WO2014100880A2 - Moléculas variantes sintéticas de toxinas cry1ia12 com propriedades de controlar insetos-praga, composições contendo tais mutantes e método de utilização dos mesmos - Google Patents

Moléculas variantes sintéticas de toxinas cry1ia12 com propriedades de controlar insetos-praga, composições contendo tais mutantes e método de utilização dos mesmos Download PDF

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José Edilson GOMES JÚNIOR
Isabela TRISTAN LOURENÇO
Leonardo LIMA PEPINO DE MACEDO
Wagner Alexandre LUCENA
Fernando CAMPOS DE ASSIS FONSECA
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins

Definitions

  • the present invention relates to the field of pest insect control using methods and compositions comprising mutant ⁇ -endotoxin analogs. More specifically, the present invention aims to provide novel molecules from the Cry1 la12 gene with enhanced toxicity to make sugarcane plants resistant to the giant sugarcane borer, generating transgenic plants capable of expressing toxins. with high entomotoxic activity; make ⁇ -endotoxins enhanced by biotechnological processes available; assist in reducing chemical pesticide application rates with reduced social and environmental costs and increased crop productivity.
  • aspects of the invention are gene constructs containing the modified Cry1 la12 coding nucleic acid molecules, methods for heterologous expression of the new molecules in active form, as well as their use in insect pest control.
  • the invention also provides synthetic analog genes which are optimized for transformation and expression in plants.
  • one of the main damage-causing pest insects is the giant sugarcane borer, Telchin licus licus (Drury 1773; Lepidoptera: Castniidae), a lepidopteran insect that reaches up to 90 at the end of the larval phase.
  • mm presenting very difficult control due to inaccessibility to the caterpillars inside the culm.
  • Caterpillars when attacking new sugarcane plants, cause the so-called “dead hearts”: In adult plants, weight loss, lateral sprouting, breakage and atrophy of internodes occur.
  • the giant sugarcane borer predominates in the Northeast, especially in the states of Alagoas, Pernambuco, Para ⁇ ba and Rio Grande do Norte (Mendonça, AF, Viveiros, AJA, Sampaio, FF (1996). from sugarcane, Castnia licus Drury, 1770 (Lep. Castniidae). Sugarcane Pests, 133-167, Insects, Cia. Maceió).
  • This insect pest causes annual losses of 35 million in the Northeast region and is projected, up to 400 million reais per crop in the Southeast (Almeida, LC, Dias Filho, MM, Arrigoni, EB (2007 ) First Ocurrence of Telchin Licus (Drury, 1773), the "giant sugarcane borer” in the state of Sao Paulo, Brazil. Journal of Agriculture (Piracicaba). 82: 223-225). These data are alarming and require measures to prevent a loss of competitiveness of the national sugar and alcohol sector. And a preventative measure would be to make sugarcane resistant to pest insects by genetic transformation with genes of interest or by classical genetic improvement.
  • sugarcane can be a powerful tool by introducing traits such as pathogen and disease resistance in commercial sugarcane varieties, increasing their agronomic performance and obtaining sugar (Borém, A, Silva, J ⁇ , Diola, V (2010) Molecular Biology and Biotechnology In: Sugarcane: bioenergy, sugar and alcohol - technologies and perspectives Santos, F, Borem, A, Caldas, C (eds.) 333-353, University ViOFFsa, Vi
  • the present invention aims to make sugarcane plants resistant to the giant sugarcane borer, generating transgenic plants capable of expressing toxins with high entomotoxic activity, original ⁇ -endotoxins and improved by biotechnological processes, remedying and / or minimizing the problem of chemical insecticide abuse and its consequences.
  • Cry toxins are described as candidates for pest control (Carlini, CR, Gross-Sa, MF (2002) Plant toxins with insecticidal properties. A review of their potential bioinsecticides. Toxicon.
  • DNA shuffling has been used for various purposes, aiming to obtain molecules with desired characteristics, such as the improvement of enzymatic kinetics, generation of new specificities for certain substrates, formation of new products or modification of enzymes to optimal performance in specific environments (Lassner, M, Bedbrook, J (2001). Directed molecular evolution in plant improvement. Current Opinion in Plant Biology. 4: 152-156).
  • the genes of interest are first randomly fragmented into small sequences of 50-300 bp, and this product is recombined in a PCR (Polymerase Chain Reaction) reaction, which is conducted without the addition of oligonucleotides. In a second consecutive reaction, first reaction products and specific oligonucleotides are added.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • first reaction products and specific oligonucleotides are added.
  • the efficiency of the technique to produce analogous molecules with higher biological activity could be proven in several studies, such as, for example, in Jager et al (Jager, SAW, Jekel, PA and Janssen, DB Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of ⁇ - lactam antibiotics, Enzyme And Microbial Technology, Vol. 40, pp. 1335 - 1344, 2007), where the enzymatic activity of penicillin acyclase increased by 90%.
  • the technique may utilize one or more homologous genes and their success depends on a delicate arrangement between library size, originated biological diversity and a methodology for selecting variants with the desired trait (Ling Yuan, L. Kurek, I. , English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, pp. 373-392, 2005).
  • a successful example of the application of this technique includes the acquired toxicity of the Cry1 Ba / Cry1 Db chimeric toxin against Epiphyas postvittana (Knight, JS, Broadwell, AH, Grant, WN, Shoemaker, CB (2004). Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. Journal of Economic Entomology. 97: 1805-1813).
  • the Phage display technique involves the expression of proteins or peptides on the surface of filamentous phages, being presented as a fusion product to one of the bacteriophage protein coat proteins (Willats, WGT (2002) Phage display: practilities and prospects. Molecular Biology 50: 837-854).
  • This technique is one of the options for the selection of recombinant proteins or peptides, and has been successful in selecting peptides or proteins with specific binding properties (Smith, GP (1985). Filamentous fusion phage-novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228: 1315-1317) and alter the affinity of proteins for their ligands (Neri, D, Petrul, H, Roncucci, G (1995) Engineering recombinant antibodies for immunotherapy. Celi Biophysics. 27: 47-61).
  • CrylAc toxin has been fused into the protein phage lambda capsid D (Fernández, LE, Gomez, I, Pacheco, S, Arenas, I, Gill, SS, Bravo, A, Soberon, M (2008) Employing phage display to study the mode of action of Bacillus thuringiensis Cry toxins (Peptides 29: 324-329).
  • the present invention aims to solve the problem of chemical insecticide abuse, as well as to increase plant resistance by generating transgenic plants capable of expressing genes that code for molecules with high activity for ⁇ mutant analogs. -endotoxins.
  • the present invention relates to the field of pest insect control using methods and compositions comprising mutant ⁇ -endotoxin analogs. More specifically, the present invention aims to provide novel molecules from the Cry1 la12 gene with enhanced toxicity to make sugarcane plants resistant to the giant sugarcane borer, generating transgenic plants capable of expressing toxins with high entomotoxic activity; make ⁇ -endotoxins enhanced by biotechnological processes available; assist in reducing chemical pesticide application rates, reducing social and environmental costs and increasing crop productivity.
  • One embodiment of the present invention relates to synthetic variant Cry1 la12 toxin nucleic acid molecules comprising:
  • a second embodiment of the present invention relates to a gene construct containing the isolated nucleic acid molecule.
  • a third embodiment of the present invention relates to a binary vector characterized in that it contains a gene construct. More specifically, the present invention relates to a binary vector comprising:
  • a promoter optionally linked to a leader sequence and operably linked to
  • a fourth embodiment of the present invention concerns isolated polypeptides comprising sequences substantially similar to any of the sequences selected from the group identified as SEQ ID NO 7-12.
  • a fifth embodiment of the present invention relates to a transformed cell characterized in that it contains a gene construct or a binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention; or a polypeptide of the present invention.
  • a sixth embodiment of the present invention relates to a plant, or part, or propagule or progeny thereof comprising a gene construct or a binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention; or a polypeptide of the present invention.
  • a seventh embodiment of the present invention relates to a microorganism or a part thereof comprising a gene construct or a binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention; or a polypeptide of the present invention.
  • step (b) ç. regenerate mature plants, mature embryos or transformed cell microorganisms, cell callus, embryos or seeds selected in step (b);
  • step (c) selecting mature plants, mature embryos or microorganism cells of step (c) containing binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention
  • a tenth embodiment of the present invention relates to a recombinant protein obtained by the method described in the present invention.
  • An eleventh embodiment of the present invention relates to a biodegradable pesticidal composition comprising an effective concentration of the isolated polypeptide or mutant analog in an agronomically acceptable carrier vehicle.
  • a thirteenth embodiment of the present invention relates to a method of obtaining transgenic strains resistant to a pest insect, characterized in that it comprises the following steps:
  • Figure 1 0.8% agarose gel electrophoresis, showing the shuffling DNA reaction product for the crylAa and cry1 la12 genes.
  • A Molecular Weight Marker - 1 Kb Plus Ladder
  • B Positive Control
  • C Population of recombinant cryl Ia12 genes after shuffling DNA.
  • FIG. 1 Mortality analysis of T. I. licus larvae caused by Cry1 la 2 toxin variants in bioassays using artificial diet. Negative control, artificial liquid diet only, wild Cry1 la12, original protein expressed in E. coli, Variants I, II, III, IV and V, Cry la 2 toxin variants expressed in E. coli. Means followed by the same letter do not differ statistically by the Duncan test at the 5% significance level.
  • Figures 3a and 3b Alignment of amino acid residue sequences of wild Cry1 la12 toxin and its variants generated by DNA shuffling, where residue changes were indicated compared to wild toxin.
  • nucleic acids (genes) of the present invention comprise nucleotide sequences selected from the group identified as SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 or SEQ ID NO 6, which encode ⁇ -endotoxin proteins substantially similar to the sequences identified as SEQ ID Nos 7- 7-
  • the ⁇ -endotoxin proteins described are preferably biologically active against the insect pest belonging to the order Lepdoptera: the borer giant sugar cane (Telchin licus licus).
  • the invention involves a strategy to assist in pest control, involving the steps of producing and selecting new genes to be inserted into plants via transgenics to make them resistant to the target pest.
  • the production involves recombination and generation of new molecules and concerns the product of the application of DNA shuffling technique. Selection concerns the application of the Phage display technique - resulting in gene selection according to a desired trait.
  • the techniques used for the production and selection of new genes are already well described in the state of the art.
  • the present invention also describes a gene construct and a binary vector comprising gene sequences encoding proteins with high ⁇ -endotoxin activity.
  • the binary vector is further characterized by comprising:
  • a promoter optionally linked to a leader sequence and operably linked to
  • the present invention further provides a cell, plant, microorganism containing the nucleic acid and / or peptide molecules of the present invention.
  • the present invention provides new techniques which do not depend on the use of traditional synthetic chemical pesticides.
  • the invention relates to naturally occurring biodegradable pesticides and genes encoding them.
  • the invention provides for the creation of synthetic Cry la12 toxin variants (SEQ ID NO: 1) isolated from Bacillus thuringiensis.
  • the invention also relates to a method for producing a genetically modified organism comprising the following steps:
  • step (b) ç. regenerate mature plants, mature embryos or transformed cell microorganisms, cell callus, embryos or seeds selected in step (b);
  • step (c) select mature plants, mature embryos or microorganism cells from step (c) containing the gene construct or binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention.
  • the present invention further relates to a method for producing recombinant protein comprising the following steps:
  • step (b) select transformed cells, cell callus, embryos or seeds; ç. regenerate mature plants, mature embryos or transformed cell microorganisms, cell callus, embryos or seeds selected in step (b);
  • step (c) selecting mature plants, mature embryos or microorganism cells of step (c) containing binary vector containing the nucleic acid molecules of the present invention
  • the present invention also relates to a biodegradable pesticidal composition
  • a biodegradable pesticidal composition comprising an effective concentration of the isolated polypeptide of the present invention or mutant analog in an agronomically acceptable carrier vehicle.
  • the invention relates to a method of pest control comprising the following steps:
  • the invention also relates to a method for obtaining transgenic strains resistant to a pest insect, characterized in that it comprises the following steps:
  • the DNA Shuffling technique (Rosic, NN, Huang, W., Johnston, WA, James J. Devoss, JJ, Gillam, EMJ) Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by DNA family shuffling. , 35762, No of Pages 9, 2007; Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3 , pp. 373 - 392, 2005; Abécassis, V., Pompon, D. and Truan, G.
  • a new gene belonging to the cryl l family with high toxicity to lepidopteran insects, specifically the giant sugarcane borer was identified and cloned.
  • the codons of this sequence were optimized for their expression in plants, specifically for monocotyledonous plants.
  • a combinatorial library was built, DNA shuffling technique to develop mutant analog genes, which also encode the protein of the Cry l family.
  • the generated mutant analog genes have potential effect on the control of the giant sugarcane borer.
  • cry1 la12 gene isolated from B. thuringiensis strain S811 was used. This gene was used as a substrate in the process of generating variant genes by DNA shuffling technique. The variants were selected for their ability to bind to receptors on the membrane of the midgut giant sugarcane borer (BBMVs) by the Phage display protein surface technique.
  • BBMVs midgut giant sugarcane borer
  • cry1a2 gene variants of the present invention we used the Phage Display surface protein presentation technique.
  • the native toxin Cry1 la12 and its mutant analogs had their entomotoxic effects evaluated in vitro by selective bioassays.
  • the selected analogous genes were cloned into heterologous expression vectors (E. coli) and the generated recombinant toxins used in bioassays against giant sugarcane borer larvae.
  • nucleic acids (genes) of the present invention comprising nucleotide sequences which encode entomotoxic proteins (polypeptides).
  • isolated nucleic acid molecule is used to refer to the nucleic acids of the present invention. This term, when applied to the DNA of the present invention, refers to the DNA molecule that is originated from the cry1 la12 gene.
  • the "isolated nucleic acid molecule” may be inserted into a vector, such as a plasmid or virus vector, or integrated within a prokaryote or eukaryote genomic DNA.
  • An "isolated nucleic acid molecule” may also comprise a cDNA molecule.
  • An isolated nucleic acid molecule inserted into a vector is also sometimes referred to herein as a recombinant nucleic acid molecule.
  • isolated nucleic acid molecule may also be applied to transcribed RNA molecules of a DNA molecule as described above.
  • complement for the 5'AGTGAAGT3 'sequence, the complement is 3TCACTTCA5', the reverse complement is 3'ACTTCACT5 'and the reverse sequence is 5TGAAGTGA3 * .
  • variants or substantially similar or “peptide analog” or “mutant analog” includes amino acid sequences or nucleotides other than specifically identified sequences, in which one or more nucleotides or amino acid residues are deleted, replaced or added and may have its biological activity altered, aided, increased or decreased compared to the native or non-mutated parent protein.
  • Variants may be allelic, naturally occurring variants, or non-naturally occurring variants.
  • Variant or substantially similar sequences refer to nucleic acid or peptide fragments which may be characterized by the percent identity of their nucleotide or amino acid sequence to the nucleotide (SEQ ID NO. 2-6) or amino acid sequence (SEQ ID Nos.
  • nucleic acid or peptide fragments are those whose nucleotide or amino acid sequences have at least about 40 or 45% sequence identity, preferably about 50% or 55% sequence identity, more preferably about 60% or more. 65% of sequence identity, more preferably about 70% or 75% sequence identity, more preferably about 80% or 85% sequence identity, more preferably about 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity as compared to the reference sequence.
  • Percentage identity is determined by aligning two sequences to be compared by determining the number of identical residues in the aligned portion, dividing this number by the total number of residues in the searched sequence, and multiplying the result by 100. This alignment can be done using tools. public domain, such as BLASTN and BLASTP, available on the National Center for Biotechnology Information / NCBI page (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sequence alignment and percent identity calculation of the present invention were performed as described with sequences deposited in the Gene Bank.
