BRPI0908276B1 - uso de um anticorpo antagonista anti-cgrp para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de dor de osteoartrite - Google Patents

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BRPI0908276B1
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Kristian Todd Poulsen
David Louis Shelton
Joerg Zeller
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Abstract

USO DE COMPOSTO PARA TRATAR DOR INFLAMATÓRIA. A invenção diz respeito de um anticorpo anti-CGRP para uso na prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória, e a um método de tratar e/ou prevenir dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória usando um anticorpo anti-CGRP.

Description

Campo da Invenção
[001]A invenção diz respeito a um anticorpo anti-CGRP para uso na preven-ção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória, e a um método de tratar e/ou prevenir dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória usando um anticorpo anti-CGRP.
Antecedentes da Invenção.
[002]O processo inflamatório é uma série complexa de eventos bioquímicos e celulares, ativado em resposta a lesão de tecido ou a presença de substâncias estranhas, que resulta em inchaço e dor (Levine e Taiwo, 1994, Textbook of Pain, 45-56). Dor artrítica é a dor inflamatória mais comum. Doença reumatóide é uma das condições inflamatórias crônicas mais comuns em países desenvolvidos e artrite reumatóide é uma causa comum de incapacidade. A etiologia exata de artrite reuma-tóide é desconhecida, mas hipóteses atuais sugerem que tanto fatores genéticos quanto microbiológicos podem ser importantes (Grennan & Jayson, 1994, Textbook of Pain, 397-407). Estima-se que quase 16 milhões de americanos tenham osteoar- trite sintomática (OA) ou doença degenerativa da junta, a maioria desses está acima de 60 anos de idade, e espera-se que isto aumente para 40 milhões, uma vez que a idade da população aumenta, tornando isto um problema de saúde pública de enor-me magnitude (Houge & Mersfelder, 2002, Ann Pharmacother, 36, 679-686; McCar-thy et al., 1994, Textbook de Dor, 387-395). A maioria dos pacientes com osteoartrite procura atenção médica em virtude da dor associada. Artrite tem um impacto signifi-cativo na função psicosocial e física e é conhecida por ser a causa principal de inca-pacidade na vida adulta. Espondilite anquilosante é também uma doença reumática que causa artrite das juntas da espinha dorsal e sacroilíacas. Ela variará de episó-dios intermitentes de dor lombar que ocorre por toda a vida até uma doença crônica severa que ataca a espinha dorsal, juntas periféricas e outros órgãos do corpo.
[003]Um outro tipo de dor inflamatória é dor visceral que inclui dor associada com doença do intestino inflamatório (IBD). Dor visceral é dor associada com as vís-ceras, que engloba os órgãos da cavidade abdominal. Esses órgãos incluem os ór-gãos sexuais, baço e parte do sistema digestivo. Dor associada com as vísceras pode ser dividida em dor visceral digestiva e dor visceral não digestiva. Os distúrbios gastrintestinais (Gl) comumente encontrados que causam dor incluem distúrbio do intestino funcional (FBD) e doença do intestino inflamatório (IBD). Esses distúrbios Gl incluem uma ampla faixa de estados da doença que são atualmente apenas mo-deradamente controlados, incluindo, com relação a FBD, refluxo gastroesofageal, dispepsia, síndrome do intestino irritável (IBS) e síndrome da dor abdominal funcio-nal (FAPS) e, com relação a IBD, doença de Crohn, ileíte e colite ulcerativa, todos os quais produzem dor visceral regularmente. Outros tipos de dor visceral incluem a dor associada com dismenorréia, cistite e pancreatite e dor pélvica.
[004]Existe uma necessidade médica crítica de identificar compostos farma-ceuticamente ativos inéditos que interferem nas etapas chaves do processo da dor inflamatória e particularmente para o tratamento e/ou prevenção de dor de artrite e/ou sintomas de dor de artrite.
[005]Observamos surpreendentemente que a administração de um anticorpo anti-CGRP é efetiva na prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória, dor de artrite e em particular dor de osteoartrite.
[006]CGRP (peptídeo relacionado ao gene de calcitonina) é um neuropeptí- deo de 37 aminoácidos que age como um neurotransmissor no sistema nervoso central. Ele se liga com alta afinidade ao receptor de CGRP, receptor tipo receptor de calcitonina (CRLR), ativando a produção de adenilato ciclase e quinase A da pro-teína.
[007]Antagonistas CGRP seletivos de molécula pequena, administrados es-pinhalmente penetrando centralmente, mostraram ser úteis no tratamento de condi-ções de dor neuropática e nociceptiva (Adwanikar et al, Pain 2007), sugerindo que a remoção de CGRP endógeno na medula espinhal tem um efeito antinociceptivo. Adicionalmente mostrou-se que a administração intratecal de antissoro contra CGRP reduz o comportamento nociceptivo em modelos de roedores de artrite (Kuraishi, Y., et. al Neurosci. lett (1998) 92, 325 - 329).
[008]Surpreendentemente observamos que a administração de um anticorpo anti-CGRP é efetiva, com um sítio periférico de ação, na prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e em particular dor de osteoartrite quando administrado periferi-camente. Esta via de administração periférica fornece uma vantagem distinta com relação a exigência de administrar anticorpos intratecalmente ou espinhalmente, um procedimento com risco mais alto e inconveniente.
Descrição Resumida da Invenção
[009]A presente invenção diz respeito ao uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória, em que o medicamento é pre-parado para ser administrado perifericamente.
[0010]A presente invenção diz respeito adicionalmente a um método de pre-venção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em um indivíduo, que compreende administrar perifericamente ao dito indivíduo uma quan-tidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
[0011]Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP age periferi-camente na administração.
Descrição das Figuras
[0012]Figura 1: Dor de modelo de osteoartrite. Anticorpo G2 foi administrado a 1 e 10 mg/kg, intravenosamente (1 mL/kg, IV) e, um anticorpo null (não se liga a CGRP) foi administrado a 10 mg/kg, IV como um controle negativo. Ambos anticorpos foram dissolvidos em uma solução veículo contendo PBS + Tween 20 0,01 %. Celecoxib foi usado como controle positivo no estudo. Ele foi suspenso em metilcelu- lose 0,5 % e Tween-20 0,025 % e foi administrado por gavagem oral (1 mL/kg) a 30 mg/kg, duas vezes um dia por todo o período de estudo. Respostas a dor foram ava-liadas no dia 2, 3, 7 e 10 após a iniciação do estudo farmacológico (dia 0) e foram avaliadas em um modo completamente cego. Dados são a média ±SEM de 6 ratos por grupo. *p<0,05 e p<0,01 vs valor de linha de base (teste de Dunnett em Gra- phPad Prism). Na figura, da esquerda para a direita, barra 1 = linha de base, barras 2-5 = anticorpo null, barras 6-9 = 1 mg/mL G2, barras 10-13 = 10 mg/mL G2, barras 14-17 = Celecoxib 30 mg/mL.
[0013]Figura 2: Dados de ensaio de ligação demonstrando que anticorpo G1 inibe a ligação de a- CGRP no receptor de CGRP1.
[0014]Figura 3a: nível de soro de concentração de anti-CGRP (ug/mL) vs tempo após a administração IV de 10 mg/kg, medido por anti-lgG ELISA.
[0015]Figura 3b: nível de soro de concentração de anti-CGRP (ug/mL) vs ti-me após administração IV de 10, 30, 100 mg/kg, medido por ELISA anti-lgG.
[0016]Figura 4: Varredura de alanina usando um fragmento de CGRP C- terminal (CGRP 25-37). A mudança na afinidade é expressa em número de vezes de perda de afinidade e que mostra que anticorpo anti-CGRP G1 liga na região C- terminal de a-CGRP humano.
[0017]Figura 5: competição de solução por Biacore: CGRP, fragmentos de CGRP ou peptídeos relacionados na sequência para CGRP foram usados para de-terminar a especificidade de G1.
[0018]Figura 6: Sequências de CGRP de humano, macaco cinomolgo, rato, camundongo, cão e coelho. Espécies entre resíduos não conservados são sobrescri-tas, o epítopo de G1 está em negrito.
[0019]Figura 7: Dados mostrando que G1 inibe erupção neurogênica na pele começando de 90 minutos após o tratamento. G1 foi aplicado por administração in-travenosa (1 mL/kg). Dados são de 6-8 ou 13 ratos por grupo. *p=0,05, **p=0,01 vs grupo tratado com veículo (salina tamponada com fosfato) em cada ponto de tempo (ANOVA). Tabela 1: Kd e IC50 de anticorpos anti-CGRP medidos a 25 °C contra a- CGRP humano [muMab7E9 = precursor de murino de G1. Seu Ko para β-CGRP de rato =1 nM. RN4901 = fezes de murino, reconhecendo o mesmo epítopo como G1 mas mostrou as mesmas afinidades e seletividade em ratos (β-CGRP Ko= 17 nM); G1 = anticorpo humanizado de muMab7E9 (Ko para βCGRP de rato = 0,1 nM).]
[0020]Tabela 2: Afinidades de ligação de G1 da maneira determinada por Biacore
Descrição da invenção Técnicas gerais
[0021]A prática da presente invenção empregará, a menos que de outra for-ma indicada, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas re- combinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que são co-nhecidos pelos versados da tecnologia. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods Molecular Biology, Human Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. CelMs, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Imunology (D. M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (MulMs et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (CA. Jane-way and P. Travers, 1997); Anticbodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical ap-proach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical ap-proach (P. Shepherd and C Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using anti-corpos: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (VT. DeVita et al., eds., J. B. Lippincott Company, 1993).
Definições
[0022]Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica em um alvo, tais como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptí-deo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Da maneira aqui usada, o termo engloba não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também fragmentos destes (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb), anticorpos de cadeia única (ScFv), seus mutantes, anticorpos quiméricos, diacorpos, proteínas de fusão com-preendendo um porção de anticorpo, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antíge-no. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tais como IgG, IgA, ou IgM (ou subclasse desses), e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe particular. Dependendo da sequência de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser projetadas para classes diferen-tes. Existem cinco classes de imunoglobulinas principais: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas dessas podem ser divididas adicionalmente em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pe- sada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0023]"Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um sítio de reconheci-mento e ligação de antígeno completo. Em uma espécie de Fv de duas cadeias, esta região consiste em um dímero de um domínio variável cadeia pesada e uma leve em associação firme, não covalente. Em uma espécie de Fv de cadeia única, um domí-nio variável de cadeia pesada e leve pode ser covalentemente ligado por um agente de ligação de peptídeo flexível de maneira que as cadeias leves e pesadas possam associar em uma estrutura dimérica análoga àquela em uma espécie de Fv de duas cadeias. É nesta configuração que os três CDRs de cada domínio variável interagem para definir uma especificidade de ligação de antígeno na superfície do dímero VH- VL. Entretanto, mesmo um domínio variável único (ou metade de um Fv compreen-dendo apenas 3 CDRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reco-nhecer e ligar antígeno, embora no geral a uma afinidade mais baixa que o sítio de ligação total.
