BRPI0908642A2 - Polinucleotídeo recombinante, construção de dna recombinante, método para aumentar o teor total de ácido graxo de uma semente, produto ou subproduto, método para produzir uma semente de oleaginosa com um teor total de ácidos graxos aumentado e método para produzir um produto a partir de uma semente de oleaginosa - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, POLIPEPTÍDEO, CONSTRUCTO DE DNA RECOMBINANTE, CÉLULA QUE COMPREENDE EM SEU GENOMA O CONSTRUCTO DE DNA RECOMBINANTE, SEMENTE OLEAGINOSA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA AUMENTO DO TEOR TOTAL DE ÁCIDO GRAXO DE UMA SEMENTE OLEAGINOSA, PRODUTO E/OU SUBPRODUTO OBTIDO A PARTIR DE SEMENTE DE LINHAÇA TRANSGÊNICA, PLANTAS DE PROGENIA OBTIDAS A PARTIR DAS SEMENTES OLEAGINOSAS TRANSGÊNICAS E CÉLULAS FÚNGICAS Trata-se de semente de soja transgênica que tem teor de ácido graxo total aumentado em pelo menos 10% e perfis de ácido graxo alterados quando comparados ao conteúdo total de ácido graxo de semente de soja não segregante e não transgênica são descritos. Os genes DGAT provenientes de organismos oleaginosas são usados para alcançar o aumento nos lipídios de armazenamento de semente.

Description

E E EaD RARA ERA RAE AO > ED A AR DO A DO DAE EAD E E ED EAD O AEDI AE E ED REDE AD AODDEE3> EE EO CO ECO >OÕE"ÕSPP o PS»Oâ» »—E Io » j »CCIIl o A ' 1 | . -: À : “POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, CONSTRUÇÃO DE DNA Ns v RECOMBINANTE, MÉTODO PARA AUMENTAR O TEOR TOTAL DE ÁCIDO GRAXO DE UMA SEMENTE, PRODUTO OU SUBPRODUTO, MÉTODO

PARA PRODUZIR UMA SEMENTE DE OLEAGINOSA COM UM TEOR —TOTALDE ÁCIDOSGRAXOS AUMENTADO E MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO A PARTIR DE UMA SEMENTE DE OLEAGINOSA” Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório US 61/055.585, depositado em 23 de maio de 2008, cujo conteúdo encontra-se incorporado ao presente a título de referência.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada ao campo da biotecnologia, em particular, a presente invenção refere-se a sequências de polinucleotídeos que codificam genes de diacilglicerol aciltransferase e ao uso dessas aciltransferases para produção aumentada de lipídios armazenados em sementes e perfis alterados de ácidos graxos em plantas de semente oleaginosa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Lipídios vegetais têm uma variedade de usos nutricionais e industriais e são centrais à função da membrana da planta e adaptação climática. Esses lipídios representam um vasto conjunto de estruturas químicas, e essas estruturas determinam as suas propriedades industriais e fisiológicas. Muitas dessas estruturas resultam direta ou indiretamente dos processos metabólicos que alteram o grau de insaturação do lipídio. Regimes metabólicos diferentes em plantas diferentes produzem esses lipídios alterados, e a domesticação de espécies de planta exótica ou a modificação de espécies agronomicamente adaptadas são usualmente exigidas para produzir economicamente grandes quantidades do lipídio desejado. Existem sérias limitações ao uso de mutagênese para alterar o

' : Na teor e a composição de ácido graxo. As triagens raramente revelarão mutações R que (a) resultam em um fenótipo dominante (de "ganho de função"), (b) estão em genes que são essenciais para o crescimento da planta, e (c) estão em uma enzima que não é limitadora de taxa e que seja codificada por mais de um gene Em casos em que os fenótipos desejados estão disponíveis em linhagens mutantes de plantas de cultivo, sua introgressão em linhagens de elite por meio de técnicas tradicionais de. cruzamento é lenta e cara, tendo em vista que as composições de óleo desejadas são provavelmente o resultado de diversos genes recessivos.

Técnicas recentes de biologia celular e molecular oferecem o potencial para superar algumas das limitações da abordagem da mutagênese, incluindo a necessidade de cruzamento extensivo. Algumas das tecnologias particularmente úteis são expressão específica de semente de genes exógenos em plantas transgênicas [vide Goldberg et a/. (1989) Cell 56:149-160), e o uso de RNA anti-senso para inibir genes alvo da planta de uma maneira dominante e tecido-específica [vide van der Krol et al. (1988) Gene 72:45 a 50]. Outros avanços incluem a transferência de genes exógenos em variedades comerciais de elite de cultura de plantas | oleaginosas comerciais, como a soja [Chee et al. (1989) Plant Physiol. 91 :1212-1218; Christou et a/. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:7500- | 7504; Hinchee et a/. (1988) Bio/Technology 6:915-922; EPO publication O 301 749 A2], semente de colza [De Block et a/. (1989) Plant Physiol. 91 :694 a 701], e girassol [Everett et al. (1987) Bio/Technology 5:1201 a 1204], e o uso de genes como marcadores de polimorfismo de fragmentos de restrição (RFLP) em um programa de cruzamento, que faz introgressão de traços recessivos em linhagens de elite rápidas e menos caras [Tanksley et al. (1989) Bio/Technology 7:257-264]. Entretanto, a aplicação de cada uma dessas tecnologias exige identificação e isolamento de genes

E O O A 3 ns ae comercialmente importantes.

- A maioria dos ácidos graxos livres se tornam esterificados à coenzima A (CoA), para produzir acil-CoAs. Essas moléculas são, então, substratos para a síntese de glicerolipídio no retículo endoplásmico da célula, onde ácido fosfatídico e diacilglicerol (DAG) são produzidos. Qualquer um desses intermediários metabólicos pode ser direcionado para os fosfoliideos de membrana (por exemplo, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina) ou DAG podem ser direcionados para formarem triacilgliceróis (TAGs), a reserva de armazenamento principal de lipídios em células eucarióticas.

Diacilglicerol aciltransferase ("DGAT") é uma proteína de membrana integral que catalisa a etapa enzimática final na produção de triacilgliceróis em plantas, fungos e mamíferos. Essa enzima é responsável pela transferência de um grupo acila a partir de acil-coenzima-A para a posição sn-3 de 1,2-diacilglicerol ("DAG") para formar triacilglicerol! ("TAG"). A DGAT está associada a frações de membrana e de corpo de lipídio em plantas e fungos, particularmente em sementes oleaginosas onde a enzima contribui para o armazenamento de carbono usado como reserva de energia. Acredita-se que o TAG seja um importante composto parao armazenamento de energia em células. A DGAT é conhecida por regular a estrutura de TAG e direcionar a síntese de TAG. Além disso, é conhecido que a reação de DGAT é específica para síntese de óleo.

TAG é o componente principal do óleo vegetal em plantas, e é usado pela semente como uma forma armazenada de energia a ser usada durante a sua germinação.

Duas famílias diferentes de proteinas de DGAT foram identificadas. A primeira família de proteínas de DGAT ("DGAT1") está relacionada à acil-coenzima A: a colesterol aciltransferase ("ACAT") e foi

Pes descrita nas Patentes US 6.100.077 e US 6.344.548. Uma segunda família P de proteinas de DGAT ("DGAT2") não é relacionada a família DGAT1 e é descrita na publicação WOZ2004/011671 publicada de 5 de fevereiro de

2004. Outras referências aos genes de DGAT e seu uso em plantas incluem as publicações WOZ004/011.671, WO1998/055.631, e WOZ2000/001.713, e a publicação US 2003/0115632.

O Pedido de Patente Copendente US 2006/0094088 pertencente à Cessionária da Depositante descreve genes para DGATs de plantas e fungos, e seu uso na modificação dos níveis de de ácidos graxos poliinsaturados ("PUFAs") em óleos comestíveis.

O Pedido PCT pertencente à Cessionária da Depositante publicado como WO 2005/003322 descreve a clonagem de fosfatidilcolina diacilglicerol aciltransferase e DGAT2 para alterar o PUFA e teor de óleo em levedura oleaginosa.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada a uma semente de soja transgênica que tem teor de ácido graxo total aumentado em pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de uma semente de soja não segregante e não transgênica. Em uma segunda modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumentar o teor de ácido graxo total de uma semente de | soja compreendendo: | (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

ra, Em uma terceira modalidade, a presente invenção se refere a ! um grão de milho transgênico que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de um grão de milho segregante nulo, não transgênico. 5 Em uma quarta modalidade, a presente invenção relaciona-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total de um grão de | milho compreendendo: | (a) transformar pelo menos um grão de milho com uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar o(s) grão(s) de milho transformado(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de um grão de milho segregante nulo, não transgênico.

Em uma quinta modalidade, a presente invenção relaciona-se a uma semente de soja transgênica que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção se refere a uma soja transgênica que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e pelo menos qualquer um de i) um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25%; ii) um teor de ácido linolênico diminuído de pelo menos 25%; iii) um teor de ácido linoleico diminuído de pelo menos 4%; iv) um teor de ácido palmítico diminuído de pelo menos 8%; e v) um teor de ácido esteárico diminuído de pelo menos 14% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ácido oleico, ácido linolênico, ácido linoleico, ácido palmítico ou ácido esteárico, respectivamente, teor de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

te Em uma sexta modalidade, a presente invenção se refere a : um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido oleico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma — construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Em uma sétima modalidade, a presente invenção relaciona-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e diminuir o teor de ácido linolênico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido linolênico diminuído de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de sojanão segregante e não transgênica.

Em uma oitava modalidade, a presente invenção relaciona-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e diminuir o teor de ácido linoleico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido linoleico diminuído de pelo menos 4% quando comparado ao

Teo teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja h não segregante e não transgênica.

Em uma nona modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido palmítico —diminuídode uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido palmítico diminuído de pelo menos 8% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Em uma décima modalidade, a presente invenção relaciona-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido esteárico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido esteárico diminuído de pelo menos 14% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Qualquer uma das sementes transgênicas da invenção pode compreender uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT que pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em DGAT1 , DGAT2 e DGAT1 em combinação com DGAT2. Além disso, a sequência de DGAT pode ser uma sequência de organismo oleaginoso.

Também dentro do escopo da invenção estão o(s) produto(s) e/ou

Ft sub-produto(s) obtidos a partir das sementes de soja transgênicas da invenção. . Em uma décima modalidade, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica um —polipeptídeo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% de identidade de aminoácidos, com base no método Clustal V de alinhamento, quando comparado a uma sequência de aminoácidos conforme descrito nas SEQ ID NO: 135, 136, 147, 162, | 176, 215, 234, 265, 272, 299, 304,306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322,351,0ou 363; (b) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método BLASTN de alinhamento, quando comparada a uma sequência de nucleotídeos conforme descrita nas SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161 , 175, 214, 233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350 ou 362; (c) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeos se hibridiza, sob condições estringentes, a uma sequência de nucleotídeos conforme descrita nas SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350 ou 362; ou (d) um complemento da sequência de nucleotídeos de (a), (b) ou (c),) em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem no mesmo número de nucleotidecos e são 100% complementares.

Também pode ser compreendido que a presente invenção se en refere a um polinucleotídeo isolado compreendendo: . (a) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo tendo atividade de diacilglicerol aciltransferase sendo que o polipeptídeo é exposto nas SEQ ID NO:135, 136, 147, 162, 176, 215, 234, 265,272,299,304,306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 351, ou 363; (b) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo tendo atividade de diacilglicero!l aciltransferase, sendo que a sequência de nucleotídeos é exposta nas SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175,214,233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350, ou 362; ou (c) um complemento da sequência de nucleotídeos de (a) ou (b) sendo que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem no mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

O polinucleotíideo isolado que codifica diacilglicerol aciltransferase pode ser obtido a partir de um ou mais organismos oleaginosos. Esses organismos oleaginosos podem ser, mas não estão limitados a, Torulaspora delbrueckii, Pichia anomala, Debaryomyces hansenii, Candida zeylanoides, Lipomyces starkeyi, Mucor circinelloides, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula glutinis, Cryptococcus curvatus, e Mortierella alpina.

A construção de DNA recombinante que compreende o fragmento de ácido nucleico isolado que codifica diacilglicero! aciltransferase pode ser ligada de operativamente a pelo menos uma sequência regulatória, e pode ser incorporada no interior de uma célula. À célula pode ser de uma planta de semente oleaginosa. Em uma décima primeira modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumentar o teor total de ácido graxo de uma semente

TA oleaginosa compreendendo: ; (a) transformar pelo menos uma célula de semente oleaginosa com a construção recombinante mencionada acima; (b) selecionar a(s) célula (s) de semente oleaginosa transformada(s) da etapa (a) tendo um teor total de ácido graxo aumentado quando comparado ao teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa não segregante nula e não transgênica.

Em uma décima segunda modalidade, a presente invenção se refere a progênie e aos produtos e sub-produtos de semente obtidos a partir das sementes oleaginosas transformadas com as construções recombinantes mencionadas acima.

Em uma modalidade final a presente invenção é concernente a fungos, ou organismos oleaginosos microbianos, compreendendo uma construção de DNA recombinante que compreende quaisquer fragmentos de ácido nucleico isolado que codificam qualquer diacilglicerol aciltransferase da presente invenção. Além disso, a célula de origem fúngica pode ser, mas não é limitada a, Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS E DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS A invenção pode ser compreendida de forma mais completa a partir da seguinte descrição detalhada e dos desenhos em anexo e da Listagem de Sequência, que forma uma parte dessa aplicação.

A FIGURA 1 apresenta mapa de plasmídio para pFBAln- YLDGATI , para pFBAIn- YLDGAT?2, e para pFBAINn-MOD1.

A FIGURA 2 apresenta mapa de plasmídio para KS352 e KS332.

A FIGURA 3 apresenta mapa de plasmídio para KS349, KS362, e KS364.

NEN: A FIGURA 4 apresenta uma correlação forte (R? > 0,59) entre : o teor de ácido oleico e o teor de ácido graxo esterificado total para embriões somáticos gerados com KS349.

A FIGURA 5 apresenta uma correlação forte (R? > 0,67) entre o teor de ácido oleico e o teor de ácido graxo esterificado total para embriões somáticos gerados com KS362 sozinhos ou em combinação com KS349 bem como com KS364.

A FIGURA 6 apresenta uma correlação (R? > 0,45) entre o teor de ácido oleico e o teor de óleo para semente de soja transgênica (geração T1) gerada através de co-transformação de plasmídios KS349 e KS362.

A FIGURA 7 apresenta teor de óleo e peso de semente de semente T1 gerada através de co-transformação de plasmídios KS349 e KS362 (A) e KS362 sozinhos (B).

A FIGURA 8 apresenta resultados de hibridização a partir de transferências de DNA genômico. O DNA genômico foi isolado de soja transgênicos obtidos a partir dos eventos AFS4818.1.2, AFS4818.1.3, AFS4818.1.5, AFS48182.6, AFS4818.1.9 (Vide Exemplo 6). O DNA foi digerido com EcoRI ou Hindlll e deixado sobre um gel e transferido para os filtros de náilon [AFS4818.1.2 pistas 1 e 2, AFS4818.1.3 pistas 3 e 4, AFS4818.1.5 pistas 5 e 6, AFS48182.6 pistas 7 e 8, AFS4818.1.9 pistas 9 e 10, e pistas 11 e 12 são DNA do tipo selvagem não transgênico também digerido com EcoRi e Hindllll. As sondas de hibridização foram uma sonda específica de DGAT Yarrowia para a transferência superior (A) e a transferência inferior foi sondada com uma sonda específica de DGAT2 Yarrowia.

A FIGURA 9 apresenta resultados de hibridização a partir das transferências de DNA genômico. As transferências são similares àquelas descritas na FIGURA 8 exceto todos os DNAs que foram todos digeridos | | |

Te. com BstXland, a transferência foi sondada com a sonda específica de : DGAT?2 Yarrowia.

A FIGURA 10 que apresenta atividade de DGAT2 do tipo selvagem de Yarowia lipolytica (YL) (barra preta) é uma atividade normalizada ajustada para 100%. Construções de DGAT2 de Mortierella alpine (MA), | Torulaspora delbrueckii (TD), Debaryomyces hansenii (DH), Lipomyces starkeyi | (LS), Rhodottorula glutinis (RG), Phaffia rhodozyma (PR), Pichia anomala (PA), | Candida zeylanoides (CZ), Cryptococcus curvatus (CC), e Murcor circinelloides | (MC) foram do tipo selvagem (barras quadriculadas) ou códon otimizado/tema | 10 alterado (barras brancas). Os resultados são a média de níveis de óleo dos cinco eventos máximos de cada construção que são então normalizados para uma média dos cinco eventos máximos para YL DGAT?2 testado no mesmo conjunto experimental. As construções de YL DGAT1, MS e LS são mostradas nos últimos três conjuntos. A versão otimizada/alterada por tema de códon de DGAT2 de TD não foi testada (ND). Os detalhes das construções e os resultados de ensaio podem ser encontrados nos Exemplos.

As descrições de sequência resumem a Listagem de Sequências afixada ao presente. A Listagem de Sequência contém códigos de letra para caracteres de sequência de nucleotídeos e os únicos e três códigos de letra para aminoácidos conforme definido nos padrões IUPAC-IUB descritos em Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) e em Biochemical Joumal 219(2):345-373 (1984).

SUMÁRIO DE SEQ ID NO DE PROTEÍNA E ÁCIDO NUCLEICO SEQ1D NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico SEQGID NO do e EE 1 meme [em | ee [et [

: SEQ ID NO de mn R SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico , Proteína (aa) NM (pb) 75 de pl ídi É le plasmídio PY " (7518 pb) YLDGAT! de pY75 de plasmídio: YLDGAT1 inserido 4 em pY75 (9109)

pRS425 de plasmídio (6849 pb) : 6 pGDP425 de plasmídio (7494 pb) E 9 10 Gene de DGAT2 de Yarrowia lipolytica (1545 pb) (514aa) YLDGAT?2 de pY75 de plasmídio, pY75 com YL nn DGAT? inserido (9070 pb) Variante de gene de DGAT1 de Yarrowia lipolytica 16 com sítios de Ncol e Not! adicionados (1603 pb) Variante de gene de DGAT2 de Yarrowia lipolytica 17 com sítios de Ncol e Not! adicionados (1567 pb) 18 PFBAIN-MOD-1 de plasmídio (6991 pb) PFBAIN-YLDGAT de plasmídio, pFBAIN com YL 19 DGAT1 inserido (8568 pb)

PFBAIN-YLDGAT? de plasmídio (8532 pb) 21 pKS123 de plasmídio (7049 pb) 22 cal a24-4 (1098 pb)

PKR53B de plasmídio (8138 pb) 26 PKR72 de plasmídio (7085 pb) 27 PKR85 de plasmídio (7085 pb)

PPCR85 de plasmídio (4827 pb)

. SEQ ID NO de .. SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico Proteína (aa) . (pb) Ea KR92 de pl: dis ” le plasmídio P P (13268 pb) YL DGAT2 de pKR92 de plasmídio, pKR92 com 33 | gene de YL DGAT?2 inserido (19604 pb) ' 34 YL DGAT1 YL DGAT?2 de pKR92 de plasmídio (20082 pb) Gene de glicinina 1 de soja (GY1) (Banco de Genes 35 X15121) (3527 pb) 36 Promotor de GY1 de soja (690 pb) 39 PZBL 114 de plasmídio (6660 pb) 40 Gene de GY1 (glicinina 1) de GM de soja (1437 pb) ” : 41 Gene de BHL8 (alta lisina de cevada) sintética (204 pb) 42 Produto de fusão de GY 1-BHL8 (1701 pb) 43 PZBL 133 de plasmídio (6493 pb) 44 pKS238 de plasmídio (6472 pb) 45 pKS240 de plasmídio (6259 pb) 46 pKS120 de plasmídio (5267 pb) 47 pKS242 de plasmídio (8643 pb) 48 pKS349 de plasmídio (8720 pb) 49 pKS121/BS de plasmídio (5280 pb) 50 pDs-Red de plasmídio em pKS121/BS (5968 pb)

| . SEQ ID NO de [ss SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico , Proteína (aa) . (pb) 51 pKS332 de plasmídio (10058 pb) 52 pKS362 de plasmídio (11611 pb) : 53 GM P34 promotor de soja (1422 pb) YR 56 PZBL115 de plasmídio (7466 pb) 57 pJS89 de plasmídio (7841 pb) Sequência de codificação de gene de delta-6 58 desaturase de Morteriella alpina (1390 pb) 59 pJS93 de plasmídio (9223 pb) 60 pKS127 de plasmídio (7472 pb) 61 pKS343 de plasmídio (7847 pb) 62 pKS352 de plasmídio (10866 pb) 63 pKS364 de plasmídio (12055 pb) Códon de gene de DGAT1 de Yarrowia lipolytica 64 65 otimizado para soja (1581 pb) (526aa) Códon de gene de DGAT2 de Yarrowia lipolytica 66 67 otimizado para soja (1545 pb) (S14aa) 68 PKR 1234 de plasmídio (8638 pb) PSgly32 de pl: di: á le plasmídio pranoS p Á (3673 pb) 72 pKR264 de plasmídio (4171 pb) 73 PKR1212 de plasmídio (6130 pb)

; SEQ ID NÓ de nr R SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico , Proteína (aa) W (pb)

EE CESTA PKR1236 de plasmídio compreendendo DGAT1 e 75 DGAT?2 de Yarrowia lipolytica (11693 pb) PKR 1254 de plasmídio compreendendo DGAT2 de 78 Yarrowia lipolytica do tipo selvagem (5079 pb) PKR1254, pKR1254 Y326F de plasmídio, 81 compreendendo DGAT?2 de Yarrowia lipolytica de (5079 pb) Y326F mutante DGAT?2 de Yarrowia lipolytica compreendendo códon 82 83 326 mutado a partir de Tyr para Phe (1545 pb) (514aa) pKR1254, pKR1254 Y326L de plasmídio 86 compreendendo DGAT2 de Yarrowia lipolytica de (5079 pb) Y326L mutante DGAT?2 de Yarrowia lipolytica compreendendo códon 87 88 326 mutado a partir de Tyr para Leu (1545 pb) (514aa) PKR1254, pKR1254 R327K de plasmídio o1 compreendendo DGAT?2 de Yarrowia lipolytica de (5079 pb) R327K mutante DGAT? de Yarrowia lipolytica compreendendo códon 92 93 327 mutado a partir de Arg para Lys (1545 pb) (514aa) Vetor de expressão de levedura de pY 191 de 9% plasmídio compreendendo DGAT2 de Yarrowia YR V A (9074 pb) lipolytica do tipo selvagem Vetor de expressão de levedura de pY 192 de ss plasmídio compreendendo DGAT?2 de Yarrowia . À (9074 pb) lipolytica de Y326F mutante Vetor de expressão de levedura de pY 193 de o5 plasmídio compreendendo DGAT?2 de Yarrowia ' À (9074 pb) lipolytica de Y326L mutante Vetor de expressão de levedura de pY 194 de o7 plasmídio compreendendo DGAT?2 de Yarrowia dns (9074 pb) lipolytica de R327K mutante | Vetor de expressão de soja de pKR1256 de o8 plasmídio compreendendo DGAT2 de Yarrowia ind (8641 pb) lipolytica do tipo selvagem

. SEQ ID NO de "| SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico h Proteína (aa) . (pb) Vetor de expressão de soja de pKR1277 de so plasmídio compreendendo DGAT2 de Yarrowia R : (8641 pb) lipolytica de Y326F mutante Vetor de expressão de soja de pKR1278 de 100 plasmídio compreendendo DGAT?2 de Yarrowia : : (8641 pb) lipolytica de Y326L mutante pKS392 de plasmídio compreendendo códon de 101 DGAT1 de Yarrowia lipolytica otimizado para soja . a (11647 pb) acionado por promotor de B-conglicina pKS393 de plasmídio compreendendo códon de 102 DGAT?2 de Yarrowia lipolytica otimizado para soja (11611 pb) acionado por promotor de B-con PpKS391 de plasmídio compreendendo DGAT1 de 103 Yarrowia lipolytica acionado por promotor de B-con (11649 pb) Sequência consenso a partir de 5 cosmídios isolados 131 independentemente para DGAT2A de Td , (2567 pb) (Torulaspora delbrueckii) Sequência consenso a partir de 5 cosmídios isolados 132 independentemente para DGAT2B de Td (2700 pb) | (Torulaspora delbrueckii) Sequência genômica para DGAT2A de Td 133 135 (Torulaspora delbrueckii) (1362 pb) (453aa) Sequência genômica para DGAT2B de Td 134 136 (Torulaspora delbrueckii) (1362 pb) (453aa) Sequência consenso a partir de 5 cosmídios isolados 145 independentemente para DGAT2 de Pa (Pichia (2062 pb) anomala) Sequência genômica para DGAT2 de Pa (Pichia 146 147 anomala) (1290 pb) (429aa) Sequência consenso a partir de 3 cosmídios isolados 160 independentemente para DGAT2 de Dh . (2800 pb) (Debaryomyces hansenil)

SN SEQ ID NO de ' : — | SEQIDNO de Descrição e Abreviações ácido nucleico Proteína (aa) , Á (pb) Sequência genômica para DGAT2 de Dh 161 162 (Debarvomvces hansenii) (2028 pb) (675aa) Sequência de consenso a partir de 4 cosmídeos 174 isolados independentemente para DGAT2 de Cz ; À (3021pb) (Candida zeylanoides) Sequência genômica para DGAT2 de Cz (Candida 175 176 zeylanoides) (1695 pb) (564aa) Sequência de consenso a partir de 2 cosmídeos 189 isolados independentemente para DGAT1 de Ls pen Vo º (3343 pb) (Lipomyces starkeyi) Sequência genômica para DGAT2 de Ls 194 (Lipomyces starkeyi) (2090 pb) Sequência genômica a partir de 7 cosmídeos 204 isolados independentemente para DGAT2 de Rg DA (2944 pb) (Rhodotorula glutinis) DGAT?2 de Pr (Phaffia rhodozyma) montado de 214 215 PCR/RACE (1218 pb) (405aa) Sequência de consenso a partir de 7 cosmídeos 226 isolados independentemente para Cc (2816 pb) (Cryptococcus curvatus) DGAT?2 de Mc (Mucor circinelloides) montado de 233 234 PCR/RACE (1110 pb) (369aa) pKR1295 de plasmídeo compreendendo DGAT2a 237 de Torulaspora delbrueckii (4895 pb) pKR1324 de plasmídeo compreendendo DGAT2a 238 de Torulaspora delbrueckii (8457 pb) pKR1296 de plasmídeo compreendendo DGAT2b 241 de Torulaspora delbrueckii (4896 pb)

—— SEQ ID NO de SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico SD Proteína (aa) . (pb) pKR1325 de plasmídeo compreendendo DGAT2b 242 de Torulaspora delbrueckii (8458 pb) | | PKR 1297de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 245 | Debaryomyces hansenii (5561pb) | PKR179 de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 246 | Debaryomyces hansenii (4480 pb) | IpKR 1327 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 247 Debaryomyces hansenii (6519 pb) | | pKR325 de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 248 Debaryomyces hansenii (5303 pb) | IpKR 1328 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 del 249 Debaryomyces hansenii (9122 pb) PMDGAT?2-17 de plasmídeo compreendendo 250 DGAT?2 de Mortierella alpina (8084 pb) IpKR 1330 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 253 Mortierella alpina (4529 pb) , 254 255 DGAT? de Mortiereila alpina (996 pb) (331 aa) IpKR 1335 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 256 Mortierella alpina (8091 pb) IpKR1319 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 259 Pichia anomala (4824 pb) |PKR 1332 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 260 Pichia anomala (8386 pb) PHD28 de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 263 Rhodotorula glutinis (4573 pb)

» SEQ ID NO de . — —|SEQIDNO de Descrição e Abreviações ácido nucleico . Proteína (aa) .: (pb) 264 265 DGAT?2 de Rhodotorula glutinis (1041 pb) (346aa) PpKR1333 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 266 Rhodotorula glutinis (8137 pb) pHD30 de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 270 Lipomyces starkeyi (4766 pb) 1 DGAT?2 de Lipomyces starkeyi 27 272 (1233 pb) (410aa) pKR1337 de pasmídeo compreendendo DGAT2 de 273 Lipomyces starkeyi (8329 pb) PMDGAT1-17 de plasmídeo compreendendo 274 DGAT1 de Mortierella alpina (8666 pb) IpKR 1329 de plasmídeo compreendendo DGAT1 de 277 Mortierella alpina (5111 pb) 278 279 DGAT1 de Mortierella alpina (1578 pb) (525aa) pKR1334 de Plasmídeo compreendendo DGAT1 de; 280 Mortierella alpina (8674 pb) pKR 1314 de plasmídeo compreendendo DGAT1 de 281 Yarrowia lipolytica (4547 pb) PKR1310 de plasmídeo compreendendo parte do 286 códon otimizado do DGAT1 de Yarrowia lipolytica (4749 pb) 287 pKR1316 de plasmídeo compreendendo códon otimizado de DGAT1 de Yarrowia lipolytica (5136 pb) 288 Códon otimizado DGAT1 de Yarrowia lipolytica (1581 pb) pKR 1323 de plasmídeo compreendendo códon 289 otimizado DGAT1 de Yarrowia lipolytica (8677 pb) pHD37 de plasmídeo compreendendo DGAT2 de 292 Phaffia rhodozyma (4751 pb)

» SEQ ID NO de e. * — |SEQIDNO de Descrição e Abreviações ácido nucleico Proteína (aa) . (pb) 293 DGAT?2 de Phaffia rhodozyma (1218 pb) IpKR1372 de plasmídeo compreendendo DGAT?2 de 294 Phaffia rhodozyma (8314 pb) PHD38 de plasmídeo compreendendo DGAT1 de 297 Lipomyces starkeyi (5198 pb) DGAT1 de Lipomyces starkeyi 298 299 (1665 pb) (554aa) 300 PpKR1375 de Plasmídeo compreendendo DGAT1 de; Lipomyces starkeyi (8761 pb) 301 Códon otimizado de DGAT1 de Mortierella alpina | (1578 pb) | 302 ! Códon otimizado de DGAT1 de Lipomyces starkeyi (1665 pb pb) 303 304 Códon otimizado e DGAT2A de Torulaspora delbrueckii mutado de Tyr para Phe (1362 pb) (453aa) 305 306 Códon otimizado e DGAT2B de Torulaspora delbrueckii mutado de Tyr para Phe (1362 pb) (453aa) 307 308 Códon otimizado e DGAT2 de Pichia anomala mutado de Tyr para Phe (1290 pb) (429aa) 309 310 Códon otimizado e DGAT2 de Debaryomyces hansenii mutado de Tyr para Phe (2028 pb) (675aa) ICódon otimizado e DGAT2 de Candida zeylanoides;) 31 312 mutado de Tyr para Phe (1695 pb) (564aa)

"a.

SEQ iD NO de Nm SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico Proteína (aa) . (pb) Códon otimizado e DGAT2 de Lipomyces starkeyi 21 314 DGAT?2 mutado de Tyr para Phe (1233 pb) (410aa) Códon otimizado e DGAT2 de Mucor circinelloides as Sie mutado de Tyr para Phe (1110 pb) (369aa) " : 317 318 Códon otimizado e DGAT2 de Phaffia rhodozyma mutado de Tyr para Phe (1218bp) (405aa) Códon otimizado e DGAT2 de Rhodotorula glutinis dás 320 mutado de Tyr para Phe (1041 bp) (346aa) Tm 321 322 Códon otimizado e DGAT2 de Mortierella alpina mutado de Tyr para Phe (1110 pb) (369aa) PpKR278 de plasmídeo 323 (5303) PKR1274 de plasmídeo 324 (8358) 325 Gene da tioesterase2 do soja (1251) 326 pTC4 de plasmídeo (9592) 331 PKR1258 de plasmídeo (4738) 332 Gene da Fad 2-1 do soja (1164) 333 PBS43 de plasmídeo (10303) PCRblunt-Fad2-1 de plasmídeo 338 tao SEQ ID NO de SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico Proteína (aa) . (pb) LOIRO ao a 339 PKR1259 de plasmídeo (56797) 340 PKR1261 de plasmídeo (7590) 341 | pKR123R de plasmídeo | (4993) | 342 PKR1266 de plasmídeo (9036) 343 | pKR1267 de plasmídeo (11615) | 344 PKR457 de plasmídeo (5252) | 345 PKR 1264 de plasmídeo (9295) 346 PKR1277 de plasmídeo (2577) 347 PKR 1269 de plasmídeo (9219) 350 351 Gene de DGAT2 de Cryptococcus curvatus (1506) (501) ' 354 pHD39 de plasmídeo (5227) | 355 | PKR 1392 de plasmídeo (8791) | 358 plasmídeo pKR 1408 (4643) Gene de DGAT2 de Mucor circinelloides | aa tas SEQ ID NO de . SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico , Proteína (aa) É (pb)

ORE 360 PpKR1409 de plasmídeo (8206) 361 PKR1427 de plasmídeo (8602) [Gene otimizado de DGAT2 Cryptococcus curvatus para a 362 363 expressão da soja (1506) (501) 364 PKR1422 de plasmídeo (8458) PKR1421 de plasmídeo 365 (8386) 366 PKR 1420 de plasmídeo (9124) 367 PKR1512 de plasmídeo (8791) 368 PKR1415 de plasmídeo (8329) 369 PKR1513 de plasmídeo (8206) 370 PKR1416 de plasmídeo (8314) 371 PKR 1423 de plasmídeo (8137) 372 PKR1419 de plasmídeo (8092) 373 PKR1522 de plasmídeo (8602) PKR1514 de plasmídeo 374

"a. o. SEQ ID NO de Descrição e Abreviações ácido nucleico pERID None e Ee

EEE A SEQ |D NO: 7 a 8 correspondem aos primers de PCR | oYLDGAT2-1 (SEQ ID NO: 7) e oYLDGAT2-2 (SEQ ID NO: 8), usados para | amplificarem o gene diacilglicero! aciltransferase 2 de Yarrowia lipolytica (YL DGAT?2) a partir de um lisado de levedura (para detalhes, vide Exemplo 1.) | As SEQ |D NO: 12 a 15 correspondem aos primers de oligonucleotídeo usados para amplificarem as regiões de codificação de YL DGAT1 (YDGAT1-F e YDGAT1-R; SEQ ID NO: 12 a 13, respectivamente) e YL DGAT2 (YDGAT2-F e YDGAT2-R, SEQ ID NO: 14 a 15, respectivamente) a partir de DNA genômico de Yarrowia lipolytica. A SEQ ID NO: 23 (oCal-15) e a SEQ ID NO: 24 (oCal-6) correspondem aos primers de oligonucleotídeo usados para amplificarem cal a24-4 de fragmento de DNA (SEQ ID NO: 22) a partir de CalFad2-2 de plasmídio modelo descrito na Publicação PCT Nº WO 02/008269. A SEQ ID NO: 28 (oKR85-1) e a SEQ ID NO: 29 (oKR85-2) “5 correspondem aos primers usados para amplificarem a região terminadora 3' de promotor-(sítio de clonagem Notl)-faseolina de beta-conglicin a partir de pKR85 de plasmídio (SEQ ID NO: 27). A SEQ ID NO: 37 (o0Gy1-1 ) e a SEQ ID NO: 38 (0Gy1-2) correspondem aos primers usados para amplificarem o promotor de glicinina 1 de soja (SEQ ID NO: 36) e incorporarem sítios de BamHI e Ncol nas terminações 5' e 3', respectivamente. A SEQ ID NO: 54 (0P34-1) e a SEQ ID NO: 55 (0P34-2) correspondem aos primers usados para amplificarem o promotor de P34 de mr soja (SEQ ID NO: 53) e incorporarem sítios de BamHI e Notl nas terminações . 5' e 3', respectivamente.

A SEQ ID NO: 69 (oSGIy-2) e a SEQ ID NO: 70 (0SGlIy-3) correspondem aos primers usados para amplificarem o promotor de GY1 de glicinina.

A SEQ ID NO: 76(o0YDG2-1 ) e a SEQ ID NO: 77 (o0YDG2-2) correspondem aos primers usados para amplificarem DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO:10) que foi então incorporado em PpKR1254 (SEQ ID NO: 78).

A SEQ ID NO: 79 (YID2 Y326F-5) e a SEQ ID NO: 80 (YID2 Y326F-3) correspondem aos primers usados para mutarem o aminoácido na posição 326 de DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO: 10) a partir de tirosina para fenilalanina.

A SEQ ID NO: 84 (YID2 Y326L-5) e a SEQ ID NO: 85 (YID2 Y326L-3) correspondem aos primers usados para mutarem O aminoácido na posição 326 de DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO: 10) a partir de tirosina para leucina.

A SEQ ID NO: 89 (YID2 R327K-5) e a SEQ ID NO: 90 (YID2 R327K-3) correspondem aos primers usados para mutarem o aminoácido na posição 327 de DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO: 10) a partir de argininapara lisina.

A SEQ ID NO: 104 (MWG619) e a SEQ ID NO: 105 (MWG620) correspondem aos primers usados para amplificarem sequências de DNA ribossômico 268.

A SEQ ID NO: 106 (TD de 268 de iniciador) é o fragmento de TDNA 268 isolado de Torulaspora delbrueckiiá Esses fragmentos de sequenciamento são usados para identificarem os organismos a partir do que o DNA genômico foi isolado.

As SEQ ID NO: 107 a 120 são primers degenerados usados para

[rm amplificarem genes DGAT1 e DGAT? a partir de DNA genômico de organismo . oleaginoso. Vide Tabela 37 no Exemplo 18 para detalhes.

A SEQ ID NO: 121 é o fragmento de PCR isolado de Torulaspora delbrueckii que foi usado como uma sonda para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos.A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 122.

As SEQ ID NO: 123 a 130 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Torulaspora delbrueckii contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 137 é o fragmento de rDNA 268 isolado de Pichia anomala.

A SEQ ID NO: 138 é o fragmento de PCR isolado de Pichia anomala que foi usado como uma sonda para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 139.

As SEQ ID NO: 140 a 144 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Pichia anomala contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 148 é o fragmento de PCR isolado de Debaryomyces hansenii que foi usado como uma sonda para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ IDNO: 149.

As SEQ ID NO: 150 a 159 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Debaryomyces hansenii contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 163 é o fragmento de rDNA 268 isolado de Candida zeylanoides.

A SEQ ID NO: 164 é o fragmento de PCR isolado de Candida zeylanoides que foi usado como uma sonda para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 165.

rr As SEQ ID NO: 166 a 173 são primers de sequenciamento , usados na caracterização do DGAT2 de Candida zeylanoides contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 177 é o fragmento de PCR isolado de Lipomyces —starkeyi que foi usado como uma sonda de DGAT1 para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 178.

A SEQ ID NO: 179 é o fragmento de PCR isolado de Lipomyces starkeyi que foi usado como uma sonda de DGAT?2 para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO:180.

As SEQ ID NO: 181 a 188 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT1 de Lipomyces starkey contendo clones de cosmiídio.

As SEQ ID NO: 190 a 193 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Lipomyces starkeyi contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 195 é o fragmento de PCR isolado de Rhodotorula glutinis que foi usado como uma sonda de DGAT?2 para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 196.

As SEQ ID NO: 197 a 203 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Rhodotorula glutinis contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 205 é o fragmento de PCR isolado de Phaffia rhodozyma que codifica um DGAT?2 parcial. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 206.

As SEQ ID NO: 207 a 213 são primers de sequenciamento

VW usados na caracterização do DGAT2 de Phaffia rhodozyma contendo clones de : cosmídio. A SEQ |D NO: 216 é o fragmento de PCR isolado de Cryptococcus curvatus que foi usado como uma sonda de DGAT2 para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 217.

As SEQ ID NO: 218 a 225 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Cryptococcus curvatus contendo clones de cosmídio.

A SEQ ID NO: 227 é o fragmento de PCR isolado de Mucor circinelloides que foi usado como uma sonda de DGAT?2 para realizar triagem de bibliotecas de cosmídeos. A tradução desse fragmento é mostrada na SEQ ID NO: 228.

As SEQ ID NO: 229 a 232 são primers de sequenciamento usados na caracterização do DGAT2 de Mucor circinelloides contendo clones de cosmídio.

As SEQ ID NO: 235 a 237 são primers usados na amplificação do DGAT? de Torulaspora delbrueckiia para clonar em pKR1324 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 239 a 240 são primers usados na amplificação do DGAT2 de Torulaspora delbrueckiib para clonar em pKR1325 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 243 a 244 são primers usados na amplificação do DGAT?2 de Debaryomyces hansenii para clonar em pKR1327 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 243 a 244 são primers usados na amplificação do DGAT? de Mortierella alpina para clonar em pKR1330 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 257 a 258 são primers usados na amplificação do DGAT? de Pichia anomala para clonar em pKR1319 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 261 a 262 são primers usados na amplificação do | DGAT?2 de Rhodotorula glutinis para clonar em pHD28 de plasmídio.

o As SEQ ID NO: 267 a 269 são primers usados na amplificação do : DGAT? de Lipomyces starkeyi para clonar em pHD30 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 275 a 276 são primers usados na amplificação do DGAT1 de Mortierella alpina para clonar em pKR1329 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 282 a 285 são primers usados na otimização de códon do DGAT1 de Yarrowia lipolytica para clonar em pKR1310 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 290 a 291 são primers usados na amplificação do DGAT? de Phaffia rhodozyma para clonar em pHD37 de plasmídio.

As SEQ ID NO: 295 a 296 são primers usados na amplificação do | 10 DGAT1 de Lipomyces starkeyi para clonar em pHD38 de plasmídio As SEQ ID NO: 327 a 330 (GmMTE2 5-1, GNTE2 3-1, GmTE2 5-2, e GmTE2 3-2, respectivamente) correspondem aos primers usados para amplificarem o gene de tioesterase 2 de soja.

As SEQ ID NO: 334 a 337 (GmFad2-1 5-1, GmFad2-1 3-1, GmFad2-15-2, e GmFad2-1 3-2, respectivamente) correspondem aos primers usados para amplificarem o gene de desaturase 2-1 de ácido graxo de soja.

As SEQ ID NO: 348 a 349 (CC ORF FWD e CC ORF REV, respectivamente) correspondem aos primers usados para amplificarem o gene de diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Cryptococcus curvatus.

As SEQ |D NO: 352 a 353 (CZDGAT2-5 e CzDGAT2-3, respectivamente) correspondem aos primers usados para amplificarem o gene de diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Candida zeylanoides.

As SEQ |D NO: 356 a 357 (oMcDG2-1 e oMcDG2-?, respectivamente) correspondem aos primers usados para amplificarem o gene de aciltransferase 2 de Mucor circinelloides.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A descrição de cada referência exposta neste documento é incorporada integralmente ao presente a título de referência.

Ú Pa mo 31 | Por Conforme usado neste documento e nas reivindicações em J anexo, as formas no singular "um", "uma", e "o", "a" incluem referência no plural a menos que o contexto determine claramente de outro modo.

Desse modo, por exemplo, a referência para "uma planta" inclui uma pluralidade de | 5 tais plantas, a referência para "uma célula" inclui uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas por aqueles versados na técnica, e assim por diante.

No contexto dessa descrição, inúmeros termos e abreviações são usados.

As seguintes definições são apresentadas. "Quadro aberto de leitura" é abreviado para ORF. "Reação em cadeia da polimerase" é abreviado para PCR. "Coleção de Culturas do Tipo Americana" é abreviado para ATCC. "Acil-CoA:esterol-aciltransferase" é abreviado para ARE2 "Fosfolipídeo:diacilglicerol! aciltransferase" é abreviado para PDAT. "Diacilglicero! aciltransferase" é abreviado para DAG AT ou DGAT. "Diacilglicerol" é abreviado para DAG. "Triacilgliceróis" é abreviado para TAGs. "Co-enzima A" é abreviado para CoA.

O termo "ácidos graxos" refere-se a ácidos alifáticos de cadeia longa (ácidos alcanóicos) de comprimento de cadeia variado, de cerca de C17 a C22 (embora ambos os ácidos de comprimento de cadeia mais curto e mais longo sejam conhecidos). Os comprimentos de cadeia predominantes estão entre C16 e C22. A estrutura de um ácido graxo é representada por um sistema de notação simples de "X:Y", onde X é o número total de átomos de carbono (C) no ácido graxo particular e Y é o número de ligações duplas.

Em geral, ácidos graxos são classificados como saturados ou insaturados.

O termo "ácidos graxos saturados" refere-se àqueles ácidos rar graxos que não têm "ligações duplas" entre sua espinha dorsal de carbono. Em |. contraste, "ácidos graxos insaturados" têm "ligações duplas" ao longo de suas espinhas dorsais de carbono (que estão mais comumente na configuração cis). "Ácidos graxos monoinsaturados" têm somente uma "ligação dupla" ao longo da espinha dorsal de carbono (por exemplo, usualmente entre o 9º e o 10º átomo de carbono como para ácido palmitoleico (16:1) e ácido oleico (18:1)), ao mesmo tempo em que "ácidos graxos poliinsaturados" (ou "PUFAs") têm pelo menos duas ligações duplas ao longo da espinha dorsal de carbono (por exemplo, entre o 9º e o 10º, e 0 12º e o 13º átomos de carbono para ácido linoleico (18:2); e entre o 9º e 0 10º, 0 12º e o 13º, é 0 15º e 0 16º para ácido a- linolênico (18:3)).

"Óleos microbianos" ou "óleos de célula única" são aqueles óleos produzidos naturalmente por meio de microorganismos (por exemplo, algas, leveduras oleaginosas e fungos filamentosos) durante seu tempo de vida. O termo "óleo" se refere a uma substância lipídica que é líquida a 25ºC e usualmente poliinsaturada. Em contraste, o termo "gordura" refere-se a uma substância lipídica que é sólida a 25ºC e usualmente saturada.

"Corpos lipídicos" referem-se às gotículas de lipídio que são usualmente ligadas por meio de proteínas específicas e a camada única de fosfolipídeo. Essas organelas são sítios onde a maior parte dos organismos transporta/armazena lipídios neutros. Corpos lipídicos são vistos por surgirem de microdomínios do retículo endoplásmico que contém enzimas de biossíntese de TAG; e, sua síntese e tamanho parecem ser controlados por componentes de proteína específicos.

"Lipídios neutros" referem-se àqueles lipídios encontrados comumente em células em corpos lipídicos como óleos e gorduras de armazenamento e são desta forma chamados pelo fato de em pH celular, os lipídios não suportam grupos carregados. Em geral, eles são completamente tara não-polares sem nenhuma afinidade para água. Lipídios neutros, em geral, referem-se a mono-, di-, e/ou triésteres de glicerol com ácidos graxos, também ' chamados monoacilglicerol, diacilglicerol ou TAG, respectivamente (ou coletivamente, acilgliceróis), Uma reação de hidólise precisa ocorrer para liberar ácidos graxos livres a partir de acilgliceróis.

Os termos "triacilglicerol", "óleo" e "TAGs" referem-se a lipídios neutros compostos de três resíduos de acila graxa esterificados a uma molécula de glicerol (e tais termos serão usados de maneira intercambiável ao longo da presente descrição neste documento). Tais óleos podem conter PUFAs de cadeia longa, bem como ácidos graxos insaturados e saturados de cadeia mais curta e ácidos graxos saturados de cadeia mais longa. Desse modo, "biossíntese de óleo" se refere genericamente à síntese de TAGs na célula.

O termo "DAG AT" ou "DGAT'" refere-se a uma diacilglicerol | aciltransferase (também conhecida como uma acil-CoA-diacilglicerol | aciltransferase ou uma diacilglicerol O- aciltransferase) (EC 2.3.1.20). Essa enzima é responsável pela conversão de acil-CoA e 1,2-diacilglicerol para TAG e CoA (desse modo envolvida na etapa terminal de biossíntese de TAG). Duas famílias de enzimas de DAG AT existem: DGAT1 e DGAT2. A primeira família compartilha homologia com a família gênica de acil-CoA:colestero! aciltransferase (ACAT), ao mesmo tempo em que a última família é não- relacionada (Lardizabal et al., J. Biol. Chem. 276(42):38862-28869 (2001 )).

O temo "PDAT" referesse a uma enzima de fosfolipídeo:diacilglicerol aciltransferase (EC 2.311.158) Essa enzima é responsável pela transferência de um grupo acila a partir da posição sn-2 de um fosfolipídeo para a posição sn-3 de 1,2-diacilglicerol, resultando, assim, no | lisofosfolipídeo e TAG (desse modo envolvida na etapa terminal de biossíntese de TAG). Essa enzima difere de DGAT (EC 2.3.1.20) sintetizando TAG via um

1. rar mecanismo independente de acil-CoA. . O termo "AREZ2" refere-se a uma enzima de acil-CoA:esterol- aciltransferase (EC 2.3.1.26; também conhecida como uma enzima de esterol- éster sintase 2), catalizando a seguinte reação: acil-CoA + colesterol = CoA + colesterol éster.

Conforme usado neste documento, "ácido nucleico" significa um polinucleotídeo e inclui polímero de filamento duplo ou único de bases de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo. Ácidos nucleicos também podem incluir fragmentos e nucleotídeos modificados. Desse modo, os termos | 10 "polinucleotídeo", "sequência de ácido nucleico", "sequência de nucleotídeos" ou "fragmento de ácido nucleico" são usados de maneira intercambiável e é um polímero de RNA ou DNA que é de filamento duplo ou único, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo alteradas ou não-naturais, sintéticas. Nucleotídeos (usualmente encontrados na sua forma de 5'- monofosfato) são chamados por meio de sua designação de letra única conforme segue: "A" para adenilato ou desoxiadenilato (for RNA ou DNA, respectivamente), "C" for citidilato ou desoxicitidilato, "G" for guanilato ou desoxiguanilato, "U" para uridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidienes (C ou T), "K" para G ou T, "H" para A ou C ou T, "l" para inosina, e “"N"para qualquer nucleotídeo.

Os termos "subfragmento que é funcionalmente equivalente" e "subfragmento funcionalmente equivalente" são usados de maneira intercambiável neste documento. Esses termos referem-se a uma porção ou subsequência de um fragmento de ácido nucleico isolado em que a capacidade para alterar expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo é retida quer queira o fragmento ou o subfragmento codifique uma enzima ativa ou não. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser usado no projeto de genes quiméricos para produzir o fenótipo desejado em uma planta a.

SM transformada. Genes quiméricos podem ser designados pra uso em supressão | . ligando um fragmento de ácido nucleico ou subfragmento do mesmo, quer | queira ele codifique uma enzima ativa ou não, na orientação de anti-senso ou senso relativa a uma sequência promotora de planta.

O termo "domínio conservado" ou "tema" significa um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma sequência alinhada de proteínas relacionadas de forma evolutiva. Ao mesmo tempo em que aminoácidos em outras posições podem variar entre proteínas homólogas, os aminoácidos que estão altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, na estabilidade, ou na atividade de uma proteína. Pelo fato de elas serem identificadas por seu grau alto de conservação em sequências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, elas podem ser usadas como identificadores, ou "assinaturas", para determinarem se uma proteina com uma sequência recém-determinada pertence a uma família de proteínas identificada previamente.

Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente similar" e "que corresponde substancialmente" são usados de maneira intercambiável neste documento. Eles se referem aos fragmentos de ácido nucleico sendo que mudanças em uma ou mais bases de nucleotídeo não afetam a capacidade de o fragmento de ácido nucleico mediar a expressão gênica ou produzir um determinado fenótipo. Esses termos também se referem às modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção como exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucleico resultante relativo ao fragmento não-modificado, inicial. Compreende-se, portanto, conforme aqueles versados na técnica compreenderão, que a invenção abrange mais do que sequências exemplificadoras específicas. Além disso, o elemento versado na técnica reconhece que as

Por sequências de ácido nucleico substancialmente similares abrangidas por essa | . invenção também são definidas por meio de sua capacidade para hibridizar | (sob condições moderadamente estringentes, por exemplo, 0,5X SSC, 0,1% de SDS, 60ºC) com as sequências exemplificadas neste documento, ou para — qualquer porção das sequências de nucleotídeos descritas neste documento e que são funcionalmente equivalentes a qualquer uma das sequências de ácido nucleico descritas neste documento.

Condições de adstringência podem ser ajustadas para a triagem de fragmentos moderadamente similares, como sequências homólogas a partir de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos aproximadamente relacionados.

Lavagens de pós- hibridização determinam as condições de adstringência.

O termo "hibridiza seletivamente" inclui a referência para hibridização, sob condições de hibridização estringentes, de uma sequência de ácido nucleico para uma sequência alvo de ácido nucleico específica para um grau maior que pode ser detectado (por exemplo, pelo menos 2 vezes acima da base) do que sua hibridização para sequências de ácido nucleico não-alvo e para a exclusão substancial de ácidos nucleicos não-alvo.

Sequências seletivamente hibridizantes têm tipicamente cerca de pelo menos 80% de identidade de sequência, ou 90% de identidade de sequência, até e incluindo 100% de identidade de sequência (isto é, completamente complementar) uma com a outra.

O termo "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" inclui a referência para condições sob as quais uma sonda irá —hibridizar seletivamente para sua sequência alvo.

Condições estringentes são dependentes de sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes.

Controlando a adstringência das condições de hibridização e/ou lavagem, as sequências alvo podem ser identificadas o que são 100% complementares à

"rr sonda (sondagem homóloga). De forma alternativa, as condições de : adstringência podem ser ajustadas para permitirem alguma incompatibilidade nas sequências para que graus mais baixos de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Em geral, uma sonda é inferior a cerca de 1.000 —nucleotideos em comprimento, opcionalmente inferior a 500 nucleotídeos em comprimento.

Tipicamente, as condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou outros sais) em pH de 7,0 a8,3e a temperatura é de pelo menos cerca de 30ºC para sondas curtas (por | exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60ºC para sondas longas (por exemplo, maior que 50 nucleotídeos). As condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes | como formamida.

Condições de adstringência baixa exemplificadoras incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de | NaCl, 1% de SDS (sódio docecil sulfato) a 37ºC, e uma lavagem em 1X a 2X | de SSC (20X de SSC = 3,0 M de NaCl1/0,3 M de citrato trisódico) a 50 até | 55ºC.

Condições de adstringência moderada exemplificadoras incluem | hibridização em 40 até 45% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37ºC, e | uma lavagem em 0O,5X a 1X de SSC a 55 até 60ºC.

Condições de adstringência alta exemplificadoras incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de | NaCl, 1% de SDS a 37ºC, e uma lavagem em 0,1X de SSC a 60 até 65ºC. | Especificidade é tipicamente a função de lavagens de pós- hibridização, os fatores cruciais que são a força iônica e a temperatura: da solução de lavagem final.

Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth et al., Anal.

Biochem. 138:267- 284 (1984): Tm = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0,41 (% de GC) — 0,61 (% de forma) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, % de GC é a

Pao porcentagem de nucleotídeos de guanosina e ditosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do | híbrido em pares de base.

A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza para uma sonda perfeitamente compatível.

A Tm é reduzida por cerca de 1ºC para cada 1% de incompatibilidade; desse modo, condições de Tm, hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizarem para sequências da identidade desejada.

Por exemplo, se as sequências com >90% de identidade forem necessárias, a Tm pode ser diminuída para 10ºC.

Em geral, as condições | estringentes são selecionadas para serem de cerca de 5ºC inferiores ao ponto | de fusão térmica (Tm) para a sequência específica e seu complemento em uma força iônica e um pH definidos.

Entretanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4ºC inferior ao ponto de fusão térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10ºC inferior ao ponto de fusão térmica (Tm); condições de adstringência baixa podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20ºC inferior ao ponto de fusão térmica (Tm). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles versados na técnica compreenderão que variações na adstringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas.

Se o grau desejado de incompatibilidade resultar em uma Tm de menos de 45ºC (solução aquosa) ou 32ºC (solução de formamida) é preferencial aumentar a concentração de SSC para que uma temperatura mais alta possa ser usada.

Um guia extensivo para a hibridização de ácidos —nucleicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hibridization with Nucleic Acid Probes, Parte |, Capítulo 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, Nova Yorque (1993); e Current Protocols in Molecular

"a Biology, Capítulo 2, Ausubel et al. Eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, Nova Yorque (1995). Condições de hibridização e/ou lavagem i podem ser aplicadas por pelo menos 10, 30, 60, 90, 120, ou 240 minutos. "Identidade de sequência" ou "identidade" no contexto de sequências de polipeptídeos ou ácidos nucleicos refere-se às bases de ácido nucleico ou aos resíduos de aminoácido em duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para correspondência máxima acima de uma janela de comparação especificada.

Desse modo, "porcentagem de identidade de sequência" refere-se ao valor determinado comparando duas sequências alinhadas de forma ideal acima de uma janela de comparação, sendo que a porção da sequência de polipeptídeos ou polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (isto é, espaços) conforme comparado à sequência de referência (que não compreende adições ou exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando o número de posições em que a base de ácido nucleico ideal ou o resíduo de aminoácido ocorre em ambas sequências para render o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando os resultados por 100 para render a porcentagem de identidade de sequência. Exemplos úteis de identidades de sequência por cento incluem, mas não estão limitados a, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou qualquer porcentagem de número inteiro de 50% a 100%. Essas identidades podem ser determinadas usando qualquer um dos programas descritos neste documento.

Alinhamentos de sequência e identidade por cento ou cálculos de similaridade podem ser determinados usando uma variedade de métodos de comparação designados para detectarem sequências homólogas incluindo, mas não limitadas a, o programa MegAlign'" da suíte de computação de

PE bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Dentro do contexto | ' dessa aplicação será compreendido que, onde o software de análise de | sequência for usado para análise, os resultados da análise serão com base nos "valores padrão" do programa referenciado, a menos que de outra forma — especificado.

Conforme usado neste documento "valores padrão" significarão qualquer conjunto de valores ou parâmetros que carregam originalmente com o software quando primeiro inicializado. - O "método Clustal V de alinhamento" corresponde ao método de alinhamento marcado Clustal V (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5:151 - 153 (1989); Higgins, D.

G. et al. (1992) Comput.

Appl.

Biosci. 8:189-191) e é encontrado no programa MegAlignTY da suíte de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para alinhamentos múltiplos, os | valores padrão correspondem a GAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Os parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo de identidade por cento de sequências de proteínas usando o método Clustal são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para Ácidos nucleicos, esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW3=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após o alinhamento das sequências usando o programa Clustal V, é possível obter uma "identidade por cento" Visualizando a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.

O "método BLASTN de alinhamento" é um algoritmo fornecido pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) para comparar as sequências de nucleotídeos usando parâmetros padrão.

É bem compreendido por aquele versado na técnica que muitos —níveisde identidade de sequência são úteis na identificação de polipeptídeos, a partir de outras espécies, sendo que tais polipeptídeos têm a mesma ou similar função ou atividade.

Exemplos úteis de identidades por cento incluem, mas não estão limitados a, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%,

E A 3 ma o 41 ELE) ou qualquer porcentagem de número inteiro a de 50% a 100%. Certamente, : qualquer identidade de aminoácidos de número inteiro de 50% a 100% pode ser útil na descrição da presente invenção, como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 294%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Além disso, qualquer complemento parcial ou de tamanho completo desse fragmento de nucleotídeo isolado é de interesse. "Gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteina específica, incluindo sequências regulatórias precedendo (sequências de não-codificação 5') e seguindo (sequências de não-codificação 3) a sequência de codificação. "Gene nativo" refere-se a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências regulatórias. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo sequências de codificação e regulatórias que não são encontradas juntamente na natureza.

Assim sendo, um gene quimérico pode | compreender sequências regulatórias e sequências de codificação que são derivadas de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza.

Um gene "exógeno" refere-se a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas é introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferência gênica.

Genes : exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não- nativo, ou genes quiméricos.

Um "transgene" é um gene que foi introduzido no —genoma por meio de um procedimento de transformação.

O termo "genoma" conforme se aplica a células de planta abrange não somente DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, mas DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelulares (por exemplo,

tas mitocondrial, plastídio) da célula. . Um "gene otimizado por códon" é um gene que tem sua frequência de uso de códon designada para imitar a frequência de uso de códon preferencial da célula hospedeira.

Um "alelo" é uma das diversas formas alternativas de um gene ocupando a determinado locus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um determinado locus em um cromossomo são os mesmos da planta que é homozigota naquele locus. Se os alelos presentes em um determinado locus em um cromossomo diferirem daquela planta que heterozigota naquele locus.

"Sequência de codificação" refere-se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos específica. "Sequências regulatórias" referem-se a sequências de nucleotídeos localizadas à upstream (sequências de não-codificação 5'), dentro, ou à downstream (sequências de —não-codificação 3') de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, o processamento de RNA ou a estabilidade, ou a tradução da sequência de codificação associada. As sequências regulatórias podem incluir, mas não estão limitados a: promotores, sequências líder de tradução, introns, sequências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação de efetor e estruturas semicirculares (stem-loop).

"Promotor" refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. A sequência de promotor consiste em elementos à upstream proximais e mais distais, os últimos elementos chamados com frequências de intensificadores. Assim sendo, um "intensificador" é uma sequência de DNA que pode estimular a atividade de promotor, e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para intensificar o nível ou a especificidade de tecido de um promotor. Os promotores podem ser derivados integramente a

43 | q - Í "Pr partir de um gene nativo, ou serem compostos de elementos diferentes | . derivadas de promotores encontrados na natureza, ou compreenderem até mesmo segmentos de DNA sintéticos.

É compreendido por aqueles versados na técnica que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos diferentes ou tipos de célula, ou em estágios diferentes de desenvolvimento, ou em resposta às condições ambientais diferentes.

É reconhecido adicionalmente que tendo em vista que na maioria dos casos os limites exatos de sequências regulatórias não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de alguma variação podem ter atividade de promotor idêntica.

Promotores que fazem com que um gene seja expresso na maior parte dos tipos de célula na maioria das vezes são comumente chamados de “promotores constitutivos". Promotores recentes de diversos tipos úteis nas células de planta estão constantemente sendo revelados; exemplos numerosos podem ser encontrados na compilação por meio de Okamuro, J.

K, e Goldberg, R.

B.

Biochemistry of Plants 15:1 -82 (1989). "Sequência líder de tradução" referem-se a uma sequência de polinucleotídeos localizada entre a sequência de promotor de um gene e a sequência de codificação.

A sequência líder de tradução está presente no mMRNA completamente processado à upstream da sequência de início de tradução.

A sequência líder de tradução pode afetar o processamento da transcrição principal para mMRNA, estabilidade de mMRNA ou eficiência de tradução.

Os exemplos de sequências líder de tradução foram descritos (Turner, R. e Foster, G.

D., Mol.

