KR20170102043A - 의학적 질환 및 병태의 진단, 예후, 및 치료에 있어서 미세소포체의 용도 - Google Patents

의학적 질환 및 병태의 진단, 예후, 및 치료에 있어서 미세소포체의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시 내용은 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 단리된 미세소포체 중의 생체마커를 검출하여 대상체에서 질환 또는 다른 의학적 병태를 진단, 예후, 모니터링 및 평가하는 것을 보조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 개시 내용은 생물학적 샘플 내의 미세소포체의 농도를 측정하여 질환을 진단, 모니터링하는 방법; 핵산 또는 단백질을 함유하는 미세소포체를 투여함으로써 표적 모두에게 상기 핵산 또는 단백질을 전달하는 방법; 미세소포체 무함유 또는 미세소포체가 강화된 체액 분획을 환자 내로 도입하여 체액 주입을 실시하는 방법에 관한 것이다.

Description

의학적 질환 및 병태의 진단, 예후, 및 치료에 있어서 미세소포체의 용도{USE OF MICROVESICLES IN DIAGNOSIS, PROGNOSIS AND TREATMENT OF MEDICAL DISEASES AND CONDITIONS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2008년 2월 1일 출원된 미국 가출원 61/025,536, 및 2008년 9월 26일 출원된 미국 가출원 61/100,293 (이들 각각의 전문이 본원에서 참고로 인용된다)에 대한 우선권을 주장한다.
정부 지원
본 발명은 국립 암 연구소(National Cancer Institute)에 의해 주어진 승인 NCI CA86355 및 NCI CA69246하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 가진다.
본 발명의 분야
본 발명은 의학적 진단, 환자 모니터링, 치료 효능 평가, 핵산 및 단백질 전달, 및 혈액 주입 분야에 관한 것이다.
아교모세포종은 집약적인 연구와 임상적인 노력에도 불구하고 예후가 나쁜 고도의 악성 뇌종양이다 (문헌 [Louis et al., 2007]). 종양의 침윤적 성질로 인해 완전한 외과적 절제술은 불가능하고, 생존 시간의 중앙값은 단지 약 15개월 정도에 불과하다 (문헌 [Stupp et al., 2005]). 아교모세포종 세포 뿐만 아니라, 다수의 다른 종양 세포는 그의 기질 환경을 그 자신에게 유리하게 만드는 뚜렷한 능력을 갖고 있다. 종양 세포는 직접 주변에 있는 정상 세포를 변경시켜 종양 세포의 성장, 침윤, 화학물질에 대한 내성, 면역-회피 및 전이를 용이하게 한다 (문헌 ([Mazzocca et al., 2005]; [Muerkoster et al., 2004]; [Singer et al., 2007])). 종양 세포는 또한 정상 혈관구조를 탈취하고, 종양에 영양을 공급하기 위해 새로운 혈관이 빠르게 형성될 수 있도록 자극한다 (문헌 [Carmeliet and Jain, 2000]). 면역계가 초기에는 종양 성장을 억제시킬 수는 있지만, 이는 대개 면역억제성 경로의 종양 활성화에 의해 점진적으로 약화된다 (문헌 [Gabrilovich, 2007]).
세포에 의해 탈락된 작은 미세소포체가 엑소좀으로서 알려져 있다 (문헌 [Thery et al., 2002]). 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm인 것으로 보고되어 있으며, 이는 정상 상태 및 병적 상태, 이 2가지 모든 상태하에 다수의 다른 세포 유형으로부터 탈락된 것이다 (문헌 [Thery et al., 2002]). 이러한 미세소포체는 처음에는 성숙 망상적혈구의 세포 표면으로부터 트랜스페린-수용체를 버리는 기전으로서 설명되었다 (문헌 [Pan and Johnstone, 1983]). 엑소좀은 엔도좀 막이 안쪽으로 출아하여 세포내 다중소포체 (MVB)를 일으키고, 이후 형질막과 융합하여 엑소좀을 외부로 방출시킴으로써 형성이 되는 것이다 (문헌 [Thery et al., 2002]). 그러나, 현재는 엑소좀을 보다 직접적으로 방출하는 것에 관한 증거가 있다. 저캣(Jurkat) T-세포와 같은 특정 세포의 경우, 이는 형질막을 바깥쪽으로 출아시킴으로써 직접적으로 엑소좀을 탈락시킨다고 보고되었다 (문헌 [Booth et al., 2006]). 세포에 의해서 탈락된 모든 막 소포체를 본원에서는 총칭하여 미세소포체로서 지칭한다.
소위 아르고좀(argosome)이라 일컬어지는, 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)의 미세소포체는 예로서, 날개가 없는 것과 관련된(Wingless) 단백질인 모르포겐을 포함하고, 드로소필라 멜라노가스터 배아 발생에 있어 성충 판 상피를 통해 장거리를 이동하는 것으로 보고되었다 (문헌 [Greco et al., 2001]). 정액에서 발견되는 미세소포체는 프로스타좀으로서 알려져 있는데, 이는 정자 운동성 촉진, 첨체 반응의 안정화, 면역억제 촉진, 및 혈관형성 저해를 비롯한, 광범위한 기능을 갖는 것으로 언급된 바 있다 (문헌 [Delves et al., 2007]). 한편, 악성 전립선 세포에 의해 방출되는 프로스타좀은 혈관형성을 촉진시키는 것으로 보고되었다. 미세소포체는 단백질을 전달하는 것으로 보고된 바 있으며 (문헌 [Mack et al., 2000]), 최근 연구를 통해서는 상이한 세포주로부터 단리된 미세소포체가 또한 메신저 RNA (mRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)를 포함할 수 있고, mRNA를 다른 세포 유형으로 전달할 수 있다고 언급된 바 있다 (문헌 ([Baj-Krzyworzeka et al., 2006]; [Valadi et al., 2007])).
B-세포 및 가지 세포로부터 유래된 미세소포체는 생체내에서 강력한 면역-자극성 및 항종양 효과를 가지며, 이는 항종양 백신으로서 사용된 것으로 언급된 바 있다 (문헌 [Chaput et al., 2005]). 가지 세포-유래의 미세소포체는 T-세포 활성화에 필요한 공자극성 단백질을 포함하는 것으로 언급된 반면, 대부분의 종양 세포-유래의 미세소포체는 그렇지 않은 것으로 언급된 바 있다 (문헌 [Wieckowski and Whiteside, 2006]). 종양 세포로부터 단리된 미세소포체는 면역 반응을 억제시키고, 종양 성장을 가속화시키는 작용을 할 수 있다 (문헌 ([Clayton et al., 2007]; [Liu et al., 2006a])). 유방암 미세소포체는 혈관형성을 자극시킬 수 있고, 혈소판-유래 미세소포체는 종양 진행과 폐암 세포 전이를 촉진시킬 수 있다 (문헌 ([Janowska-Wieczorek et al., 2005]; [Millimaggi et al., 2007])).
암은 비제한적인 세포 성장을 촉진하는 유전적 변경의 누적을 통해 일어나는 것이다. 각각의 종양은 비-종양 세포에는 존재하지 않는 돌연변이를 평균적으로는 대략 50-80개 보유하는 것으로 언급된 바 있다 (문헌 ([Jones et al., 2008]; [Parsons et al., 2008]; [Wood et al., 2007])). 이러한 돌연변이 프로필을 검출하는 현 기법으로는 생검 샘플 분석 및 예로서, 혈액과 같은 체액을 순환하는 돌연변이체 종양 DNA 단편의 비-침습적 분석을 포함한다 (문헌 [Diehl et al., 2008]). 전자의 방법은 침습성이고, 합병증이 있으며, 가능하게는 대상체에게 유해할 수도 있다. 후자 방법의 경우, 이는 체액 중 돌연변이체 암 DNA의 복제수가 극도로 낮기 때문에 감도가 본래 불충분하다 (문헌 [Gormally et al., 2007]). 따라서, 암 진단과 직면하고 있는 한가지 도전 과제는 상이한 단계에서 비-침습적으로, 그러나, 고감도 및 고특이성으로 종양 세포를 검출할 수 있는 진단 방법을 개발하는 것이다. (mRNA 또는 마이크로RNA를 코딩하는) 유전자 발현 프로필이 암성 조직 및 비-암성 조직을 식별할 수 있다고 언급된 바 있다 (문헌 ([Jones et al., 2008]; [Parsons et al., 2008]; [Schetter et al., 2008])). 그러나, 유전자 발현 프로필을 검출하는 현 진단 기법은 침입성 생검 조직을 필요로 한다. 몇몇 생검 방법은 고도한 위험을 일으킬 수 있고, 잠재적으로는 유해하다. 또한, 생검 방법에서는 제한 부위로부터 조직 샘플을 채취하는데, 이는 특히 종양이 이종성이고/거나, 정상 조직 내에 분산되어 있는 경우에 조직 샘플은 위 양성체 또는 위 음성체일 수 있다. 그러므로, 생체마커 검출을 위한 비-침입성의 고감도 진단 방법이 고도로 바람직할 수 있다.
본 발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 대상체에서 미세소포체에 함유되어 있는 각종 생체마커의 존재 또는 부재 여부를 검출함으로써 미세소포체 생체마커와 관련된 질환, 다른 의학적 병태, 및 치료 효능을 진단, 모니터링 및 평가하는 것을 보조하는 신규한 방법이다.
본 발명의 한 측면은 a) 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 미세소포체 분획을 단리시키는 단계; 및 b) 미세소포체 분획 내의 생체마커의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 생체마커는 질환 또는 다른 의학적 병태와 관련이 있는 것인, 대상체에서 질환 또는 다른 의학적 병태를 진단하거나 모니터링하는 것을 보조하는 방법이다. 본 방법은 추가로 검출 단계의 결과를 대조군과 비교하되 (예를 들면, 샘플 중에서 검출된 하나 이상의 생체마커의 양을 하나 이상의 대조군 수준과 비교하되), 여기서, 대조군과의 비교시 검출 단계의 결과에 있어 측정가능한 차이가 존재한다면, 대상체를 질환 또는 다른 의학적 병태 (예를 들면, 암)를 앓는 것으로 진단하는 것인 단계 또는 단계들을 포함할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 a) 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 미세소포체 분획을 단리시키는 단계; b) 미세소포체 분획 내의 생체마커의 존재 또는 부재 여부를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 생체마커는 질환 또는 다른 의학적 병태의 치료 효능과 관련이 있는 것인, 대상체에서 치료 효능을 평가하는 것을 보조하는 방법이다. 본 방법은 일정 기간 동안 일련의 생물학적 샘플을 대상체로부터 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 본 방법은 일련의 생물학적 샘플 각각에서 검출 단계의 결과 (예로서, 하나 이상의 생체마커 검출량) 상의 임의의 측정가능한 변화를 측정함으로써 질환 또는 다른 의학적 병태의 치료 효능을 평가하는 단계 또는 단계들을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 관한 특정의 바람직한 실시태양에서, 대상체로부터의 생물학적 샘플은 체액 샘플이다. 특히 바람직한 체액은 혈액 및 뇨이다.
본 발명의 상기 측면에 관한 특정의 바람직한 실시태양에서, 본 방법은 추가로 특정 유형의 세포 (예로서, 암 또는 종양 세포)로부터 유래된 선택성 미세소포체 분획을 단리시키는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 선택성 미세소포체 분획은 본질적으로 뇨 미세소포체로 구성될 수 있다.
본 발명의 상기 측면에 관한 특정의 바람직한 실시태양에서, 질환 또는 다른 의학적 병태와 관련된 생체마커는 i) 핵산 종; ii) 하나 이상의 핵산의 발현 수준; iii) 핵산 변이체; 또는 iv) 상기 중 임의의 것의 조합이다. 그러한 생체마커의 바람직한 실시태양은 메신저 RNA, 마이크로RNA, DNA, 싱글 스트랜드 DNA, 상보성 DNA 및 비코딩 DNA를 포함한다.
본 발명의 상기 측면에 관한 특정의 바람직한 실시태양에서, 질환 또는 다른 의학적 병태는 신생물성 질환 또는 병태 (예로서, 아교모세포종, 췌장암, 유방암, 흑색종 및 결장직장암), 대사 질환 또는 병태 (예로서, 당뇨병, 염증, 출생전후 병태, 또는 철 대사와 관련된 질환 또는 병태), 이식후 병태, 또는 태아 병태이다.
본 발명의 또다른 측면은 a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 및 b) 생물학적 샘플 내의 미세소포체의 농도를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환, 또는 다른 의학적 병태의 진단 또는 모니터링을 보조하는 방법이다.
본 발명의 또다른 추가적인 측면은 핵산 또는 단백질을 함유하는 미세소포체, 또는 상기 미세소포체를 생산하는 하나 이상의 세포를 개체에게 투여하여 미세소포체가 개체의 표적 세포로 유입되도록 하는 것인 단계를 포함하는, 개체에서 핵산 또는 단백질을 표적 세포로 전달하는 방법이다. 본 발명의 이러한 측면에 관한 바람직한 실시태양에서, 미세소포체는 뇌 세포로 전달된다.
본 발명의 추가의 측면은 모든 또는 실질적으로 모든 미세소포체를 함유하지 않거나, 특정 세포 유형 (예로서, 종양 세포)으로부터 유래된 모든 또는 실질적으로 모든 미세소포체를 함유하지 않는 공여자의 체액 분획을 수득하는 단계, 및 미세소포체 무함유 분획을 환자에게 도입하는 단계를 포함하는, 체액 주입 (예로서, 혈액, 혈청 또는 혈장)을 실시하는 방법이다. 본 발명과 관련된 측면은 모든 미세소포체를 함유하지 않거나, 특정 세포 유형으로부터의 모든 또는 실질적으로 모든 미세소포체를 함유하지 않는 체액의 샘플 (예로서, 혈액, 혈청 또는 혈장)을 포함하는 물질의 조성물이다.
본 발명의 또다른 측면은 공여자의 체액 중 미세소포체가 강화된 분획을 수득하는 단계, 및 미세소포체가 강화된 분획을 환자에게 도입하는 단계를 포함하는, 체액 주입 (예로서, 혈액, 혈청 또는 혈장)을 실시하는 방법이다. 바람직한 실시태양에서, 분획은 특정 세포 유형으로부터 유래된 미세소포체가 강화된 것이다. 본 발명의 관련된 측면은 미세소포체가 강화된 체액 (예로서, 혈액, 혈청 또는 혈장) 샘플을 포함하는 물질의 조성물이다.
본 발명의 추가의 측면은 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; 상기 샘플로부터 미세소포체 분획을 단리시키는 단계; 및 미세소포체 분획 내에서 핵산 종; 그 각각의 발현 수준 또는 농도; 핵산 변이체; 또는 그의 조합을 검출하는 단계를 포함하는, 질환 또는 다른 의학적 병태와 관련된 새로운 생체마커를 확인하는 것을 보조하는 방법이다.
이제, 본 발명의 다양한 측면과 실시태양을 상세히 기술할 것이다. 상세히 설명된 것은 본 발명의 범주를 벗어남 없이 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 문맥상 달리 필요하지 않는 한, 단수 용어는 복수의 것을 포함하고, 복수 용어는 단수의 것을 포함하여야 한다.
확인된 모든 특허, 특허 출원, 및 공개문헌은, 상기 공개문헌에 기재되어 있는 것으로서 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 방법을 기술하고 개시하고자 하는 목적으로 본원에서 명백히 참고로 인용된다. 이러한 공개문헌은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 상기 개시내용을 선행할 자격을 갖지 못한다는 것을 용인으로서 해석되어서는 안 될 것이다. 날짜에 관한 언급 또는 이들 문헌 상의 내용에 관한 설명 모두 출원인이 이용할 수 있는 정보에 기초한 것이며, 날짜 또는 이들 문헌 상의 내용에 대한 보정에 관해서는 어떤 용인도 포함하지는 않는다.
도 1. 아교모세포종 세포가 RNA를 함유하는 미세소포체를 생산한다. (a) 원발성 아교모세포종 세포의 주사 전자 현미경 영상 (바 = 10 ㎛). (b) 세포 표면 상에 존재하는 미세소포체를 보여주는 고배율 확대도 소포체의 직경은 약 50 nm 내지 약 500 nm로 그 크기는 다양하다 (바 = 1 ㎛). (c) RNase A로 처리하거나 처리하지 않은 미세소포체로부터 추출된 RNA의 총량을 나타내는 그래프. 260 nm 파장 (x축)에서의 흡광도 (Ab, y축)로 그 양을 나타낸다. 본 실험은 5회 반복하였고, 대표 그래프를 나타내었다. (d) 원발성 아교모세포종 세포로부터 추출된 전체 RNA의 크기 분포를 보여주는 생체분석기 데이타, 및 (e) 원발성 아교모세포종 세포로부터 단리된 미세소포체로부터 추출된 전체 RNA의 크기 분포를 보여주는 생체분석기 데이타. 25 nt 피크가 내부 표준을 나타낸다. (d)에서 현저히 나타난 2개의 피크 (화살표 표시)는 18S (좌측 화살표) 및 28S (우측 화살표) 리보좀 RNA를 나타낸다. 미세소포체로부터 추출된 RNA에는 리보좀 피크가 존재하지 않는다 ((e)). (f) 원발성 아교모세포종 세포에 의해 분비된 미세소포체의 투과 전자 현미경 영상 (바 = 100 nm).
도 2. 미세소포체 RNA 분석. 도 2(a) 및 2(b)는 2개의 다른 실험으로부터 얻은 미세소포체 중 mRNA 수준과, 공여자 아교모세포종 세포 중 mRNA 수준의 산포도이다. 선형 회귀는 공여자 세포 중 mRNA 수준 대 미세소포체 중 mRNA 수준 사이에는 충분한 상관관계가 없음을 나타낸다. 도 2(c) 및 2(d)는 2개의 상이한 공여자 세포 또는 2개의 상이한 미세소포체 시료 중의 mRNA 수준이다. 도 2(a) 및 2(b)와는 대조적으로, 선형 회귀는, 공여자 세포 사이의 mRNA 수준 (도 2(c)) 또는 미세소포체 사이의 mRNA 수준 (도 2(d))에는 밀접한 상관관계가 있었음을 나타낸다.
도 3. 미세소포체 DNA 분석.
a) 핵산 추출에 앞서 DNase로 처리한 엑소좀으로부터 얻은 DNA 주형을 사용한 GAPDH 유전자 증폭. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp MW 래더
2. 음성 대조군
3. GBM 20/3 세포로부터 얻은 게놈 DNA 대조군
4. 정상 혈청 엑소좀으로부터 얻은 DNA (종양 세포가 없는 대조군)
5. 정상 인간 섬유모세포 (NHF19)로부터 유래된 엑소좀 DNA
6. 원발성 수모세포종 세포 (D425)로부터 유래된 엑소좀 DNA
b) 사전 DNase 처리 없이 엑소좀으로부터 얻은 DNA 주형을 사용한 GAPDH 유전자 증폭. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp MW 래더
2. 원발성 흑색종 세포 0105로부터 얻은 DNA
3. 흑색종 0105로부터 유래된 엑소좀 DNA
4. 음성 대조군
5. 원발성 GBM 20/3 (양성 대조군)으로부터 얻은 cDNA
c) 인간 내인성 레트로바이러스 K 유전자 증폭. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp MW 래더
2. 수모세포종 D425 a로부터 유래된 엑소좀 DNA
3. 수모세포종 D425 b로부터 유래된 엑소좀 DNA
4. 정상 인간 섬유모세포 (NHF19)로부터 유래된 엑소좀 DNA
5. 정상 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀 DNA
6. GBM 20/3으로부터 얻은 게놈 DNA
7. 음성 대조군
d) 테나신 C 유전자 증폭. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp MW 래더
2. 정상 인간 섬유모세포 (NHF19)로부터 유래된 엑소좀
3. 혈청으로부터 유래된 엑소좀 (종양 세포가 없는 개체 A)
4. 혈청으로부터 유래된 엑소좀 (종양 세포가 없는 개체 B)
5. 원발성 수모세포종 세포 D425로부터 유래된 엑소좀
e) 전위성 라인 1 요소 증폭. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp MW 래더.
2. 정상 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀 DNA
3. 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀 DNA
4. 수모세포종 D425 a로부터 유래된 엑소좀 DNA
5. 수모세포종 D425 b로부터 유래된 엑소좀 DNA
f) DNA는 D425 수모세포종 세포로부터 유래된 엑소좀에 존재한다. 래인은 하기와 같이 표시한다:
1. 100 bp 마커
2. DNase 비처리 D425
3. DNase로 처리된 D425
4. 1 kb 마커
g) RNA 피코 칩을 사용한 싱글 스트랜드 핵산 분석. 상부 패널: 정제된 DNA를 DNase로 처리하지 않았다; 하부 패널: 정제된 DNA를 DNase로 처리하였다. 상부 패널의 화살표 표시는 검출된 핵산을 나타낸다. 25 nt의 피크는 내부 표준이다.
h) 원발성 수모세포종 D425로부터 유래된 엑소좀에 함유되어 있는 핵산 분석. 상부 패널: RNA 피코 칩에 의해 검출된 싱글 스트랜드 핵산. 하부 패널: DNA 1000칩에 의해 검출된 더블 스트랜드 핵산. 상부 패널의 화살표 표시는 검출된 핵산을 나타낸다. 2개의 피크 (15 및 1500 bp)는 내부 표준이다.
i) RNA 피코 칩을 사용한, 다른 기원으로부터 유래된 엑소좀 DNA의 분석. 상부 패널: DNA를 아교모세포종 세포로부터 유래된 엑소좀으로부터 추출하였다. 하부 패널: DNA를 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀으로부터 추출하였다.
도 4. 혈청 엑소좀 단리 단계를 포함하는 경우, 혈청으로부터의 세포외 RNA 추출이 더욱 효율적이다. a) 혈청으로부터 유래된 엑소좀 RNA, b) 직접적인 전 혈청 추출, c) 빈 웰. 화살표 표시는 샘플 중 검출된 RNA를 나타낸다.
도 5. 미세소포체와, 그의 기원이 되는 세포 사이의 유전자 발현 수준 비교. 3426개의 유전자는 미세소포체가 유래된 것인 세포와 비교하였을 때 미세소포체에서 5배 초과로 차별적으로 분포하는 것으로 나타났다 (p 값 <0.01).
도 6. 미세소포체 RNA의 온톨로지 분석. (a) 파이 도표는 미세소포체 중 가장 풍부하게 존재하는 500개의 mRNA 종의 생물학적 프로세스 온톨로지를 나타낸다. (b) 종양 성장에 관련된 온톨로지에 속한 미세소포체 RNA의 강도를 나타내는 그래프이다. x축은 온톨로지에 존재하는 mRNA 전사체의 수를 나타낸다. 어레이 상에서 강도 수준의 중앙값은 182였다.
도 7. mRNA 수준의 클러스터링 다이어그램. 세포주 및 이들 세포주의 배양 배지로부터 단리된 엑소좀에서의 mRNA 발현 프로필에 관한 마이크로어레이 데이타를 분석하고, 발현 프로필의 클러스터를 작성하였다. RNA 종에 대한 표지는 하기와 같다:
20/3C-1: 아교모세포종 20/3 세포 RNA, 어레이 복제물 1
20/3C-2: 아교모세포종 20/3 세포 RNA, 어레이 복제물 2
11/5C: 아교모세포종 11/5 세포 RNA
0105C: 흑색종 0105 세포 RNA
0664C: 흑색종 0664 세포 RNA
0664 E-1: 흑색종 0664 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 1
0664 E-2: 흑색종 0664 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 2
0105E: 흑색종 0105 엑소좀 RNA
20/3E: 아교모세포종 20/3 엑소좀 RNA
11/5E-1: 아교모세포종 11/5 엑소좀, 어레이 복제물 1
11/5E-2: 아교모세포종 11/5 엑소좀, 어레이 복제물 2
GBM: 아교모세포종. 눈금 표시는 클러스터 간의 거리를 나타낸다.
도 8. 혈청으로부터 유래된 미세소포체는 마이크로RNA를 함유한다. 정량적 miRNA RT-PCR을 사용하여 2명의 다른 환자 (GBM1 및 GBM2)로부터 얻은 미세소포체 및 아교모세포종 세포로부터 추출된 성숙 miRNA의 수준을 분석하였다. 주기 임계값 (Ct)은 평균 ± SEM (n = 4)이었다.
