BRPI0906128B1 - Molécula de ácido nucléico isolada, construção gênica, vetor, célula transgênica, método para obtenção de uma célula e de uma planta transgênica,composição pesticida biodegradável, método para o controle de uma praga, método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga - Google Patents

Abstract

molécula de ácido nucléico isolada, construção gênica, vetor, célula transgênica, método para obtenção de uma célula e de uma planta transgênica, polipeptídeo isolado e purificado, composição pesticida biodegradável, método para o controle de uma praga, método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga.a presente invenção pertence a um novo composto inseticida derivado de uma linhagem de bacilius thuringiensis e refere-se ao campo de controle de pragas de plantas, particularmente ao controle do bicudo-do-algodoeiro - anthonomus grandis. mais especificamente, o objeto da invenção refere-se a um novo gene para uma nova delta-endotoxina designada cry8ha e a clonagem e expressão em escherichia coli do gene que codifica para a proteína cry8ha. são fornecidas a seqúência nucleotídica e protéica codificadora da nova delta-endotoxina, vetores recombinantes e células hospedeiras. são ainda fornecidos processos e meios para a produção recombinante e o uso da nova delta-endotoxina para aplicação no controle do bicudo-do-algodoeiro. adicionalmente, a invenção também fornece um gene sintético otimizado para expressão em plantas de algodão. usando o gene aqui descrito, é possível a transformação de plantas, a partir das técnicas conhecidas pelos especialistas na área, para a expressão da endotoxina ativa contra o bicudo-do-algodoeiro.

Description

Relatório de Patente de Invenção: “MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, CONSTRUÇÃO GÊNICA, VETOR, CÉLULA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DE UMA CÉLULA E DE UMA PLANTA TRANSGÊNICA, COMPOSIÇÃO PESTICIDA BIODEGRADÁVEL, MÉTODO PARA O CONTROLE DE UMA PRAGA, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE LINHAGENS TRANSGÊNICAS RESISTENTES A UM INSETO PRAGA” CAMPO DA INVENÇÃO

[1] O seguinte relatório descritivo da patente de invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga que atacam lavouras agrícolas, utilizando métodos e composições que compreendem δ-endotoxinas derivadas do microrganismo Bacillus thuringiensis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] O algodoeiro é, dentre todas as plantas domésticas e cultiváveis, uma das mais atacadas por doenças e insetos-praga, além de apresentar alta sensibilidade à ocorrência imposta por plantas daninhas (Beltrão, E. M., Souza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa: Brasília, v.01, 1999). Dentre os principais insetos-praga, destaca-se o bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis species Curculionidum cum synonymia hujus Familiae, vol. 7, pt. 2. Paris: Roret. 461p., 1843), considerado uma das pragas mais sérias da cultura do algodão, encontrando-se dispersa no México, Cuba, Haiti, Venezuela, Colômbia, Paraguai e Brasil. Este inseto utiliza os botões florais e frutos do seu hospedeiro como fonte de alimento e local de desenvolvimento, causando prejuízos diretos à comercialização da fibra de algodão. Os níveis de infestação crescem rapidamente e os prejuízos podem atingir até 100% da produção, caso as medidas de controle não sejam adequadas. Este inseto representa um grande potencial de dano, sendo considerado praga-chave no planejamento e controle de insetos nocivos à cultura, principalmente devido à dificuldade de controle pelos inseticidas químicos.

[3] O algodoeiro e suas pragas coexistem por um longo período evolutivo. Planta e inseto formam um sistema morfológico e bioquímico interdependente e competitivo, resultando na maioria das vezes, na utilização de parte da planta pelo inseto. Essa parte utilizada representa o dano causado pelo inseto à planta, e depende do tamanho da população da praga, e da habilidade da planta em resistir ao ataque e de se recuperar do dano sofrido (Beltrão, E. M., Souza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa: Brasília, v.01, 1999]|.

[4] A interação planta versus inseto pode ser visualizada de pelo menos duas maneiras: do ponto de vista do inseto, com a planta variando de adequada a completamente inadequada como hospedeira e, por outro lado, do ponto de vista da planta onde, quanto menor o número de espécies e abundância de insetos associados a ela, e quanto menor o efeito que esses insetos exercem sobre elas, maior a sua resistência sobre esses insetos (Santos, W. J. Identificação' biologia, amostragem e controle das pragas do algodoeiro. In: Embrapa Agropecuária Oeste; Embrapa Algodão. Algodão: tecnologia de produção., p. 296p. 2002).

[5] Entre um extremo e outro de resistência das plantas aos insetos-praga, existe um completo e extensivo arsenal de mecanismos de ataque e contra-ataque a ação dos insetos, que vão desde um simples impedimento morfológico a complexos componentes fitoquímicos, que interferem diretamente no processo metabólico envolvido na utilização da planta como hospedeira do inseto. Em termos práticos, a resistência do algodoeiro aos insetos-praga representa a habilidade de certas cultivares produzirem algodão de melhor qualidade em maior quantidade que outros cultivares, sob ataque da mesma população de insetos-praga (Freire, E. C. Cultivares e produgão de semente na melhoria da qualidade do algodão no nordeste e centro-oeste do Brasil. Boletim informativo Embrapa/ CNPA, 19971 [6] Na maioria dos países onde o algodão é cultivado, a vulnerabilidade às pragas representa o principal problema desta cultura. Sem alternativas de controle mais eficazes, os produtores, de forma rotineira, continuam acreditando que os inseticidas químicos sejam a única forma de proteção das lavouras. Embora eficientes, são onerosos, potencialmente danosos ao homem, ao meio ambiente e, em longo prazo, ocasionam o desencadeamento de processos de resistência, ressurgimento de pragas e redução na incidência de inimigos naturais (Panizzi, A. R. Efeito de inseticidas na população das principais pragas da soja. An. Soc. iBntomol. Brasil, v.6, p.264-275. 1977¾. Diante isso, a presente invenção tem como objetivo aumentar a resistência de plantas, gerando plantas transgênicas, as quais sejam capazes de expressar genes de alta atividade entomotóxica, solucionando, consequentemente, o problema do uso abusivo de inseticidas químicos.

[7] A introdução estável de genes exógenos em plantas de algodão, com a finalidade de induzir resistência a insetos-praga, é uma excelente alternativa para a diminuição de grande parte dos problemas associados aos métodos químicos. Esta tecnologia reúne várias vantagens, principalmente pelo fato de não poluir o ambiente. Dados gerais demonstram que plantas transformadas de algodão não apresentaram efeitos negativos sobre o ambiente, sendo as características herdáveis e expressas normalmente na planta (Adamczyk, J, J., L, C, Adams L, C., Hardee, D. D. Field efficaçy and seasonal expression profiles for terminal leaves of single and double Bacillus thuringjensis toxin cotton genotypes. Journal of Economic Entomology, y.94, n.6, DEC, p.1589-1593. 2001¾.

[8] A disponibilidade de microrganismos e compostos orgânicos na natureza para utilização biológica é muito grande, e os mesmos fornecem ampla variedade de matéria-prima para o desenvolvimento de novos produtos, com maior patogenicidade contra o inseto e amplo espectro de ação. Dentre estes microrganismos, uma grande descoberta foi a bactéria de solo Bacillus thuringiensis, a qual é amplamente utilizada como agente de controle biológico e como fonte de moléculas potenciais para programas biotecnológicos, destinados à obtenção de plantas transgênicas resistentes à insetos-praga. Com esta estratégia é possível reduzir em níveis toleráveis as populações de pragas agrícolas de interesse econômico fcPerlak, F. J., R. W.| [Deaton, T. A. Armstronft R. L. Fuchs, S. R. Sims, J. T. Greenplate e D. A. Fischhoff. Insect resistant cotton plants. Biotechnology (N Y), v.8, n.10, p.939-943. 1990).

[9] Embora já tenham sido identificadas e descritas algumas δ-endotoxinas com atividade sobre o bicudo-do-algodoeiro, o hábito endofítico desta praga dificulta ou até mesmo inviabiliza o emprego destas toxinas por meios convencionais, as quais são comercializadas como bioinseticidas, como por exemplo, formulações protéicas contendo as toxinas Cry. Estes apresentam instabilidade no meio ambiente, baixo rendimento na purificação a partir de fontes naturais, além da fácil perda de atividade destas toxinas pelas intempéries do ambiente como chuva e sol. Diante deste problema, a estratégia de maior eficiência é a utilização dos genes codificadores de toxinas Cry na geração de plantas geneticamente modificadas.

[10] O uso de genes codificantes para este tipo de proteínas entomotóxicas e a expressão das mesmas em sistemas heterólogos (bactérias ou plantas transgênicas) contorna as dificuldades geradas pelo uso dos bioinseticidas. Esta estratégia vem se destacando nos últimos anos na área da transgenia, devido à especificidade destas toxinas em relação aos insetos-praga, eficiência, expressão direcionada e sua inocuidade sobre animais e humanos. Desta forma, plantas geneticamente modificadas com resistência específica ao inseto-praga podem ser geradas em sistemas de alta eficiência.

[11] Existem alguns genes e transgenes Bt com atividade para coleópteros, como, por exemplo, as plantas expressando um gene cry8 da empresa DU PONT DE MENOURS com toxicidade para Leptinotarsa decemlineata (US20030177528), o milho transgênico com um gene cry8-like da PIONEER & DU PONT com toxicidade para Diabrotica virgifera, Diabrotica undecimpunctata howardi, Leptinotarsa decemlineata e Anthonomus grandis KUS20060021096, como mencionado também nos pedidos de patente US7105332 e US2005166284), Feng, S et al., 2005 também descrevem um gene cry8 modificado, cry8Ca, com atividade específica para insetos coleópteros fCNl609220-A]| e, mais recentemente, a PIONEER & DU PONT descrevem um gene sintético cry8 com toxicidade para Diabrotica virgifera virgifera em plantas monocotiledôneas como exemplo em plantas de milho (como mencionado no pedido de patente US20060288448]|.

[12] Atualmente, plantas expressando genes Bt do tipo cry8 são, em sua totalidade, monocotiledôneas (p.ex.: milho). Sendo assim, até a presente data, nenhuma invenção descreveu um gene desta natureza, com potencial aplicação em plantas dicotiledôneas, como é o caso da planta de algodão.

[13] Técnicas modernas de biologia molecular, como a construção de bibliotecas combinatórias, são utilizadas para desenvolver e identificar genes análogos mutantes com objetivos específicos.

[14] A construção de bibliotecas de genes análogos variantes, utilizando técnicas de evolução molecular in vitro, têm sido empregada nas últimas três décadas. Esse fato se deve ao surgimento de ferramentas biotecnológicas, as quais servem como plataforma de engenharia genética no desenvolvimento de novas moléculas com atividade melhorada, visando principalmente a agricultura e a indústria farmacêutica (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J.

and Keenan, R. Laboratoiy-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology [Eteview. Vol. 69, No. 3, p, 373 - 392, 20051 Existem diversas técnicas, as quais podem ser aplicadas para gerar mutações em uma seqüência gênica, na presente invenção destaca-se a técnica de embaralhamento de DNA (Rosic, N. N., Huang, W., Johnston, W. A,, James J. Devoss, J. J., Gillam, E. M. J. Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by DNA

[15] A técnica de embaralhamento de DNA consiste em uma evolução molecular dirigida, a qual gera mudanças pontuais na estrutura primária das moléculas de DNA por meio de mutações randômicas (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed ). 373 - 392, ing. Nature. . O gene de interesse é primeiramente fragmentado de forma aleatória em pequenas seqüências de 30-50 pares de base, sendo este produto recombinado em uma reação de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), a qual é conduzida sem adição de oligonucleotídeos. Em uma segunda reação consecutiva, são adicionados os produtos da primeira reação e oligonucleotídeos específicos. Permite-se, desta forma, a amplificação de uma população de genes análogos mutantes/ variantes DNApNa and nonfi [Proc, Nat [16] A eficiência da técnica para produzir moléculas análogas de maior atividade biológica pôde ser comprovada em diversos trabalhos como, por exemplo, em Jager et al (Jager, S. A. W., Jekel, P. A. and Janssen, D. B. Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of β-lactam antibiotics. Enzyme And Microbial Technology, Vol. 40, p. 1335 -1344, 2007¾ onde a atividade enzimática da penicilina aciclase aumentou em 90%. A técnica pode utilizar um único ou mais genes homólogos e seu sucesso dependente de um delicado arranjo entre o tamanho da biblioteca, a diversidade biológica originada e de uma metodologia de seleção das variantes com a característica desejada (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology [17] A associação das técnicas de embaralhamento de DNA (criação de bibliotecas combinatórias) e apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display, tornam a seleção e a expressão de novas moléculas muito mais eficientes (Stoop, A. A., Jespers, L., Lasters, I., Eldering, E. And Pannekoek, H. High-density mutagenesis by combined DNA shuffling and Phage display to assign essential amino acid residues in protein- [18] SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[19] A presente invenção fornece moléculas que codificam novas δ-endotoxinas naturais, análogos mutantes e análogos sintéticos para o controle de insetos-praga, particularmente o bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis), o qual apresenta susceptibilidade às novas toxinas.

