BRPI0908198B1 - célula de fermentação de açúcar pentose - Google Patents

Description

(54) Título: CÉLULA DE FERMENTAÇÃO DE AÇÚCAR PENTOSE (51) Int.CI.: C12N 9/92; C12P 7/10; C12N 15/52 (30) Prioridade Unionista: 07/03/2008 EP 08102407.7 (73) Titular(es): DSM IP ASSETS B.V.

(72) Inventor(es): PAUL KLAASSEN; JAN METSKE VAN DER LAAN; BIANCA ELISABETH MARIA GIELESEN; GIJSBERDINA PIETERNELLA VAN SUYLEKOM (85) Data do Início da Fase Nacional: 27/08/2010

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CÉLULA DE FERMENTAÇÃO DE AÇÚCAR PENTOSE Campo da Invenção

A presente invenção se refere a uma célula a qual é capaz de isomerizar xilose em xilulose. A invenção também se refere a um processo no qual tais células são usadas para a produção de um produto de fermentação, como etanol.

Antecedentes da Invenção consumo em larga escala de combustíveis fósseis tradicionais (combustíveis à base de petróleo) nas décadas recentes tem contribuído para altos níveis de poluição. Isto, juntamente com a constatação de que o estoque mundial de combustíveis fósseis não é limitado e que uma preocupação ambiental crescente tem estimulado novas iniciativas de investigar a possibilidade de combustíveis alternativos como etanol, o qual é uma fonte de combustível de queima isenta de particulados que libera menos CO₂ do que a gasolina sem chumbo em uma base por litro.

Embora etanol derivado de biomassa possa ser produzido pela fermentação de açúcares de hexose obtidos de muitas diferentes fontes, os substratos tipicamente usados para a produção em escala comercial de álcool combustível, como cana-de-açúcar e amido de milho, são caros. Aumentos na produção de etanol combustível irão consequentemente, requerer o uso de matérias-primas de custo mais baixo.

Atualmente, somente a matéria-prima lignocelulósica derivada da biomassa vegetal é disponível em quantidades suficientes para substituir as safras atualmente usadas para a produção de etanol. Na maioria do material lignocelulósico, o segundo açúcar mais comum, depois da glicose, é a xilose. Deste modo, para um processo de

2/71 produção de combustível economicamente viável, tanto açúcares de hexose quanto de pentose devem ser fermentados para formar etanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae é robusta e bem adaptada para a produção de etanol, porém é incapaz de produzir etanol usando xilose como fonte de carbono. Também nenhum organismo de ocorrência natural é conhecido o qual pode fermentar a xilose em etanol tanto com alto rendimento de etanol quanto com elevada produtividade de etanol.

Consequentemente	existe	uma	necessidade	por	um
organismo que possua	essas	características de	modo	a
permitir a produção	comercialmente	viável de	etanol	a

partir de matérias-primas lignocelulósicas.

Sumário da Invenção

De acordo com a invenção, é fornecida uma célula que é capaz de fermentar, como fermentação alcoólica, e de usar xilose como fonte de carbono. Tal célula compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácidos da xilose isomerase tem pelo menos cerca de 7 0% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 3 em que a sequência de nucleotídeos é heteróloga ao hospedeiro. Tal célula produz uma maior quantidade de etanol ao usar xilose como fonte de carbono em comparação com o fungo filamentoso tipo selvagem.

A invenção também fornece:

- um processo para a produção de um produto de fermentação, cujo processo compreende fermentar um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula da invenção, de modo que a célula fermente xilose para o produto de

3/71 fermentação;

- um processo para a produção de um produto de fermentação cujo processo compreende fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de Larabinose com uma célula conforme definida da invenção, a qual também é capaz de utilizar L-arabinose de modo que a célula fermente xilose e L-arabinose ao produto de fermentação; e

- um processo para produzir um produto de fermentação cujo processo compreende fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula da invenção e uma célula capaz de usar Larabinose, por meio do que cada célula fermenta xilose e/ou arabinose no produto de fermentação.

Ά invenção ainda fornece o uso de uma célula da invenção em um processo para a produção de um produto de fermentação.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 estabelece o mapa de plasmídeo de pYISIT4XKSl-xylA (Baun CpO) codificando a xilos isomerase de Bacteroides uniformis ATCC 84 92 para a expressão em Saccharomyces cerevisiae. CpO denota par de códons otimizado.

Figura 2 estabelece um mapa físico do plasmídeo pPWT080,a sequência da qual é dada na SEQ ID NO: 4.

Figura 3 estabelece um mapa físico do locus GRE3 tipo selvagem (quadro a) e de uma integração de cópia no locus GRE3 (quadro b, mostrando onde os iniciadores se ligam e o quadro c, onde a sonda RKI1 se liga).

Figura 4 estabelece um autorradiograma mostrando a

4/71 integração correta de uma cópia do plasmídeo pPWT080 em CEN.PK113-7D;

Quadro a: Digestão Xcml de preparações de DNA cromossomais, hibridizadas com a sonda RKI-1. Raia 1: CEN.PK113-7D; raia 2: BIE104F1; raia 3: BIE104P1.

Quadro b: Digestão Psil de preparações de DNA cromossomais, hibridizadas com a sonda RKI-1. Raia 1: CEN.PK113-7D; raia 2: BIE104F1; raia 3: BIE104P1.

AGRE::PPP estabelece a substituição da região codifícadora do gene GRE3 pelo cassete contendo os genes TAL1, TKL1, RKI1 e RPE1 sob o controle de promotores constitutivo fortes, AGRE3::[TPllp-TALl-ADHlp-TKLl-PGllpRPEl-ENOlp-RKIl].

Figura 5 estabelece um mapa físico do locus GRE3, onde a região codifícadora do gene GRE3 foi substituída pela integração dos genes PPP TAL1, TKL1, RKI1 e RPE1. Quadro a mostra onde os iniciadores da SEQ ID 5 e 6 se ligam, quadro b mostra onde a sonda RKI1 se liga.

Figura 6 estabelece um mapa físico do plasmídeo pYI#SIT4.

Figura 7 estabelece um mapa físico do plasmídeo pPWT07.

Figura 8 estabelece um mapa físico do plasmídeo pPWT042.

Figura 9 estabelece um mapa físico do locus SIT-4 tipo selvagem (quadro a) e uma integração de cópia de PWT080 no locus SIT4 (quadro b, mostrando onde os iniciadores se ligam)

Figura 10 estabelece uma curva de crescimento de BIE104P1Y9 em xilose 2% como a única fonte de carbono,

5/71 depois de vários pré-cultivos, e da cepa de referência sem uma cópia de pPWT042 integrada no genoma. Eventos indicados no gráfico pelos números (1): transferência para YNB glicose 1% + xilose 1%; (2) transferência para YNB glicose 0,1% + xilose 2%; (3) transferência para YNB xilose 2%; (4) transferência para YNB xilose 2% (somente BIE104P1Y9).

Figura 11	estabelece	uma curva	de	crescimento	da cepa
de referência	BIE104P1 e	uma cepa	que	metaboliza	xilose,
BIE104P1Y9.
Figura 12	estabelece	o consumo	de xilose e glicose e a

produção de etanol no momento das cepas BIE104P1 précultivadas de glicose (quadro a), BIE104P1Y9 pré-cultivadas em glicose (quadro b) e BIE104P1Y9 pré-cultivadas em xilose (quadro c).

Figura 13 estabelece um mapa físico do plasmídeo pPWT018.

Figura 14 estabelece um mapa físico do plasmídeo pPWT006.

Figura 15 estabelece um autorradiograma Southern blot. DNA cromossomal da cepa tipo selvagem CEN.PK113-7D (raia 1) e BIE104A2 (raia 2) foram digeridos tanto com EcoRI quanto HindIII. O blot foi hibridizado com uma sonda SIT2 específica.

Figura 16 estabelece mapas físicos do locus SIT2 tipo selvagem (quadro a) e depois da introdução dos genes ara pela integração do plasmídeo pPWT018, seguindo pela recombinação intramolecular que leva à perda das sequências de vetor e de marcador selecionável (quadro b) . A hibridização da sonda é indicada.

Figura 17 estabelece uma representação gráfica das

6/71 curvas de crescimento da cepa BIE104A2P1Y9 em meios diferentes. Quadro a: cepa BIE104A2P1Y9 crescidas em galactose, seguido pelos eventos indicados no gráfico pelos números (1) transferência para arabinose 1% + xilose 1% e (2) transferência para xilose 2% + arabinose 0,2%. Quadro b: cepa BIE104A2PIY9 crescida em glicose, seguido pela (1) transferência para arabinose 1% + xilose 1% e (2) transferência para xilose 2% + arabinose 0,2%.

Breve Descrição da Listagem de Sequências

SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de xilose isomerase tipo selvagem de Bacteroides uniformis ATCC 8492.

No. de Acesso Genbank AAYH02000036.

SEQ ID NO: 2 estabelece uma sequência de códons otimizada derivada da SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácidos da xilose isomerase de Bacteroides uniformis ATCC 8492.

SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência do plasmídeo pPWT080.

SEQ ID NO: 5 estabelece a sequência do iniciador de sentido normal.

SEQ ID NO: 6 estabelece a sequência do iniciador de sentido reverso.

SEQ ID NO: 7 estabelece a sequência do iniciador multifuncional de sentido normal para o PCR de diagnóstico.

SEQ ID NO: 8 estabelece a sequência do iniciador multifuncional de sentido reverso para o PCR de diagnóstico.

SEQ ID NO: 9 estabelece a sequência da sonda RKI-1 do iniciador de sentido normal.

SEQ ID NO: 10 estabelece a sequência da sonda RKI-1 do

7/71 iniciador de sentido reverso.

	SEQ	ID	NO:	11	estabelece a	sequência	do	cassete	kanMX
do	iniciador	de	sentido normal.
	SEQ	ID	NO:	12	estabelece a	sequência	do	cassete	kanMX
do	iniciador	de	sentido reverso.
	SEQ	ID	NO:	13	estabelece a	sequência	do	iniciador de
sentido :	normal.
	SEQ	ID	NO:	14	estabelece a	sequência	do	iniciador de
sentido :	reverso.
	SEQ	ID	NO:	: 15 estabelece	a sequência	do iniciador

multifuncional de sentido normal para PCR de diagnóstico.

SEQ ID NO: 16 estabelece a sequência do iniciador multifuncional de sentido reverso para PCR de diagnóstico.

SEQ ID NO: 17 estabelece a sequência da sequência do plasmídeo pPWT018.

SEQ ID NO: 18 estabelece a sequência de integração do iniciador de sentido normal pPWT018.

SEQ ID NO: 19 estabelece a sequência de integração do iniciador de sentido reverso pPWT018.

SEQ ID NO: 20 estabelece a sequência da sonda SIT-2 de sentido normal.

SEQ ID NO: 21 estabelece a sequência da sonda SIT-2 de sentido reverso.

Descrição Detalhada da Invenção Por todo o relatório descritivo e as reivindicações associadas, as palavras compreende e inclui e variações como compreende, compreendendo, incluir w incluindo são para ser interpretadas inclusivamente. Isto é, essas palavras são tencionadas a transmitir a idéia da possível inclusão de outros elementos ou números inteiros não

8/71 citados especificamente, onde o contexto permite.

A invenção se refere a uma célula a qual compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase, em que a sequência de aminoácidos da xilose isomerase tem pelo menos cerca de 7 0% de identidade com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3, e em que a sequência de nucleotídeos é heteróloga ao hospedeiro.

A presença da sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase confere na célula a capacidade de isomerizar xilose em xilulose.

Uma xilose isomerase (EC 5.3.1.5) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de Dxilose em D-xilulose e/ou vice versa. A enzima também é conhecida como D-xilose cetoisomerase. Uma xilose isomerase aqui também pode ser capaz de catalisar a conversão entre D-glicose e D-frutose (e deste modo pode consequentemente ser referida como glicose isomerase). Uma xilose isomerase da presente invenção pode requerer um cátion bivalente, como magnésio, manganês ou cobalto como co-fator.

Deste modo, uma célula da invenção é capaz de isomerizar xilose em xilulose. A capacidade de isomerizar xilose em xilulose é conferida à célula hospedeira pela transformação da célula hospedeira com um constructo de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase definida. Uma célula da invenção isomeriza xilose em xilulose pela isomerização direta de xilose em xilulose. Isto é compreendido como significando que a xilose é isomerizada em xilulose em uma reação única catalisada por uma xilose isomerase, ao contrário da conversão em duas etapas de xilose em xilulose

9/71 através de um intermediário xilitol como catalisado pela xilose redutase e xilitol desidrogenase, respectivamente.

Uma unidade (U) de atividade de xilose isomerase pode ser aqui definida como a quantidade de enzima produzindo 1 nmol de xilulose por minuto, sob condições conforme descritas por Kuyper et al. (2003, FEMS Yeast Res. 4: 6978) .

A célula da invenção é definida com referência a uma xilose isomerase com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência com pelo menos cerca de 7 0% de identidade de sequência com ela. Da mesma forma, uma célula da invenção pode ser definida com referência a uma xilose isomerase ser uma sequência de nucleotídeos codificando tal sequência de aminoácidos.

SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácidos da xilose isomerase a partir de Bacteroides uniformis ATCC 8492. Uma célula da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase com o aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou uma a qual tenha pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com ela.

Preferivelmente, uma célula de acordo com a presente invenção é uma célula que compreende uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase com uma sequência a qual tem pelo menos cerca de 75%, preferivelmente pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98% ou pelo menos cerca de 99% ou pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%,

10/71 pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Entretanto, uma célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase com uma sequência a qual tem pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60% ou pelo menos cerca de 70% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 3.