[0024]O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fabs pela adição de alguns resíduos no término carboxila do domínio CH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteínas das o anticorpo regiões de dobradiça. Um fragmento F(ab)2 é um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fabs ligados por uma ligação de dissulfeto na região de dobradiça.
[0025]Um anticorpo pode ter um ou mais sítios de ligação (para combinar com antígeno). Se existir mais que um sítio de ligação, os sítios de ligação podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferentes. Por exemplo, uma imunoglobulina de ocorrência natural tem dois sítios de ligação idênticos, um anticorpo de cadeia única ou fragmento Fab tem um sítio de ligação, enquanto um anticorpo "bi- específico" ou "bifuncional" (diacorpo) tem dois sítios de ligação diferentes, em termos de reconhecimento de sequência e/ou antígeno / epítopo.
[0026]Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) não é associado com componentes associados naturalmente, incluindo outros anticorpos associados naturalmente, que o acompanham em seu estado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.
[0027]Um "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população de anticorpo homogêneo em que o anticorpo monoclonal é compreendido de aminoácidos (de ocorrência natural e de ocorrência não natural) que são envolvidos na ligação seleti-va de um antígeno. Uma população de anticorpos monoclonais é altamente específi-ca, sendo direcionada contra um sítio antigênico único. O termo "anticorpo monoclo-nal" engloba não apenas anticorpos monoclonais intactos e anticorpos monoclonais de comprimento total, mas também fragmentos desses (tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia única (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo um porção de anticorpo, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imu-noglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especifici-dade exigida e a capacidade de se ligar a um antígeno. Não deve-se ficar limitado com relação à fonte do anticorpo ou a maneira na qual ele é feito (por exemplo, por hibridoma, seleção defago, expressão recombinante, animais transgênicos, etc.).
[0028]Da maneira aqui usada, anticorpos "humanizados" referem-se a for-mas de anticorpos não humano (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina, ou fragmentos desses (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação de antígeno de anticorpos) que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo reci- piente) em que resíduos de uma região determinante de complementariedade (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, ou coelho tendo a especificidade, afinidade, e atividade biológica desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não hu-manos correspondentes. Além do mais, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo recipiente nem nas sequências CDR ou estrutura importada, mas são incluídos para refinar e otimizar adicionalmen-te o desempenho do anticorpo. No geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das regiões CDR correspondem aquela de uma imunoglobulina não humana e todos ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Anticorpos podem ter regiões Fc modificadas da maneira descrita em WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados têm um ou mais CDRs (um, dois, três, quatro, cinco, seis) que são alterados com relação ao anticorpo original, que são também denominados um ou mais CDRs "derivada de" um ou mais CDRs do anticorpo original.
[0029]Da maneira aqui usada, "anticorpo humano" significa um anticorpo com uma sequência de aminoácidos correspondente à de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi feito usando quaisquer das técnicas para produzir anti-corpos humanos conhecidas na tecnologia ou aqui reveladas.
[0030]Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos compreen-dendo pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada de humano ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve de humano. Um exemplo como esse é um anticorpo compreendendo polipeptídeos de cadeia leve de murino e cadeia pesada de huma-no. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na tecnologia. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma bibli-oteca de fago, onde tal biblioteca de fago expressa anticorpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Anticorpos humanos podem também ser feitos introdu- zindo-se imunoglobulina humana loci em animais transgênicos, por exemplo, ca-mundongos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcialmente ou completamente inativados. Esta abordagem é descrita nas patentes U.S. Nos, 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado imortalizando-se linfócitos B humanos que produzem um anticorpo direcionado contra um antígeno alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados a partir de um indivíduo ou pode ser imunizados in vitro). Ver, por exemplo, Cole et al., monoclonal Anticbodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e patente U.S. No. 5,750,373.
[0031]Um anticorpo de cadeia única (scFc) é um anticorpo em que as regi-ões VL e VH são pareadas para formar uma molécula monovalente por meio de um agente de ligação sintético que permite que eles sejam produzidos como uma única cadeia de proteína (Bird et al Science, 242: 423-426 (1988) and Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879-5883 (1988)).
[0032]Diacorpos são anticorpos bivalentes, bi-específicos em que domínios VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um agente de ligação que é muito pequena para permitir pareamento entre os dois do-mínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a parear com domínios com-plementares de uma outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno.
[0033]"Anticorpos quiméricos" referem-se aos anticorpos em que uma porção de cada uma da sequência de aminoácidos de cadeia leve e pesada é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencente a uma classe particular, embora o segmento remanescente das cadeias seja homólogo às sequências correspondentes em um outro. Tipicamente, nestes anticorpos quiméricos, a região variável tanto de cadeias leves quanto pesadas mimetiza as regiões variáveis de anticorpos derivadas de uma espécie de mamíferos, embora as porções constantes sejam homólogas às sequências em anticorpos derivados de um outro. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que, por exemplo, as regiões variáveis podem convenientemente ser derivadas de fontes atualmente conhecidas usando hibridomas ou células B facilmente disponíveis de organismos de hospedeiro não humano em combinação com regiões constantes derivadas, por exemplo, de preparações de célula humana. Embora a região variável tenha a vantagem de facilidade de preparação, e a especificidade não seja afetada por sua fonte, a região constante sendo humana, é menos provável elicitar uma res-posta imune de um sujeito humano quando os anticorpos são injetados do que seria a região constante a partir de uma fonte não humana. Entretanto, a definição não está limitada a este exemplo particular.
[0034]Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. As "funções efetoras" exemplares incluem liga-ção C1 q; citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação do receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; in- fraregulagem de receptores de superfície da célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras no geral exigem a região Fc para ser combinadas com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio de anticorpo variável) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na tecnologia para avaliar tais funções efetoras do anticorpo.
[0035]Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa devido a de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácido comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a região Fc de um polipeptídeo pai, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez subs-tituições de aminoácido, e preferivelmente de cerca de um a cerca de cinco substi-tuições de aminoácido em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo pai. A região Fc variante possuirá aqui preferivelmente pelo menos cer-ca de 80 % de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo pai, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 % de identidade de sequência com ele, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência com ele.
[0036]Da maneira aqui usada "citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, célu-las exterminadoras naturais (NK), neutrófilos, e macrófagos) reconhecem anticorpo ligado a uma célula alvo e subsequentemente causa lise da célula alvo. Atividade de ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio ADCC in vitro, tal como o descrito na patente U.S. No. 5.500.362 ou 5.821.337. Células efeto-ras usadas para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como revelado em Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652- 656.
[0037]Da maneira aqui usada, "receptor Fc" e "FcR" descrevem um receptor que liga na região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Entretanto, um FcR preferido é um que liga um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e altemativamente formas emendadas desses receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que tem sequência de aminoácidos similar que difere basicamente nos seus domínios citoplásmicos. FcRs são revisados em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and of Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternal para o feto (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).
[0038]"Citotoxicidade dependente do complemento" e "CDC" referem-se à li- se de um alvo na presença de complemento. O caminho da ativação de complemento é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1 q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio CDC, por exemplo, da maneira descrita em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996), pode ser realizado.
[0039]Da maneira aqui usada, os termos "G1" e "anticorpo G1” são usados intercambiavelmente para referir-se a um anticorpo produzido pelos vetores de ex-pressão tendo números de depósito ATCC-PTA- 6867 e ATCC- PTA-6866. A se-quência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve é mostrada em SEQ ID Nos. 1 e 2. As porções CDR de anticorpo G1 (incluindo Chothia e Kabat CDRs) são diagramaticamente descritas na Figura 5 de WQ2007/054809, o teor das quais está aqui incorporado pela referência na sua íntegra. Os Polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são mostrados em SEQ ID Nos. 9 e 10. a caracterização de anticorpo G1 é descrita nos Exemplos de W02007/054809, o teor na íntegra dos quais está aqui incorporado pela referência. G1 é um anticorpo de bloqueio monoclonal humanizado (lgG2) que bloqueia a ligação e atividade do neuropeptídeo CGRP (a e b) e seu efeito de vasodilatação neurogênica causada pela liberação de CGRP. G1 é um anticorpo antagonista anti-CGRP monoclonal lgG2Δa derivada do precursor do anticorpo antagonista anti-CGRP murino, denotou muMAb7E9 identificado em uma classifica-ção usando células do baço preparadas a partir de um camundongo imunizado com CGRP humano e rato que foram fundidas com células plasmacitoma de murino. G1 foi criado enxertando-se os CDRs derivados de muMAb 7E9 de cadeia leve e pesada na sequência da linha germinal humana mais próxima seguido pela introdução de pelo menos 1 mutação em cada CDR e 2 mutações de estrutura em VH. Duas muta-ções foram introduzidas no domínio Fc de G1 para suprimir ativação do receptor Fc humano. Mostrou-se que G1 e muMab7E9 reconhecem o mesmo epítopo.
[0040]Da maneira aqui usada, os termos "G2" e "anticorpo G2" são usados intercambiavelmente para referir-se a um anticorpo monoclonal de camundongo CGRP anti-rato da maneira descrita em Wong HC et al. Hybridoma 12:93-106 (1993). A sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve é mostrada em SEQ ID Nos. 19 e 20. Os Polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são mostrados em SEQ ID Nos. 27 e 28. As porções CDR de anticorpo G2 são fornecidas em SEQ ID Nos. 21 a 26. G2 mostrou reconhecer o mesmo epítopo como G1.
[0041]Da maneira aqui usada, ligação de anticorpos "imunoespecíficos" refere-se à interação de ligação específica de antígeno que ocorre entre o sítio de combinação de antígeno de um anticorpo e o antígeno específico reconhecido por aquele anticorpo (isto é, o anticorpo reage com a proteína em um ELISA ou outro imuno- ensaio, e não reage detectavelmente com proteínas não relacionadas).
[0042]Um epítopo que "se liga especificamente", ou "se liga preferencial-mente" (usado intercambiavelmente aqui) a um anticorpo ou um polipeptídeo é um termo bem entendido na tecnologia, e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial são também ‘bem conhecido na tecnologia. Diz-se que uma molécula apresenta "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reagir ou associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância particular do que acontece com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" ou "se liga preferencial- mente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais facilmente, e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Entende-se também lendo-se esta definição, por exemplo, que um anticorpo (ou fração ou epítopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Dessa maneira, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não exige necessariamente (embora ela possa incluir) ligação exclusiva. No geral, mas não necessariamente, referência a ligação significa ligação preferencial.
[0043]Os termos "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente aqui para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compre-ender aminoácidos modificados, e ele pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado natu-ralmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação de dissulfeto, glicosi- lação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modifi-cação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também incluído na definição, por exemplo, estão polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como ou-tras modificações conhecidas na tecnologia. Percebe-se que, em virtude de os poli-peptídeos desta invenção serem baseados em um anticorpo, os polipeptídeos po- dem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.