  • the term "synthetic analogs" as cited in this invention refers to modification of the nucleotide sequences of the selected variants. Modifications in nucleotide base substitutions appropriating the preferred base codon of the plant used for genetic transformation. The new sequence is obtained by chemical synthesis and nucleotide substitutions do not represent changes in the translated amino acid sequence.
  • Coding sequence refers to the DNA sequence that encodes a specific protein and excludes the noncoding sequence.
  • An "interrupted coding sequence” means the sequence that acts as a separator (for example, one or more introns linked through junctions).
  • An "intron” is a nucleotide sequence that is transcribed and present in the pre mRNA, but is removed by cleavage and re-binding of the mRNA within the cell generating a mature mRNA that can be translated into a protein.
  • introns include, but are not limited to, pdk2 intron, castor bean intron catalase, cotton Delta 12 denaturase intron, Arabidopsis Delta 12 denaturase, ubiquitin intron, SV40 intron, malate synthase gene introns.
  • a "gene construct" is a gene comprising a promoter and a coding region from different origins. In the case of the present invention, the gene construct comprises the polynucleotides of the present invention linked together or alone to expression regulatory regions such as promoters and termination signals.
  • vector refers to a replicon, such as plasmid, phage or virus, to which other gene sequences or elements (whether DNA or RNA) may be linked. In this way the genes can be replicated along with the vector.
  • a replicon such as plasmid, phage or virus
  • phagemid refers to a vector containing sequence for phage and bacterial replication, this vector has characteristics that meet host cell specifications as well as selection agents and promoters.
  • pComb3X phagemid (Andris-Widhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, CF Methods for the generation of monoclonal chicken antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000), as a characteristic to fuse the gene of interest to the protein III gene of the filamentous bacteriophage M13, located in the viral capsid.
  • the term "recombinant vector” results from the combination of a commercial vector with genes of the present invention operably linked to an endogenous and / or heterologous polynucleotide of interest which is in turn operably linked to a termination signal.
  • Such vectors may be obtained commercially, including Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif.), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) And Promega (Madison, Wis.).
  • Some examples of vectors used in the present invention, but not limited to, are pGEM-T easy vectors (Promega Corporation), pCambia 2300 (Canberra, Australia), pComb3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, CF Methods for the generation of monoclonal chicken antibody fragments by Phage display.
  • a "binary vector” is a plasmid-derived vector capable of replicating in both Escherichia coli and Agrobacterium.
  • the binary vectors were used: plPKb002 and plPKb003 (Himmelbach, A.; Zierold, U .; Hensel, G.; Riechen, J.; Douchkov, D.; Schweizer, P.; Kumlehn, J. A Set of Modular Binary Vectors for Transformation of Cereals Breakthrough Technologies, 145: 1192-1200, 2000), in addition to the p7iU® vector (DNA Cloning Service e. K.).
  • operably linked means that regulatory sequences required for expression of the coding sequence are placed on the DNA molecule at appropriate positions relative to the coding sequence for the purpose of its expression. This same definition is sometimes applied for the arrangement of coding sequences and transcriptional controlling elements (for example, promoters, enhancers, and terminating elements) in the binary vector.
  • An exogenous coding region is typically flanked by operably linked regulatory regions that regulate expression of the exogenous coding region in a transformed cell (may be microorganism, plant or animal).
  • a typical regulatory region operably linked to an exogenous coding region includes a promoter, that is, a nucleic acid fragment that can cause transcription of exogenous coding regions, positioned at the 5 'region of the exogenous coding region.
  • operably linked means that regulatory sequences necessary for expression of the coding sequence are placed on the DNA molecule at appropriate positions relative to the coding sequence for the purpose of its expression. This same definition is sometimes applied for the arrangement of coding sequences and transcriptional controlling elements (for example, promoters, enhancers, and terminating elements) in the binary vector.
  • An exogenous coding region is typically flanked by operably linked regulatory regions that regulate expression of the exogenous coding region in a transformed cell (may be microorganism, plant or animal).
  • a typical regulatory region operably linked to an exogenous coding region includes a promoter, that is, a nucleic acid fragment that can cause transcription of exogenous coding regions, positioned at the 5 'region of the exogenous coding region.
  • promoters may be, but are not limited to, inducible, constitutive, and tissue-specific.
  • the promoter is a constitutive promoter.
  • promoter activity is stimulated by external or internal factors such as, but not limited to, hormones, chemical compounds, mechanical impulses, and conditions of biotic or abiotic stress.
  • the promoter activity can also be regulated temporally and spatially (such as tissue-specific promoters and regulated promoters during development).
  • the promoter may contain enhancer elements.
  • An enhancer is a DNA sequence that can stimulate promoter activity. It may be an innate promoter element or a heterologous element inserted to increase the level and / or tissue specificity of a promoter.
  • Constutive promoters refer to those who drive gene expression in all tissues at all times.
  • tissue-specific or development-specific promoters are those that drive gene expression almost exclusively in specific tissues, such as leaves, roots, stems, flowers, fruits or seeds, or at specific stages of development in a tissue, as at the beginning or end of embryogenesis.
  • the promoter is a plant expressed promoter.
  • plant expressed promoter means a DNA sequence that is capable of initiating and / or controlling transcription in a plant cell. This includes any promoter of plant origin; any promoter of non-plant origin capable of directing the synthesis of the gene present in the Agrobaterium T-DNA; tissue-specific or organ-specific promoters, including but not limited to seed-specific promoters (WO8903887), primordial organ-specific promoters (as mentioned in US20030175783, An, YQ, Huang, S., McDowell, JM, McKinney , E.
  • the promoter of the present invention is chosen from the group of promoters, which may be, but is not limited to, Ubi1 (Zea mays) (Christensen, AH, Sharrock, RA, Quail, PH.
  • bacterially expressed promoter means a DNA sequence that is capable of initiating and / or controlling transcription in a bacterial cell.
  • fungal expressed promoter means a DNA sequence that is capable of initiating and / or controlling transcription in a fungal cell.
  • insect expressed promoter means a DNA sequence that is capable of initiating and / or controlling transcription in an insect cell.
  • leader sequence or “signal sequence” in the present invention means a nucleic acid sequence which, when operatively linked to a nucleic acid molecule, allows secretion of the product from the nucleic acid molecule.
  • the leader sequence is preferably located in the 5 'region of the nucleic acid molecule.
  • the leader sequence is obtained from the same gene as the promoter used to direct transcription of the nucleic acid molecule, or is obtained from the gene where the nucleic acid molecule is derived.
  • the present invention utilizes the signal sequence from a sugarcane cultivar.
  • the transcription termination signal and polyadenylation region of the present invention includes, but is not limited to, SV40 termination signal, HSV TK adenylation signal, Agrobacterium tumefasciens (NOS) nopaline synthase gene termination signal, octopine synthase gene termination signal, CaMV 19S and 35S gene termination signal, corn alcohol dehydrogenase gene termination signal, mannopine synthase gene termination signal, beta-phaseoline gene termination signal, ssRUBISCO gene termination signal, sucrose synthase gene termination signal, virus termination signal attacking Trifolium subterranean (SCSV), Aspergillus nidulans trpC gene termination signal, and the like.
  • SCSV Trifolium subterranean
  • selective marker is referred to herein as sequences conferring antibiotic resistance or being visual markers.
  • the markers may be selected from, but not limited to, coding sequences for the kanamycin, neomycin, ampicillin, chloramphenicol, streptomycin, hygromycin, geneticin, phosphinothricin, glyphosate, ammonium glufosinate, AHAS, BAR and GUS genes.
  • Organisms (plants or bacteria) surviving the marker gene (or resistance gene) in culture medium or in topical applications are indicated as positive transformants characterized by the presence of exogenous gene integrated in the genome of this organism.
  • oligonucleotide is referred to herein as primers and probes of the present invention, and is defined as a nucleic acid molecule comprising from ten to ninety deoxyribonucleotides, preferably more than eight. The exact size of oligonucleotides is dependent on the particular experimental factors of each process step.
  • the terms "encoding”, “encoding” or “encoded” when used in the context of a specific nucleotide sequence means that it has information which will be translated biologically from the nucleotide sequence to a specific protein sequence.
  • the information by which a protein is encoded is specified by the use of codons. These codons are explored by each living organism differently and parts of distinct nucleotide sequences can be translated biologically into identical codons.
  • gene corresponds to a specific nucleotide sequence located in a particular region of the chromosome and is responsible for encoding a specific end product.
  • the gene also carries in its primary structure all the information necessary for transcription and biological translation processes, such as transcription promoter and regulatory regions.
  • gene comprises the coding nucleotide sequences corresponding to the cryl lal 2 gene and its analogs.
  • Polypeptides of the invention may be produced either by a nucleic acid described herein or by the use of standard molecular biology techniques.
  • a truncated protein of the invention may be produced by expressing a recombinant nucleic acid of the invention in an appropriate host cell, or alternatively by combining procedures such as protease digestion and purification.
  • the term "recombinant protein” refers to chimeric molecules obtained from the application of the gene shuffling technique of DNA (Cry1 la12 coders). These molecules may be expressed, but not only in phages, yeast bacteria and plants.
  • the recombinant protein of the present invention is characterized by having ⁇ -endotoxin activity.
  • isolated gene refers to the nucleotide sequence in a given genome.
  • isolated protein or “isolated and purified protein” is sometimes used in the present invention. This term refers to a protein produced by the expression of an isolated nucleic acid molecule of the present invention. Alternatively, this term may refer to a protein that has been sufficiently separated from other proteins that it could be naturally associated with, as it exists in its “substantially pure” form.
  • isolated does not exclude synthetic or artificial mixtures with other compounds or materials, or the presence of impurities that do not interfere with the fundamental activity of the protein, and which may be present, for example, in incomplete purification, addition of stabilizers, or combined in, for example, in an agriculturally acceptable composition.
  • biological activity refers to a function or group of functions performed by a molecule in a biological context (that is, in an in vitro organism or substitute or some other similar model).
  • biological activity is characterized by its cytotoxic activity to receptors present in the midgut of the target insect pest, leading to its death.
  • impacting pest insects refers to the effect of changing on insects feeding, growth, and / or behavior at any stage of development, including, but not limited to: killing the insect; slow growth; impede reproductive capacity; anti-eating activity; and the like.
  • the term "effective amount of pesticide” refers to an amount of a substance or organism that has pesticidal activity when present in the pest environment. For each substance or organism, the effective amount of pesticide is determined empirically for each pest affected in a specific environment. Similarly the term “effective amount of pesticide” may be used to refer to an "effective amount of pesticide” when a pest is an insect pest.
  • biodegradable pesticide composition is characterized by being products or substances released into the soil for action in pest environment, which can be degraded by microorganisms, photolysis, oxidation, among others, in a short period of time.
  • Biodegradable compositions involve Substances classified as organophosphates, carbamates, triazines, anilines can be placed in the form of cuttings that can be introduced into the soil without permanent damage.
  • Products generally comprise a water-soluble, hydrophilic solid polymeric binder to a systemic pesticide.
  • the biodegradable pesticide is characterized by the fact that an acceptable carrier vehicle may be a surface active agent, an inert carrier vehicle, a condom, a humectant, a food stimulant, an attractant, an encapsulating agent, a binder, a emulsifier, a dye, a UV (ultraviolet) protector, a buffer, a flow agent or fertilizer, micronutrient donors, or other preparations that influence plant growth.
  • the biodegradable pesticidal composition is characterized in that the acceptable carrier carrier is a transformed microorganism.
  • the biodegradable pesticidal composition is characterized in that the polypeptide of the present invention or mutant analog is used in combination with other insecticidal proteins.
  • Phage display surface protein presentation refers to a bacteriophage-fused protein expression and interaction system that allows cells, tissues, or organs to be scanned for receptor-ligand pairs. ligands, proteins that bind to receptors present on the target under study.
  • mutated nucleotide sequence or “mutation” or “mutagenized nucleotide sequence” refers to a nucleotide sequence that has been mutated or altered to contain one or more nucleotide residues (e.g. base pairs) that is not present in the wild type or in the unchanged sequence.
  • mutagenesis or alteration consists of one or more additions, deletions, or substitutions or reallocation of nucleic acid residues.
  • the term "improved insecticidal activity" or “improved pesticidal activity” characterizes a polypeptide or ⁇ -endotoxin of the invention that has improved lepidopteran pesticidal activity over original ⁇ -endotoxins that are not effective against insects .
  • a demonstration of change in the development (size and weight) of insect-specific larvae or larval mortality after contact with the ⁇ -endotoxin of the invention should be required. .
  • the pesticidal proteins of the invention may be altered in a number of ways, including amino acid substitution, deletions, truncations, and insertions. Methods for such manipulations are generally known in the prior art.
  • a variant amino acid sequence of the pesticidal protein of the present invention may be prepared by introducing mutations into a synthetic nucleic acid (e.g., DNA molecule). Methods for mutagenesis and nucleic acid changes are well described in the prior art. It is understood that the polypeptides of the invention may be produced either by expression of a nucleic acid described herein or by the use of standard molecular biology techniques.
  • a method for pest control can be characterized by comprising the following steps: a) detecting the occurrence of the pest in an environment; b) contacting the pest with a pesticidal protein isolated or produced as a composition of the present invention.
  • Pesticide proteins are known to be oligomeric and vary in molecular weight, number of residues, peptide components, activities against particular pests, and other characteristics. However, by the methods described herein, proteins active against a variety of pests can be isolated and characterized.
  • the pesticidal proteins of the invention may be used in combination or other insecticidal proteins to enhance action on the target insect. Moreover, the use of pesticidal proteins of the present invention in combination with other insecticidal principles of a different nature may have particular utility for preventing and / or managing insect resistance.
  • Other insecticidal principles include, but are not limited to, other types of protease inhibitors (both serine and cysteine), lectins, and peroxidases.
  • the invention also provides a method of increasing the range of the target insect by the use of pesticidal proteins of the invention in combination with at least one second pesticidal protein that is different from the protein pesticide of the invention.
  • Any pesticidal protein known in the art may be used in the method of the present invention.
  • pesticidal proteins include, but are not limited to Bt D-endotoxins, protease inhibitors, lectins, alpha amylases, acyl lipid hydrolases, and peroxidases.
  • the invention also comprises transgenic or transformed plants comprising at least one nucleotide sequence of the invention.
  • the plant is stably transformed with a chimeric gene comprising at least one nucleotide sequence of the invention operably linked to a promoter that directs expression in plant cells.
  • transgenic plants or “transformed plants” refers to a plant comprising within its genome a heterologous polynucleotide.
  • the heterologous polynucleotide is stably integrated into the genome of a transgenic plant so that the polynucleotide is passed on to successive generations.
  • the heterologous polynucleotide may be integrated within the genome alone or as part of a recombinant vector.
  • transgenic includes any cell, cell line, callus, tissue, plant part, or plant genotype that has been altered by the presence of heterologous nucleic acid including those initially altered transgenics as well as those created by sexual crossing. or sexual spread of the sexual transgenic.
  • plants refers to photosynthetic organisms, both eukaryotes and prokaryotes, where the term “developed plants” refers to eukaryotic plants.
  • the term refers to whole plants, plant organs (e.g., leaves, stems, roots, flowers, among others), seeds, plant cells, and progenies thereof.
  • Parts of transgenic plants are also included within the scope of the invention comprising, for example, plant cells, protoplasts, tissues, corns, embryos as well as flowers, eggs, stems, fruits, leaves, roots originating from transgenic plants or their previously transformed progeny. with a DNA molecule of the invention and therefore consisting of at least part of the cells GMOs are also the object of the present invention.
  • the nucleic acids of the invention may be used to confer desired treatments on essentially any plant.
  • the invention has use over various plant species, including species of the genera Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, coconuts, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Anihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Persiflora, Passiflora Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Seneci
  • Transformation protocols as well as protocols for introducing nucleotide sequences into plants may vary depending on the type of plant or plant cell, for example, monocotyledons or dicotyledons, targets of transformation.