[20] São também aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de ácido nucléico codificantes para as δ-endotoxinas, vetores de transformação e expressão, células e organismos transgênicos, métodos para a expressão heteróloga das novas δ-endotoxinas em organismos transgênicos, bem como o uso das mesmas no controle de pragas. A invenção compreende, também, um método para obtenção de uma planta transgênica caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula de planta com uma construção gênica de acordo com a reivindicação 4; b) cultivar a célula transformada, contendo a construção gênica de interesse estavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais de crescimento em cultura celular; e c) regenerar uma planta transgênica expressando o produto da construção inserida, a partir da célula transformada e de obtenção de plantas transgênicas.

[21] A invenção também fornece genes análogos sintéticos, os quais são otimizados para transformação e expressão dos mesmos em plantas, particularmente em plantas de algodão.

[22] Outra concretização da invenção refere-se aos peptídeos sintéticos de δ-endotoxinas usados para o tratamento de plantas infectadas, no controle de insetos-praga e a utilização destes na elaboração de composições pesticidas biodegradáveis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[23] Figura 1: Amplificação do gene cry8. Reação de amplificação por PCR, utilizando-se oligonucleotídeos específicos descritos por Bravo et al (1998). Gel de agarose 1,0% corado com brometo de etídio (A) Primeira rodada com os oligonucleotídeos descritos por Bravo et al (1998). Linha 1. Marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. Linha 2. Bandas amplificadas de aproximadamente 400 pb com o oligonucleotídeos cry8b, 2a. rodada. A seta indica o produto provável desejado. Linha 3. Oligonucleotídeos cry8a, 2a. rodada. Linha 4. Oligonucleotídeos cry8geral. Linha 5. Oligonucleotídeos cry8a, 1a. Rodada. Linha 6. Oligonucleotídeos cry8geral, 1a. Rodada. (B) Segunda rodada com o oligonucleotídeo cry 8b Linha 1. Marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. Linha 2 e 3. Amplificação utilizando 1 pL da reação 1 (Figura A) e amostra da linha 2 com a banda de aproximadamente 450 pb.

[24] Figura 2: TAIL-PCR. Representação esquemática da técnica de TAIL-PCR (Liu et al.,1995). 1. Primeira amplificação com os oligonucleotídeos específico 1 e arbitrário. 2. Resultado da primeira amplificação gerando produtos inespecíficos (a, b) e o produto específico (c). 3. Segunda amplificação com o mesmo oligonucleotídeo arbitrário e oligonucleotídeo específico mais interno gerando o segundo produto específico (d). 4. Terceira amplificação com o mesmo oligonucleotídeo arbitrário e o oligonucleotídeo específico 3 gerando o produto final (e). 5. Produto final específico.

[25] Figura 3: Clonagem do gene cry8 da estirpe S811 por TAIL-PCR. Géis de agarose 1,0% corados com brometo de etídio e marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. (A) Primeiro TAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários AD1, AD2, AD3, AD4, mostrando as sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeos específico. (B) Primeiro TAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários AD5, AD10, AD11, W4, mostrando as sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeos específico. (C) Segundo TAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários AD3, AD4, AD2 e AD1, mostrando as sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeo específico. As setas indicam os produtos potencialmente positivos que foram subsequentemente clonados e seqüenciados.

[26] Figura 4: Dendrograma do alinhamento da nova toxina Cry8Ka1, obtido após as duas rodadas de TAIL-PCR. Análise com as demais toxinas Cry8 depositadas no banco de dados até o momento, mostrando a alta identidade entre elas e que o gene clonado codifica uma proteína distinta das demais. A escala indica que no espaço representado existe a troca de 0,1 aa. O dendrograma foi feito utilizando o programa MEGA4 (Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599).

[27] Figura 5: Mapa do vetor comercial pET101/D-TOPO para expressão heteróloga em Escherichia coli. Representação esquemática do vetor, incluindo o promotor pT7. Pomotor T7: Induzido por IPTG permite a expressão em larga escala em algumas linhagens de Escherichia coli; Operon lac (lacO): Sítio de ligação do repressor lac, importante para a redução da expressão basal das proteínas recombinantes (sua função pode ser regulada pela presença ou ausência de glicose no meio de cultura); RBS: Sítio de ligação do ribossomo, localizado acima da região 5' do gene a ser clonado na posição idealpara início do processo de tradução; Sítio de clonagem TOPO: Região que compreende a localização exata de onde o inserto será clonado; Epitopo V5 (Gly- Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu- Gly-Leu-Asp-Ser-Thr): Utilizado para a detecção de proteínas recombinantes por western blot utilizando anticorpos anti-V5; 6His C-terminal: Importante para a purificação de proteínas, utilizando para tal, resinas as quais possuem metal acoplado; Terminador T7: Seqüência do bacteriófago T7 que permite a finalização da transcrição dos genes; Promotor bla: Promotor do gene de resistência a ampicilina; Gene de resisteência a ampicilina β-lactamase): Seleciona os plasmídeos resistentes em E.coli; Origem de replicação pBR322 (ori): Elemento de replicação e manutenção do plasmídeo em E.coli.

[28] Figura 6: Esquema do sistema de ligação do produto de PCR no vetor de pET101/D-TOPO. (A) A extremidade coesiva do vetor onde o produto de PCR será clonado é demonstrada juntamente com a presença da enzima topoisomerase. (B) O produto de PCR é diretamente clonado pela adição dos 4 pares de bases do oligonucleotídeo de orientação direta. A extremidade coesiva do vetor de clonagem (GTGG) invade a extremidade 5' do produto de PCR, anelando-se com as quatro bases adicionadas (CACC) e estabilizando o produto de PCR na orientação correta. A topoisomerase então cliva o pedaço sobressalente do produto de PCR para que a ligação seja efetiva.

[29] Figura 7: Análise por SDS-PAGE 12% da proteína recombinante Cry8Ka1 purificada por cromatografia de afinidade (Ni-NTA). Linha 1. Marcador de peso molecular. Linha 2. Extrato total da E. coli expressando a proteína recombinante Cry8Ka1. Linha 3. Fração não retida na resina Ni-NTA. Linhas 4, 5 e 6. Proteína Cry8Ka1 eluída da resina Ni-NTA em diferentes concentrações para confirmação do grau de pureza da mesma. 5 pg (linhas 2, 3 e 4), 10 pg (linha 5) e 15 pg (linha 6) de amostra foram adicionadas a tampão de amostra, submetidas a SDS-PAGE 12%, a 25 mA e coradas com nitrato de prata.

[30] Figura 8: Bioensaios contra A. grandis e S. frugiperda com as toxinas Cry8Ka1 e Cry8Ka1 recombinantes. (A) Bioensaio contra S. frugiperda utilizando Cry8Ka1. Dieta de superfície demonstrando mortalidade de 50% na concentração de 5 pg/mL. (B) Bioensaio contra A. grandis utilizando Cry8Ka1. Dieta incorporada demonstrando mortalidade de 50% na concentração de 230 pg/mL. (C) Bioensaio contra A. grandis utilizando Cry8Ka1. Dieta incorporada demonstrando mortalidade de 50% na concentração de 160pg/mL. Como controle foi utilizada a água de diálise na qual as proteínas foram submetidas. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas com 30 insetos de A. grandis e 90 de S. frugiperda.

[31] Figura 9. Esquema da Técnica de embaralhamento de DNA utilizando um único gene como substrato. Esquema da amplificação do gene cry8Ka1 com oligonucleotídeos específicos para inserção do sítio de restrição à enzima Sfil. Fragmentações, amplificações e reconstrução dos genes análogos mutantes.

[32] Figura 10. Interação entre BBMVs de A. grandis e fagos de fusão. Para a leitura da absorbância foi utilizado o comprimento de onda de 405nm. R-1 a R-6 - Ciclos de seleção e o número de lavagens por ciclo. A maior absorbância, ou seja, maior número de fagos de fusão com especificidade a BBMVs do inseto A. grandis, ocorreu a partir do 5° ciclo da seleção.

[33] Figura 11. PCR de colônia de variantes BI utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos. Foto de gel de agarose 1% exibindo DNA amplificado no tamanho esperado de aproximadamente 2000pb. Neste gel cinco colônias, além do controle positivo, apresentaram o tamanho esperado (4, 6, 10, 17 e 18). 1 - Marcador 1 Kb plus® (INVITROGEN). 2 a 18 -Variantes do gene cry8Kal. 19 - Controle negativo (PCR sem DNA). 20 - Controle positivo, gene cry8Kal com oligonucleotídeos iniciadores específicos.

[34] Figura 12. Bioensaio com larvas neonatas de A. grandis para a determinação da atividade inseticida das proteínas Cry8Kal e Cry8Ka5 (mutante). Controle - Controle negativo, dieta sem a adição das proteínas em estudo. A - Mortalidade de larvas alimentadas com Cry8Kal; B - Mortalidade de larvas alimentadas com Cry8Ka5. Foi observado na concentração de 6 pg/mL de dieta um aumento de duas vezes na atividade inseticida da nova molécula.

[35] Figura 13. Representação da estrutura modelada da toxina nativa Cry8Kal utilizando programa Modeller e visualizada pelo PyMOL (Delano, W. L. The PyMOL Molecular Graphics System (2002) on World Wide Web http://www.pymol.org). No análago Cry8Ka5 o esqueleto da estrutura permanece o mesmo sendo apenas as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos substituídas. Na Figura estão indicados os resíduos de aminoácidos de Cry8Kal que foram substituídos na sequência do análogo Cry8Ka5. Em A, representação da molécula com os três domínios I, Π e ΠΙ. Em B, Destaque para o domínio I, formado por sete α-hélices. A arginina 132 substituída por glutamina esta localizada na hélice 3. Em C, destaque para as três folhas β anti-paralelas do domínio Π, com indicação dos resíduos de Cry 8 nativa substituídos na molécula do análogo: tirosina 311 substituída em Cry8Ka5 por cisteína e prolina 372 pela alanina. Em D, ο β sanduíche do Domínio ΙΠ, e indicação dos três resíduos substituídos na molécula do análogo (arginina 559 por glicina, lisina 589 por ácido glutâmico e ácido glutâmico 645 pela asparagina.

[36] Figura 14. Gráfico da atividade entomotóxica dos genes cry8 análogos ao gene nativo cry8Kal. O bioensaio foi conduzido com os fagos de fusão. Legenda: C- - Controle negativo utilizando fagos HELPER. Cry8Kal - Proteína original expressa no sistema de fago.

Cry8Ka2, Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5 - Variantes da toxina Cry8 expressas no sistema de fago.

[37] Figura 15. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com as seqüências de Cry8AB00.1, 50C (b) e Cry8Bbl. A primeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; a segunda linha, Cry8AB00.1, seqüência 3 da patente US 73297361; a terceira linha, Cry8AB00.1, seqüência 5 da patente US 7339092; a quarta linha, a seqüência de 50C (b) da patente US 5554534; a quinta linha, Cry8Bbl, seqüência 15 da patente W02005083095; a sexta linha, Cry8Bbl, seqüência 17 da patente W02005083095. Os números acima dos alinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) [38] Figura 16. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl A primeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 32a linha, Cry8Bbl, seqüências 1, 3, 5, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente W02005063996. Os números acima dos alinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) [39] Figura 17. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl. A primeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 31a linha, Cry8Bbl, seqüências 1, 3, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente US 7105332. Os números acima dos alinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) (Larkin, MA;

[40] Figura 18. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl. A primeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 31a linha, Cry8Bbl, seqüências 1, 3, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente US 7378499. Os números acima dos alinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) (Larkin, MA;

[41] Figura 19. Alinhamento das seqüências de aminoácidos da nova ô-endotoxina Cry8Kal com seqüências de Cry8. As seqüências foram alinhadas utilizando o programa CLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) contendo * são aminoácidos conservados; : , substituições conservativas; . , substituições semiconservativas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[42] Na presente invenção, foi identificado e clonado um novo gene pertencente à família cry8, com alta toxicidade a insetos coleópteros, especificamente ao bicudo-do-algodoeiro. Os códons desta seqüência foram otimizados para sua expressão em plantas, especificamente, para plantas de algodão. Além disso, foi construída uma biblioteca combinatória, através da técnica de embaralhamento de DNA, com o intuito de desenvolver genes análogos mutantes, os quais também codificam para a proteína da família Cry8. Os genes análogos mutantes gerados, assim como o gene original, possuem potencial efeito no controle do bicudo-do-algodoeiro.