[0044]"Polinucleotídeo," ou "ácido nucléico," da maneira usada intercambia- velmente aqui, refere-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxiribonucleotídeos, ribonucleotí- deos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que pode ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase. Um poli- nucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tal como nucleotídeos me- tilados e seus análogos. Se presente, modificação na estrutura de nucleotídeo pode ser conferida antes ou após agrupamento do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "ca- peamentos", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações de internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoa- midatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas contendo frações pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, bóron, metais oxidan- tes, etc.), aquelas contendo alquiladores, aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucléicos anoméricos alfa, etc.), bem como formas não modificadas do(s) Polinucleotídeo(s). Adicionalmente, quaisquer dos grupos hidroxila ordinaria-mente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos de fosfonato, grupos de fosfato, protegidos por grupos protetores padrões, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conju-gados suportes sólidos. O OH do terminal 5’ e 3’ pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou frações grupos de capeamento orgânicos de 1 a 20 átomos de car-bono. Outras hidroxilas podem também ser derivatizados de grupos protetores pa-drões. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares ribose ou deoxiribose que são no geral conhecidos na tecnologia, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alila, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como açúcares arabinoses, xilo- ses ou lixoses, piranoses, açúcares furanose, sedoeptuloses, análogos acíclicos e análogos nucleosídeo abásico tal como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas sem limitações, modalidades em que fosfato é substituído por P(0)S("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OU', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila substituído ou não substituído (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
[0045]Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia leve do anticorpo ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha quanto em combinação. As regiões variáveis da cadeia pesada e leve con-sistem cada uma em quatro regiões da estrutura (FR) conectadas por três regiões determinantes de complementariedade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos na proximidade ime-diata pelo FRs e, com os CDRs das outras cadeias, contribui para a formação do sítio de ligação de antígeno de anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade da sequência de espécie cruzada (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); e (2) uma aborda- gem com base nos estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo (Chothia et al. (1989) Nature 342:877; Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927- 948)). Da maneira aqui usada, um CDR pode referir-se a CDRs definidos tanto por abordagem quanto por uma combinação de ambas abordagens.
[0046]Uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia leve do anticorpo ou a região constante da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha quanto em combinação.
[0047]Da maneira aqui usada, um "anticorpo antagonista anti-CGRP" (inter-cambiavelmente denominado "anticorpo anti- CGRP") refere-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a CGRP e inibir atividade biológica de CGRP e/ou caminho(s) à jusante. Um anticorpo antagonista anti-CGRP engloba anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (incluindo significativamente) a atividade bioló-gica de CGRP. Com o propósito da presente invenção, deve-se entender explicita-mente que o termo "anticorpo antagonista anti-CGRP" engloba todos os termos, títu-los, e estados e características funcionais previamente identificados por meio dos quais o próprio CGRP, uma atividade biológica de CGRP, ou as consequências da atividade biológica, são substancialmente anuladas, diminuídas, ou neutralizas em qualquer grau significativo. Exemplos de anticorpos do antagonista anti-CGRP são fornecidos aqui.
[0048]Da maneira aqui usada "substancialmente puro" refere-se a material que é pelo menos 50 % puro (isto é, sem contaminantes), mais preferivelmente pelo menos 90 % puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, mais preferivelmente pelo menos 99 % puro.
[0049]Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura celular que pode ser ou que foi um recipiente para vetor(s) para incorporação de insertos de polinucleotídeo. Células hospedeiras incluem progénie de uma célula hospedeira única, e a progénie pode necessariamente não ser completamente idêntica (em mor- fologia ou em complemento de DNA genômico) à célula mãe original devido a muta-ção natural, acidental, ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfec- tadas ín vivo com um polinucleotídeo(s) desta invenção.
[0050]Da maneira aqui usada, "tratamento" é uma abordagem para obter-se resultados clínicos benéficos ou desejados. Com os propósitos desta invenção, re-sultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas sem limitações, um ou mais dos seguintes: melhora ou alívio de qualquer aspecto de dor inflamatória e/ou sinto-ma de dor inflamatória, com os propósitos desta invenção, resultados clínicos bené-ficos ou desejados incluem, mas sem limitações, um ou mais do seguinte: incluindo diminuir a gravidade, alívio de dor e/ou um sintoma associado com dor inflamatória.
[0051]Uma “quantidade efetiva" de medicamento, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para causar resultados benéficos ou dese-jados, incluindo resultados clínicos tal como alívio ou redução na sensação de dor. Uma quantidade efetiva pode ser administrada em uma ou mais administrações, com os propósitos desta invenção, uma quantidade efetiva de medicamento, composto, ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para tratar, melhorar, reduzir a intensidade e/ou prevenir dor inflamatória ou sintoma associado com dor inflamatória. Da maneira entendida no contexto clínico, uma quantidade efetiva de um medicamento, composto, ou composição farmacêutica pode ou não ser obtida em conjunto com um outro medicamento, composto, ou composição farmacêutica. Assim, uma “quantidade efetiva" pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado para ser dado em uma quantidade efetiva se, junto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for obtido.
[0052]Em uma modalidade, "preparado para" significa aqui o medicamento é na forma de uma dosagem unitária ou similares adequadamente embalado e/ou marcado para uso em administração periférica.
[0053]"Reduzir a incidência" de dor inflamatória e/ou um sintoma associado com dor inflamatória significa qualquer de reduzir gravidade (que pode incluir reduzir a necessidade e/ou quantidade de (por exemplo, exposição) outros medicamentos e/ou terapias no geral usados para essas condições), duração, e/ou frequência.
[0054]"Melhora" de dor inflamatória e/ou um sintoma associado com dor in-flamatória significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas de dor in-flamatória e/ou sintomas associados com dor inflamatória comparado a não adminis-tração de um anticorpo antagonista anti-CGRP. "Melhora" também inclui diminuição ou redução na duração de um sintoma.
[0055]"Paliar" dor inflamatória e/ou um sintoma associado com dor inflamató-ria significa diminuir a extensão de uma ou mais manifestações clínicas indesejáveis de dor inflamatória em um indivíduo ou população de indivíduos tratados com um anticorpo antagonista anti-CGRP de acordo com a invenção.
[0056]Da maneira usada nele, "atrasar" o desenvolvimento de dor inflamató-ria significa adiar, impedir, diminuir, retardar, estabilizar e/ou atrasar o progresso de dor inflamatória e/ou um sintoma associado com dor inflamatória. Este atraso pode ser de período de tempo variado, dependendo da história da doença e/ou indivíduos sendo tratados. Como é evidente aos versados na tecnologia, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, englobar prevenção, em que o indivíduo não de-senvolve dor inflamatória. Um método que "atrasa" o desenvolvimento do sintoma é um método que reduz a probabilidade de desenvolver o sintoma em um dado quadro de tempo e/ou reduz a extensão dos sintomas em um dado quadro de tempo, quando comparado a não usar o método. Tais comparações são tipicamente com base nos estudos clínicos, usando um número estatisticamente significativo de sujeitos.
[0057]Uma "amostra biológica" engloba uma variedade de tipos de amostra obtida de um indivíduo e pode ser usada em um diagnóstico ou ensaio de monitora-mento. A definição engloba sangue e outras amostras líquidas de origem biológica, amostras de tecido sólido tal como uma espécie de biópsia ou culturas de tecido ou células derivadas deles, e a progénie destes. A definição também inclui amostras que foram manipuladas em qualquer modo após seu aprivisionamento, tal como por tratamento com reagentes, solubilização, ou enriquecimento para certos componen-tes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou pela incorporação em uma matriz semi-sólida ou sólida com propósito de seccionamento. O termo "amostra biológica" engloba uma amostra clínica, e também inclui amostras de células em cultura, célula sobrenadantes, lisatos de célula, soro, plasma, fluido biológico e tecido.
[0058]Um "indivíduo” ou “sujeito" é um vertebrado, preferivelmente um ma-mífero, mais preferivelmente um humano. Mamíferos incluem, mas sem limitações, animais de fazenda (tal como vacas), animais esportivos, de estimação (tal como gatos, cães e cavalos), primatas, camundongos e ratos.
[0059]Da maneira aqui usada, "vetor" significa um construto, que é capaz de distribuir, e preferivelmente expressar, um ou mais gene(s) ou sequência(s) de inte-resse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas sem limitações, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nu, vetores de plasm ideo, cosmídeo ou fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados com agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomos, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[0060]Da maneira aqui usada, "sequência de controle de expressão" signifi-ca uma sequência de ácido nucléico que dirige transcrição de um ácido nucléico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um pro-motor constitutivo ou um indutível, ou um melhorador. A sequência de controle de expressão é operacionalmente ligada à sequência de ácido nucléico para ser trans-crita.
[0061]Da maneira aqui usada, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente retenha atividade biológica e seja não reativo com o sistema imune do sujeito. Exemplos incluem, mas sem limitações, quaisquer dos carreadores farma-cêuticos padrões tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emul-sões tal como emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferidos para administração aerossol ou parenteral são salina tamponada com fos-fato ou salina normal (0,9 %). Composições compreendendo tais carreadores são formuladas por convencionais bem conhecidas métodos (ver, por exemplo, Reming-ton's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, 0 Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).
[0062]O termo "administrado perifericamente" da maneira aqui usada refere- se à via pela qual uma substância, medicamento e/ou anticorpo antagonista anti- CGRP deve ser distribuído, em particular significa não centralmente, não espinhal-mente, não intratecalmente, não distribuído diretamente no CNS. O termo refere-se às vias de administração sem ser aquelas imediatamente supracitadas e inclui por meio de uma via que é oral, sublingual, bucal, tópica, retal, por meio de inalação, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardiaca, intraóssea, intradérmica, intraperitoneal, transmucosal, vaginal, intravitrea, intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
[0063]O termo "age perifericamente" da maneira aqui usada refere-se ao sítio de ação de uma substância, composto, medicamento e/ou anticorpo antagonista anti-CGRP o dito sítio estando no sistema nervoso periférico, oposto ao sistema nervoso central, o dito composto, medicamento e/ou anticorpo antagonista anti-CGRP sendo limitado por incapacidade de cruzar a barreira até o CNS e cérebro quando administrado perifericamente. O termo "penetrar centralmente" refere-se à capacida-de de uma substância cruzar a barreira até o cérebro ou CNS.
[0064]O termo "Koff", da maneira aqui usada, deve referir-se à constante de dissociação para dissociação de um anticorpo a partir do complexo anticor- po/antígeno.
[0065]O termo "Kd", da maneira aqui usada, deve referir-se à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno.
[0066]A presente invenção é direcionada a um medicamento para a preven-ção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória e métodos para prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em um indivíduo.