  • Viable methods of introducing nucleotide sequences into plant cells and subsequent insertion into the plant genome are well described in the art and may be, but are not limited to techniques such as electroporation and microinjection of plant cell protoplasts, or construction may be introduced directly into plant tissue using ballistic methods such as bombardment of DNA-coated particles.
  • Microinjection techniques are known in the state of the art and well described in scientific and patent literature (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., Liu, G., Introduction of exogenous DNA into cotton embryos, Meth in Enzymol., 101, 433-448, 1983) (as mentioned in US patent application 4743548).
  • the introduction of gene constructs using polyethylene glycol precipitations is described in Paszkowski et al. (Paszkowski, J., Shillito, RD, Saul, M., Mandák, V., Hohn, T. Hohn, B., 13 000609
  • the gene constructs may be combined with appropriate T-DNA flanking regions and introduced into a conventional vector, the host Agrobacterium tumefaciens.
  • the virulence function of the host Agrobacterium tumefaciens will direct the insertion of the gene constructs and adjacent marker into the plant cell DNA when the cell is infected with the bacterium.
  • Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation techniques including disarmament and the use of binary vectors, are well described in the scientific literature (as mentioned in US Patent Application 20020152501, Horsch, RB, Fraley, RT, Rogers, SG, Sanders, PR, Lloyd). A., Hoffmann, N. Inheritance of Functional Foreign genes in Plants Science 233:.
  • Transformed plant cells derived from any of the transformation techniques described above can be cultured to regenerate an entire plant having the transformed genotype and then the desired phenotype, such as insect resistance.
  • Such regeneration techniques rely on the manipulation of certain phytohormones in tissue culture growth media, typically containing a biocidal and / or herbicidal marker, which must be introduced together with the nucleotide sequence. desired.
  • Plant regeneration from protoplast culture is described in Evans et al (Evans, DE, and Bravo, JE, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, Vol. 1, 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York 1983); and Binding 1985 (Binding, H., Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985) (as mentioned in US20020152501).
  • Regeneration can also be achieved through plant calli, explants, organs, or part thereof. Such regeneration techniques are generally described in Klee et al (Klee, H., Horsch, R., Rogers, S., Agrobacterium-mediated plant transformation and its further applications to plant biology. Ann. Ver. Of Plant Phys. 38: 467-486, 1987 (as mentioned in US20020152501).
  • a gene encoding a pesticidal protein of the invention may be introduced via a viable vector into a microbial host, and said host may be inserted into plants or animals.
  • the term "introduced” in the context of inserting a nucleic acid into a cell means “transfection” or “transformation” or “transduction” and includes the incorporation of a nucleic acid into a prokaryotic or eukaryotic cell where the nucleic acid may be incorporated. within the cell genome (eg, chromosome, plasmid, plastid, or mitochondrial DNA), converted into an autonomous replicon, or transiently expressed (eg, transfected mRNA).
  • microorganism is defined herein as microbes that have functional organelles within their capsules or cells such as bacteria, protozoa, unicellular fungi, and unicellular algae.
  • expression vectors may be constructed containing the nucleotide sequence of interest operably linked to regulatory transcriptional and translational signals for expression of the nucleotide sequence.
  • an internal homologous nucleotide sequence in the organism is With the sequence in the binary vector, there may be a recombination between them and the gene encoding the pesticidal protein will integrate into the host organism's genome stably.
  • Viable host cells where cells containing the insecticidal protein will be treated to prolong the activity of the insecticidal protein in the cell when the treated cell is applied to the target pest environment, may include prokaryotes or eukaryotes, usually being limited to those cells that do not produce substances. toxic to higher organisms. However, organisms that produce toxic substances in higher organisms may be used where the toxin is unstable or the level of application sufficiently low to avoid any possibility of mammalian host toxicity. Particularly the hosts are less developed prokaryotes and eukaryotes such as fungi.
  • prokaryotes both gram negative and gram positive, include, but are not limited to Enterobacteriaceae, such as Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, and Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, such as Rhizobium; Spirillaceae, such as Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, such as Pseudomonas and Acetobacter; Azotobacteraceae and Nitrobacteraceae.
  • Enterobacteriaceae such as Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, and Proteus
  • Bacillaceae Rhizobiceae, such as Rhizobium
  • Spirillaceae such as Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio
  • fungi such as Phycomycetes and Ascomycetes which include yeast such as Saccharomyces and Schizosaccharomyces; and Basidiomycetes, such as Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, and the like.
  • Host organisms of particular interest include yeast such as Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., And Sporobolomyces spp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and the like.
  • Embodiments of the present invention may be effective against a variety of pests.
  • pests include, but are not limited to, insects, fungi, bacteria, nematodes, mites, protozoan pathogens, animal parasites, and the like.
  • Pests of particular interest are pest insects, particularly pest insects that cause significant damage to agricultural plants.
  • Pest insects means insects and other similar pests such as, for example, insects of the orders Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularly, Lepidoptera especially giant sugarcane borer, Telchin licus licus.
  • Pest insects of the present invention of most cultivars include, but are not limited to Corn: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis Howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucopterus, Agranus pluropsis, Anuraphis maculis pluridopsis urticae; Sorghum: Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia subterra
  • Tetranychus cinnabarinus Tetranychus urticae
  • Wheat Pseudalet ⁇ a unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata.
  • Thrips tabaci Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Barley: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola: Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, and Meligethes viridescens; Potato, Leptinotarsa decemlineata and Beans: Zabrotes subfasciatus; Calossobruchus spp., Acant
  • Example 1 Generation of mutant genes, analogous to the native cry1 la12 gene, highly effective in controlling T. I. licus by DNA shuffling technique.
  • cry1 la12 gene library analogous to the cry1 la12 gene is an important biotechnological strategy, contributing significantly to plant breeding programs via genetic transformation for transgenic generation.
  • This technology provides a variety of new molecules with potential use in plant transformation for target insect control as well as improved insecticidal activity of new proteins encoded by recombinant genes.
  • the wild cry1la 2 gene (SEQ ID NO 1) was reamplified by PCR with oligonucleotides specific for the gene sequence in question, which contain the site for the restriction enzyme Sfi I (Cry1 laShuffFOR_SfiExtr_AP: 5'GAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTG TCAGGATCCTGTTTGAAAATGTCTGAG3 'and Cry1 laShuffREV_SfiExtr_AP: 5' CGAGGGGGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGATC
  • Sfi I Cry1 laShuffFOR_SfiExtr_AP: 5'GAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTG TCAGGATCCTGTTTGAAAATG
  • Amplification was performed in a thermal cycler (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) under the following conditions: 95 ° C for 2 minutes; 35 cycles: 45 seconds at 95 ° C (denaturation), 45 seconds at 60 ° C (oligonucleotide annealing) and 2 minutes at 72 ° C (DNA polymerase extension) and a final extension of 5 minutes at 72 ° C.
  • An aliquot of PCR products (approximately 2000 bp product) was analyzed on 1% agarose gel and the remainder was purified using the QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN). Following the protocol of the DNA shuffling technique (Stemmer, WPC (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature.
  • cry1 la12 gene fragments were used in a 25 pL final volume PCR reaction without the addition of primer oligonucleotides, 400 ⁇ dNTPs, 1 mM MgSO4, 5X buffer for TaqPlatinum DNA Polymerase High Fidelity ( Invitrogen®), 2.5 U Taq Platinum DNA High Fidelity Polymerase (Invitrogen®) and 1.5 pg DNA of cry1 la12 gene fragments.
  • the reaction was performed in a thermal cycler (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) under the following conditions: 95 ° C for 2 minutes; 44 cycles: 95 ° C for 1 minute (denaturation), 42 ° C for 1 minute (annealing) and 72 ° C for 1 minute (with a 5 second increase in extension time per cycle) and a final extension of 7 minutes at 72 ° C.
  • This first reaction of the DNA scrambling technique generated a number of fragments of varying sizes.
  • This new product was then used in the second PCR reaction (50 pL) as a template under the following conditions: one and a half microliters of the first reaction product, 1X Taq Platinum DNA Polymerase Buffer High Fidelity 1X, 0.2 mM dNTPs, 0 , 8 ⁇ espec ⁇ ficos of the Shuff2FOR_SfiExtr_AP specific oligonucleotides (5 'CGAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTGTCAGGATCC 3') and Shuff2REV_SfiExtr_AP (5 'CGAGGCCGGCCCCGACGGGGT1T1T1105Hg2 DNA2Thase2) Cenbiot®).
  • the amplification reaction was performed in a thermocycler (MastercyclerGradient - Eppendorf) under the following conditions: 95 ° C for 2 minutes, 10 cycles: 95 ° C for 30 seconds (denaturation); 42 ° C for 1 minute (fragment annealing) and 72 ° C for 1 minute (DNA polymerase extension), 14 cycles: 95 ° C for 1 minute, 42 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute (with an increase of 20 seconds per cycle), with a final extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the wild cry1 la12 gene submitted to DNA shuffling technique generated a population of variant genes, either by introducing, deleting or replacing nucleotides ( Figure 1).
  • the new reconstructed genes analogous to the wild cry1 la12 gene, were cloned into the vector with the aid of the enzyme T4 DNA Ligase® (Invitrogen).
  • the vector was added and the cry genes were mixed in a 4: 1 ratio (vector.insert) with the addition of T4 DNA Ligase 1X enzyme buffer, T4 DNA Ligase 1 U enzyme and 20 mM ATP in a final volume of 25 pL at 15 ° C for 16 hours.
  • the ligation product (pCOMB3X + cry1 la12) was used to transform E. coli XL-1 Blue cells via electroporation.
  • Transformants were grown in LB medium containing 100 mg / ml ampicillin and indicated a titer of 106 cells for the cry1 la12 variant combinatorial gene library. A portion of these colonies were analyzed by colony PCRs and transgene-bearing colony DNAs were prepared and sequences determined using the primer oligonucleotides MMB4 (5 'GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT 3'), MMB5 (5 '
  • Example 2 Selection of variant Cry1 la12 toxins analogous to wild Cry1 la12 toxin by the Phage display technique.
  • the cry1 la12 gene library generated by DNA shuffling and fusion protein III of the filamentous phage M13 capsid (fusion phages) was then selected by the Phage Display (Barbas III, CF) surface protein presentation technique. , Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ (2001) Selection from antibody libraries In: Phage display - A Laboratory Manual - USA: Cold Spring Laboratory, 10.1 - 10.20) using IT licus BBMVs (Francis, BR) , Maaty, WSA, Bulla Jr., LA (1998) Effects of Midgut-Protein-Preparative and Ligand Binding Procedures on the Toxin Binding Characteristics of BT-R1, the Common High-Affinity Receptor in Manduca Friday for Cry A Bacillus thuringiensis Toxins.
  • Cry1 la12 toxin-fused phages were deposited in wells of a microtiter plate previously sensitized with BBMVs (100 pg / pL) extracted from the intestinal membrane of the giant cane borer larvae. - sugar.
  • BBMVs 100 pg / pL
  • the wells are washed with PBS-Tween solution (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 12 mM Na 2 HPO 4, 1.2 mM KH 2 PO 4 and 0.05% Tween 20®) and the specific phages eluted at low pH, are used to transfect new E. coli cells.
  • Amplified phage particles are used in the successive selection cycle.
  • the procedure involved five wash, elution and amplification cycles. Titration of the colonies collected in each cycle is done by plating colonies at serial dilutions in 100 pg / mL carbenicillin-containing SBagar medium. Colonies isolated from the amount of specific phages eluted in the fourth selection cycle (indicated as the specific phage enrichment cycle) ) were amplified with end-specific oligonucleotides of the pCOMB3X phagemid vector to which cry1 la12 genes are linked. Five colonies showing PCR amplification and containing approximately 2000 bp (original gene size) were selected for expression in E. coli.
  • Example 3 Expression of wild and variant genes in E. coli XL-1 Blue.
  • Wild cry1 la12 genes and variants selected by Phage display and expected insert size (approximately 2000 bp), indicated by colony PCRs, were used for expression in E. coli following IPTG induction (Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ (2001) Analysis of Antibody Fragment-expressing Clones in ELISA In: Phage display - A Laboratory Manual - USA: Cold Spring Laboratory, 11.9 - 11.12). The selected colonies were inoculated into SB medium containing carbenicillin [100 mg / mL] and incubated at 37 ° C with shaking at 200 rpm until achieve OD 600nm 0.5.
  • Example 4 Selective bioassays against giant sugarcane borer for determination of entomotoxic activity of analogous ⁇ -endotoxin Cry1 la12.
  • TI licus adult females were collected in the field and housed in cages with the bottom to allow the separation of the eggs laid. After 24 hours, the eggs were collected and kept in an inset chamber (type BOD) at 28 ⁇ 1 ° C and 70 ⁇ 10% relative humidity. Eight-day-old eggs were individualized in 96-well plates, thus allowing larvae to hatch in separate reservoirs. The larvae, after hatching, were kept on a spongy substrate, which was moistened with a liquid diet, modified from the diet already established by HENSLEY and HAMMOND (1968) for the creation of Diatraea saccharalis.
  • the larvae that were able to feed from the diet changed their color and were then transferred to a new plate containing a new diet, remaining in it until its use in the bioassays for a maximum of 7 days. Due to the cannibalism characteristic of IT licus larvae. 96-well microtiter plates were used so that the larvae were individualized. Each well of the experiment contained a sponge (80% viscose, 20% polyester), approximately 1 cm2, previously soaked in liquid diet suspension, with 3.5 pg / mL of the original Cry1 la12 toxins (SEQ ID NO 7). and variants I, II, III, IV and V (SEQ ID NOs 8-12) expressed in bacteria. The control treatment was performed with diet without any bacteria.
  • cry1 LA12 analogous genes selected by colony PCRs were subjected to sequencing reactions under the following conditions: 500 ng of plasmid DNA containing the analogs and 3 ⁇ specific oligonucleotides (VarPhaDispJnt_FOR (5 'CTTTAGCATTATTGTGTTCC 3'), VarPhaDisp_lnt_REV (5 'CGCATACCCGTACGACGTTCC 3 '), VarPhaDisp_lnt_FOR_2 (5' G AAATC GTAATAAC AC AAG GG 3 ') and VarPhaDisp_lnt_REV_2 (5' CCAGCACCATCACCATCACC 3 ')), in an ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer automated sequencer (Applied Bios).
  • cry1 la12 gene variants I, II, III, IV and V - SEQ ID NO 2-6, respectively.
  • the new molecules generated by the cry1 la12 gene recombination showed differences from 0.15 to 1.24% of modified amino acid residues.
  • sequence analysis and classification as wild cry1 la12 gene analogs these molecules were grouped by nucleotide sequence similarity. Even though there were nucleotide mutations in the generated sequences, few meant amino acid residue modifications (up to 1.08%) (Table 1).
  • Cry1 la12 molecules Two new Cry1 la12 molecules, variant II (SEQ ID NO 8) and variant V (SEQ ID NO 1 1), were approximately 3 times more active than the wild-type molecule (Cry1 la12 - SEQ ID NO 1) exhibiting a mortality of 55 , 5 and 75% of neonate larvae fed diet containing 3 pg protein per milliliter of liquid diet.
  • the models of Cry1 la12 and their analogs showed the same structural framework, with differences observed only in the side chains of amino acids substituted in the analog.
  • the wild and analogous structures Cry1 la12 have the three conserved functional domains (I, II, and III) typical of Cry toxins.

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Abstract

A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando métodos e composições que compreendem análogos mutantes de δ-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cry1la12 com toxicidade melhorada para tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar δ- endotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura. São também aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de ácido nucleico, codificantes para Cry1la12 modificado, métodos para a expressão heteróloga das novas moléculas na forma ativa, bem como o uso das mesmas no controle de insetos-praga. A invenção também fornece genes análogos sintéticos os quais são otimizados para transformação e expressão dos mesmos em plantas.