도 9. 마이크로RNA 수준의 클러스터링 다이어그램. 세포주 및 이들 세포주의 배양 배지로부터 단리된 엑소좀에서의 마이크로RNA 발현 프로필에 관한 마이크로어레이 데이타를 분석하고, 발현 프로필의 클러스터를 작성하였다. RNA 종에 대한 표지는 하기와 같다:
0664C-1: 흑색종 0664 세포 RNA, 어레이 복제물 1
0664C-2: 흑색종 0664 세포 RNA, 어레이 복제물 2
0105C-1: 흑색종 0105 세포 RNA, 어레이 복제물 1
0105C-2: 흑색종 0105 세포 RNA, 어레이 복제물 2
20/3C-1: 아교모세포종 20/3 세포 RNA, 어레이 복제물 1
20/3C-2: 아교모세포종 20/3 세포 RNA, 어레이 복제물 2
11/5C-1: 아교모세포종 11/5 세포 RNA, 어레이 복제물 1
11/5C-2: 아교모세포종 11/5 세포 RNA, 어레이 복제물 2
11/5E-1: 아교모세포종 11/5 엑소좀, 어레이 복제물 1
11/5E-2: 아교모세포종 11/5 엑소좀, 어레이 복제물 2
20/3E-1: 아교모세포종 20/3 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 1
20/3E-2: 아교모세포종 20/3 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 2
0664 E: 흑색종 0664 엑소좀 RNA
0105E-1: 흑색종 0105 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 1
0105E-2: 흑색종 0105 엑소좀 RNA, 어레이 복제물 2
GBM: 아교모세포종. 눈금 표시는 클러스터 간의 거리를 나타낸다.
도 10. 혈청 미세소포체 중 마이크로RNA의 발현 수준-21이 신경아교종과 관련이 있다. 좌측 막대 그래프는 정상 대조군 혈청을 나타내고, 우측의 것은 신경아교종 혈청을 나타낸다. 정량적 RT-PCR을 사용하여 아교모세포종 환자와 정상 환자 대조군의 혈청으로부터 유래된 엑소좀 중의 마이크로RNA-21 (miR-21)의 수준을 측정하였다. 아교모세포종 혈청은 Ct-값이 5.4 감소한 것으로 나타났는데, 이는 miR21의 대략 40 (2ΔCt)배 증가에 상응하는 것이다. miR21 수준을 각 샘플 (n=3)에서 GAPDH로 정규화시켰다.
도 11. 이중 RT-PCR을 사용하여 종양 샘플 및 상응하는 혈청 엑소좀 중의 EGFRvIII mRNA를 검출하였다. 야생형 EGFR PCR 생성물은 1153 bp에서 밴드가 출현하였고, EGFRvIII PCR 생성물은 352 bp에서 밴드가 출현하였다. GAPDH mRNA의 RT PCR을 양성 대조군 (226 bp)으로서 포함시켰다. EGFRvIII에 대해 양성인 것으로 간주되는 샘플에 별표 표시하였다. 11번, 12번 및 14번 환자에서는 종양 샘플 중 EGFRvIII이 단지 약하게 증폭된 것으로 나타났지만, 더 많은 샘플을 적재하였을 때에는 뚜렷하게 나타났다.
도 12. 52개의 정상 대조군 혈청으로부터 유래된 미세소포체에 대한 EGFRvIII의 이중 RT PCR을 수행하였다. 정상 대조군 혈청에서는 EGFRvIII (352 bp)은 전혀 관찰되지 않았다. GAPDH (226 bp) PCR을 대조군으로서 포함시켰다.
도 13. 헵시딘 mRNA은 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀 내에서 검출될 수 있다. A) 애질런트(Agilent) 생체분석기에 의해 생성된 슈도겔(pseudo-gel). B) 애질런트 생체분석기에 의해 생성된 양성 대조군 (샘플 1)에 대한 원래 플롯(raw plot). C) 애질런트 생체분석기에 의해 생성된 음성 대조군 (샘플 2)에 대한 원래 플롯. D) 애질런트 생체분석기에 의해 생성된 엑소좀 (샘플 3)에 대한 원래 플롯.
도 14. 뇨 엑소좀 단리 및 뇨 엑소좀 내의 핵산 확인. (a) 세뇨관 세포 중에 다수의 작은 "엑소좀"을 함유하는 다중소포체 (MVB)에 대한 전자 현미경 영상, (b) 단리된 뇨 엑소좀의 전자 현미경 영상. (c) 생체분석기에 의한, 뇨 엑소좀 내에 함유되어 있는 RNA 전사체 분석. 광범위한 RNA 종이 확인되었지만, 18S 및 28S 리보좀 RNA, 2가지 모두는 존재하지 않았다. (d) PCR에 의한, 뇨 엑소좀 중의 각종 RNA 전사체 확인. 이렇게 확인된 전사체는 아쿠아포린(Aquaporin) 1 (AQP1); Aquaporin 2 (AQP2); 쿠불린(Cubulin) (CUBN); 메갈린(Megalin) (LRP2); 아르기닌 바소프레신 수용체 2 (AVPR2); 나트륨/수소 교환체 3 (SLC9A3); V-ATPase B1 서브유닛 (ATP6V1B1); 네프린(Nephrin) (NPHS1); 포도신(Podocin) (NPHS2); 및 염소 채널 3 (CLCN3). 위에서부터 아래로 분자량 (MW) 래인의 5개의 밴드는 1000, 850, 650, 500, 400, 300 염기쌍 단편에 상응한다. (e) 뇨 샘플로부터 유래된 엑소좀 핵산에 의한 생체분석기 다이어그램. 숫자는 인간 개체에 붙여진 번호이다. (f) (e)에 기술된 핵산 추출물을 사용함으로써 상이한 프라이머 쌍으로 생성이 된 PCR 생성물을 도시한 슈도겔. 하우스는 액틴 유전자를 나타내고, 액틴 프라이머는 암비온(Ambion) (미국 텍사스주 소재)으로부터 입수하였다. +ve 대조군은 암비온 (미국 텍사스주 소재)으로부터 입수한 인간 신장 cDNA를 주형으로서 사용한 PCR을 나타내고, -ve 대조군은 핵산 주형없이 실시한 PCR을 나타낸다. (g) 핵산 추출에 앞서 엑소좀을 DNase로 처리하거나 처리하지 않고 실시한 PCR을 통해 얻은 액틴 유전자 cDNA의 양성 확인 결과를 보여주는 슈도겔 사진. (h) 인간 뇨 엑소좀으로부터 단리된 핵산의 양을 보여주는 생체분석기 다이어그램.
도 15. 뇨 엑소좀 중의 전립선암 생체마커 분석. (a) TMPRSS2-ERG 유전자의 PCR 생성물 및 상기 PCR 생성물의 분해된 단편을 나타내는 겔 사진. P1 및 P2는 각각 환자 1 및 환자 2로부터 유래된 뇨 샘플을 나타낸다. 각 샘플에 대해 분해되지 않은 생성물은 좌측 래인에, 및 분해된 생성물은 우측 래인에 있다. MWM은 MW 마커를 표시하는 래인을 나타낸다. 밴드 (분해되지 않은 밴드 및 분해된 밴드)의 크기는 패널 우측에 표시되어 있다. (b) PCA3 유전자의 PCR 생성물 및 상기 PCR 생성물의 분해된 단편을 나타내는 겔 사진. P1, P2, P3 및 P4는 각각 환자 1, 환자 2, 환자 3 및 환자 4로부터 유래된 뇨 샘플을 나타낸다. 각 샘플에 대해 분해되지 않은 생성물은 좌측 래인에, 및 분해된 생성물은 우측 래인에 있다. MWM은 MW 마커를 표시하는 래인을 나타낸다. 밴드 (분해되지 않은 밴드 및 분해된 밴드)의 크기는 패널 우측에 표시되어 있다. (c) (a) 및 (b)에 제시된 환자 정보 및 데이타에 대한 요약. TMERG는 TMPRSS2-ERG 융합 유전자를 나타낸다.
도 16. BRAF mRNA는 흑색종 세포에 의해 탈락된 미세소포체 내에 함유되어 있다. (a) BRAF 유전자 증폭의 RT-PCR 생성물을 보여주는 전기영동 겔 사진. (b) GAPDH 유전자 증폭의 RT-PCR 생성물을 보여주는 전기영동 겔 사진. 래인과 그에 상응하는 샘플은 하기와 같다: 1번 래인 - 100 bp 분자량 마커; 2번 래인 - YUMEL-01-06 엑소; 3번 래인 - YUMEL-01-06 세포; 4번 래인 - YUMEL-06-64 엑소; 5번 래인 - YUMEL-06-64 세포; 6번 래인 - M34 엑소; 7번 래인 - M34 세포; 8번 래인 - 섬유모세포 세포; 9번 래인 - 음성 대조군. 참조 용어 "엑소"는, RNA가 배양 배지 중 엑소좀으로부터 추출된 것임을 의미한다. 참조 용어 "세포"는 RNA가 배양된 세포로부터 추출된 것임을 의미한다. YUMEL 다음에 기재된 번호는 특정 배취의 YUMEL 세포주에 대한 식별 표시이다. (c) YUMEL-01-06 엑소로부터 얻은 PCR 생성물의 시퀀싱 결과. YUMEL-01-06 세포, YUMEL-06-64 엑소 및 YUMEL-06-64 세포로부터 얻은 결과는 YUMEL-01-06 엑소로부터 얻은 결과와 동일하다. (d) M34 엑소로부터 얻은 PCR 생성물의 시퀀싱 결과. M34 세포로부터 얻은 결과는 M34 엑소로부터 얻은 결과와 동일하다.
도 17. 아교모세포종 미세소포체는 HBMVEC로 기능성 RNA를 전달할 수 있다. (a) 정제된 미세소포체를 막 염료 PKH67 (녹색)로 표시하고, HBMVEC에 첨가하였다. 1시간 이내에 미세소포체가 엔도좀-유사 구조 내로 내재화되었다. (b) Gluc를 안정하게 발현시키는 아교모세포종 세포로부터 미세소포체를 단리시켰다. Gluc 및 GAPDH mRNA의 RNA 추출 및 RT-PCR을 통해 둘 모두가 미세소포체 내로 혼입된 것으로 나타났다. (c) 이어서, 미세소포체를 HBMVEC에 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 미세소포체 첨가 후 0, 15 및 24시간이 경과하였을 때, 배지 중 Gluc 활성을 측정하고, 미세소포체에서의 Gluc 활성으로 정규화시켰다. 결과를 평균 ± SEM (n = 4)으로 나타내었다.
도 18. 아교모세포종 미세소포체는 시험관내에서 혈관형성을 자극하고, 혈관형성 단백질을 함유한다. (a) HBMVEC를 기초 배지만 있는 것 (EBM), 또는 GBM 미세소포체 (EBM+MV) 또는 혈관형성 인자 (EGM)로 보충된 것 중 마트리겔(Matrigel) ™상에서 배양하였다. 16시간 경과 후에 관 형성을 측정하고, EBM 중에서 성장시킨 것과 비교하여 평균 혈관 길이 ± SEM (n = 6)으로 나타내었다. (b) 원발성 아교모세포종 세포 및 이들 세포로부터 유래된 미세소포체 (MV)로부터의 총 단백질 (각각 1mg씩)을 인간 혈관형성 항체 어레이 상에서 분석하였다. (c) 어레이를 스캐닝하고, 이미지 J(Image J) 소프트웨어를 사용하여 강도를 분석하였다 (n = 4).
도 19. 원발성 아교모세포종 세포로부터 단리된 미세소포체가 U87 아교모세포종 세포주의 증식을 촉진시킨다. 100,000개의 U87 세포를 24웰 플레이트의 웰에 시딩하고, (a) 정상 성장 배지 (DMEM-5% FBS) 또는 (b) 125 ㎍ 미세소포체로 보충된 정상 성장 배지 중에서 3일 동안 성장시켰다. (c) 3일 경과 후, 보충되지 않은 세포는 480,000개의 세포로 확장된 반면, 미세소포체가 보충된 세포는 810,000개의 세포로 확장되었다. NC는 정상 대조군 배지에서 성장된 세포를 나타내고, MV는 미세소포체로 보충된 배지에서 성장된 세포를 나타낸다. 결과를 평균 ± SEM (n=6)으로 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
미세소포체는 진핵 세포에 의해 탈락되거나, 형질막에서부터 세포 밖으로 출아된 것이다. 이들 막 소포체의 크기는 불균일하고, 그 직경 범위는 약 10 nm 내지 약 5000 nm이다. 세포내 다중소포체의 세포외유출에 의해 방출된 작은 미세소포체 (직경이 대략 10 내지 1000 nm, 및 보다 대체로는 30 내지 200 nm)를 당업계에서는 "엑소좀"이라 지칭한다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 모든 크기의 미세소포체 (바람직하게 30 내지 800 nm; 및 더욱 바람직하게 30 내지 200 nm)에 동등하게 적용된다.
일부 문헌에서 "엑소좀"이라는 용어는 또한 mRNA 분해, 및 작은 핵소체 RNA (snoRNA), 작은 핵 RNA (snRNA) 및 리보좀 RNA (rRNA)의 프로세싱에 관여하는 엑소리보뉴클레아제를 함유하는 단백질 복합체를 지칭한다 (문헌 ([Liu et al., 2006b]; [van Dijk et al., 2007])). 그러한 단백질 복합체에는 막이 없으며, 이는 본원에서 사용되는 용어와 같은 "미세소포체" 또는 "엑소좀"은 아니다.
진단 및/또는 예후 도구로서의 엑소좀
본 발명의 특정 측면은 아교모세포종 유래의 미세소포체가 아교모세포종 환자의 혈청으로부터 단리될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 이는 대상체의 체액 중에 존재하는 것으로서, 뇌 세포로부터 유래된 미세소포체에 관한 최초의 발견이다. 상기와 같은 내용을 발견하기 전까지는 아교모세포종 세포가 미세소포체를 생산하는지 여부, 또는 그러한 미세소포체가 혈액뇌장벽을 가로질러 신체 나머지 부위로 넘어가는지 여부를 알지 못했다. 이들 미세소포체는 종양 세포와 관련된 돌연변이체 mRNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 미세소포체는 또한 아교모세포종에 풍부한 것으로 밝혀진 마이크로RNA (miRNA)를 포함하였다. 아교모세포종 유래의 미세소포체는 또한 배양물 중 1차 인간 뇌 미세혈관 내피 세포 (HBMVEC)의 혈관형성 특성을 강력하게 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 이러한 혈관형성 효과는 적어도 부분적으로는 미세소포체에 존재하는 혈관형성 단백질을 통해서 매개되었다. 이들 미세소포체 내에서 발견되는 핵산 뿐만 아니라, 미세소포체의 다른 내용물, 예로서, 혈관형성 단백질은 유전적 프로필을 제공함으로써 종양 진단, 특징 규명 및 예후를 위한 가치있는 생체마커로서 사용될 수 있다. 미세소포체 내의 내용물은 또한 종양이 진행되는 동안 다른 돌연변이를 획득하게 되는지 여부 뿐만 아니라, 시간이 경과함에 따라 또는 치료 과정이 진행됨에 따라 특정 돌연변이의 수준이 증가 또는 감소하게 되는지 여부를 분석함으로써 시간에 따른 종양 진행 상태를 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 측면은, 미세소포체가 종양 세포에 의해 분비되어 체액 중에서 순환한다는 발견에 기초한다. 종양이 성장함에 따라 미세소포체의 개수는 증가한다. 체액 중 미세소포체의 농도는 상응하는 종양 부하량에 비례한다. 종양 부하량이 클수록 체액 중 미세소포체의 농도는 높다.
본 발명의 특정 측면은, 대상체의 체액 중 대부분의 세포외 RNA는 미세소포체 내에 함유되어 있으며, 이로써 리보뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호된다는 또하나의 놀라운 발견에 기초한다. 실시예 3에 나타낸 바와 같이, 전체 혈청 중 90% 초과의 세포외 RNA가 미세소포체에서 회수될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 생물학적 샘플 중 미세소포체의 농도를 측정함으로써 대상체에서의 질환 또는 다른 의학적 병태를 검출, 진단, 모니터링, 치료 또는 평가하는 방법에 관한 것이다. 먼저 미세소포체를 단리시키지 않고 생물학적 샘플을 사용하거나, 먼저 미세소포체를 단리시킴으로써 상기와 같은 측정을 수행할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 대상체의 체액으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 엑소좀 내에 함유되어 있는 하나 이상의 핵산을 분석하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 다른 의학적 병태를 검출, 진단, 모니터링, 치료 또는 평가하는 방법에 관한 것이다. 핵산을 정성 및/또는 정량적으로 분석하고, 그 결과를, 질환 또는 다른 의학적 병태를 앓거나 앓지 않는 하나 이상의 다른 대상체에서 기대되는 결과 또는 그에 대해서 얻은 결과와 비교한다. 하나 이상의 다른 개체와 비교하였을 때, 대상체의 미세소포체 핵산 함량에 있어 차이가 존재한다면, 이는 대상체에 질환 또는 다른 의학적 병태가 존재 또는 부재하거나, 그가 진행 중이거나 (예로서, 종양 크기 및 종양 악성도의 변화), 그에 걸리기 쉽다는 것을 나타내는 것일 수 있다.
실제로, 본원에 기술된 단리 방법 및 기법은 현재까지 실현되지 않았던 하기와 같은 이점을 제공한다: 1) 질환- 또는 종양-특이 핵산을 선택적으로 분석할 수 있는 기회 (이러한 기회는 질환- 또는 종양-특이 미세소포체를 체액 샘플 내에 존재하는 다른 미세소포체로부터 단리시킴으로써 실현될 수 있다); 2) 핵산을 체액 샘플로부터 직접 추출함으로써 수득된 핵산 종의 수율/통합성을 비교하였을 때, 수율은 유의적으로 더욱 높고 서열 통합성도 더 높음; 3) 예로서, 저수준으로 발현되는 핵산을 검출할 수 있는 확장성 (감도는 대량의 혈청으로부터 더 많은 미세소포체를 펠릿화시킴으로써 증가될 수 있다); 4) 핵산 추출 단계 이전에 단백질 및 지질, 죽은 세포로부터의 부스러기, 및 다른 잠재적인 오염원 및 PCR 저해제를 제외시킨다는 점에서 핵산의 순도가 더 높음; 및 5) 미세소포체 펠릿은 출발 혈청의 것보다 더욱더 소량이기 때문에 핵산 추출 방법에 있어 선택의 폭이 더 크고, 이로써 소량의 필터를 사용하여 이들 미세소포체 펠릿으로부터 핵산을 추출할 수 있음.
미세소포체는 바람직하게 대상체로부터의 체액으로부터 채취된 샘플로부터 단리된다. 본원에서 사용되는 바, "체액"은 대상체의 신체 어디든, 바람직하게는, 주변 위치로부터 단리된 체액 샘플을 지칭하는 것으로, 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 및 비뇨생식관액, 눈물, 타액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"대상체"라는 용어는 미세소포체를 갖는 것으로 나타나거나, 그럴 것으로 예측되는 모든 동물을 포함하는 것으로 한다. 특정 실시태양에서, 대상체는 포유동물, 인간 또는 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 다른 가축, 또는 설치류 (예로서, 마우스, 래트, 기니아 피크 등)이다. "대상체" 및 "개체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
생물학적 샘플로부터 미세소포체를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 편차 원심분리법이 라포소(Raposo) 등의 논문 (문헌 [Raposo et al., 1996])에 기재되어 있고, 유사 방법은 본원 실시예 섹션에 상세히 설명되어 있다. 음이온 교환 방법 및/또는 겔 투과 크로마토그래피는 미국 특허 번호 제6,899,863호 및 제6,812,023호에 기재되어 있다. 수크로스 밀도 구배 방법 또는 세포소기관 전기영동은 미국 특허 번호 제7,198,923호에 기재되어 있다. 자성 활성 세포 분류 방법 (MACS)은 문헌 [Taylor and Gercel-Taylor, 2008]에 기재되어 있다. 나노막 한외여과 농축기 방법은 문헌 [Cheruvanky et al., 2007]에 기재되어 있다. 바람직하게, 미세소포체는 종양 유래의 미세소포체를 효율적이면서도 선택적으로 분리해낼 수 있는 특유의 미세유체 플랫폼을 사용하는, 새로 개발된 마이크로칩 기술에 의해서 대상체의 체액으로부터 확인하고 단리시킬 수 있다. 나그래트(Nagrath) 등에 의한 논문 (문헌 [Nagrath et al., 2007])에 기재되어 있는 것과 같이, 상기의 기술을 적합하게 개조하여 상기 논문에서 교시된 바와 유사한 포획 및 분리 원리를 사용함으로써 미세소포체를 확인하고 분리할 수 있다. 각각의 상기 언급한 문헌들은 이러한 방법의 교시를 위해 본원에서 참고로 인용된다.
하나의 실시태양에서, 체액으로부터 단리된 미세소포체는 예를 들면, 폐, 췌장, 위, 장, 담낭, 신장, 난소, 정소, 피부, 결장직장, 유방, 전립선, 뇌, 식도, 간, 태반, 태아 세포와 같이 특정 세포 유형으로부터 기원하는 것에 대해 강화된다. 미세소포체는 대개 그의 공여자 세포로부터 유래되는 표면 분자, 예로서, 항원을 보유하기 때문에, 특정 공여자 세포 유형으로부터 미세소포체를 확인, 단리 및/또는 그에 대해 강화시키는데 표면 분자가 사용될 수 있다 (문헌 ([Al-Nedawi et al., 2008]; [Taylor and Gercel-Taylor, 2008])). 이러한 방식으로, 다른 세포 군집으로부터 기원하는 미세소포체를 그의 핵산 함량에 대하여 분석할 수 있다. 예를 들면, 종양 (악성 및 비-악성) 미세소포체는 종양-관련 표면 항원을 보유하며, 이는 이들 특이적인 종양-관련 표면 항원을 통해 검출, 단리 및/또는 강화될 수 있다. 일례로, 표면 항원은 상피-세포-부착-세포 (EpCAM)인데, 이는 폐, 결장직장, 유방, 전립선, 두부경부, 및 간 기원의 암종 (단, 혈액성 세포 기원의 암종 예외)으로부터 유래된 미세소포체에 대해 특이성을 띤다 (문헌 ([Balzar et al., 1999]; [Went et al., 2004])). 또다른 일례로, 표면 항원은 CD24인데, 이는 뇨 미세소포체에 특이적인 당단백질이다 (문헌 [Keller et al., 2007]). 추가의 또다른 일례로, 표면 항원은 분자 CD70, 암배아 항원 (CEA), EGFR, EGFRvIII 및 기타 변이체, Fas 리간드, TRAIL, 트랜스페린 수용체, p38.5, p97 및 HSP72로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로, 종양 특이 미세소포체는 예로서, CD80 및 CD86과 같은 표면 마커의 부재를 통해 특징이 규명될 수 있다.
특정 세포 유형으로부터 미세소포체를 단리시키는 것은 예를 들면, 원하는 표면 항원에 대하여 특이적인 항체, 압타머, 압타머 유사체 또는 분자적으로 각인된 중합체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 표면 항원은 암 유형에 대하여 특이적이다. 또다른 실시태양에서, 표면 항원은 반드시 암성을 띠는 것은 아닌 세포 유형에 대하여 특이적이다. 세포 표면 항원에 기초하여 미세소포체를 분리하는 방법의 한 일례가 미국 특허 번호 제7,198,923호에 제공되어 있다. 예로서, 미국 특허 번호 제5,840,867호 및 제5,582,981호, WO/2003/050290 및 공개문헌 [Johnson et al. (Johnson et al., 2008)]에 기재되어 있는 바와 같이, 압타머 및 그의 유사체는 표면 분자에 특이적으로 결합하며, 세포 유형에 특이적인 미세소포체를 회수하는 분리 도구로서 사용될 수 있다. 분자적으로 각인된 중합체는 또한 예로서, 미국 특허 번호 제6,525,154호, 제7,332,553호 및 제7,384,589호, 및 공개문헌 [Bossi et al. (Bossi et al., 2007)]에 기재되어 있는 바와 같이, 표면 분자를 특이적으로 인식하며, 이는 세포 유형에 특이적인 미세소포체를 회수하고 단리시키는 도구가 된다. 하기의 참고 문헌들은 각각 이들 방법을 교시하기 위하여 본원에서 인용된다.
