BRPI0905514A2 - biomaterial de quitosana e hidroxiapatita (cnhap) para preenchimento ósseo e processo para produção do mesmo - Google Patents

Abstract

BIOMATERIAL DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA (CNHAP) PARA PREENCHIMENTO óSSEO E PROCESSO PARA PRODUçãO DO MESMO Processo para a obtenção do scaffold de um biomaterial hidrogel compósito (CNHAP) à base de quitosana (CN) e hidroxiapatita (HA), com grande potencial de aplicação na área médica-odontológica, demonstrando características de biocompatibilidade evidenciadas por ensaios clássicos in vitro. Estas características estão associadas à combinação de propriedadesfísico-químicas e biológicas dos materiais que o compõem. CNHAP foi obtido na forma de hidrogel com boas características mecânicas, de fácil manuseio e modelagem, com alta porosidade, o que o torna promissor como material de preenchimento ósseo. A produção do scaffold hidrogel compósito CNHAP foi efetuadapor um procedimento de mineralização ín situ do hidrogel polimérico de CN, por HA. Este método de mineralização in situ promoveu características mecânicas e de bioatividade ao CNHAP, adequadas à aplicação médico-odontológico. Além da biocompatibilidade, materiais de preenchimento de tecidos devem ser capazes de promover adesão, proliferação e diferenciação celular, requisitos essenciais à bioengenharia de tecidos, a qual vem sendo cada vez mais explorada, dentro da prática clínica.

Description

"BIOMATERIAL DE QUITOSANA E HIDROXIAPATITA (CNHAP) PARAPREENCHIMENTO ÓSSEO E PROCESSO PARA PRODUÇÃO DO MESMO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um biomaterial constituído dequitosana e hidroxiapatita (CNHAP) com aplicação em reconstrução tecidualóssea. Destaca-se neste biomaterial a ausência da possibilidade detransmissão de doenças infecto-contagiosas e de reações imunogênicas; alémde reações imunogênicas, infecções, inflamações devido à composição decomponentes bioativos, biodegradáveis e estéreis, além da capacidade de seabsorver substâncias como fármacos ou substâncias endógenas, por exemplo,células tronco.

Neste material a ausência da possibilidade de transmissão dedoenças infecto-contagiosas e de reações imunogênicas são importantes deserem destacadas; não proporciona infecções nem inflamações, porqueCNHAP é a união de dois componentes bioativos e biodegradáveis; estéril;permite fácil aplicação e manuseio, bastando manter devidamenteacondicionado à fratura. Este material é totalmente identificávelradiologicamente.

Atualmente, o processo de preenchimento ósseo é realizado coma utilização de cimentos ósseos, misturas simples, composição na forma de póe pasta, que apresentam limitações, como a impossibilidade de mineralizaçãoin situ, além do alto custo. A presente invenção permite contornar taislimitações e possibilitam agregar valor ao produto.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

As doenças degenerativas e inflamatórias de ossos e articulaçõesafetam milhões de pessoas no mundo inteiro, representando cerca metade detodas as doenças crônicas em pessoas com mais de 50 anos de idade nospaíses desenvolvidos. A previsão é que a percentagem de pessoas com maisde 50 anos de idade afetadas por doenças ósseas irá dobrar até o ano de2020. Essas doenças freqüentemente exigem procedimentos cirúrgicos,incluindo substituição total ou parcial do tecido danificado nos casos dedoenças degenerativas ou fraturas por acidentes.

Os biomateriais destinam-se à implantação no corpo humanocomo constituintes de dispositivos que são designados a realizar certasfunções bioiógicas através da substituição ou guiando o reparo ósseo quandonecessário.

Os biomateriais são descritos como materiais (implantes)especificamente desenvolvidos para obter compatibilidade com o sistemabiológico. Além disso, um biomaterial pode ser entendido como um material denatureza sintética ou natural com finalidade de melhorar, aumentar ou substituirtecidos ou órgãos. O critério para a escolha de um biomaterial é feito de acordocom a similaridade química e física deste, em relação ao tecido ou órgão a sersubstituído.

