KR20140099251A - 아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인 - Google Patents

아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헥소스, 펜토즈 및 아세트산을 포함하는 목질 섬유 가수분해물로부터 에탄올을 생성하는 방법에 관한 것으로, 이에 따라 아세트알데히드 디하이드로게나아제를 암호화하는 외인성 유전자 및 NAD+-결합된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 박테리아 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 이스트 세포가 사용된다. 상기 방법은 또한, 글리세롤이 배지에 존재하거나 또는 이와 함께 공급되며, 이에 따라 변형된 이스트 세포는 헥소스, 펜토즈, 아세트산 및 글리세롤을 에탄올로 발효하는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 이러한 방법에 사용되는 이스트 세포에 관한 것이다. 상기 이스트 세포는 유리하게 하나 이상의 디히드록시아세톤 키나아제 활성 및 글리세롤을 세포내로 수송하는 능력을 증가시키는 변형과 같이 글리세롤 이용을 향상시키는 유전적 변형을 포함한다. 상기 이스트 세포는 또한 바람직하게 L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환하는 능력을 세포에 부여하는 기능적 외인성 자일로즈 이소머라아제 유전자 및/또는 기능적 외인성 유전자를 포함하며, 그리고 이들은 아세틸-CoA 합성효소 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함할 수 있다.

Description

아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인{YEAST STRAINS ENGINEERED TO PRODUCE ETHANOL FROM ACETIC ACID AND GLYCEROL}
본 발명은 이스트와 같은 미생물에서의 대사 공학(metabolic engineering)에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하도록 합성된 이스트 스트레인에 관한 것이다. 아세트산 및 글리세롤에 부가적으로, 이스트 스트레인은 또한 에탄올의 생성을 위한 헥소스 및 펜토스를 소비할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 합성 스트레인이 아세트산 및 글리세롤로부터 에탄올을 생성하는 방법에 관한 것이다.
2세대 바이오에탄올은, 에탄올로의 발효를 위해 예를 들어 헥소스 및 펜토스와 같이 유리 단량체 당질로 가수분해되는 식물 바이오매스의 목질 섬유 분획으로부터 생성된다. 목질 섬유 가수분해물은 고량의 아세트산을 함유하며, 이는 이스트와 같은 에탄올 생성에 사용되는 미생물의 발효 능력의 강한 억제제이다.
Sonderegger 등(2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 2892-2897)은 자일로스-발효 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 스트레인에서 포스포트랜스아세틸라아제 및 아세트알데히드 디하이드로게나아제의 이종성 발현에 대해 개시하였다. 이에 따라, Sonderegger 등은 고유의 포스포케톨라아제와 함께, 상기 스트레인에서 자일로스 활용에 사용되는 자일로스 환원효소 및 자일로스 디하이드로게나아제의 이종성 발현에 의해 생성된 NADH의 순 재산화(net reoxidation)를 할 수 있는 기능성 포스포케톨라아제 경로를 생성하였다.
Guadalupe 등(2009, Appl. Environ. Microbiol. doi:10.1128/AEM.01772-09)은 부산물 글리세롤의 생성이 내생성 NAD-의존적 글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제 유전자(GPD1 및 GPD2)의 붕괴에 의해 제거되는 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 스트레인을 개시하였다. 아세틸레이팅 NAD-의존적 아세트알데히드 디하이드로게나아제를 암호화하는 이. 콜라이(E. coli) mhpF 유전자의 발현은 아세트산을 함유하는 배지로 보충함으로써 혐기적으로 성장하는 GPD-붕괴된 스트레인의 능력을 회복시켰다.
Yu 등(2010, Bioresour. Technol. 101(11):4157-61. Epub 2010 Feb 9)은 글리세롤 디하이드로게나아제(GCY), 디하이드록시아세톤 키나아제(DAK) 및 글리세롤 흡수 단백질(GUP1)의 동시 과발현에 의해 글리세롤로부터 향상된 에탄올 생성을 위해 대사적으로 합성된 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 스트레인을 개시하였다.
Lee 및 Dasilva(2006, Metab Eng. 8(1):58-65)는 그 중에서도 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) mgs 및 gldA 유전자의 발현을 도입하여 글리세롤로부터 1,2-프로판디올을 생성하도록 합성된 이스트 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 개시하였다.
본 발명의 목적은 아세트산 및 글리세롤 (및 헥소스 및 펜토스)로부터 에탄올을 생성할 수 있는 이스트뿐만 아니라, 이러한 스트레인이 에탄올 및/또는 다른 발효 산물의 생성을 위해 사용되는 공정을 제공하는 것이다.
정의
본 명세서에서 서열 동일성은 서열을 비교함으로써 측정되는 둘 이상의 아미노산(폴리펩타이드 또는 단백질) 서열 또는 둘 이상의 핵산(폴리뉴틀레오타이드) 서열 사이의 관계로서 정의된다. 당해 기술분야에서, "동일성(identity)"은 또한 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련 정도를 의미하며, 경우에 따라 이러한 서열들의 스트링들 사이를 매칭함으로써 측정된다. 두 아미노산 서열 사이의 "유사성(similarity)"은 한 폴리펩타이드의 아미노산 서열 및 이의 보존 아미노산 치환체를 제2 폴리펩타이드의 서열과 비교함으로써 측정된다. "동일성" 및 "유사성"은 공지된 방법에 의해 쉽게 산출될 수 있다. 용어 "서열 동일성" 또는 "서열 유사성"은 최적으로 정렬된 경우에, 바람직하게 (비교시 적어도 가장 짧은 서열의) 전체 길이에 걸쳐 그리고 디폴트 파라미터를 이용하는 프로그램 ClustalW(1.83), GAP 또는 BESTFIT에 의한 것과 같이 매치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화하는 것으로 정렬된 경우에, 두 (폴리)펩타이드 또는 두 뉴클레오타이드 서열이, 적어도 본 명세서에 정의된 바와 같은 서열 동일성의 특정 퍼센트를 공유함을 의미한다. GAP은 이들의 전체 길이에 걸쳐 두 서열을 정렬하기 위해 Needleman and Wunsch 글로벌 정렬 알고리즘을 사용하여 매치의 수를 최대화하고 갭의 수를 최소화한다. 일반적으로, GAP 디폴트 파라미터는 갭 생성 패널티 = 50(뉴클레오타이드)/8(단백질) 및 갭 확장 패널티 = 3(뉴클레오타이드)/2(단백질)로 사용된다. 뉴클레오타이드에 대해, 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 nwsgapdna이며, 단백질에 대한 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62(Heinkoff & Heinkoff, 1992, PNAS 89, 915-919)이다. 본 발명의 단백질 서열을 정렬하기에 바람직한 다중 정렬 프로그램은 블로섬 매트릭스 및 디폴트 세팅(갭 오프닝 패널티: 10; 갭 확장 패널티: 0.05)을 이용하는 ClustalW(1.83)이다. RNA 서열이 DNA 서열과 본질적으로 유사하거나 특정 정도의 서열 동일성을 갖는 것으로 언급되는 경우에, DNA 서열에서 티민(T)은 RNA 서열에서 우라실(U)과 동등한 것으로 간주된다. 서열 정렬 및 퍼센트 서열 동일성에 대한 스코어는 GCG 위스콘신 패키지 버전 10.3(Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752 USA) 또는 오픈 소스 소프트웨어 윈도우용 엠보스(현재 버전 2.7.1-07)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 검출될 수 있다.
동일성을 검출하는 바람직한 방법은 시험되는 서열들 간의 가장 많은 매치를 제공하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 검출하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 편성된다. 두 서열 간에 동일성 및 유사성을 검출하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 예를 들어 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1):387 (1984)), BestFit, BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))을 포함한다. BLAST X 프로그램은 NCBI 및 다른 공급원(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990))으로부터 공개적으로 이용가능하다. 잘 알려진 스미스 워터맨 알고리즘이 또한 동일성을 검출하는데 사용될 수 있다.
폴리펩타이드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: BLOSSUM62(Hentikoff 및 Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992)); 갭 패널티: 12; 및 갭 길이 패널티: 4. 이러한 파라미터와 함께 유용한 프로그램은 "오갭(Ogap)" 프로그램(Genetics Computer Group, Madison, WI)으로서 공개적으로 이용가능하다. 상기 언급된 파라미터는 (엔드 갭을 위한 패널티가 없이) 아미노산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
핵산 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다: 알고리즘: Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970); 비교 매트릭스: 매치=+10, 미스매치=0; 갭 패널티: 50; 및 갭 길이 패널티: 3. 갭(Gap) 프로그램(Genetics Computer Group, Madison, WI)으로서 공개적으로 이용가능하다. 상기 언급된 파라미터는 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
선택적으로, 아미노산 유사성 정도 검출시, 통상의 기술자는 또한 통상의 기술자에게 알 수 있는 바와 같이 소위 "보존적(conservative)" 아미노산 치환을 고려할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 호환성을 칭한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이며; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 세린 및 트레오닌이며; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 아스파라긴 및 글루타민이며; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이며; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 그리고 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 그룹은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 본 명세서에 개시된 아미노산 서열의 치환 변이체는 개시된 서열내의 적어도 하나의 잔기가 제거되고 그 자리에 다른 잔기가 삽입된 것들이다. 바람직하게, 아미노산 변화는 보존적이다. 자연적으로 발생하는 각각의 아미노산에 대한 바람직한 보존적 치환은 다음과 같다: Ala 대 ser; Arg 대 lys; Asn 대 gln 또는 his; Asp 대 glu; Cys 대 ser 대 ala; Gln 대 asn; Glu 대 asp; Gly 대 pro; His 대 asn 또는 gln; Ile 대 leu 또는 val; Leu 대 ile 또는 val; Lys 대 arg; gln 또는 glu; Met 대 leu 또는 ile; Phe 대 met, leu 또는 tyr; Ser 대 thr; Thr 대 ser; Trp 대 tyr; Tyr 대 trp 또는 phe; 및, Val 대 ile 또는 leu.
또한, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 각각, 중간의 또는 바람직하게 엄격한 하이브리드화 조건하에서 본 명세서에 개시된 특정 뉴클레오타이드 서열의 일부와 하이브리드되는 이들의 능력에 의해 정의될 수 있다. 본 명세서에서 엄격한 하이브리드화 조건은 적어도 약 25, 바람직하게 약 50 뉴클레오타이드, 75 또는 100 및 가장 바람직하게 약 200 이상의 뉴클레오타이드가 약 1M 염, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당하는 이온 강도를 갖는 용액에서 약 60℃의 온도에서 하이브리드화되고, 약 0.1M 염 이하, 바람직하게 0.2 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당하는 이온 강도를 갖는 다른 용액에서 65℃에서 세정하는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 하이브리드화는 밤새, 즉, 적어도 10시간 동안 수행되며, 그리고 바람직하게 세정은 적어도 세정 용액을 2회 교체해 주면서 적어도 1시간 동안 수행된다. 이러한 조건은 보통 약 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 하이브리드화를 가능케 할 것이다.
중간 조건은 적어도 50 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 200 이상의 뉴클레오타이드의 핵산 서열이 약 1M 염, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당하는 이온 강도를 갖는 어느 다른 용액에서 약 45℃의 온도에서 하이브리드화되고, 약 1M 염 이하, 바람직하게 6 x SSC를 포함하는 용액에서 또는 이에 상당하는 이온 강도를 갖는 다른 용액에서 실온에서 세정하는 조건으로 정의된다. 바람직하게, 하이브리드화는 밤새, 즉, 적어도 10시간 동안 수행되며, 그리고 바람직하게 세정은 적어도 세정 용액을 2회 교체해 주면서 적어도 1시간 동안 수행된다. 이러한 조건은 최대 50%의 서열 동일성을 갖는 서열의 특이적 하이브리드화를 가능케 할 것이다. 당해 기술분야의 통상의 기술자는 50%와 90% 사이의 동일성 범위의 서열을 특이적으로 식별하기 위한 이러한 하이브리드화 조건을 조절할 수 있을 것이다.
"핵산 구조물(nucleic acid construct)" 또는 "핵산 벡터(nucleic acid vector)"는 본 명세서에서 재조합 DNA 기술의 사용으로부터 형성되는 인공 합성 핵산 분자를 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "핵산 구조물"은 따라서 자연적으로 발생하는 핵산 분자를 포함하지 않으나, 그럼에도 불구하고 핵산 구조물은 자연적으로 발생하는 핵산 분자(의 일부)를 포함할 수 있다. 용어 "발현 벡터(expression vector)" 또는 "발현 구조물(expression construct)"은 이러한 서열과 호환적인 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 칭한다. 이러한 발현 벡터는 전형적으로 적어도 적절한 전사 조절 서열 및 선택적으로, 3' 전사 종료 신호를 포함한다. 또한 발현 인핸서 엘리멘트와 같은 발현에 영향을 주는데 필요하거나 도움이 되는 부가적인 인자들이 존재할 수 있다. 발현 벡터는 적절한 숙주 세포에 도입되며, 숙주 세포의 시험관내 세포 배양시 암호 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다. 발현 벡터는 본 발명의 숙주 세포 또는 유기체에서 복제에 적절할 것이다.
본 명세서에 사용된, 용어 "프로모터" 또는 "전사 조절 서열"은 하나 이상의 암호서열의 전사를 조절하는 기능을 하며, 암호 서열의 전사 개시 부위의 전사 방향에 대하여 상향 흐름에 위치하며, 그리고 DNA-의존적 RNA 폴리머라아제에 대한 바인딩 사이트, 전사 제한부위, 및 이에 한정하는 것은 아니나, 전사 인자 바인딩 부위, 리프레서 및 액티베이터 단백질 바인딩 부위, 및 프로모터로부터 전사의 양을 직접 또는 간접적으로 조절하는 것으로 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려진 어느 다른 뉴클레오타이드 서열울 포함하는 어느 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 식별되는 핵산 프래그먼트를 칭한다. "구성적인(constitutive)" 프로모터는 대부분의 생리학적 및 발달 조건하에서 대부분의 조직에서 활성적인 프로모터이다. "유도성(inducible)" 프로모터는 예를 들어, 화학 인듀서의 적용에 의해 생리학적으로 또는 발달학적으로 조절된 프로모터이다.
용어 "선별가능한 마커"는 당해 기술분야의 숙련자에게 익숙한 용어이며, 본 명세서에서 발현시 선별가능한 마커를 함유하는 세포 또는 세포들을 선별하는데 사용될 수 있는 어느 유전학적 엔티티를 나타내는데 사용된다. 용어 "리포터"는 마커와 호환적으로 사용될 수 있으나, 주로 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 가시적 마커를 칭하는데 사용된다. 선별가능한 마커는 우성적이거나 열성적이거나 또는 양방향성일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 기능적 관계에서 폴리뉴클레오타이드 엘리먼트의 결합을 칭한다. 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 놓여질 경우에 핵산이 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 전사 조절 서열은 암호 서열의 전사에 영향을 줄 경우에 암호 서열에 작동가능하게 연결된다. 작동가능하게 연결된이란 연결되는 DNA 서열이 전형적으로 인접되어 있으며, 두 단백질 암호부위를 연결하는 것이 필요한 경우에 인접되어 있으며 리딩 프래임내에 존재하는 것을 의미한다.
용어 "단백질" 또는 "폴리펩타이드"는 특정 활성 모드, 크기, 3-차원 구조 또는 오리진에 대한 레퍼런스가 없는 경우에 호환적으로 사용되며 아미노산의 사슬로 구성되는 분자를 칭한다.
"균류(fungi)"(단수 fungus)는 본 명세서에서 이들의 음식을 외부로 소화하고, 영양 분자를 이들의 세포내로 흡수하는 종속 영양 진행 미생물로서 이해된다. 균류는 진핵 유기체의 별도 계이며, 이스트, 곰팡이 및 버섯을 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어, 균류(fungi, fungus) 및 균류의는 따라서 이스트뿐만 아니라 필라멘트성 균류를 포함한다.
용어 "유전자"는 세포에서 RNA 분자(예, mRNA)로 전사되는 부위(전사 부위)를 포함하며, 적절한 조절 부위(예, 프로모터)에 작동가능하게 연결된 DNA 프래그먼트를 의미한다. 유전자는 보통 프로모터 5' 리더 서열, 암호 부위 및 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 서열(3'말단)과 같은 여러 작동가능하게 연결된 프래그먼트를 포함할 것이다. "유전자의 발현"은 적절한 조절 부위, 특히 프로모터에 작동가능하게 연결된 DNA 부위가 생물학적으로 활성적인, 즉, 생물학적으로 활성적인 단백질 또는 펩타이드로 번역될 수 있는 RNA로 전사되는 프로세스를 칭한다.
주어진 (재조합) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자 및 주어진 숙주 유기체 또는 숙주 세포 사이의 관계를 나타내는데 사용될 경우에 용어 "동종성(homologous)"은 사실상 핵산 또는 폴리펩타이드 분자가 동일한 종, 바람직하게 동일한 변종 또는 스트레인의 숙주 세포 또는 유기체에 의해 생성되는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 숙주 세포에 동종성인 경우에, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 전형적으로(하지만 필수적은 것은 아님) 다른 (이종성) 프로모터 서열과 작동가능하게 연결되며, 그리고 적용가능할 경우에 이의 천연 환경에 비해 다른 (이종성) 분비 신호 서열 및/또는 종결 서열에 작동가능하게 연결된다. 조절 서열, 신호 서열, 종결 서열 등은 또한 숙주 세포에 동종성일 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 정황에서, 단지 "동종성" 서열 엘리먼트의 사용은 "자가-복제된(self-cloned)" 유전적으로 변형된 유기체(GMO's)의 구조가 가능하다(여기서 자가 복제는 유럽 지령 98/81/EC 부록 II에 정의된 바와 같음). 두 핵산 서열의 관련성을 나타내는데 사용될 경우에, 용어 "동종성"은 단일-가닥 핵산 서열이 완전히 단일-가닥 핵산 서열과 하이브리드될 수 있음을 의미한다. 하이브리드화 정도는 서열간의 동일성의 양 및 이후에 언급되는 온도 및 염 농도와 같은 하이브리드화 조건을 포함하는 다수의 인자들에 따라 달라질 수 있다.
핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질과 관련하여 사용되는 용어 "이종성(heterologous)" 및 "외인성(exogenous)"은 그 안에 존재하는 유기체, 세포, 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열의 일부로서 자연적으로 발생하지 않거나, 또는 자연적으로 발견되는 것과 다른 세포에서 또는 그 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열 는 핵산 또는 단백질내의 위치 또는 위치들에서 발견되는 핵산 또는 단백질을 칭한다. 이종성 및 외인성 핵산 또는 단백질은 그 내부로 도입되는 세포에 대해 내인성은 아니나, 다른 세포로부터 획득되며, 또는 합성적으로 또는 재조합적으로 생성된다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니나, 이러한 핵산은 단백질, 즉, DNA가 전사되거나 발현되는 세포에 의해 정상적으로 생성되지 않는 외인성 단백질을 암호화한다. 마찬가지로, 외인성 RNA는 외인성 RNA가 존재하는 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 단백질을 암호화한다. 이종성/외인성 핵산 및 단백질은 또한 외부 핵산 또는 단백질로 칭하여질 수 있다. 당해 기술분야의 통상의 기술자가 그 내부에서 발현되는 세포에 대하여 외부로서 인지하는 어느 핵산 또는 단백질은 본 명세서에 이종성 또는 외인성 핵산 또는 단백질로 포함된다. 용어 이종성 및 외인성은 또한 핵산 또는 아미노산 서열의 비-자연적 조합, 즉, 적어도 두개의 복합 서열이 서로에 대해 외래인 조합에 대해 적용된다.