분석하기 이전에 핵산을 엑소좀으로부터 추출하는 것이 유익하거나, 다르게는 바람직할 수 있다. 핵산 분자는 당업계에 주지되어 있는 임의의 많은 방법들, 특정 생물학적 샘플에 대하여 적절한 것으로 선택되는 특정 단리 방법을 사용함으로써 미세소포체로부터 단리될 수 있다. 추출 방법의 예가 본원 실시예 섹션에서 제공된다. 일례로는 또한 미세소포체로부터 추출하지 않고서도 몇몇 기법을 사용함으로써 핵산을 분석할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, DNA 및/또는 RNA를 비롯한, 추출된 핵산을 증폭 단계없이 직접 분석한다. 나노스트링 기술을 포함하나, 이에 한정되지 않는 상이한 방법을 사용함으로써 직접적으로 분석할 수 있다. 나노스트링 기술을 통해 색깔로 표시되는 형광 리포터를 각각의 표적 분자에 부착시킴으로써 생물학적 샘플 중 개별 표적 분자를 확인하고 정량할 수 있다. 이러한 접근법은 바코드를 스캐닝하여 목록을 판단하는 개념과 유사하다. 수백 또는 심지어는 수천개의 다른 코드를 갖는 리포터를 제조할 수 있으며, 이를 통해 고도로 다중화된 분석을 수행할 수 있다. 본 기술은 공개문헌 [Geiss et al. (Geiss et al., 2008)]에 기재되어 있으며, 이는 상기 교시를 위해 본원에서 참고로 인용된다.
또다른 실시태양에서, 미세소포체의 핵산을 분석하기 이전에 이를 증폭시키는 것이 유익하거나, 다르게는 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 방법은 보편적으로 사용되는 것이며, 이는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 그의 예로서 다수가 본원에 기술되어 있다. 원하는 경우, 정량적 증폭을 수행할 수 있다. 정량적 증폭을 통해 다양한 핵산의 상대적인 양을 정량적으로 측정할 수 있고, 이로써 하기 기술하는 바와 같이, 프로필을 작성할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 추출된 핵산은 RNA이다. 이어서, 추가로 증폭시키기 이전에 RNA를 상보성 DNA로 역전사시키는 것이 바람직하다. 상기와 같은 역전사 단계는 단독으로 수행되거나, 증폭 단계와 함께 수행될 수 있다. 역전사 단계와 증폭 단계를 조합시킨 방법의 일례로는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)이 있으며, 이는 미국 특허 번호 제5,639,606호 (이는 상기 교시를 위해 본원에서 참고로 인용된다)에 기재되어 있는 바와 같이, 정량적인 것, 예로서, 정량적 RT-PCR로 추가 변형될 수 있다.
핵산 증폭 방법으로는 제한없이, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) (미국 특허 번호 제5,219,727호) 및 그의 변형, 예로서, 계내 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 제5,538,871호), 정량적 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 제5,219,727호), 이중(nested) 중합효소 연쇄 반응 (미국 특허 번호 제5,556,773호), 자립형 서열 복제 및 그의 변형 (문헌 [Guatelli et al., 1990]), 전사 증폭 시스템 및 그의 변형 (문헌 [Kwoh et al., 1989]), Qb 리플리카제 및 그의 변형 (문헌 [Miele et al., 1983]), 냉-PCR (문헌 [Li et al., 2008]) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법을 수행한 후, 이어서 당업계에 공지된 기법을 사용함으로써 증폭된 분자를 검출하는 것을 포함한다. 상기 분자가 극히 낮은 개수로 존재하는 경우, 핵산 분자 검출을 위해 디자인된 상기와 같은 검출 계획안이 특히 유용하다. 상기 참고문헌은 이들 방법에 관한 상기 교시를 위해 본원에서 참고로 인용된다.
미세소포체에 존재하는 핵산을 분석하는 것은 정량적 및/또는 정성적인 것이다. 정량적 분석인 경우에는 상대적인 양이든 절대적인 양이든, 미세소포체 내에 존재하는 관심의 대상이 되는 특정 핵산의 양 (발현 수준)을 당업계에 공지된 방법 (하기 기술)을 사용하여 측정한다. 정성적 분석인 경우에는 야생형이든 변이체이든, 미세소포체 내에 존재하는 관심의 대상이 되는 특정 핵산 종을 당업계에 공지된 방법 (하기 기술)을 사용하여 확인한다.
"유전적 이상"이란 미세소포체 내에 존재하는 핵산의 양과 핵산 변이체에 관해 언급하기 위해서 본원에서 사용된다. 구체적으로, 유전적 이상은 제한없이, 유전자 (예로서, 온코진) 또는 유전자 패널의 과다발현, 유전자 (예로서, 종양 억제 유전자, 예로서, p53 또는 RB) 또는 유전자 패널의 과소발현, 유전자 또는 유전자 패널의 스플라이스 변이체의 선택적 생산, 유전자 복제수 변이체 (CNV) (예로서, DNA 이중 미소체) (문헌 [Hahn, 1993]), 핵산 변형 (예로서, 메틸화, 아세틸화 및 인산화), 단일 염기 다형성 (SNP), 염색체 재배열 (예로서, 역전, 결실 및 중복), 및 유전자 또는 유전자 패널의 돌연변이화 (삽입, 결실, 중복, 미스센스, 넌센스, 동의 또는 임의의 다른 뉴클레오티드 변화) (대개의 경우, 이런 돌연변이화가 궁극적으로는 유전자의 활성과 기능에 영향을 미쳐 선택적 전사 스플라이싱 변이체 및/또는 유전자 발현 수준의 변화를 일으킨다)를 포함한다.
이러한 유전적 이상을 측정하는 것은 숙련인에게 공지되어 있는 각종 기법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 핵산 발현 수준, 선택적 스플라이싱 변이체, 염색체 재배열 및 유전자 복제수는 마이크로어레이 분석법 (미국 특허 번호 제6,913,879호, 제7,364,848호, 제7,378,245호, 제6,893,837호, 및 제6,004,755호) 및 정량적 PCR에 의해 측정될 수 있다. 특히, 복제수 변화는 일루미나 인피늄 II(Illumina Infinium II) 전체 게놈 유전자형 분석법 또는 애질런트 휴먼 게놈 CGH 마이크로어레이(Agilent Human Genome CGH Microarray)를 사용하여 검출할 수 있다 (문헌 [Steemers et al., 2006]). 핵산 변형은 예로서, 미국 특허 번호 제7,186,512호 및 특허 공개공보 WO/2003/023065에 기재되어 있는 방법에 의해 분석할 수 있다. 특히, 메틸화 프로필은 일루미나 DNA 메틸레이션 OMA003 캔서 패널(Illumina DNA Methylation OMA003 Cancer Panel)에 의해 측정할 수 있다. SNP 및 돌연변이화는 대립유전자에 특이적인 프로브와의 혼성화, 효소에 의한 돌연변이 검출, 미스매치된 이형접합체의 화학적 절단 (문헌 [Cotton et al., 1988]), 미스매치된 염기의 리보뉴클레아제에 의한 절단 (문헌 [Myers et al., 1985]), 질량 분광분석법 (미국 특허 번호 제6,994,960호, 제7,074,563호, 및 제7,198,893호), 핵산 시퀀싱, 싱글 스트랜드 입체형태 다형성 (SSCP) (문헌 [Orita et al., 1989]), 변성 구배 겔 전기영동 (DGGE) (문헌 ([Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b])), 온도 구배 겔 전기영동 (TGGE) (문헌 ([Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b])), 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) (문헌 ([Kan and Dozy, 1978a]; [Kan and Dozy, 1978b])), 올리고뉴클레오티드 연결 분석법 (OLA), 대립유전자-특이 PCR (ASPCR) (미국 특허 번호 제5,639,611호), 연결 연쇄 반응 (LCR) 및 그의 변형 방법 (문헌 ([Abravaya et al., 1995]; [Landegren et al., 1988]; [Nakazawa et al., 1994])), 유식세포 측정식 이형접합체 분석 (WO/2006/113590) 및 그의 조합/변형에 의해 검출할 수 있다. 특히, 유전자 발현 수준은 유전자 발현 연속 분석 (SAGE) 기법에 의해 측정할 수 있다 (문헌 [Velculescu et al., 1995]). 일반적으로, 유전적 이상을 분석하는 방법은 본원에서 인용되는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 다수의 공개문헌에 보고되어 있으며, 숙련인은 이를 이용할 수 있다. 적절한 분석 방법은 분석의 구체적인 목적, 환자의 상태/병력, 및 특정 암(들), 검출, 모니터링, 또는 치료하고자 하는 질환 또는 다른 의학적 병태에 따라 달라질 것이다. 상기 참고문헌은 이들 방법에 관한 상기 교시를 위해 본원에서 참고로 인용된다.
각종 유전적 이상이 초기 암 발생 또는 진행을 일으키고/거나 그에 원인이 된다고 확인되었다. 암에서 보편적으로 상향조절되어 있는 (즉, 과다발현된) 유전자의 예는 표 4 (상이한 유형의 암) 및 표 6 (췌장암)에 제공되어 있다. 뇌 종양에서 상향조절되어 있는 마이크로RNA의 예는 표 8에 제공되어 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 표 4 및/또는 표 6에 열거되어 있는 유전자, 및/또는 표 8에 열거되어 있는 마이크로RNA의 핵산 발현 수준은 증가되어 있다. 암에서 보편적으로 하향조절되어 있는 (예로서, 과소발현된) 유전자의 예는 표 5 (상이한 유형의 암) 및 표 7 (췌장암)에 제공되어 있다. 뇌 종양에서 하향조절되어 있는 마이크로RNA의 예는 표 9에 제공되어 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 표 5 및/또는 표 7에 열거되어 있는 유전자, 및/또는 표 9에 열거되어 있는 마이크로RNA의 핵산 발현 수준은 감소되어 있다. 뇌 종양에서 하향조절되어 있거나, 상향조절되어 있는 유전자의 예는 문헌 [Furnari et al., 2007] (이러한 내용은 본원에서 참고로 인용된다)에서 리뷰할 수 있다. 뇌 종양 발생과 관련하여, RB 및 p53은 대개 하향조절되어 있고, 다르게는 그의 종양 억제 활성이 감소되어 있다. 따라서, 이러한 실시태양에서, 유전자(들) 및/또는 마이크로RNA(들) 발현 수준의 조절장애가 암 유형에 특이적인 것인, 유전자(들) 및/또는 마이크로RNA(들)의 핵산 발현 수준 상의 증가 또는 감소가 존재하는지 또는 부재하는지, 그 여부를 사용하여 대상체에 그러한 암 유형이 존재 또는 부재하는지를 나타낼 수 있다.
유사하게, 임산부 (여기서, 태아로부터 유래된 미세소포체는 혈청 뿐만 아니라, 양수 중에 존재할 수 있다)를 비롯한 대상체의 체액으로부터 유래된 미세소포체 내에서 핵산 변이체, 예로서, DNA 또는 RNA 변형, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 돌연변이화 (예로서, 미스센스, 넌센스, 삽입, 결실, 중복) 또한 분석할 수 있다. 그의 비제한적인 예가 표 3에 제공되어 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변이체는 EGFR 유전자 중에 있다. 추가의 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변이체는 EGFRvIII 돌연변이/변이체이다. "EGFR," "표피 성장 인자 수용체" 및 "ErbB1"이라는 용어는 예를 들면, 카펜터(Carpenter)에 의한 논문 [Carpenter, 1987]에 기재되어 있는 바와 같이, 당업계에서 상호교환적으로 사용된다. 뇌 종양 발생과 관련하여, RB, PTEN, p16, p21 및 p53은 대개 하향조절되어 있고, 다르게는 그의 종양 억제 활성이 감소되어 있다. 특정 형태의 뇌 종양에서 특정 돌연변이의 예는 퓨너리(Furnari) 등의 논문 [Furnari et al., 2007] (이러한 내용은 본원에서 참고로 인용된다)에 논의되어 있다.
추가로, 최근 진행중인 몇몇 프로젝트에서 암과 관련된 더 많은 유전적 이상이 확인되었다. 예를 들면, 더 캔서 게놈 아틀라스(TCGA: the Cancer Genome Atlas)는 인간 암에 관여하는 게놈 변화 스펙트럼을 조사하고 있다. 상기 프로젝트와 다른 유사 연구 노력의 결과가 공개되어 있으며, 본원에서 참고로 인용된다 (문헌 ([Jones et al., 2008]; [McLendon et al., 2008]; [Parsons et al., 2008]; [Wood et al., 2007])). 구체적으로, 이들 연구 프로젝트를 통해 인간 아교모세포종, 췌장암, 유방암 및/또는 결장직장암에서의 유전적 이상, 예로서, 돌연변이 (예로서, 미스센스, 넌센스, 삽입, 결실 및 중복), 유전자 발현 수준 변이 (mRNA 또는 마이크로RNA), 복제수 변이 및 핵산 변형 (예로서, 메틸화)이 확인되었다. 이들 암에서 가장 빈번하게 돌연변이화된 유전자는 표 11 및 표 12 (아교모세포종), 표 13 (췌장암), 표 14 (유방암) 및 표 15 (결장직장암)에 열거되어 있다. 이들 유전자에서의 유전적 이상, 및 실제로 암에서 임의의 유전적 이상을 포함하는 임의의 유전자가 본원에 기술된 방법에 의해서 암을 진단 및/또는 모니터링하는데 사용하기 위해 선택될 수 있는 표적이 된다.
미세소포체 내의 핵산에 대한 뉴클레오티드 변이체 스크린을 실시함으로써 하나 이상의 뉴클레오티드 변이체를 검출할 수 있다. 상기 스크린은 당업자가 필요하다고 판단하거나 바람직하다고 판단하는 바에 따라 광범위한 스크린이거나, 협소한 스크린일 수 있다. 이는 (하나 이상의 암 또는 질환 상태와 관련된 것으로 알려져 있는 유전자에 대하여 가능한 모든 뉴클레오티드 변이체를 검출할 수 있도록 설정된) 괌범위한 스크린이 될 수 있다. 하나의 특정 암 또는 질환이 의심되거나 존재하는 것으로 알려진 경우, 스크린은 암 또는 질환에 대해 특이적일 수 있다. 일례로는, (예로서, 각종의 임상적으로 다른 뇌 암의 하위유형 또는 상기 암의 공지 약물-내성 또는 약물-감수성 돌연변이와 관련된 유전자에 대하여 가능한 모든 뉴클레오티드 변이체를 검출할 수 있도록 설정된) 뇌 종양/뇌 암 스크린이 있다.
하나의 실시태양에서, 분석은 미세소포체 중에 존재하는 특정 핵산의 양 (수준)에 관한 프로필이다 (본원에서는 이하 미세소포체의 "정량적 핵산 프로필"로 지칭한다). 또다른 실시태양에서, 분석은 미세소포체 중에 존재하는 특정 핵산 종 (야생형 뿐만 아니라, 변이체)에 관한 프로필이다 (본원에서는 "핵산 종 프로필"로 지칭한다). 본원에서 이러한 유형의 프로필 조합을 지칭하는데 사용된 용어는 뉴클레오티드 종, 변이체, 및 핵산 수준의 증가 또는 감소의 존재 또는 부재에 관한 측정을 나타내는 "유전적 프로필"이다.
일단 작성되면, 미세소포체의 이들 유전적 프로필을 건강한 정상 개체에서 기대되는 것, 또는 다르게는 건강한 정상 개체로부터 유래된 것과 비교한다. 프로필은 (발현된 유전자 또는 DNA 서열을 가능한 모두 검출할 수 있도록 설정된) 광범위한 게놈 프로필일 수 있다. 이는 또한 그보다는 협소할 수 있는데, 예로서, (하나 이상의 암으로부터 유래되거나, 또는 하나 이상의 암과 관련이 있는 것으로 알려져 있는 유전자 또는 핵산을 가능한 모두 검출할 수 있도록 설정된) 광범위한 암 프로필이 있다. 하나의 특정 암이 존재하는 것으로 의심이 되거나, 그러한 것으로 알려져 있는 경우, 그 프로필은 (예로서, 암으로부터 유래되거나, 각종의 임상적으로 다른 암의 하위유형 또는 암의 공지 약물-내성 또는 약물-감수성 돌연변이와 관련된 유전자 또는 핵산을 가능한 모두 검출할 수 있도록 설정된) 암에 대하여 특이적일 수 있다.
어떤 핵산을 증폭시킬 것인지 및/또는 분석할지는 숙련인에 의해 선택될 수 있다. 엑소좀의 전체 핵산 내용물, 또는 예로서, 암과 같은 질환 또는 다른 의학적 병태의 존재에 의해 영향을 받을 수 있거나, 그러할 것으로 의식되는 특정 핵산의 하위세트만을 증폭시키고/거나 분석할 수 있다. 분석하는 미세소포체 핵산 중에서 핵산 이상(들)을 확인하게 되면, 이를 사용하여 상기 이상(들)과 관련이 있는 질환, 예로서, 암, 유전병, 또는 바이러스 감염의 존재에 대하여 대상체를 진단할 수 있다. 예를 들면, 암에 대하여 특이적인 유전자의 하나 이상의 핵산 변이체 (예로서, EGFRvIII 돌연변이)의 존재 또는 부재에 대한 분석은 개체에서 암의 존재를 나타낼 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 암에 대하여 특이적인 핵산 수준 상의 증가 또는 감소에 관한 핵산 분석이 개체에서의 암의 존재에 관해 나타낼 수 있다 (예로서, EGFR 핵산의 상대적인 증가, 예로서, p53과 같은 종양 억제 유전자의 상대적인 감소).
하나의 실시태양에서, 예로서, 암과 같은 질환과 관련이 있는 유전자의 돌연변이 (예로서, 뉴클레오티드 변이체, 과다발현 또는 과소발현을 통한 유전자의 돌연변이)는 미세소포체 중의 핵산 분석에 의해 검출되는데, 여기서, 핵산은 기원 세포 중의 그 자체의 게놈으로부터 또는 바이러스를 통해 도입된 외인성 유전자로부터 유래된 것이다. 핵산 서열은 전장 또는 부분 서열일 수 있는데, 이 둘 모두가 질환의 진단 또는 예후에서 유용한 정보를 제공할 것으로 기대되기 때문이다. 서열은 실제 유전자 또는 전사된 서열에 대해 센스 또는 안티-센스일 수 있다. 숙련인은 미세소포체 중에 존재할 수 있는 센스 또는 안티-센스일 핵산으로부터 뉴클레오티드 변이에 대한 검출 방법을 디자인할 수 있다. 상기와 같은 다수의 방법들은 직접 뉴클레오티드 변이 측면에 위치하거나, 그를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적인 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 숙련인은 유전자 서열과 상기 유전자 내의 핵산 변이체의 위치에 관한 정보를 제공받으면 상기와 같은 프로브를 디자인할 수 있다. 당업계에 기재되어 있고 본원에 기술되어 있는 바와 같이, 상기와 같은 프로브를 사용하여 핵산 변이체를 단리, 증폭, 및/또는 실제로 혼성화시켜 검출할 수 있다.
대상체로부터 유래된 미세소포체 내의 핵산 중 특정 뉴클레오티드 변이체 또는 복수개의 변이체의 존재 또는 부재를 측정하는 것은 각종 방법으로 수행될 수 있다. 상기 분석을 위해 PCR, 대립유전자에 특이적인 프로브와의 혼성화, 효소에 의한 돌연변이 검출, 미스매치의 화학적 절단, 질량 분광분석법 또는 DNA 시퀀싱 (미니시퀀싱 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 방법을 이용할 수 있다. 특정 실시태양에서, 대립유전자에 특이적인 프로브와의 혼성화는 하기 2가지 포맷으로 수행될 수 있다: 1) 다수의 DNA 칩 적용에서와 같이, 고체상 (유리, 실리콘, 나일론 막)에 결합된, 대립유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 용액 중에 존재하는 표지된 샘플, 또는 2) 결합된 샘플 (대개는 클로닝된 DNA 또는 PCR 증폭된 DNA)과, 용액 중에 존재하는 표지된 올리고뉴클레오티드 (상기 올리고뉴클레오티드는 혼성화에 의해 시퀀싱할 수 있도록 하기 위해서 대립유전자에 특이적이거나, 단쇄이다). 진단 시험은 대개는 고체 지지체 상에 변이 패널을 포함할 수 있는데, 이를 통해서 1 초과의 변이를 동시에 측정할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 미세소포체 핵산 중 적어도 하나의 핵산 변이의 존재에 대하여 측정하는 것은 반수체형 분석 시험을 포함한다. 반수체형을 측정하는 방법은 예를 들면, WO 00/04194에서와 같이, 당업자에게 공지되어 있다.
하나의 실시태양에서, 핵산 변이체(들)의 존재 또는 부재 여부를 측정하는 것은 예로서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 연쇄 종결 DNA 시퀀싱 (미국 특허 번호 제5547859호), 미니시퀀싱 (문헌 [Fiorentino et al., 2003]), 올리고뉴클레오티드 혼성화, 파이로시퀀싱, 일루미나 게놈 분석기, 심도 시퀀싱, 질량 분광분석법 또는 다른 핵산 서열 검출 방법과 같은 방법에 의해서 변이체 부위 또는 부위들 (표준으로부터 핵산 변이가 발생한, 서열 내의 정확한 위치)의 서열을 측정하는 것을 포함한다. 핵산 변이체를 검출하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, WO 00/04194 (본원에서 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 예시적인 방법에서, 진단 시험은 원하는 유전 서열 중 하나 이상의 공지 변이체에 놓여 있는 DNA 또는 RNA (일반적으로는 RNA가 상보성 DNA로 전환된 후의 것)의 세그먼트를 증폭시키는 것을 포함한다. 이어서, 증폭된 세그먼트 중 뉴클레오티드 변이체를 확인하기 위해 상기 증폭된 세그먼트를 시퀀싱하고/거나 전기영동시킨다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 단리된 미세소포체의 핵산 중 뉴클레오티드 변이체를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이는 예를 들면, PCR에 의해, 또는 별법으로, 연결 연쇄 반응 (LCR) (문헌 ([Abravaya et al., 1995]; [Landegren et al., 1988]; [Nakazawa et al., 1994]))에 의해 달성될 수 있다. LCR은 특히 관심의 대상이 되는 유전자 중 점 돌연변이를 검출하는데 있어 유용할 수 있다 (문헌 [Abravaya et al., 1995]). LCR 방법은 관심의 대상이 되는 유전자에 상응하는 핵산 중 하나 이상의 보존 영역에 상응하는 프라이머인, 표적 서열을 증폭시키기 위한 축퇴 프라이머를 디자인하는 단계, 미세소포체로부터 수득한 핵산을 주형으로서 사용하여 상기 프라이머로 PCR 생성물을 증폭시키는 단계, 및 PCR 생성물을 분석하는 단계를 포함한다. 미세소포체 핵산의 PCR 생성물을 대조군 샘플 (뉴클레오티드 변이체를 갖거나 갖지 않는 샘플)을 비교함으로써 미세소포체 핵산 중의 변이체를 나타낸다. 상기 변경은 대조군에 따라 미세소포체 핵산 중의 뉴클레오티드 변이체의 부재 또는 존재일 수 있다.
자동화 및 수동 겔 전기영동, 질량 분광분석법 등을 비롯한 방법으로서, 그의 크기에 따라 증폭 생성물을 분리할 수 있는 것인 임의의 방법을 사용함으로써 증폭 생성물을 분석할 수 있다.
별법으로, SSCP, DGGE, TGGE, 화학적 절단, OLA, 제한 단편 길이 다형성 뿐만 아니라, 혼성화, 예를 들면, 핵산 마이크로어레이를 사용함으로써 서열 차이에 기초하여 증폭 생성물을 분석할 수 있다.
핵산 단리, 증폭 및 분석 방법은 당업자에게는 통상적인 것으로서, 프로토콜의 예는 예를 들면, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel, and Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 3rd edition (January 15, 2001), ISBN: 0879695773]에서 살펴볼 수 있다. PCR 증폭에 사용되는 방법에 대하여 특히 유용한 프로토콜의 출처는 [PCR Basics: From Background to Bench by Springer Verlag; 1st edition (October 15, 2000), ISBN: 0387916008]이다.