Biotechnol. 3:225-236 (1995)). "Sequências de não-codificação 3"", "terminador de transcrição" —ou"sequências de terminação" referem-se a sequências de DNA localizadas à downstream de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação e outras sequências que codificam sinais regulatórios capazes de afetar o processamento de RNA ou a expressão

"ater gênica.

O sinal de poliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a , adição de tratos de ácido poliadenílico para a extremidade 3' do precursor de MRNA.

E o uso de sequências de não-codificação 3' diferentes é exemplificado por Ingelbrecht, |. L., et al.

Plant Cell 1 :671 -680 (1989). "Transcrição de RNA" refere-se ao produto resultante de transcrição catalizada por RNA polimerase de uma sequência de DNA.

Quando a transcrição de RNA é uma cópia complementar perfeita da sequência de DNA, é denominada de transcrição principal.

Uma transcrição de RNA é denominada de RNA maduro quando é uma sequência de RNA derivada de processamento pós-transcricional da transcrição principal. "RNA mensageiro" ou "mMRNA" refere-se ao RNA que é sem introns e que pode ser traduzido em proteína por meio da célula.

O "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar a, e sintetizado a partir de, um modelo de mRNA usando a enzima transcriptase reversa.

O cDNA pode ser de filamento único ou convertido na forma de filamento duplo usando o fragmento Klenow de DNA polimerase |. RNA "senso" refere-se à transcrição de RNA que inclui o mMRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. "RNA anti- senso" refere-se a uma transcrição de RNA que é complementar a toda ou parte de uma transcrição principal alvo ou mRNA, e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente Nº U.S. 5.107.065). A complementaridade de um RNA anti-senso pode ser com qualquer parte da transcrição gênica específica, isto é, na sequência de não-codificação 5', sequência de não-codificação 3', introns, ou na sequência de codificação. "RNA funcional" refere-se a RNA anti- senso, RNA ribozima, ou outro RNA que pode não ser traduzido, mas ainda tem um efeito nos processos celulares.

Os termos "complemento" e "complemento reverso" são usados de maneira intercambiável neste documento em relação a transcrições de mRNA, e são destinados a definir o RNA anti-senso da mensagem.

[EE ua.

O termo "ligado operativamente" refere-se à associação de . sequências de ácido nucleico em um fragmento de ácido nucleico único para que a função de um seja regulada pelo outro.

Por exemplo, um promotor é ligado operativamente com uma sequência de codificação quando é capaz de regular a expressão daquela sequência de codificação (isto é, a sequência de codificação está sob o controle transcricional do promotor). Sequências de codificação podem ser ligadas operativamente a sequências regulatórias em uma orientação anti-senso ou senso.

Em outro exemplo, as regiões de RNA | complementares da invenção podem ser ligadas operativamente, direta ou | indiretamente, 5' ao MRNA alvo, ou 3' ao MRNA alvo, ou dentro do MRNA alvo, ou uma primeira região complementar é 5' e seu complemento é 3' ao MRNA alvo.

Técnicas clonagem molecular e DNA recombinante padrão usadas neste documento são bem conhecidas na técnica e são descritas de forma mais completa em Sambrook, J., Fritsch, E.

F. e Maniatis, T.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Métodos de transformação são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e são descritos abaixo. "PCR" ou "reação em cadeia da polimerase" é uma técnica para a síntese de quantidades grandes de segmentos de DNA específicos e consiste em uma série de ciclos repetitivos (Perkin Elmer Cetus Instruments, Nonwalk, CT). Tipicamente, o DNA de filamento duplo é desnaturado por calor, os dois primers complementares aos limites de 3' do segmento alvo são anelados à temperatura baixa e então entendidos a uma temperatura intermediária.

Um conjunto dessas três etapas consecutivas é denominado como um "ciclo". O termo "recombinante" refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos de sequência diferentemente separados, por exemplo, por meio de síntese química ou por meio da manipulação de segmentos isolados tos de ácidos nucleicos por meio de técnicas de engenharia genética.

. Os termos "plasmídio", "vetor" e "cassete" referem-se a um elemento cromossômico extra que transporta, com frequência, genes que não são parte do metabolismo central da célula, e usualmente na forma de fragmentos de DNA de filamento duplo circular. Tais elementos podem ser sequências de replicação de forma autônoma, sequências de integração de genoma, fago ou sequências de nucleotídeos, linear ou circular, de um DNA ou RNA de filamento duplo ou único, derivados de qualquer fonte, em que inúmeras sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em uma construção exclusiva que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e sequência de DNA para um produto de gene selecionado junto com a sequência não-traduzida 3' apropriada no interior de uma célula. "Cassete de transformação" refere-se a um vetor específico contendo um gene exógeno e tendo elementos além do gene exógeno que facilita a transformação de uma célula hospedeira particular. "Cassete de expressão" refere-se a um vetor específico contendo um gene exógeno e tendo elementos além do gene exógeno que permitem expressão intensificada daquele gene em um hospedeiro exógeno (isto é, para um fragmento discreto de ácido nucleico no interior do qual uma sequência de ácido nucleico ou fragmento pode ser movida.) Os termos "construção recombinante", "construção de expressão", "construção quimérica", "construção", e "construção de DNA recombinante" são usados de maneira intercambiável neste documento. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, por exemplo, sequências de codificação e regulatórias que | não são encontradas junto à natureza. Por exemplo, uma construção quimérica | | pode compreender sequências regulatórias e sequências de codificação que | são derivadas de fontes diferentes, ou sequências regulatórias e sequências de | | foro codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira . diferente do que daquela encontrada na natureza.

Tal construção pode ser usada por ela mesma ou pode ser usada em conjunto com um vetor.

Se um vetor for usado, então a escolha do vetor é dependente do método que será usado para transformar células hospedeiras conforme é bem conhecido por aqueles versados na técnica.

Por exemplo, um vetor de plasmídio pode ser usado.

O elemento versado na técnica está ciente dos elementos genéticos : que precisam estar presentes no vetor com a finalidade de transformar, selecionar e propagar, com êxito, células hospedeiras compreendendo quaisquer dos fragmentos de ácido nucleico isolados da invenção.

O elemento versado na técnica também reconhecerá que eventos de transformação independentes diferentes resultarão em padrões e níveis diferentes de expressão (Jones et a/., EMBO J. 4:2411 a 2418 (1985); De Almeida et al, Mol.

Gen.

Genetics 218:78-86 (1989)), e, desse modo, que eventos múltiplos devem ser triados com a finalidade de obter linhagens exibindo o padrão e nível desejado.

Tal triagem pode ser obtida por meio de análise de Southern de DNA, análise de Northern de expressão de mRNA, análise de imunotransferência de expressão de proteína, ou análise fenotípica, dentre outros.

O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-se à produção de um produto final funcional (por exemplo, um MRNA ou uma proteína [precursora ou madural]). O termo "introduzido" significa fornecer um ácido nucleico (por exemplo, construção de expressão) ou proteína no interior de uma célula. —Introduzido inclui a referência para a incorporação de um ácido nucleico em uma célula procariótica ou eucariótica onde o ácido nucleico pode ser | incorporado no genoma da célula, e inclui a referência para a provisão transiente de um ácido nucleico ou proteína para a célula.

Introduzido inclui a too referência para métodos de transformação transientes ou estáveis, bem como . cruzamento sexual.

Desse modo, "introduzido" no contexto de inserção de um fragmento de ácido nucleico (por exemplo, uma construção de DNA recombinante/construção de expressão) no interior de uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui a referência para a incorporação de um fragmento de ácido nucleico no interior de uma célula procariótica ou eucariótica onde o fragmento de ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídio, plastídio ou DNA mitocondrial), convertido em uma réplica autônoma, ou expresso de forma transiente (por exemplo, mRNA transfectado). Proteína "madura" refere-se a um polipeptídeo processado de forma pós-translacional (isto é, um do quaisquer dos pré- ou propeptídeos presentes no produto de tradução principal foram removidos). Proteína "precursora" refere-se ao produto principal de tradução de mMRNA (isto é, com pré-e propeptídeos ainda presentes). Pré- e propeptídeos podem ser, mas não estão limitados a sinais de localização intracelular. "Transformação estável" refere-se à transferência de um | fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro, incluindo tanto genoma nuclear quanto organetlar, resultando em herança | geneticamente estável.

Em contraste, "transformação transiente" refere-se à | transferência de um fragmento de ácido nucleico no interior do núcleo, ou organela contendo DNA, de um organismo hospedeiro resultando na expressão gênica sem integração ou herança estável.

Organismos hospedeiros contendo | os fragmentos de ácido nucleico transformados são denominados organismos "transgênicos". Conforme usado neste documento, "transgênico" refere-se a uma planta ou uma célula que compreende dentro de seu genoma um polipeptídeo heterólogo.

De preferência, o polipeptídeo heterólogo é integrado de forma | | too estável dentro do genoma para que o polinucleotídeo seja passado para . gerações sucessivas. O polipeptídeo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de uma construção de expressão. Transgênico é usado neste documento para incluir qualquer célula, linhagem de células, calos, tecido, parte de planta ou planta, o genótipo do qual foi alterado pela presença de ácido nucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexual a partir de transgênico inicial. O termo "transgênico" conforme usado neste documento não abrange a alteração do genoma (cromossomal ou extra- —cromosomal) por meio de métodos de cruzamento de planta convencionais ou por meio de eventos de ocorrência natural como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não-recombinante, transposição não-recombinante, ou mutação espontânea.

"Inibição anti-senso" refere-se às transcrições de produção de RNA anti-senso capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Co- supressão" refere-se à produção de transcrições de RNA senso capazes de suprimir a expressão de genes idênticos ou substancialmente similares exógenos ou endógenos (Patente Nº U.S. 5.231.020). Construções de co- supressão em plantas foram designadas previamente focando na expressão excessiva de uma sequência de ácido nucleico tendo homologia para um mMRNA endógeno, na orientação senso, que resulta na redução de todo o RNA que tem homologia para a sequência expressa excessivamente (Vaucheret et ! al., Plant J. 16:651-659 (1998); Gura, Nature 404:804-808 (2000)). A eficiência | como um todo desse fenômeno é baixa, e a extensão da redução de RNA é —amplamente variável. Estudo mais recente descreveu o uso de estruturas "em forma de grampo" que incorporam todas ou parte de uma sequência de codificação de MRNA em uma orientação complementar que resulta em uma estrutura “semicircular" potencial do RNA expresso (Publicação PCT Nº WO foro 99/53050, publicada em 21 de outubro de 1999; Publicação PCT Nº WO . 02/00904, publicada em 3 de janeiro de 2002). Isso aumenta a frequência de co-supressão nas plantas transgênicas recobertas. Outra variação descreve o uso de sequências virais de planta para direcionar a supressão, OU "silenciamento", de sequências de codificação de mRNA proximal (Publicação WO 98/36083, publicada em 20 de agosto de 1998). Ambos fenômenos de co- supressão não foram elucidados mecanisticamente, embora a evidência genética tenha começado a desemanharar essa situação complexa (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747 a 1757 (1998)).

O termo "oleaginoso(a)" refere-se àqueles organismos que tendem a armazenar sua fonte de energia na forma de lipídio (Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2º Ed., Plenum, 1980). Uma classe de plantas identificadas como oleaginosas é comumente denominada plantas "de semente oleaginosa". Exemplos de plantas de semente oleaginosa incluem, mas não estão limitados a: soja (Glycine e Soja sp.), linho (Linum sp.), semente de colza (Brassica sp.), milho, algodão, açafrão (Carthamus sp.) e girassol (Helianthus sp.).

Dentro de microorganismos oleaginosos o óleo celular ou teor de TAG segue, em geral, uma curva sigmóide, sendo que a concentração de lipídios aumenta até que alcance um máximo na última fase de crescimento antecipado estacionário ou logarítmico e então diminua gradualmente durante as últimas fases de morte e estacionária (Yongmanitchai e Ward, Appl. Environ. Microbiol. 57:419 a 25 (1991 )).

Também descritos nestes documentos estão os organismos —microbianos oleaginosos produzidos através dos métodos descritos neste documento. Isso inclui, portanto, bactérias, algas, musgo, euglenóides, fungos stramenopiles e levedura oleaginosos, compreendendo em seu genoma uma construção recombinante que incorpora um ácido nucleico isolado da presente

: 51 rar invenção. Adicionalmente, lipídios e óleos obtidos a partir desses organismos . oleaginosos, produtos obtidos a partir do processamento dos lipídios e óleo, o uso desses lipídios e óleo em alimentos, rações para animais ou em aplicações industriais e/ou o uso dos sub-produtos em alimentos ou rações para animais também são descritos. Microalgas oleaginosas também existem com a capacidade de produzirem teor de óleos de 20 a 50% de seu peso a seco total, especialmente sob condições de tensão (Hu et a/., 2008, Plant J 54:621 a 639). Exemplos de microalgas incluem, mas não estão limitados a Rhodomonas salina, Crypthecodinium cohnii, Chaetoceros lauderi, Pavlova pinguis, e Emiliania huxleyi. Existe atualmente grande interesse no uso de microalgas oleaginosas para produzir óleo para biocombustíveis, ou para uso como nutracêuticos ou cosméticos (Hu et a/., 2008, Plant J 54:621 a 639; Waltz, 2009, Nature Biotechnology 27: 15-18). A abordagem de genes de expressão excessiva em microalgas para melhorar a produção de óleo para aplicações de biocombustíveis está sendo explorada (Waltz, 2009, Nature Biotchnology 27:15 a 18).

O termo "levedura oleaginosa" refere-se àqueles microorganismos classificados como leveduras que produzem óleo. Não é incomum para microorganismos oleaginosos acumular em excesso de cerca de 25% do seu peso da célula seca como óleo. Exemplos de levedura oleaginosa incluem, mas não são limitados a, os seguintes gêneros: Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococeus, Trichosporon e Lipomyces.

O termo "planta" refere-se às plantas inteiras, órgãos de planta, tecido de planta, sementes, células de planta, sementes e progênie das —mesmas. Células de planta incluem, sem limitação, células de sementes, culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raízes, galhos, gametófitos, esporófitos, pólen e micro esporos.

"Progênie" compreende qualquer geração subsequente de uma

| Pa o oi o oi oi a Do oi Di Doi o oi Doo oi Do o o o o o a a NE o | : 52 . - .

rr planta.

. "Semente de soja não transgênica, segregante nulo" refere-se a uma planta isogênica próxima ou semente que carece do transgene, e/ou uma planta parental usada no processo de transformação para obter o evento transgênico. Segregantes nulos podem ser plantas ou sementes que não contém o traço transgênico devido à segregação genética normal durante a propagação das plantas transgênicas heterozigotas.

Uma "cariopse" (kernel) é a cariopse de milho, consistindo em um embrião maduro e endosperma que são produtos de dupla fertilização. O termo "milho em grão" ou "milho verde" representa qualquer variedade, cultivo, ou população de Zea mays L.

"Grão" compreende cariopses (Kernels) de milho maduras produzidas por produtores comerciais para uso em fazenda ou para venda aos consumidores em ambos os casos para fins que não o crescimento ou reprodução de espécies. A "semente" é a cariopse (Kernel) de milho maduro produzido para a finalidade de propagar as espécies e para venda aos produtores comerciais. Conforme usado neste documento os termos sementes, cariopses (Kernels), e grãos podem ser usados de maneira intercambiável. O "embrião" ou o também chamado "germe" é uma planta esporofítica jovem, —antesdo início de um período de crescimento rápido (germinação da semente). O embrião (germe) do milho contém a vasta maioria do óleo encontrado na cariopse (Kernel). A estrutura do embrião no grão do cereal inclui o eixo embriônico e o escutelo. O "escutelo" é a folha embriônica única de um embrião de grão de cereal, especializado para a absorção do endosperma. À "aleurona' é um material proteináceo, usualmente na forma de pequenos grânulos, ocorrendo na camada da célula mais externa do endosperma do milho e outros grãos.

A presente invenção é concernente a uma semente de soja

. 53 | ta transgênica tendo teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% . quando comparado ao teor de ácido graxo total de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Compreende-se que qualquer aumento mensurável no teor de ácido graxo total de um transgênico versus um não- transgênico, segregante nulo seria útil.

Tais aumentos no teor de ácido graxo total incluiriam, mas não estão limitados a, pelo menos 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ou 20%. Uma semente oleaginosa transgênica da invenção pode compreender uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT.

Esta sequência de DGAT pode ser selecionada do grupo consistindo em DGAT1, DGAT?2 e DGAT1 em combinação com DGATZ2. Além disso, pelo menos uma sequência de DGAT pode ser de Yarrowia.

Exemplos das sequências de DGAT adequadas que podem ser usados para praticar a invenção são discutidos nos Exemplos abaixo.

Podem ser mencionados os Números de Identificação de Sequência (SEQ ID NOs): 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 278, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350, 352, ou 362 na presente invenção.

Aqueles versados na técnica compreenderão que a presente invenção inclui, mas não esta limitada, as sequências de DGAT divulgadas aqui.

Tal promotor de construção recombinante compreenderia diferentes componentes tais como um promotor que é uma sequência de DNA | que direciona o maquinário celular de uma planta para produzir RNA a partir da | sequência de codificação contígua a downstream (3!) do promotor.

A região do promotor influencia a taxa, estágio de desenvolvimento, e tipo de célula em que otranscrito de RNA do gene é feito.

O transcrito de RNA é processado para produzir mRNA o qual serve como um modelo para a tradução da Sequência de RNA para a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado.

A | sequência líder não-traduzida 5' é uma região do mMRNA a upstream da região o tao de codificação da proteína que pode desempenhar uma função na iniciação e . tradução do mRNA. O sinal de término/poliadenilação da transcrição 3' é uma região não-traduzida a downstream da região de codificação da proteína que funciona na célula da planta para causar o término do transcrito de RNA e a —adiçãodos nucleotídeos poliadenilados para a extremidade 3' do RNA.

A origem do promotor escolhido para acionar a expressão da sequência de codificação de DGAT não é importante desde que tenha atividade transcricional suficiente para efetuar a invenção pela expressão do mMRNA traduzível para os fragmentos de ácido nucleico desejáveis no tecido hospedeiro desejado no momento certo. Tanto promotores heterológos ou não- heterólogos (isto é, endógenos) podem ser usados para praticar a invenção. Por exemplo, promotores adequados incluem, mas não estão limitados a: a subunidade principal alfa do promotor de conglicinina beta, o promotor do inibidor 3 de tripsina Kunitz, o promotor de anexina, o promotor de GY1 de glicinina, a subunidade beta do promotor de conglicinina beta, o promotor P34/Gly Bd m 30K, o promotor de albumina, o promotor Leg A1 e o promotor Leg A2.

O promotor de anexina, ou P34, é descrito na Publicação PCT Nº WO 2004/07 1178 (publicado em 26 de agosto de 2004). O nível da atividade do promotor de anexina é comparável àquele de muitos promotores fortes conhecidos, tais como: (1 ) o promotor CaMV 35S (Atanassova et al., Plant Mol. Biol. 37:275 a 285 (1998); Battraw and Hall, Plant Mol. Biol. 15:527 a 538 (1990); Holtorf et a/., Plant Mol. Biol. 29:637 a 646 (1995); Jefferson et al. EMBO J. 6:3901 a 3907 (1987); Wilmink et a/., Plant Mol. Biol. 28:949 a 955 (1995)); (2) os promotores de oleosina Arabidopsis (Plant et a/., Plant Mol. Biol. 25:193 a 205 (1994); Li, Texas A&M University Ph.D. dissertation, páginas 107 a 128 (1997)); (3) os promotores da proteina de extensão de ubiquitina Arabidopsis (Callis et a/., J Biol. Chem. 265(21 ):12486 a 93 (1990)); (4) um |

: 55 LN promotor do gene de ubiquitina de tomate (Rollfinke et al., Gene. 211 (2):267 a | - 76 (1998)); (5) um promotor de proteína de choque térmico de soja (Schoffl et | al., Mol Gen Genet. 217(2 a 3):246 a 53 (1989)); e, (6) um promotor do gene de | histona de milho verde H3 (Atanassova et al., Plant Mol Biol. 37(2):275 a 85 | 5 (1989). Outra característica útil do promotor de anexina é seu perfil de expressão nas sementes em desenvolvimento.

O promotor de anexina é o mais ativo nas sementes em desenvolvimento nos primeiros estágios (antes de 10 dias após a polinação) e é predominantemente inativo nos últimos estágios.

Oo perfil de expressão do promotor de anexina é diferente daquele de muitos promotores de semente específica, por exemplo, promotores da proteína de armazenamento da semente, que frequentemente fornecem a atividade mais alta nos últimos estágios de desenvolvimento (Chen et a/., Dev.

Genet. 10:112 a 122 (1989); Ellerstrom et al., Plant Mol.

Biol. 32:1019 a 1027 (1996); Keddie etal, Plant Mol.

Biol. 24:327 a 340 (1994); Plant et a/., (supra); Li, (supra)). O promotor de anexina tem um perfil de expressão mais convencional mas permanece distinto de outros promotores específicos de semente conhecidos.

Desse modo, o promotor de anexina será um candidato muito atraente quando a super-expressão, ou supressão, de um gene nos embriões for desejada em uma estágio de desenvolvimento inicial.

Por exemplo, pode ser desejável | super-expressar um gene regulando o desenvolvimento inicial do embrião ou um gene envolvido no metabolismo antes da maturação da semente.

Após a identificação de um promotor apropriado adequado para a expressão de uma sequência de codificação de DGAT específico, o promotor é então operativamente ligado em uma orientação de sentido usando meios ! convencionais bem conhecidos por aqueles versados na técnica. | O DNA recombinante e técnicas de clonagem moleculares padrão | usados neste documento são bem conhecidos na técnica e são descritos mais i 56 MASEA completamente em Sambrook, J. ef al., In Molecular Cloning: A Laboratory - Manual; 2º edição.; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (doravante "Sambrook et a/., 1989" ) ou Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K,, Eds; ln Current Protocols in Molecular Biology; John Wiley and Sons: New York, 1990 (doravante "Ausubel et a/., 1990").

Em outro aspecto, essa invenção refere-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Uma vez que a construção recombinante estiver feita, esta pode ser então introduzida em uma célula de planta de escolha pelos métodos bem conhecidos por aqueles versados na técnica (por exemplo, transfecção, transformação e eletroporação). As células da planta de semente oleaginosa são as células de plantas preferidas. A célula de planta transformada é então cultivada e regenerada sob condições adequadas permitindo a seleção daquelas célula(s) de soja transformadas tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Tais construções recombinantes podem ser introduzidas em uma célula de planta; ou, alternativamente, cada construção pode ser introduzida em células de plantas separadas.

A expressão em uma célula de planta pode ser efetuada de um | modo transiente ou estável como é descrito acima. Também dentro do escopo |

Ps, dessa invenção estão as sementes ou partes de planta obtidas de tais plantas . transformadas. | Partes da planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados incluindo, entre outros, os seguintes: raízes, caules, galhos, folhas, pólen, sementes, tecido de tumor e várias formas das células e cultura (por exemplo, células únicas, protoplastos, embriões e tecido de calo). O tecido da planta pode estar na planta ou em um órgão, tecido ou cultura de célula da planta.

O termo "órgão da planta" refere-se ao tecido da planta ou um grupo de tecidos que constituem uma parte morfologicamente e funcionalmente distinta de uma planta. O termo "genoma" refere-se ao seguinte: (1) o complemento inteiro do material genético (genes e sequências de não- codificação) que está presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; e/ou (2) um conjunto completo de cromossomos herdados como uma unidade (haplóide) de um pai. Métodos para transformação de dicotiledôneas (principalmente * — pelo uso de Agrobacterium tumefaciens) e obtenção de plantas transgênicas foram publicados, entre outros, para: algodão (Patente nº US 5.004.863; Patente nº US 5.159.135); soja (Patente nº US 5.569.834; Patente nº US

5.416.011); Brassica (Patente nº US 5.463.174); amendoim (Cheng et a/. Plant Cell Rep. 15:653 a 657 (1996); McKently et al. Plant Cell Rep. 14:699 a 703 (1995)); papaia (Ling, K. et a/. Bio/ftechnology 9:752 a 758 (1991 )); e ervilha (Grant et al. Plant Cell Rep. 15:254 a 258 (1995)). Para uma revisão de outros métodos de transformação de planta comumente usados ver Newell, CA. (Mol. —Biotechnol. 16:53 a 65 (2000)) Um destes métodos de transformação usa Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, M. and Casse-Delbart, F. Microbiol. Sci. 4:24 a 28 (1987)). A transformação da soja usando a entrega direta do DNA foi publicada usando a fusão de PEG (Publicação PCT Nº WO 92/17598),

tor eletroporação (Chowrira, G.

M. et al, Mol.

Biotechnol. 3:17 a 23 (1995); : Chhstou, P. et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

U.S.A. 84:3.962 a 3.966 (1987)), microinjeção e bombardeio de partícula (McCabe, D.

E. et. al., Bio/Technology 6:923 (1988); Chhstou et a/., Plant Physiol. 87:671 a 674 (1988)). Existe uma variedade de métodos para a regeneração de plantas a partir do tecido da planta.

O método de regeneração particular dependerá do tecido da planta de partida e das espécies de planta particulares a serem regeneradas.

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir dos transformantes de protoplasto de planta únicos ou a partir de várias explantas transformadas é bem conhecida na técnica (Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic: San Diego, CA (1988)). Este processo de regeneração e crescimento tipicamente inclui as etapas de seleção das células transformadas e cultivo daquelas células individualizadas através dos estágios usuais do desenvolvimento embriônico através do estágio de plantas pequenas enraizadas.

Embriões e sementes transgênicos são similarmente regenerados.

Os galhos enraizados transgênicos resultantes são então plantados em um meio de crescimento de planta apropriado tal como solo.

De preferência, as plantas regeneradas são auto-polinadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas.

De outra forma, o pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado para plantas de crescimento por semente de linhagens agronomicamente importantes.

De modo oposto, o pólen das plantas dessas linhagens importantes é usado para polinar plantas regeneradas.

Uma planta transgênica da presente invenção contendo um polipeptídeo desejado é cultivada usando os métodos bem conhecidos a uma pessoa versada na técnica. i Além dos procedimentos acima discutidos, praticantes são familiares com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para: a construção, manipulação e isolamento de

Pra macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.); a geração . dos fragmentos de DNA recombinantes e construções de expressão recombinante; e, a triagem e isolamento de clones.

Ver, por exemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: | NY (1989); Maliga et al, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring | Harbor: NY (1995); Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, VoM, | Cold Spring Harbor: NY (1998); Birren et a/., Genome Analysis: Analyzing DNA, Vol.2, Cold Spring Harbor: NY (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, editores.

Clark, Springer: NY (1997). Exemplos de plantas de semente oleaginosas incluem, mas não estão limitados a: soja, espécies Brassica, girassol, milho verde, algodão, linho e açafrão.

Em outro aspecto, essa invenção refere-se a um grão de milho transgênico que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de um grão de milho segregante nulo, não-transgênico.

Tal grão de milho transgênico pode compreender uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT.

Esta sequência de DGAT pode ser selecionada do grupo consistindo em DGAT1, DGAT2, ou DGAT1 em combinação com DGAT2. Ainda em outro aspecto, a presente invenção é concernente a um método para aumentar o teor de ácido graxo total de um grão de milho compreendendo: (a) transformar pelo menos um grão de milho com uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar o(s) grão(s) de milho transformado(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% quando comparado ao teor de ácido graxo total de um grão de milho segregante nulo, não-transgênico. | rr A presente invenção também refere-se a uma semente de soja ' transgênica que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

E a presente invenção ainda refere-se a um soja transgênico que tem teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e pelo menos qualquer um de i) um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25%; ii) um teor de ácido linolênico diminuído de pelo menos 25%; iii) um teor de ácido linoleico diminuído de pelo menos 4%; iv) um teor de ácido palmítico diminuído de pelo menos 8%; e v) um teor de ácido esteárico diminuído de pelo menos 14% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ácido oleico, ácido linolênico, ácido linoleico, ácido palmítico ou ácido esteárico, respectivamente, teor de uma semente de soja não segregante, não transgênica.

Ainda em um aspecto adicional, a presente invenção também refere-se a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido oleico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido oleico aumentado de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico da semente de soja não segregante e não transgênica.

Ainda, em um aspecto adicional, a presente invenção é concernente a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e diminuir o teor de ácido linolênico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma | tos construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; : (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido linolênico diminuído de pelo menos 25% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Ainda, outra vez, em um aspecto adicional, a presente invenção é concernente a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e diminuir o teor de ácido linoleico de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido linoleico diminuído de pelo menos 4% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Outra vez em um aspecto adicional, a presente invenção é concernente a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido palmítico diminuído de uma semente de soja compreendendo: (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido palmítico diminuído de pelo menos 8% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica.

Ainda, em outro aspecto, a presente invenção é concernente a um método para aumentar o teor de ácido graxo total e o teor de ácido esteárico de

Ts uma semente de soja compreendendo: . (a) transformar pelo menos uma célula de soja com uma construção recombinante que tem pelo menos uma sequência de DGAT; (b) selecionar a(s) célula(s) de soja transformada(s) da etapa (a) tendo um teor de ácido graxo total aumentado de pelo menos 10% e um teor de ácido esteárico diminuído de pelo menos 14% quando comparado ao teor de ácido graxo total e ao teor de ácido oleico de uma semente de soja não segregante e não transgênica. Como foi discutido acima, qualquer das sementes oleaginosas transgênicas discutidas aqui pode compreender uma construção recombinante tendo pelo menos uma sequência de DGAT. Esta sequência de DGAT pode ser selecionada do grupo consistindo em DGAT1, DGAT2, ou DGAT1I em combinação com DGAT?2. Além disso, pelo menos uma sequência de DGAT é da Yarrowia.

A transformação das monocotiledôneas usando a eletroporação, bombardeio de partícula, e Agrobacterium foi relatada. A transformação e regeneração da planta foram atingidas em aspargos (Bytebier et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:5.354, (1987)); cevada (Wan and Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)); Zea mays (Rhodes et al., Science 240:204 (1988), Gordon- Kammetal, Plant Cell 2:603 a 618 (1990), Fromm et a/., BioITechnology 8:833 (1990), Koziel et a/., BioITechnology 11:194, (1993), Armstrong et al., Crop Science 35:550 a 557 (1995)); aveia (Somers et a/., BioITechnology 10: 15 a 89 (1992)); dátilo (Horn et a/., Plant Cell Rep. 7:469 (1988)); arroz (Toriyama et al., TheorAppl. Genet. 205:34, (1986); Part et a/., Plant Mol. Biol. 32:1.135 a 1.148, (1996); Abedinia et al, Aust. J. Plant Physiol. 24:133 a 141 (1997); Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835 (1988); Zhang et a/. Plant Cell Rep. 7:379, (1988); Battrav and Hall, Plant Sci. 86:191 a 202 (1992); Christou et al, Bio/Technology 9:957 (1991 )); centeio (De la Pena et al/., Nature 325:274

“Ta (1987)); cana de açúcar (Bower and Birch, Plant J. 2:409 (1992)); festuca . (Wang et al, BiolTechnology 10:691 (1992)), e trigo (Vasil et al, Bio/Technology 10:667 (1992); Patente nº US 5.631.152).

Ensaios para a expressão gênica com base na expressão transiente das construções de ácido nucleico clonados foram desenvolvidas pela introdução das moléculas de ácido nucleico nas células de plantas pelo tratamento com polietileno glicol, eletroporação, ou bombardeio de partícula (Marcotte ef a/., Nature 335:454 a 457 (1988); Marcotte et a/., Pant Cell 1 :523 a 532 (1989); McCarty et a/., Cell 66:895 a 905 (1991 ); Hattori et al., Genes Dev 6:609 a618 (1992); Goff et al., EMBO J. 9:2517 a 2522 (1990)).

Sistemas de expressão transientes podem ser usados para funcionalmente dissecar as construções do gene (ver em geral, Maliga et al,, Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)). Compreende-se que qualquer das moléculas de ácido nucleico da presente invenção pode ser introduzida em uma célula de planta de uma maneira permanente ou transiente em combinação com outros elementos genéticos tais como vetores, promotores, intensificadores etc.

Além dos procedimentos discutidos acima, praticantes são familiares com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos específicos e para a construção, manipulação e isolamento das macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídios, etc.), geração dos organismos recombinantes e a triagem e isolamento dos clones, (ver por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et a/., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et a/l., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, New York (1998); Birren et al, Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, New York (1998); Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, editores. Clark, Springer, New York o. - . oo (1997)). : As sementes oleaginosas transgênicas da invenção podem ser processadas para produzir óleo, produtos de proteína e/ou sub-produtos que são derivados obtidos pelo processamento que tem valor comercial. Um | 5 exemplo, de muitos, útil para ilustrar este ponto são as sementes de soja transgênicas da invenção que podem ser processadas para produzir óleo de soja, produtos de soja e/ou sub-produtos de seja. "Produtos de soja" podem incluir, mas não estão limitados a, aqueles itens listados na Tabela 1A. TABELA 1A PRODUTOS DE PROTEÍNA DE SOJA DERIVADOS DE SEMENTES DE SOJA?

RR Alimentos/Ingredientes de Soja | Proteína Isolada da Soja Especializados Juss Teoncenvados Texuizados = | | Proteina vegeta Harorisaga | | Proteína Espumante *Ver Soy Proteins Products: Characteristics, Nutritional Aspects and Utilization (1987). Soy Protein Council.

tes "Processamento" refere-se a qualquer método físico e químico . usado para obter os produtos listados na Tabela 1A e inclui, mas não está limitado a, condicionamento térmico, floculação e moagem, extrusão, extração | de solvente, ou absorção aquosa e extração de sementes inteiras ou parciais. | Além disso, "processamento" inclui os métodos usados para concentrar e isolar | a proteina da soja das sementes inteiras ou parciais, bem como os vários métodos Orientais tradicionais na preparação de produtos alimentícios de soja fermentados. Padrões e Especificações de Comérico foram estabelecidos para muitos desses produtos (ver National Oilseed Processors Association Yearbook and Trading Rules 1991 a1992). Os produtos referidos como sendo "alta proteína" ou "baixa proteína" são aqueles como descritos por estas Especificações Padrão. "NSI" refere-se ao Índice de Solubilidade do Nitrogênio conforme definido pelo Método Ac4 41 da American Oil Chemists' Society. "Solubilidade do Nitrogênio em KOH" é um indicador da qualidade da farinha dosojae refere-se à quantidade de nitrogênio solúvel em 0.036 M KOH sob as condições como descrito por Araba and Dale [(1990) Poult. Sci. 69:76 a 83]. Flocos "brancos" referem-se aos colilédones em flocos, descascados que foram desengordurados e tratados com calor úmido controlado para ter uma NS! de cerca de 85 a 90. Este termo também pode se referir a uma farinha com uma NSI semelhante que foi moída para passar através de um tamanho de Peneira do Padrão U.S. No. 100. "Cozido" refere-se ao produto da proteína da soja, tipicamente uma farinha, com uma NSI de aproximadamente 20 a 60. "Torrado" refere-se ao produto da proteina da soja, tipicamente uma farinha, com um NSI abaixo de 20. "Milho Granulado" (grits) refere-se a folhas —embriônicas, descascadas, desengorduradas que têm uma medida padrão de tela entre os nº 10 e 80. "Concentrados da Proteína da soja" refere-se àqueles produtos produzidos a partir dos grãos de soja descascados, sem gordura por três processos básicos: lixiviação ácida (a aproximadamente pH 4.5), extração

D

' | tes com álcool (aproximadamente 55-80%), e desnaturação da proteína com calor úmido antes da extração com água. As condições tipicamente usadas para preparar os concentrados da proteína da soja foram descritas por Pass [(1975) Patente nº US 3.897.574; Campbell et a/., (1985) em New Protein Foods, editores Altschul and Wilcke, Academic Press, Volume 5, Capítulo 10, Seed Storage Proteins, páginas 302 a 338]. "Extrusão" refere-se aos processos por meio dos quais o material (milhos granutados, farinha ou concentrado) é passado através de uma verruma encapada usando altas pressões e temperaturas como um meio de alterar a textura do material. "Texturização" e "estruturação" refere-se aos processos de extrusão usados para modificar as características físicas do material. As características destes processos, incluindo a extrusão termoplástica, foram descritas anteriormente [Atkinson (1970) Patente US 3.488.770, Horan (1985) In New Protein Foods, editores: Altschul and Wilcke, Academic Press, volume 1A, capítulo 8, páginas 367 a 414). Além disso, as condições usadas durante o processamento da extrusão das misturas alimentícias complexas que incluem os produtos da proteina da soja foram descritas anteriormente [Rokey (1983) Feed Manufacturing Technology Ill, 222 a 237; McCulloch, Patente nº US 4.454.804]. TABELA 1B

ETAPAS GENERALIZADAS PARA ÓLEO DE SOJA E PRODUÇÃO DE SUBPRODUTO Etapa do Processo Impurezas Removidas e/ou Processo Subprodutos Obtidos e semente de sola [| es pegomagem =| restma === refinamento alcalino ou físico gomas, ácidos graxos livres, pigmentos e Branqueamento | corsapão metal | ae fhidrogenação) e interização — | eseaina =| O Desodorização — | — ácidosgraxoslivres, =— | i Processo Subprodutos Obtidos o tocoferóis, esteróis, voláteis | nero Produtos do6lea Mais especificamente, as sementes de soja são limpas, misturadas, descascadas e lascadas, por meio disso aumentando a eficiência | de extração do óleo.

A extração do óleo é usualmente realizada pela extração de solvente (por exemplo, hexano), mas também pode ser atingida através de uma combinação de pressão física e/ou extração de solvente.

O óleo resultante é denominado óleo cru.

O óleo cru pode ser degomado através da hidratação de fosfolipideos e de outros complexos de lipídeos neutros ou polares que facilita sua separação da fração de triglicerídeo não hidratada (óleo de soja). As gomas de lecitina resultantes podem ser processadas adicionalmente para produzir produtos de licitihna comercialmente importantes usados em uma variedade de produtos industriais e alimentícios como agentes de liberação e de emulsificação (isto é, antiaderentes). O óleo degumado pode ser refinado adicionalmente para a remoção de impurezas (primeiramente dos ácidos graxos livres, pigmentos e gomas residuais). O refino é realizado pela adição de um agente cáustico que reage com ácido graxo livre para formar sabão e hidrata fosfatídeos e proteínas no óleo cru.

A água é usada para lavar vestígios de sabão formados durante o refino.

O subproduto de borra pode ser usado diretamente em rações animais ou acidulados para recuperar os ácidos graxos livres.

A cor é removida pela adsorção com uma terra de branqueamento que remove a maior parte dos compostos de clorofila e de carotenóide.

O óleo refinado pode ser hidrogenado, por meio disso resultando em gorduras com várias texturas e propriedades de derretimento.

A Winterização (fracionamento) pode ser usada para remover estearina do óleo hidrogenado através da cristalização sob condições de resfriamento cuidadosamente controladas.

A —desodorização (principalmente via destilação a vapor sob vácuo) é a última

Teo etapa e é elaborada para remover compostos que conferem odor ou sabor ao : óleo. Outros subprodutos valiosos como tocoferóis e esteróis podem ser removidos durante o processo de desodorização. Os destilados desodorizados contendo esses subprodutos podem ser vendidos para a produção de vitamina E naturale outros produtos farmacêuticos de alto valor. As gorduras e óleos refinados, branqueados, (hidrogenados, fracionados) e desodorizados podem ser embalados e vendidos diretamente ou processados adicionalmente em produtos mais especializados. Uma referência mais detalhada para o processamento de óleo de soja, produção de óleo de soja e utilização de subproduto pode ser encontrada em Erickson, Practical Handbook of Soybean Processing and Utilization, The American Oil Chemists' Society and United Soybean Board (1995). O óleo de soja é líquido à temperatura ambiente porque este é relativamente baixo em ácidos graxos saturados quando comparado com óleos como côco, palma, palmiste e manteiga de cacau.

Os óleos microbianos e vegetais contendo PUFAs que foram | refinados e/ou purificados podem ser hidrogenados, por meio disso resultando em gorduras com várias texturas e propriedades de fusão. Muitas gorduras processadas (incluindo pastas, gorduras de confeitaria, manteigas duras, margarinas, gorduras vegetais para panificação, etc.) exigem graus de variação de consistência à temperatura ambiente e somente podem ser produzidas pela alteração das propriedades físicas do óleo de origem. Isso é mais comumente atingido através de hidrogenação catalítica.

A hidrogenação é uma reação química na qual hidrogênio é adicionado às ligações duplas de ácido graxo insaturado com a ajuda de um catalisador como o níquel. Por exemplo, óleo de soja com alto teor oleico contém ácidos graxos insaturados linolênicos oleicos, e cada um desses pode ser hidrogenado. A hidrogenação tem dois efeitos primordiais. Primeiro, a estabilidade oxidativa do óleo é aumentada como um resultado da redução do

| 69 | as teor de ácido graxo insaturado. Segundo, as propriedades físicas do óleo são : alteradas devido ao fato de que as modificações de ácido graxo aumentam o ponto de fusão resultando em uma gordura semi-líquida ou sólida à temperatura ambiente.

Existem inúmeras variações que afetam a reação de hidrogenação, que, por sua vez, altera a composição do produto final. As condições de operação que incluem pressão, temperatura, concentração e tipo de catalisador, agitação e projeto de reação estão entre os parâmetros mais importantes que podem ser controlados. As condições de hidrogenação seletiva podem ser usadas para hidrogenar os ácidos graxos mais insaturados em preferência àqueles menos insaturados. Uma hidrogenação muito leve ou brusca é frequentemente empregada para aumentar a estabilidade de óleos líquidos. A hidrogenação converte adicionalmente um óleo líquido em uma gordura fisicamente sólida.

| 15 O grau de hidrogenação depende das características de | desempenho e fusão desejadas para o produto final particular. As gorduras | vegetais líquidas (usadas na fabricação de produtos de panificação, gorduras sólidas e gorduras vegetais usadas para operações comerciais de assadura e fritura) e estoques de base para a fabricação de margarina estão entre a miríade de produtos de óleo e gordura possíveis alcançados através da hidrogenação. Uma descrição mais detalhada da hidrogenação e dos produtos hidrogenados pode ser encontrada em Patterson, H. B. W,, Hidrogenation of Fats and Oils: Theory and Practice. The American Oil Chemists' Society (1994).

Os óleos hidrogenados se tornaram controversos de certa maneira, devido à presença de isômeros de ácido graxo trans que resultam do processo de hidrogenação. A ingestão de grande quantidade de isômeros trans está ligada a efeitos prejudiciais à saúde incluindo taxas elevadas de

"rar lipoproteínas de baixa densidade até de alta densidade no plasma sanguíneo e . um risco elevado de doença coronária.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um polinucleotídeo isolado que compreende: (a) uma sequência de nucleotídeo que encodifica um polipeptídeo que tem atividade da diacilglicerol aciltransferase em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% de identidade de aminoácido, com base no método de alinhamento Clustal V, quando comparada a uma sequência de aminoácido conforme apresentada em SEQ ID NO: 135, 136, 147, 162, 176, 215, 234, 255, 265,272,299,304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318 ou 320; (b) uma sequência de nucleotídeo que encodifica um polipeptídeo que tem atividade da diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeo tem pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método de alinhamento BLASTN, quando comparada a uma sequência de —nucleotídeo conforme apresentada em SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 350 ou 362; (c) uma sequência de nucleotídeo que encodiífica um polipeptídeo que tem atividade da diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de —nucleotídeo se hibridiza sob condições estringentes em relação a uma sequência de nucleotídeo conforme apresentada em SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 350 ou 362; ou (d) um complemento da sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou | (c),em que o complemento e a sequência de nucleotídeo consistem no mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementários. | Em um aspecto relacionado, a presente invenção refere-se a um | polinucleotídeo isolado que compreende: | are (a) uma sequência de nucleotídeo que encodifica um polipeptídeo . que tem atividade da diacilglicerol aciltransferase em que o polipeptídeo é apresentado em SEQ ID NO:135, 136, 147, 162, 176, 215, 234, 255, 265, 272, 299, 304,306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 351 ou 363; (b) uma sequência de nucleotídeo que encodifica um polipeptídeo que tem atividade da diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeo é apresentada em SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 298, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 319, 350 ou 362; ou (c) um complemento da sequência de nucleotídeo de (a) ou (b) em que o complemento e a sequência de nucleotídeo consiste no mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementários.

Ainda, o polinucleotídeo isolado supracitado que encodifica uma DGAT pode ser obtido de um ou mais organismo oleaginoso.

Esses organismos oleaginosos podem ser, mas não são limitados a, Torulaspora delbruecíkii, Pichia anomala, Debaryomyces hansenii, Candida zeylanoides, Lipomyces starkeyi, Mucor circinelloides, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula | glutinis, Cryptococcus curvatus e Mortierella alpina.

Uma construção de DNA recombinante que compreende o fragmento de ácido nucleico isolado que encodifica a diacilglicerol aciltransferase pode ser ligada operativamente a pelo menos uma sequência regulatória, e pode ser incorporada em uma célula.

A célula pode ser um vegetal de semente oleaginosa.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção refere-se a um método para o aumento do teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa que compreende: (a) transformar pelo menos uma célula de semente oleaginosa com a construção recombinante mencionada acima;

"ao (b) selecionar a(s) célula(s) de semente oleaginosa transformada : da etapa (a) que tem um teor total aumentado de ácido graxo quando comparado ao teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa não segregante e não transgênica.

Em um aspecto final, a presente invenção refere-se a uma célula fúngica ou a um organismo microbiano oleaginoso, que compreende Uma construção de DNA recombinante que compreende qualquer fragmento de ácido nucleico isolado que encodifica qualquer diacilglicerol aciltransferase da presente invenção. Ainda, a célula fúngica pode ser, mas não é limitada a, Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporidium, Cryptococcus, Trichosporon e Lipomyces.

EXEMPLOS A presente invenção é definida adicionalmente nos seguintes exemplos, nos quais partes e porcentagens são por peso e graus são Celsius, salvo se especificado de outra maneira. Deve ser compreendido que esses exemplos, quando indicando modalidades preferenciais da invenção, são dados somente a título de ilustração. A partir da discussão acima e desses exemplos, um elemento versado na técnica pode avaliar as características essenciais dessa invenção e, sem se afastar do espírito e do âmbito da mesma, pode realizar várias alterações e modificações da invenção para adaptá-la aos vários usos e condições. Assim, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas no presente documento se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são destinadas a se incluíem no âmbito das reivindicações em anexo.

O significado das abreviações é conforme a seguir: "s" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "ul" significa microlitro(s), "ml" significa mililitro(s), "I" significa litro(s), "uM"

toa significa micromolar, "mM" significa millimolar, "M" significa molar, "mmol" . significa millimol(s), "umol" significa micromol(s), "g" significa grama(s), "ug" significa micrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp" significa par(es) de base e "kB" significa quilobase(s). EXEMPLO 1

EXPRESSÃO DOS GENES DGAT DE YARROWIA LIPOLYTICA EM SACCHAROMYCES

CEREVISIAE O gene DGAT1 (SEQ ID NO:1) de Yarrowia lipolytica foi excisado do vetor de plasmídeo pYDA1 (SEQ ID NO:2) pela digestão de restrição com Ncol e Notfl. As extremidades do fragmento de DNA foram completamente preenchidas com o uso de T4 DNA polimerase (Promega, Madison, WI, EUA) e ligadas no único sítio Notl de pY75 (SEQ ID NO:3). Antes de seu uso para clonagem, o vetor pY75 foi linearizado com Notl, preenchido com T4 DNA polimerase e desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão (NEB, Beverly, MA, EUA). O DNA plasmídeo foi isolado com o uso de técnicas padrão e as digestões de restrição com EcoRI foram conduzidas para identificar clones plasmídeos nos quais o códon de iniciação estava próximo à extremidade 3' do promotor GPD em pY75 (orientação de sentido do gene DGAT1). Esse plasmídeo de agora em diante terá a referência de pY75 YL DGAT1 (SEQ ID NO). Uma construção de pYDA1 é descrita na Publicação PCT No. WO 2006/052914, que é aqui incorporado como referência. O vetor pRS425 do tipo plasmídeo epissomal de leveduras (YEp) (SEQ ID NO:5) (Christianson et al, Gene 110:119 a 122 (1992)) contém sequências do plasmídeo endógeno de 2 micra de Saccharomyces cerevisiae, um marcador selecionável LEU2 e sequências baseadas na cadeia principal de um fagomídeo multifuncional, pBluescript Il SK(+). O promotor constituivo forte de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD) Saccharomyces cerevisiae foi clonado entre os sítios Sacll e Spel de pRS425 na mesma forma conforme

*.. descrito por Jia et al. (Physiol. Genomics 3:83 a 92 (2000)) para produzir . PGPD+425 (SEQ ID NO:6). Um sítio Notil foi introduzido no sítio BamHI de PGPD-425, assim obtendo um sítio Notl flanqueado por sítios BamHl, e esse plamídeo foi denominado pY75 (SEQ ID NO:3).

O gene DGAT?2 foi ampliado por PCR do genoma de Yarrowia lipolytica (Nº.de acesso ATCC 20362) conforme a seguir. As células de levedura foram cultivadas em meio YPD sólido durante 72 h.

As células foram ressuspensas em 200 ul de tampão de extração de DNA (Tris 100 mM em pH 7,5, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 0,1%) e suplementadas com 2 a 5 microesferas de vidro (3 mm de diâmetro) e aproximadamente 0,1 g de microesferas de vidro (0,5 mm de diâmetro). À suspensão da célula de levedura foi misturada vigorosamente com o uso de um misturador vórtex e incubada a 75 ºC durante 25 min. O lisado foi resfriado à temperatura ambiente e limpo por centrifugação. Os dois primers de oligonucleotídeo seguintes foram usados para gerar um fragmento de PCR de aproximadamente 1600 bp: oYLDGAT2-1: GCGGCCGCATGACTATCGACTCACAATACTACAAGT (SEQ ID NO:7), e oYLDGAT2-2: GCGGCCGCTTACTCAATCATTOEGGAACTCTGGGGCT (SEQ ID NO:8). Brevemente, uma mistura de reação de PCR (100 ul) contendo MgCl2 2,5 mM, dNTPs 2 mM, Tris/HCI 10 mM (pH 8,8), KCI 50 mM, Nonidet P40 0,08%, 1 uM de oYLDGAT2-1 (SEQ ID NO:7) e oYLDGAT2-2 (SEQ ID —NO:8), Taq polimerase a 10 U (Fermentas, Hanover, MD, EUA), e 2 ul de lisado de levedura foram criados. A mistura de PCR foi dividida em quatro alíquotas de 25 pl e a ampliação foi executada durante 35 ciclos, cada um compreendendo 45 s a 94 ºC, 45 s na temperatura de anelamento respectiva, e

MS ls a a O e O

J 75 La: 1 min a 72 ºC. Os produtos de PCR foram purificados com gel e clonados em . PGEM T-easy (Promega) com o uso das instruções do fabricante. Dez clones de plasmídeos independentes foram completamente sequenciados. A sequência consenso dessa análise é apresentada conforme SEQID NOS Essa sequência de DNA se difere da sequência DGAT2 revelada na publicação WO 2005/003322 em duas posições diferentes de nucleotídeos. A diferença na sequência de DNA afeta nt 448 e nt 672 do quadro de leitura de abertura DGAT2 quadro aberto de leitura. À primeira diferença de nt altera a sequência de aminoácido prevista da proteína DGAT. Ela substitui uma serina encontrada na sequência DGAT revelada na publicação WO 2005/003322 com um resíduo de treonina. A segunda diferença de sequência não altera a sequência de aminoácido daquela revelada na publicação WO 2005/003322. A diferença entre a sequência DGAT2 de Yarrowia lipolytica revelada no presente documento e aquela da publicação WO 2005/003322 pode ser atribuída às cepas de Yarrowia lipolytica diferentes que foram usadas para o isolamento do gene DGAT2. A sequência de aminoácido prevista da proteina DGAT de cepa de Número de Acesso ATCC 20362 é apresentada como SEQ ID NO:10. O gene DGAT (SEQ ID NO: 9) foi excisado como um fragmento de restrição Notl do vetor pGEM T-easy e foi ligado ao DNA desfosforilado linearizado Notl de pY75 (SEQ ID NO: 3). O DNA plamídeo foi isolado de clones recombinantes e a digestão de restrição com Sacl e Pacl foi permitida para identificar clones nos quais o códon de inicialização do gene DGAT2 estivesse próximo à extremidade 3' do promotor GPD em pY75 (orientação de — sentido do gene DGAT2). Esse plasmídeo é de agora em diante referido como pY75 YL DGAT2 (SEQ ID NO: 11). O DNA plasmídeo de pY75 YL DGAT1 (SEQ ID NO: 4) e o vetor pY75 vazio foram transformados na cepa INVSC1 de Saccharomyces

| 76 tos t Í " | .. cerevisiae (Invitrogen, EUA) com o uso de métodos padrão (Gietz, R.

Daniel; do Woods, Robin A., Meth.

Enzymol. 350:87 a 96 (2002)). As colônias de levedura | recombinantes foram selecionadas no meio DOBA suplementado com CSM-leu (Qbiogene, Carlsbad, CA, EUA). Cinco culturas de 50 ml de meio DOBA —suplementado com CSM-leu foram inoculadas com cinco colônias geradas independentemente e cultivadas em 30 ºC durante 72 h.

As células foram colhidas através de centrifugação e ressuspensas em meio idêntico ao meio DOBA descrito acima com a exceção de que o sulfato de amônio como fonte de nitrogênio foi omitido.

As culturas foram cultivadas durante 60 h adicionais e as células foram colhidas por centrifugação.

As células foram congeladas em gelo seco e liofilizadas.

O teor total de ácido graxo de cada amostra de célula de levedura foi medido três vezes conforme a seguir.

Aproximadamente 5 a 15 mg de pó de levedura foram pesados no fundo de um tubo de cultura de vidro de 13 x 100 mm com tampão roscado e vedação de Teflon. 5 ul de uma solução estoque de TAG de 17:0 (10 mg/ml em tolueno) foram adicionados seguidos da adição de 500 ul de ácido sulfúrico a 5% em metanol (anidro). As amostras foram incubadas a 95 ºC por 1,5 h.

Subsequentemente, permitiu-se que os tubos resfriassem à temperatura ambiente após 1 ml de cloreto de sódio 1 M ter sido adicionado seguido da mistura. 1 ml de heptano foi adicionado, os teores foram misturados e as amostras foram giradas brevemente para mediar a separação de fase.

Aproximadamente 500 ul da fase orgânica foram transferidos para um frasco GC.

Metil ésteres de ácido graxo foram analisados por cromatografia a gás. 4 ul de extrato de heptano foram analisados por cromatografia a gás em Hewlett-Packard 6890 equipado com j uma coluna capilar de sílica fundida Omegawax 320 (Supelco Inc., Número de Catálogo 24152). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220 ºC durante 2,7 min, aumentar para 240 ºC em 20 C /min

' 77 e, então, permanecer por 2,3 min adicionais. O gás carreador foi suprido com um gerador de hidrogênio Whatman. Os momentos de retenção foram comparados àqueles para metil ésteres de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc. Número de catálogo U-99-A).

O DNA plasmídeo de pY75 YL DGAT2 (SEQ ID NO: 11 ) e o vetor pY75 vazio foram transformados na cepa INVSC1 de Saccharomyces cerevisiae e o teor total de ácido graxo de culturas de levedura recombinantes foi analisado conforme descrito previamente. As conclusões relacionadas à superexpressão de ambos os genes DGAT em levedura estão resumidas na Tabela2. TABELA 2

TEOR TOTAL DE ÁCIDO GRAXO DE CULTURAS DE SACCHAROMYCES CEREVISEA % ácido % ácido %ácido | % ácido FAME FAME DP FAME palmítico | palmitoleico | esteárico | oleico | (%DCW) média (% DCW) (% DCW) prev f as | a [75 [as [ee Jar [ DGAT | 196 | e | 7a [ss [es fo Po [12 | 3 [7 [e | ea Jos | | [ss [386 [7 as bons Jor | | [si [3a [77 | me | 1a [oe] nº | os | Pas | me | | 7a | ass | or fa Po | 12 | 32 [7 [ss | or joel —[ | | me [ao [68 [e doa do | | | ma | as [6 | | lol | | [ao [oa [6 | e | ss [or| o | os | prin | ane | oo | 12 | o [ra Jor Pp Dente | sm | 31 [me | 26 | 159 [o] | | [| 57 | 38 [om [ans | se [| | | 289 | az [ss [ss [es DD 1 | 22 [Joao [168 [o [ne [ar] 2 | 23 | [| aa a ar it [200 | 34 [98 [7 658 [ol | : ao. = - a

A E AA palmítico | palmitoleico | esteárico | oleico | (%DCW) média (% DCW) - (% DCW) [se [e [ss [ss De fo | | Eae A [188 [368 [Or [3 [| 6 Jos] 66 | 02 | A Tabela 2 mostra que existe um aumento significativo de ácidos graxos totais em células de levedura que colhem o pY75 YL DGAT1 (SEQ ID NO:4) comparado às células que contêm somente o plasmídeo pY75 vazio. A porcentagem de peso médio de célula seca de ácido graxo —(DCW) de cinco culturas independentes é de 11,9 % comparada com 9,3% para controles de vetor cultivados sob condições idênticas. Em resumo, existe um aumento de 28% na produção total de ácido graxo. Além disso, existe uma sutil alteração no perfil de ácido graxo associado à expressão de YL DGAT1 caracterizada por um aumento em ácido palmítico.

A expressão constitutiva de YL DGAT2 sob a inanição de | nitrogênio aumentou o teor total de ácido graxo em 110 % comparada a um controle de vetor cultivado sob condições idênticas. O teor total de ácido graxo do controle apenas do vetor foi de 6,6% enquanto que o teor médio de ácido graxo dos transformadores de YL DGAT?2 foi de 14,2%. O perfil de ácido graxo se alterou como resultado da expressão de YL DGAT?2. O teor de ácido palmítico aumentou significativamente acompanhado por uma redução moderada em ácido palmitoleico. Em adição, o teor de ácido esteárico aumentou signficativamente acompanhado por uma redução clara em teor de ácido oleico. Tomando em conjunto, os resultados mostram que a superexpressão de YL DGATs em levedura sob condições de razões de carbono/nitrogênio elevadas levam ao aumento da acumulação de ácido graxo. As enzimas de YL DGAT superexpressas são capazes de aumentar a atividade de DGAT endógena em Saccharomyces cerevisiae.

NC Experimentos similares foram repetidos com ambos os genes DGAT duas : vezes mais. Uma diferença no teor de ácido graxo entre a cultura de YL DGAT e o controle de vetor pôde ser observada a cada momento e foi de pelo menos 8% e 14,3% para YL DGAT1 (SEQ ID NO:1) e YL DGAT2 (SEQ IDNO:9), respectivamente. EXEMPLO 2 CLONAGEM DE DGAT1 E DGAT2 DE YARROWIA LIPOLYTICA EM VETORES DE

EXPRESSÃO DE YARROWIA LIPOLYTICA O presente exemplo descreve a geração de pFBAIN-YDG1 e pFBAIN-YDG2, que compreende um gene quimérico FBAINm::YDGAT1 ::PEX20 e um gene quimérico FBAINM::YDGAT2::PEX20, respectivamente (Figuras 1A e 1B). Estes foram projetados para a superexpressão do DGAT1 e do DGAT2 em Yarrowia lipolytica.

Os oligonucleotídeos YDGAT1-F (SEQ ID NO:12) e YDGAT-R (SEQID NO:13) foram projetados e sintetizados para permitir a ampliação do DGAT1 ORF do DNA genômico de Yarrowia lipolytica (isolado da cepa de Número de Acesso ATCC 20362, adquirido junto à American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA)), enquanto os oligonucleotideos YDGAT2-F (SEQ ID NO: 14) e YDGAT2-R (SEQ ID NO:15) foram projetados e sintetizados para permitira ampliação do DGAT2 ORF.

As reações de PCR, com DNA genômico de Yarrowia lipolytica como modelo, foram executadas individualmente em um volume total de 50 ul compreendendo: 1 ul cada dos primers direto e reversos a 20 uM, 1 ul! DNA genômico (100 ng), 10 ul de 5X tampão de PCR, 1 ul de mistura dNTP (10 uM cada), 35 ulde água e 1 /yulde polimerase Phusion (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, EUA). A ampliação foi executada a 98 ºC durante 1 min, seguida por 30 ciclos a 98 ºC durante 10 s, 55 ºC durante 10 s, e 72 ºC durante 30 s, seguidos por um ciclo de prolongamento final a 72 ºC durante 5 min. Um mta, fragmento de DNA 1603 bp (SEQ ID NO:16) e um fragmento 1567 bp (SEQ ID . NO:17) foram gerados e contioham o DGATI e DGAT2 ORFs, respectivamente. Os fragmentos de PCR foram purificados com kits de purificação de PCR Qiagen seguindo o protocolo do fabricante. As amostras de DNA purificadas foram digeridas com Ncol e Not, purificadas com um kit de limpeza de reação Qiagen e, então, ligadas diretamente com pFBAIN-MOD-1 digerido de Ncol/Noti (Figura 1C; SEQ ID NO:18). Epecificamente, a reação de ligação contém: 10 ul de tampão de ligação 2X, 1 ul de T4 DNA ligase (Promega), 4 ul (-300 ng) ou do fragmento 1600 bp (isto é, DGAT1; SEQ ID NO:16) ou do fragmento 1564 bp (isto é, DGAT2; SEQ ID NO:17) e 1 ul de PFBAIN-MOD-1 (-150 ng). As misturas de reação foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 h e usadas para transformar células competentes de E. coli Top10 (Invitrogen). O DNA plasmídeo dos transformadores foi recuperado com o uso de um kit Qiagen Miniprep. Os clones corretos foram identificados através de mapeamento de restrição e as construções finais foram denominadas "pFBAIN- YDG1" e "pFBAIN-YDG2", respectivamente. Assim, pFBAIN-YDG1 (Figura 1A; SEQ ID NO:19) através disso contém os seguintes componentes: TABELA 3 COMPONENTES DE PEBAIN-YDG1 PLASMÍDEO (SEQID NO:19) Sítios RE e Descrição de Fragmento e Componentes de Gene Nucleotídeos dentro da Quimérico

EE + FBAINm: promotor FBAINm de Yarrowia lipolytica (Publicação PCT Nº WO2005/049805) e YDG1: DGAT1 ORF de Y. Iypolitica (SEQ ID NO:16) ' + Pex20: sequência de teminação Pex20 do gene Pex20 de Yarrowia (Nº de Acesso GenBank AFOS4613)

Nucleotídeos dentro da Quimérico « SEQ ID NO:19 Nº de Acesso GenBank M91600 e Nº A17608) O pFBAIN-YDG?2 plasmídeo (Figura 1B; SEQ ID NO:20) continha componentes idênticos àqueles de pFBAIN-YDG1, com a exceção de que o DGAT?2 ORF de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO: 17; identificada como YDG2 na figura 1B) estava presente ao invés do DGAT1 ORF de Yarrowia lipolytica em —pFBAIN-YDG1. O termo "promotor de FBAINm" ou "região promotora de FBAINm" é uma versão modificada do promotor de FBAIN (infra), em que FBAINm tem uma deleção de 52 bp entre o códon de iniciação de translação ATG e o intrão do promotor de FBAIN (por meio disso incluindo apenas 22 aminoácidos da terminação N) e um novo motivo consensual de translação após o intrão.