효소의 "특이적 활성(specific activity)"은 본 명세서에서 총 숙주 세포 단백질의 양 당 특정 효소의 활성량을 의미하는 것으로 이해되며, 보통 총 숙주 세포 단백질 mg 당 효소 활성의 유닛으로 표현된다. 본 발명의 정황에서, 특정 효소의 특이적 활성은 (다른 동일한) 와일드 타입 숙주 세포에서 그 효소의 특이적 활성에 비해 증가 또는 감소될 수 있다.
"혐기적 조건(anaerobic conditions)" 또는 혐기적 발효 공정은 본 명세서에서 산소의 부재하에서 또는 실질적으로 산소가 소비되지 않는, 바람직하게 5, 2.5 또는 1mmol/L/h 이하, 또는 바람직하게 0 mmol/L/h가 소비되며(즉, 산소 소비가 검출불가한), 유기 분자가 전자 도너 및 전자 어셉터 모두로 제공되는 조건 또는 발효 공정 작업으로 정의된다.
도 1. 시간 경과(hours)에 따른 순 글리세롤 수준(g/l)(즉, 생산 - 소비)의 평가를 S. cerevisiae 스트레인 RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 및 RN1189에 대해 나타내었다.
도 2. 시간 경과(hours)에 따른 순 아세트산 수준(g/l)(즉, 생산 - 소비)의 평가를 S. cerevisiae 스트레인 RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 및 RN1189에 대해 나타내었다.
이스트에서 외인성 아세트알데히드 디하이드로게나아제의 발현은 이스트가 목질섬유 가수분해물에 고량 존재할 수 있는 아세트산을 에탄올로 전환하도록 해준다. 아세트산의 에탄올로의 NADH 의존적 환원은 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae)의 혐기적 글루코즈-성장 배양에서 레독스 싱크(redox sink)로서 글리세롤 형성에 대한 대체물로서 제시되어, 이에 따라 산업적 에탄올 제조 중에 글리세롤 생성(부산물로서)의 제거에 대한 화학량론적 베이시스를 제공하며, 결과적으로 보다 높은 에탄올 수율을 제공한다(Guadalupe et al. 상기 참조). 그러나, 이러한 반응의 화학량론은 아세트산의 에탄올로의 한 분자의 환원은 2개의 글리세롤 분자를 필요로 하나 이러한 2개의 글리세롤 분자는 생성되지 않는다. 그러나, 본 발명자들은 산업적 목질섬유 가수분해물에 전형적으로 존재하는 아세트산의 양이 실제로 에탄올로 환원되는데 필요한 NADH의 양이 혐기적 조건하에서 성장되는 이스트에서 글리세롤 생성을 억제하는에 이용가능한 NADH의 양을 초과하는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 이제 상당히 보다 많은 양의 아세트산이 글리세롤 생성 억제에 의한 것 보다는, 이스트에 의해 글리세롤의 동시적 소비에 의해 에탄올로 환원될 수 있음을 예기치 않게 발견하였다.
다량의 글리세롤이 식물성 오일 또는 동물 지방 및 알코올을 이용하여 트랜스에스테르화 반응으로부터 바이오디젤 생성시 부산물로서 생성된다. 크루드 글리세롤의 이용가능성은 따라서 전 세계적인 바이오디젤 생성의 성장 결과로 내년에 증가할 것으로 예상된다. 결론적으로, 다량의 글리세롤이 저가로 이용될 것이다. 본 발명은 예를 들어, 바이오디젤 생성으로부터 부산물로서 얻어지는 글리세롤을 바이오연료로 사용될 수 있는 에탄올로 전환시킴으로써 가치화하는 수단 및 방법을 제공한다. 동시에, 본 발명은 목질섬유 가수분해물에 존재하는 고량의 아세트산 및 이러한 가수분해물로부터 에탄올을 생성하는 이스트의 발효 성능을 저해하는 고량의 아세트산의 문제를 해소한다. 본 발명의 추가적인 이점은 본 발명의 이스트 세포에서 온전한 고-삼투성 글리세롤 반응 경로를 떠남으로써((모든) 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제가 Guadalupe 등(상기 참조)에 의해 기재된 바와 같이 불활성화되는 스트레인과 반대됨), 산업적 발효 조건하에서 발생할 수 있는 삼투성 스트레스를 더욱 잘 다스릴 수 있는 보다 강건한 이스트 스트레인이 획득되는 것이다.
제1견지로, 본 발명은 아세틸CoA를 아세트알데히드로 환원시키는 능력을 갖는 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 아세트산을 에탄올로 전환시키는 능력을 세포에 부여하는 균류 숙주 세포에 관한 것이다. 아세틸CoA를 아세트알데히드로 환원시키는 능력을 가진 효소는 본 명세서에서 반응을 촉매하는 효소(ACDH; EC 1.2.1.10)로 이해된다.
아세트알데히드 + NAD+ + 조효소 A ↔ 아세틸-조효소 A + NADH + H+
따라서, 상기 효소는 아세틸CoA를 아세트알데히드로 전환(및 그 역도 같음)을 촉매하며, (아세틸레이팅 NDA-의존적) 아세트알데히드 디하이드로게나아제 또는 아세틸-CoA 환원효소로 칭하여진다. 상기 효소는 아세트알데히드의 에탄올로의 전환(및 그 역도 같은; 하기 참조)을 더욱 촉매하는 이중 기능성 효소일 수 있다. 편의상, 본 명세서에서 적어도 아세틸CoA를 아세트알데히드 또는 에탄올로 환원하는 능력을 가진 효소를 "아세트알데히드 디하이드로게나아제"라 칭한다. 또한, 균류 숙주 세포가 내인성 아세틸-CoA 합성효소 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 가지며, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성과 함께 제공되는 세포가 아세트산의 에탄올로의 완전한 전환을 가능케 하는 것으로 이해된다.
외인성 유전자는 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) mhpF 유전자에 의해 암호화되는 아세트알데히드 디하이드로게나아제와 같은 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성만을 갖는 단일 기능 효소(즉, 아세틸CoA를 아세트알데히드로 환원하는 능력만을 갖는 효소)를 암호할 수 있다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 적절한 외인성 유전자는 SEQ ID NO: 1과 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 단일 기능 효소를 포함하는 원핵 생물의 적절한 예는 표 1에 제공된다. 이러한 단일 기능 효소의 아미노산 서열은 공개 데이터 베이스에서 이용가능하며, 이에 상응하는 단일 기능 효소를 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열(참조 예, SEQ ID NO: 2)을 디자인하는데 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
이. 콜라이 ( E. coli ) mhpF 와 관련된 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소
유기체 아미노산 동일성 (%)
Escherichia coli str. K12 substr. MG1655 100%
Shigella sonnei 100%
Escherichia coli IAI39 99%
Citrobacter youngae ATCC 29220 93%
Citrobacter sp. 30_2 92%
Klebsiella pneumoniae 342) 87%
Klebsiella variicola 87%
Pseudomonas putida 81%
Ralstonia eutropha JMP134 82%
Burkholderia sp. H160 81%
Azotobacter vinelandii DJ 79%
Ralstonia metallidurans CH34 70%
Xanthobacter autotrophicus Py2 67%
Burkholderia cenocepacia J2315 68%
Frankia sp. EAN1pec 67%
Polaromonas sp. JS666 68%
Burkholderia phytofirmans PsJN 70%
Rhodococcus opacus B4 64%
바람직하게, 숙주 세포는 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소를 암호화하며, 세포에 아세트산을 에탄올로 전환하는 능력을 부여하는 외인성 유전자를 포함한다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 각각의 활성에 대한 개별 효소에 비해, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소를 이용하는 이점은, 경로에서 연속적 반응을 촉매하는 효소들 사이에 중간물의 직접적인 채널링이 효율적이고, 독점적이고, 보호되는 수단의 대사물 운반을 제공할 수 있는 것이다. 이에 따라 기질 채널링은 중간물의 수송 시간을 감소시키고, 확산에 의한 중간물의 손실을 억제하고, 용매로부터 불안정한 중간물을 보호하고, 중간물의 경합 대사 경로로의 입장을 미연에 방지한다. 따라서, 이중 기능성 효소는 개별 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 효소에 비해 아세트산의 에탄올로의 보다 효율적인 전환을 가능케 한다. 이중 기능성 효소의 다른 이점은, 이는 또한 예를 들어, 혐기적 조건 및/또는 이화 대사 억제와 같은 사용되는 조건하에서 알코올 디하이드로게나아제 활성이 거의 없거나 전혀 없이 숙주 세포에서 사용될 수 있는 것이다.
아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소는 원핵 생물 및 프로토조아 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 에스케리차 콜라이(Escherichia coli) adhE 및 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica) ADH2 유전자에 의해 암호화되는 이중 기능성 효소를 포함한다(참조 Bruchaus and Tannich, 1994, J. Biochem. 303: 743-748; Burdette and Zeikus, 1994, J. Biochem. 302: 163-170; Koo et al., 2005, Biotechnol. Lett. 27: 505-510; Yong et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93: 6464-6469). 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소는 약 900 아미노산으로 구성되는 보다 큰 단백질이며, 이들은 아세트알데히드 디하이드로게나아제(ACDH; EC 1.2.1.10) 및 알코올 디하이드로게나아제 활성(ADH; EC 1.1.1.1) 모두를 나타내는 이중 기능성이다. E. coli adhE과 Entamoeba histolytica ADH2는 45% 아미노산 동일성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일 구현으로, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소을 암호화하는 적절한 외인성 유전자는 SEQ ID NO: 3 중 적어도 하나의 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소를 포함하는 원핵 생물의 적절한 예는 표 2 및 3에 제공된다. 이러한 이중 기능성 효소의 아미노산 서열은 이에 상응하는 이중 기능성 효소를 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열(참조 예, SEQ ID NO: 4 또는 6)을 디자인하기 위해 공개된 데이타 베이스에서 이용가능하며, 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.
E. coli adhE 와 관련된 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하 이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소
유기체 아미노산 동일성 (%)
Escherichia coli O157:H7 str. Sakai 100%
Shigella sonnei 100%
Shigella dysenteriae 1012 99%
Klebsiella pneumoniae 342 97%
Enterobacter sp. 638 94%
Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 90%
Serratia proteamaculans 568 90%
Pectobacterium carotovorum WPP14 90%
Sodalis glossinidius str. 'morsitans' 87%
Erwinia tasmaniensis Et1/99 86%
Aeromonas hydrophila ATCC 7966 81%
Vibrio vulnificus YJ016] 76%
Entamoeba histolytica ADH2 와 관련된 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소
유기체 아미노산 동일성 (%)
Entamoeba histolytica HM-1:IMSS 99%
Entamoeba dispar SAW760 98%
Mollicutes bacterium D7 65%
Fusobacterium mortiferum ATCC 9817 64%
Actinobacillus succinogenes 130Z 63%
Pasteurella multocida Pm70 62%
Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 61%
Streptococcus sp. 2_1_36FAA] 61%
아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소에 있어서, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 이중 기능성 효소를 암호화하는 외인성 유전자는 바람직하게 본 발명의 숙주 세포내로 발현 구조물의 트랜스포메이션시 효소의 발현을 확실히 하도록 적절한 발현 조절 부위/서열에 작동가능하게 연결된 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 구조물이다. 따라서, 유전자 또는 발현 구조물은 암호 서열에 작동가능하게 연결된 숙주 세포에 기능적인 프로모터를 적어도 포함할 것이다. 유전자 또는 구조물은 암호 부위의 상향흐름의 5' 리더 서열 및 암호화 서열의 하향흐름의 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위를 포함하는 3'-비번역 서열(3'말단)을 더 포함할 수 있다.
일 견지로 본 발명은 본 발명의 이스트 세포를 제조 및 구축하는 방법에 관한 것이다. 이러한 목적으로, 표준 유전학 및 분자생물학 기술이 사용되며, 이는 일반적으로 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, Sambrook and Russell (2001, "Molecular cloning: a laboratory manual" (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press) and Ausubel et al. (1987, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York)에 기술되어 있다. 또한, 돌연변이된 숙주 이스트 스트레인의 구축은 결과적으로 형성된 디플로이드의 유전학적 크로스, 포자형성, 원하는 영양요구성 마커를 함유하는 하플로이드 스포어의 테트라드 절개 및 적절한 선별 배지에서 이러한 하플로이드 숙주 이스트의 콜로니 정제에 의해 수행된다. 이러한 모든 방법들은 당해 기술분야에 알려진 표준 이스트 유전학 방법이다. 참조 예, Sherman et al., Methods Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1978) and Guthrie et al. (Eds.) Guide To Yeast Genetics and Molecular Biology Vol. 194, Academic Press, San Diego (1991).
아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 선택적으로 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소 (뿐만 아니라 하기 본 발명의 다른 효소)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현을 위한 적절한 프로모터는 바람직하게, 이화 생성물(글루코즈) 억제에 민감하지 않으며, 혐기적 조건하에서 활성적이며 그리고/또는 바람직하게 유도를 위해 자일로즈 또는 아라비노즈를 필요로 하지 않는 프로모터들을 포함한다. 이러한 특성을 갖는 프로모터는 광범위하게 이용가능하며, 통상의 기술자에 의해 알려져 있다. 이러한 프로모터의 적절한 예는 이스트의 프로모터들인, 포스포프룰토키나아제(PPK), 트리오즈 포스페이트 이소머라아제(TPI), 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GDP , TDH3 또는 GAPDH), 피루베이트 키나아제(PYK), 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 글루코즈-6-포스페이트 이소머라아제 프로모터(PG11)와 같은 당분해 유전자의 프로모터를 포함한다. 이스트의 이러한 프로모터들에 대한 보다 상세한 사항은 (WO 93/03159)에서 찾아볼 수 있다. 다른 유용한 프로모터는 리보좀 단백질 암호 유전자 프로모터(TEF1), 락타아제 유전자 프로모터(LAC4), 알코올 디하이드로게나아제 프로모터(ADH1, ADH4 등), 에놀라아제 프로모터(ENO) 및 헥소즈(글루코즈) 트랜스포터 프로모터(HXT7)이다. 변형적으로, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 선택적으로 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 S. cerevisiae ANB1 프로모터(SEQ ID NO: 19)와 같은 무산소 프로모터를 이용하여 혐기적 조건하에서 과발현된다. 모두 구성적이며 유도적인 다른 프로모터들 및 인핸서 또는 상향흐름 활성화 서열은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다. 바람직하게, 상기 정의된 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 숙주 세포에 동종성이다. 적절한 종결 서열은 예를 들어 시토크롬 c1(CYC1) 유전자 또는 알코올 디하이드로게나아제 유전자(예, ADH1)로부터 획득가능하다.
아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 선택적으로 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소가 본 발명의 형질전환된 숙주 세포에서 충분한 수준으로 그리고 활성적인 형태로 발현되는 가능성을 증가시키기 위해, 이러한 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 본 발명의 다른 효소(하기 참조)는 바람직하게 문제의 숙주 세포의 효소에 대해 이들의 코돈 사용을 최적화하도록 개작된다. 숙주 세포의 코돈 사용에 대한 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 적용성은 코돈 적응 지수(CAI)로 표현될 수 있다. 코돈 적응 지수는 본 명세서에서 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 고 발현되는 유전자의 코돈 사용에 대한 유전자의 코돈 사용의 상대적 적응성의 측정으로 정의된다. 각 코돈의 상대적 적응성(w)은 각 코돈의 동일한 아미노산에 대한 가장 풍부한 코돈의 적응성에 대한 사용의 비율이다. CAI 지수는 이러한 상대적인 적응성 값의 기하학적 평균으로 정의된다. 비슷하지 않은 코돈 및 종결 코돈(유전학적 암호에 따라 달라짐)은 배제된다. CAI 값은 0 내지 1이며, 보다 높은 값은 보다 높은 비율의 가장 풍부한 코돈을 나타낸다(Sharp and Li , 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; also see: Jansen et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31(8):2242-51). 적응된 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 CAI를 갖는다. 가장 바람직하게 예를 들어, S. cerevisiae 세포와 같은 문제의 균류 숙주 세포에서 발현을 위하 코돈 최적화된 서열이다.
상기 뉴클레오타이드 서열은, 바람직하게 형질전환된 숙주 세포에서 활성 형태로 발현되는 아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 선택적으로 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화한다. 따라서, 숙주 세포에서 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현은 본 명세서에 실시예에 기재된 바와 같이 30℃에서 형질전환된 숙주 세포의 세포 추출물에서 아세틸-CoA 의존적 NADH 환원비로 측정시 적어도 0.005, 0.010, 0.020, 0.050 또는 0.10μmol min-1 (mg protein)-1의 특정 활성을 갖는 아세트알데히드 디하이드로게나아제를 생성한다.
아세트알데히드 디하이드로게나아제 및 선택적으로 알코올 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물로 형질전환되는 숙주 세포는 바람직하게 이스트 숙주 세포이다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 배양된 세포이다. 본 발명의 숙주 세포는 바람직하게 펜토즈(자일로즈 및 바람직하게 또한 아라미노즈)를 세포내로 능동적 또는 수동적으로 수송할 수 있는 숙주이다. 상기 숙주 세포는 바람직하게 활성 당분해를 함유한다. 상기 숙주 세포는 또한 바람직하게, 자일로즈로부터 이소머화된 자일룰로즈가 피루베이트로 대사될 수 있도록, 내인성 펜토즈 포스페이트 경로를 함유하며, 내인성 자일룰로즈 키나아제 활성을 함유할 수 있다. 상기 숙주는 또한 바람직하게 에탄올, 락틱산, 3-히드록시-프로피온산, 아크릴산, 1,3-프로판-디올, 부탄올(1-부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올) 및 이소프레노이드-유래 산물과 같은 원하는 발효 산물로의 (바람직하게 피루베이트를 통해) 펜토즈의 전환을 위한 효소 함유한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 자연적으로 알코올 발효가능한, 바람직하게는 혐기적 알코올 발효가능한 이스트 세포이다. 이스트 숙주 세포는 또한 바람직하게 에탄올에 대해 높은 내성, 저 pH에 높은 내성(즉, pH 5, 4 또는 3이하에서 성장이 가능함)을 가지며, 프루프랄 및 히드록시-메틸프루프랄과 같은 락틱산, 아세트산 또는 포름산 및 당 분해물과 같은 유기산에 대해 높은 내성을 가지며, 그리고 상승된 온도에 대해 높은 내성을 갖는다. 상기 숙주 세포의 이러한 어느 특성 또는 활성은 숙주 세포에 자연적으로 존재하거나 또는 유전적 변형에 의해 도입되거나 변형될 수 있으며, 바람직하게는 자가 클로닝에 의해 또는 하기 본 발명의 방법에 의해 도입되거나 변형될 수 있다. 적절한 세포는 배양된 세포, 예를 들어 수중 또는 고상 발효에서와 같은 발효 공정에서 배양될 수 있는 세포이다. 특히 적절한 세포는 예를 들어, 균류와 같은 진핵 미생물이나, 본 발명에 사용되기에 가장 적절한 것은 이스트이다.