Identidade de sequência (ou similaridade de sequência) é aqui definida como uma relação entre duas ou mais sequências de aminoácidos (polipeptídeo ou proteína) ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos (polinucleotídeo), conforme determinado pela comparação das sequências. Comumente, identidades ou similaridades de sequências são comparadas, tipicamente em uma extensão completa de sequências comparadas. Entretanto, sequências podem ser comparadas em janelas de comparação mais curtas. Na técnica, identidade também significa o grau de relação de sequência entre sequências de aminoácido ou de ácido nucléico, conforme pode ser o caso, conforme determinado pelo emparelhamento entre as séries de tais sequências.

Métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer o maior emparelhamento entre as sequências testadas. Métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador publicamente conhecidos. Métodos de programas de computador preferidos para determinar a identidade3 e similaridade entre duas sequências incluem, por exemplo, o BestFit,

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BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et al. , J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), publicamente disponíveis de NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S., et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894). Parâmetros preferidos para a comparação das sequências de aminoácidos usando BLASTP são a abertura de intervalo de 11,0, extensão de intervalo de 1, matriz Blosum 62. Parâmetros preferidos para a comparação de sequências de ácido nucléico usando BLASTP são abertura de intervalo de 11,0, extensão de intervalo de 1, matriz de DNA completa (matriz de identidade de DNA).

Opcionalmente, na determinação do grau de similaridade de aminoácido, a pessoa habilitada pode também levar em consideração as chamadas substituições de aminoácidos conservativas, conforme será evidente para a pessoa versada.

Substituições de aminoácidos conservativas se referem à intermutabilidade dos resíduos com cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é a glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifático-hidroxila é a serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas é a fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas é a lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre é a cisteína e metionina.

Grupos de substituição de aminoácidos conservativos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina12/71 aquelas nas quais pelo menos tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparaginaglutamina. Variantes de substituição da sequência de aminoácidos aqui revelada são um resíduo nas sequências reveladas foi removido e um resíduo diferente foi inserido em seu lugar. Preferivelmente, a mudança de aminoácido é conservativa. Substituições conservativas preferidas para cada um dos ural são as seguintes: Ala ra gin ou his/ ASp para glu; asn; Glu para asp; Gly para ara leu ou vai; Leu para iel lu; Met para leu ou ile; Phe thr; Thr para ser; Trp para aminoácidos de ocorrência nat' para ser; Arg para lys; Asn paj Cys para ser ou ala; Gin para pro; His para asn ou gin; He p; ou vai; Lys para arg; gin ou g'. para met, leu ou tyr; Ser para tyr; Tyr para trp ou phe; e Vai para ile ou leu.

Uma sequência de nucleotídeos codificando uma enzima a qual catalisa a conversão de xilose em xilulose de acordo com a invenção pode ser também definida por sua capacidade de hibridizar com as sequências de nucleotídeo codificando a enzima com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 3 ou uma sequência com pelo menos cc sequência com ela, sob condiçõí ou preferivelmente estringenteç.

Formalmente, tais sequências de nucleotídeo hibridizam erca de 70% de identidade de es de hibridização moderada, com o complemento reverso das quais codificam a enzima com SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de identidade de sequência com as quais hibridizam com o complemento reverso das SEQ ID

NOs: 1 ou 2.

Condições de hibridização estringentes são aqui sequências de nucleotídeo as a sequência estabelecida na com pelo menos cerca de 70% ela, por exemplo, sequências

13/71 definidas como as condições que permitem que uma sequência de ácido nucleico de pelo menos cerca de 25, preferivelmente cerca de 50 nucleotídeos, 75 ou 100 e mais preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeos, hibridizem em uma temperatura de cerca de 65 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC (cloreto de sódio, citrato de sódio) o qualquer outra solução com uma força iônica comparável, e lavagem a 65 °C em uma solução compreendendo cerca de 0,1 M de sal, ou menos, preferivelmente 0,2 x SSX ou qualquer outra solução com força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é efetuada de um dia para o outro, isto é, pelo menos por 10 horas e preferivelmente a lavagem é efetuada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem. Essas condições irão comumente permitir a hibridização específica das sequências com cerca de 90% ou mais de identidade de sequência.

Condições moderadas são aqui definidas como condições que permitem que sequências de ácido nucleico de pelo menos 50 nucleotídeos, preferivelmente de cerca de 200 ou mais nucleotídeo, hibridizem em uma temperatura de cerca de 45 °C em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução com força iônica comparável, e lavagem em temperatura ambiente em uma solução compreendendo cerca de 1 M de sal, preferivelmente 6 x SSC ou qualquer outra solução com força iônica comparável. Preferivelmente, a hibridização é efetuada de um dia para o outro, isto é, pelo menos por 10 horas, e preferivelmente a lavagem é efetuada por pelo menos uma hora com pelo menos duas mudanças da solução de lavagem.

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Essas condições irão comumente permitir a hibridização específica das sequências com até 5 0% de identidade de sequência. A pessoa versada na técnica será capaz de modificar essas condições de hibridização para identificar especificamente as sequências que variam em identidade entre 50% e 90%.

Para aumentar a probabilidade de que a enzima introduzida seja expressa na forma ativa em uma célula da invenção, a sequência de nucleotídeo codificadora correspondente pode ser adaptada para otimizar o seu uso e códon àquele da célula de levedura escolhida. Vários métodos para a otimização de códon são conhecidos na técnica. Um método preferido para otimizar o uso de códon das sequências de nucleotídeo com aquele da levedura é uma tecnologia de otimização de par de códon conforme revelado em W02006/077258 e W02008/000632. W02008/000632 endereça a otimização do par de códon. A otimização de par de códon é um método em que as sequências de nucleotídeo codificando um polipeptídeo são modificadas em relação ao seus usos de códon, particularmente os pares de códons que são usados, para obter a expressão melhorada da sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo e/ou a produção melhorada do polipeptídeo codificado. Pares de códons não definidos como um grupo de tripletes subsequentes (códons) em uma sequência codificadora.

Como uma medida simples para a expressão gênica e eficiência de tradução, aqui, o índice de Adaptação de

Códon (CAI), conforme descrito em Xuhua Xia, Evolutionary

Bioinformatics 2007,: 3 53-58, é usado. O índice usa um grupo de referência de genes altamente expressos de uma

15/71 espécie para avaliar os méritos relativos de cada códon, e uma pontuação para um gene é calculada a partir da frequência de uso de todos os códons naquele gene. O índice avalia a extensão à qual a seleção foi eficaz na moldagem do padrão do uso do códon. Sob aquele aspecto, é útil prever o nível de expressão de um gene, para avaliar a adaptação de genes virais aos seus hospedeiros, e para fazer comparações de uso de códon em diferentes organismos. O índice também pode fornecer uma indicação aproximada da probabilidade de sucesso de expressão de gene heterólogo. Nos genes otimizados do par de códons de acordo com a invenção, o CAI é de 0,6 ou mais, 0,7 ou mais, 0,8 ou mais, 0,85 ou mais, 0,87 ou mais, 0,90 ou mais, 0,95 ou mais, ou de cerca de 1,0.

Em uma célula da invenção, a xilose isomerase é tipicamente heteróloga à célula. Em outras palavras,a xilose isomerase tem uma sequência a qual não ocorre naturalmente na célula em questão como parte do organismo, célula, sequência de DNA ou RNA de genoma no qual ela está presente. Em outras palavras, a xilose isomerase é exógena â célula ou não ocorre naturalmente na célula. Deste modo, uma sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase é tipicamente expressa ou é capaz de ser expressa na forma ativa na célula hospedeira transformada.

Deste modo, uma célula da invenção é uma célula que compreende, isto é, foi transformada com um constructo de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeos codificando a xilose isomerase conforme definido acima. 0 constructo de ácido nucleico compreendendo a sequência codificadora de xilose isomerase é preferivelmente capaz de

16/71 expressão da xilose isomerase na célula hospedeira.

Métodos para expressar uma sequência da xilose isomerase heteróloga em uma célula são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

Deste modo, uma célula da invenção é uma célula recombinante. Em outras palavras, uma célula da invenção compreende, ou é transformada com ou é geneticamente modificada com uma sequência de nucleotídeos que não ocorre naturalmente na célula em questão.

Técnicas para a expressão da xilose isomerase em uma célula, assim como para as modificações genéticas adicionais de uma célula da invenção, são bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Tipicamente, tais técnicas envolvem a transformação de uma célula com constructo de ácido nucléico compreendendo a sequência relevante. Tais métodos são, por exemplo, conhecidos a partir de manuais padrões, como Sambrook e Russel (2001 ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3^a edição), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ou F. Ausubel et al. , eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, Nova Iorque (1987). Métodos para a transformação e modificação genética de células hospedeiras fúngicas são conhecidos, por exemplo, de EP-A- 0635 574, WO 98/46772, WO 99/60102, WO 00/37671 , WO90/14423, EP-A0481008, EP-A-0635574 e US 6.265.186.

A maioria dos plasmídeos epissomais ou 2μ são relativamente instáveis, sendo perdidos em aproximadamente

10'² ou mais células depois de cada geração. Mesmo sob condições de crescimento seletivo, somente de 60% a 95% das

17/71 células retêm o plasmídeo epissomal. A quantidade de cópias da maioria dos plasmídeos epissomais varia de 10 a 40 por célula de hospedeiros cir⁺. Entretanto, os plasmídeos não estão igualmente distribuídos dentre as células, e existe uma alta variância na quantidade de cópias por célula nas populações. Cepas transformadas com plasmídeos integrativos são extremamente estáveis, mesmo na ausência de pressão seletiva. Entretanto, a perda de plasmídeo pode ocorrer em frequências de aproximadamente 10'³ a IO'⁴ por recombinação homóloga entre DNA repetido em tandem, levando à saída por loop da sequência do vetor. Preferivelmente, o design do vetor, no caso de integração estável é tal que na perda dos genes marcadores de seleção (o que também ocorre por recombinação intramolecular homóloga) aquela saída por loop do constructo integrado não é mais possível. Preferivelmente, os genes são, deste modo, estavelmente integrados. A integração estável é aqui definida como a integração no genoma, em que a saída por loop do constructo integrado não é mais possível. Preferivelmente, os marcadores de seleção estão ausentes.

Tipicamente, o constructo do ácido nucléico pode ser um plasmídeo, por exemplo, um plasmídeo de baixa cópia ou um plasmídeo de alta cópia. A célula de acordo com a presente invenção pode compreender uma única ou múltiplas cópias da sequência de nucleotídeo codificando uma xilose isomerase, por exemplo, por múltiplas cópias de um constructo de nucleotídeo ou pelo uso do constructo o qual tenha múltiplas cópias da sequência xilose isomerase.

O constructo de ácido nucléico pode ser mantido epissomalmente e, deste modo, compreender uma sequência

18/71 para replicação autonômica, como uma sequência de replicação autossômica. Um constructo de ácido nucléico epissomal adequado pode, por exemplo, ser baseado nos plasmídeos de levedura 2μ ou pKDl (Gleer et al. , 1991 , Biotechnology 9: 968-975), ou os plasmídeos AMA. (Fierro et al. , 1995, Curr Genet. 29:482-489). Alternativamente, cada constructo de ácido nucléico pode ser integrado em uma ou mais cópias no genoma da célula. A integração no genoma da célula pode ocorrer aleatoriamente por recombinação nãohomóloga, porém preferivelmente o constructo de ácido nucléico pode ser integrado no genoma da célula por recombinação homóloga conforme é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, WO90/14423, EP-A-0481008, EP-A-0635 574 e US 6.265.186) .

Tipicamente, a sequência que codifica a xilose isomerase será operativamente ligada a uma ou mais sequências de ácido nucléico capazes de proporcionar ou ajudar a transcrição e/ou tradução da sequência de xilose isomerase.

termo operativamente ligado se refere a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem das suas formas tencionadas. Por exemplo, um promotor ou intensificador é operativamente ligado a uma sequência codificadora, o dito promotor ou intensificador afeta a transcrição da sequência codificadora.

Conforme aqui utilizado, o termo promotor se refere a um fragmento de ácido nucléico que funciona para controlar a transcrição de um ou mais genes, localizados â montante em relação à direção de transcrição do sítio de

19/71 início de transcrição do gene, e é estruturalmente identificado pela presença de um sítio de ligação para a RNA polimerase dependente de DNA, sítios de iniciação de transcrição e quaisquer outras sequências de DNA conhecidas por uma pessoa versada na técnica. Um promotor constitutivo é um promotor que é ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor induzível é um promotor que é ativo sob regulação ambiental e de desenvolvimento.

O promotor que poderia ser usado para alcançar a expressão de uma sequência de nucleotídeos codificando uma enzima de acordo com a presente invenção pode não ser natural à sequência de nucleotídeos que codifica a enzima a ser expressa, isto é, um promotor que seja heterólogo à sequência de nucleotídeos (sequência codificadora) à qual ele está operativamente ligado. O promotor pode, entretanto, ser homólogo, isto é, endógeno, à célula hospedeira.

Promotores adequados neste contexto incluem promotores naturais tanto constitutivos quando induzíveis, assim como promotores manipulados, os quais são bem conhecidos por uma pessoa na técnica. Promotores adequados em células hospedeiras eucarióticas podem ser GAL7, GAL10 ou GAL1, CYC1, HIS3, ADH1, PGL, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, EN01, TPH e AOX1. Outros promotores adequados incluem PDC1, GPD1, PGK1, TEF1 e TDH3.