본원에서 입증된 바와 같이, 몇몇 정상 세포 뿐만 아니라, 종양 세포도 체액 내로 미세소포체를 탈락시키고, 이들 미세소포체 내의 유전적 이상이 종양 세포 내의 유전적 이상을 반영하는 바, 미세소포체를 사용하여 종양 생검 샘플에 대하여 수행되는 다수의 진단 방법을 실시할 수 있다. 추가로, 미세소포체를 사용하는 진단 방법은 종양 생검 샘플에 대해 직접적으로 수행되는 진단 방법은 없다는 점을 특징으로 한다. 예를 들면, 종양/암 핵산을 샘플링하는 다른 형태와는 대조적으로, 미세소포체 핵산을 분석하는 것이 갖는 한가지 특별한 이점은 종양의 모든 병소로부터 유래되거나, 개체내 존재하는 유전적으로 이종성인 종양으로부터 유래된 종양/암 핵산의 분석이 이용가능하다는 점이다. 생검 샘플은 생검이 수득되는 종양의 특정 병소에 대한 정보만을 제공하는 것으로 제한되어 있다. 체내, 또는 심지어는 단일 종양 내에서 발견되는 상이한 종양성/암성 병소도 자주 상이한 유전적 프로필을 갖고, 표준 생검으로 분석되지 못한다. 그러나, 가정컨대, 단일 생검으로는 제공할 수 없는, 개체로부터 유래된 미세소포체 핵산을 분석함으로써 개체 내의 모든 병소를 샘플링할 수 있다. 이는 권고된 치료법, 치료 효능, 질환 진단, 및 질환 재발 분석과 관련하여 가치있는 정보를 제공하게 된다.
본원에 기술된 방법에 의해 특정 질환 및/또는 의학적 병태와 관련된 유전적 이상을 확인하는 것은 또한 질환 또는 다른 의학적 병태, 예로서, 암으로 진단받은 개체의 예후 및 치료법 결정에 사용될 수 있다. 질환 및/또는 의학적 병태의 유전적 소지를 확인하는 것은 질환 및/또는 의학적 병태의 치료법에 대해 지침이 되는 유용한 정보를 제공한다. 예를 들면, 다수의 화학요법이 특정의 유전자 이상/유전적 이상을 보이는 암에 대하여 더욱 효과적인 것으로 나타났다. 일례로는 예로서, 키나제 저해제인 게피티닙 및 엘로티닙과 같은 의약을 사용하여 EGFR-표적화하는 치료법을 수행하였을 때의 효능을 들 수 있다. 상기와 같은 치료법은 EGFR 유전자가 EGFR 단백질의 키나제 도메인 중에 특정의 뉴클레오티드 돌연변이를 보유하는 것인 암 세포에 대하여 더욱 효과적인 것으로 나타났다 (미국 특허 공개 번호 20060147959). EGFR 핵산 메세지의 키나제 도메인 중 확인된 뉴클레오티드 변이체가 적어도 하나 존재한다는 것은 환자가 EGFR-표적화 화합물인 게피티닙 또는 엘로티닙을 사용한 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 종양 기원의 EGFR 전사체가 체액 중 미세소포체로부터 단리된다고 입증된 바, 그러한 뉴클레오티드 변이체는 본원에 기술된 방법에 의해 미세소포체 중에 존재하는 핵산 중에서 확인될 수 있다.
다른 유전자에서의 유전적 이상은 또한 치료 효능에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 퓨너리 등 (문헌 [(Furnari et al., 2007)])의 공개문헌에 개시되어 있는 바와 같이, 각종 유전자의 돌연변이가 뇌 종양 치료를 위한 화학요법에 사용되는 특정 의약의 효능에 영향을 준다. 미세소포체 중 핵산 내의 이러한 유전적 이상을 확인하는 것은 적절한 치료 계획을 선택하는데 지침이 될 것이다.
따라서, 본 발명의 측면은 대상체에서 질환 (예로서, 암) 진행을 모니터링하는 방법, 및 추가로 개체에서 질환 재발을 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 본원에서 논의된 바와 같이, 개체의 체액으로부터 미세소포체를 단리시키는 단계, 및 (예로서, 미세소포체의 유전적 프로필을 작성하기 위해) 본원에서 논의된 바와 같이, 미세소포체 내의 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 특정 유전적 이상/프로필의 존재/부재를 사용하여 대상체에서의 질환 (예로서, 암)의 존재/부재를 나타낼 수 있다. 이 과정은 시간을 두고 주기적으로 수행하고 결과를 리뷰함으로써 질환의 진행 또는 퇴행을 모니터링하거나, 질환의 재발을 결정한다. 바꿔 말하면, 유전적 프로필의 변화가 대상체에서 질환 상태의 변화를 나타낸다. 미세소포체의 단리 및 분석 수행을 위해 대상체로부터 미세소포체를 샘플링하는 사이에 경과되는 시간은 대상체의 상황에 따라 달라질 것이며, 이는 당업자에 의해 결정될 것이다. 대상체가 받은 요법과 관련이 있는 유전자로부터 핵산을 분석할 때에 상기 방법은 매우 유익한 것으로 판명될 것이다. 예를 들면, 요법에 의해 표적화되는 유전자는 상기 요법에 대한 내성을 부여하는 돌연변이가 발생에 대하여 모니터링될 수 있으며, 돌연변이 발생 시점에서 요법은 적절히 변형될 수 있다. 모니터링되는 유전자는 또한 특정 요법에 대하여 특정 반응성을 나타내는 것이다.
본 발명의 측면은 또한 각종 비-암 질환 및/또는 의학적 병태가 또한 유전적 관련성 및/또는 원인을 갖고 있으며, 그러한 질환 및/또는 의학적 병태 역시 본원에 기술된 방법에 의해 진단되고/거나 모니터링될 수 있다는 사실에 관한 것이다. 그러한 질환은 다수가 성질상 대사성, 감염성 또는 퇴행성이다. 그러한 질환 중 하나는, 바소프레신 2형 수용체 (V2R)이 변형된 것인 당뇨병 (예로서, 요붕증)이다. 상기와 같은 질환 중 또다른 것은 콜라겐, 피브로넥틴 및 TGF-β의 유전자에 대한 유전적 프로필이 변화된 신장 섬유증이다. 물질 남용 (예로서, 스테로이드 또는 약물 사용), 바이러스 및/또는 세균 감염, 및 유전성 질환 상태에 기인하는 유전적 프로필의 변화는 본원에 기술된 방법에 의해 검출될 수 있다.
본원에 기술된 발명이 적용될 수 있는 질환 또는 다른 의학적 병태로는 신장병증, 요붕증, 당뇨병 I형, 당뇨병 II형, 신장병 사구체신염, 세균성 또는 바이러스성 사구체신염, IgA 신장병증, 헤노호-쉐라인(Henoch-Schonlein) 자반증, 막증식성 사구체신염, 막성 신장병증, 쇼그렌 증후군, 신증후군 미세 변화병, 초점성 사구체경화증 및 관련 질병, 급성 신부전증, 급성 세뇨관간질 신염, 신우신염, GU관 염증성 질환, 전자간증, 신장 이식 거부, 나병, 역류 신장병증, 신장결석증, 유전성 신장병, 수질 낭성 질환, 수질 해면 질환, 다낭성 신장병, 보통염색체 우성 다낭성 신장병, 보통염색체 열성 다낭성 신장병, 결절 경화증, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 가족성 박층-사구체 기저막 질병, 콜라겐 III 사구체병증, 피브로넥틴 사구체병증, 알포오트 증후군, 파브리 질환, 손발톱-슬개골 증후군, 선천성 비뇨성 기형, 모노클로날 감마 글로불린병증, 다발 골수종, 아밀로이드증 및 관련 질병, 열병, 가족성 지중해열, HIV 감염-AIDS, 염증성 질환, 전신성 혈관염, 결절 다발동맥염, 베게너 육아종증, 다발동맥염, 괴사성 및 초승달 사구체신염, 다발성 근염-피부근염, 췌장염, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 통풍, 혈액 질병, 겸상적혈구병, 혈전 저혈소판증 자반증, 판코니 증후군, 이식, 급성 신장 손상, 과민성 대장 증후군, 용혈-요독 증후군, 급성 피질 괴사, 신장 혈전색전증, 외상 및 수술, 확산성 손상, 화상, 복부 및 혈관 수술, 마비 유도, 약물 사용 또는 약물 남용 부작용, 순환계 질환, 심근경색, 심부전증, 말초 혈관 질환, 고혈압, 관상동맥 심장 질환, 비-죽상경화 심혈관 질환, 죽상경화 심혈관 질환, 피부병, 일사병, 전신 경화증, 호흡기 질환, COPD, 폐쇄 수면 무호흡, 고산 저산소증 또는 내분비계 질환, 말단거대증, 당뇨병, 또는 요붕증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
미세소포체가 단리되는 개체를 선택하는 것은 각종 인자들 중 하나 이상에 대하여 실시된 분석에 기초하여 당업자에 의해 실시된다. 고려 사항이 되는 인자로는 대상체가 특정 질환 (예로서, 암)에 대한 가족력이 있는지 여부, 상기 질환에 대한 유전적 소인이 있는지 여부, 가족력, 유전적 소인, 소인을 나타내는 다른 질환 또는 신체적인 증상에 기인하여 상기 질환에 걸릴 위험이 증가되어 있는지 여부, 또는 환경적인 이유가 있다. 환경적인 이유로는 생활 방식, 질환을 유발하거나 그의 원인이 되는 물질, 예로서, 대기, 토양, 물 또는 섭식 중의 물질에 대한 노출을 포함한다. 추가로, 이미 상기 질환을 앓고 있거나, 요법 이전 또는 요법 이후 현재는 상기 질환으로 진단을 받았거나, 현재 질환에 대한 치료를 받고 있거나 (요법 치료 중이거나), 질환이 완화되거나 그로부터 회복 중에 있는 것이 본 방법을 수행하기 위해 개체를 선택하는 또다른 이유가 된다.
본원에 기술된 방법은 분석 단계 이전에 분석을 위해 유전자 또는 핵산을 선택하는 추가의 단계와 함께 임의로 수행된다. 대상체의 임의의 소인, 또는 임의의 기존 노출 또는 진단, 또는 대상체가 받은 경험이 있거나 현재 받고 있는 치료학적 치료법에 기초하여 선택할 수 있다.
진단되거나, 모니터링되거나, 다르게는 프로파일링되는 암은 모든 종류의 암이 될 수 있다. 이는 제한없이, 상피 세포 암, 예로서, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암, 뇌암, 결장암 및 전립선암을 포함한다. 위장관암, 두부경부 암, 비-소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-요로암 및 담낭암, 흑색종, 및 백혈병 또한 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법 및 조성물은 개체에서 비-악성 종양 (예로서 신경섬유종증, 수막종 및 슈반세포종)의 검출, 진단 및 예후에도 동등하게 적용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 암은 뇌암이다. 뇌 종양 및 암 유형이 당업계에 주지되어 있다. 신경아교종은 뇌의 신경아교 (지지) 조직으로부터 일어나는 종양에 대한 일반면이다. 신경아교종이 가장 일반적인 원발성 뇌 종양이다. 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 및 혼합형 신경아교종이라 명명되는, 2가지 이상의 세포 유형의 혼합물을 포함하는 종양이 가장 일반적인 신경아교종이다. 뇌 종양의 다른 일반 유형은 하기와 같다: 청신경초종 (신경집종, 슈반세포종, 신경초종), 샘종, 성상세포종, 저등급 성상세포종, 거대 세포 성상세포종, 중등급 및 고등급 성상세포종, 재발성 종양, 뇌간 신경아교종, 척삭종, 맥락막총 유두종, CNS 림프종 (원발성 악성 림프종), 낭종, 유피 낭종, 표피양 낭종, 두개인두종, 뇌실막종 역형성 뇌실막종, 신경절세포종 (신경절신경종), 신경절신경아교종, 다형성 아교모세포종 (GBM), 악성 성상세포종, 신경아교종, 혈관모세포종, 수술불능성 뇌 종양, 림프종, 수모세포종 (MDL), 수막종, 전이성 뇌 종양, 혼합형 신경아교종, 신경섬유종증, 희소돌기아교세포종, 시신경 신경아교종, 송과체 부위 종양, 뇌하수체 샘종, PNET (원시신경 외배엽 종양), 척수 종양, 뇌실막하세포종, 및 결절 경화증 (부르네빌병).
(질환과 관련이 있는 것으로서) 이미 공지되어 있는 핵산 이상을 확인하는 것 이외에도, 본 발명은 그 이상이 특정 질환 및/또는 의학적 병태와 관련이 있는 것으로서 종래 확인되지 않은 미확인 핵산 서열/변형 (예로서, 전사 후 변형)을 확인하는데 에 사용될 수 있다. 이는 예를 들면, 주어진 질환/의학적 병태 (예로서, 암의 임상적 유형 또는 하위유형)를 앓는 하나 이상의 대상체의 체액으로부터 얻은 미세소포체 내의 핵산을 분석하고, 주어진 질환/의학적 병태를 앓지 않는 하나 이상의 대상체의 미세소포체 내의 핵산과 비교하여 그 핵산 내용물 간의 차이를 확인함으로써 달성할 수 있다. 상기 차이는 제한없이, 핵산 발현 수준, 선택적 스플라이스 변이체, 유전자 복제수 변이체 (CNV), 핵산 변형, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 및 핵산의 돌연변이 (삽입, 결실 또는 단일 뉴클레오티드 변화)를 포함하는 임의의 유전적 이상일 수 있다. 일단 특정 핵산의 유전적 파라미터 상의 차이가 특정 질환에 대한 것으로 확인이 되고 나면, 임상적으로 및 통계학적으로 유의적인 수만큼 대상체를 포함하는 추가의 연구를 수행하여 특정 핵산의 유전적 이상과 질환 사이의 상관관계를 확립할 수 있다. 유전적 이상에 관한 분석은 당업자에 의해 적절하게 결정되는 바와 같이, 본원에 기술된 하나 이상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
전달 비히클로서의 엑소좀
본 발명의 측면은 또한 본원에 기술된 실제 미세소포체에 관한 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 개체로부터 단리된 것인, 본원에 기술된 단리된 미세소포체이다. 하나의 실시태양에서, 미세소포체는 개체의 뇌안에 있는 세포 (예로서, 종양 또는 비-종양 세포)에 의해 생산된다. 또다른 실시태양에서, 미세소포체는 본원에 기술된 바와 같이, 개체의 체액으로부터 단리된 것이다. 단리 방법은 본원에 기술되어 있다.
본 발명의 또다른 측면은 인간 아교모세포종 세포로부터의 단리된 미세소포체가 mRNA, miRNA 및 혈관형성 단백질을 함유한다는 발견 사실에 관한 것이다. 그러한 아교모세포종 미세소포체는 가능하게는 세포내유입 기전을 통해 1차 인간 뇌 내피 세포에 의해 유입되고, 미세소포체 내로 혼입된 리포터 단백질 mRNA는 상기 세포에서 번역되었다. 이는, 미세소포체에 의해 전달되는 메세지가 표적 세포 (미세소포체를 유입하는 세포)의 유전적 프로필 및/또는 번역 프로필을 변화시킬 수 있다는 것을 시사한다. 미세소포체는 또한 아교모세포종에 풍부하게 존재한다고 알려져 있는 miRNA를 포함하였다 (문헌 [Krichevsky et al, manuscript in preparation]). 따라서, 아교모세포종 종양으로부터 유래된 미세소포체는 mRNA, miRNA 및 단백질에 대한 전달 비히클로서의 작용을 함으로써 특정 mRNA 종의 전달을 통해 다른 세포의 번역 상태를 변화시킬 수 있고, 내피 세포의 혈관형성을 촉진시킬 수 있으며, 종양 성장을 자극시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 공여자 대상체로부터 유래된 체액을 수혜자 대상체에게 전달하기 이전에 상기 체액으로부터 미세소포체를 제거한다. 공여자 대상체는 검출불가능한 종양을 가진 대상체일 수 있고, 체액 중의 미세소포체는 상기 종양으로부터 유래되는 것일 수 있다. 공여자 체액 중의 종양 미세소포체가 제거되지 않았을 경우, 미세소포체 중의 유전 물질 및 단백질이 수혜자 대상체에서 세포의 비제한적인 성장을 촉진시킬 수 있기 때문에, 이는 유해할 것이다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면은 핵산을 세포로 전달하는, 본원에서 확인된 미세소포체의 용도이다. 하나의 실시태양에서, 세포는 개체의 체내 존재하는 것이다. 본 방법은 핵산을 함유하는 미세소포체(들), 또는 상기 미세소포체를 생산하는 세포를 개체에게 투여하여 미세소포체가 개체의 세포와 접촉하고/거나 그 세포 내로 유입될 수 있도록 하는 단계를 포함한다. 핵산이 전달되어 도달하게 되는 세포를 표적 세포로 지칭한다.
천연적으로는 함유하지 않는 (즉, 미세소포체의 일반 내용물에 대하여 외인성인) 핵산을 함유하도록 미세소포체를 공학처리할 수 있다. 이는 핵산을 미세소포체 내로 물리적으로 삽입시킴으로써 달성할 수 있다. 별법으로, 하나 이상의 특정 핵산이 엑소좀을 표적하도록 세포 (예로서, 배양물 중에서 성장시킨 세포)를 공학처리할 수 있으며, 상기 엑소좀은 세포로부터 단리될 수 있다. 별법으로, 공학처리된 세포 그 자체를 개체에 투여할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 투여하기 위한 엑소좀 생산 세포는 표적 세포와 기원이, 또는 체내 위치가 동일하거나 유사하다. 즉, 미세소포체를 뇌 세포로 전달하기 위해서는 미세소포체를 생산하는 세포가 뇌 세포 (예로서, 배양물에서 성장된 1차 세포)일 것이다. 또다른 실시태양에서, 엑소좀 생산 세포는 표적 세포와는 다른 세포 유형이다. 하나의 실시태양에서, 엑소좀 생산 세포는 체내에서 표적 세포에 인접하게 위치하는 유형의 것이다.
엑소좀을 통해 세포로 전달될 수 있는 핵산 서열은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 이는 싱글 또는 더블 스트랜드일 수 있으며, 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 핵산, 올리고뉴클레오티드, 핵산 유사체, 예를 들면, 펩티드-핵산 (PNA), 위-상보성 PNA (pc-PNA), 잠금 핵산 (LNA) 등을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기와 같은 핵산 서열은 예를 들면, 전사 억제자로서 작용하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 안티센스 분자, 리보자임, 작은 억제 핵산 서열, 예를 들면, 제한되는 것은 아니지만, RNAi, shRNA, siRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포 유형으로부터 단리된 미세소포체가 수혜자 대상체로 전달된다. 상기 미세소포체는 수혜자 대상체에게 의학적으로 유익할 수 있다. 예를 들면, 종양 엑소좀의 혈관형성 및 사전증식 효과는 수혜자 대상체에서 손상된 조직의 재생에 도움이 될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 전달 수단은 공여자 대상체로부터 유래된 체액을 수혜자 대상체에게 전달하기 이전에 미세소포체를 상기 체액으로 첨가하는 것인 체액 주입에 의한 것이다.
또다른 실시태양에서, 미세소포체는 성분 (예로서, (본원에 기술된 본 방법으로) 대상체에게 투여하기에 적합한 약제학적으로 허용가능한 제형 중의 활성 성분)이다. 일반적으로, 활성 성분을 위한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 특정의 담체는 많은 인자 (예로서, 투여 경로)에 따라 달라질 것이다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"란 표적화된 전달 조성물을 포함하고/거나, 그를 대상체에게 전달하는 임의의 약제학적으로 허용가능한 수단을 의미한다. 이는 대상 물질을 신체의 한 기관 또는 그 일부로부터 신체의 또다른 기관 또는 그 일부로 운반하거나 수송하는 데 관여하는, 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물, 또는 비히클, 예로서, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 액제, 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 각 담체는 제형의 다른 성분들과 화합성이고, 대상체, 예를 들면, 인간에의 투여에 대하여 화합성이라는 의미에서 "허용가능"하여야 한다.
대상체에게 투여하는 것은 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 이는 제한없이, 비경구 또는 경구 경로, 근육내 주사, 피하/진피내 주사, 정맥내 주사, 협측 투여, 경피 전달 및 직장, 결장, 질내, 비내, 또는 기도 경로에 의한 전달을 비롯한, 대상체에서 활성 화합물을 원하는 위치로 전달하는 데 적합한 경로에 의해서 (예로서, 약제학적 제형 중) 활성 화합물을 분산, 전달, 또는 적용시키는 것을 포함한다.
본 발명이 본원에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약으로 제한되는 것은 아니며, 이는 달라질 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 목적으로 기술된 것이고, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 의도는 아니며, 본 발명의 범주는 단지 특허청구범위에 의해서만 정의되어 진다.
이와 관련하여, 본 발명은, 본 발명에 본질적이되, 단, 본질적이든 아니든 그와는 무관하게 ("포함하는"의 의미), 비특정 요소를 포함할 준비되어 있는, 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 그의 각 구성요소에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, 조성물, 방법, 및 그의 각 구성요소에 관한 설명에 포함시키고자 하는 다른 요소는 본 발명의 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한된다 ("본질적으로 ~으로 구성된"의 의미). 이는 기술된 방법 내의 단계 뿐만 아니라, 조성물 및 그 안의 구성 성분에도 동일하게 적용된다. 다른 실시태양에서, 본원에 기술된 발명, 조성물, 방법, 및 그의 각 구성요소는, 구성요소, 조성물 또는 방법에 대해 본질적인 요소로 간주되는 것이 아닌 임의의 요소는 배제시키고자 한다 ("~으로 구성된"의 의미).
실시예
실시예 1-7. 종양 세포는 미세소포체를 탈락시키는데, 상기 미세소포체는 mRNA 및 마이크로RNA를 비롯한 RNA를 함유하며, 상기 미세소포체는 체액 중 90% 초과의 세포외 RNA를 함유한다.
실시예 1: 미세소포체는 원발성 인간 아교모세포종 세포로부터 탈락된 것이다.
아교모세포종 조직을 외과적 절제술로부터 수득하고, 종양 세포를 해리시키고, 단일층으로 배양하였다. 구체적으로, 신경병리학에 의해 다형성 아교모세포종으로 진단을 받은 환자로부터 유래된 뇌 종양 표본을 수술로부터 직접 수득하고, 멸균 냉 신경기초 배지(Neurobasal media) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))에 놓았다. 신경 조직 해리 키트(Neural Tissue Dissociation Kit) (독일 베르기쉬 글라드바흐 소재의 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech))를 사용하여 수술 시점으로부터 1시간 이내에 상기 표본을 단일 세포로 해리시키고, 페니실린-스트렙토마이신 (각각 10 IU ml-1 및 10 ㎍ ml-1, 미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로 보충된 DMEM 5% dFBS 중에 플레이팅하였다. 전통적으로 세포 배양에 사용되는 우태아 혈청 (FBS)에서 미세소포체가 관찰될 수 있고, 이들 미세소포체가 상당량의 mRNA 및 miRNA를 함유할 수 있기 때문에, 미세소포체가 제거된 FBS (dFBS)를 함유하는 배지 중에서 종양 세포를 성장시키는 것이 중요하였다. 3개의 아교모세포종 종양으로부터 수득되어 배양된 1차 세포는 초기 및 후기 계대 (계대란 세포 분열로 정의되는 세포 세대로서, 이는 보편적인 세포 배양 기법이고, 세포를 살아있는 상태로 유지시키 데 필요한 것이다), 둘 모두에서 미세소포체를 생산하는 것으로 나타났다. 주사 전자 현미경법 (도 1a 및 1b) 및 투과 전자 현미경법 (도 1f)으로 미세소포체를 검출할 수 있었다. 간략하게 설명하면, 인간 아교모세포종 세포를 오르니틴으로 코팅된 커버 슬립 위에 놓고, 0.5x 카르노브스키(Karnovsky) 고정제 중에서 고정시킨 후, PBS를 사용하여 2x5분으로 (각각 5분씩 2회에 걸쳐) 세척하였다. 세포를 35% EtOH 10분, 50% EtOH 2x10분, 70% EtOH 2x10분, 95% EtOH 2x10분, 및 100% EtOH 4x10분으로 탈수시켰다. 이어서, 세포를 투시미스(Tousimis) SAMDR1-795 반-자동 임계점 건조기(Critical Point Dryer) 중에서 임계점 건조 상태가 되게 한 후, 가탄 모델 681 고해상 이온 빔 코터(GATAN Model 681 High Resolution Ion Beam Coater)에서 크로뮴으로 코팅하였다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, 종양 세포는, 약 50 - 500 nm로 크기가 다양한 미세소포체로 덮여 있었다.
실시예 2: 아교모세포종 미세소포체는 RNA를 포함한다.
