BRPI0907050B1 - Método para detectar em um indivíduo a presença ou ausência de um ácido nucleico biomarcador predeterminado associado com câncer de próstata - Google Patents

Abstract

MÉTODOS PARA DETECTAR EM UM INDIVÍDUO A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM ÁCIDO NUCLEICO BIOMARCADOR ASSOCIADO COM GLIOBLASTOMA OU CÂNCER DE PRÓSTATA, PARA AUXILIAR NO DIAGNÓSTICO OU PROGNÓSTICO DE UMA DOENÇA OU OUTRA CONDIÇÃO MÉDICA EM UM INDIVÍDUO, PARA ISOLAR RNA E DNA DE MICROVESÍCULAS, PARA DETECTAR EM UM INDIVÍDUO A PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DNA EXTRACELULAR, PARA AUXILIAR NA AVALIAÇÃO DE ADEQUABILIDADE OU EFICÁCIA RELATIVA DE UMA TERAPIA ESPECÍFICA, E, KIT PARA A EXTRAÇÃO DE RNA E DNA MICROVESICULAR. A matéria objeto presentemente divulgada está direcionada aos métodos de auxiliar o diagnóstico, prognóstico, monitoramento e avaliação de uma doença ou outra condição médica em um paciente pela detecção de um biomarcador em microvesículas isoladas de uma amostra biológica do paciente. Além disso, a matéria objeto divulgada está direcionada a métodos de diagnóstico, monitoramento de uma doença pela determinação da concentração de microvesículas dentro de uma amostra biológica; métodos de liberar um ácido nucleico ou proteína a um alvo todos pela administração de microvesículas que contém o dito ácido nucleico ou proteína; métodos para realizar uma transfusão de fluido corporal pela introdução de uma fração isenta de microvesícula ou enriquecida com microvesícula em um paciente.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade para os pedidos provisórios US 61/025.536, depositado em 1 de fevereiro de 2008 e 61/100.293, depositado em 26 de setembro de 2008, cada um dos quais é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

SUPORTE GOVERNAMENTAL

[002] Esta invenção foi feita com suporte do Governo sob as concessões NCI CA86355 e NCI CA69246 outorgadas pelo National Cancer Institute. O Governo tem certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção diz respeito aos campos do diagnóstico médico, monitoramento de paciente, avaliação da eficácia de tratamento, liberação de ácido nucleico e proteína, e transfusão de sangue.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[004] Os glioblastomas são tumores cerebrais altamente malignos com um prognóstico deficiente a despeito de pesquisa e esforços clínicos intensivos (Louis et al., 2007). A natureza invasiva deste tumor torna a resseção cirúrgica completa impossível e o tempo de sobrevivência médio é de apenas cerca de 15 meses (Stupp et al., 2005). As células de glioblastoma assim como muitas outras células de tumor têm uma capacidade extraordinário para moldar o seu ambiente estrômico para a sua própria vantagem. As células de tumor diretamente alteram as células normais circundantes para facilitar o crescimento, invasão, quimio-resistência, imuno- evasão e metástase de célula de tumor (Mazzocca et al., 2005; Muerkoster et al., 2004; Singer et al., 2007). As células de tumor também sequestra a vasculatura normal e estimula a formação rápida de novos vasos sanguíneos para suprir o tumor com nutrição (Carmeliet e Jain, 2000). Embora o sistema imune possa inicialmente suprimir o crescimento de tumor, o mesmo é de modo frequente progressivamente enfraquecido pela ativação de tumor dos caminhos imunossupressivos (Gabrilovich, 2007).

[005] Pequenas microvesículas derramadas pelas células são conhecidas como exossomas (Thery et al., 2002). Os exossomas são relatados como tendo um diâmetro de aproximadamente 30 a 100 nm e são derramadas de muitos tipos de célula diferentes tanto sob condições normais quanto patológicas (Thery et al., 2002). Estas microvesículas foram primeiro descritas como um mecanismo para descartar receptores de transferrina a partir da superfície celular de reticulócitos maduros (Pan e Johnstone, 1983). Os exossomas são formados através da germinação para dentro de membranas endossômicas dando origem aos corpos multivesiculares intracelulares (MVB) que mais tarde fundem com a membrana plasmática, liberando os exossomas para o exterior (Thery et al., 2002). Entretanto, existe agora evidência quanto a uma liberação mais direta de exossomas. Certas células, tais como as células T Jurkat, são ditas derramar exossomas diretamente pela germinação para fora da membrana plasmática (Booth et al., 2006). Todas as vesículas de membrana derramadas pelas células são aqui aludidas coletivamente como microvesículas.

[006] As microvesículas em Drosophila melanogaster, chamadas argossomas, são ditas conter morfogênios tais como a proteína de Wingless e moverem-se em grandes distâncias através do disco imaginário do epitélio em desenvolvimento de embriões de Drosophila melanogaster (Greco et al., 2001). As microvesículas encontradas no sêmen, conhecidas como prostassomas, são estabelecidas ter uma ampla faixa de funções incluindo a promoção da motilidade do esperma, a estabilização da reação de acrossoma, a facilitação da imunossupressão e a inibição da angiogênese (Delves et al., 2007). Por outro lado, prostassomas dispensados pelas células prostáticas malignas são ditas promover a angiogênese. As microvesículas são ditas transferir proteínas (Mack et al., 2000) e estudos recentes estabelecem que as microvesículas isoladas de linhagens de célula diferentes também podem conter RNA mensageiro (mRNA) e microRNA (miRNA) e podem transferir mRNA para outros tipos de célula (Baj-Krzyworzeka et al., 2006; Valadi et al., 2007).

[007] As microvesículas derivadas de células B e células dendríticas são estabelecidas ter efeitos imuno-estimuladores e antitumor potentes in vivo e foram usados como vacinas de antitumor (Chaput et al., 2005). As microvesículas derivadas de células dendríticas são declaradas conter as proteínas co-estimulatórias necessárias para a ativação de célula T, ao passo que a maior parte das microvesículas derivadas de célula de tumor não (Wieckowski e Whiteside, 2006). As microvesículas isoladas de células de tumor podem atuar para suprimir a resposta imune e acelerar o crescimento do tumor (Clayton et al., 2007; Liu et al., 2006a). As microvesículas do câncer de mama podem estimular a angiogênese, e as microvesículas derivadas de plaqueta pode promover a progressão de tumor e metástase de células de câncer pulmonar (Janowska-Wieczorek et al., 2005; Millimaggi et al., 2007).

[008] Cânceres surgem através do acúmulo de alterações genéticas que promovem o crescimento de célula ilimitadas. Foi estabelecido que cada tumor abriga, em média, em torno de 50 a 80 mutações que estão ausentes em células que não de tumor (Jones et al., 2008; Parsons et al., 2008; Wood et al., 2007). As técnicas para detectar estes perfis de mutação incluem a análise de amostras de biópsia e a análise não invasiva de fragmentos de DNA de tumor mutante que circula em fluidos corporais tais como o sangue (Diehl et al., 2008). O primeiro método é invasivo, complicado e possivelmente nocivo aos pacientes. O último método inerentemente carece de sensibilidade devido ao número de cópia extremamente baixo de DNA de câncer mutante em fluido corporal (Gormally et al., 2007). Portanto, um desafio que enfrenta o diagnóstico do câncer é desenvolver um método de diagnóstico que possa detectar células de tumor em estágios diferentes de modo não invasivo, embora com alta sensibilidade e especificidade. Também foi estabelecido que os perfis de expressão de gene (que codificam mRNA ou microRNA) podem distinguir tecido canceroso e não canceroso (Jones et al., 2008; Parsons et al., 2008; Schetter et al., 2008). Entretanto, técnicas de diagnóstico correntes para detectar os perfis de expressão de gene requerem biópsia intrusiva de tecidos. Alguns procedimentos de biópsia causam risco alto e são potencialmente nocivos. Além disso, em um procedimento de biópsia, as amostras de tecido são tiradas de uma área limitada e podem dar origem a falsos positivos ou falsos negativos, especialmente em tumores que são heterogêneos e/ou dispersos dentro do tecido normal. Portanto, um método de diagnóstico não intrusivo e sensível para detectar biomarcadores seria altamente desejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] No geral, a invenção é um novo método para detectar em um paciente a presença ou ausência de uma variedade de biomarcadores contidos em microvesículas, ajudando deste modo o diagnóstico, monitoramento e avaliação de doenças, outras condições médicas, e eficácia de tratamento associadas com biomarcadores de microvesícula.

[010] Um aspecto da invenção são métodos para ajudar no diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou outra condição médica em um paciente, que compreende as etapas de: a) isolar uma fração de microvesícula de uma amostra biológica do paciente; e b) detectar a presença ou ausência de um biomarcador dentro da fração de microvesícula, em que o biomarcador está associado com a doença ou outra condição médica. Os métodos podem compreender ainda a etapa ou etapas de comparar o resultado da etapa de detecção com um controle (por exemplo, comparando a quantidade de um ou mais biomarcadores detectados na amostra com um ou mais níveis de controle), em que o paciente é diagnosticado como tendo a doença ou outra condição médica (por exemplo, câncer) se houver uma diferença mensurável no resultado da etapa de detecção quando comparado a um controle.

[011] Um outro aspecto da invenção é um método para ajudar na avaliação de eficácia de tratamento em um paciente, que compreende as etapas de: a) isolar uma fração de microvesícula de uma amostra biológica do paciente; e b) detectar a presença ou ausência de um biomarcador dentro da fração de microvesícula, em que o biomarcador está associado com a eficácia de tratamento para uma doença ou outra condição médica. O método pode compreender ainda a etapa de fornecer uma série de uma amostras biológicas em um período de tempo do paciente. Adicionalmente, o método pode compreender ainda a etapa ou etapas de determinar qualquer mudança mensurável nos resultados da etapa de detecção (por exemplo, a quantidade de um ou mais biomarcadores detectados) em cada uma das amostras biológicas da série para avaliar deste modo a eficácia de tratamento para a doença ou outra condição médica.

[012] Em certas formas de realização preferidas dos aspectos precedentes da invenção, a amostra biológica do paciente é uma amostra de fluido corporal. Os fluidos corporais particularmente preferidos são sangue e urina.

[013] Em certas formas de realização preferidas dos aspectos precedentes da invenção, os métodos compreendem ainda a isolação de uma fração seletiva de microvesícula derivada de células de um tipo específico (por exemplo, células cancerosas ou de tumor). Adicionalmente, a fração seletiva de microvesícula pode consistir essencialmente de microvesículas urinárias.

[014] Em certas formas de realização dos aspectos precedentes da invenção, o biomarcador associado com uma doença ou outra condição médica é i) uma espécie de ácido nucleico; ii) um nível de expressão de um ou mais ácidos nucleicos; iii) uma variante de ácido nucleico; ou iv) uma combinação de qualquer um dos precedentes. As formas de realização preferidas de tais biomarcadores incluem RNA mensageiro, microRNA, DNA, DNA de filamento único, DNA complementar e DNA não codificador.

[015] Em certas formas de realização dos aspectos precedentes da invenção, a doença ou outra condição médica é uma doença ou condição neoplástica (por exemplo, glioblastoma, câncer pancreático, câncer mamário, melanoma e câncer colorretal), uma doença ou condição metabólica (por exemplo, diabete, inflamação, condições perinatais ou uma doença ou condição associadas com o metabolismo do ferro), uma condição pós- transplante, ou uma condição fetal.

[016] Um outro aspecto da invenção é um método para ajudar no diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou outra condição médica em um paciente, que compreende as etapas de a) obter uma amostra biológica do paciente; e b) determinar a concentração de microvesículas dentro da amostra biológica.

[017] Ainda um outro aspecto desta invenção é um método para liberar um ácido nucleico ou proteína a uma célula alvo em um indivíduo que compreende as etapas de administrar microvesículas que contenham o ácido nucleico ou proteína, ou uma ou mais células que produzam tais microvesículas, ao indivíduo tal que as microvesículas entrem na célula alvo do indivíduo. Em uma forma de realização preferida deste aspecto da invenção, as microvesículas são dispensadas às células cerebrais.

[018] Um outro aspecto desta invenção é um método para realizar a transfusão de fluido corporal (por exemplo, sangue, soro ou plasma), que compreende as etapas de obter uma fração de fluido corporal do doador isenta de todas ou substancialmente todas as microvesículas, ou livre de todas ou substancialmente todas microvesículas de um tipo de célula particular (por exemplo, células de tumor), e introduzir a fração isenta de microvesícula em um paciente. Um aspecto relacionado desta invenção é uma composição de matéria que compreende uma amostra de fluido corporal (por exemplo, sangue, soro ou plasma) isenta de todas ou substancialmente todas microvesículas, ou isenta de todas ou substancialmente todas microvesículas de um tipo de célula particular.

[019] Um outro aspecto desta invenção é um método para realizar a transfusão de fluido corporal (por exemplo, sangue, soro ou plasma), que compreende as etapas de obter uma fração enriquecida em microvesícula de fluido corporal do doador e introduzir a fração enriquecida em microvesícula em um paciente. Em uma forma de realização preferida, a fração é enriquecida com microvesículas derivadas de um tipo de célula particular. Um aspecto relacionado desta invenção é uma composição de matéria que compreende uma amostra de fluido corporal (por exemplo, sangue, soro ou plasma) enriquecida com microvesículas.

[020] Um outro aspecto desta invenção é um método para ajudar na identificação de novos biomarcadores associados com uma doença ou outra condição médica, que compreende as etapas de obter uma amostra biológica de um paciente; isolar uma fração de microvesícula da amostra; e detectar dentro da fração de microvesícula espécies de ácido nucleico; seus respectivos níveis de expressão ou concentrações; variantes de ácido nucleico; ou combinações dos mesmos.

[021] Vários aspectos e formas de realização da invenção serão agora descritos em detalhes. Será avaliado que a modificação dos detalhes pode ser feita sem divergir do escopo da invenção. Além disso, a mesmo que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares devem incluir as pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular.

[022] Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações identificadas são aqui expressamente incorporados por referência com o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, as metodologias descritas em tais publicações que poderiam ser usadas em conexão com a presente invenção. Estas publicações são fornecidas unicamente para a sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido. Nada a este respeito deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não são autorizados para antedatar tal divulgação em virtude da invenção anterior ou por qualquer outra razão. Todas as afirmações como em relação às datas ou representações como para os conteúdos destes documentos são fundamentadas na informação disponível para os requerentes e não constituem nenhuma admissão quanto à exatidão das datas ou conteúdos destes documentos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[023] FIGURA 1. As células de glioblastoma produzem microvesículas contendo RNA. (a) Imagem da microscopia eletrônica de varredura de uma célula de glioblastoma primária (barra = 10 μm). (b) Ampliação mais alta mostrando as microvesículas na superfície celular. As vesículas variam no tamanho com diâmetros em torno de 50 nm e em torno de 500 nm (barra = 1 μm). (c) Gráfico mostrando a quantidade de RNA total extraído de microvesículas que foram tratadas ou não tratadas com RNase A. As quantidades são indicadas como a absorção (Abs, eixo y) de 260 nm de comprimento de onda (eixo x). Os experimentos foram repetidos 5 vezes e um gráfico representativo é mostrado. (d) Dados de bioanalisador mostrando a distribuição de tamanho de RNA total extraído de células de glioblastoma primárias e (e) Dados de bioanalisador mostrando a distribuição de tamanho de RNA total extraído de microvesículas isoladas de células de glioblastoma primárias. O pico de 25 nt representa um padrão interno. Os dois picos proeminentes em (d) (setas) representam os RNAs ribossômicos 18S (seta à esquerda) e 28S (seta à direita). Os picos ribossômicos estão ausentes do RNA extraído das microvesículas (e). (f) Imagem de microscopia eletrônica de transmissão de microvesículas secretadas pelas células de glioblastoma primárias (barra = 100 nm).

[024] FIGURA 2. Análise de RNA de microvesícula. As FIGS. 2 (a) e 2 (b) são plotagens dispersas de níveis de mRNA em microvesículas e níveis de mRNA em células de glioblastoma doadoras de dois experimentos diferentes. As regressões lineares mostram que os níveis de mRNA em células doadoras versus microvesículas não foram bem correlacionadas. As FIGS. 2 (c) e 2 (d) são níveis de mRNA em duas células doadoras diferentes ou duas preparações de microvesícula diferentes. Ao contrário das FIGS. 2 (a) e 2 (b), as regressões lineares mostram que os níveis de mRNA entre as células doadoras FIG 2 (c) ou entre microvesículas FIG 2 (d) foram intimamente correlacionadas.

[025] FIGURA 3. Análise de DNA de microvesícula. a) A amplificação do gene GAPDH com padrões de DNA a partir de exossomas tratados com DNase antes da extração de ácido nucleico. As linhas são identificadas como segue: 1. 100bp MW ladder 2. Controle negativo 3. Controle de DNA genômico de células GBM 20/3 4. DNA de exossomas séricos normais (controle isento de célula de tumor) 5. DNA exossômico de fibroblastos humanos normais (NHF19) 6. DNA exossômico de células de meduloblastoma primário (D425) b) Amplificação de gene GAPDH com padrões de DNA de exossomas sem tratamento com DNase anterior. As linhas são identificadas como segue: 1. 100bp MW ladder 2. DNA de célula de melanoma primário 0105 3. DNA exossômico de melanoma 0105 4. Controle Negativo 5. cDNA de GBM 20/3 primário (controle positivo) c) Amplificação de gene K de retrovírus endógeno humano. As linhas são identificadas como segue: 1. 100 bp MW ladder 2. DNA exossômico de meduloblastoma D425 a 3. DNA exossômico de meduloblastoma D425 b 4. DNA exossômico de fibroblastos humanos normais (NHF19) 5. DNA exossômico de soro humano normal 6. DNA genômico de GBM 20/3. 7. Controle Negativo d) Amplificação de gene da Tenascina C. As linhas são identificadas como segue: 1. 100bp MW ladder 2. Exossomas de fibroblastos humanos normais (NHF19) 3. Exossomas de soro (indivíduo A isento de célula de tumor) 4. Exossomas de soro (indivíduo B isento de célula de tumor) 5. Exossomas de célula de meduloblastoma primária D425 e) Amplificação de elemento da Linha Transponível 1. As linhas são identificadas como segue: 1. 100bp MW ladder. 2. DNA exossômico de soro humano normal. 3. DNA exossômico de fibroblastos humanos normais 4. DNA exossômico de meduloblastoma D425 a 5. DNA exossômico de meduloblastoma D425 b f) O DNA está presente em exossomas de célula de meduloblastoma D425. As linhas são identificadas como segue: 1. Marcador de 100 bp 2. D425 nenhuma DNase 3. D425 com DNase 4. Marcador de 1 kb g) Análise de ácido nucleico de filamento único usando um chip de pico de RNA. Painel superior: o DNA purificado não foi tratado com DNase; painel inferior: o DNA purificado foi tratado com DNase. A seta no painel superior refere-se aos ácidos nucleicos detectados. O pico em 25 nt é um padrão interno. h) Análise de ácidos nucleicos contidos em exossomas de meduloblastoma primário D425. Painel superior: ácidos nucleicos de filamento único detectados por um chip de pico de RNA. Painel inferior: ácidos nucleicos de filamento duplo detectados por 1000 chips de DNA. A seta no painel superior refere-se aos ácidos nucleicos detectados. Os dois picos (15 e 1500 bp) são padrões internos. i) Análise de DNA exossômico de origens diferentes usando um chip de pico de RNA. Painel superior: O DNA foi extraído de exossomas de células de glioblastoma. Painel inferior: O DNA foi extraído de exossomas de fibroblastos humanos normais.

[026] FIGURA 4. A extração de RNA extracelular de soro é mais eficiente quando uma etapa de isolação de exossoma sérico é incluída. a) RNA de exossoma do soro. b) Extração do soro integral direta. c) Reservatório vazio. As setas referem-se ao RNA detectado nas amostras.

[027] FIGURA 5. Comparação dos níveis de expressão de gene entre microvesículas e células de origem. 3426 genes foram descobertos serem mais do que 5 vezes diferencialmente distribuídos nas microvesículas quando comparadas com as células a partir das quais as mesmas foram derivadas (valor p <0,01).

[028] FIGURA 6. Análise ontológica de RNAs microvesiculares. (a) O diagrama de torta demonstra a ontologia de processo biológico das 500 espécies de mRNA mais abundantes nas microvesículas. (b) Gráfico mostrando a intensidade de RNAs de microvesícula pertencentes às ontologias relacionadas com o crescimento do tumor. O eixo x representa o número de transcritos de mRNA presentes na ontologia. Os níveis de intensidade média nos arranjos foram 182.

[029] FIGURA 7. Diagrama de grupo de níveis de mRNA. Os dados de microarranjo nos perfis de expressão de mRNA em linhagens de célula e exossomas isolados do meio de cultura destas linhagens de célula foram analisados e grupos de perfis de expressão foram gerados. Os rótulos das espécies de RNA são como segue: 20/3C-1: Glioblastoma 20/3 RNA Celular, réplica de arranjo 1 20/3C-2: Glioblastoma 20/3 RNA Celular, réplica de arranjo 2 11/5C: Glioblastoma 11/5 RNA Celular 0105C: Melanoma 0105 RNA Celular 0664C: Melanoma 0664 RNA Celular 0664 E-1: Melanoma 0664 RNA exossômico, réplica de arranjo 1 0664 E-2: Melanoma 0664 RNA exossômico, réplica de arranjo 2 0105E: Melanoma 0105 RNA exossômico 20/3E: Glioblastoma 20/3 RNA exossômico 11/5E-1: Glioblastoma 11/5 Exossomas, réplica de arranjo 1 11/5E-2: Glioblastoma 11/5 Exossomas, réplica de arranjo 2 GBM: glioblastoma. A escala refere-se à distância entre os grupos.