[43] Para alcançar o objetivo desejado, ou seja, genes de δ-endotoxinas com atividade sobre o bicudo do algodoeiro, realizou-se inicialmente, uma varredura no banco de germoplasma de B. thuringiensis da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, com o intuito de identificar estirpes com atividade sobre o bicudo-do-algodoeiro. As estirpes efetivas tiveram seu material genético extraído e submetido a técnicas de biologia molecular para identificação, caracterização e posterior clonagem dos genes cry. A partir desta varredura, foi identificada uma estirpe, denominada S811, altamente efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro.

[44] Para a clonagem dos genes cry da estirpe S811 (Banco de Germoplasma, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) foi feita uma amplificação inicial por PCR com oligonucleotídeos específicos para diversas famílias de δ-endotoxinas. A amplificação com oligonucleotídeos específicos para a família Cry8 resultou em um fragmento de cerca de 500 pb correspondente à extremidade 5’ de um gene novo da família cry8. Para obter a seqüência completa do gene foi utilizada a técnica de TAIL-PCR (Reação da Polimerase em Cadeia por Entrelaçamento Termal Assimétrico), com oligonucleotídeos específicos derivados das seqüências previamente amplificadas e oito oligonucleotídeos iniciadores arbitrários. O TAIL-PCR consiste numa aplicação da técnica de PCR que permite o isolamento de segmentos de DNA adjacentes a seqüências conhecidas (Liu & Whittier, Efficient isolation and mapping of [45] Resumidamente, são feitas seqüencialmente três reações de PCR utilizando três oligonucleotídeos seqüenciais específicos de um lado e um oligonucleotídeo de seqüência arbitrária do outro lado. É feito um ciclo inicial a baixa estringência de modo a permitir o andamento do oligonucleotídeo arbitrário com o segmento alvo de seqüência desconhecida, seguido de alguns ciclos a alta estringência de modo a favorecer o andamento do oligonucleotídeo específico e a amplificação linear da seqüência alvo. Altemando-se ciclos de alta e de baixa estringência, são formadas moléculas dupla fita e a amplificação da seqüência alvo torna-se logarítmica. Num segundo e terceiro ciclo de amplificações produtos não específicos deixam de ser amplificados e são eliminados.

[46] Fragmentos amplificados no TAIL-PCR e, potencialmente positivos, foram clonados e seqüenciados em ambas as direções em um seqüenciador automático. No total, foram realizadas duas reações seqüenciais de TAIL-PCR e amplificados 2688 pb (SEQ ID N° 1) equivalentes a 896 aminoácidos (SEQ ID N° 2) de um novo gene de B. thuringiensis pertencente à família de δ-endotoxinas Cry8. A seqüência protéica predita do novo gene, denominado cry8Kal(nomenclatura seguindo regras oficiais apresenta os três domínios estruturais característicos da extremidade N-terminal ativada das δ-endotoxinas e 240 aminoácidos da extensão C-terminal. Esta seqüência original serviu como molde para a geração de análogos com atividade entomotóxica melhorada.

[47] Para obtenção de genes cry análogos, com alta entomotoxicidade para o bicudo-do-algodoeiro, foi utilizado o gene cry8Kal isolado da cepa S811 de B. thuringiensis. Este gene foi utilizado como substrato no processo de originar genes variantes pela técnica de embaralhamento de DNA. Os variantes foram selecionadas quanto a capacidade de se ligarem a receptores presentes na membrana do intestino médio do bicudo-do-algodoeiro (BBMVs), pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display libraries. In: Phage display - A laboratory manual -USA: Cold Spring Laboratory, p. 10.1- [48] Para a seleção dos variantes do gene cry8 da presente invenção utilizamos a técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display (Zhang, Q., Bai, G., [49] Ao final, a toxina nativa Cry8Kal, seus análogos mutantes e sintéticos tiveram seus efeitos entomotóxicos avaliados in vitro, por meio de bioensaios seletivos. Para isso, os genes análogos selecionados foram cionados em vetores de expressão heteróloga (Escherichia coli) e as toxinas recombinantes geradas utilizadas em bioensaios contra os insetos-praga do algodoeiro (SEQ ID N° 5 a 12).

[50] A invenção descreve novas entomotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração de tecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse econômico. Mais especificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos e variantes dos mesmos, compreendem seqüências nucleotídicas, as quais codificam proteínas (polipeptídeos) entomotóxicas. As proteínas entomotóxicas descritas são biologicamente ativas contra alguns insetos-praga pertencentes à ordem Coleóptera, como por exemplo: o bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis; o verme da raiz do milho ocidental, Diabrotica virgifera virgifera; a vaquinha, Diabrotica longicornis barberi; o besouro do pepino, Diabrotica undecimpunctata howardi. Pragas adicionais incluem: larvas de besouros elatérios como Melanotus, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp; besouro japonês, Popillia japonica; larva branca, Phyllophaga crinita; pulguinha do milho e do arroz, Chaetocnema pulicaria; besouro do caule de girassol, Cylindrocupturus adspersus; besouro de semente de girassol cinza, Smicronyx sordidus; besouro de girassol, Zygogramma exclamationis; besouro de alfafa, Hypera nigrirostris; besouro ‘sem asa’ de crucíferas, Phyllotreta cruciferae; besouro da batata Colorado, Leptinotarsa decemlineata; besouro ‘sem asa’ listrado, Phyllotreta striolata; besouro ‘sem asa’ listrado da raiz de mostarda, Phyllotreta nemorum e o besouro de Brassica, Meligethes aeneus.

[51] Além das seqüências nucleotídicas, a presente invenção também descreve um vetor de expressão compreendendo as seqüências gênicas codificadoras de proteínas com alta atividade entomotóxica.

[52] As seqüências nucleotídicas da invenção possuem uso direto nos métodos de controle dos insetos-praga, particularmente da ordem Coleoptera. A presente invenção provê novas técnicas, as quais não dependem do uso dos pesticidas químicos sintéticos tradicionais. A invenção diz respeito a pesticidas biodegradáveis ocorrendo naturalmente e genes codificando os mesmos.

[53] Em algumas concretizações a invenção provê um gene codificador para δ-endotoxinas da família Cry8, obtido de fontes naturais, denominado cry8Kal (seguindo nomenclatura Foram criados por mutação in vitro, genes análogos mutantes e genes sintéticos ao gene nativo, também codificadores de δ-endotoxinas. Em outras concretizações, a invenção provê microrganismos e plantas geneticamente modificados capazes de expressar (produzir) as novas δ-endotoxinas, bem como métodos envolvendo o uso dos ácidos nucléicos em composições e/ou produtos pesticidas para atuar contra os insetos-praga em questão. A invenção também está relacionada às possíveis seqüências codificadoras ou aos fragmentos variantes codificadores de δ-endotoxinas.

[54] Na descrição que segue, vários termos são utilizados extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

[55] Como descrito aqui, o termo “análogo” descreve seqüências nucleotídicas ou protéicas diferentes das seqüências originais especificamente identificadas, onde um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos foram deletados, substituídos e/ou adicionados. Estas seqüências podem ser caracterizadas pela porcentagem de identidade de suas seqüências, por algoritmos comuns empregados no estado da técnica, com as seqüências nucleotídicas (SEQ ID N° 1-2) ou protéicas (SEQ ID N° 3-4) descritas aqui. A identidade percentual é determinada pelo alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na seqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de ferramentas de domínio público, como BLASTN e BLASTP, disponíveis na página do Centro Nacional para Informação Biotecnológica/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O alinhamento de seqüência e o cálculo de porcentagem de identidade da presente invenção foram realizados conforme descrito com as seqüências depositadas no Banco de Genes.

[56] Como usado aqui, os termos “ácido nucléico” e “seqüências nucleotídicas” fazem referência a um polímero desoxiribonucleotídeo de cadeia dupla (DNA), englobando análogos conhecidos que possuem a essência natural dos nucleotídeos naturais e hibridizam especificamente com ácidos nucleicos de cadeia simples de maneira similar aos nucleotídeos ocorrendo naturalmente.

[57] O termo “oligonucleotídeo” é referido aqui como ‘primers’ e ‘sondas’ da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucleico compreendendo de dez a trinta deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que oito. O tamanho exato dos oligonucleotídeos é dependente dos fatores experimentais particulares de cada etapa do processo.

[58] Conforme usado na presente invenção, os termos “codificador”, “codificando” ou “codificado” significam que uma sequência nucleotídica possui uma informação, a qual será traduzida biologicamente da seqüência de nucleotídeo em uma sequencia proteica específica. A informação codificada de uma proteína é especificada pelos códons expressos na sequência nucleotídica. Estes códons são explorados por cada organismo vivo de maneira diferenciada, podendo partes de seqüências nucleotídicas distintas serem traduzidas biologicamente em peptídeos idênticos.

[59] Como usado aqui, o termo “antisense”, usado no contexto da orientação de uma seqüência de nucleotídeo, refere-se a uma seqüência complementar de uma sequencia codificante de polinucleotídeo, que é operacionalmente ligada no sentido 3’-5’ portanto, a partir da extremidade 5' de um gene. A cadeia antisense é complementar a cadeia de orientação sense gerando um mRNA final capaz de hibridizar com o mRNA produzido a partir da transcrição da sequência original.

[60] O termo “gene” corresponde a uma seqüência nucleotídica específica localizada em uma região em particular do cromossomo, sendo responsável por codificar um produto final específico. O gene também carrega em sua estrutura primária toda a informação necessária para os processos de transcrição e tradução biológica, como por exemplo, regiões promotoras e reguladoras da transcrição. No caso da presente invenção, gene compreende uma seqüência nucleotídica codificadora correspondente as toxinas Cry provenientes de Bacillus thuringiensis.

[61] O termo “vetor” diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras seqüências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados.

Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente um dos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo “fagomídeo” diz respeito a um vetor que contém seqüência para replicação em fago e em bactéria, este vetor tem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentes selecionadores e promotores. Um exemplo é o fagomídeo pComb3X monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: que tem como característica fusionar a sequência de interesse ao gene da proteína ΙΠ, do bacteriófago filamentoso Ml3, localizada no capsídeo viral. O termo “vetor recombinante” é resultante da combinação de um vetor comercial com genes da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Paio Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Califi), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados, são os vetores pGEM-T easy (Promega Corporation), pETIOl/ D-TOPO (Invitrogen), pComb3X fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al.

Laboratory Press. 1989).

[62] Um “vetor de expressão” é um vetor especializado que contém um gene com regiões regulatórias necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (Paio Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). O termo “operacionalmente ligado” significa que as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificante estão colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas de maneira que quando juntadas à seqüência codificante, esta mantenha a fase de leitura adequada para efeito de sua expressão. Essa mesma definição é, às vezes, aplicada para o arranjo de seqüências codificantes e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou “enhancers” e elementos de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificante exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo ser microrganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléico que pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5' da região codificante exógena.

[63] A presente invenção não está limitada para o uso de qualquer promotor, estes podem ser induzíveis, constitutivos e tecido-específicos. Preferencialmente, o promotor da presente invenção é do grupo dos promotores dos genes da fibra de algodão, podendo ser, mas não estando limitado a E6, H6S, Rac13, LTP, ACP, Expansina, CAP, Anexina, FbL2A e actina 2.

[64] O promotor pode conter elementos “enhancers”. Um “enhancer” é uma seqüência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. “Promotores constitutivos” referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores “tecido-específicos” ou “desenvolvimento-específicos” são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios específicos do desenvolvimento em um tecido, como no início ou final da embriogênese.