Existem requisitos necessários para que um biomaterial sejaadequado, como: não causar danos locais ou sistêmicos (tóxicos,carcinogênicos ou radioativos) e ser biocompatível. A biocompatibilidade é umfator de suma importância para o sucesso dos biomateriais e pode ser definidacomo um material que provoca reações desejadas ao organismo. Além disso,características como composição e morfologia similar ao tecido a serreconstituído, vem sendo um aspecto diferencial e inovador nodesenvolvimento dos biomateriais. Até os dias de hoje não há um substitutoideal desenvolvido para substituição de tecidos ósseos.

Os biomateriais existentes no mercado variam muito de preço,sendo assim a melhor escolha seria o mais econômico a longo prazo. Comisso, os biomateriais que são substituídos pelo tecido ósseo novo reconstruídono local possuem custo mais elevado, entretanto o uso de biomateriais que nãosão substituídos resulta em uma nova intervenção cirúrgica para a troca por umnovo dispositivo com o passar do tempo, resultando num custo final dotratamento mais elevado.

O biomaterial scaffold hidrogel compósito constituído dequitosana/hidroxiapatita, CNHAP, possui aplicação na área de preenchimentoósseo devido à união das características peculiares dos componentesenvolvidos, quitosana e hidroxiapatita. Entende-se por scaffold uma estruturade suporte, no caso da presente invenção uma matriz porosa que compreendebiomaterias com finalidade de preenchimento ósseo.

A quitosana, um polissacarídeo, é obtida por desacetilaçãoalcaíina de ligações N-acetil presentes na quitina, as quais são rompidasformando a D-glicosamina, que contém um grupo amino livre, como ilustradana Figura 2. A diferença entre a quitina e a quitosana está na quantidade degrupos acetil. Quando o número de grupos acetil é maior que 50% (70-90%) obipolímero é determinado por quitina. Na terminologia da quitina, o número degrupos acetoamido é determinado pelo grau de acetilação (DA). Por outro lado,quando o grau de desacetilação (DD) ou o grupo amino é predominante, obiopolímero é determinado como quitosana. Logo, a quitosana é constituída porum conjunto de cadeias poliméricas parcialmente desacetiladas. As aplicaçõese características da quitosana dependem fundamentalmente do grau dedesacetilação e do tamanho das cadeias poliméricas. É um polímeroparcialmente cristalino, e o grau de cristalinidade depende do grau dedesacetilação.

Estudos comprovaram que a quitosana é segura para o consumohumano e tem sido utilizada em numerosas aplicações industriais, na área desaúde e em produtos alimentícios. É descrito que a toxicidade da quitosana émenor que a glicose (açúcar comum) ou sacarose.

A quitosana além de biocompatível, bioativa e biodegradávelapresenta interessante propriedades biológicas, tais como atividadesbactericida, osteogênica, fungicida, hemostática, osteocondutiva, antitumor,imuno-adjuvante e ainda promove a osteointegração de um biomaterial aotecido ósseo.

Biomateriais à base de quitosana tiveram utilização comobioadesivo, agente cicatrizante, agente antimicrobiano, material de bandagem,suporte para enxerto de pele, agente hemostático, material para sutura, e atémesmo material para lentes de contato, nas formas de filmes, géis, cápsulas,micro cápsulas ou soluções. Além disso, a quitosana apresenta açãobacteriostática, provavelmente pela ação dos grupos amino catiônicos daquitosana sobre os grupos aniônicos da parede celular de microorganismos.Biomateriais de quitosana também têm sido considerados como acelerador dareparação tecidual, capazes de aumentar a produção de matriz extracelularatravés do aumento de produção de fatores de crescimento. Tambémacelerariam a infiltração de linfócitos polimorfonucleares nas fases iniciais decicatrização tecidual, aumentando consideravelmente a osteopontina, umafosfoproteína capaz de aumentar a ligação celular na ferida em cicatrização.Alguns autores citam que a quitosana fomenta o crescimento celular, porque ascélulas aderem fortemente ao polímero e proliferam mais rapidamente. Estecomportamento tem sido aproveitado para os estudos em engenharia detecidos, sendo a quitosana utilizada em trabalhos de regeneração da pele, dotecido ósseo e cartilaginoso e na preparação de pele artificial. Atua tambémcomo material substituto ósseo que, ao longo do tempo, vai sendo substituídopor osso natural. Biomateriais à base de quitosana não reportaram nenhumareação alérgica ou inflamatória após sua implantação, injeção, aplicação tópicaou ingestão pelo corpo humano. Nesse âmbito, uma das possibilidades maispromissoras dos biomateriais obtidos da quitosana é sua capacidade emformar estruturas porosas, contendo fatores de crescimento, como proteínasmorfogenéticas ósseas ou fatores de crescimento vascular em suacomposição, e que podem ser utilizados como suportes para crescimentocelular. Recentemente, hidrogéis de quitosana foram utilizados comocarreadores para proteínas morfogenéticas ósseas (BMP-2) e implantados emdefeitos ósseos críticos criados na calvária de ratos, proporcionandoregeneração tecidual otimizada, quando comparada ao uso dessas proteínasisoladamente.