[030] FIGURA 8. Microvesículas de soro contêm microRNAs. Os níveis de miRNAs maduros extraídos de microvesículas e de células de glioblastoma de dois pacientes diferentes (GBM1 e GBM2) foram analisados usando RT-PCR de miRNA quantitativa. O valor de limiar de ciclo (Ct) é apresentado como a média ± SEM (n = 4).

[031] FIGURA 9. Diagrama de grupos de níveis de microRNA. Os dados de microarranjo nos perfis de expressão de microRNA em linhagens de célula e exossomas isolados do meio de cultura destas linhagens de célula foram analisados e grupos de perfis de expressão foram gerados. Os rótulos das espécies de RNA são como segue: 0664C-1: Melanoma 0664 RNA Celular, réplica de arranjo 1 0664C-2: Melanoma 0664 RNA Celular, réplica de arranjo 2 0105C-1: Melanoma 0105 RNA Celular, réplica de arranjo 1 0105C-2: Melanoma 0105 RNA Celular, réplica de arranjo 2 20/3C-1: Glioblastoma 20/3 RNA Celular, réplica de arranjo 1 20/3C-2: Glioblastoma 20/3 RNA Celular, réplica de arranjo 2 11/5C-1: Glioblastoma 11/5 RNA Celular, réplica de arranjo 1 11/5C-2: Glioblastoma 11/5 RNA Celular, réplica de arranjo 2 11/5E-1: Glioblastoma 11/5 Exossomas, réplica de arranjo 1 11/5E-2: Glioblastoma 11/5 Exossomas, réplica de arranjo 2 20/3E-1: Glioblastoma 20/3 RNA exossômico, réplica de arranjo 1 20/3E-2: Glioblastoma 20/3 RNA exossômico, réplica de arranjo 2 0664 E: Melanoma 0664 RNA exossômico 0105E-1: Melanoma 0105 RNA exossômico, réplica de arranjo 1 0105E-2: Melanoma 0105 RNA exossômico, réplica de arranjo 2 GBM: Glioblastoma. A escala refere-se à distância entre grupos.

[032] FIGURA 10. O nível de expressão de microRNA-21 em microvesículas séricas está associado com glioma. É mostrado um gráfico de barra, soro de controle normal na esquerda, soro de glioma na direita. A RT-PCR quantitativa foi usada para medir os níveis de microRNA-21 (miR- 21) em exossomas de soro de pacientes com glioblastoma assim como controles de paciente normal. O soro de glioblastoma mostrou uma redução de 5,4 do valor Ct, correspondente a um aumento de aproximadamente 40 (2ΔCt)-vezes de miR21. Os níveis de miR21 foram normalizados para GAPDH em cada amostra (n = 3).

[033] FIGURA 11. A RT-PCR abrigada foi usada para detectar mRNA de EGFRvIII em amostras de tumor e exossomas séricos correspondentes. O produto de EGFR PCR do tipo selvagem aparece como uma faixa em 1153 bp e o produto de EGFRvIII PCR aparece como uma faixa a 352 bp. A RT PCR de mRNA de GAPDH foi incluída como um controle positivo (226 bp). As amostras consideradas como positivas para EGFRvIII são indicadas com um asterisco. Os pacientes 11, 12 e 14 mostraram apenas uma amplificação fraca de EGFRvIII na amostra de tumor, mas foi evidente quando mais amostras foram carregadas.

[034] FIGURA 12. A RT PCR abrigada de EGFRvIII foi realizada em microvesículas de 52 soros de controle normais. EGFRvIII (352 bp) nunca foi encontrado nos soros de controle normais. A PCR de GAPDH (226 bp) foi incluída como um controle.

[035] FIGURA 13. O mRNA de Hepcidina pode ser detectado dentro dos exossomas de soro humano. A) Pseudo-gel gerado por um Bioanalisador Agilent. B) Plotagem bruta gerada por um Bioanalisador Agilent para o controle positivo (Amostra 1). C) Plotagem bruta gerada por um Bioanalisador Agilent para o Controle Negativo (Amostra 2). D) Plotagem bruta gerada por um Bioanalisador Agilent para os exossomas (Amostra 3).

[036] FIGURA 14. Isolação de exossoma urinário e identificação de ácido nucleico dentro de exossomas urinários. (a) Imagem de microscopia eletrônica de um corpo multivesicular (MVB) contendo muitos pequenos “exossomas” em uma célula de túbulo renal. (b) A imagem de microscopia eletrônica de exossomas urinários isolados. (c) Análise de transcritos de RNA contidos dentro de exossomas urinários por um Bioanalisador Agilent. Um ampla faixa de espécies de RNA foram identificadas mas os RNAs ribossômicos tanto 18S quanto 28S foram ausentes. (d) Identificação de vários transcritos de RNA em exomas urinários pela PCR. Os transcritos assim identificados foram: Aquaporina 1 (AQP1); Aquaporina 2 (AQP2); Cubulina (CUBN); Megalina (LRP2); Receptor de Vasopressina de Arginina 2 (AVPR2); Trocador de Sódio/Hidrogênio 3 (SLC9A3); V-ATPase subunidade B1 (ATP6V1B1); Nefrina (NPHS1); Podocina (NPHS2); e Canal de Cloreto 3 (CLCN3). Do topo para o fundo, as cinco faixas na linha de peso molecular (MW) corresponde a fragmentos de 1000, 850, 650, 500, 400, 300 pares de base. (e) Diagramas de bioanalisador de ácidos nucleicos exossômicos de amostras de urina. Os números referem- se à numeração de indivíduos humanos. (f) Pseudogéis que representam produtos de PCR gerados com pares de iniciador diferentes usando os extratos de ácido nucleico descritos em (e). Alojamento refere-se ao gene da actina e os iniciadores da actina foram da Ambion (TX, USA). O controle +ve refere- se às PCRs usando cDNA de rim humano da Ambion (TX, USA) como padrões e o controle -ve refere-se às PCRs sem padrões de ácido nucleico. (g) O quadro de pseudo-gel mostrando a identificação positiva de cDNA do gene da actina via PCR com e sem o tratamento de DNase de exossomas antes da extração com ácido nucleico. (h) Diagramas de bioanalisador mostrando a quantidade de ácidos nucleicos isolados a partir de exomas urinários humanos.

[037] FIGURA 15. Análise de biomarcadores de câncer da próstata em exomas urinários. (a) Quadros de gel mostrando produtos de PCR do gene TMPRSS2-ERG e fragmentos digeridos dos produtos de PCR. P1 e P2 referem-se às amostras de urina do paciente 1 e paciente 2, respectivamente. Para cada amostra, o produto não digerido está na linha esquerda e o produto digerido está na linha direita. MWM indica linhas com marcadores de MW. Os tamanhos das faixas (tanto não digeridos quanto digeridos) são indicados na direita do painel. (b) Quadros de gel mostrando produtos de PCR do gene PCA3 e fragmentos digeridos dos produtos de PCR. P1, P2, P3 e P4 referem-se às amostras de urina do paciente 1, paciente 2, paciente 3 e paciente 4, respectivamente. Para cada amostra, o produto não digerido está na linha esquerda e o produto digerido está na linha direita. MWM indica linhas com marcadores de MW. Os tamanhos das faixas (tanto não digerido quanto digerido) são indicados na direita do painel. (c) Um sumário da informação dos pacientes e os dados apresentados em (a) e (b). TMERG refere-se ao gene da fusão TMPRSS2-ERG.

[038] FIGURA 16. mRNA BRAF está contido dentro das microvesículas derramadas pelas células de melanoma. (a) Um quadro de gel de eletroforese mostrando produtos de RT-PCR da amplificação do gene BRAF. (b) Um quadro de gel de eletroforese mostrando produtos de RT-PCR da amplificação do gene GAPDH. As linhas e as suas amostras correspondentes são como segue: Linhagem #1 - Marcador de Peso Molecular de 100 bp; Linhagem #2-YUMEL-01-06 exo; Linhagem # 3 - célula YUMEL-01-06; Linhagem # 4 YUMEL-06-64 exo; Linhagem # 5. Célula YUMEL-06-64; Linhagem # 6. M34 exo; Linhagem # 7 - célula M34; Linhagem # 8 - célula de Fibroblasto; Linhagem # 9-Controle Negativo. O termo de referência “exo” significa que o RNA foi extraído de exossomas no meio de cultura. O termo de referência “célula” significa que o RNA foi extraído das células cultivadas. Os números a seguir de YUMEL refere-se à identificação de um lote específico da linhagem de célula YUMEL. (c) Resultados de sequenciamento de produtos de PCR de YUMEL-01-06 exo. Os resultados de YUMEL-01-06 célula, YUMEL-06-64 exo e YUMEL-06-64 célula são os mesmos como aqueles de YUMEL-01-06 exo. (d) os resultados de sequenciamento de produtos de PCR de M34 exo. Os resultados de célula M34 são os mesmos como aqueles de M34 exo.

[039] FIGURA 17. Microvesículas de glioblastoma pode liberar RNA funcional às HBMVECs. (a) As microvesículas purificadas foram rotuladas com corante de membrana PKH67 (verde) e adicionadas às HBMVECs. As microvesículas foram internalizadas dentro de estruturas equivalentes a endossoma dentro de uma hora. (b) As microvesículas foram isoladas das células de glioblastoma que expressam estavelmente Gluc. A extração de RNA e RT-PCR de mRNAs Gluc e GAPDH mostrados que foram incorporados em microvesículas. (c) As microvesículas foram depois adicionados às HBMVECs e incubadas por 24 horas. A atividade de Gluc foi medida no meio a 0, 15 e 24 horas depois da adição das microvesícula e normalizadas para a atividade de Gluc nas microvesículas. Os resultados são apresentados como a média ± SEM (n = 4).

[040] FIGURA 18. As microvesículas de glioblastoma estimulam a angiogênese in vitro e contêm proteínas angiogênicas. (a) HBMVECs foram cultivadas em Matrigel® em meio basal (EBM) sozinho, ou suplementado com microvesículas GBM (EBM+MV) ou fatores angiogênicos (EGM). A formação de túbulo foi medida depois de 16 horas como comprimento de túbulo médio ± SEM comparado com as células cultivadas em EBM (n = 6). (b) A proteína total das células de glioblastoma primárias e microvesículas (MV) destas células (1 mg cada uma) foram analisadas em um arranjo de anticorpo da angiogênese humana. (c) Os arranjos foram escaneados e as intensidades analisadas com o software Image J (n = 4).

[041] FIGURA 19. Microvesículas isolada de células de glioblastoma primárias promovem a proliferação da linhagem de célula de glioblastoma U87. 100.000 células U87 foram semeadas em reservatórios de uma placa de 24 reservatórios e deixadas cultivar por três dias em (a) meio de crescimento normal (DMEM-5% de FBS) ou (b) meio de crescimento normal suplementado com 125 μg de microvesículas. (c) Depois de três dias, as células não suplementadas foram expandidas para 480.000 células, ao passo que as células suplementadas com microvesícula foram expandidas a 810.000 células. NC refere-se às células cultivadas em meio de controle normal e MV refere-se às células cultivadas em meio suplementado com microvesículas. O resultado é apresentado como a média ± SEM (n = 6).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[042] As microvesículas são derramadas pelas células eucarióticas, ou germinadas para fora da membrana plasmática, para o exterior da célula. Estas vesículas de membrana são heterogêneos no tamanho com diâmetros variando de cerca de 10 nm a cerca de 5000 nm. As microvesículas pequenas (aproximadamente 10 a 1000 nm, e mais frequentemente 30 a 200 nm no diâmetro) que são dispensadas pela exocitose de corpos multivesiculares intracelulares são aludidos na técnica como “exossomas”. Os métodos e composições aqui descritos são igualmente aplicáveis às microvesículas de todos os tamanhos; preferivelmente de 30 a 800 nm; e mais preferivelmente de 30 a 200 nm.

[043] Em algumas das literaturas, o termo “exossoma” também refere-se aos complexos de proteína contendo exorribonucleases que estão envolvidas na degradação de mRNA e no processamento de RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs), RNAs nucleares pequenos (snRNAs) e RNAs ribossômicos (rRNA) (Liu et al., 2006b; van Dijk et al., 2007). Tais complexos de proteína não têm membranas e não são “microvesículas” ou “exossomas” como estes termos são aqui usados.

Exossomas Como Ferramentas de Diagnóstico E/Ou Prognóstico

[044] Certos aspectos da presente invenção são fundamentados na surpreendente descoberta de que microvesículas derivadas de glioblastoma podem ser isoladas do soro de pacientes com glioblastoma. Esta é a primeira descoberta de microvesículas derivadas de células no cérebro, presentes em um fluido corporal de um paciente. Antes desta descoberta não se sabia se as células de glioblastoma produziam microvesículas ou se tais microvesículas cruzariam a barreira hematoencefálica para dentro do resto do corpo. Estas microvesículas foram descobertas conter mRNA mutante associado com células de tumor. As microvesículas também contiveram microRNAs (miRNAs) que foram descobertas serem abundantes em glioblastomas. As microvesículas derivadas de glioblastoma também foram descobertas promover potencialmente características angiogênicas em células endoteliais microvasculares do cérebro humano primárias (HBMVEC) em cultura. Este efeito angiogênico foi mediado pelo menos em parte através de proteínas angiogênicas presentes nas microvesículas. Os ácidos nucleicos encontrados dentro destas microvesículas, assim como outros conteúdos das microvesículas tais como proteínas angiogênicas, podem ser usados como biomarcadores valiosos para o diagnóstico de tumor, caracterização e prognóstico pelo fornecimento de um perfil genético. Os conteúdos dentro destas microvesículas também podem ser usados para monitorar a progressão de tumor com o tempo analisando-se se outras mutações são adquiridas durante a progressão do tumor assim como se os níveis de certas mutações estão se tornando aumentadas ou diminuídas com o tempo ou em um curso de tratamento.

[045] Certos aspectos da presente invenção são fundamentados na descoberta de que as microvesículas são secretadas pelas células de tumor e circulantes em fluidos corporais. O número de microvesículas aumenta conforme o tumor cresce. A concentração das microvesículas nos fluidos corporais é proporcional à carga tumoral correspondente. Quanto maior a carga tumoral, maior a concentração de microvesículas nos fluidos corporais.

[046] Certos aspectos da presente invenção são fundamentados em uma outra descoberta surpreendente de que a maior parte dos RNAs extracelulares no fluido corporal de um paciente está contido dentro das microvesículas e assim protegidos da degradação pelas ribonucleases. Como mostrado no Exemplo 3, mais do que 90% do RNA extracelular no soro total pode ser recuperado em microvesículas.

[047] Um aspecto da presente invenção diz respeito aos métodos para detectar, diagnosticar, monitorar, tratar ou avaliar uma doença ou outra condição médica em um paciente pela determinação da concentração de microvesículas em uma amostra biológica. A determinação pode ser realizada usando a amostra biológica sem primeiro isolar as microvesículas ou isolando-se as microvesículas primeiro.

[048] Um outro aspecto da presente invenção diz respeito aos métodos para detectar, diagnosticar, monitorar, tratar ou avaliar uma doença ou outra condição médica em um paciente que compreende as etapas de, isolar exossomas de um fluido corporal de um paciente, e analisar um ou mais ácidos nucleicos contidos dentro dos exossomas. Os ácidos nucleicos são analisados qualitativa e/ou quantitativamente, e os resultados são comparados com os resultados esperados ou obtidos para um ou mais outros pacientes que têm ou não a doença ou outra condição médica. A presença de uma diferença no teor de ácido nucleico microvesicular do paciente, quando comparado com aquele de um ou mais outros indivíduos, pode indicar a presença ou ausência da progressão de (por exemplo, mudanças de tamanho de tumor e malignidade de tumor), ou a susceptibilidade para uma doença ou outra condição médica no paciente.

[049] De fato, os métodos e técnicas de isolação aqui descritos fornecem as seguintes vantagens antes não realizadas: 1) a oportunidade de seletivamente analisar ácidos nucleicos específicos de doença ou tumor, que pode ser realizada isolando-se microvesículas específicas de doença ou tumor separadamente de outras microvesículas dentro da amostra fluida; 2) rendimento significantemente mais alto de espécies de ácido nucleico com integridade de sequência mais alta quando comparado com o rendimento/integridade obtidos extraindo-se ácidos nucleicos diretamente da amostra fluida; 3) escalabilidade, por exemplo para detectar ácidos nucleicos expressados em níveis baixos, a sensibilidade pode ser aumentada pelotizando-se mais microvesículas de um volume maior de soro; 4) ácidos nucleicos mais puros em que proteína e lipídeos, fragmentos de células mortas, e outros contaminantes potenciais e inibidores de PCR são excluídos das pelotas de microvesícula antes da etapa de extração de ácido nucleico; e 5) mais escolhas em métodos de extração de ácido nucleico visto que as pelotas de microvesícula são de volume muito menor do que aquelas do soro de partida, tornando-as possíveis extrair ácidos nucleicos destas pelotas de microvesícula usando filtros de coluna de volume pequeno.

[050] As microvesículas são preferivelmente isoladas de uma amostra tirada de um fluido corporal de um paciente. Como aqui usado, um “fluido corporal” refere-se a uma amostra de fluido isolada de qualquer lugar no corpo do paciente, preferivelmente um local periférico, incluindo mas não limitado, por exemplo, a sangue, plasma, soro, urina, catarro, fluido espinal, fluido pleural, aspirados de mamilo, fluido linfático, fluido dos tratos respiratório, intestinal e genitourinário, fluido de lágrima, saliva, leite de mama, fluido do sistema linfático, sêmen, fluido cerebroespinhal, fluido de sistema intra-órgão, fluido ascítico, fluido cístico de tumor, fluido amniótico e combinações dos mesmos.

[051] O termo “paciente” é intencionado a incluir todos os animais mostrados ou esperados ter microvesículas. Em formas de realização particulares, o paciente é um mamífero, um ser humano ou primata não humano, um cão, um gato, um cavalo, um bovino, outros animais de fazenda, ou um roedor (por exemplo camundongos, ratos, porquinho da Índia. etc.). O termo “paciente” e “indivíduo” são aqui usados intercambiavelmente.

[052] Os métodos de isolar microvesículas de uma amostra biológica são conhecidos na técnica. Por exemplo, um método de centrifugação diferencial é descrito em um documento por Raposo et al. (Raposo et al., 1996), e métodos similares são detalhados na seção Exemplos aqui. Os métodos de cromatografia de troca aniônica e/ou permeação em gel são descritos nas Patentes US Nos 6.899.863 e 6.812.023. Os métodos de gradientes de densidade de sacarose ou eletroforese de organela são descritos na Patente U.S. No 7.198.923. Um método de classificação de célula ativada magnético (MACS) é descrito em (Taylor e Gercel-Taylor, 2008). Um método de concentrador de ultrafiltração de nanomembrana é descrito em (Cheruvanky et al., 2007). Preferivelmente, as microvesículas podem ser identificadas e isoladas a partir do fluido corporal de um paciente por uma tecnologia de microchip recém desenvolvida que usa uma plataforma microfluídica única para separar eficiente e seletivamente microvesículas derivadas de tumor. Esta tecnologia, como descrita em um documento por Nagrath et al. (Nagrath et al., 2007), pode ser adaptada para identificar e separar microvesículas usando princípios similares de captura e separação como divulgado no documento. Cada uma das referências precedentes é aqui incorporada por referência quanto a sua divulgação destes métodos.

[053] Em uma forma de realização, as microvesículas isoladas de um fluido corporal são enriquecidas por aquelas que se originam de um tipo específico de célula, por exemplo, células do pulmão, pâncreas, estômago, intestino, bexiga, rim, ovário, testículo, pele, colorretal, mama, próstata, cérebro, esôfago, fígado, placenta, feto. Porque as microvesículas frequentemente carregam moléculas de superfície tais como antígenos das suas células doadoras, as moléculas de superfície podem ser usadas para identificar, isolar e/ou enriquecer as microvesículas a partir de um tipo de célula doadoras específica (Al-Nedawi et al., 2008; Taylor e Gercel-Taylor, 2008). Deste modo, as microvesículas que se originam de populações de célula distintas podem ser analisadas quanto ao seu teor de ácido nucleico. Por exemplo, as microvesículas de tumor (maligno e não maligno) carregam antígenos de superfície associados com tumor e podem ser detectados, isolados e/ou enriquecidos por intermédio destes antígenos de superfície associados a tumor específicos. Em um exemplo, o antígeno de superfície é molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM), que é específico para as microvesículas de carcinomas de origem pulmonar, colorretal, mamária, prostática, da cabeça e pescoço, e hepática, mas não de origem de célula hematológica (Balzar et al., 1999; Went et al., 2004). Em um outro exemplo, o antígeno de superfície é CD24, que é uma glicoproteína específica para microvesículas urina (Keller et al., 2007). Já em um outro exemplo, o antígeno de superfície é selecionado de um grupo de moléculas CD70, antígeno carcinoembrionário (CEA), EGFR, EGFRvIII e outras variantes, ligando Fas, TRAIL, receptor de tranferrina, p38.5, p97 e HSP72. Adicionalmente, as microvesículas específicas de tumor podem ser caracterizadas pela falta de marcadores de superfície, tais como CD80 e CD86.