Description

00609
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Relatório de Patente de Invenção: "MOLÉCULAS VARIANTES SINTÉTICAS DE TOXINAS CRY1 IA12 COM PROPRIEDADES DE CONTROLAR INSETOS-PRAGA, COMPOSIÇÕES CONTENDO TAIS MUTANTES E MÉTODO DE UTILIZAÇÃO DOS MESMOS".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando métodos e composições que compreendem análogos mutantes de δ-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cry1 la12 com toxicidade melhorada para tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar δ- endotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura.
São também aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de ácido nucleico, codificantes para Cry1 la12 modificado, métodos para a expressão heteróloga das novas moléculas na forma ativa, bem como o uso das mesmas no controle de insetos-praga. A invenção também fornece genes análogos sintéticos os quais são otimizados para transformação e expressão dos mesmos em plantas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A importância da cultura da cana-de-açúcar vem aumentando ao longo dos anos, uma vez que, além de ser utilizada para a produção de açúcar, alimentação animal, energia e fertilizantes, também se apresenta como uma fonte para a produção de combustíveis renováveis, possuindo rápido crescimento e alta produção de energia por hectare (Hartemink, AE (2008) Sugarcane for Bioethanol: Soil and Environmental Issues. Advances in Agronomy. 99: 125-182). Para produzir biomassa em atendimento à necessidade energética da humanidade sem competir com a produção de alimentos, deve-se priorizar a produção de plantas fibrosas em vez de amiláceas e oleaginosas (Sticklen, MB (2008) Plant genetic engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol. Nature Reviews. 9: 433-443). Nesse contexto, plantas fibrosas, como a cultura da cana-de- açúcar, apresentam vantagens, como (i) plantas de alta eficiência energética, (ii) crescimento perene e dossel de longa duração para permitir a colheita durante a maior parte do ano, (iii) possibilidade de aplicação de tecnologia agrícola de produção em grande escala, (iv) serem de fácil e eficiente transformação em formas utilizáveis de energia e (v) de possuírem exploração sustentável económica e ambientalmente (Matsuoka, S, Bressiani, J, Maccheroni, W, Fouto, I (2010) Bioenergia da Cana. In: Cana- de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool - tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.), 487-517, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).
Neste sentido o Brasil ocupa posição destacada na produção mundial de etanol a partir da cana-de-açúcar. De acordo com a Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB 2011 , http://www.conab.gov.br/OlalaCMS/uploads/arquivos/11_01_06_09_14 _50_boletim_cana_3o_lev_safra_2010_201 L.pdf, acessado em Fevereiro/2012), a previsão do total de cana-de-açúcar a ser moída na safra 2011/2012 é de 571 ,5 milhões de toneladas em uma área total de aproximadamente oito milhões de hectares. Destes, 47,3% serão destinados à produção de açúcar enquanto que 52,7% à produção de etanol, o que permitirá produzir 22,8 bilhões de litros de álcool. Esses valores colocam o Brasil em primeiro lugar entre os maiores produtores de cana-de-açúcar, seguido por índia, Tailândia e China (USDA (2010) Sugar: World Production, Supply and Distribution). Os principais fatores que permitiram ao país chegar a esse patamar foram a disponibilidade de terras agricultáveis, um custo total de produção reduzido, a larga experiência nacional, a grande demanda por açúcar e o aumento da necessidade de utilização de fontes de energias limpas e renováveis (Goldemberg, J (2007) Ethanol for a Sustainable Energy Future. Science. 315: 808-810). Para aumentar a competitividade do etanol brasileiro no mercado internacional, serão necessários maiores investimentos em infraestrutura, construção de dutos para diminuir custos de transporte, formação de estoques reguladores e aumento no rendimento das plantas (BNDES (2008) Bioetanol de cana-de-açúcar: energia para o desenvolvimento sustentável, 316, Rio de Janeiro-RJ). Os fatores abióticos, como os estresses hídrico e salino, e fatores abióticos, como vírus, fungos, nematóides e insetos-praga, sendo esse último de destacada importância, interferem no rendimento das plantas.
Neste contexto, aproximadamente 85 espécies de insetos estão identificadas como causadoras de danos a lavoura canavieira no Brasil, diminuindo a sua produtividade e/ou a qualidade do produto. Dentre estas, algumas são consideradas pragas importantes, em alguns casos com abrangência nacional e em outros, regional (Macedo, N, Macedo, D, Campos, MBS, Novaretti, WRT, Ferraz, LCCB (2010) Manejo de Pragas e Nematóides. In: Cana-de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool - tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.) 1 9-159, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).
No cenário brasileiro, um dos principais insetos-praga causadores de danos é a broca gigante da cana-de-açúcar, Telchin licus licus (Drury 1773; Lepidoptera: Castniidae), um inseto lepidóptero que, no final da fase larval, atinge até 90 mm, apresentando controle bastante difícil devido a inacessibilidade às lagartas que ficam no interior do colmo. As lagartas, quando atacam as plantas de cana-de-açúcar novas, causam os conhecidos "corações-mortos": Em plantas adultas, ocorre perda de peso, brotação lateral, quebra e atrofiamento de entrenós. A penetração de fungos (Fusarium moniliforme e/ou Colletotrichum falcatum) nas galerias abertas pelas brocas, muito comum após o ataque das lagartas, ocasiona, por sua vez, a podridão vermelha, que determina a inversão da sacarose, diminuição da pureza do caldo, aumento de gomas e contaminantes, reduzindo o rendimento industrial da cana-de-açúcar (Planalsucar (1977) Guia das principais pragas da cana-de-açúcar no Brasil, Piracicaba-SP).
A broca gigante da cana-de-açúcar predomina na região Nordeste, especialmente nos estados de Alagoas, Pernambuco, Paraíba e Rio Grande do Norte (Mendonça, AF, Viveiros, AJA, Sampaio, FF (1996) A broca gigante da cana-de-açúcar, Castnia licus Drury, 1770 (Lep. Castniidae). Pragas da cana-de-açúcar, 133-167, Insetos, Cia. Maceió). Este inseto-praga causa, anualmente, prejuízos na ordem de 35 milhões na região Nordeste e, projeta-se, até 400 milhões de reais, por safra, na região Sudeste (Almeida, LC, Dias Filho, MM, Arrigoni, EB (2007) First ocurrence of Telchin licus (Drury, 1773), the "giant sugarcane borer" in the state of São Paulo, Brazil. Revista de Agricultura (Piracicaba). 82: 223-225). Estes dados são alarmantes e requerem medidas para evitar uma perda de competitividade do setor sucroalcooleiro nacional. E uma medida preventiva, seria tornar a cana-de-açúcar resistente a insetos-praga, através de transformação genética com genes de interesse ou por melhoramento genético clássico. A modificação genética da cana-de-açúcar pode ser uma ferramenta poderosa por introduzir características como resistência a patógenos e a doenças em variedades comerciais de cana-de-açúcar, aumentar seu desempenho agronómico e obtenção de açúcar (Borém, A, Silva, JÁ, Diola, V (2010) Biologia Molecular e Biotecnologia. In: Cana-de-açúcar: bioenergia, açúcar e álcool - tecnologias e perspectivas. Santos, F, Borém, A, Caldas, C (eds.) 333-353, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG).
Diante do exposto neste documento, a presente invenção tem como objetívo tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de- açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica, δ-endotoxinas originais e melhoradas por processos biotecnológicos, sanando e/ou minimizando o problema do uso abusivo de inseticidas químicos e suas consequências. As toxinas Cry são descritas como candidatas no controle de insetos-praga (Carlini, CR, Grossi- de-Sa, MF (2002) Plant toxic proteins with insecticidal properties. A review on their potentialities as bioinsecticides. Toxicon. 40: 1515-1539; Christou, P, Capell, T, Kohli, A, Gatehouse, JA, Gatehouse, AMR (2006) Recent developments and future prospects in insect pest control in transgenic crops. TRENDS in Plant Science. 1 , 302-308). São amplamente descritas na literatura (Hõfte, H, Whiteley, HR (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological Reviews. 53: 242-255; Schnepf, HE, Crickmore, N, Van Rie, J, Lereclus, D, Baum, JR, Feitelson, J, Zeigler, DR, Dean, DH (1998) Bacillus íhuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62: 775-806; Bravo, A, Soberon, M (2008) How to cope with resistance to Bt toxins? TRENDS in Biotechnology. 26: 573-579) e especialmente interessantes devido à sua especificidade e por serem inócuas a vertebrados e insetos não alvos. O efeito de culturas Bt em macroorganismos tem sido estudado em experimentos de laboratório e de campo, indicando que as toxinas Cry não são tóxicas a esses organismos (Liu, B, Wang, L, Zeng, Q, Meng, J, Hu, WJ, Li, XG, Zhou, KX, Xu, K, Liu, DD, Zheng, YP (2009) Assessing effects of transgenic CrylAc cotton on the earthworm Eisenia fétida. Soil Biology & Biochemistry. 41 : 1841-1846; Bai, YY, Yan, RH, Ye, GY, Huang, FN, Cheng, JA (2010) Effects of transgenic rice expressing Bacillus thuringiensis CrylAb protein on ground-dwelling collembolan community in postharvest seasons. Environmental Entomology. 39: 243-251).
Paralelamente, à importância agronómica da cultura da cana-de-açúcar e dos insetos-praga, tais como a broca gigante da cana-de-açúcar, avanços nas técnicas de biologia molecular e nas técnicas aplicadas na área de biotecnologia permitiram que a recombinação gênica fosse empregada em experimentos de evolução molecular in vitro para o desenvolvimento de novas sequências de DNA e moléculas de proteínas (Peng, W, Levine, H, Hwa, T, Kessler, DA (2004) Analytical study of the effect of recombination on evolution via DNA shuffling. Physical Review E. 69: 051911). E dentre as técnicas, o embaralhamento de DNA tem sido utilizado para diversos fins, com objetivo de se obter moléculas com características desejadas, como a melhoria da cinética enzimática, geração de novas especificidades para determinados substratos, formação de novos produtos ou modificação de enzimas para desempenho ótimo em ambientes específicos (Lassner, M, Bedbrook, J (2001) Directed molecular evolution in plant improvement. Current Opinion in Plant Biology. 4: 152-156).
A técnica de Embaralhamento de ADN consiste em uma evolução molecular dirigida, a qual gera mudanças pontuais na estrutura primária das moléculas de ADN por meio de mutações randômicas (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005; Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro By Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391 , 1994, US5605793, US5811238, US5830721). Os genes de interesse são primeiramente fragmentados de forma aleatória em pequenas sequências de 50-300 pares de base, sendo este produto recombinado em uma reação de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia), a qual é conduzida sem adição de oligonucleotídeos. Em uma segunda reação consecutiva, são adicionados os produtos da primeira reação e oligonucleotídeos específicos. Permitindo, desta forma, a amplificação de uma população de genes análogos mutantes/ variantes (Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro by Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391 , 1994; Zhao, H. and Arnold, F.H. Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., Vol. 94, p. 7997 - 8000, 1997).
A eficiência da técnica para produzir moléculas análogas de maior atividade biológica pôde ser comprovada em diversos trabalhos como, por exemplo, em Jager et al (Jager, S. A. W., Jekel, P. A. and Janssen, D. B. Hybrid penicillin acylases with improved properties for synthesis of β-lactam antibiotics. Enzyme And Microbial Technology, Vol. 40, p. 1335 - 1344, 2007), onde a atividade enzimática da penicilina aciclase aumentou em 90%. A técnica pode utilizar um único ou mais genes homólogos e seu sucesso dependente de um delicado arranjo entre o tamanho da biblioteca, a diversidade biológica originada e de uma metodologia de seleção das variantes com a característica desejada (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005).
Um exemplo de sucesso na aplicação dessa técnica inclui a toxicidade adquirida da toxina quimérica Cry1 Ba/Cry1 Db contra Epiphyas postvittana (Knight, JS, Broadwell, AH, Grant, WN, Shoemaker, CB (2004) A Strategy for Shuffling Numerous Bacillus thuringiensis Crystal Protein Domains. Journal of Economic Entomology. 97: 1805-1813). Em outro estudo, uma variação da técnica de DNA shufliing resultou no SPOP ("Shuffled Proteins on Phages") que consiste de ciclos consecutivos de embaralhamento de DNA, seguido de Phage display e seleção funcional (Stoop, AA, Jespers, L, Eldering, E, Pannekoek, H (2000) High-density mutagenesis by combined DNA shuffling and Phage display to assign essencial amino acid residues in protein-protein interactions: application to study structure-function of plasminogen activation inhibitor 1 (PAI-I). Journal of Molecular Biology. 301 : 1 135-1 147).
A técnica de Phage display envolve a expressão de proteínas ou peptídeos na superfície de fagos filamentosos, sendo apresentadas como um produto de fusão a uma das proteínas da capa protéica de um bacteriófago (Willats, WGT (2002) Phage display: practilities and prospects. Plant Molecular Biology. 50: 837-854).
Essa técnica constitui uma das opções para a seleção de proteínas ou peptídeos recombinantes, apresentando êxito para selecionar peptídeos ou proteínas com propriedades específicas de ligação (Smith, GP (1985) Filamentous fusion phage-novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228: 1315-1317) e alterar a afinidade de proteínas por seus ligantes (Neri, D, Petrul, H, Roncucci, G (1995) Engineering recombinant antibodies for immunotherapy. Celi Biophysics. 27: 47-61 ). Vários tipos de fagos já foram utilizados na seleção de proteínas Cry: a toxina CrylAc foi fusionada na proteína D do capsídeo do fago lambda, (Fernández, LE, Gómez, I, Pacheco, S, Arenas, I, Gill, SS, Bravo, A, Soberon, M (2008) Employing phage display to study the mode of action of Bacillus thuringiensis Cry toxins. Peptides. 29: 324-329).
Diante isso, a presente invenção tem como objetivo solucionar o problema do uso abusivo de inseticidas químicos, bem como aumentar a resistência de plantas, gerando plantas transgênicas, as quais sejam capazes de expressar genes que codificam para moléculas com alta atividade para análogos mutantes de δ-endotoxinas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo de controle de insetos-praga, utilizando métodos e composições que compreendem análogos mutantes de δ-endotoxinas. Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo disponibilizar moléculas novas a partir do gene Cry1 la12 com i toxicidade melhorada para tornar as plantas de cana-de-açúcar resistentes à broca gigante da cana-de-açúcar, gerando plantas transgênicas, capazes de expressar toxinas com elevada atividade entomotóxica; disponibilizar δ- endotoxinas melhoradas por processos biotecnológicos; auxiliar para a redução das doses de aplicação de defensivos químicos com redução de i custos sociais e ambientais e aumento da produtividade da cultura.
Uma concretização da presente invenção diz respeito a moléculas de ácido nucleico variantes sintéticas de toxinas Cry1 la12 caracterizadas por compreender:
a) sequências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
b) complementos das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
c) complementos reversos das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
d) sequências reversas das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.
Uma segunda concretização da presente invenção diz respeito a uma construção gênica contendo a molécula isolada de ácido nucleico.
Uma terceira concretização da presente invenção diz respeito a um vetor binário caracterizado por conter uma construção gênica. Mais especificamente a presente invenção diz respeito a um vetor binário caracterizado por compreender:
a. um promotor opcionalmente ligado a uma sequência líder e operacionalmente ligado a
b. sequência selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a c. um sinal de terminação;
d. uma origem de replicação;
e. um marcador seletivo; e
f. um sítio de clonagem.
Uma quarta concretização da presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados, caracterizados por compreender sequências substancialmente similares a qualquer uma das sequências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 7-12.
Uma quinta concretização da presente invenção diz respeito a uma célula transformada caracterizada pelo fato de conter uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.
Uma sexta concretização da presente invenção diz respeito a uma planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progénie da mesma caracterizada por compreender uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.
Uma sétima concretização da presente invenção diz respeito a um microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção; ou um polipeptídeo da presente invenção.
Uma oitava concretização da presente invenção diz respeito a um método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção gênica ou um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;
b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção.