미세소포체를 단리시키기 위해, 미세소포체 무함유 배지 (110,000 x g로 16시간 동안 초원심분리함으로써 소 미세소포체가 제거되고 이로써 제조된 5% dFBS 함유 DMEM)에서 1-15 계대의 아교모세포종 세포를 배양하였다. 48시간 경과 후에 조절된 배지로부터 4천만개의 세포를 수거하였다. 미세소포체를 편차 원심분리에 의해 정제하였다. 구체적으로, 아교모세포종 조절된 배지를 300 x g로 10분 동안 원심분리하여 임의의 세포 오염원을 제거하였다. 상등액을 16,500 x g로 20분 동안 추가로 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 110,000 x g로 70분 동안 초원심분리하여 펠릿화시켰다. 미세소포체 펠릿을 13 ml PBS 중에서 세척하고, 다시 펠릿화하고, PBS 중에 재현탁시켰다.
DC 단백질 분석법(DC Protein Assay) (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-래드(Bio-Rad))을 사용하여 단리된 미세소포체를 그의 총 단백질 함량에 대해 측정하였다.
미세소포체로부터 RNA를 추출하기 위해서 최종 농도 100 ㎍/ml의 RNase A (미국 메릴랜드주 글렌 버지 소재의 페르멘타스(Fermentas))를 미세소포체 현탁액에 첨가하고, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션시켜 미세소포체 밖에 존재하는 RNA를 제거하였고, 이를 통해 추출된 RNA는 내부 미세소포체로부터 기원하는 것이 되도록 하였다. 이어서, 제조사의 프로토콜에 따라 미르바나(MirVana) RNA 단리 키트 (미국 텍사스주 오스틴 소재의 암비온을 사용하여 미세소포체로부터 전체 RNA를 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 DNAse로 처리한 후, 나노드롭 ND-1000 기기 (미국 델라웨어주 윌밍턴 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific))를 사용하여 전체 RNA를 정량하였다.
아교모세포종 미세소포체는 대략 1:80 (㎍ RNA:㎍ 단백질)의 비율로 RNA와 단백질을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 48시간 동안에 걸쳐 배양물 중 미세소포체로부터 단리된 단백질과 RNA의 평균 수율은 대략 세포 백만개당 4 ㎍ 단백질 및 50 ng RNA였다.
RNA가 미세소포체 내에 함유되어 있음을 확인하기 위해서 미세소포체를 RNase A에 노출시키거나, RNA 추출 이전에 모의 처리하였다 (도 1c). RNase 처리 이후 RNA의 함량은 7% 초과로는 감소하지 않았다. 따라서, 배지로부터 얻은 세포외 RNA 거의 모두가 미세소포체 내에 함유되어 있으며, 이로써 주변 소포 막을 통해 외부 RNase로부터 보호된다고 보여진다.
미세소포체 및 그의 공여자 세포로부터 유래된 전체 RNA를 생체분석기를 사용하여 분석하였는데, 이를 통해 미세소포체는 크기가 범위가 매우 광범위한 RNA (이는 각종 mRNA 및 miRNA와 일관성을 갖는다)를 갖지만, 세포 RNA의 특징인 18S 및 28S 리보좀 RNA 피크는 없는 것으로 나타났다 (도 1d 및 1e).
실시예 3: 미세소포체는 DNA를 함유한다.
미세소포체가 또한 DNA도 함유하는지를 시험하기 위해 실시예 2에서 언급한 바와 같이 엑소좀을 단리시키고, DNase로 처리한 후 용해시켜 내용물이 방출되도록 하였다. DNase 처리 단계를 통해 엑소좀 밖의 DNA를 제거함으로써 오직 엑소좀 내부에 존재하는 DNA만이 추출될 수 있도록 하였다. 구체적으로, 제조사의 권고에 따라 (카탈로그 번호 AM1906) 암비온으로부터 입수한 DNA 무함유 키트를 사용하여 DNase 처리를 수행하였다. DNA 정제 단계를 위해서, 분취량의, 단리된 엑소좀을 미르바나 RNA 단리 키트 (암비온)의 한 부품인 300 ㎕ 용해 완충액 중에서 용해시키고, 제조사의 권고에 따라 DNA 정제 키트 (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 용해된 혼합물로부터 DNA를 정제하였다.
추출된 DNA가 공통 유전자를 함유하는지 여부를 조사하기 위해, GAPDH, 인간 내인성 레트로바이러스 K, 테나신-c 및 라인-1에 특이적인 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다. GAPDH 유전자에 대해서 하기 프라이머를 사용하였다: Forw3GAPDHnew (서열 번호: 1) 및 Rev3GAPDHnew (서열 번호: 2). 주형이 스플라이싱된 GAPDH cDNA일 경우, 프라이머 쌍은 112 bp 앰플리콘을 증폭시키고, 주형이 스플라이싱되지 않은 게놈 GAPDH DNA일 경우에는 216 bp 앰플리콘을 증폭시킨다. 한 실험에서, 단리된 엑소좀을 DNase으로 처리한 후, DNA 추출을 위해 용해시켰다 (도 3a). 예측된 바와 같이, 종양 혈청 (도 3a의 래인 4 참조) 및 원발성 종양 세포 (도 3a의 래인 6 참조)로부터 유래된 엑소좀으로부터는 112 bp 단편의 증폭이 이루어졌는데, 정상 인간 섬유모세포 (도 3a의 래인 5 참조)로부터 유래된 엑소좀으로부터는 이루어지지 않았다. 216 bp 단편의 증폭은 3가지 기원 모두의 엑소좀으로부터 이루어지지 않았다. 그러나, 아교모세포종 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 주형으로서 사용한 경우에는 (도 3a의 래인 3 참조) 112 bp 및 216 bp의 2가지 단편 모두 증폭이 이루어졌다. 따라서, 스플라이싱된 GAPDH DNA는 종양 세포로부터 단리된 엑소좀 내에 존재하지만, 정상 섬유모세포 세포로부터 단리된 엑소좀 내에는 존재하지 않는다.
대조적으로, 또다른 실험에서는 단리된 엑소좀을 DNase으로 처리하지 않은 상태로 DNA 추출을 위해 용해시켰다 (도 3b). 원발성 흑색종 세포 (도 3b의 래인 3 참조)로부터 단리된 엑소좀으로부터는 112 bp 단편 뿐만 아니라, 216 bp 단편에서 모두 증폭이 이루어졌는데, 이는 스플라이싱되지 않은 GAPDH DNA, 또는 역전사된, 부분적으로 스플라이싱된 cDNA가 엑소좀 바깥쪽에 존재한다는 것을 제안하는 것이다.
인간 내인성 레트로바이러스 K (HERV-K) 유전자에 대해서 하기 프라이머를 사용하였다: HERVK_6Forw (서열 번호: 3) 및 HERVK_6Rev (서열 번호: 4). 프라이머 쌍은 172 bp 앰플리콘을 증폭시킨다. DNA는, 단리되고 DNase로 처리된 엑소좀으로부터 추출하고, 이를 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 도 3c에 나타난 바와 같이, 종양 및 정상 인간 혈청 엑소좀 모두에서 172 bp 단편의 증폭이 이루어졌지만, 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀에서는 증폭이 이루어지지 않았다. 이러한 데이타는, 종양 및 정상 인간 혈청 엑소좀이 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀과는 달리 내인성 레트로바이러스 DNA를 함유한다는 것을 제안한다. 종양 엑소좀이 또한 전위성 요소도 함유하는지 여부를 조사하기 위하여, PCR 증폭을 위해 하기 라인-1 특이 프라이머를 사용하였다: 라인1_Forw (서열 번호: 5) 및 라인1_Rev (서열 번호: 6). 이들 두 프라이머는 각각 동량의, 2개의 상이한 올리고를 함유하기 때문에 모든 종에 있어서 라인-1을 검출하도록 상기 프라이머가 디자인되었다. 라인1_Forw 프라이머의 경우, 하나의 올리고는 C를 함유하고, 나머지 다른 하나의 올리고는 "s"로 지정된 위치에 G를 함유한다. 라인1_Rev 프라이머의 경우, 하나의 올리고는 A를 함유하고, 나머지 다른 하나의 올리고는 "r"로 지정된 위치에 G를 함유한다. 프라이머 쌍은 290 bp 앰플리콘을 증폭시킨다. 주형은, DNase로 처리된 엑소좀으로부터 추출된 DNA였다 (상기 기술된 바와 같다). 도 3e에 나타난 바와 같이, 종양 세포 및 정상 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀으로부터 290 bp 라인-1 단편의 증폭이 이루어졌지만, 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀에서는 증폭이 이루어지지 않았다.
엑소좀이 또한 테나신-C DNA도 함유하는지 여부를 조사하기 위하여, 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다: 테나신 C Forw (서열 번호: 7) 및 테나신 C Rev (서열 번호: 8). 프라이머 쌍은 197 bp 앰플리콘을 증폭시킨다. 주형은, 단리시킨 후에 DNase로 처리하고 용해시킨 엑소좀으로부터 추출된 DNA였다. 도 3d에 나타난 바와 같이, 종양 세포 또는 정상 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀에서는 197 bp 테나신 C 단편의 증폭이 이루어졌지만, 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀에서는 증폭이 이루어지지 않았다. 따라서, 테나신-C DNA는 종양 및 정상 인간 혈청 엑소좀에는 존재하지만, 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀에는 존재하지 않는다.
엑소좀 중 DNA의 존재에 관해 추가로 확인하기 위해, 상기 기술된 방법을 사용하여 D425 수모세포종 세포로부터 엑소좀 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 엑소좀을 단리시키고, DNase로 처리한 후에 용해시켰다. 동량의 최종 DNA 추출물을 DNase로 처리하거나, DNase로 처리하지 않고, 이어서 1% 아가로스 겔 중 에티디움 브로마이드 염색에 의해 시각화하였다. 에티디움 브로마이드는 특이적으로 핵산을 염색하고, 자외선하에서 시각화될 수 있는 염료이다. 도 3f에 나타난 바와 같이, 에티디움 브로마이드 염색은 DNase 처리 후에 사라진 반면 (도 3f의 래인 3 참조), 비처리 분취물 (도 3f의 래인 2 참조)에서는 강하게 염색된 것을 관찰할 수 있었다. DNase 처리 및 비처리 추출물 또한 RNA 피코 칩 (애질러트 테크놀러지스(애질런트 Technologies)) 상에서 분석하였다. 도 3g에 나타난 바와 같이, 싱글 스트랜드 DNA는 DNase 비처리 추출물 (도 3g의 상부 패널 참조)에서는 쉽게 검출될 수 있었지만, DNase 처리 추출물 (도 3g의 하부 패널 참조)에서는 검출이 되지 않았다.
추출된 DNA가 싱글 스트랜드인지 여부를 시험하기 위해, 상기 문단에서 기술된 바와 같이 핵산을 처리된 엑소좀으로부터 추출하고, 추가로 RNase로 처리하여 임의의 세포 오염원을 제거하였다. 이어서, 처리된 핵산을 RNA 피코 생체분석기 칩 상에서, 및 DNA 1000 칩에서 분석하였다. RNA 피코 칩은 오직 싱글 스트랜드 핵산만을 검출한다. DNA 1000 칩은 더블 스트랜드 핵산을 검출하였다. 도 3h에 나타난 바와 같이, 싱글 스트랜드 핵산이 검출되었지만 (상부 패널 참조), 더블 스트랜드 핵산은 검출되지 않았다 (하부 패널 참조). 따라서, 종양 엑소좀 내에 함유되어 있는 DNA는 주로 싱글 스트랜드이다.
싱글 스트랜드 DNA가 종양 세포에는 존재하지만, 정상 인간 섬유모세포에는 존재하지 않는다는 것을 입증하기 위해, 핵산을 아교모세포종 환자 혈청 또는 정상 인간 섬유모세포로부터 유래된 엑소좀으로부터 추출하였다. 엑소좀을 DNase로 처리한 후에 용해시키고, 정제된 핵산을 RNase로 처리한 후에 분석하였다. 도 3i에 나타난 바와 같이, 아교모세포종 환자 혈청으로부터 추출된 엑소좀 핵산은 RNA 피코 칩에 의해 검출할 수 있었다. 대조적으로, 단지 극소량의 싱글 스트랜드 DNA가 정상 인간 섬유모세포로부터 추출되었다.
따라서, 종양 세포 및 정상 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀은 싱글 스트랜드 DNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 싱글 스트랜드 DNA는 역전사 생성물인데, 이는 증폭 생성물이 인트론을 함유하지 않기 때문이다 (도 3a 및 도 3b). 정상 전구 세포/줄기 세포에서의 활성이 상대적으로 더욱더 낮기는 하지만, 종양 세포 뿐만 아니라, 정상 전구 세포/줄기 세포는 활성 역전사효소 (RT) 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이러한 RT 활성을 통해 세포내 RNA 전사체는 역전사될 수 있고, cDNA로서 엑소좀 내로 패킹될 수 있다. 흥미롭게도, 종양 세포로부터 유래된 엑소좀은 종양-특이 유전자 전사체에 상응하는 cDNA를 더 많이 함유하는데, 이는 종양 세포가 보통 상향조절된 역전사효소 활성을 갖고 있기 때문이다. 따라서, 엑소좀 중 종양 특이 cDNA를 상이한 종양 유형의 진단 또는 예후용 생체마커로서 사용할 수 있다. 종양에 대한 생체마커로서 mRNA를 사용하는 것과 비교하여 생체마커로서 cDNA를 사용함으로써 역전사 단계는 생략될 것이다. 추가로, 엑소좀 cDNA를 사용하는 것이 전 혈청/혈장 DNA를 사용하는 것보다 유리한데, 이는 혈청/혈장이 사멸 세포로부터 유리된 게놈 DNA를 함유하기 때문이다. 증폭된 전 혈청/혈장 DNA를 시험할 때에는 더 많은 배경이 존재할 것이다.
실시예 4: 인간 혈청 중 대부분의 세포외 RNA는 엑소좀 내에 함유되어 있다.
"유리 RNA"/RNA-단백질 복합체로서 혈청내에서 순환하는 RNA의 양 대 엑소좀 내에 함유되어 있는 RNA의 양을 측정하기 위해, 본 발명자들은 건강한 인간 대상체로부터 혈청을 단리시키고, 혈청을 동량의 두 샘플로 고르게 분할하였다. 샘플 1의 경우, 혈청을 초원심분리하여 대부분의 미세소포체를 제거하였다. 이어서, 혈청 상등액을 수집하고, 상등액 중에 남아있는 RNA는 트리졸 LS(Trizol LS)를 사용하여 추출하였다. 샘플 2의 경우, 혈청을 초원심분리하지 않고, 트리졸 LS를 사용하여 혈청으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 샘플 1 상등액 및 샘플 2 혈청 중의 RNA의 양을 측정하였다. 결과, 샘플 1 상등액 중 유리 RNA 양이 혈청 샘플 2로부터 단리된 전체 RNA 양의 10% 미만인 것으로 나타났다. 따라서, 혈청내 RNA 대다수는 엑소좀과 관련이 있는 것이다.
실시예 5: 혈청 엑소좀 단리 단계를 도입함으로써 혈청 세포외 핵산을 고효율로 추출할 수 있다.
전 혈청 및 혈장은 다량의 순환 DNA를 함유하고, 가능하게는 단백질 복합체로 보호되는 RNA도 함유하는데, 유기 RNA의 반감기는 혈청 중에서 몇분 정도에 해당된다. 혈청내 세포외 핵산 프로필은 정상인 포유동물과 이환 포유동물 사이에서 차이를 보이며, 따라서, 이는 특정 질환에 대해 생체마커가 될 수 있다. 프로필을 조사하기 위해서는 핵산을 추출하여야 한다. 그러나, 혈청 및 혈장으로부터, 특히, 다량의 혈청/혈장으로부터 직접 핵산을 추출하는 것은 실현불가능하다. 이러한 경우, 다량의 트리졸 LS (RNA 추출 시약)를 사용하여 즉석에서 모든 혈청 뉴클레아제를 불활성화시킨 후, 엑소좀 핵산을 추출한다. 이후, 오염물질이 샘플내 침전되고, 이는 추후의 분석에 영향을 미치게 된다. 실시예 4에 나타난 바와 같이, 혈청 중 대개의 세포외 RNA는 혈청 엑소좀 중에 함유되어 있다. 그러나, 본 발명자들은 핵산 추출 이전에 혈청 엑소좀을 단리시킴으로써 세포외 핵산을 단리시키는 것이 더욱 효율적인지 여부를 시험하였다.
환자로부터 얻은 혈액 혈청 4 밀리리터 (ml)를 각각 2 ml씩 2개의 분취물로 분할하였다. 하나의 분취물로부터 얻은 혈청 엑소좀은 RNA 추출 이전에 단리시켰다. 엑소좀을 단리시키고 RNA를 추출하는 방법은 실시예 2에 언급된 방법과 동일하다. 나머지 다른 하나의 분취물의 경우, 제조사의 권고에 따라 트리졸 LS를 사용하여 RNA를 직접 추출하였다. 이 두 추출로부터 얻은 핵산을 생체분석기 RNA 칩 (애질러트 테크놀러지스) 상에서 분석하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 전자의 방법으로 추출된 RNA의 양이 후자의 방법으로부터 얻은 양보다 현저히 더 많았다. 추가로, 후자의 방법으로부터 추출된 RNA의 질은 전자의 방법으로부터 얻은 것보다 상대적으로 열악하였다. 따라서, 엑소좀 단리 단계가 혈청으로부터의 세포외 RNA의 추출 효율에 대한 원인이 된다.
실시예 6: mRNA의 마이크로어레이 분석
애질런트 전 인간 게놈 마이크로어레이(Agilent Whole Human Genome Microarray) (4x44K, 2 색상 어레이)를 사용하여 밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech) (미국 캘리포니아주 오번 소재)에 의해 아교모세포종 세포, 및 상기 세포로부터 유래된 미세소포체 중의 mRNA 군집에 대한 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 실시예 1 및 2에 기술된 바와 같이 제조된, 원발성 아교모세포종 세포로부터의 2개의 상이한 RNA 시료 및 그에 상응하는 미세소포체 RNA 시료에 대한 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 진시프터(GeneSifter) 소프트웨어 (미국 워싱턴주 시애틀 소재의 비직스랩스(Vizxlabs))를 사용하여 데이타를 분석하였다. 인터섹터(Intersector) 소프트웨어 (비직스랩스)를 사용하여 두 어레이 모두에서 쉽게 검출되는 유전자를 추출하였다. 마이크로어레이 데이타를 NCBI 진 익스프레션 옴니버스(NCBI's Gene Expression Omnibus)에 기탁하였고, 이는 GEO 시리즈 수탁 번호 GSE13470를 통해 입수가능하다.
본 발명자들은 두 어레이 모두에서 배경 수준보다 훨씬 더 큰 것으로 검출되는 것으로서 (99% 신뢰 구간), 세포 중에서 대략 22,000개의 유전자 전사체를, 및 미세소포체 중에서 27,000개의 유전자 전사체를 발견하였다. 두 어레이 모두에서 미세소포체 중에서만 대략 4,700개의 상이한 mRNA가 검출되었는데, 이는 미세소포체 내의 선택적 강화 프로세스를 시사하는 것이다. 이와 일관되게, 2개의 종양 세포 시료로부터 얻은 미세소포체를, 그의 기원이 되는 세포와 비교하였을 때 mRNA 수준에 있어서 전반적인 상관관계는 부족하였다 (도 2a and 2b). 대조적으로, 제1 세포 배양물 (A) 대 제2 세포 배양물 (B)로부터의 mRNA 수준에 있어서는 우수한 상관관계가 존재하였고 (도 2c), 상응하는 미세소포체 (A) 및 (B)로부터의 mRNA 수준에 있어서는 유사한 상관관계가 존재하였다 (도 2d). 따라서, 종양 세포와 미세소포체 내의 mRNA 분포는 일관성을 갖는다. 미세소포체 중의 전사체 대 상기 미세소포체의 기원이 되는 세포 중의 전사체의 비를 비교하였을 때, 본 발명자들은 5배 초과 (p-값 <0.01)로 차별적으로 분포하는 3,426개의 전사체를 발견하였다. 이중, 2,238개의 전사체가 강화되어 있었고 (380배 이상), 1,188개의 전사체는 세포에서 보다 덜 풍부하였다 (90배 이상) (도 5). 유전자 전사체 모두의 강도와 비를 문서로 작성하였다. 10배 초과로 강화되거나 감소된 mRNA 전사체의 온톨로지를 기록하고 리뷰하였다.
미세소포체에서 고도로 강화된 mRNA 전사체가 항상 미세소포체에 가장 풍부하게 존재하는 것은 아니었다. 가장 풍부하게 존재하는 전사체는 전달시 수혜자 세포에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 더욱 크며, 따라서, 미세소포체 중에 가장 풍부하게 존재하는 500개의 mRNA 전사체를 그의 온톨로지 설명에 기초하여 상이한 생물학적 프로세스로 나누었다 (도 6a). 종양 기질 재형성 및 종양 성장 증진에 관여할 수 있는 특이적인 기능을 나타내는 바, 상기의 다양한 온톨로지 중, 혈관형성, 세포 증식, 면역 반응, 세포 이동 및 히스톤 변형을 추가 연구를 선택하였다. 이들 5가지의 온톨로지에 속하는 아교모세포종 미세소포체 mRNA를 플롯팅하여 그의 수준 및 mRNA 스펙트럼에 대한 기여도를 비교하였다 (도 6b). 5가지의 온톨로지 모두는 어레이의 신호 강도 중앙값과 비교하였을 때 매우 높은 발현을 수준을 갖는 mRNA를 포함하였다.
미세소포체 중에서 강화된 mRNA 대 공여자 세포 중에서 강화된 mRNA에 대한 철저한 분석은, 예를 들면, 베타 액틴처럼 특정 세포 위치에서 번역되는 mRNA에 대하여 기재되어 있는 바와 같이 (문헌 [Kislauskis et al., 1994]), 가능하게는 3'UTR 중의 "집 코드(zip code)"를 통해 상기 메세지를 미세소포체 내로 국소화시키는 세포 기전이 존재할 수 있다는 것을 제안한다. 미세소포체 중 mRNA의 입체형태는 알려진 바 없지만, 이는 리보핵 입자 (RNP)로서 존재할 수 있는데 (문헌 [Mallardo et al., 2003]), 이를 통해 이후의 공여자 세포에서의 분해 및 조기 번역은 일어나지 못할 것이다.
전-게놈 cDNA-매개 어닐링, 선별, 확장, 및 연결(Whole-Genome cDNA-mediated Annealing, Selection, Extension, and Ligation) (DASL) 분석법을 사용하여 일루미나 인크.(Illumina Inc.) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 아교모세포종 세포 및 아교모세포종 세포로부터 유래된 미세소포체, 흑색종 세포 및 흑색종 세포로부터 유래된 미세소포체 중의 mRNA 군집에 대한 마이크로어레이 분석을 실시하였다. 전-게놈 DASL 분석법은 일루미나 DASL 분석법(Illumina's DASL Assay)의 PCR 및 표지화 단계를 일루미나 휴먼Ref-8 비드칩(Illumina' s HumanRef-8 BeadChip)의 유전자-기반 혼성화 및 전-게놈 프로브 세트와 조합한 것이다. 상기 비드칩은 RefSeq (Build 36.2, Release 22)로부터 유도된 24,000개 초과의 유전자 (주석을 포함하는 유전자)를 포함한다. 원발성 아교모세포종 세포 및 (실시예 1 및 2에 기술된 방법으로 유래된) 아교모세포종 세포로부터의 미세소포체, 흑색종 세포 및 (실시예 1 및 2에 기술된 방법으로 유래된) 흑색종 세포로부터의 미세소포체로부터 얻은 2개의 상이한 RNA 시료에 관한 마이크로어레이 분석을 실시하였다.
각 RNA 시료에 대한 발현 데이타를 함께 풀링하고, 이를 사용하여 클러스터 다이어그램을 작성하였다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 각각 아교모세포종 세포, 아교모세포종 세포로부터 유래된 미세소포체, 흑색종 세포 및 흑색종 세포로부터 유래된 미세소포체에 대한 mRNA 발현 프로필을 함께 클러스터링하였다. 2개의 원발성 아교모세포종 세포주 20/3C 및 11/5c의 발현 프로필을 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.06이다. 2개의 원발성 흑색종 세포주 0105C 및 0664C의 발현 프로필을 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.09이다. 2개의 원발성 흑색종 세포주 0105C 및 0664C로부터 유래된 엑소좀의 발현 프로필을 함께 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.15이다. 2개의 원발성 아교모세포종 세포주 20/3C 및 11/5c로부터 유래된 엑소좀의 발현 프로필을 함께 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.098이다. 따라서, 아교모세포종 및 흑색종으로부터 유래된 엑소좀은 상이한 mRNA 발현 특징을 가지며, 엑소좀의 유전자 발현 특징은 그의 원 세포의 것과는 상이하다. 이들 데이타는 미세소포체로부터 얻은 mRNA 발현 프로필을 본원에 기술된 암의 진단 및 예후 방법에 사용할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 7: 아교모세포종 미세소포체가 miRNA를 함유한다
정량적 miRNA 역전사 PCR을 사용하여 미세소포체 및 공여자 세포로부터의 성숙 miRNA를 검출하였다. 구체적으로, 미르바나 RNA 단리 키트 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 미세소포체 및 공여자 세포로부터 전체 RNA를 단리시켰다. 택맨(TaqMan)® 마이크로RNA 분석 키트 (미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 30 ng의 전체 RNA를 특이적인 miR-프라이머를 사용함으로써 cDNA로 전환시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 추가로 증폭시켰다.