본 명세서에서 이스트는 진행 미생물로서 정의되며, 주로 단세포 형태로 성장하는 모든 하위 분류의 진균류종을 포함한다(Yeasts: characteristics and identification, J.A. Barnett, R.W. Payne, D. Yarrow, 2000, 3rd ed., Cambridge University Press, Cambridge UK; and, The yeasts, a taxonomic study, C.P. Kurtzman and J.W. Fell (eds) 1998, 4th ed., Elsevier Science Publ. B.V., Amsterdam, The Netherlands). 이스트는 단세포 엽상체의 출아에 의해 성장하거나 유기체의 분열에 의해 성장할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 이스트 세포는 속 Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia , Schizosaccharomyces, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, 및 Yarrowia 에 속한다. 바람직하게 상기 이스트는 혐기적 발효가 가능하며, 보다 바람직하게 혐기적 알코올 발효가 가능하다. 수년간, 당료 작물로부터 바이오-에탄올의 생성을 위한 다양한 미생물의 도입에 대한 제안이 이루어져 왔다. 그러나, 실제로, 모든 주요 바이오-에탄올 생성 공정은 에탄올 생산자로서 속 Saccharomyces의 이스트를 계속 사용하였다. 이는 산업적 공정을 위한 Saccharomyces의 많은 매력적 특징들, 즉, 높은 산-, 에탄올- 및 삼투압-내성, 혐기적 성장의 능력 및 물론 이의 높은 알코올 발효 성능에 기인한다. 숙주 세포로서 바람직한 이스트종은 S. cerevisiae, S. exiguus, S. bayanus, K. lactis , K. marxianus 및 Schizosaccharomyces pombe를 포함한다.
다른 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 세포안에 NAD+-결합된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 도입하는 유전적 변형을 더 포함한다. 내인성 이스트 GCY1 유전자에 의해 암호화되는 글리세롤 디하이드로게나아제는 NAD+(EC 1.1.1.6)과 상반적으로 보조인자 NADP+(EC 1.1.1.72)에 특이적인 것으로 나타났다. S. cerevisiae와 같은 이스트는 NAD+-의존적 글리세롤 디하이드로게나아제 활성이 결여된 것으로 나타났다(EC 1.1.1.6) (참조 예. KEGG pathway 00561). NAD--결합된 글리세롤 디하이드로게나아제는 본 명세서에서 화학 반응을 촉매하는 효소로 이해된다(EC 1.1.1.6).
글리세롤 + NAD+ ↔ 글리세론 + NADH + H+
일반적으로 사용되는 다른 명칭은 글리세린 디하이드로게나아제 및 글리세롤:NAD+ 2-옥시도리덕타아제를 포함한다.
바람직하게, 숙주 세포에 NAD+-결합 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 도입하는 유전학적 변형은 숙주 세포에 이종성인 NAD+-결합 글리세롤 디하이드로게나아제의 발현이다. 보다 바람직하게, 본 발명의 세포에서 이종성 글리세롤 디하이드로게나아제의 발현을 위한 뉴클레오타이드 서열은 보조인자로서 NAD+를 사용하는 박테리아 글리세롤 디하이드로게나아제를 암호화하는 서열이다. 본 발명의 숙주 세포에서 발현을 위한 박테리아 NAD+-결합 글리세롤 디하이드로게나아제의 적절한 예는 예를 들어, Truniger 및 Boos(1994, J Bacteriol. 176(6):1796-1800)에 기재된 E. coli의 gldA 유전자이며, 이스트에서 이의 발현은 이미 보고된바 있다(Lee 및 Dasilva, 2006, Metab Eng. 8(1):58-65). 바람직하게, 이종성 글리세롤 디하이드로게나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 7과 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ ID NO: 7과 비교하여 하나 또는 여러 개의 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 구현으로, 상기 이종성 글리세롤 디하이드로게나아제를 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 7의 글리세롤 디하이드로게나아제의 아미노산 서열을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열과 같이 과발현된다. 이러한 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 21(위치 10 - 1113; CAI = 0.976)에 제공된다.
상기 글리세롤 디하이드로게나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현을 위해, (발현될) 상기 뉴클레오타이드 서열은 본 발명의 숙주 세포내로 발현 구조물의 형질전환시 글리세롤 디하이드로게나아제 효소의 과발현을 확실히 하도록 적절한 발현 조절 부위/서열에 작동가능하게 연결되는 발현 구조물에 넣어진다(상기 참조). 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 (과)발현을 위해 적절한 프로모터는, 바람직하게 이화대사(글루코즈) 억제에 민감하지 않으며, 혐기적 조건하에서 활성적이며 그리고/또는 바람직하게 유도를 위해 자일로즈 또는 아라비노즈를 필요로 하지 않는 프로모터들을 포함한다.
이러한 프로모터들의 예는 상기 주어진다. 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 본 실시예에 기재된 바와 같이 30℃에서 형질전환된 숙주 세포의 세포 추출물에서 측정시 적어도 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, or 5.0 U min-1 (mg protein)-1의 특이적 NAD+-결합 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 생성한다.
다른 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 또한 세포에서 히히드록시아세톤 키나아제의 특이적 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 내인성 DAK1 디히드록시아세톤 키나아제가 이미 S. cerevisiae에서 고 수준으로 발현되는 것으로 전사체 데이터는 보여주었다. 본 발명의 세포에서 디히드록시아세톤 키나아제 활성의 추가 증가는 따라서 엄격히 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 바람직한 구현으로, 최적 전환율을 위해, 따라서 본 발명의 숙주 세포는 세포내에 디히드록시아세톤 키나아제의 특이적 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 디히드록시아세톤 키나아제는 본 명세서에서 화학반응(EC 2.7.1.29)을 촉매하는 효소로 이해된다:
ATP + 글리세론 ↔ ADP + 글리세론 포스페이트
일반적으로 사용되는 다른 명칭은 글리세론 키나아제, ATP:글리세론 포스포트랜스퍼라아제 및 (포스포릴화) 아세톨 키나아제를 포함한다. 글리세론 및 디히드록시아세톤은 동일한 분자인 것으로 이해된다. 바람직하게, 유전적 변형은 예를 들어, 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현에 의해 디히드록시아세톤 키나아제의 과발현을 일으킨다. 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포에 내인성이거나 또는 세포에 이종성인 디히드록시아세톤 키나아제일 수 있다. 본 발명의 세포에서 디히드록시아세톤 키나아제의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, Molin et al(2003, J. Biol. Chem. 278:1415-1423)에 의해 기재된 S. cerevisiae의 디히드록시아세톤 키나아제 유전자(DAK1) 및 (DAK2)이다. 바람직하게, 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs: 8 및 9 중 적어도 하나와 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현으로, 디히드록사아세톤 키나아제를 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 8의 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ ID NO: 9의 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열과 같이 과발현된다. 디히드록시아세톤 키나아제의 과발현을 위한 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 디히드록시아세톤 키타아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이며, SEQ ID NOs: 8(S. cerevisiae(DAK1)) 또는 SEQ ID NO: 8과 비교하여 하나 또는 여러 개의 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 것 중 적어도 하나와 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 세포에서 이종성 디히드록시아세톤 키나아제의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, Daniel 등(1995, J. Bacteriol. 177:4392-4401)에 의해 기재된 Citobacter freundii의 dhaK 유전자와 같은 박테리아 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 서열이다. 바람직하게, 이종성 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 25와 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ ID NO: 25와 비교하여 하나 또는 여러 개의 치환, 삽입 및/또는 결실을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 구현으로, 이종성 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어 SEQ ID NO: 25의 디히드록시아세톤 키나아제의 아미노산 서열을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열과 같이 과발현된다. 이러한 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, SEQ ID NO: 26(위치 10 - 1668)에 제공된다.
디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현을 위해, (과발현되는) 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 본 발명의 숙주 세포내로 발현 구조물의 형질전환시 디히드록시아세톤 키나아제 효소의 과발현을 확실히 하도록 적절한 발현 조절 부위/서열에 작동가능하게 연결된 발현 구조물에 넣어진다(상기 참조). 디히드록시아세톤 키나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 (과)발현을 위해 적절한 프로모터는, 바람직하게 이화대사(글루코즈) 억제에 민감하지 않으며, 혐기적 조건하에서 활성적이며 그리고/또는 바람직하게 유도를 위해 자일로즈 또는 아라비노즈를 필요로 하지 않는 프로모터들을 포함한다. 이러한 프로모터들의 예는 상기에 주어진다. 본 발명의 세포에서, 과발현되는 디히드록시아세톤 키나아제는 바람직하게 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20이 과발현된다. 바람직하게, 상기 디히드록시아세톤 키나아제는 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20이 혐기적 조건하에서 과발현된다. 이러한 수준의 과발현은 세포에서 안정한 상태 수준의 효소의 활성(세포에서 특이적 활성), 안정한 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라, 안정한 상태 수준의 효소를 암호하는 전사체에 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 과발현은 본 명세서에서 실시예에 기재된 바와 같이 30℃에서 형질전환된 숙주 세포의 세포 추출물에서 검출시, 적어도 0.002, 0.005, 0.01, 0.02 또는 0.05 U min-1(mg protein)-1의 특이적 디히드록시아세톤 키나아제 활성을 생성한다.
다른 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 또한 글리세롤의 세포내로의 수송을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게, 글리세롤의 세포내로의 수송을 증가시키는 유전적 변형은 바람직하게 글리세롤 흡수 단백질 및 글리세롤 채널 중 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 관발현을 일으키는 유전적 변형이다.
글리세롤 흡수 단백질은 본 명세서에서, 예를 들어, GUP1 및 GUP2 유전자에 의해 암호화되는 S. cerevisiae 글리세롤 흡수 단백질을 포함하는 멤브레인 바운드 O-아실트랜스퍼라아제(MBOAT) 수퍼패밀리에 포함되는 것들에 속하는 멀티멤브레인-스패닝 단백질로 이해된다. 바람직하게, 상기 유전적 변형은 예를 들어, 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현에 의해 글리세롤 흡수 단백질의 과발현을 일으킨다. 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 세포에 내인성이거나 또는 상기 세포에 이종성인 글리세롤 흡수 단백질일 수 있다. 본 발명의 세포에서 글리세롤 흡수 단백질의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, Neves 등(2004, FEMS Yeast Res. 5:51-62)에 의해 기재된 바와 같은, 예를 들어, S. cerevisiae (GUP1) 및 (GUP2)의 글리세롤 흡수 단백질 유전자 및 이의 상동 유전자이다. 바람직하게, 상기 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO's: 10(Gup1p) 및 11(Gup2p) 중 적어도 하나와 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직한 구현으로, 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, SEQ ID NO: 10의 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열 또는 SEQ ID NO: 11의 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 코돈 회적화된 뉴클레오타이드 서열과 같이 과발현된다. 글리세롤 수송에 대한 GUP1의 영향의 정확한 특성이 아직 불투명함에도 불구하고, Yu 등(2010, 상기 참조)은 S. cerevisiae에서 GUP1의 과발현이 글리세롤 성장 세포에서 에탄올 생성을 향상시키는 것으로 나타났다. 글리세롤 흡수 단백질의 과발현에 대한 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 따라서 Neves 등(2004, 상기 참조)에 의해 기술된 바와 같은 상보성에 의해 S. cerevisiae gup1 Δ 돌연변이의 염 스트레스-관련 표현형을 구조할 수 있는 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다. 이러한 S. cerevisiae GUP1의 상보성 상동 유전자는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열과 적어도 60, 68, 72, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Pichia, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces, 및 Yarrowia의 속에 속하는 이스트종으로부터 획득될 수 있다.
본 명세서에서 글리세롤 채널은 Reizer 등(1993, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 28: 235-257)에 의해 리뷰된 MIP과의 채널 단백질의 멤버로서 이해되며, 이 채널 단백질은 6 멤브래인-스패닝 도메인으로 구성되는 250-280 아미노산 트랜스멤브레인 도메인을 포함하며, S. cerevisiae FPS1 아쿠아글리세로포린, SEQ ID NO: 12의 아미노산 250 및 530 사이의 아미노산 서열과 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 동일성, 또는 적어도 55, 60, 65, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는다. 본 발명의 세포에서 글리세롤 채널의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, S. cerevisiae의 이스트 아쿠아글리세로포린 FPS1 유전자(Van Aelst et al., 1991, EMBO J. 10:2095-2104) 및 예를 들어, Neves 등(2004, 상기 참조)에 의해 기재된 바와 같은 Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus 및 Zygosaccharomyces rouxii 를 포함하는 다른 이스트들의 이의 상동 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 그러나, 예를 들어, Luyten 등(1995, EMBO J. 14:1360-1371)이 S. cerevisiae FPS1 아쿠아글리세로포린의 아미노산 250 내지 530 사이의 아미노산 서열과 단지 30% 서열 동일성을 갖는 E. coli 글리세롤 패실리태이터가 S. cerevisiae fps1 Δ 돌연변이에서 상보적인 글리세롤 흡수를 할 수 있다는 것을 보여준 바와 같이, 박테리아 또는 식물 글리세롤 채널의 사용이 배제되지 않는다. 글리세롤 채널을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포에 내인성이거나 또는 세포에 외인성인 글리세롤 채널일 수 있다. 바람직한 구현으로, SEQ ID NO: 12의 아쿠아글리세로포린을 암호화하는 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열과 같이 글리세롤 채널을 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열은 과발현된다.
글리세롤 흡수 단백질 및/또는 글리세롤 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현을 위해, (과발현되는) 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 본 발명의 숙주 세포내로 발현 구조물의 형질전환시 글리세롤 흡수 단백질 및/또는 글리세롤 채널 단백질의 과발현을 확실히 하도록 적절한 발현 조절 부위/서열에 작동가능하게 연결된 발현 구조물에 넣어진다(상기 참조). 글리세롤 흡수 단백질 및/또는 글리세롤 채널 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 (과)발현을 위해 적절한 프로모터는, 바람직하게 이화대사(글루코즈) 억제에 민감하지 않으며, 혐기적 조건하에서 활성적이며 그리고/또는 바람직하게 유도를 위해 자일로즈 또는 아라비노즈를 필요로 하지 않는 프로모터들을 포함한다. 이러한 프로모터들의 예는 상기에 주어진다. 본 발명의 세포에서, 과발현되는 글리세롤 흡수 단백질 및/또는 글리세롤 채널 단백질은 바람직하게 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20이 과발현된다. 바람직하게, 상기 글리세롤 흡수 단백질 및/또는 글리세롤 채널 단백질은 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20이 혐기적 조건하에서 과발현된다. 이러한 수준의 과발현은 세포에서 안정한 상태 수준의 효소의 활성(세포에서 특이적 활성), 안정한 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라, 안정한 상태 수준의 효소를 암호하는 전사체에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 숙주 세포의 바람직한 구현으로, 상기 정의된 글리세롤 채널 단백질의 발현은 감소되거나 불활성화된다. 글리세롤 채널 단백질의 발현을 감소시키거나 불활성화시키는 유전적 변형은 세포 외로 글리세롤의 수송을 감소 또는 억제하는데 유용할 수 있다. 바람직하게, 글리세롤 채널 단백질의 발현의 감소 또는 불활성화는 상기 정의한 바와 같이 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현과 조합된다.
다른 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 또한 세포에서, 특이적 아세틸-CoA 합성 효소 활성을 증가시키는, 바람직하게 이러한 활성이 이러한 조건하에서 속도-제한되는 혐기적 조건하에서, 특이적 아세틸-CoA 합성 효소 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 아세틸-CoA 합성효소 또는 아세테이트-CoA 리가아제(EC 6.2.1.1)는 본 명세서에서 아세테이트와 조효소 A(CoA) 사이의 새로운 화학 결합의 형성을 촉매하는 효소로 이해된다. 바람직하게, 유전적 변형은 예를 들어, 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현에 의해 아세틸-CoA 합성효소의 과발현을 일으킨다. 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 세포에 내인성이거나 또는 세포에 이종성인 아세틸-CoA 합성효소일 수 있다. 본 발명의 세포에서 아세틸-CoA 합성효소의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, Jong-Gubbels 등(1998, FEMS Microbiol Lett. 165: 15-20)에 의해 기술된 바와 같이, S. cerevisiae (ACS1 및 ACS2)의 아세틸-CoA 합성효소 유전자이다. 바람직하게, 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NOs: 13 및 14 중 적어도 하나와 적어도 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 구현으로, 과발현되는 뉴클레오타이드 서열은 아세테이트에 대해 고 친화도로 아세틸-CoA 합성효소를 암호화한다. 아세테이트에 대해 고 친화도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소의 사용은, 예를 들어 배지 L당 2g 이하의 아세트산과 같이 배지내에 상대적으로 저 농도의 아세트산이 존재하는 조건하에서 행하는 것이 바람직하다. 아세테이트에 대해 고 친화도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소는 S. cerevisiae ACS2에 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소보다 더 높은 아세테이트 친화도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소로 정의된다. 바람직하게, 아세테이트에 대해 고 친화도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소는 S. cerevisiae ACS1 유전자에 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소와 같이 10, 5, 2, 1, 0.5, 0.2 또는 0.1 mM 이하의 아세테이트에 대한 Km을 갖는다. 보다 바람직하게 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열이 과발현된다.
다른 구현으로, 과발현되는 뉴클레오타이드 서열은 높은 최대 속도(Vmax)로 아세틸-CoA 합성효소를 암호화한다. 높은 최대 속도로 아세틸-CoA 합성효소의 사용은, 예를 들어, 배지 L당 적어도 2, 3, 4 또는 5g 아세트산과 같이 배지내에 상대적으로 높은 농도의 아세트산이 존재하는 조건하에서 수행되는 것이 바람직하다. 높은 최대 속도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소는 본 명세서에서 S. cerevisiae ACS1에 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소보다 더 높은 최대 속도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소로 정의된다. 바람직하게, 높은 최대 속도를 갖는 아세틸-CoA 합성효소는 S. cerevisiae ACS2 유전자 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소이다. 보다 바람직하게, SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 암호화하는 코돈-최적화된(상기 참조) 뉴클레오타이드 서열이 과발현된다.
(과발현되는) 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현을 위해, (과발현되는) 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게 본 발명의 숙주 세포내로 발현 구조물의 형질전환시 아세틸-CoA 합성효소의 과발현을 확실히 하도록 적절한 발현 조절 부위/서열에 작동가능하게 연결된 발현 구조물에 넣어진다(상기 참조). 아세틸-CoA 합성효소 활성을 갖는 상기 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 (과)발현을 위해 적절한 프로모터는, 바람직하게 이화대사(글루코즈) 억제에 민감하지 않으며, 혐기적 조건하에서 활성적이며 그리고/또는 바람직하게 유도를 위해 자일로즈 또는 아라비노즈를 필요로 하지 않는 프로모터들을 포함한다. 이러한 프로모터들의 예는 상기에 주어진다. 본 발명의 세포에서, 과발현되는 아세틸-CoA 합성효소는 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20이 과발현된다. 바람직하게, 상기 아세틸-CoA 합성효소는 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인과 비교하여 적어도 팩터 2, 5, 10, 20, 50 또는 100이 혐기적 조건하에서 과발현된다. 이러한 수준의 과발현은 세포에서 안정한 상태 수준의 효소의 활성(세포에서 특이적 활성), 안정한 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라, 안정한 상태 수준의 효소를 암호하는 전사체에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
다른 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 또한 세포에서 특이적 NAD+-의존적 글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함한다. 글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제 또는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제(EC 1.1.1.8)는 NADH를 NAD+로 산화시키며 sn-글리세롤 3-포스페이트에 대한 디하이드로게나아제 포스페이트의 환원을 촉매한다. 본 발명의 세포에서, 특이적 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제 활성은 바람직하게 과발현을 일으키는, 바람직하게 혐기적 조건하에서 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인에 비해 바람직하게 적어도 팩터 0.8, 0.5, 0.3, 0.1, 0.05 또는 0.01 감소된다.