Uma nona concretização da presente invenção diz respeito a um método para produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;
b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;
c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;
e. Fazer a extração da proteína recombinante produzida nos organismos selecionados na etapa (d).
Uma décima concretização da presente invenção diz respeito a uma proteína recombinante obtida através do método descrito na presente invenção.
Uma décima primeira concretização da presente invenção diz respeito a uma composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.
Uma décima segunda concretização da presente invenção diz respeito a um método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente; b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das sequências selecionadas do grupo de sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID N° 7-12.
Uma décima terceira concretização da presente invenção diz respeito a um método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica ou um vetor vetor binário contendo as moléculas de ácido nucleico da presente invenção;
b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas;
c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δ-endotoxina da invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Eletroforese em gel de agarose 0,8%, mostrando o produto da reação do DNA shuffling para os genes crylAa e cry1 la12. (A) Marcador de pesos moleculares - 1 Kb Plus Ladder, (B) controle positivo, (C) população de genes cryl Ia12 recombinados após o DNA shuffling.
Figura 2. Análise de mortalidade das larvas de T. I. licus causadas pelas variantes da toxina Cry1 la 2 em bioensaios utilizando dieta artificial. Controle negativo, somente dieta líquida artificial, Cry1 la12 selvagem, proteína original expressa em E. coli, Variantes I, II, III, IV e V, variantes da toxina Cry la 2 expressas em E. coli. Médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan no nível de 5% de significância.
Figuras 3a e 3b. Alinhamento das sequências de resíduos de aminoácidos da toxina Cry1 la12 selvagem e suas variantes geradas por embaralhamento de DNA (DNA shuffling), onde foram indicadas as alterações dos resíduos comparando-se com a toxina selvagem.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção descreve novas moléculas de δ-endotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração de tecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse económico. Mais especificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos e variantes dos mesmos, compreendem sequências nucleotídicas selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6, as quais codificam proteínas δ-endotoxinas substancialmente similares às sequências identificadas como SEQ ID Nos 7- 11. As proteínas δ-endotoxinas descritas são preferencialmente biologicamente ativas contra o inseto-praga pertencente à ordem Lepdóptera: a broca gigante da cana-de-açúcar (Telchin licus licus).
A invenção envolve uma estratégia para auxiliar no controle da praga, envolvendo as etapas de produção e seleção de genes novos para serem inseridos em plantas via transgenia, a fim de torná-las resistente a praga alvo. A produção envolve a recombinação e geração de novas moléculas e diz respeito ao produto da aplicação da técnica de DNA shuffling. A seleção diz respeito à aplicação da técnica de Phage display - resulta em escolha de genes de acordo com uma característica desejada. As técnicas utilizadas para produção e seleção de genes novos já estão bem descritas no estado da técnica.
Além das sequências nucleotídicas, a presente invenção também descreve uma construção gênica e um vetor binário compreendendo as sequências gênicas codificadoras de proteínas com alta atividade δ-endotoxinas. O vetor binário é ainda caracterizado por compreender:
a. um promotor opcionalmente ligado a uma sequência líder e operacionalmente ligado a
b. sequência selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 1 , SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a;
c. um sinal de terminação;
d. uma origem de replicação;
e. um marcador seletivo; e f. um sítio de clonagem
A presente invenção provê ainda uma célula, planta, microorganismos contendo as moléculas de ácido nucleico e/ou peptídeo da presente invenção.
A presente invenção provê novas técnicas, as quais não dependem do uso dos pesticidas químicos sintéticos tradicionais. A invenção diz respeito a pesticidas biodegradáveis ocorrendo naturalmente e genes codificando os mesmos.
A invenção provê a criação de variantes sintéticas da toxina Cry la12 (SEQ ID N° 1), isolados de Bacillus thuringiensis.
A invenção diz respeito também a um método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;
b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;
c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção.
A presente invenção diz respeito ainda a um método para produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;
b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes; c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção;
e. Fazer a extração da proteína recombinante produzida nos organismos selecionados na etapa (d).
A presente invenção diz respeito também a uma composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado da presente invenção ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.
A invenção diz respeito a um método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente;
b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das sequências selecionadas do grupo de sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID N° 7-12.
A invenção diz respeito também a um método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica ou um vetor binário contendo as moléculas de ácio nucleico da presente invenção; b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas;
c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de entomotoxicidade da δ-endotoxina.
A construção de bibliotecas de genes análogos variantes, utilizando técnicas de evolução molecular in vitro, tem sido empregada nas últimas três décadas. Esse fato se deve ao surgimento de ferramentas biotecnológicas, as quais servem como plataforma de engenharia genética no desenvolvimento de novas moléculas com atividade melhorada, visando principalmente à agricultura e a indústria farmacêutica (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Review. Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005). Várias técnicas, incluindo modificações químicas, PCR induzido ao erro e mutagênese sítio dirigida podem ser aplicadas para gerar mutações em uma sequência gênica (Neylon, C. Chemical and biochemicai strategies fot the randomization of protein encoding DNA sequences: library construction methods for directed evolution. Nucleic Acids Research, vol. 32, N. 4, PP. 1448-1459, 2004). Preferencialmente na presente invenção destaca-se a técnica de Embaralhamento de ADN (Rosic, N. N., Huang, W., Johnston, W. A., James J. Devoss, J. J., Gillam, E. M. J. Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by ADN family shuffling. Gene, Vol. 35762, No of Pages 9, 2007; Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005; Abécassis, V., Pompon, D. and Truan, G. High efficiency family shuffling based on multi-step PCR and in vivo ADN recombination in yeast: statistical analysis of a combinatorial library between human cytochrome P450 1A1 and 1A2. Nucleic Acids Research, Vol. 28, No. 20: E 88, 2000; Zhao, H. and Arnold, F.H. Functional and nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., Vol. 94, p. 7997 - 8000, 1997; Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro By Embaralhamento de ADN. Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391 , 1994). A estratégia de Embaralhamento de ADN aplicada na presente invenção apresenta a vantagem de gerar ao mesmo tempo grande diversidade em mutantes contendo mutações produzidas aleatoriamente.
Na presente invenção, foi identificado e clonado um novo gene pertencente à família cryl l, com alta toxicidade a insetos lepidópteros, especificamente a broca gigante da cana-de-açúcar. Os códons desta sequência foram otimizados para sua expressão em plantas, especificamente, para plantas monocotiledôneas. Além disso, foi construída uma biblioteca combinatória, através da técnica de embaralhamento de DNA, com o intuito de desenvolver genes análogos mutantes, os quais também codificam para a proteína da família Cry l. Os genes análogos mutantes gerados possuem potencial efeito no controle da broca gigante da cana-de-açúcar.
Para obtenção de genes cry análogos, com alta entomotoxicidade para a broca gigante da cana-de-açúcar, foi utilizado o gene cry1 la12 (SEQ ID NO 1) isolado da cepa S811 de B. thuringiensis. Este gene foi utilizado como substrato no processo de originar genes variantes pela técnica de embaralhamento de DNA. Os variantes foram selecionados quanto à capacidade de se ligarem a receptores presentes na membrana do intestino médio broca gigante da cana-de-açúcar (BBMVs), pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display. Para a seleção dos variantes do gene cry1 la 2 da presente invenção utilizamos a técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display.
Ao final, a toxina nativa Cry1 la12 e seus análogos mutantes tiveram seus efeitos entomotóxicos avaliados in vitro, por meio de bioensaios seletivos. Para isso, os genes análogos selecionados foram clonados em vetores de expressão heteróloga (E. coli) e as toxinas recombinantes geradas utilizadas em bioensaios contra larvas da broca gigante da cana-de-açúcar.
A invenção descreve novas entomotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração de tecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse económico. Mais especificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos e variantes dos genes cry em questão, compreendem sequências nucleotídicas, as quais codificam proteínas (polipeptídeos) entomotóxicas.
Na descrição que segue, um número de termos são utilizados extensivamente. As seguintes definições são providas para facilitar o entendimento da invenção.
O termo "molécula isolada de ácido nucleico" é utilizado para se referenciar aos ácidos nucleicos da presente invenção. Este termo, quando aplicado para o DNA da presente invenção, refere-se à molécula de DNA que é originada do gene cry1 la12. Por exemplo, a "molécula isolada de ácido nucleico" pode estar inserida em um vetor, tal como um plasmídeo ou um vetor de vírus, ou integrado dentro de um DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Uma "molécula isolada de ácido nucleico" pode compreender também uma molécula de cDNA. Uma molécula isolada de ácido nucleico inserida em um vetor é também referida às vezes aqui como molécula de ácido nucleico recombinante. O termo "molécula isolada de ácido nucleico" também poderá ser aplicado à moléculas de RNA transcritas de uma molécula de DNA conforme descrita acima.
A definição dos termos "complemento", "complemento reverso" e "sequência reversa" como usados aqui é ilustrada pelo seguinte exemplo: para a sequência 5'AGTGAAGT3', o complemento é 3TCACTTCA5', o complemento reverso é 3'ACTTCACT5' e a sequência reversa é 5TGAAGTGA3*.
Como usado aqui, o termo "variante" ou "substancialmente similar" ou ainda "análogo peptídico" ou "análogo mutante" compreende sequências de aminoácidos ou nucleotídeos diferentes de sequências especificamente identificadas, em que um ou mais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos é deletado, substituído ou adicionado e que pode ter sua atividade biológica alterada, auxiliada, aumentada ou diminuída quando comparada com a proteína parental nativa ou não-mutada. As variantes podem ser variantes alélicas, de ocorrência natural, ou variantes de ocorrência não natural. As sequências variantes ou substancialmente similares dizem respeito a fragmentos de ácidos nucleicos ou peptídeos que podem ser caracterizados pela porcentagem de identidade de suas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos com as sequências de nucleotídeo (SEQ ID Nos 2-6) ou de aminoácidos (SEQ ID Nos 8-12) descritas aqui, como determinada por algoritmos comuns empregados no estado da técnica. Os fragmentos de ácidos nucleicos ou peptídeos preferidos são aqueles cujas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos têm pelo menos cerca de 40 ou 45% de identidade de sequência, preferencialmente cerca de 50% ou 55% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 60% ou 65% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 70% ou 75% de identidade de sequência, mais preferencialmente cerca de 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferencialmente ainda com cerca de 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência quando comparada com a sequência de referência. A identidade percentual é determinada pelo alinhamento de duas sequências a serem comparadas, determinando o número de resíduos idênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos na sequência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feito através de ferramentas de domínio público, como BLASTN e BLASTP, disponíveis na página do Centro Nacional para Informação Biotecnológica/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). O alinhamento de sequência e o cálculo de porcentagem de identidade da presente invenção foram realizados conforme descrito com as sequências depositadas no Banco de Genes. O termo "análogos sintéticos" como citado nesta invenção diz respeito a modificação das sequencias nucleotídica dos variantes selecionados. Modificações em substituições de bases nucleotídicas apropriando ao códon preferencial de bases, próprio da planta utilizada na transformação genética. A nova sequencia é obtida por síntese química e as substituições nos nucleotídeos não representam alterações na sequencia traduzida de aminácidos.
"Sequência codificadora" refere-se à sequência de DNA que codifica uma proteína específica e exclui a sequência não codificadora. Uma "sequência codificadora interrompida" significa a sequência que atua como separadora (por exemplo, um ou mais íntrons ligados através de junções). Um "íntron" é uma sequência de nucleotídeo que é transcrita e está presente no pré mRNA, mas é removida através de clivagem e a re-ligação do mRNA dentro da célula gerando um mRNA maduro que pode ser traduzido em uma proteína. Exemplos de íntrons incluem, mas não são limitados a, íntron pdk2, íntron catalase da mamona, íntron Delta 12 desnaturase de algodão, Delta 12 desnaturase de Arabidopsis, íntron ubiquitina de milho, íntron de SV40, íntrons do gene da malato sintase. Uma "construção gênica" é um gene compreendendo um promotor e uma região codificadora de diferentes origens. No caso da presente invenção, a construção gênica compreende os polinucleotídeos da presente invenção ligados de forma associada ou isoladamente à regiões reguladoras da expressão, como promotores e sinais de terminação.
A obtenção de construções gênicas compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook, et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. ( 989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
O termo "vetor" diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qual outras sequências genéticas ou elementos (sejam eles de ADN ou RNA) podem ser ligados. Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente um dos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo "fagomídeo" diz respeito a um vetor que contém sequência para replicação em fago e em bactéria, este vetor tem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentes selecionadores e promotores. Um exemplo é o fagomídeo pComb3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, C. F. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181 , 2000),
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como característica fusionar a gene de interesse ao gene da proteína III, do bacteriófago filamentoso M13, localizada no capsídeo virai. O termo "vetor recombinante" é resultante da combinação de um vetor comercial com genes da presente invenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesse que por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns exemplos de vetores utilizados na presente invenção, mas não limitados, são os vetores pGEM-T easy (Promega Corporation), pCambia 2300 (Canberra, Austrália), pComb3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C; Steinberger, P.; Fuller, R., Barbas III, C. F. Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181 , 2000), pAHC17 e pAHC20 (Christensen, A. H. & Quail, P. H. Ubiquitin promoter- based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research, 5: 213- 218, 1996). A obtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos é conhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
Um "vetor binário" é um vetor derivado de plasmídios capazes de se replicar tanto em Escherichia coli quanto em Agrobacterium. Preferencialmente para a presente invenção foram utilizados os vetores binários: plPKb002 e plPKb003 (Himmelbach, A.; Zierold, U.; Hensel, G.; Riechen, J.; Douchkov, D.; Schweizer, P.; Kumlehn, J. A Set of Modular Binary Vectors for Transformation of Cereais. Breakthrough Technologies, 145: 1192-1200, 2000), além do vetor p7iU® (DNA Cloning Service e. K.). Um vetor de transformação de plantas baseado no sistema Agrobacterium do tipo binário deve conter uma origem de replicação apropriada e um gene de seleção em bactéria, geralmente resistência a um antibiótico. Além disso, é desejável que ele contenha uma região de múltiplos sítios de clonagem (contendo sequências de enzimas de restrição) entre as extremidades do T-DNA, para a inserção das sequencias gênicas desejadas, e uma região de transferência (ori I) e sítio de ativação para conjugação. Uma vez obtido o vetor binário com a sequência desejada do gene, operacionalmente ligado, ele deve ser transferido para Agrobacterium. Tais vetores podem ser obtidos comercialmente, incluindo Clontech Laboratories, Inc (Palo Alto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs (Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.) ou adquridos por doação pública (série pCambia, Canberra, Austrália). O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências regulatórias necessárias para expressão da sequência codificante são colocadas na molécula de ADN em posições apropriadas relativas à sequência codificante para efeito de sua expressão. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de sequências codificantes e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou "enhancers" e elementos de terminação) no vetor binário. Uma região codificante exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo ser microrganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucleico que pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5' da região codificante exógena.
O termo "operacionalmente ligado" significa que as sequências regulatórias necessárias para expressão da sequência codificante são colocadas na molécula de DNA em posições apropriadas relativas à sequência codificante para efeito de sua expressão. Essa mesma definição é às vezes aplicada para o arranjo de sequências codificantes e elementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou "enhancers" e elementos de terminação) no vetor binário. Uma região codificante exógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas que regulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo ser microorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada a uma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucleico que pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5' da região codificante exógena. A presente invenção não está limitada para o uso de qualquer promotor em particular e uma ampla variedade de promotores são conhecidos no estado da técnica. Os promotores podem ser, mas não estão limitados a, induzíveis, constitutivos e tecido-específicos. Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor constitutivo. Em outro aspecto da invenção, a atividade do promotor é estimulada por fatores externos ou internos tais como, mas não limitado a, hormônios, compostos químicos, impulsos mecânicos, e condições de estresse biótico ou abiótico. A atividade do promotor também pode ser regulada de maneira temporal e espacial (como por exemplo, promotores tecido-específicos e promotores regulados durante o desenvolvimento).