Além disso, enquanto o promotor de FBAIN gera uma proteína de fusão quando fundido com a região de codificação de um gene a ser expresso, o promotor de FBAINm não gera essa proteina de fusão.

O promotor de FBAIN se refere à região não traduzida a upstream 5' em frente ao códon de iniciação de translação 'ATG' da enzima fructose-bisfosfato aldolase de Yarrowia lipolytica | (E.

C. 4.1.2.13) encodificada pelo gene fba1 e que é necessário para a expressão, mais uma porção de região de encodificação 5' que tem um intrão do gene fba1. Esses promotores são descritos em detalhes na Publicação WO 2005/049805 e patente U.S.7.202.356, que são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade.

e... EXEMPLO 3 : SUPEREXPRESSÃO DOS GENES DGAT1 E DGAT2 DE YARROWIA LIPOLYTICA EM CEPA Y 2224 DE YARROWIA LIPOLYTICA O presente exemplo descreve o teor elevado de ácido graxo, e modificação para a abundância relativa de cada espécie de ácido graxo, na cepa Y2224 de Yarrowia lipolytica que foi transformada para co-expressar tanto o DGAT1 de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO:16) quanto o DGAT2 de Yarrowia lipolytica (SEQ ID NO: 17). A cepa Y2224 é um mutante resistente à FOA de uma mutação autônoma do gene Ura3 de cepa de Yarrowia de tipo selvagem deNºde Acesso ATCC 20362. 1 Geração de Cepa Y2224: A cepa Y2224 foi isolada na seguinte forma: células de Nº de Acesso ATCC 20362 de Yarrowia lipolytica de uma placa de ágar YPD (1 % de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose, 2% de ágar) foram semeadas sobre uma placa de meio mínimo (75 mg/l cada dentre uracila e uridina, 6,7 g/l de YNB com sulfato de amônia, sem aminoácido, e 20 g/Il de glicose) contendo 250 mg/l de 5-FOA (monoidrato de ácido 5-fluorouracil-S-carboxílico; Zymo Research). As placas foram incubadas | a 28 ºC e quatro dentre as colônias resultantes foram colocadas em pedaços | separadamente sobre placas de meio mínimo (MM) contendo 200 mg/ml de 5- | 20 FOA e placas de MM desprovidas de uracial e uridina para confirmar a | auxotrofia de uracila Ura3. | Transformação de Cepa Y2224: Um clone de pFBAIN-YDG1, um | clone de pFBAIN-YDG2 e pFBAIN-MOD-1 de plasmídeo de controle foram transformados em cepa Y2224 de Yarrowia lipolytica conforme descrito abaixo.

A transformação de Yarrowia lipolytica foi realizada de acordo com o método de Chen, D.

C. et al. (Appl.

Microbiol Biotechnol. 48(2):232 a 235 | (1997)), exceto se observado em contrário.

Brevemente, Yarrowia foi semeada | sobre uma placa de ágar de YPD e cultivada a 30 ºC para aproximadamente 18

| 83 .. . h. Inúmeras alçadas grandes de células foram raspadas da placa e BR ressuspensas em 1 ml de tampão de transformação contendo: 2,25 ml de 50 % de PEG, MW médio 3350; 0,125 ml de acetato de lítio 2 M, pH 6,0; 0,125 ml! de DTT 2 M; e 50 ug de DNA de esperma de salmão tosquiado. Então, aproximadamente 500 ng de DNA plasmídeo linearizado foi incubado em 100 up! de células ressuspensas, e mantido a 39 ºC durante 1 h com misturador vórtex em intervalos de 15 min.

As células de cada transformação foram plaqueadas sobre placas de meio mínimo (MM) desprovidas de uracila (0,17 % de base de nitrogênio de levedura (DIFCO Laboratories, Detroit, MI, EUA) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2 % de glicose, 0,1 % de prolina, pH 6,1, 20 g/l de ágar) e mantidas a 30 ºC durante 2 dias. Três transformadores de cada placa de transformação foram usados para inocular culturas individuais de 25 ml! em meio MM (0.17 % de base de nitrogênio de levedura (DIFCO Laboratories) sem sulfato de amônio ou aminoácidos, 2% de glicose, 0,1 % de prolina, pH 6,1). Permitiu-se que cada cultura fosse cultivada por 2 dias a 30 ºC, então, trocadas em 25 ml de meio com alto nível de glicose ("meio HG", compreendendo 80 g/! de glicose, 27 g/l de KHPO,, 6,3 g/l KH2PO,, pH -7,5) e permitiu-se que fossem cultivadas por 5 dias a 30 ºC.

Análise de Lipídio: Lipídeos inteiros foram extraídos, e metil ésteres de ácido graxo (FAMEs) foram preparados por trans-esterificação, e subsequentemente analisados com um Hewlett-Packard 6890 GC.

Mais especificamente, para a análise de ácido graxo, as células foram coletadas por centrifugação e os lipídeos foram extraídos conforme descrito em Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37:911 a 917 (1959). Os metil ésteres de ácido graxo foram preparados por transesterificação do extrato de lipídeo com metóxido de sódio (Roughan, G. e Nishida 1., Arch Biochem Biophys. 276(1):38 a 46 (1990)) e subsequentemente

E, analisados com um Hewlett-Packard 6890 GC equipado com uma coluna de 30 ' m X 0,25 mm (i.d.) HP-INNOWAX (Hewlett-Packard). A temperatura do forno foi de 170 ºC (25 min de permanência) a 185 ºC a 3,5 ºC/min.

Para a transesterificação de base direta, a cultura de Yarrowia (3 ml) foi colhida, lavada uma vez em água destilada e seca a vácuo em um Speed-Vac por 5 a 10 min. Metóxido de sódio (100 ul de 1 %) dói adicionado à amostra, e, então, a amostra foi submetida ao vórtex e agitada por 20 min. Após a adição de 3 gotas de NaCl 1 M e 400 ul de hexano, a amostra foi submetida ao vórtex e girada. A camada superior foi removida e analisada por GC conforme descrito acima.

Com base nas análises acima, o teor de lipídeo e a composição foram determinados em cepas trasformadoras de Y2224, que compreendem PFBAIN-YDG1, pFBAIN-YDG2 e pFBAIN-MOD-1 (controle), respectivamente, conforme mostrado abaixo na Tabela 4. Três transformadores independentes de cada cepa foram analisados, enquanto os resultados proporcionais são mostrados nas linhas destacadas em cinza. Os ácidos graxos são identificados | como 16:0 (palmitato), 16:1 (acido palmitoleico), 18:0, 18:1 (ácido oleico) e 18:2 (LA); e a composição de cada um deles é apresentada como uma % dos ácidos graxos totais.

"% de FAME/DCW" representa a porcentagem de metil éster de ácido graxo/peso seco da célula. O peso seco da célula foi determinado através da coleta de células de 10 ml de cultura via centrifugação, lavagem das células com água uma vez para remover o meio de resíduo, secagem das células em um forno a vácuo a 80 ºC de um dia para o outro, e pesagem das células secas. O teor total de metil ésteres de ácido graxo em uma amostra foi determinado através da comparação das áreas de todos os picos no perfil de GC com a área de pico de um teor conhecido adicionado de ácido graxo C15:0 de padrão interno.

| 85 nn PY TABELA 4 ; TEOR DE LIPÍDEO AlE COMPOSIÇÃO EM CEPA Y 2224 DE YARROWIA QUE SUPEREXPRESSA YDGAT1 E YDGAT2 Plasmídeo % de 18:0 FAME/DCW [3 | erasanmod: | 2190 [1596] 1641 [601 [4028 [1836] [| 2 | eraBamMOD? | — 2398 — [1672/1590] 597 | 3964 [1821 | [a | praBanMODt | 1827 — [1442/1574] 559 [4107 [19,89 À Média de 1a3 | Média de pFABAIN- 21,39 15,70 5,86 | 40,33 | 18,82 MOD-1 ; [a | ereannvost | 2250 — [1576] 1674 | 595 [4072 [17:79] ! | 6 —L ereaNnYDSt | 2438 — [1476 [1886] 4,60 | 43,90 [15.89 | [6 L eFeamvDs: | 2423 — [1520] 1842 | 466 [4920] 161 | Média de 4a 6 | Média de pFBAINnN- 23,70 15,24 5,97 | 42,61 | 16,59 i YDG1 i ' [7 | ereannvosa [| 2351 1356/1355] 770 | 4620 [1646 [ ss | preannvoce | 2030 [1510/1287 (800 [4540 | 1524] [o — | ereanYosa | 2015 — [1467/1374 [844 | 4700 | 1379 | Média de 7a 9 | Média de pFBAINn- 27,32 14,41 | 13,38 46,23 | 15,16 YDG2 As análises de GC mostraram que houve um aumento significante de no total de ácidos graxos nas células que transportam pFBAIN-YDG1, ] quando comparado às células que transportam pFBAIN-MOD-1. A média de É " ; ácido graxo aumentou de 21,39 % de FAME/DCW no controle para 23,70 % de : FAME/DCW em células que expressam YDGAT1 (isto é, um aumento de 10,8 %). Além disso, também houve um aumento na quantidade de ácidos graxos C16:1eC18:1e uma redução de ácido graxo C18:2 (Tabela 4). As células que transportam pFBAIN-YDG2 também tiveram um grande aumento no teor de ácido graxo em relação ao controle, resultando em uma média de 27,32 % de FAME/DCW (representando um aumento de 27,7%). A distribuição de espécie de ácido graxo também alterou significativamente.

Especificamente, o teor de C18:0 e C18:1 aumentou, enquanto que o teor de C16:0, C16:1 e C18:2 diminuiu.

NL 86 Coletivamente, esses resultados demonstram que àa superexpressão de DGAT1 ou DGAT2 de Yarrowia lipolytica impactam em ambos os teores totais de lipídeos e a abundância relativa de cada espécie de ácido graxo. EXEMPLO 4

EXPRESSÃO DE GENES DGAT DE YARROWIA LIPOLYTICA EM SEMENTE DE

ARABIDOPSIS Um vetor binário adequado para uma transformação mediada por agrobactéria foi gerado conforme a seguir. Vários sítios de restrição foram adicionados, através de uma variedade de etapas de clonagem, às extremidades do cassete Bcon/Notl/Phas3' de KS123 (SEQ ID NO:21 ), que foi descrito anteriormente na publicação WO 02/008269 (o conteúdo do mesmo está incorporado no presente documento a título de referência). Brevemente, um fragmento de DNA (cal a24-4; SEQ ID NO:22) foi ampliado do CalFad2-2 —plamídeo (descrito na publicação WO 01/12800) usando os primers oCal-15 (SEQ ID NO:23) e oCal-6 (SEQ ID NO:24). O fragmento de DNA cal a24-4 (SEQ ID NO:22) foi digerido com Bg/ll e BamHl e clonado no sítio BamHI de pKS123 para obter pKR53B (SEQ ID NO:25). O fragmento Xbal/Sbfi de pKR53B, contendo o cassete Bcon/Noti/Phas3' foi clonado no fragmento Xbal/Sbflde pKR72 (Nº de Acesso ATCC PTA-6019; SEQ ID NO:26) contendo ! o gene de fosfotransferase de higromícina bacteriana, para obter pKR85 (SEQ | ID NO:27). As características de pKR72 são conforme a seguir. Um plasmídeo | de inicialização pKR72 (Nº de Acesso ATCC PTA-6019; SEQ ID NO:26), um | derivado de pKS123 que foi previamente descrito em Publicação WO | —02/008269 (o conteúdo do mesmo está incorporados no presente documento a | título de referência), contém o gene de fosfotransferase B de higromicina (HPT) (Gritz, L. e Davies, J., Gene 25:179 a 188 (1983)), flanqueado pelo promotor T7 e terminador de transcrição (promotor T7/hpt/cassete de terminação T7), e uma

E: 87 origem bacteriana de replicação (oh) para seleção e replicação em bactérias (por exemplo, E. coli.

Em adição, pKR72 também contém o gene de fosfotransferase B de higromícina, flanqueado pelo promotor 35S (Odell et al, Nature 313:810 a 812 (1985)) e o terminador de transcrição NOS 3' (Depicker etal,J.

Mol.

Appl.

Genet. 1:561 a 570 (1982)) (35S/hpt/cassete NOS3') para a seleção em plantas como soja. pKR72 também contém um sítio de restrição | Not, flanqueado pelo promotor para a subunidade a” de B-conglicinina (Beachy et al., EMBO J. 4:3047 a 3053 (1985)) e a região de terminação de transcrição 3' do gene da faseolina (Doyle et al., J.

Biol.

Chem. 261: 9228 a 9238 (1986)), | 10 permitindo assim uma forte expressão específica de tecido nas sementes de soja de genes clonados no sítio Notl. | O cassete Bcon/Notl/Phas3' foi ampliado do plasmídeo pKR85 (SEQ ID NO:27) usando os primers OKR85-1 (SEQ ID NO:28) e OKR85-2 (SEQ ID NO:29) e o fragmento de DNA resultante foi clonado em PCR-Scriptº (Stratgene) seguindo o protocolo do fabricante, para obter pPCR85 (SEQ ID NO:30). O fragmento EcoRIBgNl de pPCR85, contendo o cassete Bcon/Notl/Phas3' foi clonado no fragmento EcoRI/BamHI de plasmídeo pZS199 (Publicação WO 93/11245; também patente U.S. 5.952.544 que foi publicada em 10 de junho de 1993; sendo que as revelações dos mesmos estão incorporadas no presente documento a título de referência), contendo a cadeia principal de vetor binário de Arabidopsis para produzir pKR91 (SEQ ID NO:31). O cassete Bcon/Notl/Phas3' foi removido de pKR91 pela digestão com Ascl e o vetor binário religado contendo um único sítio de clone Ascl foi — produzido denominado pKR92 (SEQ ID NO:32). Construção de pKR92 YL DGAT2: A construção do plasmídeo de expressão KS362 é descrita no exemplo 5. Um cassete de expressão que abriga o gene YL DGAT?2, fundido ao

MO promotor de betaconglicinina e ao terminador de faseolina e o gene DsRed . fundido ao promotor de Kti e às sequências terminadoras foi excisado do KS362 como um fragmento Ascl 6,4 kb.

Esse DNA foi ligado ao DNA de vetor pKR92 desfosforilado e linearizado Ascl para obter pKR92 YL DGAT2 (SEQ ID NO:33). Construção de pKR92 YL DGAT1/YL DGAT2: A construção do plasmídeo de expressão KS364 é descrita no exemplo 5. Um cassete de expressão em que os genes YL DGAT1 (SEQ ID NO:1 ) e YL DGAT2 (SEQ ID NO:9) são fundidos à sequência idêntica do terminador da faseolina e à glicinina 1 e aos promotores de betaconglicinina respectivamente, foi excisado do KS364 como um fragmento Ascl 7 kb.

Esse DNA foi ligado ao DNA de vetor pKR92 desfosforilado e linearizado Ascl para obter pKR92 YL DGAT1 /YL DGAT?2 (SEQ ID NO:34) Geração e Análise de Linhagem de Arabidospis Transgênica: O DNA plasmídeo de pKR92 YL DGAT2 e pKR92 YL DGAT1 YL DGAT? foi introduzido em Agrobacterium tumefaciens NTLA (Luo et al, Molecular Plant- Microbe Interactions 14(1):98 a 103 (2001)) por eletroporação.

Brevemente, 1 ug de DNA plasmídeo foi misturado com 100 ul de células eletrocompetentes em gelo.

A suspensão celular foi transferida para uma curetade eletroporação de 100 ul (1 mm de largura de vão) e eletroporada com o uso de eletroporador BIORAD ajustado para 1 kV, 400Q e 25 ypF.

As células foram transferidas para meio LB de 1 ml! e incubadas durante 2 h a 30 ºC.

As células foram plaqueadas sobre meio LB contendo 50 pg/ml de canamicina.

As placas foram incubadas a 30 ºC durante 60 h.

As culturas de agrobactérias | 25 —recombinantes (500 ml de LB, 50 pg/ml de canamicina) foram inoculadas de | colônias únicas de células de agrobactéria transformadas e cultivadas a 30 ºC durante 60 h.

As células foram colhidas por centrifugação (5000xg, 10 min) e ressuspensas em 1 | de 5 % (VWV) de sacarose contendo 0,05 % (VV) de

“o.

Silwet.

As plantas de Arabidopsis foram cultivadas em solo em uma densidade de 30 plantas por 100 cm? e colocadas em um pote em uma mistura de solo metromix 360 durante 4 semanas (22 ºC, luz permanente, 100 uE m?s”). As plantas foram imersas repetidamente na suspensão de agrobactéria que abriga os vetores binários e mantidas em um ambiente escuro de alta umidade durante 24 h.

As plantas foram cultivadas por quatro a cinco semanas sob condições de crescimento vegetal padrão descritas acima e o material vegetal foi colhido e seco por uma semana a temperaturas ambientes em sacolas de papel.

As sementes foram colhidas com o uso de uma peneira de arame de 0,425mm mesh.

As sementes de Arabidopsis limpas (2 g, correspondente a cerca de 100.000 sementes) foram esterilizadas por lavagens em 45 ml de etanol 80%, triton X-100 0,01 %, seguido por 45 ml de branqueador doméstico em água 30% (V/V), triton X-100 0,01 % e, finalmente, através do enxágue repetido em água estéril.

As alíquotas de 20.000 sementes foram transferidas para placas quadradas (20 x 20 cm) contendo 150 ml de meio de crescimento de planta estéril composto de 0,5 x sais MS, sacarose 1,0 % (WWV), 0,05 de MES/KOH (pH 5,8), 200 pg/ml! de timentina, e 50 úg/ml de canamicina solidificada com 10 g/! de ágar.

A dispersão homogênea da semente sobre o meio foi facilitada | através da mistura da suspensão de semente aquosa com um volume igual de | meio de crescimento de vegetal fundido.

As placas foram inoculadas sob condições de crescimento padrão durante dez dias.

As mudas resistentes à canamicina foram transferidas para o meio de crescimento vegetal sem agente — seletivo e foram cultivadas até a maturidade de 8 a 10 semanas (22 ºC, luz escura permanente, 100 a 200 uE m?s*). As plantas foram cultivadas em planos com 36 inserções.

Em cadá plano pelo menos seis plantas de controle do tipo selvagem não transformadas foram cultivadas perto de ar «.. aproximadamente trinta plantas T2. As sementes foram colhidas de plantas individuais e o teor de óleo da semente foi medido por NMR. Análise baseada em NMR do teor de oleaginosidade da semente: O teor de oleaginosidade da semente foi determinado com o uso de um analisador Maran Ultta NMR (Resonance Instruments Ltd, Whitney, Oxfordshire, Reino Unido). As amostras (tanto semente de soja individual quanto lotes de semente de Arabidopsis na faixa de peso entre 5 e 200 mg) foram colocadas em tubos de polipropileno de 2 ml! pré pesados (Corning Inc, Corning NY, EUA; Parte Nº. 430917) previamente marcados com identificadores de código de barra única. As amostras foram, então, colocadas em carreadores de 96 placas e processadas através da seguinte série de etapas por um sistema robótico Adept Cobra 600 SCARA.

1. escolher um tubo (o braço robótico foi equipado com um dispositivo de erguimento a vácuo)

2. ler o código de barras

3. expor o tubo ao dispositivo antiestático (garantindo que a semente de Arabidopsis não adira às paredes do tubo)

4. pesar o tubo (que contém a amostra), para 0,0001 g de precisão. |

5. leitura por NMR; medida conforme a intensidade do eco de spin do próton de 1 ms após um sinal de 22,95 MHz ter sido aplicado à amostra (os dados foram coletados por varreduras de 32 NMR por amostra)

6. retornar o tubo à prateleira

7. repetir o processo com o próximo tubo Os códigos de barras, peso dos tubos e leituras por NMR foram gravados por um computador conectado ao sistema. O peso da amostra foi determinado através da subtração do peso do tubo de polipropileno do peso do tubo contendo a amostra.

: 91 . O teor de oleaginosidade da semente de soja foi calculado conforme a seguir: % de óleo (% em peso de base) = (sinal de NMR / amostra em peso (9))-70,58) 351,45 Os parâmetros de calibragem foram determinados através de amostras precisamente pesadas de óleo de soja (na faixa de 0,0050 a 0,0700 g em intervalos de aproximadamente 0,0050 g; pesadas para uma precisão de 0,0001 g) em tubos Corning (vide acima) e submetendo-as à análise por NMR.

Uma curva de calibragem de teor de óleo (% de base em peso de semente; | 10 supondo um peso de semente padrão de 0,1500 g) para um valor de NMR foi estabelecida.

A relação entre os teores de oleaginosidade da semente medidos por NMR e os teores de oleaginosidade absolutos medidos através de métodos clássicos de química analítica foi determinada conforme a seguir.

Cinquenta sementes de soja, escolhidas por terem uma faixa de teor de óleo, foram secas a 40 ºC em um forno de ar forçado por 48 h.

As sementes individuais foram submetidas à análise por NMR, conforme descrita acima e, então, foram trituradas até um pó fino em um triturador do tipo GenoGrinder (SPEX Centhprep (Metuchen, N.J., EUA); 1500 oscilações por minuto, durante 1 minuto). As alíquotas entre 70 e 100 mg foram pesadas (para 0,0001 g de precisão) em tubos de vidro de 13 x 100 mm equipados com tampões roscados enfileirados Teflonº; o resíduo do pó de cada grão foi usado para determinar o teor da mistura, através da diferença de peso após 18 h em um forno de ar forçado a 105 ºC.

Heptano (3 ml) foi —adicionado aos pós nos tubos e após as amostras de mistura em vórtex terem sido extraídas em um agitador de extremo a extremo, durante 1 h à temperatura ambiente.

Os extratos foram centrifugados, 1500 x g por 10 min, o sobrenadante foi decantado em tubo limpo e os péletes foram extraídos duas vezes (1 h cada) com 1 ml de heptano.

Os sobrenadantes das três extrações foram combinados e 50 ul de padrão interno (ácido triheptadecanóico; 10 mg / ml de tolueno) foi adicionado antes da evaporação até a secura à temperatura ambiente sob um fluxo de gás nitrogênio; padrões contendo O, 0,0050, 0,0100, 0,0150, 0,0200 e 0,0300 g | de óleo de soja, em 5 ml de heptano, foram preparados na mesma maneira.

As gorduras foram convertidas em metil ésteres de ácidos graxos (FAMEs) | através da adição de 1 ml de ácido sulfúrico a 5% (v:v. em metanol anidro) aos péletes secos e aquecendo-os a 80 ºC durante 30 min, com uma mistura em vórtex ocasional.

Permitiu-se que as amostras fossem resfriadas à | temperatura ambiente e 1 ml de cloreto de sódio aquoso a 25% foi | adicionado seguido de 0,8 ml de heptano.

Após uma mistura em vórtex, permitiu-se que as fases se separassem e a fase orgânica superior fosse transferida para uma amostra do frasco e submetida à análise de GC. | 15 O teor de óleo determinado por NMR de plotagem versus o teor de óleo determinado por GC resultou em uma relação linear entre 9,66 e | 26,27% de óleo (valores de GC; % base em peso de semente) com uma inclinação de 1,0225 e um R? de 0,9744; baseado em um teor de mistura de | umidade da semente que tem a média de 2,6 +/- 0,8 %. | 20 O teor de oleaginosidade da semente de arabidopsis foi calculado | conforme a seguir: | óleo mg = (sinal NMR — 2,1112)/37,514 1 | % de óleo (% de base em peso) = (óleo mg /1000)/peso da amostra)*100 Antes de estabelecer esta fórmula, o óleo da semente de Arabidopsis foi extraído conforme a seguir.

Aproximadamente 5 g de sementes de Arabidopsis maduras (cv Columbia) foram trituradas até um pó fino com o uso de um pilão e almoriz.

O pó foi colocado em um dedal de | | | papel de 33 x 94 mm (Ahistrom Nº 7100 a 3394; Ahlstrom, Mount Holly Springs, PA, EUA) e o óleo foi extraído durante aproximadamente 40 ciclos de extração com éter de petróleo (BP 39,9 — 51,7 ºC) em um aparelho Soxhlet. Permitiu-se que o extrato resfriasse e o óleo bruto foi recuperado através da remoção do solvente sob vácuo em um evaporador giratório. Os parâmetros de calibragem foram determinados através da pesagem precisa de 11 amostras padrão de óleo de Arabidopsis parcialmente purificado (amostras continham 3,6, 6,3, 7,9, 9,6 12,8, 16,3, 20,3, 28,2, 32,1, 39,9 e 60 mg de óleo de Arabidopsis parcialmente purificado) pesado para uma precisão de 0,0001 g) em tubos de polipropileno de 2 ml (Corning Inc, Corning NY, EUA; Parte Nº, 430917) e submetendo-as à análise por NMR. À curva de calibragem de teor de óleo (% de base em peso da semente) para o valor de NMR foi estabelecida.

As sementes para pKR92 YL DGAT2 T2 foram cultivadas de um | total de 293 eventos independentes ao longo de 75 controles do tipo selvagem. O teor de óleo de transgênicos YL DGAT?2 situa-se na faixa de 27,9 a 47,3%. O teor médio de óleo foi de 43,7%. O teor de óleo de controles de tipo selvagem situa-se na faixa de 39,5 a 49,6%. O teor médio de óleo de controles em peso foi de 44,8%.

As sementes para pKR92 YL DGAT1 /YL DGAT2 T2 foram cultivadas de um total de 295 eventos independentes ao longo de 77 controles do tipo selvagem. O teor de óleo dos transgênicos YL DGAT1 /YL DGAT?2 situa-se na faixa de 34,5 a 47,6%. O teor médio de óleo foi de 44%. O teor de óleo de controles do tipo selvagem situa-se na faixa de 41,3 a 46,6%. O teor médio de óleo de controles do tipo selvagem foi de 45%. Em resumo, essas conclusões sugerem que a expressão específica de semente do gene YL DGAT não aumenta o teor de óleo das sementes de Arabidopsis.

Análise do perfil de ácido graxo de sementes de Arabdidopsis que expressam YL DGAT?2 sozinho ou em combinação com YL DGAT1: A análise de GC de FAME foi empregada para investigar se a expressão de YL DGAT altera o perfil de ácido graxo das sementes de —Arabidopsis. Aproximadamente 100 sementes F2 foram dispensadas em cavidades individuais de tubos de tira de 96 cavidades. Para a transesterificação, 50 ul de hidróxido de trimetilsulfônio (TMSH) e 0,5 ml de hexano foram adicionados em cada tubo de tira e incubados durante 30 min à temperatura ambiente enquanto eram agitados. Metil ésteres de ácido graxo(1 yulinjetado da camada de hexano) foram separados e quantificados com o uso de uma cromatografia a gás Hewlett-Packard 6890 equipada com um coluna capilar fundida Omegawax 320 (Catálogo Nº 24152, Supelco Inc.). A temperatura do forno foi programada para permanecer a 220 ºC durante 2,6 min, aumentar para 240 ºC a 20 ºC/min e, então, permanecer pormais2,4min. O gás carreador foi suprido por um gerador de hidrogênio Whatman. Os momentos de retenção foram comparados àqueles para ,etil ésteres de padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.). Os resultados estão resumidos na Tabela 5.

TABELAS ue édia % de oleico | Faixa de % oleico | | pKRS2 YE DGAT 1/yE DeaTa NS | conta dospo sevagem | | eee | 01s2 | sense | |ooeencemr | | | contos domo semagem | |

. 95 Os resultados demonstram claramente que a expressão de YL DAGT? e ainda mais a co-expressão de YL DGAT1 e YL DGAT2 em semente de Arabidopsis levam à incorporação aumentada de ácido oleico em lipídeos de sementes que fornecem a primeira indicação de que as proteinas ativas YL —DGAT1eYL DGAT2 podem ser produzidas em sementes transgênicas. | EXEMPLO 5 |

EXPRESSÃO DE GENES DGAT DE YARROWIA LIPOLYTICA EM EMBRIÕES SOMÁTICOS

DE SOJA A TABELA 6 e TABELA 7 listam sequências terminadoras e promotoras que foram usadas em construções de plasmídeos para a superexpressão específica de sementes de genes YL DGAT. TABELA 6

PROMOTORES ESPECÍFICOS DE SEMENTE 4: 3047 a 3053 (1985) 1: 1079 a 1093 (1989) | emeeno | sã | wosoosonaet | TABELA 7 Terminadores de Transcrição A construção de uma construção de plasmídeo para a expressão do gene YL DGAT1 sob controle do promotor glicina Gy 1 (KS349) (Figura 3). O isolamento do promotor glicina Gy1 de soja foi realizado conforme a seguir. Com base nas sequências da sequência de gene glicina

Gy1 de soja (Nº de Acesso GenBank X15121 ; SEQ ID NO:35) na base de dados NCBI, dois oligos tanto com o sítio BamHI quanto com Ncol nas extremidades 5' foram projetados para ampliar o promotor glicina Gy1 de soja (SEQ ID NO:36). A sequência de nucleotídeos desses dois oligos são conforme aseguir SEQ ID NO:37 (0Gy1-1):

CGCGGATCCTAGCCTAAGTACGTACTCAAAATGCCA SEQ ID NO:38 (0Gy1-2):

GAATTCCCATGGGGTGATGACTGATGAGTGTTTAAGGAC O plasmídeo pKS349 foi construído em muitas etapas a partir de uma variedade de vetores intermediários diferentes. O fragmento do promotor glicina Gy1 de soja ampliado foi digerido com BamHI e Nool, purificado e | clonado nos sítios BamHI e Ncol de p24K-G4G-(QSall (WO 98/59062) para obter pZBL114 (SEQ ID NO:39). O fragmento Ncol/Kpnl contendo GUS fou substituido com um fragmento Ncol/Kpnl contendo um produto de fusão do gene GY1 de soja (SEQ ID NO:40) e o gene de lisina de alto teor de cevada sintético 8 (BHL8) (US 6800726 B1) (SEQ ID NO:41) para produzir pZBL133 (SEQ ID NO:43). A sequência de DNA do produto de fusão do gene BHL8 e gene GY1 de soja é apresentada como SEQ ID NO: 42. O terminador de faseolina foi removido de pZBL133 (Xbal/preenchido) e substituído com o terminador de faseolina encontrado em pKS123 (WO 02/08269) (sem corte) para obter pKS238 (SEQ ID NO:44). A fusão de GY 1-BHL8 foi substituída por uma sequência de GY1 nativa conforme a seguir. pKS238 foi digerido com Kpnl/Bgli, a faixa do vetor remanescente (5,1 kb) foi ligado a um fragmento de — DNA (Bglll/Kpnl) do gene GY1 nativo (SEQ ID NO:40) para obter pKS240 (SEQ ID NO: 45). O fragmento BamHlI/Sall contendo Gy1/GM-GY1/Phas3' foi excisado de pKS 240 r ligado aos sítios BamHI/Sal de pKS120 (SEQ ID NO:46) para obter pKS242 (SEQ ID NO:47). O plasmídeo pKS120 é idêntico a

| pKS123 (supra) com a exceção de que o fragmento HindWl contendo cassete Bcon/Notl/Phas3' foi removido. O fragmento NcoVNott contendo GM-GY1 foi substituído pelo fragmento Ncol/Notl contendo YL-DGAT1 de pYDA1 para resultar pKS349 (SEQ ID NO:48). Preparação de uma construção para a expressão do gene YL DGAT?2 sob o controle do promotor betaconglicinina (KS362) (Figura 3): O plasmídeo pKS362 foi construído em muitas etapas a partir de uma variedade de vetores intermediários diferentes. O cassete Ascl contendo Kti/Notl/Kti3' de pKS121 (WO 02/00904) foi embotado no sítio Notl (preenchido) em pBluescript Il SK+ (Stratagene) para obter pKS121/BS. O fragmento Ncol/Notft do vetor de expressão pDsRed (Clontech) foi embutido no sítio Nofl (preenchido) de pKS121/BS para resultar PDS-RED em KS121/BS (SEQ ID NO:49). O cassete BamHI contendo Kti/DsRed/Kti3' em pDS-RED em KS121/BS (SEQ ID NO:50) foi ligado no sítio BamHI de pKS123 (Nº de pedido PCTWO 02/08269) para resultar pKS332 (SEQ ID NO:51). O gene para o YL- DGAT? foi sintetizado por PCR com primers para introduzir os sítios Nofl em ambas as extremidades do gene (ver Exemplo 1). O produto de PCR resultante é digerido com uma enzima de restrição Notl e ligado n sítio Notl de pKS332 para obter pKS362 (SEQ ID NO:52).

Construção de um plasmídeo de controle (KS352) (Figura 2): Com base nas sequências do promotor P34 de grão d soja clonado (WO 2004/071467) (SEQ ID NO:53), dois oligos tanto com o sítio BamHlI quanto com o sítio Notl nas extremidades 5' foram projetados para reampliar o promotor P34. As sequências de nucleotídeos desses dois oligos —sãomostradas conforme a seguir: SEQ ID NO:54 (0P34-1):

CGCGGATCCAACTAAAAMAAMAGCTCTCAAATTACATTTTGAG SEQ ID NO:55 (0P34-2):

. 98

GAATTCGCGGCCGCAACTTGGTGGAAGAATTITTATGATTTGAAA O fragmento do promotor P34 reampliado foi digerido com BamHl| e Not, purificado e clonado nos sítios BamHI e Notfl de plasmídeo pZBL115 (SEQ ID NO:56) para produzir pJS89 (SEQ ID NO:57). O plasmídeo pZBL115 contém a origem de replicação de pRB322, o gene com resistência à higromicina HPT bacteriana direcionado pelo promotor T7 e terminador T7, e um gene promotor-HPT-Nos3' de 358 para servir como um marcador de seleção de planta resistente à higromicina. —- O gene delta-6 desaturase de Morteriella alpina (patente Nº U.S.5.968.809) (SEQ ID NO:58) foi clonado no sítio Nofl de pJS89(SEQ ID NO:57) na orientação de sentido para produzir os cassetes de expressão da planta e pJS93 (SEQ ID NO:59).

O promotor P34 foi excisado de pJS93 (SEQ ID NO:59) com o uso de digestão dupla com Sail Notfl e foi ligado ao vetor pKS127 linearizado por Sall/Notl (pedido de patente US 11/476.510) (SEQ ID NO:60) para obter pKS343(SEQ ID NO:61). O cassete BamHI contendo Kti/DsRed/Kti3' em pDS- RED em KS121/BS foi embutido e ligado no sítio Hinalll (enchido) de pKS343 para obter pKS352 (SEQ ID NO:62).

Construção de um plasmídeo para co-expressão de YL DGAT1 e YL DGAT? (KS364): O plasmídeo pKS364 (SEQ ID NO:63) foi construído através da ligação do cassete Hindlll de 3,3 kb contendo Bcongl PRO /YL-DGAT2/Phas TER de pKS362 (SEQ ID NO:52) no sítio Hindlll único a downstream do promotor Gy1 em pKS349 (SEQ ID NO:48).

Geração de embriões somáticos transgênicos: Para a co-expressão dos genes YL DGAT1 e YL DGAT?2, o tecido de soja embriões somáticos de soja foi co-bombardeado como descrito abaixo com uma mistura de KS349 e KS362. Brevemente, o DNA de KS349 foi digerido com enzimas de restrição Pstl, Xhol para inativar o cassete de gene

: 99 de marcador selecionável (CaMV35S PRO/ HPT/CaMV NOS TER ). Esse DNA foi misturado em uma razão de 10:1 com DNA plasmídeo linearizado com Sall de KS362 e usado para a transformação de soja conforme descrito abaixo.

Alternativamente, o tecido de soja de embriões somáticos de soja foi — bombardeado como descrito abaixo com DNA plasmídeo intacto de KS364 que contém cassetes de expressão funcionais tanto para YL DGAT1 quanto para YL DGAT2. Para a expressão de YL DGAT1 sozinho, DNA plasmídeo não cortado de KS349 foi usado para o bombardeamento de partícula de tecido de embrião.

Similarmente, para a expressão de YL DGAT2 sozinho, DNA plasmídeo não cortado de KS362 foi usado para o bombardeamento de partícula de tecido de embrião.

Além disso, o DNA que continha apenas um marcador selecionável (KS352) foi usado para a transformação de tecido de soja em uma maneira idêntica.

Condições de Cultura: As culturas de suspensão embriogênicas de soja (cv.

Jack) foram mantidas em meio líquido de 35 m! SB196 (infra) em um agitador giratório, 150 rpm, 26 ºC com luzes fluorescentes brancas frias em fotoperíodo de 16:8 h dia/noite em alta intensidade de 60 a 85 uE/m2/s.

As culturas foram subcultivadas a cada 7 dias até duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de líquido fresco SB196 (o intervalo de subcultivo preferencial é a cada 7 dias). As culturas de suspensão embriogênica de soja foram transformadas com os plasmídeos de expressão de soja pelo método de —bombardeamento de bombardeamento por pistola de partícula (Klein et al., Nature 327:70 (1987)) com o uso de um instrumento DuPont Biolistic PDS1000/HE (aperfeiçoamento de hélio) para todas as transformações.

Iniciação de Cultura de Suspensão Embriogênica de Soja:

h 100 As culturas de soja foram iniciadas duas vezes a cada mês com 5 a 7 dias entre cada iniciação.

As vagens com sementes imaturas de plantas de soja disponíveis 45 a 55 dias após a plantação foram escolhidas, removidas de suas carcaças e colocadas em uma caixa magenta esterilizada.

As sementes de sojaforam esterilizadas através da agitação das mesmas durante 15 min em uma solução de Clorox 5% com 1 gota de sabão de marfim (isto é, 95 ml de água destilada aquecida em auto clave mais 5 ml de Clorox e 1 gota de sabão, bem misturados). As sementes foram enxaguadas com o uso de 2 garrafas de 1 litro de água destilada estéril e as sementes menores que 4 mm foram colocadas em lâminas de microscópio individuais.

A extremidade pequena da semente foi cortada e os cotilédones foram pressionados para fora do revestimento da semente.

Os cotilédones foram transferidos para placas contendo meio SB199 (25 a 30 cotilédones por placa) por 2 semanas, então, transferidos para SB1 por 2 a 4 semanas.

As placas foram envoltas com fita de fibra.

Após esse momento, osembriões secundários-foram cortados e colocados em meio líquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA para Bombardeamento: Tanto um plasmídeo intacto quanto um fragmento de DNA plasmídeo contendo os genes de interesse e o gene marcador selecionável foram usados para o bombardeamento.

Uma alíquota de 50 ul de água destilada estéril contendo 1 mg de partículas de ouro foi adicionada a 5 ul de uma solução de DNA de 1 ug/ul (tanto o plasmídeo intacto quanto o fragmento de DNA foram preparados conforme descrito acima), 50 ul de CaCl2 2,5 M e 20 ul de espermidina 0,1 M.

À mistura foi usada 5 vezes no nível 4 de um agitador vórtex e girada por 5 s em uma centrífuga de bancada.

Após uma lavagem com 150 ul de 100% etanol, o pélete foi suspenso através de sonicação em 85 ul de 100% etanol.

Cinco ul de suspensão de DNA foram dispensadas em cada disco de suspensão do disco de instrumento Biolistic

PDS1000/HE.

Cada alíquota de 5 ul continha aproximadamente 0,058 mg de partículas de ouro por bombardeamento (isto é, por disco). Bombardeamento e Preparação de Tecido com DNA: Aproximadamente 100 a 150 mg de culturas de suspensão embriônicade idade de 7 dias foram colocadas em um prato petri vazio estéril de 60 x 15 mm e o prato foi colocado dentro de um prato petri vazio de 150 x 25 mm.

O tecido foi bombardeado com 1 tiro por placo com a pressão de ruptura de membrana ajustada para 650 PS! e a câmara foi evacuada para um vácuo de 27 a 28 polegadas de mercúrio.

O tecido foi colocado aproximadamente a 2,5 polegadas da tela de parada/retenção.

Seleção de Embriões Transformados: Os embriões transformados foram selecionados com o uso de higromicina como o marcador selecionável.

Especificamente, seguindo o bombardeamento, o tecido foi colocado em um meio SB196 fresco e cultivado — conforme descrito acima.

Seis a oito dias após o bombardeamento, o meio SB196 foi trocado com SB196 fresco contendo 30 mg/l de higromicina.

O meio de seleção foi renovado semanalmente.

Quatro a seis semanas pós-seleção, um tecido transformado verde foi observado crescendo de agrupamentos embriogênicos necróticos não transformados.

O tecido verde isolado foi removido e inoculado em placas de múltiplas cavidades para gerar culturas de suspensão embriogênicas | transformadas propagadas de maneira clonal e novas.

Maturação do Embrião: | Os agrupamentos embriogênicos transformados foram cultivados | por uma a três semanas a 26 ºC em SB196 sob bulbos fluorescentes brancos frios (Phillips cool white Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro) (40 watt) em um fotoperíodo de 16:8 com intensidade de luz de 90 a 120 upemºs. | Após este período, os agrupamentos de embrião foram removidos para um meio de ágar sólido, SB166, por 1 semana.

Então, subcultivados no meio SB103 por 3

| 102 | si | semanas.

Alternativamente, os agrupamentos de embrião foram removidos para meio líquido (SHaM) SB228, 35 ml em frasco Erlenmeyer de 250 ml, por 2a 3 semanas.

O tecido cultivado em SB228 foi mantido em um agitador rotatório, 130 rpm, 26 *C com luz fluorescente branca fria em fotoperíodo dia/noite de 16:8 h em intensidade de luz de 60 a 85 pE/m2/s.

Durante este período, os embriões individuais foram removidos dos agrupamentos e triados para alterações em suas composições de ácido graxo conforme descrito acima.

Receitas do Meio:

SB 196 — Meio de Proliferação Líquido FN Lite (por litro)

MS FeEDTA — 100x Estoque 1 10 ml

Sulfato de MS — 100x Estoque 2 10 ml

Haletos de FN Lite — 100x Estoque 3 10 ml

P, B, Mo de FN Lite — 100x Estoque 4 10m!

Vitaminas B5 (1 mVI) 10ml

2,4-D (concentração final de 10 mg/l) 10m!

KNO; 2,83 gm

(NH4)2SO, 0,463 gm

Asparagina 10gm

Sacarose (1%) 10 gm pH 5,8

Soluções Estoque de FN Lite

[Número do estoque =" T[1o00m = Tsoom “|

1 eee e

2

| feno Ta A

. 103 [Noúmerodoestaque — —— J1000m ———Tsoom | 3 [csch-2mo — scg [soa [o REEoa aaa Meio Sólido SB1 (por litro) 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL — Categoria Nº11117-066) 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque 31,5 g de glicose 2 ml de 2,4-D (concentração final de 20 mg/l) pH 5,7 8 gde TC ágar Meio Sólido SB199 (por litro) 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL — Categoria Nº11117-066) 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque 30g de sacarose 4 ml! de 2,4-D (concentração final de 40 mg/l) pH 7,0 2 gm de Gelrite Meio Sólido SB 166 (por litro) 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL — Categoria Nº 11117-066) 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque

. 104 60 g de maltose 750 mg de hexahidrato de MgCl, g de carvão ativado pH 5,7 5 2 g de Gelrite Meio Sólido SB 103 (por litro) 1 pacote de sais de MS (Gibco/ BRL — Categoria Nº 11117-066) 1 ml de vitaminas B5 1000X estoque 60 g de maltose 750 mg de hexahidrato de MgCl2 pH 5,7 2 g de Gelrite Meio Sólido SB 71-4 (por litro) 1 garrafa de sais B5 de Gamborg w/ sacarose (Gibco/ BRL — Categoria Nº 21153-036) pH 5,7 5 gde TC ágar 2,4-D Estoque Obter o preparado anteriormente da Phytotech Categoria Nº D 295- concentração de 1 mg/ml Estoque de Vitaminas B5 (por 100 ml!) Alíquotas de estoque a -20 ºC 10 g de Myo-inosito! 100 mg de ácido nicotínico 100 mg de HCl de Piridoxina 1 gde Tiamina | Se a solução não se dissolver rápido o suficiente, aplica-se um | nível baixo de calor via placa de agitação a quente. |

D 105 Maturação & Histodiferenciação de Soja - SB 228 (SHaM) (por litro) DDI HO 600ml Macro Sais de FN-Lite para SHaM 10X 100ml! Micro Sais de MS 1000x 1ml MS FeEDTA 100x 10ml CaCl 100x 6,82ml Vitaminas B5 1000x 1ml L-Metionina 0,149g Sacarose 30g Sorbitol 309g Ajuste de volume para 900 ml! pH 5,8 Autoclave Adiciona-se ao meio resfriado (<30C): *Glutamina (concentração final de 3SOMM) 4% 110ml *Nota: O volume final será de 1010 ml após a adição de glutamina. Devido ao fato de a glutamina se degradar relativamente rápido, pode ser preferível adicioná-la imediatamente antes do uso do meio. À expiração é de 2 semanas após a glutamina ser adicionada; o meio de base pode ser mantido por mais tempo com glutamina w/o. Macro de FN-lite para SHAM 10X- Estoque Nº 1 (por litro) (NH4)2SO, (Sulfato de Amônio) 4,639 KNO; (Nitrato de Potássio) 28,3g MgSO4*7H20 (Heptahidrato de Sulfato de Magnésio) 3,79 KH2PO; (Fosfato de Potássio, Monobásico) 1,859 Obter o volume | Autoclave |

J |

: 106 Micro de MS 1000X- Estoque Nº 2 (por 1 litro) H3BO; (ácido bórico) 6,2g MnSO,4*H2O (Monoidrato de Sulfato de Manganês) 16,9g ZnSO4*7H20 (Heptahidrato de Sulfato de Zinco) 8,69 NazMoO,4*2H70 (Diidrato de Molibdato de Sódio) 0,259g ' CuSO,*5H20 (Pentahidrato de Sulfato de Cobre) 0,025g CoCl2*6H20 (Hexahidrato de Cloreto de Cobalto) 0,0259g KI (lodeto de Potássio) 0,8300g Obter o volume Autoclave FeEDTA 100X- Estoque Nº3 (por litro) Na2EDTA* (EDTA de Sódio) 3,739 FeSO4*7H20 (Heptahidrato de Sulfato de Ferro) 2,789 *EDTA deve ser completamente dissolvido antes da adição de ferro.

Obter o volume A solução is fotossensível.

Garrafa(s) devem ser envoltas em folha metálica pra omitir a luz.

Autoclave Ca 100X- Estoque Nº4 (por litro) CaCl2*2H20 (Diidrato de Cloreto de Cálcio) 449 Obter o volume Autoclave Vitamina B5 1000X- Estoque Nº5 (por litro) Tiamina*HCI 10g | 25 Ácido nicotínico 19 | Piridoxina"HCI 19 Myo-lnositol 100g Obter o volume .

: 107 | - Armazenamento congelado | 4% Glutamina- Etoque Nº6 (por litro) | água DD! aquecida a 30ºC 900ml L-Glutamina 409 Adicionar gradualmente enquanto agita e aplicar baixo aquecimento.

Não exceder 35ºC.

Obter o Volume Esterilizar o filtro Armazenamento congelado * *Nota: estoque degelado aquecido em banho de 31ºC para dissolver totalmente os cristais.

Análise do óleo: Os embriões somáticos foram colhidos após duas semanas de cultivo no meio líquido de meio líquido de maturação líquido SB228 (SHaM). Aproximadamente 30 eventos foram criados em transformações com KS352, KS349/KS362, e KS362 e KS364. Todos os embriões gerados para um dado evento foram colhidos a granel e processados conforme a seguir.

Os embriões foram congelados em gelo seco ou por inoculação em um freezer a -80 ºC por duash e seguido por liofiização por 48 h.

Os embriões secos foram triturados a um pó fino com o uso de um frasco do tipo genogrinder (1/2"X2" de policarbonato) e uma esfera de aço (SPEX Centriprep (Metuchen, N.J., EUA). O tempo de trituração foi de 30 s em oscilações de 1450 por min.

Para cada evento, triplicatas de aproximadamente 10 mg de tecido foram pesadas em tubos de Eppendorf.

O tecido foi extraído com o uso de 200 ul de heptano à temperatura ambiente sob agitação contínua por 2 h.

Os extratos de heptano foram limpos através de centrifugação e 25 ul de extrato foi derivatizado de metil ésteres de ácido graxo conforme a seguir.

Um ml de uma

. 108 solução estoque de metóxido de sódio a 25% foi adicionado a 24 ml de metano! grau HPLC.

O metóxido de sódio foi armazenado sob um gás inerte.

Cinco ul de uma solução estoque (10 mg/ml) de 17:0 TAG (Nu- Chek Prep, Elysian, MN, EUA) foi combinada com 25 ul de extrato de tecido de heptano em um tubo de cultura de vidro de 500 ul de 1 % metóxido de sódio adicionado.

As amostras foram derivatizadas em um banho de água a 50 ºC por 15 min.

Permitiu-se que as amostras ' resfriassem à RT e 1 ml de NaCl 1 M foi adicionado seguido de uma breve mistura.

FAMEs foram extraídos em 1 ml de heptano e 4 ul de amostra foram quantificados por análise de GC.

A análise de dados foi realizada através da plotagem do teor de oleico (% do total de FAME) contra o teor de FAME total (% DW). À Tabela 8 mostra que os embriões somáticos gerados com um controle de vetor (KS352) mostram uma pequena flutuação no teor de ácido oleico e alguma flutuação em teor de óleo que pode muito provavelmente ser atribuído à variação biológica que é introduzida no processo de regeneração.

Por exemplo, os embriões muito provavelmente mostram a variação em seu estágio desenvolvido no momento da colheita.

Nos embriões gerados com a construção de controle nenhuma correlação (R2 = 0,1142) foi observada entre o teor de ácido oleico e o teor de óleo (TABELA 8). Nos embriões gerados com construção de plasmídeos que expressam os genes YL DGAT1 e YL DGAT?2 sozinhos, KS349 e KS362, respectivamente ou ambos os genes YL DGAT1 e DGAT2 (KS349/KS362, KS364) sob o controle de fortes promotores específicos de semente, tanto o teor de ácido oleico quanto o teor de ácido graxo esterificado total mostraram um amplo intervalo de flutuação.

Além disso, conforme mostrado nas figuras 4 e 5, uma forte correlação (R? 2 0,59) foi observada entre o teor de ácido oleico e o teor de ácido graxo esterificado total para

DO A EEEEET E EETD EDS A A A LITE EP ETR TE ET ET ET EEE A a A A A Ai TP EP o A TP TP ED DD : 109 | embriões somáticos gerados com KS349 e KS362 tanto sozinho quanto em | combinações assim como com KS364, um plasmídeo de transformação que contém cassetes de expressão para os genes YL DGAT1 e YL DAT?2. TABELA 8 — TEORDE ÁCIDO OLEICO E ÁCIDO GRAXO ESTERIFICADO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SoJA Ce eme

FE BIOT E Evento | (4DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) 2 ez fe dass da fas dra dra [36 sto de dass [es as dra [194 | [66 fse Je fis de as ba 19 | [6 se fa dass da fas dra aa [1 ss a ds o as dra [159 | [5 ss da fz [a fas da ma [e sa Ja fas dor aa da ma 3 sa da dra Je as da 1162 | [eo sa dra fre [so fas da ma Bode fe dies ds ls da js | ode e die ds das do [161 no sro da das fe as dra [567 | «4 dez fe dass de fo dra [1a | le dee e dee de da da [168 os de dare das ao da | | [1 sa ma ao 3 ao ja 1136

. 110 Nº do | FAME Ácido |Nºdo | FAME(% Ácido Evento | (4DCW) oleico | Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) a fo de mr de o a bas | e ee fes Je fe Te Tae [6 fo da ea lo se a 122 | e jso fe rs je ae he me | [66 so da ea de aro e dra e e Je e e de e qe [6 fee dao sr ds se e bis | [26 ao a rs [oo sa a [166 | 2 fe e [me de ss e dass | fee e Je fe fe Te] le as e [mo de ss a bios | [6 fas a o fo ar fa 155 | fe e e e e e | eo devo de ma do so e 162 | le faro eo [o der as a [160 | [eo das fa fa js das e 1a | [2 as da [se de 22 ba 1165 | [6 la la ee | [| [| |

Nº do | FAME Ácido | Nº do FAME(% Ácido Evento | (%DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) For AAA [25 [13 Jos jar do lo Jos das | | [19 7 oz dans | dis oo 209 | | e os oo jar dm 183 dos jara | 178 jos or das je les or j3o6 | [90 er joo fãs 6 ms 13 amo | 18 es jos jaxo | ns los 1265 | ada Aa [26 84 dor fog [1 Jos or 2372 | 6 les dos faro |236 os ot | 268 | Foro rr dr dee =| [5 far oz dass 2% jos oz am | dr dos fsos | Jos or ms | [2 ds dor jss2 | Jor dos avi |

Evento | (4DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) [26 rs 120 15 des oo [11 | [2º 66 os [164 | bre for ia | moles dor [27 | 7% os 13 | [5 fee for [286 | 72 os [2% | e jszo for 2 | dr os |: 1 sz jon [236 o | 72 oz |mó | 1 ss for faz 2 es os |ms | 1236 ss for [11 db? fi os 122 | [36 ss for aos |s 66 foz ma | 2 ss Jos [aa pp e sao for [rs o las dos de oo css xs | Nºdo | FAME Ácido | Nºdo FAME(% Ácido Evento | (4DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) [12 dez Jos fai da 6 dos 359 | po o o o o o o o o o o | | 113 Nº do |FAME Ácido |Nºdo | FAME(% Ácido Evento | (%4DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) [5 mo foz fas dao des Jos av | [26 fa for jonas oo jr fog | ase | [2 ds Too Tr das jus Jor 136 Nºdo | FAME Ácido |Nºdo | FAME(% Ácido Evento | (%DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) 110 os foz fe ja dns 16 docs | le for for fas ds na no josa [25 os for fr fe 1 14 [ao | 7 2 os as | for Jos 1308 [26 100 os [266 [a [7 os aa | [no les os aa 2 fis oz [62 [16 Jos for faz de for for 1526 | 1 fes os fa ]s oo os [35 | 125 as os fe dn os for js | zo des fon [me fe os os aro | 116 fa for 128 de oa [or dois | [26 as foz 116 fm los for ar

. 114 [O seen x = Nº do | FAME Ácido Nº do FAME(% Ácido Evento | (%DCW) oleico Evento | DCW) oleico (% de (% de

FAME FAME total) total) e leo or [as | jar fos fost | [er fra Jos fio Te far dor (3a 37 e jog 127 7 86 os 267 | [906 fee for dat a 76 for jest | 2 so los mar | 57 foz a | 1 de oa 290 |o jaz fog 1151 | 22 56 or me mu 42 for 11 | 8 as for ma dm as Jos jrno | [20 fas Tor a Em resumo, os dados mostram que os embriões somáticos de soja, similar à expressão do gene YL DGAT da semente de Arabidopsis estão associados à incorporação aumentada de ácido oleico na fração de ácido graxo esteríficada total. Entretanto, em contraste à Arabidopsis, em embriões somáticos de soja, o teor de ácido oleico aumentado é fortemente correlacionado ao acúmulo total de ácido graxo esterificado. Em outras palavras, a expressão de YL DGAT2 sozinho e a co-expressão de YL DGAT1I e YL DAGT2 em embriões somáticos de soja levam à biossíntese aumentada e incorporação de ácido graxos na fração de ácido graxo esterificada total. Tomando junto essa conclusão, esta sugere | fortemente que a expressão de genes YL DGAT fornece uma estratégia | eficiente ara atingir um aumento no total do teor de óleo da semente do soja.

EXEMPLO 6

EXPRESSÃO DE GENES DGAT DE YARROWIA LIPOLYTICA EM SEMENTE DE SOJA A construção de um plasmídeo de controle (KS332) (Figura 2) contendo apenas os cassetes de expressão CaMV 358 PRO/HPT/NOS TERekKtiPRO/DsRed/Kti TER é descrita no Exemplo 5. Sua sequência é apresentada como SEQ ID NO:51.

As linhagens de soja transgênicas foram geradas pelo método de bombardeamento por pistola de partícula (Klein ef a/., Nature (Londres) 327:70 a 73 (1987); Patente Nº U.S$.4.945.050) usando um instrumento BIORAD Biolistic PDS1000/He e DNA plasmídeo de KS332, KS362 e uma mistura 10:1 de KS349 e KS362 preparada conforme descrita no Exemplo

3. As seguintes soluções estoque e meio foram usados para a transformação e regeneração de plantas de soja: Soluções Estoque: | Sulfato 100X Estoque: 37,0 g de MgSO4.TH2O, 1,69 g de MNSOs.H2O, 0,86 g de ZNnSO4.7H2O, 0,0025 g de CuSO,4.5H20 Haletos 100X Estoque: 30,0 g de CaCl2.2H2O, 0,083 g de KI, 0,0025 g de CoCl2.6H2,0 P, B, Mo 100X Estoque: 185 g de KH.PO, 0,62 g de H;BO3, 0,025 g de Na2MoO,.2H20 Fe EDTA 100X Estoque: 3,724 g de NaçEDTA, 2,784 g de FeSO,.7H20 2,4-D Estoque: 10 mg/ml! de Vitamina B5 1000X Estoque: 10,0 g de myo-inositol, 0,10 g de ácido nicotínico, 0,10 g de piridoxina HCI, 1 g de tiamina.

Meio (por litro): SB196: 10 ml! de cada uma das soluções estoque acima, 1 ml de Vitamina B5 Estoque, 0,463 g de (NHa)> SO, 2,83 g de KNO;3, 1 ml de 2,4-D estoque, 1 g de asparagina, 10 g de sacarose, pH 5,7 SB103: 1 pacote de mistura de sais Murashige & Skoog, 1 mi de Vitamina B5 estoque, 750 mg de hexahidrato de MgCl,, 60 g de | maltose, 2 g de gelrite, pH 5,7.

SB166: SB103 suplementado com 5 g por litro de carvão ativado.

SB71-4: sais B5 de Gamborg, 1 ml! de vitamina B5 estoque, 30 gde sacarose, 5gdeTC ágar, pH 5,7.

Para preparar o tecido para a transformação, as culturas de suspensão embriogênicas de soja foram mantidas em 35 ml de meio líquido (SB196) em um agitador giratório (150 rpm) a 28 ºC com luzes fluorescentes que fornecem um ciclo de 16 h por dia /8 h por noite. As culturas foram subcultivadas a cada duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido fresco.

Nos procedimentos de bombardeamento por pistola de partícula é possível usar 1) DNA plasmídeo inteiro purificado; ou 2) fragmentos de DNA purificados contendo apenas o(s) cassete(s) de expressão de DNA recombinante de interesse. Para cada dezessete transformações de bombardeamento, 85 yul de suspensão são preparados contendo de 1 a 90 picogramas (pg) de DNA plasmídeo por par de base de cada DNA plasmídeo. Ambos os DNA plasmídeos foram —co-precipitados sobre partículas de ouro conforme a seguir. Os DNAs em suspensão foram adicionados a 50 pl de 20 a 60 mg/ml de uma suspensão de partícula de ouro 0,6 um e, então, combinados com 50 ul de CaCl, (2,5 M) e 20 ul de espermicina (0,1 M). A mistura foi submetida ao vórtex por 5 s, girada em uma centrífuga por 5 s, e o sobrenadante foi removido.

As partículas revestidas com DNA foram, então, lavadas uma vez com 150 ul de 100% etanol, submetidas ao vórtex e giradas em uma centrífuga novamente, então, ressuspensas em 85 ul de um etanol anidro.

Cinco ul das partículas de ouro revestidas com DNA foram, então, carregadas em cada disco de macrocarreador.

Aproximadamente 150 a 250 mg de cultura de suspensão de duas semanas de idade foram colocadas em um prato petri vazio de 60 mm X 15 mm e o líquido residual foi removido do tecido com o uso de pipeta.

O tecido foi colocado cerca de 3,5 polegadas afastado da tela de retenção e cada placa de tecido foi bombardeada uma vez.

A pressão de ruptura de membrana foi ajustada em 650 psi e a câmara foi evacuada para -28 polegadas de Hg.

Três placas foram bombardeadas, e, seguindo o bombardeamento, o tecido de cada placa foi dividido entre dois frascos, colocado de volta no meio líquido, e cultivado conforme descrito acima.

Sete dias após o bombardeamento, o meio líquido foi trocado com meio SB196 fresco suplementado com 30 a 50 mg/l de higromicina.O meio seletivo foi subsequentemente renovado semanalmente ou bi- semanalmente.

Sete semanas pós-bombardeamento, um tecido transformado verde escuro foi observado crescendo de agrupamentos embriogênicos necróticos ou cloróticos não transformados.

O tecido verde isolado foi removido e inoculado em cavidades individuais em pratos de cultura de seis cavidades para gerar culturas embriogênicas transformadas clonalmente propagadas.

Assim, cada nova linhagem foi tratada como um evento de transformação independente em uma cavidade individual.

Essas suspensões podem, então, ser mantidas como suspensões de embriões agrupados em um estágio de desenvolvimento imaturo através do subcultivo ou podem ser regeneradas na planta por

. 118 inteiro através da maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

Após duas semanas em cavidades de célula individual, os agrupamentos embriogênicos transformados foram removidos da cultura de líquido e colocados em meio solidificado (SB166) não contendo hormônios ou antibióticos por uma semana. Os embriões foram cultivados a 26 ºC com luzes incandescentes e fluorescentes misturadas em uma programação de 16 h por dia / 8 h por noite. Após uma semana, as culturas foram, então, transferidas ara meio SB103 e mantidas nas mesmas condições de crescimento por 3 semanas adicionais.

Os embriões somáticos se tornaram adequados para germinação após quatro semanas e, então, foram removidos do meio de maturação e secos em pratos petri vazios de um a cinco dias. Os embriões secos foram, então, plantados em meio SB71-4 no qual permitiu-se que germinassem sob as mesmas condições de temperatura e luz conforme descrito acima. Os embriões germinados foram transferidos para solo estéril e cultivados até a maturidade para a produção de sementes.