O componente inorgânico que mais se assemelha à composiçãodo osso é os fosfato de cálcio, dentre os quais a mais difundida é ahidroxiapatita (HA), cuja estrutura química é representada pela fórmulaC10(PO4)6(OH)2. As propriedades biológicas da hidroxiapatita sintética (HA) sãobem documentadas na literatura. Ela é utilizada na correção de defeitos ósseosno homem e em várias espécies animais, com resultados satisfatórios. Évantajosa por causa de sua composição uniforme, alta biocompatibilidade,segurança (não é tóxica, nem alergênica ou carcinogênica) e pelo fato de suamicroestrutura (tamanho dos poros) ser completamente controlável. Ahidroxiapatita permite a junção, proliferação, migração e expressão fenotípicade células ósseas, o que resulta em formação de novo osso, em aposiçãodireta ao biomateriai.

As biocerâmicas de fosfato de cálcio porosas com estruturastridimensionais utilizadas para preenchimento ósseo são bioativas e permite ocrescimento de tecido ósseo e revascularização da área do implante pelaligação química estabelecida entre a fase mineral dos ossos e o biomateriai. Adificuldade em relação ao uso de biocerâmicas está na má adaptação direta àfalha do tecido ósseo a ser reparado, pois são peças rígidas com tamanhosdefinidos devendo ser adaptados com um segundo material geralmente naforma de pasta ou pó particulado para o completo preenchimento do local, ou amigração de fragmentos ocasionando na não regeneração óssea.

É importante salientar que o conceito de material poroso, sob aóptica da biocompatibilidade, está fundamentado em dimensões de poroscompletamente diferentes do que é usual para a Química. Segundo IUPAC,materiais macroporos apresentam poros com dimensões maiores que 50 nm.Contudo, para que um biomateriai seja considerado macroporoso é necessárioque ele apresente poros da ordem do diâmetro Harvesiano (50 a 250 mm).

Como já foram discutidas anteriormente, as biocerâmicas defosfato de cálcio apresentam características físico-químicas e arquitetônicasimportantes que possibilitam respostas biológicas como osteocondutividade eosteoindutividade intrínseca. Por outro lado, os polímeros biodegradáveis têmsido utilizados como suportes na engenharia de tecidos, principalmente pelacinética previsível de biodegradação e plasticidade. No entanto, a formação decompósitos parece aperfeiçoar a resposta biológica reparadora. Todavia, aquitosana apresenta propriedades biológicas bastante favoráveis para areconstrução óssea.

Desse modo, apesar de existirem muitos biomateriais na forma descaffolds para a engenharia de tecidos, uma matriz para o crescimento ósseodeveria ser arquitetada para degradar (1) passivamente por dissolução no meiobiológico e (2) ativamente por reabsorção dos osteoclastos durante oremodelamento normal do tecido ósseo.

Entre os principais requisitos para o desenvolvimento de umbiomaterial scaffold para engenharia de tecidos óssea poderíamos citar: (1)fácil disponibilidade para o cirurgião; (2) promoção do crescimento ósseo; (3)não indução de crescimento de tecido mole na interface osso/implante; (4)diâmetro médio dos poros entre 200 e 400 mm; (5) absorção de uma maneiraprevisível de acordo com o crescimento ósseo e (6) propriedades mecânicas efísicas apropriadas para aplicação.

Adicionalmente, o projeto de cada biomaterial scaffold devepermitir: (1) fácil manipulação na preparação e implementação do materialimplantado; (2) alta porosidade para permitir um rápido acesso e manutençãoda vasculatura, assim como apresentar espaço para deposição de matrizes ecomponentes estruturais; (3) capacidade de ser aparado ou esculpido paraencaixar-se perfeitamente ao sítio cirúrgico e (4) um rápido e reprodutívelprocesso de dissolução em cada sítio implantado.