신경아교종에서 상향조절되고 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있는 것 중 11개의 miRNA로 이루어진 하위세트를 2개의 상이한 원발성 아교모세포종 (GBM 1 및 GBM 2)으로부터 정제된 미세소포체에서 분석하였다. 이들 하위세트는 let-7a, miR-15b, miR-16, miR-19b, miR-21, miR-26a, miR-27a, miR-92, miR-93, miR-320 및 miR-20을 함유하였다. 이들 miRNA 모두가 공여자 세포 및 미세소포체에서 쉽게 검출되었다 (도 8). 수준은 일반적으로 전체 RNA 1 ㎍당 모체 세포에서보다 미세소포체에서 더 낮았지만 (10%, 이는 대략 3개의 Ct-값에 상응), 수준에는 밀접한 상관관계가 있었으며, 이는 이들 11개의 miRNA 종이 미세소포체 중에는 풍부하게 존재하지 않는다는 것을 시사한다.
마이크로RNA 발현 프로파일링 패널(MicroRNA Expression Profiling Panel)을 사용하여 일루미나 인크.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에 의해 아교모세포종 세포 및 아교모세포종 세포로부터 유래된 미세소포체, 흑색종 세포 및 흑색종 세포로부터 유래된 미세소포체 중의 마이크로RNA에 관한 마이크로어레이 분석이 수행되었는데, 이는 DASL 분석법으로 강화된 분석이었다. 인간 마이크로RNA 패널은 1146개의 마이크로RNA 종을 포함한다. 원발성 아교모세포종 세포, (실시예 1 및 2에 기술된 방법을 사용하여 유래된) 아교모세포종 세포로부터 유래된 미세소포체, 흑색종 세포, 및 (실시예 1 및 2에 기술된 방법을 사용하여 유래된) 흑색종 세포로부터 유래된 미세소포체로부터 얻은 2개의 상이한 RNA 시료에 대하여 마이크로어레이 분석을 수행하였다.
각 RNA 시료에 대한 발현 데이타를 함께 풀링하고, 이를 사용하여 클러스터 다이어그램을 작성하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 각각 아교모세포종 세포, 아교모세포종 세포로부터 유래된 미세소포체, 흑색종 세포, 및 흑색종 세포로부터 유래된 미세소포체에 대한 마이크로RNA 발현 프로필을 함께 클러스터링하였다. 2개의 원발성 흑색종 세포주, 0105C 및 0664C의 발현 프로필을 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.13이다. 2개의 원발성 아교모세포종 세포주, 20/3C 및 11/5c의 발현 프로필을 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.12이다. 2개의 원발성 아교모세포종 세포주, 20/3C 및 11/5c로부터 유래된 엑소좀의 발현 프로필을 함께 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.12이다. 2개의 원발성 아교모세포종 세포주, 0105C 및 0664C로부터 유래된 엑소좀의 발현 프로필을 함께 클러스터링하였는데, 이 거리는 약 0.17이다. 따라서, 아교모세포종 및 흑색종으로부터 유래된 엑소좀은 상이한 마이크로RNA 발현 특징을 가지며, 엑소좀의 유전자 발현 특징은 그의 원 세포의 것과는 상이하다. 추가로, 본원에서 입증된 바와 같이, 미세소포체로부터 얻은 마이크로RNA 발현 프로필을 본원에 기술된 암의 진단 및 예후 방법에 사용할 수 있다.
미세소포체 중에서 miRNA가 발견된다는 사실은, 종양 유래의 미세소포체가 주변 정상 세포의 전사/번역 프로필을 변화시킴으로써 상기 정상 세포를 변형시킬 수 있다는 것을 제안한다. 추가로, 본원에서 입증된 바와 같이, 미세소포체로부터 얻은 마이크로RNA 발현 프로필을, 본원에 기술된, 아교모세포종을 포함하나, 이에 한정되지 않는 암의 진단 및 예후 방법에 사용할 수 있다.
실시예 8-15. 본 실시예는 체액으로부터 유래된 엑소좀 내의 핵산이 질환 또는 다른 의학적 병태에 대한 생체마커로서 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 미세소포체 중 miRNA의 발현 프로필이 아교모세포종에 대한 고감도 생체마커로서 사용될 수 있다
엑소좀 내의 마이크로RNA가 질환 및/또는 의학적 병태에 대한 생체마커로서 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 마이크로RNA의 발현 수준과 질환 상태 사이에 상관관계가 존재하는지를 조사하였다. 마이크로RNA-21이 아교모세포종 세포에서 고수준으로 발현되고, 아교모세포종 환자의 혈청으로부터 단리된 엑소좀에서 쉽게 검출될 수 있기 때문에, 본 발명자들은 아교모세포종 환자의 혈청으로부터 유래된 엑소좀 내의 마이크로RNA-21 복제수를 정량적 RT-PCR에 의해서 정량적으로 측정하였다. 구체적으로, 9명의 정상적인 인간 대상체 및 9명의 아교모세포종 환자로부터 유래된 4 ml 혈청 샘플로부터 엑소좀을 단리시켰다. RNA 추출 방법은 실시예 2에 기술되어 있는 RNA 추출 방법과 유사하였다. 단일(singleplex) qPCR (어플라이드 바이오시스템)을 사용하여 miR-21의 수준을 분석하고, GAPDH 발현 수준으로 정규화하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 평균 Ct-값은 아교모세포종 혈청 샘플에서 5.98 만큼 더 낮았는데, 이는 아교모세포종 환자의 엑소좀 miRNA-21 발현 수준이 정상 인간 대상체에서의 것보다 대략 63배 더 높다는 것을 시사한다. 상기 차이는 통계학적으로 유의적이며, p 값은 0.01이다. 따라서, 마이크로RNA-21 발현 수준과 아교모세포종 질환 상태 사이에는 상관관계가 존재하는데, 이는 본원에 개시된 비-침습적 진단 방법의 타당성과 적용가능성을 입증한다. 예를 들면, 하나의 측면에서, 본 방법은 대상체의 체액으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 마이크로RNA-21의 복제수를 측정하고, 상기 복제수를 정상 대상체의 엑소좀 내의 것과 또는 정상 대상체 군으로부터 유래된 엑소좀 내의 마이크로RNA-21 함량을 분석하여 작성된 표준 복제수를 비교함으로써 엑소좀 내의 마이크로RNA-21 발현 수준을 분석하는 단계를 포함하였다. 복제수가 증가하였다는 것은 대상체에 아교모세포종이 존재한다는 것을 시사하는 반면, 증가한 복제수가 없다면 이는 대상체에 아교모세포종이 존재하지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 기본적인 방법을 외삽하여 다른 종의 마이크로RNA와 관련된 다른 질환 및/또는 의학적 병태를 진단/모니터링할 수 있다.
실시예 9: 미세소포체 중의 mRNA를 진단을 위한 고감도 생체마커로서 사용할 수 있다
핵산은 PCR 방법에 의해 고감도로 검출될 수 있는 능력이 있기 때문에 생체마커로서 가치가 높다. 따라서, 하기와 같은 시험을 디자인하고 수행하여 미세소포체 중의 mRNA가 의학적 질환 또는 병태, 본 경우에서는 아교모세포종 종양에 대한 생체마커로서 사용될 수 있는지 여부에 관해 결정하였다. EGFRvIII 돌연변이 발현이 몇몇 종양에 대해 특이적이고, 이는 신경아교종의 임상적으로 독특한 하위유형을 정의하기 때문에 (문헌 [Pelloski et al., 2007]) 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) mRNA를 선택하였다. 추가로, EGFRvIII 돌연변이는 체세포 돌연변이지, 생식세포 돌연변이가 아니기 때문에 전통적으로 병변 조직 이외의 조직을 사용해서는 검출할 수 없었다. 따라서, 통상 EGFRvIII 돌연변이를 검출하기 위해서는 병변 조직, 예로서, 신경아교종 종양으로부터 유래된 생검이 필요하다. 하기 설명하는 바와 같이, 이중 RT-PCR을 사용하여 신경아교종 종양 생검 샘플 중 EGFRvIII mRNA를 확인하고, 그 결과를, 같은 환자로부터의 혈청 샘플로부터 정제된 미세소포체에서 발견되는 mRNA 종과 비교하였다.
미세소포체를 원발성 인간 아교모세포종 세포로부터 정제한 후, 미세소포체 및 공여자 세포 (생검), 둘 모두로부터 RNA를 추출하였다. 샘플에 식별 표시하고, 맹검 방식으로 PCR을 수행하였다. Gli-36EGFRvIII (EGFRvIII을 안정적으로 발현하는 인간 신경아교종 세포)를 양성 대조군으로서 포함하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 0.5-2 ml의 냉동 혈청 샘플로부터 미세소포체를 펠릿화하고, 미르바나 미세소포체 RNA 단리 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 이어서, 이중 RT-PCR을 사용하여 미세소포체 및 공여자 세포, 둘 모두로부터 얻은 EGFRvIII (352 bp) 전사체와 야생형 EGFR (1153 bp), 둘 모두를 같은 프라이머 세트를 사용함으로써 증폭시켰다. 구체적으로, 제조사의 권고된 프로토콜에 따라 옴니스크립트 RT 키트(Omniscript RT kit) (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠 인크.(Qiagen Inc.))를 사용하여 RNA를 cDNA로 전환시켰다. GAPDH 프라이머는 GAPDH 전방향 (서열 번호: 9) 및 GAPDH 역방향 (서열 번호: 10)이었다. EGFR/EGFRvIII PCR1 프라이머는 서열 번호: 11 및 서열 번호: 12였다. EGFR/EGFRvIII PCR2 프라이머는 서열 번호: 13 및 서열 번호: 14였다. PCR 순환 과정 프로토콜은 하기와 같았다: 3분 동안 94℃; 45초 동안 94℃, 45초 동안 60℃, 2분 동안 72℃ (35회 주기); 및 최종 단계 7분 동안 72℃.
본 발명자들은 생검 샘플을 분석하여 EGFRvIII mRNA가 존재하는지 여부를 측정하고, 이 결과를, 같은 환자로부터의 냉동 혈청 샘플로부터 정제된 엑소좀으로부터 추출된 RNA와 비교하였다. 30개의 종양 샘플 중 14개 (47%)가 EGFRvIII 전사체를 함유하였는데, 이는 다른 연구 (문헌 [Nishikawa et al., 2004])에서 상기 돌연변이를 포함하는 것으로 밝혀진 아교모세포종의 비율과 일치하는 것이다. 수술하는 동안 혈청이 채취된 25명의 환자 중 7명 (28%)의 환자에서 EGFRvIII이 엑소좀으로부터 증폭될 수 있었다 (도 11 및 표 1). 상기 이중 PCR 증폭을 위한 제2 프라이머 쌍으로서 새로운 프라이머 쌍 EGFR/EGFRvIII PCR3: 서열 번호: 15 및 서열 번호: 16을 사용하였을 때, EGFRvIII 돌연변이를 보유하는 개체가 더 많이 발견되었다 (표 1). 음성인 것으로 확인된 6명의 환자에서 EGFRvIII이 기존 프라이머 쌍 PCR2: 서열 번호: 13 및 서열 번호: 14를 사용함으로써 엑소좀으로부터 증폭될 수 있었다. 특히, 생검이 EGFRvIII 돌연변이를 나타내지 않는 개체 13으로부터 유래된 엑소좀이 EGFRvIII 돌연변이를 함유하는 것으로 나타났는데, 이는 엑소좀 기술을 사용하여 이루어진 EGFRvIII 돌연변이 검출의 감도 증가를 시사한다. 52개의 정상 대조군 혈청 샘플로부터 단리된 엑소좀으로부터는 EGFRvIII이 증폭될 수 없었다 (도 12). 흥미롭게도, EGFRvIII 음성 종양 샘플을 갖는 2명의 환자가 혈청 엑소좀에서 EGFRvIII 양성인 것으로 판명되었는데, 이는 신경아교종 종양에서 EGFRvIII 발현이 이종의 병소에서 일어났음을 입증한다. 추가로, 본 발명자들의 데이타는, 예상외로 미세소포체 중의 무손상 RNA가 냉동된 아교모세포종 환자의 체내 혈청으로부터 단리될 수 있다는 것을 나타내었다. 확인된 아교모세포종 환자로부터의 이들 맹검 혈청 샘플은 암 연구 센터 (네덜란드 암스테르담 소재의 VU 메디컬 센터(medical center))로부터 입수하고, 사용시까지 -80℃에서 보관하였다. 혈청 미세소포체 중 종양 특이 RNA를 확인하면 종양 세포 중에 존재하는 체세포 돌연변이를 검출할 수 있다. 이러한 기술이 진단 및 치료 결정을 개선시켜야 한다.
미세소포체에서 발견된 RNA는 주어진 시간에 세포 유전자 발현 프로파일을 이루는 기본 어레이의 "스냅샷"을 포함한다. 아교모세포종-유래의 미세소포체에서 발견되는 mRNA 중, EGFR mRNA가 특히 관심의 대상이 되는데, 이는 EGFRvIII 스플라이스 변이체가 특히 아교모세포종과 관련이 있기 때문이다 (문헌 [Nishikawa et al., 2004]). 여기서, 뇌 종양이 혈액뇌장벽(BBB)를 가로질러 혈류 내로 미세소포체를 방출한다고 입증되었는데, 이에 관해서는 종래에 밝혀진 바 없었다. 추가로, 예로서, 뇌 종양 중의 EGFRvIII과 같은 mRNA 변이체가 소량의 환자 혈청으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 상기 미세소포체 중 RNA를 분석하는 단계를 포함하는 방법에 의해 검출될 수 있다는 것 역시 입증된다.
종양에서 EGFRvIII 돌연변이에 관한 정보는 최적의 치료 요법을 선택함에 있어 중요하다. EGFRvIII-양성 신경아교종이 게피티닙 또는 엘로티닙과 같은 EGFR- 저해제를 사용하는 치료법에 대하여 더욱더 많이 반응할 수 있는 가능성은 50배를 초과한다 (문헌 [Mellinghoff et al., 2005]).
실시예 10: 철 대사 장애 진단
하기 실시예에 제시된 바와 같이, 다른 목적으로 엑소좀 진단 방법을 적합화시킬 수 있다.
항균 펩티드인 헵시딘은 철 대사의 지배적인 호르몬 조절인자이다. 상기 펩티드는 대개 포유동물의 간에서 생산되며, 골수의 적혈구조혈 활성, 순환 및 저장된 체내 철의 양, 및 염증에 의해 조정된다. 자극을 받게 되면, 헵시딘은 순환 또는 뇨로 분비되어 그 곳에서 표적 페로포틴-발현 세포에 대해 작용을 발휘할 수 있다. 페로포틴은 현재까지 확인된 유일의 철 방출인자이며, 헵시딘에 결합하였을 경우에 내재화되고 분해된다. 페로포틴이 분해되면 그 결과로 페로포틴-발현 세포, 예로서, 대식세포 및 장세포에 철이 잔류하게 된다. 이러한 병리생리학적인 기전이 만성 빈혈 질환의 기초가 된다. 더욱 특히, 세망내피계 내의 부적절하게 높은 수준의 헵시딘과 철 함량의 상승이 빈혈의 특징이 된다. 실제로, 빈혈은 많은 질환 및/또는 의학적 병태, 예로서, 감염 (급성 및 만성), 암, 자가면역, 실질-기관 이식 후 만성 거부, 및 만성 신장 질환 및 염증과 관련이 있을 수 있다 (문헌 [Weiss and Goodnough, 2005]). 예로서, 유전성 혈색소침착증과 같은 유전적 철 과부하 질환에서는 헵시딘의 부적절하게 낮은 발현 수준으로 인해 세망내피계내에서 철의 잠재적으로 과도한 유출이 일어나게 된다. 이로써, 헵시딘은 만성 질환과 관련된 빈혈에서는 상향조절이 되지만, 혈색소침착증에서는 하향조절이 된다.
현재까지 순환 또는 뇨 중 헵시딘 수준을 정량적으로 측정할 수 있는 적합한 분석법으로는 ([Kemna et al., 2008]) 비행 시간 질량 분광분석법 (TOF MS)이 유일한 방법인데, 이는 고도로 전문화된 장치인 바, 이로써 쉽게 입수할 수가 없다. 최근, 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA) 방법이 헵시딘 호르몬 수준을 정량적으로 측정할 수 있는 것으로서 제안되었지만, 이러한 방법은 헵시딘과 기타 철 관련 파라미터 (문헌 ([Brookes et al., 2005]; [Roe et al., 2007]))와의 뚜렷한 상관관계가 존재하지 않기 때문에 일치하지 않는다.
하기와 같이, 헵시딘 mRNA을 인간 혈청으로부터 유래된 엑소좀에서 검출하였다. 먼저, 엑소좀을 인간 혈청으로부터 단리시키고, 그의 mRNA 내용물을 추출한 후, cDNA로 전환시키고, PCR 증폭을 실시하였다. 인간 헵시딘의 129 뉴클레오티드로 이루어진 단편을 증폭시키기 위해 PCR 프라이머를 디자인하였다. 프라이머 서열은 서열 번호: 57 및 서열 번호: 58이다. 129 뉴클레오티드의 헵시딘 전사체 (도 13D의 중간에 있는 피크)는 생체분석기로 쉽게 검출하였다. 양성 대조군 (도 13B)으로서, 인간 간암 세포주 Huh-7로부터의 RNA를 추출하고, cDNA로 전환시켰다. 음성 대조군 (도 13C)은 mRNA를 포함하지 않았다. 이들 생체분석기 데이타 또한 도 13A의 슈도겔에 제시되어 있다.
순환 미세소포체 내의 헵시딘 mRNA는 간 세포 중의 헵시딘 mRNA와 상관관계에 있다. 그러므로, 체액 샘플 중 미세소포체 내의 헵시딘 mRNA을 측정함으로써 대상체의 빈혈 또는 혈색소침착증을 진단하거나 모니터링할 수 있다.
따라서, 체액으로부터 미세소포체를 단리시키고, 상기 미세소포체 내의 헵시딘 mRNA을 정상 대상체로부터 얻은 mRNA와 비교함으로써 대상체의 빈혈 및 혈색소침착증을 진단 및/또는 모니터링할 수 있다. 빈혈을 앓는 대상체의 경우, mRNA의 복제수는 정상인 비-빈혈 수준 이상으로 증가되어 있다. 혈색소침착증을 앓는 대상체에서의 복제수는 정상 대상체의 mRNA에 비해 감소되어 있다.
실시예 11: 당뇨 신장병증 진단을 위한 엑소좀의 비-침습적 전사 프로파일링
당뇨 신장병증 (DN)은 생명을 위협하는 합병증인데, 현재로서는 구체적인 치료법이 존재하지 않는다. 따라서, DN이 발병한 환자 또는 발병될 수 있는 위험에 있는 환자를 확인하고, 조기에 개입하여 모니터링할 수 있는 고감도 진단법을 개발하는 것이 필요하다.
뇨 분석이 생검을 채취할 필요없이 신장의 기능을 검사하는 방법이다. 현재까지는 이러한 분석은 뇨 중에 존재하는 단백질 연구로만 제한이 되었다. 본 실시예는 보통 신장 생검에 의해서만 수득할 수 있는 세포 유래의 뇨 전사 프로필을 수득할 수 있는 방법을 설명한다. 구체적으로, 본 방법은 뇨 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 상기 엑소좀 내의 RNA를 분석하여 전사 프로필을 수득하고, 상기 프로실을 사용하여 당뇨를 앓는 개체의 신장 세포에서 이루어진 분자상의 변화를 조사하고 신장에 의해 이루어진 임의의 새 단백질의 '스냅샷'을 제공하는 단계를 포함한다. 엑소좀 전사 프로필을 수득하는 최신식 기술로는 최신식 혼성화 어레이, PCR 기반 기술, 및 차세대 시퀀싱 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 직접적인 시퀀싱 방법은 사전에 디자인된 프라이머 또는 스폿팅된 DNA 올리고를 필요로 하지 않기 때문에, 엑소좀 RNA 프로필에 관한 비-편향적 설명을 제공할 것이다. 차세대 시퀀싱 기술의 예는 일루미나 게놈 애널라이저(Illumina Genome Analyzer)에 의해 제공되는데, 이는 1회 작동시 인간 게놈의 1/3에 해당하는 등가물을 서열분석할 수 있는 대량 병렬식 시퀀싱 기술을 이용하다. 상기 분석으로부터 수득할 수 있는 데이타를 통해 뇨 엑소좀 전사 프로필을 신속하고 완전하게 조사할 수 있고, 전체 신장과 비교할 수 있을 것이다. 이러한 방법을 사용함으로써 뇨 엑소좀 전사 프로필에 관해 필요한 정보를 더 많이 얻을 수 있다. 대조군 대 당뇨병-유래의 뇨 엑소좀 중의 전사체 비교를 통해서는 추가로 당뇨 신장병증에 대한 예측 생체마커와 새로운 생체마커, 둘 모두의 완전한 목록을 제공할 수 있다.
상기 기술된 진단 방법의 실현가능성을 입증하기 위해서 실험을 디자인하고 수행함으로써 뇨 엑소좀을 단리시키고, 이들 뇨 엑소좀 내의 신장 특이 생체마커의 존재를 확인하였다. 본 실험에서, 28세의 건강한 남성 대상체로부터 220 ml의 뇨 샘플을 아침에 새로 수집하고, 편차 원심분리를 통해 프로세싱하여 뇨 엑소좀을 단리시켰다. 구체적으로, 먼저 10분 동안 300 x g 회전식으로 뇨를 회전시켜 샘플로부터 임의의 세포를 제거하였다. 상등액을 수집하고, 20분 동안 16,500x g 회전식으로 회전시켜 임의의 세포 부스러기 또는 단백질 응집체를 침전시켰다. 이어서, 상등액을 0.22 uM 막 필터를 통해 통과시킴으로써 직경이 0.22 uM보다 큰 부스거기를 제거하였다. 최종적으로, 샘플을 1시간 동안 100,000 x g으로 초원심분리시켜 엑소좀을 페릿화하였다 (문헌 [Thery et al., 2006]). 펠릿을 인산염 완충처리된 염수 (PBS)로 온화하게 세척하고, 제조사의 설명서에 따라 퀴아젠 RNeasy 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 옴니스크립트(Omniscript) RT 키트 (퀴아젠)를 사용하여 단리된 RNA를 cDNA로 전환시키고, 신장 특이 유전자를 PCR을 통해 증폭시켰다.
조사된 신장 특이 유전자, 및 상기 유전자가 발현되는 상기 유전자의 상응 신장 부위는 하기와 같다: AQP1 - 근위 요세관; AQP2 - 원위 요세관 (주세포); CUBN - 근위 요세관; LRP2 - 근위 요세관; AVPR2 - 근위 및 원위 요세관; SLC9A3 (NHE-3) - 근위 요세관; ATP6V1B1 - 원위 요세관 (개재 세포); NPHS1 - 사구체 (발세포); NPHS2 - 사구체 (발세포); 및 CLCN3 - 집합관 개재 세포 B형. 각 유전자를 증폭시키기 위해 디자인된 프라이머 서열은 AQP1-F (서열 번호: 17) 및 AQP1-R (서열 번호: 18); AQP2-F (서열 번호: 19) 및 AQP2-R (서열 번호: 20); CUBN-F (서열 번호: 21) 및 CUBN-R (서열 번호: 22); LRP2-F (서열 번호: 23) 및 LRP2-R (서열 번호: 24); AVPR2-F (서열 번호: 25) 및 AVPR2-R (서열 번호: 26); SLC9A3-F (서열 번호: 27) 및 SLC9A3-R (서열 번호: 28); ATP6V1B1-F (서열 번호: 29) 및 ATP6V1B1-R (서열 번호: 30); NPHS1-F (서열 번호: 31) 및 NPHS1-R (서열 번호: 32); NPHS2-F (서열 번호: 33) 및 NPHS2-R (서열 번호: 34); CLCN5-F (서열 번호: 35) 및 CLCN5-R (서열 번호: 36)이다.