[65] Conforme descrito anteriormente, a expressão “vetores de expressão” pode compreender um promotor induzível operacionalmente ligado a uma seqüência de ácido nucléico codificando a proteína pesticida da presente invenção. Promotores “induzíveis” podem dirigir a expressão de um polinucleotídeo com o qual eles estejam operacionalmente ligados, em um tecido ou estágio específico do desenvolvimento ou respondendo a condições ambientais. Em um dos aspectos da invenção, vetores de expressão compreendem um promotor induzível firmemente regulado operacionalmente ligado à uma molécula de ácido nucléico codificando uma proteína pesticida. Tal vetor de expressão pode adicionalmente compreender um gene marcador de seleção (por exemplo, um gene codificando uma proteína que confere resistência a antibiótico) operacionalmente ligado a um promotor constitutivo ou a um promotor induzível firmemente regulado. Dependendo da aplicação, ele pode beneficiar a expressão da seqüência de ácido nucléico codificando uma proteína pesticida através de um promotor induzível de inseto-praga. Em um aspecto da presente invenção pode ser vantajoso utilizar promotores que são expressos localmente ou próximo do sítio de infecção da praga.

[66] Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo “promotor expresso em plantas” significa uma seqüência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal que seja capaz de direcionar a síntese do gene presente no T-DNA de Agrobaterium; promotores tecido-específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado tecidos vasculares Saito, K., Cottyn, B., Engler, G., Seurinck, J., Van Montagu, M., Inze, D., Structure and expression analyses of the S-adenosylmethionine synthetase gene family in Arabidopsis promotores específicos de estames (WO8910396, WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes.

[67] Uma “seqüência líder” ou “seqüência sinal” na presente invenção significa uma seqüência de ácido nucléico que, quando operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucléico, permite a secreção do produto da molécula de ácido nucléico. A seqüência líder está preferencialmente localizada na região 5’ da molécula de ácido nucléico. Preferencialmente, a seqüência líder é obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula de ácido nucléico, ou é obtida do gene onde a molécula de ácido nucléico é derivada. Preferencialmente a presente invenção utiliza a seqüência sinal proveninente de uma cultivar de algodão brasileira.

[68] O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19Se35Sdo CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes.

[69] Os termos “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados de forma interrelacionada para referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se para polímeros de aminoácidos onde um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como para polímeros de aminoácidos ocorrendo naturalmente.

[70] Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos ou através de um ácido nucléico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular. Por exemplo, uma proteína truncada da invenção pode ser produzida pela expressão de um ácido nucléico recombinante da invenção em uma célula hospedeira apropriada, ou alternativamente pela combinação de procedimentos, tais como digestão utilizando protease e purificação.

[71] O termo “substancialmente pura” refere-se a preparações compreendendo pelo menos 50-60% de peso do componente de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, polipeptídeo, proteína, etc). Mais preferencialmente, a preparação compreende pelo menos 75% de peso, e mais preferencialmente 90-99% de peso do componente de interesse. A pureza é medida por meio de métodos apropriados para o componente de interesse (por exemplo, espectometria de massa e similares).

[72] O termo “proteína isolada” ou “proteína isolada e purificada” é, às vezes, utilizado na presente invenção. Este termo refere-se a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. Alternativamente, este termo pode referir-se a uma proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas as quais ela poderia estar naturalmente associada, tal como ela existe na sua forma “substancialmente pura”. O termo “isolado” não exclui misturas sintéticas ou artificiais com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade fundamental da proteína, e que pode estar presente, por exemplo, em uma purificação incompleta, adição de estabilizadores, ou combinados dentro, por exemplo, em uma composição agriculturalmente aceitável.

[73] O termo “veículo agriculturalmente aceitável” refere-se a soluções nas quais uma proteína pesticida ou uma seqüência de ácido nucleico codificadora de uma proteína pesticida possa ser mantida sem a alteração das propriedades funcionais da molécula da proteína aqui descrita para uso agrícola. Os veículos utilizados na presente invenção podem ser líquidos ou sólidos. Veículos líquidos que podem ser utilizados para formar composições utilizando proteína recombinante da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a água ou solventes orgânicos, tais como polióis, ésteres, cloreto de metileno, álcool, ou óleo vegetal. Outros componentes que podem ser incluídos na formulação incluem umectantes, preservativos, espessantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, emulsificadores, polímeros formadores de filme e misturas destes. Umectantes podem incluir polióis, açúcares (tais como melaço), glicóis e sais higroscópicos. Membranas vítreas, polímeros formadores de filmes incluem goma rosina, látex, pirrolidona polivinil, álcool polivinil, cloreto polivinil, polietileno, acetato de polivinil, e misturas destes. Aditivos opcionais adicionais incluem metil, metalcrilato, e misturas destes.

[74] Os termos “análogo peptídico” ou “análogo mutante” significam um análogo natural ou mutante de uma proteína, compreendendo uma série de fragmentos lineares ou discontínuos daquela proteína e no qual pode ter um ou mais aminoácidos recolocado(s) com outro(s) aminoácido(s) e que pode ter sua atividade biológica alterada, auxiliada, aumentada ou diminuída quando comparada com a proteína parental nativa ou não-mutada.

[75] O termo “atividade biológica” diz respeito a uma função ou um grupo de funções executado por uma molécula em um contexto biológico (isto é, em um organismo ou substituto in vitro ou algum outro modelo similar). Para as proteínas entomotóxicas, a atividade biológica é caracterizada pelas propriedades físico-químicas como por exemplo, estruturação em domínios altamente hidrofóbicos, capazes de formar oligômeros, e afinidade por membrana biologicas, causando a destruição das mesmas. Esta afinidade por membranas pode ser ocasionada pela presença de receptores específicos bem como pela simples interação química entre ambas.

[76] Como usado aqui, o termo “impactando insetos-praga” refere-se ao efeito de mudar nos insetos a alimentação, crescimento, e/ou comportamento em qualquer estágio do desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a: matar o inseto; retardar o crescimento; impedir capacidade reprodutiva; atividade anti-alimentação; e outros semelhantes.

[77] Os termos “atividade pesticida” e “atividade inseticida” são utilizados sinonimamente para referir-se a atividade de um organismo ou uma substância (p.ex: uma proteína) que pode ser medida por, mas não estando limitada a mortalidade da praga, perda de peso da praga, repelência à pragas, e outros comportamentos e mudanças físicas de uma praga depois da alimentação e exposição por um apropriado período de tempo. Dessa forma, o impacto da atividade pesticida deve ter pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão da praga. Por exemplo, “proteínas pesticidas” são proteínas que desencadeiam a atividade pesticida por elas mesmas ou em combinação com outras proteínas. Endotoxinas e δ-endotoxina são proteínas pesticidas. Outros exemplos de proteínas pesticidas incluem, por exemplo, pentina-1 e jaburetox.

[78] O termo “quantidade efetiva de pesticida” diz respeito a uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no ambiente da praga. Para cada substância ou organismo, a quantidade efetiva de pesticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Similarmente o termo “quantidade efetiva de pesticida” pode ser usado para referir a uma “quantidade efetiva de pesticida” quando uma praga é um inseto-praga.

[79] O termo “recombinantemente engenheirado” ou “engenheirado” diz respeito a utilização da tecnologia do DNA recombinante para gerar (engenheirar) uma mudança na estrutura da proteína baseando-se no entendimento do mecanismo de ação da mesma, podendo os aminoácidos serem introduzidos, deletados ou substituídos.

[80] O termo “Embaralhamento de DNA” é utilizado para descrever um método empregado em evolução molecular dirigida in vitro para gerar variantes de uma única seqüência gênica, ou duas ou mais seqüências gênicas homólogas por meio de recombinações de fragmentos gerados randomicamente, com recuperação de seqüências modificadas e com conseqüente modificação de resíduos de aminoácidos na proteína codificada pelo análogo mutante.

[81] O termo “apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display” diz respeito a um sistema de expressão e de interações de proteínas fusionadas a bacteriófagos que permitem uma varredura em células, tecidos ou órgãos a procura de pares receptores-ligantes, sendo esses ligantes proteínas que se ligam aos receptores presentes no alvo em estudo.

[82] Como usado aqui, o termo “seqüência de nucleotídeo mutada” ou “mutação” ou “seqüência de nucleotídeo mutageneizada” diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo que foi mutada ou alterada para conter para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (p.ex.: pares de base) que não estão presentes no tipo selvagem ou na seqüência não-mutada. Tal mutagênese ou alteração consiste de uma ou mais adições, deleções, ou substituições ou realocamento de resíduos de ácidos nucleicos.

[83] O termo “análogo” ou “mutante” é utilizado para identificar um gene que foi alterado por mutação e que o torna diferente do tipo selvagem ou da variação normal da população.

[84] Como usado aqui, o termo “melhora da atividade inseticida” ou “melhora da atividade pesticida” caracteriza um polipeptídeo ou uma δ-endotoxina da invenção que possui a atividade pesticida contra coleópteros melhorada em relação às outras δ-endotoxinas que sejam efetivas contra insetos. Para medir a melhora da atividade pesticida ou inseticida deve-se requerer uma demonstração de aumento da toxicidade de pelo menos 10%, contra o inseto alvo, e mais preferencialmente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 200% ou um maior aumento de toxicidade com relação à atividade inseticida das δ-endotoxinas Cry8 existentes que sejam ativas contra o mesmo inseto.

[85] O termo “toxina” ou “endotoxina” está relacionado a um polipeptídeo, o qual aprenseta atividade tóxica inseticida. É conhecido, no estado da técnica, que as δ-endotoxinas de ocorrência natural, são sintetizadas por B. thuringiensis, os quais esporulam liberando a inclusão cristalina protéica contendo a δ-endotoxina.

[86] Para um interesse particular da invenção, foram otimizadas seqüências codificando proteínas pesticidas desta invenção. Como usada aqui, os termos “seqüências de nucleotídeos otimizadas” ou “seqüências sintéticas” referem-se a ácidos nucleicos que são otimizados para expressão em um organismo particular. Seqüências de nucleotídeos otimizadas incluem aquelas seqüências que foram tão modificadas que o conteúdo GC da seqüência de nucleotídeos passa a ficar alterado. Tal modificação na seqüência de nucleotídeo pode ou não compreender uma região codificadora. Onde a seqüência modificada de nucleotídeo compreende uma região codificadora, as alterações no conteúdo de GC podem ser feitas em vista de outro fenômeno genético, como por exemplo, a preferência de um códon por um organismo particular ou a tendência do conteúdo de GC na região codificadora.

[87] Em algumas concretizações da invenção, onde a seqüência de nucleotídeo otimizada compreende a região codificadora, a alteração no conteúdo de GC não resulta em uma mudança na proteína codificada pela seqüência de nucleotídeo. Em outras concretizações, a alteração no conteúdo de GC resulta em mudanças na proteína codificada que podem ser mudanças em aminoácidos conservados que podem não alterar significantemente a função da proteína codificada. O conteúdo de GC de uma seqüência de nucleotídeo pode diferir da seqüência de nucleotídeo nativa em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, ou 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%,20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, ou mais. Então, o conteúdo de GC de uma seqüência de nucleotídeo otimizada pode ser 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, ou 80%, ou maior.

[88] Um especialista no assunto tem conhecimento de que avanços no campo da biologia molecular tais como uma mutagênese sítio-específica ou ao acaso, metodologia da reação de polimerase em cadeia (PCR), e técnicas da engenharia protéica dispõem de uma extensiva coleção de ferramentas e protocolos viáveis para o uso para alterar ou engenheirar ambas as seqüências de aminoácido e seqüências genéticas disfarçadas de proteínas de interesse agrícola. Então, as proteínas pesticidas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras, incluindo substituição de aminoácido, deleções, truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma seqüência de aminoácido variante da proteína pesticida da presente invenção pode ser preparada pela introdução de mutações dentro de um ácido nucleico sintético (p.ex.: molécula de DNA). Métodos para mutagênese e alterações em ácidos nucleicos são bem descritos no estado da técnica.

[89] O desenho do gene sintético foi realizado com base na seqüência original do gene, incluindo a porção N-terminal da proteína com os três domínios responsáveis pela atividade inseticida. No desenho do gene sintético foram modificados 262 pares de base, resultando na eliminação de 25 possíveis sinais de poliadenilação, 17 motivos de instabilidade, 95 códons pouco usados em plantas e no aumento do conteúdo de G-C de 35.6 para 43.8%. A seqüência protéica final do gene sintético é idêntica a seqüência original, ou seja, permaneceu inalterada.

[90] Entende-se que os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto pela expressão de um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular.