[0067]Em um primeiro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um anti-corpo antagonista anti-CGRP para a fabricação de um medicamento para a preven-ção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória, em que o medicamento é preparado para administração periférica ou em que o medicamento é administrado perifericamente.
[0068]Em um segundo aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo an-tagonista anti-CGRP para uso na prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em que o anticorpo é preparado para administração periférica ou em que o anticorpo é administrado perifericamente.
[0069]Em terceiro aspecto, a invenção diz respeito ao uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP para a fabricação de um medicamento para melhorar, con-trolar, reduzir a incidência ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de dor infla-matória e/ou sintomas de dor inflamatória, em que o medicamento é preparado para administração periférica ou em que o medicamento é administrado perifericamente. Na alternativa deste aspecto, a invenção diz respeito a um anticorpo antagonista anti-CGRP para uso em melhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atrasar o de-senvolvimento ou progressão de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória, em que o anticorpo é preparado para administração periférica ou em que o anticorpo é administrado perifericamente.
[0070]Em um quarto aspecto, a invenção diz respeito a um método de pre-venir e/ou tratar dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em um indivíduo, compreendendo administração periférica ao indivíduo de uma quantidade efetiva de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
[0071]Em um quinto aspecto, a invenção diz respeito a um método de me-lhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em um indivíduo, compreendendo administração periférica ao indivíduo de uma quantidade efetiva de um anticorpo antagonista anti-CGRP.
[0072]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o in-divíduo é preferivelmente um mamífero, por exemplo, um animal de companhia tais como um cavalo, gato ou cão ou um animal de fazenda tais como uma ovelha, vaca ou porco. Mais preferivelmente o mamífero é um humano.
[0073]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o medicamento e/ou anticorpo antagonista anti-CGRP é preparado para administração oral, sublingual, bucal, tópica, retal, inalação, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracardíaca, intraóssea, intradérmica, intraperitoneal, transmucosal, vaginal, intravítrea, intra-articular, peri-articular, local ou epicutânea.
[0074]De acordo com uma modalidade preferida adicional, o medicamento é preparado para administração periférica antes e/ou durante e/ou após o desenvolvi-mento de dor inflamatória.
[0075]Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP age periferi-camente na administração. Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP não é administrado centralmente, espinhalmente ou intratecalmente.
[0076]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a dor inflamatória é dor artrítica, que pode ser dor de artrite reumatóide ou dor de osteoar-trite. Preferivelmente, a dor inflamatória é dor de osteoartrite.
[0077]Os usos e métodos da invenção podem ser para melhorar a função fí-sica em um indivíduo que tem osteoartrite e/ou aumentar a rigidez em um indivíduo que tem osteoartrite.
[0078]Diagnóstico ou avaliação de dor de artrite reumatóide é bem estabele-cido na tecnologia. A avaliação pode ser realizada com base nas medições conheci-das na tecnologia, tal como caracterização do paciente de dor usando várias escalas de dor. Ver, por exemplo, Katz et al, Surg CHn North Am. (1999) 79 (2):231 -52; Ca- raceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239- 55. Existem também escalas comumente usadas para medir o estado da doença tais como o American College of Rheumatology (ACR) (Felson, et al., Artrhitis and Rheumatism (1993) 36(6):729- 740), the Health Assessment Questionnaire (HAQ) (Fries, et al., (1982) J. Rheumatol. 9: 789-793), the Paulus Scale (Paulus, et al., Arthritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), e the Arthritis Impact Measure Scale (AIMS) (Meenam, et al., Arthritis and Rheumatology (1982) 25: 1048-1053).
[0079]Em uma modalidade, melhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atra-sar o desenvolvimento ou progressão de dor de artrite reumatóide e/ou sintomas de dor de artrite reumatóide é medido por um ou mais de ACR, HAQ e AIMS.
[0080]Diagnóstico ou avaliação de dor de osteoartrite é também bem estabe-lecido na tecnologia. A avaliação pode ser realizada com base nas medições conhe-cidas na tecnologia, tal como caracterização de paciente de dor usando várias esca-las de dor. Ver, por exemplo, Katz et al, Surg CHn North Am. (1999) 79 (2):231 -52; Caraceni et al. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3):239- 55. por exemplo, WOMAC escala de dor de locomoção (incluindo dor, rigidez, e função física) e 100 mm de Escala analógica visual (VAS) podem ser empregados para avaliar dor e avaliar resposta ao tratamento.
[0081]Em uma modalidade, melhorar, controlar, reduzira incidência, ou atra-sar o desenvolvimento ou progressão de dor de osteoartrite e/ou sintomas de dor de osteoartrite é medido por um ou mais de WOMAC escala de dor de locomoção e VAS.
[0082]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o an-ticorpo antagonista anti-CGRP se liga a CGRP, mais preferivelmente se liga a CGRP e inibe a capacidade de CGRP de se ligar ao receptor de CGRP. Preferivelmente o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga tanto a humano quanto a roedores CGRP, preferivelmente humano e rato CGRP. Mais preferivelmente o anticorpo se liga a CGRP humano, ainda mais preferivelmente o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga a a-CGRP humano ou a a-CGRP humano e/ou β-CGRP. Mais preferivelmente o anticorpo antagonista anti-CGRP é um anticorpo que apresenta qualquer um ou mais das seguintes características funcionais: (a) se liga a CGRP; (b) bloqueia CGRP a partir de ligação com seu(s) receptor(s); (c) bloqueia ou diminui ativação do receptor de CGRP, incluindo ativação de cAMP; (d) inibe, bloqueia, suprime ou reduz atividade biológica de CGRP, incluindo caminhos à jusante mediados por sinali-zação de CGRP, tais como ligação do receptor e/ou elicitação de um resposta celular ao CGRP; (e) previne, melhora, ou trata qualquer aspecto de dor inflamatória; (f) aumenta depuração de CGRP; e (g) inibe (reduz) produção ou liberação de síntese de CGRP. Anticorpos da invenção, incluindo G1 e G2, são conhecidos para ligar CGRP e remover sua disponibilidade biológica por exemplo, no soro prevenindo assim que CGRP acesse o seu receptor e respostas celulares à jusante e efeitos biológicos de CGRP tal como erupção e vasodilatação.
[0083]Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o anticorpo an-tagonista anti-CGRP se liga a um fragmento de CGRP, mais preferivelmente a um fragmento de CGRP bem como ao CGRP de comprimento total. Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga na região C- terminal ou fragmento de CRGP. A região C-terminal ou fragmento de CRGP preferivelmente compreende aminoácidos 19-37 ou 25-37 ou 29-37 ou alternativamente 30-37, ainda mais alter-nativamente 31-37 de CGRP. Em uma modalidade adicional, a região C-terminal ou a de CRGP preferivelmente compreende aminoácidos 32-37 mais preferivelmente 33 a 37 de CGRP. Preferivelmente o CGRP tanto é a-CGRP quanto β-CGRP, ainda mais preferivelmente humano ou roedores, ainda mais preferivelmente humano ou rato, mais preferivelmente humano, ainda mais preferivelmente a-CGRP humano ou β-CGRP, mais preferivelmente a-CGRP humano.
[0084]Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o anticorpo an-tagonista anti-CGRP se liga especificamente na sequência de aminoácidos GSKAF. Preferivelmente a sequência GSKAF de CGRP é o epítopo no qual o anticorpo anta-gonista anti-CGRP se liga, preferivelmente na posição 33 a 37, mais preferivelmente a sequência é GXXXF onde X pode ser qualquer aminoácido, preferivelmente nas posições 33 a 37 de CGRP, os terminais definidos por aminoácidos G33 e F37 de CGRP.
[0085]Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo antagonista anti-CGRP que se liga especificamente a um epítopo definido por ami-noácidos G33 a F37 de CGRP. O anticorpo antagonista anti-CGRP pode especifi-camente se ligar ao epítopo definido pela sequência de aminoácidos GSKAF. Em uma modalidade, a presente invenção diz respeito ao uso de um anticorpo como esse nos usos e métodos definidos nos vários aspectos da presente invenção.
[0086]Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP inibe ou pre-vine ativação do receptor de CGRP. Preferivelmente o anticorpo anti-CGRP tem um IC50 de entre 0,0001 (0,1 nM) a 500 pM. Em algumas modalidades preferidas, o IC50 é entre 0,0001 pM e, ou é a cerca de, qualquer de 250 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, ou 0,5 nM medido em um ensaio de ligação in vitro. Em algumas modalidades preferidas adicionais, IC50 é menos que qualquer de 500 pM, ou 100 pM, ou 50 pM, medido em um ensaio de ligação in vitro. Em uma modalidade ainda mais preferida IC50 é 1,2 nM OU 31 nM.
[0087]Em uma modalidade preferida adicional, o anticorpo antagonista anti- CGRP usado é capaz de competir com um anticorpo descrito aqui anteriormente para a ligação de CGRP ou para um fragmento de CGRP, ou para um fragmento de CGRP bem como o CGRP de comprimento total, preferivelmente para a região C- terminal ou fragmento de CRGP, preferivelmente a região C-terminal ou fragmento de CRGP compreende aminoácidos 19 - 37 ou 25-37 ou 29-37 ou alternativamente 30-37, ainda mais alternativamente 31-37 de CGRP. Em uma modalidade adicional, a região C- terminal ou fragmento de CRGP preferivelmente compreende aminoácidos 32-37, mais preferivelmente 33 a 37 de CGRP.
[0088]Em uma modalidade preferida adicional, o anticorpo antagonista anti- CGRP ou sua porção de ligação de antígeno da maneira usada na invenção é capaz de competir com um anticorpo antagonista anti-CGRP descrito aqui anteriormente, em particular G1 ou G2 da maneira aqui descrita, para: (a)a ligação de CGRP ou um fragmento de CGRP, ou um fragmento de CGRP bem como o CGRP de comprimento total, preferivelmente a região C-terminal ou fragmento de CRGP, preferivelmente a região C-terminal ou fragmento de CRGP compreendendo aminoácidos 19 - 37 ou 25-37 ou 29- 37 ou alternativamente 30-37, ainda mais alternativamente 31 -37, preferivelmente aminoácidos 32-37, mais prefe-rivelmente 33 a 37 de CGRP, preferivelmente o CGRP é alfa ou beta, preferivelmente beta, mais preferivelmente roedores ou humano, mais preferivelmente humano, (b)a ligação do GSKAF da sequência de epítopo, preferivelmente na posição do aminoácido 33 a 37 de CGRP da maneira definida em (a), mais preferivelmente na sequência GXXXF, onde X é qualquer aminoácido, preferivelmente GXXXF na posição do aminoácido 33 a 37 de CGRP da maneira definida em (a), (c)a ligação da maneira descrita em (a) ou (b) substancialmente com o mesmo Kd e/ou substancialmente o mesmo Koff, e/ou (d)ligação do CGRP Θ inibição/antagonização da atividade biológica de CGRP e/ou caminho(s) à jusante, preferivelmente o CGRP é alfa ou beta, preferi-velmente beta, mais preferivelmente roedores ou humano, mais preferivelmente hu-mano..