바람직하게, 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제 활성은 숙주 세포에서 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 불활성화시키는 하나 이상의 유전적 변형에 의해 감소된다. 바람직하게, 유전적 변형은 세포 게놈에서 특이적 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자의 각 내인성 카피의 발현을 감소시키거나 불활성화시킨다. 주어진 세포는 디-, 폴리- 또는 이수성의 결과로서 하나 및 이와 동일한 아미노산 서열을 갖는 특이적 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자의 다중 카피를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 바람직하게 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 특이적 유전자의 각 카피의 발현은 감소되거나 불활성화된다. 변형적으로, 세포는 아미노산 서열이 다르며 다른 유전자에 의해 각각 암호화된 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제 활성을 갖는 여러 다른 (이소)효소를 함유할 수 있다. 이러한 예에서, 본 발명의 일부 구현으로, 상기 이소효소의 한 특정 타입은 감소되거나 불활성화되고 다른 타입은 영향을 받지 않는 것이 바람직하다(하기 참조). 바람직하게, 상기 유전자는 상기 유전자의 적어도 일부의 결실에 의해 또는 상기 유전자의 붕괴에 의해 불활성화되며, 이러한 정황에서 용어 유전자는 또한 암호 서열의 상향 또는 하향-흐름의 어느 논코딩 서열을 포함하며, 이의 (부분) 결실 또는 불활성화는 숙주 세포에서 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제 활성의 발현 감소를 일으킨다.
본 발명의 세포에서 이의 활성이 감소되거나 불활성화되는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 바람직한 유전자는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 암호화하는 Eriksson 등(1995, Mol. Microbiol. 17: 95-107)에 의해 기재된 바와 같은 S. cerevisiae GPD2 유전자 및 다른 종에서 이의 상동 유전자이다. 따라서, 본 발명의 세포에서 이의 활성이 감소되거나 불활성화되는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자는 SEQ ID NO: 15와 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 기능성 고-삼투성 글리세롤 반응 경로를 포함한다. 따라서, 바람직하게 SEQ ID NO: 15와 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자(들)의 활성만이 감소되거나 불활성화되며, 한편 SEQ ID NO: 16과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 적어도 하나의 내인성 유전자는 기능적이다. SEQ ID NO: 16은 Albertyn 등(1994, Mol. Cell. Biol. 14: 4135-4144)에 의해 기재된 바와 같은 S. cerevisiae GPD1 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 나타내며, 이는 S. cerevisiae GPD2 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제와 69% 아미노산 동일성을 갖는다. S. cerevisiae GPD1 유전자는 S. cerevisiae의 스트레스-유도 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제이며, 이는 산업적 발효 조건하에서 일어날 수 있는 삼투압 스트레스하에서 성장에 중요하다. 이의 발현은 특히 고-삼투성 글리세롤 반응 경로에 의해 조절된다. 따라서, 본 발명의 숙주 세포는 SEQ ID NO: 16과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 내인성 유전자의 적어도 하나의 기능적 카피를 갖는 것이 유리하다.
상기에도 불구하고, 본 발명자들은 S. cerevisiae GPD1 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제의 불활성화가, S. cerevisiae GPD2 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제의 불활성화에 비해, 글리세롤 생성의 감소 및 글리세롤 및 아세테이트 소비의 증가에 보다 유리한 효과를 갖는다는 것을 이제 예기치않게 발견하였다. 따라서, 보다 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 SEQ ID NO: 16(GDP1)에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 유전자(들)의 발현을 감소시키거나 불활성화시키는 유전적 변형을 포함한다.
다른 구현으로, 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 숙주 세포에서 모든 유전자의 활성이 감소되거나 불활성화된다. 이러한 세포에서, 바람직하게 SEQ ID NO: 15 또는 16에 대해 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 내인성 유전자의 모든 카피는 발현이 불활성화되거나 적어도 감소된다.
본 발명의 다른 구현으로, 상기 숙주 세포는 피부베이트 및 조효소-A를 포메이트 및 아세틸-CoA로 전환시키는 능력을 가진 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하는 이스트 세포가 아니다. 바람직하게, 상기 숙주 세포는 피루베이트 포메이트 리아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 이스트 세포가 아니다.
본 발명의 다른 구현으로, 상기 숙주 세포는 특이적 포메이트 디하이드로게나아제 활성이, a) 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하며, 아세트산을 에탄올로 전화하는 능력을 세포에 부여하는 외인성 유전자(의 도입); b) NAD+-결합 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 박테리아 유전자; 및 c) 본 명세서에 상기한 다른 어느 유전적 변형물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 숙주 세포의 스트레인에서 특이적 포메이트 디하이드로게나아제 활성의 적어도 81, 85, 90, 95 또는 100%인 숙주 세포이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 숙주 세포는 세포에서 특이적 NAD+-의존적 포메이트 디하이드로게나아제 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 이스트 세포가 아니다.
다른 바람직한 구현으로, 본 발명의 숙주 세포는 a) 자일로즈를 자일룰로즈로 이소머화하는 능력; 및 b) L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환하는 능력 중 적어도 하나를 갖는다. a)에 대해, 세포는 바람직하게 기능적 외인성 자일로즈 이소머라아제 유전자를 가지며, 이 유전자는 세포에 자일로즈를 자일룰로즈로 이소머화하는 능력을 부여한다. b)에 대해, 세포는 바람직하게 L-아라비노즈 이소머라아제, L-리불로키나아제 및 L-리불로즈-5-포스페이트 4-에피머라아제를 암호화하는 기능적 외인성 유전자를 가지며, 이 유전자는 L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환시키는 이소머화 능력을 세포에 부여한다.
자일로즈를 자일룰로즈로 이소머화하는 능력을 가진 균류 숙주 세포는 예를 들어, WO 03/0624430 및 WO 06/009434에 기재되어 있는 바와 같다. 자일로즈를 자일룰로즈로 이소머화하는 능력은 바람직하게 자일로즈 이소머라아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물을 이용한 형질전환에 의해 세포에 부여된다. 따라서, 바람직하게 상기 세포는 자일로즈를 자일룰로즈로 직접 이소머화하는 능력을 획득한다. 이에 따라, 보다 바람직하게 상기 세포는 자일로즈의 자일룰로즈의 직접적인 이소머화 (및 자일로즈의 추가 대사)를 통해 태양 에너지 및/또는 탄소 공급원으로서 자일로즈에서 호기적으로 그리고/또는 혐기적으로 성장하는 능력을 획득한다. 여기서 자일로즈의 자일룰로즈로의 직접적인 이소머화는, 각각 자일로즈 환원효소 및 자일리톨 디하이드로게나아제에 의해 촉매되는 자일리톨 중간물을 통해 자일로즈의 자일룰로즈의 2단계 전환과 상반적으로, 자일로즈 이소머라아제에 의해 촉매되는 단일 반응으로 일어나는 것으로 이해된다.
본 발명의 세포에 자일로즈를 자일룰로즈로 직접 이소머화하는 능력을 부여하는데 성공적으로 사용될 수 있는 여러 자일로즈 이소머라아제 (및 이들의 아미노산 및 암호 뉴클레오타이드 서열)는 당해 기술분야에 기술되어 있다. 이들은 Piromyces sp. 및 Neocallimastix, Caecomyces, Piromyces 또는 Ruminomyces(WO 03/0624430), Cyllamyces aberensis(US 20060234364), Orpinomyces(Madhavan et al., 2008, DOI 10.1007/s00253-008-1794-6)과에 속하는 다른 혐기성 균류의 자일로즈 이소머라아제, 예를 들어, B. thetaiotaomicron (WO 06/009434), B. fragilis, 및 B. uniformis (WO 09/109633)를 포함하는 박테리아속 Bacteroides의 자일로즈 이소머라아제, 혐기성 박테리아 Clostridium phytofermentans (Brat et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2304-2311)의 자일로즈 이소머라아제, 및 Clostridium difficile, Ciona intestinales 및 Fusobacterium mortiferum의 자일로즈 이소머라아제를 포함한다.
예를 들어, Wissenlink 등(2007, AEM Accepts, published online ahead of print on 1 June 2007; Appl. Environ. Microbiol. doi:10.1128/AEM.00177-07) 및 EP 1 499 708에 기재된 바와 같은, L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환하는 능력을 가진 균류 숙주 세포가 사용된다. L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환하는 능력은 바람직하게 a) 아라비노즈 이소머라아제; b) 리불로인산화 효소, 바람직하게 L-리불로인산화 효소 자일로즈 이소머라아제; 및 c) 리불로즈-5-P-4-에피머라아제, 바람직하게 L-리불로즈-5-P-4-에피머라아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 구조물(들)을 이용한 형질전환에 의해 세포에 부여된다. 바람직하게, 본 발명의 세포에서, L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환시키는 능력은, 1) 아라비노즈의 리불로즈로의 이소머화; 2) 리불로즈의 리불로즈 5-포스페이트로의 인산화 및 3) 리불로즈 5-포스페이트의 D-자일로즈 5-포스페이트로의 에피머화를 통한 L-아라비노즈의 D-자일로즈 5-포스페이트로의 전환 능력이다. 아라비노즈 이소머라아제, 리불로인산환 효소 및 리불로즈-5-P-4-에피머라아제를 암호화하는 적절한 뉴클레오타이드 서열은 Bacillus subtilis, Escherichia coli(참조 예 EP 1 499 708), Lactobacilli, 예, Lactobacillus plantarum(참조 예 Wisselink et al. supra), 또는Clavibacter, Arthrobacter 및 Gramella의 종으로부터 획득될 수 있으며, 이중에서 바람직하게는Clavibacter michiganensis , Arthrobacter aurescens and Gramella forsetii(참조 WO2009/011591)이다.
본 발명의 형질전환된 숙주 세포는 또한 바람직하게, 자일로즈로부터 이소머화되는 자일룰로즈가 피루베이트로 대사될 수 있도록 자일룰로즈 키나아제 활성을 포함한다. 바람직하게, 상기 세포는 내인성 자일룰로즈 키나아제 활성을 함유한다. 보다 바람직하게, 본 발명의 세포는 특이적 자일룰로즈 키나아제 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게, 유전적 변형은 예를 들어, 자일룰로즈 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현에 의해 자일룰로즈 키나아제의 과발현을 일으킨다. 자일룰로즈 키나아제를 암호화하는 유전자는 세포에 대해 내인성이거나 세포에 이종성인 자일룰로즈 키나아제일 수 있다. 본 발명의 세포에서 자일룰로즈 키나아제의 과발현에 사용될 수 있는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, Deng 및 Ho(1990, Appl. Biochem. Biotechnol. 24-25: 193-199)에 의해 기재된 S. cerevisiae (XKS1 )의 자일룰로즈 키나아제 유전자이다. 다른 바람직한 자일룰로즈 키나아제는 Piromyces (xylB; 참조 WO 03/0624430)의 자일로즈 키나아제와 관련된 자일로즈 키나아제이다. 이 Piromyces 자일룰로즈 키나아제는 실제로, 이스트 키나아제와 같은 공지된 모든 진핵 키나아제에 비해 원핵 키나아제와 보다 관련된다. 진핵 자일룰로즈 키나아제는 비-특이적 당 키나아제로 나타내며, 이는 자일룰로즈를 포함하는 광범위한 기질 범위를 갖는다. 이와 대조적으로, Piromyces 키나아제가 가장 근접하게 관련된 원핵 자일룰로즈 키나아제는 자일룰로즈에 보다 특이적인, 즉 보다 좁은 기질 범위를 갖는 키나아제인 것으로 나타났다. 본 발명의 세포에서, 과발현되는 자일로즈 키나아제는, 과발현을 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인에 비해 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20으로 과발현된다. 이러한 수준의 과발현은 안정한 상태 수준의 효소의 활성, 안정한 상태 수준의 효소의 단백질뿐만 아니라, 안정한 상태 수준의 효소를 암호하는 전사체에 적용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 세포는 또한 바람직하게 WO06/009434에 기재된 바와 같은 펜토즈 포스페이트 경로의 플럭스를 증가시키는 유전적 변형을 포함한다. 특히, 유전적 변형은 비-산화부 펜토즈 포스페이트 경로의 증가된 플럭스를 일으킨다. 펜토즈 포스페이트 경로의 비-산화부의 증가된 플럭스를 일으키는 유전적 변형은 본 명세서에서 증가된 플럭스를 일으키는 유전적 변형을 제외하고 유전적으로 동일한 스트레인에서의 플럭스에 비해 적어도 팩터 1.1, 1.2, 1.5, 2, 5, 10 또는 20으로 플럭스를 증가시키는 변형을 의미하는 것으로 이해된다. 펜토즈 포스페이트 경로의 비-산화부의 플럭스는 WO 06/009434에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
펜토즈 포스페이트 경로의 플럭스를 증가시키는 유전적 변형은 다양한 방법으로 본 발명의 세포에 도입될 수 있다. 이는 예를 들어, 보다 높은 안정한 상태 수준 활성 수준의 자일룰로즈 키나아제 및/또는 비-산화부 펜토즈 포스페이트 경로의 하나 이상의 효소 및/또는 감소된 안정한 상태 수준의 비특이적 알도즈 환원효소 활성을 달성하는 것을 포함한다. 이러한 안정한 상태 활성 수준의 변화는 (자연적이거나 또는, 화학 또는 방사선에 의해 유도되는) 돌연변이의 선별에 의해 그리고/또는 예를 들어, 각각 상기 효소를 암호화하는 유전자 또는 이러한 유전자를 조절하는 인자의 과발현 또는 불활성화에 의한 것과 같은 재조합 DNA 기술에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 바람직한 세포에서, 유전적 변형은 (비-산화부) 펜토즈 포스페이트 경로의 적어도 하나의 효소의 과발현을 포함한다. 바람직하게, 상기 효소는 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제를 암호화하는 효소로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 상기 (비-산화부) 펜토즈 포스페이트 경로의 다양한 조합의 효소가 과발현될 수 있다. 예를 들어, 과발현되는 효소는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제 및 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제 및 트랜스케톨라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 및 트랜스케톨라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 및 트랜스알돌라아제 효소이거나; 또는 적어도 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 및 트랜스알돌라아제 효소이거나; 또는 적어도 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 및 트랜스케톨라아제 효소일 수 있다. 본 발명의 일 구현으로, 각각의 효소 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제가 본 발명의 세포에서 과발현된다. 유전적 변형이 적어도 효소 트랜스알돌라아제의 과발현을 포함하는 세포가 바람직하다. 숙주 세포가 이미 자일로스에서 혐기적 성장이 가능한 것과 같이, 유전적 변형이 적어도 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제 효소 모두의 과발현을 포함하는 것이 보다 바람직하다. 실제로, 4가지 모든 효소, 즉, 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제, 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제를 과발현하는 세포와 같이, 일부 조건하에서, 트랜스케톨라아제 및 트랜스알돌라아제만을 과발현하는 세포가 이미 자일로즈에서 동일한 혐기적 성장 속도를 갖는 것을 발견하였다. 더욱이, 리불로즈-5-포스페이트 이소머라아제 및 리불로즈-5-포스페이트 3-에피머라아제 효소 모두를 과발현하는 본 발명의 세포는 이러한 효소들 중 하나만의 과발현이 대사 불균형을 생성함에 따라, 상기 이소머라아제 또는 상기 3-에피머라아제만을 과발현하는 세포에 비해 바람직하다.
본 발명의 세포에서 효소의 과발현을 위해 당해 기술분야에 이용가능한 다양한 수단들이 있다. 구체적으로, 효소는 예를 들어, 세포의 게놈내의 유전자의 부가적인 카피를 통합함으로써, 에피좀 다중카피 발현벡터로부터 유전자를 발현시킴으로써 또는 유전자의 다중카피를 포함하는 에피좀 발현벡터를 도입함으로써 세포에서 효소를 암호화하는 유전자의 카피 수를 증가시켜 과발현될 수 있다. 효소의 과발현에 사용되는 암호 서열은 바람직하게 본 발명의 숙주 세포와 동종성이다. 그러나, 본 발명의 숙주 세포에 이종성인 암호 서열이 마찬가지로 적용될 수 있다.
변형적으로, 본 발명의 세포에서 효소의 과발현은, 과발현되는 효소를 암호화하는 서열에 고유적이지 않은 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다. 즉, 작동가능하게 연결되는 암호 서열에 이종성인 프로모터를 이용할 수 있다. 상기 프로모터는 바람직하게 이에 작동가능하게 연결되는 코딩 서열에 이종성임에도 불구하고, 상기 프로모터는 동종성, 즉, 본 발명의 세포에 내인성인 것이 또한 바람직하다. 바람직하게, 이종성 프로모터는 바람직하게는, 자일로즈 또는 자일로즈 및 글루코즈가 탄소 공급원으로, 보다 바람직하게는, 주요 탄소 공급원으로서(즉, 이용가능한 탄소 공급원의 50% 이상이 자일로즈 또는 자일로즈 및 글루코즈로 구성됨), 가장 바람직하게는 탄소 공급원 단독으로서 이용가능한 조건하에서, 코딩 서열에 고유적인 프로모터인 것보다 보다 높은 안정 상태 수준의 코딩 서열을 포함하는 전사체를 생성할 수 있다(또는 시간 단위당 보다 많은 전사체 분자, 즉, mRNA 분자를 생성할 수 있다).
본 발명의 추가의 바람직한 세포는 세포에서 비특이적 알도즈 환원효소 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게, 비특이적 알도즈 환원효소 활성은, 비특이적 알도즈 환원효소를 암호화하는 유전자의 발현을 감소시키거나 불활성화하는 하나 이상의 유전적 변형에 의해 숙주 세포에서 감소된다. 바람직하게, 유전적 변형은 세포의 게놈에서 자일로즈, 자일룰로즈 및 아라비노즈를 포함하는 알도펜토즈를 환원시킬 수 있는 비특이적 알도즈 환원효소를 암호화하는 유전자의 각 내인성 카피의 발현을 감소시키거나 불활성화한다. 주어진 세포는 디-, 폴리- 또는 이수성의 결과로서 비특이적 알도즈 환원효소를 암호화하는 다중 카피를 포함할 수 있으며, 그리고/또는 세포는 아미노산 서열이 다르며 다른 유전자에 의해 각각 암호화된 알도즈 환원효소 활성을 갖는 여러 다른 (이소)효소를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 예에서, 바람직하게 비특이적 알도즈 환원효소를 암호화하는 각 유전자의 발현은 감소되거나 불활성화된다. 바람직하게, 상기 유전자는 상기 유전자의 적어도 일부의 결실에 의해 또는 상기 유전자의 붕괴에 의해 불활성화되며, 이러한 정황에서 용어 유전자는 또한 암호 서열의 상향 또는 하향-흐름의 어느 논코딩 서열을 포함하며, 이의 (부분) 결실 또는 불활성화는 숙주 세포에서 비특이적 알도즈 환원효소 활성의 발현 감소를 일으킨다. 본 발명의 세포에서 활성이 환원되는 알도즈 환원효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 이러한 알도즈 환원효소의 아미노산 서열은 WO 06/009434에 기재되어 있으며, 예를 들어, S. cerevisiae GRE3 유전자(Traff et al., 2001, Appl. Environm. Microbiol. 67: 5668-5674)의 (비특이적) 알도즈 환원효소 및 다른 종에서 이의 상동 유전자를 포함한다.