Neste contexto, quitosana tem sido utilizada em combinação comdiferentes componentes inorgânicos bioativos, especificamente a hidroxiaptaita(HA) para regeneração de tecidos devido à osteocondutividade. A incorporaçãode HA com quitosana pode promover a bioatividade e a osteointegração dobiomaterial e o osso. Os pesquisadores têm dado muita atenção aoscompósitos de quitosana e hidroxiapatita em diferentes proporções, na formade pó, pasta e ainda na forma de scaffold para regeneração óssea.

Os métodos convencionais para a preparação de compósitos dequitosana e hidroxiapatita são realizados pela mistura mecânica da HAP emquitosana dissolvida em soluções de ácido acético, e então a mistura é secaem temperatura ambiente ou liofilizada. O material final é heterogêneo e opacocom estrutura compacta ou porosa. Entretanto, o método de liofilização para aobtenção de material poroso, não mantém a integridade da estrutura domaterial, fazendo com que o material se rompa pela velocidade de evaporaçãodo solvente.Um compósito de quitosana e hidroxiapatita pode ser preparadopelo método de precipitação simultânea na forma de bastão (Hu ecolaboradores [18]). Sendo assim, é preparado um gel de quitosana dissolvidaem solução de ácido acético e posteriormente adicionado uma solução deCa(N03)2-4H20 e KH2PO4 em ácido acético, misturados e o gel foi despejadoem um cilindro preparado por uma membrana de quitosana enrolada. Após ogel estar dentro do cilindro de quitosana foi imerso em solução de hidróxidopara a precipitação simultânea de CN e HA e em seguida retirada a membranae o hidrogel liofilizado. O material apresentou-se na forma transparente combaixa quantidade de HA e opaco com alta quantidade de HA e com ausênciade poros. Entretanto, a ausência de poros na material afeta no desempenho daregeneração óssea, uma vez que a morfologia e porosidade similar ao tecidoósseo são de extrema importância na osteocondução. A ausência de poros nomaterial pode levar a agir como barreira para a condução do fluído corpóreopodendo desencadear inflamação generalizada no local.

Entre os muitos materiais utilizados como cimento ósseo,polimetilmetacrilato (PMMA) ou seus derivados têm sido bastante utilizados emcirurgias ortopédicas. Entretanto, o uso é limitado devido às diversascomplicações, como exemplo, o PMMA não proporciona a osseointegraçãoentre o material e o osso, não tem bioatividade, possui baixa propriedademecânica, provoca aumento da temperatura no local devido à reaçãoexotérmica de polimerização, e apresenta toxicidade do monômero. Alémdisso, mesmo a grande utilização de cimentos a base de PMMA nos últimosanos, falhas ocorreram na maioria das vezes devido à necrose do tecido.

Contudo, diversas pesquisas têm sido realizadas em adicionar componentesbioativos com PMMA. Kim e colaboradores modificaram PMMA pela adição dequitosana e hidroxiapatita por serem bioativos e biocompatíveis. Investigaram opotencial de aplicação clínica através de testes in vitro e animais. Foiobservado que os compósitos demonstraram osteocondução ebiocompatibilidade. Entretanto, concluíram que mais estudos com animaisprecisam ser realizados para uma avaliação mais completa para a substituiçãodo cimento já utilizado de PMMA pelos compósitos dePMMA/quitosana/hidroxiapatita. Dois anos após a publicação desse artigohouve o depósito de uma patente internacional por Neoh e colaboradores em2007 relatando o invento de um cimento ósseo composto de PMMA comquitosana ou derivado de quitosana.

Ito e colaborador desenvolveram e testaram um material na formade pasta para um possível substituto ósseo para tratamento odontológico. Omaterial foi preparado pela mistura mecânica dos compostos hidroxiapatita(HAP) na forma de pó, ZnO e CaO, e misturados a um gel de quitosana paraformar uma pasta de endurecimento rápido. O composto apresentou pH neutro,ajuste em tempo curto, e resistência à compressão relativamente alta. O uso domaterial para tratamento de defeitos periodontais se mostrou bastante eficaz naunião entre o implante e o osso e tem grande potencial para aliviar osproblemas associados com a implantação de partículas HAP, pois ocorre amigração antecipada dessas partículas sem que haja a união entre o implantee o osso. Porém a forma de pasta limita o processo de regeneração do osso,podendo dificultar o manuseio ou ainda desencadear uma reação inflamatóriageneralizada, algo que não ocorre com o presente invento proposto.