[054] A isolação de microvesículas a partir de tipos de célula específicos pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de anticorpos, aptâmeros, análogos de aptâmero ou polímeros molecularmente impressos específico para um antígeno de superfície desejado. Em uma forma de realização, o antígeno de superfície é específico para um tipo de câncer. Em uma outra forma de realização, o antígeno de superfície é específico para um tipo de célula que não é necessariamente canceroso. Um exemplo de um método de separação de microvesícula com base no antígeno de superfície celular é fornecido na Patente U.S. No 7.198.923. Como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos 5.840.867 e 5.582.981, WO/2003/050290 e uma publicação por Johnson et al. (Johnson et al., 2008), aptâmeros e seus análogos especificamente ligam moléculas de superfície e podem ser usadas como uma ferramenta de separação para recuperar microvesículas específicas do tipo de célula. Os polímeros molecularmente impressos também especificamente reconhecem as moléculas de superfície como descritas, por exemplo, nas Patentes US Nos 6.525.154, 7.332.553 e 7.384.589 e uma publicação por Bossi et al. (Bossi et al., 2007) e são uma ferramenta para recuperar e isolar microvesículas específicas do tipo de célula. Cada uma das referências precedentes é aqui incorporada quanto a sua divulgação destes métodos.

[055] Pode ser benéfico ou de outro modo desejável extrair o ácido nucleico dos exossomas antes da análise. As moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas a partir de uma microvesícula usando qualquer número de procedimentos, que são bem conhecidos na técnica, o procedimento de isolação particular escolhido sendo apropriado para a amostra biológica particular. Os exemplos de métodos para a extração são fornecidos na seção de Exemplos aqui. Em alguns casos, com algumas técnicas, também pode ser possível analisar o ácido nucleico sem extração a partir da microvesícula.

[056] Em uma forma de realização, os ácidos nucleicos extraídos, incluindo DNA e/ou RNA, são analisados diretamente sem uma etapa de amplificação. A análise direta pode ser realizada com métodos diferentes incluindo, mas não limitado à tecnologia de nanofilamento. A tecnologia de NanoFilamento possibilita a identificação e quantificação de moléculas alvo do indivíduo em uma amostra biológica pela ligação de um repórter fluorescente codificado por cor a cada molécula alvo. Este método é similar ao conceito de inventário de medição pelos códigos de barra de varredura. Os repórteres podem ser fabricados com centenas ou mesmo milhares de códigos diferentes permitindo quanto a análise altamente multiplexada. A tecnologia é descrita em uma publicação por Geiss et al. (Geiss et al., 2008) e é aqui incorporado por referência para a sua divulgação.

[057] Em uma outra forma de realização, pode ser benéfico ou de outro modo desejável amplificar o ácido nucleico da microvesícula antes de analisá-la. Os métodos de amplificação de ácido nucleico são habitualmente usados e no geral conhecidos na técnica, muitos exemplos dos quais são aqui descritos. Se desejado, a amplificação pode ser realizada tal que a mesma seja quantitativa. A amplificação quantitativa possibilitará a determinação quantitativa de quantidades relativas dos vários ácidos nucleicos, para gerar um perfil como descrito abaixo.

[058] Em uma forma de realização, o ácido nucleico extraído é RNA. Os RNAs são depois preferivelmente transcritos de modo reverso em DNA complementar antes de outra amplificação. Tal transcrição reversa pode ser realizada sozinha ou em combinação com uma etapa de amplificação. Um exemplo de um método que combina as etapas de transcrição reversa e amplificação é a transcrição reversa da reação da cadeia da polimerase (RT-PCR), que pode ser ainda modificada para ser quantitativa, por exemplo, RT-PCR quantitativa como descrito na Patente US No 5.639.606, que é aqui incorporada por referência para esta divulgação.

[059] Os métodos de amplificação de ácido nucleico incluem, sem limitação, a reação da cadeia da polimerase (PCR) (Patente US No 5.219.727) e suas variantes tais como a reação da cadeia da polimerase in situ (Patente US No 5.538.871), reação da cadeia da polimerase quantitativa (Patente US No 5.219.727), reação da cadeia da polimerase abrigada (Patente US No 5.556.773), replicação de sequência auto prolongada e suas variantes (Guatelli et al., 1990), sistema de amplificação transcricional e suas variantes (Kwoh et al., 1989), Replicase Qb e suas variantes (Miele et al., 1983), PCR fria (Li et al., 2008) ou qualquer outro dos métodos de amplificação de ácido nucleico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando técnicas bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Especialmente úteis são aqueles esquemas de detecção planejados para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estão presentes em números muito baixos. As referências precedentes são aqui incorporadas quanto as suas divulgações destes métodos.

[060] A análise de ácidos nucleicos presentes nas microvesículas é quantitativa e/ou qualitativa. Para a análise quantitativa, as quantidades (níveis de expressão), relativas ou absolutas, de ácidos nucleicos específicos de interesse dentro das microvesículas são medidas com métodos conhecidos na técnica (descritos abaixo). Para a análise qualitativa, as espécies de ácidos nucleicos específicos de interesse dentro das microvesículas, sejam do tipo selvagem ou variantes, são identificadas com métodos conhecidos na técnica (descritos abaixo).

[061] “Aberrações genéticas” é aqui usado para se referir às quantidades de ácido nucleico assim como variantes de ácido nucleico dentro das microvesículas. Especificamente, as aberrações genéticas incluindo, sem limitação, a super-expressão de um gene (por exemplo, oncogenes) ou um painel de genes, sub-expressão de um gene (por exemplo, genes supressores de tumor tais como p53 ou RB) ou um painel de genes, produção alternativa de variantes de junção de um gene ou um painel de genes, variantes do número de cópia (CNV) (por exemplo anotações de DNA duplo) (Hahn, 1993), modificações de ácido nucleico (por exemplo, metilação, acetilação e fosforilações), polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), rearranjos cromossômicos (por exemplo, inversões, deleções e duplicações), e mutações (inserções, deleções, duplicações, sentido errado, não sentido, sinônimos ou qualquer outra mudança de nucleotídeo) de um gene ou um painel de genes, mutações estas que, em muitos casos, por fim afetam a atividade e função dos produtos de gene, levam às variantes de junção transcricionais alternativas e/ou mudanças de nível de expressão de gene.

[062] A determinação de tais aberrações genéticas podem ser realizadas por uma variedade de técnicas conhecidas pelo médico habilitado. Por exemplo, os níveis de expressão de ácidos nucleicos, as variantes de junção alternativas, rearranjo de cromossoma e números de cópia de gene podem ser determinadas pela análise de microarranjo (Patente US Nos 6.913.879, 7.364.848, 7.378.245, 6.893.837 e 6.004.755) e PCR quantitativa. Particularmente, as mudanças do número de cópia podem ser detectadas com o ensaio de genotipagem de genoma integral Illumina Infinium II ou Microarranjo CGH de Genoma Humano Agilent (Steemers et al., 2006). As modificações de ácido nucleico podem ser ensaiadas pelos métodos descritos, por exemplo, na Patente US No 7.186.512 e publicação de patente WO/2003/023065. Particularmente, os perfis de metilação podem ser determinados pelo Illumina DNA Methilation OMA003 Cancer Panel. SNPs e mutações podem ser detectadas pela hibridização com sondas específicas de alelo, detecção de mutação enzimática, clivagem química de heteroduplex desemparelhados (Cotton et al., 1988), clivagem de ribonuclease de bases desemparelhadas (Myers et al., 1985), espectrometria por massa (Patente US Nos 6.994.960, 7.074.563, e 7.198.893), sequenciamento de ácido nucleico, polimorfismo de conformação de filamento único (SSCP) (Orita et al., 1989), eletroforese em gel por gradiente desnaturante (DGGE)(Fischer e Lerman, 1979a; Fischer e Lerman, 1979b), eletroforese em gel por gradiente de temperatura (TGGE) (Fischer e Lerman, 1979a; Fischer e Lerman, 1979b), polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) (Kan e Dozy, 1978a; Kan e Dozy, 1978b), ensaio de ligação de oligonucleotídeo (OLA), PCR específica de alelo (ASPCR) (Patente US No 5.639.611), reação da cadeia de ligação (LCR) e suas variantes (Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994), análise de heteroduplex de citometria de fluxo (WO/2006/113590) e combinações/modificações destes. Notavelmente, os níveis de expressão de gene podem ser determinados pela técnica da análise serial da expressão de gene (SAGE) (Velculescu et al., 1995). No geral, os métodos para analisar aberrações genéticas são relatadas em numerosas publicações, não limitados àquelas aqui citadas, e são disponíveis aos médicos habilitados. O método apropriado de análise dependerá das metas específicas da análise, a condição/história do paciente, e do câncer(s) específico(s), doenças ou outras condições médicas a serem detectadas, monitoradas ou tratadas. As referências precedentes são aqui incorporadas para a sua divulgação destes métodos.

[063] Uma variedade de aberrações genéticas foram identificadas ocorrer e/ou contribuir para a geração inicial ou progressão de câncer. Os exemplos de genes que são habitualmente supra-regulados (isto é, super-expressados) em câncer são fornecidos na Tabela 4 (cânceres de tipos diferentes) e Tabela 6 (câncer pancreático). Os exemplos de microRNAs que são supra-regulados em tumor cerebral são fornecidos na Tabela 8. Em uma forma de realização da invenção, existe um aumento no nível de expressão do ácido nucleico de um gene listado na Tabela 4 e/ou Tabela 6 e/ou de um microRNA listado na Tabela 8. Os exemplos de genes que são habitualmente infra-regulados (por exemplo sob-expressados) no câncer são fornecidos na Tabela 5 (cânceres de tipos diferentes) e Tabela 7 (câncer pancreático). Os exemplos de microRNAs que são infra-regulados em tumor cerebral são fornecidos na Tabela 9. Em uma forma de realização da invenção, existe uma diminuição no nível de expressão de ácido nucleico de um gene listado na Tabela 5 e/ou Tabela 7 e/ou um microRNA listado na Tabela 9. Os exemplos de genes que são habitualmente sub expressados, ou supra expressados em tumores cerebrais são revisados em (Furnari et al., 2007), e esta matéria objeto é aqui incorporada por referência. Com respeito ao desenvolvimento de tumores cerebrais, RB e p53 são frequentemente infra-regulados para de outro modo diminuir a sua atividade supressiva de tumor. Portanto, nestas formas de realização, a presença ou ausência de um aumento ou diminuição no nível de expressão de ácido nucleico de um gene(s) e/ou um microRNA(s) cujo nível de expressão desregulado é específico de um tipo de câncer podem ser usados para indicar a presença ou ausência do tipo de câncer no paciente.

[064] Do mesmo modo, as variantes de ácido nucleico, por exemplo, modificações de DNA ou RNA, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e mutações (por exemplo, de sentido errado, que não de sentido, inserções, deleções, duplicações) também podem ser analisadas dentro das microvesículas de fluido corporal de um paciente, incluindo fêmeas grávidas onde microvesículas derivadas do feto podem estar no soro assim como no fluido amniótico. Os exemplos não limitantes são fornecidos na Tabela 3. Já em uma outra forma de realização, a variante de nucleotídeo está no gene EGFR. Ainda em uma outra Ainda em uma outra forma de realização, a variante de nucleotídeo é a mutação/variante EGFRvIII. Os termos “EGFR”, “receptor do fator de crescimento epidérmico” e “ErbB1” são usados intercambiavelmente na técnica, por exemplo como descrito em um documento por Carpenter (Carpenter, 1987). Com respeito ao desenvolvimento de tumores cerebrais, RB, PTEN, p16, p21 e p53 são frequentemente mutados para de outro modo diminuir a sua atividade supressiva de tumor. Os exemplos de mutações específicas em formas específicas de tumores cerebrais são debatidos em um documento por Furnari et al. (Furnari et al., 2007), e esta matéria objeto é aqui incorporada por referência.

[065] Além disso, mais aberrações genéticas associadas com cânceres foram identificadas recentemente em uns poucos projetos de pesquisa em andamento. Por exemplo, o programa Cancer Genome Atlas (TCGA) está explorando um espectro de mudanças genômicas envolvidas em cânceres humanos. Os resultados deste projeto e outros esforços de pesquisa similares são publicados e aqui incorporados por referência (Jones et al., 2008; McLendon et al., 2008; Parsons et al., 2008; Wood et al., 2007). Especificamente, estes projetos de pesquisa identificaram aberrações genéticas, tais como mutações (por exemplo, sentido errado, que não de sentido, inserções, deleções e duplicações), variações no nível de expressão de gene (mRNA ou microRNA), variações no número de cópia e modificação de ácido nucleico (por exemplo metilação), em glioblastoma humano, câncer pancreático, câncer mamário e/ou câncer colorretal. Os genes mais frequentemente mutados nestes cânceres são listados na Tabela 11 e Tabela 12 (glioblastoma), Tabela 13 (câncer pancreático), Tabela 14 (câncer mamário) e Tabela 15 (câncer colorretal). As aberrações genéticas nestes genes, e de fato qualquer um dos genes que contêm qualquer uma das aberrações genéticas em um câncer, são alvos que podem ser selecionados para o uso no diagnóstico e/ou monitoramento de câncer pelos métodos aqui descritos.

[066] A detecção de uma ou mais variantes de nucleotídeo pode ser realizada realizando-se uma triagem de variante de nucleotídeo nos ácidos nucleicos dentro das microvesículas. Uma tal triagem pode ser tanto ampla quanto estreita como determinado necessário ou desejável pelo médico habilitado. A mesma pode ser uma triagem ampla (ajustada para detectar todas as variantes de nucleotídeo possíveis nos genes conhecidos por estarem associados com um ou mais cânceres ou estados de doença). Onde um câncer ou doença específicos são suspeitos ou conhecidos existir, a triagem pode ser específica a este câncer ou doença. Um exemplo é uma triagem de tumor cerebral/câncer cerebral (por exemplo, ajustado para detectar todas as variantes de nucleotídeo possíveis nos genes associados com vários subtipos clinicamente distintos de câncer cerebral ou mutações resistentes a medicamento ou sensíveis a medicamento conhecidas deste câncer).

[067] Em uma forma de realização, a análise é de um perfil de quantidades (níveis) de ácidos nucleicos específicos presentes na microvesícula, aqui aludido como um “perfil de ácido nucleico quantitativo” das microvesículas. Em uma outra forma de realização, a análise é de um perfil das espécies de ácidos nucleicos específicos presentes nas microvesículas (tanto do tipo selvagem assim como variantes), aqui aludido como um “perfil de espécies de ácido nucleico.” Um termo aqui usado para se referir a uma combinação dos mesmos tipos de perfis é o “perfil genético” que refere-se à determinação da presença ou ausência de espécies de nucleotídeo, variantes e também aumentos ou diminuições nos níveis de ácido nucleico.

[068] Uma vez gerados, estes perfis genéticos das microvesículas são comparados com aqueles esperados em, ou de outro modo derivados de um indivíduo normal saudável. Um perfil pode ser um perfil de genoma amplo (ajustado para detectar todos os genes expressados possíveis ou sequências de DNA. O mesmo também pode ser mais estreito, tal como um perfil amplo de câncer (ajustado para detectar todos os genes ou ácidos nucleicos possíveis derivados do mesmo, ou conhecidos como estando associados com um ou mais cânceres). Onde um câncer específico é suspeito ou conhecido existir, o perfil pode ser específico para este câncer (por exemplo, ajustado para detectar todos os genes possíveis ou ácidos nucleicos derivados deste, associados com vários subtipos clinicamente distintos deste câncer ou mutações resistentes ou sensíveis a medicamento conhecidas deste câncer).

[069] Quais ácidos nucleicos devam ser amplificados e/ou analisados podem ser selecionados pelo médico habilitado. O teor de ácido nucleico inteiro dos exossomas ou apenas um subconjunto de ácidos nucleicos específicos que são prováveis ou suspeitos de serem influenciados pela presença de uma doença ou outra condição médica tais como câncer, pode ser amplificado e/ou analisado. A identificação de uma aberração(ões) de ácido nucleico no ácido nucleico da microvesícula analisada pode ser usada para diagnosticar o paciente quanto a presença de uma doença tal como câncer, doenças hereditárias ou infecção viral com que esta(s) aberração(ões) está(ão) associada(s). Por exemplo, a análise quanto a presença ou ausência de uma ou mais variantes de ácido nucleico de um gene específico para um câncer (por exemplo a mutação de EGFRvIII) pode indicar a presença do câncer no indivíduo. Alternativamente, ou além disso, a análise de ácidos nucleicos quanto a um aumento ou diminuição nos níveis de ácido nucleico específicos para um câncer pode indicar a presença do câncer no indivíduo (por exemplo, um aumento relativo no ácido nucleico de EGFR, ou uma diminuição relativa em um gene supressor de tumor tal como p53).

[070] Em uma forma de realização, as mutações de um gene que está associado com uma doença tal como câncer (por exemplo via variantes de nucleotídeo, super-expressão ou sub-expressão) são detectadas pela análise dos ácidos nucleicos em microvesículas, ácidos nucleicos que são derivados do próprio genoma na célula de origem ou genes exógenos introduzidos através de vírus. As sequências de ácido nucleico podem ser completas ou parciais, visto que ambas são esperadas produzir informação útil em diagnóstico e prognóstico de uma doença. As sequências podem ser de sentido ou anti-sentido em relação ao gene real ou sequências transcritas. O médico habilitado será capaz de inventar métodos de detecção para uma variação de nucleotídeo a partir dos ácidos nucleicos de sentido ou de anti- sentido que podem estar presentes em uma microvesícula. Muitos de tais métodos envolvem o uso de sondas que são específicas para as sequências de nucleotídeo que diretamente flanqueiam, ou contêm as variações de nucleotídeo. Tais sondas podem ser planejadas pelo médico habilitado dado o conhecimento das sequências de gene e a localização das variantes de ácido nucleico dentro do gene. Tais sondas podem ser usadas para isolar, amplificar, e/ou de fato hibridizar para detectar as variantes de ácido nucleico, como descrito na técnica e aqui.

[071] A determinação da presença ou ausência de uma variante de nucleotídeo particular ou pluralidade de variantes no ácido nucleico dentro de microvesículas de um paciente pode ser realizada em uma variedade de modos. Uma variedade de métodos estão disponíveis para tal análise, incluindo, mas não limitados à, PCR, hibridização com sondas específicas de alelo, detecção de mutação enzimática, clivagem química de desemparelhamentos, espectrometria por massa ou sequenciamento de DNA, incluindo minisequenciamento. Em formas de realização particulares, a hibridização com sondas específicas de alelo pode ser conduzida em dois formatos: 1) oligonucleotídeos específicos de alelo ligados a uma fase sólida (vidro, silício, membranas de náilon) e a amostra rotulada em solução, como em muitas aplicações de chip de DNA, ou 2) amostra ligada (frequentemente DNA clonado ou DNA amplificado pela PCR) e oligonucleotídeos rotulados em solução (específico de alelo ou curto de modo a permitir o sequenciamento pela hibridização). Os testes de diagnóstico podem envolver um painel de variações, frequentemente em um suporte sólido, que possibilita a determinação simultânea de mais do que uma variação. Em uma outra forma de realização, determinar a presença de pelo menos uma variação de ácido nucleico no ácido nucleico na microvesícula acarreta necessariamente um teste de haplotipagem. Os métodos de determinar haplotipos são conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, como por exemplo, na WO 00/04194.

[072] Em uma forma de realização, a determinação da presença ou ausência de uma variante(s) de ácido nucleico envolve determinar a sequência do sítio ou sítios de variante (a localização exata dentro da sequência onde a variação de ácido nucleico do padrão ocorre) pelos métodos tais como reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de DNA limitado à cadeia (Patente US No 5547859), mini-sequenciamento (Fiorentino et al., 2003), hibridização de oligonucleotídeo, pirossequenciamento, analisador de genoma Illumina, sequenciamento profundo, espectrometria por massa ou outros métodos de detecção de sequência de ácido nucleico. Os métodos para detectar variantes de ácido nucleico são bem conhecidos na técnica e divulgados na WO 00/04194, aqui incorporada por referência. Em um método exemplar, o teste de diagnóstico compreende amplificar um segmento de DNA ou RNA (no geral depois de converter o RNA ao DNA complementar) transpondo uma ou mais variantes conhecidas na sequência de gene desejada. Este segmento amplificado é depois sequenciado e/ou submetido à eletroforese de modo a identificar variantes de nucleotídeo no segmento amplificado.