Em sequência isomerase sequência uma célula da invenção, a extremidade 3' da de ácido de nucleotídeo codificando a xilose preferivelmente é operativamente ligada a uma terminadora de transcrição. Preferivelmente, a

20/71 sequência terminadora é operável em uma célula hospedeira de escolha, como por exemplo, as espécies de levedura de escolha. Em qualquer caso, a escolha do terminador não é crítica; ela pode, por exemplo, ser de qualquer gene de levedura, embora terminadores possam algumas vezes funcionar se de um gene eucariótico que não seja de levedura. Usualmente, uma sequência de nucleotídeos codificando a xilose isomerase compreende um terminador. Preferivelmente, tais terminadores são combinados com mutações que evitam o decaimento de RNAm mediado semsentido na célula hospedeira da invenção (ver, por exemplo: Shirley et al., 2002, Genetics 161: 1465-1482).

A sequência terminadora de transcrição ainda preferivelmente compreende um sinal de poliadenilação.

Opcionalmente, um marcador selecionável pode estar presente em um constructo de ácido nucléico adequado para uso na invenção. Conforme aqui utilizado, o termo marcador se refere a um gene codificando uma característica ou um fenótipo o qual permite a seleção de, ou a varredura por uma célula hospedeira contendo o marcador. O gene marcador pode ser um gene de resistência a antibiótico por meio do qual o antibiótico apropriado pode ser usado para selecionar as células transformadas dentre as células que não são transformadas. Exemplos de marcadores de resistência a antibióticos adequados incluem, por exemplo, diidrofolato redutase, higromicina-Bfosfotransferase, 3'-O-fosfotransferase II (resistência à canamicina, neomicina e G418). Embora os marcadores de resistência a antibiótico possam ser mais convenientes para a transformação de células hospedeiras poliplóides,

21/71 verde fluorescente, acetiltransferase, preferivelmente, entretanto, os marcadores de resistência não-antibióticos são usados, como marcadores auxotróficos (URA3, TRPI, LEU2) ou o gene TPI de S. pombe (descrito por Russell P R, 1985, Gene 40: 125-13 0) . Em uma modalidade preferida, as células hospedeiras transformadas com os constructos de ácido nucleico são isentas de genes marcadores. Métodos para construir células hospedeiras microbianas livres de genes marcadores recombinantes são revelados em EP-A-0 635 574 e são baseados no uso de marcadores bidirecionais como o gene de A. nidulans amdS (acetamidase) ou os genesURA3 e LYS2 de leveduras.

Alternativamente, um marcador rastreãvel como a proteína lacL, luciferase, cloranfenicol beta-glucuronidase podem ser incorporados nos constructos de ácido nucleico da invenção, permitindo a varredura de células transformadas.

Elementos adicionais opcionais que podem estar presentes nos constructo de ácido nucleico adequados para uso na invenção incluem, mas não estão limitados, a uma ou mais sequências líderes,intensificadores, fatores de integração e/ou genes repórteres, sequências de íntron, centrômeros, telômeros e/ou sequências de ligação à matriz (MAR) . Os constructos de ácido nucleico a invenção podem ainda compreender uma sequência para a replicação autonômica, como uma sequência ARS.

Preferivelmente, a xilose isomerase é expressa no citosol. A expressão citosólica pode ser conseguida pela eliminação ou modificação de um sinal de alvejamento mitocondrial ou peroxissômico.

Uma célula da invenção pode ser qualquer célula

22/71 adequada, como uma célula procariótica, como uma bactéria, ou uma célula eucariótica. Tipicamente, a célula será uma célula eucariótica, por exemplo, uma levedura ou um fungo filamentoso.

Leveduras são aqui definidas como microorganismos eucarióticos e incluem todas as espécies da subdivisão Eumycotina (Alexopoulos, C. J. ,1962, em: Introductory Mycology, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque) que crescem predominantemente na forma unicelular.

Leveduras podem ou crescer pelo brotamento de um talo unicelular ou podem crescer por fissão do organismo. Uma levedura preferida como uma célula da invenção pode pertencer aos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces ou Yarrowia. Preferivelmente, a levedura é uma capaz de efetuar fermentação anaeróbia, mais preferivelmente uma capaz de efetuar fermentação alcoólica

anaeróbica.
Fungos filamentosos	são	aqui definidos	como
microorganismos eucarióticos	que	incluem todas as formas
filamentosas da subdivisão	Eumycotina. Esses fungos	são
caracterizados por um micélio	vegetativo composto	de

quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos.

Os fungos filamentosos adequados para uso como uma célula da presente invenção são morfologicamente, fisiologicamente e geneticamente distintos das leveduras. Células fúngicas filamentosas podem ser vantajosamente usadas, uma vez que a maioria dos fungos não requer condições estéreis para a propagação e são insensíveis às infecções por bacteriófagos. O crescimento vegetativo por

23/71 fungo filamentoso é por alongamento de hifa e o catabolismo de carbono da maioria dos fungos filamentosos é obrigatoriamente aeróbico. Fungos filamentosos preferidos como uma célula hospedeira da invenção podem pertencer aos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremoniurra, Fusarium ou Penicillium. Mais preferivelmente, as células fúngicas filamentosas podem ser uma célula de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, a Penicillium chrysogenum, ou Rhizopus oryzae.

Com o passar dos anos, sugestões foram feitas para a introdução de vários organismos para a produção de bioetanol a partir de açúcares de safra. Na prática, entretanto, todos os processos de produção de bioetanol principais continuaram a usar as leveduras do gênero Saccharomyces como produtoras de etanol. Isto é devido às muitas características atrativas das espécies de Saccharomyces para processos industriais, isto é, osmotolerância e tolerância ao etanol e alta concentração de ácidos, capacidade de crescimento anaeróbico e, é claro, sua alta capacidade fermentativa alcoólica. Espécies de leveduras preferidas como células hospedeiras incluem S. cerevisiae, S. bulderi, S. barnetti, S. exiguus, S. uvarum, S. diastaticus, K. lactis, K. marxianus ou K fragilis.

Uma célula da invenção pode ser também capaz de converter biomassa vegetal, celuloses, hemiceluloses, pectinas, ramnose, galactose, fucose, maltose, maltodextrinas, ribose, ribulose ou amido, derivados do amido, sacarose, lactose e glicerol, por exemplo, em açúcares fermentáveis. Deste modo, uma célula da invenção pode expressar uma ou mais enzimas como celulase (uma

24/71 endocelulase ou uma exocelulase), uma hemicelulase (uma endo ou exoxilanase ou arabinase) necessárias para a conversão de celulase em monômeros de glicose e hemicelulose em monômeros de xilose e arabinose, uma pectinase capaz de converter pectinas em ácido glucurônico e ácido galacturônico ou uma amilase para converter amido em monômeros de glicose.

Uma célula da invenção é preferivelmente um hospedeiro capaz de transportar xilose ativamente ou passivamente na célula.

Preferivelmente, uma célula a invenção:

é capaz de efetuar glicose ativa; e/ou apresenta um fluxo através da via pentose fosfato;

e/ou apresenta atividade da xilulose quinase de modo que a xilulose isomerizada de xilose possa ser metabolizada em piruvato.

A célula ainda preferivelmente compreende aquelas atividades enzimáticas necessárias para a conversão de piruvato em um produto de fermentação desejado, como etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico ou uma cefalosporina.

Uma célula preferida da invenção é uma célula que é naturalmente capaz de efetuar fermentação alcoólica, preferivelmente fermentação alcoólica anaeróbica. Uma célula da invenção preferivelmente tem alta tolerância ao etanol, uma alta tolerância a pH baixo (isto é, capaz de

25/71 crescer em um pH mais baixo do que cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3 ou cerca de 2,5) e para ácidos orgânicos como ácido lático, ácido acético ou ácido fórmico e/ou produtos de degradação de açúcar como furfural e hidroximetilfurfural e/ou uma alta tolerância às temperaturas elevadas.

Qualquer uma das características ou atividades acima de uma célula da invenção pode estar naturalmente presente em uma célula ou pode ser introduzida ou modificada por modificação genética.

A sequência de nucleotídeos codificando uma xilose isomerase é tipicamente expressa ou é capaz de ser expressa na forma ativa na célula hospedeira transformada. Deste modo, a expressão da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira produz uma xilose isomerase ativa, tipicamente com uma atividade específica de pelo menos cerca de 10 U de atividade de xilose isomerase por mg de proteína a cerca de 3 0 °C, preferivelmente pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 3 00, pelo menos cerca de 5 00, pelo menos cerca de 750 ou pelo menos cerca de 1000 U por mg a cerca de 30 °C. A atividade específica da xilose isomerase expressa na célula hospedeira transformada é aqui definida como a quantidade de unidades de atividade de xilose isomerase por mg de proteína do lisato livre de células da célula hospedeira, por exemplo, um lisato livre de células de levedura. A determinação da atividade da xilose isomerase, quantidade de proteína e a preparação do lisato livre de células são conforme aqui descrito.

26/71 a(s) modificação levar a um fluxo

Preferivelmente, a expressão da sequência de nucleotídeos codificando a xilose isomerase na célula hospedeira produz uma xilose isomerase com K_m para xilose menor do que 50, 40, 30 ou 25 mM, mais preferivelmente, o K_m para a xilose é de cerca de 20 mM ou menos.

Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentem o fluxo da via da pentose fosfato. Particularmente, (modificações) genética(s) pode(m) aumentado através da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato. Uma modificação genética que causa um fluxo aumentado da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato é aqui compreendida como significando uma modificação que aumenta o fluxo por pelo menos um fator de cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 em comparação com o fluxo em uma cepa a qual é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética que causa o fluxo aumentado. O fluxo da parte nãooxidativa da via da pentose fosfato pode ser medido pelo crescimento de hospedeiro modificado em xilose como a única fonte de carbono, determinando a taxa de consumo de xilose específica, se qualquer xilitol for produzido. Entretanto, o fluxo da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato é proporcional à taxa de crescimento de xilose como a única fonte de carbono, preferivelmente com uma taxa de crescimento anaeróbico na xilose como a única fonte de carbono. Existe uma relação linear entre a taxa de crescimento na xilose como a única fonte de carbono (gmax) e o fluxo da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato. A taxa de consumo de xilose específica (Q_s) é igual à taxa

27/71 de crescimento (μ) dividido pelo rendimento da biomassa no açúcar (Y_xs) porque o rendimento da biomassa no açúcar é constante (sob um dado conjunto de condições: anaeróbico, meio de crescimento, pH, antecedente genético da cepa, etc.,· isto é, Q_s = μ/Yxs) · Consequentemente, o fluxo aumentado da parte não-oxidativa da via da pentose fosfato pode ser deduzido do aumento na taxa de crescimento máximo sob essas condições, exceto o transporte (absorção é limitante).

Uma ou mais modificações genéticas que aumentam o fluxo da via da pentose fosfato podem ser introduzidas na célula hospedeira de várias formas. Essas incluindo, por exemplo, alcançar níveis de atividade de estado constante mais altos de xilulose quinase e/ou uma ou mais das enzimas da parte não-oxidativa da via pentose fosfato e/ou um nível de estado constante reduzido da atividade aldose redutase não-específica. Essas mudanças nos níveis de atividade de estado constante podem ser efetuadas pela seleção de mutantes (espontâneo ou induzido por substâncias químicas ou radiação) e/ou por tecnologia de DNA recombinante, por exemplo, por superexpressão ou inativação, respectivamente, dos genes codificando as enzimas ou fatores que regulam esses genes.

Em uma célula hospedeira preferida, a modificação genética compreende a superexpressão de pelo menos uma enzima da (parte não-oxidativa da) via pentose fosfato. Preferivelmente, a enzima é selecionada do grupo consistindo das enzimas que codificam a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Várias combinações de enzimas da (parte não28/71 oxidativa) da pentose fosfato podem ser expressas. Por exemplo, as enzimas que são superexpressas podem ser pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e ribulose-5fosfato epimerase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5fosfato isomerase e transcetolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase; o pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, transcetolase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transaldolase; ou pelo menos as enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase e transcetolase. Em uma modalidade da invenção, cada uma das enzimas ribulose-5fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase são superexpressas na célula hospedeira. É mais preferida uma célula hospedeira na qual a modificação genética compreende pelo menos a superexpressão de ambas as enzimas transcetolase e transaldolase, uma vez que tal célula hospedeira já é capaz do crescimento aneróbico com xilose. De fato, sob algumas condições, as células hospedeiras superexpressndo somente a transcetolase e a transaldolase já têm a mesma taxa de crescimento anaeróbico na xilose que as células hospedeiras que superexpressam todas as quatro enzimas, isto é, a ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase. Além disso, as células

29/71 hospedeiras superexpressando ambas as enzimas ribulose-5fosfato isomerase e ribulose-5-fosfato epimerase são preferidas em relação às células hospedeiras superexpressando somente a isomerase ou somente a epimerase como superexpressão de somente uma das enzimas podem produzir desequilíbrios metabólicos.

A enzima ribulose-5-fosfato epimerase (EC 5.1.3.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a epimerização de D-xilulose-5-fosfato em D-ribulose-5-fosfato e vice versa. A enzima também é conhecida como fosforribulose epimerase; eritrose-4-fosfato isomerase; fosfocetopentose3-epimerase; xilulosefosfato-3-epimerase; fosfocetopentose epimerase; ribulose-5-fosfato-3-epimerase; Dribulosefosfato-3-epimerase; D-ribulose-5-fosfato epimerase; D-ribulose-5-P-3-epimerase; D-xilulose-5fosfato-3-epimerase; pentose-5-fosfato-3-epimerase; ou Dribulose-5-fosfato-3-epimerase. Uma ribulose-5-fosfato epimerase pode ser ainda definida pela sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma, uma ribulose-5-fosfato epimerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos codificando a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos hibridizando uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma ribulose-5fosfato epimerase. A sequência de nucleotídeos codificando uma ribulose-5-fosato-epimerase é aqui designada RPE1.