[91] Sabe-se que proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e variam em peso molecular, número de resíduos, componentes peptídicos, atividades contra pragas particulares, e outras características. No entanto, pelos métodos descritos aqui, proteínas ativas contra uma variedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas. As proteínas pesticidas da invenção podem ser usadas em combinação com δ-endotoxinas Bt ou outras proteínas inseticidas para aumentar a ação no inseto alvo. Além do mais, o uso de proteínas pesticidas da presente invenção em combinação com δ-endotoxinas de Bt ou outros princípios inseticidas de uma natureza diferente podem ter uma utilidade particular para prevenção e/ou manejo da resistência à inseto. Outros princípios inseticidas incluem, mas não estão limitados a inibidores de protease (ambos serina e cisteína), lectinas, alfa-amilases, e peroxidases.

[92] A invenção também diz respeito a microrganismos transformados com pelo menos um ácido nucleico da presente invenção, com um gene quimérico compreendendo o ácido nucleico, ou com um vetor de expressão compreendendo o gene quimérico. Preferencialmente, o microrganismo é um que se multiplica em plantas. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma bactéria colonizadora de raiz. Uma concretização da presente invenção diz respeito a uma proteína pesticida encapsulada, que compreende um microrganismo transformado compreendendo pelo menos uma proteína pesticida da invenção.

[93] A invenção também provê composições pesticidas compreendendo um organismo transformado da invenção. Preferencialmente o microrganismo transformado está presente na composição pesticida em uma quantidade pesticida efetiva, junto com um veículo carregador aceitável. A invenção também compreende composições pesticidas compreendendo uma proteína isolada da invenção, sozinha ou em combinação com um organismo transformado da invenção e/ou uma proteína pesticida encapsulada da invenção, em uma quantidade inseticida efetiva, junto com um veículo aceitável.

[94] A invenção também provê um método de aumentar o alcance do inseto alvo através do uso de proteínas pesticidas da invenção em combinação com pelo menos uma segunda proteína pesticida que seja diferente da proteína pesticida da invenção. Qualquer proteína pesticida conhecida no estado da técnica pode ser utilizada no método da presente invenção. Tais proteínas pesticidas incluem, mas não estão limitadas a δ-endotoxinas de Bt, inibidores de protease, lectinas, alfa amilases, hidrolases acil lipídicas, e peroxidases.

[95] A invenção também compreende plantas transgênicas ou transformadas compreendendo pelo menos uma seqüência nucleotídica da invenção. Preferencialmente, a planta é estavelmente transformada com um gene quimérico compreendendo pelo menos uma seqüência nucleotídica da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em células vegetais. Como usado aqui, o termo “plantas transgênicas” ou “plantas transformadas” refere-se a uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado ao genoma de uma planta transgênica, de forma estável para que o polinucleotídeo seja passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado dentro do genoma sozinho ou como parte de um vetor recombinante.

[96] Como usado aqui, o termo “transgênico” inclui qualquer célula, linhagem celular, calos, tecidos, parte da planta, ou genótipo da planta que tem sido alterado pela presença do ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamento sexual ou propagação sexual do transgênico sexual.

[97] O termo “plantas” refere-se a organismos fotossintéticos, ambos eucariotos e procariotos, onde o termo “plantas desenvolvidas” refere-se a plantas eucariotas. O termo refere-se a plantas inteiras, órgãos vegetais (p.ex.: folhas, caules, raízes, flores, entre outros), sementes, células vegetais, e progênies dos mesmos. Partes das plantas transgênicas também estão incluídas dentro do escopo da invenção compreendendo, por exemplo, células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, raízes originados de plantas transgênicas ou sua progênie previamente transformada com uma molécula de DNA da invenção e, portanto, consistindo de pelo menos parte das células transgênicas, são também objeto da presente invenção. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Particularmente a presente invenção diz respeito a plantas de algodão transformadas com as seqüências nucleotídicas da presente invenção bem como fragmentos e derivados das mesmas, mais especificamente plantas transformadas de Gossypium hirsutum.

[98] Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir seqüências de nucleotídeos dentro de plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal, por exemplo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, alvos da transformação. Métodos viáveis de introduzir seqüências nucleotídicas em células vegetais e a subseqüente inserção dentro do genoma vegetal são bem descritos no estado da técnica e podem ser, mas não estão limitados a técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA.

[99] Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol., 101, 433-448, 1983) A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. (Paszkowski, US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al (Fromm, Μ. E., [100] Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas em um vetor convencional, o hospedeiro Agrobacterium tumefaciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científici iHorsch, R, B,, Fraley, R. T,, Inheritance of functional foreign genes in plants. Science 233:496-498, 1984; e Fraley, R. T., [101] Células de plantas transformadas derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado, tal como resistência a insetos. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al (Evans, D. E,, and Bravo, através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al (Klee, H., Horsch, R., Rogers, S., Agrobacterium-mediated plant transformation and its further applications to plant biology. Ann. Ver. Of Plant [102] Sabe-se que os genes codificando as proteínas pesticidas podem ser usados para transformar organismos patogênicos a insetos. Tais organismos incluem baculovírus, fungos, protozoários, bactérias, e nematóides.

[103] Um gene codificando uma proteína pesticida da invenção pode ser introduzido através de um vetor viável dentro de um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro pode ser aplicado no ambiente, ou em plantas, ou em animais. O termo “introduzido” no contexto de inserir um ácido nucleico dentro de uma célula significa “transfecção” ou “transformação” ou “transdução” e inclui a incorporação de um ácido nucleico dentro de uma célula procariótica ou eucariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado dentro do genoma da célula (p.ex.: cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertido dentro de um replicon autônomo, ou expresso transientemente (p.ex.: RNAm transfectado).

[104] Microorganismos hospedeiros têm sido conhecidos por ocupar a “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera, e/ou rizoplano) de uma ou mais cultivares de interesse selecionada(s). Esses microorganismos de interesse são selecionados para serem capazes de competir com sucesso em um meio ambiente particular com microorganismos selvagens, provendo uma manutenção e expressão estável do gene expressando a proteína pesticida, e desejavelmente, melhorar a proteção do pesticida da degradação ambiental e inativação.

[105] Tais microorganismos incluem, mas não estão limitados a bactérias, algas e fungos. Particularmente os microorganismos incluem bactérias tais como Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, e Alcaligenes, fungos, particularmente leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. De particular interesse existem as espécies bacterianas da fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli e Azotobacter vinlandir e espécies de leveduras da fitosfera tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, e Aureobasidium pollulans.

[106] Existem vários métodos viáveis para introduzir um gene expressando a proteína pesticida dentro de um microrganismo hospedeiro sob condições que permitam a manutenção e a expressão estável do gene. Por exemplo, vetores de expressão podem ser construídos contendo a seqüência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada a sinais regulatórios de transcrição e tradução para expressão da seqüência de nucleotídeo. Quando uma seqüência de nucleotídeo homóloga interna do organismo se encontra com a seqüência no vetor de expressão, poderá haver uma recombinação entre elas e o gene que codifica a proteína pesticida se integrará no genoma do organismo hospedeiro de forma estável.

[107] Células hospedeiras viáveis, onde as células contendo a proteína pesticida serão tratadas para prolongar a atividade da proteína pesticida na célula quando a célula tratada for aplicada no meio ambiente da praga alvo, podem incluir células de procariotos ou eucariotos, normalmente sendo limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas em organismos superiores. No entanto, organismos que produzem substâncias tóxicas em organismos superiores podem ser usados, desde que a toxina seja instável ou o nível de aplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a hospedeiros mamíferos. Particularmente os hospedeiros são procariotas e eucariotas menos desenvolvidos como os fungos. Exemplos de procariotos, ambos gram negativos e gram positivos, incluem, mas não estão limitados a Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tais como Rhizobium; Spirillaceae, tais como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotos podem ser exemplificados os fungos, tais como Phycomycetes e Ascomycetes, os quais incluem leveduras, tais como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e Basidiomycetes, tais como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e semelhantes.

[108] Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para o propósito de produzir a proteína pesticida incluem a facilidade de introdução do gene da proteína pesticida dentro do sistema de expressão, eficiência de expressão, estabilidade da proteína no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Características de interesse para o uso de uma microcápsula pesticida incluem qualidade protetora para o pesticida, tais como espessura da parede celular, pigmentação, e empacotamento intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade foliar; ausência de toxicidade a mamíferos; atratividade para ingestão pelas pragas; facilidade de matar e fixar sem prejudicar a toxina; e semelhantes. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manuseio, economia, estabilidade de estocagem, e semelhantes.

[109] Organismos hospedeiros de particular interesse incluem leveduras, tais como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., e Sporobolomyces spp., organismos filoplanos tais como Pseudomonas spp., Erwinia spp., e Flavobacterium spp., e outros organismos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, e outros semelhantes.

[110] Na presente invenção, um microorganismo transformado (contendo a seqüência codificadora da proteína pesticida da invenção) ou uma proteína pesticida isolada pode ser formulado como um veículo carregador aceitável dentro de uma composição pesticida, que pode ser, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó, um grânulo dispersível, um pó umedecido, um concentrado emulsificado, um aerosol, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma cápsula coberta, e também encapsulações em, por exemplo, substâncias poliméricas.

[111] Tais composições divulgadas aqui podem ser obtidas pela adição de um agente superfície-ativo, um veículo carregador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor U.V. (ultra-violeta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta. Um ou mais agroquímicos incluindo, mas não limitados a herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, moluscocidas, acaricidas, reguladores de crescimento de planta, suportes de colheita, e fertilizantes, podem ser combinados com veículos carregadores, surfactantes ou adjuvantes normalmente utilizados em formulações, ou outros componentes utilizados para facilitar o manuseio e aplicação para uma praga alvo em particular. Carregadores e adjuvantes viáveis podem ser sólidos ou líquidos e correspondem a substâncias ordinariamente empregadas em uma tecnologia de formulação, por exemplo, natural ou substâncias minerais regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umidificantes, ligantes, ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área cultivada, plantas, ou sementes a ser tratadas. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser aplicadas em grãos nas preparações ou durante a estocagem em um silo de grãos, por exemplo. As composições da presente invenção podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outros compostos. Métodos de aplicar um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composição agroquímica da presente invenção que contenha pelo menos uma das proteínas pesticidas produzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem, mas não estão limitados a aplicação foliar, cobertura de semente, e aplicação no solo. O número de aplicações e taxa de aplicação dependerá da intensidade da infestação pela praga correspondente.

[112] Exemplos de materiais inertes incluem, mas não estão limitados a minerais inorgânicos tais como kaolina, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, ou materiais botânicos tais como cortiça, caroço de milho em pó, massa do amendoim, massa do arroz, concha da noz.

[113] As composições da presente invenção podem estar em uma forma viável para aplicação direta ou como um concentrado da composição primária que requer diluição com uma quantidade viável de água ou outro diluente antes de ser aplicada. A concentração pesticida irá variar dependendo da natureza da formulação em particular, especificamente, se é um concentrado ou será utilizado diretamente. A composição pode conter de 1 a 98% de um veículo inerte líquido ou sólido, e 0 a 50%, preferencialmente de 0,1% a 50% de um surfactante. Essas composições serão administradas em uma taxa rotulada para produtos comerciais, preferencialmente cerca de 0,01 lb - 5,0 lb por acre quando na forma seca e cerca de 0,01 pts - 10 pts por acre quando na forma líquida.

[114] As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade de pragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a, insetos, fungos, bactérias, nematóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, e semelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente insetos-praga que causam danos significativos para plantas agrícolas. Entende-se como “insetos-praga” insetos e outras pragas similares tais como, por exemplo, os insetos das ordens Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera, especialmente Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera e Lepidoptera. Insetos-praga da presente invenção da maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a Milho: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Hylemya platura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscrurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae; Sorgo: Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia subterranea, Phyllophaga crinita, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus leucopterus, Contarinia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae; Trigo: Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetiola destructor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Aceria tulipae; Girassol: Cylindrocupturus adspersus, Smicronyxfulus, Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeosoma electellum, Zygogramma exclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasioptera murtfeldtiana; Algodão: Heliothis virescens, lagarta-das-maçãs; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltadora do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Franklinkiella fusca, tripes; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus leucopterus, Acrosternum hilare; Soja: Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna varivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabilis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Cevada: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola: Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, e Meligethes viridescens; Batata, Leptinotarsa decemlineata.

[115) Os exemplos abaixo são colocados de forma a ilustrar e elucidar melhor a invenção e não podem ser tidos como forma de limitar a presente invenção.

EXEMPLOS

[116) Técnicas usuais de biologia molecular (p.ex.: transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos) estão descritas por meio de termos comumente empregados. Detalhes da prática de tais técnicas são descritos em Sambrook et al (Sambrooly Laboratory Press. 1989).