[073] Em uma forma de realização, a invenção fornece um método de triar quanto às variantes de nucleotídeo no ácido nucleico de microvesículas isoladas como aqui descrito. Isto pode ser obtido, por exemplo, pela PCR ou, alternativamente, em uma reação da cadeia de ligação (LCR) (Abravaya et al., 1995; Landegren et al., 1988; Nakazawa et al., 1994). A LCR pode ser particularmente útil para detectar mutações pontuais em um gene de interesse (Abravaya et al., 1995). O método de LCR compreende as etapas de planejar iniciadores degenerados para amplificar o sequência alvo, os iniciadores que correspondem a uma ou mais regiões conservadas do ácido nucleico que corresponde ao gene de interesse, produtos de amplificação de PCR com os iniciadores usando, como um padrão, um ácido nucleico obtido a partir de uma microvesícula, e analisando os produtos de PCR. A comparação dos produtos de PCR do ácido nucleico da microvesícula com uma amostra de controle (tendo ou não a variante de nucleotídeo) indica variantes no ácido nucleico da microvesícula. A mudança pode ser uma ausência ou presença de uma variante de nucleotídeo no ácido nucleico da microvesícula, dependendo do controle.

[074] A análise de produtos de amplificação pode ser realizada usando qualquer método capaz de separar os produtos de amplificação de acordo com o seu tamanho, incluindo a eletroforese em gel automatizado e manual, espectrometria por massa, e outros.

[075] Alternativamente, os produtos de amplificação podem ser analisados com base nas diferenças de sequência, usando SSCP, DGGE, TGGE, clivagem química, OLA, polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição assim como hibridização, por exemplo, microarranjos de ácido nucleico.

[076] Os métodos de isolação, amplificação e análise de ácido nucleico são rotina para a pessoa habilitada na técnica e os exemplos de protocolos podem ser encontrados, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Volume 3 da Série) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, e Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 3a edição (15 de Janeiro de 2001), ISBN:0879695773. Uma fonte de protocolo útil particular para os métodos usados na amplificação pela PCR é a PCR Basics: From Background to Bench by Springer Verlag; 1a edição (15 de outubro de 2000), ISBN:0387916008.

[077] Muitos métodos de diagnóstico realizados em uma amostra de biópsia de tumor podem ser realizados com microvesículas visto que as células de tumor, assim algumas células normais são conhecidas por derramar microvesículas no fluido corporal e as aberrações genéticas dentro destas microvesículas refletem aquelas dentro das células de tumor como aqui demonstrado. Além disso, os métodos de diagnóstico usando microvesículas têm características que estão ausentes nos métodos de diagnóstico realizados diretamente em uma amostra de biópsia de tumor. Por exemplo, uma vantagem particular da análise de ácidos nucleicos microvesiculares, como oposto às outras formas de amostragem de ácido nucleico de tumor/câncer, é a disponibilidade para a análise de ácidos nucleicos de tumor/câncer derivados de todos os focos de um tumor ou tumores geneticamente heterogêneos presentes em um indivíduo. As amostras de biópsia são limitadas em que elas fornecem informação apenas a respeito do foco específico do tumor a partir do qual a biópsia é obtida. Diferentes focos tumorosos/cancerosos encontrados dentro do corpo, ou mesmo dentro de um único tumor frequentemente têm perfis genéticos diferentes e não são analisados em uma biópsia padrão. Entretanto, a análise dos ácidos nucleicos microvesiculares de um indivíduo presumivelmente fornece uma amostragem de todos os focos dentro de um indivíduo. Isto fornece informação valiosa a respeito dos tratamentos recomendados, eficácia de tratamento, prognóstico de doença, e análise da recaída da doença, que não podem ser fornecidos por uma biópsia simples.

[078] A identificação de aberrações genéticas associadas com doenças e/ou condições médicas específicas pelos métodos aqui descritos também pode ser usada para o prognóstico e decisões de tratamento de um indivíduo diagnosticado com uma doença ou outra condição médica tal como câncer. A identificação da base genética de uma doença e/ou condição médica fornece informação útil que orienta o tratamento da doença e/ou condição médica. Por exemplo, muitas formas de quimioterapia têm sido mostrada ser mais eficazes nos cânceres com anormalidades/aberrações genéticas específicas. Um exemplo é a eficácia de tratamentos que alvejam EGFR com remédios, tais como os inibidores de cinase gefitinib e erlotinib. Tal tratamento foi mostrado ser mais eficaz nas células cancerígenas cujo gene de EGFR abriga mutações de nucleotídeo específicas no domínio da cinase da proteína de EGFR (publicação de Patente U.S. 20060147959). Em outras palavras, a presença de pelo menos uma das variantes de nucleotídeo identificadas no domínio de cinase da mensagem de ácido nucleico de EGFR indica que um paciente provavelmente beneficiar-se-á do tratamento com os compostos que alvejam EGFR gefitinib ou erlotinib. Tais variantes de nucleotídeo podem ser identificadas em ácidos nucleicos presentes em microvesículas pelos métodos aqui descritos, visto que foi demonstrado que os transcritos de EGFR de origem tumoral são isolados a partir das microvesículas no fluido corporal.

[079] As aberrações genéticas em outros genes também foram descobertos influenciar a eficácia de tratamentos. Como divulgado na publicação por Furnari et al. (Furnari et al., 2007), as mutações em uma variedade de genes afetam a eficácia de remédios específicos usados na quimioterapia para tratar tumores cerebrais. A identificação destas aberrações genéticas nos ácidos nucleicos dentro das microvesículas orientará a seleção de planos de tratamento apropriados.

[080] Como tal, aspectos da presente invenção dizem respeito a um método para o monitoramento da progressão da doença (por exemplo câncer) em um paciente, e também a um método para o monitoramento da recaída da doença em um indivíduo. Estes métodos compreendem as etapas de isolar microvesículas a partir de um fluido corporal de um indivíduo, como aqui debatido, e analisar o ácido nucleico dentro das microvesículas como aqui debatido (por exemplo para criar um perfil genético das microvesículas). A presença/ausência de uma certa aberração/perfil genéticos são usadas para indicar a presença/ausência da doença (por exemplo câncer) no paciente como aqui debatido. O processo é realizado periodicamente com o tempo, e os resultados revisados, para monitorar a progressão ou regressão da doença, ou para determinar a recaída da doença. Colocado de um outro modo, uma mudança no perfil genético indica uma mudança no estado de doença no paciente. O período de tempo para decorrer entre a amostragem de microvesículas do paciente, para o desempenho da isolação e análise da microvesícula, dependerá das circunstâncias do paciente, e deve ser determinado pelo médico habilitado. Um tal método mostrar-se-ia extremamente benéfico quando da análise de um ácido nucleico de um gene que está associado com a terapia passada pelo paciente. Por exemplo, um gene que é alvejado pela terapia pode ser monitorado quanto ao desenvolvimento de mutações que o tornam resistentes à terapia, tempo no qual a terapia pode ser modificada consequentemente. O gene monitorado também pode ser um que indica a responsividade específica a uma terapia específica.

[081] Os aspectos da presente invenção também dizem respeito ao fato de que uma variedade de doenças e/ou condições medicas não cancerosas também têm ligações e/ou causas genéticas, e tais doenças e/ou condições médicas podem ser igualmente diagnosticadas e/ou monitoradas pelos métodos aqui descritos. Muitas de tais doenças são metabólicas, infecciosas ou degenerativas por natureza. Uma tal doença é a diabete (por exemplo a diabete insípida) em que o receptor tipo 2 da vasopressina (V2R) é modificado. Uma outra tal doença é a fibrose renal em que os perfis genéticos para os genes de colágenos, fibronectina e TGF-α são mudados. As mudanças no perfil genético devido ao abuso de substância (por exemplo um esteróide ou uso de droga), infecção viral e/ou bacteriana, e estados de doença hereditários podem do mesmo modo ser detectados pelos métodos aqui descritos.

[082] As doenças ou outras condições médicas para as quais as invenções aqui descritas são aplicáveis incluem, mas não são limitadas a, nefropatia, diabete insípida, diabete tipo I, diabete II, doença renal, glomerulonefrite, glomerulonefrites bacterianas ou virais, nefropatia de IgA, Púrpura de Henoch-Schonlein, glomerulonefrite membrano-proliferativa, nefropatia membranosa, síndrome de Sjogren, doença da mudança mínima da síndrome nefrótica, glomeruloesclerose focal e distúrbios relacionados, insuficiência renal aguda, nefrite tubulointersticial aguda, pielonefrite, doença inflamatória do trato GU, Pré-eclampsia, rejeição de enxerto renal, lepra, nefropatia de refluxo, nefrolitíase, doença renal genética, cístico medular, esponja medular, doença renal policística, doença renal policística dominante autossômica, doença renal policística recessiva autossômica, esclerose tuberosa, doença de von Hippel-Lindau, doença de membrana de base glomerular fina familiar, glomerulopatia de colágeno III, glomerulopatia de fibronectina, síndrome de Alport, doença de Fabry, Síndrome de Nail-Patella, anomalias urológicas congênitas, gamopatias monoclonais, mieloma múltiplo, amiloidose e distúrbios relacionados, enfermidade febril, febre do mediterrâneo familiar, infecção pelo HIV-AIDS, doença inflamatória, vasculites sistêmicas, poliarterite nodosa, granulomatose de Wegener, poliarterite, glomerulonefrite necrosante e crescêntica, polimiosite- dermatomiosite, pancreatite, artrite reumatóide, lupo eritematoso sistêmico, gota, distúrbios sanguíneos, doença de célula falciforme, púrpura trombocitopênica trombótica, síndrome de Fanconi, transplante, lesão renal aguda, síndrome do intestino irritável, síndrome hemolítica-urêmica, necrose corticol aguda, tromboembolismo renal, trauma e cirurgia, lesões extensas, queimadura, cirurgia abdominal e vascular, indução de anestesia, efeito colateral do uso de drogas ou abuso de drogas, infarto do miocárdio na doença circulatória, insuficiência cardíaca, doença vascular periférica, hipertensão, doença cardíaca coronária, doença cardiovascular não aterosclerótica, doença cardiovascular aterosclerótica, doença de pele, psoríase, esclerose sistêmica, doença respiratória, COPD, apnéia do sono obstrutiva, hipóia em alta altitude ou doença erdocrina, acromegalia, diabete melito, ou diabete insípida.

[083] Seleção de um indivíduo a partir do qual as microvesículas são isoladas é realizada pelo médico habilitado com base na análise de uma ou mais de uma variedade de fatores. Tais fatores por consideração são se o paciente tem uma história familiar de uma doença específica (por exemplo um câncer), tem uma predisposição genética para uma tal doença, tem um risco aumentado para uma tal doença devido à história familiar, predisposição genética, outra doença ou sintomas físicos que indicam uma predisposição, ou razões ambientais. As razões ambientais incluem estilo de vida, exposição aos agentes que causam ou contribuem para a doença tais como no ar, terra, água ou dieta. Além disso, tendo anteriormente tido a doença, sendo correntemente diagnosticado com a doença antes da terapia ou depois da terapia, sendo correntemente tratada para a doença (que passa pela terapia), estando em remissão ou recuperação da doença, são outras razões para selecionar um indivíduo para realizar os métodos.

[084] Os métodos aqui descritos são opcionalmente realizados com a etapa adicional de selecionar um gene ou ácido nucleico para análise, antes da etapa de análise. Esta seleção pode ser fundamentada em quaisquer predisposições do paciente, ou quaisquer exposições anteriores ou diagnóstico, ou tratamentos terapêuticos experienciados ou concorrentemente sofridos pelo paciente.

[085] O câncer diagnosticado, monitorado ou de outro modo perfilado, pode ser qualquer tipo de câncer. Isto inclui, sem limitação, cânceres de célula epitelial tais como cânceres pulmonar, ovariano, cervical, endometrial, mamário, cerebral, colônico e da próstata. Também incluídos são o câncer gastrointestinal, câncer da cabeça e pescoço, câncer pulmonar de célula não pequena, câncer do sistema nervoso, câncer renal, câncer da retina, câncer de pele, câncer hepático, câncer pancreático, câncer gênito-urinário e câncer da bexiga, melanoma, e leucemia. Além disso, os métodos e composições da presente invenção são igualmente aplicáveis para detecção, diagnóstico e prognóstico de tumores não malignos em um indivíduo (por exemplo neurofibromas, meningiomas e schwannomas).

[086] Em uma forma de realização, o câncer é câncer cerebral. Os tipos de tumores e câncer cerebrais são bem conhecidos na técnica. Glioma é um nome geral para tumores que surgem do tecido glial (sustentador) do cérebro. Gliomas são os tumores cerebrais primários mais comum. Astrocitomas, ependimomas, oligodendrogliomas e tumores com misturas de dois ou mais tipos de célula, os chamados gliomas mistos, são os gliomas mais comuns. Os seguintes são outros tipos comuns de tumores cerebrais: Neuroma Acústicos (Neurilemoma, Schwannoma. Neurinoma), Adenoma, Astracitoma, Astrocitoma de Grau Baixo, astrocitomas de célula gigante, Astrocitoma de Grau Médio e Alto, tumores recorrentes, Glioma de Tronco Cerebral, Cordoma, Papiloma de Plexo Coroidal, Linfoma de CNS (Linfoma Maligno Primário), Cistos, Cistos dermóides, cistos epidermóides, Craniofaringioma, Ependimoma, Ependimoma anaplástico, Gangliocitoma (Ganglioneuroma), Ganglioglioma, Glioblastoma Multiforme (GBM), Astracitoma Maligno, Glioma, Hemangioblastoma, Tumores cerebrais inoperáveis, Linfoma, Meduloblastoma (MDL), Meningioma, Tumores cerebrais metastático, Glioma Misto, Neurofibromatose, Oligodendroglioma, Glioma de Nervo Óptico, Tumores da Região Pineal, Adenoma Pituitário, PNET (Tumor Neuroectodérmico Primitivo), Tumores espinhais, Subependimoma, e Esclerose Tuberoso (Doença de Bourneville).

[087] Além de identificar aberrações de ácido nucleico previamente conhecidos (como associado com doenças), os métodos da presente invenção podem ser usados para identificar sequências/ modificações de anteriormente não identificadas (por exemplo modificações pós transcricionais) cujas aberrações estão associadas com certas doenças e/ou condições médicas. Isto é realizado, por exemplo, pela análise do ácido nucleico dentro de microvesículas a partir de um fluido corporal de um ou mais pacientes com uma dada doença/condição médica (por exemplo um tipo clínico ou subtipo de câncer) e comparação com o ácido nucleico dentro das microvesículas de um ou mais pacientes sem a dada doença/condição médica, para identificar diferenças em seu teor de ácido nucleico. As diferenças podem ser quaisquer aberrações genéticas incluindo, sem limitação, nível de expressão do ácido nucleico, variantes de junção alternativas, variantes de número de cópia de gene (CNV), modificações do ácido nucleico, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), e mutações (inserções, deleções ou mudanças de nucleotídeo único) do ácido nucleico. Uma vez que uma diferença em um parâmetro genético de um ácido nucleico particular é identificada para uma certa doença, outros estudos envolvendo um número clínica e estatisticamente significante de pacientes pode ser realizado para estabelecer a correlação entre a aberração genética do particular ácido nucleico e da doença. A análise de aberrações genéticas pode ser feita por um ou mais métodos aqui descritos, como determinado apropriado pelo médico habilitado.

Exossomas Como Veículos de Liberação

[088] Os aspectos da presente invenção também dizem respeito às microvesículas reais aqui descritas. Em uma forma de realização, a invenção é uma microvesícula isolada como aqui descrita, isolada de um indivíduo. Em uma forma de realização, a microvesícula é produzida por uma célula dentro do cérebro do indivíduo (por exemplo uma célula de tumor ou que não de tumor). Em uma outra forma de realização, a microvesícula é isolada de um fluido corporal de um indivíduo, como aqui descrito. Os métodos de isolação são aqui descritos.

[089] Um outro aspecto da invenção diz respeito às descobertas de que as microvesículas isoladas de células de glioblastoma humanas contêm mRNAs, miRNAs e proteínas angiogênicas. Tais microvesículas de glioblastoma foram absorvidas pelas células endoteliais cerebrais humanas primárias, provavelmente por intermédio de um mecanismo endocitótico, e um mRNA de proteína repórter incorporado nas microvesículas foi traduzido nestas células. Isto indica que as mensagens dispensadas pelas microvesículas podem mudar o perfil genético e/ou traducional de uma célula alvo (uma célula que absorve uma microvesícula). As microvesículas também contiveram miRNAs que são conhecidos ser abundantes em glioblastomas (Krichevsky et al, manuscrito em preparação). Assim as microvesículas derivadas de tumores de glioblastoma funcionam como veículos de liberação para mRNA, miRNA e proteínas que podem mudar o estado traducional de outras células por intermédio da liberação de espécies de mRNA específicos, promovem angiogênese de células endoteliais, e estimulam o crescimento do tumor.

[090] Em uma forma de realização, as microvesículas são esgotadas de um fluido corporal de um paciente doador antes do dito fluido corporal é dispensado a um paciente receptor. O paciente doador pode ser um paciente com um tumor indetectável e as microvesículas no fluido corporal são derivadas do tumor. As microvesículas de tumor no fluido corporal doador, se não removidas, seriam nocivas visto que os materiais genéticos e proteínas na microvesícula podem promover o crescimento não restrito de células no paciente receptor.

[091] Como tal, um outro aspecto da invenção é o uso das microvesículas identificadas aqui para liberar um ácido nucleico a uma célula. Em uma forma de realização, a célula está dentro do corpo de um indivíduo. O método compreende administrar uma microvesícula(s) que contém o ácido nucleico, ou uma célula que produz tais microvesículas, para o indivíduo tal que as microvesículas contata e/ou entra a célula do indivíduo. A célula para a qual o ácido nucleico torna-se dispensado é aludido como a célula alvo.

[092] A microvesícula pode ser engendrado conter um ácido nucleico que naturalmente não conteria (isto é, que é exógeno para o conteúdo normal da microvesícula). Isto pode ser realizado inserindo-se fisicamente o ácido nucleico nas microvesículas. Alternativamente, uma célula (por exemplo cultivo em cultura) pode ser engendrada para alvejar um ou mais ácidos nucleicos específicos no exossoma, e o exossoma pode ser isolado da célula. Alternativamente, a célula engendrada por si só pode ser administrada ao indivíduo.

[093] Em uma forma de realização, a célula que produz o exossoma para administração é da mesma origem ou similar ou localização no corpo como a célula alvo. Isto quer dizer, para a liberação de uma microvesícula a uma célula cerebral, a célula que produz a microvesícula seria uma célula cerebral (por exemplo uma célula primária cultivada em cultura). Em uma outra forma de realização, a célula que produz o exossoma é de um tipo de célula diferente do que a célula alvo. Em uma forma de realização, a célula que produz o exossoma é um tipo que está localizado na proximidade no corpo à célula alvo.

[094] Uma sequência de ácido nucleico que pode ser dispensada a um célula por intermédio de um exossoma pode ser RNA ou DNA, e pode ser de filamento único ou duplo, e pode ser selecionada de um grupo que compreende: ácido nucleico que codifica uma proteína de interesse, oligonucleotídeos, análogos de ácido nucleico, por exemplo peptídeo-ácido nucleico (PNA), PNA pseudo-complementar (pc-PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) etc. Tais sequências de ácido nucleico incluindo, por exemplo, mas não são limitadas a, sequências de ácido nucleico que codifica proteínas, por exemplo que atuam como repressores transcricionais, moléculas de anti-sentido, ribozima, sequências de ácido nucleico inibidores pequenos, por exemplo mas não são limitadas a RNAi, shRNA, siRNA, miRNA, oligonucleotídeos de anti-sentido, e combinações dos mesmos.

[095] As microvesículas isoladas de um tipo de célula são dispensadas a um paciente receptor. As ditas microvesículas podem se beneficiar o paciente receptor medicamente. Por exemplo, a angiogênese e os efeitos de pró-proliferação de exossomas de tumor podem ajudar na regeneração de tecidos lesados no paciente receptor. Em uma forma de realização, os meios de liberação é pela transfusão de fluido corporal em que microvesículas são adicionados em um fluido corporal de um paciente doador antes do dito fluido corporal ser dispensado a um paciente receptor.

[096] Em uma outra forma de realização, a microvesícula é um ingrediente (por exemplo o ingrediente ativo em uma formulação farmaceuticamente aceitável adequada para a administração ao paciente (por exemplo nos métodos aqui descritos). No geral isto compreende um carreador farmaceuticamente aceitável para o ingrediente ativo. O carreador específico dependerá de vários fatores (por exemplo, a via de administração).

[097] O “carreador farmaceuticamente aceitável” significa qualquer meio farmaceuticamente aceitável para misturar e/ou liberar a composição de liberação alvejada a um paciente. Isto inclui um material, composição ou veículo farmaceuticamente aceitáveis, tais como um enchedor, diluente, excipiente, solvente ou material de encapsulação líquidos ou sólidos, envolvidos no carregamento ou transporte dos agentes objetos de um órgão, ou porção do corpo, para um outro órgão, ou porção do corpo. Cada carreador deve ser “aceitável” no sentido de serem compatíveis com os outros ingredientes da formulação e é compatível com a administração a um paciente, por exemplo um ser humano.

[098] A administração ao paciente pode ser sistêmica ou localizada. Isto inclui, sem limitação, dispensar, liberar ou aplicar um composto ativo (por exemplo em uma formulação farmacêutica) ao paciente por qualquer via adequada para a liberação do composto ativo ao local desejado no paciente, incluindo a liberação pelas vias parenteral ou oral, injeção intramuscular, injeção subcutânea/intradérmica, injeção intravenosa, administração bucal, liberação transdérmica e administração pela via retal, colônica, vaginal, intranasal ou trato respiratório.