O promotor pode conter elementos "enhancers". Um "enhancer" é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. "Promotores constitutivos" referem-se àqueles que dirigem a expressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores "tecido-específicos" ou "desenvolvimento-específicos" são aqueles que dirigem a expressão gênica quase que exclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ou sementes, ou em estágios do desenvolvimento específicos em um tecido, como no início ou final da embriogênese.
Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Como usado aqui, o termo "promotor expresso em plantas" significa uma sequência de ADN que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal que seja capaz de direcionar a síntese do gene presente no T-ADN de Agrobaterium; promotores tecido- específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (WO8903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionado no pedido de patente US20030175783, An, Y. Q., Huang, S., McDowell, J. M., McKinney, E. C, Meagher, R. B., Conserved expression of the Arabidopsis ACT1 and ACT3 actin subclass in organ primordia and mature pollen. The Plant Celi 8, 15-30, 1996), promotores específicos de caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller, B., Sauer, N., Lamb, C. J., Glycine-rich cell wall proteins in bean: Gene structure and association of the protein with the vascular system. EMBO J. 7: 3625-3633, 1988), promotores específicos de folhas (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Hudspeth, R. L, Gruía, J. W., Structure and expression of the maize gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase involved in C4 photosynthesis. Plant Mol Biol 12:579-589, 1989), promotores específicos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller, B., Lamb, C. J., Specific expression of a novel cell wall hydroxyproline-rich glycoprotein gene in lateral root initiation. Genes Devei. 3:1639-1646, 1989), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keil, M., Sánchez- Serrano, J. J., Willmitzer, L, Both wound-inducible and tuber-spceific expression are mediated by the promoter of a single member of the potato proteinase inhibitor II gene family. EMBO J. 8: 1323:1330, 1989), promotores específicos de tecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman J., Saito, K., Cottyn, B., Engler, G., Seurinck, J., Van Montagu, M., Inze, D., Structure and expression analyses of the S- adenosylmethionine synthetase gene family in Arabidopsis thaliana. Gene 84: 359-369, 1989), promotores específicos de estames (WO89 0396, W092 3956), promotores específicos da zona de deiscência (W09713865); e semelhantes. Preferencialmente, o promotor da presente invenção é escolhido do grupo dos promotores, podendo ser, mas não estando limitado a Ubi1 (Zea mays) (Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Molecular Biology, 18: 675-689, Christensen, A. H. & Quail, P. H. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Research, 5: 213-218, 1996), Ubi9 (Saccharum officinarum) (Wei, H., Wang, M., Moore, P. H., Albert, H. H. Comparative expression analysis of two sugarcane polyubiquitin promoters and flanking sequences in transgenic plants. Journal of Plant Physiology, 160: 1241-1251 , 2003) e Act1 (Oryza sativa) (McElroy, D., Blowers, A. D., Jenes, B., Wu, R. Construction of expression vectors based on rice actin 1 (Act1) 5' region for use in monocot transformation. Molecular and General Genetics, 231 : 150-160, 1991). Como usado aqui, o termo "promotor expresso em bactérias" significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula bacteriana. Como usado aqui, o termo "promotor expresso em fungos" significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de fungo. Como usado aqui, o termo "promotor expresso em insetos" significa uma sequência de DNA que é capaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de inseto.
Uma "sequência líder" ou "sequência sinal" na presente invenção significa uma sequência de ácido nucleico que, quando operacionalmente ligada a uma molécula de ácido nucleico, permite a secreção do produto da molécula de ácido nucleico. A sequência líder está preferencialmente localizada na região 5' da molécula de ácido nucleico. Preferencialmente, a sequência líder é obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula de ácido nucleico, ou é obtida do gene onde a molécula de ácido nucleico é derivada. Preferencialmente a presente invenção utiliza a sequência sinal proveninente de uma cultivar de cana-de- açúcar.
O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invenção inclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans, e outros semelhantes. Conforme descrito anteriormente, a expressão "vetores binários" pode compreender um promotor induzível operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína inseticida da presente invenção. Promotores "induzíveis" podem dirigir a expressão de um polinucleotídeo com o qual eles estejam operacionalmente ligados, em um tecido ou estágio específico do desenvolvimento ou respondendo a condições ambientais. Em um dos aspectos da invenção, vetores de expressão compreendem um promotor induzível firmemente regulado operacionalmente ligado à uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida. Tal vetor binário pode adicionalmente compreender um gene marcador de seleção (por exemplo, um gene codificando uma proteína que confere resistência a antibiótico) operacionalmente ligado a um promotor constitutivo ou a um promotor induzível firmemente regulado. Dependendo da aplicação, ele pode beneficiar a expressão da sequência de ácido nucleico codificando uma proteína inseticida através de um promotor induzível de inseto-praga. Em um aspecto da presente invenção pode ser vantajoso utilizar promotores que são expressos localmente ou próximo do sítio de infecção da praga.
O termo "marcador seletivo" é referido aqui como sendo sequências que conferem resistência a antibióticos ou serem marcadores visuais. Preferencialmente os marcadores podem ser selecionados do grupo de, mas não estando limitado a, sequências codificadoras dos genes canamicina, neomicina, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, higromicina, geneticina, fosfinotricina, glifosato, glufosinato de amónio, AHAS, BAR e GUS. Organismos (plantas ou bactérias) sobreviventes ao gene marcador (ou gene de resistência) em meio de cultivo ou em aplicações tópicas são indicados como transformantes positivos caracterizados pela presença de gene exógeno integrado ao genoma desse organismo.
O termo "oligonucleotídeo" é referido aqui como 'primers' e 'sondas' da presente invenção, e é definido como uma molécula de ácido nucleico compreendendo de dez a noventa deoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que oito. O tamanho exato dos oligonucleotídeos é dependente dos fatores experimentais particulares de cada etapa do processo.
Conforme usado na presente invenção, os termos "codificador", "codificando" ou "codificado" quando usados no contexto de uma sequência nucleotídica específica significa a mesma possui uma informação, a qual será traduzida biologicamente da sequência de nucleotídeo para uma sequencia proteica específica. A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Estes códons são explorados por cada organismo vivo de maneira diferenciada podendo partes de sequências nucleotídicas distintas serem traduzidas biologicamente em codons idênticos.
O termo "gene" corresponde a uma sequência nucleotídica especifica localizada em uma região em particular do cromossomo, sendo responsável por codificar um produto final específico. O gene também carrega em sua estrutura primária toda a informação necessária para os processos de transcrição e tradução biológica, como por exemplo, regiões promotoras e reguladoras da transcrição. No caso da presente invenção, gene compreende as sequências nucleotídicas codificadoras correspondente ao gene cryl lal 2 e aos seus análogos.
Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados de forma interrelacionados para referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se para polímeros de aminoácidos onde um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial de um aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como para polímeros de aminoácidos ocorrendo naturalmente.
Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos ou através de um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular. Por exemplo, uma proteína truncada da invenção pode ser produzida pela expressão de um ácido nucleico recombinante da invenção em uma célula hospedeira apropriada, ou alternativamente pela combinação de procedimentos, tais como digestão utilizando protease e purificação.
Na presente invenção os polipeptídeos isolados são caracterizados por compreender sequências substancialmente similares a qualquer uma das sequências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 7-11 e exibirem atividade inseticida, quando administrado oralmente, a larvas de insetos susceptíveis. Os polipeptídeos da presente invenção são caracterizados por exibir atividade inseticida, quando fornecido em uma dieta administrada oralmente a uma larva de inseto lepidóptero, mais especificamente a larva de broca gigante da cana-de-açúcar. Mais especificamente, os polipeptídeos isolados da presente invenção são caracterizados por ser uma δ-endotoxina.
Na presente invenção o termo "proteína recombinante" se refere às moléculas quiméricas obtidas a partir da aplicação da técnica de embaralhamento do DNA de genes (codificadores de Cry1 la12). Podendo ser essas moléculas expressadas, mas não somente, em fagos, bactérias leveduras e plantas. Preferencialmente, a proteína recombinante da presente invenção é caracterizada por ter atividade δ-endotoxina.
O termo "substancialmente pura" refere-se a preparações compreendendo pelo menos 50-60% de peso do componente de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo, polipeptídeo, proteína, etc). Mais preferencialmente, a preparação compreende pelo menos 75% de peso, e mais preferencialmente 90-99% de peso do componente de interesse. A pureza é medida por meio de métodos apropriados para o componente de interesse (por exemplo, espectometria de massa e similares).
O termo "gene isolado" é utilizado na presente invenção. Este termo refere- se à sequência nucleotídica existente em determinado genoma.
O termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" é, às vezes, utilizado na presente invenção. Este termo refere-se a uma proteína produzida pela expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. Alternativamente, este termo pode referir-se a uma proteína que tem sido suficientemente separada de outras proteínas que ela poderia estar naturalmente associada, tal como ela existe na sua forma "substancialmente pura". O termo "isolado" não exclui misturas sintéticas ou artificiais com outros compostos ou materiais, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade fundamental da proteína, e que pode estar presente, por exemplo, em uma purificação incompleta, adição de estabilizadores, ou combinados dentro, por exemplo, em uma composição agriculturalmente aceitável.
O termo "atividade biológica" diz respeito a uma função ou um grupo de funções executado por uma molécula em um contexto biológico (isto é, em um organismo ou substituto in vitro ou algum outro modelo similar). Para uma δ-endotoxina, a atividade biológica é caracterizada pela sua atividade citotóxica aos receptores presentes no intestino médio do inseto-praga alvo, ocasionando à morte do mesmo.
Como usado aqui, o termo "impactando insetos-praga" refere-se ao efeito de mudar nos insetos a alimentação, crescimento, e/ou comportamento em qualquer estágio do desenvolvimento, incluindo, mas não limitado a: matar o inseto; retardar o crescimento; impedir capacidade reprodutiva; atividade anti-alimentação; e outros semelhantes.
Os termos "atividade pesticida" e "atividade inseticida" são utilizados sinonimamente para referir-se a atividade de um organismo ou uma substância (p.ex: uma proteína) que pode ser medida por, mas não estando limitada a mortalidade da praga, perda de peso da praga, repetência à pragas, e outros comportamentos e mudanças físicas de uma praga depois da alimentação e exposição por um apropriado período de tempo. Dessa forma, o impacto da atividade pesticida deve ter pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão da praga. Por exemplo, "proteínas pesticidas e/ou inseticidas" são proteínas que desencadeiam a atividade pesticida por elas mesmas ou em combinação com outras proteínas, δ-endotoxinas são proteínas pesticidas. Outros exemplos de proteínas pesticidas incluem, por exemplo, jaburetox, inibidores de alfa-amilase, dentre outros.
O termo "quantidade efetiva de pesticida" diz respeito a uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no ambiente da praga. Para cada substância ou organismo, a quantidade efetiva de pesticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Similarmente o termo "quantidade efetiva de pesticida" pode ser usado para referir a uma "quantidade efetiva de pesticida" quando uma praga é um inseto-praga. O termo "composição pesticida biodegradável" é caracterizado por ser produtos ou substâncias liberadas no solo para ação em ambiente de praga, podendo ser degradados por ação de microorganismos, fotólise, oxidação, entre outros, em um período curto de tempo. As composições biodegradáveis envolvem substâncias classificadas como organofosforados, carbamatos, triazinas, anilinas, podem ser colocadas na forma de estacas que podem ser introduzidas no solo sem danos permanentes. Os produtos geralmente compreendem um aglutinante polimérico sólido, hidrófilo, solúvel em água, a um pesticida sistémico. Ainda, o pesticida biodegradável se caracterizada pelo fato de que um veículo carreador aceitável pode ser um agente superfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor uv (ultra-violeta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta. A composição pesticida biodegradável é caracterizada pelo fato de o veículo carreador aceitável ser um microorganismo transformado. Na presente invenção a composição pesticida biodegradável é caracterizada pelo fato de o polipeptídeo da presente invenção ou análogo mutante ser usado em combinação outras proteínas inseticidas.
O termo "recombinantemente engenheirado" ou "engenheirado" diz respeito a utilização da tecnologia do ADN recombinante para gerar (engenheirar) uma mudança na estrutura da proteína baseando-se no entendimento do mecanismo de ação da mesma, podendo os aminoácidos serem introduzidos, deletados ou substituídos.
O termo "Embaralhamento de ADN" é utilizado para descrever um método empregado em evolução molecular dirigida in vitro para gerar variantes de uma única sequência gênica, ou duas ou mais sequências gênicas homólogas por meio de recombinações de fragmentos gerados randomicamente, com recuperação de sequências modificadas e com consequente modificação de resíduos de aminoácidos na proteína codificada pelo análogo mutante.
O termo "apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display" diz respeito a um sistema de expressão e de interações de proteínas fusionadas a bacteriófagos que permitem uma varredura em células, tecidos ou órgãos a procura de pares receptor-ligantes, sendo esses ligantes, proteínas que se ligam aos receptores presentes no alvo em estudo.
Como usado aqui, o termo "sequência de nucleotídeo mutada" ou "mutação" ou "sequência de nucleotídeo mutageneizada" diz respeito a uma sequência de nucleotídeo que tem sido mutada ou alterada para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (p.ex.: pares de base) que não está presente no tipo selvagem ou na sequência não-mutada. Tal mutagênese ou alteração consiste de uma ou mais adições, deleções, ou substituições ou realocamento de resíduos de ácidos nucleicos.
Como usado aqui, o termo "melhora da atividade inseticida" ou "melhora da atividade pesticida" caracteriza um polipeptídeo ou uma δ-endotoxina da invenção que possui a atividade pesticida contra lepidópteras melhorada em relação às δ-endotoxinas originais que não sejam efetivos contra insetos. Para medir a melhora da atividade pesticida ou inseticida deve-se requerer uma demonstração de alteração do desenvolvimento (tamanho e peso) das larvas do inseto-específico ou da mortalidade das larvas após o contato com a δ-endotoxina da invenção. .
Um especialista no assunto tem conhecimento dos avanços no campo da biologia molecular tais como uma mutagênese sítio-específica ou ao acaso, metodologia da reação de polimerase em cadeia (PCR), e técnicas da engenharia protéica provém uma extensiva coleção de ferramentas e protocolos viáveis para o uso para alterar ou engenheirar ambas as sequências de aminoácido e sequências genéticas disfarçadas de proteínas de interesse agrícola. Então, as proteínas pesticidas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras, incluindo substituição de aminoácido, deleções, truncações, e inserções. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma sequência de aminoácido variante da proteína pesticida da presente invenção pode ser preparada pela introdução de mutações dentro de um ácido nucleico sintético (p.ex.: molécula de ADN). Métodos para mutagênese e alterações em ácidos nucleicos são bem descritos no estado da técnica. Entende-se que os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto pela expressão de um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular.
Descreve-se que um método para o controle de uma praga pode ser caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente; b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou produzida como uma composição da presente invenção.
Sabe-se que proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e variam em peso molecular, número de resíduos, componentes peptídicos, atividades contra pragas particulares, e outras características. No entanto, pelos métodos descritos aqui, proteínas ativas contra uma variedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas. As proteínas pesticidas da invenção podem ser usadas em combinação ou outras proteínas inseticidas para aumentar a ação no inseto alvo. Além do mais, o uso de proteínas pesticidas da presente invenção em combinação com outros princípios inseticidas de uma natureza diferente podem ter uma utilidade particular para prevenção e/ou manejo da resistência à inseto. Outros princípios inseticidas incluem, mas não estão limitados a outros tipos de inibidores de protease (ambos serina e cisteína), lectinas, e peroxidases.
A invenção também diz respeito a plantas transformadas com pelo menos um ácido nucleico da presente invenção, com um gene quimérico compreendendo o ácido nucleico, ou com um vetor binário compreendendo o gene quimérico. Preferencialmente, o microrganismo é um que se multiplica em plantas. Mais preferencialmente, o microrganismo é uma bactéria colonizadora de raiz. Uma concretização da presente invenção diz respeito a uma proteína pesticida encapsulada, que compreende um microrganismo transformado compreendendo pelo menos uma proteína pesticida da invenção.