: Um total de 29 linhagens transgênicas com sementes foi gerado com DNA plasmídeo intacto de KS362 em concentração de 15 pg por bp de DNA plasmídeo por preparação de partícula de ouro (ver acima). Para cada evento, 20 sementes foram pontuadas para a presença do gene marcador DS. Brevemente, as sementes foram observadas sob um microscópio estéreo (Leica MZ Fluo Il!) com o uso de uma fonte de luz UV. Um conjunto de filtro customizado para fluorescência associado à expressão de DsRed com as propriedades seguintes foi usado: Excitação A=540 a 580 nm / Emissão A > 570 nm. Nos casos em que menos do que 20 sementes estavam disponíveis, todas as sementes foram pontuadas dessa maneira. Subsequentemente, o teor de oleaginosidade do soja foi medido por NMR conforme descrito previamente 3. Dezenove eventos gerados com KS362 continham sementes que eram positivas para DsRed. Dentre essas, 11 eventos mostraram uma diferença detectável no teor de óleo entre segregantes transgênicos positivos DsRed e não segregantes negativos DsRed. Os dados estão resumidos na TABELA 9.

TABELA 9 TEOR DE ÓLEO NA SEMENTE DE SOJA DE T1 GERADO COM KS362 % Média % Média | % deltade | % Nulo DsRed + | Pontos delta para óleo para óleo Um total de 10 linhas transgênicas com semente foi gerado com 9 DNA de KS332. Para cada ocorrência, 20 sementes foram classificadas quanto à presença do gene do marcador DS, conforme descrito acima. Nos casos em que menos do que 20 sementes estavam disponíveis, todas as sementes foram classificadas desta maneira. Posteriormente, o teor de óleo de soja foi medido por NMR, conforme descrito no Exemplo 4. Sete ocorrências geradas com KS 9 332 continham sementes positivas para DsRed. Os dados encontram-se resumidos na TABELA 10. TABELA 10 TEOR DE ÓLEO NA SEMENTE DE SOJA DE T1 GERADO COM KS332 % Média % Média | % delta de % Nulo para DsRed + Pontos delta óleo para óleo AFS4703.1.1.1 AFS4703.1.2.1 AFS4703.1.6.1 |5 204 15 [21440 1170 -—-"-"l5o | AFSA703.231 |8 221 [12 12117 0-9 41 | AFSA703.24.1 |6 222 14 2317 dos |-20 | AFSA4703.38.1 |6 218 —l14 218 joo fo2 | AFSA7O3.3.161 |5' 238 js 233 [068 |-25 | Ao contrário da semente gerada com o KS362, para semente transgênica gerada com o KS332 nenhum aumento consistente em óleo poderia ser associado à presença do marcador DsRed nos segregantes T1. Quatro eventos gerados com KS362 foram submetidos à análise sobre a condição do DsRed e o NMR em óleo para todas as sementes em T1 disponíveis.

Os dados estão resumidos na TABELA 11. TABELA 11 TEOR DE ÓLEO NA SEMENTE DE SOJA DE T1 GERADO COM KS362 % Média % Média % delta de % Nulo para DsRed + Pontos delta óleo para óleo AFS4822.4.5.1 | 8 |120 [24 183 63 ——>>—l529 | AFS4822.1.13.1 | 17 [150 —T42 [187 137 246 | AFS4822121 | 4 |157 Tao [193 135 1223 | AFS4822210.1 | 8 [195 125 230 135 [178 | AFS4822.2111 | 6 [179 17 123 2a [135 | Em suma, os dados apresentados nas tabelas anteriores e na Figura 7 mostram que a expressão específica de semente de YL DAGT2 conduz a uma biossíntese progressiva de óleo durante a maturação da semente de soja e, portanto, fornece uma ferramenta eficaz de engenharia metabólica para aumentar o acúmulo de óleo nas sementes de soja.

Um total de 16 linhas transgênicas com semente foi gerado por meio de bombardeamento conjunto de DNA de KS349 e de KS362 que foi misturado a uma razão de 10:1 (consulte o Exemplo 4). A mistura de DNA foi entregue em transformação de semente de soja a uma concentração final de

15 pg por bp de DNA de plásmídeo pela preparação da partícula dourada.

Em suma, antes do bombardeamento, o DNA KS349 foi digerido com Pstl, Xhol para inatividade do gene marcador selecionável neste plasmídeo.

O DNA de KS362 foi linearizado com o Sail.

É razoável admitir que devido ao pré- tratamento do DNA, o gene do marcador selecionável em todas as transformações foi entregue a partir do plásmideo (KS362) que foi bombardeado na mais baixa concentração de DNA.

A inspeção inicial destas sementes sob fluorescência inicial estéreo-microscópica revelou que muito poucas ocorrências desta transformação continham semente de T1 que deram positivo para o marcador DsRed.

Este resultado pode ter ocorrido devido à proximidade do cassete de expressão DsRed com o final do fragmento de restrição Sal/ de KS362 que foi usado para a transformação da semente de soja.

O resultado

—podetersido a integração de fragmento de DNA de KS362 que não continha um cassete de expressão DsRed funcional.

Por este motivo, a semente de T1 foi submetida à triagem pela ausência do YL DGAT derivado da transgenia pela avaliação da composição de ácido graxo de semente.

Para cada evento 20 sementes foram analisadas pela semente GC. 50 sementes de soja não transformadas foram processadas da mesma maneira.

Lascas de semente de soja foram produzidas cortando a semente com uma lâmina de barbear evitando o eixo geométrico embrionário.

As lascas da semente com aproximadamente 2 mg foram colocadas em um frasco contendo 50 ul de hidróxido de trimetilsulfônio e 0,5 mL de hexano.

As lascas ficaram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente durante agitação. 50 ul de camada de hexano foram injetados em um Cromatógrafo Gasoso Hewlett Packard 6890 que continha uma coluna capilar com sílica em fusão Omegawax (Supelco Cat.

Nº 24152). As condições do forno eram as seguintes: temperatura inicial de 220ºC por 2,7 minutos, com curva para 240ºC por cerca de 1 minuto e mantida a 240ºC, por um tempo total de execução de 6 minutos.

Os tempos de retenção foram comparados aos padrões disponíveis comercialmente (Nu-Chek Prep, Inc.

Cat. ! Nº U-99-A). Os ácidos graxos foram determinados por transesterificação direta ' de padrões individuais em 0,5 mL de H2SO, metanólico (2.5%). Os ésteres | metila de ácido graxo foram extraídos das soluções metanólicas formando hexano após a adição de um volume equivalente de água.

Dez eventos foram identificados contendo semente de T1 com 225% de conteúdo de ácido oleico.

Uma vez que este conteúdo de ácido oleico não foi observado na semente de soja não-transformada (consulte Figura 6 e TABELA 12) e o conteúdo aumentado de ácido oleico foi previamente associado com a co-expressão de YL DGAT2 e YL DGAT1 e YL DGAT?2 tanto na semente de Arabidopsis quanto nos embriões somáticos da semente de soja, acredita-se que a presença de ácido oleico a níveis de < 25% confira meios para identificar o YL DGAT positivo em Semente de T1. Depois da análise GC quanto à genotipagem YL DGAT, as sementes foram submetidas à medição de óleo pelo NMR conforme previamente descrito (Exemplo 3). Quando o conteúdo de ácido oleico foi plotado de encontro a um teor total de óleo, sete dos 10 eventos com semente de T1 de 225% mostraram uma correlação de R? > 0,3 entre o óleo e o conteúdo de ácido oleico.

As propriedades destes eventos estão descritas em maiores detalhes na TABELA 12. TABELA 12 TEOR DE ÓLEO NA SEMENTE DE SOJA EM T1 GERADA COM KS349/KS362 % Média % Média %Deltade | % %Rº Óleo < que Óleo > 25% | Pontos Delta | Oleico 25% Oleico 1% de Oleico óleo LaFsAB18.3.11 [15 [119 65 fase a ao as | | aFSA818.1.5.1 [10 [155 J1o0 (200 Tas ÔÚÀÚÀUu>g7 069 | |AaFSA818.2101 |10 [132 ——J1aol165 —>=Ja3 = 252 039 | LaFsa818.1.9.1 |5 129 —>——J14 1159 3 "úúl229 fost |

% Média % Média —[%Deltade |% % R Óleo < que Óleo > 25% | Pontos Delta | Oleico 25% Oleico 1% de Oleico óleo AFS4818.26.1 |12|186 8 219 134 181 os: | | AFS4818.13.1 |6 |205 —— 14/2368 137 —-"õl149 Joss | AFSA818.121 |6 [194 (14/28 124 [124 jo37 | peso) Sementes do tipo selvagem de Jack desenvolveram-se mediante condições similares àquelas empregadas na geração de sementes em T1 e foram avaliadas pela análise de GC e NMR.

Observou-se que os teores de ácido oleico e óleo flutuaram entre 7,6 a 20,5% e 186 a 25,2%, respectivamente.

Nenhuma correlação entre o conteúdo de ácido oleico e o teor de óleo pôde ser observada na semente de soja não-transformada.

Quatro eventos gerados com KS349/KS362 foram submetidos à análise de GC de NMR de todas as sementes disponíveis em T1. Os dados encontram-se resumidos na TABELA 13. TABELA 13 TEOR DE ÓLEO NA SEMENTE DE T1 DE SOJA GERADA coM KS349/KS362 % Média % Média | %Deltade |% % R? Óleo < que Óleo > Pontos Delta | Oleico/ ã o 25% % de Oleico óleo asas ja os ja jaz ão ae [os | AFSA818.26.1 49 [181 — 23 219 137 ——>>——l2o7 Joso | AFSAB18.1.3.1 AFSA818.12.1 [13 [193 ——S/2s 221 127 last joass | Conciliando-se os dados apresentados nas tabelas anteriores e nas Figuras 6 e 7 eles suportam com veemência a conclusão de que a co- expressão dos genes YL DGAT1 e YL DGAT2, como a expressão do gene YL —DGAT?2 isoladamente, proporciona uma estratégia eficaz para que se obtenha um aumento no teor total da semente de soja.

Adicionalmente, verifica-se que um alto índice de eventos poderia ser identificado com uma diferença de >2%

: | pontos em óleo entre os segregantes nulos e transgênicos na triagem entre um | conjunto pequeno de eventos de transgênicos. | EXEMPLO 7 EXPRESSÃO DE YARROWIA LIPOLYTICA NOS GENES DGAT Do MiLHo Com base em resultados que foram revelados nos Exemplos 4, 5 e 6 do presente pedido, os genes YL DGAT1 e YL DGAT2 podem ser expressos nas sementes embrionárias do milho para aumentar o teor de óleo deste tecido.

Conforme descrito abaixo, este resultado pode ser alcançado pela transformação do milho com cassetes de expressão que compreendem quadros de leitura abertos para DGAT1 e DGAT2 da Yarrowia lipolytica operativamente ligados nas suas 5' terminações aos promotores embrionários preferenciais, como o promoter do gene de oleosina do milho para 16 kDa (Lee, K. e Huang, A.H., Plant Mol.

Biol. 26:1981 a 1987 (1984)) e o terminal e promotor embrionário do milho abundante (EAP1) (US 2006272058A1). Um cassete de expressão que compreende o promotor do gene de olesina 16 kDa (OLE PRO), a sequência de codificação do gene YL DGAT?2 (SEQ ID NO:9) e a sequência/terminal do sinal de poliadenilação da síntese do gene de nopalina (NOS) da Agrobacterium tumefaciens são construídos com o uso de métodos e tecnologias conhecidas na técnica.

Um Segundo cassete de expressão do gene YL DGAT1 mediante controle transcricional do promotor e do terminal da proteína abundante no embrião do milho (EAP1), com o ADH1 INTRON1 do milho inserido entre o promotor e a sequência de codificação para a obtenção de uma acentuada expressão.

Os dois cassetes de expressão são ligados um com o outro com um gene que encodifica um marcador selecionável em um vetor binário adequado para a transformação do milho mediada pela Agrobacterium.

Um provocou baseado na Agrobacterium pode ser usado para a transformação do milho (consulte abaixo). O vetor binário resultante é introduzido nas células da Agrobactejum LBA4404 (PHP10523) preferencialmente por meio de eletroporação.

Uma recombinação in vivo gera um plasmídeo co-integrado entre o vetor binário introduzido e o plasmídeo vir (PHP10523) que reside nas células da Agrobacterium.

As células de —Agrobacterium resultantes são utilizadas para transformar milho.

Transformação de Milho Mediada pela Agrobacterium: Os embriões imaturos do milho recém isolados com cerca de dez dias após a polinização (DAP), podem ser incubados com a Agrobacterium.

O genótipo preferencial para transformação é o genótipo altamente transformável Hill (Armstrong, Maize Gen.

Coop.

Boletim Informativo 65:92 a 93 (1991)). Um F1 híbrido criado pelo cruzamento do Hi-ll com um inato de elite também pode ser utilizado.

Após o tratamento de embriões imaturos com Agrobacterium, os embriões podem ser submetidos à cultura em meio contendo níveis tóxicos de herbicida.

Apenas aquelas células que receberam o gene resistente a herbicida e o(s) gene(s) ligado(s), crescem em meio seletivo.

Os eventos transgênicos selecionados assim podem ser propagados e regenerados para plantas totais, produzirem sementes e transmitirem transgenes para progênie.

Preparação da Agrobacterium: A Agrobacterium tumefaciens LBA4404 construída por engenharia genética para conter plasmídeos para a expressão preferencial da semente em YL DGAT1 e YL DGAT?2, conforme revela a Patente nº U.S. 5.591.616 (cujo conteúdo está incorporado pelo presente a título de referência). Para usar a construção da engenharia genética na transformação da planta, uma placa mestre com uma única colônia bacteriana transformada com plasmídeos para a expressão preferencial dos genes YL DGAT1 e YL DGAT2n pode ser preparada pela inoculação da bactéria em meio AB mínimo e possibilitando-se : a incubação a 28ºC por aproximadamente três dias. (A composição e | preparação de meio AB mínimo foram previamente descritas na Publicação

PCT sob nº WO 02/009040 (cujo conteúdo o presente incorpora a título de referência). Uma placa de trabalho pode então ser preparada fazendo traços na Agrobacterium transformada em meio de extrato de levedura YP (0,5% (peso/volume), 1 % de peptona (peso/volume), 0,5% de cloreto de sódio (pesoívolume), 1,5% (peso/volume) de Agar que contém 50 ug/ml de espectinomícina.

A Agrobacterium transformada para co-cultivo e transfecção de planta pode ser preparada com um dia de antecedência da transformação do milho. Com 30 mL de um meio mínimo A (preparado conforme descrito no WO 02/009040), dentro de um frasco colocou-se 50 ug/mL de espectinomicina, 100 V9/M de acetosiringona e cerca de 1/8 da alça de Agrobacterium ficando de um a dois dias na placa de trabalho. A Agrobacterium pôde então crescer a 28ºC com agitação a 200 rpm por aproximadamente quatorze horas. Na fase de registro médio, a Agrobacterium pôde ser cultivada e ressuspensa a uma densidade de 3 a 5X 108 CFU/mL em meio de 561 Q que contém 100 uM de acetosiringona usando técnicas microbicidas padrão. A composição e a preparação do meio 561 Q foram descritas no WO 02/009040. Preparação de Embrião Imaturo: De nove a dez dias após a polinização controlada de uma planta de milho, os embriões imaturos em desenvolvimento ficam opacos e com 1 a 1,5 mm de comprimento. Este comprimento é um tamanho ótimo para infecção com A Agrobacterium transformada PHP18749. As espigas descascadas podem ser esterilizadas com alvejante comercial na concentração de 50% adicionando-se um agora de Tween-20 durante trinta minutos e em seguida | 25 —enxaguadas duas vezes com água esterilizada. Os embriões imaturos podem | então ser removidos com assepsia do cariopse e colocados em 2 mL de | solução mantida estéril consistindo em um meio de 561 Q que contém 100 uM de acetosiringona.

Infecção com Agrobacterium e Co-cultivo de Embriões: A solução de controle pode ser decantada dos embriões imaturos extirpados e substituídos por Agrobacterium transformada.

Depois de uma | misturação branda e incubação por cerca de cinco minutes, a Agrobacterium | 5 — pode ser decantada dos embriões imaturos.

Os embriões imaturos foram então | movidos para uma placa com meio de 562P, cuja composição foi previamente descrita no WO 02/009040. Os embriões imaturos podem ser colocados na superfície do escutelo voltado para cima e em seguida incubada a 20ºC durante três dias no escuro.

Esta etapa pode ser seguida da incubação a 28ºC por três dias em local escuro no meio 562P que contém 100ug/mL de carbenecilina, conforme descrito na Patente nº U.S. 5.981.840. Seleção de Eventos de Transgênicos: Após a incubação, os embriões imaturos podem ser transferidos para o meio 5630, que pode ser preparado conforme descrito noWoO 02/009040. Este meio contém Bialafos para a seleção das células de plantas transgênicas conforme conferido pelo gene BAR que é ligado ao cassete de expressão da cevada HGGT.

Em intervalos de dez a quatorze dias, os embriões foram transferidos para o meio 5630. O tecido embriogênico transgênico putativo em franco crescimento pode ficar depois de seis a oito dias no meio 5630. | Regeneração Plantas To: O tecido embriogenético transgênico é transferido para o meio ' 288W e fica incubado a 28ºC no escuro até que amadureçam os embriões somáticos ou de cerca de dez a dezoito dias.

Os embriões somáticos maduros individuais com escutelo e coleóptilo bem definidos são transferidos para o meio 272 de germinação embrionária e incubados a 28ºC na luz.

Depois de os brotos e raízes emergirem, plantas são plotadas individualmente e plantadas profundamente no solo com o uso de métodos típicos da horticultura.

O meio 288W contém os seguintes ingredientes: 950 ml de água deionizada; 4,3 g de sais MS (Gibco); 0,1 g de mio-inositol; 5 ml de solução estoque de vitaminas MS (Gibco); 1 ml de zeatina (solução de 5 mg/ml); 60 gde sacarose; 8 g de ágar (Sigma A- 7049, Purificado), 2 ml! de ácido acético indo! (solução* de 0,5 mg/mL); 1 mi! de 0,1 MM ABA*; 3 ml de bialafos ( solução* de 1 mg/mL); e 2 mL de carbenicillina (solução de 50 mg/mL).

O pH dessa solução é ajustado para um pH de 5,6. A solução é autoclavada e os ingredientes marcados com um asterisco (*) são adicionados após o meio ter resfriado a 60ºC.

O meio 272 contém os seguintes ingredientes: 950 mL de água deionizada; 4,3 g de sais MS (Gibco); 0,1 g de mio-inositol; 5 mL de solução estoque de vitaminas MS (Gibco); 40 g de sacarose; e 1,5 g de | 15 Gelrita. Essa solução é ajustada para um pH de 5,6 e, então, ela é autoclavada.

EXEMPLO 8 ANÁLISE DO CONTEÚDO DO ÓLEO DA CARIOPSE (KERNEL) | Análise de ressonância magnética nuclear (NMR): A semente é embebida em água destilada durante 12 a 24 horas a 4ºC. O embrião é dissecado e armazenado em uma placa com 48 cavidades. As amostras são liofilizadas durante a noite em um liofilizador Virtis 24x48.

O NMR (Tecnologias de controle de processo - PCT (Ft. Collins, CO) é configurado de acordo com as instruções do fabricante. O NMR é calibrado com o uso de uma série de 5 mm de tubos NMR contendo quantidades precisamente medidas de óleo de milho (Mazola). Os padrões de calibração são 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 27, 33, e 40 mg de óleo.

EXEMPLO 9 SÍNTESE DE GENES DE YL DGAT1 e YL DGAT2 As sequências de nucleotídeo que encodificam os YL DGAT1 e YL DGAT?2 foram projetadas para a expressão otimizada em semente de sojacom ouso de métodos similares àqueles descritos em Wu, G et al. Nucleic Acids Research (2007), 35: D76-D79; Villalobos, A. et al. BMC Bioinformatics (2006), 7 No pp. given; Wu, G. et al. Protein Expression and Purification (2006), 47: páginas 441 a 445; Richardson, S. M. et al. Genome Research (2006), 16: 550 a 556; Jayaraj, S. et al. Nucleic Acids Research (2005) 33: 3011 a 3016. As moléculas de DNA foram sintetizadas pelo DNA 2.0 (Menlo Park, CA, EUA, USA). As sequências de DNA de expressão otimizada de YL DGAT1 e YL DGAT2 são demonstradas na SEQ ID NO:64 e SEQ ID NO:66, respectivamente. As sequências de aminoácido para as enzimas otimizadas de soja são demonstradas na SEQ ID NO:65 (YL DGAT1) e SEQ. ID NO:67 (YL DGAT?2) e são idênticas aos produtos de translação da SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:9, respectivamente. EXEMPLO 10 |

COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DOS EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA QUE EXPRESSAM OS GENES YL DGAT.

Os embriões somáticos transgênicos foram gerados com o uso das construções de plasmídeo KS352, KS349, KS362 e KS364. A geração das construções de DNA e o processo de transformação são descritos em detalhe no EXEMPLO 5. A composição de ácido graxo foi determinada pela análise por cromatografia a gás de metil ésteres de ácido graxo gerados pela derivatização de metóxido de sódio de extratos de heptano. As constatações são sumarizadas na Tabela 14. A tabela compara a composição de ácido graxo dos 100 eventos gerados com um plasmídeo de controle desprovido dos genes YL DGAT com | | aqueles dos eventos criados com os plasmídeos contendo YL DGAT1 (KS349), YL DGAT?2 (KS362) ou ambos os genes (KS364). Para os eventos gerados com YL DGAT contendo construções de DNA, a composição média de ácido graxo de todos os eventos com mais de 30 % oleico é mostrada. TABELA 14

COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA GERADOS COM KS352, 349, 362, 3498362 E 364 Plasmídeo Ácido Ácido Ácido Ácido Ácido palmítico esteárico oleico linoleico linolenico [mssisdersasz — jo fio sz [me far es | Intervalo de KS352 126a208 |42a66 12,3a22,9 | 39,3a46,9 | 124 a 23,5 média de KS349 (> 30% oleico) Intervalo de KS349 10,7a128 |42a65 30,5a37 |38,7a446 |7,8a10,7 (> 30% oleico) | média de KS362 (> | 30% oleico) | Intervalo de KS362 1092127 |5,7a7,0 30,6 a 33,1 | 41,9a44,8 |6,2a7,7 | (> 30% oleico) média de 39,7 KS3498.362 (> 30% oleico) Intervalo de 115a144 |38a7,0 30,8 a 35,5 | 38 a 42,7 6,3 a 10,3 KS3498&362 (> 30% oleico) média de KS364 (> 57 30% oleico) Intervalo de KS364 5,98a7,7 32,8 a48,6 | 314a42,7 | 3,2a6,5 (> 30% oleico) A tabela mostra que a expressão de YL DGAT1 ou YL DGAT2 bem como a co-expressão dos ditos genes alteram o perfil FA dos embriões somáticos de soja. A alteração mais pronunciada é um aumento do ácido oleico e uma diminuição do ácido linolênico que observada de maneira consistente com todas as construções de DNA testadas. A expressão dos genes YL DGAT também ocasiona uma diminuição do ácido palmítico e linoleico e um aumento no ácido esteárico. |

EXEMPLO 11

COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DA SEMENTE DE SOJA QUE EXPRESSA OS GENES YL DGAT. O evento AFS4822.1.13.1 foi gerado com o uso de um plasmídeo —DNA de KS362 conforme descrito no exemplo 6. As sementes transgênicas T! mostram um aumento no conteúdo de óleo de 24,6 % quando comparadas a uma semente não segregante da mesma planta T1. Esta observação sustenta fortemente a conclusão de que estes eventos expressam YL DGAT2. A semente T1 de AFS4822.1.13.1 com ou sem o transgene YL DGAT? foi germinada e cultivada na câmara de cultivo durante três meses. A semente T1 positiva de DS-red do evento AFS4703.1.6 foi germinada e cultivada ao longo do evento YL DGAT2. O evento AFS4703.1.6 foi gerado com KS332, um vetor de plasmídeo que contém o gene identificador da DS-red mas que não contém YL DGAT?2 (vide Exemplo 5). Vários segregantes T1 que produziram apenas uma semente T2 positiva da DS-red indicando que essas linhas foram homozigoto para o transgene respectivo poderia ser identificados. A semente T2 colhida da prole não segregante foi DS-red negativa confirmando que essas linhas provavelmente não continham um transgene funcional.

Para cada seleção, seis sementes foram quebradas e a | composição de ácido graxo dos pedaços integrados de semente foi analisada | por derivatização de TMSH seguida da cromatografia por gás conforme | descrito no exemplo 6. A tabela 15A compara a composição média de ácido graxo de seis pedaços de semente de segregantes positivos da DS-red do evento AFS4822.1.13.1 com esses pedaços de semente derivados de uma planta não segregante e com esses pedaços de semente do evento AFSA4703.1.6 contendo apenas o gene identificador da DS-red. Isso demonstra que a expressão de YL DGAT? altera o perfil de FA da semente de soja. A alteração mais pronunciada é um aumento de ácido oleico e uma diminuição de ácido linolênico.

A expressão dos genes YL DGAT também leva a uma diminuição do ácido palmítico e linoleico e um aumento do ácido esteárico.

TABELA 15A COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DA SEMENTE DE SOJA T2 GERADA COM KS362 e e Ti elis [8 uid [ft palmítico esteárico oleico ) linoleico linolenico Média de 10,8 4,6 292 [495 AFS4822.1.13.1 (DS red positiva Média de 12,0 3,4 16,3 AFS4822.1.13.1 (não segregante) Média de 11,5 3,3 158 [598 9,6 AFS4703.1.6 DS red positiva ' Os eventos AFS4818.1.9 e AFS4818.1.3 foram gerados com o do uso de uma mistura de fragmentos de DNA derivados dos plasmídeos KS349 (YL DGAT1) e KS362 (YL DGAT2) conforme descrito no exemplo 5. As sementes transgênicas T1 desses dois eventos mostram um aumento no conteúdo de óleo de 22,9 e 16,2 %, respectivamente, quando comparado com uma semente não segregante da mesma planta T1. Embora esta observação sustente fortemente a conclusão de que ambos os eventos que expressam o YL DGAT derivado de transgene, não está claro se ambos os eventos contêm cópias intactas de ambos ou de apenas um gene DGAT presente na mistura de DNA usada na transformação.

A semente T1 com um conteúdo de ácido oleico e de óleo aumentado (vide Exemplo 6) foi plantada para os eventos AFS4818.1.2, AFS4818.1.3, AFS4818.1.5, AFS48182.6, AFS4818.1.9. O DNA foi isolado, digerido com as duas enzimas de restrição EcoRI e Hindlll, e transferido para as membranas de náilon com o uso de protocolos padrão.

As nódoas duplicadas foram produzidas e hibridizadas independentemente com as sondas que correspondem a um fragmento de restrição de 1,21 kb do gene YL

DGAT1 (gerado pela digestão de KS349 com Ncol/EcoRI) e os genes YL DGAT? intactos (gerados pela digestão de Notl de KS 362). Com base na sequência de KS 349 (SEQ ID NO:48) e KS 362 (SEQ ID NO: 52), a inserção de uma cópia intacta dos genes YL DGAT1 e YL DGAT2 no genoma de soja poderia ser indicada por um forte sinal de hibridização dos fragmentos de restrição com um tamanho =1,908 kb e 23,335 kb, respectivamente. Dessa maneira, todos os eventos apresentaram fortes faixas de hibridização de 1,908 kb quando uma sonda do YL DGAT1 foi usada (figura 8 A). Nenhum sinal de hibridização foi observado quando o DNA de feijões soja não modificados foi usado (pistas 11 e 12, figuras B8A e B). Isto demonstra que todos os eventos testados têm inserções de ao ! menos uma cópia do cassete de expressão de YL DGAT1 intacto presente em KS 349. Entretanto, quando o DNA de YL DGAT2 foi usado nos o experimentos de hibridização, o evento 4818.1.9 não apresentou apenas uma faixa de hibridização muito fraca de MW alto enquanto que todos os outros eventos testados apresentaram fortes faixas de hibridização de >3.335 kb (pista 9, figura 8 B). O próximo DNA genômico de todos os cinco eventos foi digerido com BstXl, transferido para as membranas de náilon, e sondado com o DNA de YL DGAT?2 intacto gerado conforme descrito acima (figura 9). A inserção de uma cópia intacta do cassete de expressão de YL DGAT?2 poderia ser indicada pelas fortes faixas de hibridização de 0,584 kb (fragmento interno) e fragmentos adicionais de >0,2 e >0,77 kb. Todos os eventos exceto pelo 4818.1.9 apresentam o padrão de hibridização indicativo da inserção completa de YL DGAT2. Concluiu-se que o evento

4818.1.9 contém apenas uma unidade de expressão funcional para o YL DGAT1. As plantas T1 dos eventos 4818.1.9 e 4818.1.3 que foram derivadas da semente com um conteúdo oleico e de óleo aumentado do evento

4818.1.9 e 4818.1.3 foram cultivadas até a maturidade e as sementes foram colhidas.

A composição de ácido graxo da semente T2 foi determinada pela derivatização TMSH e da análise GC dos pedaços de semente derivados da semente T2. A tabela compara a composição de ácido graxo das sementes não — segregantes e transgênicas de uma planta T2 de 4818.1.9 e 4818.1.3 (tabela 15B). Isso demonstra que a expressão de YL DGAT1 bem como a co- expressão de YL DGAT1 e YL DGAT?2 alteram o perfil de FA da semente de soja.

A alteração mais pronunciada é um aumento no ácido oleico e uma diminuição no ácido linoleico.

A expressão dos genes YL DGAT também leva a uma diminuição nos ácido palmítico e linoleico e a um aumento no ácido esteárico. . TABELA 15B i COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DA SEMENTE DE SOJA T2 GERADA PELA CO- o TRANSFORMAÇÃO COM KS349 E KS362 E Et 5h ee [E [EE palmítico esteárico oleico linoleico linolenico AFS4818.1.9 Média de 12,2 14,3 57,0 13 AFS4818.1.9 (não segregante) AFS4818.1.3 Média de 3,0 58,7 10,5 AFS4818.1.3 (segmento nulo) EXEMPLO 12 ANÁLISE DE EVENTOS TRANSGÊNICOS: CÂMARA DE CULTIVO O presente exemplo descreve medições do conteúdo de óleo do soja derivado das plantas T2 que foram homozigotos heterozigotos para .transgenes compreendendo YL DGAT1 ou YL DGAT2 ou ambos os genes YL DGAT.

As — plantas T2 foram cultivadas em um ambiente controlado (câmara de crescimento).

A análise de óleo da semente de soja T2 derivada das plantas cultivadas em uma câmara de crescimento de planta foi realizada por NMR. A semente foi colhida forma plantas individuais. As seleções de semente de plantas heterozigotas derivadas que formam transformações como gene DGAT2 da Yarrowia apresentaram uma segregação do identificador de DS red. O conteúdo de óleo de semente positiva de DS red (com transgene DGAT2) e uma semente não segregante da mesma planta é mostrada na tabela 16. No dito conteúdo de óleo da tabela da semente contendo o DGAT2, o transgene é comparado àquele da semente não segregante não transgênica da mesma planta. TABELA 16

CONTEÚDO DE ÓLEO DA SEMENTE TRANSGÊNICA E DA SEMENTE NÃO SEGREGANTE ' DERIVADO DAS PLANTAS T2 DE SOJA TRANSGÊNICO QUE SEGREGAM O TRANSGENE COM O GENE DGAT2 DE YARROWIA Evento Planta — (%) Média n (%) Média n %A % A de óleo de óleo pontos com nulo transgene

4822.1.13 A 22,2 37 19,6 1 2,3 11,5 B 214 27 19,5 13 média 21,8 19,6

4822.4.5 A 22,3 35 184 13 3,6 19,6 B 22,5 38 18,5 10 Cc 21,7 31 17,7 17 D 22,7 31 18,2 117 E 21,7 23 18,9 17 média 22,2 18,6

4822.1.9 A 22,9 33 20,4 7 2,5 12,3

4822.2.10 A 24,3 62 20,1 24 3,3 16,3 B 23 30 19,5 10 Cc 22,5 23 20,5 17 média 23,3 20,0 As seleções da semente T2 dos eventos gerados pela co- transformação de KS349 e KS362 foram triadas por meio da análise GC | | õ dos pedaços de semente conforme descrito acima (exemplo 6). A re ENE sementes foram colhidas das plantas individuais. As seleções de semente das plantas heterozigotas derivadas das transformações com os genes DGAT de Yarrowia segregados para um conteúdo de ácido —oleico elevado (> 22% do FA total). O exemplo 11 descreve esse evento

4818.1.9 contendo apenas um cassete de expressão intacto para o gene DGAT1 de Yarrowia. O conteúdo de óleo da semente com um teor de ácido oleico elevado (com o transgene DGAT1) e da semente não segregante da mesma planta é mostrado na tabela 17. Nessa tabela, o conteúdo de óleo da semente contendo o Transgene DGAT1 foi comparado àquele das plantas segregantes nulas não transgênicas da mesma planta. a TABELA 17 o CONTEÚDO DE ÓLEO DE SEMENTE TRANSGÊNICA E DE SEMENTE NÃO SEGREGANTE — DERIVADO DE PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS QUE SEGREGAM UM TRANSGENE COM O GENE DGAT1 DE YARROWIA Evento — Planta (%) Médiade n (%) n %A %A óleo com Média de pontos transgene óleo nulo

4818.1.9 A 21,8 58 18,9 42 4,4 25,1 B 21,3 16 17,0 6 Cc 23,1 34 17,0 14 média 22,1 17,6 O exemplo 11 descreve que outros eventos gerados pela co- transformação de KS349 e KS362 contêm um cassete de expressão intacto para ambos os genes DGAT de Yarrowia. O conteúdo de óleo da semente com um teor de ácido oleico elevado (copm ambos os transgenes DGAT) e da semente não segregante da mesma planta é mostrado na tabela 18. Nessa tabela, o conteúdo de óleo de semente contendo ambos os transgenes DGAT

- foi comparado com o das plantas segregantes nulas não transgênicas da : mesma planta. TABELA 18

CONTEÚDO DE ÓLEO DA SEMENTE TRANSGÊNICA E DA SEMENTE NÃO SEGREGANTE DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS QUE SEGREGA TRANSGENES COM GENES DGAT1 E DGAT2 DE VARROWIA Evento — Planta (%)Média n (%) n %A %A i de óleo Média pontos com de óleo transgene nulo

4818.1.2 A 23,9 33 20 15 3,4 17,3 B 22,9 35 20,3 13 Cc 23 31 19,2 17 média 23,3 19,8 a 4818.1.3 A 24,5 32 21,6 16 3,4 16,3 o B 23,6 34 19,5 14 [o 25,3 28 22 20 média 24,5 21,0

4818.2.6 A 22,3 31 19 17 3,2 15,8 B 24,1 21 20,6 27 Cc 24,1 23 20,7 25 D 23,2 30 20,6 18 média 23,4 20,2 A seleção da semente homozigota T2 para o KS362 derivou o cassete de expressão de DGAT2 de Yarrowia que não é mais segregado do identificador de DS red. O conteúdo de óleo das 48 sementes (ou de todas as sementes disponíveis se menos de 48 sementes estivessem disponíveis) foi medido por NMR. Para cada evento, as sementes T1 negativas de DS-red foram plantadas, e as sementes T2 de segregantes nulos foram colhidas das plantas cultivadas na mesma câmara de cultivo usada para o cultivo do homozigoto das plantas T1 para o transgene DGAT. O conteúdo de óleo das |

7 sementes derivadas forma seleções de segregantes nulos e homozigotos de : linhagem para o transgene DGAT mostrado na tabela 19. TABELA 19

O CONTEÚDO DE ÓLEO DAS SEMENTES SEGREGANTES NULAS E DAS SEMENTES TRANSGÊNICAS DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS QUE SÃO HOMOZIGOTOS PARA TRANSGENES COM O GENE DGAT2 DE YARROWIA Evento Planta n (%) Média % A pontos %A de óleo :

4822.1.13 A 48 22,7 2,3 11,6 B 48 21,9 [o 48 22,7 Média 22,4 Nulo-A 48 19,7 Nulo-B 48 20,5 Média 20,1

4822.1.9 A 48 23,0 3,6 18,5 - B 48 24,0 Cc 48 22,7 y | Média 23,2 : Nulo-A 48 19,6

4822.2.10 A 48 22,5 2,3 10,9 B 48 24,4 Média 23,5 Nulo-A 48 20,9 Nulo-B 48 21,4 Média 21,2 A seleção da semente homozigota T2 para os cassetes de expressão DGAT2 derivados de KS362 e DGAT1 de Yarrowia derivada de KS349 não foi mais segregada com relação ao fenótipo de ácido oleico elevado (222% oleico) associado à expressão dos genes DGAT de yarrowia. O conteúdo de óleo das 48 sementes (ou de todas as sementes disponíveis se menos de 48 sementes estivessem disponíveis) foi medido por NMR. Para cada evento, sementes segregantes nulas T1 que não apresentaram uma elevação de ácido oleico foram plantadas e as sementes T2 desses segregantes nulos foram colhidas a partir das plantas cultivadas na mesma câmara de cultivo usada no cultivo das plantas homozigotas T1 para os transgenes DGAT. O conteúdo de óleo das sementes derivadas forma

7 seleções de segregantes nulos e homozigotos de linhagens para o transgene DGAT mostrado na tabela 20. TABELA 20

CONTEÚDO DE ÓLEO DE SEMENTES NÃO SEGREGANTES E SEMENTES TRANSGÊNICAS — DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS QUE SÃO HOMOZIGOTAS PARA | OS TRANSGENES COM GENES DGAT1 E DGAT2 DE YARROWIA Evento Planta n (%) Média —% A pontos %A de óleo

4818.1.2 A 23,9 3,8 18,5 B 24,1 Média 24,0 Nula-A 20,1 Nula-B 20,4 Média 20,3 - 4818.1.3 A 24,4 4,5 22,8 . B 24,4 | Cc 24,3 Média 24,4 Nula-A 20,2 Nula-B 19,5 Média 19,9

4818.1.5 A 24,4 4,8 24,2 B 24,4 Cc 25,1 Média 24,6 Nula-A 19,4 Nula-B 20,2 Média 19,8

4818.2.6 A 24,2 3,1 14,4 Nula-A 214 Nula-B 20,9 Média 21,2

: Em suma, os resultados da câmara de cultivo apresentaram . uma excelente hereditariedade da característica do óleo aumentada associada à super expressão dos genes DGAT de uma única yarrowia ou a co-expressão de ambos os genes DGAT yarrowia na semente de soja.

O aumento de óleo (em comparação com a semente não segregante) associado à expressão de genes DGAT de uma única yarrowia é de ao menos 10,9 % e tão alto quanto 25,1 %. O aumento de óleo (em comparação com a semente não segregante) associado à expressão de ambos os genes DGAT de yarrowia é de ao menos 14,4% e tão alto quanto 24,2%. EXEMPLO 13A ' ANÁLISE DE EVENTOS TRANSGÊNICOS: CAMPO o O presente exemplo descreve medições de conteúdo de óleo do O soja derivado das plantas T2 que foram homozigotas ou heterozigotas para os transgenes compreendendo YL DGAT1 ou YL DGAT2 ou ambos os genes YL

DGAT.

As plantas T2 foram cultivadas em um ambiente não-controlado (campo). As sementes T1 positivas de DS red dos eventos transgênicos gerados com YL DGAT2 (contido em KS 362) e que correspondem às sementes não segregantes negativas de DS red foram cultivadas em um campo em lowa no verão de 2007. As sementes T1 com conteúdo de ácido elevado que foram geradas por meio da co-transformação com YL DGAT1 e YL DGAT? e que correspondem às sementes não segregantes com níveis normais de ácido oleico foram cultivadas de uma forma similar.

As sementes T2 foram colhidas das plantas individuais e foram submetidas à análise de NMR para mediro conteúdo de óleo.

A tabela 21 mostra o conteúdo de óleo de 48 sementes uniformemente positivas de DS red derivadas dos eventos que foram homozigotos para o transgene KS362 e sendo que as sementes negativas de

7 DS-red das sementes não segregantes do mesmo evento foram cultivadas no mesmo ambiente. TABELA 21

CONTEÚDO DE ÓLEO DAS SEMENTES NÃO SEGREGANTES E DAS SEMENTES — TRANSGÊNICAS DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS CULTIVADAS EM CAMPO QUE SÃO HOMOZIGOTOS PARA OS TRANSGENES COM O GENE DGAT2 DE

YARROWIA Evento Planta n (%) Média = % A pontos %A de óleo

4822.1.2 A 48 22,4 24 13 B 48 20,5 Cc 48 21,5 E 48 21,7 F 48 20,7 G 48 19,5 H 40 23 Média 21,3 Nula À 48 18,9 7 Nula B 48 19 Nula C 48 18,7 Nula D 16 17,9 Nula E 24 20,2 Média 18,9

4822.2.11 A 48 22,1 2,6 14 B 47 21 Cc 48 23,8 D 48 211 E 48 23,1 F 48 22 G 48 20,4 H 48 20,8 1 48 20,3 Média 21,6 Nula À 48 19,2 Nula B 48 19,5 Nula C 48 18,3 Média 19

4822.2.10 A 40 21,8 2.6 13.6 B 48 21,8 Média 21,8 Nula À 48 18,6 Nula B 48 19,2 Nula C 48 19,2 Nula E 16 19,7 Nula F 48 19,7 Nula G 48 19 Média 19,2 : | |

7 A tabela 22 mostra um conteúdo de óleo de 48 sementes de segregantes que foram homozigotos para os transgenes YL DGAT1 e DGAT2 de YL. Todas as sementes colhidas dessas seleções de sementes T2 homozigotas mostraram o teor de ácido oleico elevado associado à expressão deYlDGAT. Na tabela 22, o teor de óleo dessas linhagens é comparado com o | das sementes não segregantes dos mesmos eventos com níveis inalterados de | ácido oleico, derivado das plantas cultivadas no mesmo ambiente. TABELA 22 |

TEOR DE ÓLEO DERIVADO DAS SEMENTES TRANSGÊNICAS E DAS SEMENTES — SEGREGANTES DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS CULTIVADAS EM CAMPO QUE SÃO HOMOZIGOTAS PARA OS TRANSGENES COM OS GENES DGAT1 E DGAT2 DE YARROWIA. Evento Planta n (%) Média = % A pontos %A de óleo A 37 22,2 3,8 20 B 48 22,5 Cc 48 22,7 D 48 22,6 E 48 24,3 F 40 21,5 Média 22,6 Nula A 48 17,9 Nula B 48 18,9 Nula C 48 19,4 Nula D 48 19,5 Nula E 48 19,7 Nula F 48 18,4 Nula G 48 17,9 Média 18,8

4818.1.3 A 48 23,5 3,5 19 B 48 22,4 Cc 48 22,8 D 19 21,3 E 48 20,5 F 48 22,3 G 48 22,8 H 48 22,5 média 22,3 Nula A 48 184 Nula B 48 19,1 Nula C 48 17,9 Nula D 48 19 Nula E 48 19,3 Nula F 48 18,3 Nula G 48 18,3 Média 18,6

" O exemplo 11 descreve que o evento 4818.1.9 contém apenas . um cassete de expressão intacto para o gene DGAT1 da Yarrowia. Três plantas T1 desse evento derivadas das sementes T1 com um teor de ácido oleico elevado foram cultivadas no campo em lowa lado a lado com plantas não segregantes derivadas das Sementes T1 com um teor de ácido oleico inalterado. As sementes T2 de todos os três segregantes transgênicos apresentaram, ainda, uma segregação do fenótipo de ácido oleico elevado indicando que as linhagens parentais ainda eram heterozigotos para O transgene DGAT1. Com o uso da análise GC, todas as sementes de transgene positivo foram identificadas a partir dessas linhagens e foram submetidas a uma análise de óleo por NMR. Na tabela 23, o conteúdo de óleo dessas sementes é comparado com o das sementes não segregantes derivadas das plantas T1 que foram cultivadas no mesmo ambiente. TABELA 23 —TEORDEÓLEODAS SEMENTES NÃO SEGREGANTES E DAS SEMENTES TRANSGÊNICAS DERIVADAS DAS PLANTAS T1 DE SOJA TRANSGÊNICAS CULTIVADAS EM CAMPO QUE SÃO HETEROZIGOTAS PARA OS TRANSGENES COM O GENE DGAT1 DE YARROWIA. Evento Planta n (%) Média — % A pontos %A de óleo

4818.1.9 A 14 20,7 2 nm B 14 19,1 | Cc 20 20 Média 20 Nula À 40 181 Nula B 40 17,8 Média 18

7 Em suma, os resultados do ambiente de campo apresentaram ' uma excelente hereditariedade do traço de óleo adequado associada com a super expressão dos genes DGAT de uma única yarrowia ou co-expressão de ambos os genes DGAT de yarrowia nas sementes de soja.

O aumento de óleo (em comparaçãocoma semente não segregante) associado com a expressão de genes DGAT de uma única yarrowia é de ao menos 11 % e tal alto quanto 14%. O aumento de óleo (em comparação com a semente não segregante) associado com a expressão de ambos os genes DGAT de yarrowia é de ao menos 19% e tão alto quanto 20%. Exemplo 13B Análise composicional das sementes de soja O presente exemplo descreve medições de parâmetros composicionais de sementes como o teor de proteína e o teor de carboidratos solúveis das sementes de soja derivadas dos eventos transgênicos que expressam genes YL DGAT únicos (YL DGAT2) ou ambos os genes YL DGAT.

Alterações na composição das sementes de soja associadas À expressão dos genes YL DGAT foram medidas.

Com este objetivo, as concentrações de proteína, carboidratos solúveis e amido foram medidas da maneira a seguir.

Análise de proteína e carboidrato não estruturais.

As sementes de soja secas foram trituradas formando um pó fino em um GenoGrinder e subamostras foram pesadas (com uma precisão de 0,1 mg) em tubos de vidro 13x100mm; os tubos tinham fechamentos de tampa de | 25 —roscaforrados com Teflon.

Três réplicas foram preparadas para cada amostra testada.

Os pesos do tecido seco foram calculados mediante a pesagem das sub-amostras antes e após a secagem em um forno com circulação forçada de ar durante 18 horas a 105C.

7 A extração de lipídeo foi realizada mediante a adição de ' alíquotas de 2ml de heptano para cada tubo. Os tubos foram misturados em vortex e colocados em um banho ultrassônico (VWR Scientific, modelo 750D) preenchido com água aquecida a 60C. As amostras foram sonicadas com potência total (-360W) durante 15 minutos, e então, foram centrifugadas (5 min x 1700g). Os supernadantes foram transferidos para limparem os tubos de vidro 13x100mm e os péletes foram extraídos mais 2 vezes com heptano (2ml na segunda extração, 1 ml! na terceira extração) com os supernadantes de cada extração sendo acumulados. Após a extração de lipídeo, 1 ml de acetona foi adicionado aos péletes e, após a mistura em vortex, para dispersar completamente o material, eles foram levados à secura em um Speedvac.

Análise e extração de carboidrato não estrutural.

Dois ml! de 80% de etanol foram adicionados aos péletes secos mencionados acima. As amostras foram completamente misturadas em vortex até que o material da planta fosse completamente disperso no solvente antes da sonicação a 60C durante 15 minutos. Após a centrifugação, 5min x 1700g, os supernadantes foram decantados em tubos de vidro 13x100mm limpos. Mais duas extrações com 80% de etanol foram realizadas, e os supernadantes de cada uma foram acumuladas. Os péletes extraídos foram suspensos em acetona e foram secos (conforme mencionado acima). Um B-fenil glucopiranosídeo de padrão interno (100ul de um estoque de 0,5000 +/- 0,0010g/100ml) foi adicionado a cada extrato antes da secagem em um Speedvac. Os extratos foram mantidos em um —dessecador até a realização de uma análise adicional.

Os pós secos de acetona mencionados acima foram suspensos em 0,9ml de MOPS (ácido 3-N[morfolino]propano-sulfônico; S5OmM, tampão CaClz SmMM, pH 7,0) contendo 100U de a-amilase estável |

| 146 Í aquecida (do Bacillus licheniformis; Sigma A-4551 ). As amostras foram colocadas em um bloco de aquecimento (90C) durante 75 minutos, e foram misturadas em vortex a cada 15 minutos.

As amostras foram, então, deixadas resfriar à temperatura ambiente e 0,6ml de tampão acetato (285mM, pH 4,5) contendo amiloglucosidase SU (Roche 110 202 367 001 ) foi adicionado em cada uma.

As amostras foram incubadas durante 15 a 18 horas a 55C em um banho de água adaptado com um agitador reciprocante; modelos de amido de batata solúvel (Sigma S-2630) foram incluídos para assegurar que a digestão de amido fosse terminada.

Após a digestão, os carboidratos liberados foram extraídos antes da análise. (6ml) de etanol absoluto foram adicionados a cada tubo e, após a mistura em vortex, as amostras foram sonicadas durante 15 minutos a 60C.

As amostras foram centrifugadas (S5min x 1700g) e os supernadantes foram decantados em tubos de vidro 13x100mm limpos.

Os péletes foram extraídos mais 2 vezes com 3ml de 80% de etanol, e os supernadantes resultantes foram acumulados.

O modelo interno (100u! B- fenil glucopiranosídeo, conforme mencionado acima) foi adicionado a cada amostra antes da secagem em um Speedvac.

Análise e preparação da amostra As amostras secas das extrações de amido e solúveis descritas acima foram solubilizadas em piridina anidra (Sigma-Aldrich P57506) contendo 30mg/ml de hidroxilamina HCI (Sigma-Aldrich 159417). As amostras foram colocadas em um agitador orbital (300rpm) de um dia parao outroe foram, então, aquecidas durante 1 hora (75C) com uma mistura em vortex vigorosa aplicada a cada 15 minutos.

Após o resfriamento à temperatura ambiente, 1 ml! de hexametildisilazano (Sigma- Aldrich H-4875) e 100ul de ácido trifluoroacético (Sigma- Aldrich T-6508)

| 147 foram adicionados.

As amostas foram misturadas em vortex e os ' precipitados foram deixados se acomodar antes da transferência dos supernadantes para os francos de amostra de GC. | As amostras foram analisadas em um cromatógrafo a gás | 5 Agilent 6890 ajustado com uma coluna capilar DB-17MS (filme 15m x | 0,32mm x 0,25um). As temperaturas de entrada e do detector foram ambas de 275C.

Após a injeção (2ul, divisão de 20:1), a temperatura inicial da coluna (150C) foi aumentada para 180C com uma taxa de 3ºC/min, e então, a 25C/min até uma temperatura final de 320ºC.

A temperatura final foimantida durante 10 minutos.

O gás de arrasto foi o H2 com uma velocidade linear de 51 cm/sec.

A detecção se deu por ionização de chama.

A análise de dados foi realizada com o uso de um software ChemsStation, da Agilent.

Cada açúcar foi quantificada em relação ao padrão interno, e as respostas do detector foram aplicadas em cada carboidrato individual | (calculadas a partir dos padrões concordando com cada conjunto de | amostras). As concentrações finais de carboidrato foram expressas em | uma base de peso a seco do tecido.

Análise de proteina Os teores de proteina foram estimados pela análise de combustão em um analisador de combustão Thermo Finnigan Flash 1112EA.

As amostras, de 4 a 8 mg, pesadas com uma precisão de 0,001 mg em uma micro-balança Mettler-Toledo MX5 foram usadas na análise.

Os teores de proteína foram calculados através da multiplicação da % de N, determinada pelo analisador, por 6,25. Os teores finais de proteína foram expressos em uma % de base de peso a seco do tecido.

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: As tabelas 24 a 26 ilustram a expressão de um ou dois genes YL DGAT em diferentes ambientes (câmara de cultivo, campo) associada a um deslocamento consistente na composição de semente que se caracteriza por uma redução em carboidratos solúveis, quer dizer, uma redução na sacarose e, em menor medida, uma redução em estaquiose. Mais importante é não haver redução no teor de proteína observada quando o acúmulo de óleo for aumentado através da expressão dos genes YL DGAT. EXEMPLO 14

MEDIÇÃO QUANTO À ATIVIDADE DE DGAT NO DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES

SOMÁTICOS E DE SEMENTE O presente exemplo descreve a construção de vetores de expressão de soja que compreendem DGAT?2 de Yarrowia sozinho ou DGAT2 e DGAT1 de Yarrowia, a expressão desses gene(s) na semente de soja ou em embriões somáticos e a atividade da enzima DGAT nesses tecidos. Construção de pKR1234 que compreende YL DGAT2 O fragmento Notl de KS362 (SEQ ID NO:52), contendo o YL | DGAT?2, foi clonado formando o fragmento Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; | Exemplo 4) para produzir pKR 1234 (SEQ ID NO:68). Construção de PKR1236 compreendendo DGAT1 e YL DGAT2 | 20 O promotor Gy1 da glicina foi amplificado por PCR a partir de pZBL119 (o qual está descrito na publicação PCT nº WO 2004/07 1467, sendo que os conteúdos da mesma estão incorporados nesse documento por referência) com o uso de primers oSGlIy-2 (SEQ ID NO:69) e oSGly-3 (SEQ ID | NO:70). O fragmento de PCR resultante foi sub-clonado formando o vetor de clonagem intermediário pCR-Script AMP SK(+) (Stratagene), de acordo com o protocolo do fabricante, para produzir plasmídeo pPSgly32 (SEQ ID NO:71). O fragmento Psti/Nofl de plasmídeo pSGly32 (SEQ ID NO:71), contendo o promotor Gy1, foi clonado formando o fragmento Psti/Notl do |

' plasmídeo pKR142 (que está descrito na publicação PCT nº WO 2004/07 1467), . contendo a região de terminação de transcrição leguminA2 3', um gene de resistência à ampicilina, e ori bacteriana, para produzir pKR264 (SEQ ID NO:72). Dessa forma, o vetor pKR264 contém um sítio de Not! flanqueado pelo promotor para o gene Gy1 de glicina e para a região de terminação de transcrição de leguminA2 3' (cassete de Gy 1/Noti/legA2).

O fragmento de Ncol/Xbal de KS349 (SEQ ID NO:48), contendo DGAT1 de Yarrowia, foi clonado formando os sítios de Ncol/Xbal de pKR908, (BB1574; publicado no documento US20080095915), que contém os sítios de Ncol/Xbal flanqueados por sítios Notl, para produzir PKR1212 (SEQ ID NO:73).

O fragmento Notl de pKR1212 (SEQ ID NO:73), contendo o gene DGAT1 de Yarrowia foi clonado formando o sítio de Notl de pKR264 (SEQ ID NO:72) para a produção de pKR1235 (SEQ ID | 15 NO:74). O fragmento de BsiWIl de pKR1235 (74), contendo o gene DGAT1 de Yarrowia foi clonado formando o sítio de BsiWI de pKR1234 (SEQ ID NO:68) para produzir pKR1236 (SEQ ID NO:75). Ensaios de DGAT em extratos microssômicos da semente T2 em desenvolvimento As culturas de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foram transformadas com KS362 conforme descrito no presente documento (Exemplo 6), compreendendo DGAT2 de Yarrowia, conforme descrito no presente documento, e as sementes T1 de plantas de soja AFS4822.1.13.1 (semente chamada de 7GR11-58) e AFS4822.2.10.1 (semente chamada de 7GR11-66) foram plantadas, e as plantas foram cultivadas conforme descrito no Exemplo 12. Em ambos os eventos, verificou-se que a concentração de óleo de semente da semente de transgene positivo era |

. elevada em comparação com a semente não segregante do mesmo evento.

De maneira similar, as culturas de suspensão embriogênicas de soja (cv. Jack) foram co-transformadas com KS362 (compreendendo YL —DGAT2)eKS349 (compreendendo YL DGAT1) conforme descrito no presente documento (Exemplo 6). As sementes T1 de transgene positivo do evento AFS4818.1.2.1 são representadas pela semente 7GR11-2. Nesse evento, verificou-se a concentração de óleo de semente da semente de transgene positivo como sendo elevada em comparação com a semente não segregante domesmo evento (Exemplo 6). As sementes não segregantes T1 de transgene negativo derivadas de AFS4818.1.2.1 e AFS4818.1.3.1 são representadas por 7GR11-7 e 7GR11-15. Essas sementes foram plantadas e as plantas foram cultivadas conforme descrito no exemplo 12. Aproximadamente 1g de semente T2 foi coletado das plantas | 15 selecionadas 30 dias após a floração (DAF), e foi congelado instantaneamente em nitrogênio líquido e foi armazenado a -80ºC até que estivesse pronto para o processo. Após a trituração de 1g do tecido de semente congelado em nitrogênio líquido em um pilão e almofariz, 3 mL de tampão de homogeneização de planta (300 mM sacarose; 1 mM EDTA; 10 mM Tris.HCI, pH80;1mMbDTT; 0,1% de polivinilpolipirrolidina) foram adicionados e o tecido foi homogeneizado adicionalmente com o uso de um homogeneizador polytron durante 1 minuto. Debris foram coletados por filtragem a vácuo através de 3 camadas de musselina de algodão seguido pela filtragem através de 1 camada de papel tipo mira cloth. O filtrado resultante foi centrifugado por 15 “minutos duas vezes a 1,500 x g, e o supernadante resultante foi, então, centrifugado a 100,000 x g durante 60 minutos. O pélete resultante foi reagido em aproximadamente 0,5 a 1 mL de tampão microssoma (100 mM fosfato de potássio, pH 7,2) através de pipetagem suave seguida por uma ressuspensão

" adicional em um homogeneizador revestido com teflon com 2 mL de tamanho. . As concentrações de proteína foram determinadas com o uso de um reagente Bradford (Sigma-Aldrich) e microssomos foram congelados instantaneamente em nitrogênio líquido e foram armazenados a -80ºC até que fosse submetido a umensaio.

Os ensaios de DGAT foram executados por 5 minutos a 25 ºC em um tampão ensaio de planta (500 mM Tricina, pH 7,8; 28 mM cloreto de sódio; 0,06% de CHAPS), com de 20 uM de uma enzima de oleoila marcada A 1-14C (50 mCi/mmol, Perkin Elmer), 1,5 mM dioleoilglocerídeo (Sigma-Aldrich) e 20 pgde proteina microssômica em um volume de reação total de 100 ul. Cada reação foi iniciada mediante a adição das membranas microssômicas ao restante dos componentes de reação. Os ensaios foram terminados através da adição de 1 ml de isopropanol quente (75ºC) e através de aquecimento a 75 durante 10 minutos. As provas foram resfriadas à temperatura ambiente, 1,5 ml de hexano foram adicionados e as amostras foram misturadas. As fases foram separadas por meio de centrifugação em baixa velocidade após a adição de 1,25 ml! de 500 mM sulfato de sódio, e a fase superior foi transferida para outro tubo de vidro. A fase superior foi, então, seca com gás nitrogênio. O lipídeo de cada prova foi re-dissolvido em 75uL de hexano reforçado com 1 ul de óleo de soja. O lipídeo foi aplicado em uma placa de TLC 60 A por sílica gel Partisil K6 (Whatman, 250 urn de espessura, 20 cm x 20 cm) e os triglicerídeos foram separados de outros lipídeos mediante o desenvolvimento com 80:20:1 (v/v/v) hexano:dietiléter:ácido acético. Triacilglicerol foi visualizado e marcado por manchamento suave por vapor de iodina em um tanque. A placa foi removida —do tanque de iodina e, após o desaparecimento da mancha, o triacilglicerol foi fragmentado, e a radioatividade foi determinada pela contagem de cintilação líquida e expressa como dpm por minuto. A atividade total foi determinada como a quantidade de ácido oleico radiomarcado incorporado em triacilglicerol

| 155 7 por minuto por mg de proteína com o uso da fórmula a seguir: ([dpm] / [2200000 dpm/uCi] / [50 uCi/umol] / [5 min.] / [0,02 mg de proteína] x [1000 nmol/umol]). As atividades de DGAT para cada uma das amostras descritas são mostradas na tabela 27. TABELA 27 ATIVIDADES DE DGAT PARA A SEMENTE T2 EM DESENVOLVIMENTO SELECIONADA Fenótipo DGAT da de óleo Semente semente em Plasmídeo | DGAT Evento Planta T1 de Ti desenvolvimento semente T2 (nmol.min- Ti

1.mg-1) Ks362 | DGAT2 7GR 4818 AFS4818.1.2 | AFS4818.1.2.1 DGAT 28 4818 AFS4818.1.2 | AFS4818.1.2.1 KSs349 | DAGT1 117 Ks362 | DGAT2 7GR 4818 AFS4818.1.3 | AFS4818.1.3.1 04 7GR [| vem foova isnia vens | 12% [om | 26 | 7GR

[2022] sam [nova | arsiezzaso |arsimazao | 7% | com | se | Ensaios de DGAT nos extratos microssômicos dos embriões somáticos de soja As culturas de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foram transformadas com cada pKR1234 (SEQ ID NO:68), compreendendo DGAT2 de Yarrowia e tendo um número de experimento MSE2181, ou com pKR1236 (SEQ ID NO:75), compreendendo DGAT2 e DGAT1 de Yarrowia e tendo um número de experimento MSE2182. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos foram maturados em SHaM conforme descrito no exemplo

5. Após 2 semanas de maturação em SHaM, aproximadamente 1 g de tecido de cada evento foi congelada em nitrogênio líquido, e o tecido foi cultivado com um pilão e almofariz conforme descrito com relação à semente de soja em

| | 156 | E desenvolvimento.

Uma pequena quantidade de tecido vegetal (aproximadamente 100 mg) foi liofiizada de um dia para o outro, e o tecido restante foi armazenado a -80ºC.

As concentrações de óleo foram determinadas em aproximadamente 10 mg de tecido liofilizado de cada evento com o uso do método GC, e do padrão interno 17:0 exatamente conforme descrito no exemplo 5, e os resultados das concentrações de óleo e do teor de ácido oleico (% do FAME total) são mostrados na tabela 28. Foram produzidas preparações de proteína microssômica, foram determinadas concentrações de proteína, e os ensaiosde DGAT foram executados em eventos selecionados determinados para ter uma faixa de concentrações de óleo exatamente conforme descrito anteriormente para o tecido de semente.