[0089]O anticorpo antagonista anti-CGRP se liga preferivelmente a CGRP, região de CGRP ou fragmento de CGRP com uma afinidade de ligação (Kd) entre 0,000001 pM (0,001 nM) ou 0,00001 pM (0,01 nM) a 500 pM. Em algumas modali-dades preferidas, a afinidade de ligação (Kd) é entre 0,000001 pM ou 0,00001 pM e, ou é cerca de, qualquer de 250 pM, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 1 pM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 0,5 nM, 1 nM, 0,05 nM, ou 0,01 nM, 0,005 nM, 0,001 nM, medido em um ensaio de ligação in vitro. Em algumas mo-dalidades preferidas adicionais, afinidade de ligação (Kd) é menos que qualquer de 500 pM, ou 100 pM, 50 pM, ou 10 pM, 5 pM, 1 pM, medido em um ensaio de ligação in vitro. Em uma modalidade ainda mais preferida afinidade de ligação (Kd) é 0,04 nM ou 16 nM.
[0090]O anticorpo antagonista anti-CGRP da maneira usada na presente in-venção pode ser selecionado do grupo de: anticorpos monoclonais, anticorpos poli- clonais, fragmento de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos bi-específicos, anticorpos heteroconjugados, anti-corpos de cadeia única (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo do domínio), anticorpo huma-nizado, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da exigida, incluindo vari-antes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anti-corpos, e anticorpos covalentemente modificados. O anticorpo antagonista anti- CGRP pode ser murino, rato, humano, ou qualquer outra origem (incluindo anticor-pos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser humanizado, mas é mais preferivelmente humano. Preferivel-mente o anticorpo antagonista anti-CGRP é isolado, ele é ainda mais preferivelmente substancialmente puro. Onde o anticorpo antagonista anti-CGRP é um fragmento de anticorpo o fragmento preferivelmente retém as características funcionais do anti-corpo original isto é, a ligação de CGRP e/ou atividade do antagonista da maneira descrita nas características funcionais anteriores.
[0091]Exemplos de anticorpos do antagonista anti-CGRP são conhecidos na tecnologia. Consequentemente, de acordo com uma modalidade preferida da pre-sente invenção, o anticorpo antagonista anti-CGRP da maneira usada na presente invenção é preferivelmente um anticorpo anti-CGRP da maneira geralmente ou es-pecificamente revelada em qualquer de (i) W02007/054809, (ii) W02007/076336, (iii) Tan et al., Clin. Sei. (Lond). 89:565-73, 1995, (iv) Sigma (Missouri, US), product number C71 13 (clone #4901), (v) Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993 ou que compreende ou consiste em: (a) um fragmento do dito anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv etc.), (b) uma cadeia leve do dito anticorpo, (c) uma cadeia pesada do dito anti-corpo, (d) uma ou mais região(s) variável(s) de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do dito anticorpo, (e) um ou mais CDR(s) (um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs) do dito anticorpo, (f) CDR H3 da cadeia pesada do dito anticorpo, (g) CDR L3 da cadeia leve do dito anticorpo, (h) três CDRs da cadeia leve do dito anticorpo, (i) três CDRs da cadeia pe-sada do dito anticorpo, (j) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada, do dito anticor- po, (k) qualquer um ou mais de (a) até (j).
[0092]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o an-ticorpo antagonista anti-CGRP é anticorpo G2 ou anticorpo G1. De acordo com uma modalidade mais preferida da presente o anticorpo antagonista anti-CGRP usado é o anticorpo anti-CGRP G1 da maneira especificamente revelada no pedido de patente W02007/054809, ou compreendendo suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809, também incluindo anticorpos funcionalmente equivalentes a G1, isto é, compreendendo substituições conservadoras de resíduos de aminoácidos ou um ou mais deleções ou adições de aminoácidos que não afetam significativamente suas características funcionais, por exemplo, ligação de CRGP ou atividade do an-tagonista e variantes que melhoram ou diminuem a atividade e/ou ligação. Da ma-neira aqui usada, os termos "G1” e "anticorpo G1” são usados intercambiavelmente para referir-se a um anticorpo produzido por vetores de expressão tendo números de depósito de ATCC PTA-6867 e ATCC PTA- 6866 da maneira revelada no pedido W02007/054809.
[0093]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o an-ticorpo antagonista anti-CGRP compreende ou consiste em um polipeptídeo selecio-nado de: (a) anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (b) um fragmento ou uma região de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (c) uma cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (d) uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809 (e) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (f) um ou mais CDR(s) (um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs) de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (g) CDR H3 da cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (h) CDR L3 da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (i) três CDRs da cadeia leve de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; G) três CDRs da cadeia pesada de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; (k) três CDRs da cadeia leve e/ou três CDRs da cadeia pesada, de anticorpo G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809; e (i) um anticorpo compreen-dendo qualquer um de (b) até (k). A invenção também diz respeito a polipeptídeos compreendendo qualquer um ou mais dos anteriores. Em algumas modalidades, pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, ou seis CDR(s) são pelo menos cerca de 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idênticos a pelo menos um, dois, três, quatro, cinco ou seis CDRs de G1 ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809.
[0094]Determinação de regiões CDR está de acordo com o conhecimento dos versados. Percebe-se que em algumas modalidades, CDRs pode ser uma com-binação do CDR Kabat e Chothia. Em algumas modalidades, os CDRs são os CDRs Kabat. Em outras modalidades, os CDRs são os CDRs Chothia.
[0095]O anticorpo antagonista anti-CGRP preferivelmente compreende ou consiste em um fragmento ou uma região de o anticorpo G1 (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, ScFv etc.) ou suas variantes mostradas na Tabela 6 de W02007/054809. Preferivelmente, o dito fragmento ou região tem as características funcionais de um anticorpo antagonista anti-CGRP, por exemplo, ligação de CGRP atividade e/ou atividade do antagonista e compreende ou consiste em um ou mais de um fragmento de cadeia leve, cadeia pesada, contendo uma ou mais regiões va-riáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada, ou um ou mais CDRs de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo G1.
[0096]De acordo com uma modalidade preferida adicional da invenção o an-ticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma região variável de cadeia leve, LCVR, compreendendo um peptídeo com uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 28-32 e/ou uma região variável de cadeia pesada, HCVR, compreendendo um peptídeo com uma sequência selecionada do grupo que consis-te em SEQ ID NOs: 34-38 do pedido de patente WQ2007/076336.
[0097]Ainda mais preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP com-preende um polipeptídeo LCVR de uma SEQ ID NO da maneira mostrada na Tabela 1 do pedido de patente WQ2007/076336 e compreende adicionalmente um polipep-tídeo HCVR de uma SEQ ID NO da maneira mostrada na Tabela 1 do pedido de pa-tente WQ2007/076336.
[0098]De acordo com uma modalidade adicional da invenção o anticorpo an-tagonista anti-CGRP usado compreende uma CDR de cadeia leve (CDRL) selecio-nada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8-13 e / ou uma CDR de cadeia pesada (CDRH) selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14-22 do pedido de patente WQ2007/076336.
[0099]Métodos de produzir e isolar os anticorpos do antagonista anti-CGRP do pedido WQ2007/076336 e dados demonstrando a ligação de CGRP e caracteri-zação do antagonista do mesmo são descritos no pedido WQ2007/076336.
[00100]Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP para uso na pre-sente invenção compreende um domínio VH que é pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 % pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % idênticos na sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 19 aqui apresentada.
[00101]Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende um domínio VL que é pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 % pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % idênticos em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 20 aqui apresentada.
[00102]Q anticorpo antagonista anti-CGRP preferivelmente compreende um domínio VH e um domínio VL que são pelo menos 85 %, pelo menos 86 %, pelo menos 87 %, pelo menos 88 %, pelo menos 89 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 % pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % idên-ticos em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1 e 2 respectivamente ou SEQ ID NO: 19 e 20 aqui apresentadas, respectivamente.
[00103]Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende um domínio VH que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1 e um domínio VL que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de amino-ácidos à SEQ ID NO: 2 aqui apresentada.
[00104]Alternativamente, o anticorpo antagonista anti-CGRP preferivelmente compreende um domínio VH que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de ami-noácidos à SEQ ID NO: 19 e um domínio VL que é pelo menos 90 % idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 20 aqui apresentada.
[00105]Q anticorpo antagonista anti-CGRP preferivelmente compreende pelo menos um CDR selecionado do grupo que consiste em: (a). CDR H1 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 3 ou 21; (b). CDR H2 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 4 ou 22; (c). CDR H3 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 5 ou 23; (d). CDR L1 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 6 ou 24; (e) CDR L2 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 7 ou 25; (f). CDR L3 da maneira apresentada em SEQ ID NO: 8 ou 26; e (g). variantes de CDR L1, CDR L2 e CDR H2 da maneira mostrada na Tabela 6 de WQ2007/054809.
[00106]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, a região constante de cadeia pesada do anticorpo antagonista anti-CGRP pode ser de quaisquer tipos de região constante, tais como IgG, IgM, IgD, IgA, e IgE; e quaisquer isotipos, tais como IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4.
[00107]Ainda mais preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com No. de acesso ATCC PTA-6867. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo antagonista anti- CGRP compreende uma cadeia leve produzida pelo vetor de expressão com No. de acesso ATCC PTA-6866. Ainda mais preferivelmente o anticorpo antagonista anti- CGRP é produzido pelos vetores de expressão com Nos. de acesso ATCC PTA- 6867 e PTA-6866.
[00108]Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP para uso na pre-sente invenção é anticorpo G1 ou anticorpo G2 aqui definidos.
[00109]De acordo com uma modalidade adicional da invenção, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma região constante modificada, por exemplo, descrita em W02007/054809. Preferivelmente, a região constante modificada é imu-nologicamente inerte, incluindo imunologicamente parcialmente inerte, de maneira que ela não desencadeie lise mediada por complemento, não estimule citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), não ative microglia. Preferi-velmente, a região constante modificada é reduzida em uma ou mais dessas ativida-des. Mais preferivelmente, a região constante é modificada da maneira descrita em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; pedido de PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou pedido de patente UK No. 9809951.8. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o anticorpo antagonista anti-CGRP compreende uma região constante lgG2 de cadeia pesada humana compreendendo as seguintes mutações: A330, P331 para S330, S331 (numeração de aminoácido com referência à sequência lgG2 tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624.
[00110]Métodos de produzir e isolar os anticorpos do antagonista anti-CGRP do pedido W02007/054809 e dados demonstrando a ligação de CGRP e caracterização do antagonista do mesmo são descritos no pedido WQ2007/054809. Sequências de SEQ ID No. 1 a 14 do dito pedido são fornecidas aqui como SEQ ID No. 1 a 14, respectivamente.