A enzima ribulose-5-fosfato epimerase (EC 5.3.1.6) é aqui definida como uma enzima que catalisa a isomerização direta de D-ribose-5-fosfato em D-ribulose-5-fosfato e vice versa. A enzima também é conhecida como fosfopentosisomerase; fosforriboisomerase; ribose fosfato

30/71 isomerase; 5-fosforribose isomerase; D-ribose-5-fosfato isomerase; D-ribose-5-fosfato cetol-isomerase; ou D-ribose5-fosfato aldose-cetose-isomeraseUma ribulose-5-fosfato isomerase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma, uma ribulose-5fosfatoisomerase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos codificando a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos hibridizando a uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma ribulose-5fosfato isomerase. A sequência de nucleotídeos codificando a ribulose-5-fosfato isomerase é aqui designada RPI1.

A enzima transcetolase (EC 2.2.1.1) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: D-ribose-5-fosfato + D-xilulose-5-fosfato <-> sedoeptulose-7-fosfato + Dgliceraldeído-3-fosfato e vice versa. A enzima também é conhecida como glicolaldeidotransferase ou sedoeptulose-7 fosfato:D-gliceraldeído-3- fosfato glicolaldeidotransferase. Uma transcetolase pode ser ainda definida por seu aminoácido. Da mesma forma, uma transcetolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos codificando a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos hibridizando a uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma transcetolase. A sequência de nucleotídeos codificando uma transcetolase é aqui designada TKL1.

A enzima transaldolase (EC 2.2.1.2) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação: sedoeptulose-7fosfato + D-gliceraldeído-3-fosfato <-> D-eritrose-4-fosfato + D-frutose-6 -fosfato e vice versa. A enzima também é conhecida como diidroxiacetonatransferase; diidroxiacetona sintase; formaldeído transcetolase; ou sedoeptulose-731/71 fosfato:D-gliceraldeído-3-fosfato gliceronatransferase. Uma transaldolase pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma, uma^; transaldolase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos codificando a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos hibridizando a uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma transaldolase. A sequência de nucleotídeos codificando uma transcetolase é aqui designada TAL1.

Várias formas são conhecidas pelas pessoas versadas na técnica para a expressão e superexpressão de enzimas em uma célula da invenção. Particularmente, uma enzima pode ser superexpressa pelo aumento da quantidade de cópias do gene que codifica a enzima na célula hospedeira, por exemplo, pela integração de cópias adicionais do gene no genoma da célula hospedeira, pela expressão do gene de um vetor de expressão de múltiplas cópias epissomais ou pela introdução de um vetor de expressão epissomal que compreende múltiplas cópias do gene.

Alternativamente, a superexpressão das enzimas nas células hospedeiras da invenção pode ser conseguida pelo uso e um promotor que não seja ativo na sequência codificando para a enzima a ser superexpressa, isto é, um promotor que seja heterólogo à sequência codificadora à qual é operativamente ligada. Embora o promotor preferivelmente seja heterólogo à sequência codificadora à qual ele está operativamente ligado, também é preferível que o promotor seja homólogo, isto é, endógeno à célula hospedeira. Preferivelmente, o promotor heterólogo é capaz de produzir um nível de estado constante mais elevado do transcrito compreendendo a sequência codificadora (ou seja

32/71 capaz de produzir mais moléculas i de transcrito, isto é, moléculas de RNAm, por unidade de tempo) do que é o promotor que é natural á sequência codificadora, preferivelmente sob condições onde xilose ou xilose e glicose são disponíveis como fontes de carbono, mais preferivelmente como fontes de carbono principais (isto é, mais de 50% da fonte de carbono disponível consiste de xilose ou xilose e glicose), mais preferivelmente como únicas fontes de carbono. Promotores adequados neste contexto incluem promotores naturais tanto constitutivos quando induzíveis, assim como promotores manipulados. Um promotor preferido para uso na presente invenção irá, além disso, ser insensível à repressão do catabólito (glicose) e/ou não irá preferivelmente requerer xilose para indução. Promotores com essas características são amplamente disponíveis e conhecidos para a pessoa versada na técnica. Exemplos adequados de tais promotores incluem, por exemplo, promotores dos genes glicolíticos, como promotores da fosfofrutoquinase (PEFK), triose fosfato isomerase (TPI), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD, TDH3 ou GAPDH), piruvato quinase (PYK), fosfoglicerato quinase (PGK) de leveduras ou fungos filamentosos; mais detalhes acerca de tais promotores de levedura podem ser encontrados em (WO 93/03159). Outros promotores úteis são promotores de genes codificando a proteína ribossomal, o promotor do gene da lactase (LAC4), os promotores de álcool desidrogenase (ADHI, ADH4, e semelhantes), e o promotor da enolase (ENO). Outros promotores tanto constitutivos quanto induzíveis, e intensificadores das sequências ativadoras à montante serão conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Os promotores

33/71 usados nas células hospedeiras da invenção podem ser modificados, caso seja desejado, para afetar as suas características de controle.

A sequência codificadora usada para a superexpressão das enzimas mencionadas acima pode ser preferivelmente homóloga à célula hospedeira da invenção. Entretanto,sequências codificadoras que são heterólogas à célula hospedeira da invenção podem ser usadas.

A superexpressão de uma enzima, ao se referir à produção da enzima em uma célula hospedeira geneticamente modificada, significa que a enzima é produzida em um nível de atividade enzimática específica mais alto em comparação com a célula hospedeira não-modificada sob condições idênticas. Geralmente, isto significa que a proteína enzimaticamente ativa (ou proteínas, no caso de enzimas com várias subunidades) é produzida em maiores quantidades, ou então em um nível de estado constante maior em comparação com a célula hospedeira não-modifiçada sob condições idênticas. Semelhantemente, isto comumente significa que o RNAm codificando a proteína enzimaticamente ativa é produzido em maiores quantidades, ou novamente então em um nível de estado constante maio em comparação com a célula hospedeira não-modifiçada sob condições idênticas. A superexpressão de uma enzima é, deste modo, preferivelmente determinada pela medição do nível de atividade específica da enzima na célula hospedeira usando ensaios enzimáticos apropriados conforme aqui descrito. Alternativamente, a superexpressão da enzima pode ser determinada indiretamente pela quantificação do nível de estado constante específico da proteína enzimática, por exemplo, usando anticorpos

34/71 específicos para a enzima, ou pela quantificação do nível constante específico do RNAm codificando a enzima. O último pode ser particularmente adequado para enzimas da via pentose fosfato para a qual os ensaios enzimáticos não são facilmente executáveis, uma vez que substratos para as enzimas não são comercialmente disponíveis. Preferivelmente em uma célula hospedeira da invenção, uma enzima a ser superexpressa é superexpressa por um fator de pelo menos cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 5, cerca de 10 ou cerca de 20 em comparação com uma cepa a qual é geneticamente idêntica, exceto pela modificação genética que causa a superexpressão. É para ser compreendido que esses níveis de superexpressão podem se

aplicar ao	nível	e	estado	constante	da atividade
enzimática, o	nível	de	estado	constante	da proteína	da
enzima, assim	como	ao	nível	de estado	constante	do
transcrito que	codifica a	enzima.

Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que aumentam a atividade da xilulose quinase específica. Preferivelmente, a modificação ou modificações genéticas causam a superexpressão de uma xilulose quinase, por exemplo, pela superexpressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma xilulose quinase. O gene que codifica a xilulose quinase pode ser endógeno à célula hospedeira ou pode ser uma xilulose quinase que é heteróloga à célula hospedeira. Uma sequência de nucleotídeos usada para a superexpressão da xilulose quinase na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade da xilulose quinase.

35/71

A enzima xilulose quinase: (EC 2.7.1.17) é aqui definida como uma enzima que catalisa a reação ATP + Dxilulose = ADP + D-xilulose-5-fosfato. A enzima é também conhecida como uma xiluloquinase fosforiladora, Dxiluloquinase ou ATP:D-xilulose-5-fosfotransferase. Uma xilulose quinase da invenção pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácido. Da mesma forma, uma xilulose quinase pode ser definida por uma sequência de nucleotídeos codificando uma enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos hibridizando a uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma xilulose quinase.

Em uma célula da invenção, uma modificação ou modificações genéticas que aumenta(m) a atividade da xilulose quinase específica pode ser combinada com qualquer uma das modificações que aumentam o fluxo da via pentose fosfato conforme aqui descrito. Entretanto, isto não é essencial.

Deste modo, uma célula hospedeira da invenção pode compreender somente uma modificação genética ou modificações que aumentem a atividade da xilulose quinase específica. As várias formas disponíveis na técnica para alcançar e analisar a superexpressão de uma xilulose quinase nas células hospedeiras da invenção são as mesmas descritas acima para as enzimas da via pentose fosfato. Preferivelmente nas células hospedeiras da invenção, uma xilulose quinase a ser superexpressa é superexpressa por pelo menos um fator de cerca de 1,1, de cerca de 1,2, de cerca de 1,5, de cerca de 2, de cerca de 5, de cerca de 10 ou de cerca de 2 0 em comparação com uma cepa a qual é geneticamente idêntica, exceto pela(s) modificações

36/71 genéticas que causam a superexpressâo. É para ser compreendido que estes níveis de superexpressâo podem se aplicar ao nível de estado constante da atividade da enzima, o nível de estado constante da proteína da enzima, assim como o nível de estado constante do transcrito que codifica a enzima.

Uma célula da invenção pode compreender uma ou mais modificações genéticas que reduzem a atividade da aldose redutase inespecífica na célula hospedeira. Preferivelmente, a atividade da aldose redutase inespecífica é reduzida na célula hospedeira por uma ou mais modificações genéticas que reduzem a expressão de ou inativam um gene que codifica uma aldose redutase inespecífica. Preferivelmente, a(s) modificação/ modificações genética(s) reduz(em) ou inativa(m) a expressão de cada cópia endógena de um gene que codifica uma aldose redutase inespecífica na célula hospedeira. Células hospedeiras pode(m) compreender múltiplas cópias dos genes que codificam as aldose redutases inespecíficas como resultado de di, poli ou aneuploidia, e/ou a célula hospedeira pode conter várias (iso)enzima(s) diferente(s)_ com atividade aldose redutase que diferem na sequência de aminoácidos que são cada uma codificadas por um gene diferente. Também em tais exemplos, preferivelmente a expressão de cada gene que codifica uma aldose redutase inespecífica é reduzida ou inativada. Preferivelmente, o gene é inativado por eliminação de pelo menos parte do gene ou por rompimento do gene, por meio do que, neste contexto, o termo gene também inclui qualquer sequência nãocodificadora à montante ou à jusante da sequência

37/71 codificadora, a eliminação ou inativação (parcial) da qual resultando em uma redução da expressão da atividade aldose redutase inespecífica na célula hospedeira.

Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma aldose redutase cuja atividade é para ser reduzida na célula hospedeira da invenção é uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo com atividade aldose redutase.

Nas células hospedeiras da invenção, modificação genética que reduz a atividade aldose redutase inespecífica na célula hospedeira pode ser combinada com qualquer uma das modificações que aumenta o fluxo da via pentose fosfato e/ou com qualquer uma das modificações que aumenta a atividade da xilulose quinase específica nas células hospedeiras, como descrito acima. Entretanto, isto não é essencial.

Deste modo, uma célula hospedeira da invenção compreendendo somente uma modificação ou modificações genética(s) a(s) qual/quais reduz(em) a atividade da aldose redutase inespecífica na célula hospedeira é especificamente incluída na invenção.

A enzima aldose redutase (EC 1.1.1.21) é aqui definida como qualquer enzima que seja capaz de reduzir a xilose ou xilulose em xilitol. No contexto da presente invenção, uma aldose redutase pode ser qualquer aldose redutase inespecífica que seja natural (endógena) a uma célula hospedeira da invenção e que seja capaz de reduzir xilose ou xilulose em xilitol. Aldoses redutases inespecíficas catalisam a reação:

aldose + NAD(P)H + H⁺ <-> alditol + NAD(P) ⁺

A enzima tem uma ampla especificidade e também é

38/71 conhecida como aldose redutase; poliol desidrogenase (NADP⁺) ; alditol:NADP oxidorredutase; alditol:NADP⁺ 1oxidorredutase; NADPH-aldopentose redutase; ou NADPH-aldose redutase.

Um exemplo particular de tal aldose redutase inespecífica que é endógena à S. cerevisiae e que é codificada pelo gene GRE3 (Traff et al. , 2001 , Appl. Environ. Microbiol. 67: 5668-74) . Deste modo, uma aldose redutase da invenção pode ser ainda definida por sua sequência de aminoácidos. Da mesma forma, uma aldose redutase pode ser definida pelas sequências de nucleotídeo codificando a enzima, assim como por uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com uma sequência de nucleotídeos de referência codificando uma aldose redutase.