본 발명에 따른 다른 바람직한 형질전환 숙주 세포는 (a) 자일로즈 및/또는 아라비노즈의 세포로의 증가된 수송; (b) 이화대사 억제에 대한 감소된 민감성; (c) 에탄올, 삼투성 또는 유기산에 대한 증가된 내성; 및 (d) 부산물의 감소된 생성으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 형성하는 추가의 유전적 변형을 포함할 수 있다. 부산물은 원하는 발효 산물 이외의 탄소-함유 분자를 의미하는 것으로 이해되며, 예를 들어, 자일리톨, 아라비니톨, 글리세롤 및/또는 아세트산을 포함한다. 본 명세서에 기재된 어느 유전적 변형은 통상적인 돌연변이 발생에 의해 그리고 원하는 돌연변이에 대한 스크리닝 및/또는 선별에 의해 도입되거나, 또는 단순히 원하는 특성을 갖는 자연적 돌연변이에 대한 스크리닝 및/또는 선별에 의해 도입될 수 있다. 변형적으로, 유전적 변형은 내인성 유전자의 과발현 및/또는 내인성 유전자의 불활성화로 구성될 수 있다. 아라비노즈 및/또는 자일로즈의 세포내로의 증가된 수송을 위해 과발현이 원하여지는 유전자는 바람직하게 헥소스 또는 펜토즈 트랜스포터를 암호화하는 유전자로부터 선택된다. S. cerevisiae 및 다른 이스트에서, 이러한 유전자는 HXT1 , HXT2 , HXT4 , HXT5 , HXT7 및 GAL2를 포함하며, 이중에서 HXT1 , HXT5 및 GAL2가 가장 바람직하다(Sedlack 및 Ho, Yeast 2004; 21: 671-684). 이스트에서 발현을 위해 바람직한 다른 트랜스포터는 P. stipitis SUT1 유전자(Katahira et al., 2008, Enzyme Microb. Technol. 43: 115-119)에 의해 암호화된 글루코즈 트랜스포터이다. 마찬가지로, 다른 종에서의 이러한 트랜스포터 유전자의 상동 유전자가 과발현될 수 있다. 본 발명의 세포에서 과발현될 수 있는 다른 유전자는 당분해 효소 및 알코올 디하이드로게나아제와 같은 에탄올생성 효소를 암호화하는 유전자를 포함한다. 불활성화를 위한 바람직한 내인성 유전자는 예를 들어, S. cerevisiae HXK2 유전자(참조 Diderich et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 1587-1593); S. cerevisiae MIG1 또는 MIG2 유전자; S. cerevisiae 글리세롤-포스페이트 디하이드로게나아제 1 및/또는 2 유전자와 같은 글리세롤 대사에 연루된 효소를 암호하는 유전자와 같은 헥소스 키나아제 유전자; 또는 다른 종에서 이러한 유전자의 (하이브리드) 상동 유전자를 포함한다. 자일로즈 발효를 위한 숙주 세포의 다른 바람직한 추가 변형은 van Maris 등(2006, Antonie van Leeuwenhoek 90:391-418), WO2006/009434, WO2005/023998, WO2005/111214, 및 WO2005/091733에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 세포들의 어느 유전적 변형은 가능한 한 바람직하게 자가 클로닝 유전 변형에 의해 도입되거나 변형된다.
본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 탄소/에너지 공급원으로서 자일로즈 및 아라미노즈 중 적어도 하나에서, 바람직하게 탄소/에너지 공급원 단독으로서, 그리고 바람직하게 혐기 조건하에서, 즉, 혐기 발효 공정에 대해 하기 정의된 바와 같은 조건하에서 성장하는 능력을 갖는다. 바람직하게, 탄소/에너지 공급원으로서 자일로스에서 성장시, 숙주 세포는 자일리톨을 본질적으로 생성하지 않는다. 예를 들어, 생성되는 자일리톨은 검출 제한 이하이거나 몰 기준으로 소비된 탄소의 5, 2, 1, 0.5 또는 0.3%미만이다. 바람직하게, 탄소/에너지 공급원으로서 아라비노즈에서 성장시, 세포는 본질적으로 아라비니톨을 생성하지 않으며, 예를 들어, 생성되는 아라비니톨은 검출 제한 이하이거나 물 기준으로 소비된 탄소의 5, 2, 1, 0.5 또는 0.3%미만이다.
본 발명의 바람직한 숙주 세포는 a) 헥소스 및 펜토즈 중 적어도 하나; b) 아세트산; 및 c) 글리세롤의 조합에서 혐기 조건하에서 적어도 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25 또는 0.3 h- 1 의 속도, 또는 보다 바람직하게 혐기 조건하에서 적어도 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.08, 0.1, 0.12, 0.15 또는 0.2 h- 1 의 속도로 성장하는 능력을 갖는다. 따라서, 바람직하게 숙주 세포는 탄소/에너지 공급원 단독으로서 자일로즈 및 아라비노즈 중 적어도 하나에서, 혐기 조건하에서 적어도 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25 또는 0.3 h- 1 의 속도, 또는 보다 바람직하게 혐기 조건하에서 적어도 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.08, 0.1, 0.12, 0.15 또는 0.2 h- 1 의 속도로 성장하는 능력을 갖는다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 탄소/에너지 공급원으로서 헥소스(예, 글루코즈)와 자일로즈 및 아라비노즈 중 적어도 하나의 혼합물(1:1 중량비로)에서, 혐기 조건하에서 적어도 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25 또는 0.3 h- 1 의 속도, 또는 보다 바람직하게 혐기 조건하에서 적어도 0.005, 0.01, 0.02, 0.05, 0.08, 0.1, 0.12, 0.15 또는 0.2 h- 1 의 속도로 성장하는 능력을 갖는다.
일 견지로, 본 발명은 에탄올, 락틱산, 3-히드록시-프로피온산, 아크릴산, 1,3-프로판디올, 부탄올 및 이소프레노이드-유도 산물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 발효 산물의 제조를 위해 사용되는 본 발명에 따른 이스트 세포의 용도에 관한 것이다.
다른 견지로, 본 발명은 에탄올, 락틱산, 3-히드록시-프로피온산, 아크릴산, 1,3-프로판디올, 부탄올(1-부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올) 및 이소프레노이드-유도 산물로 구성되는 그룹으로부터 선택된 발효 산물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 바람직하게, a) 배지를 이스트 세포로 발효시켜, 이에 의해 배지는 a) 헥소스 및 펜토즈 중 적어도 하나의 공급원; b) 아세트산 공급원; 및 c) 글리세롤의 공급원을 함유하거나 이와 함께 공급되고, 이에 따라 이스트 세포는 아세트산, 글리세롤, 및 헥소스와 펜토즈 중 적어도 하나를 에탄올로 발효시키는 단계를 포함한다. 이스트 세포는 바람직하게 상기 정의된 바와 같은 (숙주) 세포이다. 상기 방법은 바람직하게 발효 산물이 회수되는 추가 단계를 포함한다. 상기 방법은 배치 공정, 유가식 공정 또는 연속 공정일 수 있으며, 이들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 방법에서, 글리세롤의 공급원은 글루코즈보다 더 환원된 상태를 갖는 어느 탄소 공급원일 수 있다. 글루코즈보다 더 환원된 상태를 갖는 탄소 공급원은 (함유된 화합물의) C-몰당 평균 환원 상태가 글루코즈의 C-몰당 환원 상태보다 더 큰 탄소 공급원으로 이해된다. 글루코즈보다 더 환원된 상태를 갖는 탄소 공급원의 예는 프로판올 및 부탄올과 같은 알칸올; 1,3-프로판-디올, 부탄디올, 글리세롤, 만니톨 및 자일리톨과 같은 폴리올을 포함한다.
바람직한 방법으로, 헥소스의 공급원은 글루코즈를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게, 상기 공급원 펜토즈는 자일로즈 및 아라비노즈 중 적어도 하나를 포함하거나 이로 구성된다. 바람직하게, 본 발명의 세포에 의해 발효되는 배지는 글루코즈, 자일로즈 및/또는 아라비노즈와 같은 헥소스 및 펜토스 중 적어도 하나를 포함하는 가수분해된 바이오매스(의 분획)를 포함하거나 이와 함께 공급된다. 헥소스 및 펜토즈를 포함하는 가수분해된 바이오매스(의 분획)는 일반적으로 또한 아세트산 (또는 이의 염)을 포함할 것이다. 본 발명의 방법에서 발효될 가수분해되는 바이오매스의 예는 예를 들어, 가수분해된 목질 섬유 바이오매스이다. 본 명세서에서 목질 섬유 바이오매스는 셀룰로즈, 헤미셀룰로즈 및 리그닌을 포함하여 구성되는 식물 바이오매스로 이해된다. 탄수화물 폴리머(셀룰로즈 및 헤미셀룰로즈)가 리그닌에 단단히 바인딩된다. 본 발명에 사용되는 가수분해될 목질 섬유 바이오매스의 예는 (옥수수 대 및 사탕수수 찌꺼기를 포함하는) 농업 잔류물, (제재소 및 제지 공장 폐기물을 포함하는) 목재 잔류물 및 (공공) 종이 폐기물을 포함한다. 목질 섬유와 같은 바이오매스의 가수분해를 위한 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예를 들어, 황산과 같은 산 및 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제와 같은 효소를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 자일로즈, 글루코즈 및 아라비노즈의 공급원은 그 자체(즉, 단량체 당질로서) 자일로즈, 글루코즈 및 아라비노즈이거나, 또는 이들은 목질 섬유, 아라비난, 자일란, 셀룰로즈, 전분 등과 같이 자일로즈, 글루코즈 및/또는 아라비노즈 유닛을 포함하는 어느 탄수화물 올리고- 또는 폴리머의 형태일 수 있다. 이러한 탄수화물로부터 자일로즈, 글루코즈 및/또는 아라비노즈 유닛의 방출을 위해 적절한 탄수화물 분해효소(아라비나아제, 자일라나아제, 글루카나아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 글루카나아제 등과 같은)가 발효 배지에 첨가되거나, 또는 변형 숙주 세포에 의해 생성될 수 있다. 후자의 경우에, 변형된 숙주 세포는 이러한 탄수화물 분해효소를 생성하고 분비하도록 유전적으로 합성될 수 있다. 글루코즈의 올리고- 또는 중합 공급원의 부가적인 이점은, 예를 들어, 발효 중에 바람직하게 탄수화물 분해효소의 속도-제한 량을 이용하여, 발효 중에 저(보다 낮은) 농도의 유리 글루코즈를 유지하는 것이 가능한 것이다. 이는, 그 다음 자일로즈 및 아라비노즈와 같은 비-글루코즈 당질의 대사 및 수송에 필요한 시스템의 억압을 억제할 것이다. 바람직한 방법으로, 변형된 숙주 세포는 글루코즈 및 자일로즈와 아라비노즈 중 적어도 하나 모두를 발효시키며, 바람직하게 동시에, 이중영양적 성장을 억제하는 글루코즈 억압에 덜 민감한 변형된 숙주 세포가 사용된다. 탄소 공급원으로서 자일로즈 및 아라비노즈 (및 글루코즈) 중 적어도 하나의 공급원에 부가적으로, 발효 배지는 또한 변형된 숙주 세포의 성장에 필요한 적절한 성분을 포함할 것이다. 이스트와 같은 진핵 미생물의 성장을 위한 발효 배지의 조성물은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 방법에서, 배지는 바람직하게 글리세롤의 공급원을 더 포함하며 그리고/또는 글리세롤의 공급원과 함께 공급된다. 본 발명의 방법에 사용되는 글리세롤은 유리하게 식물 오일 또는 동물 지방 및 알코올을 이용한 트랜스에스테르화 반응으로부터 바이오디젤 생성시 부산물로서 생성되는 글리세롤일 수 있다.
발효 공정은 호기성 또는 혐기성 발효 공정일 수 있다. 혐기성 발효 공정은 본 명세서에서 산소의 부재하에 운전되거나 실질적으로 산소가 소비되지 않는, 바람직하게 5, 2.5 또는 1mmol/L/h 미만, 보다 바람직하게 0mmol/L/h이 소비되며(즉, 산소 소비가 검출불가한), 그리고 유기 분자가 전자 도너 및 전자 어셉터 모두로 제공되는 발효 공정으로 정의된다. 산소의 부재하에, 당분해 및 바이오매스 형성시 생성되는 NADH는 산화성 인산화에 의해 산화될 수 없다. 이 문제를 해소하기 위해, 다수의 미생물들은 전자 및 수소 어셉터로서 피루베이트 또는 이의 유도체들 중 하나를 사용하여 NAD+를 재생한다. 따라서, 바람직한 혐기 발효 공정에서, 피루베이트는 전자 (및 수소 어셉터)로 사용되며, 에탄올과 같은 발효 산물뿐만 아니라 락틱산, 3-히드록시-프로피온산, 아크릴산, 1,3-프로판-디올, 부탄올(1-부탄올, 2-부탄올, 이소부탄올) 이소프레노이드-유래 산물과 같은 비-에탄올 발효 산물로 환원된다. 본 발명의 혐기 공정은, 혐기 공정이 에어레이션을 위한 장치 및 에너지를 필요로 하지 않고, 또한 형기 공정은 호기 공정보다 더 높은 산물 수율을 생성하기 때문에, 호기 공정에 비해 바람직하다.
변형적으로, 본 발명의 발효 공정은 호기 산소-제한 조건하에서 운전될 수 있다. 바람직하게, 산소-제한 조건하에서 호기 공정에서, 산소 소비 속도는 적어도 5.5, 보다 바람직하게 적어도 6, 그리고 보다 바람직하게 적어도 7mmol/L/h이다. 본 발명의 바람직한 호기 산소-제한 발효 공정에서, 본 발명의 이스트 세포는 탄소 공급원의 발효 산물로의 전환 중에 소비되는 탄소 공급원과 관련된 C-몰 기준으로 30, 20, 18, 15, 12, 10, 8 또는 5% 미만의 산소량을 소비한다. C-몰 기준(Cos)으로 이용되는 기질에 걸쳐 소비되는 산소의 전환 계수는 본 명세서에서 소비된 C-몰 탄소 공급원당 사용된 몰 O2를 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명의 방법은 엄격한 혐기 조건(즉, Cos = 0.0)하에서 수행될 수 있으며, 또는 본 발명의 방법은 호기 조건하에서, 바람직하게 Cos가 바람직하게 0.3, 0.2, 0.18, 0.15, 0.12, 0.1, 0.08 또는 0.05 미만인 산소-제한된 조건하에서 수행될 수 있다.
발효 공정은 바람직하게 본 발명의 변형된 세포에 대해 최적인 온도에서 운전된다. 따라서, 대부분의 이스트 세포에 있어서, 발효 공정은 42℃미만, 바람직하게 38℃미만인 온도에서 수행된다. 이스트 세포에 있어서, 발효 공정은 바람직하게 35, 33, 30 또는 20℃이하인 온도 및 20, 22 또는 25℃이상인 온도에서 수행된다.
본 발명에 따른 바람직한 발효 공정은 에탄올 생산을 위한 공정이며, 이에 따라 상기 공정은 이스트 세포로 배지를 발효하는 단계를 포함하며, 따라서 상기 배지는 a) 헥소스 및 펜토스 중 적어도 하나의 공급원; b) 아세트산의 공급원; 및 c) 글리세롤의 공급원을 함유하거나 이와 함께 공급되며, 이에 따라 상기 이스트 세포는 아세트산, 글리세롤, 및 헥소스와 펜토즈 중 적어도 하나를 에탄올로 발효시키며, 그리고 선택적으로, b) 에탄올의 회수 단계를 포함한다. 발효 배지는 또한 상기한 바와 같이 수행될 수 있다. 상기 공정에서, 용량적 에탄올 생산성은 바람직하게 적어도 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 5.0 또는 10.0g 에탄올/l/h이다. 상기 공정에서 자일로즈 및/또는 글루코즈 및/또는 아라비노즈 및/또는 아세테이트 및/또는 글리세롤에 대한 에탄올 수율은 바람직하게 적어도 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 98%이다. 본 명세서에서 에탄올 수율은 이론적 최대 수율의 퍼센트로서 정의되며, 여기서 자일로즈, 글루코즈 및 아라비노즈에 대해 0.51g. 에탄올/g. 자일로즈, 글루코즈 또는 아라비노즈이다. 글리세롤에 대해, 이론적 최대 수율은 0.50g. 에탄올/g. 글리세롤이며, 아세트산에 대해 이론적 최대 수율은 0.77g. 에탄올/g. 아세트산이다.
본 명세서 및 청구범위에서, 동사 "포함하다" 및 이의 동사 활용어는 상기 문자에 후속되는 아이템이 포함되나, 별도 언급이 없는 아이템이 배제되지 않는 것을 의미하는 비-제한적 인식으로 사용된다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"가 언급된 경우에, 문맥상 분명히 하나가 존재하고 엘리먼트들 중 단지 하나만이 존재하는 것이 요구되는 것을 제외하고, 하나 이상의 엘리먼트가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 보통 "적어도 하나(at least one)"을 의미한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌들은 이의 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
하기 실시예는 단지 예시 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어느 방식으로 한정하려는 것은 아니다.
실시예
1. 효소 활성 어세이
활성 어세이를 위한 세포 추출물을 기하급수적으로 성장하는 호기성 또는 혐기성 배치 배양으로부터 준비하고, Abbot 등(2009, Appl. Environ. Microbiol. 75: 2320-2325)에 의해 기재된 바와 같이 단백질 함량에 대해 분석하였다.
NAD+-의존적 아세트알데히드 디하이드로게나아제(EC 1.2.1.10) 활성은 340nm에서 NADH의 산화를 모니터링하여 30℃에서 측정하였다. 반응 혼합물(총 부피 1ml)은 50mM 포타슘 포스페이트 버퍼(pH 7.5), 0.15mM NADH 및 세포 추출물을 함유하였다. 반응은 0.5mM 아세틸-조효소 A의 첨가에 의해 시작되었다.
글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제(EC 1.1.1.8) 활성 측정을 위해, 세포 추출물은 포스페이트 버퍼를 트리에탄올아민 버퍼(10mM, pH 5)로 대체한 것을 제외하고 상기한 바와 같이 준비하였다. 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로게나아제 활성은 이전에 기재된 바와 같이(Blomberg and Adler, 1989, J. Bacteriol. 171: 1087-1092.9) 30℃에서 세포 추출물에서 평가하였다. 반응 속도는 첨가된 세포 추출물의 양에 비례하였다.
아세틸-CoA 합성효소(EC 6.2.1.1) 활성은 Webster의 방법(Webster, 1969, Methods Enzymol. 13: 375-381)의 변형인 Frenkel 및 Kitchens에 의해 기재된 바와 같이(1977, J. Biol. Chem. 252: 504-507) 측정하였다. 측정된 NADH 형성은, 생성된 아세틸-CoA가 시트레이트 합성효소 및 말산염 디하이드로게나아제 반응과 결합될 경우에 분광 분석으로 측정하였다. 어세이 시스템은 100 mM Tris-Cl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 6mM ATP, 5mM 말산염, 1mM NAD+, 0.1mM NADH, 2.5 mM 디티오트레이톨 또는 2-머캅토에탄올, 0.2mM 조효소 A, 25㎍ 시트레이트 합성효소(80 units/mg), 20㎍ 말산염 디하이드로게나아제(1000 units/mg), 및 10mM 아세테이트를 함유하였으며, 반응을 측정하고, 반응 속도를 340nm에서 측정하고, NADH(6.22 x 106 cm2/mol)의 흡광 계수로부터 산출하였다.
글리세롤 디하이드로게나아제 및 디히드록시아세톤 키나아제의 활성은 본질적으로 이전에 기재된 바와 같이(Gonzalez et al., 2008, Metab. Eng. 10, 234-245) 세포 추출물에서 30℃에서 측정하였다. 글리세롤 디하이드로게나아제 및 디히드록시아세톤 키나아제의 효소 활성은 세포 단백질의 기질의 μ몰/min/mg으로 나타내었다.