[117) Exemplo 1 - Seleção da estirpe S811 de Bacillus thuringiensis proveniente do Banco de Germoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnológicos.

[118) Em um trabalho prévio de Silva-Werneck et al. (Monerat, R. G., Silva, S. F,, Silva· Embrapa-Cenargen, Documentos 60, 65 p., 2001), foram identificadas e caracterizadas diversas estirpes pertencentes ao Banco de Germoplasma Microbiano da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Dentre estas, selecionou-se a estirpe S811 devido a sua elevada atividade entomotóxica contra insetos da ordem Coleóptera, como, por exemplo, Anthonomus grandis. A avaliação da toxicidade foi feita por meio de bioensaios seletivos, utilizando-se como substrato o extrato protéico total da bactéria Bacillus thuringiensis S811.

[119) Para obtenção do extrato bruto protéico a estirpe foi cultivada em meio de cultura caldo nutritivo (MCCN; caldo nutriente 8 g/L, extrato de levedura 1 g/L e 1 g/L de fosfato de potássio monobásico) a 30°C, sob uma agitação de 200 rpm. Após 12 horas de cultivo, com a cultura em fase vegetativa e após 48 - 72 horas com completa esporulação, pode-se obter o material genético e o extrato protéico bruto, respectivamente.

[120) Exemplo 2 - Identificação, isolamento e caracterização do gene cry8 proveniente da estirpe de Bacillus thuringiensis S81E

[121] A extração de DNA total do Bacillus thuringiensis S811 foi realizada de acordo com o protocolo de CTAB (2 % CTAB, 0,2 % de β-mercaptoetanol). Após 12 horas de cultivo, 30 mL da cultura, em fase vegetativa, foram centrifugados a 5000 rpm por 20 minutos. O sedimento foi congelado em nitrogênio líquido e macerado seguindo-se as descrições do protocolo descrito por Romano, E. (Romano, E. Extração de DNA| de tecidos vegetais. In: Manual de transformação genética de plantas. A.C.M. Brasileiro & V.T.C. Carneiro (Eds). iBmbrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, 1998]|. O produto final foi seco e ressuspendido em 50 gL de água Milli-Q e, posteriormente, armazenado a -20°C.

[122] Para identificação de genes codificadores de toxinas Cry na estirpe S811, foi utilizada a técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). As amplificações foram realizadas utilizando oligonucleotídeos específicos para detecção de genes do subgrupo cryl (Cerón, J~ 4965-4972, 1998]|. As condições de reação PCR contendo os oligonucleotídeos do grupo cryl foram descritas por Cerón et al (Cerón, J.; Covarrubias, L,; Quintero, R,; Ortiz, A,; Ortiz, M,; Aranda, E.; Lina, L., Bravo, A. PCR analysis of the cryl insecticidal crystal family genes from Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol., 60, 353-356, 1994) e as condições de reação de PCR contendo os oligonucleotídeos do grupo cry8 foram descritas por Bravo et al (Bravo, de DNA total, 10 mM Tris-HCI pH 8,4, 2 mM de MgCl2, 50 mM KC1, 200 mM de cada dNTP (deoxi-ribonucleotídeos trifosfato), 500 nM de cada oligonucleotídeo e 0,1 U/gL de Taq DNA polimerase para cada amostra de DNA. A amplificação foi realizada em termociclador (MasterCicle Gradient Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 94 °C por 2 minutos, repetição e 30 ciclos a 94 °C por 45 segundos (desnaturação), anelamento dos oligonucleotídeos por 45 segundos (temperatura específica para cada oligonucleotídeo), 72 °C por 2 minutos (extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão final de 72 °C por 5 minutos. Os fragmentos amplificados por PCR foram separadas e visualizados em gel 0,8% de agarose. Os fragmentos de DNA foram excisados do gel e purificados utilizando-se kit GeneClean (Biol01 System) e quantificados por espectrofotometria. Os fragmentos purificados foram então ligados a 50 ng de vetor comercial pGEMT-easy (PROMEGA), na razão molar de 3:1 (inserto:vetor) com 4 U/gL T4 DNA ligase e tampão 1 X no volume final de 15 gL. Os vetores gerados foram utilizados para transformar células competentes de Escherichia coli por eletroporação. Os clones positivos foram identificados por PCR de colônia e tiveram seu DNA plasmidial extraído. Os DNAs plasmidiais obtidos foram seqüenciados em um seqüenciador automático ABI, utilizando-se oligonucleotídeos gerais T7, SP6, reverso e universal (Nag, D.K., Huang, H.V. and Berg, D.E. Bidirectional [123] As seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências do Banco de Dados (GeneBank e SwissProt) pelo programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). O alinhamento múltiplo das seqüências dos clones obtidos foi realizado com as seqüências mais similares depositadas no Banco de Dados (GeneBank) foi feito pelo CLUSTALW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) (Thompson, J. D., D. G. Higgins e T. J. Gibson. CLUSTALW: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids [124] A primeira reação de amplificação por PCR com os oligonucleotídeos específicos para a família cry8, Bravo et al, 1998, teve como resultado um fragmento de 442 pb (Figura 1) correspondente à extremidade 5’ de um novo gene pertencente a família cry8 (SEQ. ID NO.l). Como intuito de obter a seqüência completa do gene cry8, realizou-se duas rodadas de amplificação pela técnica de TAIL-PCR (Reação da Polimerase em Cadeia por Entrelaçamento uma aplicação da técnica de PCR que permite o isolamento de segmentos de DNA adjacentes a seqüências conhecidas, utilizando para tal o DNA genômico do organismo. A técnica utiliza oligonucleotídeos específicos seqüenciais, junto a pequenos oligonucleotídeos arbitrários degenerados de modo a controlar termicamente a eficiência de amplificação relativa de produtos específicos e inespecíficos. Intercalando-se ciclos de altas e baixas estringências, produtos específicos são preferencialmente amplificados sobre produtos não-específicos.

[125) Resumidamente, feitas três reações seqüenciais de PCR utilizando usando oligonucleotídeos específicos derivados das seqüências previamente amplificadas de um lado 1995]|. Fragmentos foram amplificados, clonados, seqüenciados e analisados nas mesmas condições descritas anteriormente para a identificação inicial do gene.

[126) O produto final, obtido pela técnica de TAIL-PCR, contém 2688 pb amplificado (SEQ ID N° 1) e codifica uma nova δ-endotoxina de 896 aminoácidos (SEQ ID N° 2). A análise da seqüência nucleotídica pelo programa BLASTn, tendo como padrão de busca o banco de dados de patentes depositados no NCBI, indentificou a seqüência da presente invenção como sendo correspondente à família Cry8, apresentando mais de 90% de identidade, como demonstrado nos alinhamentos (Figuras 15, 16, 17, 18 e 19).

[127) Análises da seqüência protéica predita do novo gene Cry8 mostram a presença dos três domínios estruturais característicos das δ-endotoxinas, em sua porção N-Terminal. As análises também demonstram a presença de mais 240 aminoácidos da extensão C-terminal da nova δ-endotoxina (Figura 3).

[128] O alinhamento das seqüências de aminoácidos da presente invenção com outras proteínas patenteadas da família Cry8 mostra que a nova δ-endotoxina difere 80% das outras seqüências de aminoácidos, apresentando cerca de 150 aminoácidos conservados (Figura 19).

[129] Quando comparada a outras δ-endotoxinas, a nova δ-endotoxina Cry8, apresentou maior similaridade com o gene crySAa (53% identidade e 67% similaridade), seguido dos genes cry8Ba (53% identidade e 66% similaridade) e crySCa (49% identidade e 65% similaridade). A Figura 4 apresenta um dendograma do alinhamento da nova toxina Cry8 com as demais toxinas Cry8 depositadas no banco de dados até o momento atual. Na Figura 4 podemos observar a alta identidade entre as toxinas. A escala indica que no espaço representado existe a troca de pelo menos 0,1 aa.

[130] As extremidades N-terminal e C-terminal da nova δ-endotoxina Cry8Kal apresentam alta identidade com outras δ-endotoxinas Cry8, enquanto os três domínios estruturais são menos conservados, particularmente o segundo e terceiro domínios (Tabela 1), que estão envolvidos na ligação ao receptor, sugerindo novas atividades/especificidades inseticidas para o gene isolado.

[131] Tabela 1. Identidade média entre os domínios da δ-endotoxina Cry8Ga e os domínios correspondentes em outras δ-endotoxina Cry8.

Cry8Kal N-terminal Domínio I Domínio II Domínio III C-terminal CrySAa 87.7% 48.6% 29.8% 35.5% 90.7% CrySBa 89.8% 47.7% 31.3% 37.6% 91.1% CrySCa 73.5% 57.7% 31.6% 33.3% 68.6% [132] Exemplo 3 - Construção do vetor de expressão contendo o novo gene cry8Kal e obtenção da toxina recombinante.

[133] Para expressão da proteína heteróloga foi utilizado o vetor de expressão comercial pETIOl-D/TOPO (Invitrogen - Figura 5). O vetor foi adquirido em sua forma linearizada com uma extremidade abrupta e outra coesiva, complementar à extremidade do inserto de gene amplificado. Neste sistema, o produto de PCR é diretamente clonado pela adição dos quatro pares de bases do oligonucleotídeo de orientação “sense”. A extremidade coesiva do vetor de clonagem (GTGG) invade a extremidade 5' do produto de PCR, anelando-se com as quatro bases adicionadas (CACC) e estabiliza o produto de PCR na correta orientação. A topoisomerase então cliva a porção sobressalente do produto de PCR para que a ligação seja efetiva (Figura 6). Os insertos podem ser clonados desta forma com 90% de eficiência.

[134] Para amplificar o gene cry8 com as extremidades complementares, foram desenhados oligonucleotídeos com base no códon de iniciação (ATG) dos genes, com adição da seqüência CACC na região 5’ do oligonucleotídeo em orientação “sense”, segundo instruções do fabricante do sistema pET Directional TOPO cloning (Invitrogen). O oligonucleotídeo “antisense” não possui o códon de terminação, pois o mesmo encontra-se logo após a cauda de poli-histidina (Figura 5). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em uma reação de PCR com volume final de 25 pL, contendo 400 nM de cada oligonucleotídeo, 200 mM de dNTPs, 1 X do tampão para a enzima pfu, 2,5 U de DNA polimerase pfu (Stratagene) e 10 ng dos genes cry clonados no vetor pGEMT-easy (Invitrogen). A amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 94 °C por 1,5 minuto uma repetição de 30 ciclos a 94 °C por 1 minuto (desnaturação); 55 °C por 1 minuto (anelamento dos oligonucleotídeos) e 72 °C por 2 minutos (Extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão 72 °C por 5 minutos.

[135] O produto gerado foi então submetido a uma reação de ligação nas seguintes condições: 10 ng do produto de PCR, 200 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 pL do vetor pET101. A mistura foi incubada à temperatura ambiente, 25 °C, por 30 minutos. Células competentes de E. coli TOP10 foram transformadas com 3 pL do sistema de ligação (10 ng) por choque térmico. Para este procedimento, os 10 ng de DNA foram misturados a 200 pL de células competentes e a mistura incubada em gelo por 30 min. O choque térmico foi realizado por 3 minutos a 42 °C. As células foram imediatamente transferidas para o gelo e subseqüentemente foram adicionados 500 pL de meio de cultura SOC (2% triptona; 0,5% extrato de levedura; 0,05% NaCl; 2,5 mM KCl; 20 mM MgCl2). Posteriormente, as células foram inoculadas em 10 mL de meio de cultura Luria-Bertani ágar contendo 100 pM de ampicilina/mL e crescidas durante 16 horas, a 37 °C. Para verificação de clones positivos foi realizada uma PCR de colônia, a qual utilizou como molde o DNA das bactérias transformadas e as mesmas condições descritas para a clonagem dos genes. Os clones positivos foram então inoculados em 5 mL de meio Luria-Bertani ágar contendo 100 μΜ de ampicilina/mL.

