissolvidaem solução de ácido acético e posteriormente adicionado uma solução deCa(N03)2-4H20 e KH2PO4 em ácido acético, misturados e o gel foi despejadoem um cilindro preparado por uma membrana de quitosana enrolada. Após ogel estar dentro do cilindro de quitosana foi imerso em solução de hidróxidopara a precipitação simultânea de CN e HA e em seguida retirada a membranae o hidrogel liofilizado. O material apresentou-se na forma transparente combaixa quantidade de HA e opaco com alta quantidade de HA e com ausênciade poros. Entretanto, a ausência de poros na material afeta no desempenho daregeneração óssea, uma vez que a morfologia e porosidade similar ao tecidoósseo são de extrema importância na osteocondução. A ausência de poros nomaterial pode levar a agir como barreira para a condução do fluído corpóreopodendo desencadear inflamação generalizada no local.Conventional methods for the preparation of dequitosan and hydroxyapatite composites are performed by mechanical mixing of PAH emchitosan dissolved in acetic acid solutions, and then the mixture is dried at room temperature or lyophilized. The final material is heterogeneous and opaque with compact or porous structure. However, the lyophilization method for obtaining porous material does not maintain the integrity of the material structure, causing the material to rupture at the rate of solvent evaporation. A chitosan and hydroxyapatite composite can be prepared by the simultaneous precipitation method in the form of a rod. (Hu and co-workers [18]). Thus, a chitosan gel dissolved in acetic acid solution is prepared and then added a solution of Ca (NO3) 2-4H20 and KH2PO4 in acetic acid, mixed and the gel poured into a cylinder prepared by a rolled chitosan membrane. After the gel was inside the chitosan cylinder, it was immersed in hydroxide solution for simultaneous precipitation of CN and HA and then the lyophilized hydrogel was removed from the membranes. The material was transparent in the form of low HA and opaque with high HA and no pores. However, the absence of pores in the material affects bone regeneration performance, since bone tissue morphology and porosity are of utmost importance in osteoconduction. The absence of nomaterial pores may lead to act as a barrier to the conduction of body fluid and may trigger widespread inflammation at the site.
Entre os muitos materiais utilizados como cimento ósseo,polimetilmetacrilato (PMMA) ou seus derivados têm sido bastante utilizados emcirurgias ortopédicas. Entretanto, o uso é limitado devido às diversascomplicações, como exemplo, o PMMA não proporciona a osseointegraçãoentre o material e o osso, não tem bioatividade, possui baixa propriedademecânica, provoca aumento da temperatura no local devido à reaçãoexotérmica de polimerização, e apresenta toxicidade do monômero. Alémdisso, mesmo a grande utilização de cimentos a base de PMMA nos últimosanos, falhas ocorreram na maioria das vezes devido à necrose do tecido.Among the many materials used as bone cement, polymethyl methacrylate (PMMA) or their derivatives have been widely used in orthopedic surgeries. However, its use is limited due to various complications, for example, PMMA does not provide osseointegration between material and bone, has no bioactivity, has low mechanical properties, causes an increase in site temperature due to the polymerization exothermic reaction, and monomer toxicity. . Moreover, even the widespread use of PMMA-based cements in recent years, failures have occurred most often due to tissue necrosis.
Contudo, diversas pesquisas têm sido realizadas em adicionar componentesbioativos com PMMA. Kim e colaboradores modificaram PMMA pela adição dequitosana e hidroxiapatita por serem bioativos e biocompatíveis. Investigaram opotencial de aplicação clínica através de testes in vitro e animais. Foiobservado que os compósitos demonstraram osteocondução ebiocompatibilidade. Entretanto, concluíram que mais estudos com animaisprecisam ser realizados para uma avaliação mais completa para a substituiçãodo cimento já utilizado de PMMA pelos compósitos dePMMA/quitosana/hidroxiapatita. Dois anos após a publicação desse artigohouve o depósito de uma patente internacional por Neoh e colaboradores em2007 relatando o invento de um cimento ósseo composto de PMMA comquitosana ou derivado de quitosana.However, a lot of research has been done into adding PMMA bioactive components. Kim and colleagues modified PMMA by adding chitosan and hydroxyapatite because they are bioactive and biocompatible. They investigated the potential for clinical application through in vitro and animal testing. It was noted that the composites demonstrated osteoconduction and bio-compatibility. However, they concluded that further animal studies need to be performed for a more thorough evaluation of the replacement of the previously used PMMA cement with PMMA / chitosan / hydroxyapatite composites. Two years after the publication of this article, an international patent was filed by Neoh and colleagues in 2007 reporting the invention of a bone cement composed of either chitosan or chitosan-derived PMMA.