Uma célula da invenção pode ser adaptada ao uso da xilose pela seleção de mutantes, seja espontaneamente ou de modo induzido (por exemplo, por radiação ou substâncias químicas), para crescimento na xilose, preferivelmente na xilose como única fonte de carbono, e mais preferivelmente sob condições anaeróbicas. A seleção de mutantes pode ser efetuada por técnicas incluindo passagem em série de culturas como, por exemplo, descrito por Kuyper et al. (2004, FEMS Yeast Res. 4: 655-664), ou pelo cultivo sob pressão seletiva em uma cultura quimiostática. Em uma célula hospedeira preferida da invenção, pelo menos uma das modificações genéticas descritas acima, incluindo modificações obtidas pela seleção de mutantes, confere à célula hospedeira a capacidade de crescer em xilose como fonte de carbono, preferivelmente como a única fonte de carbono, e preferivelmente sob condições anaeróbicas.

39/71

Preferivelmente, a célula hospedeira modificada não produz essencialmente xilitol, por exemplo, o xilitol produzido está abaixo do limite de detecção de, por exemplo, menos de cerca de 5, cerca de 2, cerca de 1, cerca de 0,5 ou cerca de 0,3% do carbono consumido em base molar.

Uma célula da invenção pode ter a capacidade de crescer em xilose como a única fonte de carbono em uma taxa de pelo menos cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,25 ou cerca de 0,3 h¹ sob condições aeróbicas ou, caso aplicável, em uma taxa de pelo menos cerca de 0,03, cerca de 0,05, cerca de 0,07, cerca de 0,08, cerca de

0,09, cerca de 0,1, cerca de 0,12, cerca de 0,15 ou cerca de 0,2 h¹ sob condições anaeróbicas. Preferivelmente, a célula hospedeira modificada tem a capacidade de crescer em uma mistura de glicose e xilose (em uma proporção em peso de 1:1) como a única fonte de carbono em uma taxa de pelo menos cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,2, cerca de 0,25 ou cerca de 0,3 h¹ sob condições aeróbicas ou, caso aplicável, em uma taxa de pelo menos cerca de 0,03, cerca de 0,05, cerca de 0,1, cerca de 0,12, cerca de 0,15 ou cerca de 0,2 h¹ sob condições anaeróbicas.

Uma célula da invenção pode ter uma taxa de consumo de xilose específica de pelo menos cerca de 200, cerca de 250, cerca de 300, cerca de 346, cerca de 350, cerca de 400, cerca de 500, cerca de 600, cerca de 750, ou cerca de 1000 mg de xilose/g de células/h. Uma célula da invenção pode ter um rendimento de produto de fermentação (como etanol) em xilose que seja de pelo menos cerca de 40, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95 cerca de 98 ou cerca de 99%

40/71 do rendimento da célula hospedeira do produto de fermentação (como etanol) em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento de um produto de fermentação (como etanol) de uma célula da invenção em xilose pode ser igual ao rendimento da célula do produto de fermentação (como etanol) em glicose. Da mesma forma, o rendimento de biomassa celular em xilose pode ser de pelo menos cerca de 40, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 95, cerca de 98 ou cerca de 99% do rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. Mais preferivelmente, o rendimento de biomassa celular em xilose pode: ser igual ao rendimento de biomassa da célula hospedeira em glicose. É compreendido que na comparação dos rendimentos de glicose e xilose, ambos os rendimentos são comparados sob condições aeróbicas ou ambos sob condições anaeróbicas.

Uma célula da invenção pode ser capaz de converter Larabinose em L-ribulose e/ou xilulose-5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo, um daqueles aqui mencionados.

Organismos, por exemplo, cepas de S. cerevisiae, capazes de produzir etanol de L-arabinose, podem ser produzidos pela modificação de uma célula introduzindo o genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser introduzidos em uma célula da invenção para que seja capaz de usara arabinose. Tal abordagem é descrita em W02003/095627. ;

Uma célula da invenção pode ser uma célula adequada para a produção de etanol. Entretanto, uma célula da

41/71 invenção pode ser adequada para a jprodução de produtos de fermentação diferentes de etanol. Tais produtos de fermentação não-etanólicos incluem, a princípio, qualquer massa de substância química fina que seja produzível por um microorganismo eucariótico como uma levedura ou fungo filamentoso.

Tais produtos de fermentação podem ser, por exemplo, butanol, ácido lãtico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico itacônico, um glicerol, um ácido málico, ácido fumárico, : ácido aminoácido 1,3-propanodiol, etileno, antibiótico β-lactama ou uma cefalosporina. Uma célula hospedeira modificada preferida da invenção para a produção de produtos de fermentação não-etanólicos é uma célula hospedeira que contém uma modificação genética que resulta na atividade da álcool desidrogenase reduzida.

Em um outro aspecto, a invenção se refere aos processos de fermentação nos quais as célula hospedeiras modificadas da invenção são usadas para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo uma fonte de xilose, como xilose. Além de uma fonte de xilose, a fonte de carbono no meio de fermentação pode também compreender uma fonte de glicose. A fonte de xilose ou glicose pode ser xilose ou glicose como tal, ou pode ser qualquer oligocarboidrato ou polímero compreendendo unidades de xilose ou glicose, como por exemplo, lignocelulose, xilanose, celulose, amido e semelhantes. Para liberação de unidades de xilose ou glicose ; de tais carboidratos, carboidrases apropriadas (como xilanases, glucanases, amilases e semelhantes) podem ser adicionadas ao meio de

42/71 fermentação ou podem ser produzidas pela célula hospedeira modificada. No último caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente manipulada para produzir e excretar tais carboidratos. Uma vantagem adicional do uso de fontes oligo ou poliméricas de glicose é: que ela permite manter uma (mais) baixa concentração de glicose livre durante a fermentação, por exemplo, pelo uso de quantidades limitadoras de índice das carboidrases. Isto, por sua vez, irá evitar a repressão dos sistemas necessário para o metabolismo e transporte de açúcares diferentes de glicose como xilose.

Em um processo preferido,: a célula hospedeira modificada fermenta tanto a xilose quanto a glicose, em cuj o caso preferivelmente simultaneamente, preferivelmente uma célula hospedeira modificada é usada a qual é insensível à repressão de glicose para prevenir o crescimento duplo. Além de uma fonte de xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fermentação irá ainda compreender o ingrediente apropriado necessário para o crescimento da célula hospedeira modificada. Composições do meio de fermentação para o crescimento dos microorganismos como leveduras são bem conhecidas na técnica. O processo de fermentação é um processo para a produção de um produto de fermentação como, por exemplo, etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico, como penicilina G ou penicilina V e derivado fermentativos do mesmos, e uma cefalosporina.

43/71

O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação efetuado na ausência de oxigênio, ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, mais preferivelmente 0 mmol/L/h é consumido (isto é, o consumo de oxigênio não é detectável) , e em que moléculas orgânicas servem tanto como doadoras de elétrons como aceptoras de elétrons. Na ausência de oxigênio NADH produzido na glicólise e formação de biomassa, não podem ser oxidados por fosforilação oxidativa. Para solucionar este problema, muitos microorganismos usam piruvato ou um de seus derivados como um aceptor de elétron e hidrogênio, deste modo regenerando NAD⁺.

Deste modo, em um processo de fermentação anaeróbico preferido, piruvato é usado como um aceptor de elétrons (e hidrogênio) e é reduzido aos produtos de fermentação como etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico ácido cítrico, ácido fumárico, ácido málico, um aminoácido, 1,3propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina.

O processo de fermentação é preferivelmente efetuado em uma temperatura que é ótima para a célula hospedeira modificada. Deste modo, para a maior parte das leveduras ou células hospedeiras fúngicas, o processo de fermentação é efetuado em uma temperatura a qual é menor do que cerca de 4 2 °C, preferivelmente menor do que cerca de 3 8 °C. Para levedura ou células hospedeiras de fungos filamentosos o

44/71 processo de fermentação é preferivelmente efetuado em uma temperatura a qual é menor do que cerca de 35, cerca de 33, cerca de 3 0 ou cerca de 2 8 °C e uma temperatura a qual é maior do que cerca de 20, cerca de 22 ou cerca de 25 °C.

Um processo preferido é um processo para a produção de etanol, por meio do que o processo compreende as etapas de: (a) fermentar um meio contendo uma; fonte de xilose com uma célula hospedeira modificada conforme definido acima, por meio do que a célula hospedeira fermenta xilose em etanol; e opcionalmente, (b) recuperação; do etanol. 0 meio de fermentação pode também compreender uma fonte de glicose que é também fermentada em etanol. No processo, a produtividade de etanol volumétrica é preferivelmente de pelo menos cerca de 0,5, cerca de 1,0, cerca de 1,5, cerca de 2,0, cerca de 2,5, cerca de 3,0, cerca de 5,0 ou cerca de 10,0 g de etanol por litro por hora. O rendimento de etanol em xilose e/ou glicose no processo preferivelmente é de pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 95 ou cerca de 98%. 0 rendimento de etanol é aqui definido como uma porcentagem do rendimento máximo teórico.

A invenção também se refere a um processo para a produção de um produto de fermentação, como um produto selecionado do grupo consistindo de ácido butanol-lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico,; ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina. O processo preferivelmente compreende a fermentação de um meio contendo uma; fonte de xilose com uma

45/71 célula hospedeira modificada conforme definido aqui acima, por meio do que a célula hospedeira fermenta xilose no produto de fermentação. :

A invenção também fornece um processo para produzir um produto de fermentação, como um produto selecionado do grupo consistindo de etanol, butanol, ácido lático, ácido

3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina. O processo compreende preferivelmente a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula conforme: definido acima a qual é capaz de usar tanto xilose quanto L-arabinose, de modo que a célula fermenta xilose e arabinose ao produto de fermentação.

A invenção também fornece um processo para produzir um produto de fermentação, como um produto selecionado do grupo consistindo de etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina. O processo preferivelmente compreende a fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de L-arabinose com uma célula conforme definido acima, e uma célula capaz de usar L-arabinose, por meio do que cada célula fermenta xilose e/ou arabinose ao produto de fermentação.

Um processo da invenção pode também compreender a

46/71 recuperação do produto de fermentação. O meio com o qual o processo é efetuado pode também conter uma fonte de glicose. :

O processo de acordo com a invenção pode ser efetuado sob condições aeróbicas e anaeróbicas. Preferivelmente, o processo é efetuado sob condições: microaerofílicas ou com oxigênio limitado.

Um processo de fermentação anaeróbica é aqui definido como um processo de fermentação efetuado na ausência de oxigênio ou no qual substancialmente nenhum oxigênio é consumido, preferivelmente menos de cerca de 5, cerca de 2,5 ou cerca de 1 mmol/L/h, e em que as moléculas orgânicas servem tanto como aceptoras de elétron quanto como doadoras de elétrons.

Um processo de fermentação de oxigênio limitado é um processo no qual o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada, assim como pelas propriedades de mistura/transferência de massa efetivas do equipamento de fermentação usado. Preferivelmente, em um processo sob condições limitadas :de oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é de pelo menos cerca de 5,5, mais preferivelmente de pelo menos cerca de 6, como de pelo menos 7 mmol/L/h.

Os Exemplos a seguir ilustram a invenção:

EXEMPLOS

A não ser que seja indicado de outra forma, os métodos usados são técnicas bioquímicas padrões. Exemplos de livros texto de metodologia geral adequada incluem Sambrook et

47/71 al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) e Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. ;

Atividade da Xilose Isomerase (conforme determinado nos exemplos 1 e 2) :

A atividade da xilose isomerase pode ser avaliada a 37 °C em uma mistura reacional contendo tampão fosfato 50 mM (pH 7,0), xilose 10 mM, MgCl₂ 10 mM e uma quantidade adequada de extrato isento de células. A quantidade de xilulose formada pode ser determinada pelo método de cisteína-carbazol (Goldstein e McCusker, Yeast 15, 15411553, 1999). Alternativamente, a atividade da xilose isomerase é avaliada a 30 °C usando o ensaio de enzimas de

Kersters-Hildersson et al. (Kinetic characterization of Dxylose isomerases by enzymatic assays using D-sorbitol dehydrogenase. Enz. Microb. Technol. 9 (1987) 145- 148) . A atividade in vitro da xilose isomerase nos extratos isentos de célula de cepas de S. cerevisiae transformadas é dependente dos cátions bivalentes (Mg²⁺ ou Co²⁺) .

Transformação de S. cerevisiae

A transformação de S. cerevisiae foi feita conforme descrito por Gietz e Woods (2002; Transformation of the yeast by the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96).

PCR de colônia

Um isolado de colônia individual foi pego com um palito de dente plástico e ressuspenso em 50 μΒ de água

Milli-Q. A amostra foi incubada por 10 minutos a 99 °C. 5 μΒ da amostra incubada foram usado como molde para a reação de PCR, usando Phuson® DNA polimeráse (Finnzymes) de acordo

48/71 com as instruções Condições de Etapa 1 3'

Etapa 2 10

Etapa 3 15 fornecidas pelo fornecedor. Reação de PCR: ' °C °C °C

Repetir ciclos a etapa 2 a 4 por 30

Etapa 4 30 72 °C

Etapa 5 4' 72 °C

Etapa 6 30 20 °C

Pré-tratamento da amostra ;para determinações da atividade da xilose isomerase (geral aqui e no exemplo 3)

0,5 mL de tampão MOPS 0,1 M (pH 7,5) foi adicionado ao pélete celular de uma cultura de um dia para o outro. As células foram ressuspensas e transferidas para um tubo de Eppendorf de 2 mL o qual já continha 0,5 g de pérolas de vidro com um diâmetro de 0,4 a 0,5 mm. Todas as amostras foram vigorosamente agitadas em um agitador de tubo Eppendorf (IKA VIBRAX-VXR) por 20 min a 4 °C, na velocidade máxima. O extrato foi centrifugado por 5 minutos a 14000 rpm e 4 °C. O sobrenadante, o qual é o extrato isento de células, foi transferido em um tubo Eppendorf novo.