[136] Para expressão do novo gene, os plasmídieos gerados foram transformados por choque térmico em células de Escherichia coli BL21 (DE) Star (Invitrogen). Foram adicionados 10 ng dos vetores pET101/cry8Kal em 200 gL de células competentes e incubou-se a mistura em gelo por 30 minutos. O choque térmico foi realizado por 3 min a 42 °C e, logo em seguida, a mistura de células foi colocada no gelo. Em seguida, adicionou-se 250 gL de meio SOC e incubou-se por 30 minutos a 37 °C e 200 rpm de agitação. Após este período as células foram inoculadas em 10 mL de meio LB-amp e crescidas por 16 horas. Esta cultura foi então utilizada com pré-inóculo para a expressão. Para cada 100 mL de meio Luria-Bertoni foram adicionados a 5 mL do pré-inóculo. O material foi incubado a 37 °C com 200 rpm de agitação. Após a cultura atingir a DOóoo entre 0,6-0,8 foi adicionado o indutor (IPTG) na concentração de 1 mM e a cultura permaneceu a 37 °C por mais 16 horas a fim de se obter a toxina recombinante Cry8Kal. Determinadas as condições de cultura ideais para melhor rendimento da expressão da proteína recombinante, as células foram inoculas em volumes de 500 mL. Após as 18 h de cultivo, o montante de células foi centrifugado por 10 minutos a 4000 g e o sobrenadante foi descartado. O precipitado de células foi ressuspenso em 10 mL de tampão de lise (50 mM de tampão fosfato pH 7,8; 300 mM NaCl, 10% glicerol, 0,5% triton X-100 contendo ou não 2 mg/mL lisozima) e as células foram rompidas por ultra-som (3X5 min). O produto lisado foi então centrifugado por 15 min a 10000 g. O sobrenadante foi então recolhido, quantificado pela metodologia descrita por Lowry et al. (Lowry, Ο. Η., N. J.

[137] Com o intuito de obter a toxina recombinante purificada, o sobrenadante obtido foi submetido à cromatografia de afinidade a Níquel (Ni), utilizando-se 5 ml da resina Ni-NTA (ácido nitrilotriacético-Níquel), com a capacidade de reter 5-10 mg de proteína recombinante com cauda de poli-histidina. A resina foi então empacotada em uma coluna de vidro e equilibrada com 4 volumes de coluna com solução de equilíbrio (50 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,8; 300mM NaCl e 10 mM imidazol). A amostra foi adicionada (não excedendo a capacidade total da resina) e a porção não retida, reservada e quantificada para análise. O excesso de material foi retirado com a adição de 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio. A lavagem foi realizada com 6 volumes de coluna de solução de lavagem (50 mM de tampão fosfato pH 7,8; 300 mM NaCl e 20 mM imidazol). A proteína foi eluída com dois volumes de coluna de tampão de eluição (50 mM de tampão fosfato pH 7,8; 300mM NaCl e 250 mM imidazol). O material eluído foi então dialisado contra 15 mM tampão carbonato (1,59 g de Na2CO3 e 2,93 g de NaHCO3), quantificado por Lowry e submetido à eletroforese unidimensional em gel de poliacrilamida 12 % (Figura 7). A Figura 7 mostra todo o processo de expressão e purificação da nova δ-endotoxina, em gel de poliacrilamida 12%.

[138] Exemplo 4 - Bioensaios seletivos contra o bicudo-do-algodoeiro para determinação da atividade entomotóxica da nova δ-endotoxina recombinante Cry8Kal.

[139] Com a finalidade de verificar a atividade das toxinas recombinantes foram realizados os bioensaios seletivos contra os insetos-praga de interesse. Os bioensaios seletivos foram Embrapa-Cenargen. 2004, Vol. 39, No 1, p. 11-16), incorporando-se 50 pg/mL, 100 pg/mL, 200 pg/mL da nova toxina recombinante Cry8Kal em 5 mL de dieta artificial (a 50 °C), TM vertida em Placas de Células de 6 poços NUNC . Após solidificação da dieta, foram feitos 15 furos de aproximadamente 0,6 mm , onde as larvas neonatas (uma por furo) foram inseridas, utilizou-se culturas da estirpe de Bacillus thuringiensis S811, contendo o gene cry8 nativo e, como controle negativo, 15 mM tampão carbonato.

[140] Como controle externo ao experimento realizou-se bioensaios contra larvas neonatas de Spodoptera frugiperda. Os bioensaios mostraram atividade tóxica significativa da cultura de Bacillus thuringiensis expressando a toxina Cry8Kal nativa, bem como da toxina recombinante pura, sobre Anthonomus grandis (Figura 8). Desta forma, foi confirmada a atividade entomotóxica do gene cry8Ka1.

[141] Exemplo 5 - Geração de genes mutantes, análogos ao gene cry8Ka1 nativo, altamente eficazes no controle de Anthonomus grandis pela técnica de embaralhamento de DNA.

[142] A construção de biblioteca de genes recombinantes análogos ao novo gene cry8 é uma importante estratégia biotecnológica, contribuindo de modo importante em programas de melhoramento de plantas, via transformação genética para geração de transgênicos. Esta tecnologia disponibiliza uma variedade de novas moléculas com potencial uso na transformação de plantas visando o controle do inseto-alvo, bem como a melhoria da atividade inseticida de novas proteínas codificadas pelos genes recombinantes. Este fator torna-se ainda mais relevante quando levamos em consideração os baixos níveis de expressão destas proteínas heterólogas em plantas geneticamente transformadas.

[143] Uma vez confirmada a atividade entomotóxica da nova δ-endotoxina Cry8Ka1 contra o inseto-praga Anthonomus grandis, partiu-se para a estratégia de obtenção in vitro de novos genes, análogos ao gene cry8, codificadores para a mesma toxina Cry8Ka1. Para isso, o gene nativo cry8Ka1 foi re-amplificado por PCR com oligonucleotídeos específicos para seqüência gênica em questão, os quais contêm a seqüência da enzima de restrição Sfil (5'GGCCNN NNNGGCC3'). Estes oligonucleotídeos foram desenhados em nosso laboratório utilizando-se como molde a seqüência gênica nativa cry8Ka1 e introduzem às extremidade 5'e 3' do gene nativo a seqüência da enzima em questão (oligonucleotídeo 5’: SfiI F - 5'CCCGGCCCAGGC GGCCGACCACGCGTATCGA 3' e oligonucleotídeo 3’: SfiI R - 5'CCCGGCCGGCCT GGCCGTTCAAGGAACCGTT 3'). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em uma reação de PCR com volume final de 25 gL, contendo 300nM de cada oligonucleotídeo específico, 200 nM de dNTPs, 1 X do tampão para a enzima taq (PHT), 1 U de DNA polimerase taq (PHT) e 400 ng de DNA cry8Ka1 (ativo. A amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 95 °C por 5 minutos; uma repetição de 29 ciclos a 95 °C por 40 segundos (desnaturação), 45 °C por 40 segundos (anelamento dos oligonucleotídeos) e 72 °C por 40 segundos (Extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão 72 °C por 2 minutos.

[144] A reação gerou um produto de 2000 pb (pares de base), o qual foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1%, a 100 Volts por 90 minutos. O fragmento gênico foi excisado e eluído do gel de agarose utilizando-se o kit Geneclean® Π (Qbiogene). Foram digeridos 100 pg do novo produto de DNA (SfiiHcry8Kal/SfiiT) com a enzima Sfil por 24 horas a 50 °C. O produto da digestão enzimática foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1%, excisado e eluído do gel. Ao final, obteve-se aproximadamente 40gg do novo produto de DNA (SfillcrySKalSfil) digerido com Sfil.

[145] Seguindo o protocolo da técnica de embaralhamento de DNA descrito por Stemmer, nuclease DNAsel, de 10gg do novo produto de DNA (SfillcrySKal Sfil) digerido com Sfil. A reação foi conduzida em tampão próprio da enzima com 10 U da mesma e interrompida pela adição de 26 mM de EDTA (Ácido 4-acético 2-amino etileno). Após esta etapa, o produto gênico é completamente fragmentado gerando pequenos pedaços gênicos de 30 a 50 pb, os quais foram purificados com o Kit High Pure PCR Product Purification® (Roche). Os fragmentos purificados foram utilizados em uma reação de PCR, a qual seguiu as seguintes condições: 100 ng do produto puro digerido com DNAsel, 1 X do Tampão Taq Platinum, 2.5 mM de dNTPs, 0.5 mM de MgSO4, 2,5 U de Taq Platinum High Fidelity DNA polimerase. A reação de PCR foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 95 °C por 2 minutos, uma repetição de 43 ciclos a 95 °C por 1 minuto (desnaturação); 44 °C por 1 minuto (anelamento dos fragmentos) e 72 °C por 1 minuto com acréscimo de 5 segundos por ciclo (Extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão 72 °C por 7 minutos.

[146] Esta reação de embaralhamento de DNA é conduzida sem a adição de oligonucleotídeos, o que gera ao final um montante de fragmentos de tamanhos variados. Este novo produto é então utilizado na segunda reação de PCR como molde, nas seguintes condições: 1/3 do volume do produto da primeira reação (molde), 1 X do Tampão Taq Platinum, 0,2 mM dNTPs, 0,8 μΜ dos oligonucleotídeos específicos Sfil F e Sfil R, 2mM de MgSCL e 25 U na mistura de 1:1 Taq Platinum High Fidelity (Invitrogen)/Taq PHT. A reação de amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 95 °C por 2 minutos, uma repetição de 10 ciclos a 95 °C por 30 segundos (desnaturação); 45 °C por 30 segundos (anelamento dos fragmentos), 72 °C por 1 minuto (extensão da DNA polimerase), outra repetição de 14 ciclos a 95 °C por 30 segundos (desnaturação), 43 °C por 30 segundos (anelamento do produto), 72 °C por 42 segundos (extensão da DNA polimerase) com acréscimo de 20 segundos por ciclo e ao final uma extensão 72 °C por 7 minutos.

[147] Sendo assim, o gene original é reconstituído com modificações em sua estrutura nucleotídica, seja pela introdução, deleção ou substituição de nucleotídeos. Este produto final, reconstruído foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1%, a 100 Volts por 90 minutos, excisado e eluído do gel com o Kit Geneclean® Π (Qbiogene). O produto purificado, aproximadamente 25 gg, foi então digerido com a enzima de restrição Sfil (condições anteriores) e submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1% , a 100 Volts por 90 minutos. A banda no tamanho aproximado do gene original (aproximadamente 2000 pb) foi excisada do gel e o DNA eluído pelo Geneclean® Π Kit (Qbiogene) (Figura 9).

[148] O produto final (população de genes recombinados) com adaptadores específicos torna- c í fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000). Assim, os novos genes reconstruídos (análogos ao gene nativo crySKal) foram clonados no vetor com auxílio da enzima T4 DNA Ligase® (Invitrogen) e este utilizado para transformar células de Escherichia coli XLl-Blue® (Stratagene), via eletroporaçao, nas seguintes condições: capacitância 25 uFD, resistência 200 Ω, voltagem 2,5 KVolts. Os transformantes foram então semeados em placas contendo meio de cultura Luria-Bertani Agar e Ampicilina® USB (100 gg/ mL). Após 17 horas a 37 °C as colônias crescidas em meio seletivo indicam o título da biblioteca contendo 105 transformantes.

[149] Esta biblioteca de análogos de cry8Kal gerada por embaralhamento de DNA e fusionados a proteína ΙΠ do capsídeo do fago filamentoso Ml3 (fagos de fusão) foi então selecionada pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage [150] O cultivo de células de E. coli XLl-Blue transformadas, em meio SB contendo lOOpg mL'carbenicilina, 5pg mL'1 tetraciclina, foi incubado em 37 °C com agitação até atingir densidade ópticaTsso = 0.6-0.8. Então, lxl012pfu mL'1 do fago auxiliar (VCSM13® Stratagene) foi adicionado para produzir fagos de fusão contendo os análogos do crySKal, incubados por 2 h a 37 °C. Adicionou-se Canamicina lOOpg mL'1, e a incubação seguiu por 12 h a 37 °C. As células coletadas por centrifugação foram guardadas a -20 °C para posterior preparação de DNA. Os fagos de fusão foram precipitados com PEG-8000 (4% p/v) durante 30 minutos no gelo e após centrifugação ressuspendidos em 2 mL of 1% (p/v) ASB (Albumina de soro bovino) em solução salina. Coletados após centrifugação, a preparação de fagos de fusão é utilizada nos ciclos de seleção.