A invenção também provê um método de aumentar o alcance do inseto alvo através do uso de proteínas pesticidas da invenção em combinação com pelo menos uma segunda proteína pesticida que seja diferente da proteína pesticida da invenção. Qualquer proteína pesticida conhecida no estado da técnica pode ser utilizada no método da presente invenção. Tais proteínas pesticidas incluem, mas não estão limitadas a D-endotoxinas de Bt, inibidores de protease, lectinas, alfa amilases, hidrolases acil lipídicas, e peroxidases.
A invenção também compreende plantas transgênicas ou transformadas compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica da invenção. Preferencialmente, a planta é estavelmente transformada com um gene quimérico, compreendendo pelo menos uma sequência nucleotídica da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão em células vegetais. Como usado aqui, o termo "plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" refere-se a uma planta que compreende dentro de seu genoma um polinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado ao genoma de uma planta transgênica, de forma estável para que o polinucleotídeo seja passado para gerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado dentro do genoma sozinho ou como parte de um vetor recombinante.
Como usado aqui, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calos, tecidos, parte da planta, ou genótipo da planta que tem sido alterado pela presença do ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamento sexual ou propagação sexual do transgênico sexual.
O termo "plantas" refere-se a organismos fotossintéticos, ambos eucariotos e procariotos, onde o termo "plantas desenvolvidas" refere-se a plantas eucariotas. O termo refere-se a plantas inteiras, órgãos vegetais (p.ex.: folhas, caules, raízes, flores, entre outros), sementes, células vegetais, e progénies dos mesmos. Partes das plantas transgênicas também estão incluídas dentro do escopo da invenção compreendendo, por exemplo, células vegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, raízes originados de plantas transgênicas ou sua progénie previamente transformada com uma molécula de ADN da invenção e, portanto, consistindo de pelo menos parte das células transgênicas, são também objeto da presente invenção. Os ácidos nucleicos da invenção podem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então, a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos géneros Anona, Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Carica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, anihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna, e Zea. Particularmente, a presente invenção diz respeito a plantas de cana-de- açúcar transformadas com as sequências nucleotídicas da presente invenção bem como fragmentos e derivados das mesmas.
Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir sequências de nucleotídeos dentro de plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célula vegetal, por exemplo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, alvos da transformação. Métodos viáveis de introduzir sequências nucleotídicas em células vegetais e a subsequente inserção dentro do genoma vegetal são bem descritos no estado da técnica e podem ser, mas não estão limitados a técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-se métodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com ADN.
Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas em literatura científica e patentária (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., Liu, G., Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol., 101 , 433-448, 1983) (como mencionado no pedido de patente US4743548). A introdução de construções gênicas utilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. (Paszkowski, J., Shillito, R. D., Saul, M., Mandák, V., Hohn, T. Hohn, B., 13 000609
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Potrykus, l„ Direct gene transfer to plants. Embo J. 3: 2717-2722, 1984) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al (Fromm, M. E., Taylor, L. P. Walbot, V., Expression of genes electroporated into monocot and dicot plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824, 1985) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al. (Klein, T. M., Wolf,. E. D., Wu, R., Sanford, J. C, High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327:70-73, 1987) (como mencionado no pedido de patente US20020152501 ).
Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiões flanqueadoras de T-ADN apropriadas e introduzidas em um vetor convencional, o hospedeiro Agrobacterium tumefaciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens direcionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do ADN da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bem descritas na literatura cientifica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501 , Horsch, R. B., Fraley, R. T., Rogers, S. G., Sanders, P. R., Lloyd, A., Hoffmann, N. Inheritance of functional foreign genes in plants. Science 233:496^98, 1984; e Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B., Sanders, P. R., Flick, J. S., Adams, S. P.t Bittner, . L, Brand, L. A., Fink, C. L, Fry, J. S., Galluppi, G. R., Goldberg, S. B., Hoffmann, N. L, Woo, S. C. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983). Células de plantas transformadas derivadas de qualquer uma das técnicas de transformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira que possua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado, tal como resistência a insetos. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio de crescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida, que deve ser introduzido junto com a sequência de nucleotídeos desejada. Regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al (Evans, D. E., and Bravo, J. E., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Celi Culture, vol. 1 , 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983); e Binding 1985 (Binding, H., Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985) (como mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtida através de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee et al (Klee, H., Horsch, R., Rogers, S., Agrobacterium- mediated plant transformation and its further applications to plant biology. Ann. Ver. Of Plant Phys. 38:467-486, 1987 (como mencionado no pedido de patente US20020152501).
Um gene codificando uma proteína pesticida da invenção pode ser introduzido por meio de um vetor viável dentro de um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro pode ser inserido em plantas ou em animais. O termo "introduzido" no contexto de inserir um ácido nucleico dentro de uma célula significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui a incorporação de um ácido nucleico dentro de uma célula procariótica ou eucariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado dentro do genoma da célula (p.ex.: cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou ADN mitocondrial), convertido dentro de um replicon autónomo, ou expresso transientemente (p.ex.: ARNm transfectado).
O termo "microorganismo" é definido aqui como sendo micróbios que possuem organelas funcionais no interior de suas cápsulas ou células como bactérias, protozoários, fungos unicelulares e algas unicelulares.
Existem vários métodos viáveis para introduzir um gene expressando a proteína pesticida dentro de um microrganismo hospedeiro sob condições que permitam a manutenção e a expressão estável do gene. Por exemplo, vetores de expressão podem ser construídos contendo a sequência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada a sinais regulatórios de transcrição e tradução para expressão da sequência de nucleotídeo. Quando uma sequência de nucleotídeo homóloga interna do organismo se encontra com a sequência no vetor binário, poderá haver uma recombinação entre elas e o gene que codifica a proteína pesticida se integrará no genoma do organismo hospedeiro de forma estável.
Células hospedeiras viáveis, onde as células contendo a proteína inseticida serão tratadas para prolongar a atividade da proteína inseticida na célula quando a célula tratada for aplicada no meio ambiente da praga alvo, pode incluir procariotos ou eucariotos, normalmente sendo limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas em organismos superiores. No entanto, organismos que produzem substâncias tóxicas em organismos superiores podem ser usados, onde a toxina for instável ou o nível de aplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a hospedeiros mamíferos. Particularmente os hospedeiros são procariotas e eucariotas menos desenvolvidos como os fungos. Exemplos de procariotos, ambos gram negativos e gram positivos, incluem, mas não estão limitados a Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tais como Rhizobium; Spirillaceae, tais como Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariotos podem ser exemplificados os fungos, tais como Phycomycetes e Ascomycetes, os quais incluem leveduras, tais como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e Basidiomycetes, tais como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e semelhantes.
Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para o propósito de produzir a proteína inseticida incluem a facilidade de introdução do gene da proteína inseticida dentro do sistema de expressão, eficiência de expressão, estabilidade da proteína no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares.
Organismos hospedeiros de particular interesse incluem leveduras, tais como Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., e Sporobolomyces spp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilís, e outros semelhantes.
As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade de pragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a, insetos, fungos, bactérias, nematóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, e semelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente insetos-praga que causam danos significativos para plantas agrícolas. Entende-se como "insetos-praga" insetos e outras pragas similares tais como, por exemplo, os insetos das ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc, particularmente, Lepidoptera especialmente broca gigante da cana-de-açúcar, Telchin licus licus. Insetos- praga da presente invenção da maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a Milho: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraea grandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saccharalis, Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi, Diabrotica undecimpunctata howardi, Melanotus spp., Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japonica, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradicis, Blissus leucopterus leucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinípes, Hylemya platura, Agromyza parvicornis, Anaphothrips obscrurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae; Sorgo: Chilo partellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltia subterrânea, Phyllophaga crinita, Eléodes, Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus, Chaetocnema pulicaria, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissus leucopterus leucopterus, Contarinia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychus urticae; Trigo: Pseudaletía unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata, Diabrotica undecimpunctata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetiola destructor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coarctata, Frankliniella fusca, Cephus cinctus, Aceria tulipae; Girassol: Cylindrocupturus adspersus, Smicronyx fulus, Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeosoma electellum, Zygogramma exclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasioptera murtfeldtiana; Algodão: Heliothis virescens, lagarta-das-maçãs; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta do cartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltadora do algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Franklinkiella fusca, tripés; Tetranychus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado; Arroz: Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea, Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterus leucopterus, Acrosternum hilare; Soja: Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, Epilachna varívestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabiiis, Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae; Cevada: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destructor, Petrobia latens; Canola: Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum, Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, e Meligethes viridescens; Batata, Leptinotarsa decemlineata e Feijão: Zabrotes subfasciatus; Calossobruchus spp., Acanthoscelides obtectus.
Os exemplos abaixo são colocados de forma a ilustrar e elucidar melhor a invenção e não podem ser tidos como forma de limitar a presente invenção. EXEMPLOS Técnicas usuais de biologia molecular (p.ex.: transformação de bactérias e eletroforese em gel de agarose de ácidos nucleicos) estão descritas por meio de termos comumente empregados. Detalhes da prática de tais técnicas são descritos em Sambrook et al (Sambrook, J., Russell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989).
Exemplo 1 - Geração de genes mutantes, análogos ao gene cry1 la12 nativo, altamente eficazes no controle de T. I. licus pela técnica de embaralhamento do DNA.
A construção de biblioteca de genes recombinantes análogos ao gene cry1 la12 é uma importante estratégia biotecnológica, contribuindo de modo importante em programas de melhoramento de plantas, via transformação genética para geração de transgênicos. Esta tecnologia disponibiliza uma variedade de novas moléculas com potencial uso na transformação de plantas visando o controle do inseto-alvo, bem como a melhoria da atividade inseticida de novas proteínas codificadas pelos genes recombinantes.
Em estudos prévios (Grossi-de-Sá, MF, Magalhães, MQ, Silva, MS, Silva, SMB, Dias, SC, Nakasu, EYT, Brunetta, PSF, Oliveira, GR, Oliveira Neto, OB, Oliveira, RS, Soares, LHB, Ayub, MAS, Siqueira, HAA, Figueira, ELZ (2007) Susceptibility of Anthonomus grandis (Cottoh Boll Weevil) and Spodoptera frugiperda (Fali Armyworm) to a Cry1 la-type Toxin from a Brazilian Bacillus thuringiensis Strain. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 40 (5), 773-782; Craveiro, KIC, Gomes Júnior, JE, Silva, MCM, Macedo, LLP, Lucena, WA, Silva, MS, Antonino-Souza Júnior, JD, Oliveira, GR, Magalhães, MTQ, Santiago, AD, Grossi-de-Sá, MF (2010) Variant Cryl l toxinsgeneratedby DNA shuffling are active against sugar cane giant borer. Journal of Biotechnology. 145, 215-221), foi demonstrado que a toxina Cry1 la 2 apresenta atividade moderada contra insetos lepidópteros e, com o objetivo de obter, in vitro, novos genes, análogos ao gene cry1 la12, altamente eficazes contra T. I. licus, foi realizada a técnica de DNA shuffling. Para isso, o gene selvagem cry1la 2 (SEQ ID NO 1) foi reamplificado por PCR com oligonucleotídeos específicos para sequência gênica em questão, os quais contêm o sítio para a enzima de restrição Sfi I (Cry1 laShuffFOR_SfiExtr_AP:5'GAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTG TCAGGATCCTGTTTGAAAATGTCTGAG3' e Cry1 laShuffREV_SfiExtr_AP:5' CGAGGCCGGCCTGGCCCAACATGTAGCCGCATGCGCGTTCTACCGGAA CAAATTCAATTC3'). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em uma reação de PCR com volume final de 50 pL, contendo 150 nM de cada oligonucleotídeo específico, 400 μΜ de dNTPs, 3 mM de MgCI2, 1X do tampão para a enzima Taq DNA Polimerase (Cenbiot®), 1 ,5 U de TaqDNA polimerase (Cenbiot®) e 200 ng de DNA cry1 la12. A amplificação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos; 35 ciclos: 45 segundos a 95 °C (desnaturação), 45 segundos a 60°C (anelamento dos oligonucleotídeos) e 2 minutos a 72 °C (extensão da DNA polimerase) e uma extensão final de 5 minutos a 72 °C. Uma alíquota dos produtos da PCR (um produto de aproximadamente 2000 pb) foi analisada em gel de agarose 1 % e o restante foi purificado utilizando o QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN). Seguindo o protocolo da técnica de DNA shuffling (Stemmer, WPC (1994) Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370, 389-391 ; Zhao, H & Arnold, FH (1997) Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination. Nucleic Acids Research. 25, 1307-1308), vinte microgramas do gene cry1 la12 com os sítios para a enzima de restrição Sfi I foram liofilizados, solubilizados em tampão de DNAse I e digeridos com 30 U de DNAse I a 15°C por 20 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 5 pL de EDTA 0,5 M. Uma alíquota do produto da digestão foi analisada em gel de agarose 2,5%. O restante do produto da digestão foi purificado utilizando colunas Microcon® YM-100 (Millipore), seguindo as instruções do fabricante visando a recuperação de fragmentos de até 125 pb. Os fragmentos do gene cry1 la12 purificados foram utilizados em uma reação de PCR com volume final de 25 pL, sem a adição de oligonucleotídeos iniciadores, 400 μΜ de dNTPs, 1 mM de MgSO4, 5X do tampão para a enzima TaqPlatinum DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen®), 2,5 U de Taq Platinum DNA Polimerase High Fidelity (Invitrogen®) e 1 ,5 pg de DNA de fragmentos do gene cry1 la12. A reação foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf®) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos; 44 ciclos: 95°C por 1 minuto (desnaturação), 42°C por 1 minuto (anelamento) e 72°C por 1 minuto (com um acréscimo de 5 segundos no tempo de extensão a cada ciclo) e uma extensão final de 7 minutos a 72°C. Esta primeira reação da técnica de embaralhamento de DNA gerou um montante de fragmentos de tamanhos variados. Este novo produto foi então utilizado na segunda reação de PCR (50 pL) como molde, nas seguintes condições: um microlitro e meio do produto da primeira reação, 1X do Tampão Taq Platínum DNA Polimerase High Fidelity 1X, 0,2 mM dNTPs, 0,8 μΜ dos oligonucleotídeos específicos Shuff2FOR_SfiExtr_AP (5' CGAGGCCCAGGCGGCCAGTAGTGGCGTGTCAGGATCC 3') e Shuff2REV_SfiExtr_AP (5' CGAGGCCGGCCTGGCCCAACATGTAGCCGCATGCGCG 3'), 2mM MgS04 e 10 U na mistura de 1 : 1 Taq Platinum DNA Polimerase High Fidelity (lnvitrogen®)/Taq DNA Polimerase (Cenbiot®). A reação de amplificação foi realizada em termociclador (MastercyclerGradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: 95°C por 2 minutos, 10 ciclos: 95°C por 30 segundos (desnaturação); 42°C por 1 minuto (anelamento dos fragmentos) e 72°C por 1 minuto (extensão da DNA polimerase), 14 ciclos: 95°C por 1 minuto, 42°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto (com um acréscimo de 20 segundos por ciclo), com uma extensão final a 72°C por 10 minutos. Dessa forma, o gene cry1 la12 selvagem submetido à técnica de embaralhamento de DNA, gerou uma população de genes variantes, seja pela introdução, deleção ou substituição de nucleotídeos (Figura 1). Esse produto foi analisado em gel de agarose 1 % e o amplicon de aproximadamente 2000 pb, correspondendo à população de genes cry1 la12 variantes, foi excisado e purificado com o QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). O vetor fagomídeo pCOMB3X (Andris-Widhopf, J, Rader, C, Steinberger, P, Fuller, R, Barbas III, CF (2000) Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181) foi submetido à digestão com a enzima de restrição Sfi I. Foram utilizados 2 μg de DNA do vetor, tampão NEB2 1X, BSA 1 mg/mL e 40 U Sfi I (New England Biolabs®), para um volume final de reação de 40 μ!_, ocorrendo a 50°C por 2 horas. As mesmas condições foram obedecidas para as digestões dos genes cry1 la12 selvagem e variantes. Os produtos das digestões foram analisados em gel de agarose 0,8% e as bandas correspondentes ao vetor fagomídeo pCOMB3X linearizado (aproximadamente 3000 pb) e aos genes cry1 la12 selvagem e variantes (aproximadamente 2000 pb) foram excisadas e purificadas com o QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN). Os novos genes reconstruídos, análogos ao gene cry1 la12 selvagem, foram clonados no vetor com auxílio da enzima T4 DNA Ligase® (Invitrogen). Adicionou-se o vetor e os genes cry foram misturados na proporção de 4:1 (vetor.inserto), com a adição do tampão da enzima T4 DNA Ligase 1X, enzima T4 DNA Ligase 1 U e ATP 20 mM, num volume final de 25 pL, a 15°C por 16 horas. O produto da ligação (pCOMB3X + cry1 la12) foi utilizado para transformar células E. coli XL-1 Blue, via eletroporação. Os transformantes foram crescidos em meio LB contendo ampicilina 100 mg/mL e indicaram um título de 106 células para a biblioteca combinatória de genes cry1 la12 variantes. Uma parte dessas colónias foi analisada por PCRs de colónia e os DNAs das colónias apresentando o transgene foram preparados e as sequências determinadas utilizando os oligonucleotídeos iniciadores MMB4 (5' GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT 3'), MMB5 (5'
CGTCCATTGCATTCTTTTAAT 3').