[00111]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção o medicamento é preparado para administração periférica entre uma vez a 7 vezes por semana, ainda mais preferivelmente entre uma vez a quatro vezes por mês, ainda mais preferivelmente entre uma vez a seis vezes por período de 6 meses, ainda mais preferivelmente, uma vez a doze vezes por ano. Preferivelmente, o medicamento é preparado para ser administrado perifericamente em um período selecionado de: uma vez diariamente, uma vez a cada dois, três, quatro, cinco ou seis dias, semanalmente, uma vez a cada dois semanas, uma vez a cada três semanas, mensalmente, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada sete meses, uma vez a cada oito meses, uma vez a cada nove meses, uma vez a cada dez meses, uma vez a cada onze meses ou anualmente. De acordo com modalidades preferidas, o medicamento é preparado para ser administrado perifericamente por meio de uma via selecionada de um ou mais de; oralmente, sublingualmente, bucalmente, topicamente, retalmente, por meio de inalação, transdermi- camente, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente ou intramuscularmente, por meio de administração intracardíaca, intra-osseamente, intradermica- mente, intraperitonealmente, transmucosalmente, vaginalmente, intravitreamente, epicutanemente, intra-articularmente, peri-articularlmente ou localmente.
[00112]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o medicamento é preparado para administração periférica com uma concentração de anticorpo entre 0,1 a 200 mg/mL; preferivelmente a cerca de, ou entre 0,1 e cerca de, qualquer um de 0,5, 1,5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mg/mL +/-10 % de erro, mais preferivelmente a 50 mg/mL.
[00113]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o medicamento é preparado para administração periférica com uma concentração de anticorpo entre 0,1 a 200 mg/kg de peso corpóreo; preferivelmente a cerca de, ou entre 0,1 e cerca de, qualquer um de 0,5, 1, 5, 10,15 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mg/kg de peso corpóreo +/-10 % de erro, mais preferivelmente a 10 mg/kg.
[00114]De acordo com uma modalidade preferida da presente invenção, o anticorpo antagonista anti-CGRP tem um meia vida in vivo de mais que qualquer um de 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 1 12, 1 14, 1 16, 1 18, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152,154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208 ou 210 dias +/- 1 dia, ainda mais preferivelmente mais que qualquer um de 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses.
[00115]Preferivelmente, o anticorpo antagonista anti-CGRP tem uma meia vida in vivo de mais que 6 dias.
[00116]De acordo com uma modalidade preferida adicional da presente in-venção, o medicamento e/ou o anticorpo antagonista anti-CGRP não produz efeitos de sistema nervoso central e/ou prejuízo cognitivo. Preferivelmente, o medicamento e/ou o anticorpo antagonista anti-CGRP não induzem qualquer uma ou mais do se-guinte: amnésia, confusão, despersonalização, hipestesia, pensamento anormal, trismo, vertigem, acatisia, apatia, ataxia, parestesia circumoral, estímulo de CNS, labilidade emocional, euforia, alucinações, hostilidade, hiperestesia, hipercinesia, hipotonia, falta de coordenação, aumento da libido, reação maníaca, mioclono, neu- ralgia, neuropatia, psicose, ataque de eplepsia, fala anormal, estupor, ideal suicida; tontura, sonolência, insônia, ansiedade, tremor, depressão ou parestesia. Mais pre-ferivelmente o medicamento e/ou o anticorpo antagonista anti-CGRP não induz pre-juízo de coordenação motora ou atenção.
[00117]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o medicamento e/ou o anticorpo antagonista anti-CGRP não produz prejuízo respirató-rio, renal ou gastrintestinal.
[00118]De acordo com uma modalidade adicional da presente invenção, o medicamento e/ou o anticorpo antagonista anti-CGRP não produz efeitos de depen-dência física e/ou psicológica. Preferivelmente, o medicamento e/ou o anticorpo an-tagonista anti-CGRP não demonstram afinidade com opiato, benzodiazepina, fenci- clidina (PCP), ou receptores de ácido N-metil-D-aspártico (NMDA), ou estimulante de CNS, ou produz qualquer efeito sedativo ou eufórico.
[00119]Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP, na admi-nistração, melhora, controla, reduz incidência, ou atrasa o desenvolvimento ou pro-gressão de sensação de dor central.
[00120]Em uma outra modalidade, o efeito do anticorpo antagonista anti- CGRP é igual e/ou superior aos efeitos de NSAIDS e/ou opiatos nos mesmos mode-los de dor inflamatória. Em uma modalidade, o anticorpo antagonista anti-CGRP é efetivo em tratar populações dor refratória.
[00121]De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido o uso ou método de acordo com qualquer outro aspecto da invenção em que o anticorpo antagonista anti-CGRP é administrado separadamente, sequencialmente ou simultaneamente em combinação com um ou mais compostos ou agentes ainda mais farmacologicamente ativos, preferivelmente compostos ou agentes usados para tratar dor inflamatória. Preferivelmente o(s) agente(s) adiconal(s) é/são selecionado^) de um ou mais de: (i) um analgésico de opióide, por exemplo, morfina, heroína, hidromorfona, oximorfona, levorfanol, levalorfano, metadona, meperidina, fentanila, cocaína, codeí-na, di-idrocodeína, oxicodona, hidrocodona, propoxifeno, nalmefeno, nalorfina, nalo- xona, naltrexona, buprenorfina, butorfanol, nalbufina ou pentazocina; (ii) um medicamento anti-inflamatório não esteroidal (NSAID), por exemplo, aspirina, diclofenac, diflusinal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno, flufenisal, flurbipro- feno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolac, ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, nabumetona, naproxeno, oxaprozina, fenilbutazona, piroxicam, sulin- dac, tolmetina ou zomepirac, inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2), celecoxib; ro- fecoxib; meloxicam; JTE-522; L- 745,337; NS398;, ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; (iii) um sedativo de barbitúrico, por exemplo, amobarbital, aprobarbital, buta-barbital, butabital, mefobarbital, metarbital, metoexital, pentobarbital, fenobartital, secobarbital, talbutal, teamilal ou tiopental ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; (iv) um benzodiazepínico tendo uma ação sedativa, por exemplo, clordiaze- póxido, clorazepate, diazepam, flurazepam, lorazepam, oxazepam, temazepam ou triazolam ou urn sal farmaceuticamente aceitável desses; (v) um antagonista de Hi tendo uma ação sedativa, por exemplo, difenidra- mina, pirilamina, prometazina, clorfeniramina ou clorciclizina ou um sal farmaceuti-camente aceitável desses; (vi) um sedativo tal como glutetimida, meprobamato, metaqualona ou diclo- ralfenazona ou um sal farmaceuticamente aceitável desses; (vii) um relaxante de músculo esquelético, por exemplo, baclofeno, casopro- dol, clorzoxazona, ciclobenzaprina, metocarbamol ou orfrenadina ou um sal farma-ceuticamente aceitável desses; (viii) um antagonista do receptor de NMDA, por exemplo, dextrometorfano ((+)-3-hidróxi-N- metilmorfinano) ou seu metabólito dextrorfano ((+)-3-hidróxi-N- metilmorfinan), cetamina, memantina, pirroloquinolina quinona ou ácido cis-4- (fosfonometil)-2- piperidinacarboxílico ou um sal farmaceuticamente aceitável des-ses; (ix) um alfa-adrenérgico, por exemplo, doxazosina, tamsulosina, clonidina ou 4-amino-6,7- dimetóxi-2-(5-metanossulfonamido-1,2,3,4-tetraidroisoquinol-2-il)-5-(2- piridil) quinazolina; (x) um antidepressivo tricíclico, por exemplo, desipramina, imipramina, ami- triptilina ou nortriptilina; (xi) um anticonvulsivo, por exemplo, carbamazepina ou valproato; (xii) um antagonista de taquicinina (NK), particularmente um antagonista NK- 3, NK-2 ou NK-1, por exemplo, (aR, 9R)-7-[3,5-bis(trifluormetil)benzil]-8,9, 10,1 1 - tetraidro-9-metil-5-(4- metiIfenil)-7H-[ 1,4]diazocino[2,1 -g][1,7]naftridina-6-13-diona (TAK-637), 5- [[(2R,3S)-2-[(1 R)-1 -[3,5-bis(trifluormetil)fenil]etóxi-3-(4-fluorfenil)-4- morfolinil]metil]-1,2-dihidro-3H-1,2,4-triazol-3-ona (MK-869), lanepitant, dapitant ou 3- [[2-metóxi-5-(trifluormetóxi)fenil]metilamino]-2-fenil-pipendina (2S,3S); (xiii) um antagonista muscarínico, por exemplo, oxibutina, tolterodina, propi- verina, cloreto de tróspio ou darifenacina; (xiv) um inibidor de COX-2, por exemplo, celecoxib, rofecoxib ou valdecoxib; (xv) um inibidor de COX não seletivo (preferivelmente com proteção Gl), por exemplo, nitroflurbiprofeno (HCT-1026); (xvi) um analgésico de alcatrão de hulha, em paracetamol particular; (xvii) um neuroléptico tal como droperidol; (xviii) um agonista do receptor de vanilóide (por exemplo, resinferatoxina) ou antagonista (por exemplo, capsazepina); (xix) um beta-adrenérgico tal como propranolol; (xx) um anestésico local, tal como mexiletina; (xxi) um corticosteróide, tal como dexametasoπa; (xxii) um agonista ou antagonista do receptor de serotonina; (xxiii) um analgésico colinérgico (nicotínico); (xxiv) Tramadol (marca registrada); (xxv) um inibidor de PDEV, tal como sil-denafil, vardenafil ou taladafil; (xxvi) um ligante alfa-2-delta tal como gabapentina ou pregabalina; (xxvii) um canabinóide; e (xxviii) um antidepressivo, tal como amitriptilina (Elavil), trazodona (Desyrel), e imipramina (Tofranil) ou anticonvulsivos tal como fenitoína (Dilantin) ou carbama- zepina (Tegretol).
[00122]De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provida uma composição farmacêutica para a prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória em um indivíduo, compreendendo um anticorpo antagonista anti-CGRP e um carreador farmaceuticamente aceitável e/ou um excipiente, em que a composição é preparada para ser administrada perifericamente.
[00123]De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é provido um kit compreendendo: (a) uma composição farmacêutica da maneira definida anteriormente; e (b) instruções para a administração periférica de uma quantidade efetiva de dita composição farmacêutica a um individual para a prevenção e/ou tratamento de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória ou para melhorar, controlar, reduzir a incidência, ou atrasar o desenvolvimento ou progressão de dor inflamatória e/ou sintomas de dor inflamatória.
[00124]O kit pode incluir um ou mais recipientes contendo um anticorpo an-tagonista anti-CGRP ou polipeptídeo aqui descrito e instruções para Uso, de acordo com quaisquer dos métodos e usos da invenção. O kit pode compreender adicio-nalmente uma descrição de selecionar um indivíduo adequado para tratamento com base na identificação quer o individual tenha dor inflamatória quer tenha o risco de dor inflamatória. As instruções para a administração periférica da composição farma-cêutica podem incluir informação com relação a dosagem, escala de dosagem e vias de administração para o tratamento pretendido.