Os resultados dos ensaios de DGAT também são mostrados na tabela 28. TABELA 28 ÁCIDO GRAXO ESTERIFICADO, TEOR DE ÁCIDO OLEICO E ATIVIDADES DE DGAT DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA TRANSFORMADOS COM PKR1234 ou PKR1236 MSE2181-pKR1234 (YL DGAT2) nºdo FAME Ácido oleico Atividade de DGAT evento (% DCW) (% total de (nmol.min.mg*)

FAME) a a ag Ps za aa a a es ae a aa aa a za ag as a A Pa se asa asa a ag Pa a a az Pa az as aa ao aa | e as asa

. nºdo FAME Ácido oleico Atividade de DGAT evento (% DCW) (% total de (nmol.min'.mg”) FAME) rede de cw MSE2182-pKR1236 (YL DGAT2 / YL DGAT1)

DCW) total de FAME) (nmol.min".mg”) La ag a a LE a Ba az as aa Loo ae aa | 2 q 82 | ar Poa ag Ls o a 2 TO o o asa Lar a oa Jor aaa La 6 pp ao Pag oa sa a | La ag | a PB aa | Po se aos Pa se a | Ps sa aa | La aa | | a [| sr 1 22 Pg Lo se ag Los a aaa | NE YE A 7 Rr a a | Pas ar ag | [22 Jog Ta

Os eventos transformados com pKR1234 e que têm algumas das concentrações de óleo mais altas tiveram aumentos na atividade de DGAT de até 9 vezes em comparação com aqueles eventos que têm níveis de ocorrência natural de óleo.

Os eventos transformados com pKR1236 e que têm algumas te

E das concentrações de óleo mais altas tiveram aumentos na atividade de DGAT . de até 15,8 vezes em comparação com aqueles eventos que têm níveis de ocorrência natural de óleo.

A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv.

Jack) também foi transformada com KS364 (SEQ ID NO:63), compreendendo DGAT2 e DGAT1 de Yarrowia (Experimento nº MSE2134) e eventos individuais foram analisados quanto ao perfil de ácido graxo e à concentração de óleo conforme descrito no exemplo 5. Com base nesses dados, um evento (Evento 54) que tem altas concentrações de ácido oleico (32,83% dos ácidos graxos totais) e de óleo (12,5 % DCWt) e um evento (Evento 33) que tem níveis de ocorrência natural de ácido oleico | (15,52% de ácidos graxos totais) e concentrações de óleo (8,2% DCWt) ! foram escolhidos para os ensaios de DGAT.

A cultura de suspensão | embriogênica transformada de cada evento foi volumado em um meio SB 196, e os embriões foram maturados em SHaM conforme descrito no exemplo 5. Após 2 semanas de maturação em SHaM, aproximadamente 1 g de tecido de cada evento foi congelado em nitrogênio líquido, as preparações de proteina microssômicas foram produzidas e ensaios de DGAT foram executados em cada evento exatamente conforme descrito anteriormente, e os resultados são mostrados na tabela 29. O lipídeo total também foi extraído e as concentrações de ácido oleico e de óleo foram determinadas conforme descrito abaixo, e os resultados estão relatados na tabela 29. TABELA 29 ÁCIDO GRAXO ESTERIFICADO, TEOR DE ÁCIDO OLEICO E ATIVIDADES DE DGAT DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA TRANSFORMADAS COM KS364 KS364 (DGAT2/DGAT1)

i . nº do FAME Ácido oleico Atividade de DGAT evento (% de (% de FAME (nmol.min.mg*)) . DCW) total) 33 8,2 15,5 0,3 54 12,7 32,1 3,2 O evento que tem a alta concentração de óleo (Evento 54) teve aumentos na atividade de DGAT de 10,7 vezes em comparação com o evento que tem níveis de ocorrência natural de óleo (Evento 33). EXEMPLO 15

ANÁLISE DE FRAÇÕES DE LIPÍDEO DA SEMENTE TRANSGÊNICA E DE EMBRIÕES

SOMÁTICOS QUE EXPRESSAM GENES DE DGAT Os embriões somáticos de soja transformados com KS364 de um evento com concentrações de ocorrência natural de óleo e de ácido oleico (Evento 33) e de um evento com altas concentrações de óleo e ácido oleico (Evento 54) foram liofilizados durante 48 horas e um tecido foi cultivado com o uso de um triturador genogrinder exatamente conforme descrito no exemplo 5. Extração de lipídeo total O lipídeo total foi extraído de cada evento por meio do método de Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (Can. J. Biochem. Physiol. 37:911 a 917 (1959)) com algumas modificações. Em suma, aproximadamente 100 mg de tecido vegetal de cada evento foram adicionadas a um tubo de ensaio com dimensões de 16mm x 125mm com uma cobertura de tampa de rosca revestida com teflon. Uma mistura de metanol:clorofórmio/2:1 (6 mL) foi adicionada e a amostra foi extraída com uma mistura suave durante 1 hora após a qual 2 mL de clorofórmio foram adicionados seguidos por mistura continuada durante 30 minutos. Subsequentemente, 3,6 ml de água foram adicionados, o tubo foi vigorosamente submetido a vortex e as fases foram separadas por centrifugação em uma centrífuga clínica. A camada orgânica inferior foi removida suavemente para um segundo tubo de ensaio de

' vidro, e as camadas aquosas superiores foram re-extraídas com 2 ml de . clorofórmio.

A centrifugação foi repetida e a fase orgânica inferior foi combinada com a primeira fase orgânica.

As amostras foram secas com vapor de nitrogênio a 50ºC, o lipídeo total foi estimado por pesagem, e o lipídeo foi dissolvido em —clorofórmio:metanol/6:1 com uma concentração de aproximadamente 10 mg/mL.

A análise FAME foi executada em aproximadamente 50 ug de cada amostra com o uso do procedimento de ácido sulfúrico/metano! descrito no presente documento (Exemplo 4), e os resultados são mostrados na tabela 30. Separação de lipídeos polares e neutros As colunas Sep-pak de extração em fase sólida de amino-propil (Waters; colunas 6cc, WATO54560) foram equilibradas com 5 ml de metano! seguido por 5 ml de metanol:clorofórmio/1 :1 seguido por 5 ml de clorofórmio.

Aproximadamente 5mg de lipídeo total em clorofórmio/metanol/6:1 foram adicionados a cada coluna, seguido de 5 x 1 mlde alíquotas de clorofórmio para eluir lipídeos neutros e todas as frações foram coletadas, combinadas e secas com uma corrente de nitrogênio a 50ºC.

Os Lipídeos polares foram, então, eluídos a partir de cada coluna com o uso de 5 x 1 ml de alíquotas de metanol :clorofórmio/1:1 seguido por 5 x 1 ml de alíquotas de metanol, e todas as frações foram combinadas e secas com nitrogênio.

Os lipídeos neutros foram dissolvidos em aproximadamente 1 ml de CHCI3:MeOH/6:1 e os lipídeos polares foram dissolvidos em aproximadamente 200 ul. de CHCI3:MeOH/6:1. A análise de FAME foi executada em aproximadamente 50 ug de lipídeo neutro com o uso do procedimento de ácido sulfúrico/metanol descrito na presente invenção | (Exemplo4)eos resultados são mostrados na tabela 30. Separação de TAG, PC e PE por TLC Aproximadamente 100 ul de extrato de lipídeo neutro foram carregados 2 cm do fundo de uma placa de TLC 60 A em sílica gel Partisil

. k6 (Whatman, expessura de 250 um, 20 cm x 20 cm). Similarmente, aproximadamente 200 ul da fração de lipídeo polar foram carregados sobre a mesma placa de TLC. As soluções padrão (10 mg/ml em clorofórmio/metanol/6:1 ) de TAG, PC e PE também foram marcadas sobre as placas. As placas de TLC foram desenvolvidas em CHCI3:MeOH:AcCOH/65:35:8 até que a frente de solvente estivesse aproximadamente na metade do caminho até a placa. As placas de TLC foram, então, secas com ar durante 10 minutos e foram completamente desenvolvidas em 70:30:1 (v/v/v) hexano:dietiléter:ácido acético. Os padrões foram visualizados por manchamento suave por vapor de iodina, e faixas correspondentes de TAG, PC e PE foram cortadas para fora da placa de TLC. O silica gel contendo cada espécie de lipídeo foi derivatizado diretamente com ácido sulfúrico/metanol conforme descrito na presente invenção (Exemplo 4) e os resultados são mostrados na tabela

30.

Análise posicional de ácido graxo de TAG Os perfis de ácido graxo da posição sn2 de TAG foram determinados com o uso de lipase pancreática porcina para remover os grupos acila da posição sni e sn3 apenas de TAG, seguido pela transesterificação do monoacilglicerídeo resultante (MAG) produzido. Aproximadamente 5 mg do extrato de lipídeo neutro foram suspensas em 2 ml! de 1 M Tris.HCI, pH 8,0 junto com 0,2 m! de 2.2% de cloreto de cálcio e 0,5 m! de 0,05% de sais de bile em um tubo de ensaio de vidro com tampa de rosca. O lipídeo foi incubado a 37ºC durante 5 minutos, 5 mg de lipase —pancreática porcina foram adicionadas diretamente e a suspensão foi incubada com agitação a 37ºC durante 20 minutos. Após a incubação, a reação foi finalizada com a adição de 1 ml! de etanol seguido por 1 ml de 6 M HCl. Após a mistura, 2,5 ml de éter dietílico foram adicionados, as fases bi foram separadas por centrifugação e a camada orgânica superior foi cuidadosamente removida. A extração de éter dietílico foi repetida e a fase de éter dietílico superior foi combinada com a primeira. Após a secagem com sulfato de sódio anidro, o éter dietílico evaporou sob uma corrente de | 5 nitrogênio a 50ºC e o lipídeo resultante foi dissolvido em 200 ul de clorofórmio/metanol/6:1. O lipídeo foi carregado sobre uma placa de TLC Partisil K6 junto com padrões de triacilglicerídeo (TAG), diacilglicerídeo (DAG), monoacilglicerídeo (MAG) e ácido graxo livre (FFA), e a placa de TLC foi desenvolvida conforme descrito na presente invenção. Depois, os padrões foram visualizados com manchamento suave por iodina e a faixa de MAG foi cortada e derivatizada com metanol/ácido sulfúrico conforme descrito anteriormente na presente invenção. Os resultados para o perfil de ácido graxo de FAME da faixa de MAG representando o perfil de ácido graxo da posição sn2 de TAG (isto é, o grupo acila em C2 de glicerol), junto com as posições sn1 e sn3 calculadas, são mostrados na tabela 30. Na tabela 30, a porcentagem de ácido graxo total para cada ácido graxo (isto é, 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3) nas posições sn1 e sn3 de TAG é calculada com a fórmula a seguir: =([TAGx]-[sn2x]/3)*3/2; em que x indica o ácido graxo de interesse. TABELA 30

COMPOSIÇÃO DE ÁCIDO GRAXO DE VÁRIAS ESPÉCIES DE LIPÍDEO E DISTRIBUIÇÃO

POSICIONAL EM TAG Amostra Evento % de óleo | 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Extrato 33 82 15,6 39 15,5 50,8 14,2 Total 54 127 10,5 47 32,1 43,9 88 Lipideos — 33 82 144 37 17,0 52,5 12,4 neutros 54 12,7 9,8 5,3 36,0 42,3 6.6 TAG 33 82 18,2 48 20,8 47,4 87 54 12,7 11,8 5,8 40,7 37,0 46 PC 33 82 34,1 10,6 17,2 33,8 43 54 12,7 21,5 10,0 32,1 33,7 27

: Amostra — Evento — | % de óleo | 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 - 54 12,7 45,8 9,8 21,9 15,3 71 | TAG-snt 33 1.0 o3 14,9 72,7 11,0 54 12,7 1.0 o,5 24,0 67,1 7A TAG-sn1,3 33 26,8 70 238 34,9 75 (calculado) 54 12,7 17,3 85 49,1 22,0 3,2 As alterações nos perfis de ácido graxo associados à expressão de YL DGAT observada em TAG também são observadas nos lipídeos polares. EXEMPLO 16

VARIANTES DE DGAT DE YARROWIA COM UMA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS

ALTERADA O presente exemplo descreve a criação de formas mutantes de DGAT2 de Yarrowia, clonando-se formando um vetor de expressão de levedura e testando frações de proteína microssômica quanto á atividade de DGAT.

Construção de vetores de expressão de Saccharomyces contendo DGAT2s mutantes de Yarrowia O DGAT2 de Yarrowia foi amplificado a partir de pKR1234 (SEQ ID NO:68; Exemplo 14) com primers oYDG2-1 de oligonucleotídeo (SEQ ID NO:76) e OYDG2-2 (SEQ ID NO:77), com o uso da DNA Polimerase de alta fidelidade Phusion'Y (Cat. nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado formando o vetor de clonagem pCR-Bluntº com o uso do kit de clonagem de Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1254 (SEQ ID NO:78).

Um único códon na sequência de DGAT2 de Yarrowia, com os códigos de aminoácido Y326 na sequência de aminoácido correspondente SEQ ID NO:10 foi alterado com o uso do Kit de mutagênese sítio-dirigida Quickchangeº (Cat. nº 200518, Stratagene, La Jolla, CA), com os |

' oligonucleotídeos YID2 Y326F-5 (SEQ ID NO:79) e YID2 Y326F-3 (SEQ . ID NO:80), seguindo o protocolo do fabricante. Após um sequenciamento extensivo, uma codificação de clone para uma sequência de aminoácido que é idêntica ao DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO:10), exceto pelo fato de que Y326 foi alterado para F326, foi escolhida para um estudo adicional. Esse clone foi chamado de pKR1254 Y326F (SEQ ID NO:81) A sequência de nucleotideo para a sequência de codificação alterada (YVIDGAT2 Y326F) é apresentada na SEQ ID NO:82, e a sequência de aminoácido correspondente é apresentada na SEQ ID NO:83. Um único códon na sequência de DGAT2 de Yarrowia, que codifica o aminoácido Y326 na sequência de aminoácido correspondente SEQ ID NO:10, foi alterado com o uso do kit de mutagênese sítio-dirigida | Quickchangeº (Cat. nº 200518, Stratagene, La Jolla, CA), com os | oligonucleotídeos YID2 Y326L-5 (SEQ ID NO:84) e YID2 Y326L-3 (SEQ | 15 ID NO:85), seguindo o protocolo do fabricante. Após o sequenciamento | extensivo, uma codificação de clone de uma sequência de aminoácido que é idêntica ao DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO:10), exceto pelo fato de que Y326 foi alterado para L326, foi escolhida para um estudo adicional. Esse clone foi chamado de pKR1254 Y326L (SEQ ID NO:86). A sequência de —nucleotídeo para a sequência de codificação alterada (YIDGAT2 Y326L) é apresentada na SEQ |D NO:87 e a sequência de aminoácido correspondente é apresentada na SEQ ID NO:88.

Um único códon na sequência de DGAT2 de Yarrowia, que codifica o aminoácido R327 na sequência de aminoácido correspondente SEQID NO:10, foi alterado com o uso do kit de mutagênese sítio-dirigida Quickchangeº (Cat. nº 200518, Stratagene, La Jolla, CA), com os oligonucleotídeos YID2 R327K-5 (SEQ ID NO:89) e YID2 R327K-3 (SEQ ID NO:90), seguindo o protocolo do fabricante. Após o sequenciamento

' extensivo, uma codificação de clone para uma sequência de aminoácido . que é idêntica ao DGAT2 de Yarrowia (SEQ ID NO:10), exceto pelo fato de que R327 foi alterado para K327, foi escolhida para um estudo adicional.

Esse clone foi chamado de pKR1254 R327K (SEQ ID NO:91 ). A sequência de nucleotídeo para a sequência de codificação alterada (YIDGAT2 Y326L) é apresentada na SEQ ID NO:92 e a sequência de aminoácido correspondente é apresentada na SEQ ID NO:93. Os fragmentos Notl de pKR1254, pKR1254 Y326F, pKR1254 Y326L ou pKR1254 R327K, cada um contendo uma versão mutante ou de ocorrência natural de YIDGAT?2, foram clonados formando o sítio Notl de pY75 (SEQ ID NO:3; Exemplo 1 ) para produzir pY 191 (SEQ ID NO:94), pY 192 (SEQ ID NO:95), pY 193 (SEQ ID NO:96) ou pY 194 (SEQ ID NO:97), respectivamente.

Ensaio quanto á atividade de DGAT dos DGAT2s mutantes de Yarrowia Uma cepa mutante de Saccharomyces cerevisiae onde o gene DGAT2 endógeno (DGA1) foi submetido a knock out e tem o genótipo a seguir (BY4741, MATa his3A1 leu2AO met 1540 ura3A0) foi obtida junto à Open Biosystems (http://www.openbiosystems.com/). Ela foi transformada com pY191, pY192, pY193 ou pY194, e os transformantes | foram isolados conforme descrito na presente invenção.

Três | transformantes individuais por transformação foram inoculados em | culturas de 2 ml do meio de DOBA suplementados com CSM-leu 30ºC durante 16 horas.

As células (1 ml) foram transferidas para 50 ml do meio de DOBA descrito acima, e foram cultivadas a 30 ºC durante 16 horas adicionais.

As células foram peletadas por centrifugação, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 “ºC até que fossem solicitadas para uso.

n Os péletes foram ressuspensos em 2 ml! de tampão de homogeneização de levedura (20 mM Tris.HCI, pH 8.0; 10 mM MgCl2; 1 i mM EDTA; 5% de glicerol; 1 mM DTT; 0,3 M (NH4)2SO:4) e a suspensão foi adicionada a um tubo de tampa de rosca de 2 ml contendo aproximadamente 1 ml de 0,5 mm de microesferas de vidro. A remoção posterior de bolsas de ar por vortexação, a ressuspensão foi preenchida áté o topo do tubo, sendo que o tubo foi terminado e as células foram quebradas com três pulsos de 1 minuto em um disruptor celular tipo mini bead beater a 5000 rpm com um armazenamento em gelo durante 5 minutos. O homogenado de levedura foi centrifugado a 1,500 x g durante minutos a 4ºC e o supernadante resultante foi, então, centrifugado a 100,000 x g durante 60 minutos. O pélete resultante foi reagido em aproximadamente 0,2 a 0,5 ml de tampão microssoma (100 mM fosfato de potássio, pH 7,2) mediante uma pipetagem suave seguida por uma 15 ressuspensão adicional em um homogeneizador Dounce revestido com | teflon dimensionado em 2 ml. As Concentrações de proteína foram determinadas com ouso de um reagente Bradford (Sigma-Aldhch) e os microssomos foram congelados instantaneamente em nitrogênio líquido e foram armazenados a — 80ºC até que fossem testados.

Os ensaios de DGAT foram executados durante 1 minuto a 25 ºC em um tampão de teste de levedura (50 mM fosfato de potássio (pH 7,2)), com uma coenzima A de oleoila marcada 1-14C de 20 uM (50 mCi/mmol, Perkin Elmer), e 20 ug de proteina microssômica em um volume de reação total de 100 ul. Cada reação foi iniciada através da adição das membranas microssômicas ao restante dos componentes de reação. Os ensaios foram concluídos e determinados radioativamente em TAG exatamente conforme descrito com relação aos ensaios de DGAT de planta exceto pelo fato de que a fórmula foi alterada para refletir um tempo de ensaio de 1 minuto (isto é, [dbm] / [2200000

' dpm/uCi] / [50 uCifumol] / [5 min.] / [0,02 mg de proteína] x [1000 nmol/umol]). As atividades de DGAT para cada uma das amostras bem como as médias descritas são mostradas na tabela 31. TABELA 31 — ATIVIDADES DE DGAT PARA O DGA1 TRANSFORMADO COM PY 191, PY 192, PY 193 Ou PY194. Plasmídeo Mutante Atividade de — Média de Std Dev DGAT atividade de (nmol.min' DGAT mg?) (nmol.min' mg”) pY191 peso 7,6 10,4 27 10,6 13,0 pY192 Y326F 6,5 8,3 17 8,4 10,0 pY193 Y326L 6,2 8,1 1,9 10,0 8,2 pY194 R327K 5,9 6,2 0,4 6,0 6,7 A partir da tabela 31, parece que as alterações de aminoácido Y326F e Y326L têm um efeito mínimo na atividade de DGAT2 de Yarrowia quando testadas em levedura, e esses dois mutantes foram escolhidos quanto àexpressãoem embriões somáticos de soja.

Construção dos vetores de expressão de soja contendo DGAT2s de Yarrowia mutantes O fragmento Notl de pKR1254 (SEQ ID NO:78), pKR1254 Y326F (SEQ ID NO:81 ) ou pKR1254 Y326L (SEQ ID NO:86), contendo formas mutantes ou de ocorrência natural de DGAT2 de Yarrowia foi clonado formando o fragmento Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir

º pKR1256 (SEQ ID NO:98), pKR1277 (SEQ ID NO:99) ou pKR1278 (SEQ ID NO:100), respectivamente.

Determinação das Concentrações de óleo de embriões somáticos de soja que expressam DGAT2S de Yarrowia mutante A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv.

Jack) foi transformada com cada pKR1256 (SEQ ID NO:98), compreendendo um DGAT2 de Yarrowia de ocorrência natural e que tem um número de Á experimento MSE2228, pKR1277 (SEQ ID NO:99), compreendendo DGAT2 de Yarrowia Y326F e que tem um número de experimento MSE2229, ou pKR1278(SEQID NO: 100), compreendendo DGAT2 de Yarrowia Y326L e que tem um número de experimento MSE2230. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos foram maturados em SHaM conforme descrito no exemplo 5. As concentrações de óleo foram determinadas para cada evento com o uso do NMR, e foram descritas na | | 15 presente invenção, e os perfis de ácido graxo foram determinados por GC exatamente conforme descrito na presente invenção, e os resultados das concentrações de óleo e do teor de ácido oleico (% do FAME total) são mostrados na tabela 32 TABELA 32 — CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO DE EMBRIÕES DE SOJA SOMÁTICOS TRANSFORMADOS COM PKR1256, PKR1277 ou PKR1278 MSE2228-pKR1256 MSE2229-Pkr1277 MSE2230-PKR1278 (wt DGAT2) (Y326F) (Y326L) nºdo |IFAME |Ácido | nºdo FAME |Ácido |nºdo FAME | Ácido evento | (% oleico evento | (% oleico evento | (% oleico DCW) | (%total DCW) |(%total DCW) |(%total de de de FAME) FAME) FAME) | 22289 | 17,3 | 4434 | 22206 | 151 | 435 [22304 | 116 | 351 | | 222820 | 126 | 343 |222020| 144 | 443 [223021] 101 | 223 | [ 22283 | 124 | 303 [222013] 144 | 381 [223015] o8 | 224 |

(wt DGAT2) (Y326F) (Y326L) nºdo [FAME |Ácido |nºdo FAME [Ácido |nºdo FAME | Ácido ' evento | (% oleico evento | (% oleico evento | (% oleico DCW) | (%total DCW) | (%total DCW) |(%total de de de

FAME) FAME) FAME) | 22282 | 117 | 368 2229168) 132 | 363 [223020] o6 | 330 | [222817 | 106,0 | 235 | 22203 | 122 | 413 [2230190] 90 | 347 | | 222824 | 100 | 276 [222025] 120 | 204 | 22306] 86 | 236 | [222868 | 95 | 252 [222031] 119 | 390 |223024] 85 | 233 | | 222818 | 95 | 324 [222018] 116 | 406 |223018] 84 | 358 | | 222821 | 90 | 329 | 22205] 114 | 367 j223022] 73 | 233 | | 222810 | 84 | 243 [2229010] 113 | 356 j223014| 69 | 259 | [222822 | 75 | 299 [222027] 109 | 278 | 22309 | 69 | 229 | | 22288 | 68 | 214 [222030] 107 | 390 |223025| 68 | 273 | [222819 | 65 | 273 [222015] 104 | 363 | 22307] 68 | 375 | [222623 | 64 | 265 |22208| 97 | 305 | 22305] 65 | 256 | [| 22287 | 61 | 222 [22209 | 94 | 374 |223010] 64 | 311 | [22284 | 51 | 185 [222026] 84 | 312 [223017] 63 | 252 | [222816 | 42 | 193 [222017] 83 | 382 |223020] 63 | 192 | [22281 | 32 | 231 222028) 79 | 272 [223013] 58 | 223 | [ Média | 86 | 281 [222029] 78 | 257 223012] 57 | 217 | | 22201 | 74 | 328 223023] 56 | 251 | | 22202 | 59 | 186 [223011 55 | 207 | [222011 | 46 | 186 [22301 | 54 | 263 | | | 22204 | 40 | 212 [223028] 46 | 204 | | | [média | 868 | 322 | média | 65 | 264 | Em embriões somáticos de soja, uma variante da proteína de YL DGAT?2 que transporta a mutação de Y326F aumenta as concentrações de óleo e desloca o perfil de ácido graxo do óleo pelo menos da mesma forma como o DGAT?2 de Yarrowia de ocorrência natural.

' EXEMPLO 17 . EXPRESSÃO DE GENES DGAT oTIMIZADOS

As sequências que encodificam os genes YL DGAT1 e YL DGAT2 que são otimizadas para a expressão de plantas de soja são apresentadas como —SEQIDNO:64eSEQID NO:668 . O projeto dessas três sequências está descrito no exemplo 9. As Moléculas de DNA com essa sequência de DNA flanqueada pelos sítios de restrição Not | foram sintetizadas pelo DNA 2.0 (California, EUA). O DNA plasmídeo com os genes sintetizados foi digerido com Not |. Os fragmentos de restrição Not | com os Genes de DGTA foram ligados ao Not linearizado, DNA defosforilado de KS332, que está descrito no exemplo 5. As construções de DNA resultantes nas quais a expressão de variantes de expressão otimizadas dos genes DGAT1 de yarrowia oi DGAT2 de Yarrowia estão sob o controle do promotor de betaconglicinina, e são chamadas de agora em diante de KS392 e KS393. Sua sequência é estabelecida como SEQ ID NO:101 e SEQ ID NO:102. Além disso, a KS391 de plasmídeo foi construída.

Com este objetivo, o DNA de KS349 foi digerido com Notl e Ncol.

As extremidades do fragmento de restrição de DGAT1 resultante foram completamente preenchidas e ligadas ao Not! linearizado e preenchido no DNA de KS332. A construção de plasmídeo resultante é de agora em diante chamada de KS391. Nessa construção, as sequências de YL DGAT1 nativo estão sob o controle do promotor de betaconglicinina.

A sequência de | KS391 é estabelecida como SEQ ID NO:103. Os embriões somáticos de soja transgênicos foram regenerados como no bombardeamento de partícula posterior com um DNA plasmídeo de KS391, KS392, KS362 e KS393 conforme descrito acima (Exemplo 5). O teor de óleo dos embriões somáticos foi medido com o uso de NMR.

Em suma, o tecido do embrião liofilizado foi pulverizado em um frasco genogrmder conforme descrito anteriormente (Exemplo 4). De 20 a 200 mg de pó de tecido foram transferidas para os tubos de NMR.

O teor de óleo do pó de tecido f do embrião somático foi calculado a partir do sinal de NMR conforme descrito no exemplo 4. TABELA 33

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO DE EMBRIÕES DE SOJA SOMÁTICOS TRANSFORMADOS COM PKS392 E PKS391 Amostra % de | Amostra % de óleo óleo [oa | 216105 JB a o 5301 — 112) [| a | 21616 134) 4 | 215303 110] [5 | 2661702 J12] 5 |] 215302 106) [| 6 [| 21830 jr 6 | 165406 104) [8 | 206305 [16 / gg |] —is201 101] | a | 216106 [1n4| 9 | 215304 J93| | 1B | 29612 Jo] 13 | 21%5314 86) [15 | 216300 [81 | 15) "65401 77 [| 16 | 21640 |81| 16 | 215503 | 65) | 21 | 2196104 73/22] ÀÀW195313 | 60 | | 22 | 216202 73 | 22 | 2195505 | 59) | 23 [| “2196307 | 69 | 23 | 215403 | 56) | 2 | 2610 [65| 2 | 21550 | 55) | 2 [| 216403 | 665| 25 | 21570 53) | 2 | 286117 f6o| 28 |] 65404 | 53)

A tabela 33 compara o conteúdo de óleo dos eventos 30 e 31 gerados com KS392 e KS 391, respectivamente. A média de conteúdo de óleo de todos os eventos generada com KS392 foi de 9,1 % enquanto o conteúdo de óleo de todos os eventos gerados com KS391 foi de 7,6 %. Além disso, o conteúdo de óleo mais — alto observado com KS392 foi de 15,7 % em comparação com 12,8 % de KS391. Os requerentes demonstraram que a otimização da expressão de YL DGAT1 leva a um aumento no conteúdo de óleo em embriões de soja em desenvolvimento quando comparada com o gene de YL DGAT1 nativo.

TABELA 34 — CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO DE EMBRIÕES DE SOJA SOMÁTICOS TRANSFORMADOS COM PKS393 E PKS362 construção KS393 construção KS362 óleo óleo | 1 | 2207,5.05 2208.2.08 | 2 | 2207508 | 122 2208504 | 11,5 |

2207.5.06 2208.2.04

2207.5.03 2208.2.10 | 5 2207501 [1096 8 À 2208209 6 2207504 [oa 208.202

2207.4.04 2208.5.02 | 8 | 22073098 | 95 Na 2208310 | 98 | a ao oz a vv oaog312 | 98 | 2207,4.01 2208306 | 95 |

2207.4.02 2208.3.04

2207.3068 | 80 PÚaBr a2085.05 | 86 |

2207.3.04 2208207 | 81 |

2207.4.06 2208203 | 8o |

2207.4.03 2208303 | 8o |

2207.4.08 2208.5.01 | 8o |

2207.3.14 2208.2.06

2207.4.05 2208.2.11

2207.3.12 2208.5.07

2207.3071 ia oOB 314

2207.5.02 | 68 Na 208302 2207302 | 67 | 22 | 2208308

2207.3.07 2208307 | 61 | 2207303 | 66 | 24 | 2208212 2207313 | 65 | 25 | 2208309 | 6o | 2207311 | 63 | 268 -) "22086311 | 60 |

2207.3.05 2208.2.01

2207.3.10 2208.2.05

. construção KS393 construção KS362 óleo óleo . 2207.4.07 2208.3.01

2207.3.08 2208.5.03

2207.4.09 2208.3.13 [o o | o | 3 | 2208.5.06 Lo o | o | 8 | 2208305 Média de % E Média de % de | 7,8 de óleo óleo A tabela 34 compara o conteúdo de óleo dos eventos 31 e 33 gerados com KS393 e KS362. A média do conteúdo de óleo de todos os eventos gerados com KS393 foi de 8,0 % enquanto o conteúdo de óleo de todos os eventos gerados com KS393 foi de 7,8 %. Além disso, o conteúdo deóleomais alto observado com KS393 foi de 12,3 % em comparação com 11,6 % de KS362. Os requerentes demonstraram que a otimização da | expressão de YL DGAT2 ocasiona um aumento muito pequeno do conteúdo de óleo em embriões de soja em desenvolvimento quando comparado com o gene YL DGAT? nativo. EXEMPLO 18 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 DE TORULOSPORA DELBRUECKII Isolamento de Torulospora delbrueckii a partir de uma amostra de carne curada Uma salsicha do tipo Sopressata foi adquirida junto à uma mercearia local. Uma pequena porção de salsicha, aproximadamente 10 gramas, foi homogeneizada em uma solução estéril de 0,1 % sw Triton-X 100 com o uso de um misturador Waring blender. Adicionou-se glicerol à suspensão de salsicha com uma concentração final de 15 % (Ww). Diluições em série da suspensão de salsicha foram plaqueadas em um meio sólido preparado com o uso de um meio Agar de morfologia de levedura pré-fabricado (HiMedia Laboratories, Índia) contendo 150 mg [ de cloranfenicol. As placas foram incubadas à temperatura ambiente

| 174 7 durante uma semana. As colônias individuais foram reaplicadas por esfregaço em um meio com uma composição idêntica com a exceção do i magenta glucuro. CHA (sal de Bromo-6-cloro-3-indolil-B-D-glucuronida ciclohexilamoniuo (Sigma, EUA)) que foi adicionado ao meio com uma —concentraçãode200mgL”.

Vários isolados de levedura não produziram colônias de cor violeta escura quando aplicados por esfregaço em um meio contendo magenta glucuro CHA. De acordo com M. Quiros et al (Journal of Food Protection (2005), 68(4), 808 a 814) esta reação colorimétrica fornece um meio confiável para a identificação de Debaryomyces hansenii.

Isolamento de DNA genômico e sequenciamento de DNA ribossômico Uma cultura de líquido (meio de YPD de 50 ml) de um magenta-glucuro.CHA negativo foi cultivado a 28 ºC durante 72h, a 250 rpm. As células de levedura foram coletadas por centrifugação e lavadas em água deionizada. As células de levedura foram ressuspensas em um tampão 2 mLof STE (0,1 M sorbitol, 10 mM Ths/HCI, pH 7,5, 1 MM EDTA) contendo 10 mg mi" de Zimolase (Zymo Research Corporation, California, EUA) e foram encubadas durante 2 horas a 37 ºC. O DNA genômico total foi isolado dos esferoplastos de levedura da seguinte maneira. A suspensão de levedura foi submetida à lise em 4 ml de tampão de extração de uréia (0,3125 M NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 MM EDTA, 1 % de sarcosina) e um volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado seguido por uma mistura completa. Após a centrifugação, a fase aquosa foi re- extraída com fenol-clorofórmio. Os Ácidos nucleicos foram precipitados mediante a adição de 1/8 de volume de 4,4 M acetato de sódio e 1 volume de isopropanol seguido de centrifugação. O ácido nucleico foi seco e ressuspenso em 500 microL TE (10 mM Tris, 1 MM EDTA). Uma pequena

. aliquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em 0,4 % de géis de agarose perto do identificador de peso molecular para confirmar que o peso molecular foi = 50 kb.

TABELA 35 — PRIMERSDE OLIGONUCLEOTÍDEO PARA A AMPLIFICAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE DNA RIBOSSÔMICA 268 A PARTIR DA LEVEDURA DE ASCOMICETA Po ereta netos

| Um fragmento de gene ribossômico 268 foi gerado por PCR da seguinte maneira.

A reação de PCR continha 50 mM KCI, 10 mM Tris- HC! (pH 9), 0,1 % de Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 100 ng de DNA genômico da cepa de levedura com magenta-glucuro.CHA negativo e os primers de PCR MWG619 (SEQ ID NO:104) e MWG620 (SEQ ID NO:105) com uma concentração final de 1 uM.

A amplificação foi executada em 35 ciclos, cada um compreendendo 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC,e1 minuto a?72º*C.

Um produto do PCR de aproximadamente 600 bp foi extirpado dos géis de agarose e sequenciado diretamente com o uso dos primers MWG619 e MWG620. Uma busca de BLASTN contra NT (DNA público de NCBI) foi conduzida com o uso da Sequência de DNA resultante.

Conforme mostrado na tabela 36, verificou-se que a sequência era99% idêntica a várias entradas de 26s de sequências ribossômicas derivadas de Torulaspora delbrueckii.

O fragmento de DNA ribossômico 26s da cepa de levedura de Torulaspora delbrueckii isolada pelos requerentes a partir de uma amostra de carne curada é determinada como a SEQ ID NO:106.

- TABELA 36

RESULTADOS DA BUSCA DE BLASTN GERADOS COM A SEQUÊNCIA DE UMA CEPA DE i LEVEDURA COM MAGENTA-GLUCURO.CHA NEGATIVO DERIVADO DE UMA CARNE

CURADA >gil169125895/gblEU 441895. 11 Contagem = 1082 partes (546), Expectativa = 0,0 Gene de RNA ribossômico 268 da Identidades = 560/562 (99%), intervalos = 2/562 cepa de Torulaspora delbruechi B-5(3) (0%) Comprimento de Sequência parcial= 613 Filamento = mais / menos 2 >gil117573753/gblEFOS3 125.11 gene de Contagem = 1082 partes (546), RNA ribossômico 268 da cepa de Expectativa = 0,0 Torulaspora delbruechii EXOC35, Identidades = 560/562 (99%), intervalos = 2/562 sequência parcial (0%) Filamento = mais /menos Geração de ponta de prova específica de DGAT2 com o uso de

PCR Um fragmento do gene DGAT?2 foi gerado por PCR da maneira a seguir. A reação de PCR continha 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 9), 0,1 % de Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, USA), 100 ng de DNA genômico de Torulaspora delbrueckii e primers de PCR P7 (SEQ ID NO:107) e P8 (SEQ ID NO:108) com uma concentração final de 1 uM. A amplificação foi executada por 35 ciclos, cada um compreendendo 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto do PCR de aproximadamente 270 bp foi extirpado dos géis de agarose, clonado e sequenciado com o uso de técnicas padrão. Clones de um plasmídeo foram identificados contendo um produto do PCR clonado de 263 bp. O nucleotídeo e a sequência de aminoácido deduzida desse produto do PCR são estabelecidos como SEQ ID NO:121 e SEQ ID NO:122. Uma busca de BLASTP da base de dados da proteína fúngica detalhada em NCBI foi conduzida. A sequência de aminoácido deduzida do produto do PCR compartilha 79,5 % da identidade de sequência com um produto de proteína sem nome de Candida glabrata com um número de acesso

Area da aaa dadddda - ao GENBANK XP 447864 que representa a proteina com a similaridade mais próxima nessa base de dados. A sequência de aminoácido deduzida desse ' Produto do PCR também compartilha 75,9 % de identidade de sequência com um Dga1i de Saccharomyces cerevisiae com um número de acesso ao —GENBANKNP 014888. TABELA 37

PRIMERS DE OLIGONUCLEOTÍDEO DEGENERADOS USADOS NA AMPLIFICAÇÃO DOS

GENES DGTA DE LEVEDURA E FUNGO OLEAGINOSOS Nome do primer de Sequência de oligonucleotídeo degenerado oligonucieotídeo AACTACATCTTCGGCTAYCAYCCNCAYGG(SEQ ID NO: 107) | lPeBEmen — — | AGGGACTCGGAGGCGCCGCCNCANACDAT(SEQ ID NO: 108) | [PrÇmen ————— | ARCTACATCTTCGGCTAYCAYCCXCAYGG(SEQ ID NO: 109) | fpçemen ———— | AGGGACTCGGAGGCGCCGCCXCAXACDAT(SEQ ID NO: 110) BM DGAT?2 fwd (41mer) CCXCCXAAYMGXCCXTAYYTXTTYGGXTAYCAYCCXCAYGG(SE Q ID NO: 111) BM DGAT?2 rev (40mer) CRTTYTCXCCRAAXSWRAAXSWRAAXACXGGXACXARRTCXGC XXX(SEQ ID NO: 112) DGAT1 | fiwd (37mer) GGTGGGCXCCXACXYTXGTXTAYCARCCXGTXTAYCC(SEQ ID NO: 113) rev (41mer) CCDATDATRTTRTGXGTXGGXACXCCXACXARXARYTCRTG(SE Q1ID NO: 114) Nome do primer de Sequência de aminoácido correspondente oligonucleotideo DGAT2 | P7 (29mer) NYIFGYHPHG(SEQ ID NO: 115) | ——JPseemen | WWGGASESL(SEQID NO: 116) | —— | P7iegemen NYIFGYHPHG(SEQ ID NO: 115) | — Trsi(2omer) IVVGGASESL(SEQ ID NO: 116) | — |smDGAT2fwd(4imen — | PPNXPYXFGYHPH(SEQ ID No: Ira | — TJ em DGAT2 rev (40mer) GADXVPVFXFGEN(SEQ ID NO: 118) fd (37mer) WWAPTLVYQPVYP(SEQ ID NO: 119) Lo Trevaimen 0 | HELLVGVPTHNIIG(SEQ ID NO: 120) Símbolo (Significado): R (G ou A), Y (T ou C), M (A ou C), K(G ou T), S (G ou C), W(A ou T), H(A ou C), B(G | ou T ou C), V (G ou C ou A), D (G ou A ou T), N(G ou A ou T ou C), e X (Inosina) Construção de biblioteca de cosmídeo, exibição e sequenciamento de um gene DGAT2 | O DNA genômico de Torulaspora delbrueckii foi digerido | parcialmente com Mbol. Em suma, aproximadamente 10 pg de DNA

- genômico foram digeridos com 0,5 unidade de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de 0,1 mg mL” BSA, e 0,1 mg mL” RNAse isento de DNAse (Quiagen, EUA) 100 mM NaCl, 50 MM Tris-HCI, 10 MM MgCl2, 1 MM DTT, pH 7,9. As aliquotas de 25 ul. foram removidas após 30, 60,120 e 180 segundos respectivamente, e foram combinadas em um tubo que continha 5 ul de 500 mM EDTA. O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado com um volume final de 10 ul com o uso de colunas spin column do DNA Clean and Concentrator"” (Zymoresearch, EUA) de acordo com instruções do fabricante. O DNA foi ligadoa2yugde DNA de pLAFR3 linearizado (B. Staskawicz et a/l., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 5794) que foi digerido completamente com BamHI e defosforilado com fosfatase antártica (NEB, USA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transfectada em células de E. coli da cepa NM554 (Stratagene, EUA) com o uso de extratos de embalagem MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com instruções do fabricante. As células transfectadas foram adicionadas a 15 mL do meio de LB, foram incubadas a 37 ºC em um agitador de laboratório ajustado em 250 rpm. O glicerol foi adicionado com uma concentração final de 15 % (w/w), e a suspensão de célula foi congelada como uso de uma mistura de metanol de gelo seco. A titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada por meio do plaqueamento de diluições em série da suspensão de célula descongelada em um meio de LB solidificado contendo 10 mg L' de tetraciclina. Aproximadamente

20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em um meio seletivo, transferidos para membranas B de Biodyne (PALL Corporation, EUA) e triados com uma ponta de prova marcada *?P que corresponde ao produto do PCR clonado derivado de Torulaspora delbrueckii (SEQ ID NO:121 ) de acordo com protocolos padrão. A centrifugação do gradiente de densidade

179 | - de cloreto de césio foi usada conforme descrito em T. Maniatis et al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 pp., foi usada para purificar o DNA do cosmídeo das culturas de líquido derivadas das colônias que foram hibridizadas para a ponta de prova sob condições estringentes.

Cinco clones de cosmídeo foram sequenciados com o uso de oito primers com SEQ ID NOs: 123 até 130 (tabela 38). As sequências foram montadas com o uso do programa SEQMAN do pacote de software LASERGENE TM" versão 7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA ).

O sequenciamento do DNA de cinco cosmídeos isolados indepententemente com os ditos primers produziu as sequências de DNA que poderiam ser montadas em duas sequências relacionadas de maneira próxima. As sequências consenso derivadas dessa tentativa são chamadas de gene TD DGAT2A e gene TD DGATZ2B, e são apresentadas como SEQ ID NO:131 e SEQ ID NO:132. O gene TD DGATZ2A e o gene TD DGAT2B são sequências genômicas de 2700 bp que contêm ORFs TD DGAT2A (SEQ ID NO:133) e TD DGAT2B (SEQ ID NO:134), sendo que cada uma compreende 1362 bp das proteínas relacionadas de maneira próxima de encodificação da sequência TD DGAT2A (SEQ ID NO:135) e TD DGAT2B (SEQ ID NO:136) que compreendem 453 aminoácidos. O nucleotídeo e a sequência de aminoácido deduzida de TD DGAT2A e TD DGAT2B compartilham 95 % e 96,9 % da identidade de sequência em alinhamentos CLUSTALW. A sequência de aminoácido deduzida TD DGAT2A e TD DGAT2B compartilha 57,4 e 56 % de identidade de sequência, respectivamente em um alinhamento CLUSTALW com um produto de proteina sem nome de Candida glabrata com um número de acesso ao GENBANK XP 447864 que representa a proteína com a similaridade mais próxima aos ditos genes de Torulaspora delbrueckii nessa base de dados.

As sequências de aminoácido deduzidas TD DAGT2A e TD DGAT2B

- também compartilham 57,3 e 57 % de identidade de sequência, respectivamente com Dga1 de Saccharomyces cerevisiae com um número de acesso ao GENBANK NP 014888. TABELA 38

PRIMERS USADOS NO SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DERIVADOS DE

TORULASPORA DELBRUECKII Nome Sequência SEQ ID NO: MWG 625 CCATTGGTACTGAAGGTTGTGGCTGGTCC 123 MWG 626 GGACCAGCCACAACCTTCAGTACCAATGG 124 MWG 627 GTCCCATTGTACAGGGATTACTTATTGGCG 125 MWG628 — CGCCAATAAGTAATCCCTGTACAATGGGAC 126 MWG 637 CCCTCATTATGGGCTTCCTAGGTTAG 127 MWG 638 CTACCTAGGAAGCCCATAATGAGGG 128 MWG 639 CCAAACCCAACACAGGAACAAGTAGATC 129 MWG 640 GATCTACTTGTTCCTGTGTTGGGTITTGG 130 EXEMPLO 19 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT?2 DE PICHIA ANOMALA Isoalamento de Píchia Anomala a partir de uma amostra de carne curada Uma salsicha do tipo Sopressata foi adquirida junto a uma mercearia local. Uma pequena porção da salsicha, aproximadamente 10 gramas, foi homogeneizada em uma solução estéril de 0,1 % de Triton-X 100 com o uso de um misturador Waring.

r O glicerol foi adicionado à suspensão de salsicha com uma concentração final de 15 % (w/w). | Diluições em série da suspensão de salsicha foram plaqueadas em um meio sólido preparado com o uso de um meio de Agar de morfologia de levedura pré-fabricado (HiMedia Laboratories, Índia) contendo 150 mg L' de cloranfenicol.

As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma semana.

As colônias individuais foram reaplicadas por esfregaço em um meio com uma composição idêntica exceto pelo magenta-glucuro.CHA (sal de Bromo-6-cloro-3-indolil-B-D- | 10 glucuronida ciclohexilamônio (Sigma, EUA)) que foi adicionado ao meio com uma concentração de 200 mg L-1. | Vários isolados de levedura não produziram colônias de cor | violeta escura quando aplicadas por esfregaço em um meio contendo | magenta-glucuro.CHA.

De acordo com M.

Quiros et al (Journal of Food Protection (2005), 68(4), 808 a 814) essa reação colorimétrica fornece um meio confiável para a identificação de Debaryomyces hansenii.

Isolamento de DNA genômico e sequenciamento de DNA ribossômico Uma cultura de líquido (meio de YPD de 50 mL) de uma segunda cepa de levedura de magenta-glucuro.

CHA negativo foi cultivada a28ºC durante 72h, a 250 rpm.

As células de levedura foram coletadas por centrifugação e lavadas em água deionizada.

As células de levedura foram ressuspensas em um tampão 2 mLof STE (0,1 M sorbitol, 10 mM Tris/HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA) contendo 10 mg mL-1 de zimolase (Zymo Research Corporation, California, EUA) e foram incubadas durante 2 horas a 37 ºC.

O DNA genômico total foi isolado dos esferoplastos de levedura da seguinte maneira.

A suspensão de levedura foi submetida a lise em 4 mL de tampão de extração de uréia (0,3125 M NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 f mM EDTA, 1 % de sarcosina) e um volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado seguido por uma mistura completa. Após a centrifugação, a i fase aquosa foi extraída novamente com fenol-clorofórmio. Os ácidos nucleicos foram precipitados mediante a adição de 1/8 do volume de 4.4 M acetato de sódio e 1 volume de isopropanol seguido pela centrifugação.

Os ácidos nucleicos foram secos e ressuspensos em 500 microL TE (10 mM Tris, 1 MM EDTA). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em 0,4 % dos géis de agarose perto de um identificador de peso molecular para confirmar que o peso molecular foi = 50 kb. O fragmento de DNA ribossômico 26s da cepa de levedura de Pichia anomala isolado pelos requerentes a partir de Um fragmento de gene ribossômico 268 foi gerado por PCR da maneira a seguir.

A reação de PCR continha 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 9), 0,1% de Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 100 ng de DNA genômico da cepa de levedura de magenta-glucuro.CHA negativo e primers de PCR MWG619 (SEQ ID NO:104) e MWG620 (SEQ ID NO:105) com uma concentração final de 1 UM. A amplificação foi executada com 35 ciclos, cada um compreendendo 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto do PCR de aproximadamente 600 bp foi extirpado dos géis de agarose e foram sequenciados diretamente com o uso de primers MWG619 (SEQ ID NO:104) e MWG620 (SEQ ID NO:105).

Uma busca de BLASTN contra NT (DNA público de NCBI) foi conduzida com o uso da sequência de DNA resultante. — Conforme mostrado na tabela, verificou-se que a sequência era 99 % idêntica a | várias entradas de sequências ribossômicas 26s derivadas de Pichia anomala.

' O fragmento de DNA ribossômico 26s da cepa de levedura Pichia anomala isolado pelos inventores a partir de uma amostra de carne curada é apresentado como SEQ ID NO:137. TABELA 39 — RESULTADOS DA BUSCA DE BLASTN GERADOS COM A SEQUÊNCIA DE UMA CEPA DE LEVEDURA DE MAGENTA-GLUCURO.CHA NEGATIVO DERIVADO DA CARNE CURADA > gil171194254/g9blEUSSO879. 11 gene de Pontuação = 1031 partes (520), expectativa = 0,0 RNA ribossômico 268 da cepa de Pichia — | identidades = 527/528 (99%), intervalos = 1/528 (0%) anomalia 8, comprimento de sequência Filamento = mais / menos parcial = 604 2 > gil 165967963!/gblEU327 111.11 gene de Pontuação = 1031 partes (520), expectativa = 0,0 RNA ribossômico 26S da cepa de Pichia identidades = 527/528 (99%), intervalos = 1/528 (0%) anômala TJY9d, comprimento de Filamento = mais / menos sequência parcial = 614 Geração de ponta de prova específica de DGAT2 com o uso de

PCR Um fragmento do gene DGAT?2 foi gerado por PCR da maneira a seguir. A reação de PCR continha 50 mM KCI, 10 mM Ths-HCI (pH 9), 0,1 % de Triton X-100, 2,5 mM MgCbk, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 100 ng de DNA genômico de Píchia anômala e primers de PCR P7 (SEQ ID NO:107) e P8 (SEQ ID NO:108) com uma concentração final de 1 UM. A amplificação foi executada com 35 ciclos, cada um compreendendo 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto do PCR de aproximadamente 270 bp foi extirpado dos géis de agarose, clonado e sequenciado com o uso de técnicas padrão. Os clones de um plasmídeo foram identificados contendo um produto clonado de PCR de 263 bp. O nucleotídeo e a sequência de aminoácidos deduzida desse produto do PCR são apresentados como SEQ ID NO:138 e SEQ ID NO:139. Uma busca de BLASTP da base de dados de proteína fúngica curada em NCB! foi conduzida. Com base em um alinhamento de CLUSTALW, a sequência de

: aminoácidos deduzida do produto do PCR compartilha 66,7 % da identidade de . sequência com um produto de proteína sem nome de Kluyveromyces lactis com um número de aceso ao GENBANK XP 455588 que representa a proteína com a similaridade mais próxima nessa base de dados.

A sequência de aminoácidos deduzida desse Produto do PCR também compartilha 60,9 % da identidade de sequência com Dga1l de Saccharomyces cerevisiae com o número de acesso ao GENBANK NP 014888. Construção “de biblioteca de plasmídeo, triagem e sequenciamento de um gene DGAT2 O DNA genômico de Píichia anomala foi digerido parcialmente com Mbol.

Em suma, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foram digeridos com 0,5 unidade de Mbo! (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de 0,1 mg mL” de BSA, e 0,1 mg mL de RNAse isento de DNAse (Quiagen, EUA) 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, 10 mM de MgCl,1mM de DTT, pH 7,9. As alíquotas de 25 ul foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos respectivamente e foram combinadas em um tubo que continha 5 ul. de 500 mM EDTA.

O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado com um volume final de 10 ul com o uso de colunas do tipo spin columns de DNA Clean and Concentrator*“ (Zymoresearch, EUA) de acordo com instruções do fabricante.

O DNA foi ligado a 2 ug de DNA de pLAFR3 linearizado (B.

Staskawicz et a/l., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 5794) que foi completamente digerido com BamHI e defosforilado com fosfatase antártica (NEB, EUA). A reação de ligação foi embalada invitro e | transfectada em células de E. coli da cepa NM554 (Stratagene, EUA) com o usode extratos deembalagem MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas em 15 mL do meio de LB, incubadas a 37 ºC em um agitador de laboratótio ajustado para 250 rpm.

O glicerol foi adicionado com uma

º concentração final de 15 % (w/w) e a suspensão de célula foi congelada com o uso de uma mistura de etanol em gelo seco. A titulação das biblioteca de i cosmídeo foi determinada mediante as diluições em série de plaqueamento da suspensão de célula descongelada em um meio de LB solidificado contendo 10 mgl”? de tetraciclina. Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em um meio seletivo, transferidos para membranas B de Biodyne (PALL Corporation, EUA) e triados com uma ponta de prova marcada *?P que corresponde ao Produto do PCR clonado derivado de Piíchia anomala apresentado como SEQ ID NO;138 de acordo com protocolos padrão. A centrifugação do gradiente de densidade do cloreto de césio foi usada conforme descrito em T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 pp., e foi usada para purificar o DNA de cosmídeo das culturas de líquido derivadas das colônias que foram hibridizadas para a ponta de prova sob condições estringentes. Os cinco clones de cosmídeo de hibridização positiva foram sequenciados com o uso de cinco primers com as SEQ ID NOs 140 até 144 (Tabela 40). As sequências foram montadas com o uso do programa SEQMAN do pacote de software LASERGENETY versão

7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA). O sequenciamento do DNA de cinco cosmídeos isolados indepentemente com os ditos primers produziu as sequências de DNA que poderiam ser montadas formando uma única sequência de 2062 bp com relação ao gene PA DAGT?2 apresentado como SEQ ID NO:145. Ela contém o ORF de 1593 bp chamado de PA DGAT?2 (SEQ ID NO:146) e encodifica uma proteina com uma sequência deduzida de 429 aminoácidos apresentados como SEQ ID NO:147. Uma busca de BLASTP da base de dados da proteína fúngica curada em NCBI foi conduzida. O produto do gene PA DGAT2 compartilha 48,2 % da identidade de sequência em um alinhamento de CLUSTALW com um produto de gene derivado do GENBANK com número de acesso NP 983542 de Ashbya gossypii ATCC 10895. Observa-se que esse

' produto tem uma similaridade com relação à família da proteina contendo : aciltransferases envolvidas na biossíntese de fosfolipídeos e outras proteínas de função desconhecida. As sequências de aminoácidos deduzidas de PA DGAT2 também compartilham 46,1 % da identidade de sequência com o —Dgalde Saccharomyces cerevisiae com o número de acesso ao GENBANK NP 014888. TABELA 40

PRIMERS USADOS NO SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DERIVADOS DE

PICHIA ANOMALA Nome Sequência SEQ ID NO: MWG 653 CCTTGAGTGGATTTGGTGGTATTGGAACTGACG 140 MWG 654: CGTCAGTTCCAATACCACCAAATCCACTCAAGG 141 MWG 655 GCCCTCAAAATATTGAAGCAAGGATTCTCC 142 MWG 656 GGAGAATCCTTGCTTCAATATTTTGAGGGC 143 MWG 660 GGTGGTATTGGAACTGACGG 144 EXEMPLO 20 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 DE DEBARVOMVCES HANSENII Isolamento de Debaryomyces hansenii a partir de uma amostra de carne curada Uma salsicha do tipo Sopressata foi adquirida junto a uma mercearia local. Uma pequena porção de salsicha, aproximadamente 10 gramas, foi homogeneizada em uma solução estéril de 0,1 % de Triton-X 100 com o uso de um misturador Waring blender. O glicerol foi adicionado á suspensão da salsicha com uma concentração final de 15 % (w/w). As diluições em série da suspensão de salsicha foram plaqueadas em um meio sólido preparado com o uso de um meio de Agar de morfologia de levedura pré- fabricado (HiMedia Laboratories, Índia) contendo 150 mg L de cloranfenicol. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma semana. Colônias individuais foram reaplicadas por esfregaço em um meio com uma

É composição idêntica com a exceção do magenta-glucuro.CHA (sal de Bromo-6- cloro-3-indolil-[beta]-D-glucuronida ciclohexilamônio (Sigma, EUA)) que foi i adicionado ao meio com uma concentração de 200 mg L*. Muitos isolados de levedura produziram colônias de cor violeta escuro quando aplicados por esfregaço em um meio contendo magenta- glucuro.CHA.

De acordo com M.

Quiros et a/ (Journal of Food Protection (2005), 68(4), 808 a 814) esta reação colotimétrica fornece um meio confiável para a identificação de Debaryomyces hansenii.

Isolamento do DNA genômico Uma cultura de líquido (meio de YPD de 50 mL) de uma cepa de levedura de magenta-glucuro.

CHA-positivo foi cultivada a 28 ºC por 72h, a 250 rpm.

As células de levedura foram coletadas por centrifugação e | lavadas em água deionizada.

As células de levedura foram ressuspensas em 2 mL de tampão de STE (0,1 M sorbitol, 10 mM Tris/HCI, pH 7,5, 1 MM EDTA) contendo10 mg mL de Zimolase (Zymo Research Corporation, California, EUA) e foram incubadas durante 2 horas a 37 ºC.

O DNA genômico total foi isolado dos esferoplastos de levedura da seguinte maneira.

A suspensão de levedura foi submetida a lese em 4 mL de tampão de extração de uréia (0,3125 M NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA, 1 % de sarcosina) e um volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado seguindo por uma mistura completa.

Após a centrifugação, a fase aquosa foi re-extraída com fenol-clorofórmio.

Os ácidos nucleicos foram precipitados mediante a adição de 1/8 do volume de 4,4 M de acetato de sódio e 1 volume de isopropanol seguido pela centrifugação.

O ácido —nucleico foi seco e ressuspenso em 500 microL TE (10 MM Tris, 1 mM EDTA). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em 0,4 % de géis de agarose perto do identificador de peso molecular para confirmar que o peso molecular era 2 50 kb.

My Um fragmento do gene DGAT?2 foi gerado por PCR da maneira a seguir.

A reação de PCR continha 50 mM KCI, 10 mM Tris-HC! (pH 9), 0,1 % À de Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, USA), 100 ng de DNA genômico da cepa de levedura de magenta-glucuro.CHA-positivo e os primers PCR P7 (SEQ ID NO:107) e P8 (SEQ ID NO:108) com uma concentração final de 0,2 UM.

À amplificação foi executada com 35 ciclos, cada um compreendendo 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto do PCR de aproximadamente 350 bp foi extirpado dos géis de agarose, clonado e —sequenciado com o uso de técnicas padrão.

Vários clones de plasmídeo foram identificados contendo um Produto do PCR clonado de 328 bp.

O nucleotídeo e a sequência de aminoácidos deduzida desse produto do PCR são apresentados como SEQ ID NO:148 e SEQ ID NO:149. Com base em um alinhamento de CLUTALW, a sequência de aminoácidos deduzida do produto do PCR compartilha 95,4 % da identidade de sequência com a proteína hipotética DEHAOC13101g de Debaryomyces hansenii, CBS767. Esse gene que representa o gene mais bem sucedido nas sequências base de dados públicas tem o número do GENBANK XP 458203 e é observado como tendo uma similaridade com relação às aciltransferases envolvidas na biossíntese de fosfolipídeo e de outras proteínas de função desconhecida.

Construção da biblioteca de cosmídeo, triagem e sequenciamento de um gene DGAT2

O DNA genômico da cepa de levedura magenta-glucuro.CHA positivo foi parcialmente digerido com Mbol De maneira resumida, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foram digeridos com 0,5 unidades de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul. na presença de BSA 0,1 mg mL-1 e NaCl 100mM de RNAse livre de DNAse 0,1 mg mL-1 (Quiagen, EUA), Tris-HCI 50 MM, MgCI2 10 mM, DTT 1 mM, pH de 7,9. As alíquotas de

: 25 uL foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos, respectivamente, e combinadas em um tubo que continha 5 ul de 500 mM de EDTA.

O DNA i parcialmente digerido foi purificado e concentrado em um volume final de 10 ul através do uso de Colunas de centrifugação do tipo DNA Clean e

Concentrator'"* (Zymoresearch, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

O DNA foi ligado a 2ug de DNA pLAFR3 linearizado (B.

Staskawicz et al, Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 94) que foi completamente digerido com BamHI e desfosforilado com Fosfatase Antártica (NEB, EUA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transferida para célulasE. colide cepa NM554 (Stratagene, EUA) através do uso de extratos de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas a mL de meio de LB, incubado a 37ºC em agitador do tipo Lab configurado em

250 rpm.

O glicerol foi adicionado a uma concentração final de 15 % (em peso)

15 ea suspensão de célula foi congelada através do uso de uma mistura de metanol com gelo seco.

A titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada através do plaqueamento de diluições em série da suspensão celular descongelada em meio solidificado de LB que contém tetraciclina 10 mg L-1. Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada com 32P que correspondem ao produto de PCR clonado de PCR clonado derivado da cepa de levedura magenta- glucuro.CHA positivo de acordo com os protocolos padrões.

Foi usada centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito emT.

Maniatis ef al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a sonda sob condições estringentes.

Os clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso de dez primers com SEQ ID NO

. 150 até 159 (Tabela 41). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENE'!Y 7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA). O sequenciamento de DNA de três cosmídeos independentemente isolados com os ditos primers produziu sequências de —DNA que poderiam ser montadas em uma sequência única. A sequência consensual de 2800 nucleotídeos derivados deste esforço é configurada como SEQ ID NO:160. Isto contém um ORF de 2028 bp (SEQ ID NO:161) que pode ser convertido em uma proteína de 675 aminoácidos (SEQ ID NO:162). Esta proteína compartilha 91,3 % de identidade de sequência em um alinhamento | ClustalW com a proteína hipotética DEHAOC13101g de Debaryomyces | hansenii, CBS767. Este gene tem número GENBANK XP 458203. Isto representa o gene com a similaridade mais próxima ao gene de SEQ ID NO:161 e está anotado como tendo similaridade com aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida. TABELA 41

PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DERIVADO DE

DEBARYOMYCES HANSENII Sequência SEQ |D NO: MWG 621 CGGAATGAACCATATCAGCCTCC 150 MWG 622 GGAGGCTGATATGGTTCATTCCG 151 MWG 623 GAGCTTGGGATTGACAAGTGCATCTTAC 152 MWG 624 GTAAGATGCACTTGTCAATCCCAAGCTC 153 MWG 631 GGCTGGATCATCTGGATATTTGTGATCC 154 MWSG 632 GGATCACAAATATCCAGATGATCCAGCC 155 MWSG 633 GCCAGGATGATGACTCCTCAAGTCCAAG 156 MWG 634 CTTGGACTTGAGGAGTCATCATCCTGGC 157 MWG 635 GCTAACCCAAAACCGGGATCTCTTGG 158 MWG 636 CAGTGCCATTTTTCAGTGCCAGAGGTG 159

. EXEMPLO 21 SEQUENCIAMENTO E CLONAGEM DE DGAT?2 A PARTIR DE CANDIDA ZEYLANOIDES

À Isolamento de Candida zeylanoides a partir de uma amostra de carne curada | 5 Uma amostra de Presunto de Parma importada de Parma, Itália, foi adquirida junto a uma loja italiana local.