Exemplo 2 - Seleção das toxinas Cry1 la12 variantes, análogas à toxina Cry1 la12 selvagem, pela técnica de Phage display.
A biblioteca de genes análogos ao cry1 la12 gerada por embaralhamento do DNA e fusionados a proteína III do capsídeo do fago filamentoso M13 (fagos de fusão) foi então selecionada pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display (Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ (2001) Selection from antibody libraries. In: Phage display - A Laboratory Manual - USA: Cold Spring Laboratory, 10.1 - 10.20) utilizando como ligantes BBMVs de T. I. licus (Francis, BR, Maaty, WSA, Bulla Jr., LA (1998) Effects of Midgut-Protein-Preparative and Ligand Binding Procedures on the Toxin Binding Characteristics of BT-R1 , a Common High- Affinity Receptor in Manduca sexta for Cry A Bacillus thuringiensis Toxins. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6): 2158-2165). No procedimento de seleção por afinidade de ligação, os fagos fusionados às toxinas Cry1 la12 foram depositados em poços de uma placa de microtitulação previamente sensibilizadas com BBMVs (100 pg/pL), extraídas da membrana do intestino de larvas da broca gigante da cana-de- açúcar. A cada ciclo de seleção, os poços são lavados com solução PBS- Tween (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 12 mM Na2HP04, 1,2 mM KH2P04 e 0,05% Tween 20®) e, os fagos específicos, eluídos em pH baixo, são usados para transfectar novas células de E. coli. As partículas de fagos amplificadas são utilizadas no sucessivo ciclo de seleção. O procedimento envolveu cinco ciclos de lavagem, eluição e amplificação. A titulação das colónias coletadas em cada ciclo é feito pelo plaqueamento de colónias em diluições seriais em meio SBágar contendo carbenicilina 100 pg/mL As colónias isoladas do montante de fagos específicos eluídos no quarto ciclo de seleção (indicados como o ciclo de enriquecimento de fagos específicos) foram amplificadas com oligonucleotídeos específicos para as extremidades do vetor fagomídeo pCOMB3X, nas quais estão ligados os genes cry1 la12. Cinco colónias mostrando amplificação em PCR e contendo aproximadamente 2000 pb (tamanho do gene original) foram selecionadas para a expressão em E. coli.
Exemplo 3 - Expressão dos genes selvagem e variantes em E. coli XL-1 Blue.
Os genes cry1 la12 selvagem e variantes selecionados por Phage display e com o tamanho esperado do inserto (aproximadamente 2000 pb), indicado pelas PCRs de colónia, foram utilizados para expressão em E. coli após indução por IPTG (Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, Silverman, GJ (2001) Analysis of Antibody Fragment-expressing Clones in ELISA. In: Phage display - A Laboratory Manual - USA: Cold Spring Laboratory, 11.9 - 11.12). As colónias selecionadas foram inoculadas em meio SB contendo carbenicilina [100 mg/mL] e incubadas a 37°C, sob agitação de 200 rpm até atingir a de DO600nm = 0,5. A expressão foi induzida pela adição de IPTG (concentração final de 2 mM) utilizando agitação de 300 rpm por 16 horas a 37°C. Para obter as toxinas Cry, a partir do lisado celular, as culturas induzidas foram centrifugadas a 2000 x g por 10 minutos. Os sedimentos foram solubilizados em TBS (2% do volume), e transferidos para tubos de microcentrífugas. As células foram lisadas por congelamento em nitrogénio líquido por 5 minutos seguido por descongelamento em banho-maria a 37°C por 3 minutos, repetindo-se esse procedimento por três vezes. Os restos celulares foram separados por centrifugação a 15000 x g por 15 minutos e o sobrenadante contendo as toxinas Cry expressas, armazenados para utilização nos ensaios de atividade.
Exemplo 4 - Bioensaios seletivos contra broca gigante da cana-de-açúcar para determinação da atividade entomotóxica das δ-endotoxina Cry1 la12 análogas.
Fêmeas adultas de T. I. licus foram coletadas em campo e acondicionadas em gaiolas com o fundo telado, de modo a permitir a separação dos ovos depositados. Após 24 horas, os ovos foram coletados e mantidos em câmara insetária (tipo B.O.D.) a 28 ±1 °C e 70±10% de umidade relativa. Ovos com oito dias foram individualizados em placas de 96 poços, permitindo assim, a eclosão das larvas em reservatórios separados. As larvas, depois de eclodidas, foram mantidas sobre um substrato esponjoso, o qual foi umedecido com uma dieta líquida, modificada a partir da dieta já estabelecida por HENSLEY E HAMMOND (1968) para a criação de Diatraea saccharalis. As larvas que conseguiram se alimentar da dieta mudaram de coloração e foram então transferidas para uma nova placa, contendo nova dieta, permanecendo nesta até sua utilização nos bioensaios, por um período máximo de 7 dias. Devido à característica de canibalismo das larvas de T. I. licus. Foram utilizadas placas de microtitulação de 96 poços, para que as larvas ficassem individualizadas. Cada poço do experimento continha uma esponja (80% de viscose, 20% de poliéster) com, aproximadamente 1 cm2, previamente embebida em suspensão de dieta liquida, com 3,5 pg/mL das toxinas Cry1 la12 original (SEQ ID NO 7) e variantes I, II, III, IV e V (SEQ ID NOs 8-12) expressas em bactéria. O tratamento-testemunha foi realizado com dieta sem nenhuma bactéria. Os experimentos foram realizados em triplicata em que cada unidade experimental consistia de 12 larvas de 1 o instar, individualizadas em cada poço contendo os diferentes tratamentos. As placas foram mantidas em câmara climatizada a 28±1°C, UR 70+10% e fotoperíodo de 12 horas. Após cinco dias, o experimento foi interrompido para a avaliação de mortalidade larval dos diferentes tratamentos. Os valores de mortalidade foram comparados utilizando-se de análise de variância pelo teste de Tukey, ao nível de significância de 5% (Figura 2). Exemplo 5 - Determinação da sequência primária das toxinas análogas Cry1 la12.
Os genes análogos cry1 la12 selecionados por PCRs de colónia foram submetidos a reações de sequenciamento nas seguintes condições: 500 ng de DNA plasmidial contendo os análogos e 3 μΜ de oligonucleotídeos específicos (VarPhaDispJnt_FOR (5' CTTTAGCATTATTGTGTTCC 3'), VarPhaDisp_lnt_REV (5' CGCATACCCGTACGACGTTCC 3'), VarPhaDisp_lnt_FOR_2 (5' G AAATC GTAATAAC AC AAG G G 3') e VarPhaDisp_lnt_REV_2 (5' CCAGCACCATCACCATCACC 3')), em um sequenciador automático modelo ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Ao final, foram selecionadas cinco sequências análogas ao gene cry1 la12 (variantes I, II, III, IV e V - SEQ ID NO 2-6, respectivamente). As novas moléculas geradas pela recombinação do gene cry1 la12 apresentaram diferenças de 0,15 a 1 ,24% de resíduos de aminoácidos modificados. Para a análise das sequências e classificação das mesmas como análogas do gene cry1 la12 selvagem, estas moléculas foram agrupadas por similaridade de sequências nucleotídicas. Mesmo havendo mutações nucleotídicas nas sequências geradas, poucas significaram modificações de resíduos de aminoácidos (até 1 ,08%) (Tabela 1). Duas novas moléculas Cry1 la12, variante II (SEQ ID NO 8) e variante V (SEQ ID NO 1 1), se mostraram aproximadamente 3 vezes mais ativas que a molécula selvagem (Cry1 la12 - SEQ ID NO 1) exibindo uma mortalidade de 55,5 e 75% das larvas neonatas alimentadas com dieta contendo 3 pg de proteína por mililitro de dieta líquida. Os modelos de Cry1 la12 e de seus análogos mostraram o mesmo arcabouço estrutural, sendo diferenças observadas apenas nas cadeias laterais dos aminoácidos substituídos no análogo. As estruturas selvagem e análoga Cry1 la12 apresentam os três domínios funcionais conservados (I, II, e III), típicos das toxinas Cry.
Tabela 1. Mutações encontradas nas toxinas Cry1la12 variantes.
Variantes Cry1la12 Mutações Domínio
I (SEQ ID NO 8) S84G I
R159K I
G380R II
II (SEQ IO NO 9) S84G I
R159K I
L212del I
S213del I
D233N I
Q413S II
P414T II
P419L II
III (SEQ ID NO 10) S84G I
IV (SEQ ID NO 11) S84G I
R159K I
G380R II
K426 F427insK II
V (SEQ ID NO 12) D233N

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Moléculas isoladas de ácido nucleico caracterizadas por compreender:
a) sequências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
b) complementos das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
c) complementos reversos das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6;
d) sequências reversas das sequências descritas em SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.
2. Construção gênica caracterizada por compreender a molécula isolada da reivindicação 1.
3. Construção gênica caracterizada por compreender:
a) um promotor opcionalmente ligado a uma sequência líder e operacionalmente ligado a
b) uma sequência codificadora selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6.
4. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor ser selecionado do grupo consistindo de constitutivos, induzíveis e tecido-específicos.
5. Construção gênica de acordo com a reivindicação 4 caracterizada pelo fato do promotor tecido-específico ser selecionado entre promotores Ubi1 , Ubi 9 e Act1.
6. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor conter elementos enhancers.
7. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato do promotor poder ser expresso em plantas, animais, bactérias, fungos ou insetos.
8. Construção gênica de acordo com a reivindicação 3 caracterizada pelo fato da sequência líder ser obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula isolada de ácido nucleico.
9. Vetor binário caracterizado por conter uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-8.
10. Vetor binário caracterizado por compreender:
a. um promotor opcionalmente ligado a uma sequência líder e operacionalmente ligado a
b. uma sequência codificadora selecionada do grupo identificado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5 ou SEQ ID NO 6 operacionalmente ligada a
c. um sinal de terminação;
d. uma origem de replicação;
e. um marcador seletivo; e
f. um sítio de clonagem.
11. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor ser selecionado do grupo consistindo de constitutivos, induzíveis e tecido-específicos.
12. Vetor binário de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato do promotor constitutivo ser selecionado entre promotores Ubi1 , Ubi9 e Act1.
13. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor conter elementos enhancers.
14. Vetor binário de acordo coma reivindicação 10 caracterizado pelo fato da sequência líder ser obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição da molécula isolada de ácido nucleico.
15. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do promotor poder ser expresso em plantas, animais, bactérias, fungos ou insetos.
6. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do sinal de terminação ser selecionado do grupo sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK, sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinal de terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 9S e 35S do CaMV, sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene da manopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do gene da ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírus que ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillus nidulans e outros semelhantes.
7. Vetor binário de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo fato do marcador seletivo ser selecionado entre sequências que conferem resistência a antibióticos ou marcadores visuais.
18. Vetor binário de acordo com a reivindicação 17 caracterizado pelo fato marcador seletivo ser selecionado entre as sequências codificadoras dos genes canamicina, neomicina, ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, higromicina, geneticina, fosfinotricina, glifosato, glufosinato de amónio, AHAS, BAR e GUS.
19. Polipeptídeos isolados, caracterizados por compreender sequências substancialmente similares a qualquer uma das sequências selecionadas do grupo identificado como SEQ ID NO 8-12.
20. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 19, caracterizados por exibir atividade inseticida, quando administrado oralmente, a larvas de insetos susceptíveis.
21. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 19, caracterizados por exibir atividade inseticida, quando fornecido em uma dieta administrada oralmente a uma larva de inseto lepdóptero.
22. Polipeptídeos de acordo com a reivindicação 21 , caracterizados pelo fato de a larva de inseto ser uma larva de broca gigante da cana-de-açúcar.
23. Polipeptídeos isolados de acordo com as reivindicações 19 a 22, caracterizados por ser uma δ-endotoxina.
24. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.
25. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.
26. Célula transformada caracterizada pelo fato de conter um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.
27. Célula transformada de acordo com as reivindicações 24-26 caracterizada pelo fato da célula ser oriunda de qualquer um dos grupos consistindo de bactérias, fungos, insetos, mamíferos e vegetais.
28. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progénie da mesma caracterizada por compreender uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.
29. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progénie da mesma caracterizada por compreender um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.
30. Planta, ou uma parte, ou um propágulo ou progénie da mesma caracterizada pelo fato de possuir um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.
31. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.
32. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18.
33. Microorganismo, ou uma parte do mesmo caracterizado por compreender um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23.
34. Método para produzir um organismo geneticamente modificado caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8 ou um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18; b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;
c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b); d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo a construção gênica ou vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 18.
35. Método para produção de proteína recombinante caracterizado pelo fato de compreender as seguintes etapas:
a. transformar uma célula, tecido, órgão ou embrião com um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18;
b. selecionar células transformadas, calos de células, embriões ou sementes;
c. regenerar plantas maduras, embriões maduros ou microorganismos de células transformadas, calos de células, embriões ou sementes selecionados na etapa (b);
d. selecionar plantas maduras, embriões maduros ou células de microorganismos da etapa (c) contendo vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18;
e. Fazer a extração da proteína recombinante produzida nos organismos selecionados na etapa (d).
36. Proteína recombinante obtida através do método descrito na reivindicação 35.
37. Proteína recombinante de acordo com a reivindicação 36 caracterizada pelo fato da proteína ter atividade δ-endotoxina.
38. Composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender uma concentração eficaz do polipeptídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 19 a 23 ou análogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.
39. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação
38, caracterizada pelo fato de o veículo carreador aceitável ser um microorganismo transformado.
40. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação
39, caracterizada pelo fato de que um veículo carreador aceitável pode ser um agente superfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, um corante, um protetor uv (ultra-violeta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta.
41. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 38, caracterizada pelo fato de o polipeptídeo uma das reivindicações de 19 a 23 ou análogo mutante ser usado em combinação com outras proteínas inseticidas.
42. Método para o controle de uma praga caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente;
b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com uma composição da invenção, em que a referida proteína consiste das sequências selecionadas do grupo de sequências de aminoácidos descritas em SEQ ID N° 8-12.
43. Método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga, caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8 ou um vetor binário de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 18;
b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmente integrada em seus genomas;
c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δ-endotoxina da invenção.
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