Ito e colaborador desenvolveram e testaram um material na formade pasta para um possível substituto ósseo para tratamento odontológico. Omaterial foi preparado pela mistura mecânica dos compostos hidroxiapatita(HAP) na forma de pó, ZnO e CaO, e misturados a um gel de quitosana paraformar uma pasta de endurecimento rápido. O composto apresentou pH neutro,ajuste em tempo curto, e resistência à compressão relativamente alta. O uso domaterial para tratamento de defeitos periodontais se mostrou bastante eficaz naunião entre o implante e o osso e tem grande potencial para aliviar osproblemas associados com a implantação de partículas HAP, pois ocorre amigração antecipada dessas partículas sem que haja a união entre o implantee o osso. Porém a forma de pasta limita o processo de regeneração do osso,podendo dificultar o manuseio ou ainda desencadear uma reação inflamatóriageneralizada, algo que não ocorre com o presente invento proposto.Ito and collaborator developed and tested a paste-like material for a possible bone substitute for dental treatment. The material was prepared by mechanical mixing of the hydroxyapatite (HAP) compounds in powder form, ZnO and CaO, and mixed with a chitosan gel to form a fast hardening paste. The compound showed neutral pH, short time adjustment, and relatively high compressive strength. The use of the material to treat periodontal defects has been shown to be very effective in the joint between the implant and the bone and has great potential to alleviate the problems associated with the implantation of PAH particles, because there is anticipated amicability of these particles without the union between the implant and the bone. . However, the paste form limits the process of bone regeneration and may make it difficult to handle or even trigger a generalized inflammatory reaction, something that does not occur with the proposed present invention.
Diante do estado da técnica é possível observar diversosdocumentos que mencionam produtos e processos que contemplam o uso dequitosana e hidroxiapatica como componentes, porém baseiam-se somente emuma mistura mecânica entre os componentes, algo que difere da presenteinvenção. Ito e colaboradores descrevem um método de obtenção de umasubstância osseoindutiva e a preparação de um material contendo essasubstância osseoindutiva para preenchimento ósseo. O material foi preparadopela mistura de substância osseoindutiva (substância derivada do colágeno)com gel de quitosana e hidroxiapatita em pó. Para a formação do gel dequitosana utilizou o ácido málico. Foram preparadas diferentes proporções doscomponentes e obtidos materiais com diferentes propriedades mecânicas. Omaterial utilizado na preparação do biomaterial é relativamente longo e requeroutras etapas de preparação podendo carregar resíduos de príon devido aomaterial ser de origem animal, podendo acarretar também em inflamação aotecido vizinho.No pedido de patente US2008181926-A1 há descrição do métodobiomimético de obtenção de compósitos de quitosana/ácidogalacturônico/hidroxiapatita pela mineralização in situ de hidroxiapatita. Foramutilizadas misturas de diferentes soluções preparadas a partir dos componentesquitosana, ácido galacturônico e NaaHPO4 e CaC^1 e obtiveram compósitosnas formas de grânulos através de centrifugação e posterior secagem e filmesscaffolds através de liofilização. Os resultados dos materiais demonstraramuma boa interação entre a matriz quitosana e as partículas de HA, mudançasnos parâmetros e cristalinidade da HA devido à presença da quitosana quandocomparado a HA pura e uma alta biocompatibilidade. O processo de obtençãodo material citado no trabalho requer de longo processo de preparaçãoresultando num maior custo final e ainda o processo de liofilização (secagemdo material por sublimação) não mantém a integridade da estrutura dos porosdo material. Além de ser uma técnica muito cara e não aceitar qualquersolvente, principalmente se for ácido.Given the state of the art it is possible to observe several documents that mention products and processes that contemplate the use of chitosan and hydroxyapatica as components, but are based only on a mechanical mixture between the components, something that differs from the present invention. Ito and colleagues describe a method for obtaining an osseous inductive substance and the preparation of a material containing such an osseous inductive substance for bone filling. The material was prepared by mixing bone-inductive substance (collagen-derived substance) with chitosan gel and hydroxyapatite powder. For the formation of