각 유전자에 대한 PCR 생성물의 예측 크기는 AQP1-226 bp, AQP2-208 bp, CUBN-285 bp, LRP2-220 bp, AVPR2-290 bp, SLC9A3-200 bp, ATP6V1Bl-226 bp, NPHS1-201bp, NPHS2-266 bp 및 CLCN5-204 bp이다. PCR 순환 과정 프로토콜은 8분 동안 95℃; 30초 동안 95℃, 30초 동안 60℃, 45초 동안 72℃로 30회 주기; 및 최종 단계: 10분 동안 72℃.
도 14a에 나타난 바와 같이, 세뇨관 세포는 다중소포체를 함유하는데, 이는 엑소좀 생성 동안 중간 단계이다. 이러한 세포로부터 단리된 엑소좀을 전자 현미경으로 확인할 수 있다 (도 14b). 뇨 엑소좀으로부터 추출된 전체 RNA 분석 결과 크기 범위가 광범위한 RNA 종이 존재하는 것으로 나타났다 (도 14c). 18S 및 28S 리보좀 RNA는 발견되지 않았다. PCR 분석을 통해 뇨 엑소좀 내의 신장 특이 전사체의 존재에 대해 확인하였다 (도 14d). 이러한 데이타는 신장 세포가 엑소좀을 뇨로 탈락시키고, 이러한 뇨 엑소좀은 신장 기원의 전사체를 함유한다는 것, 및 엑소좀 방법이 특정의 신장 질환 및/또는 다른 의학적 병태와 관련된 신장 생체마커를 검출할 수 있다는 것을 제시한다.
뇨 엑소좀 중 신장 특이 mRNA 전사체의 존재를 추가로 확인하기 위해, 6명의 개체로부터 유래된 뇨 샘플을 사용하여 독립된 실험 세트를 수행하였다. 상기 언급한 방법에 따라 각 개체로부터 아침에 채취한 200 ml의 뇨 샘플로부터 엑소좀 핵산을 추출하였다. 구체적으로, 뇨 샘플은 1000 xg 원심분리에서 출발하여 편차 원심분리를 함으로써 전체 세포와 세포 부스러기르 침전(spin down)시켰다. 주의하여 상등액을 제거하고, 20분 동안 16,500 xg로 원심분리하였다. 이어서, 후속 상등액을 제거하고, 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 엑소좀 함유 상등액으로부터 잔류 부스러기를 제거하였다. 이어서, 최종의 상등액을 1시간 10분 동안 100,000 xg로 초원심분리하였다. 뉴클레아제 무함유 PBS 중에서 펠릿을 세척하고, 1시간 10분 동안 100,000 xg로 재원심분리하여 핵산 추출 준비가 된 엑소좀 펠릿을 수득하였다. 아르크투루스 피코푸어 RNA 단리 키트(Arcturus PicoPure RNA Isolation kit)를 사용하여 펠릿화된 엑소좀으로부터 핵산을 추출하고, 생체분석기 (애질런트) 피코 칩을 사용하여 핵산 농도 및 통합성을 분석하였다. 도 14e에 나타난 바와 같이, 뇨 엑소좀으로부터 단리된 핵산은 개체마다 상이하다. 신장 생체마커의 존재 또한 개체마다 상이한지 여부를 시험하기 위해서, 새 프라이머 쌍 세트: AQP1 새 프라이머 쌍: 서열 번호: 37 및 서열 번호: 38; AQP2 새 프라이머 쌍: 서열 번호: 39 및 서열 번호: 40; CUBN 새 프라이머 쌍: 서열 번호: 41 및 서열 번호: 42를 사용하여 아쿠아포린1, 아쿠아포린2 및 쿠빌린 유전자에 대한 PCR 증폭을 수행하였다. 특이적으로 스플라이싱된 및 역전사된 cDNA 단편을 증폭시키기 위해서 상기 프라이머 쌍을 디자인하였다. 역전사는 퀴아젠 센시스크립트 키트(Qiagen Sensiscript kit)를 사용하여 수행하였다. 도 14f에 나타난 바와 같이, 1번 개체에서는 증폭이 관찰되지 않았는데, 이는 아마도 핵산 추출 실패가 원인인 것으로 보여진다. AQP1은 2번 개체에서만 증폭되었다. CUBN은 2번 및 3번 개체에서 증폭되었다. 또한, AQP2는 2번, 3번, 4번 및 5번 개체에서 증폭되었다. 비교로 액틴 유전자 (도 14f에서 "하우스"로 표시)는 2번, 3번, 4번, 5번 및 6번 개체에서 증폭되었다. 비록 발현 수준이 다른 개체간에는 차이를 보이기는 하지만, 뇨 엑소좀이 신장 특이 mRNA 전사체를 함유한다는 것이 상기 데이타를 통해 추가로 입증되었다.
뇨 엑소좀 중 cDNA의 존재를 시험하기 위하여 200 ml의 인간 뇨 샘플를 100 ml의 뇨 샘플 2개로 분할하였다. 각 샘플로부터 뇨 엑소좀을 단리시켰다. 한 샘플로부터 유래된 엑소좀은 DNase로 처리하였고, 나머지 한 샘플로부터의 것은 모의 처리하였다. 이어서, 피코푸어 RNA 단리 키트(아르크투루스)를 사용하여 핵산을 추출하기 위해 각 샘플로부터 유래된 엑소좀을 용해시켰다. 역전사시키기 이전에 핵산을 이중-PCR 증폭 (실시예 9에 기술되어 있는 PCR 프로토콜)을 위한 주형으로서 사용하였다. 액틴 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 쌍은 액틴-FOR (서열 번호: 43) 및 액틴-REV (서열 번호: 44); 액틴-이중-FOR (서열 번호: 45) 및 액틴-이중-REV (서열 번호: 46)였고, 액틴 유전자 cDNA 서열에 기초하여 예측되는 최종 앰플리콘은 100 bp였다. 도 14g에 나타난 바와 같이, 100 bp 단편은 양성 대조군 (주형으로서 인간 신장 cDNA), DNase 처리 엑소좀 및 DNase 비처리 엑소좀에는 존재하였지만, 음성 대조군 래인 (주형 미포함)에는 존재하지 않았다. 따라서, 액틴 cDNA는 DNase 처리 엑소좀 및 DNase 비처리 엑소좀, 둘 모두에 존재한다.
본 방법을 사용하여 추출된 대부분의 핵산이 엑소좀 내에 존재하는지 여부를 시험하기 위해, DNase 처리 엑소좀 및 DNase 비처리 엑소좀으로부터 추출된 핵산을 동량으로 용해시키고, RNA 피코 칩 (애질런트 테크놀러지스)을 사용하여 분석하였다. 도 14h에 나타난 바와 같이, DNase 처리 샘플로부터 단리된 핵산의 농도는 1,131 pg/ul이고, 비처리 샘플로부터의 것은 1,378 pg/ul였다. 따라서, 상기 방법을 사용하여 뇨 엑소좀으로부터 추출되는 80% 초과의 핵산은 엑소좀 내부로부터의 것이었다.
뇨 엑소좀의 내용물을 체계적으로 확인하기 위해 뇨 엑소좀으로부터 핵산을 추출하고, 시퀀싱을 위해 브로드 인스티튜트(Broad Institute)에 제출하였다. 대략 1400만여개의 서열 판독물을 작성되었는데, 이들 각각의 길이는 76 뉴클레오티드였다. 이들 서열 판독물은 뇨 엑소좀 내에 존재하는 DNA/RNA 전사체 단편에 상응하는 것이다. 매우 엄격한 정렬 파라미터 (전장 서열에 대해 100%의 동일성)를 사용하여, 판독물 중 대략 15%를 인간 게놈에 정렬시켰다. 조금 덜 엄격한 정렬 기준을 사용하였다면 상기 비율을 증가시킬 수 있었다. 이들 15%의 판독물 중 대다수가 단백질 코딩 유전자와는 정렬되지 않고, 비-코딩 게놈 요소와 정렬이 되는데, 이는 트랜스포존 및 각종의 라인 & 사인(LINE & SINE) 리피트 요소이다. 특히, 인간 게놈에 정렬되지 않는 판독물에 대해서는 바이러스 서열에 정렬시킨다. 질환 상태와 관련하여 뇨 엑소좀 내에 함유되어 있는 핵산의 조성과 수준이 변할 수 있다는 점에서 본 발명에 따라 핵산 프로필을 질환 진단용 생체마커로서 사용할 수 있다.
본 실시예는, 뇨 엑소좀을 분석하는 엑소좀 방법을 사용함으로써 고도로 위한 침습적 신장 생검을 채취할 필요없이 당뇨병과 관련된 신장 질환이 있는 신장 중의 세포 변화를 측정할 수 있다는 것을 입증한다. 본 방법은 엑소좀을 사용하여 예로서, 당뇨 신장병증과 같은 신장 질환을 조기에 검출하기 위한, 신규의 고감도 진단 도구를 제공한다. 이를 통해 중간에 개입하고 치료할 수 있을 것이다. 요약하면, 본원에 기술된 엑소좀 진단 방법 및 기술은 뇨 엑소좀에 함유되어 있는 특정의 핵산 프로필과 관련된 당뇨 신장병증 및 다른 질환을 진단하는데 절실히 필요한 진단 수단을 제공한다.
실시예 12: 전립선암 진단 및 뇨 엑소좀
전립선암은 오늘날 남성암중 가장 일반적인 것이다. 전립선암에 걸릴 위험율은 대략 16%이다. 2008년도에는 218,000명을 초과하는 미국 남성이 상기 질환으로 진단을 받았다. 전립선암을 조기에 검출하면 할수록, 성공적으로 치료할 수 있는 기회는 더욱 커진다. 미국 암 학회(American Cancer Society)에 따르면, 전립선암이 전립선 그 자체에 또는 그 주변 부위에 존재하는 동안 발견된다면 5년 생존율은 98%를 넘는 것으로 나타났다.
수지 직장 검사와 병용하여, 혈액 중 전립선 특이 항원 (PSA)의 수준을 측정함으로써 하나의 확립된 진단 방법을 수행하였다. 그러나, PSA 시험의 감도와 특이성은 많은 개선을 필요로 한다. 상기 낮은 특이성은 다수의 위 양성 결과를 초래하는데, 이는 불필요하고 값비싼 생검을 생성한다. 체액, 예로서, 혈청 및 뇨에서 발견되는 전립선암 세포 (문헌 ([Groskopf et al., 2006]; [Wright and Lange, 2007])) 중 전립선암 유전자 3 (PCA3) (문헌 ([Groskopf et al., 2006]; [Nakanishi et al., 2008])), 막통과 프로테아제 세린 2와 ETS-관련 유전자 사이의 융합 유전자 (TMPRSS2-ERG) (문헌 [Tomlins et al., 2005]), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 pi (문헌 ([Goessl et al., 2000]; [Gonzalgo et al., 2004])), 및 알파-메틸아실 CoA 라세마제 (AMACR) (문헌 ([Zehentner et al., 2006]; [Zielie et al., 2004]))를 포함하나, 이에 한정되지 않는 새롭게 확인된 생체마커의 유전적 프로필을 검출함으로써 다른 진단 방법을 수행한다. 전립선암 세포에서의 과다발현으로 인해 이들 생체마커의 특이성이 증가할 수는 있지만 (예로서, PCA3 발현이 전립선암 세포에서 60 내지 100배 증가), 수지 직장 검사를 위해서는 표본 수집 직전에 전립선 세포를 뇨로 착유(milk)시켜야 한다 (문헌 [Nakanishi et al., 2008]). 상기와 같은 직장 검사는 예로서, 뇨로 쉽게 착유되는 암 세포가 수집된다는 편향성과, 의사가 관여함으로써 시간과 비용이 든다는 단점을 고유한 단점을 갖고 있다.
그러므로, 상기 언급한 한계를 극복하기 위해 이들 생체마커의 유전적 프로필을 검출하는 새로운 방법이 제안된다. 본 방법은 체액으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 상기 엑소좀으로부터 핵산을 분석하는 단계를 포함한다. 본 방법의 절차는 실시예 9에 상세히 설명되어 있는 것과 유사하다. 본 실시예에서, 전립선암으로 진단받은 암 환자 4명으로부터 뇨 샘플을 수득하였다. 도 15c에 나타낸 바와 같이, 암 단계를 등급, 글리슨(Gleason) 단계 및 PSA 수준에 의해 특징을 규명하였다. 추가로, 실시예 7에 상세히 설명되어 있는 바와 같이 이중-RT-PCR에 의해 분석된 핵산은, 전립선암의 새로 확인된 생체마커 중 2가지인 TMPRSS2-ERG와 PCA3이었다. TMPRSS2-ERG의 증폭을 위한 제1 증폭 단계의 프라이머 쌍은 TMPRSS2-ERG F1 (서열 번호: 47) 및 TMPRSS2-ERG R1 (서열 번호: 48)이고; 제2 증폭 단계의 프라이머 쌍은 TMPRSS2-ERG F2 (서열 번호: 49) 및 TMPRSS2-ERG R2 (서열 번호: 50)였다. 예측되는 앰플리콘은 122 염기쌍 (bp)이고, 제한 효소 HaeII로 분해한 후에는 2개의 단편 (하나는 68 bp이고, 나머지 하나는 54 bp이다)이 생성된다. PCA3의 증폭을 위한 제1 증폭 단계의 프라이머 쌍은 PCA3 F1 (서열 번호: 51) 및 PCA3 R1 (서열 번호: 52)이고; 제2 증폭 단계의 프라이머 쌍은 PCA3 F2 (서열 번호: 53) 및 PCA3 R2 (서열 번호: 54)이다. 예측되는 앰플리콘의 길이는 152 bp이고, 제한 효소 Sca1로 분해한 후에는 2개의 단편 (하나는 90 bp이고, 나머지 하나는 62 bp이다)이 생성된다.
도 15a에 나타난 바와 같이, 환자 3 및 4를 제외한, 환자 1 및 2, 둘 모두에서 TMPRSS2-ERG의 예측된 앰플리콘이 검출될 수 있고, 예측된 크기의 2개이 단편으로 분해될 수 있었다. 도 15b에 나타난 바와 같이, 환자 4명 모두에서, PCA3의 예측된 앰플리콘이 검출될 수 있고, 예측된 크기의 2개이 단편으로 분해될 수 있었다. 그러므로, PCA3 발현은 4명의 환자 모두로부터 유래된 뇨 샘플 중에서 검출될 수 있는 반면, TMPRSS2-ERG 발현은 오직 환자 1 및 2로부터 유래된 뇨 샘플 중에서만 검출될 수 있었다 (도 15c). 샘플 크기가 작기 때문에 확정할 수는 없지만, 이러한 데이다를 통해 전립선암의 생체마커를 검출하는 신규한 방법의 적용가능성이이 입증되었다. 추가로, 엑소좀 방법은 진단으로만 제한되는 것은 아니며, 전립선암과 관련된 다른 의학적 병태를 예후 및/또는 모니터링하는 데에도 사용될 수 있다.
실시예 13: 비-침습적 태아기 진단에서의 미세소포체
태아기 진단은 현재 전 세계적으로 확립된 산과 진료의 일부분이다. 유전적 분석을 위해 태아 조직을 수득하는 종래 방법으로는 양수천자 및 융모막 융모 샘플링을 포함하는데, 이 2가지 모두 침습성이고, 미출생 태아에게 위험을 줄 수 있다. 임상 유전학에서는 비침습적으로 진단할 수 있는 방법 개발을 장기간 동안 필요로 했었다. 광범위하게 조사되었던 한가지 접근법은 모체 혈장 중에 태아 세포가 순환한다는 발견에 기초한다. 그러나, 임상적 배경에서 그를 적용시키는 것을 방해하는 장애 요소가 다수 존재한다. 그러한 장애 요소로는 태아 세포가 부족 (모체 혈액 1 ml당 단지 1.2개의 태아 세포 존재)하여 상대적으로 다량의 혈액 샘플이 필요하다는 점, 및 이전 임신으로부터 잔류하는 태야 세포의 반감기가 길기 때문에 이를 통해 위 양성 결과를 초래할 수 있다는 점을 포함한다. 또다른 접근법은 모체 혈장 중 태아 DNA가 발견된다는 점에 기초한다. 태아 DNA의 양이 충분하고 제거 시간이 짧다는 점을 통해 태아 세포 방법과 관련된 장애 요소는 해소된다. 그럼에도 불구하고, DNA는 오직 유전될 수 있는 유전적 및 몇몇 후성적 정보를 부여하는데, 이 2가지 모두가 태아의 의학적 병태와 연관된 동력학적인 유전자 발현 프로필을 나타낼 수는 없다. 모체 혈장 중 순환하는 태아 RNA를 발견하는 것 (문헌 ([Ng et al., 2003b]; [Wong et al., 2005]))이 비-침습적 태아기 진단을 위한 최선의 방법이 될 수 있다.
몇가지 연구를 통해 태아 RNA는 진단 가치가 높다고 제안되었다. 예를 들면, 태아 코르티코트로핀-방출 호르몬 (CRH) 전사체 발현의 증가는 임신 중의 전자간증 (고혈압, 부종 및 단백뇨의 소견을 보이는 임상적 병태)과 관련이 있다. 추가로, 모체 혈장 중 태반-특이 4 (PLAC4) mRNA는 홀배수체 임신 (예로서, 세염색체증, 다운 증후군)에 대한 비-침습적 시험에서 성공적으로 사용되었다 (문헌 [Lo et al., 2007]). 추가로, 모체 혈장 중 태아 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG) 전사체는, 는 모체 숙주에서 태아 조직의 종양성 성장을 보이는 임신성 영양모세포 질환 (GTD)의 마커가 될 수 있다. 순환 태아 RNA는 대개 태반 기원의 것이다 (문헌 [Ng et al., 2003b]). 이들 태아 RNA는 임신 4주째로 조기에 검출될 수 있으며, 상기 RNA는 산후에는 신속하게 제거된다.
그럼에도 불구하고, 모체 혈장 중의 순환 태아 RNA를 사용하여 태아기를 진단하는 것에는 여러 가지 한계가 있다. 순환 태아 RNA는 혈충 모체 RNA와 혼합되어 있어 효과적으로 분리될 수 없다는 점이 첫번째 한계가 된다. 현재, 태아 전사체는 분만전 임산부 뿐만 아니라, 그의 영아의 제대혈에서 검출되나, 분만 후 24 또는 36시간 이내에 모체 혈액 중에서는 현저히 감소되어 있거나 존재하지 않는다라는 것과 같은 가정에 기초하여 확인되는 것이다 (문헌 [Maron et al., 2007]). 태아 RNA가 패킹되고 방출되는 방법이 여전히 알려져 있지 않기 때문에 진단 감도를 증진시키기 위하여 순환 태아 RNA를 강화시키는 방법은 확립되어 있지 않다는 점이 두번째 한계이다. 이러한 한계를 극복하는 방법은 미세소포체를 단리시키고, 그 안에 존재하는 태아 RNA를 분석하는 것에 달려있다.
수개의 사실을 통해, 진핵 세포에 의해 탈락된 미세소포체가 모체 혈장 중 순환 태아 RNA에 대한 비히클이라는 것이 제안되었다. 첫번째로, 미세소포체 내의 순환 RNA는 RNase 분해로부터 보호된다. 두번째로, 순환 태아 RNA는 모체 혈장의 비세포 분획 중에 남아있는 것으로 보이는데, 이는 상기 태아 RNA를 포함하는 미세소포체가 0.22 um 막을 통해 여과될 수 있다는 개념과도 일치하는 것이다. 세번째로, 미세소포체를 탈락시키는 것으로 알려져 있는 종양성 조직과 유사하게, 위-악성 태아 조직인 태반 세포는 미세소포체를 탈락시킬 수 있는 가능성은 매우 높다. 따라서, 신규한 비-침습적 태아기 진단 방법은 모체 혈액 혈장으로부터 태아 미세소포체를 단리시킨 후, 특정 질환 및/또는 다른 의학적 병태와 관련된 임의의 유전적 변이체에 대해서 미세소포체 내의 핵산을 분석하는 것으로 구성된다.
가상의 비-침습적 태아기 진단 사례는 하기와 같다: 말초 혈액 샘플을 임산부로부터 수집하고, 자성 활성 세포 분류 (MACS) 또는 다른 친화성 정제를 수행하여 태아-특이 미세소포체를 단리시키고 강화시킨다. 미세소포체 펠릿을 PBS 중에 재현탁시키고, 즉시 사용하거나, 추가 프로세싱을 위해 -20℃에 저장한다. 제조사의 설명서에 따라 퀴아젠 RNA 추출 키트를 사용하여 단리된 미세소포체로부터 RNA를 추출한다. 태아 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG) 전사체의 발현 수준에 대하여 RNA 함량을 분석한다. 표준 범위와 비교하여 hCG의 발현 수준이 증가하였다는 것은 임신성 영양모세포 질환 (GTD)이 발병되었음을 나타내는 것이고, 이는 추가로 태아의 상기와 같은 비정상적인 성장을 임상적으로 치료해야 한다는 것을 포함한다. 고감도 미세소포체 기술을 통해 임의의 증상 소견 또는 구조적 변화를 초음파 검사를 통해 검출할 수 있기 전에 매우 빠른 조기 단계에서 GTD를 검출할 수 있다. hCG 전사체 수준의 표준 범위는 정상 임신으로부터 통계학적으로 유의적인 순환 태아 RNA 샘플의 수를 조사함으로써 결정할 수 있다.
이들 질환 또는 의학적 병태와 관련된 상기 전사체를 조사함으로써 상기 태아기 진단 방법을 다른 질환 또는 의학적 병태의 태아기 진단 및/또는 모니터링에 외삽시킬 수 있다. 예를 들면, 모체 혈액으로부터 얻은 태아 기원의 미세소포체로부터 유래된 역형성 림프종 키나제 (ALK) 핵산의 추출 및 분석은, 상기 키나제 도메인 내의 돌연변이 또는 ALK 발현 상승과 매우 밀접한 관련이 있는 신경모세포종의 비-침습적 태아기 진단이 된다 (문헌 [Mosse et al., 2008]). 따라서, 본원에 기재되어 있는 미세소포체 방법 및 기술을 통해 장기간 필요로 한, 새시대의 비-침습적 태아기 유전적 진단법을 얻을 수 있다.
실시예 14: 흑색종 진단
흑색종은 멜라닌 세포 (색소 세포)의 악성 종양이며, 이는 피부에서 대개 발견이 된다. 이는 중증의 피부암 형태로서, 피부암과 관련된 모든 사망 중 75%를 차지한다. BRAF의 체세포 활성화 돌연변이 (예로서 V600E)는 인간 흑색종 발생에서 검출되는 가장 초기의 가장 보편적인 유전자 이상이다. 활성화된 BRAF가 흑색종 세포 주기 진행 및/또는 생존을 촉진시킨다.
추가로 현재, 흑색종의 진단은 신체 검사와 절제 생검에 기초하여 이루어진다. 그러나, 생검은 병변 내에 존재하는 제한된 개수의 병소만을 샘플링할 수 있고, 위 양성 또는 위 음성 결과를 제시할 수 있다. 엑소좀 방법은 보다 정확한 흑색종 진단 수단을 제공한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 방법은 대상체의 체액으로부터 엑소좀을 단리시키는 단계, 및 상기 엑소좀으로부터 핵산을 분석하는 단계를 포함한다.