Condições do ensaio do ensaio da atividade da xilose isomerase (geral aqui e como determinado no exemplo 3).

O método a seguir é uma versão modificada do método descrito por Dische-Borenfreud (J. Biol. Chem. (1951) 192, 2, 583-587). Um (1,0) mL da mistura de substrato (MOPS 100 mM pH 7,5, MgCl₂ 10 mM, D-xilose 10 mM) foi misturado com 50 μΕ de extrato isento de células (diluído) , em duplicata em gelo. Subsequentemente, os tubos reacionais foram colocados em um banho e água a 50 °C por 3 0 minutos. Além

49/71 disso, as reações foram efetuadas a 30 °C, também em duplicata. A reação foi interrompida pela colocação dos tubos reacionais em água gelada, seguido pela adição de 0,2 mL de solução de cloridrato de ;L-cisteína monoidratado 1,67% (Merck) . A mistura é a seguir bem misturada submetendo-a ao vórtex. Subsequentemente, 6 mL de solução de H₂SO₄ (190 mL de água com 450 ml de H₂SO₄ concentrado 9597%) foram adicionados, imediatamente seguido por 0,2 mL de carbazol 0,12% (p/v) (Merck), dissolvido em etanol. Esta mistura final foi bem misturada no vórtex e deixada em temperatura ambiente por 6 0 min. Ai absorção é medida a 560 nm usando cubetas plásticas.

D ( + )-f rutose, a qual também é uma cetose, foi usada com referência. Até este ponto, aproximadamente 1000 mg de D-frutose foram pesados com precisão e dissolvidos em tampão MOPs 0,1 M, pH 7,5 em um frasco volumétrico de 50 mL. Uma série de diluições foi feita variando de aproximadamente 2 a 20 qmol/mL. 50 qL dessas soluções de frutose foram usadas no ensaio conforme descrito acima e a absorção a 56 0 nm foi usada para fazer uma curva de calibração. A atividade das amostras foi calculada pela relação da absorvância a 560 nm com a curva de calibração.

A concentração de proteína da amostra foi determinada de acordo com um protocolo modificado pelo método Bradford, usando o Ensaio de Coomassie mais Proteína (Thermo Scientific). A atividade específica da xilose isomerase é expressa como nmol/mg de proteína.min.

Exemplo 1

Expressão da xilose isomerase de Bácteroides uniformis ATCC

8492 em Saccharomyces cerevisiae

50/71

1.1.1 Construção do vetor dè expressão da xilose isomerase

Xilose isomerase [E.C. 4.2.1.2], número de acesso

GenBank AAYH02000036 (SEQ ID NO: 1) de Bacteroides uniformis ATCC 8492 foi analisada em relação ao uso do códon. O uso do códon foi otimizado conforme descrito em WO

2006/077258 e WO 2008/000632 (SEQ ID NO: 2).

O gene de acordo com a SEQ ID NO: 2 foi clonado em frente ao promotor TPI da S. cerevisiae. Para evitar a expressão ineficiente potencial da xilose isomerase, a seguinte sequência foi colocada em frente à sequência codificadora:

ACTAGTAAAAACACATACATAAACTAAAAATG^ mostrando o códon de início sublinhado.

Um sítio de restrição Spel ACTAGT) foi introduzido no promotor TPI-1 constitutivo forte, mudando a sequência TCTTGCTTAAATCTATAACTACAAAAAACACATACATAAACTAAAAATG (promotor TPH original) em

TCTTGCTTAAATCTATAACTAGTAAAAACACATACATAAACTAAAAATG.

Isto permite a operavelmente a ligação da sequência codificadora da xilose isomerase códon-otimizada ao promotor TPI1.

Além disso, o códon de terminação TAA foi mudado em TAAG, o qual é o códon de terminação mais eficiente em leveduras. Sítios de restrição convenientes foram adicionados para facilitar a clonagem. A sequência é sintetizada por GeneARt AG (Regensburg, Alemanha).

O construeto de expressão de levedura final pYISIT4XKSl-xylA (Baun CpO) é estabelecido ma Figura 1.

1.2 Transformação de levedura

51/71

A cepa de S. cerevisiae CEN.PK1 13-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) e um derivado de CEN.PK113-7D, no qual o gene GRE3 foi substituído pelos genes da parte nãooxidativa da via pentose fosfato (ver acima) (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 GRE3 : : [TPIlp-TALl_ADHlpTKLl_PGIlp-RPEl_ENOlp-RKIll]) são transformados com o constructo pYISIT4-XKS1- xylA (Baun CpO) . As misturas de transformação são plaqueadas em Base de Carbono de Levedura (YCB) w/o sulfato de amônio (Difco), KPi 40 mM (pH 6,8) e acetamida 5 mM. Células não-transformadas não podem crescer neste meio.

Os transformantes são caracterizados usando técnicas de PCR e/ou técnicas de Southern blotting.

Exemplo 2

Crescimento de cepas de levedura transformadas em xilose

2.1 Composição do meio

Experimentos de crescimento: Cepas de Saccharomyces cerevisiae crescem em meio com a seguinte composição: 0,67% (p/v) de base de nitrogênio de levedura e glicose, galactose ou xilose, ou uma combinação desses substratos (ver abaixo) . Para placas de agar, o meio é suplementado com agar bacteriológico 2% (p/v).

Produção de etanol: Cultivos de frascos de agitação foram efetuados a 30 °C em meio sintético (Verduyn et al., Yeast 8: 501-517, 1992). O pH do meio foi ajustado para 6,0 com KOH 2 M antes da esterilização. Para o meio sintético sólido,, 1,5% de agar foi adicionado.

Pré-culturas foram preparadas: pela inoculação de 100 mL de meio contendo o açúcar apropriado em um frasco de agitação de 500 mL com uma cultura estoque congelada.

52/71

Depois da incubação a 3 0 °C em um agitador orbital (20 0 rpm), esta cultura foi usada para inocular quaisquer culturas em frasco de agitação. Ò meio sintético para o

cultivo anaeróbico	foi	suplementado	com 0,01 g	1-1 de
ergosterol e 0,42 g	1-1	de Tween 80	dissolvidos em etanol
(Andreasen e Stier.	J.	Cell Physiol	. 41:23-36,	1953; e

Andreasen e Stier. J. Cell Physiol. 43:271- 281, 1954).

2.2 Experimentos de crescimento

A cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D do derivado expressando constitutivaménte o PPP (ver Exemplo 1) , transformado com pYISIT4-XKSl-xylA (Baun CpO), crescem em placas de agar com glicose 2% como fonte de carbono. Quando as colônias são visíveis, colônias individuais são usadas para inocular meio líquido com xilose 100 mM, glicose 100 mM e galactose 100 mM como fontes de carbono, ou combinações das mesmas. 0 crescimento é monitorado pela medição do aumento na densidade ótica a 600 nm em um espectrofotômetro LKB Ultrospec.

2.3 Produção de etanol

A cepa de Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D do derivado expressando constitutivaménte o PPP (ver Exemplo 1) , transformado com pYISIT4-XKSl-xylA (Baun CpO), crescem em placas de agar com glicose 2% como fonte de carbono. Quando as colônias são visíveis, colônias individuais são usadas para inocular meio sintético (Verduyn et al., supra). Misturas de glicose, xilose e galactose são adicionadas ao meio como uma fonte de carbono, variando de 0 a 50 gramas por litro. O crescimento é monitorado pela medição do aumento na densidade ótica a 600 nm em um espectrofotômetro LKB Ultrospec K. A produção de etanol e o

53/71 consumo de açúcar no tempo são monitorados por HPLC e/ou análise de RMN.

Exemplo 3

3.1 Introdução de quatro genes constitutivamente expressos da via pentose fosfato não-oxidativa

Saccharomyces cerevisiae BIE104P1, expressando os genes TAL1, TKL1, RKI1 e RPE1, constitutivamente, foram obtidos pela transformação de CEN.PK1 13-7D [MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) com o plasmídeo pPWT080 (figura 2). Até uma grande extensão, o plasmídeo pPWT080 foi construído pelo uso de DNA sintético, sintetizado por GeneArt AG (Regensburg, Alemanha). A sequência do plasmídeo pPWT080 é estabelecida na SEQ ID NO: 4. em resumo, o plasmídeo pPWT080 consiste da região promotora do gene GRE3, seguido pelos quatro genes PPP TAL1, TKL1, RKI1 e RPE1 sob o controle de promotores constitutivos fortes, e as sequências 3' não-codificadoras do gene GRE3, conforme estabelecido na figura 2. Como marcadores selecionáveis, o gene kanMX que confere resistência ao G418 e o gene amdS de Aspergillus que permite que os transformantes cresçam em acetamida como única fonte de nitrogênio estão presentes neste plasmídeo. Na integração, seguido por recombinação intramolecular, os marcadores são perdidos e a integração deste constructo leva à inativação da região codificadora do gene GRE3 e a superexpressão dos genes TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1.

Antes da transformação de CEN.PK1 13-7D, pPWT080 foi linearizado usando a enzima de restrição Sfil (New England

Biolabs), de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor. Misturas de transformação foram plaqueadas em

54/71

YPD (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de agar) contendo 100 pg deÍG418 (Sigma Aldrich) por mL.

Depois de dois a quatro dias: as colônias apareceram nas placas, enquanto que o controle negativo (isto é, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas YPD/G418 em placas YPD/G418 vazias.

A integração do plasmideo pPWT080 é direcionada ao locus GRE3. O transformantes foram caracterizados usando técnicas de PCR e de Southern blotting.

Reações de PCR, as quais são indicativas para a integração correta de uma cópia do plasmideo pPWTOSO, foram efetuadas com os iniciadores indicados pela SEQ ID 5 e 6, e 6 e 7 (ver figura 3). Com os pares de iniciadores da SEQ ID 5 e 6, a integração correta e o locus GRE-3 foram verificados. Se o plasmideo pPWT080 fosse integrado em várias cópias (integração cabeça-cauda), o par de iniciadores da SEQ ID NO 6 e 7 fornecerá um produto de PCR. Se o último produto de PCR estiver ausente, isto é indicativo de uma integração de uma cópia.

Para verificar a correta integração de uma cópia nos transformantes identificados como tais usando a técnica de

PCR descrita acima, uma análise de Southern blot foi efetuada. Até este ponto, o DNA cromossomal foi isolado da cepa tipo selvagem CEN.PK113-7D e os transformantes usando técnicas de biologia molecular padrões. O DNA cromossomal foi digerido com as enzimas de restrição Xcml e Psil, submetidos à eletroforese em um gel· de agarose 0,7% e o DNA foi transferido para uma membrana de náilon (Hybond N+,

55/71

Amersham Pharmacia Biotech) de acordo com as instruções do fabricante.

Como uma sonda para detectar :a correta integração do plasmídeo pPWT080, uma sonda derivada do gene RKI1, presente no plasmídeo pPWT080, foi usada. A sonda foi feita pelo uso dos iniciadores da SEQ ID NO 9 e 10 e o plasmídeo pPWT080 como um molde. A marcação da sonda e os subsequentes procedimentos de hibridização e lavagem foram efetuados conforme sugerido pelo fornecedor do sistema de Marcação e Detecção Direta ECL (GE Life Sciences).

O autorradiograma, conforme apresentado na figura 4, mostra a correta integração de uma cópia do plasmídeo pPWT080, de acordo com o padrão de hibridização esperado conforme pode ser deduzido a partir da figura 3 (quadro c). A cepa foi designada BIE104F1.

Para ser capaz de introduzir os genes codificando a xilose isomerase e a xiluloquinase (seção 3.2), é necessário remover os marcadores de seleção introduzidos pela integração do plasmídeo pPWT080. O design do plasmídeo pPWT080 foi tal que na integração de pPWT080 no cromossomo, as sequências homólogas estão em íntima proximidade entre si. Este design permite que marcadores selecionáveis sejam pedidos por recombinação intramolecular espontânea dessas regiões homólogas. A remoção dos marcadores da cepa resulta em uma cepa isenta de marcador que é mais estável no seu uso do que uma cepa contendo marcadores. Mais especificamente, a região promotora do gene GRE3 e a região não-codificadora 3' do gene GRE3 são duplicadas depois da integração de uma cópia de pPWT08 0 no local GRE3 de S. cerevisiae. No crescimento vegetativo, a recombinação

56/71 intramolecular irá ocorrer, embora: em baixa frequência. A frequência desta recombinação depende do comprimento da homologia e do locus no genoma (resultados não-publicados). Na transferência sequencial de uma subfração da cultura para o meio fresco, o recombinantes intramoleculares irão se acumular no decorrer do tempo.

Até este ponto, a cepa BIE104F1 foi cultivada em glicose YPD-2%, iniciando de um isolado de colônia. 25 pL de uma cultura de um dia para o ; ouro foram usados para inocular meio de glicose YPD-2% fresco. Depois de cinco transferências em série, a densidade ótica da cultura foi determinada e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5000 por mL. 100 pL da suspensão de células foram plaqueados em meio de base de carbono de levedura (Difco) contendo KPi 30 mM (pH 6,8), (NH₄)₂SO₄ 0,1%, fluoracetamida 4 0 mM (Amersham) e 1,8% de agar (Difco) . As células idênticas às células da cepa BIE104F1, isto é, sem recombinação intracelular, ainda contêm o gene amdS. Para aquelas células, a fluoracetamida é tóxica. Essas células não serão capazes de crescer e não formarão colônias em um meio contendo fluoracetamida.