Diante do estado da técnica é possível observar diversosdocumentos que mencionam produtos e processos que contemplam o uso dequitosana e hidroxiapatica como componentes, porém baseiam-se somente emuma mistura mecânica entre os componentes, algo que difere da presenteinvenção. Ito e colaboradores descrevem um método de obtenção de umasubstância osseoindutiva e a preparação de um material contendo essasubstância osseoindutiva para preenchimento ósseo. O material foi preparadopela mistura de substância osseoindutiva (substância derivada do colágeno)com gel de quitosana e hidroxiapatita em pó. Para a formação do gel dequitosana utilizou o ácido málico. Foram preparadas diferentes proporções doscomponentes e obtidos materiais com diferentes propriedades mecânicas. Omaterial utilizado na preparação do biomaterial é relativamente longo e requeroutras etapas de preparação podendo carregar resíduos de príon devido aomaterial ser de origem animal, podendo acarretar também em inflamação aotecido vizinho.No pedido de patente US2008181926-A1 há descrição do métodobiomimético de obtenção de compósitos de quitosana/ácidogalacturônico/hidroxiapatita pela mineralização in situ de hidroxiapatita. Foramutilizadas misturas de diferentes soluções preparadas a partir dos componentesquitosana, ácido galacturônico e NaaHPO4 e CaC^1 e obtiveram compósitosnas formas de grânulos através de centrifugação e posterior secagem e filmesscaffolds através de liofilização. Os resultados dos materiais demonstraramuma boa interação entre a matriz quitosana e as partículas de HA, mudançasnos parâmetros e cristalinidade da HA devido à presença da quitosana quandocomparado a HA pura e uma alta biocompatibilidade. O processo de obtençãodo material citado no trabalho requer de longo processo de preparaçãoresultando num maior custo final e ainda o processo de liofilização (secagemdo material por sublimação) não mantém a integridade da estrutura dos porosdo material. Além de ser uma técnica muito cara e não aceitar qualquersolvente, principalmente se for ácido.

Tendo em vista as limitações das tecnologias atuais, a presenteinvenção traz um biomaterial na forma final de hidrogel, que possuicaracterísticas de extrema importância na aplicação em tecidos ósseos, comoa morfologia similar ao osso, scaffold com poros interconectados quepromovem uma melhor regeneração do tecido ósseo pela osseocondução.

Devido a sua forma de hidrogel, há uma facilidade de adaptação ao local defratura ósseo, aliado à facilidade de troca da água preenchida nos poros porsoluções contendo substâncias bioativas ou ainda células tronco para induçãoda formação óssea mais rápida e eficaz.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A presente invenção trata-se de um scaffold biomaterial hidrogelcompósito CNHAP com características mecânicas que permitem um manuseiono momento de sua utilização, fracionamento no tamanho da fratura óssea emoldagem à sua forma no instante da intervenção cirúrgica. Além disso, obiomaterial apresenta características similares ao tecido ósseo como acomposição, topografia, poros intercomunicantes, propriedadesintercomunicantes e propriedades biológicas adequadas à regeneração óssea,sem deixar resíduo tóxico ou carcinogênico além de ser antibactericida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 ilustra um esquema de preparação do CNHAP.

A Figura 2 ilustra um esquema da obtenção da quitosana atravésda quitina.

A Figura 3 ilustra um esquema de preparação do scaffold hidrogelcompósito CNHAP através da reação dos precursores envolvidos na reação dahidroxiapatita e o gel de quitosana.

A Figura 4 apresenta um espectro IV do compósito de CNHAP.

A Figura 5 ilustra um espectro RMN 31P do compósito CNHAP. Oreferido espectro ilustra um único pico indicando um tipo de fosfato de cálcio,HA.

A Figura 6 apresenta difratogramas da quitosana pura (A) e docompósito CNHAP (B). Observa-se através da análise de raios X dos materiais,picos de difração típicos de HA e o decréscimo do halo da quitosana.