2. 스트레인 구성
모든 변형은 자일로즈 및 아라비노즈 발효 스트레인 RN1008 his-로 시작하였다. RN1008 his-는 본 명세서에서 RN1041이라고도 하며, 하기 유전자형을 갖는 CEN.PK-계 아라비노즈 및 자일로즈 발효 스트레인이다:
Mat a, ura3-52, leu2-112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-Ptpi::TAL1, loxP-Ptpi::RKI1, loxP-Ptpi-TKL1, loxP-Ptpi-RPE1, delta:: -LEU2, delta:: Padh1XKS1Tcyc1-URA3-Ptpi-xylA-Tcyc1, delta:: LEU2-AAAaraABD.　
Mat a = mating type a
ura3-52, leu2-112, his3::loxP는 유전자 ura3, leu2 및 his3에서 돌연변이이며, ura3는 xylA-XKS 과발현 구조물에 의해 보완되며, leu2는 AraABD 과발현에 구조물에 의해 보완된다. his3는 부가적인 플라스미드의 선별을 위해 사용될 수 있으며, RN1041은 성장을 위해 배지에 히스티딘을 필요로 한다.
gre3::loxP = 자일로즈 환원효소를 암호화하는 gre3 유전자의 결실, loxP 부위는 마커 제거 후 남는다.
loxP-Ptpi ....= 헤트(het) 펜토즈 포스페이트 경로의 과발현, 구성 프로모터의 상향흐름의 loxP 부위는 마커 제거 후에 남는다.
delta:: = Ty1 레트로트랜스포손의 긴말단 반복순서에서 재조합 후의 구조물의 통합
AAAaraABD = 코돈 최적화된 아트로박터 아우레센스(arthrobacter aurescens) araA, araB 및 araD 유전자(WO2009/011591 참조)
GPD1 및 GPD2 를 위한 결실 구조물
RN1041에서 GPD1의 결실은 RN1197 스트레인을 생성한다. RN1041에서 GPD2의 결실은 RN1198 스트레인을 생성한다. 이 스트레인에서, 후속적으로 gpd1이 결실되어 RN1199 스트레인을 생성한다. 이러한 스트레인에서, 플라스미드들은 ACS 유전자(RN1200 내지 RN1207, 표 4) 및 표 4에 나타낸 바와 같은 추가 유전자들의 과발현을 위해 도입되었다.　 　
gpd1 :: hphMX
프라이머 gpd1uf, gpd1ur, gpd1df 및 gpd1dr은 이의 불활성화를 위해 GPD1 유전자의 상향 및 하향흐름의 게놈 서열 프래그먼트의 증폭을 위해 사용된다. 상향- 및 하향흐름 모두의 GPD1 프래그먼트들을 토포 블런트(topo blunt) 벡터(InVitrogen)에 클로닝되어 각각, pGPD1up 및 pGPD1down을 생성하였다.
gpd1uf: AAGCTTGGTACCCGCCTTGCTTCTCTCCCC (SEQ ID NO: 41)
gpd1ur: TCTAGACCAGCATTCAAGTGGCCGGA (SEQ ID NO: 42)
gpd1df: CGTACGAGTTGTTGAATGGCCAATCCGCT (SEQ ID NO: 43)
gpd1dr: CCATGGTACCGAGTGGTGTTGTAACCACCCT (SEQ ID NO: 44)
gpd1cf: ACCAATACGTAAACGGGGCG (SEQ ID NO: 45)
gpd1cr: AATACACCCATACATACGGACGC (SEQ ID NO: 46)
플라스미드 pRN593(SEQ ID NO: 40)은 pGPD1up으로부터 HindIII 및 XbaI으로 절제된 프래그먼트를 SpeI 및 BsrGI으로 절제된 hphMX 프래그먼트(플라스미드 콜렉션 C5YeastCompany)와 pGPD1down으로부터 BsiWI 및 NcoI으로 절제된 프래그먼트를 HindIII 및 NcoI 절제된 topo T/A 벡터(Invitrogen)에 라이게이션하여 구성되었다. 플라스미드 pRN593은 KpnI으로 절제되어 게놈 카피를 방해하는 결실 프래그먼트를 획득하였다(SEQ ID NO: 17). 선형 프래그먼트의 혼합물은 이스트의 형질전환에 사용되었다. 형질전환체는 하이드로마이신 내성에 대해 선별되었다. 올바른 인테그레이션은 GPD1 오픈 리딩 프래임의 결실을 일으킨다. 인테그레이션은 gpd1cf 및 gpd1cr 프라이머를 이용하여 PCR로 확인된다.
gpd2 :: natMX
GPD2uf, GPD2ur, GPD2df 및 GPD2dr 프라이머가 이의 활성화를 위해 GPD2 유전자의 상향흐름 및 하향흐름의 게놈 서열 프래그먼트의 증폭을 위해 사용된다. (GPD2 서열로부터 유래된) 3'-말단에서 AflII 사이트 및 (결실 구조물의 분리를 위한) 5'-말단에 Bg/II 사이트를 갖는 407bp 상향흐름 PCR 프래그먼트를 GPD2uf, GPD2ur을 이용하여 증폭하고, pCR2.1(topo T/A, Invitrogen)에 클로닝하였다.
GPD2uf: GGTACCAGATCTTTTGCGGCGAGGTGCCG (SEQ ID NO: 32)
GPD2ur: TCTAGACTTAAGGAATGTGTATCTTGTTAATCTTCTGACAGC (SEQ ID NO: 33)
5'-말단에 XhoI 사이트 및 3'-말단에 BglII 사이트를 가진 417bp 하향흐름 PCR 프래그먼트를 GPD2df 및 GPD2dr을 이용하여 증폭하였다.
GPD2df: CTCGAGATAGTCTACAACAACGTCCGCA (SEQ ID NO: 34)
GPD2dr: CCATGGAGATCTGCAGTGAAAAAGCTCGAAGAAACAGCT (SEQ ID NO: 35)
최종 구성을 위해, 상향흐름 프래그먼트를 함유하는 플라스미드를 AflII 및 Kpn으로 절제하고, 하향흐름 프래그먼트를 XhoI en NcoI으로 절제하고, natMX 마커(플라스미드 콜렉션 Royal Nedalco)를 AflII en XhoI으로 절제하고, 그 프래그먼트를 라이게이션하여 플라스미드 pRN594(SEQ ID NO: 36)을 생성하였다. pRN594는 이스트 형성 전에 BglII로 절제하였다. 형질전환체는 너스오트리신(nourseotricin) 내성에 대해 선별하였다. 올바른 인테그레이션은 PCR에 의해 확인된다.
사카로미세스 세레비지아에 ( Saccharomyces cerevisiae ) ACS1 및 ACS2 유전자의 과발현을 위한 클로닝 방법
ACS1 오픈 리딩 프래임은 acs1f 및 acs1r 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다.
acs1f : TTAAGCTTAAAATGTCGCCCTCTGCCGT (SEQ ID NO: 47)
acs1r: AAGCGCGCTACAACTTGACCGAATCAATTAGATGTCTAACAATGCCAGGG (SEQ ID NO: 48)
이 PCR 프래그먼트를 제한효소 HindIII 및 BssHIII으로 절제하고, SalI 및 HindIII 절제된 TEF1 프로모터 프래그먼트(콜렉션 C5YeastCompany), 및 BssHII 및 BsiWI 절제된 ADH1 종결 프래그먼트(콜렉션 C5YeastCompany)에 라이게이션하였다. 이 복합 프래그먼트를 프로모터 및 종결 특이 프라이머로 PCR하고, topo Blunt 벡터(InVitrogen)로 클로닝하여 pACS1을 제공하였다.
ACS2 오픈 리딩 프래임은 acs2f 및 acs2r로 PCR 증폭되었다.
acs2f: AACTGCAGAAAATGACAATCAAGGAACATAAAGTAGTTTATGAAGCTCA (SEQ ID NO: 49)
acs2r: ACGTCGACTATTTCTTTTTTTGAGAGAAAAATTGGTTCTCTACAGCAGA (SEQ ID NO: 50)
이 PCR 프래그먼트는 제한효소 PstI 및 SalI으로 절제되고, SpeI 및 PstI 절제된 PGK1 프로모터 그래그먼트(콜렉션 C5YeastCompany) 및 XhoI 및 BsiWI 절제된 PGI1 종결 프래그먼트(콜렉션 C5YeastCompany)에 라이게이션되었다. 이 복합 프래그먼트는 프로모터 및 종결 특이 프라이머로 PCR하고, topo Blunt 벡터(InVitrogen)로 클로닝하여 pACS2을 제공하였다.
ACS1 과발현 구조물은 제한효소 SalI 및 BsiWI으로 pACS1으로부터 절제되고, ACS2 과발현 구조물은 제한효소 SpeI 및 BsiWI으로 pACS2로부터 절제되고, KanMX 마커는 BspE1 및 XbaI으로 절제되었다(플라스미드 콜렉션 C5YeastCompany). 이러한 프래그먼트들은 BspE1 및 XhoI으로 절제된 플라스미드 pRS306 + 2mu ORI(플라스미드 콜렉션 C5Yeast company)에 라이게이션되어 최종 플라스미드 pRN753(SEQ ID NO: 51)을 제공하였다. 이 플라스미드는 표 4에 나타낸 이스트 스트레인들을 형질전환하는데 사용되고, 형질전환체들은 G418 내성에 대해 선별되었다. 과발현은 qPCR에 의해 확인되었다. ACS1 및 ACS2의 과발현에 사용될 수 있는 변형적인 플라스미드는 pRN500(SEQ ID NO: 20)이다.
E. coli , adhE . E. histolytica ADH2 또는 E. coli mphF 의 발현
PGK1 프로모터(SpeI-Pst1) 및 ADH1 종결 서열(AflII-NotI)은 코돈 최적화된 합성 프래그먼트에 부가되고, SpeI 및 NotI으로 절제된 2μ ori를 갖는 pRS303으로 클로닝되었으며, 발현 구조물은 이 벡터에 클로닝되었다. 발현은 qPCR에 의해 확인되었다. E. coli mphF(SEQ ID NO: 2), E. coli adhE(SEQ ID NO: 4) 및 E. histolytica ADH2(SEQ ID NO: 6)에 대해 코돈 최적화된 서열은 서열 목록에 나타낸 바와 같다.
E. coli mphF 유전자의 발현을 위해, 이스트 PGK1 프로모터 프래그먼트(SpeI - PstI) 및 ADH1 종결 프래그먼트(AflII - NotI)(모두 Nedalco 플라스미드 콜렉션으로부터 구입)를 E. coli mphF(SEQ ID NO: 2)를 암호화하는 코돈-최적화된 합성 프래그먼트에 라이게이션하였다. 2μ ori를 가진 pRS 303(= pRN347, Royal Nedalco 플라스미드 콜렉션)을 SpeI 및 NotI으로 절제하고, mhpF 발현 구조물을 이 벡터에 클로닝하여 pRN558(SEQ ID NO: 29)를 생성하였다.
E. coli adhE 유전자의 발현을 위해, E. coli adhE(SEQ ID NO: 4)를 암호화하는 코돈 최적화된 합성 프래그먼트를 XbaI 및 AflII로 절제하고, (pRN558내의 E.coli mhpF 유전자를 대체하는) XbaI 및 AflII로 절제된 pRN558내로 라이게이션하여 pRN595(SEQ ID NO: 30)을 생성하였다.
Entamoebe histolytica adh2의 발현을 위해, E. histolytica adh2(SEQ ID NO: 6)을 암호화하는 코돈 최적화된 합성 프래그먼트를 XbaI 및 AflII로 절제하고, (pRN558내의 E. coli mhpF 유전자를 대체하는) XbaI 및 AflII로 절제된 pRN558내로 라이게이션하여 pRN596(SEQ ID NO: 31)을 생성하였다.
pRN595는 pRN957 및 pRN977(하기 참조)의 추가 구성을 위해 사용하였다. pRN558 및 pRN596은 동일한 방식으로 사용될 수 있어, 이에 따라 각각, E. coli adhE의 발현을 E. coli mhpF 또는 E. histolytica adh2로 대체할 수 있다.
E. coli gldA 의 발현
E. coli gldA의 이스트에서 발현을 위한 구조물은 (제한효소 SpeI 및 PstI으로 절제된) 이스트 ACT1 프로모터 프래그먼트, (PstI en BssHII으로 절제된) E. coli gldA를 암호화하는 합성 ORF(SEQ ID NO: 21) 및 (BssHII 및 BsiWI으로 절제된) 이스트 CYC1 종결 프래그먼트를 함께 pCRII 블런트(Invitrogen)내로 라이게이션하여 pRNgldA(SEQ ID NO: 28)을 생성하였다.
DAK1 과발현
PCR은 ATG의 XbaI 사이트 5' 및 TAA의 SalI 사이트 3'을 도입하는 프라이머로 S. cerevisiae의 게놈 DNA에서 수행하여 SEQ ID NO: 22의 프래그먼트를 생성하였다. S. cerevisiae의 TPI1 프로모터를 포함하는 DNA 프래그먼트는 DAK ORF의 상향흐름에 라이게이션되고, S. cerevisiae의 PGI1 종결 프래그먼트를 포함하는 DNA 프래그먼트는 DAK1 ORF의 하향흐름에 라이게이션되어 pRNDAK(SEQ ID No: 38)을 생성하였다.
C. freundii dhaK 의 발현
Citrobacter freundii dhaK의 이스트에서의 발현을 위한 구조물은 (제한효소 XhoI 및 XbaI으로 절제된) 이스트 TPI1 프로모터 프래그먼트, (XbaI 및 SalI으로 절제된) C. freundii dhaK를 암호화하는 합성 ORF(SEQ ID NO: 26) 및 (XhoI 및 BsiWI으로 절제된) 이스트 PGI1 종결 프래그먼트를 함께 pCRII 블런트(Invitrogen)내로 라이게이션하여 pRNdhaK(SEQ ID NO: 27)을 생성하였다.
GUP1 과발현
PCR은 ATG의 HindIII 사이트 5' 및 TAA의 BamHI 사이트 3'을 도입하는 프라이머로 S. cerevisiae의 게놈 DNA에서 수행하여 SEQ ID NO: 23의 프래그먼트를 생성하였다. S. cerevisiae의 TDH3 프로모터를 포함하는 DNA 프래그먼트는 GUP1 ORF의 상향흐름에 라이게이션되고, S. cerevisiae의 CYC1 종결 프래그먼트를 포함하는 DNA 프래그먼트는 GUP1 ORF의 하향흐름에 라이게이션되었다.
FPS1 과발현
PCR은 ATG의 NsiI 사이트 5' 및 TAA의 BamHI 사이트 3'을 도입하는 프라이머로 S. cerevisiae의 게놈 DNA에서 수행하여 SEQ ID NO: 24의 프래그먼트를 생성하였다. S. cerevisiae의 ADH1(미디움) 프로모터를 포함하는 DNA 프래그먼트는 FSP1 ORF의 상향흐름에 라이게이션되고, S. cerevisiae의 CYC1 종결 프래그먼트를 포함하는 DNA 프래그먼트는 FSP1 ORF의 하향흐름에 라이게이션되었다.
pRN347 및 이스트 스트레인 RN1151 의 구성
pRN347은 (상보성을 위한 HIS3 유전자를 갖는) pRS303에서 2μ 오리진의 복사체(pYES2로부터 PCR-증폭된)를 클로닝하여 구성되었다. RN1041은 pRN347로 형질전환되어 RN1151 스트레인을 생성하였다.
E. coli gldA 및 C. freundii dhaK 를 발현하거나 DAK1 을 과발현하는 스트레인
pRN957의 구성을 위해, E. coli gldA 발현 구조물이 SpeI 및 BsiWI 제한효소로 pRNgldA 플라스미드로부터 절제되었다. C. freundii dhaK 발현 구조물은 BsiWI 및 XhoI 제한효소로 pRNdhaK로부터 절제되었다. 이러한 프래그먼트는 SpeI 및 SalI 제한효소로 절제된 pRN595 플라스미드로 라이게이션되어 pRN957(SEQ ID NO: 37)을 생성하였다.
pRN977의 구성을 위해, E. coli gldA 발현 구조물이 SpeI 및 BsiWI 제한효소로 pRNgldA 플라스미드로부터 절제되었다. DAK1 발현 구조물은 BsiWI 및 XhoI 제한효소로 pRNDAK로부터 절제되었다. 이러한 프래그먼트는 SpeI 및 SalI 제한효소로 절제된 pRN595 플라스미드로 라이게이션되어 pRN977(SEQ ID NO: 39)을 생성하였다.
pRN957 및 pRN977은 RN1041, RN1197, RN1198 및 RN1199를 형질전환하여 표 4에 나타낸 바와 같은 이스트 스트레인을 생성하는데 사용되었다.
Figure pct00001
3. 글리세롤 및/또는 아세트산의 존재 및 부재하에서 제조된 스트레인들을 이용한 멸균 이스트 추출물 펩톤 배지에서 무산소 발효
수반되는 아세트산의 환원 및 글리세롤의 산화의 원리의 증명은 1% 이스트 추출물 및 1% 펩톤을 함유하는 배지를 이용하여 획득되었다. 실험은 D = 0.05h-1에서 캐모스태트 배양(1리터 워킹 용량)으로 수행되었으며, pH는 KOH 또는 H2SO4의 자동 첨가에 의해 5.5로 유지하였다. 글루코즈(50g/l) 및 자일로즈(50g/l)를 이스트 추출물 펩톤 배지에 탄소 및 에너지 공급원으로 첨가하였다. 원리의 입증을 보여주는 이러한 실험을 위해, 아라비노즈가 포함되지 않았다. 적절한 경우에, 아세트산이 4g/l로 그리고 글리세롤이 10g/l로 이스트 추출물 펩톤 배지에 첨가하였다. 온도를 32℃로 유지하였다.
YP(이스트 추출물 1% w/v 및 펩톤 1% w/v) 배지에 각각의 당류 글루코즈 및 자일로즈(각각 1% w/v)에 부가적으로 이스트의 동결 글리세롤 스톡 배양물을 32℃ 및 pH 5.5에서 접종하여 스트레인의 예비배양물을 준비하였다. 쉐이크 플라스크에서 유산소 조건하에서 24h 배양 후, 이 배양물의 50ml를 상기 케모스태트 배양에 접종하는데 사용하였다.
안정한 상태의 발효시(5 용량 변화), 당(글루코즈 및 자일로즈) 소비, 아세트산의 소비 및 대사물(에탄올 및 글리세롤)의 분석을 위해 시료를 취하였다. 에탄올, 글리세롤 및 아세트산 농도는 HPLC 분석에 의해 모니터하였다. 당 소비를 측정하기 위해, 글루코즈 및 자일로즈를 HPAEC(Dionex) 분석에 의해 측정하였다.
RN1151 스트레인은 글리세롤의 존재 또는 부재하에서 4g/l 아세트산을 함유하는 배지에서 안정한 상태 환경에 이를 수 없었다. 아세트산이 배지에 첨가되지 않은 경우에, 안정한 상태에서 유기체는 모든 글루코즈 및 자일로즈를 소비하였다(1g/l 이하가 잔존함). 글리세롤이 소비되지 않았으나, 대신에 생성되었다.