[00125]Recursos preferidos de cada aspecto da invenção se aplicam igual-mente a cada outros aspectos mutatis mutandis.
Exemplos
[00126]A presente invenção é agora descrita com referência aos seguintes Exemplos que devem ilustrar, mas não limitar a invenção.
[00127]Os exemplos e figuras seguintes são feitos com referência ao anti-corpo G1, um anticorpo monoclonal humano CGRP anti-humano; e ao anticorpo G2, um anticorpo monoclonal de camundongo CGRP anti-rato (Wong HC et al. Hybrido- ma 12:93-106(1993)). Exemplo 1: Modelos mecanísticos de dor de osteoartrite (OA) (transecção do menisco medial (MMT))
[00128]Transecção do menisco medial (MMT) em um joelho traseiro do rato resulta no desenvolvimento de lesões de cartilagem e outras mudanças na junta si-milares ás que ocorrem em OA. A dor na junta resultante leva ao desenvolvimento de mudanças sustentadas no carregamento de peso (avaliada usando um medidor de incapacitação) nos membros traseiros do rato e alodinia mecânica (táctil) (avaliada usando filamentos von Frey), na pata traseira, persistindo diversas semanas. Es-tudos foram realizados de acordo com um protocolo cego, onde o investigador não estava ciente da identidade do composto/controle ou do tratamento do animal.
[00129]Anticorpo G2 (um anti-CGRP anticorpo monoclonal) reverteu déficit de carregamento de peso do membro traseiro com OA na dose mais alta testada, 10 mg/kg, IV. Seu efeito foi comparável ao celecoxib. Ambos compostos reverteram o deslocamento no carregamento de peso no membro com OA para valor normal. Não foi visto nenhum efeito com a dose menor. Este efeito persistiu 10 dias após a admi-nistração quando a exposição a plasma de anticorpo G2 obteve um valor médio de 65,1 ±3 ug/ml_ (6,3±0,3 ug/mL, para a dose menor em 10 dias após IV).
[00130]O controle negativo, anticorpo null, isto é, não se liga a CGRP, (ver figura 1), demonstrou um efeito no carregamento de peso nos pontos de tempo inici-ais. Este efeito foi inesperado e não pode ser explicado, mas foi não sustentado e não observado nos pontos finais de alodinia (Figura 1).
[00131]Experimentos repetidos nas mesmas condições usando um tampão como controle negativo não mostrou nenhum efeito no carregamento de peso para o controle negativo e reverteu o deslocamento em carregamento de peso no membro de OA para valor normal para G1. Exemplo 2: Ensaio de ligação
[00132]Um ensaio de ligação foi realizado para medir o IC50 de anticorpo anti-CGRP G2 e G1 no bloqueio de a-CGRP humano a partir da ligação no receptor CGRP1 - em células SK-N-MC. Curvas de resposta a dose foram colocadas em grá-fico e valores Ki foram determinados usando a equação: Ki = ICW(I +([ligante]/Ko); Figura 2, onde a constante de dissociação de equilíbrio KD = 0,37 nM para a-CGRP humano para receptor CGRP1 - presente nas células SK-N-MC. O valor IC50 repor-tado (em termos de moléculas IgG) foi convertido nos sítios de ligação de maneira que ele possa ser comparado com as afinidades (KD) determinadas por Biacore usando a-CGRPs de humano e rato N-biotinilado capturadas nas células de fluxo do indivíduo em baixos níveis (tipicamente 100 unidades de resposta) para fornecer as superfícies da reação, enquanto uma célula de fluxo não modificada serviu como um canal de referência. G1 foi titulado nas afinidades de ligação de superfície do chip foram deduzido do cociente das constantes cinéticas (Ko=Wkon) ver Tabela 1. Tabela 1
Figure img0001
Tabela 2
Figure img0002
[00133]Afinidade de ligação de G1 para CGRP α e β humano foi equivalente (Kd = 0,155 e 0,152 nM respectivamente). Afinidade de ligação de G2 para CGRP α e β de rato foi equivalente (16 e 17 nM, respectivamente). Adicionalmente afinidade de ligação G1 é 40 vezes mais potente em humano do que em rato para a-CGRP (Kd = 0,042 e 1,22 nM, respectivamente) e equipotente em humano e rato para β- CGRP (Kd = 0,155 e 0,152 nM, respectivamente). Anticorpo G1 também demonstrou boa seletividade espécie cruzada e se liga a a-CGRP de rato com a mesma afinidade do anticorpo G2 (em torno de 1,2 nM) Tabela 2.
[00134]G1 se liga a CGRP α- e β- de humano e macaco cinomolgo com alta afinidade (KD = 63 e 155 pM, respectivamente). G1 exibe seletividade de espécie para CGRP de humano/cino e se liga a CGRP α - e β- from a partir de outra espécie, por exemplo, rato com afinidade mais baixa (KD = 2,57nM e 152 pM, respectivamen- te). Exemplo 3: Meia vida de anti-CGRP in vivo
[00135]Medições de soro de anti-CGRP em rato, Figura 3, indica que a meia vida é da ordem de 7 dias. O anticorpo é perifericamente restrito tendo um peso mo-lecular de cerca de 150.000, Figuras 3a, 3b, isto é, não atravessa o sistema nervoso central ou atravessa a barreira sangue cérebro. Exemplo 4: Seletividade de anticorpo anti-CGRP
[00136]Determinamos a especificidade de anticorpo G1 para CGRP humano ou rato usando o chip Biacore para "sondar" a concentração livre de um complexo pré-misturado de mAb + peptídeo. Conforme esperado quando pré-incubamos o anticorpo G1 com CGRP de humano ou rato a resposta foi completamente bloqueada. Ao contrário, pré-incubar G1, com um excesso de amilina, calcitonina ou adrenome- dulina foi comparável com a resposta controle (G 1 mais tampão) demonstrando que G1 não formou um complexo com esses peptídeos (Figura 5). Exemplo 5: Identificação de epítopo de ligação anticorpo G1
[00137]Análise de interação foi conduzida a 25 °C em um sistema Biacore 3000™ equipado com chips sensores revestidos com estreptavidina (SA) (Biacore AB, Uppsala, Sweden) usando um tampão de corrida Biacore padrão (HBS-P). Primeiro confirmamos que um fragmento a-CGRP humano 25-37 N-biotinilado liga com a mesma afinidade ao anticorpo G1, que a-CGRP humano N- biotinilado de comprimento total. Cada aminoácido entre a posição 27-37 foi então mutado individualmente para alanina e expressou o número de vezes de perda de afinidade comparado ao fragmento tipo selvagem. Os fragmentos N-biotinilados foram capturados em células individuais de fluxo em baixos níveis (tipicamente 100 unidades de resposta) para fornecer as superfícies da reação, enquanto uma célula de fluxo não modificada serviu como um canal de referência. Fragmentos Fabs purificados de anticorpo G1 foram gerados. Os fragmentos Fabs foram titulados sobre o chip usando 1 pM como a concentração de topo de uma série de diluição de duas vezes. As fases de associação e dissociação foram monitoradas a 100 pl/minuto para 1 minuto e 5 minutos respectivamente. Superfícies foram regeneradas com um mistura de etanol 35 % + Na- OH 25 mM + NaCI 0,5M.
[00138]O resultado de varredura de alanina mostra que o anticorpo G1 se liga a região C-terminal de a-CGRP humano, particularmente resíduos 25 a 37, e mostra ligação específica com uma região (isto é, perda de afinidade é notavelmente maior quando a região de ligação específica é mutada) que pode ser definido como o epítopo e que fica nos últimos 5 aminoácidos C-terminal, isto é, de G33A a F37A. Mudanças mais profundas em afinidade são causadas pela mutação G33A e F37A (Figura 4). Phe C-terminal é importante para seletividade de anticorpo G1 com CGRP vs membros da família de peptídeos e gene relacionados (Figura 6).
[00139]Assim, em uma modalidade, a presente invenção diz respeito a um anticorpo antagonista anti-CGRP que se liga especificamente a um epítopo definido por aminoácidos G33 a F37 de CGRP. O anticorpo antagonista anti-CGRP pode es-pecificamente se ligar ao epítopo definido pela sequência de aminoácidos GSKAF, mais especificamente para o epítopo de CGRP é definido como GXXXF onde X pode ser qualquer aminoácido, o G33 e F37 sendo os resíduos mais importantes do epítopo para definir ligação de alta afinidade do anticorpo antagonista anti-CGRP. Exemplo 6: Análise de indicadores de dependência física ou psicológica
[00140]Nem anticorpo G1 nem anticorpo G2 demonstram penetração de CNS. Adicionalmente, observação a longo prazo de animais (ratos) dosados com anticorpo qualquer nos níveis usados nos exemplos anteriores não revelou eventos CNS adversos tal como sedação ou estímulo / comportamento eufórico em comparação com animais de controle. Essas observações indicam uma ausência de risco de dependência para os anticorpos e consequentemente uma segurança significati-vamente melhor dos anticorpos sobre os atuais opiatos usado em terapias de dor atuais. Exemplo 7: Análise de indicadores de efeitos adversos gastrintestinal
[00141]Um estudo rato in vivo de 1 mês com anticorpo G2 e estudo comparativo de 1 semana com anticorpo G1 demonstraram que não foram observados efeitos adversos gastrintestinais no comportamento, ingestão de alimento, produção de fezes ou histopatologia em comparação com animais de controle. Essas observações indicam uma ausência de risco gastrintestinal para os anticorpos e consequentemente uma segurança significativamente maior dos anticorpos sobre atuais NSAIDs usados em terapias de dor atuais. Exemplo 8; G1 e G2 como anticorpos do antagonista anti-CGRP
[00142]Uma consequência conhecida de atividade biológica de CGRP é a geração de erupção neurogênica quando distribuído in vivo. G1 e G2 são demonstrados para ser anticorpos do antagonista anti-CGRP no qual eles impedem o de-senvolvimento de erupção neurogênica in vivo.
[00143]Usando um modelo de rato de erupção de pele neurogênica a eficácia de G1 foi testada com relação à sua capacidade de bloquear efeito CGRP in vivo. O nervo safenoso no rato é estimulado eletricamente, causando liberação de CGRP das terminações dos nervos e levando a vasodilatação, as mudanças resultantes no fluxo sanguíneo podem ser medidas usando métodos Dopier laser.