dequitosan gel used malic acid. Different proportions of the components were prepared and materials with different mechanical properties were obtained. The material used in the preparation of the biomaterial is relatively long and requires other preparation steps which may carry prion residues due to the material being of animal origin and may also cause inflammation to the neighboring fabric. In US2008181926-A1 there is a description of the biomimetic method of obtaining composites of chitosan / galacturonic acid / hydroxyapatite by in situ mineralization of hydroxyapatite. Mixtures of different solutions prepared from the components chitosan, galacturonic acid and NaaHPO4 and CaC ^ 1 were used and obtained composites in the form of granules by centrifugation and subsequent drying and filmcaffolds by lyophilization. The results of the materials demonstrated a good interaction between the chitosan matrix and HA particles, changes in the parameters and crystallinity of HA due to the presence of chitosan when compared to pure HA and a high biocompatibility. The process of obtaining the material cited in the paper requires a long process of preparation resulting in a higher final cost and yet the lyophilization process (drying of the material by sublimation) does not maintain the integrity of the pore structure of the material. Besides being a very expensive technique and not accepting any solvents, especially if it is acidic.
Tendo em vista as limitações das tecnologias atuais, a presenteinvenção traz um biomaterial na forma final de hidrogel, que possuicaracterísticas de extrema importância na aplicação em tecidos ósseos, comoa morfologia similar ao osso, scaffold com poros interconectados quepromovem uma melhor regeneração do tecido ósseo pela osseocondução.Given the limitations of current technologies, the present invention brings a biomaterial in the final form of hydrogel, which has extremely important features in bone tissue application, such as bone-like morphology, scaffold with interconnected pores that promote better bone tissue regeneration by osseeduction. .
Devido a sua forma de hidrogel, há uma facilidade de adaptação ao local defratura ósseo, aliado à facilidade de troca da água preenchida nos poros porsoluções contendo substâncias bioativas ou ainda células tronco para induçãoda formação óssea mais rápida e eficaz.Due to its hydrogel form, it is easy to adapt to the bone fracture site, combined with the ease of exchange of water filled in the pores by solutions containing bioactive substances or even stem cells to induce faster and more effective bone formation.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOBRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION
A presente invenção trata-se de um scaffold biomaterial hidrogelcompósito CNHAP com características mecânicas que permitem um manuseiono momento de sua utilização, fracionamento no tamanho da fratura óssea emoldagem à sua forma no instante da intervenção cirúrgica. Além disso, obiomaterial apresenta características similares ao tecido ósseo como acomposição, topografia, poros intercomunicantes, propriedadesintercomunicantes e propriedades biológicas adequadas à regeneração óssea,sem deixar resíduo tóxico ou carcinogênico além de ser antibactericida.The present invention is a CNHAP hydrogelcomponent biomaterial scaffold with mechanical characteristics that allow a handling moment of its use, fractionation in the size of the bone fracture and its shape at the moment of the surgical intervention. In addition, the obiomaterial presents characteristics similar to bone tissue such as its composition, topography, intercommunicating pores, intercommunicating properties and biological properties suitable for bone regeneration, without leaving toxic or carcinogenic residue besides being antibacterial.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
A Figura 1 ilustra um esquema de preparação do CNHAP.Figure 1 illustrates a CNHAP preparation scheme.
A Figura 2 ilustra um esquema da obtenção da quitosana atravésda quitina.Figure 2 illustrates a scheme of obtaining chitosan through chitin.
A Figura 3 ilustra um esquema de preparação do scaffold hidrogelcompósito CNHAP através da reação dos precursores envolvidos na reação dahidroxiapatita e o gel de quitosana.Figure 3 illustrates a scheme for preparing the CNHAP hydrogel composite scaffold by reacting the precursors involved in the reaction of hydroxyapatite and chitosan gel.
A Figura 4 apresenta um espectro IV do compósito de CNHAP.Figure 4 shows an IR spectrum of the CNHAP composite.