A Figura 7 apresenta curvas termogravimétricas (a) e da derivadada curva termogravimétrica (b) para quitosana pura (A) e para o scaffoldcompósito CNHAP (Β). A referida figura ilustra as curvas termogravimétricas daquitosana e do scaffold seco. Observam-se comportamentos similares entre adegradação da quitosana pura e do scaffold seco, restando um resíduobastante significativo de aproximadamente 49% referente a HA mineralizada insitu.

A Figura 8 ilustra uma fotografia do scaffold hidrogel compósitoCNHAP. Superfície da face superior (esquerda) e superfície da face inferior(direita). Tal fotografia ilustra a diferença entre as superfícies em relação àtopografia, as quais diferem numa maior área superficial, disponibilizando umamaior área para a adesão de células, como pode ser observado nos resultadosbiológicos, que o CNHAP-rugoso (Figura 8 lado esquerdo) apresenta melhoresresultados em relação a superfície lisa (Figura 8 lado direito).A Figura 9 apresenta uma fotografia do corte do scaffold hidrogelcompósito CNHAP.

A Figura 10 apresenta micrografias do scaffold hidrogel compósitoCNHAP. (A) x1000 e (B) x6000. Pode ser observada a porosidadeintercomunicante do scaffold, conforme a seta, e a morfologia globular da HAdispersa pela matriz de quitosana.

A Figura 11 apresenta uma análise da viabilidade celular de pre-osteoblastos crescidos sobre diferentes materiais. Células crescidas sobre opoliestireno foi considerado como 100% (controle positivo, PS); (*) p<0.05.PS=Poliestireno.

A Figura 12 ilustra a. expressão de proteínas relacionadas com asobrevivência e viabilidade celular: A) Akt e B) Erk. Poliestireno (PS) foiconsiderado como grupo controle. Os gráficos representam a análisedensitométrica das bandas obtidas por immunoblotting.

A Figura 13 apresenta níveis de adesão e proliferação celular. Ográfico representa qualitativamente a quantidade de células aderidas pelaincorporação do cristal violeta. Tempos de análise: 15 min, 6 h e 48 h de cultivocelular; (*) p<0.05; (**) p<0.01. Poliestireno (PS) foi considerado como grupocontrole.

A Figura 14. (A) ilustra uma expressão de proteínas relacionadascom a adesão celular. Poliestireno (PS) foi considerado como grupo controle.Já a Figura 14 (B) ilustra um gráfico representando a análise densitométricadas bandas obtidas por immunoblotting.

A Figura 15. (A) ilustra uma expressão de proteínas relacionadascom a progressão do ciclo celular. Poliestireno (PS) foi considerado comogrupo controle. Já a Figura 15 (B) ilustra um gráfico representando a análisedensitométrica das bandas obtidas por immunoblotting.

A Figura 16 apresenta uma análise da atividade de fosfatasealcalina de pre-osteoblastos cultivadas sobre os diferentes materiais.

Poliestireno (PS) foi considerado como grupo controle, (ns) sem diferençaestatística; (*) p<0.05; (**) p<0.01.DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O objeto do presente invento trata-se de um processo paraobtenção de um biomaterial hidrogel scaffold compósito através damineralização in situ e produto obtido compreendendo elementos bioativos,biodegradáveis e estéreis para aplicação em reconstrução tecidual óssea.

Para efeito desta invenção, a expressão biomaterial hidrogelscaffold compósito diz respeito ao material obtido com as características deinteresse para aplicação em reconstrução tecidual óssea.

Para a execução do invento foram utilizados materiais de partidacompreendendo a quitosana de alta massa molar, viscosidade entre 800-2000cP e grau de desacetilação ~83%, na forma de pó, de procedência Aldrich (St.Louis1 MO, USA). A hidroxiapatita comercial (do tipo P.A. ≥90%) deprocedência Fluka, foi utilizada como referência. O Ca(NO3)2 foi de procedênciaMerck (Darmstadt, Hessen, Alemanha). O H3PO4 (do tipo P.A.) e o NH4OH(teor (NH3) 28,0-30,0%) foram de procedência Synth (Diadema, São Paulo,Brasil). Todos os componentes foram utilizados sem tratamento prévio. Placasde poços de poliestireno, PS, de procedência TPP (St. Louis, MO, USA), foramutilizadas como controle para o cultivo de células. Os anticorpos utilizadosneste trabalho foram obtidos da Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA).pNPP (fosfato p-nitrofenil dissódico hexahidratado) usado para medida daatividade de fosfatase alcalina e MTT (brometo de dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeηiItetrazólio) foram adquiridos da Sigma (St. Louis, MO, USA).