[151] No procedimento de seleção por afinidade de ligação, os fagos fusionados foram depositados em poços de uma placa de microtitulação previamente sensibilizados com BBMVs (100 pg pL'1), extraídas da membrana do intestino de larvas do bicudo do algodoeiro. A cada ciclo de seleção, os poços são lavados com solução PBS-Tween (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4 and 0.05% Tween 20®) e, os fagos específicos, eluídos em baixo pH, são usados para transfectar novas células de E. coli. As partículas de fagos amplificadas são utilizadas no sucessivo ciclo de seleção. O procedimento envolveu cinco ciclos de lavagem, eluição e amplificação. A titulação das colônias coletadas em cada ciclo é feito pelo plaqueamento de colônias em diluições seriais em meio SB-agar contendo carbenicilina 100 pg mL'1. As colônias isoladas do montante de fagos específicos eluídos no quinto ciclo de seleção (apresentando o maior título e portanto, representando o ciclo de enriquecimento de fagos específicos) Figura 10 foram amplificadas com oligonucleotídeos específicos para o gene cry8Ka1. Colônias mostrando amplificação em PCR e contendo aproximadamente 2000bp (tamanho do gene original) foram selecionadas para a expressão em fagos Figura 11.

[152] O gene cry8Ka1 e os genes análogos selecionados no quinto ciclo de seleção foram expressados em meio seletivo (1% MOPS, 2% Extrato de Levedura, 3% triptona, 100 pg mL-1 ampicilina, 5 pg mL-1 tetraciclina, 100 pg mL-1 Canamicina, pH 7.0) contendo o fago auxiliar VCSM13, com incubação de 18 h a 37oC. O cultivo foi centrifugado e os fagos coletados precipitados com solução PEG-NaCl (20% Polietileno-Glicol 8000, 15% Cloreto de Sódio) durante 30 minutos no gelo. Após a centrifigação os fagos foram ressuspendidos em solução salina TBS (5 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH 7.5), novamente centrifugados, coletados e armazenados a 4oC para utilização imediata em bioensaios.

[153] Os análogos selecionados foram avaliados por meio de bioensaios seletivos contra as larvas de Anthonomus grandis, sendo aqueles que apresentaram maior atividade entomotóxica submetidos a uma reação de seqüenciamento nas seguintes condições: 400-800 ng de DNA plasmidial contendo os análogos e 4 pM de oligonucleotídeos específicos (Sfil R e Sfil F) em um seqüenciador automático modelo 3130 xL Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS).

[154] Ao final, foram selecionadas quatro seqüências análogas ao novo gene cry8Ka1, as quais estão descriminadas na Tabela 2. As novas moléculas geradas pela recombinação do gene cry8Ka1 apresentaram diferenças significativas de 13,29 a 16,33% pares de bases e de 2,10 a 5,11% de resíduos de aminoácidos modificados (Tabela 2). Para a análise das seqüências e classificação das mesmas como análogas do gene nativo cry8Ka1, estas moléculas foram agrupadas por similaridade de seqüências nucleotídicas obedecendo ao sistema de nomenclatura para toxinas Cry (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). Devido a uma variação < 5% entre as toxinas análogas e a toxina nativa Cry8Ka1, as novas seqüências foram classificadas na família das toxinas Cry8, sendo posteriormente nomeadas de Cry8Ka2, Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5 (Tabela 2) (SEQ ID N° 5-12).

[155] Tabela 2. Modificações de bases nucleotídicas e de resíduos de aminoácidos gerados pela técnica de embaralhamento de DNA no gene cry8Ka1 e mortalidade de larvas neonatas de Anthonomus grandis alimentadas com as proteínas expressas no sistema de fago.

Nucleotídeos Aminoácidos Gene Pares de base Modificados (%) Resíduos Modificados (%) DL 50 (%) cry8Kal 2001 - 666 - 36,1 cry8Ka2 1982 13,29 660 2,1 54,6 cry8Ka3 1991 13,25 663 2,84 63 cry8Ka.4 1989 14,1 663 2,99 50 crySKaS 1947 16,33 649 5,11 77,08 [156] [157] Apesar do elevado número de mutações nucleotídicas nas seqüências geradas (de 13 a 16%) ocorreram poucas modificações de resíduos de aminoácidos (de 2 a 5%) sendo gerado também a deleção de resíduos de aminoácido na extremidade 5' das variantes. A nova molécula Cry8Ka5 se mostrou aproximadamente 3 vezes mais ativa que a molécula original (Cry8Kal) exibindo uma mortalidade de 77% das larvas neonatas alimentadas com dieta contendo 6 pg de proteína por mL de dieta (Figura 12).

[158] Exemplo 6 - Determinação da estrutura terciária in silico das toxinas nativa Cry8Kal e análoga Cry8Ka5.

[159] As estruturas terciárias das toxinas Cry8Kal e do análogo Cry8Ka5 foram preditas in silico, sendo modeladas pela modelagem molecular utilizando como molde as estruturas de cristal das toxinas Cry3Bbl e Cry3A (ljió.pdb; Galitsky, N., Cody, V.; Wojtczak, A.; Ghosh, Cry3Bbl of Bacillus thuringiensis. Acta Crystallographica, Section D, Biological Crystallography, 57: 1101-1109, 2001) e Cry3A (ldlc.pdb; Li, J.; Carrol, J., Ellar, D. J. Crystal 353: 815-821, 199l|) depositadas no Banco de Dados de estrutura de Proteínas (PDB), O alinhamento de sequências múltiplas contendo as sequências das estruturas moldes e da toxinas para modelar foi submetido para o programa Modeller Version 9.2 (Sali A, Blundell 234(3):779-815.

[160] Os modelos obtidos pelo programa Modeller foram analisados quanto suas propriedades estereoquímicas pelo programa PROCHECK (Laskowski RA, Macarthur MW, Structures. Journal of Applied Crystallography 1993, 26:283-291).

[161] Os modelos de Cry8Kal e do análogo Cry8Ka5 mostraram o mesmo esqueleto estrutural, sendo diferenças observadas apenas nas cadeias laterais dos aminoácidos substituídos no análogo. As estruturas original e análoga Cry8Ka5 apresentam os três domínios funcionais conservados (I, Π, e ΙΠ), típicos das toxinas Cry, sendo todas as mutações e/ou substituições localizadas na superfície externa da molécula (Figura 13).

[162] Exemplo 7 - Bioensaios seletivos contra o bicudo-do-algodoeiro para determinação da atividade entomotóxica da nova δ-endotoxina recombinante Cry8Kal e seus análogos Cry8Ka2, Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5.

[163] Os bioensaios seletivos foram realizados seguindo as mesmas condições previamente descritas no exemplo 3 desta invenção. A Figura 14 demonstra os resultados referentes as atividades entomotóxicas determinadas.

[164] Exemplo 8 - Desenho de um gene cry8Kal sintético otimizado para expressão em plantas de algodão.

[165] O desenho do gene cry8Kal sintético foi baseado na seqüência do gene cry8Kal nativo, incluindo os três domínios responsáveis pela atividade inseticida, constituída de 666 aminoácidos. No desenho do gene cry8Kal sintético foram modificados 262 pares de base, resultando na eliminação de 25 possíveis sinais de poliadenilação, 17 motivos de instabilidade, 95 códons pouco usados em plantas e no aumento do conteúdo de G-C de 35.6 para 43.8%. A seqüência protéica final do gene cry8Kal sintético (SEQ Π) N° 4) é idêntica a seqüência original (SEQ ID N° 2). Um resumo das modificações introduzidas é apresentado na Tabela 3.

[166] Tabela 3. Modificações introduzidas na sequência nucleotídica do gene cry8Kal sintético e os parâmetros levados em consideração para modificações da sequência (SEQS ID 03 e 04).

Segmento N-terminal domínios I, Cry8Kal sintético II & III do gene Cry8Kal Pares de base (pb) 1998 pb = 666 aa 1998 pb = 666 aa A 690 558 T 597 565 C 333 441 G 378 434 A+T 1287 (64.4%) 1123 (56.2%) C+G 711(35.6%) 875 (43.8%) pb modificados 0 262 (13%) Códons modificados 0 261 (39%) Motivo ATTTA 17 0 Sítios de polia denilação putativos 26 1 Códons NCG 23 0 Códons NTA 72 0 [167] [168] Para modificar a seqüência do gene cry8Kal foi utilizada a metodologia Ligação Direta do Molde por Reação da Polimerase em Cadeia - TDL-PCR, descrita por Strizhov et al.

[169] A seqüência do gene cry8Kal foi dividida em três blocos denominados A, B e C com 595, 665 e 753 pb, respectivamente. Os blocos A e B são delimitados por um sítio de Nde I e os blocos B e C por um sítio de Spe I. Para a síntese do bloco A foram desenhados 6 ‘oligonucleotídeos’, para o bloco B, 7 ‘oligonucleotídeos’ e para o bloco C, 9 ‘oligonucleotídeos’. Os oligonucleotídeos nas extremidades de cada bloco contêm seqüências únicas não complementares ao gene original, para a posterior amplificação seletiva por PCR. Dentro de cada bloco não há sobreposição na seqüência dos oligonucleotídeos.

[170] Exemplo 9 - Construção do gene sintético cry8Kal otimizado para expressão em plantas de algodão.

[171] Resumidamente, a metodologia utilizada, ‘template directed ligation-PCR’ - TDL- etapas: (1) Análise da seqüência e síntese química dos oligonucleotídeos com as modificações a serem introduzidas; (2) Produção de DNA fita simples, da seqüência do gene, e que será utilizado como molde na etapa subseqüente; (3) Anelamento dos oligonucleotídeos com o DNA molde fita simples, parcialmente complementar, derivado do gene original, e ligação dos oligos utilizando uma DNA ligase; (4) Amplificação seletiva e síntese da segunda fita do DNA sintético por PCR, com oligonucleotídeos complementares apenas ao DNA sintético; (5) Montagem do gene, subclonagem e seqüenciamento.

[172] A Tabela 3 mostra as modificações introduzidas na seqüência nucleotídica do gene cry8Kal sintético. A Tabela também mostra os parâmetros levados em consideração para modificações da seqüência.

[173] Modificações das concretizações aqui apresentadas, relacionadas com a presente invenção, poderão ser idealizadas por especialistas na matéria a que esta invenção se refere, partindo-se dos ensinamentos apresentados na presente descrição e respectivas Figuras. Portanto, entende-se que a invenção não se limita às concretizações especificamente divulgadas e que eventuais modificações e outras concretizações podem ser incluídas dentro do escopo da invenção aqui divulgada.

[174] Todas as publicações e os pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do estado da técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e os pedidos de patentes são aqui incorporados por referência.

REIVINDICAÇÕES

Claims (13)

1. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por apresentar os domínios I, II e III, otimizada para expressão em plantas, consistindo de qualquer uma das sequências descritas em SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 11.

2. Construção gênica caracterizada por compreender: a) um polinucleotídeo de acordo a reivindicação 1; e b) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em (a).

3. Vetor caracterizado por compreender a construção gênica de acordo com a reivindicação 2.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o referido vetor ser capaz de promover a expressão das proteínas com as sequências apresentadas em SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10 ou SEQ ID N° 12.

5. Célula microbiana transgênica caracterizada por conter uma seqüência polinucleotídica otimizada para expressão em plantas de acordo com a reivindicação 1.

6. Método para obtenção de uma célula de microrganismo transgênica, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula com uma construção gênica de acordo com a reivindicação 2; e b) regenerar a célula transformada, contendo a construção gênica de interesse estavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais de crescimento em cultura celular; e c) expressar o produto gênico da construção inserida na célula regenerada.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o microorganismo ser uma bactéria colonizadora de raiz.

8. Método para obtenção de uma planta transgênica caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma célula de planta com uma construção gênica de acordo com a reivindicação 2; b) cultivar a célula transformada, contendo a construção gênica de interesse estavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais de crescimento em cultura celular; e c) regenerar uma planta transgênica expressando o produto da construção inserida, a partir da célula transformada.

9. Método de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a planta ser monocotiledônea ou dicotiledônea.

10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por a dicotiledônea ser uma planta de algodão.

11. Composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado cuja sequência de aminoácidos corresponde a qualquer uma das sequencias descritas em SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10 ou SEQ ID N° 12 e com atividade de δ-endotoxina Bt, em um veículo carreador agronomicamente aceitável a ser selecionado dentre um microorganismo transformado, agente superfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor uv (ultravioleta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta.

12. Método para o controle de um inseto praga da ordem Coleoptera caracterizado por compreender: a) detectar a ocorrência do inseto praga em um ambiente; b) promover o contato do inseto praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste em qualquer uma das sequêncisa de aminoácidos descrita em SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10 ou SEQ ID N° 12.

13. Método de obtenção de linhagens transgênicas de planta resistentes a um inseto praga da ordem Coleoptera, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica de acordo com a reivindicação 2; b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas; c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δ-endotoxina da invenção.