A Figura 5 ilustra um espectro RMN 31P do compósito CNHAP. Oreferido espectro ilustra um único pico indicando um tipo de fosfato de cálcio,HA.Figure 5 illustrates a 31 P NMR spectrum of the CNHAP composite. Said spectrum illustrates a single peak indicating a type of calcium phosphate, HA.
A Figura 6 apresenta difratogramas da quitosana pura (A) e docompósito CNHAP (B). Observa-se através da análise de raios X dos materiais,picos de difração típicos de HA e o decréscimo do halo da quitosana.Figure 6 shows diffractograms of pure chitosan (A) and CNHAP composite (B). Through the X-ray analysis of the materials, typical HA diffraction peaks and the chitosan halo decrease are observed.
A Figura 7 apresenta curvas termogravimétricas (a) e da derivadada curva termogravimétrica (b) para quitosana pura (A) e para o scaffoldcompósito CNHAP (Β). A referida figura ilustra as curvas termogravimétricas daquitosana e do scaffold seco. Observam-se comportamentos similares entre adegradação da quitosana pura e do scaffold seco, restando um resíduobastante significativo de aproximadamente 49% referente a HA mineralizada insitu.Figure 7 shows thermogravimetric curves (a) and the derived thermogravimetric curve (b) for pure chitosan (A) and CNHAP composite scaffold (Β). Said figure illustrates the thermogravimetric curves of that and dry scaffold. Similar behaviors are observed between the degradation of pure chitosan and dry scaffold, with a significant residual of approximately 49% remaining with respect to insitu mineralized HA.
A Figura 8 ilustra uma fotografia do scaffold hidrogel compósitoCNHAP. Superfície da face superior (esquerda) e superfície da face inferior(direita). Tal fotografia ilustra a diferença entre as superfícies em relação àtopografia, as quais diferem numa maior área superficial, disponibilizando umamaior área para a adesão de células, como pode ser observado nos resultadosbiológicos, que o CNHAP-rugoso (Figura 8 lado esquerdo) apresenta melhoresresultados em relação a superfície lisa (Figura 8 lado direito).A Figura 9 apresenta uma fotografia do corte do scaffold hidrogelcompósito CNHAP.Figure 8 illustrates a photograph of the scaffold CNHAP composite hydrogel. Upper face surface (left) and lower face surface (right). This photograph illustrates the difference between the surfaces in relation to the topography, which differ in a larger surface area, providing a larger area for cell adhesion, as can be observed in the biological results, that the rough-CNHAP (Figure 8 left side) has better results. relation to the smooth surface (Figure 8 right side). Figure 9 shows a photograph of the CNHAP composite hydrogel scaffold cut.
A Figura 10 apresenta micrografias do scaffold hidrogel compósitoCNHAP. (A) x1000 e (B) x6000. Pode ser observada a porosidadeintercomunicante do scaffold, conforme a seta, e a morfologia globular da HAdispersa pela matriz de quitosana.Figure 10 shows micrographs of the scaffold CNHAP composite hydrogel. (A) x1000 and (B) x6000. Intercommunicating porosity of scaffold can be observed, according to the arrow, and globular morphology of HAdispersa by the chitosan matrix.
A Figura 11 apresenta uma análise da viabilidade celular de pre-osteoblastos crescidos sobre diferentes materiais. Células crescidas sobre opoliestireno foi considerado como 100% (controle positivo, PS); (*) p<0.05.PS=Poliestireno.Figure 11 presents an analysis of the cell viability of pre-osteoblasts grown on different materials. Cells grown on opolystyrene were considered as 100% (positive control, PS); (*) p <0.05.PS = Polystyrene.
A Figura 12 ilustra a. expressão de proteínas relacionadas com asobrevivência e viabilidade celular: A) Akt e B) Erk. Poliestireno (PS) foiconsiderado como grupo controle. Os gráficos representam a análisedensitométrica das bandas obtidas por immunoblotting.Figure 12 illustrates a. protein expression related to cell survival and viability: A) Akt and B) Erk. Polystyrene (PS) was considered as a control group. The graphs represent the sensitivity analysis of the bands obtained by immunoblotting.