[099] Deve ser entendido que esta invenção não é limitada às metodologias, protocolos e reagentes particulares, aqui descritos e como tal pode variar. A terminologia aqui usada é para o propósito de descrever apenas as formas de realização particulares, e não é intencionada a limitar o escopo da presente invenção, que é definida unicamente pelas reivindicações.

[0100] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito às composições, métodos aqui descritos, e respectivos componentes destes, como essenciais para a invenção, embora aberta para a inclusão de elementos não especificados, essenciais ou não (“que compreende”). Em algumas formas de realização, outros elementos a serem incluídos na descrição da composição, método ou respectivos componentes destes são limitados por aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção (“consistindo essencialmente de”). Isto se aplica igualmente às etapas dentro de um método descrito assim como composições e componentes neste. Em outras formas de realização, as invenções, composições, métodos, e componentes respectivos destes, aqui descritos são intencionado a serem exclusivos de qualquer elemento não julgado um elemento essencial para o componente, composição ou método (“que consiste de”).

EXEMPLOS

[0101] Exemplos de 1 a 7. Microvesículas derramadas de células de tumor, que contêm RNAs, incluindo mRNAs e microRNAs, e microvesículas estas que contêm mais do que 90% do RNA extracelular em fluidos corporais.

Exemplo 1: As microvesículas são derramadas a partir de células de glioblastoma humanas primárias.

[0102] Tecido de glioblastoma foi obtido de resseções cirúgicas e as células de tumor foram dissociadas e cultivadas como monocamadas. Especificamente, espécimes de tumor cerebral de pacientes diagnosticados por um neuropatologista como glioblastoma multiforme foram tirados diretamente da cirurgia e colocados em meio Neurobasal estéril frio (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Os espécimes foram dissociados em células únicas dentro de 1 h do momento da cirurgia usando um Kit de Dissociação de Tecido Neural (Miltenyi Biotech, Berisch Gladbach, Alemanha) e plaqueados em DMEM 5% dFBS suplementado com penicilina- estreptomicina (10 IU ml-1 e 10 μg ml-1, respectivamente, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Porque as microvesículas podem ser encontradas no soro bovino fetal (FBS) tradicionalmente usado para cultivar células, e estas microvesículas contêm quantidades substanciais de mRNA e miRNA, foi importante cultivar as células de tumor em meio contendo FBS esgotado de microvesícula (dFBS). As células primárias cultivadas obtidas a partir de três tumores de glioblastoma foram descobertos produzir microvesículas tanto na passagem inicial quanto na tardia (uma passagem é uma geração celular definida pela divisão de células, que é uma técnica de cultura de célula comum e é necessária para manter as células vivas). As microvesículas foram capazes de serem detectadas pela microscopia eletrônica de varredura (FIGS 1a e 1b) e microscopia eletrônica de transmissão (FIG 1f). Em resumo, as células de glioblastoma humanas foram colocadas em lamínulas revestidas com ornitina, fixadas em 0,5x fixativo de Karnovskys e depois lavadas 2 x 5 min (2 vezes com 5 min cada uma) com PBS. As células foram desidratadas em 35% de EtOH 10 min, 50% EtOH 2x 10 min, 70% de EtOH 2x 10 min, 95% de EtOH 2x 10 min, e 100% de EtOH 4 x 10 min. As células foram depois transferidas para secagem de ponto crítico em um Secador de Ponto Crítico semi-automático Tousimis SAMDR1-795 seguido pelo revestimento com cromo em um Revestidor de Feixe de Íon de Alta Resolução GATAN Modelo 681. Como mostrado nas FIGS. 1a e 1b, as células de tumor foram cobertas com microvesículas variando no tamanho de cerca de 50 a 500 nm.

Exemplo 2: As microvesículas de glioblastoma contêm RNA.

[0103] Para isolar microvesículas, as células de glioblastoma na passagem 1-15 foram cultivadas em meio isento de microvesícula (DMEM contendo 5% de dFBS preparada pela ultracentrifugação a 110.000 x g por 16 horas para remover microvesículas bovinas). O meio condicionado de 40 milhões de células foi colhido depois de 48 horas. As microvesículas foram purificadas pela centrifugação diferencial. Especificamente, o meio condicionado de glioblastoma foi centrifugado por 10 min a 300 x g para eliminar qualquer contaminação de célula. Os sobrenadantes foram centrifugados ainda por 20 min a 16.500 x g e filtrados através de um filtro de 0,22 μm. As microvesículas foram depois pelotizadas pela ultracentrifugação a 110.000 x g por 70 min. As pelotas de microvesícula foram lavadas em 13 ml de PBS, pelotizadas mais uma vez e recolocadas em suspensão em PBS.

[0104] As microvesículas isoladas foram medidas quanto ao seu teor de proteína total usando Ensaio de Proteína DC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

[0105] Para a extração de RNA das microvesículas, RNase A (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) em uma concentração final de 100 μg/ml foi adicionado às suspensões de microvesículas e incubadas por 15 min a 37°C para livrar-se do RNA fora das microvesículas e assim garantir que o RNA extraído viesse de fora das microvesículas. O RNA total foi depois extraído das microvesículas usando o kit de isolação de RNA MirVana (Ambion, Austin TX, USA) de acordo com o protocolo do fabricante. Depois do tratamento com DNAse de acordo com o protocolo do fabricante, o RNA total foi quantificado usando um instrumento de nanogota ND-1000 (Thermo Fischer Scientific, Wilmington, DE, USA).

[0106] As microvesículas de glioblastoma foram descobertas conter RNA e proteína em uma razão de aproximadamente 1:80 (μg de RNA:μg de proteína). O rendimento médio de proteínas e RNAs isolados das microvesículas em um período de 48 horas em cultura foi em torno de 4 μg de proteína e 50 ng de RNA/milhões de células.

[0107] Para confirmar que o RNA foi contido fora das microvesículas, as microvesículas foram expostas à RNase A ou tratamento simulado antes da extração do RNA (FIG. 1c). Nunca houve mais do que uma diminuição de 7% no conteúdo de RNA a seguir do tratamento com RNase. Assim, parece que quase todo do RNA extracelular do meio está contido dentro das microvesículas e está deste modo protegido das RNases externas pela membrana vesicular circundante.

[0108] O RNA Total das microvesículas e suas células doadoras foi analisado com um Bioanalisador, mostrando que as microvesículas contêm uma faixa ampla de tamanhos de RNA compatíveis com uma variedade de mRNAs e miRNAs, mas carecem de 18S e 28S os picos de RNA ribossômico característicos do RNA celular (FIGS. 1d e 1e).

Exemplo 3: As microvesículas contêm DNA.

[0109] Para testar se as microvesículas também contêm DNA, exossomas foram isolados como mencionado no Exemplo 2 e depois tratadas com DNase antes de serem lisadas para liberar os conteúdos. A etapa de tratamento com DNase foi para remover DNA fora dos exossomas de modo que apenas o DNA que reside dentro dos exossomas fosse extraído. Especificamente, o tratamento com a DNase foi realizado usando o kit DNA- free da Ambion de acordo com as recomendações do fabricante (Catálogo #AM1906). Para a etapa de purificação de DNA, uma alíquota de exossomas isolados foi lisada em 300 μl de tampão de lise que foi parte do kit de isolação de RNA MirVana (Ambion) e os DNAs foram purificados da mistura lisada usando um kit de purificação de DNA (Qiagen) de acordo com a recomendação do fabricante.

[0110] Para examinar se o DNA extraído contém genes comuns, PCRs foram realizadas usando pares de iniciador específicos para GAPDH, retrovírus K endógeno humano, Tenascina-c e Linhagem-1. Para o gene GAPDH, os seguintes iniciadores foram usados: Forw3GAPDHnew (SEQ ID NO:1) e Rev3GAPDHnew (SEQ ID NO:2). O par de iniciadores amplifica um amplicon de 112 bp se o padrão é um cDNA de GAPDH unido e um amplicon de 216 bp se o padrão é um DNA de GAPDH genômico não unido. Em um experimento, exossomas isolados foram tratados com DNase antes de serem lisados quanto a extração de DNA (FIG. 3a). Os fragmentos de 112 bp foram amplificados como esperado a partir dos exossomas do soro de tumor (Ver a Linhagem 4 na FIG. 3a) e as células de tumor primárias (Ver a Linhagem 6 na FIG. 3a) mas não dos exossomas de fibroblastos humanos normais (Ver Linhagem 5 na FIG. 3a). O fragmento de 216 bp não pôde ser amplificado a partir de exossomas de todas as três origens. Entretanto, fragmentos tanto de 112 bp quanto de 216 bp foram amplificados quando o DNA genômico isolado da célula de glioblastoma foi usado como padrão (Ver a Linhagem 3 na FIG. 3a). Assim, o DNA de GAPDH unido existe dentro de exossomas isolados a partir de células de tumor mas não dentro de exossomas isolados a partir de células de fibroblasto normais.

[0111] Ao contrário, em um outro experimento, exossomas isolados não foram tratados com DNase antes de serem lisados para a extração de DNA (FIG. 3b). Não apenas os fragmentos de 112 bp mas também os fragmentos de 216 bp foram amplificados a partir de exossomas isolados de células de melanoma primário (Ver a Linhagem 3 na FIG. 3b), sugerindo que DNA de GAPDH não unido ou cDNA parcialmente unido que foi transcrito de modo reverso existe fora dos exossomas.

[0112] Para o gene de Retrovírus K Endógeno Humano (HERV-K), os seguintes iniciadores foram usados: HERVK_6Forw (SEQ ID NO:3) e HERVK_6Rev (SEQ ID NO:4). O par de iniciadores amplifica um amplicon de 172 bp. O DNA foi extraído a partir de exossomas que foram isolados e tratados com DNase, e usados como o padrão para a amplificação pela PCR. Como mostrado na FIG. 3c, fragmentos de 172 bp foram amplificados em todos os exossomas de tumor e soro humano normal mas não em exossomas de fibroblastos humanos normais. Estes dados sugerem que exossomas diferentes de fibroblastos humanos normais, exossomas de tumor e soro humano normal contêm sequências de DNA de retrovírus endógeno. Para examinar se exossomas de tumor também contêm elementos transponíveis, os seguintes iniciadores específicos da LINHAGEM 1 foram usados para as amplificações pela PCR: Line1_Forw (SEQ ID NO:5) e Line1_Rev (SEQ ID NO:6). Estes dois iniciadores são planejados para detectar LINHAGEM-1 em todas as espécies visto que cada iniciador contêm quantidades iguais de dois oligos diferentes. Para o iniciador Line1_Forw, um oligo contém um C e o outro oligo contém um G na posição designada com “s”. Para o iniciador Line1_Rev, um oligo contém um A e o outro oligo contém um G na posição designada com “r”. O par de iniciadores amplifica um amplicon de 290 bp. O padrão foi o DNA extraído de exossomas que foram tratados com DNase (como descrito acima). Como mostrado na FIG. 3e, fragmentos de 290 bp da LINHAGEM-1 puderam ser amplificados a partir dos exossomas de células de tumor e soro humano normal mas não de exossomas dos fibroblastos humanos normais.

[0113] Para testar se exossomas também contêm DNA de Tenascina-C, o seguinte par de iniciadores foi usado para realizar a PCR: Tenascina C Forw (SEQ ID NO:7) e Tenascina C Rev (SEQ ID NO:8). O par de iniciadores amplifica um amplicon de 197 bp. O padrão foi o DNA extraído de exossomas que foram isolados e depois tratados com DNase antes da lise. Como mostrado na FIG. 3d, fragmentos de Tenascina C de 197 bp foram amplificados em exossomas de células de tumor ou soro humano normal mas não em exossomas de fibroblastos humanos normais. Assim, o DNA da Tenascina-C existe em exossomas de tumor e soro humano normal mas não em exossomas de fibroblastos humanos normais.

[0114] Para confirmar ainda mais a presença de DNA em exossomas, DNA exossômico foi extraído de células de meduloblastoma D425 usando o método descrito acima. Especificamente, os exossomas foram isolados e tratados com DNase antes da lise. Volumes iguais do extrato de DNA final foram tratados com DNase ou não tratados com DNase antes de serem visualizados pelo tingimento com Brometo de Etídio em 1% de gel de agarose. O Brometo de Etídio é um corante que especificamente tinge ácidos nucleicos e pode ser visualizado sob luz ultravioleta. Como mostrado na FIG. 3f, o tingimento com Brometo de Etídio desapareceu depois do tratamento com DNase (Ver Linhagem 3 na FIG. 3f) enquanto tingimento forte pôde ser visualizado na alíquota não tratada (Ver a Linhagem 2 na FIG. 3f). Os extratos tratados e não tratados com DNase foram também analisados em um chip de pico de RNA (Agilent Technologies). Como mostrado na FIG. 3g, o DNA de filamento único pôde ser facilmente detectado no extrato não tratado com DNase (Ver o painel superior na FIG. 3g) mas pôde ser escassamente detectado no extrato tratado com DNase (Ver o painel inferior na FIG. 3g).

[0115] Para testar se o DNA extraído foi de filamento único, os ácidos nucleicos foram extraídos dos exossomas tratados como descrito no parágrafo anterior e tratados ainda com RNAse para eliminar qualquer contaminação de RNA. Os ácidos nucleicos tratados foram depois analisados em uma lasca de bioanalisador de pico de RNA e em um chip DNA 1000. O chip de pico de RNA detecta apenas ácidos nucleicos de filamento único. A lasca de DNA 1000 detectou ácidos nucleicos de filamento duplo. Como mostrado na FIG. 3h, ácidos nucleicos de filamento único foram detectados (Ver painel superior) mas ácidos nucleicos de filamento duplo não foram detectados (Ver painel inferior). Assim, o DNA contido dentro de exossomas de tumor são principalmente de filamento único.

[0116] Para demonstrar que o DNA de filamento único existe em células de tumor mas não em fibroblastos humanos normais, os ácidos nucleicos foram extraídos dos exossomas de soro de paciente com glioblastoma ou fibroblastos humanos normais. Os exossomas foram tratados com DNase antes da lise e os ácidos nucleicos purificados foram tratados com RNase antes da análise. Como mostrado na FIG. 3i, ácidos nucleicos exossômicos extraídos de soro de paciente com glioblastoma puderam ser detectados por um chip de pico de RNA. Ao contrário, apenas uma quantidade muito pequena de DNA de filamento único foi extraída de fibroblastos humanos normais.

[0117] Consequentemente, os exossomas de células de tumor e soro humano normal foram descobertos conter DNA de filamento único. O DNA de filamento único é um produto da transcrição reversa visto que os produtos de amplificação não contêm introns (FIG. 3a e FIG. 3b). É conhecido que as células de tumor assim como as células progenitoras/células tronco normais têm atividade de transcriptase reversa (RT) ativa embora a atividade nas células progenitoras/células tronco normais seja relativamente muito mais baixa. Esta atividade de RT torna plausível que os transcritos de RNA na célula possam ser transcritos de modo reverso e empacotados dentro de exossomas como cDNA. DE maneira interessante, os exossomas de células de tumor contêm mais cDNAs que correspondem aos transcritos de gene específicos de tumor visto que as células de tumor usualmente têm atividade de transcriptase reversa supra-regulada. Portanto, o cDNA específico de tumor em exossomas pode ser usado como biomarcadores para o diagnóstico ou prognóstico de tipos de tumor diferentes. O uso de cDNAs como biomarcadores pularia a etapa de transcrição reversa comparada com o uso de mRNA como biomarcadores para tumores. Além disso, o uso de cDNA exossômico é vantajoso em relação ao uso de DNA de soro integral/plasma porque o soro/plasma contêm DNA genômico dispensado de células mortas. Quando do teste de DNA do soro integral/plasma amplificado, haverá mais fundo. Exemplo 4: A maior parte do RNA extracelular em soro humano está contida dentro de exossomas.

[0118] Para determinar a quantidade de RNA circulando em soro como complexo de proteína “livre de RNA”/RNA versus a quantidade de RNA contida dentro dos exossomas, nós isolamos soro de um paciente humano saudável, e dividimos uniformemente o soro em duas amostras com volume igual. Para a amostra 1, o soro foi ultracentrifugado para remover a maior parte das microvesículas. Depois o sobrenadante sérico foi coletado e o RNA deixado no sobrenadante foi extraído usando Trizol LS. Para a amostra 2, o soro não foi ultracentrifugado e o RNA total foi extraído do soro usando Trizol LS. A quantidade de RNA no sobrenadante da amostra 1 e no soro da amostra 2 foi medida. Como um resultado, foi descoberto que a quantidade de RNA livre no sobrenadante da amostra 1 foi menor do que 10% da quantidade de RNA total isolado do soro da amostra 2. Portanto, uma maioria do RNA no soro está associada com os exossomas. Exemplo 5: Alta eficiência de extração de ácido nucleico no soro extracelular é obtido incorporando-se uma etapa de isolação de exossoma sérico.

[0119] O soro integral e plasma contêm grandes quantidades de DNA circulante e possivelmente também RNA protegido em complexos de proteína, embora o RNA livre tenha uma meia-vida de uns poucos minutos no soro. Os perfis de ácido nucleico extracelular no soro variam entre mamíferos normais e doentes e assim podem ser biomarcadores para certas doenças. Para examinar os perfis, os ácidos nucleicos necessitam ser extraídos. Entretanto, a extração direta de ácidos nucleicos do soro e plasma não é prática, especialmente de volumes de soro/plasma grandes. Neste caso, volumes grandes de Trizol LS (um reagente de extração de RNA) são usados para inativar instantaneamente todas as nucleases séricas antes de extrair os ácidos nucleicos exossômicos. Subsequentemente, os contaminantes precipitam na amostra e afetam as análises subsequentes. Como mostrado no Exemplo 4, a maior parte dos RNAs extracelulares no soro são contidos nos exossomas séricos. Portanto, nós testamos se é mais eficiente isolar ácidos nucleicos extracelulares pela isolação dos exossomas séricos antes da extração de ácido nucleico.

[0120] Quatro mililitros (ml) de soro do sangue de um paciente foram divididos em 2 alíquotas de 2 ml cada uma. Os exossomas séricos de uma alíquota foram isolados antes da extração de RNA. Os métodos de isolação de exossoma e de extração de RNA são os mesmos como mencionados no Exemplo 2. Para a outra alíquota, o RNA foi extraído diretamente usando Trizol LS de acordo com a recomendação do fabricante. Os ácidos nucleicos destas duas extrações foram analisados em um chip de RNA do Bioanalisador (Agilent Technologies). Como mostrado na Figura 4, a quantidade de RNA extraído com o primeiro método é significantemente maior do que aquela obtida a partir do último método. Além disso, a qualidade do RNA extraído com o último método é relativamente pobre comparada com aquela do primeiro método. Assim, a etapa de isolação de exossoma contribui para a eficiência da extração de RNA extracelular do soro.

Exemplo 6: Análise de microarranjo de mRNA.

[0121] A análise de microarranjo da população de mRNA em células de glioblastoma e microvesículas derivadas destas foi realizada pela Miltenyi Biotech (Auburn, CA, USA) usando o Microarranjo de Genoma Humano Integral da Agilent, 4x44K, arranjo de duas cores. A análise de microarranjo foi realizada em duas preparações de RNA diferentes das células de glioblastoma primárias e suas preparações de RNA em microvesículas correspondentes preparadas como descrito nos Exemplos 1 e 2. Os dados foram analisados usando o software GeneSifter (Vizxlabs, Seattle, WA, USA). O software Intersector (Vizxlabs) foi usado para extrair os genes facilmente detectados em ambos os arranjos. Os dados de microarranjo foram depositados no Fene Expression Omnibus da NCBIe são acessíveis através da série GEO número de acesso GSE13470.

[0122] Nós descobrimos aproximadamente 22.000 transcritos de gene nas células e 27.000 transcritos de gene nas microvesículas que foram detectadas em níveis bem acima do fundo (99% de intervalo de confidência) em ambos os arranjos. Aproximadamente 4.700 mRNAs diferentes foram detectados exclusivamente nas microvesículas em ambos os arranjos, indicando um processo de enriquecimento seletivo dentro das microvesículas. Compatível com isto, houve uma correlação global deficiente nos níveis de mRNAs nas microvesículas quando comparadas com as suas células de origem a partir de duas preparações de célula de tumor (FIGS. 2a e 2b). Ao contrário, houve uma boa correlação nos níveis de mRNA a partir de uma cultura de célula (a) versus a segunda cultura de célula (B) (FIG. 2c) e uma correlação similar nos níveis de mRNA a partir das microvesículas (A) e (B) correspondentes (FIG. 2d). Consequentemente, existe uma consistência de distribuição de mRNA dentro das células de tumor e microvesículas. Em comparação a razão de transcritos nas microvesículas versus as suas células de origem, nós descobrimos 3.426 transcritos diferentemente distribuídos mais do que 5 vezes (valor p <0,01). Destes, 2.238 transcritos foram enriquecidos (até 380 vezes) e 1.188 transcritos foram menos abundantes (até 90 vezes) do que nas células (FIG. 5). As intensidades e razões de todos os transcritos de gene foram documentados. As ontologias de transcritos de mRNA enriquecidos ou reduzidos mais do que 10 vezes foram registrados e revisados.