RN1200 및 RN1201 스트레인은 아세트산 및 글리세롤이 첨가되거나 첨가되지 않은 배지에서 마찬가지로 시험하였다. 이러한 스트레인은 RN1151 스트레인과 분명하게 다르게 수행하였다. 글리세롤-함유 배지에서, 당류 글루코즈 및 자일로즈는 거의 완전히 소비되었다(1g/l 이하가 잔존함). 아세트산 수준은 0.5g/l로 감소하고, 발효 마지막에 글리세롤의 농도는 3가지 모든 경우에 3g/l이었다. RN1200 및 RN1201 스트레인에 의해 생성된 에탄올의 양은 다양한 실험에서 43-47g/l 범위이었다. 글리세롤을 함유하지 않았지만, 아세트산 4g/l를 함유하는 배지에서, 안정한 안정 상태가 획득되지 않았다. 이 스트레인은 이러한 조건하에서 성장할 수 없었다. 이러한 결과로부터, DAK1의 상향조절 또는 C. freundii dhaK의 발현과 함께 E. coli gldA 및 adhE 유전자의 발현은 스트레인의 성능에 깊은 영향을 나타내는 것으로 결론내렸다. 글리세롤의 존재하에서, 이들은 글리세롤 및 아세트산을 소비할 수 있다.
RN1202 내지 RN1207 스트레인은 GPD1 및/또는 GPD2 유전자가 결실된 것을 제외하고 RN1200 및 RN1201 스트레인과 유사하다. RN1200 및 RN1201 스트레인에 대한 경우에서와 같이 글리세롤이 배지에 첨가될 경우에, 아세트산 4g/l을 함유하는 배지에서, 당류 글루코즈 및 자일로즈는 거의 완전히 소비된다(1g/l 이하가 잔존함). 글리세롤이 첨가되지 않는 경우에, 안정한 상태가 획득되지 않는다.
4. 글리세롤의 존재 또는 부재하에서 목질 섬유 가수분해물을 포함하는 아세트산에서 제조된 스트레인들을 이용한 혐기성 발효
옥수수 섬유 가수분해물은 글루코즈(38g/l), 자일로즈(28g/l), 아라비노즈(12g/l) 및 아세트산(4g/l)을 함유한다. 이는 옥수수 섬유를 160℃ pH 3.0에서 20분간 처리한 다음, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 효소적 가수분해에 의해 제조되었다. 아세트산을 이 가수분해물에 첨가하여 가수분해물에서 아세트산의 총 농도를 10g/l로 형성하였다. 아세트산이 풍부한 이러한 가수분해물의 pH는 KOH 첨가에 의해 pH = 4.5로 회복되었다. 이스트 추출물은 5g/l의 최종 농도에 이르도록 이 가수분해물에 첨가되었다. 모든 후속 실험에서, 이 농축된 가수분해물을 사용하였다. 발효 중에 pH는 KOH 또는 H2SO4의 자동 첨가에 의해 6.5로 유지되었다.
YP(이스트 추출물 1% w/v 및 펩톤 1% w/v) 배지에 각각의 당류 글루코즈, 자일로즈 및 아라비노즈(각각 1% w/v)에 부가적으로 이스트의 동결 글리세롤 스톡 배양물을 32℃ 및 pH 5.5에서 접종하여 스트레인의 예비배양물을 준비하였다. 쉐이크 플라스크에서 유산소 조건하에서 24h 배양 후, 이 배양물의 50ml를 발효조 배양에 접종하는데 사용하였다. 발효는 유가배양 발효 셋업을 수행하였다. (50g/l로 첨가된 글리세롤을 함유하거나 함유하지 않은) 가수분해물을 발효조에 펌핑하였다. 글리세롤이 첨가되지 않은 경우에, 40ml의 물을 첨가하였다. 처음 6시간 동안, 가수분해물에 대한 흐름 속도는 시간당 5ml의 속도로 설정되었다. 다음 6시간 동안, 흐름 속도는 시간당 10ml로 설정되었다. 후속적으로, 추가 43시간 동안, 흐름 속도는 시간당 20ml로 설정되었다. 발효의 마지막에 총 용량은 1000ml에 이르렀다. 이러한 혐기성 유가배양 발효는 100rpm에서 온화한 교반을 하면서 약 pH = 4.5에서 수행하였다. 발효중에 온도는 32℃로 설정하였다. 감염을 최소화하기 위해, 가수분해물은 발효전에 105℃에서 10분간 가열하고, 항생제 카나마이신을 50㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다.
55시간 후, 발효의 마지막에, 당(글루코즈, 자일로즈 및 아라비노즈) 소비, 아세트산의 소비 및 대사물(에탄올 및 글리세롤)의 분석을 위해 시료를 취하였다. 에탄올, 글리세롤 및 아세트산 농도는 시간 경과에 걸쳐 HPLC 분석에 의해 모니터하였다. 당 소비를 측정하기 위해, 글루코즈, 자일로즈 및 아라비노즈를 HPAEC(Dionex) 분석에 의해 측정하였다.
RN1151(= HIS3로 보완된 RN1041) 스트레인은 첨가되는 글리세롤의 존재 또는 부재하에서 가수분해물에 대해 시험되었다. 두 모든 경우에, 발효 운전의 마지막(55h)에 글루코즈의 농도는 35g/l이었으나, 자일로즈 및 아라비노즈는 각각, 28 및 12g/l의 이들의 초기 농도로 유지되었다. 생성된 에탄올의 양은 2g/l이었으며, 아세트산은 9.5g/l로 존재하였다. 글리세롤 소비는 글리세롤-함유 가수분해물에서 검출되지 않았다. 당류의 발효는 증가된 수준의 아세트산 때문에 유가 배양 운전 코스 중에 멈추었다. 초기에, 아세트산이 발효조에 존재하지 않았으나, 독성 수준의 아세트산을 함유한 가수분해물을 펌핑하는 동안 아세트산 농도는 신속히 독성 수준에 도달하였다.
RN1200 및 RN1201 스트레인은 글리세롤이 첨가되거나 첨가되지 않은 가수분해물에서 마찬가지로 시험하였다. 이러한 스트레인은 RN1151 스트레인과 분명하게 다르게 수행하였다. 글리세롤-함유 가수분해물에서, 당류 글루코즈, 자일로즈 및 아라비노즈는 완전히 소비되었다. 아세트산 수준은 2g/l로 감소하고, 발효 마지막에 글리세롤의 농도는 3가지 모든 경우에 29.5g/l이었다. RN1200 및 RN1201 스트레인에 의해 생성된 에탄올의 양은 각각, 51.7 및 52.2g/l이었다. 글리세롤을 함유하지 않은 가수분해물에서, 상당히 적은 당이 소비되었다. 자일로즈 및 아라비노즈 수준은 각각 28 및 12g/l에서 변하지 않았다. 글루코즈는 소비되었으나 단지 제한된 정도로만 소비되었다. 발효의 마지막에, 잔존 농도는 3가지 모든 경우에서 32g/l이었으며, 에탄올은 3g/l의 농도에 이르렀다. 아세트산의 농도는 발효의 마지막에 9.1g/l로 감소하였으며, 한편 일부 글리세롤이 생성되었다(0.5g/l 미만). 이러한 결과로부터, DAK1의 상향조절 또는 C. freundii dhaK의 발현과 함께 E. coli gldA 및 adhE 유전자의 발현은 스트레인의 성능에 깊은 영향을 나타내는 것으로 결론내렸다. 글리세롤의 존재하에서, 이들은 글리세롤 및 아세트산을 소비할 수 있으며, (RN1151 스트레인에 비해) 부가적인 에탄올을 생성할 수 있다. 글리세롤의 부재하에서, 상기 스트레인들은 일부 아세트산을 소비한다. 하지만, 발효 중에, 아세트산 수준은 독성 수준으로 증가한다.
RN1202 내지 RN1207 스트레인은 GPD1 및/또는 GPD2 유전자가 결실된 것을 제외하고 RN1200 및 RN1201 스트레인과 유사하다. RN1200 스트레인에 대한 경우에서와 같이 글리세롤 함유 가수분해물에서, 당류 글루코즈, 자일로즈 및 아라비노즈는 완전히 소비된다. 이러한 3가지 경우에서 발효의 마지막에 아세트산 수준은 약 2g/l로 감소하고, 글리세롤의 농도는 28g/l이었다. RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 및 RN1207 스트레인에 대해 생성된 에탄올의 양은 각각, 51.6, 52.9, 52.1, 52.5, 53.1 및 52.3 g/l이었다. 글리세롤을 함유하지 않은 가수분해물에서, 상당히 적은 당이 소비되었다. 자일로즈 및 아라비노즈 수준은 각각 28 및 12g/l에서 변하지 않았다. 글루코즈는 소비되었으나 단지 제한된 정도로만 소비되었다. 발효의 마지막에, 비-글리세롤 가수분해물에서 글루코즈에 대한 잔존 농도는 3가지 모든 경우에서 31g/l이었으며, 에탄올은 3g/l의 농도에 이르렀다. 아세트산의 농도는 발효의 마지막에 9.1g/l로 감소하였으며, 한편 일부 글리세롤이 생성되었다(0.5g/l 미만). 이러한 결과로부터, RN1202, RN1203, RN1204, RN1205, RN1206 및 RN1207에서 다른 변형과 함께 GPD1 및/또는 GPD2 유전자 결실은 원하는 반응을 수행할 수 있는 스트레인을 형성하는 것으로 결론내렸다.
실시예 5-8에 대한 재료 및 방법
일반 분자생물학 기술
달리 언급하지 않는 한, 사용된 방법들은 표준 생화학 기술이다. 적절한 일반적 방법론 교과서의 예는 Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989) 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.를 포함한다.
배지
실험에 사용된 배지는 실시예에 나타낸 바와 같이 당류가 보충된 YEP-배지(10g/l 이스트 추출물, 20g/l 펩톤) 또는 고형 YNB-배지(6.7g/l 이스트 니트로겐 베이스, 15g/l 아가)이었다. 고형 YEP 배지를 위해, 15g/l 아가가 멸균전에 액체 배지에 첨가되었다.
AFM 실험에서, 미네랄 배지가 사용되었다. 미네랄 배지의 조성은 Verduyn 등(Yeast (1992), Volume 8, 501-517)에 기재되어 있으며, 우레아 2.325g/l 및 실시예에 나타낸 바와 같이 당류가 보충되었다.
이스트 세포의 형질전환
이스트 형질전환은 Schiestl 및 Gietz(Current Genetics (1989), Volume 16, 339-346)에 의해 기재된 방법에 따라 수행하였다.
콜로니 PCR
게놈 DNA는 Looke 등(BioTechniques (2011), Volume 50, 325-328)에 의해 기재된 방법에 따라 PCR을 위한 단일 이스트 콜로니로부터 추출하였다.
AFM 공정
알코올 발효 모니터(AFM; Halotec, Veenendaal, the Netherlands)는 동시에 6가지 혐기성 발효에 대한 탄소 전환율 및 수율을 정확하게 비교할 수 있는 강건하고 사용자에게 친숙한 실험실 병렬 바이오리액터이다.
AFM 실험의 출발 배양물은 50mg의 이스트(건중량)를 함유하였다. 이를 측정하기 위해, 보정 곡선은 바이오매스 대 OD700의 RN1041 스트레인으로 형성되었다. 이 보정 곡선은 50mg의 이스트(건중량)에 대해 요구되는 세포 배양물의 용량을 측정하기 위해 본 실험에서 사용되었다.
AFM 실험의 출발 전에, 예비배양물을 실시예에 나타낸 바와 같이 성장시켰다. 각 스트레인에 대해, OD700을 측정하고, 50mg의 이스트(건중량)를 2.325g/l 우레아 및 실시예에 나타낸 바와 같은 당류가 보충된 400ml 미네랄 배지(Verduyn 등(Yeast (1992), Volume 8, 501-517)에 접종하였다.
글리세롤디하이드로게나아제 활성 어세이
글리세롤디하이드로게나아제 활성 어세이의 측정 방법은 Lin 및 Magasanik(1960) J Biol Chem.235:1820-1823으로부터 적용하였다.
어세이 조건
1.0 M 카보네이트/비카보네이트 버퍼 pH 10 800㎕
1.0 M 암모늄설페이트 33㎕
0.1 M NAD+ 33㎕
세포 프리 추출물 5㎕
세포 프리 추출물은 원심분리에 의해 세포들을 수거하여 준비하였다. 세포들을 대수증식기에서 수거하였다. 세포 펠렛을 1M 카보네이트/비카보네이트 버퍼(pH 10)으로 1회 세정하고, 유리 비드를 첨가하고, 세포가 붕괴될 때까지 1분간 간격으로 최대 속도로 보텍싱하여 세포 프리 추출물을 동시에 준비하였다. 후자는 현미경으로 체크하였다.
쉐이크 플라스크 실험
혐기성 쉐이크 플라스크 실험을 실시예에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 전형적인 실험은 25ml의 배지를 함유하는 100ml Erlenmeyer 플라스크를 사용하였다. 혐기적 조건을 확실히 하기 위해, 플라스크를 워터락으로 봉하였다.
각 시점에 대해, 각각의 쉐이크 플라스크에 접종하였으며, 이에 따라 샘플링 중에 에어레이션을 생략하였다.
스트레인
실시예 5 내지 8에 기재된 실험에 사용된 모 스트레인은 RN1041이다.
RN1041은 WO 2012067510에 기재되어 있다. 이 스트레인은 하기 유전자형을 갖는다:
MAT a, ura3 -52, leu2 -112, his3::loxP, gre3::loxP, loxP-pTPI1::TAL1, loxP-pTPI1::RKI1, loxP-pTPI1-TKL1, loxP-pTPI1-RPE1, delta::pADH1-XKS1-tCYC1-LEU2, delta:: URA3-pTPI1-xylA-tCYC1
MAT a = 매이팅 타입 a
ura3 -52, leu -112, HIS3::loxP는 각각, URA3 , LEU2 및 HIS3 유전자에서 돌연변이이다. ura3 -52 돌연변이는 xylA 과발현 구조물상의 URA3 유전자에 의해 보완되며; leu2 -112 돌연변이는 XKS1 과발현 구조물상의 LEU2 유전자에 의해 보완된다. HIS3-유전자의 결실은 히스티딘 영양요구성을 일으킨다. 이러한 이유로, RN1041은 성장 배지에 히스티딘을 필요로 한다.
gre3::loxP는 알도즈 환원효소를 암호화하는 GRE3 유전자의 결실이다. loxP 사이트는 마커 제거 후에 게놈에 남는다.
loxP-pTPI1은 본 명세서에 기재된 실험에서, TPI1 유전자의 프로모터에 의해 고유 프로모터의 대체에 의해 비-산화 펜토즈 포스페이트 경로의 유전자의 과발현을 지정한다. 강하고 구성적인 TPI1 프로모터의 상향흐름의 loxP 사이트는 마커 제거 후에 게놈에 잔류한다(Kuyper et al, FEMS Yeast Research 5 (2005) 925-934).
델타:: Ty1 레트로트랜스포손의 긴말단 반복순서에서 재조합 후의 구조물의 염색체 통합을 의미한다.
실시예 5
스트레인의 구성
하기 스트레인들이 제조되었다.
제조된 스트레인
RN1041 모 스트레인(상기 참조)
RN1067 RN1041 gpd1 :: hphMX
RN1068 RN1041 gpd2 :: natMX
RN1069 RN1041 gpd1 :: hphMX gpd2 :: natMX
RN1186 RN1041 + pRN977
RN1187 RN1067 + pRN977
RN1188 RN1068 + pRN977
RN1189 RN1069 + pRN977
GPD1-유전자(gpd1) 및/또는 GPD2-유전자(gpd2)의 결실은 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
RN1041, RN1067, RN1068 및 RN1069 스트레인은 플라스미드 pRN977로 형질전환되었다. 이 플라스미드는 하기 특징을 함유한다: 형질전환체의 선별을 위한 HIS3-유전자, 2μ의 복제 오리진, E. coli에서 선별을 위한 암피실린 내성 마커, PGK1-프로모터 및 ADH1-종결자의 조절하에 있는 E. coli의 adhE-유전자, TPI1-프로모터 및 PGI1-종결자의 조절하에 있는 S. cerevisiae의 DAK1-유전자 및 ACT1-프로모터 및 CYC1-종결자의 조절하에 있는 E. coli gldA-유전자. 모든 프로모터 및 종결자는 S. cerevisiae로부터 얻어진다. pRN977의 서열은 SEQ ID NO: 39에 기재되어 있다.
RN1041, RN1067, RN1068 및 RN1069 스트레인의 형질전환 후, 단일 콜로니 분리물은 pRN977 플라스미드의 존재를 체크하기 위해 콜로니 PCR 분석된다. 각 형질전환의 대표적 콜로니는 다른 실험을 위해 선별된다. 이러한 선별된 스트레인은 RN1186, RN1187, RN1188 및 RN1189로 지정된다.
마찬가지로, 형질전환체들은 하기 설명에 따라 생성되었다:
형질전환체
RN1190 RN1041 + pRN957
RN1191 RN1067 + pRN957
RN1192 RN1068 + pRN957
RN1193 RN1069 + pRN957
pRN957 플라스미드는 pRN977과 유사하나, S. cerevisiae의 DAK1-유전자는 Citrobacter freundii의 dhaK-유전자로 대체되었다. 이 플라스미드 pRN957의 서열을 SEQ ID NO: 37에 기재하였다.
컨트롤 스트레인으로서, RN1041 스트레인은 pRN595 플라스미드(RN1041+pRN595)로 형질전환되었다. 이 플라스미드, pRN595는 pRN977과 유사하나, gldA 및 DAK1 유전자가 결여되어 있다. 플라스미드 pRN595의 서열을 SEQ ID NO: 30에 기재하였다.
실시예 6
쉐이크 플라스크 실험
제조된 스트레인들의 성능은 혐기성 쉐이크 플라스크 실험에서 시험하였다. 이를 위해, 세포들을 탄소 공급원으로서 글루코즈가 보충된 미네랄 배지(Verduyn)에서 예비 성장시켰다. 배양물을 280rpm, 30℃에서 회전 쉐이커에서 밤새 배양하였다.
혐기적 배양의 접종을 위해 세포들의 분액을 밤새 배양된 배양물로부터 취하였다. 세포들의 양은 혐기적 배양물이 600nm에서 약 0.1의 초기 광학 밀도를 갖도록 하였다.
미네랄 배지의 탄소 조성물: 2.5% 글루코즈, 2.5% 자일로즈, 1% 글리세롤 및 2g/l HAc. pH는 pH 4.5로 조절되었다. 쉐이크 플라스크는 혐기적 조건을 확실히 하기 위해 워터락으로 봉하였다. 각 시점에 대해, 각각의 플라스크에 접종되었다.
발효 94시간 후에, 순 글리세롤 증가 또는 감소, 및 HAc 소비의 결과를 하기 표에 나타내었다.
각 스트레인에서 글리세롤 및 HAc 소비, 및 에탄올 생성값
스트레인 순 글리세롤 증가(+) 또는 감소(-) (grams/liter) HAc 소비
(grams/liter)		 에탄올 역가
(grams/liter)
RN1041 + 1.47 0.24 23.28
RN1186 - 1.20 0.99 25.32
RN1187 - 1.52 0.99 23.76
RN1188 - 0.80 0.97 25.01
RN1189 - 0.86 0.89 24.85
RN1190 - 0.47 0.71 24.38
RN1191 - 0.80 0.93 24.77
RN1192 + 0.93 0.29 23.60
RN1193 - 0.84 0.92 24.93
표 8에서 RN1041로 나타낸 스트레인은 HIS3-유전자 및 2μ 복제 오리진을 함유하여 히스티딘 영양요구성을 보완하는 표준 클로닝 벡터인 플라스미드 pRS323으로 형질전환되었다.
결과는 다음과 같다:
- RN1041은 글리세롤을 생성하며, 이는 GPD1 - 및 GPD2 -유전자 모두가 활성적이며 gldA 및 DAK1은 과발현되지 않기 때문에 실행가능하다. adhE는 이 스트레인에서 발현되지 않기 때문에, HAc 소비는 낮다.