Para o processo de obtenção do biomaterial hidrogel scaffoldcompósito foi realizado uma mineralização in situ do gel de quitosana por25 hidroxiapatita. em meio ácido, seguido de adição de solução de Ca+2 eposterior neutralização, visando manter uma razão Ca/P de 1,67, razão de Cae P observada nos ossos, onde quitosana (pó), 3g, foram adicionados a 80 mLde uma solução de ácido fosfórico (1,85 mL de H3P04/80 mL de H2O), seguidada adição de 20 mL de uma solução de Ca+2 (Ca(NO3)2, 10,68g/20mL H2O),obedecendo a uma razão Ca/P de 1,67, o qual representa a formação dehidroxiapatita, formando um gel ácido (pH~ 2,3). A proporção em massa deCN:HA estimada nos compósitos foi de 60:40, próximo das proporções decomponentes orgânico: inorgânico encontradas nos ossos. Alíquotas de 4 a 6 mL, preferencialmente 5 mL deste hidrogel foram transferidas para moldes deTeflon® (3cm2 de diâmetro χ 2cm de profundidade) e neutralizadas pela adiçãode 20mL da solução de hidróxido de amônio (NH4OH) diretamente sobre o gelaté o total preenchimento do volume do molde. Após esta etapa, os moldespermaneceram em recipiente fechado entre 40 e 60 h, preferencialmente por48h à temperatura entre 10 e 30°C, preferencialmente 25°|C para o processode mineralização de hidroxiapatita in situ. O scaffold compósito foi retirado,lavado com água deionizada até a remoção completa do subproduto salino(nitrato de amônio) e mantidos em água deionizada sob 15 e -2°C,preferencialmente 10°C refrigeração, até sua utilização.

Os exemplos aqui descritos tem o intuito somente de exemplificaralgumas das inúmeras formas de realização da invenção, e portanto devem serencarados de forma ilustrativa, e não restritiva.

Claims (16)

1. Processo para a produção de um biomaterial de quitosana ehidroxiapatita (CNHAP), caracterizado pela mineralização in situ do gel dequitosana por hidroxiapatita em meio ácido.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopor compreender as etapas:a) adição de quitosana em uma solução ácida;b) adição de solução de Ca+2 sob agitação constante;c) separação de alíquotas em moldes;d) neutralização das alíquotas obtidas de c) pela adição de umabase;e) armazenamento durante um período entre 40 e 60 horas a umatemperatura entre 10 e 30° C;f) lavagem do compósito resultante com água deionizada; eg) armazenamento do produto obtido em e) a uma temperaturaentre -2 a 15 °C até a sua utilização.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopela razão da quitosana/solução ácida variar preferencialmente de 1:20 a 1:30,preferencialmente 1:26,6.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopela base ser preferencialmente (NH4OH);

5. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo armazenamento ser preferencialmente em um recipiente fechado.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo tempo de armazenamento ser preferencialmente de 48 horas.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopela temperatura ser preferencialmente 25° C.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopela referida quitosana ser preferencialmente em pó de alta massa molecular,com viscosidade entre 800 a 2000 cP e grau de acetilação cerca de ~83%.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a referida hidroxiapatita é do tipo P,A. >90%.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido H3PO4 é do tipo P.A.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o referido NH4OH apresenta um teor de NH3 de 28 a 30%.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que durante a adição da solução de Ca+2 obedecer uma razãoCa/P de 1,67.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopela solução de Ca+2 ser preferencialmente Ca(NC>3)2·

14. Biomaterial de quitosana e hidroxiapatita (CNHAP),caracterizado pelo fato de ser um compósito scaffold na forma hidrogel.

15. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de apresentar morfologia similar ao osso com porosinterconectados e proporção de CN:HA preferencialmente de 60:40.

16. Biomaterial, de acordo com a reivindicação 14 ou 15,caracterizado pelo fato de compreender elementos bioativos, biodegradáveis eestéreis.