[0123] Os transcritos de mRNA que foram altamente enriquecidos nas microvesículas não foram sempre aqueles que foram mais abundantes nas microvesículas. Os transcritos mais abundantes seriam mais prováveis de gerar um efeito na célula receptora na liberação, e portanto os 500 transcritos de mRNA mais abundantes presentes nas microvesículas foram divididas em processos biológicos diferentes com base nas suas descrições de ontologia (FIG. 6a). Das várias ontologias, a angiogênese, proliferação celular, resposta imune, migração celular e modificação de histona foram selecionadas para estudo adicional visto que as mesmas representam funções específicas que podem estar envolvidas na remodelagem do estroma de tumor e realçar o crescimento do tumor. Os mRNAs de microvesícula de glioblastoma pertencentes a estas cinco ontologias foram plotados para comparar seus níveis e contribuição para o espectro de mRNA (FIG. 6b). Todas as cinco ontologias contiveram mRNAs com níveis de expressão muito altos comparado com o nível de intensidade de sinal médio do arranjo.

[0124] Uma análise completa de mRNAs que são enriquecidos nas microvesículas versus células doadoras, sugere que possa haver um mecanismo celular para a localização destas mensagens em microvesículas, possivelmente via um “código de endereçamento” na 3’UTR como descrito para mRNAs traduzidos em localizações celulares específicas, tais como aquelas para a beta actina (Kislauskis et al., 1994). A conformação dos mRNAs nas microvesículas não é conhecida, mas elas podem estar presentes como partículas ribonucleares (RNPs) (Mallardo et al., 2003) que poderiam então prevenir a degradação e tradução prematura na célula doadora.

[0125] A análise de microarranjo das populações de mRNA em células de glioblastoma e microvesículas derivadas das células de glioblastoma, células de melanoma, e microvesículas derivadas de células de melanoma foi realizada pela Illumina Inc. (San Diego, CA, USA) usando o Ensaio de Recozimento, Seleção, Extensão e Ligação mediados pelo cDNA do Genoma Inteiro (DASL). O Ensaio de DASL de do Genoma Inteiro combina a PCR e etapas de rotulação do Ensaio de DASL da Illumina com a hibridização com base em gene e conjunto de sonda de genoma inteiro de HumanRef-8 BeadChip da Illumina. Este BeadChip abrange mais do que 24.000 genes anotados derivados de RefSeq (Build 36.2, Release 22). A análise de microarranjo foi realizada em duas preparações de RNA diferentes das células de glioblastoma primárias, microvesículas de células de glioblastomas (derivadas com o método como descrito nos Exemplos 1 e 2), células de melanoma, e microvesículas de células de melanoma (derivadas com o método como descrito nos Exemplos 1 e 2).

[0126] Os dados de expressão para cada preparação de RNA foram reunidos juntos e usados para gerar um diagrama de grupo. Como mostrado na FIG. 7, os perfis de expressão de mRNA para as células de glioblastoma, microvesículas de células de glioblastomas, células de melanoma, e microvesículas de células de melanoma são agrupadas juntas, respectivamente. Os perfis de expressão das duas linhagens de célula de glioblastoma primárias 20/3C e 11/5c são agrupadas com uma distância de cerca de 0,06. Os perfis de expressão das duas linhagens de célula de melanoma primária 0105C e 0664C são agrupadas com uma distância de cerca de 0,09. Os perfis de expressão de exossomas das duas linhagens de célula de melanoma primária 0105C e 0664C são agrupadas juntas com uma distância em torno de 0,15. Os perfis de expressão de exossomas das duas linhagens de célula de glioblastoma primárias 20/3C e 11/5c são agrupadas juntas com uma distância em torno de 0,098. Assim, os exossomas de glioblastoma e melanoma têm assinaturas de expressão de mRNA distintivas e a assinatura de expressão de gene de exossomas difere daquela de suas células originais. Estes dados demonstram que os perfis de expressão de mRNA de microvesículas podem ser usadas nos métodos aqui descritos para o diagnóstico e prognóstico de cânceres.

Exemplo 7: Microvesículas de glioblastoma contém miRNA

[0127] miRNA maduro de microvesículas e de células doadoras foi detectado usando uma PCR de transcrição reversa de miRNA quantitativa. Especificamente, o RNA total foi isolado das microvesículas e das células doadoras usando o kit de isolação de RNA mirVana (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Usando os kits de Ensaio TaqMan® MicroRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 30 ng de RNA total foi convertido em cDNA usando miR-iniciadores específicos e ainda amplificados de acordo com o protocolo do fabricante.

[0128] Um subconjunto de 11 miRNAs entre aqueles conhecidos como estando supra-regulados e abundantes em gliomas foi analisado em microvesículas purificadas a partir de dois glioblastomas primários diferentes (GBM 1 e GBM 2). Este subconjunto conteve let-7a, miR-15b, miR-16, miR-19b, miR-21, miR-26a, miR-27a, miR-92, miR-93, miR-320 e miR-20. Todos estes miRNA foram facilmente detectados em células doadoras e em microvesículas (FIG. 8). Os níveis foram no geral mais baixos nas microvesículas por μg de RNA total do que nas células precursoras (10%, correspondendo a aproximadamente 3 valores Ct), mas os níveis foram bem correlacionados, indicando que estas 11 espécies de miRNA não são enriquecidas em microvesículas.

[0129] Análise de microarranjo das populações de microRNA em células de glioblastoma e microvesículas derivadas de células de glioblastoma, células de melanoma, e microvesículas derivadas de células de melanoma foi realizada pela Illumina Inc. (San Diego, CA, USA) usando o Painel de Definição de Perfil de Expressão de MicroRNA, alimentado pelo Ensaio DASL. Os Painéis de MicroRNA humanos inclui 1146 espécies de microRNA. A análise de microarranjo foi realizada em duas preparações de RNA diferentes das células de glioblastoma primárias, microvesículas de células de glioblastomas (derivadas usando o método descrito nos Exemplos 1 e 2), células de melanoma, e microvesículas de células de melanoma (derivadas usando o método descrito nos Exemplos 1 e 2).

[0130] Os dados de expressão para cada preparação de RNA foram reunidas juntas e usadas para gerar um diagrama de grupo. Como mostrado na FIG. 9, os perfis de expressão de microRNA para as células de glioblastoma, microvesículas de células de glioblastomas, células de melanoma, e microvesículas de células de melanoma são agrupadas juntas, respectivamente. Os perfis de expressão das duas linhagens de célula de melanoma primário 0105C e 0664C são agrupadas com uma distância de cerca de 0,13. Os perfis de expressão das duas linhagens de célula de glioblastoma primária 20/3C e 11/5c são agrupadas com uma distância de cerca de 0,12. Os perfis de expressão de exossomas das duas linhagens de célula de glioblastoma primária 20/3C e 11/5c são agrupadas juntas com uma distância em torno de 0,12. Os perfis de expressão de exossomas das duas linhagens de célula de melanoma primária 0105C e 0664C são agrupadas juntas com uma distância em torno de 0,17. Assim, exossomas de glioblastoma e melanoma têm assinaturas de expressão de microRNA distintas e que a assinatura de expressão de gene de exossomas difere daquela das suas células originais. Além disso, como aqui demonstrado, os perfis de expressão de microRNA de microvesículas podem ser usados nos métodos aqui descritos para o diagnóstico e prognóstico de cânceres.

[0131] A descoberta de miRNAs nas microvesículas sugere que as microvesículas derivadas de tumor podem modificar as células normais circundantes pela mudança dos seus perfis transcricionais/traducionais. Além disso, como aqui demonstrado, o perfil de expressão de miRNA de microvesículas pode ser usado nos métodos aqui descritos para o diagnóstico e prognóstico de cânceres, incluindo mas não limitados à glioblastoma.

[0132] Exemplos de 8 a 15. Estes exemplos mostram que os ácidos nucleicos dentro dos exossomas de fluidos corporais podem ser usados como biomarcadores para doenças ou outras condições médicas.

Exemplo 8: Os perfis de expressão de miRNAs nas microvesículas podem ser usados como biomarcadores sensíveis para glioblastoma.

[0133] Para determinar se microRNAs dentro dos exossomas podem ser usados como biomarcadores para uma doença e/ou condição médica, nós examinamos a existência de uma correlação entre o nível de expressão de microRNA e a situação da doença. Visto que microRNA-21 é expressado em altos níveis em células de glioblastoma e é facilmente detectável em exossomas isolados de soro de pacientes com glioblastoma, nós medimos quantitativamente os números de cópia de microRNA-21 dentro dos exossomas dos soros de pacientes com glioblastoma pela RT-PCR quantitativa. Especificamente, os exossomas foram isolados a partir de 4 ml de amostras de soro de 9 pacientes humanos normais e 9 pacientes com glioblastoma. O procedimento de extração de RNA foi similar ao procedimento de extração de RNA como descrito no Exemplo 2. O nível de miR-21 foi analisado usando singleplex qPCR (Applied Biosystems) e normalizado ao nível de expressão de GAPDH.

[0134] Como mostrado na FIG. 10, o valor de Ct médio foi 5,98 mais baixo na amostra de soro de glioblastoma, sugerindo que o nível de expressão de miRNA-21 exossônico em pacientes com glioblastoma é aproximadamente 63 vezes mais alto do que aquele em um paciente humano normal. A diferença é estatisticamente significante com um valor p de 0,01. Portanto, existe uma correlação entre o nível de expressão de microRNA-21 e a situação da doença de glioblastoma, que demonstra que a validade e aplicabilidade dos métodos de diagnóstico não invasivos aqui divulgados. Por exemplo, em um aspecto, o método compreendeu as etapas de isolar exossomas do fluido corporal de um paciente e analisar os níveis de expressão de microRNA-21 dentro dos exossomas pela medição do número de cópia de microRNA-21 e comparando o número com aquele dentro dos exossomas de um paciente normal ou a um número padrão gerado analisando-se os conteúdos de micro-RNA-21 dentro de exossomas de um grupo de pacientes normais. Um número de cópia aumentado indica a existência de glioblastoma no paciente; enquanto que a ausência de um número de cópia aumentado indica a ausência de glioblastoma no paciente. Este método básico pode ser extrapolado para diagnosticar/monitorar outras doenças e/ou condições médicas associadas com outras espécies de microRNAs.

Exemplo 9: mRNAs em microvesículas podem ser usados como biomarcadores sensíveis para diagnóstico

[0135] Os ácidos nucleicos são de alto valor como biomarcadores por causa de sua capacidade a ser detectada com alta sensibilidade pelos métodos de PCR. Consequentemente, os seguintes testes foram planejados e realizados para determinar se o mRNA em microvesículas pode ser usado como biomarcadores para uma doença ou condição médicas, neste caso tumores de glioblastoma. O receptor de mRNA do fator de crescimento epidérmico (EGFR) foi selecionado porque a expressão da mutação EGFRvIII é específica para alguns tumores e define um subtipo clinicamente distinto de glioma (Pelloski et al., 2007). Além disso, as mutações EGFRvIII tradicionalmente não podem ser detectadas usando tecidos outros que não os tecidos de lesão visto que estas mutações são mutações somáticas mas não mutações da linha germinativa. Portanto, uma biópsia de tecidos lesionados tais como tumor de glioma é convencionalmente requerido detectar as mutações de EGFRvIII. Como detalhado abaixo, a RT- PCR abrigada foi usada para identificar mRNA de EGFRvIII em amostras de biópsia de tumor de glioma e os resultados comparados com as espécies de mRNA encontradas em microvesículas purificadas a partir de uma amostra de soro do mesmo paciente.

[0136] As microvesículas foram purificadas a partir de células de glioblastoma humanas primárias seguido pela extração de RNA tanto das microvesículas quanto das células doadoras (biópsia). As amostras foram codificadas e as PCRs foram realizadas em uma maneira cega. Gli-36EGFRvIII (célula de glioma humana que expressa estavelmente EGFRvIII) foi incluída como um controle positivo. As microvesículas de 0,5 a 2 ml de amostras de soro congeladas foram pelotizadas como descrito no Exemplo 2 e o RNA foi extraído usando o kit de isolação de RNA de Microvesículas MirVana. A RT-PCR abrigada foi depois usada para amplificar os transcritos tanto de EGFR do tipo selvagem (1153 bp) quanto de EGFRvIII (352 bp) tanto das microvesículas quanto das células doadoras usando o mesmo conjunto de iniciadores. Especificamente, o RNA foi convertido para cDNA usando o kit Omniscript RT (Qiagen Inc, Valencia, CA, USA) de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. Os iniciadores de GAPDH foram GAPDH Avançado (SEQ ID NO:9) e GAPDH Reverso (SEQ ID NO:10). Os iniciadores de PCR1 de EGFR/EGFRvIII foram SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:12. Os iniciadores de PCR2 de EGFR/EGFRvIII foram SEQ ID NO:13 e SEQ ID NO:14. O protocolo de ciclagem de PCR foi 94°C por 3 minutos; 94°C por 45 segundos, 60°C por 45 segundos, 72°C por 2 minutos por 35 ciclos; e uma etapa final de 72°C por 7 minutos.

[0137] Nós analisamos a amostra de biópsia para determinar se o mRNA de EGFRvIII foi presente e comparamos o resultado com RNA extraído de exossomas purificados a partir de uma amostra de soro congelada do mesmo paciente. Quatorze das 30 amostras de tumor (47%) contiveram o transcrito EGFRvIII, que é compatível com a porcentagem de glioblastomas encontrados conter esta mutação em outros estudos (Nishikawa et al., 2004). EGFRvIII pôde ser amplificado a partir de exossomas em sete dos 25 pacientes (28%) dos quais o soro foi drenado em torno do momento da cirurgia (FIG. 11 e Tabela 1). Quando um novo par de iniciadores da PCR3 de EGFR/EGFRvIII: SEQ ID NO:15 e SEQ ID NO:16, foram usados como o segundo par de iniciador para a amplificação pela PCR abrigada acima, mais indivíduos foram descobertos abrigar as mutações EGFRvIII (Tabela 1). EGFRvIII pôde ser amplificado a partir dos exossomas nos seis pacientes que foram identificados como negativos com o par velho de iniciadores da PCR2 de EGFRvIII: SEQ ID NO:13 E SEQ ID NO:14. Notavelmente, os exossomas do indivíduo 13, cuja biópsia não mostrou a mutação de EGFRvIII, foi mostrado conter a mutação EGFRvIII, sugerindo uma sensibilidade aumentada de detecção da mutação de EGFRvIII usando a tecnologia dos exossomas. A partir dos exossomas isolados de 52 amostras de soro de controle normais, EGFRvIII não pôde ser amplificado (FIG. 12). De modo interessante, dois pacientes com uma amostra de tumor negativo em EGFRvIII voltaram a ser positivos em EGFRvIII nos exossomas séricos, sustentando focos heterogêneos de expressão de EGFRvIII no tumor de glioma. Além disso, nossos dados também mostraram que RNAs intactos em microvesículas foram, inesperadamente, capazes de serem isolados de soro corporal congelado de pacientes com glioblastoma. Estas amostras de soro cegas de pacientes com glioblastoma confirmado foram obtidos da Cancer Research Center (VU medical center, Amsterdam, Países Baixos) e foram mantidas a-80°C até o uso. A identificação de RNAs específicos de tumor em microvesículas séricas possibilita a detecção de mutações somáticas que estão presentes nas células de tumor. Tal tecnologia deve resultar em diagnóstico e decisões terapêuticas melhorados.

[0138] O RNA encontrado nas microvesículas contém um “instantâneo” de um arranjo substancial do perfil de expressão de gene celular em um dado tempo. Entre o mRNA encontrado em microvesículas derivadas de glioblastoma, o mRNA de EGFR é de interesse especial visto que a variante de junção de EGFRvIII é especificamente associada com glioblastomas (Nishikawa et al., 2004). Aqui é demonstrado que os tumores cerebrais liberam microvesículas na corrente sanguínea através da barreira hematoencefálica (BBB), que não foi antes mostrado. É ainda demonstrado que as variantes de mRNA, tais como EGFRvIII em tumores cerebrais, são capazes de serem detectados por um método que compreende as etapas de isolar exossomas de uma quantidade pequena de soro do paciente e analisar o RNA nas ditas microvesículas.

[0139] O conhecimento da mutação de EGFRvIII em tumores é importante na escolha de um regime de tratamento ótimo. Os gliomas positivos em EGFRvIII são mais de 50 vezes mais prováveis de responder ao tratamento com inibidores de EGFR como erlotinib ou gefitinib (Mellinghoff et al., 2005).

Exemplo 10: Diagnóstico de distúrbios do metabolismo do ferro

[0140] Os método de diagnóstico de exossoma pode ser adaptado para outros propósitos como mostrado pelo exemplo que segue.

[0141] Hepcidina, um peptídeo antimicrobiano, é o regulador hormonal mestre do metabolismo do ferro. Este peptídeo é produzido principalmente no fígado de mamíferos e é controlado pela atividade eritropoiética da medula óssea, a quantidade de ferro no corpo circulante e armazenado, e inflamação. Na estimulação, a hepcidina é secretada na circulação ou urina onde a mesma pode atuar sobre as células que expressam a ferroportina alvo. A ferroportina é o único exportador de ferro identificado até agora e quando ligado à hepcidina, o mesmo é internalizado e degradado. A destruição resultante da ferroportina leva à retenção de ferro nas células que expressam a ferroportina tais como macrófagos e enterócitos. Este mecanismo fisiopatológico está subordinado à anemia das doenças crônicas. Mais especificamente, níveis inadequadamente altos de hepcidina e teor de ferro elevado dentro do sistema reticuloendotelial caracterizam a anemia. De fato, a anemia pode estar associada com muitas doenças e/ou condições médicas tais como infecções (agudas e crônicas), câncer, autoimune, rejeição crônica depois do transplante de órgão sólido, e doença renal crônica e inflamação (Weiss e Goodnough, 2005). Por outro lado, em uma doença de sobrecarga de ferro genética tal como na hemocromatose hereditária, níveis de expressão inadequadamente baixos de hepcidina encorajam um efluxo excessivo potencialmente fatal de ferro de dentro do sistema reticuloendotelial. Assim, a hepcidina é supra-regulada na anemia associada com doença crônica, mas infra-regulada na hemocromatose.

[0142] Correntemente, não existe nenhum ensaio adequado para medir quantitativamente os níveis de hepcidina na circulação ou urina (Kemna et al., 2008) exceto a espectrometria por massa de tempo de vôo (TOF MS), que necessita equipamento altamente especializado, e portanto não é facilmente acessível. Recentemente, o método de Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzima (ELISA) foi proposto medir quantitativamente os níveis hormonais de hepcidina mas este método não é consistente por causa da falta de correlações claras com a hepcidina (Kemna et al., 2005; Kemna et al., 2007) e outros parâmetros relacionados com o ferro (Brookes et al., 2005; Roe et al., 2007).

[0143] O mRNA da hepcidina foi detectado em exossomas a partir de soro humano, como segue. Os exossomas foram primeiro isolados a partir do soro humano e seus conteúdos de mRNA extraídos antes da conversão ao cDNA e amplificação pela PCR. Os iniciadores de PCR foram planejados para amplificar um fragmento de 129 nucleotídeos de Hepcidina humana. As sequências dos iniciadores são SEQ ID NO:57 e SEQ ID NO:58. Um transcrito de hepcidina de 129 nucleotídeos (o pico intermediário na FIG. 13D) foi facilmente detectado pelo Bioanalisador. Como um controle positivo (FIG. 13B), o RNA de uma linhagem de célula de hepatoma humano Huh-7 foi extraído e convertido ao cDNA. O Controle Negativo (FIG. 13C) é sem mRNA. Estes Dados de Bioanalisador também são mostrados no pseudogel na FIG. 13A.

[0144] O mRNA da hepcidina em microvesículas em circulação correlaciona-se com o mRNA da hepcidina em células hepáticas. Consequentemente, medir o mRNA da hepcidina dentro das microvesículas em uma amostra de fluido corporal permitiria que uma pessoa diagnosticasse ou monitorasse a anemia ou hemocromatose no paciente.

[0145] Assim, é possível diagnosticar e/ou monitorar a anemia e a hemocromatose em um paciente pela isolação de microvesículas a partir de um fluido corporal e comparar o mRNA da hepcidina nas ditas microvesículas com o mRNA de um paciente normal. Com um paciente anêmico, o número de cópia de mRNA é aumentado em relação ao normal, o nível não anêmico. Em um paciente que sofre de hemocromatose, o número de cópia é a diminuição em relação ao mRNA em um paciente normal.

Exemplo 11: Descrição de perfil transcricional não invasivo de exossomas para o diagnóstico da nefropatia diabética

[0146] A nefropatia diabética (DN) é uma complicação ameaçadora da vida que correntemente carece de tratamentos específicos. Assim, existe uma necessidade para desenvolver diagnósticos sensíveis para identificar pacientes que desenvolvem ou em risco de desenvolver DN, permitindo a intervenção precoce e monitoramento.