Uma pequena porção do presunto, aproximadamente 10 gramas, foi homogeneizada em uma solução estéril de Triton-X 100 0,1 % através do uso de um misturador Waring.

Foi adicionado glicerol à suspensão de salsicha a uma concentração final de 15 % (em peso). As diluições em série da suspensão de salsicha foram plaqueadas em meio sólido preparado através do uso de meio pré-fabricado de Agar Morfologia de Levedura (HiMedia Laboratories, India) que contém 150 mg L-1 de cloranfenicol.

As placas foram incubadas a temperatura ambiente durante uma semana.

As colônias individuais foram remarcadas no meio com composição idêntica e usadas para identificação de cepa através de sequenciamento de DNA ribossomal 26S.

De maneira reduzida, um pequena proteína de células de levedura foi adicionada a 100 ul de tampão STE que contém 10 mg mL-1 de zimolase.

As células foram resuspendidas e incubadas por 30 minutos a 37 ºC.

A suspensão celular foi aquecida a 95 ºC por 10 minutos e resfriadas a temperatura ambiente.

Foram usados 5 ul de lisina de célula em uma reação de PCR para amplificação de um fragmento de DNA ribossomal 268. A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X-100 0,1 %, MgClI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 5 uL de lisado de célula de levedura e primers de PCR MWGB619 (SEQ ID NO:104) e MWG620 (SEQ ID NO:105) a uma concentração final de 1 UM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC e 1 minuto a 72 ºC.

Os produtos de PCR de aproximadamente 600 bp foram excisados de géis de

. agarose e sequenciados diretamente através do uso dos primers MWG619 (SEQ ID NO:104) e MWG620 (SEQ ID NO:105). Uma busca BLASTN por NT (DNA público de NCBI) foi conduzida através do uso da sequência de DNA resultante. A vasta maioria de colônias de levedura derivada das amostras de — Presunto de Parma produziu produtos de PCR que, quando submetidos ao sequenciamento de DNA, mostraram identidade > 99 % para sequências de DNA ribossomal 26S de Debaryomyces hansenii. No entanto, uma colônia de levedura com características morfológicas diferentes daquelas da maioria das colônias de levedura derivadas da amostra de Presunto de Parma poderia ser identificada pela produção de uma sequência de DNA genômico ribossomal 26S (SEQ ID NO:163 ) que mostrou alta similaridade (identidade de 99 %) a uma sequência de Candida zeylanoides (Tabela) TABELA 42 RESULTADOS DE BLASTN GERADOS COM UMA SEQUÊNCIA RIBOSSOMAL 26S DE UMA

CEPA DE LEVEDURA DERIVADA DE PRESUNTO DE PARMA 1 Gene de RNA ribossomial 268 TJY7b de | Contagem = 1068 bits(539) Expectativa = 0,0 cepa de Candida Zeylanoides | Identidades = 549/551 (99%), Intervalos = 1/551 >gi165967959/9b|EU3S27107.1], (0%) Comprimento de sequência parcial = 615 Filamento = Mais/Mais 2 Gene de RNA ribossomial 26S TJY7b de | Contagem = 1068 bits(539) Expectativa = 0,0 cepa de Candida Zeylanoides | Identidades = 549/551 (99%), Intervalos = 1/551 >gil 165967958 gb/EU3S27106.1|, (0%) Comprimento de sequência parcial = 805 | Filamento = Mais/Mais Com base neste resultado, a cepa foi identificada como Candida zeylanoides. Isolamento de DNA genômico Uma cultura líquida (50 mL, meio de YPD) da cepa Candida zeylanoides foi cultivada a 28 ºC por 72h, a 250 rpm. As células de levedura mo o o o o o a 193 - foram coletadas através de centrifugação e lavadas em água deionizada.

As células de levedura foram resuspendidas em 2 mL de tampão STE (sorbitol 0,1 i M, Tris/HC! 10 mM, pH de 7,5, EDTA 1 mM) que contêm 10 mg de mL-1 de Zimolase (Zymo Research Corporation, Califórnia, EUA) e incubadas por 2 horasa37ºC.O DNA genômico total foi isolado dos esferoplastos de Levedura como segue.

A suspensão de levedura foi lisada em tampão de extração de Uréia 4 mL (0,3125 M de NaCl, 50 mM Tris de HCl, pH 8,0, 20 mM de EDTA, | sarcosina a 1 %) e foi adicionado volume igual de fenol /clorofórmio sucedido pela mistura.

Após a centrifugação, a fase aquosa foi re-extraída com fenol —clorofórmio.

Os ácidos nucleicos foram precipitados através da adição de 1/8 de volume de 4,4 M de acetato de sódio e 1 volume de isopropanol sucedida pela centrifugação.

O ácido nucleico foi secado e resuspendido em 500 microL de TE (10 mM de Tris, EDTA 1 mM). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em géis de agarose a 0,4% próximo ao marcador de peso molecular para confirmar que peso molecular era > 50 kb.

Geração de sonda específica DGAT2 através do uso de PCR Foi gerado um Fragmento de gene DGAT?2 através de PCR como segue.

A reação de PCR continha KCl 50 mM, 10 mM de Ths-HCI (pH 9), Triton X-100 0,1 %, 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq —polimerase (MBI Fermentas, EUA), 100 ng de DNA genômico de Candida zeylanoides e primers de PCR P7 (SEQ ID NO:107) e P8 (SEQ ID NO:108) a uma concentração final de 1 uM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 330 bp foi excisado a partirde géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões.

Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um produto de PCR clonado de 325 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de nucleotídeo deste produto de PCR são definidos como SEQ ID NO: 164 e SEQ

. ID NO:165. Foi conduzida uma busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica curada em NCBI.

Com base no alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 79,6 % de identidade de sequência com um produto de proteína de Pichia stipidis com número de — acessão GENBANK XP 001382973. Este produto de proteína é anotado como proteína hipotética com similaridade com diacilglicerol aciltransferase.

Isto representa a proteína com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

Sequenciamento, triagem e construção de biblioteca de cosmídeo de um gene DGAT2 O DNA genômico de Candida zeylanoides foi parcialmente digerido com Mbol.

De maneira resumida, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foi digerido com 0,5 unidades de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de BSA 0,1 mg mL-1 e NaCl 100mM de RNAse livre de DNAse 0,1 mg mL-1 (Quiagen, EUA), Ths-HCI 50 mM, MaCI2 10 mM, DTT1mM, pH de 7,9. As alíquotas de 25 ul. foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos, respectivamente, e combinadas em um tubo que continha 5 ul de 500 mM de EDTA.

O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado em um volume final de 10 ul através do uso de colunas de centrifugação do tipo DNA Clean e Concentrator'" (Zymoresearch, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

O DNA foi ligado a 2 ug de DNA PLAFR3 linearizado (B.

Staskawicz et al., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 94) que foi completamente digerido com BamHI e desfosforilado com Fosfatase Antártica (NEB, EUA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transferida para células E. coli de cepa NM554 —(Stratagene, EUA) através do uso de extratos de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas a 15 mL de meio de LB, incubadas a 37 ºC em agitador do tipo Lab configurado em 250 rpm.

O glicerol OA Ao RE e e a

P | . foi adicionado a uma concentração final de 15 % (em peso) e uma suspensão de célula foi congelada através do uso de uma mistura de metanol com gelo ] seco.

A titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada através do plaqueamento de diluições em série da suspensão celular descongelada em meio solidifcado de LB que contém 10 mg L-1 de tetraciclina.

Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada 32P que corresponde ao produto de PCR clonado de PCR clonado derivado de Pichia anomala de acordo com os protocolos padrões.

Foi usada centrifugação por gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito em T.

Maniatis et al.

Molecular Cloning: À Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a sonda sob condições estringentes.

Quatro clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso deoito primers com SEQ ID NO: 166 até 173 (Tabela). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENETY 7.1.1 (DNASTAR, INC,, EUA). O sequenciamento de DNA de quatro cosmídeos independentemente isolados com os ditos primers produziram sequências de DNA que poderiam ser montadas em uma sequência única de 3021 bp relacionada ao gene CZ DAGT2 apresentado como SEQ ID NO:174 . O mesmo contém um ORF de 1695 bp relacionado à CZ DGAT2 (SEQ ID NO:175) e encodifica uma proteína com uma sequência deduzida de 564 aminoácidos apresentados como SEQ ID NO:176 . Foi conduzida uma busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica curada em NCBl.

Com base no alinhamento CLUSTALW, o produto de gene CZ DGAT2 compartilha 57,6 % de identidade de sequência em um alinhamento CLUSTALW com um produto de gene derivado, de número de acessão GENBANK XP 001527478, de Lodderomyces elongisporus, NRRL

. YB-4239. Este produto é anotado como proteina hipotética com similaridade com diacilglicero! aciltransferase. Isto representa a proteína com a similaridade mais próxima neste banco de dados. TABELA 43

PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DERIVADOS DE

CANDIDA ZEYLANOIDES Nome Sequência SEQ ID NO: MWG722 GTCATTTCGATGGGGGTGATGGGCAC 166 MWG723 GTGCCCATCACCCCCATCGAAATGAC 167 MWG724 GCGCCGCGGCAAAGAACATCAAGAGC 168 MWG725 GCTCTTGATGTTCTTTGCCGCGGCGC 169 MWG726 CCCACTGGCGGGCGCCGACAGCACGC 170 MWG727 GCGTGCTGTCGGCGCCCGCCAGTGGG 171 MWG728 GCGCGTCTACGAGGATAACAAGGACAAG 172 MWG729 CTTGTCCTTGTTATCCTCGTAGACGCGC 173 ExEMPLO 22 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT1 E DGAT2 DE LIPOMYCES STARKEYI Isolamento de RNA e síntese de CDNA Lipomyces starkeyi (Número de catálogo 78-23T) foi adquirido junto a coleção PHAFF (UC Davis, Califórnia, EUA). Uma cultura líquida (50 mL, meio de YPD) de Lipomyces starkeyi foi cultivada a 28 ºC. As células foram colhidas através de centrifugação, lavadas com água deionizada e coletadas novamente através de centrifugação. O RNA total foi isolado a partir do pélete de cultura celular resultante através do uso do método de feno! quente exatamente conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Somerset, NJ), mas onde todos os volumes de reagente foram aumentados em 10-vezes (por exemplo, o pélete celular foi re- suspendido em 4 mL de solução de TES ao invés de 400 uL). O pélete de RNA

Í 197 i . final foi dissolvido em 1 mL de água e a concentração foi determinada como 500 ng/uL.

O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total (2 uL) através do uso do Sistema de Síntese de Primeiro Filamento Superscript?” para kit de —“RT-PCR (Invitrogen'Y Life Technologies, Carisbad, CA, EUA) com o primer oligo(dT) fornecido do acordo com o protocolo do fabricante.

Após o tratamento de RNAse H, foi usado o CONA como modelo de PCR para a geração de fragmentos de gene específico DGAT1 e DGAT2 como segue.

Geração de uma sonda específica DGAT1 através do uso de PCR Um fragmento de gene DGAT1 foi gerado através de PCR como segue.

A reação de PCR continha KCI 50 MM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- 100 0,1 %, MgCI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de Lipomyces starkeyi e primers de PCR DGAT1 FWD (SEQ ID NO:113) e DGAT1 REV (SEQ ID NO:114) a uma concentração final de 1 UM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 500 bp foi ! excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de ! técnicas padrões.

Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um : 20 produto de PCR clonado de 517 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de | nucleotídeo deste produto de PCR são definidos como SEQ ID NO:177 e SEQ ID NO:178 . Foi conduzida uma busca BASTP do banco de dados de proteina fúngica anotada em NCBI.

Com base no alinhamento CLUSTALW, uma sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 66,1 % identidade de sequência com um produto de proteína hipotética de Gibberella : zeae PH-1 com número de acessão GENBANK XP 386864 que representa a !: proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

A proteína foi anotada como membro da família MBOAT (O-acil transferase ligada a

| J 198 membrana) de proteínas de membrana que contém uma variedade de enzimas de aciltransferase.

Geração de uma sonda específica DGAT2 através do uso de PCR Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue A reação de PCR continha KCI 50 mM, 10 mM de Ths-HCI (pH 9), Triton X-100 0,1 %, MgCI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de Lipomyces starkeyi e | primers de PCR P7 (SEQ ID NO:) e P8 (SEQ ID NO:) a uma concentração final | de 1 UM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um | 10 compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 270 bp foi excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões.

Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um produto de PCR clonado | de 263 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de nucleotídeo deste | 15 produto de PCR são definidos como SEQ ID NO:179 e SEQ ID NO:180. Foi conduzida uma busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBIl.

Com base no alinhamento CLUSTALW, uma sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 66,1 % de identidade de | sequência com um produto de proteína hipotética de Yarrowia lipolytica CLIB1I22 com número de acessão GENBANK XP 504700 que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

A sequência de aminoácido desta proteína é idêntica àquela de YL DGAT 2 descrita no Pedido de Publicação PCT Nº WO 2005/003322 e difere em um resíduo de aminoácido daquela de YL-DGAT2 apresentados como SEQ ID NO:10 por razões que estão esboçadas no Exemplo 1. Isolamento de DNA genômico Uma cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Lipomyces starkeyi foi cultivada a 28 ºC por 72h, a 250 rpm.

As células de levedura foram coletadas

. através de centrifugação e lavadas em água deionizada. As células de levedura foram resuspendidas em 2 mL de tampão STE (sorbitol 0,1 M, Tris/HCI 10 mM, PH de 7,5, EDTA 1 mM) que contém Zimolase 10 mg mL-1 (Zymo Research Corporation, Califórnia, EUA) e incubadas por 2 horas a 37 ºC. O DNA genômico total foi isolado de esferoplastos de Lipomyces como segue. À suspensão de levedura foi lisada em tampão de extração de Uréia 4 mL (NaCl 0,3125 M, Tris HCl 50 mM, pH de 8,0, EDTA 20 mM, sarcosina a 1%) e volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado sucedido pela mistura. Após centrifugação, a fase aquosa foi re-extraída com fenol clorofórmio. Os ácidos —nucleicos foram precipitados através da adição de 1/8 de volume de 4,4 M de acetato de sódio e 1 volume de isopropano! sucedido pela centrifugação. Os ácidos nucleicos foram secados e resuspendidos em TE 500 microL (Tris10 mM, EDTA 1 mM). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em géis de agarose a 0,4% próxima ao marcador de —pesomolecular para confirmar que o peso molecular era < 50 kb.

Construção de biblioteca de cosmídeo O DNA genômico de Lipomyces starkeyi foi parcialmente digerido com Mbol. De maneira resumida, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foi digerido com 0,5 unidades de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de BSA 0,1 mg mL-1 e NaCl 100 mM de RNAse livre de DNAse 0,1 mg mL-1 (Quiagen, EUA), Tris-HCI 50 mM, MgCI2 10 mM, DTT 1 MM, pH de 7,9. As alíquotas de 25 ul. foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos, respectivamente, e combinadas em um tubo que continha 5 ul. de EDTA 500 mM. O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado em um — volume final de 10 ul através do uso de Colunas de centrifugação do tipo DNA | Clean e Concentrator'" (Zymoresearch, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, O DNA foi ligado a 2 ug de DNA pLAFR3 linearizado (B. Staskawicz et al., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 94) que foi completamente

: digerido com BamHI e desfosforilado com Fosfatase Antártica (NEB, EUA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transferida para células E. coli de i cepa NMS554 (Stratagene, EUA) através do uso de extratos de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas a 15 mL de meio de LB, incubadas a 37 ºC em agitador do tipo Lab configurado em 250 rpm.

O glicerol | foi adicionado a uma concentração final de 15 % (em peso) e a suspensão de célula foi congelada através do uso de uma mistura de metanol com gelo seco.

À | titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada através do plaqueamento de diluições em série da suspensão celular descongelada em meio solidificado de LB que contém 10 mg L-1 de tetraciclina.

Triagem e sequenciamento de cosmídeos que compreendem Lipomyces starkeyi DGAT1 Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada 32P que corresponde ao produto de PCR relacionado ao DGAT1 clonado de SEQ ID NO: derivado de Lipomyces starkeyi de acordo com os protocolos padrões.

Foi usada centrifugação com gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito em T.

Maniatis ef al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a sonda sob condições estringentes.

Dois clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso de seis primers com SEQ ID NO 181 até 188 (Tabela 44). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENE!Y 7,11 (DNASTAR, INC., EUA). O sequenciamento de DNA de dois cosmídeos independentemente isolados com os ditos primers produziram sequências de DNA que poderiam ser montadas em uma sequência única de 3343 bp

. relacionada ao gene LS DGAT1 apresentado como SEQ ID NO:189. A busca TBLASTX do banco de dados de proteina fúngica anotada em NCBI foi conduzida com o gene LS DGAT1I (SEQ ID NO:189) que mostrou similaridades com as proteínas fúngicas hipotéticas com similaridades com a aciltransferase. Também se revelou que o gene LS DGAT1 é interrompido por íntrons. Portanto, a clonagem e amplificação de PCR do LS DGAT1 cDNA foi necessária. Isto está descrito no Exemplo 32. TABELA 44 PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DGAT1

DERIVADOS DE LIPOMYCES STARKEYI Nome Sequência SEQ ID NO: MWG713 GTCAAGCGGATTCTGGAGATGGTGGGCC 181 - MWG714 GGCCCACCATCTCCAGAATCCGCTTGAC 182 MWG715 CCGCTTSGTGCECCGCGGGTGGAATTCTGCG 183 MWG716 CGCAGAATTCCACCCGCGGCGCACAAGCGG 184 MWG717 CGCTGAGCGAAGCGACCGTAG 185 MWG718 CCCATTITGGGGTTGGAGCG 186 MWG719 TTGATTTGCTTCTGGTCCCG 187 MWG720 CGTGCCCATTGCATGGATTC 188 Triagem e sequenciamento de cosmídeos que compreendem Lipomyces starkeyi DGAT2 Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada 32P que corresponde ao produto de PCR relacionado ao DGAT2 clonado de SEQ ID NO: derivado de Lipomyces starkeyi de acordo com protocolos padrões. Foi usada centrifugação com gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito em T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar —DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a

- sonda sob condições estringentes. Quatro clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso de quatro primers com SEQ ID NO 190 até 193 (Tabela 45). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENET!Y 7.1.1 (DNASTAR, INC, EUA). O sequenciamento de DNA de quatro cosmídeos independentemente isolados com os ditos primers produziram sequências de DNA que poderiam ser montadas em uma sequência única de 2090 bp relacionada ao gene LS DAGT2 apresentado como SEQ ID NO:194. Uma busca TBLASTX do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida com o gene LS DGAT2 (SEQ ID NO:194) que mostrou similaridades com as proteínas fúngicas hipotéticas com similaridades com a aciltransferase. Também se revelou que o gene LS DGAT?2 é interrompido por íntrons. Portanto, uma clonagem e amplificação de PCR do LS DGAT?2 cDNA foi necessária. Isto está descrito no Exemplo 29. TABELA 45 PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DGAT2

DERIVADOS DE LIPOMYCES STARKEYI Nome Sequência SEQ ID NO: MWG667 GGGTGCGTTTGGTGCTATTGGTACGGAAGG 190 MWG668 CCTTCCGTACCAATAGCACCAAMACGCACCC — 191 MWG669 GGGATTGCTTCAGTATCTCGACGGTCTTG — 192 MWG670 CAAGACCGTCGAGATACTGAAGCAATCCC — 193 EXEMPLO 23 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 DE RHODOTORULA GLUTINIS Isolamento de RNA e síntese de CONA Rhodotorula glutinis (Número de catálogo 68-255T) foi adquirida junto à coleção PHAFF (UC Davis, Califórnia). Uma cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Rhodotorula glutinis foi cultivada a 28 ºC. As células foram colhidas através de centrifugação, lavadas com água deionizada e coletadas

. novamente através de centrifugação.

O RNA total foi isolado a partir do pélete de cultura celular resultante através do uso do método de fenol quente É exatamente conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John i

Wiley & Sons, Somerset, NJ, EUA), mas onde todos os volumes de reagente foram aumentados em 10-vezes (por exemplo, pélete celular foi re-suspendido em 4 mL de solução de TES ao invés de 400 ul). O pélete de RNA final foi dissolvido em 1 mL de água e a concentração foi determinada como 500 ng/uL.

O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total (2 ul) através do uso do Sistema de Síntese de Primeiro Filamento Superscript'"Y“ para Kit de PCR-RT (Invitrogen'Y Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o indicador oligo(dT) fornecido do acordo com o protocolo do fabricante.

Após o tratamento de RNAse H, foi usado o CDONA como modelo de PCR para geração de fragmentos de gene específico DGAT2 como segue.

Geração de uma sonda específica DGAT2 através do uso de PCR Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue.

A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- 1000,1 %, MgCl2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de Rhodotorula glutinis e | primers de PCR BM DGAT2 FWD (SEQ ID NO:111 ) e BM DGAT2 REV (SEQ 1IDNO:112) a uma concentração final de 1 uM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 480 bp foi excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões.

Muitos clones de plasmídeo foram identificados e — continham um produto de PCR clonado de 474 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de nucleotídeo deste produto de PCR são definidos como SEQ ID NO:195 e SEQ ID NO:196. Foi conduzida uma busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI.

Com base no alinhamento

: CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 70,8 % de identidade de sequência com um produto de proteína hipotética de Ustilago maydis 521 com número de acessão GENBANK XP 760084 que representa a proteína com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

Isolamento de DNA genômico Uma cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Rhodotorula glutinis foi cultivada a 28 ºC por 72h, a 250 rpm.

As células de levedura foram coletadas através de centrifugação e lavadas em água deionizada.

As células de levedura foram resuspendidas em 2 mL de tampão STE (sorbitol | 0,1 M, Tris/HCI 10 mM, pH de 7,5, EDTA 1 mM) que contém 10 mg mL-1 de | Zimolase (Zymo Research Corporation, Califórnia, EUA) e incubadas por 2 horas a 37 “ºC.

O DNA genômico total foi isolado de esferoplastos de Rhodotorula glutinis como segue.

A suspensão de levedura foi lisada em 4 mL de tampão de extração de Uréia (M NaCl 0,3125, 50 mM Tris HCl, pH 8,0, EDTA 20 mM, sarcosina 1 %) e volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado sucedido pela mistura.

Após centrifugação, a fase aquosa foi re- extraída com fenol clorofórmio.

Os ácidos nucleicos foram precipitados através da adição de 1/8 volume de acetato de sódio 4,4 M e 1 volume de isopropanol sucedido pela centrifugação.

Os ácidos nucleicos foram secados e resuspendidos em TE 500 microL (Tris 10 MM, EDTA 1 mM). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em géis de agarose a 0,4 % próxima ao marcador de peso molecular para confirmar que o peso molecular era < 50 kb.

Construção de biblioteca de plasmídeo O DNA genômico de Rhodotorula glutinis foi parcialmente

Ô ah Ad o o o a 205 r digerido com Mbol.

De maneira resumida, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foi digerido com 0,5 unidades de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de BSA 0,1 mg mL-1 e NaCl 100 mM 0,1 mg mL-1 RNAse livre de DNAse (Quiagen, EUA), Tris-HCI 50 mM, MgCl210 mM, DTT 1 mM, pH de 7,9. As alíquotas de 25 ul foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos, respectivamente, e combinadas em um tubo que continha 5 ul. de EDTA 500 mM.

O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado em um volume final de uL através do uso de colunas de centrifugação do tipo DNA Clean e | 10 Concentrator'" (Zymoresearch, EUA) de acordo com as instruções do | fabricante.

O DNA foi ligado a 2 ug de DNA pLAFR3 linearizado (B.

Staskawicz et al., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 94) que foi completamente digerido com BamHlI e desfosforilado com Fosfatase | Antártica (NEB, EUA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transferida para células E. coli de cepa NM554 (Stratagene, EUA) através do uso de extratos de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas a 15 mL de meio de LB, incubadas a 37 ºC em agitador do tipo Lab configurado em 250 rpm.

O glicerol foi adicionado a uma concentração final de 15 % (em peso) e a suspensão de célula foi congelada através do uso de uma mistura de metanol com gelo seco.

A titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada através do plaqueamento diluições em série da suspensão celular descongelada em meio solidificado de LB que contém 10 mg L-1 de tetraciclina. — Triagem e sequenciamento de cosmídeos que compreendem Rhodotorula glutinis DGAT 2 Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B

. (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada 32P que corresponde ao produto de PCR relacionado ao DGAT1 clonado de SEQ ID NO: derivado de Rhodotorula glutinis de acordo com protocolos padrões. Foi usada centrifugação com gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito em T. Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a sonda sob condições estringentes. Sete clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso de sete primers com SEQ ID NO 197 até 203 (Tabela 46). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENE"Y 7.11 (DNASTAR, INC, EUA). O sequenciamento de DNA de sete cosmídeos independentemente isolados | com os ditos primers produziu sequências de DNA que poderiam ser | montadas em uma sequência única de 2944 bp relacionada a Gene | 15 RG DGAT2 apresentados como SEQ ID NO:204. A busca TBLASTX do | banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida com o gene RG DGAT2 (SEQ ID NO:204) que mostrou similaridades com as proteinas fúngicas hipotéticas com similaridades com a aciltransferase. Também se revelou que o gene RG DGAT?2 é interrompido por íntrons. Portanto, a clonagem e amplificação de PCR do cDNA RG DGAT?2 foram necessárias. Isto está descrito no Exemplo 28. TABELA 46 PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DE DGAT2

DERIVADOS DE RHODOTORULA GLUTINIS Nome Sequência SEQ ID NO: MWG649 GCTTGATGAAGCCCTTGCGC 197 MWG650 GCGCAAGGGCTTCATCAAGC 198 MWG651 GCCAAAGTTGGCGATGGCGC 199

| . Nome Sequência SEQ ID NO: MWG652 GCGCCATCGCCAACTTTGGC 200 MWG657 GTGTGCGGCCTGAAACCGGG 201 MWG658 GCAGTGGGTGCATGGGTCAG 202 MWG659 GAAGGCGACGATGCCGTGGC 203 EXEMPLO 24 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 DE PHAFFIA RHODOZYMA Isolamento de RNA e a síntese de CDONA Phaffia rhodozyma (Número de catálogo 67-210) foi adquirida junto àcoleção PHAFF em UC Davis, CA, EUA. A cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Phaffia rhodozyma foi cultivada a 18 ºC. As células foram colhidas através de centrifugação, lavadas com água deionizada e coletadas novamente através de centrifugação. O RNA total foi isolado a partir do pélete de cultura celular resultante através do uso do método de fenol quente exatamente conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Somerset, NJ), mas onde todos os volumes de reagente foram aumentados em 10 vezes (por exemplo, o pélete celular foi re-suspendido em 4 mL de solução de TES ao invés de 400 ul). O pélete de RNA final foi dissolvido em 1 mL de água e a concentração foi determinada como 500 ng/ul. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total (2 uL) através do uso do Sistema de Síntese de Primeiro Filamento Superscript'" para Kit de PCR-RT (Invitrogen'y Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o indicador oligo(dT) fornecido do acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento de RNAse H foi usado o cDNA como modelo de PCR para geração de fragmento de gene específico DGAT2 como segue. Geração de uma sonda específica DGAT2 através do uso de

PCR Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR

' como segue.

A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X-100 0,1 %, MgCl2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de Phaffia rhodozyma e primers de PCR BM DGAT2 FWD (SEQ ID NO:111 ) e BM DGAT2 REV (SEQ ID NO:112) a uma concentração final de 1 UM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 400 bp foi excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões.

Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um produto de PCR clonado de 397 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de nucleotídeo deste produto de PCR são definidos como SEQ ID NO:205 e SEQ ID NO:206 . A busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida.

Um alinhamento de CLUSTALW revelou que uma sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 77,1 % de identidade de sequência com um produto de proteína hipotética de Cryptococcus neoformans var. neoformans B-3501 A com número de acessão GENBANK XP 774736 que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

TABELA 47 PRIMERS USADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DE 3' E 5' RACE DA TRANSCRIÇÃO DE DGAT?2 DERIVADA DE PHAFFIA RHODOZYMA Nome Sequência SEQ ID NO: MWG709 GTCATCGGGATGGGAGCTTTCGCCAACTTTGC 207 MWG710 GCAAAGTTGGCGAAAGCTCCCATCCCGATGAC 208 MWG711 CCCGGGAACAGCCGACTTGACACTCAAGAG 209

. Nome Sequência SEQ ID NO: MWG?712 CTCTTGAGTGTCAAGTCGGCTGTTCCCGGG 210 3'RACE GGCCACGCGTCGACTAGTACTITITITIIIIIIT 211 3RACEABR GGCCACGCGTCGACTAGTAC 212 5'RACE P GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGXXGGGXXGGGXXG 213 Simbolo (Significado): R (G ou A), Y (T ou C), M (A ou C), K(G ou T), S (G ou C), W(A ou T), H(Aou C), B(G ou T ou C), V(G ou Cou A), D(Gou A ou T), N(GouAouTouC)eX (Inosina) 3' RACE O cDNA foi sintetizado a partir de aproximadamente 1 ug de RNA total de Phaffia rhodozyma (2 uL) através do uso do Sistema para Síntese de Primeiro Filamento Superscript'y para Kit de RT-PCR (Invitrogen'" Life — Technologies, Carlisbad, CA, EUA) com o primer 3'RACE (SEQ ID NO:) do acordo com o protocolo do fabricante.

Após o tratamento de RNAse H foi usado o cCDNA como modelo de PCR para geração de fragmento de gene específico DGAT2 como segue.

Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue.

A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- 100 0,1 %, MgCl2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de Phaffia rhodozyma cDNA gerados com o primer 3RACE (SEQ ID NO:211 ) e primers de PCR MWG709 (SEQ ID NO:207) e 3RACE ABR (SEQ ID NO:212) a uma concentração final de 1 uM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

A reação de PCR resultante foi diluída 1000 vezes e 5 ul. foram usados em uma reação de PCR através do uso de primer 3RACE ABR (SEQ ID NO:212 ) e MWG 711 (SEQ ID NO:209). Um produto de PCR de aproximadamente 400 bp foiexcisado a partir de géis de agarose e diretamente sequenciado através do

. uso de primer MWG 711 (SEQ ID NO:209). S! RACE O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total de Phaffia rhodozyma (2 ul) através do uso do Sistema para Síntese de Primeiro — Filamento Superscript'y para Kit de RT-PCR (Invitrogen"“ Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o primer MWG712 (SEQ ID NO:210) do acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento de RNAse H os resíduos de citidila foram adicionados a 5' terminação dos cDNAs sintetizados através do uso de transferase terminal produzida de forma recombinante de timo de bezerro (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue. A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- 100 0,1 %, MgCl2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq —polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de terminal C de Phaffia rhodozyma gerado com o primer MWG712 (SEQ ID NO:210) e primers de PCR 5"RACE P (SEQ ID NO:213) e MWG710 (SEQ ID NO:208) a uma concentração final de 1 uM. Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72ºC. Um produto de PCR de aproximadamente 600 bp foi excisado a partir de géis de agarose e diretamente sequenciado através do uso de primer MWG710 (SEQ ID NO:208).

Montagem de um cDNA para PR DGAT2 As sequências derivadas de produtos de PCR gerados de RNA total através do uso de RT PCR e primers degenerados e 5' e 3' RACE foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENEY 7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA). Isto produziu uma sequência de DNA composta por um ORF de 1218 bp que encodifica uma proteína de 405 i . aminoácidos. A sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido deduzido deste ORF que está relacionado ao PR DGAT2 RACE e ao ; PR DGAT2 PRO são definidas como SEQ ID NO:214 e SEQ 1D:215. Com base no alinhamento CLUSTALW a sequência de aminoácido deduzido de PR DGAT2 RACE compartilha 60,2 % de identidade de sequência com um produto de proteina hipotética de Cryptococcus neoformans var. neoformans B- 3501A com número de acessão GENBANK XP 774736 em um alinhamento CLUSTALW. Isto representa a proteína com a similaridade mais próxima no banco de dados de proteína fúngica curada de NCBL. Isto foi anotado como tendo similaridade a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

EXEMPLO 25 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 DE CRYPTOCOCCUS CURVATUS Isolamento de RNA e síntese de CDONA Cryptococcus curvatus (ATCC 10567) foi adquirido junto a Coleção de Cultura de Tipo Americana (VA, EUA). Uma cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Cryptococcus curvatus foi cultivada a 28 ºC. As células foram colhidas através de centrifugação lavadas com água deionizada e coletadas novamente através de centrifugação. O RNA total foi isolado a partir do pélete de cultura celular resultante através do uso do método de fenol quente exatamente conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Somerset, NJ, EUA), mas onde todos os volumes de reagente foram aumentados em 10 vezes (por exemplo, o pélete celular foi re- suspendido em 4 mL de solução de TES ao invés de 400 ul). O pélete de RNA final foi dissolvido em 1 mL de água e a concentração foi determinada como | 500 ng/ul. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total (2 uL) através do uso do Sistema de Síntese de Primeiro Filamento Superscript'Y para Kit de PCR-RT (Invitrogen'“ Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o indicador

F oligo(dT) fornecido do acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento de RNAse H foi usado o cCDONA como modelo de PCR para geração de | fragmento de gene específico DGAT2 como segue. Geração de uma sonda específica DGAT2 através do uso de PCR Um Fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue. A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- 100 0,1 %, MgCl2 2,5 MM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de Cryptococcus curvatus cCDNA e primers de PCR P7 (SEQ ID NO:107) e P8 (SEQ ID NO:108) a uma concentração final de 1 UM. Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto de PCR de aproximadamente 270 bp foi excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões. Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um produto de PCR clonado de 269 bp. As sequências de aminoácido deduzido e de nucleotídeo deste produto de PCR são definidas como SEQ ID NO:216 e SEQ ID NO0:217. A busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida. Com base no alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 73,0 % de identidade de sequência com um produto de proteína hipotética de Cryptococecus neoformans var. neoformans B-3501A com número de acessão GENBANK XP 774736 que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados. Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

Isolamento de DNA genômico Uma cultura líquida (50 mL, meio YPD) de Cryptococcus curvatus foi cultivada a 28 ºC por 72h, a 250 rpm. As células de levedura foram

" coletadas através de centrifugação e lavadas em água deionizada. As células de levedura foram resuspendidas em 2 mL de tampão STE (sorbitol 0,1 M, Tris/HCI 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) que contém 10 mg mL-1 de Zimolase (Zymo Research Corporation, Califórnia, EUA) e incubadas por 2 horas a 37 ºC. O DNA genômico total foi isolado dos esferoplastos de Cryptococcus curvatus como segue. A suspensão de levedura foi lisada em 4 mL de tampão de extração de Uréia (NaCl! 0,3125 M, Tris HCI 50 mM, pH 8,0, EDTA 20 mM, sarcosina 1 %) e volume igual de fenol /clorofórmio foi adicionado sucedido pela mistura. Após a centrifugação, a fase aquosa foi re-extraída com fenol —clorofórmio. Os ácidos nucleicos foram precipitados através da adição de 1/8 volume de acetato de sódio 4,4 M e 1 volume de isopropanol sucedido pela centrifugação. Os ácidos nucleicos foram secados e resuspendidos em TE 500 microL (Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Uma pequena alíquota (1 microL) da solução de ácido nucleico foi separada em géis de agarose a 0,4 % próxima ao marcador de peso molecular para confirmar que o peso molecular era 2 50 kb.

Construção de biblioteca de plasmídeo O DNA genômico de Cryptococcus curvatus foi parcialmente digerido com Mbol. De maneira resumida, aproximadamente 10 ug de DNA genômico foi digerido com 0,5 unidades de Mbol (NEB, EUA) em um volume final de 100 ul na presença de BSA 0,1 mg mL-1, e NaCl 100 mM RNAse livre de DNAse 0,1 mg mL-1 (Quiagen, EUA) , Tris-HCI 50 mM, MgCI2 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9. Alíquotas de 25 ul. foram removidas após 30, 60, 120 e 180 segundos, respectivamente, e combinadas em um tubo que continha 5 ul. de EDTA 500 mM. O DNA parcialmente digerido foi purificado e concentrado em —um volume final de 10 ul através do uso de colunas de centrifugação do tipo DNA Clean e Concentrator"" (Zymoresearch, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi ligado a 2 ug de DNA pLAFR3 linearizado (B. Staskawicz et al., Journal of bacteriology (1987), 169(12), 5789 a 94) que foi a í completamente digerido com BamHI e desfosforilado com Fosfatase Antártica . (NEB, EUA). A reação de ligação foi empacotada in vitro e transferida para células E. coli de cepa NM554 (Stratagene, EUA) através do uso de extratos de empacotamento MAXPLAX (EPICENTRE Biotechnologies, EUA) de acordo | comas instruções do fabricante.

As células transfectadas foram adicionadas a 15 mL de meio de LB, incubadas a 37 ºC em agitador do tipo Lab configurado em 250 rpm.

O glicerol foi adicionado a uma concentração final de 15 % (em peso) e a suspensão de célula foi congelada através do uso de uma mistura de metanol com gelo seco.

A titulação da biblioteca de cosmídeo foi determinada através do plaqueamento diluições em série da suspensão celular descongelada em meio solidifcado de LB que contém 10 mg L-1 de | tetraciclina.

Triagem e sequenciamento de cosmídeos que compreendem Cryptococecus curvatus DGAT2 Aproximadamente 20.000 clones de cosmídeo foram plaqueados em meio seletivo, transferidos para membranas de Biodyne B (PALL Corporation, EUA) e triados com uma sonda marcada 32P que corresponde ao produto de PCR relacionado ao DGAT2 clonado de SEQ ID NO:216 derivado de Cryptococcus curvatus de acordo com os protocolos padrões.

Foi usada centrifugação por gradiente de densidade de cloreto de césio conforme descrito em T.

Maniatis et al.

Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (1982), 545 páginas, para purificar DNA de cosmídeo de culturas líquidas derivadas de colônias que hibridizaram a sonda sob condições estringentes.

Quatro clones de cosmídeo foram sequenciados através do uso de oito primers com SEQ ID NO218 até225 (Tabela 48). As sequências foram montadas através do uso do programa SEQMAN do pacote de software da LASERGENE"Y 7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA). O sequenciamento de DNA de sete cosmídeos independentemente isolados com os ditos primers produziu sequências de o

: DNA que poderiam ser montadas em uma sequência única de 2816 bp relacionada ao gene CC DGAT?2 apresentado como SEQ ID NO:226 . A busca TBLASTX do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida com o gene CC DGAT2 (SEQ ID NO:226) que mostrou similaridades com as proteínas fúngicas hipotéticas com similaridades com a aciltransferase. Também se revelou que o gene CC DGAT? é interrompido por vários íntrons. TABELA 48 PRIMERS USADOS PARA SEQUENCIAMENTO DE CLONES DE COSMÍDEO DE DGAT2

DERIVADOS DE CRYPTOCOCCUS CURVATUS Nome Sequência SEQIDNO: . MWG732 GGCATGGGAGCTGTCGCGGCCTTTGÉGTCCEGAGGC 218 o MWG733 GCCTCGGACGCAMAGGCCGCGACAGCTCCATGCC 219 MWG734 CCTGGCCAAGGGTCCGGGCTATGCCATCACC 220 MWG735 GGTGATGGCATAGCCCGGACCCTTGGCCAGG 221 MWG743 GCGGCEGTECEGTTGTGEGTCETACCEGGECCC 222 MWG744 CCCAGATCATGTACGGGATGAGCACTGGC 223 | MWG745 CCTTCCGCCACCCCATCGTCACTGTCG 224 MWG746 CGCTCTTCCACGGGCGCGGGCTCTTCAAC 225 EXEMPLO 26 CLONAGEM E SEQUENCIAMENTO DE DGAT2 De MucoR CIRCINELLOIDES Isolamento de RNA e síntese de CDNA Mucor circinelloides (ATCC 1216b) foi adquirido junto a Coleção de Cultura de Tipo Americana (VA, EUA). Uma cultura líquida (50 mL de caldo de dextrose de batata) de Mucor circinelloides foi cultivada a 24 ºC. O caldo de dextrose de batata foi adquirido junto a Becton, Dickinson e Company (NJ, EUA). O micélio foi colhido através de centrifugação, lavado com água deionizada e coletado novamente através de centrifugação. O RNA total foi

NS . isolado do micélio resultante através do uso do método de fenol quente exatamente conforme descrito em Current Protocols in Molecular Biology (John f Wiley & Sons, Somerset, NJ, EUA), mas onde todos os volumes de reagente foram aumentados em 10 vezes (por exemplo, o pélete celular foi re- — suspendidoem 4 mL de solução de TES ao invés de 400 ul). O pélete de RNA final foi dissolvido em 1 mL de água e a concentração foi determinada como 500 ng/ul.. O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total (2 uL) através | do uso do Sistema para Síntese de Primeiro Filamento Superscript'"” para kit | de RT-PCR (Invitrogen'" Life Technologies, Carisbad, CA, EUA) com o indicador oligo(dT) fornecido do acordo com o protocolo do fabricante.

Após o : ' tratamento de RNAse H foi usado o CDNA como modelo de PCR para geração | de fragmento de gene específico DGAT2 como segue. | Geração de uma sonda específica DGAT?2 através do uso de PCR Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como — segue.

A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 9), Triton X- | 100 0,1 %, MgCI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq | polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de Mucor circinelloides cDNA e | primers de PCR BM DGAT2 FWD (SEQ ID NO:) e BM DGAT2 REV (SEQ ID NO:) a uma concentração final de 1 uM.

Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC.

Um produto de PCR de aproximadamente 400 bp foi excisado a partir de géis de agarose, clonado e sequenciado através do uso de técnicas padrões.

Foi identificado um clone de plasmídeo que continha um produto de PCR clonado de 394 bp.

A sequência de aminoácido deduzido e de —nucleotídeo deste produto de PCR são definidas como SEQ ID NO:227 e SEQ ID NO:228. A busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida.

A sequência de aminoácido deduzido do produto de PCR compartilha 67,2 % de identidade de sequência em um alinhamento . HZ

CLUSTALW com um produto de proteína hipotética de Cryptococcus neoformans var. neoformans B-3501 A com número de acessão GENBANK XP 774736 que representa a proteina com a similaridade mais próxima no banco de dados de proteína fúngica curada em NCBI. Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida. TABELA 49 PRIMERS USADOS PARA AMPLIFICAÇÃO DE 3' E 5' RACE DA TRANSCRIÇÃO DE DGAT?2 DERIVADA DE MucoR CIRCINELLOIDES Nome Sequência SEQ ID NO: MWG736 GCAGTTTTGCTAGTTTTGCTACGGAAGC 229 MWG737 GCTTCCGTAGCAAAACTAGCAAAACTGC 230 MWG738 GAGATTAGGTTTCATCCGAATCGCGATTCGTC 231 MWG739 GACGAATCGCGATTCGGATGAAACCTAATCTC 232 3RACE GGCCACGCGTCGACTAGTACTTITTITIITITITT 211 3RACEABR GGCCACGCGTCGACTAGTAC 212 S'RACE P GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGXXGGGXXGGGXXG 213 Simbolo (Significado): R (G ou A), Y (T ou C), M(A ou C), K(G ou T), S (G ou C), W(A ou T), H | (A ou C), B(G ou T ou C), V(G ou C ou A), D (G ou A ou T), N(GouAouTouC)eX | (linosina) 3' RACE O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total de Mucor circinelloides (2 ul) através do uso do Sistema para Síntese de Primeiro Filamento Superscript'” para Kit de RT-PCR (Invitrtogen'" Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o primer 3'RACE (SEQ ID NO:) do acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento de RNAse H foi usado o cDNA como modelo de PCR para geração de fragmento de gene específico DGAT2 como segue. Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue. A reação de PCR continha KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH

E

| , 9), Triton X-100 0,1 %, MgCI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de Mucor circinelloides i cDNA gerado com o primer 3'RACE (SEQ ID NO:211 ) e primers de PCR | MWG736 (SEQ ID NO:229) e primer 3'RACE ABR (SEQ ID NO:212) a uma concentração final de 1 UM. Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto de PCR proeminente de aproximadamente 650 bp foi excisado a partir de géis de agarose e sequenciado diretamente com os primers MWG736 (SEQ ID NO:229) e MWG738 (SEQ ID NO:231).

8' RACE ' O cDNA foi sintetizado a partir de 1 ug de RNA total de Mucor circinelloides (2 ul) através do uso do Sistema para Síntese de Primeiro Filamento — Superscript'M para Kit de RT-PCR (Invittogen'y Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) com o primer MWG739 (SEQ ID NO:232) do acordo com o protocolo do fabricante. Após o tratamento de RNAse H os resíduos de citidila foram adicionados a 5' terminação dos cCDNAs sintetizados através do uso de transferase terminal produzida de forma recombinante de timo de bezerro (New England Biolabs, Beverly, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Um fragmento de gene DGAT?2 foi gerado através de PCR como segue. A reação de PCR continha KCI 50 MM, Tris-HCI 10 mM (pH | 9), Triton X-100 0,1 %, MgCI2 2,5 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 5 unidades de Taq polimerase (MBI Fermentas, EUA), 2 ul de cDNA de terminal C de Mucor circinelloides gerado com o primer MWG739 (SEQ ID NO0:232) e primers de PCR 5'RACE P (SEQ ID NO:213) e MWG737 (SEQ ID NO:230) a uma concentração final de 1 UM. Foi executada a amplificação por 35 ciclos, em que cada um compreende 45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 52 ºC, e 1 minuto a 72 ºC. Um produto de PCR de aproximadamente 600

' bp foi excisado a partir de géis de agarose e clonados em um vetor de plasmídeo.

Dois clones de plasmídeo com um acréscimo de i aproximadamente 520 bp foram completamente sequenciados.

Montagem de um cDNA para MC DGAT2

As sequências de DNA derivadas de produtos de PCR gerados a partir de RNA total através do uso de RT PCR e primers degenerados e 5' e 3! RACE foram montadas através do uso do programa

| SEQMAN do pacote de software da LASERGENETY 7.1.1 (DNASTAR, INC., EUA). Isto produziu uma sequência de DNA composta por um ORF de1110 bp que encodifica uma proteína de 369 aminoácidos.

À sequência de nucleotídeo e a sequência de aminoácido deduzido deste ORF relacionado à MC DGAT2 são definidas como SEQ ID NO:233 e SEQ

ID:234. Com base no alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido de MC DGAT2 compartilha 49,7 % de identidade de sequência com um produto de proteina hipotética de Ustilago maydis 521 com número de acessão GENBANK XP 760084 que representa a proteina com a similaridade mais próxima no banco de dados de proteína fúngica curada em NCBI.

Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

A proteina também compartilha 54,4 e 59,7 % de identidade de sequência com as proteinas DGAT2a e DAGT2b de Mortierella ramanniana descritas em Lardizabal et a/ (The Journal of biological chemistry (2001 ), 276(42), 38862 a 9.) EXEMPLO 27

EXPRESSÃO DE DGAT2S A PARTIR DE YARROWIA LIPOLYITICA, TORULOSPORA

DELBRUECKII E DEBARVOMVCES HANSENII! EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1324, que compreende Torulospora diacilglicerídeo aciltransferase 2a (TD DGAT2a);,

: pKR1325, que compreende Torulospora diacilglicerídeo aciltransferase 2b (TD DGAT2b); e pKR1328 que compreende Debaryomyces diacilglicerídeo aciltransferase 2 (DH DGAT2) e a expressão em embriões somáticos.

O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi expresso para comparação. ' Construção de pKR1324, que compreende TD DGAT2a TD DGAT2a (SEQ ID NO:121) foi amplificado a partir de um clone de cosmídeo descrito no Exemplo 18 com os oligonucleotídeos primers ocgDG2a-1 (SEQ ID NO:235) e ocgDG2a-2 (SEQ ID NO:236), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat.

Nº F5538S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1295 (SEQ ID NO:237). A sequência de aminoácido correspondente e de nucleotídeo de TD DGAT2a a partir de pKR1295 está apresentada na SEQ ID NO:133 e SEQ ID NO:135. O fragmento Not! de pKR1295 (SEQ ID NO:237), que contém TD DGAT2a, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR1324 (SEQ ID NO:238). Construção de pKR1325, que compreende TD DGAT2b TD DGAT2b (SEQ ID NO:134) foi amplificado a partir de DNA de cosmídeo de Torulospora descrito no Exemplo 18 com oligonucleotídeo primers ocgDG2b-1 (SEQ ID NO:239) e ocgDG2b-2 (SEQ ID NO:240), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'" (Cat.

No.

F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR- Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen i 221 o | i - Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1296 (SEQ ID NO:241). A sequência de aminoácido correspondente e de ' nucleotíideo de TD DGAT2b a partir de pKR1296 está apresentada na SEQ | ID NO:134 e SEQ ID NO:136. | 5 O fragmento Notl de pKR1296 (SEQ ID NO:241), containing TD DGAT?2b, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo | 4) para produzir pKR1325 (SEQ ID NO:242). Construção de pKR1328, que compreende DH DGAT2 DH DGAT?2 (SEQ ID NO:161 ) foi amplificado a partir de um clone DNA de cosmídeo clone de Debaryomyces descrito no Exemplo 20 com oligonucleotídeos primers odhDG2-1 (SEQ ID NO:243) e odhDG2-2 (SEQ ID NO:244), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade PhusionTY (Cat.

No.

F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir PKR1297 (SEQ ID NO:245). A sequência de aminoácido correspondente e de nucleotídeo de DH DGAT?2 a partir de pKR1297 está apresentada na SEQ ID NO:161 e SEQ ID NO:162. O fragmento Notl de pKR1297 (SEQ ID NO:245), que contém DH DGAT?, foi clonado no sítio Notl de pKR179 (SEQ ID NO:246), que está descrito em BB1574 US 20080095915 (os conteúdos da mesma está incorporado a título de referência) para produzir pKR1327 (SEQ ID NO:247). O fragmento Pstl de pKR1327 (SEQ ID NO:247), que contém DH —DGAT?2, foiclonado no sítio Sbfl de pKR325 (SEQ ID NO:248), previamente descrito no Pedido de Publicação PCT Nº WO 2006/012325 (os conteúdos da mesma está incorporado ao presente documento a título de referência) para produzir pKR1328 (SEQ ID NO:249).

, Expressão de TD DGAT2a, TD DGAT2b e DH DGAT2 em embriões somáticos de soja ] A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv.

Jack) foi transformada em pKR1324 (SEQ ID NO:238), que tem número de experimento MSE2268; com pKR1325 (SEQ ID NO:242), que tem número de experimento MSE2269 e com pKR1328 (SEQ ID NO:249), que tem número de experimento MSE2270. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi transformado sozinho de forma similar em um controle e tem número de experimento MSE2267. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos maturados em SHaM conforme descrito no Exemplo 5. Os perfis de ácido graxo e concentrações de óleo foram determinados conforme descrito no Exemplo 5 para MSE2267, MSE2268, MSE 2269 e MSE2270 e os resultados para cada experimento são mostrados na Tabela 50, na Tabela 51,na Tabela 52 e na Tabela 53, respectivamente.

TABELA 50 PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2267 MSE2267 (YL DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem | de Óleo 2267-13 14,4 72 33,1 36,8 8,6 10,6 | 2267-16 12,9 7,5 34,9 35,9 8,9 10,2 2267-21 139 8,2 33,5 35,3 9,1 96 2267-26 123 8,9 33,2 36,8 8,8 9,6 2267-8 15,9 8,3 25,6 37,4 12,7 9,0 226718 145 77 31,1 36,1 10,6 84 2267-19 154 7,5 24,4 40,5 12,2 8,2 2267-5 15,5 7A 24,5 40,8 11,7 81 2267-30 14,3 6,4 27,3 39,2 12,8 8,0 22674 15,4 6,4 22,0 43,4 12,8 78 2267-9 16,7 8,0 25,8 36,2 13,3 77

- Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo

2267-31 15,8 8,6 27,6 36,3 11,7 77

Á 2267-20 15,2 7,2 27,1 38,1 12,4 7,6 2267-24 167 78 23,9 40,7 10,9 7,5 2267-15 166 7,6 22,2 41,8 11,8 TA 22673 15,8 8,1 29,3 36,2 10,6 74 2267-29 148 9,0 28,8 35,5 11,9 73 2267-25 163 8,9 261 36,2 12,5 71 2267-10 15,8 8,3 25,8 36,9 13,2 7,0 2267-14 17,2 6,6 17,9 44,2 14,1 6,9 2267-17 16,9 71 221 41,3 12,6 6,9 2267-23 17,3 5,8 184 41,7 16,7 6,6 2267-22 168 7,9 24,2 38,3 12,8 6,5 2267-11 15,3 5,0 20,6 47,8 11,3 6,5 2267-28 17,2 7,2 21,6 39,6 14,4 6,3 2267-7 15,0 7,9 27,2 37,5 12,4 5,8 226712 181 5,9 19,0 42,1 15,0 5,7 2267-6 16,5 5,9 19,7 40,2 17,7 5,4 2267-27 160 6,7 18,8 40,8 17,6 5,0 2267-2 18,3 76 23,3 35,6 15,3 4,6 2267-1 18,6 5,7 17,7 41,4 16,6 4,6 Média 15,9 74 25,1 39,1 12,7 7,3

TABELA 51 PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2268 MSE2268 (TD DGAT2a) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo

22681 15,3 6,0 23,2 44,2 11,3 9,6 2268-30 16,7 5,2 19,5 45,5 13,0 9,3 2268-23 15,2 7A 23,9 42,3 11,3 9,0 22684 15,3 5,4 22,8 43,6 12,8 8,8 2268-13 15,2 6,8 25,1 41,4 11,5 8,8 2268-21 160 7,0 22,6 41,5 12,9 8,3 2268-26 15,8 7,2 22,4 41,6 13,1 77 2268-27 16,5 5,0 184 45,9 14,3 TA

. Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo 2268-6 15,7 7,5 24,0 40,4 12,4 74 Í 2268-16 16,6 6,5 22,6 40,3 14,0 74 2268-8 16,4 6,6 22,2 42,5 12,2 7,0 2268-2 16,6 5,0 16,8 45,3 16,2 6,6 2268-18 16,0 5,4 20,0 43,7 14,8 6,5 2268-14 16,5 5,8 19,5 42,4 15,8 6,5 2268-12 166 6,5 21,4 411 14,5 6,4 2268-10 16,5 6,8 22,6 40,2 13,9 6,3 2268-19 17,3 67 22,7 40,3 13,0 6,2 2268-20 16,8 7,5 20,8 41,9 13,0 6,2 2268-28 16,5 6,5 186 44,7 13,6 61 2268-11 157 5,8 21,0 41,2 16,3 5,6 2268-7 16,2 6,7 22,5 39,9 14,7 5,6 2268-22 158 71 25,0 37,4 14,6 5,5 2268-3 17,2 6,8 20,4 41,2 14,3 5,5 2268-29 15,8 7,0 24,2 38,6 14,4 5,4 2268-15 166 6,6 23,1 39,5 14,2 5,3 2268-5 171 6,6 20,1 41,8 14,4 5,2 2268-17 16,6 5,0 18,2 42,6 17,6 5,0 2268-25 17,7 5,7 17,5 411 18,0 4,6 2268-24 186 54 17,7 411 17,3 4,4 2268-31 180 5,9 21,0 37,6 17,6 3,6 2268-9 18,7 5,6 17,2 40,2 18,3 35 Média 16,5 6,3 21,2 414,7 14,4 6,5 TABELA 52 | PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2269 | MSE2269 (TD DGAT2b) | Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo 2269-20 15,25 5,2 20,0 48,5 111 10,8 2269-15 15,0 6,0 211 45,1 12,7 9,6 22694 14,4 5,4 21,9 46,5 11,8 96 2269-17 158 5,3 21,9 45,7 11,3 9,5 2269-14 16,2 5,8 20,1 44,7 13,3 8,5 2269-27 163 5,6 20,1 45,6 12,4 8,3

- Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo : 22696 16,4 47 18,0 46,4 14,5 8,1

2269-24 16,2 5,9 21,8 43,0 131 8,0 2269-16 166 6,5 18,9 43,9 14,2 7,8

2269-11 15,7 77 25,0 39,5 121 7,8

2269-13 15,9 6,1 23,3 41,6 131 7,6

2269-19 16,2 5,9 21,4 43,0 136 7A

2269-7 É — 161 5,3 20,2 436 14,8 7,3

| 2269-1 164 71 24,7 39,1 12,8 7,2

| 2269-26 167 5,0 19,6 43,5 15,1 7,0 2269-10 17,0 5,3 17,7 43,9 16,1 6,6 2269-21 163 7,0 23,6 38,3 14,8 6,6 2269-18 167 5,7 19,7 42,8 15,1 6,5 2269-3 17,0 5,4 19,6 41,4 16,7 6,1 2269-5 17,6 5,0 17,9 43,4 16,1 6,0 2269-28 17,3 6,6 17,6 43,2 15,3 5,6 2269-8 16,7 4,8 18,3 43,5 16,7 5,4 2269-25 164 4,9 16,9 45,1 16,6 5,1 2269-23 17,9 5,6 18,1 41,5 17,0 5,1 2269-9 16,6 5,4 17,9 42,4 17,6 4,9 2269-31 17,0 5,6 16,4 43,5 17,6 4,8 2269-2 18,0 4,3 14,6 42,3 20,8 3,5 2269-22 188 5,4 15,6 40,9 19,3 3,5 2269-12 181 5,4 15,4 42,3 18,8 3,3 2269-30 191 4,8 15,0 411 20,0 3,1 2269-29 19,2 4,9 14,3 42,9 18,7 2,9 Média 16,7 5,6 19,2 43,2 15,3 6,6

TABELA 53 PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2270 MSE2270 (DH DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo

2270-22. 157 4,8 20,7 471 11,7 10,6 2270-20 15,5 4,9 20,4 46,3 12,9 9,5 2270-8 16,7 5,2 20,5 44,6 13,0 8,9 | 2270-29 171 5,6 19,6 41,8 15,9 81

. Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo . 2270-30 15,9 6,2 23,5 41,8 12,6 7,9 2270-21 16,9 5,5 19,8 41,8 16,0 7,2 | 2270-2 — 17,0 5,6 20,6 42,2 14,6 71 2270-20 16,7 5,7 21,4 42,1 14,1 71 2270-2 16,9 5,9 19,2 42,9 151 6,7 22704 16,8 6,9 20,5 40,6 15,2 6,6 2270-27 160 6,2 21,5 42,1 14,2 6,3 2270-26 164 5,6 20,4 42,0 15,7 6,2 2270-9 16,3 4,7 17,7 44,7 16,5 6,2 2270-28 171 4,8 17,7 44,2 16,2 6,0 2270-21 186 5,8 16,9 41,3 17,4 5,6 2270-26 187 5,3 18,2 39,5 18,2 5,3 2270-22 17,4 6,2 186 39,2 18,5 51 2270-23 195 4,7 17,0 42,3 16,5 4,9 2270-24 194 5,0 15,2 42,1 18,3 4,8 2270-28 16,2 5,2 20,1 45,1 13,4 4,6 2270-25 16,0 8,0 20,6 39,1 16,1 4,6 2270-31 180 5,0 16,7 41,5 18,8 4,5 2270-25. 171 5,4 18,7 40,9 17,9 4,2 2270-24 13,9 5,2 16,3 45,7 18,9 41 2270-5 18,0 6,2 20,6 38,2 16,6 4,0 2270-233 19,6 4,5 15,0 40,6 20,3 4,0 2270-27 17,8 5,1 16,7 41,9 18,4 3,8 2270-6 171 5,7 16,8 41,5 18,9 3,5 2270-3 18,5 5,3 17,0 40,7 18,6 3,5 2270-7 17,3 4,3 14,4 40,9 23,2 3,2 2270-29 187 41 12,4 40,4 24,3 2,5 Média 17,2 5,4 18,5 42,1 16,7 5,7 TD DGAT2a, TD DGAT2b e DH DGAT2 aumentam as concentrações de óleo em embriões somáticos a quantidades similares a YL DGAT2. Porém, em contraste ao que foi visto para YL DGAT?2 (isto é, | concentrações de ácido oleico crescente, concentrações de ácido alfa- —linolênico e ácido palmítico decrescentes) os efeitos em perfis de ácido graxo não são tão fortes para TD DGAT2a, TD DGAT2b e DH DGAT?2.

i 227 " EXEMPLO 28 EXPRESSÃO DE DGAT2S DE YARROWIA LIPOLYITICA, MORTIERELLA ALPINA, PICHIA

Á ANOMALA E RHODOTORULA GLUTINIS EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1335, que compreende diacilglicerídeo &aciltrtansferase 2 de Mortierella alpina (Ma DGAT2); pKR1332, que compreende diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Pichia anomala (PA DGAT2); e pKR1333, que compreende diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Rhodorurola glutinis (RG DGAT2) e a expressão em embriões somáticos. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16) que compreende Yarrowia DGAT2, também foi expresso para comparação. Construção de pKR1335, que compreende MA DGAT2 O MA DGAT?2 foi amplificado a partir de pMDGAT2-17 (SEQ ID NO:250), que está descrito na Patente U.S. 7.198.937-CRD MalpinaDGAT2 emitida (o conteúdo da mesma está incorporado a título de referência) com | oligonucleotídeos primers oMaDG2-3 (SEQ ID NO:251 ) e oMaDG2- (SEQ ID NO:252), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'TY (Cat. Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1330 (SEQ ID NO:253). A sequência de aminoácido correspondente e de nucleotídeo de MA DGAT2 de PpKR1330 está apresentada na SEQ ID NO:254 e SEQ ID NO:255. O fragmento Not! de pKR1330 (SEQ ID NO:253), que contém MA DGAT?2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR1335 (SEQ ID NO:256). Construção de pKR1332, que compreende PA DGAT2 O PA DGAT2 (SEQ ID NO:146) foi amplificado a partir de um

. clone de DNA de cosmídeo Piíchia anomala descrito no Exemplo 19 com oligonucleotídeos primers oTdDG2-1 (PA) (SEQ ID NO:257) e oTdDG2-2(PA) Ê (SEQ ID NO:258), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat.

Nº F553S, Finnzymes, Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Blunt? (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1319 (SEQ ID NO:259). A sequência de aminoácido correspondente e de nucleotídeo de PA DGAT?2 a partir de pKR1319 está apresentada na SEQ ID NO:146 e SEQ ID NO:147 O fragmento Notl de pKR1319 (SEQ ID NO:259), que contém PA DGAT?2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR 1332 (SEQ ID NO:260). Construção de pKR 1333, que compreende RG DGAT2 Devido ao fato de que a sequência genômica de RG DGAT2 (SEQ ID NO:204; Exemplo 23) parecia conter inúmeros íntrons quando comparada as outras DGATs através de análise por BlastX, a sequência de codificação de RG DGAT?2 foi clonada através de PCR a partir do CDNA e o isolamento de RNA e a síntese de cDNA estão descritos abaixo. | Os oligonucleotídeos primers RgCDNA-5 (SEQ ID NO:261 ) e | 20 —RgCDNA-3 (SEQ ID NO:262), que foram projetados com base na sequência genômica de DNA do Gene RG DGAT2 (SEQ ID NO:204; Exemplo 23). Através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat.

Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante, a | transcrição de RG DGAT? foi amplificada a partir de CDNA de Rhodotorula —glutinis que foi gerado conforme descrito no Exemplo 23. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Blunt? (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pHD28 (SEQ ID NO:263). As sequências de | t aminoácido correspondente e nucleotideo de cDNA RG DGAT2 são apresentadas na SEQ ID NO:264 e SEQ ID NO:265, respectivamente.

A busca Í BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida.

Com base em um alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido da transcrição de RG DGAT2 compartilha 62,4 % de identidade de sequência com um produto de proteina hipotética de Ustilago maydis 521 com número de acessão GENBANK XP 760084 que representa a proteína com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

Esta proteína foi anotada como tendo similaridade com a aciltransferase envolvida na biosíntese de fosfolipídeo e outras proteínas de função desconhecida.

O fragmento Notl de pHD28 (SEQ ID NO:263), que contém RG DGAT?2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR 1333 (SEQ ID NO:266). Expressão de Ma DGAT2, PA DGAT2 e RG DGAT2 em embriões —somáticos de soja A cultura de suspensão embriogênica de soja (cf.

Jack) foi transformada em pKR1335 (SEQ ID NO:256), que tem número de experimento MSE2296; com pKR1332 (SEQ ID NO:260), que tem número de experimento MSE2297 e com pKR1333 (SEQ ID NO:266), que tem número de experimento MSE2298. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi transformado sozinho de forma similar em um controle e tem número de experimento MSE2295. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos maturados em SHaM conforme descrito no Exemplo 5. Os perfis de ácido graxo e concentrações de óleo foram determinados conforme descrito no Exemplo 5 para MSE2295, MSE2296, MSE 2297 e MSE2298 e os resultados para cada experimento são mostrados na Tabela 54, na Tabela 55, na Tabela 56 e na Tabela 57, respectivamente.

À mu

. TABELA 54 PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2295 Í MSE2295 (YL DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo

2295-7/ — 123 5,5 37,0 38,1 71 134

2295-26 11,9 5,7 42,1 33,6 67 12,8

| 22954 140 51 29,0 41,5 10,4 11,4

| 2295-15 13,0 65 34,0 37,3 9,1 10,0

2295-2 — 139 6,2 32,6 37,6 9,7 9,7

| 2295-14 141 51 28,5 40,6 11,7 8,8

| 2295-10 15,9 61 27,8 39,1 11,2 EX

| 2295-8 — 139 5,9 32,4 37,7 10,2 8,2

2295-585 17,1 5,7 21,3 42,8 13,1 8,0

| 22951 — 166 4,4 17,3 47,9 138 7,9 | 2295-18 14,3 5,5 34,0 35,5 10,8 7,6 | 2295-24 15,55 4,8 23,6 42,7 13,4 7,2 2295-23 17,0 4,9 17,4 44,9 16,0 6,6 | 2295-17 15,6 6,8 30,5 35,4 19,7 6,6 ! 2295-20 141 5,6 27,6 39,2 13,5 6,5 | 2295-25 16,3 5,2 20,4 41,9 16,0 63 2295-13 147 5,6 23,5 40,9 15,3 63 2295-16 16,9 7,2 24,4 38,4 13,1 6,2 2295-6 184 61 20,9 40,0 14,6 61 2295-21 181 5,2 15,1 45,5 16,1 5,9 2295-22 164 5,1 21,2 414,7 15,6 5,9 2295-3 17,9 5,5 21,3 40,3 14,9 5,8 2295-19 14,2 5,0 19,9 45,1 15,9 5,6 2295-9 16,3 4,5 23,4 40,9 14,9 5,2 2295-11 166 61 22,4 39,1 15,8 4,5 2295-12 18,3 EX) 16,3 41,7 18,7 43 Média 15,5 5,6 25,5 40,4 13,0 7,5

. TABELA 55 | PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2296 MSE2296 (MA DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo | 2296-26 134 5,3 31,5 41,8 80 13,4 | 2296-14 134 5,9 32,6 38,9 9.2 11,6 | 2296-23 139 60 32,5 39,5 81 11,0 2206-4 155 5,4 25,4 43,1 10,6 10,9 | 2296-17 1544 52 18,9 49,1 14 10,8 22906-6 — 145 67 31,9 37,5 9,3 10,3

2206-24 143 61 29,6 40,5 9,5 10,1

2296-16 146 5,8 30,0 39,3 10,3 10,0

2296-19 15,5 63 25,6 40,5 12,0 9,4

2206-12 151 60 28,6 39,8 10,6 86

2296-22 164 44 17,1 47,9 14,3 85

2296-20 — 14,9 66 27,2 39,9 11,5 83

2296-13 164 55 20,2 44,6 13,3 82

2296-11 160 6,0 22,8 42,0 13,2 8.2

2206-3 — 15,2 5,6 22,8 44,4 12,0 82

22061 — 162 47 20,5 45,6 13,2 78

2296-18 14,9 51 28,2 39,4 12,3 75

2206-9 — 15,9 7.8 211 42,5 12,6 7A

2296-15 17,1 51 18,8 44,3 14,7 7A

2296-10 165 67 25,0 39,7 12,2 78

2296-5142 67 291 38,3 u7 72

2296-25 —16,5 61 22,1 41,4 13,8 7.0

2296-21 16,4 5,8 23,6 41,2 12,9 6,4

2296-8 — 168 71 21,7 41,5 12,9 63

2296-27 — 16,5 46 17,85 441 17,4 5,8

2296-7 — 17,6 5,9 21,6 381 16,8 49

22962 — 14,3 54 19,4 413 19,6 3,5

Média — 15,5 5,9 24,6 41,7 12,3 84

. TABELA 56 PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE MSE2297 | MSE2297 (PA DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo 2297-23 17,0 5,8 221 42,1 12,9 7,2 2297-10 16,5 6,3 21,6 42,2 13,3 72 2297-21 16,58 5,1 17,1 46,9 14,4 7,0 2297-1 16,4 6,7 22,9 40,8 13,2 67 2297-15 17,2 5,4 18,8 44,5 14,0 6,4 2297-22 19,6 5,0 13,5 37,8 24,1 6,2 2297-18 17,3 6,9 21,9 40,3 13,6 6,0 2297-17 16,2 6,6 23,7 39,7 13,7 5,9 2297-5 16,8 5,5 18,6 43,7 15,4 5,9 2297-3 17,4 4,8 18,9 42,3 16,6 5,7 2297-6 17,0 6,1 18,8 41,9 16,2 5,6 2297-13 171 6,0 22,5 39,0 15,3 5,5 2297-16 16,9 5,8 21,0 42,3 14,0 5,5 2297-11 17,1 5,2 211 41,2 15,4 5,4 2297-20 17,0 5,9 21,9 39,5 15,6 5,4 2297-25 158 4,6 22,0 41,1 16,5 5,3 2297-24 17,0 5,6 21,7 42,5 13,1 5,2 2297-9 17,3 5,3 17,9 41,3 18,2 5,1 2297-14 16,7 5,4 19,6 42,6 15,7 5,1 2297-7 17,0 5,0 20,7 42,0 15,3 4,8 2297-4 15,9 5,1 19,7 40,8 18,6 4,6 2297-12 18,7 5,3 18,7 40,3 17,0 4,5 2297-26 18,5 4,8 16,8 41,1 18,7 4,3 2297-8 17,5 5,2 18,6 39,5 19,2 4,2 2297-19 18,0 5,0 18,0 40,6 184 4,2 2297-2 18,5 5,9 18,3 38,2 19,0 3,5 Média 17,2 5,6 19,9 41,3 16,1 5,5

| 233 | . TABELA 57

OS PERFIS DE ÁCIDO GRAXO E CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO PARA EVENTOS DE i MSE2298 MSE2298 (RG DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de Óleo 2298-8 14,7 5,0 22,6 44,4 13,2 9,4 2298-16 17,1 5,4 26,2 41,1 10,3 9,4 2298-11 16,5 4,8 21,0 45,0 12,7 9,2 2298-21 15,8 5,4 25,0 41,5 12,3 8,5 2298-24 16,4 4,8 20,9 44,1 13,7 8,2 2298-5 16,4 6,0 26,9 39,5 11,2 8,2 2298-4 18,3 6,5 24,2 38,8 12,2 7,9 2298-22 16,5 5,6 23,2 41,5 13,1 7,6 2298-2 16,6 5,8 27,1 39,2 11,4 7A 2298-14 17,2 5,9 28,0 36,3 12,6 74 2298-18 16,8 6,0 24,4 39,8 13,0 73 2298-19 17,2 6,3 30,0 35,3 11,2 72 2298-23 17,0 6,7 25,8 38,3 12,2 6,8 2298-10 15,2 4,5 224 41,6 16,4 6,7 2298-3 16,9 6,5 23,3 38,9 14,3 6,3 2298-6 17,2 6,0 24,3 38,4 14,0 6,0 2298-7 16,3 5,1 21,9 40,4 16,3 6,0 2298-17 16,5 5,3 17,5 41,7 19,0 5,9 2298-20 16,6 5,9 23,2 39,5 14,8 5,5 2298-9 17,1 5,2 19,5 41,7 16,5 5,5 2298-12 17,8 5,1 20,4 39,2 17,5 5,2 2298-13 15,7 5,1 20,4 39,8 18,9 5,1 2298-1 17,6 4,8 19,0 41,6 17,0 4,9 2298-15 16,7 6,1 23,3 38,2 15,7 4,4 Média 16,7 5,6 23,4 40,3 14,1 6,9 O MA DGAT?2 aumenta a concentração de ácido oleico e óleo

Á 234 '" em embriões somáticos a quantidades similares ao YL DGAT?2. MA DGAT?2 também é similar ao YL. DGAT2 no qual as concentrações de ácido alfa-linolênico e ácido palmítico são diminuídas. O RG DGAT2 tem alguma capacidade de aumentar concentrações de ácido oleico e óleo em embriões somáticos, mas o efeito geral é menor para MA DGAT2 ou YL DGAT2. O PA DGAT2 não aumenta a concentrações de ácido oleico ou óleo neste experimento. EXEMPLO 29 EXPRESSÃO DE DGAT2S A PARTIR DE YARROWIA LIPOLYITICA E LIPOMYCES

STARKEYI EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1337, que compreende diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Lipomyces starkeyi (LS DGAT?2) e a expressão em embriões somáticos. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT?2, também foi expresso para comparação.

Construção de PKR1337. que compreende LS DGAT2 Devido ao fato de que a sequência genômica de LS DGAT2 (SEQ ID NO:194; Exemplo 22) parecia conter inúmeros íntrons quando comparada aos outros DGATs através de análise por BlastX, a sequência de codificação de DGAT? foi clonada através de PCR a partir de cDNA. O isolamento de RNA e síntese de cDNA estão descritos abaixo.

O RNA foi isolado de Lipomyces starkeyi e o cDNA foi sintetizado conforme descrito no Exemplo 22. A análise da sequência genômica de LS DGAT2 (SEQ ID NO:194; Exemplo 22) sugeriu dois sítios de iniciação de ORF potenciais e 5' oligos foram construídos para cada um dentre estes locais de iniciação de ORF potenciais. Com base na sequência de DNA genômico (SEQ ID NO:194; Exemplo 22) e através do uso do primeiro local de iniciação potencial (ORF mais extenso), o LS

Do ma E a a! E. | 235 á DGAT? foi amplificado a partir do cDNA (2 ul) com oligonucleotídeos primers Lip5-1 (SEQ ID NO:267) e Lip3 (SEQ ID NO:268), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y" (Cat.

Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

Através do usodo segundo local de iniciação potencial (ORF levemente menor), o LS DGAT?2 foi amplificado a partir do cDNA (2 ul) com oligonucleotídeos primers Lip5-2 (SEQ ID NO:269) e Lip3 (SEQ ID NO:268) da mesma maneira.

Apenas a reação de PCR através do uso do segundo local de iniciação potencial (Lip5-2 com Lip3) forneceu um produto de PCR.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Blunt? (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pHD30 (SEQ ID NO: 270). As sequências de aminoácido correspondente e de —nucleotíideo de cDNA LS DGAT2 são apresentadas na SEQ ID NO:271 e SEQ ID NO:272, respectivamente.

A busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida.

Com base no alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácido deduzido do CDNA LS DGAT2 compartilha 51,0 % de identidade de sequência com um produto de proteina hipotética de Yarrowia lipolytica CLIB122 com número de acessão GENBANK XP 504700 que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

A sequência de aminoácido desta proteína é idêntica àquela de YL DGAT 2 descrita no WO 2005/003322 e difere em um resíduo de aminoácido daquela de SEQ ID NO:10 por razões que estão esboçadas no Exemplo 1. O fragmento Notl de pHD30 (SEQ ID NO:270), que contém LS DGAT?2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) ! para produzir pKR1337 (SEQ ID NO:273).

i 236 : Expressão de LS DGAT2 em embriões somáticos de soja A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foi transformada em pKR1337 (SEQ ID NO:273), que tem número de experimento MSE2333. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi transformado sozinho de forma similar em um controle e tem número de experimento MSE2334. EXEMPLO 30 EXPRESSÃO DE DGAT1S A PARTIR DE YARROWIA LIPOLYTICA E MORTIERELLA

ALPINA EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1334, que compreende diacilglicerídeo aciltransferase 1 de Mortierella (Ma DGAT1I) e vetor de controle pKR1323, que compreende códon de Yarrowia DGAT1 otimizado para expressão em soja. Construção de pKR1334, que compreende MA DGAT1 O MA DGAT!1 foi amplificado a partir de pMDGAT1-17 (SEQ ID NO:274), que está descrito na Patente U.S. 7.273.746 emitida (o conteúdo da mesma está incorporado a título de referência) com oligonucleotídeos primers oMaDG1-1 (SEQ ID NO:275) e oMaDG1-2 (SEQ ID NO:276), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat. Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR- Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Blunt? (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1329 (SEQ ID NO:277). As sequências de aminoácido correspondente e de nucleotíideo MA DGAT1 são apresentadas na SEQ ID NO:278 e SEQ ID NO:279, respectivamente. ! | |

: O fragmento Notl de pKR1329 (SEQ ID NO:277), que contém MA DGATI1, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR1334 (SEQ ID NO:280). Construção de pKR1323, que compreende códon de YL —DGAT1otimizado para soja O YL DGAT1 foi otimizado por códon para expressão em soja conforme descrito no Exemplo 9 e no Exemplo 17 e a sequência de nucleotídeo de códon otimizado está apresentada na SEQ ID NO:64. À sequência de aminoácido correspondente codificada pelo códon otimizado YL DGAT1 é idêntica à sequência de aminoácido YL DGAT1 de tipo selvagem (SEQ ID NO:65). A sequência de códon otimizado continha dois ORF internos de 1023 bp e 687 bp no comprimento na direção oposta que a sequência de codificação estava e estes não estavam presentes na sequência YL DGAT1 de tipo selvagem.

A fim de remover os ORFs internos, as seguintes etapas de clonagem foram executadas.

A fim de adicionar sítios de restrição apropriados, o fragmento Notl de KS392 (SEQ ID NO:101, Exemplo 17), que contém o códon otimizado YL DGAT1, foi clonado no vetor pBluescript Il SK(+) do sítio Notl (Stratagene), para produzir pKR1314 (SEQ ID NO:281). A fim de remover o ORF de 687 bp interno, a 5' terminação de YL DGAT1 foi amplificada a partir de KS392 (SEQ ID NO:101 ) com oligonucleotídeos primers oYIDG1co-1 (SEQ ID NO:282) e oYIDG1co-2 (SEQ ID NO:283), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat.

Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

A 5' terminação de YL DGAT1 também foi amplificada a partir de KS392 (SEQ ID NO:101) com oligonucleotídeos primers oYIDG1co-3 (SEQ ID NO:284), que é complementar ao oYLDG1co-2 (SEQ ID NO:283) e oYIDG1 co4 (SEQ ID NO:285), que remove o ORF de 1023 bp interno, através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'” (Cat Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O YL DGAT1 foi então amplificado a partir dos produtos de PCR combinados de duas reações de PCR descritas acima com oligonucleotídeos primers oYIDGIco-1 (SEQ ID NO:282) e oYIDG1co4 (SEQ ID NO:284), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'" (Cat. Nº F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1310 (SEQ ID NO:286).

O fragmento BgllVEcoRV de pKR1314 (SEQ ID NO:281) que contém a 3'terminação remanescente do gene YL-DGAT1 foi clonado no fragmento Bgll/EcoRV de pKR1310 (SEQ ID NO:286) para produzir PKR1316 (SEQ ID NO:287), que contém um códon otimizado de comprimento completo YL DGAT1 com todos os ORFs internos removidos. A sequência de nucleotídeo para o códon otimizado YL DGAT1 que têm os ORFs internos removidos, denominada YL DGAT1cod2, está apresentada na SEQ ID NO:288. A sequência de aminoácido de YL DGAT1cod2 é idêntica a YL DGAT1 de tipo selvagem (SEQ ID NO:65).

O fragmento Notl de pKR1316 (SEQ ID NO:287), que contém YL DGATicod2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR 1323 (SEQ ID NO:289).

Expressão de YL DGAT1cod2 e Ma DGAT1 em embriões somáticos de soja A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foi transformada em pKR1334 (SEQ ID NO:280), que tem número de experimento MSE2332. O vetor de controle pKR1323 (SEQ ID NO:289), que compreende YL DGAT1cod2, também, foi transformado de forma

| 239 similar e tem número de experimento MSE2331. EXEMPLO 31 EXPRESSÃO DE DGAT2S A PARTIR DE YARROWIA LIPOLYITICA E PHAFFIA

RHODOZYMA EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1372, que compreende diacilglicerídeo aciltransferase 2 de Phaffia rhodozyma (PR | DGAT2) e a expressão em embriões somáticos. O vetor de controle PKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi expresso para comparação. . 10 Construção de pKR1372, que compreende PR DGAT2 Com base na sequência de cDNA de PR DGAT2 RACE (SEQ ID NO:214; Exemplo 24) PR DGAT?2 foi amplificado a partir do CDNA (2 uL) com oligonucleotídeos primers PrDGAT2-5 (SEQ ID NO:290) e PIDGAT2-3 (SEQ ID NO:291), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion'Y (Cat. Nº F553S, Finnzymes, Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pHD37 (SEQ ID NO:292). A inserção de pHD37 que compreende o gene DGAT?2 foi completamente sequenciada. A sequência de DNA resultante está relacionada ao PR DGAT2. Suas sequências de nucleotídeo estão apresentadas como SEQ ID NO:293. Existem oito diferenças no nível de nucleotídeo entre as sequências de nucleotideo PR DGAT2 RACE (SEQ ID NO:214) e PR DGAT2 (SEQ ID NO:293), no entanto, ambas as sequências de aminoácido que podem ser deduzidas de ambas as sequências são idênticas. A sequência de aminoácido de PR DGAT?2 está apresentada como (SEQ ID NO:215). O fragmento Notl de pHD37 (SEQ ID NO:292), que contém PR DGAT?2, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) para produzir pKR1372 (SEQ ID NO:294).

| 240 Expressão de PR DGAT2 em embriões somáticos de soja A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foi transformada em pKR1372 (SEQ ID NO:294), que tem número de experimento MSE2351. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO:98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2, também foi transformado sozinho de forma | similar em um controle e tem número de experimento MSE2349. | EXEMPLO 32 | EXPRESSÃO DE DGAT1S A PARTIR DE YARROWIA LIPOLVTICA E LIPOMYCES |

STARKEYI EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a construção de pKR1375, que compreende aciltransferase 1 de Lipomyces diacilglicerídeo (LS DGAT1) e a expressão em embriões somáticos. O vetor de controle pKR1323 (SEQ ID NO:289) descrito no Exemplo 30, que compreende YL DGAT1cod2, também foi expresso para comparação. Construção de pKR1375, que compreende LS DGAT1 Devido ao fato de que a sequência genômica de LS DGAT1 (SEQ ID NO:189; Exemplo 22) parecia conter inúmeros íntrons quando comparada aos outros DGATs através de análise por BlastX, a sequência de codificação LS DGAT1 foi clonada através de PCR a partir do CDNA. À síntese de cDNA está descrita no Exemplo 22. Com base na sequência genômica de LS DGAT1 (SEQ ID NO:189). LS DGAT1I foi amplifitcado a partir de cDNA com oligonucleotídeos primers oLsDGAT1-5-1 (SEQ ID NO:295) e oLsDGAT1-3 (SEQ ID NO:296), através do uso da Polimerase de DNA de Alta Fidelidade —Phusion'Y (Cat. Nº F553S, Finnzymes, Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O isolamento de RNA e a síntese de cDNA a partir de Lipomyces starkeyi estão descritos no Exemplo 22. O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº através do uso kit

Í 241 de clonagem de PCR Zero Bluntº (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pHD38 (SEQ ID NO:297). As sequências de aminoácido correspondente e de nucleotídeo da transcrição DGAT1 de Lipomyces starkeyi são apresentadas na SEQ ID NO:298 e SEQ ID NO:299, respectivamente. A busca BASTP do banco de dados de proteína fúngica anotada em NCBI foi conduzida. A sequência de aminoácido deduzido da transcrição DGAT1 de Lipomyces starkeyi compartilha 52,4 % de identidade de sequência com um produto de proteína hipotética de Coccidioides immitis com número de acessão GENBANK XP 001247089 que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados. A proteína foi anotada como membro da família MBOAT (O-acil transferase ligada a membrana) de proteínas de membrana que contém uma variedade de enzimas de aciltransferase. O fragmento Notl de pHD38 (SEQ ID NO:297), que contém LS DGATI, foi clonado no sítio Notl de pKR72 (SEQ ID NO:26; Exemplo 4) | para produzir pKR1375 (SEQ ID NO:300). | Expressão de YL DGAT1Icod2 e LS DGAT1 em embriões | somáticos de soja A cultura de suspensão embriogênica de soja (cv. Jack) foi transformada em pKR1375 (SEQ ID NO:300), que tem número de experimento MSE2352. O vetor de controle pKR1323 (SEQ ID NO:289), que compreende YL DGAT1cod2, também foi transformado de forma similar e tem número de experimento MSE2350. EXEMPLO 33 AS SEQUÊNCIAS DO GENE DGAT1 A PARTIR DE MORTIERELLA ALPINA E LIPOMYCES

STARKEYI QUE SÃO OTIMIZADAS PARA EXPRESSÃO EM SOJA As sequências de nucleotídeos que codificam MA DGAT1 (SEQ ID NO:278) e LS DGAT1 (SEQ ID NO:298) foram re-projetadas para expressão otimizada em sementes de soja através do uso de métodos similares àquele descrito em Wu, G et al.

Nucleic Acids Research (2007), 35: D76 a D79; Villalobos, A. et al.

BMC Bioinformatics (2006), 7 As páginas não foram informadas; Wu, G. et al.

Protein Expression and — Purification (2006), 47: 441 a 445; Richardson, S.

M. et al.

Genome Research (2006), 16: 550 a 556; Jayaraj, S. et al.

Nucleic Acids Research (2005) 33: 3011 a 3016. As moléculas de DNA foram sintetizadas através de Codon Devices (MA, EUA). As sequências de DNA de expressão otimizadas de MA DGAT1 e LS DGAT1 são apresentadas na SEQ ID NO:301 e SEQ ID NO:302, respectivamente.

As sequências de aminoácido de proteínas encodificas por estas sequências de DNA são apresentadas como SEQ ID NO:279 e SEQ ID NO:299. EXEMPLO 34

AS SEQUÊNCIAS DE GENE DGAT2 DE EXPRESSÃO OTIMIZADA QUE ENCODIFICAM

VARIANTES DA PROTEÍNA DGAT2 As sequências de nulceotídeo que encodificam proteínas DGAT? a partir de Torulaspora delbrueckii, Pichia anomala, Debaryomyces hansenii, Candida zeylanoides, Lipomyces starkeyi, Mucor circinelloides, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula glutinis e Mortierella alpina descritas no presente documento (vide Exemplos anteriores 18 a 32) foram re- projetadas para expressão otimizada em sementes de soja através do uso de métodos similares àqueles descritos em Wu, G et al.

Nucleic Acids Research (2007), 35: D76 a D79; Villalobos, A. et al.

BMC Bioinformatics (2006), 7 As páginas não foram informadas; Wu, G. et al.

Protein Expression and Purification (2006), 47: 441 a 445; Richardson, S.

M. et al.

Genome Research (2006), 16: 550 a 556; Jayaraj, S. et al.

Nucleic Acids Research (2005) 33: 3011 a 3016. As moléculas de DNA foram sintetizadas através de Codon Devices (MA, EUA). As sequências de DNA de i 243 | expressão otimizadas e as proteinas DGAT2 encodificadas pelas ditas sequências de DNA e relacionadas às SEQ ID NO são mostradas na Tabela 58. Todos os variantes de DGAT2 contêm o motivo FxxPXFR que foi alterado do FxxPxYR presente nas proteínas DGAT2 nativas.

TABELA 58 |1onGaTaBcos — fais ds ExeMPLO 35 Co-ExPRESSÃO DE YL DGAT1 com UM DESENVOLVIMENTO DE REGULAÇÃO DECRESCENTE DE FAD2/TE2 EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O exemplo presente descreve um desenvolvimento de vetores de expressão de soja pKR1274, que compreende Yarrowia DGAT1 (YL DGAT1) e tanto pKR1267 quanto pKR1269, que compreende um desenvolvimento de regulação decrescente de tioesterase (GM TE2)/desaturase 2 de ácido graxo de soja (GM FAD2). Apesar de a região de regulação decrescente GM FAD2-TE2 de pKR1267 e pKR1269 serem idênticas em cada desenvolvimento e ambas serem ativadas pelo promotor KTi3, o pKR1267 contém apenas o terminador KTi3 e pKR1269 contém tanto os terminadores de albumina de soja quanto os KTi3.

i 244 Desenvolvimento de PKR1274 que compreende YL DGAT1 Um plasmídeo inicial pKR85 (SEQ ID NO: 27), que foi descrito anteriormente no Exemplo 4, contém o gene de fosfotransferase B higromicina (HPT) (Gritz, L. e Davies, J., Gene 25:179 a 188 (1983)), flanqueado pelo promotor T7 e terminador de transcrição (T7prom/hpt/T7term cassete), e uma origem de bactéria de réplica (ori) para a seleção e réplica na bactéria (por exemplo, E. coli). Além disso, o pKR72 contém, ainda, o gene de fosfotransferase B higromicina flanqueado pelo promotor 35S (Odell et a/., Nature 313:810-812 (1985)) e NOS 3' Transcription Terminator (Depicker et a/., J. Mol. Appl. Genet. 1 :561 a 570 (1982)) (35S/hpt/NOS3' cassete) para a seleção em plantas como soja. O plasmídeo pKR85 (SEQ ID NO: 27) contém, ainda, um sítio de restrição Notl flanqueado pelo promotor para a subunidade a' de B- conglicinina (Beachy et a/., EMBO J. 4:3.047-3.053 (1985)) e a região de terminador de transcrição 3' do gene de faseolina (Doyle et a/l., J. Biol. Chem. 261 :9.228-

9.238 (1986)), chamado de cassete Bcon/Notl/Phas3".

O cassete Bcon/Notl/Phas3' foi removido a partir de pKR85 (SEQ ID NO: 27) por digestão com Hindlll e o fragmento resultante foi re-ligado para produzir pKR278 (SEQ ID NO: 323).

O fragmento BsiWI de pKR1235 (SEQ ID NO: 74, Exemplo 14), que contém o YL DGAT1, foi clonado dentro do sítio BsiWI de pKR278 (SEQ ID NO: 323), que descrito anteriormente na Publicação de Patente U.S. 20080095915 (cujo conteúdo é incorporado a título de referência), para produzir pKR1274 (SEQ ID NO:324).

Desenvolvimento de pKR1267 que compreende cassete de regulação decrescente GM FAD2-TE2 A terminação 5' de GM TE2 (SEQ ID NO: 325) foi ampliada a partir de pTC4 (SEQ ID NO: 326), que foi descrito anteriormente em i 245 WO1996006936A1 (cujo conteúdo é incorporado a título de referência), com primer de oligonucleotideco GmTE2 5-1 (SEQ ID NO: 327) e GmTE2 3-1 (SEQ ID NO: 328), com o uso de Phusion'" High- Fidelity DNA Polimerase (Cat. No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o — protocolo do fabricante. A terminação 3' de GM TE2 (SEQ ID NO: 325) foi ampliado a partir de pTC4 (SEQ ID NO: 326) com o primer de oligonucleotideo GmMTE2 5-2 (SEQ ID NO: 329) e GmMTE2 3-2 (SEQ ID | NO: 330), com o uso de Phusion'* High-Fidelity DNA Polimerase (Cat. | No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. Os dois fabricantes PCR resultantes foram combinados e ampliados com GmTE2 5-1 (SEQ ID NO: 327) e GNTE2 3-2 (SEQ ID NO: 330) com o uso de Phusion""M High-Fidelity DNA Polimerase (Cat. No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo do protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado em vetor de clonagem pCR-Bluntº com o uso de Zero Blunt? PCR Cloning Kit (Invittogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir pKR1258 (SEQ ID NO: 331).

A terminação 5' de GM FAD2 (SEQ ID NO: 332) foi ampliada partir de pBS43 (SEQ ID NO: 333), que foi descrito anteriormente em WO1997047731 A2 (cujo conteúdo é incorporado a título de referência), como primer de oligonucleotideo GmMFAD2-1 5-1 (SEQ ID NO: 334) e GmFAD?2-1 3-1 (SEQ ID NO: 335), usando o Phusion'"” High- Fidelity DNA Polimerase (Cat. No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. A terminação 3' de GM FAD2-1 (SEQ ID NO: 332) foi ampliada a partir de pBS43 (SEQ ID NO: 333) com o primer de —oligonucleotideo GMFAD2-1 5-2 (SEQ ID NO: 336) e GmFAD2-1 3-2 (SEQ ID NO: 337), com o uso de Phusion'" High-Fidelity DNA Polimerase (Cat. No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. Os dois produtos PCR resultantes foram combinados e i 246 ampliados com GmMFAD2-1 5-1 (SEQ ID NO: 334) e GmMFAD2-1 3-2 (SEQ ID NO: 337) com o uso de Phusion'" High-Fidelity DNA Polimerase (Cat. No. F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante. O fragmento de DNA resultante foi clonado em vetor de clonagem pCR- BluntiR) com o uso de Zero Blunt? PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para produzir PORblunt- Fad2-1 (SEQ ID NO: 338).

O fragmento Mlul de pKR1258 (SEQ ID NO: 331), que contém GM TE2, foi clonado em fragmento Mlul de POCRblunt-Fad2-1 (SEQ ID NO: 338), que contém GM FAD2-1, para produzir pKR1259 (SEQ ID NO: 339).

O fragmento EcoRI de pKR1259 (SEQ ID NO: 339), que compreende a terminação 5' do fragmento de GM FAD2/TE2, foi clonado no sítio Mfel de pKR1259 (SEQ ID NO: 339) para produzir pKR1261 (SEQ ID NO: 340). Esta construção de DNA contém uma estrutura de haripin GM FAD2-TE2-TE2/oop-TE2-FAD?2 flanqueado por sítios de Notl.

O fragmento Notl de pKR1261 (SEQ ID NO: 340), que contém GM FAD2-TE2- TE2loop-TE2-FAD2, foi clonado em sítio de Notl de PKR123R (SEQ ID NO: 341), que foi descrito anteriormente em WO2004071467A2 (cujo conteúdo é incorporado a título de referência), para produzir pKR1266 (SEQ ID NO: 342).

O fragmento BsiWI/Pstl de pKR1266 (SEQ ID NO: 342), que | contém o GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2 foi clonado em fragmento | BsiWI/Sbfl de pKR278 (SEQ ID NO: 323) para produzir pKR1267 (SEQ ID NO: 343).

Desenvolvimento de pKR1267 que compreende cassete de regulação decrescente GM FAD2-TE2 O fragmento Notl de pKR1261 (SEQ ID NO: 340), que contém GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2, foi clonado em sítio de Notl de pKR457 (SEQ ID NO: 344), que foi descrito anteriormente na Publicação PCT No.

WO 2005/047479 (cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência), para produzir pKR1264 (SEQ ID NO: 345). O fragmento Pstl! de pKR1264 (SEQ ID NO: 345), que contém oGM FAD2- TE2-TE2/oop-TE2-FAD?2 foi clonado em fragmento Sbfl de PKR277 (SEQ ID NO: 346), que foi descrito anteriormente na Publicação PCT No.

WO 2004/071467 para produzir pKR1269 (SEQ ID NO: 347). Co-expressão de Construção de regulação decrescente GM FAD2-TE2-TE2/0o0p-TE2-FAD?2 seja sozinho ou com YL DGAT2 O cultivo de suspensão de soja embriogênica (cv.

Jack) foi transformado apenas com o pKR1267 (SEQ ID NO: 343) e resultando no experimento número MSE2213 ou com o fragmento BsiWl de pKR1269 (SEQ ID NO: 347) e pKR1274 (SEQ ID NO: 324) e resultando no experimento número MSE2210. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos amadurecidos em SHaM, conforme descrito no Exemplo 5. As concentrações de óleo e perfis de ácido graxo foram determinados conforme descrito no Exemplo 4 para MSE2213 e MSE2210 e os resultados para cada experimento são mostrados na tabela 59 e tabela 60, respectivamente.

TABELA 59 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2213 MSE2213 (GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2213-16 58 2,6 72,7 10,5 8,5 16,8 2213-26 120 5,7 24,8 47,2 10,4 16,5 2213-30 1/7 5,3 18,5 53,1 1114 15,4 221323 90 3,2 52,2 24,7 11,0 15,3 2213-29 131 3,7 13,3 57,1 12,8 15,0 |

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2213-7 6,4 31 66,3 15,6 86 14,9 2213-31 11,7 3,0 26,9 46,5 11,9 14,5 2213-13 67 3,3 64,5 16,6 8,9 14,4 2213-5 3,5 3,0 78,0 75 8,1 13,8 2213-9 7,6 34 57,6 20,3 11,0 13,2 2213-20 7,8 4,1 56,7 20,8 10,6 131 2213-4 41 27 721 111 10,0 12,7 2213-17- 7,7 5,2 57,0 19,7 10,4 12,5 2213-3 TA 3,6 64,4 14,4 10,2 12,5 2213-24 12,9 73 29,4 39,0 11,4 121 2213-1 13,8 71 221 44,6 12,4 11,9 2213-6 6,7 22 57,2 22,2 111,7 11,8 2213-11 9,2 5,2 58,2 16,4 11,0 10,9 2213-2 78 43 45,3 31,0 1,7 10,6 2213-14/ 73 4,6 63,0 15,0 10,2 10,5 2213-27 85 6,0 48,9 25,0 11,6 10,1 2213-19 80 4,0 53,7 214 12,8 9,9 2213-21 1111 5,6 28,3 40,6 14,4 9,8 2213-18 7,4 4,1 57,2 17,7 13,5 9,4

221312. 64 43 63,2 15,5 10,6 9,4 2213-10 13,8 7,0 24,0 42,1 13,2 9,4 2213-288 88 41 54,1 19,1 13,8 9,1 2213-25 69 35 53,9 21,9 13,8 9,0 2213-15" 5,2 34 61,7 17,6 121 8,0 2213-8 14,4 6,6 20,0 42,9 16,1 76 2213-22 14,3 6,3 21,3 41,9 16,2 7,2 Média 8,9 4,4 47,9 27,1 11,6 11,9 TABELA 60

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2210 MSE2210 (YL DGAT1 & GM FAD2-TE2-TE2loop-TE2-FAD2)

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2210-2 38 2,7 74,7 131 5,8 221 2210-23 10,3 6,8 32,0 44,4 6,5 20,0 2210-29 7,55 5,5 63,9 17,1 6,0 20,0 2210-19 39 3,5 79,1 81 5,4 19,7 2210-100 7,3 3,8 66,6 15,6 6,7 19,6 2210-1257 3,6 67,6 17,6 5,6 19,6 2210-14 A45 2,4 67,9 17,8 74 19,3 2210-25. 51 3,5 718 13,1 6,4 18,4 2210-5 9,0 41 43,1 35,9 7,9 17,8 2210-24 13,7 4,3 20,5 52,5 9,1 17,5 2210-13 10,2 5,5 36,8 40,4 7,0 17,4 2210-11 10,9 7,8 30,6 43,2 7,5 16,6 2210-1 4,1 3,0 75,6 9,6 77 15,9 2210-6 2,7 17 83,9 5,3 6,4 15,5 2210-16 84 3,7 48,5 31,3 8,1 15,3 2210-26 71 4,9 55,2 24,7 8,1 14,4 2210-7 4,3 3,2 62,9 20,8 8,7 14,3 2210-20 68 4,3 65,2 15,7 7,9 13,8 2210-27/ 10,9 74 42,4 30,0 9,3 13,8 2210-30 50 24 65,1 171 10,4 13,7 2210-3 71 4,8 52,9 27,4 7,9 13,6 2210-4 6,0 3,7 66,0 15,9 8,5 13,3 2210-22 32 3,3 77,7 8,1 78 13,2 2210-8 9,1 4,9 49,7 27,3 9,0 131 2210-21 6,0 3,5 67,8 14,9 78 12,8 2210-18 12,7 5,2 20,2 49,7 121 12,5 2210-31 4,4 2,9 731 10,1 9,5 1,7 2210-9 4,0 3,1 74,1 9,3 9,6 11,2 2210-15' 35 24 72,5 11,0 10,6 11,1 2210-28 14,1 5,7 20,2 45,5 14,5 10,1 2217-290 120 7,5 28,0 38,8 13,8 8,7 Média 7,2 4,2 56,6 23,6 8,4 15,4 A comparação dos resultados nas tabelas 59 e 60 demonstram que a combinação de expressão YL DGAT1 com regulação decrescente de GM FAD2-1 e GM TE2 muda o perfil de ácido graxo para uma extensão | | o oo oõó j o l i o oa oo oõíõi3okiâíií iOâõõêeâr——s o Tc õoottctetcocõ«õéÕY UN Fr zâZ%p | | 250 que excede a mudança que é observada apenas quando os genes FAD2-1 e TE2 são suprimidos. EXEMPLO 36 CLONAGEM DE CDNA PARA DGAT2 PROVENIENTE DE CRYPTOCOCCUS

CURVATUS Em razão de a sequência genômica CC DGAT?2 (SEQ ID NO: 226; Exemplo 25) parecer conter diversos íntrons quando comparada a outra DGATs por análise BlastX, a sequência de codificação CC DGAT?2 foi clonada por PCR a partir de cCDNA.

O RNA foi isolado de Cryptococcus curvatus e o cDNA foi sintetizado conforme descrito no Exemplo 25. A análise da sequência genômica CC DGAT2 (SEQ ID NO: 226; Exemplo 25) sugeriu um sítio de iniciação em potencial e um oligo 5' foi desenvolvido ao sítio de iniciação ORF. O CC DGAT?2 foi ampliado a partir do CDNA (2 uL) com o primer de —oligonucleotideo CC ORF FWD (SEQ ID NO: 348) e CC ORF REV (SEQ ID NO: 349), com o uso de GoTaq polimerase (Promega, USA) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado em pGEM T-easy (Promega) com o uso das instruções do fabricante e foi, então, sequenciado. O nucleotideo de cDNA CC DGAT2 e sequências de aminoácidos correspondentes são estabelecidos na SEQ ID NO: 350 e SEQ ID NO: 351, respectivamente. Uma pesquisa de BLASTP do banco de dados da proteína de fungo detalhado em NCBI foi conduzida. Com base em um alinhamento CLUSTALW, a sequência de aminoácidos deduzida do cDNA CC DGAT2 compartilha 61 % de identidade de sequência com um | produto de proteina DGAT2 de Cryptococcus neoformans com número de | acesso no GENBANK XP 571236, que representa a proteina com a similaridade mais próxima neste banco de dados.

EXEMPLO 37 ANÁLISE FUNCIONAL DE DGAT2S DE YARROWIA LIPOLYITICA E LIPOMYCES STARKEYI E DGAT1S DE YARROWIA LIPOLVTICA E MORTIERELLA ALPINA EM

EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a expressão de pKR1337 (SEQ ID NO: 273, Exemplo 29), que compreende Lipomyces starkeyi diacylglycehde acyltransferase 2 (LS DGAT2), pKR1256 (SEQ ID NO: 98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2 (YL DGAT2), pKR1334 (SEQ ID NO:280, Exemplo 30), que compreende Mortierella diacylglyceride acyltransferase 1 (Ma DGAT1) e pKR1323 (SEQ ID NO: 289, Exemplo 30), que compreende códon DGAT1 de Yarrowia aperfeiçoado para a expressão em soja (YL DGAT1 cod2), em embriões somáticos de soja (experimentos de número MSE2333, MSE2334, MSE2332 e MSE2331 , respectivamente). Os eventos de cada experimento foram selecionados, os embriões somáticos foram amadurecidos em SHaM e concentrações de óleo e os perfis de ácido graxo foram determinados, conforme descrito no Exemplo 5. Os resultados para MSE2331, MSE2332, MSE2333 e 2334 são mostrados na tabela 61, tabela 62, tabela 63 e tabela 64, respectivamente. TABELA 61 ' CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE | MSE2331 | MSE2331 (YL DGAT1cod2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2331-18 11,2 5,8 36,5 41,0 5,5 19,5 2331-29 11,3 5,6 41,7 36,8 4,6 180 2331-27 111 5,5 37,1 40,6 5,7 17,5

' 252 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2331-14 11,6 4,6 32,9 43,7 72 16,3 2331-5 13,3 4,1 28,4 46,6 76 16,1 2331-13 12,5 5,7 34,9 39,9 7,0 15,6 2331-21 12,8 3,8 274 47,6 8,4 15,4 2331-16 111,7 4,9 34,9 41,2 72 14,4 2331-2 11,6 5,2 32,4 43,0 77 14,4 2331-17/ 11,0 5,4 35,4 41,0 7,3 14,3 2331-11 12,4 4,2 28,6 45,1 9,7 13,8 2331-24 11,8 74 37,0 36,9 6,9 12,4 2331-19 130 6,1 32,9 39,7 8,2 12,2 2331-9 13,6 5,3 29,3 42,8 9,0 12,2 2331-20 14,8 4,6 20,9 48,5 11,3 11,8 2331-28 14,2 5,2 25,5 45,7 9,3 11,7

2331-8 — 146 4,0 24,3 46,2 10,9 11,6

2331-15 15,6 3,8 20,3 48,3 12,0 11,5

| 23317 — 144 3,9 20,6 50,3 10,9 11,4 2331-4 14,0 4,2 25,1 47,4 9,4 11,2 2331-31 12,3 6,2 31,3 40,9 9,3 10,4 2331-26 13,4 4,0 16,4 54,3 11,8 10,3 2331-30 — 133 8,0 34,7 36,0 81 10,1 2331-12 138 64 29,1 40,5 10,1 97 2331-868 — 134 6,9 32,7 38,0 9,0 9,5 2331-1 14,3 5,6 31,3 36,9 11,8 8,2 2331-23 15,8 4,4 19,2 46,6 14,0 81 2331-10 16,1 4,3 20,9 44,2 14,5 78 2331-22 15,2 6,7 22,0 43,1 131 7,6 2331-25 16,9 5,7 22,1 40,1 15,2 5,5 2331-3 15,3 5,5 24,6 39,0 15,6 4,6 Média 13,4 5,3 28,7 43,0 9,6 12,0

TABELA 62

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2332 MSE2332 (MA DGAT1) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem em óleo 2332-31 16,0 67 22,9 38,9 15,6 18,9 2332-15 11,6 5,8 38,4 37,5 6,6 15,1 2332-29 16,5 5,1 21,3 41,2 15,9 13,9 2332-9 12,4 4,5 33,2 41,4 8,6 138 2332-14 121 5,5 36,9 38,4 72 13,6 2332-22 12,3 6,5 36,0 37,3 7,9 13,2 2332-26 12,0 5,3 36,8 38,1 77 13,2 2332-20 16,9 5,2 17,7 431 171 12,7 2332-25 12,7 5,7 35,8 38,3 76 12,5 2332-21 13,0 6,8 34,4 37,8 8,0 12,0 2332-6 13,2 5,6 34,1 38,0 9,1 11,5 2332-24 13,0 6,5 35,5 37,5 7,5 11,3 2332-23 137 6,4 33,7 37,3 8,9 11,1 2332-2 13,0 5,5 33,3 38,5 9,7 10,5 2332-1 13,5 5,6 31,5 39,4 10,0 10,0 2332-19 14,0 6,2 31,8 38,1 9,9 9,8 2332-11 14,4 5,6 28,8 40,6 10,7 9,4 2332-7 15,1 5,0 26,6 42,6 10,7 9,1 2332-13 15,6 4,9 23,2 43,5 12,8 8,8 2332-18 15,3 4,5 214 45,4 13,5 81 2332-8 16,1 4,3 19,7 46,1 13,8 7.9 2332-16 16,7 4,2 20,8 43,5 14,8 71 2332-12 15,6 6,5 23,7 39,8 14,4 6,8 2332-4 16,8 5,2 20,5 41,3 16,2 6,1 2332-17 164 5,5 23,0 40,1 15,0 6,0 2332-28 17,1 5,4 23,0 37,1 17,4 5,5 2332-10 16,9 4,6 18,3 41,7 185 5,3 2332-3 16,2 5,5 20,6 41,9 15,8 5,3 2332-5 17,1 5,1 19,6 39,7 18,5 4,6 2332-30 11,9 3,7 34,4 41,6 8,3 4,5 2332-27 15,9 5,8 19,7 39,9 187 41 | Média 14,6 5,4 27,6 40,2 121 9,7

TABELA 63 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2333 MSE2333 (LS DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2333-2 15,5 6,8 28,2 38,0 11,5 12,2 2333-23 13,8 5,2 28,7 43,1 9,2 11,6 2333-27 13,4 6,0 35,3 37,2 81 10,5 2333-8 16,2 5,1 211 40,8 16,7 10,3 2333-21 14,4 6,1 30,9 39,5 9,1 9,3 2333-20 14,1 7,0 32,3 37,0 9,7 9,3 2333-1 10,3 4,3 44,0 36,3 5,1 8,6 2333-29 15,5 6,0 28,0 39,2 11,3 84 2333-14 14,2 5,3 27,8 40,7 12,0 8,2 2333-17 14,6 6,5 32,4 36,1 10,4 76 2333-28 15,0 6,8 30,1 37,0 11,2 7,6 2333-26 16,8 4,8 21,8 43,3 13,4 7,83 2333-18 15,3 5,4 29,7 37,5 121 6,8 2333-16 15,4 5,5 25,2 39,9 13,9 6,7 2333-11 16,4 72 26,0 37,3 131 6,5 2333-24 13,9 4,9 24,4 41,9 14,8 6,3 2333-15 154 5,4 28,2 37,7 13,3 6,2 2333-4 12,4 5,7 33,8 39,8 8,3 5,6 2333-5 17,0 5,5 19,0 41,4 17,2 5,4 2333-10 160 6,0 21,7 40,9 15,4 5,4 2333-12 15,6 5,5 25,7 36,7 16,5 5,4 2333-31 15,4 5,7 26,7 37,9 14,2 5,1 2333-7 16,4 5,4 20,8 41,2 16,2 5,1 2333-19 16,2 6,7 26,6 36,6 14,0 4,9 2333-30 15,9 5,5 25,9 37,6 15,1 4,8 | 2333-6 16,9 5,6 22,6 38,8 16,1 4,6 2333-25 154 5,6 21,7 39,4 17,9 4,4 2333-3 13,4 5,1 314 40,9 9,1 4,4 2333-9 13,9 6,1 31,2 41,2 77 3,9 2333-13 17,2 4,5 15,8 41,5 21,0 3,8 2333-22 166 5,6 214 37,3 19,1 2,9 Média 15,1 5,7 27,0 39,2 13,0 6,7

TABELA 64 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EvENTOS DE MSE2334 MSE2334 (YL DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2334-25 11,8 6,0 36,3 38,4 74 12,9 2334-12 12,5 6,9 37,9 36,2 6,6 12,5 2334-5 13,7 4,9 31,7 41,7 7,9 121 2334-3 124 5,3 38,6 36,4 7,3 111,1 2334-119 125 6,0 33,0 38,2 10,3 10,8 2334-4 13,0 5,1 33,7 39,2 9,0 10,7 2334-24 131 5,8 33,4 37,3 10,4 10,1 2334-1 15,0 5,0 29,4 40,5 10,2 9,5 2334-18 13,8 5,1 30,1 40,3 10,6 9,3

2334-15 14,6 6,0 31,3 37,6 10,5 8,8 2334-17 13,7 5,4 32,5 37,0 11,4 8,4 2334-30 15,3 5,6 29,4 37,4 12,2 79 2334-16 15,2 6,5 29,6 37,0 11,8 7,3 2334-21 15,4 7,5 28,8 36,5 11,8 7,2 2334-11 14,5 6,8 33,7 34,0 11,0 6,7 2334-28 14,9 4,5 27,2 39,1 14,3 6,5 2334-27 15,8 5,8 28,4 37,1 12,9 6,3 2334-14 16,1 77 27,6 35,4 131 6,3 2334-26 15,9 6,4 24,1 40,2 13,4 6,2 2334-9 16,6 41 18,3 42,3 18,8 6,1 2334-20 17,3 4,5 19,2 41,6 17,4 5,6 2334-8 15,2 5,0 27,8 36,4 15,6 5,6 2334-22 16,3 6,1 26,4 36,5 14,6 5,5 2334-2 15,8 4,6 22,3 40,4 16,9 4,9 2334-10 17,0 5,0 22,3 38,8 16,9 4,9 2334-29 18,7 3,6 9,5 47,9 20,3 4,8 2334-7 16,5 5,6 23,0 36,9 17,9 4,7 2334-23 166 4,8 17,3 41,5 19,9 4,6 2334-6 19,3 6,1 23,5 36,4 14,6 4,0 2334-13 185 5,6 20,5 37,1 18,4 3,3 média 15,2 5,6 27,6 38,5 13,1 7,5

|

O S DGAT2 aumenta a concentração de óleo e ácido oleico em embriões somáticos em quantidades similares a YL DGAT2. YL DGAT1 (cod2) e o MA DGAT1 eleva o oleico similarmente a YL DGAT2 e possui aumentos de óleo maiores com YL DGAT1 (cod2) que tem o nível de óleo maisalto. EXEMPLO 38 ANÁLISE FUNCIONAL DE DGAT2S DE YARROWIA LIPOLVITICA E PHAFFIA

RHODOZVMA E DGATIS DE YARROWIA LIPOLYTICA E LIPOMYCES STARKEYI EM

EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O presente exemplo descreve a expressão de pKR1372 (SEQ ID NO: 294, Exemplo 31), que compreende Phaffia rhodozyma diacylglyceride acyltransferase 2 (PR DGAT2), pKR1256 (SEQ ID NO: 98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2 (YL DGAT2), pKR1375 (SEQ ID NO:300, Exemplo 32), que compreende Lipomyces diacylglyceride acyltransferase 1 (LS DGAT1) e pKR1323 (SEQ ID NO:289, Exemplo 30), que compreende códon de DGAT1 Yarrowia aperfeiçoado para a expressão em soja (YL DGAT1 cod2), em embriões somáticos de soja (números de experimento MSE2351, MSE2349, MSE2352 e MSE2350, respectivamente).

Os eventos de cada experimento foram selecionados, os embriões somáticos foram amadurecidos em SHaM e concentrações de óleo e os perfis de ácido graxo foram determinados conforme descrito no Exemplo 5. Os resultados para MSE2349, MSE2350, MSE2351 e 2352 são mostrados na tabela 65, tabela 66, tabela 67 e tabela 68, respectivamente: TABELA 65

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2349 MSE2349 (YL DGAT2)

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2349-3 10,3 4,1 42,5 37,0 6,1 17,3 2349-29 11,8 4,4 32,6 43,2 8,2 15,1 2349-17 11,5 4,0 34,5 421 8,0 15,0 2349-22 10,8 4,9 34,1 42,2 8,0 14,6 2349-11 11,5 4,9 34,1 41,9 7,6 14,1 2349-27 13,0 4,5 31,0 43,0 8,5 13,6 2349-26 13,6 3,7 28,0 45,6 9,1 12,7 2349-14 12,9 5,0 30,0 43,1 9,1 12,0 2349-25 14,7 4,4 20,6 49,9 10,4 11,9 Ê 2349-2 12,4 6,4 39,5 33,9 7.8 111,11 2349-5 15,3 3,6 20,7 48,2 12,3 10,8 2349-24 14,5 5,2 26,0 43,5 10,8 10,5 2349-21 12,6 6,9 35,2 36,0 9,4 10,3 2349-6 13,0 6,1 33,6 38,2 9,2 10,3 | 2349-16 14,6 4,5 23,8 46,1 111 10,2 | 2349-1 12,8 5,1 32,0 39,7 10,4 9,9 234923 151 4,0 23,0 46,6 11,3 9,9 | 2349-20 141 5,1 23,2 46,0 11,6 9,7 | 2349-18 14,2 4,4 24,4 45,0 121 9,2 2349-19 14,5 6,1 26,8 41,7 10,9 9,2 2349-28 13,2 74 33,4 35,7 10,3 9,2 2349-4 14,7 4,4 25,0 447 11,2 8,6 2349-12 17,9 3,9 17,0 47,7 13,5 8,6 2349-10 15,7 67 22,8 41,6 131 8,3 2349-15 17,6 5,1 21,9 435 11,9 8,1 2349-8 13,8 5,4 22,5 43,0 15,2 8,1 2349-30 14,8 4,5 277 39,6 13,6 8,0 | 2349-9 14,9 6,5 26,9 39,7 121 77 2349-13 15,0 5,1 25,0 39,6 15,3 v | 2349-7 16,3 4,5 20,8 42,1 16,3 5,7

' : Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo Média 13,9 5,0 27,9 42,3 10,8 10,5 TABELA 66 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2350 MSE2350 (YL DGAT1cod2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2350-4 10,7 3,9 34,7 44,7 5,9 18,6

2350-20 99 3,9 45,0 34,9 6,3 17,7

2350-6 10,5 4,7 40,2 38,8 5,7 17,3

2350-29 11,0 4,7 37,8 40,5 6,0 16,6

2350-5 10,8 5,3 37,0 39,8 71 13,8

2350-1 114 5,4 37,1 38,5 7,5 13,7

2350-23 12,9 5,4 32,9 41,3 7,6 124

2350-17 12,3 75 35,9 37,0 7A 12,4

2350-24 14,2 41 22,7 47,9 11,0 1,7

2350-3 14,0 5,4 30,6 40,3 9,6 111,7

2350-12 13,4 6,6 27,8 42,9 9,4 11,3

2350-18 — 144 41 211 49,2 111 11111 2350-14 14,6 3,2 21,3 49,3 11,7 10,9

2350-30 13,8 6,9 29,1 40,3 9,9 10,6

2350-26 14,2 5,8 26,3 43,3 10,5 10,5 2350-21 12,9 5,8 28,5 42,7 10,2 10,1 2350-16 15,2 5,2 22,3 46,3 11,0 9,5

2350-19 13,7 5,2 27,7 41,7 11,6 9,5

2350-13 147 5,1 24,6 43,9 11,8 9,0

2350-7 14,7 64 25,8 412 11,9 8,9

2350-2 13,3 5,6 31,9 38,0 11,2 8,2

2350-27 15,9 5,3 23,0 42,7 131 7,9

2350-28 16,4 5,9 27,0 38,3 124 7,6

2350-22 15,3 6,4 23,6 421 12,5 76

2350-25 13,8 4,8 24,0 42,7 14,6 7,5

2350-31 16,6 4,5 211 43,8 14,0 7,3

2350-11 14,8 5,9 22,3 43,0 14,0 72

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2350-8 16,1 5,4 22,6 40,5 15,3 6,5 2350-10 15,5 5,9 22,1 41,3 15,2 6,0 2350-9 15,4 5,8 20,6 41,6 16,6 5,2 2350-15 15,1 4,5 171 431 20,1 51 Média 13,8 5,3 27,9 42,0 11,0 10,4 - TABELA 67 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2351 MSE2351 (PR DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2351-28 15,2 42 21,9 48,7 10,0 12,3 2351-9 14,8 3,9 22,0 48,0 11,3 12,0 2351-24 14,8 4,3 21,9 49,1 9,9 11,2 2351-11 15,3 5,0 23,8 45,6 10,3 10,8 2351-25 14,4 6,0 23,9 44,6 11,2 10,6 2351-21 15,3 5,6 24,4 44,0 10,7 10,5 2351-30 14,7 5,9 25,3 43,9 10,2 10,1 2351-1 13,9 6,8 25,1 44,2 10,0 10,1 2351-110 15,3 71 24,8 42,8 10,0 10,1 2351-13 14,9 7,0 25,9 42,8 9,4 10,0 2351-23 14,7 6,6 25,3 42,6 10,7 9,6 2351-18 15,3 5,0 23,0 46,4 10,3 9,5 2351-12 15,1 41 17,4 50,7 12,8 9,2 2351-3 15,4 72 25,1 42,1 10,3 8,8 2351-15 15,1 4,9 22,6 46,1 11,3 8,7 2351-5 15,7 TA 23,5 42,2 11,1 8,6 2351-16 15,6 5,7 23,4 43,9 11,4 8,4 2351-6 14,8 61 25,7 42,5 10,9 8,0 2351-20 15,6 6,4 25,3 412 11,6 8,0 2351-29 17,6 5,4 19,9 43,9 13,2 8,0 2351-22 15,1 7,0 25,8 40,4 1,7 7,9 2351-4 15,5 6,6 23,1 41,6 131 7,8 2351-2 15,4 6,6 24,3 41,4 12,4 77

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2351-8 15,6 6,6 24,9 39,1 13,8 6,7 | 2351-26 15,8 6,4 23,0 40,3 14,5 6,7 | 2351-14 11,8 4,0 20,7 50,0 13,4 6,3 235117 17,3 5,6 21,3 39,8 16,0 5,3 | 2351-19 16,4 64 23,0 40,1 14,2 5,3 2351-7 14,5 5,9 21,6 40,3 17,6 4,9 2351-27 16,5 6,4 22,8 40,1 14,1 4,9 Média 15,2 5,9 23,4 43,6 11,9 8,6 TABELA 68 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2352 MSE2352 (LS DGAT1) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2352-4 13,2 4,4 28,1 45,4 89 14,0 2352-6 12,4 5,8 30,3 43,3 81 13,6 2352-27 14,3 76 32,9 37,4 7,9 12,9 2352-8 14,9 4,5 21,3 49,0 10,4 121 2352-24 13,2 75 31,0 39,6 8,7 121 2352-5 13,7 78 29,9 40,0 8,6 12,0 2352-30 14,4 5,9 30,0 40,6 9,1 11,9 2352-29 14,0 6,1 31,5 39,3 9,1 10,7 2352-22 14,4 4,7 24,6 46,4 9,9 11,6 2352-28 14,4 74 28,3 40,8 9,1 91 2352-12 14,4 75 29,0 39,4 97 11,1 2352-19 145 6,1 30,5 38,7 10,2 10,9 2352-7 14,2 7,0 24,9 44,2 9,7 10,9 2352-21 15,5 6,8 25,4 42,0 10,3 10,6 2352-1 14,7 8,0 27,7 39,5 10,1 10,2 2352-9 15,0 5,7 22,7 44,5 12,2 9,3 2352-13 12,6 5,4 27,8 42,8 11,3 9,2 2352-11 14,7 7,8 26,8 40,2 10,6 9,1 2352-16 16,3 6,0 23,5 42,0 12,2 9,1 2352-18 15,2 5,9 26,7 40,4 11,9 8,7 2352-14 15,8 5,2 214 44,8 12,8 8,5 2352-15 152 6,2 23,5 42,2 12,8 8,3

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2352-10 16,2 6,3 24,5 39,8 13,2 7,9 2352-25 15,4 5,3 26,5 40,4 124 7,8 2352-26 18,9 5,0 18,5 45,1 12,6 77 2352-23 15,2 8,1 25,5 39,4 11,8 7A 2352-3 16,1 7,0 23,8 39,8 13,3 7,0 2352-17 15,0 6,3 24,7 39,9 14,1 6,5 2352-31 17,1 6,3 22,0 41,5 13,1 63 . 2352-32 16,8 7,2 26,8 37,2 121 6,1 2352-2 16,5 72 231 39,6 13,7 5,9 2352-20 16,0 72 26,5 36,3 14,0 5,2 Média 15,0 6,4 26,2 41,3 11,1 9,6 | LS DGAT1 e YL DGAT1 (cod2) aumentam a concentração de óleo e ácido oleico em embriões somáticos em quantidades similares à | forma como YL DGAT2. PR DGAT2 aumenta a concentração de óleo e oleico levemente menos que em YL DGAT2. Observa-se que as concentrações absolutas (expressas como média) podem variar com o uso dos mesmos genes, mas em experimentos diferentes separados conduzidos em momentos diferentes. Por exemplo, o YL DGAT2 proporcionou uma concentração média de óleo de 7,5% em MSE2334 (Exemplo 37), porém proporcionou 10,5% em MSE2349. Em todos os casos, a média de porcentagem de óleo em qualquer gene individual em um experimento pode ser comparada à obtida em YL DGAT2, que é feita em todos os experimentos como um controle e, dessa forma, normaliza os resultados entre os conjuntos experimentais. EXEMPLO 39 EXPRESSÃO E ANÁLISE FUNCIONAL DE DGAT2S DE YARROWIA LIPOLVITICA, CRYPTOCOCCUS CURVATUS, MUCOR CIRCINELLOIDES E CANDIDA ZEYLANOIDES

EM EMBRIÕES SOMÁTICOS DE SOJA O exemplo presente descreve o desenvolvimento de pKR1392,

| 262 que compreende Candida zeylanoides diacylglyceride acyltransferase 2 (CZ DGAT2); pKR1409, que compreende Mucor circinelloides diacylglyceride — acyltransferase 2 (MC DGAT2); e pKR1427, que compreende Cryptococcus curvatus diacylglyceride acyltransferase 2 (CC DGAT2)e a expressão em embriões somáticos.