Entretanto, se a recombinação intramolecular ocorreu, variantes BIE104F1 que perderam o marcadores selecionáveis serão capazes de crescer no meio de; fluoracetamida, uma vez que elas são incapazes de converter fluoracetamida em compostos inibidores de crescimento. Aquelas células irão formar colônias neste meio agar.

As colônias resistentes à fluoracetamida obtidas foram submetidas à análise de PCR usando os iniciadores da SEQ ID 5 e 6, 7 e 8. Os iniciadores da SEQ ID 5 e 6 fornecerão uma

57/71 banda se a recombinação dos marcadores selecionáveis ocorreu conforme tencionado, conforme estabelecido na figura 5. Como resultado, a região codifícadora do gene GRE3 é substituída pelos quatro genes TKL1, TAL1, RKI1 e RPE1. Naquele caso, uma reação de PR usando iniciadores da SEQ ID 7 e 8 não deve resultar em um produto de PCR, uma vez que o iniciador 7 inicia em uma região que deve ser recombinada externa (ver figura 3, quadro b). Se uma banda for obtida com esses iniciadores, isto é indicativo para a presença do plasmídeo completo pPWT080 no genoma, de modo que nenhuma recombinação tenha ocorrido.

Se os iniciadores da SEQ ID 5 e 6 não resultam em um produto de PCR, a recombinação ocorreu, porém de tal forma que o plasmídeo completo pPWT080 tenha se recombinado fora do genoma. Não somente os marcadores selecionáveis foram perdidos, mas também os quatro genes PPP. De fato, levedura tipo selvagem foi recuperada.

Isolados que exibiram os resultados de PCR esperados foram submetidos à análise de Southern blot (ver acima). O resultado é apresentado na figura 4. Uma das cepas que apresentou o padrão correto de bandas do Southern blot (conforme pode ser deduzido da figura 3) é a cepa designada como BIE104P1.

3.2 Introdução de genes constitutivamente expressos codificando a xilose isomerase e a xiluloquinase

O plasmídeo pYISIT4-XKSl-xylA (Baun CpO), conforme estabelecido na figura 1, foi melhorado para permitir a seleção de G418 dos transformantes. Até este ponto, uma inserção de 4 63 0 pb contendo o gene xylA sob controle do promotor TPI1 e o gene XKS1 sob o controle do promotor TDH1

58/71 foi cortada do plasmídeo pYISIT4-XKSl-xylA (Baun) (figura 1) usando as enzimas de restrição MluI e SacII.

O plasmídeo pYI#SIT4, conforme estabelecido na figura 6, foi digerido com a enzima de restrição Acc65I.

O marcador de resistência ; â canamicina (kanMX) presente no plasmídeo p427TEF (Dualsystems Biotech AG) , permitindo a seleção em E. coli (canamicina) e S. cerevisiae (G418) foi isolado por PCR usando os iniciadores da SEQ ID 11 e 12. A sequência do; iniciador da SEQ ID 12 foi projetada de tal forma que o sítio MluI no fragmento kanMX foi perdido, o que mantém o sítio MluI no plasmídeo resultante (pPWT007, ver abaixo) único. O produto de PCR foi subclonado no vetor pCRII-TOPO usando o kit de clonagem de PCR Zero Blunt® TOPO para subclonagem (Invitrogen) . Os clones corretos foram usados para cortar o marcador de resistência à kanMX usando a enzima de restrição Acc65I. A ligação deste fragmento com o plasmídeo digerido pYI#SIT4 resultou em pPWT007, o qual é estabelecido na figura 7.

plasmídeo pPWT007, o qual foi clivado com as enzimas de restrição MluI e SacII. Depois da limpeza deste vetor, o fragmento MluI-SacII de 4630 pb descrito acima de pYISIT4XKSl-xylA (Baun) foi ligado. O plasmídeo resultante é chamado pPWT042, o qual é estabelecido na figura 8.

Cepa BIE104P1 (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 AGRE:: [TPIlp-TALl-ADHlp-TKLl-PGIlP-RPEl-ENOlp-RKIlI]) (ver seção 3.1) foi transformada com o plasmídeo pPWT042. Antes da transformação de BIE104P1, pPWT042 foi linearizado usando a enzima de restrição Sfil, de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor. As misturas de transformação foram plaqueadas em YPD (por litro: 10 gramas

59/71 de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de agar) contendo 100 gg de G418 (Sigma Aldrich) por mL.

Depois de dois a quatro dias; as colônias apareceram nas placas, enquanto que o controle negativo (isto é, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas YPD/G418 vazias. ;

Na digestão do plasmídeo pPWT042 com Sfil, a sua integração é direcionada ao locus SIT4 (Gottlin-Ninfa e Kaback (1986) Molecular and Cellular Biology Vol. 6, No. 6, 2185-2197) no genoma. Os transformantes foram caracterizados usando PCR e técnicas de Southernblotting.

Reações de PCR, usando Phusion® DNA polimerase (Finnzymes), as quais são indicativas para a integração correta de uma cópia do plasmídeo pPWT042, foram efetuadas com os iniciadores indicados pelas SEQ IDs 13 e 14, e 14 e .

Conforme estabelecido na figura 9, com o par de iniciadores SEQ ID 13 e 14, a integração correta no locus SIT4 foi verificada. A integração correta do plasmídeo no locus SIT4 pode ser também verificada com o par de iniciadores SEQ ID 15 e 16 (figura 19) . Se o plasmídeo pPWT042 foi integrado em múltiplas cópias (integração cabeça-cauda) , o par de iniciadores da SEQ ID 14 e 15 fornecerá um produto de PCR. Se o último produto de PCR estiver ausente, isto é indicativo para uma integração de cópia do plasmídeo pPWT042.

Uma cepa com uma cópia do plasmídeo PPWT042 integrada no genoma foi designada BIE104P1Y9.:

3.3 Experimentos de crescimento

60/71

Isolados de colônias individuais de cepas BIE104P1 e BIE104P1Y9 foram usadas para inócular meio YNB (Difco) suplementado com 2% de glicose. Osjfrascos inoculados foram incubados por aproximadamente 16 horas a 30 °C e 280 rpm. A densidade ótica a 600 nm das culturas de um dia para o outro foi determinada. Meio YNB suplementado com glicose 1% e xilose 1% foi inoculado com as culturas de um dia para o outro em uma OD inicial de 0,2. As células cresceram de um dia para o ouro a 30 °C e 280 rpm.i Subsequentemente, meios YNB contendo 2% de xilose e 0,1% de glicose foram inoculado em uma OD600 inicial de 0,2. :

A quantidade diminuta de glicose presente no último meio foi consumida rapidamente por ambas as cepas. Na transferência ao YNB com xilose 2% como a única fonte de carbono, em uma OD600 inicial de :0,2, somente BIE104P1Y9 foi capaz de crescer neste meio depois de uma fase lag muito longa de aproximadamente 4 semanas. Se a densidade ótica a 600 nm atingiu um valor: de pelo menos 2,0, as células foram transferidas para um frasco com meio YNB fresco contendo xilose 2%, em uma OD600 inicial de 0,2.

Isto foi repetido diversas vezes, conforme é estabelecido na figura 10. O gráfico claramente mostra que a cepa BIE104P1Y9 cresce rapidamente e eficientemente em um como a única fonte de de referência, sem o capaz de fazer isso.

meio mineral contendo xilose 2% carbono, enquanto que uma cepa plasmídeo integrado pPWT042, não é

3.4 Atividade da xilose isomerase

Isolados de colônias individuais das cepas BIE104P1 e

BIE104P1Y9 foram usados para inócular em YPD glicose 2%. Os frascos inoculados foram incubados por aproximadamente 16

61/71 horas a 30 °C e 280 rpm. A densidade ótica a 600 nm das culturas de um dia para o outro foi determinada. As células foram colhidas por centrifugação. Ό pélete foi lavado uma vez com tampão MOPS 0,1 M (ácido 3-(Nmorfolino)propanossulfônico; Sigma), pH 7,5 e congelado a -20 °C até a análise ser efetuada. ;

Os resultados da análise estão resumidos na tabela abaixo. i

Cepa Atividade XI a 3 0 Atividade XI a 50 °C (nmol/mg proteína.min)

Cepa de referência < 20

BIE104P1

BIE104P1Y9 110 ! 640 de °C (nmol/mg de proteína.min) < 20

Os valores são a média de dois experimentos independentes.

3.5 Produção de etanol

Isolados de colônias individuais de cepas BIE104P1 e BIE104P1Y9 foram usados para inocular meio Verduyn (Verduyn et al., Yeast 8:501-517, 1992) suplementado com glicose 2% como a única fonte de carbono. Além disso, a cepa BIE104P1Y9 foi inoculada em meio Verduyn com xilose 2% como a única fonte de carbono. Os frascos inoculados foram incubados por aproximadamente 64 horas a 30 °C e 280 rpm. A densidade ótica a 600 nm das culturas foi determinada. As células foram coletadas por centrifugação e o pélete de células foi lavado com água milliQ estéril (Millipore).

Meio Verduyn novo suplementado com glicose 2% e xilose

2% foi inoculado com três pré-culturas descritas acima. A quantidade de células inoculada foi tal que a OD600 inicial

62/71 foi de 0,2. Os frascos foram fechados com bloqueadores de água, assegurando condições de crescimento anaeróbicas depois de o oxigênio ser esgotado :do meio e do espaço de cabeça. :

Os frascos foram incubados por: 72 horas a 30 °C e 280 rpm. As amostras foram tomadas a 23, 47 e 71 horas para análise. As seguintes análises foram efetuadas:

determinação da OD600, análise de

RMN (xilose, glicose, etanol, ácido acético e glicerol). Os resultados são mostrados nas figuras 11 e 12 e na :tabela abaixo. Os dados representam a quantidade residual de açúcares no indicado (glicose e xilose em gramas por litro) e na formação de (sub) produtos (etanol, glicerol e ácido acético) .·

Na figura 11, o desenvolvimento da densidade ótica a 600 nm (OD600) no tempo é mostrado: A cepa de referência, BIE104P1, atinge a sua OD600 máxima:antes de ou 23 h depois do início do experimento. Aparentemente, em ou antes do ponto de tempo de 23 h, a glicose foi esgotada do meio (figura 12, quadro a). Também a produção de etanol atingiu o seu máximo no momento no qual a glicose foi consumida por sua cepa de levedura. Tanto o crescimento quanto a produção de etanol foram fixados, porque esta cepa não pode utilizar e fermentar a xilose, uma vez que ela não tem as proteínas ativas necessárias (isto é, uma xilose isomerase e xiluloquinase superexpressa).

Entretanto, a cepa BIE104P1Y9, na qual a xilose isomerase derivada de Bacteroides uniformis e a xiluloquinase natural foram superexpressas, é capaz de crescer em e fermentar xilose em etanol (figuras 11 e 12) .

Depois de aproximadamente 1 dia de cultivo anaeróbico, a

62/71 cepa BIE104P1Y9 já havia consumido certa quantidade de xilose, enquanto que toda a glicose já havia sido consumida. Subsequentemente, a quantidade residual de glicose foi fermentada em etanol,ι conforme é evidente da figura 12 (quadro b e c) e a tabela abaixo. A formação de subproduto (ácido acético e glicerol) é baixa, conforme é evidente a partir da tabela abaixo.:'

Os resultados não são influenciados pelas pré-culturas; conforme é evidente a partir dos nas figuras 11 e 12.

Prê-crescimento de BIE104P1 em glicose (significativamente) (glicose ou xilose) resultados apresentados

64/71

47	0,0	6,1	0,7 i	0,8	14,9
71	0,0	1,1	0,5 ;	1,1	16,7

Todos os valores são dados em gramas por litro.

Com base nesses resultados, um; Qs de 3 63 mg de xilose por grama de biomassa, por hora foi; calculado (intervalo de tempo de 23-47 horas; densidade ótica de 30 igual a 6 gramas de matéria seca por litro), no caso da cepa BIE104P1Y9 pré-crescida em xilose. ;

Exemplo 4

4.1 Introdução dos genes araA, araB e araD no genoma de S. cerevisiae

O plasmídeo pPWT018, conforme estabelecido na Figura

13, foi construído da seguinte forma: vetor pPWT006 (figura 14) , consistindo de um locus SIT2 (Gottlin-Ninfa e Kaback (1986) Molecular and Cell Biology vol. 6, no. 6, 2185-2197) e os marcadores que permitem a seleção dos transformantes no antibiótico G418 e a capacidade de crescer em acetamida (ver acima) foi digerido com as enzimas de restrição BsiWI e MIuI. Os genes codificando a arabinose isomerase (araA), L-ribuloquinase (araB) e L-ribulose-5-fosfato-4-epimerase (araD) de Lactobacillus plantarum, conforme revelado no

20- pedido de patente W02008/041840;, foram sintetizados por GeneArt AG (Resensburg, Alemanha). Um grande fragmento foi sintetizado, abrigando os três genes ara mencionados acima, sob o controle de (ou operativamente ligado a) promotores fortes de S. cerevisiae, isto é, o promotor TDH3 controlando a expressão do gene araA, o promotor ENO1 controlando o gene araB e o promotor PGI-1 controlando o gene araD. Este fragmento foi circundado pelas enzimas de restrição únicas Acc65I e MIuI.