[0147] A análise de urina fornece um modo para examinar a função renal sem ter que tirar uma biópsia. Até agora, esta análise foi limitada ao estudo da proteína na urina. Este Exemplo apresenta um método para se obter a partir dos perfis transcricionais da urina derivados de células que normalmente apenas poderiam ser obtidas pela biópsia renal. Especificamente, o método compreende as etapas de isolar exossomas da urina e analisar os RNAs dentro dos ditos exossomas para se obter perfis transcricionais, que podem ser usados para examinar mudanças moleculares que são feitas pelas células renais em indivíduos diabéticos e fornecer um ‘instantâneo’ de qualquer nova proteína que é fabricada pelo rim. As tecnologias no estado da técnica para se obter os perfis de transcrição exossômica incluem, mas não são limitadas a, arranjos de hibridização contemporâneos, tecnologias com base na PCR, e métodos de sequenciamento da geração seguinte. Visto que o sequenciamento direto não requer iniciadores pré-planejados ou oligos de DNA manchados, o mesmo fornecerá uma descrição imparcial dos perfis de RNA exossômico. Um exemplo de tecnologia de sequenciamento da geração seguinte é fornecido pelo Analisador de Genoma Illumina, que utiliza a tecnologia de sequenciamento maciçamente paralelo que permite sequenciar o equivalente de 1/3 de um genoma humano por rodada. Os dados obteníveis a partir desta análise possibilitaria que se examinasse rápida e compreensivamente o perfil transcricional exossômico urinário e possibilitaria a comparação em relação ao rim inteiro. Usando um tal método, poder-se-ia obter muita informação necessária com respeito ao perfil de transcrição de exomas urinários. Uma comparação de transcritos em exomas urinários de controle versus derivados da diabete supriria uma pessoa com uma lista compreensiva de biomarcadores tanto prognosticáveis quanto novos para a nefropatia diabética.

[0148] De modo a provar a praticabilidade do método de diagnóstico descrito acima, um experimento foi planejado e realizado para isolar exomas urinários e para confirmar a presença de biomarcadores específicos renais dentro destes exossomas. Neste experimento, uma amostra de urina pela manhã fresca de 220 ml foi coletada de um paciente do sexo masculino saudável de 28 anos de idade e processada via centrifugação diferencial para isolar exomas urinários. Especificamente, a urina foi primeiro girada a 300 x g por 10 minutos para remover quaisquer células da amostra. O sobrenadante foi coletado e depois submetido a um giro de 16.500 x g por 20 minutos para sedimentar quaisquer fragmentos de célula ou agregados de proteína. O sobrenadante foi depois passado através de um filtro de membrana de 0,22 μM para remover fragmentos com diâmetros maiores do que 0,22 μM. Finalmente, a amostra foi submetida à ultra-centrifugação a 100.000 x g por 1 hora para pelotizar os exossomas (Thery et al., 2006). A pelota foi suavemente lavada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o RNA foi extraído usando um kit Qiagen RNeasy de acordo com as instruções do fabricante. O RNA isolado foi convertido ao cDNA usando o kit Omniscript RT (Qiagen) seguido pela amplificação pela PCR de genes renais específicos.

[0149] Os genes renais específicos examinados e sua área renal correspondente onde o gene é expressado são como segue: AQP1 - túbulos proximais; AQP2 - túbulo distal (células principais); CUBN - túbulos proximais; LRP2 - túbulos proximais; AVPR2 - túbulos proximais e distais; SLC9A3 (NHE-3)-Túbulo proximal; ATP6V1B1 - túbulo distal (células intercaladas); NPHS1 - glomérulo (células podocíticas); NPHS2 - glomérulo (células podocíticas); e CLCN3 -células intercaladas Tipo B de dutos de coleta. As sequências dos iniciadores planejados para amplificar cada gene são AQP1-F (SEQ ID NO:17) e AQP1-R (SEQ ID NO:18); AQP2-F (SEQ ID NO: 19) e AQP2-R (SEQ ID NO: 20); CUBN-F (SEQ ID NO: 21) e CUBN-R (SEQ ID NO: 22); LRP2-F (SEQ ID NO: 23) e LRP2-R (SEQ ID NO: 24); AVPR2-F (SEQ ID NO: 25) e AVPR2-R (SEQ ID NO: 26); SLC9A3-F (SEQ ID NO: 27) e SLC9A3-R (SEQ ID NO: 28); ATP6V1B1-F (SEQ ID NO: 29) e ATP6V1B1-R (SEQ ID NO: 30); NPHS1-F (SEQ ID NO: 31) e NPHS1-R (SEQ ID NO: 32); NPHS2-F (SEQ ID NO: 33) e NPHS2-R (SEQ ID NO: 34); CLCN5-F (SEQ ID NO: 35) e CLCN5-R (SEQ ID NO: 36).

[0150] Os tamanhos esperados dos produtos de PCR para cada gene são AQP1-226bp, AQP2-208bp, CUBN-285bp, LRP2-220bp, AVPR2-290bp, SLC9A3-200bp, ATP6V1B1-226bp, NPHS1-201bp, NPHS2- 266 bp e CLCN5-204bp. O protocolo de ciclagem de PCR foi de 95°C por 8 minutos; 95°C por 30 segundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 45 segundos por 30 ciclos; e uma etapa final de 72°C por 10 minutos.

[0151] Como mostrado na FIG. 14a, as células tubulares renais contêm corpos multivesiculares, que é uma etapa intermediária durante a geração de exossoma. Exossomas isolados destas células podem ser identificados pela microscopia eletrônica (FIG. 14b). A análise de RNA total extraído de exomas urinários indica a presença de espécies de RNA com uma ampla faixa de tamanhos (FIG. 14c). Os RNAs ribossômicos 18S e 28S não foram encontrados. A análise de PCR confirmou a presença de transcritos renais específicos dentro de exomas urinários (FIG. 14d). Estes dados mostram que os exossomas derramados pelas células renais dentro da urina e esses exomas urinários contêm transcritos de origem renal, e que o método do exossoma pode detectar biomarcadores renais associados com certas doenças renais e/ou outras condições médicas.

[0152] Para confirmar ainda mais a presença de transcritos de mRNA renais específicos em exomas urinários, um conjunto independente de experimentos foram realizados usando amostras de urina de seis indivíduos. Os ácidos nucleicos exossômicos foram extraídos de 200 ml de amostras de urina pela manhã de cada indivíduo seguindo um procedimento como mencionado acima. Especificamente, as amostras de urina passaram por centrifugação diferencial partindo com uma centrifugação de 1000 xg para girar células inteiras e fragmentos de célula. O sobrenadante foi cuidadosamente removido e centrifugado a 16.500 xg por 20 minutos. O sobrenadante resultante foi depois removido e filtrado através de um filtro de 0,8 μm para remover fragmentos residuais do sobrenadante contendo exossoma. O sobrenadante final depois passou por ultracentrifugação a 100.000 xg por 1 hora e 10 min. A pelota foi lavada em PBS isento de nuclease e re-centrifugado a 100.000 xg por 1 h e 10 min para se obter a pelota de exossoma que está pronta para a extração de ácido nucleico. Os ácidos nucleicos foram extraídos dos exossomas pelotizados usando o kit de Isolação de RNA Arcturus PicoPure e a concentração e integridade do ácido nucleico foram analisados usando um Bioanalisador (Agilent) Pico chip. Como mostrado na FIG. 14e, os ácidos nucleicos isolados a partir dos exomas urinários variam de indivíduo para indivíduo. Para testar se a presença de biomarcadores renais também varia de indivíduo para indivíduo, amplificações pela PCR foram realizadas para os genes Aquaporin1, Aquaporin2 e Cubilin usando um novo conjunto de par de iniciadores: novo par de iniciadores AQP1: SEQ ID NO: 37 e SEQ ID NO: 38; novo par de iniciadores AQP2: SEQ ID NO: 39 e SEQ ID NO: 40; novo par de iniciadores CUBN: SEQ ID NO: 41 e SEQ ID NO: 42. Estes pares de iniciadores foram planejados especificamente para amplificar os fragmentos de cDNA unidos e transcritos de modo reverso. A transcrição reversa foi realizada usando o kit Qiagen Sensiscript. Como mostrado na FIG. 14f, nenhuma amplificação foi observado no indivíduo 1, provavelmente devido à extração de ácido nucleico falha. AQP1 foi amplificado apenas no indivíduo 2. CUBN foi amplificado nos indivíduos 2 e 3. E AQP2 foi amplificado nos indivíduos 2, 3, 4 e 5. Em comparação o gene da actina (indicado por “Alojamento” na FIG. 14f) foi amplificado nos indivíduos 2, 3, 4, 5 e 6. Estes dados fornecem mais evidência de que os exomas urinários contém transcritos de mRNA específicos renais embora os níveis de expressão sejam diferentes entre indivíduos diferentes.

[0153] Para testar a presença de cDNAs em exomas urinários, uma amostra de urina humana de 200 ml foi dividida em duas amostras de urina de 100 ml. Os exomas urinários foram isolados de cada amostra. Os exossomas de uma amostra foram tratados com DNase e aqueles da outra amostra foram tratados simulado. Os exossomas de cada amostra foram depois lisados para a extração de ácido nucleico usando o kit de isolação de RNA PicoPure (Acturus). Os ácidos nucleicos foram usados como padrões para a amplificação pela PCR abrigada (protocolos de PCR descritos no Exemplo 9) sem transcrição reversa anterior. Os pares de iniciador para amplificar o gene de actina foram Actin-FOR (SEQ ID NO: 43) e Actin-REV (SEQ ID NO: 44); Actin-nest-FOR (SEQ ID NO: 45) e Actin-nest-REV (SEQ ID NO: 46) com um amplicon final esperado de 100 bp com base na sequência de cDNA do gene da actina. Como mostrado na FIG. 14g, os fragmentos de 100 bp foram presentes no controle positivo (cDNA de rim humano como padrões), os exossomas tratados e não tratados com DNase, mas ausentes na linhagem de Controle Negativo (sem padrões). Consequentemente, o cDNA da actina está presente tanto nos exomas urinários de DNase tratados e não tratados.

[0154] Para testar se a maior parte dos ácidos nucleicos extraídos usando o método foram presentes dentro de exossomas, os ácidos nucleicos extraídos dos exossomas tratados e não tratados com DNase foram dissolvidos em volumes iguais e analisados usando um chip RNA Pico (Agilent Technologies). Como mostrado na FIG. 14h, a concentração dos ácidos nucleicos isolados das amostra tratadas com DNase foi 1,131 pg/μl e aquela das amostras não tratadas foi 1,378 pg/μl. Assim, mais do que 80% de ácidos nucleicos extraídos de exomas urinários usando o método acima foram de dentro dos exossomas.

[0155] Para identificar o conteúdo de exomas urinários sistematicamente, os ácidos nucleicos foram extraídos dos exomas urinários e submetido ao Broad Institute para sequenciamento. Aproximadamente 14 milhões de sequências lidas foram geradas, cada uma de 76 nucleotídeos no comprimento. Estas sequências lidas correspondem aos fragmentos de transcritos de DNA/RNA presentes dentro dos exomas urinários. Usando um parâmetro de alinhamento extremamente rígido (100% de identidade com a sequência de tamanho natural), aproximadamente 15% das leituras foram alinhadas ao genoma humano. Esta porcentagem provavelmente aumentaria se critérios de alinhamento menos severos fossem usados. Uma maioria destes 15% de leitura não se alinham com os genes que codificam a proteína mas ao invés com elementos genômicos não codificadores tais como são transposons e vários elementos de repetição da LINE & SINE. Notavelmente, para estas leituras que não são alinhadas ao genoma humano, muitas são alinhadas às sequências virais. Até o grau em que as composições e níveis de ácidos nucleicos contidos em exomas urinários mudam com respeito a uma situação de doença, os perfis dos ácidos nucleicos puderam ser usados de acordo com os presentes métodos como biomarcadores para o diagnóstico de doença.

[0156] Este exemplo demonstra que o método de analisar exossomas da urina pode ser usado para determinar mudanças celulares no rim em doença renal relacionada com a diabete sem ter que tirar uma biópsia renal invasiva de alto risco. O método fornece uma nova e sensível ferramenta de diagnóstico usando exossomas para a detecção inicial de doenças renais tais como nefropatia diabética. Isto possibilitará intervenção e tratamento imediatos. Em soma, o método e a tecnologia de diagnóstico de exossoma aqui descritos fornecem um meio de diagnósticos muito necessários para a nefropatia diabética e outras doenças que são associadas com certos perfis de ácidos nucleicos contidos em exomas urinários.

Exemplo 12: Diagnóstico de câncer da próstata e exomas urinários

[0157] O câncer da próstata é o câncer mais comum nos homens da atualidade. O risco de câncer da próstata é de aproximadamente 16%. Mais do que 218.000 homens nos Estados Unidos foram diagnosticados em 2008. Quanto mais cedo o câncer da próstata é detectado, maiores são as chances de tratamento bem sucedido. De acordo com a American Cancer Society, se os cânceres da próstata são descobertos enquanto que eles ainda estão na própria próstata ou áreas próximas, a taxa de sobrevivência relativa a cinco anos é acima dos 98%.

[0158] Um método de diagnóstico estabelecido é realizado pela medição do nível de antígeno específico da próstata (PSA) no sangue, combinado com um exame retal digital. Entretanto, tanto a sensibilidade quanto a especificidade do teste de PSA requer melhora significante. Estes resultados de especificidade baixa resulta em um número alto de falsos positivos, que geram numerosas biópsias desnecessárias e caras. Outros métodos de diagnóstico são realizados pela detecção dos perfis genéticos de biomarcadores recém identificados incluindo, mas não limitados ao, gene do câncer da próstata 3 (PCA3) (Groskopf et al., 2006; Nakanishi et al., 2008), um gene de fusão entre serina protease de transmembrana 2 e o gene relacionado com ETS (TMPRSS2-ERG) (Tomlins et al., 2005), glutationa S- transferase pi (Goessl et al., 2000; Gonzalgo et al., 2004), e alfa-metilacil CoA racemase (AMACR) (Zehentner et al., 2006; Zielie et al., 2004) em células do câncer da próstata encontradas em fluidos corporais tais como soro e urina (Groskopf et al., 2006; Wright e Lange, 2007). Embora estes biomarcadores possam dar especificidade aumentada devido à superexpressão nas células de câncer da próstata (por exemplo, a expressão de PCA3 é aumentada de 60 a 100 vezes nas células do câncer da próstata), um exame retal digital é requerido para extrair células da próstata na urina exatamente antes da coleta de espécime (Nakanishi et al., 2008). Tais exames retais têm desvantagens inerentes tais como a tendência na coleta destas células cancerosas que são facilmente extraídas na urina e o envolvimento de médicos que é caro e consumidor de tempo.

[0159] Aqui, um novo método de detectar os perfis genéticos destes biomarcadores é proposto para superar as limitações mencionadas acima. O método compreende as etapas de isolar exossomas de um fluido corporal e analisar o ácido nucleico dos ditos exossomas. Os procedimentos do método são similares àqueles detalhados no Exemplo 9. Neste exemplo, as amostras de urina foram de quatro pacientes diagnosticados com câncer da próstata. Como mostrado na FIG. 15c, os estágios do câncer foram caracterizados em termos de grau, estágio de Gleason e níveis de PSA. Além disso, os ácidos nucleicos analisados pela RT- PCR abrigada como detalhada no Exemplo 7 foram TMPRSS2-ERG e PCA3, dois dos biomarcadores recém identificados de câncer da próstata. Para a amplificação de TMPRSS2-ERG, o par de iniciadores para a primeira etapa de amplificação foi TMPRSS2-ERG F1 (SEQ ID NO: 47) e TMPRSS2-ERG R1 (SEQ ID NO: 48); e o par de iniciadores para a segunda etapa de amplificação foi TMPRSS2-ERG F2 (SEQ ID NO: 49) e TMPRSS2-ERG R2 (SEQ ID NO: 50). O amplicon esperado tem 122 pares de bases (bp) e dá dois fragmentos (um tem 68 bp, o outro tem 54 bp) depois da digestão com a enzima de restrição HaeII. Para a amplificação de PCA3, o par de iniciadores para a primeira etapa de amplificação foi PCA3 F1 (SEQ ID NO: 51) e PCA3 R1 (SEQ ID NO: 52); e o par de iniciadores para a segunda etapa de amplificação foi PCA3 F2 (SEQ ID NO: 53) e PCA3 R2 (SEQ ID NO: 54). O amplicon esperado tem 152 bp no comprimento e dá dois fragmentos (um tem 90 bp, o outro tem 62 bp) depois da digestão com a enzima de restrição ScaI.

[0160] Como mostrado na FIG. 15a, tanto no paciente 1 quanto no 2, mas não nos pacientes 3 e 4, o amplicon esperado de TMPRSS2- ERG pôde ser detectado e digerido em dois fragmentos de tamanhos esperados. Como mostrado na FIG. 15b, em todos os quatro pacientes, o amplicon esperado de PCA3 pôde ser detectado e digerido em dois fragmentos de tamanhos esperados. Portanto, a expressão de PCA3 pôde ser detectada em amostras de urina de todos os quatro pacientes, enquanto que a expressão de TMPRSS2-ERG pôde ser detectada apenas em amostras de urina dos pacientes 1 e 2 (FIG. 15c). Estes dados, embora não conclusivos devido ao tamanho de amostra pequeno, demonstra a aplicabilidade do novo método em detectar biomarcadores de câncer da próstata. Além disso, o método do exossoma não é limitado ao diagnóstico mas pode ser utilizado para o prognóstico e/ou monitoramento de outras condições médicas relacionadas com o câncer da próstata.

Exemplo 13: Microvesículas em diagnóstico pré-natal não invasivo

[0161] O diagnóstico pré-natal é agora parte da prática obstétrica estabelecida em todo o mundo. Métodos convencionais de se obter tecidos fetais para a análise genética inclui amniocentese e amostragem de vilosidades coriônicos, ambos dos quais são invasivos e conferem risco para o feto não nascido. Existe uma necessidade a muito tempo percebida em genéticas clínicas para desenvolver métodos de diagnóstico não invasivos. Um método que foi investigado extensivamente é fundamentado na descoberta de células fetais circulantes em plasma materno. Entretanto, existem várias barreiras que impedem a sua aplicação em contextos clínicos. Tais barreiras incluem a escassez de células fetais (apenas 1,2 célula/ml de sangue materno), que requer amostras de sangue com volume relativamente grande, e a meia vida longa de células fetais residuais de gravidez anterior, que pode causar falsos positivos. Um outro método está fundamentado na descoberta de DNA fetal no plasma materno. Quantidades de DNA fetal suficientes e tempo de depuração curtos superam as barreiras associadas com o método da célula fetal. Não obstante, o DNA apenas confere informação genética herdável e alguma epigenética, ambas das quais pode não representar os perfis de expressão de gene dinâmicos que são ligadas às condições médicas fetais. A descoberta de RNA fetal circulante em plasma materno (Ng et al., 2003b; Wong et al., 2005) pode ser o método de escolha para o diagnóstico pré-natal não invasivo.

[0162] Diversos estudos sugerem que os RNAs fetais são de alto valor de diagnóstico. Por exemplo, a expressão elevada de transcritos do hormônio que libera a corticotropina fetal (CRH) está associado com a pré- eclampsia (uma condição clínica manifestada pela hipertensão, edema e proteinúria) durante a gravidez (Ng et al., 2003a). Além disso, o mRNA específico de placenta 4 (PLAC4) em plasma materno foi usado com êxito em um teste não invasivo para a gravidez aneuplóidica (tal como a trissomia 21, síndrome de Down) (Lo et al., 2007). Além disso, o transcrito da gonadotropina coriônica fetal humana (hCG) em plasma materno pode ser um marcador de doenças trofoblásticas gestacionais (GTDs), que é um crescimento tumoroso de tecidos fetais em um hospedeiro materno. Os RNAs fetais circulantes são principalmente de origem placentária (Ng et al., 2003b). Estes RNAs fetais podem ser detectados tão cedo quanto na 4a semana de gestação e tal RNA é depurado rapidamente no pós parto.

[0163] O diagnóstico pré-natal usando RNAs fetais circulantes em plasma materno, não obstante, tem várias limitações. A primeira limitação é que o RNA fetal circulante é misturado com RNA maternal circulante e não é eficazmente separável. Correntemente, transcritos fetais são identificados, com base em uma hipótese, visto que estes que são detectados em mulheres grávidas antes do parto assim como no sangue do cordão de seu bebê, ainda são significantemente reduzidos ou ausentes no sangue materno dentro de 24 ou 36 horas após o parto (Maron et al., 2007). A segunda limitação é que nenhum método é estabelecido para enriquecer o RNA fetal circulante para sensibilidade de diagnóstico realçada visto que é ainda desconhecido como o RNA fetal é empacotado e dispensado. O modo para superar estas limitações pode residir na isolação de microvesículas e a análise dos RNAs fetais nestas.

[0164] Vários fatos sugerem que as microvesículas, que são derramadas pelas células eucarióticas, são os veículos para RNAs fetais circulantes no plasma materno. Primeiro, RNAs circulantes dentro das microvesículas são protegidos da degradação pela RNase. Segundo, os RNAs fetais circulantes têm sido mostrados permanecer na fração não celular do plasma materno, o que é compatível com a noção de que as microvesículas que abrangem estes RNAs fetais são capazes de serem filtradas através de membrana de 0,22 μm. Terceiro, similar aos tecidos tumorosos que são conhecidos por derramar microvesículas, as células placentárias, que são um tecido fetal pseudo-maligno, são provavelmente mais capazes de derramar microvesículas. Assim, um novo método de diagnóstico pré-natal não invasivo é compreendido de isolar microvesículas fetais de plasma de sangue materno e depois analisar os ácidos nucleicos dentro das microvesículas quanto a qualquer uma das variantes genéticas associadas com certas doenças e/ou outras condições médicas.