A Figura 13 apresenta níveis de adesão e proliferação celular. Ográfico representa qualitativamente a quantidade de células aderidas pelaincorporação do cristal violeta. Tempos de análise: 15 min, 6 h e 48 h de cultivocelular; (*) p<0.05; (**) p<0.01. Poliestireno (PS) foi considerado como grupocontrole.Figure 13 shows levels of cell adhesion and proliferation. The graph represents qualitatively the amount of cells adhered by the incorporation of the violet crystal. Analysis times: 15 min, 6 h and 48 h of cell culture; (*) p <0.05; (**) p <0.01. Polystyrene (PS) was considered as group control.
A Figura 14. (A) ilustra uma expressão de proteínas relacionadascom a adesão celular. Poliestireno (PS) foi considerado como grupo controle.Já a Figura 14 (B) ilustra um gráfico representando a análise densitométricadas bandas obtidas por immunoblotting.Figure 14. (A) illustrates an expression of proteins related to cell adhesion. Polystyrene (PS) was considered as a control group. Already Figure 14 (B) illustrates a graph representing the densitometric analysis of bands obtained by immunoblotting.
A Figura 15. (A) ilustra uma expressão de proteínas relacionadascom a progressão do ciclo celular. Poliestireno (PS) foi considerado comogrupo controle. Já a Figura 15 (B) ilustra um gráfico representando a análisedensitométrica das bandas obtidas por immunoblotting.Figure 15. (A) illustrates an expression of proteins related to cell cycle progression. Polystyrene (PS) was considered as a control group. Figure 15 (B) illustrates a graph representing the sensitivity analysis of the bands obtained by immunoblotting.
A Figura 16 apresenta uma análise da atividade de fosfatasealcalina de pre-osteoblastos cultivadas sobre os diferentes materiais.Figure 16 shows an analysis of phosphatealcaline activity of pre-osteoblasts grown on different materials.
Poliestireno (PS) foi considerado como grupo controle, (ns) sem diferençaestatística; (*) p<0.05; (**) p<0.01.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃOPolystyrene (PS) was considered as a control group, (ns) without statistical difference; (*) p <0.05; (**) p <0.01. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
O objeto do presente invento trata-se de um processo paraobtenção de um biomaterial hidrogel scaffold compósito através damineralização in situ e produto obtido compreendendo elementos bioativos,biodegradáveis e estéreis para aplicação em reconstrução tecidual óssea.The object of the present invention is a process for obtaining a composite scaffold hydrogel biomaterial by in situ mineralization and a product obtained comprising bioactive, biodegradable and sterile elements for application in bone tissue reconstruction.
Para efeito desta invenção, a expressão biomaterial hidrogelscaffold compósito diz respeito ao material obtido com as características deinteresse para aplicação em reconstrução tecidual óssea.For the purpose of this invention, the term hydrogelscaffold composite biomaterial refers to material obtained with the characteristics of interest for application in bone tissue reconstruction.
Para a execução do invento foram utilizados materiais de partidacompreendendo a quitosana de alta massa molar, viscosidade entre 800-2000cP e grau de desacetilação ~83%, na forma de pó, de procedência Aldrich (St.Louis1 MO, USA). A hidroxiapatita comercial (do tipo P.A. ≥90%) deprocedência Fluka, foi utilizada como referência. O Ca(NO3)2 foi de procedênciaMerck (Darmstadt, Hessen, Alemanha). O H3PO4 (do tipo P.A.) e o NH4OH(teor (NH3) 28,0-30,0%) foram de procedência Synth (Diadema, São Paulo,Brasil). Todos os componentes foram utilizados sem tratamento prévio. Placasde poços de poliestireno, PS, de procedência TPP (St. Louis, MO, USA), foramutilizadas como controle para o cultivo de células. Os anticorpos utilizadosneste trabalho foram obtidos da Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA).pNPP (fosfato p-nitrofenil dissódico hexahidratado) usado para medida daatividade de fosfatase alcalina e MTT (brometo de dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeηiItetrazólio) foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA).For the implementation of the invention starting materials were used comprising high molar chitosan, viscosity between 800-2000cP and degree of deacetylation ~ 83% in powder form from Aldrich (St.Louis1 MO, USA). Commercial hydroxyapatite (type P.A. ≥90%) of Fluka yield was used as a reference. Ca (NO3) 2 was from Merck (Darmstadt, Hessen, Germany). H3PO4 (type P.A.) and NH4OH (content (NH3) 28.0-30.0%) were of Synth origin (Diadema, São Paulo, Brazil). All components were used without previous treatment. TP polystyrene well plates, PS, from St. Louis, MO, USA, were used as a control for cell culture. Antibodies used in this work were obtained from Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). PNPP (p-nitrophenyl disodium phosphate hexahydrate) used to measure alkaline phosphatase activity and MTT (dimethylthiazol-2-yl bromide) -2,5- dietetrazolium) were purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA).