A clonagem deste fragmento

65/71 em pPWT006 digerido com MIuI e BsiWI resultou no plasmídeo pPWT018 (figura 13) . A sequência; do plasmídeo pPWT018 é estabelecida na SEQ ID 17. ;

CEN.PK1 13-7D (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2) foi transformado com o plasmídeo pPWT018, o qual foi previamente linearizado com Sfil (New England Biolabs), de acordo com as instruções do fornecedor. Um sítio Sfil sintético foi projetado no flanco 5' do gene SIT2 (ver figura 13) . As misturas de transformação foram plaqueadas de extrato de levedura, 2 0 gramas por litro de em YPD-agar (por litro: 10 gramas 20 gramas por litro de peptona, : dextrose, 20 gramas de agar) contendo 100 qg de G418 (Sigma Aldrich) por mL.

Depois de dois a quatro dias, as colônias apareceram nas placas, enquanto que o controle negativo (isto é, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas YPD/G418 vazias.

A integração do plasmídeo pPWT080 é direcionada ao locus SIT2. Os transformantes foram caracterizados usando técnicas de PCR e de Southern blotting.

Reações de PCR, as quais são indicativas para a integração correta de uma cópia do plasmídeo pPWT018, foram efetuadas com os iniciadores indicados pela SEQ ID 18 e 15, e 15 e 14 (ver figura 3) . Com os pares de iniciadores da SEQ ID 18 e 15, a integração correta no locus SIT2-3 foi verificada. Se o plasmídeo pPWT018 fosse integrado em várias cópias (integração cabeça-cauda), o par iniciadores da SEQ ID NO 15 e 14 PCR. Se o último produto de PCR de fornecerá um produto de estiver ausente, isto é indicativo de uma integração de uma cópia de pPWT018. Uma

66/71 cepa na qual uma cópia do plasmídeo pPWT018 foi integrada no locus SIT2 foi designada como BIE104R2.

Para ser capaz de transformar a cepa de levedura com outros constructos, é necessário remover os marcadores selecionáveis. 0 design do plasmídeo pPWT018 foi tal que na integração de pPWT018 no cromossomo, as sequências homólogas estão em estrita proximidade entre si. Este design permite que os marcadores selecionáveis sejam perdidos por recombinação intramolecular espontânea dessas regiões homólogas.

No crescimento vegetativo, a recombinação intramolecular irá ocorrer, embora: com baixa frequência. A frequência desta recombinação depende do comprimento da homologia e do locus no genoma (resultados não-publicados). Na transferência sequencial de uma: subfração da cultura ao meio novo, os recombinantes intramoleculares irão se acumular com o passar do tempo.

Até este ponto, a cepa BIE104R2 foi cultivada em meio YPD (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose) iniciando de um único isolado de colônia, 2 5 μύ de uma cultura de um dia para o outro foram usados para inocular meio YPD fresco. Depois de pelo menos cinco de tais transferências em série, a densidade ótica da cultura foi determinada e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5000 por mL. 100 μΕ da suspensão celular foram plaqueados em meio de base de carbono de levedura (Amersham) e 1,8% de agar (Difco). As células idênticas às células da cepa BIE104R2, isto é, sem recombinação intracelular, ainda contêm o gene amdS. Para

67/71 aquelas células, a fluoracetamida ié tóxica. Essas células não serão capazes de crescer e não;formarão colônias em um meio contendo fluoracetamida. Entretanto, se ocorreu recombinação intramolecular, as variantes BIE104R2 que perderam os marcadores selecionáveis serão capazes de crescer no meio de f luoracetamida; uma vez que elas são incapazes de converter fluoracetamida em compostos inibidores do crescimento. Aquelas células irão formar colônias neste meio agar.

As colônias resistentes a fluoracetamida obtidas dessa forma foram submetidas â análise de PCR usando os iniciadores da SEQ ID 18 e 15, e 14; e 19. Os iniciadores da SEQ ID 18 e 5 fornecerão uma banda se a recombinação dos marcadores selecionáveis tiver ocorrido conforme tencionado. Como resultado, o cassete com os genes araA, araB e araD sob o controle dos fortes promotores de levedura foram integrados no locus SIT2 do genoma da cepa hospedeira. Naquele caso, uma reação de PCR usando os iniciadores da SEQ ID 14 e 19 não deve resultar em um produto de PCR, uma vez que o iniciador 14 se inicia em uma região que deve ser recombinada externa. Se uma banda for obtida com os últimos iniciadores, isto é indicativo para a presença do plasmídeo completo pPWT018 no genoma, de modo que nenhuma recombinação tenha ocorrido.

Se os iniciadores da SEQ ID 18 e 15 não resultarem em um produto de PCR, a recombinação ocorreu, porém de tal forma que o plasmídeo completo i pPWT018 se recombinou externo ao genoma. Não somente foram os marcadores selecionáveis perdidos, mas também os genes ara. De fato, levedura tipo selvagem foi recuperada.

68/71

Isolados que apresentaram resultados de PCR de acordo com uma integração de cópia de pPWT018 foram submetidos à análise de Southern blot. O DNÁ cromossomal das cepas CEN.PK113-7D e os recombinantes corretos foram digeridos com EcoRI e HindIII (digestão dupla). Uma sonda SIT-2 foi preparada com os iniciadores da SEQ ID 2 0 e 21, usando pPW018 como molde. O resultado do experimento de hibridização é mostrado na figura 15. O padrão de hibridização esperado pode ser deduzido dos mapas físicos conforme estabelecido na figura 16 (painéis a e b).

Na cepa tipo selvagem, uma banda de 2,35 Kb com o tamanho esperado ção e perda parcial por uma banda de 1,06 Kb foi

D fato, esta banda é observada, a qual está de acordo (figura 16, quadro a) . Na integra recombinação do plasmídeo pPWT018, esperada (figura 16, quadro b) .

observada, conforme mostrado na figura 15 (raia 2).

Uma das cepas que apresentou o padrão correto das bandas no Southern blot (conforme pode ser deduzido da figura 15) é a cepa designada como :BIE104A2.

4.2 Introdução de quatro genes constitutivamente expressos da via pentose fosfato não-oxidativa

Saccharomyces cerevisiae BIE104A2, expressando o genes araA, araB e araD constitutivamente, foi transformada com o plasmídeo pPWT080 (Figura 2) . O procedimento e os resultados já foram descritos no Exemplo 3 (seção 3.1). Em resumo, BIE104A2 foi transformado com pPWT080 digerido por Sfil. As misturas de transformação foram plaqueadas em YPDagar (por litro: 10 gramas de extrato de levedura, 20 gramas por litro de peptona, 20 gramas por litro de dextrose, 20 gramas de agar) contendo 100 qg de G418 (Sigma

69/71 a integração correta de

Aldrich) por mL.

Depois de dois a quatro dias) as colônias apareceram nas placas, enquanto que o controle negativo (isto é, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas YPD/G418 vazias. ;

A integração do plasmideo pPWT080 é direcionada ao locus GRE3. Os transformantes foram caracterizados usando técnicas de PCR e de Southern blotting, conforme descrito no Exemplo 3, seção 3.1.

Um transformante apresentando uma cópia do plasmideo pPWT080, dé acordo com o padrão de hibridização esperado, foi designado BIE104A2F1.

Para ser capaz de introduzir: os genes codificando a xilose isomerase e a xiluloquinase (seção 3.2), é necessário remover os marcadores de seleção introduzidos pela integração do plasmideo pPWT080. Até este ponto, a cepa BIE104A2F1 foi cultivada em meio YPD, iniciando de um isolado de colônia. 25 gL de uma cultura de um dia para o outro foram usados para inocular meio YPD fresco. Depois de cinco transferências em série, a densidade ótica da cultura foi determinada e as células foram diluídas até uma concentração de aproximadamente 5000 por mL. 10 0 pL da suspensão de células foram plaqueados em meio de base de carbono de levedura (Difco) contendo KPi 30 mM (pH 6,8), (NH₄)₂SO4 0,1%, fluoracetamida 40 mM (Amersham) e agar 1,8% a fluoracetamida foram caso dos perfis de PCR (Difco). As colônias resistentes submetidas à análise de PCR e, no corrigidos a análise de Southern blot (seção 3.1 do Exemplo

3) . Uma das cepas que apresentou o padrão correto das bandas no Southern blot é a cepa designada como BIE104A2P1.

70/71

4.3 Introdução de genes constitutivaménte expressos codificando a xilose isomerase e a xiluloquinase

A cepa BIE104A2P1 (MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2 SIT2::[TDH3-araA, ENOl-araB, PGIl-araD] AGRE3::[TPIlpTAL1, ADHlp-TKLl, PGIlp-RPEl : , ENOlp-RKIl]) foi transformada com o plasmídeo pPT042. Antes da transformação de BIE104A2P1, pPWT042 foi linearizado usando a enzima de restrição Sfil, de acordo com as instruções fornecidas pelo fornecedor. As misturas de transformação foram plaqueadas de extrato de levedura, 2 0 gramas por litro de em YPD-agar (por litro: 10 gramas 20 gramas por litro de peptona, dextrose, 20 gramas de agar) contendo 100 gg de G418 (Sigma Aldrich) por mL.

Depois de dois a quatro dias, as colônias apareceram nas placas, enquanto que o controle negativo (isto é, sem adição de DNA no experimento de transformação) resultou em placas YPD/G418 vazias. ;

Na digestão do plasmídeo pPWT042 com Sfil, a sua integração é direcionada ao locus SIT4 (Gottlin-Ninfa e Kaback (1986) Molecular and Cellular Biology Vol. 6, No. 6, 2185-2197) no genoma. Os ; transformantes foram caracterizados usando técnicas de PCR e Southern blotting, conforme descrito no Exemplo 3 (seção 3.2).

Uma cepa de uma cópia do plasmídeo pPWT042 integrada no genoma foi designada BIE104A2P1Y9.

4.4 Experimentos de crescimento

Isolados	de colônias	individuais	das	cepas
BIE104A2P1Y9	foram usados para	inocular o meio	YNB	(Difco)
suplementado	com glicose 2% ou galactose 2%.	Os	frascos
inoculados foram incubados a	30 °C e 280	rpm	até a

71/71 densidade ótica de 600 nm atingir um valor de pelo menos

2,0.

Meio YNB suplementado com arabinose 1% e xilose 1% foi inoculado com as culturas de um dia para o outro em uma cresceram a 30 °C e 280

600 nm foi monitorada ótica atingiu um valor cultura foi transferida

OD600 inicial de 0,2. As células rpm. A densidade ótica a regularmente. Quando a densidade maior do que 2,0, uma alíquota da para o meio YNB novo contendo xilose 2% e arabinose 0,2%. A 10 quantidade de células adicionada foi tal que a OD600 inicial da cultura foi de 0,2. ;

A densidade ótica foi monitorada regularmente. Os resultados estão mostrados na figura 17, quadro a (pré’ culturas em galactose) e quadro b (pré-culturas em 15 glicose).

Os resultados mostram claramente que as cepas são capazes de utilizar tanto arabinose quanto xilose.

1/3

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Célula, CARACTERIZADA pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada entre SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 ou suas sequências degeneradas que codificam a mesma sequência de aminoácidos da xilose isomerase como estabelecida na SEQ ID NO: 3, em que a sequência de nucleotídeos é heteróloga ao hospedeiro, e em que a célula é uma célula de levedura da espécie S.

   cerevisiae.
2. 2. Célula, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula compreende uma ou mais modificações genéticas resultando em:

   a. um aumento na atividade da xilulose quinase por superexpressão de um nucleotídeo codificando uma xilulose quinase;

   b. um aumento no fluxo pela via da pentose fosfato por superexpressão de uma enzima selecionada a partir do grupo consistindo das enzimas ribulose-5-fosfato isomerase, ribulose-5-fosfato epimerase, transcetolase e transaldolase;

   c. um decréscimo na atividade da aldose redutase por redução da expressão de ou inativação de um gene codificando aldose redutase não-específica.
3. 3. Célula, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais modificações genéticas resulta na superexpressão de pelo menos um gene codificando uma enzima da parte não-oxidativa da via pentose fosfato, em que o gene é um gene codificando uma ribulose-5-fosfato isomerase, uma ribulose-5-fosfato epimerase, uma transcetolase ou uma transaldolase.

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4. 4. Célula reivindicações 1 capacidade de usar
5. 5. Célula reivindicações 1 genes araA, araB expressos.

   , de acordo com qualquer uma das a 3, CARACTERIZADA pelo fato de ter a L-arabinose. , de acordo com qualquer uma das a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que os

   e araD de Lactobacillus plantarum são
6. 6. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que todos os genes expressos são constitutivamente expressos ou constitutivamente superexpressos.
7. 7. Célula, de acordo com a reivindicação 6,

   CARACTERIZADA pelo constitutivamente fato de que um ou mais genes constitutivamente ou expressos superexpressos são estavelmente integrados no genoma da célula.
8. 8. Processo para produzir um produto de fermentação, CARACTERIZADO pelo fato de compreender fermentação de um meio contendo uma fonte de xilose com uma célula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, de modo que a célula fermenta xilose para o produto de fermentação, em que o produto de fermentação é etanol, butanol, ácido lático, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido fumárico, ácido itacônico, um aminoácido, 1,3-propanodiol, etileno, glicerol, um antibiótico β-lactâmico e uma cefalosporina.
9. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de compreender fermentação de um meio contendo pelo menos uma fonte de xilose e uma fonte de

   Petição 870180024053, de 26/03/2018, pág. 8/10

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   L-arabinose com uma célula como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6, de modo que a célula fermenta xilose e L-arabinose para o produto de fermentação.
10. 10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo é anaeróbico.

    Petição 870180024053, de 26/03/2018, pág. 9/10

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    S/71593

    Sa/I1100 H/ndíil 1106

    Sacll 2348

    Kpn12658 San 2802

    Kpni 3474 Spe(3695

    Windlll 5473 Kpni5700

    Kpni8571