[0165] Um caso hipotético de diagnóstico pré-natal não invasivo é como segue: amostras do sangue periférico são coletadas de mulheres grávidas e passam por uma classificação de célula ativada magnética (MACS) ou outra purificação por afinidade para isolar e enriquecer microvesículas específicas de feto. A pelota microvesicular é recolocada em suspensão em PBS e usada imediatamente ou armazenada a-20°C para outro processamento. O RNA é extraído das microvesículas isoladas usando o kit de extração de RNA da Qiagen como pelas instruções do fabricante. O teor de RNA é analisado quanto ao nível de expressão de transcrito de gonadotropina coriônica humana fetal (hCG). Um nível de expressão aumentado de hCG comparado com a faixa padrão aponta para o desenvolvimento de doenças trofoblásticas gestacionais (GTDs) e acarretam ainda a necessidade quanto ao tratamento clínico para este crescimento anormal no feto. A sensibilidade da tecnologia de microvesícula torna possível detectar a GTDs em um estágio muito precoce antes de qualquer manifestação sintomática ou que a mudança estrutural torne-se detectável sob exame ultrassônico. A faixa padrão de níveis de transcrito de hCG pode ser determinada examinando-se um número estatisticamente significante de amostras de RNA fetal circulante de gestações normais.

[0166] Este método de diagnóstico pré-natal pode ser extrapolado para o diagnóstico e/ou monitoramento pré-natais de outras doenças ou condições médicas examinando-se aqueles transcritos associados com estas doenças ou condições médicas. Por exemplo, a extração e análise de ácido nucleico da cinase de linfoma anaplástico (ALK) de microvesículas de origem fetal de sangue materno é um diagnóstico pré-natal não invasivo de neuroblastoma, que está intimamente associado com mutações dentro do domínio da cinase ou expressão elevada de ALK (Mosse et al., 2008). Consequentemente, os métodos e tecnologia da microvesícula aqui descritos podem levar a uma nova era de diagnóstico genético pré-natal não invasivo muito necessário.

Exemplo 14: Diagnóstico de melanoma

[0167] Melanoma é um tumor maligno de melanócitos (células de pigmento) e é encontrado predominantemente na pele. O mesmo é uma forma séria de câncer de pele e responsável por 75 por cento de todas as mortes associadas com câncer de pele. As mutações ativadoras somáticas (por exemplo V600E) de BRAF são as anormalidades genéticas mais precoces e mais comuns detectadas na gênese de melanoma humano. BRAF ativado promove a progressão e/ou sobrevivência do ciclo celular de melanoma.

[0168] Correntemente, o diagnóstico de melanoma é feito com base no exame físico e biópsia excisional. Entretanto, uma biópsia pode amostrar apenas um número limitado de focos dentro da lesão e pode dar falsos positivos ou falsos negativos. O método do exossoma fornece um meio mais preciso para diagnosticar melanoma. Como debatido acima, o método é compreendido das etapas de isolar exossomas de um fluido corporal de um paciente e analisar o ácido nucleico a partir dos ditos exossomas.

[0169] Para determinar se os exossomas derramados pelas células de melanoma contêm mRNA de BRAF, nós cultivamos células de melanoma primárias em meio DMEM suplementado com FBS esgotado de exossoma e colhemos os exossomas no meio usando um procedimento similar como detalhado no Exemplo 2. As linhagens de célula primária foram Yumel e M34. As células Yumel não têm a mutação V600E em BRAF, enquanto que as células M34 têm a mutação V600E em BRAF. Os RNAs foram extraídos dos exossomas e depois analisados quanto a presença de mRNA de BRAF pela RT-PCR. Os iniciadores usados para a amplificação de PCR foram: BRAF avançada (SEQ ID NO: 55) e BRAF reversa (SEQ ID NO: 56). O amplicon tem 118 pares de bases (bp) de comprimento e abrange a parte de sequência de cDNA de BRAF onde a mutação V600E está localizada. Como mostrado na FIG. 16a, uma faixa de 118 bp foi detectada em exossomas a partir de células de melanoma primárias (células Yumel e M34), mas não em exossomas de células de fibroblasto humano ou Controles Negativos. A detecção negativa de uma faixa de produto de PCR de 118 bp não é devido a uma extração de RNA errada visto que os transcritos de GAPDH puderam ser detectados em exossomas tanto de célula de melanoma quanto em células de fibroblasto humanas (FIG. 16b). Os produtos de PCR de 118 bp foram sequenciados ainda para detectar a mutação V600E. Como mostrado nas FIGS. 16c e 16d, os produtos de PCR de células YUMEL, como esperado, contém mRNA de BRAF do tipo selvagem. Ao contrário, os produtos de PCR das células M34, como esperado, contém mRNA de BRAF mutante com uma mutação pontual T-A, que faz com que o aminoácido Valina (V) seja substituído pelo Ácido Glutâmico (E) na posição de aminoácido 600 da proteína BRAF. Além disso, o mRNA de BRAF não pode ser detectado em exossomas de células de fibroblasto humano normais, sugerindo que o mRNA de BRAF não está contido em exossomas de todas as origens de tecido.

[0170] Estes dados sugerem que os exossomas derramados pelas células de melanoma na circulação sanguínea e assim melanoma pode ser diagnosticado pela isolação destes exossomas a partir de soro sanguíneo e analisando o ácido nucleico a partir destes quanto a presença ou ausência de mutações (por exemplo, V600E) em BRAF. O método descrito acima também podem ser utilizado para diagnosticar melanomas que são associados com outras mutações de BRAF e mutações em outros genes. O método também pode ser utilizado para diagnosticar melanomas que estão associados com os perfis de expressão de BRAF e outros ácidos nucleicos.

Exemplo 15: Detecção de níveis de MMP de exossomas para monitorar as condições de pós-transplante.

[0171] Os transplantes de órgão são usualmente tratamentos eficazes para a insuficiência de órgãos. A insuficiência renal, a doença cardíaca, doença pulmonar de estágio e cirrose do fígado são todas condições que podem ser eficazmente tratadas por um transplante. Entretanto, as rejeições de órgão causadas pelas complicações pós-transplante são os maiores obstáculos para a sobrevivência de longa duração dos receptores de aloenxerto. Por exemplo, nos transplantes de pulmão, a síndrome da bronquiolite obliterativa é uma complicação grave que afeta as taxas de sobrevivência. Nos transplantes renais, a nefropatia de aloenxerto crônica permanece uma das causas principais de insuficiência de aloenxerto renal. A lesão de isquemia-reperfusão danifica o coração do doador depois do transplante cardíaco, assim como do fígado doador depois do transplante de fígado ortotópico. Estas complicações pós-transplante podem ser melhoradas uma vez detectadas em estágios iniciais. Portanto, é essencial monitorar as condições pós-transplante de modo a aliviar complicações adversas.

[0172] As alterações na matriz extracelular contribuem para a remodelagem intersticial nas complicações pós-transplante. As metaloproteinases de matriz (MMPs) estão envolvidas tanto na metabolização quanto degradação das proteínas de matriz extracelular (ECM). As MMPs são uma família de enzimas proteolíticas, dependentes do zinco, com 27 membros descritos até agora, demonstrando estruturas de domínio múltiplo e especificidades de substrato, e funcionando no processamento, ativação, ou desativação de uma variedade de fatores solúveis. Os níveis de MMP séricos podem indicar a situação das condições após o transplante. De fato, a MMP-2 circulante está associada com a cistatina C, a duração pós-transplante, e diabete melito em receptores de transplante renal (Chang et al., 2008). A expressão desproporcional de MMP-9 está ligada ao desenvolvimento da síndrome da bronquiolite obliterativa depois do transplante de pulmão (Hubner et al., 2005).

[0173] Os mRNAs de MMP (MMP1, 8, 12, 15, 20, 21, 24, 26 e 27) podem ser detectados em exossomas derramados pelas células de glioblastoma como mostrado no Exemplo 4 e Tabela 10. O presente método de exossoma, que isola exossomas de um fluido corporal e que analisa ácidos nucleicos dos ditos exossomas, pode ser usado para monitorar as condições de transplante. O procedimento de isolação de exossoma é similar àquele detalhado no Exemplo 2. Os presentes procedimentos para analisar ácido nucleico contido dentro dos exossomas são detalhados no Exemplo 9. Um aumento significante no nível de expressão de MMP-2 depois do transplante renal indica o início e/ou deterioração de complicações pós-transplante. Similarmente, um nível significantemente elevado de MMP-9 depois do transplante de pulmão, sugere o início e/ou deterioração da síndrome da bronquiolite obliterativa.

[0174] Portanto, o método de exossoma pode ser usado para monitorar as condições pós-transplante pela determinação dos níveis de expressão de proteínas de MMP associadas com as complicações pós- transplante. Também é esperado que o método possa ser extrapolado para monitorar condições pós-transplante determinando-se a expressão de outros genes marcadores assim como monitorar outras condições médicas determinando-se o perfil genético de ácidos nucleicos associados com estas condições médicas.

[0175] Exemplos de 16 a 18. As microvesículas podem ser agentes terapêuticos ou veículos de liberação de agentes terapêuticos.

Exemplo 16: Proteínas de microvesícula induzem a angiogênese in vitro.

[0176] Um estudo foi planejado e realizado para demonstrar que as microvesículas de glioblastoma contribuem para a angiogênese. HBMVECs (30.000 células), uma linhagem de célula endotelial cerebral, (Cell Systems, Catálogo #ACBRI-376, Kirkland, WA, USA) foram cultivadas em reservatórios revestidos com Matrigel em uma placa de 24 reservatórios apenas em meio basal (EBM) (Lonza Biologics Inc., Portsmouth, NH, USA), meio basal suplementado com microvesículas de glioblastoma (EBM+ MV) (7 μg/reservat0rio), ou meio basal suplementado com um coquetel de fatores angiogênicos (EGM; hidrocortisona, EGF, FGF, VEGF, IGF, ácido ascórbico, FBS, e heparina; Singlequots (controle positivo de EBM). A formação de túbulo foi medido depois de 16 horas e analisada com o software Image J. As HBMVECs cultivadas na presença de microvesículas de glioblastoma demonstraram uma dobra de comprimento de túbulo dentro de 16 horas. O resultado foi comparável ao resultado obtido com HBMCECs cultivadas na presença de fatores angiogênicos (FIG. 18a). Estes resultados mostram que as microvesículas derivadas de glioblastoma desempenham um papel no início da angiogênese nas células endoteliais cerebrais.

[0177] Os níveis de proteínas angiogênicas em microvesículas também foram analisados e comparados com os níveis em células doadoras de glioblastoma. Usando um arranjo de anticorpo de angiogênese humana, fomos capazes de detectar 19 proteínas envolvidas na angiogênese. Especificamente, a proteína total de células de glioblastoma primárias ou microvesículas purificadas isoladas das ditas células foram lisadas em tampão de lise (Promega, Madison, WI, USA) e adicionadas ao arranjo de anticorpo da angiogênese humana (Panomics, Fremont CA, USA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os arranjos foram escaneados e analisados com o software Image J. Como mostrado na FIG. 18b, sete das 19 proteínas angiogênicas foram facilmente detectadas nas microvesículas, 6 (angiogenina, IL-6, IL-8, TIMP-I, VEGF e TIMP-2) foram presentes em níveis mais altos em uma base de proteína total quando comparadas com as células de glioblastoma (FIG. 18c). As três proteínas angiogênicas mais enriquecidas em microvesículas comparadas com as células de tumor foram angiogenina, IL-6 e 1L-8, todas as quais foram implicadas na angiogênese de glioma com níveis mais altos associados com a malignidade aumentada (2527).

[0178] As microvesículas isoladas de células de glioblastoma primárias também foram descobertas promover a proliferação de uma linhagem de célula de glioma U87 humana. Nestes estudos, 100 000 células U87 foram observadas em reservatórios de uma placa de 24 reservatórios e deixadas crescer por três dias (DMEM-5% FBS) ou DMEM- 5% FBS suplementado com 125 μg de microvesículas isoladas de células de glioblastoma primárias. Depois de três dias, células U87 não tratadas (FIG. 19a) foram descobertas serem menos em número como determinado usando uma câmara de Burker, do que aquelas suplementadas com microvesículas (FIG. 19b). As células U87 tanto não suplementadas quanto suplementadas aumentaram 5 e 8 vezes em número durante este período, respectivamente (FIG. 19c). Assim, as microvesículas de glioblastoma parecem estimular a proliferação de outras células de glioma.

Exemplo 17: Microvesículas de glioblastoma são absorvidas pelas HBMVECs.

[0179] Para demonstrar que as microvesículas de glioblastoma são capazes de serem absorvidas pelas células endoteliais microvesiculares cerebrais humanas (HBMVECs), microvesículas de glioblastoma purificadas foram rotuladas com o kit de rotulação PKH67 Green Fluorescent (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). As microvesículas rotuladas foram incubadas com HBMVEC em cultura (5 μg/50.000 células) por 20 min a 4°C. As células foram lavadas e incubadas a 37°C por 1 hora. Dentro de 30 min as microvesículas rotuladas com PKH67 foram internalizadas dentro de estruturas equivalentes a endossoma dentro das HBMVECs (FIG. 17a). Estes resultados mostram que as microvesículas de glioblastoma podem ser internalizadas pelas células endoteliais cerebrais.

[0180] Resultados similares foram obtidos quando da adição das microvesículas fluorescentemente rotuladas às células de glioblastoma primárias.

Exemplo 18: mRNA dispensado pelas microvesículas de glioblastoma podem ser traduzidas em células receptoras.

[0181] Para determinar se o mRNA de microvesículas derivadas de glioblastoma podem ser dispensadas e expressadas em células receptoras, células de glioblastoma foram infectadas com um vetor de lentivírus auto-inativante que expressam Gaussia luciferase (Gluc) secretadas usando um promotor CMV em uma eficiência de infecção de >95%. As células foram estavelmente transduzidas e microvesículas geradas durante a passagem subsequente (2 a 10 passagens foram analisadas). As microvesículas foram isoladas das células e purificadas como descrito acima. A análise de RT-PCR mostrou que o mRNA para Gluc (555 bp) assim como GAPDH (226 bp) estavam presentes nas microvesículas (FIG. 17b). O nível de mRNA de Gluc foi mesmo mais alto do que aquele para GAPDH como avaliado com a RT-PCR quantitativa.

[0182] Cinquenta microgramas das microvesículas purificadas foram adicionadas a 50.000 células HBMVE e incubadas por 24 horas. A atividade de Gluc no sobrenadante foi medida diretamente depois da adição de microvesícula (0 h), e depois 15 horas e 24 horas. A atividade de Gluc no sobrenadante foi normalizada para a atividade de proteína Gluc associada com as microvesículas. Os resultados são apresentados como a média ± SEM (n = 4). Especificamente, a atividade nas células HBMVE receptoras demonstrou uma tradução contínua do mRNA de Gluc microvesicular. Assim, o mRNA incorporado nas microvesículas de tumor podem ser dispensadas em células de receptor e geram uma proteína funcional.

[0183] A análise estatística em todos os exemplos foi realizada usando o teste t de Student. Referências 1. Abravaya, K., J. J. Carrino, S. Muldoon, e H. H. Lee. 1995. Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap- LCR). Nucleic Acids Res. 23:675-82. 2. Al-Nedawi, K., B. Meehan, J. Micallef, V. Lhotak, L. May, A. Guha, e J. Rak. 2008. Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells. Nat Cell Biol. 10:619-24. 3. Baj-Krzyworzeka, M., R. Szatanek, K. Weglarczyk, J. Baran, B. Urbanowicz, P. Branski, M. Z. Ratajczak, e M. Zembala. 2006. Tumour-derived microvesicles carry several surface determinants and mRNA of tumour cells and transfer some of these determinants to monocytes. Cancer Immunol Immunother. 55:808-18. 4. Balzar, M., M. J. Winter, C. J. de Boer, e S. V. Litvinov. 1999. The biology of the 17-1A antigen (Ep-CAM). J Mol Med. 77:699-712. 5. Booth, A. M., Y. Fang, J. K. Fallon, J. M. Yang, J. E. 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Bloom, R. Nicol, K. Ardlie, J. Baldwin, S. Gabriel, E. S. Lander, L. Ding, R. S. Fulton, M. D. McLellan, J. Wallis, D. E. Larson, X. Shi, R. Abbott, L. Fulton, K. Chen, D. C. Koboldt, M. C. Wendl, R. Meyer, Y. Tang, L. Lin, J. R. Osborne, B. H. Dunford-Shore, T. L. Miner, K. Delehaunty, C. Markovic, G. Swift, W. Courtney, C. Pohl, S. Abbott, A. Hawkins, S. Leong, C. Haipek, H. Schmidt, M. Wiechert, T. Vickery, S. Scott, D. J. Dooling, A. Chinwalla, G. M. Weinstock, E. R. Mardis, R. K. Wilson, G. Getz, W. Winckler, R. G. Verhaak, M. S. Lawrence, M. O’Kelly, J. Robinson, G. Alexe, R. Beroukhim, S. Carter, D. Chiang, J. Gould, et al. 2008. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 53. Mellinghoff, I. K., M. Y. Wang, I. Vivanco, D. A. Haas- Kogan, S. Zhu, E. Q. Dia, K. V. Lu, K. Yoshimoto, J. H. Huang, D. J. Chute, B. L. Riggs, S. Horvath, L. M. Liau, W. K. Cavenee, P. N. Rao, R. Beroukhim, T. C. Peck, J. C. Lee, W. R. Sellers, D. 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A RT-PCR abrigada foi usada para monitorar mRNA de EGFRvIII em tecido de biópsia de glioma assim como exossomas purificados a partir de uma amostra de soro congelada do mesmo paciente. As amostras de 30 pacientes foram analisadas em uma maneira cega e as reações de PCR foram repetidas pelo menos três vezes para cada amostra. Nenhum mRNA de EGFRvIII foi encontrado nas microvesículas séricas de 30 controles normais. PP1 refere-se ao par de iniciador composto das SEQ ID NOs: 13 e 14. PP2 refere-se ao par de iniciador composto das SEQ ID NOS: 15 e 16. “-“ refere- se a “não disponível”.

*Duas após a cirurgia de remoção do tumor Tabela 2 Abreviações usadas na Tabela 3.

Noto: As IDs de acesso “NM_XXXX” são unicamente designadas a cada gene pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www,ncbi,nlm,nih,gov/sites/entrez?db=nuccore). Tabela 8. microRNAs que são supra-regulados em células de glioblastoma.

Tabela 9. microRNAs que são infra-regulados em células de glioblastoma.

Tabela 10. Genes MMP contidos dentro de microvesículas isoladas da linhagem de célula de glioblastoma.

Nota: Os símbolos de gene são símbolos padrão designados pela Entrz Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene). As IDs de acesso são 5 unicamente designadas a cada gene pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nuccore). Tabela 11. Genes contendo mutações somáticas em glioblastoma adaptadas do resultado do projeto TCGA (McLendon et al., 2008).

Claims (6)

1. Método para detectar em um indivíduo a presença ou ausência de um ácido nucleico biomarcador predeterminado associado com câncer de próstata, auxiliando assim no diagnóstico, monitoramento e/ou avaliação do câncer de próstata, caracterizado pelo fato de compreender: (a) isolar uma fração de microvesícula a partir de uma amostra de urina de um indivíduo, em que a urina é coletada sem estimulação prévia da próstata; e (b) detectar a presença ou ausência de um ácido nucleico biomarcador predeterminado na fração de microvesícula, em que o ácido nucleico biomarcador predeterminado é PCA3.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que na etapa de detecção (b) compreende extrair ácidos nucleicos a partir da fração de microvesícula e ensaiar os ácidos nucleicos extraídos para o ácido nucleico biomarcador predeterminado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ensaio dos ácidos nucleicos extraídos compreende análise de microarray, PCR, hibridização com sondas específicas de alelo, detecção de mutação enzimática, reação em cadeia de ligação (LCR), ensaio de ligação de oligonucleotídeo (OLA), análise de heteroduplex por citometria de fluxo, clivagem química de incompatibilidades, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP), eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE), eletroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismos de fragmento de restrição, análise serial da expressão gênica (SAGE), sequenciamento de próxima geração, sequenciamento massivamente paralelo ou qualquer combinação dos mesmos.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende o processamento de uma fração de microvesícula para excluir proteínas, lipídios, detritos de células mortas e outros contaminantes.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o processamento da fração de microvesícula compreende a filtragem, de preferência, em que a filtragem compreende a filtragem através de um filtro de 0,8 μm ou 0,22 μm.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende ainda purificar microvesículas da fração de microvesícula usando cromatografia de exclusão de tamanho, centrifugação de gradiente de densidade, centrifugação, centrifugação diferencial, ultracentrifugação, ultrafiltração de nanomembrana, captura imunossorvente, purificação por afinidade, microfluídico separação, cromatografia de troca aniônica, cromatografia de permeação em gel ou qualquer combinação das mesmas.

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