Para o processo de obtenção do biomaterial hidrogel scaffoldcompósito foi realizado uma mineralização in situ do gel de quitosana por25 hidroxiapatita. em meio ácido, seguido de adição de solução de Ca+2 eposterior neutralização, visando manter uma razão Ca/P de 1,67, razão de Cae P observada nos ossos, onde quitosana (pó), 3g, foram adicionados a 80 mLde uma solução de ácido fosfórico (1,85 mL de H3P04/80 mL de H2O), seguidada adição de 20 mL de uma solução de Ca+2 (Ca(NO3)2, 10,68g/20mL H2O),obedecendo a uma razão Ca/P de 1,67, o qual representa a formação dehidroxiapatita, formando um gel ácido (pH~ 2,3). A proporção em massa deCN:HA estimada nos compósitos foi de 60:40, próximo das proporções decomponentes orgânico: inorgânico encontradas nos ossos. Alíquotas de 4 a 6 mL, preferencialmente 5 mL deste hidrogel foram transferidas para moldes deTeflon® (3cm2 de diâmetro χ 2cm de profundidade) e neutralizadas pela adiçãode 20mL da solução de hidróxido de amônio (NH4OH) diretamente sobre o gelaté o total preenchimento do volume do molde. Após esta etapa, os moldespermaneceram em recipiente fechado entre 40 e 60 h, preferencialmente por48h à temperatura entre 10 e 30°C, preferencialmente 25°|C para o processode mineralização de hidroxiapatita in situ. O scaffold compósito foi retirado,lavado com água deionizada até a remoção completa do subproduto salino(nitrato de amônio) e mantidos em água deionizada sob 15 e -2°C,preferencialmente 10°C refrigeração, até sua utilização.For the process of obtaining the composite scaffold hydrogel biomaterial an in situ mineralization of the chitosan gel by 25 hydroxyapatite was performed. in acid medium followed by addition of Ca + 2 solution and subsequent neutralization to maintain a Ca / P ratio of 1.67, Cae P ratio observed in bones where chitosan (powder), 3g, was added to 80 mL of a phosphoric acid solution (1.85 mL of H3PO4 / 80 mL of H2O), followed by the addition of 20 mL of a Ca + 2 (Ca (NO3) 2, 10.68g / 20mL H2O) solution, following a Ca ratio / P of 1.67, which represents the formation of hydroxyapatite, forming an acid gel (pH ~ 2.3). The mass ratio of CN: HA estimated in the composites was 60:40, close to the organic: inorganic decomposing ratios found in bones. Aliquots of 4 to 6 mL, preferably 5 mL of this hydrogel were transferred to Teflon® molds (3cm2 χ 2cm deep) and neutralized by the addition of 20mL of ammonium hydroxide solution (NH4OH) directly onto the gel until the volume was completely filled. of the mold. After this step, the molds remained in a sealed container for 40 to 60 hours, preferably for 48 hours at a temperature of 10 to 30 ° C, preferably 25 ° C for in situ hydroxyapatite mineralization process. The composite scaffold was removed, washed with deionized water until complete removal of the saline by-product (ammonium nitrate) and kept in deionized water at 15 and -2 ° C, preferably 10 ° C refrigeration, until use.
Os exemplos aqui descritos tem o intuito somente de exemplificaralgumas das inúmeras formas de realização da invenção, e portanto devem serencarados de forma ilustrativa, e não restritiva.The examples described herein are intended solely to exemplify some of the numerous embodiments of the invention, and should therefore be construed as illustrative rather than restrictive.
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