[00144]Mudanças nos parâmetros do fluxo sanguíneo foram expressas como a área sob a curva (AUC, mudança em unidades de fluxo Doppler arbitrárias multiplicadas por tempo). CGRPs-37 do antagonista do receptor de CGRP (400 nmol/kg, i.v.) foi usado como um controle positivo para validar a especificidade do modelo (dados não mostrados). Para determinar o efeito de G1 antes da dosagem para cada animal, a resposta do fluxo sanguíneo da linha de base a estímulo foi estabelecida com dois estímulos do nervo safenoso cada 30 minutos aparte. Ratos foram tratados com G1 após a resposta do fluxo sanguíneo do segundo estímulo retornaram para os níveis da linha de base (aproximadamente 10 minutos após o estímulo) e mais quatro estímulos a intervalos de 30 minutos foram realizados.
[00145]Resultados (Figura 7) demonstraram que em animais tratados com veículo não houve nenhuma mudança significativa na resposta do fluxo sanguíneo, mas ratos tratados com G1 mostraram uma diminuição significativa na resposta do fluxo sanguíneo começando a 90 e 120 minutos após a dose para 10 mg/kg e 1 mg/kg, respectivamente. Atividade similar foi obtida usando D2. Adicionalmente, em testes de modelo erupção neurogênica e vasodilatação adicionais G1 mostrou notável efeito a 7 dias após dosagem IV (predito EDso = 6 ug/mL em modelo de estímulo de nervo safenoso). As conclusões dos testes feitos é que G1 e G2 demonstram atividade antagonista anti-CGRP. Capacidade de bloqueio da função CGRP similar para os anticorpos é também mostrada na publicação, Zeller J, et. al. Br J Pharmacol. 2008 Dec; 155(7): 1093-103. Epub 2008 Sep 8.
[00146]A seguir são dadas sequências de anticorpo usadas para praticar a presente invenção. Sequências de anticorpo Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo G1 (SEQ IP NO:1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG FTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDA SATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWG QG TLVTVSS Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo G1 (SEQ IP NO:2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGAS NRYLGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIK Anticorpo G1 CDR H1 (CDR extendido) (SEQ IP NO:3) GFTFSNYWIS Anticorpo G1 CDR H2 (CDR extendido) (SEQ ID NO:4) EI RS ES DASATHYAEAVKG Anticorpo G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5) YFDYGLAIQNY Anticorpo G1 CDR l 1 (SEQ ID NO:6) KASKRVTTYVS Anticorpo G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7) GASNRYL Anticorpo G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8) SQSYNYPYT Sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada do anticorpo G1 (SEQ ID NO:9) GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGC GTCTGTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTT CGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCG ACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGT GACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACA CCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTAC TGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCC Sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve do anticorpo G1 (SEQ ID NO:1Q) GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTGCTA CCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAGCAGAAA CCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACCTCGGTATCCC AGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGG AACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACAACTACCCCTACA CCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAA Sequência de aminoácidos do anticorpo total de cadeia pesada do anticorpo G1 (incluindo lqG2 modificado da maneira aqui descrita) (SEQ IP NO:11) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWISWVRQAPGKGLEWVAEIRSESDA SATHYAEAVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCLAYFDYGLAIQNYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPC PAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Sequência de aminoácidos do anticorpo total de cadeia leve do anticorpo G1 (SEQ IP NO:12) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKASKRVTTYVSWYQQKPGQAPRLLIYGASNRYLGIP ARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCSQSYNYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Sequência de nucleotídeo de anticorpo total de cadeia pesada do anticorpo G1 (incluindo lqG2 modificado da maneira aqui descrita) (SEQ IP NO: 13) GAAGTTCAGCTGGTTGAATCCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCAGGTGGTTCCCTGCTCT GTCCTGCGCTGCTTCCGGTTTCACCTTCTCCAACTACTGGATCTCCTGGGTT CGTCAGGCTCCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCTGAAATCCGTTCCGAATCCG ACGCGTCCGCTACCCATTACGCTGAAGCTGTTAAAGGTCGTTTCACCATCTCCCGT GACAACGCTAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGTGCTGAAGACA CCGCTGTTTACTACTGCCTGGCTTACTTTGACTACGGTCTGGCTATCCAGAACTACTGG GGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCC CACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCCTCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCA CAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGT CCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGC CAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGT GTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCA CAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGC GTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGT CCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCC AAGAGAGCCACAGGT GTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACC TGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACG GACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATC CTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAAC GTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAG CCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAA Sequência de nucleotídeo de anticorpo total de cadeia leve de anticorpo G1 (SEQ ID N0:14) GAAATCGTTCTGACCCAGTCCCCGGCTACCCTGTCCCTGTCCCCAGGTGAACGTG CTACCCTGTCCTGCAAAGCTTCCAAACGGGTTACCACCTACGTTTCCTGGTACCAG CAGAAACCCGGTCAGGCTCCTCGTCTGCTGATCTACGGTGCTTCCAACCGTTACC TCGGTATCCCAGCTCGTTTCTCCGGTTCCGGTTCCGGTACCGACTTCACCCTGAC CATCTCCTCCCTGGAACCCGAAGACTTCGCTGTTTACTACTGCAGTCAGTCCTACA ACTACCCCTACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAACGCACTGTGGCT GCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGC CTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCGCGCGAGGCCAAAGTACAGTGGA AGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGA CAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTC CAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA Comparação de sequência de aminoácidos de CGRP de humano e rato (α- CGRP de humano (SEQ ID NO:15); β-CGRP de humano (SEQ ID NO:16); α-CGRP de rato (SEQ ID NO: 17); e β- CGRP de rato (SEQ ID NO: 18)): NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGWKNNFVPTNVGSKAF-CONH2 (SEQ ID NO:15) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGIMVKSN FVPTNVGSKAF-CONH2 (SEQ ID NO:16) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGWKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (SEQ ID NO:17) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGWKDNFVPTNVGSKAF-CONH2 (SEQ ID NO:18) Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada do anticorpo G2 (SEQ ID NO:19) EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYND GTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTV SS Sequência de aminoácidos de região variável de cadeia leve do anticorpo G2 (SEQ ID NQ:20) EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPA RFSGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIK Anticorpo G2 CDR H1 (CDR extendido) (SEQ ID NO:21) SSVMH Anticorpo G2 CDR H2 (CDR extendido) (SEQ ID NO:22) YINPYNDGTKYNEKFKG Anticorpo G2 CDR H3 (SEQ ID NO:23) GGNDGY Anticorpo G2 CDR L1 (SEQ ID NO:24) SASSSISSIYLH Anticorpo G2 CDR L2 (SEQ IP NO:25) RASNLAS Anticorpo G2 CDR L3 (SEQ IP NO:26) QQGSTIPFT Anticorpo G2 sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia pesada (SEQ IP NO:27) GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG ATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGC AGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTAC TAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTG CAAAAGGGGGTAACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCA Sequência de nucleotídeo da região variável de cadeia leve do anticorpo G2 (SEQ IP NO:28) GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGATC ACTATCACCTGTAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATCAGCA GAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGATTTATAGGGCATCCAATCTGGCTTCTGGA GTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATTGGCA CCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAGTACTATACCATT CACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA Sequência de aminoácidos do anticorpo total de cadeia pesada do anticorpo G2 (não incluindo domínio Fc) (SEQ IP NO:29) EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSSVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGT KYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKGGNDGYWGQGTTLTVSSAK TTPPSWPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLY TLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRD Sequência de aminoácidos do anticorpo total de cadeia leve do anticorpo G2 (SEQ IP NQ:30) EIVLTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKVLIYRASNLASGVPARF SGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSTIPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQ LTSGGASWCFLNNFYPRDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKD EYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC Sequência de nucleotídeo de anticorpo total de cadeia pesada do anticorpo G2 (não incluindo domínio Fc) (SEQ IP NQ:31) GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAG ATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTCTGTTATGCACTGGGTGAAGC AGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGTAC TAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTG CAAAAGGGGGTAACGATGGCTACTGGGGCCAAGGCACTACTCTCACAGTCTCCTCAG CCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAA CTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGT GACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCA GTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAG CGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGA AAATTGTGCCCAGGGAT Sequência de nucleotídeo de anticorpo total de cadeia leve do anticorpo G2 (SEQ IP NO:32) GAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAACCACCATGGCTGCATCTCCCGGGGAGAAGA TCACTATCACCTGTAGTGCCAGCTCAAGTATAAGTTCCATTTACTTGCATTGGTATC AGCAGAAGCCAGGATTCTCCCCTAAAGTCTTGATTTATAGGGCATCCAATCTGGCT TCTGGAGTCCCAGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCA CAATTGGCACCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTACTACTGCCAGCAGGGTAG TACTATACCATTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGGGCTGATG CTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGT GCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAGAGACATCAATGTCAAGTG GAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGTGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAG GACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACATTGACCAAGGACG AGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCA CCCATCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAA

Claims (14)

1. Uso de um anticorpo antagonista anti-CGRP, CARACTERIZADO pelo fa-to de que é para a fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de dor de osteoartrite, em que o anticorpo antagonista anti-CGRP atua periferica-mente na administração, e em que o anticorpo anti-CGRP compreende as seguintes regiões determinantes de complementaridade (CDRs): (a) CDR H1 como apresentada na SEQ ID NO: 3; (b) CDR H2 como apresentada na SEQ ID NO: 4; (c) CDR H3 como apresentada na SEQ ID NO: 5; (d) CDR L1 como apresentada na SEQ ID NO: 6; (e) CDR L2 como apresentada na SEQ ID NO: 7; e (f) CDR L3 como apresentada na SEQ ID NO: 8.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP: (a) se liga a CGRP; (b) bloqueia CGRP da ligação ao seu receptor; (c) bloqueia ou diminui a ativação do receptor de CGRP; (d) inibe, bloqueia, suprime ou reduz a atividade biológica de CGRP; (e) aumenta a depuração de CGRP; e/ou (g) inibe a síntese, produção ou liberação de CGRP.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP: (i) é um anticorpo humano, (ii) é um anticorpo humanizado, (iii) é um anticorpo monoclonal; e/ou (iv) tem uma meia vida ín vivo de pelo menos 7 dias.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP se liga es-pecificamente à região C-terminal de CGRP.
5. Uso, de acordo com reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP reconhece especificamente o epítopo definido pela sequência GSKAF.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende um domí-nio VH que é idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende um domí-nio VL que é idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 2.
8. Uso, de acordo com reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende ainda um domínio VH que é idêntico em se-quência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende um domí-nio VH que é idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 1 e um domínio VL que é idêntico em sequência de aminoácidos à SEQ ID NO: 2.
10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende uma cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com No. de acesso ATCC PTA-6867.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP compreende uma cadeia leve produzida pelo vetor de expressão com No. de acesso ATCC PTA-6866.
12. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo anti-CGRP é produzido pelos veto-res de expressão com Nos. de acesso ATCC PTA-6867 e PTA-6866.
13. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento não produz comprometimento ao sistema nervoso central (CNS) de coordenação motora ou atenção.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo antagonista anti-CGRP não é uma molécula centralmente, espinhalmente ou intratecal penetrante.
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