흑색종 세포에 의해 탈락된 엑소좀이 BRAF mRNA를 함유하는지 여부를 측정하기 위해, 본 발명자들은 엑소좀-제거 FBS로 보충된 DMEM 배지 중에서 원발성 흑색종 세포를 배양하고, 실시예 2에 상세히 설명되어 있는 것과 유사한 방법을 사용하여 배지 중의 엑소좀을 수거하였다. 1차 세포는 Yumel 및 M34였다. Yumel 세포는 BRAF 중 V600E 돌연변이를 갖지 않는 반면, M34 세포는 BRAF 중 V600E 돌연변이를 가지고 있다. RNA를 엑소좀으로부터 추출한 후, RT-PCR에 의해 BRAF mRNA의 존재에 대해 분석하였다. PCR 증폭을 위해 사용된 프라이머는 BRAF 전방향 (서열 번호: 55) 및 BRAF 역방향 (서열 번호: 56)이었다. 앰플리콘 길이는 118 염기쌍 (bp)이고, 이는 V600E 돌연변이가 위치하는, BRAF cDNA 서열 중의 일부분을 포함한다. 도 16a에 나타난 바와 같이, 원발성 흑색종 세포 (Yumel 및 M34 세포)로부터의 엑소좀에서는 118 bp 밴드가 검출되었지만, 인간 섬유모세포 세포로부터의 엑소좀 또는 음성 대조군에서는 검출되지 않았다. GAPDH 전사체가 흑색종 세포 및 인간 섬유모세포 세포, 둘 모두로부터의 엑소좀에서 검출될 수 있기 때문에 (도 16b), 118 bp PCR 생성물 밴드의 음성적 검출이 오류 RNA 추출에 기인하는 것은 아니다. V600E 돌연변이를 검출하기 위해 118 bp PCR 생성물을 추가로 시퀀싱하였다. 도 16c 및 16d에 나타난 바와 같이, YUMEL 세포로부터의 PCR 생성물은 예측대로 야생형 BRAF mRNA를 함유한다. 대조적으로, M34 세포로부터의 PCR 생성물은 예측대로, BRAF 단백질의 위치 600에 있는 아미노산에서 아미노산 발린 (V)이 글루탐산 (E)으로 대체된 것인 T-A 점 돌연변이를 갖는 돌연변이체 BRAF mRNA를 함유한다. 추가로, BRAF mRNA는 정상 인간 섬유모세포 세포로부터의 엑소좀에서는 검출될 수 없는데, 이는 BRAF mRNA가 모든 조직 기원의 엑소좀에 함유되어 있는 것은 아니라는 것을 제안하는 것이다.
이러한 데이타는, 흑색종 세포가 엑소좀을 혈액 순환으로 탈락시키고, 이로써 흑색종은 혈액 혈청으로부터 상기 엑소좀을 단리시키고, 그로부터 핵산을 BRAF 중 돌연변이 (예로서, V600E)의 존재 또는 부재에 관해 분석함으로써 진단할 수 있다고 제안한다. 상기 기술된 방법은 또한 다른 BRAF 돌연변이 및 다른 유전자에서의 돌연변이와 관련된 흑색종을 진단하는 데에도 사용될 수 있다. 본 방법은 또한 BRAF 및 다른 핵산의 발현 프로필과 관련된 흑색종을 진단하는 데에도 사용될 수 있다.
실시예 15: 이식 후 병태를 모니터링하기 위한, 엑소좀으로부터의 MMP 수준 검출
기관 이식은 일반적으로 기관 부전에 효과적인 치료법이다. 신부전, 심장 질환, 말기 폐 질환 및 간경화는 이식에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 모든 병태이다. 그러나, 이식 후 합병증으로 인해 유발된 기관 거부는 동종이식 수혜자가 장기간 생존하는 데 있어 주된 장애물이 된다. 예를 들면, 폐 이식에서, 폐쇄 세기관지염 증후군이 생존율에 영향을 미치는 중증의 합병증이다. 신장 이식에서, 만성 동종이식 신병증은 동종이식 신부전의 주요 원인 중 하나로서 남아있다. 허혈-재관류 손상은 심장 이식 후 공여자의 심장을 손상시킬 뿐만 아니라, 동소 간 이식 후 공여자의 간도 손상시킨다. 이러한 이식 후 합병증은 일단 조기에 검출되면 호전될 수 있다. 그러므로, 유해 합병증을 완화시키기 위해서는 이식 후 병태를 모니터링하는 것이 필수적이다.
세포외 매트릭스의 변경이 이식 후 합병증에서 간질 재형성의 원인이 된다. 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)가 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질의 전환과 분해, 2가지 모두에 관여한다. MMP는 단백질분해성의 아연-의존성 효소 패밀리로, 현재까지 27개의 멤버가 기술되어 있으며, 이는 다중도메인 구조 및 기질 특이성을 보이고, 각종 가용성 인자의 프로세싱, 활성화 또는 불활성화에 작용한다. 혈청 MMP 수준이 이식 후 병태 상태를 나타낼 수 있다. 실제로, 순환 MMP-2는 신장 이식편 수혜자의 시스타틴 C, 이식 후 지속기간, 및 당뇨병과 관련이 있다 (문헌 [Chang et al., 2008]). MMP-9의 불균형적인 발현이 폐 이식 이후 폐쇄 세기관지염 증후군 발병과 연관이 있다 (문헌 [Hubner et al., 2005]).
실시예 4 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 아교모세포종 세포에 의해 탈락된 엑소좀 중에서 MMP mRNA (MMP1, 8, 12, 15, 20, 21, 24, 26 및 27)이 검출될 수 있다. 체액으로부터 엑소좀을 단리시키고, 상기 엑소좀으로부터 핵산을 분석하는 것인 본 엑소좀 방법을 사용하여 이식 병태를 모니터링할 수 있다. 엑소좀 단리 방법은 실시예 2에 상세히 설명되어 있는 것과 유사하다. 엑소좀 내에 함유되어 있는 핵산을 분석하는 방법은 실시예 9에 상세히 설명되어 있다. 신장 이식 이후에 MMP-2의 발현 수준이 유의적으로 증가하였다면, 이는 이식 후 합병증이 발병 및/또는 악화되었음을 나타내는 것이 될 것이다. 유사하게, 폐 이식 이후에 MMP-9의 발현 수준이 유의적으로 상승하였다면, 이는 이식 후 폐쇄 세기관지염 증후군이 발병 및/또는 악화되었음을 제안하는 것이다.
그러므로, 이식 후 합병증과 관련된 MMP 단백질의 발현 수준을 측정하여 엑소좀 방법을 사용함으로써 이식 후 병태를 모니터링할 수 있다. 또한, 다른 유전자의 발현을 측정하여 이식 후 병태를 모니터링하는 데 뿐만 아니라, 이들 의학적 병태와 관련된 핵산의 유전적 프로필을 측정함으로써 다른 의학적 병태를 모니터링하는 데 본 방법을 외삽시킬 수 있다.
실시예 16-18. 미세소포체는 치료제, 또는 치료제의 전달 비히클이 될 수 있다.
실시예 16: 미세소포체 단백질이 시험관내 혈관형성을 유도한다. 아교모세포종 미세소포체가 혈관 형성의 원인이 된다는 사실을 입증하기 위한 연구를 디자인하고, 이를 수행하였다. 뇌 내피 세포주 (셀 시스템즈(Cell Systems), 카탈로그 번호ACBRI-376 (미국 워싱턴주 커크랜드 소재))인 HBMVEC (30,000개의 세포)를 기초 배지만 (EBM) (미국 뉴햄프셔주 포츠머스 소재의 론자 바이올로직스 인크.(Lonza Biologics Inc.)), 아교모세포종 미세소포체로 보충된 기초 배지 (EBM+ MV) (7 ㎍/웰), 또는 혈관형성 인자 ((EGM; 하이드로코르티손, EGF, FGF, VEGF, IGF, 아스코르브산, FBS, 및 헤파린; 싱글쿼트(Singlequots))로 이루어진 칵테일로 보충된 기초 배지 (EBM 양성 대조군) 중 24웰 플레이트의 마트리겔-코팅된 웰 상에서 배양하였다. 16시간 후에 관 형성을 측정하고, 이미지 J 소프트웨어로 분석하였다. 아교모세포종 미세소포체의 존재하에서 배양된 HBMVEC에서 16시간 이내에 관의 길이가 2배가 된 것으로 나타났다. 그 결과는 혈관형성 인자의 존재하에서 배양된 HBMVEC에서 수득된 결과와 비교가능하였다 (도 18a). 이러한 결과는 아교모세포종-유래의 미세소포체가 뇌 내피 세포에서 혈관형성을 개시하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
미세소포체 중 혈관형성 단백질의 수준 또한 분석하고, 아교모세포종 공여자 세포 중의 수준과 비교하였다. 인간 혈관형성 항체 어레이를 사용하여, 본 발명자들은 혈관형성에 관여하는 19개의 단백질을 검출할 수 있었다. 구체적으로, 원발성 아교모세포종 세포 또는 상기 세포로부터 단리된 정제 미세소포체로부터의 전체 단백질을 제조사의 권고에 따라 용해 완충액 (미국 위스콘신주 매디슨 소재이 프로메가(Promega)) 중에서 용해시키고, 인간 혈관형성 항체 어레이 (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재의 파노믹스(Panomics))에 첨가하였다. 상기 어레이를 스캐닝하고, 이미지 J 소프트웨어로 분석하였다. 도 18b에 나타난 바와 같이, 19개의 혈관형성 단백질 중 7개가 미세소포체 중에서 쉽게 검출되었고, 6개 (안지오게닌, IL-6, IL-8, TIMP-1, VEGF 및 TIMP-2)는 아교모세포종 세포와 비교할 때 총 단백질 기초하여 더 높은 수준으로 존재하였다 (도 18c). 종양 세포와 비교하여 미세소포체에서 가장 풍부하게 존재하는 혈관형성 단백질 3개는 안지오게닌, IL-6 및 IL-8이였는데, 이들 모두는 악성 종양 증가와 관련된 고수준의 신경아교종 혈관형성과 관련이 있었다 (25-27).
원발성 아교모세포종 세포로부터 단리된 미세소포체는 또한 인간 U87 신경아교종 세포주의 증식을 촉진시키는 것으로 나타났다. 본 연구에서는, 100000개의 U87 세포를 24웰 플레이트의 웰에 시딩하고, 3일 동안 (DMEM-5%FBS) 또는 원발성 아교모세포종 세포로부터 단리된 125 ㎍ 미세소포체로 보충된 DMEM-5%FBS에서 성장시켰다. 3일 경과 후, 뷰르케르(Burker) 챔버를 사용하여 측정된 바, 미세소포체로 보충된 것보다 (도 19b) 비처리 U87 세포 (도 19a)의 수가 더 적은 것으로 나타났다. 이 기간 동안 보충되지 않은 U87 세포 및 보충된 U87 세포, 둘 모두의 개수가 각각 5배 및 8개 증가하였다 (도 19c). 따라서, 아교모세포종 미세소포체가 다른 신경아교종 세포의 증식을 자극하는 것으로 보여진다.
실시예 17: 아교모세포종 미세소포체는 HBMVEC에 의해 흡수된다.
아교모세포종 미세소포체가 인간 뇌 미세소포체 내피 세포 (HBMVEC)에 의해 흡수될 수 있는지를 입증하기 위하여 정제된 아교모세포종 미세소포체를 PKH67 녹색 형광 표지화 키트 (미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치)로 표지하였다. 4℃에서 20분 동안 표지된 미세소포체를 배양물 중 HBMVEC (5 ㎍/50,000 세포)와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 30분 이내에 PKH67-표지된 미세소포체가 HBMVEC 내에 존재하는 엔도좀-유사 구조체 내로 내재화되었다 (도 17a). 이러한 결과는 아교모세포종 미세소포체가 뇌 내피 세포에 의해 내재화될 수 있다는 것을 나타낸다.
원발성 아교모세포종 세포에 형광 표지된 미세소포체를 첨가하였을 때에도 유사한 결과를 얻었다.
실시예 18: 아교모세포종 미세소포체에 의해 전달된 mRNA는 수혜자 세포에서 번역될 수 있다.
아교모세포종-유래의 미세소포체 mRNA가 수혜자 세포로 전달되어 상기 세포에서 발현될 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 원발성 인간 아교모세포종 세포를, CMV 프로모터를 사용하여 분비성 가우시아 루시퍼라제(Gaussia luciferase) (Gluc)를 발현하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터를 이용하여 >95%의 감염율로 감염시켰다. 세포가 안정적으로 형질도입되었고, 차후의 계대접종 동안 (2-10 계대접종물을 분석하였다) 미세소포체가 생성되었다. 상기 기술된 바와 같이 미세소포체를 세포로부터 단리시키고 정제하였다. RT-PCR 분석을 통해 Gluc mRNA (555 bp) 및 GAPDH mRNA (226 bp)가 미세소포체 중에 존재하는 것으로 나타났다 (도 17b). 정량적 RT-PCR로 평가한 바, Gluc mRNA의 수준이 GAPDH mRNA보다 현저히 더 높았다.
정제된 미세소포체 50 ㎍을 50,000개의 HBMVE 세포에 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 미세소포체 첨가 직후 (0시간째), 및 15시간 및 24시간 경과 후 상등액 중 Gluc 활성을 측정하였다. 상등액 중 Gluc 활성을 미세소포체와 관련된 Gluc 단백질 활성으로 정규화하였다. 그 결과는 평균± SEM (n=4)으로 제시한다. 구체적으로, 수혜자 HBMVE 세포에서의 활성이 미세소포체 Gluc mRNA의 계속적인 번역을 입증하였다. 따라서, 종양 미세소포체 내로 혼입된 mRNA는 수혜자 세포 내로 전달될 수 있고, 기능성 단백질을 생성할 수 있다.
모든 실시예에서 통계학적 분석은 스튜던트의 t-검정을 사용하여 수행하였다.
참고문헌
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표 3에서 사용된 약어
약어 용어
A 증폭
AEL 급성 호산구성 백혈병
AL 급성 백혈병
ALCL 역형성 거대 세포 림프종
ALL 급성 림프구 백혈병
AML 급성 골수성 백혈병
AML* 급성 골수성 백혈병 (우선 치료 관련)
APL 급성 전골수세포 백혈병
B-ALL B-세포 급성 림프구 백혈병
B-CLL B-세포 림프구 백혈병
B-NHL B-세포 비-호지킨 림프종
CLL 만성 림프성 백혈병
CML 만성 골수성 백혈병
CMML 만성 골수단핵구 백혈병
CNS 중추 신경계
D 거대 결실
DFSP 융기 피부섬유육종
DLBL 미만성 거대 B-세포 림프종
DLCL 미만성 거대 세포 림프종
Dom 우성
E 상피
F 프레임
GIST 위장관 기질 종양
JMML 연소성 골수단핵구 백혈병
L 백혈병/림프종
M 중간엽
MALT 점막-관련 림프 조직
MDS 골수형성이상 증후군
Mis 미스센스
MLCLS 경화증을 동반한 종격 거대 세포 림프종
MM 다발골수종
MPD 골수증식 질환
N 넌센스
NHL 비-호지킨 림프종
NK/T 자연살 T 세포
NSCLC 비 소세포 폐암
O 기타
PMBL 원발성 종격 B-세포 림프종
pre-B ALL 전-B-세포 급성 림프모구 백혈병
Rec 열성
S 스플라이스 부위
T 전위
T-ALL T-세포 급성 림프모구 백혈병
T-CLL T-세포 만성 림프구 백혈병
TGCT 정소 생식 세포 종양
T-PLL T 세포 전림프구성 백혈병
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*
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SEQUENCE LISTING <110> Massachussett General Hospital Skog, Johan <120> USE OF MICROVESICLES IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF MEDICAL DISEASES AND CONDISTIONS <130> 3635 <160> 58 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 1 cgaccacttt gtcaagctca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 2 ggtggtccag gggtcttact 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 3 gagagcctcc cacagttgag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 4 tttgccagaa tctcccaatc 20 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 5 ccatgctcat sgattgg 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 6 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<211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 14 gagtatgtgt gaaggagt 18 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 15 ggctctggag gaaaagaaag gtaat 25 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 16 tcctccatct catagctgtc g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 17 attaaccctg ctcggtcctt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 18 accctggagt tgatgtcgtc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 19 cgtcactggc aaatttgatg 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic DNA sequence used as primers <400> 20 agtgcagctc caccgact 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA 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Claims (33)

  1. 대상체로부터의 생물학적 샘플로부터 미세소포체 분획 내의 핵산을 검출하는 단계, 및 생체마커의 존재 또는 부재 여부에 대해 미세소포체 분획 내의 핵산을 분석하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환 또는 다른 의학적 병태의 질환 진행의 진단, 예후, 모니터링, 질환 재발의 분석 및/또는 치료 효능 모니터링 하는 것을 보조하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서, 질환 또는 다른 의학적 병태가 면역 반응, 면역 요법, 세포 이동, 혈관 신생, 세포 증식, 히스톤 변형, 장기 이식, 신경 퇴행성 질환, 암 또는 그의 조합과 관련된 질환 또는 의학적 증상인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생체마커가
    (i) 핵산 종;
    (ii) 핵산의 발현 수준;
    (iii) 핵산 변이체;
    (iv) 유전적 이상; 또는
    (v) 그의 조합
    인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 메신저 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, 비코딩 RNA, DNA, 싱글 스트랜드 DNA, 상보성 DNA, 비코딩 DNA, 미토콘드리아 DNA, 미토콘드리아 RNA, 바이러스 핵산 또는 그의 조합인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 전립선암과 관련되며, 이때 상기 생체마커가 HOXA6, HOXC10, HOXC9, HOXD4, HOXA3, HOXA4, HOXC6, DLX1, 및 HK3(KLK3)로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 면역 반응과 관련되며, 이때 상기 생체마커가 IFN-알파, ICAM, VEGF, CD86, IL-6, IL-8, CXL2, HLA-E, TGFBR2, HLA-F, HLA-DRA 및 TNFAIP6으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택된 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 삼중 염색체 21, 삼중 염색체 18, 삼중 염색체 13, 삼중 염색체 16, 삼중 염색체 22, 삼배체성 및 성 염색체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염색체 이상 또는 다른 이수 배수체의 지표인 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 체세포 돌연변이 마커이고, 이때 상기 생체마커가 BRAF, KRAS, EGFRvIII, RB, PTEN, p16, p21 및 p53, 및 EGFR로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택된 것인 방법.
  9. 대상체로부터의 생물학적 샘플의 미세소포체 분획 내의 단백질을 검출하는 단계 및 생체마커의 존재 또는 부재에 대해 단백질을 분석하는 단계를 포함하는, 대상체의 질환 진행 또는 다른 의학적 병태의 진단, 예후, 스크리닝, 모니터링하는 것을 보조하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 질환 또는 다른 의학적 병태는 면역 반응, 면역 요법, 세포 이동, 혈관 신생, 세포 증식, 히스톤 변형, 장기 이식, 신경 퇴행성 질환, 암 또는 그의 조합과 관련된 질환 또는 다른 의학적 병태인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에있어서, 생체마커는
    (i) 하나 이상의 단백질 종;
    (ii) 하나 이상의 단백질의 풍부 수준;
    (iii) 하나 이상의 단백질 변이체;
    (iv) 단백질 변형; 또는
    (iv) 그의 조합
    인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단백질 변형이 사후 번역 변형인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 단백질 변형이 적어도 인산화, 유비퀴틴화 또는 그의 조합을 포함하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 생체마커가 면역 반응 및/또는 신경 퇴행성 질환과 관련이 있고, 생체마커가 체크 포인트 억제제, PD1, PDL1, 타우(Tau), 포스포-타우(phospho-Tau), 아밀로이드 베타 및 알파 시누클레인(alpha synuclein)으로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택된 것인 방법.
  15. 생물학적 샘플을 전처리하여 단백질, 지질, 죽은 세포로부터의 부스러기, 및 다른 오염물을 제외하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 미세소포체 분획을 단리하기 위한 방법.
  16. 제15항에 있어서, 미세소포체 분획의 단리가 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심 분리, 분별 원심 분리, 나노막 한외여과, 면역 흡착성 포획, 친화성 정제, 전하-기반 친화성 정제, 미세유체 분리 또는 그의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 전처리가 0.8 ㎛ 필터를 통해 여과시켜 행하는 것이거나, 0.8 ㎛ 필터를 통한 여과에 이어 크기 배제 크로마토그래피, 밀도 구배 원심 분리, 편차 원심분리, 나노막 한외여과, 면역 흡착성 포획, 친화성 정제, 전하-기반 친화성 정제, 미세유체 분리 또는 그의 조합의 조합에 의해 행해지는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 분석하기 전에 미세소포체 분획을 정제하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 핵산 분석 전에 또는 단백질 분석 전에 미세소포체 분획을 농축, 강화 또는 고갈시키는 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 미세소포체 분획을 초 원심 분리 또는 나노막 한외여과 농축기를 사용하여 정제시키는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 분석이 마이크로어레이 분석, PCR-기초 분석, 대립유전자에 특이적인 프로브화의 혼성화, 효소에 의한 돌연변이 검출, 연결 연쇄 반응(LCR), 올리고뉴클레오티드 연결 분석(OLA), 유식세포 측정시 이형접합체 분석, 미스매치의 화학적 절단, 질량 분광분석법, RNA 시퀀싱, DNA 시퀀싱, 또는 조합된 RNA/DNA 시퀀싱, 싱글 스트랜드 입체형성 다형성(SSCP), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE), 온도 구배 겔 전기 영동 (TGGE), 제한 단편 다형성, 유전자 발현 연속 분석(SAGE), DNA 시퀀싱 또는 그의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, PCR-기초 분석은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 계내 중합효소 연쇄 반응, 정량적 중합효소 연쇄 반응, 이중 중합효소 연쇄 반응, 자립형 서열 복제, 전사 증폭 시스템, Qb 리플리카제, 냉-PCR 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 분석 전에 미세소포체 분획으로부터 추출되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액 및 비뇨생식관액, 눈물, 타액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  25. 특정 세포 유형, 특정 기원, 하나 이상의 별개의 세포-표면 단백질, 하나 이상의 별개의 세포-표면 당 단백질, 하나 이상의 별개의 세포-표면 지질 단백질, 하나 이상의 별개의 세포-표면 지질, 하나 이상의 별개의 세포-표면 당 또는 그의 조합을 포함하는 미세소포체 분획의 특정 일부를 강화 또는 제외하기 위한 방법.
  26. 제25항에 있어서, 대상체에서 질환 또는 다른 의학적 병태의 질환 진행의 진단, 예후, 스크리닝, 모니터링, 질환 재발의 분석, 치료 효능의 모니터링 또는 그의 조합을 위해 사용하기 위해, 대상체로부터 생물학적 샘플의 미세소포체 분획 내 핵산 또는 단백질을 검출하는 단계, 및 생체마커의 존재 또는 부재를 위해 미세소포체 분획 내의 핵산 또는 단백질을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 대상체로부터의 생물학적 샘플의 미세소포체 분획 내의 핵산 또는 단백질을 검출하는 단계를 포함하고, 질환 또는 또는 다른 의학적 병태가 암에 대한 면역 반응과 관련이 있는, 질환 진행의 진단, 예후, 스크리닝, 모니터링, 질환 재발의 평가, 분석, 이의 치료 효능 모니터링 또는 이들의 조합을 보조하기 위한 방법.
  28. 대상체에서 미세소포체 분획으로부터 추출된 핵산을 분석하고 미세소포체 생체마커 프로파일을 형성하여 미세소포체 생체마커 프로파일을 대조군 프로파일과 비교하고 미세소포체 프로파일과 대조군 프로파일의 하나 이상의 차이점에 기준으로 하나 이상의 생체마커를 선택하는 것을 포함하는, 핵산을 분석하는 방법.
  29. 피험자의 미세소포체 분획으로부터 추출된 메신저 RNA 또는 다른 긴 RNA를 검출하거나 분석하는 방법.
  30. (a) 인간으로부터 유래된 체액으로부터 미세소포체 분획을 단리시키는 단계로서, 여기서 체액은 뇨, 혈청 또는 혈장이고, 하기 단계를 포함하는 단리 단계:
    단백질 및 지질, 죽은 세포로부터의 부스러기, 및 다른 잠재적인 오염원을 제외시키기 위해 미세소포체를 가공하는 단계;
    초원심분리 또는 나노막 한외여과 농축기를 사용하여 미세소포체를 정제하는 단계; 및
    미세소포체를 세척하는 단계;
    (b) 미세소포체로부터 RNA를 추출하는 단계; 및
    (c) 미세소포체 분획 내의 생체마커의 존재 또는 부재 여부에 대해 추출된 RNA를 분석하는 단계
    를 포함하며,
    여기서 생체마커는 표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Fctor Receptor, EFGR) 유전자의 EGFRvIII 변이체의 존재이고, 생체마커는 암의 진단, 예후, 또는 모니터링과 관련이 있는 것이고, 이때 상기 암이 뇌종양, 임의적으로 신경아교종 또는 아교모세포종인, 대상체에서 암의 진단, 예후, 또는 모니터링을 보조하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 체액 샘플 내에 EGFRvIII이 존재하는 경우, 대상체에 대한 치료 요법을 선택하는 단계 (d)를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 치료 요법이 EGFR-저해제를 사용하는 치료법인 방법.
  33. 제32항에 있어서, EGFR-저해제가 게피티닙 또는 엘로티닙인 방법.
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