- RN1186 내지 RN1189는 글리세롤 및 HAc 소비를 나타내며, RN1041에 비해 증가된 에탄올 역가를 형성한다.
- 형질전환체 RN1190, RN1191 및 RN1193을 이용한 실험은 동일한 결과, 즉, 글리세롤 및 아세테이트의 소비를 나타내지만, 약간 보다 적은 정도로 나타내었다. 또한, 여기서 에탄올 역가는 RN1041에 비해 높다. 스트레인 RN1192의 결과는 이후에 특성화가 이 스트레인이 이의 플라스미드 pRN957을 상실한 것으로 나타남에 따라, 이는 인위구조(artefact)이다.
gldA 및 adhE의 과발현과 함께 동종성 또는 이종성 디하이드록시아세톤 키나아제의 과발현은 혐기성 조건하에서 아세테이트 및 글리세롤의 동시 소비를 일으킨다.
실시예 7
AFM 실험
실시예 6에 나타낸 실험은 약간 다른 셋업, 즉, 실험 중에 온-라인 이산화탄소 측정이 가능한 AFM(알코올 발효 모니터)에서 반복되었다.
시험된 스트레인은 RN1041, RN1041+pRN595, RN1186, RN1187, RN1188 및 RN1189이었다. RN1041 스트레인은 HIS3-유전자 및 2μ 복제 오리진을 함유하여 히스티딘 영양요구성을 보완하는 표준 클로닝 벡터인 플라스미드 pRS323으로 형질전환되었다.
상기 스트레인들은 탄소 공급원으로서 2% 글루코즈를 함유한 미네랄 배지에서 280rpm 및 30℃에서 예비-배양되었다.
세포들을 수거하고 AFM 실험을 상기한 바와 같이 시작하였다.
시료들을 일정 간격으로 취하고, 당류, 에탄올, 글리세롤 및 HAc를 HPLC에 의해 측정하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
시간 = 112hours에서 각 스트레인에 대한 글리세롤 및 HAc 소비 및 에탄올 생성값
스트레인 순 글리세롤 증가(-) 또는 감소(+) (grams/liter) HAc 소비
(grams/liter)		 에탄올 생성
(grams/liter)
RN1041 + 1.4 0.1 24.0
RN1041+pRN595 + 1.1 0.4 24.1
RN1186 - 0.3 0.7 25.5
RN1187 - 1.2 1.0 25.5
RN1188 - 0.3 0.7 25.2
RN1189 - 1.1 1.0 25.6
시간에 따른 글리세롤 및 HAc 수준의 평가를 도 1 및 2에 나타내었다.
RN1041 및 RN1041+pRN595 스트레인은 순 글리세롤 생성을 나타내었다. RN1186 및 RN1188 스트레인은 초기에 글리세롤 생성을 나타내었으나, 약 24-32시간 후에, 글리세롤 소비가 시작되었으며, 마지막에 순 글리세롤 소비가 관찰될 때까지 계속되었다.
RN1187 및 RN1189 스트레인은 RN1186 및 RN1188에서 나타난 바와 같이 초기 글리세롤 생성을 나타내지 않았다. 24시간 후, 글리세롤 소비가 시작되었다. 글리세롤 소비는 RN1186 및 RN1188에 비해 이러한 스트레인에서 현저히 더 높았다. 이러한 결과는 GPD1-유전자의 결실이 GPD2-유전자의 결실보다 더 높은 글리세롤 소비를 형성함을 보여준다.
RN1041+pRN595 스트레인은 레퍼런스 스트레인 RN1041보다 더 높은 HAc 소비를 보여주었다. RN1186 및 RN1188은 RN1041+pRN595보다 더 높은 HAc 소비를 나타내었다. 이러한 결과는 글리세롤 소비가 HAc 소비를 증가시켰음을 나타낸다. 이러한 효과는 RN1187 및 RN1189에서 더 강하였다.
실시예 8
글리세롤 디하이드로게나아제 활성 어세이
RN1041 및 RN1190의 세포 프리 추출물(CFE)을 상기한 바와 같이 준비하였다. Lin 및 Magasanik(1960) J Biol Chem.235:1820-1823의 프로토콜로부터 채용된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성 어세이를 수행하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다.
글리세롤 디하이드로게나아제 어세이
시료 보조인자 A340/min에서 증가
RN1041 5 ㎕ CFE NAD+ 0.00
N1190 5 ㎕ CFE NAD+ 0.02
RN1041 20 ㎕ CFE NAD+ 0.00
RN1190 20 ㎕ CFE NAD+ 0.09
RN1041 5 ㎕ CFE NADP+ 0.00
RN1190 5 ㎕ CFE NADP+ 0.00
RN1041 20 ㎕ CFE NADP+ 0.00
RN1190 20 ㎕ CFE NADP+ 0.00
표 10에 RN1041로 나타낸 스트레인은 HIS3-유전자 및 2μ 복제 오리진을 함유하여 히스티딘 영양요구성을 보완하는 표준 클로닝 벡터인 pRS323 플라스미드로 형질전환되었다.
이러한 결과는 a) RN1190에서 발현되는 E. coli gldA가 NAD+-의존적이며, 그리고 b) CFE의 양 증가는 NAD+의 전환율의 비례하는 증가를 형성하였으며, 이에 따라 글리세롤의 디히드록시아세톤으로의 전환율이 비례하는 증가를 형성하였다.
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Microbial strains engineered to produce ethanol from carbohydrates, acetic acid and glycerol <130> P6038681PCT <150> EP 11191333 <151> 2011-11-30 <150> US 61/564,932 <151> 2011-11-30 <160> 51 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 316 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ser Lys Arg Lys Val Ala Ile Ile Gly Ser Gly Asn Ile Gly Thr 1 5 10 15 Asp Leu Met Ile Lys Ile Leu Arg His Gly Gln His Leu Glu Met Ala 20 25 30 Val Met Val Gly Ile Asp Pro Gln Ser Asp Gly Leu Ala Arg Ala Arg 35 40 45 Arg Met Gly Val Ala Thr Thr His Glu Gly Val Ile Gly Leu Met Asn 50 55 60 Met Pro Glu Phe Ala Asp Ile Asp Ile Val Phe Asp Ala Thr Ser Ala 65 70 75 80 Gly Ala His Val Lys Asn Asp Ala Ala Leu Arg Glu Ala Lys Pro Asp 85 90 95 Ile Arg Leu Ile Asp Leu Thr Pro Ala Ala Ile Gly Pro Tyr Cys Val 100 105 110 Pro Val Val Asn Leu Glu Ala Asn Val Asp Gln Leu Asn Val Asn Met 115 120 125 Val Thr Cys Gly Gly Gln Ala Thr Ile Pro Met Val Ala Ala Val Ser 130 135 140 Arg 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catcgttttg caagctgcta 480 tcgctgctgg tgctccaaag gacttgatcg gttggatcga ccaaccatct gttgaattgt 540 ctaacgcttt gatgcaccac ccagacatca acttgatctt ggctaccggt ggtccaggta 600 tggttaaggc tgcttactct tctggtaagc cagctatcgg tgttggtgct ggtaacaccc 660 cagttgttat cgacgaaacc gctgacatca agagagctgt tgcttctgtt ttgatgtcta 720 agaccttcga caacggtgtt atctgtgctt ctgaacaatc tgttgttgtt gttgactctg 780 tttacgacgc tgttagagaa agattcgcta cccacggtgg ttacttgttg caaggtaagg 840 aattgaaggc tgttcaagac gttatcttga agaacggtgc tttgaacgct gctatcgttg 900 gtcaaccagc ttacaagatc gctgaattag ctggtttctc tgttccagaa aacaccaaga 960 tcttgatcgg tgaagttacc gttgttgacg aatctgaacc attcgctcac gaaaagttgt 1020 ctccaacctt ggctatgtac agagctaagg acttcgaaga cgctgttgaa aaagctgaaa 1080 agttggttgc tatgggtggt attggtcaca cctcttgttt gtacaccgac caagacaacc 1140 aaccagctag agtttcttac ttcggtcaaa agatgaagac cgctagaatc ttgatcaaca 1200 ccccagcttc tcaaggtggt atcggtgact tgtacaactt caagttggct ccatctttga 1260 ccttgggttg tggttcttgg ggtggtaact ctatctctga aaacgttggt 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gctaacgctt 2160 tcttgggtgt ttgtcactct atggctcaca agttgggttc tcaattccac atcccacacg 2220 gtttggctaa cgctttgttg atctgtaacg ttatcagata caacgctaac gacaacccaa 2280 ccaagcaaac cgctttctct caatacgaca gaccacaagc tagaagaaga tacgctgaaa 2340 tcgctgacca cttgggtttg tctgctccag gtgacagaac cgctgcaaag atcgaaaagt 2400 tgttggcttg gttggaaacc ttgaaggctg aattgggtat cccaaagtct atcagagaag 2460 ctggtgttca agaagctgac ttcttggcta acgttgacaa gttgtctgaa gacgctttcg 2520 acgaccaatg taccggtgct aacccaagat acccattgat ctctgaattg aagcaaatct 2580 tgttggacac ctactacggt agagactacg ttgaaggtga aaccgctgct aagaaggaag 2640 ctgctccagc taaggctgaa aagaaggcta agaagtctgc ttagcttaag 2690 <210> 5 <211> 870 <212> PRT <213> Entamoeba histolytica <400> 5 Met Ser Thr Gln Gln Thr Met Thr Val Asp Glu His Ile Asn Gln Leu 1 5 10 15 Val Arg Lys Ala Gln Val Ala Leu Lys Glu Tyr Leu Lys Pro Glu Tyr 20 25 30 Thr Gln Glu Lys Ile Asp Tyr Ile Val Lys Lys Ala Ser Val Ala Ala 35 40 45 Leu Asp Gln His Cys Ala Leu Ala Ala Ala Ala Val Glu Glu Thr Gly 50 55 60 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aaaaagctct aaacgacttt 780 ctgtccagtg aatctgttca tacacatgat agttctagga aacaatctaa taagcagtca 840 tccgacgaag gacgctcttc atcacaacct tcacatcatc actctggtgg tactaacaac 900 aataataaca ataataataa taataataac agtaacaaca acaacaacgg caacgatggg 960 ggaaatgatg acgactatga ttatgaaatg caagattata gaccttctcc gcaaagtgcg 1020 cggcctactc ccacgtatgt tccacaatat tctgtagaaa gtgggactgc tttcccgatt 1080 caagaggtta ttcctagcgc atacattaac acacaagata taaaccataa agataacggt 1140 ccgccgagtg caagcagtaa tagagcattc aggcctagag ggcagaccac agtgtcggcc 1200 aacgtgctta acattgaaga tttttacaaa aatgcagacg atgcgcatac catcccggag 1260 tcacatttat cgagaaggag aagtaggtcg agggctacga gtaatgctgg gcacagtgcc 1320 aatacaggcg ccacgaatgg caggactact ggtgcccaaa ctaatatgga aagcaatgaa 1380 tcaccacgta acgtccccat tatggtgaag ccaaagacat tataccagaa ccctcaaaca 1440 cctacagtct tgccctccac ataccatcca attaataaat ggtcttccgt caaaaacact 1500 tatttgaagg aatttttagc cgagtttatg ggaacaatgg ttatgattat tttcggtagt 1560 gctgttgttt gtcaggtcaa tgttgctggg aaaatacagc aggacaattt 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cagtatagcg accagcattc acatacgatt gacgcatgat attactttct gcgcacttaa 8520 cttcgcatct gggcagatga tgtcgaggcg aaaaaaaata taaatcacgc taacatttga 8580 ttaaaataga acaactacaa tataaaaaaa ctatacaaat gacaagttct tgaaaacaag 8640 aatcttttta ttgtcagtac tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat 8700 ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga 8760 gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg 8820 actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt 8880 gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct 8940 ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc 9000 aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa 9060 ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca 9120 atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt gccggggatc 9180 gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga 9240 ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg 9300 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caagataaag 10980 gcatccccga ttatattcta taccgatgtg gattgcgcat actttgtgaa cagaaagtga 11040 tagcgttgat gattcttcat tggtcagaaa attatgaacg gtttcttcta ttttgtctct 11100 atatactacg tataggaaat gtttacattt tcgtattgtt ttcgattcac tctatgaata 11160 gttcttacta caattttttt gtctaaagag taatactaga gataaacata aaaaatgtag 11220 aggtcgagtt tagatgcaag ttcaaggagc gaaaggtgga tgggtaggtt atatagggat 11280 atagcacaga gatatatagc aaagagatac ttttgagcaa tgtttgtgga agcggtattc 11340 gcaatgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta 11400 gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc 11460 catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg 11520 gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat 11580 aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta 11640 acgcgaattt taacaaaata ttaacgttta caatttcctg atgcggtatt ttctccttac 11700 gcatctgtgc ggtatttcac accgcagggt aataactgat ataattaaat tgaagctcta 11760 atttgtgagt ttagtataca tgcatttact tataatacag 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gtttttgttc tgtgcagttg ggttaagaat 12660 actgggcaat ttcatgtttc ttcaacacta catatgcgta tatataccaa tctaagtctg 12720 tgctccttcc ttcgttcttc cttctgttcg gagattaccg aatcaaaaaa atttcaaaga 12780 aaccgaaatc aaaaaaaaga ataaaaaaaa aatgatgaat tgaattgaaa agcgtggtgc 12840 actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca 12900 cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg 12960 accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcga 13018

Claims (15)

  1. 이스트 세포로 배지를 발효하는 단계를 포함하는 에탄올 생성 방법으로서,
    상기 배지는
    a) 헥소스 및 펜토즈 중 적어도 하나의 공급원;
    b) 아세트산의 공급원; 및
    c) 글리세롤의 공급원
    을 함유하거나 또는 이와 함께 공급되며
    이에 따라 이스트 세포는 아세트산, 글리세롤 및 헥소스와 펜토즈 중 적어도 하나를 에탄올로 발효시키며, 그리고 선택적으로, 에탄올의 회수를 포함하며, 이에 따라 이스트 세포는 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 외인성 유전자를 포함하며, 상기 외인성 유전자는 아세트산을 에탄올로 전환하는 능력을 세포에 부여하고, 이에 따라 이스트 세포는 NAD+-결합된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 박테리아 유전자를 포함하는,
    에탄올 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 외인성 유전자는
    i) SEQ ID NO: 1과 적어도 64% 아미노산 서열 동일성,
    ii) SEQ ID NO: 3과 적어도 76% 아미노산 서열 동일성 및
    iii) SEQ ID NO: 5와 적어도 61% 아미노산 서열 동일성
    중 적어도 하나를 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
    여기서 NAD+-결합된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 박테리아 유전자는 SEQ ID NO: 7과 적어도 45% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 상기 이스트 세포에서 NAD+-의존적 글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제의 특이적 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이스트 세포에서 NAD+-의존적 글리세롤 3-포스페이트 디하이드로게나아제의 특이적 활성을 감소시키는 유전적 변형은 SEQ ID NO: 16에 대해 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 글리세롤포스페이트 디하이드로게나아제를 암호화하는 외인성 유전자의 발현을 감소시키거나 불활성화하는 유전적 변형인, 에탄올 생성 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 디히드록시아세톤 키나아제의 특이적 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하며, 여기서 상기 유전적 변형은 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현이며, 그리고 여기서, 바람직하게, 디히드록시아세톤 키나아제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 8, 9 및 25 중 적어도 하나와 적어도 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는
    i) 특이적 아세틸-CoA 합성효소 활성, 그리고 여기서 바람직하게, 유전적 변형은 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현인, 특이적 아세틸-CoA 합성효소 활성; 및
    ii) 글리세롤의 상기 세포내로의 수송
    중 적어도 하나를 증가시키는 유전적 변형을 더 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) ACS1 유전자에 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소보다 더 높은 최대 속도로 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하거나, 또는 여기서 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) ACS2 유전자에 의해 암호화되는 아세틸-CoA 합성효소보다 더 높은 아세테이트에 대한 친화도로 아세틸-CoA 합성효소를 암호화하며, 그리고 여기서 상기 세포내로 글리세롤의 수송을 증가시키는 유전적 변형은 글리세롤 흡수 단백질 및 글리세롤 채널 중 적어도 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 과발현이며, 여기서, 바람직하게, 글리세롤 흡수 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 10 및 11 중 적어도 하나와 적어도 50% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 그리고 여기서, 바람직하게 글리세롤 채널을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 250 내지 530 사이의 아미노산 서열과 적어도 30% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 유전적 변형은 혐기적 조건하에서 특이적 아세틸-CoA 합성효소 활성을 증가시키는, 에탄올 생성 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이스트 세포는
    i) 기능적 외인성 자일로즈 이소머라아제 유전자로서, 여기서 이 유전자는 자일로즈를 자일룰로즈로 이소머화하는 능력을 세포에 부여하는, 기능적 외인성 자일로즈 이소머라아제 유전자; 및
    ii) L-아라비노즈 이소머라아제, L-리불로키나아제 및 L-리불로즈-5-포스페이트 4-에피머라아제를 암호화하는 기능적 외인성 유전자로서, 여기서 이 유전자는 L-아라비노즈를 D-자일룰로즈 5-포스페이트로 전환하는 능력을 세포에 함께 부여하는 L-아라비노즈 이소머라아제, L-리불로키나아제 및 L-리불로즈-5-포스페이트 4-에피머라아제를 암호화하는 기능적 외인성 유전자
    를 포함하며, 그리고 여기서, 바람직하게 이스트 세포는
    a) 증가된 자일룰로즈 키나아제 특이적 활성;
    b) 증가된 펜토즈 포스페이트 경로의 플럭스;
    c) 감소된 비특이적 알도즈 환원효소 특이적 활성;
    d) 자일로즈 및 아라비노즈 중 적어도 하나의 숙주 세포내로의 증가된 수송;
    e) 이화대사 억제에 대한 감소된 민감성;
    f) 에탄올, 삼투성 또는 유기산에 대한 증가된 내성; 및
    g) 감소된 부산물 생성
    으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 특성을 일으키는 적어도 하나의 유전적 변형을 더 포함하는, 에탄올 생성 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 사카로미세스(Saccharomyces ), 클루이베로미세스(Kluyveromyces ), 칸디다(Candida ), 피치아(Pichia ), 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces ), 한세눌라(Hansenula ), 클로엑케라(Kloeckera ), 슈반니오미세스(Schwanniomyces ), 및 야로위아(Yarrowia)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 속에 속하는, 에탄올 생성 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 에스.세레비지아제(S. cerevisiae ), 에스. 엑시구스(S. exiguus), 에스. 바야너스(S. bayanus ), 케이. 락티스(K. lactis ), 케이. 마르시아너스(K. marxianus ) 및 쉬조사카로미세스 폼브(Schizosaccharomyces pombe)로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 종에 속하는, 에탄올 생성 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배지는 목질 섬유 가수분해물을 함유하거나 또는 이와 함께 공급되는, 에탄올 생성 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 혐기적 조건하에서 발효되는, 에탄올 생성 방법.
  14. a) 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호하는 외인성 유전자로서, 이 유전자는 아세트산을 에탄올로 전환하는 능력을 세포에 부여하는, 아세트알데히드 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호하하는 외인성 유전자; 및
    b) NAD+-결합된 글리세롤 디하이드로게나아제 활성을 갖는 효소를 암호화하는 박테리아 유전자
    를 포함하는 이스트 세포로서,
    이에 따라 상기 이스트 세포는 상기 이스트 세포에서 특이적 NAD+-의존적 포메이트 디하이드로게나아제 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 이스트 세포가 아닌, 이스트 세포.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 이스트 세포는 또한 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 것과 같은, 이스트 세포.
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