O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO: 98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2 | (YL DGAT2) também foi expresso por comparação. | Desenvolvimento de pKR1392, que compreende Cz DGAT2 O CZ DGAT2 (SEQ ID NO: 175, Exemplo 21) foi ampliado a partir de um cosmídeo isolado que contém o fragmento de DNA genômico (descrito no Exemplo 21), com o primer de oligonucleotideo CzDGAT2-5 (SEQ ID NO:352) e CZDGAT2-3 (SEQ ID NO:353), com o uso de Phusion"" High-Fidelity DNA Polimerase (Cat.

No.

F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº com o uso de Zero Bluntº PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, a fim de produzir pHD39 (SEQ ID NO: 354). O fragmento de Notl de pKRHD39 (SEQ ID NO: 354), que contém CZ DGAT?2, foi clonado no sítio de Notl de pKR72 (SEQ ID NO: 26; Exemplo 4) afimde produzir pKR1392 (SEQ ID NO: 355). Construção de pKR1409. que compreende MC DGAT2 O MC DGAT2 (SEQ ID NO: 233, Exemplo 26) foi ampliado a partir do cDNA descrito no Exemplo 26 com o primer de oligonucleotídeo OoMCcDG2-1 (SEQ ID NO: 356) e o oMcDG2-2 (SEQ ID NO:357), com o uso de —Phusion'" High-Fidelity DNA Polimerase (Cat.

No.

F553S, Finnzymes Oy, Finlândia) seguindo o protocolo do fabricante.

O fragmento de DNA resultante foi clonado no vetor de clonagem pCR-Bluntº com o uso do Zero Blunt? PCR Cloning Kit (Invitrogen Corporation), seguindo o protocolo do fabricante, para i 263 produzir pKR1408 (SEQ ID NO: 358). A sequência de nucleotídeo de MC DGAT2 de pKR1408 é estabelecida na SEQ ID NO: 359 e tem uma mudança nt comparada à SEQ ID NO: 233, que não altera a sequência aa.

O fragmento de Notl de pKR1408 (SEQ ID NO: 358), que contém MC DGAT?2, foiclonado no sítio de Notl de pKR72 (SEQ ID NO: 26; Exemplo 4) para produzir pKR1409 (SEQ ID NO: 360). Desenvolvimento de pKR1427, que compreende CC DGAT2 O plasmídeo que contém o gene CC DGAT2 descrito no Exemplo 36 foi digerido com o Notl e o fragmento que contém CC DGAT2 foi clonado no sítio de Notl de pKR72 (SEQ ID NO: 26; Exemplo 4) para produzir pKR1427 (SEQ ID NO: 361). Expressão de CZ DGAT2, MC DGAT2 e CC DGAT2 em embriões somáticos de soja.

O cultivo de suspensão de soja embriogênica (cv.

Jack) foi transformado com o pKR1392 (SEQ ID NO: 355), que tem o número de experimento MSE2451; com pKR1409 (SEQ ID NO: 360), que tem o número de experimento MSE2452 e com pKR1427 (SEQ ID NO: 361), que tem o número de experimento MSE2453. O vetor de controle pKR1256 (SEQ ID NO: 98; Exemplo 16), que compreende Yarrowia DGAT2 (YL DGAT2), também foi transformado sozinho de forma similar para controle e o mesmo tem o número de experimento MSE2454. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos amadurecidos em SHaM, conforme descrito no Exemplo 5. As concentrações de óleoe perfisde ácido graxo foram determinadas, conforme descrito no Exemplo 5 para MSE2451, MSE2452, MSE 2453 e MSE2454 e os resultados para cada experimento são mostrados na tabela 69, tabela 70, tabela 71 e tabela 72, respectivamente.

| TABELA 69

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2451 MSE2451 (CZ DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2451-13 16,2 5,3 17,0 38,1 23,4 7,0 2451-7 16,8 4,8 13,5 41,2 23,6 5,8 2451-26 15,3 6,3 214 40,3 16,7 5,3 2451-25 15,7 5,5 16,6 39,4 22,8 5,2 2451-24 15,4 51 15,0 40,9 23,6 5,0 2451-31 15,6 5,7 18,7 42,4 17,5 4,9 2451-14 15,7 63 22,7 37,9 17,4 4,9 2451-12 166 6,2 211 38,5 17,6 47 2451-30 16,7 5,2 17,0 41,4 19,7 4,6 2451-3 15,9 6,3 211 39,3 17,4 4,5 2451-9 14,4 6,6 24,8 36,4 17,9 4,4 2451-17 16,7 5,8 186 41,2 17,8 4,4 2451-15 14,4 77 24,6 37,7 5,6 14,3 2451-10 16,2 62 20,6 38,8 18,2 4,3 2451-2 15,2 5,3 16,5 42,1 20,9 4,1 2451-21 16,9 5,8 188 36,6 21,9 4,0 2451-4 16,8 67 22,6 36,1 17,8 4,0 2451-16 17,1 62 16,4 38,3 22,0 3,9 2451-28 16,2 5,3 17,4 40,6 20,5 3,9 2451-1 171 5,1 15,5 40,0 22,3 3,8 2451-6 17,8 4,8 11,3 41,3 24,9 3,8 2451-22 15,2 74 15,6 40,0 21,6 3,7 2451-200 16,0 62 214 37,7 18,7 3,7 2451-8 16,3 5,2 17,0 39,8 21,8 3,7 2451-18 16,2 5,5 19,9 40,0 18,3 3,5 2451-23 168 5,2 16,5 39,6 21,9 3,3 2451-29 16,7 5,0 16,5 39,2 22,7 3,3 2451-5 17,2 6,1 18,0 39,0 19,7 3,2 2451-27 16,4 5,2 16,2 39,1 23,2 31 2451-11 16,2 5,0 15,4 41,0 22,5 3,0 2451-19 16,7 5,2 15,8 38,7 23,6 2,7 Média 16,2 5,7 18,2 39,4 20,4 4,2

À E NS DS |

E | 265 TABELA 70

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2452 | MSE2452 (MC DGAT?2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo | 2452-6 16,6 5,3 20,9 41,0 16,2 5,6 | 2452-22 15,6 66 24,7 39,2 13,9 5,5 2452-13 16,8 71 28,1 35,1 13,0 5,4 2452-12 16,8 5,5 22,9 39,1 15,8 5,1 2452-3 16,8 5,0 22,0 39,9 16,3 5,1 2452-25 16,1 47 23,7 38,4 171 5,0 2452-29 16,2 5,1 25,2 36,9 16,7 4,8 2452-20 17,1 5,3 20,7 38,1 18,8 4,8 2452-11 16,8 5,2 24,6 37,2 16,3 4,8 2452-2 17,0 5,3 22,4 38,0 17,2 4,7 2452-8 16,5 4,4 224 39,3 17,4 4,7 2452-4 17,5 4,9 21,5 37,3 18,8 4,7 2452-28 17,3 4,4 19,2 40,5 18,7 4,6 2452-1 16,3 5,6 26,5 35,1 16,5 4,5 2452-31 17,6 5,7 22,6 38,0 16,2 4,4 2452-27 16,5 5,7 25,5 35,7 16,6 4,4 2452-23 18,5 6,3 23,1 36,0 16,0 4,3 2452-21 16,9 5,8 21,7 38,5 171 4,2 2452-5 16,4 5,3 24,1 36,1 181 4,0 2452-16 17,8 5,7 21,9 37,8 16,8 3,9 2452-14 17,3 5,3 24,3 35,8 17,3 3,9 2452-26 16,8 4,4 18,0 41,4 19,3 3,9 2452-18 16,7 4,5 16,4 39,0 23,4 3,8 2452-24 19,4 4,8 13,7 40,1 22,0 3,7 2452-9 16,8 5,1 13,6 42,8 21,7 3,6 2452-7 18,7 4,8 16,7 37,8 21,8 3,4 2452-15 17,5 5,3 18,4 38,2 20,7 3,0 2452-30 19,3 5,5 17,8 37,9 19,5 3,0 2452-10 17,1 5,6 19,4 371 20,8 2,5 Média 17,1 5,3 21,4 38,2 17,9 4,3

| | 266 | TABELA 71 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2453 MSE2453 (CC DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2453-11 16,1 6,0 22,5 40,2 15,3 5,6 2453-25 17,2 5,0 17,3 42,8 17,6 5,1 2453-12. 163 61 23,0 39,1 15,4 51 2453-29 — 16,9 47 16,2 411 211 51 2453-15 17,5 4,2 12,2 45,2 20,9 4,7 2453-13 18,8 5,6 20,5 37,8 17,3 4,5 2453-2 17,3 5,4 19,7 38,0 19,6 4,4 2453-26 16,5 4,8 18,6 38,0 22,1 4,3 2453-7 17,6 5,4 19,4 39,7 18,0 4,3 2453-20 17,3 4,7 16,0 39,9 22,1 4,1 2453-8 18,2 6,1 22,9 35,9 16,8 41 2453-6 171 5,0 20,2 38,2 19,5 41 2453-24 177 5,0 14,9 40,9 21,5 41 2453-14 17,6 5,1 19,8 38,6 18,9 4,0

2453-22 19,2 4,4 12,6 39,4 24,5 4,0

2453-28 18,2 54 21,5 37,0 17,9 4,0

2453-18 18,0 5,7 16,5 39,3 20,4 3,9

2453-21 19,6 5,9 19,1 37,0 18,4 3,9

| 2453-10 17,4 5,1 15,4 39,8 22,4 3,8 2453-17 18,0 5,6 15,9 40,8 19,7 3,7 2453-5 17,2 4,0 11,1 43,4 24,1 3,5 2453-23 18,1 4,9 15,1 41,4 20,6 3,4 2453-3 17,7 5,0 15,5 39,7 22,0 3,3 2453-9 18,6 5,6 18,3 36,0 21,6 3,2 2453-4 17,5 5,0 15,3 40,1 22,0 3,2 2453-168 17,2 5,7 25,1 32,1 20,0 2,8 2453-30 16,9 4,6 17,7 37,5 23,2 2,6 2453-19 20,6 4,4 12,0 38,4 24,5 2,3 Média 17,7 5,2 17,6 39,2 20,3 4,0

TABELA 72 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2454 MSE2454 (YL DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2454-27 12,2 6,0 35,5 36,8 9,4 9,5 2455-5 13,9 5,9 32,6 36,9 10,8 8,2 2454-13 13,6 5,8 29,4 38,9 12,3 8,0 2454-29 141 5,4 29,7 37,6 13,2 7,9 2454-26 14,5 63 33,8 33,9 11,5 7,3 2454-24 14,9 5,9 28,2 38,6 12,4 7,0 2454-17 15,3 5,1 27,0 38,7 13,9 6,6 2454-9 14,1 6,0 31,0 36,8 121 6,6 2454-15 14,6 5,9 23,0 39,5 16,9 6,4 2454-10 16,1 6,4 27,4 36,2 14,0 5,8 2454-2 17,0 5,2 22,0 40,3 15,5 5,8 2454-1 15,8 6,0 26,4 374 14,4 5,7 2455-4 17,2 5,7 23,6 37,8 15,8 5,5 2454-7 15,4 5,6 23,6 39,1 16,4 5,4 2454-8 15,8 5,5 28,8 35,8 14,0 5,3 2454-18 17,4 63 21,7 37,6 17,0 5,2 2454-3 17,8 5,9 23,0 38,3 14,9 5,1 2454-16 16,5 5,4 21,0 40,8 16,3 5,0 2454-23 17,3 4,5 19,5 40,4 18,3 4,9 2454-111 16,8 5,6 24,3 36,3 17,0 4,8 2454-25 16,8 6,0 20,9 38,2 18,1 4,8 2455-7 17,3 5,4 24,2 38,1 15,0 4,7 2454-4 17,5 6,7 21,9 37,7 16,2 4,7 2455-6 17,2 5,3 19,9 39,3 18,3 4,7 2454-14 16,5 5,8 23,1 37,4 17,2 4,4 2454-6 17,6 6,1 25,6 35,3 15,4 4,4 2454-21 16,6 4,4 20,9 38,1 20,0 3,9 2454-19 18,4 5,0 17,6 40,4 18,6 3,7 2454-30 16,6 41 15,0 40,9 23,3 3,6 2454-31 17,3 41 114 43,3 23,8 3,6 2454-28 17,5 5,0 19,7 37,5 20,2 3,5 2454-22 17,5 4,8 19,6 39,7 18,4 3,4 Média 16,2 5,5 24,1 38,2 16,0 5,5

Os CZ DGAT2, MC DAGT2 e CC DGAT?2 de tipo selvagem não parecem afetar a concentração de óleo ou ácido oleico em embriões somáticos quando comparados a YL DGAT2. EXEMPLO 40 EXPRESSÃO OTIMIZADA DE SEQUÊNCIAS DE GENE DGAT2 QUE CODIFICAM UM VARIANTE DE PROTEÍNA CC DGAT2 A sequência de nucleotídeo que codifica a proteina DGAT2 de Cryptococcus curvatus aqui descrita (consulte o Exemplo 36) foi re-projetada para expressão melhorada em semente de soja com o uso de métodos similares a aqueles descritos em Wu, G et al. Nucleic Acids Research (2007), 35: D76-D79; Villalobos, A. et al. BMC Bioinformatics (2006), 7 sem página; Wu, G. et al. Protein Expression and Purification (2006), 47: 441 a 445; Richardson, S. M. et al. Genome Research (2006), j6ê: 550 a 556; Jayaraj, S. et al. Nucleic Acids Research (2005) 33: 3011 -3016. As moléculas de DNA foram sintetizadas tanto por Codon Devices (MA, USA) ou por GENEART AG (Regensburg, Alemanha). A sequência de DNA otimizada por expressão e a proteina DGAT?2 codificada pela dita sequência de DNA | são mostradas na SEQ ID NO: 362 e SEQ ID NO: 363, respectivamente. À proteína codificada pela sequência otimizada por códon contém o motivo FPoPXFR, que foi alterado de FxxPxYR presente na proteína nativa DGAT?2. EXEMPLO 41

CLONAGEM DE SEQUÊNCIAS DGAT OTIMIZADAS POR CÓDON PARA A EXPRESSÃO EM

SOJA O exemplo presente descreve a clonagem de sequencias DGAT que foram otimizadas por códon, e cujos motivos foram alterados no caso de DGAT2s, para a expressão em soja para vetores de expressão de soja.

Todas as sequências DGAT que foram otimizadas por códon para expressão em soja, conforme descrito nos Exemplos 33,34 e 40, foram sintetizadas com sítios de enzima de restrição Notl que flanquearam a sequência de gene otimizada por códon (antes do códon de início e após o códon de terminação). Além disso, três nucleotideos (ACC) foram adicionados entre com o Notl na terminação 5' do gene otimizado por códon e o códon de início ATG em todos os casos. Os fragmentos de Notl de cada sequência de gene DGAT otimizado por códon sintetizado foram clonados em sítio de Notl de pKR72 (SEQID NO: 26; Exemplo 4) para produzir vetores de expressão de soja. As sequências de vetores para todas as sequências de gene otimizadas por códon e de tipo selvagem são resumidas na tabela 73. TABELA 73

RESUMO DAS SEQUÊNCIAS CÓDON OTIMIZADAS E DE TIPO SELVAGEM E VETORES Gene SEQ ID NO SEQ ID NO Vetor de SEQ ID NO nt aa Expressão Vetor TD DGAT2A 133 135 PKR1324 121 TD DGAT2Acod 303 304 pKR1422 364 TD DGAT2B 134 136 pKR1325 134 TD DGAT2Bcod 305 306 N/A N/A | PA DGAT2 146 147 PpKR1332 260 PA DGAT2cod 307 308 PKR1421 365 DH DGAT2 161 162 pKR1328 161 DH DGAT2cod 309 310 PKR1420 366 CZ DGAT2 175 176 PKR1392 355 CZ DGAT2cod 311 312 PKR1512 367 LS DGAT2 271 272 PKR1337 273 LS DGAT2cod 313 314 PKR1415 368 MC DGAT2 233 234 pPKR1409 360 MC DGAT2cod 315 316 PKR1513 369 PR DGAT2 293 215 PpKR1372 294 PR DGAT2cod 317 318 PKR1416 370 RG DGAT2 264 265 pKR1333 266 RG DGAT2cod 319 320 pKR1423 371 MA DGAT2 254 255 pKR1335 256

Gene SEQID NO SEQ ID NO Vetor de SEQID NO nt aa Expressão Vetor MA DGAT2cod 321 322 PKR1419 372 CC DGAT2 350 351 PKR1427 361 CC DGAT2cod 362 363 PKR1522 373 LS DGAT1 298 299 PpKR1375 300 Idêntico a LS DGATIcod 302 Wet pKR1514 374 MA DGAT1 278 279 PKR1334 280 Idêntico a MA DGATIcod 301 wt PKR1511 375 EXEMPLO 42

EXPRESSÃO DE SEQUÊNCIAS DGAT OTIMIZADAS POR CÓDON E DO TIPO SELVAGEM EM

SOJA O exemplo presente descreve a expressão e caracterização funcional de sequências DGAT de tipo selvagem e otimizadas por códon em embriões somáticos de soja.

O cultivo de suspensão de soja embriogênica (cv. Jack) foi transformado com cada um dentre os vetores de expressão de soja que compreendem as DGATs tipo selvagem ou otimizadas por códon descritas na tabela 73 (Exemplo 41). As transformações foram executadas em conjuntos que comparam os genes de tipo selvagem a genes otimizados por códon e, em geral, quatro genes (2 de tipo selvagem, 2 otimizados por códon) foram comparados de uma vez. Os eventos foram selecionados e os embriões somáticos amadurecidos em SHaM, conforme descrito no Exemplo 5. As concentrações de óleo e perfis de ácido graxo foram determinadas conforme descrito no Exemplo 5 Os resultados para pKR1337 (LS DGAT2; SEQ ID NO: 273; Experimento MSE2411), pKR1415 (LS DGAT2cod; SEQ ID NO: 368; Experimento MSE2412), pKR1372 (PR DGAT2; SEQ ID NO: 294; Experimento MSE2413) e pKR1416 (PR DGAT2cod; SEQ ID NO: 370;

i 271 Experimento MSE2414) são mostrados na tabela 74, tabela 75, tabela 76 e tabela 77, respectivamente. TABELA 74

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2411 MSE2411 (LS DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2411-24 15,7 5,0 27,3 41,9 10,2 10,8 2411-31 136 5,8 28,2 41,7 10,7 8,7 2411-32 13,7 5,6 28,6 41,4 10,7 8,6 2411-12 14,0 6,5 29,8 39,0 10,7 8,5 2411-17 16,6 5,6 21,3 42,9 13,6 77 2411-22 14,3 6,5 30,9 37,3 11,0 7,5 2411-21 16,0 6,9 27,2 36,8 13,2 6,3 2411-30 15,7 6,4 23,1 411 13,8 6,2 2411-5 16,9 6,6 26,3 37,3 12,9 6,0 2411-29 14,7 5,3 27,5 37,7 14,9 6,0 2411-5 16,9 6,4 211 41,5 14,1 5,7 2411-13 164 6,6 24,1 39,7 13,3 5,3 2411-27 17,0 5,1 211 40,1 16,6 5,2 2411-16 18,4 5,2 17,3 42,5 16,6 5,0 2411-23 17,9 6,2 20,2 40,2 15,4 5,0 2411-6 16,6 4,8 18,2 42,7 17,7 5,0 2411-4 17,3 5,8 20,2 40,5 16,3 4,9 2411-20 15,4 5,9 25,3 38,0 15,4 4,9 2411-4 16,4 43 20,1 40,8 18,3 48 2411-2 17,3 5,0 18,4 41,4 17,9 4,7 2411-26 17,0 5,9 19,1 40,6 17,4 4,6 2411-25 16,5 5,4 22,7 39,0 16,4 4,6 2411-14 181 5,0 16,4 41,9 18,5 4,6 2411-15 16,7 5,8 23,2 37,9 16,4 4,5 2411-3 17,9 5,5 17,7 41,2 17,8 4,4 i 272 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2411-1 16,3 5,0 19,9 40,4 184 4,4

2411-10 17,6 5,4 20,7 40,2 16,2 4,4

2411-3 17,3 5,7 19,3 40,8 16,9 3,9

2411-28 16,7 5,9 20,1 39,3 18,0 3,7

2411-18 17,3 4,5 16,1 41,4 20,7 3,6

2411-11 18,0 5,0 16,4 44,3 16,3 2,9

2411-19 18,9 5,1 17,2 39,6 19,1 2,4 Í Média 16,5 5,6 22,0 40,3 15,5 5,5

TABELA7S5 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2412 MSE2412 (LS DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2412-13 16,1 5,9 22,9 41,4 13,7 6,8

2412-29 16,2 6,6 23,0 411 13,1 6,6

2412-3 17,0 5,2 19,7 42,7 15,5 6,5

2412-9 16,2 6,2 22,9 41,2 13,5 6,2

2412-25 16,0 6,0 24,7 39,1 14,2 6,2

2412-26 16,6 5,8 21,8 42,0 13,8 6,1

2412-16 16,4 8,0 24,9 37,1 13,5 5,6

2412-23 16,1 6,5 23,3 40,0 14,0 5,5

2412-15 16,7 6,2 22,2 40,2 14,8 5,5

2412-5 16,2 6,7 27,3 36,9 12,9 5,4

2412-10 15,8 71 23,7 39,0 14,4 4,9

24124 17,3 3,2 12,9 44,9 21,8 4,8

2412-21 17,0 5,7 20,6 40,2 16,6 4,7

2412-30 16,6 5,9 22,6 39,8 15,0 47

241220 166 6,9 22,8 39,0 14,7 4,6

2412-28 16,6 5,1 17,1 42,7 18,5 4,6

2412-11 171 TA 24,6 36,5 14,3 4,4

2412-31 117,7 4,4 14,9 43,5 19,5 4,4

2412-24 16,6 6,8 23,7 374 15,4 4,4

2412-8 17,9 5,6 17,2 44,0 15,3 4,4

| o Pe da Pad o a mm. 273 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 24121 17,3 6,0 21,3 40,0 15,3 4,4 2412-7 17,8 6,1 20,8 40,2 15,1 4,3 2412-17 17,8 4,7 17,2 41,8 18,5 43 2412-18 17,4 4,4 15,1 42,9 20,3 4,3 2412-22 181 3,9 13,9 43,5 20,6 3,9 2412-19 17,5 4,9 14,8 42,5 20,3 3,9 2412-12 17,2 6,1 21,9 38,5 16,2 3,8 | 2412-6 17,2 6,0 22,8 38,0 15,9 3,7 2412-27 16,5 4,5 16,5 40,8 21,7 3,6 Média 16,9 5,8 20,6 40,6 16,2 4,9 TABELA 76 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2413 MSE2413 (PRDGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2413-30 14,7 5,2 20,3 47,2 12,5 9,4 2413-15 15,0 6,0 24,5 41,8 12,7 8,3 2413-22 16,2 4,8 17,7 45,7 15,6 77 2413-7 16,2 51 18,8 44,5 15,3 7,5 2413-16 15,7 5,6 22,0 42,5 14,1 7,5 2413-23 15,6 5,8 22,2 41,0 15,3 7,83 2413-111 14,9 6,0 23,5 41,7 14,0 72 2413-31 15,6 8,7 17,9 42,9 14,8 6,1 2413-28 16,6 6,3 23,8 38,2 15,0 61 2413-21 15,8 6,4 20,0 41,5 16,3 6,0 2413-27 15,7 5,7 21,7 41,3 15,7 6,0 | 2413-4 16,4 5,0 18,2 43,5 17,0 5,8 2413-19 16,0 5,4 22,5 40,3 15,8 5,7 2413-18 161 5,7 21,0 40,0 17,2 5,5 2413-14 17,2 4,6 17,6 42,6 18,0 5,5 2413-13 16,7 5,5 19,7 41,5 16,6 5,4 2413-24 16,6 5,9 19,6 41,3 16,5 5,3 2413-25 16,8 4,9 16,4 42,5 19,3 4,9 2413-2 16,6 5,3 19,8 40,8 17,6 4,7 2413-6 16,4 5,3 20,0 40,0 18,2 4,7 | | ee] a) mm

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2413-26 15,8 6,4 22,8 38,5 16,5 4,6 2413-20 16,0 6,4 22,2 38,5 16,8 4,6 2413-29 161 6,1 20,9 38,0 18,9 4,4 2413-17 16,8 5,5 211 38,0 18,5 4,3 2413-10 17,4 4,7 16,9 41,5 19,5 4,1 2413-8 17,2 4,8 16,2 40,9 20,9 3,9 2413-5 16,3 5,2 20,3 38,9 19,4 3,9 2413-3 16,1 5,5 21,8 38,0 18,6 3,8 2413-1 16,7 4,8 18,1 40,3 20,1 3,7 2413-12 16,8 5,0 18,7 39,8 19,8 3,5 2413-9 15,2 6,0 17,3 43,1 18,4 2,6 Média 16,2 5,6 20,1 41,2 16,9 5,5 | TABELA 77. CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2414 | MSE2414 (PR DGAT2cod) | Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2414-12 15,8 4,5 18,9 46,3 14,6 8,7 2414-15 15,7 4,7 19,8 45,6 14,2 8,4 2414-6 14,5 4,5 25,4 40,5 15,1 8,3 2414-31 17,4 5,5 22,5 39,6 15,1 6,9 2414-32 15,2 4,8 26,5 39,2 14,4 6,7 2414-27 14,9 5,4 26,2 39,1 14,4 6,6 2414-8 151 4,9 27,2 38,8 14,0 6,5 2414-14 16,8 5,1 18,7 43,1 16,3 6,3 2414-26 15,5 4,6 24,1 40,2 15,5 6,2 2414-29 14,6 5,9 23,9 38,2 17,4 6,2 2414-9 15,6 4,7 26,9 38,0 14,8 6,1 2414-11 15,1 5,1 26,5 38,3 15,0 6,0 2414-13 14,8 5,8 32,7 34,9 11,8 6,0 2414-16 16,4 5,1 22,4 40,4 15,6 5,9 2414-2 17,0 4,7 23,8 38,4 16,1 5,9 2414-30 15,7 4,9 24,1 40,0 15,2 5,8 2414-20 15,9 5,4 23,9 39,1 15,7 5,8 2414-19 16,3 4,7 20,3 40,6 18,1 5,6 2414-1 16,1 4,8 21,8 40,3 171 5,6

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2414-25 15,8 5,4 221 39,8 16,9 5,4 2414-24 15,6 6,4 24,8 35,7 17,6 5,3 2414-10/ 17,8 5,7 21,9 38,3 16,3 4,9 2414-17/ 166 4,9 22,6 38,8 17,1 4,9 2414-7 17,6 5,0 16,9 40,8 19,7 4,5 2414-18 16,7 5,7 18,7 39,9 19,0 4,4 2414-3 16,4 5,9 22,0 38,7 17,1 4,4 2414-5 16,4 3,9 14,4 42,6 22,7 4,3 2414-23 18,0 5,5 20,2 38,9 17,4 4,2 2414-22 16,3 5,4 21,4 38,1 18,8 4,0 2414-28 17,2 4,4 16,0 41,8 20,6 3,9 2414-21 17,6 5,0 18,0 40,3 19,0 3,7 2414-4 17,4 4,5 15,8 40,7 21,6 3,1 Média 16,2 5,1 22,2 39,8 16,7 5,6 A alteração de motivação/otimização do códon de LS DGAT2 resutou em uma leve diminuição na atividade e a alteração de motivação/otimização de códon de PR DGAT2 não afetou a atividade de forma substancial quando expresso na soja.

Os resultados para pKR1335 (MA DGAT2; SEQ ID NO: 256; Experimento MSE2427), pKR1419 (MA DGAT2codi SEQ ID NO: 372, Experimento MSE2428), pKR1328 (DH DGAT2; SEQ ID NO: 161; Experimento MSE2429) e pKR1420 (DH DGAT2cod; SEQ ID NO: 366; Experimento MSE2430) são mostrados na tabela 78, tabela 79, tabela 80 e tabela 81, respectivamente.

TABELA 78 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2427 MSE2427 (MA DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2427-24 13,8 6,4 30,3 38,6 10,8 9,6 2427-21 13,8 6,3 32,0 36,5 11,2 8,0 2427-5 14,8 5,9 25,2 41,7 12,3 77 2427-30 16,0 5,7 21,7 41,3 15,3 7,6

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2427-3 15,8 6,5 24,1 40,0 13,6 72 2427-17 14,4 6,2 30,1 36,9 12,4 7,0 2427-29 16,6 6,0 19,4 41,3 16,7 6,1 2427-27 16,6 5,8 18,2 42,5 16,9 6,1 2427-25 15,5 7,0 24,2 38,3 15,0 5,9 2427-6 16,8 5,3 188 42,7 16,4 5,6 2427-8 16,1 6,3 19,8 40,8 17,0 5,4 2427-15 16,9 5,8 20,6 39,0 7,7 4,7 2427-13 16,3 5,7 19,9 40,3 17,8 4,7 2427-9 15,5 5,2 21,7 38,5 19,1 4,6 2427-31 15,7 6,2 17,9 41,2 19,1 4,5 2427-4 15,3 5,2 20,4 39,4 19,8 4,5 2427-14 14,1 5,9 18,8 43,9 17,3 4,5 2427-19 15,6 6,2 22,7 37,6 17,9 4,5 2427-2 17,8 5,7 17,5 39,8 19,2 4,5 2427-7 17,0 5,3 17,6 41,6 18,5 4,4 2427-20 16,9 5,5 188 39,2 19,7 4,3 2427-10 16,6 5,2 17,6 40,5 20,2 41 2427-23 17,7 5,2 15,9 40,6 20,7 4,0 2427-111 15,5 5,3 23,4 39,9 15,9 4,0 2427-28 16,7 5,3 16,2 40,1 21,7 3,8 2427-1 16,2 5,4 17,5 40,0 20,9 3,7 2427-16 17,3 5,7 181 39,1 19,8 3,6 2427-26 16,8 5,1 16,7 40,9 20,5 3,4 2427-12 16,9 4,7 13,5 40,4 24,3 3,2 Média 16,0 5,7 20,6 40,1 17,5 5,2 TABELA 79 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2428 MSE2428 (MA DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2428-15 11,2 6,5 35,7 39,4 72 131 2428-25 12,5 5,7 31,0 40,8 10,1 11,8 2428-5 11,9 6,2 34,0 39,2 8,7 1111 2428-20 12,4 6,4 33,4 38,9 8,9 111 2428-27 12,2 6,4 34,6 38,0 8,8 10,4 2428-111 14 71 36,9 36,2 8,4 10,3 2428-21 11,9 6,7 34,0 38,3 9,1 10,0

| 277 | Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2428-17 134 6,0 28,8 41,5 10,4 10,0

2428-22 15,5 5,3 22,2 44,6 124 9,2

2428-3 12,8 6,5 31,8 37,4 11,6 8,5

2428-10 146 67 29,0 37,6 12,2 8,0

2428-12 131 6,6 30,8 39,6 9,8 73

2428-23 13,9 6,1 25,9 40,9 13,2 6,9

2428-29 124 7,3 35,0 35,7 9,6 6,7

2428-11 16,6 5,4 171 43,3 17,6 5,5

2428-30 16,8 8,7 23,0 38,3 131 5,5

2428-2 15,9 6,4 21,4 39,3 17,0 5,0

2428-13 17,2 5,5 16,2 42,4 18,6 4,8

2428-28 16,8 6,0 18,9 41,5 16,7 4,7

2428-31 17,0 5,7 16,4 41,9 19,0 4,3

2428-18 16,4 5,4 19,5 39,5 19,2 4,2

2428-6 16,4 4,8 16,4 41,4 20,9 3,9

2428-8 16,7 5,8 17,0 40,0 20,4 3,9

2428-4 16,6 5,4 16,9 41,9 19,2 3,8

2428-16 17,5 5,0 121 41,0 24,4 38

2428-9 171 5,2 14,8 40,9 21,9 3,8

2428-26 16,5 5,8 17,6 38,3 21,8 3,4

2428-19 168 4,9 13,4 39,8 25,1 3,3

2428-7 14,4 6,2 13,0 43,6 22,9 3,3

2428-24 17,8 5,4 18,7 39,5 18,5 2,8

Média 14,9 6,0 23,9 40,0 15,2 6,7

TABELA 80 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2429 MSE2429 (DH DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2429-30 16,6 5,2 17,9 44,0 16,3 6,7

2429-20 168 4,9 16,8 43,2 18,3 5,6

2429-10 15,9 5,4 19,8 41,8 17,2 5,5

2429-29 17,0 5,7 18,9 411 17,3 5,5

2429-13 16,6 5,1 18,0 42,7 17,7 5,3

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2429-23 16,1 5,5 19,5 411 17,8 5,3

2429-25 161 5,5 19,0 417 17,7 5,2

2429-26 16,1 5,6 18,9 40,9 18,5 5,1

2429-14 16,0 5,3 19,5 411 18,1 4,9

2429-18 15,9 6,4 21,2 39,0 17,4 4,8

2429-27 16,6 5,2 18,9 41,0 18,3 4,7

2429-17 16,9 4,9 171 42,0 19,1 4,7

2429-11 15,2 4,5 17,3 43,6 19,3 4,7

2429-31 16,4 5,7 19,3 40,1 18,5 4,6 2429-7 16,3 5,7 19,6 39,6 18,9 4,2 | 2429-19 165 5,9 20,2 37,6 19,8 4,1

2429-1 163 4,8 15,5 41,3 221 4,0

2429-24 16,9 5,0 171 39,4 21,6 4,0 2429-5167 5,5 19,5 39,8 184 39

2429-8 16,1 6,0 20,3 39,3 18,4 3,9

2429-3 17,2 5,5 18,1 40,2 19,0 3,8

2429-12 16,1 5,1 184 40,2 20,3 3,8

2429-21 16,6 5,2 15,5 40,6 22,1 3,8

2429-6 16,3 5,1 17,6 40,4 20,5 3,6

2429-15 17,2 4,5 12,7 42,6 23,0 3,3

2429-4 15,7 5,5 16,6 40,4 21,8 3,3

2429-28 137 5,6 14,4 44,0 22,3 3,2

2429-16 161 4,6 15,8 39,8 23,6 31

2429-22 14,6 4,8 11,2 43,6 25,7 3,0

2429-2 16,9 4,4 13,6 413 23,8 2,9

2429-9 16,9 5,0 16,6 38,6 22,9 2,7

Média 16,3 5,3 17,6 41,0 19,9 4,3

TABELA 81 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2430 | MSE2430 (DH DGAT2cod) ! Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem | de óleo 2430-11 15,6 5,4 21,4 43,3 14,3 8,3 2430-7 15,7 5,6 21,4 44,0 13,2 8,0 2430-2 15,9 51 20,5 43,9 14,6 7,9 2430-14 16,5 4,7 184 46,2 14,3 78 2430-9 17,0 4,7 21,8 41,3 15,3 6,7 2430-8 16,1 4,9 19,1 45,2 14,7 67 2430-13 16,1 6,4 15,5 44,1 17,8 61 2430-6 16,0 6,2 26,8 37,8 13,3 6,0 2430-100 15,9 5,6 19,9 41,3 17,3 5,8 2430-4 16,4 5,6 18,7 41,9 17,3 5,3 2430-15 17,9 4,7 17,6 41,6 18,2 5,2 2430-20 16,0 5,5 20,4 39,6 18,5 5,1 2430-21 16,7 5,7 19,2 40,8 17,6 5,0 2430-3 16,7 5,5 18,3 42,6 16,9 4,9 2430-26 16,7 5,8 21,9 38,9 16,7 48 2430-27 17,0 5,1 17,6 40,7 19,7 4,7 2430-23 15,0 5,2 17,9 411 20,9 4/7 2430-22 15,8 5,9 21,8 38,9 17,6 4,6 2430-25 16,6 5,9 18,4 40,6 18,4 4,4 2430-16 16,7 4,9 15,8 42,5 20,0 43 2430-5 17,0 5,8 19,9 38,7 18,7 4,3 2430-18 16,8 5,4 18,4 40,2 19,1 4,0 2430-24 16,2 5,1 18,3 40,1 20,4 4,0 2430-1 17,0 5,0 16,9 40,2 21,0 3,6 2430-17 16,1 4,8 16,5 39,2 23,3 3,5 2430-19 17,9 4,7 13,6 39,0 24,9 3,3 2430-12 18,5 5,1 21,0 36,8 18,6 2,9 Média 16,5 5,3 19,1 414,1 17,9 5,3 A alteração de motivo/otimização de códon de MA DGAT22 e DDHH DGAT2 aumentou de forma substancial a atividade quando expressa em soja.

Os resultados para pKR1332 (PA DGAT2; SEQ ID NO: 260; Experimento MSE2431), pKR1421 (PA DGAT2cod; SEQ ID NO: 365; Experimento

MSE2432), pKR1324 (TD DGAT2A; SEQ ID NO: 121; Experimento MSE2433) e pKR1422 (TD DGAT2Acod; SEQ ID NO: 364; Experimento MSE2434) são mostrados na tabela 82, tabela 83, tabela 84 e tabela 85, respectivamente.

TABELA 82 — CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2431 | MSE2431 (PA DGAT2) | Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem | de óleo 2431-28 164 6,2 26,2 38,7 12,5 8,5 2431-21 16,2 4,4 20,4 45,0 14,0 8,0 2431-19 153 4,9 20,3 43,7 15,8 7.9 2431-23 145 6,0 22,8 411 15,6 7,5 2431-22 15,9 7,8 28,1 35,1 13,0 71 2431-6 15,4 6,0 24,2 38,7 15,6 6,8 2431-25 16,8 5,0 22,7 40,5 15,0 6,5 2431-24 16,6 5,6 18,9 42,8 16,1 6,3 2431-7 16,3 4,4 15,8 45,1 18,3 6,1 2431-30 15,6 5,6 22,1 39,8 16,8 5,9 2431-31 16,2 5,1 18,4 41,0 19,3 5,8 2431-111 16,2 5,8 18,9 42,2 16,9 5,7 2431-26 15,7 5,5 22,2 39,5 171 5,7 2431-1 16,6 5,2 19,5 42,2 16,4 5,6 2431-2 15,9 5,1 18,8 411 19,2 5,5 2431-10 15,4 4,7 20,8 411 18,0 5,5 2431-5 15,8 4,7 19,4 411 19,1 5,5 2431-27 — 168 4,9 17,7 42,3 18,2 5,5 2431-9 17,0 5,7 16,7 38,8 21,8 5,0 2431-20 17,0 5,1 18,4 41,8 17,7 4,7 2431-14 17,3 4,4 11,5 45,2 21,5 4,7 2431-17/ 18,0 4,3 13,2 42,6 22,0 4,5 2431-4 16,6 5,4 20,6 38,0 19,4 4,5 2431-15 15,2 5,3 21,3 39,7 18,6 4,4 2431-29 17,2 5,1 18,2 411 18,3 43 2431-18 164 51 21,0 39,8 17,6 43 2431-13 17,4 5,3 19,2 38,0 20,1 43

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2431-12 18,3 4,4 15,5 40,3 21,6 4,2 2431-16 18,0 5,1 16,5 38,9 21,6 4,2 2431-8 15,4 4,8 20,7 39,2 19,9 4,0 2431-3 15,9 5,3 21,7 39,9 17,2 2,9 Média 16,4 5,2 19,7 40,8 17,9 5,5 TABELA 83

| CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2432

MSE2432 (PA DGAT2cod)

| Evento — 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem

| de óleo

| 2432-13 12,3 4,8 37,3 39,6 5,9 20,8

2432-6 13,2 43 29,8 44,0 8,7 17,4 2432-11 12,3 5,2 38,8 37,3 6,3 17,0 2432-16 12,4 5,8 42,9 33,1 5,8 16,0 2432-27 13,8 4,3 36,6 37,2 81 14,1 2432-21 14,1 4,7 26,6 44,3 10,2 13,9 2432-23 15,5 4,2 19,6 50,0 10,6 13,7 2432-5 15,2 4,8 27,3 421 10,5 13,4 2432-8 15,6 4,5 24,5 45,6 9,9 13,3 2432-15 12,2 6,2 44,0 311 6,5 13,2 2432-9 16,7 4,5 21,3 46,2 11,2 12,3 2432-4 15,8 4,4 22,0 46,5 11,4 121 2432-17 15,4 4,6 19,9 48,0 12,2 11,9 2432-12 15,2 4,8 22,7 45,7 11,6 11,3 2432-26 16,3 5,2 21,5 46,5 10,5 111 2432-25 14,0 6,5 30,0 39,9 9,7 11,0 2432-7 15,7 4,8 25,2 43,4 10,9 10,6 2432-3 14,8 5,1 24,7 44,2 11,2 10,4 2432-28 15,0 4,7 23,0 45,7 111,7 10,4 2432-29 15,5 5,4 21,9 45,0 12,3 9,7 2432-10 14,6 5,4 30,2 39,2 10,5 9,6 2432-18 16,2 5,1 21,0 44,0 13,7 84 2432-1 15,6 5,2 18,5 46,3 14,3 7,8 2432-30 15,2 4,5 22,7 43,6 13,9 76

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2432-22 16,4 4,3 15,0 45,6 18,6 72 2432-31 15,9 4,4 17,9 45,4 16,4 71 2432-2 15,7 4,8 22,9 42,4 14,2 71 2432-20 16,0 4,5 28,5 36,6 14,5 6,9 2432-14 15,4 5,1 20,9 41,2 17,5 6,8 2432-19 17,4 4,9 14,7 42,7 20,3 5,3 2432-24 17,2 3,7 11,5 46,7 20,9 5,1 Média 15,1 4,9 25,3 42,9 11,9 11,1 TABELA 84 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2433 MSE2433 (TD DGAT2A) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2433-45 15,7 4,0 20,3 50,4 9,7 16,0 2433-16 15,5 4,5 21,3 49,5 9,3 15,0 2433-19 14,5 4,7 22,8 48,3 9,7 14,9 2433-25 15,2 4,1 20,5 50,3 9,9 14,6 2433-29 13,8 5,1 23,8 47,3 10,1 14,3 2433-21 15,0 4,8 22,1 48,0 10,1 14,0 2433-30 14,1 41 20,4 50,1 11,3 12,8 2433-38 16,0 3,5 16,9 52,2 11,4 12,8 2433-39 14,5 5,7 22,8 46,5 10,5 12,7 2433-42 14,6 5,4 23,2 46,2 10,5 11,8 2433-34 14,0 4,6 20,3 49,3 11,8 111,7 2433-26 13,8 5,1 21,6 48,1 11,4 11,6 2433-5 14,2 5,9 24,8 44,3 10,8 11,3 2433-11 15,5 5,0 21,6 46,8 11,2 10,9 2433-1 15,3 4,9 21,9 46,7 11,2 10,9 2433-15 14,0 6,3 26,6 42,3 10,8 10,6 2433-13 14,7 5,5 23,4 44,1 12,2 10,2 2433-3 15,2 5,2 23,4 45,1 1111 10,1 2433-6 15,1 5,6 23,2 44,2 12,0 10,1 2433-24 161 4,3 19,0 47,1 13,5 9,6 2433-23 15,9 4,0 18,0 47,7 14,4 9,6 be

| Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2433-43 14,9 5,5 22,5 44,7 12,5 9,5 2433-2 16,3 4,4 171 48,0 14,2 9,3 2433-4 14,2 61 23,4 44,0 12,4 9,0 2433-17 15,5 5,2 21,4 44,4 13,4 8,8 2433-7 15,8 4,8 18,7 46,7 14,0 8,8 2433-10 15,7 5,6 231 42,9 12,7 8,2 2433-14 16,4 4,8 18,9 46,0 13,9 8,1 2433-8 16,3 5,3 19,4 44,5 14,4 78 2433-12 16,0 6,3 223 42,6 12,8 71 2433-9 17,4 4,3 15,0 44,7 18,5 5,3 Média 15,2 5,0 21,3 46,5 12,0 10,9 TABELA 85 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2434 MSE2434 (TD DGAT2Acod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2434-3 14,9 4,6 26,4 43,7 10,4 12,7 2434-12 15,0 51 22,3 45,5 121 11,1 2434-7 14,8 5,3 26,6 411 12,3 10,9 2434-20 13,9 6,2 23,8 43,9 12,3 10,3 2434-6 15,2 3,8 18,7 46,5 15,9 9,6 2434-16 147 5,0 22,6 44,0 13,8 96 2434-5 15,5 5,1 22,3 43,9 13,2 9,5 2434-24 14,8 6,4 25,9 40,9 121 9,4 2434-15 15,4 5,6 221 43,5 13,4 9,0 2434-9 13,4 4,3 18,3 47,0 17,0 8,8 2434-18 15,3 5,6 24,5 41,0 13,6 8,7 2434-13 15,7 5,0 18,5 46,9 13,8 8,6 2434-14 15,4 5,2 19,7 44,7 15,1 8,6 2434-10 14,7 6,8 24,3 39,5 14,8 8,5 2434-1 15,2 5,0 19,4 44,4 16,0 8,4 2434-28 14,5 6,1 24,8 40,9 13,6 8,2 2434-11 14,0 6,6 27,6 38,8 13,0 8,2 2434-8 15,4 5,7 22,0 42,4 14,4 8,0

À 284 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2434-23 15,6 4,8 19,3 44,6 15,7 7,9 2434-27 15,4 5,2 23,4 40,9 15,1 78 2434-17 157 5,6 24,5 39,4 14,8 7,5 2434-25 15,5 5,0 20,6 41,4 17,4 7,0 2434-2 15,5 4,8 18,9 44,1 16,7 6,9 2434-4 16,7 4,3 18,3 46,3 14,5 6,8 2434-21 15,9 4,0 15,9 45,4 19,0 6,8 2434-31 15,5 4,5 19,4 421 186 67 2434-29 16,3 4,4 18,5 43,7 17,1 6,5 2434-26 16,1 5,1 18,7 40,1 20,0 5,9 2434-30 16,8 4,8 17,2 42,4 18,8 5,8 2434-22 16,7 41 15,1 46,0 181 5,7 2434-19 16,1 8,1 23,5 38,2 14,1 5,7 Média 15,3 5,2 21,4 43,0 15,1 8,2 A alteração de motivo/otimização de códon de PA DGAT2 resultou em um grande aumento na atividade e a alteração de motivo/otimização de códon de TD DGAT2A diminuiu a atividade quando expressa em soja. Os resultados para pKR1333 (RG DGAT2; SEQ ID NO: 266; Experimento MSE2447) e pKR1423 (RG DGAT2cod; SEQ ID NO: 371; Experimento MSE2448) são mostrados na tabela 86 e tabela 87, respectivamente. TABELA 86

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2447 MSE2447 (RG DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2447-27 16,8 6,3 31,2 34,2 11,5 6,4 2447-18 16,4 4,3 22,2 414 15,7 6,1 2447-17 16,8 5,9 27,5 35,6 14,2 5,7 á 285 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2447-28 171 4,8 24,0 38,2 15,9 5,3 2447-100 17,5 5,9 25,8 37,2 13,7 5,2 2447-13 16,6 5,1 23,1 38,3 16,9 5,2 2447-7 17,2 4,9 211 39,4 17,3 4,9 2447-11 16,7 5,2 21,9 39,0 17,2 4,8 2447-21 14,2 5,6 21,0 40,3 18,9 4,6 2447-24 17,6 5,2 22,9 37,7 16,6 4,6 2447-6 16,8 5,0 17,0 41,3 19,9 4,4 2447-14/ 17,2 4,4 16,3 40,1 22,0 4,4 2447-25 17,2 5,2 19,6 39,7 184 4,4 2447-9 16,9 4,4 20,8 38,8 19,1 4,3 2447-8 16,7 5,4 24,4 36,1 17,4 4,2 2447-26 17,1 4,4 17,0 40,0 214 41 2447-23 16,5 5,1 22,0 39,1 17,4 4,0 2447-16 16,4 4,8 20,4 38,1 20,2 3,9 2447-19 16,7 4,6 19,3 39,2 20,3 3,9 2447-30 17,3 4,6 15,3 39,3 23,5 3,8 2447-4 16,3 5,0 22,2 36,6 19,8 3,7 2447-3 17,3 4,5 18,0 39,1 211 3,6 2447-22 18,0 4,4 13,2 421 22,3 3,5 2447-15 19,5 5,2 21,8 32,8 20,6 3,3 2447-200 17,9 5,0 15,6 40,0 21,6 31 2447-31 17,5 4,7 16,2 39,8 21,9 3,0 2447-122. 174 4,9 15,9 38,9 22,8 2,7 Média 17,0 5,0 20,6 38,6 18,8 4,3 TABELA 87 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2448 MSE2448 (RG DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2448-6 16,0 6,1 31,7 33,5 12,7 6,7 2448-4 16,7 5,3 26,6 37,6 13,8 6,5 2448-5 16,1 5,2 28,2 36,7 13,8 6,0 2448-22 16,5 5,4 25,6 35,9 16,5 5,4 2448-17 15,8 5,9 29,4 35,1 13,9 5,2 2448-20 16,3 5,7 27,A 35,2 15,4 5,2

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2448-16 17,4 4,6 17,9 42,8 17,3 5,0 2448-28 16,6 4,2 19,1 40,6 19,4 4,7 2448-13 17,2 4,9 24,1 37,1 16,7 47 2448-30 17,7 3,6 14,2 43,3 21,2 4,2 2448-2 17,3 5,2 21,9 38,0 17,6 3,9 2448-24 16,8 4,3 16,0 38,9 23,9 3,7 2448-11 17,8 4,7 14,2 40,8 22,5 36 2448-18 16,3 4,3 13,3 39,8 26,3 36 2448-29 17,1 4,9 19,1 37,8 211 3,5 2448-12 17,1 5,2 15,0 40,7 22,0 3,5 2448-3 16,3 4,5 14,8 39,1 25,3 3,5 2448-9 17,0 4,8 17,8 38,2 22,3 3,4 2448-25 17,9 4,1 17,1 40,2 20,6 3,3 2448-23 16,9 4,2 15,5 40,8 22,6 3,2 2448-14 16,8 60 17,4 38,3 21,5 3,0 2448-7 17,1 4,4 14,2 411 23,2 3,0 2448-19 16,7 4,0 13,5 42,5 23,3 2,9 2448-21 16,6 3,8 13,5 39,9 26,2 2,8 2448-1 16,8 4,5 16,5 38,4 23,8 2,2 2448-15 17,4 4,7 184 39,8 19,7 2,2 Média 16,9 4,8 19,3 38,9 20,1 4,0 A alteração de motivo/otimização de códon de RG DGAT2 não afetou de forma substancial a atividade quando expressa em soja.

Os resultados para pKR1375 (LS DGAT1; SEQ ID NO: 300; Experimento MSE2510), pKR1514 (LS DGAT1Icod; SEQ ID NO: 374; Experimento MSE2511),) pKR1334 (MA DGAT1; SEQ ID NO: 280; Experimento MSE2512) e pKR1419 (MA DGAT2cod; SEQ ID NO: 372; Experimento MSE2513) são mostrados na tabela 88, tabela 89, tabela 90 e tabela 91, respectivamente.

TABELA 88 — CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2510 MSE2510 (LS DGAT1)

i 287 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2510-14 15,1 6,4 30,1 38,4 10,0 9,8 2510-27 15,3 6,1 27,3 39,8 11,6 9,0 2510-13 15,6 6,8 27,7 37,7 121 84

2510-25 18,5 6,6 24,7 37,0 131 8,0

| 2510-11 15,9 6,5 27,2 36,8 13,6 71 2510-4 16,3 5,3 25,3 37,5 15,6 71 2510-23 16,2 5,9 23,9 38,9 15,1 6,4 2510-2 16,5 5,9 21,2 39,8 16,5 6,3 2510-15 17,0 5,5 19,0 43,3 15,2 6,2 2510-6 18,7 5,6 22,7 39,1 13,9 6,0 2510-19 15,5 6,0 22,0 40,2 16,3 5,9 2510-22 16,6 6,8 19,4 41,5 15,6 5,9 2510-9 16,5 5,6 21,3 39,8 16,8 5,9 2510-28 16,7 5,6 20,0 40,6 17,0 5,7 2510-20 17,0 5,8 20,9 41,0 15,3 5,6

| 2510-8 16,9 5,9 20,3 40,6 16,3 5,2

| 251012 97,1 5,7 20,7 38,9 17,6 5,2 2510-24 16,9 6,5 24,0 37,8 14,7 5,2 2510-16 17,0 6,2 22,5 37,4 16,9 4,9 2510-31 16,9 5,9 19,9 40,1 17,3 4,8 2510-17 17,4 5,3 20,8 38,6 17,9 4,5 2510-21 16,8 5,1 18,0 40,9 19,2 4,4 2510-118 17,5 5,1 17,9 39,8 19,7 4,3 2510-10 16,2 4,8 17,0 42,8 19,2 4,2 2510-30 17,3 4,9 16,5 41,3 19,9 4,2 2510-26 17,7 5,2 20,4 38,2 18,5 41 2510-5 17,8 4,4 13,9 41,7 221 3,9 2510-1 16,8 4,8 17,2 40,1 21,2 3,9 2510-7 17,4 5,6 18,2 39,6 19,3 3,5 2510-3 18,2 4,5 14,1 40,7 22,5 31 2510-29 171 4,3 13,2 40,3 25,1 2,5 Média 16,8 5,6 20,9 39,7 16,9 5,5

TABELA 89 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2511 MSE2511 (LS DGAT1cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2511-19 14,6 6,8 31,3 38,6 8,7 12,2 2511-18 16,0 8,2 30,7 36,7 8,4 11,9 2511-29 15,0 6,4 29,1 37,9 11,6 9,2 2511-6 15,9 5,7 24,8 40,8 12,6 8,0 2511-8 17,6 65 25,3 38,6 12,0 7,9 2511-21 17,1 4,7 16,6 45,9 15,6 7,0 2511-2 15,9 6,5 24,5 39,0 14,1 6,9 2511-27 16,9 5,9 22,1 39,9 15,2 6,5 2511-12 15,8 6,5 22,9 39,0 15,7 6,4 2511-23 15,7 6,8 29,6 36,6 11,3 6,4 2511-20 16,8 6,0 20,5 40,4 16,3 6,3 2511-5 15,8 5,8 24,7 37,7 16,0 6,1 2511-30 16,5 6,7 23,8 39,3 13,6 5,6 2511-13 17,3 5,4 20,1 39,4 17,8 5,4 25114 16,9 6,1 21,7 39,3 15,9 5,2 2511-15 16,9 5,4 20,6 40,2 17,0 5,0 2511-10 16,9 5,5 20,9 39,1 17,7 4,9 2511-25 17,2 5,9 20,7 38,1 18,1 4,8 2511-3 16,7 5,7 19,6 40,5 17,5 4,8 2511-17 17,3 5,2 19,1 40,0 18,3 4,7 2511-7 17,3 5,4 19,7 40,7 16,8 4,5 2511-14 17,2 5,9 19,2 40,4 17,3 4,3 2511-26 17,6 5,3 17,2 39,6 20,3 4,2 2511-9 17,5 5,3 17,8 40,3 19,0 41 2511-22 17,2 6,7 23,6 36,8 15,7 3,7 2511-16 17,3 5,5 16,0 411 20,0 3,7 2511-24 17,3 5,3 17,2 40,3 20,0 3,7 2511-28 17,4 4,9 14,3 43,5 20,0 3,7 25111 171 5,4 18,6 40,2 18,7 3,6 2511-31 15,9 4,8 15,4 39,8 24,1 2,9 2511-11 16,7 4,2 14,1 41,7 23,4 2,9 Média 16,7 5,8 21,3 39,7 16,4 5,7

TABELA 90 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2512 MSE2512 (MA DGAT1) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2512-27 1111 6,2 42,7 34,0 6,1 13,6 2512-5 12,0 6,6 35,4 37,9 8,1 13,5 2512-2 12,9 8,2 35,3 36,5 71 12,4 2512-24 12,7 6,6 35,5 37,2 8,0 11,6 2512-14 13,5 6,2 32,4 38,4 9,6 11,3 25121 14,6 6,5 30,8 38,4 9,6 11,0 2512-4 13,0 72 37,2 34,5 8,1 11,0 2512-15 13,5 5,7 32,5 37,7 10,6 10,2 2512-8 12,6 6,2 36,7 36,0 8,5 10,1 2512-25 13,8 5,9 31,1 37,5 11,7 8,9 2512-3 16,1 5,7 24,7 39,2 14,3 6,6 2512-9 16,2 5,9 20,3 42,0 15,6 6,5 2512-19 16,4 5,9 23,1 39,5 15,2 6,1 2512-7 16,5 6,4 23,1 38,7 15,3 6,0 2512-11 16,1 5,5 21,5 40,0 16,9 5,9 2512-18 16,3 5,9 20,1 41,3 16,4 5,6 2512-30 17,4 4,8 16,7 42,7 184 5,4 2512-10 17,0 5,2 18,1 42,0 17,6 5,4 2512-21 17,0 5,2 18,1 41,9 17,9 5,3 2512-13 17,0 4,5 18,2 40,6 19,7 5,1 2512-31 16,7 5,2 19,4 41,3 17,4 4,9 2512-12 17,8 4,6 17,7 43,2 16,6 4,8 2512-26 17,7 4,8 16,9 42,4 18,3 4,8 2512-22 17,3 4,4 15,2 40,9 221 4,6 2512-17 16,9 5,4 18,1 39,5 20,1 4,5 2512-200 17,2 5,5 20,1 38,5 18,8 4,0 2512-16 16,4 4,5 17,5 40,3 21,2 4,0 2512-29 16,8 4,4 15,5 40,4 22,8 3,8 2512-23 17,9 5,1 15,5 40,6 20,9 3,1 2512-28 17,3 6,1 20,4 38,8 17,3 2,6 Média 15,6 5,7 24,3 39,4 15,0 7 o | 290 TABELA 91

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2513

MSE22513 (MA DGAT1cod)

| Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2513-18 11,9 6,2 36,9 38,8 6,2 17,6 2513-14 10,5 6,9 40,7 35,9 6,0 16,7 2513-12 11,2 7,3 41,4 34,3 5,8 15,0 2513-22 11,0 5,0 38,8 37,7 75 14,7

2513-31 12,2 6,4 36,2 37,8 TA 13,5 2513-20 11,7 6,4 36,4 38,3 73 13,1 2513-19 12,6 5,1 33,6 39,4 9,2 13,0

2513-5 12,7 6,6 34,9 37,4 8,3 12,2

2513-13 14,7 6,2 30,6 37,8 10,6 10,0 2513-25 15,3 6,9 28,6 37,3 12,0 9,4 2513-30 14,8 76 29,6 36,1 11,9 8,7 2513-15 13,0 5,6 35,3 36,0 10,1 8,4 2513-11 15,2 73 28,5 37,6 11,4 8,2 2513-29 15,3 5,7 22,6 42,4 13,9 TA

2513-2 16,6 6,1 21,7 41,7 13,9 71

' 2513-7 16,1 7A 28,0 35,9 12,6 7,0

| 2513-24 15,4 5,8 25,0 39,3 14,5 6,7

2513-8 16,9 4,6 21,3 42,5 14,7 6,6

2513-23 15,7 6,7 27,7 36,3 13,6 6,5

| 2513-6 16,6 6,4 23,5 38,6 14,9 6,3

2513-3 16,6 7,6 25,6 37,2 131 6,1

2513-27 16,7 6,1 21,2 40,5 15,4 5,8 2513-16 15,5 5,9 19,2 43,5 15,9 5,7 2513-17 17,0 5,7 20,6 39,6 17,2 5,5 2513-28 17,3 5,5 20,4 40,2 16,6 5,4 2513-21 15,7 6,9 23,6 35,4 18,3 5,1 2513-4 16,4 5,0 20,3 41,8 16,5 5,0 2513-26 17,7 5,6 19,9 411 15,7 4,9 2513-9 17,6 4,9 16,1 44,2 17,2 4,9 2513-1 19,0 6,0 19,8 38,4 16,9 4,6 2513-10 16,4 5,2 21,8 38,1 18,6 4,0

| . Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo Média — 15,0 6,1 27,4 38,7 12,7 8,5 A otimização de códon de LS DGAT1 e MA DGAT1 aumentou de forma substancial a atividade quando expressa em soja.

Os resultados para pKR1392 (CZ DGAT2; SEQ ID NO: 355; Experimento MSE2520), pKR1512 (CZ DGAT2cod; SEQ ID NO: 367; Experimento MSE2521), pKR1409 (MC DGAT2; SEQ |D NO: 360; Experimento MSE2522) e pKR1513 (MC DGAT2cod; SEQ ID NO: 369; Experimento MSE2523) são mostrados na tabela 92, tabela 93, tabela 94 e tabela 95, respectivamente.

TABELA 92 — CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2520 MSE2520 (CZ DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2520-19 15,4 5,6 20,5 44,7 13,8 8,7 2520-4 164 5,5 20,7 40,0 17,4 5,5 2520-18 16,4 5,2 21,3 38,5 18,7 4,5 2520-23 17,2 5,7 18,8 39,8 18,5 4,4 2520-288 16,9 6,6 22,3 37,6 16,6 4,4 2520-10 17,3 5,2 20,1 39,1 18,2 4,2 2520-8 17,4 6,1 218 37,5 17,2 4,2 2520-13 18,0 6,0 20,0 38,4 17,5 4,2 2520-17 17,8 6,6 21,9 37,4 16,3 41 2520-14 17,2 6,6 24,9 34,4 16,9 41 2520-22 17,1 6,5 213 37,5 17,6 4,0 2520-255 162 5,3 21,9 37,2 19,4 4,0 2520-27 17,0 783 22,3 36,7 16,7 4,0 2520-3 16,9 4,3 16,3 41,0 21,6 3,9 2520-29 16,6 5,6 19,6 38,3 20,0 3,8 2520-9 17,0 5,4 20,7 38,0 18,9 3,8 2520-16 16,5 4,8 18,9 39,7 20,1 38 2520-24 16,7 5,8 21,3 37,8 18,4 3,7

| | Evento 16:0 18:0 181 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2520-12 17,0 5,3 17,7 40,1 19,9 3,6 2520-7 18,2 5,2 15,8 41,3 19,4 3,6 2520-5 16,5 5,8 20,9 37,6 19,2 3,5 | 2520-15 17,2 4,7 15,0 39,8 23,3 33 | | 2520-6 17,4 6,6 20,0 38,7 17,4 3,3 2520-21 17,2 5,3 17,4 39,3 20,9 3,3 2520-26 16,1 5,2 18,0 38,5 22,2 3,3 2520-20 16,7 5,9 17,4 38,9 211 3,3 2520-11 16,4 4,9 164 39,2 23,0 3,0 2520-30 17,6 5,9 20,1 38,0 18,4 3,0 2520-2 16,9 5,2 17,2 39,2 21,5 2,8 2520-1 20,9 4,5 15,1 38,2 21,3 28 Média 17,1 5,6 19,5 38,7 19,0 3,9 TABELA 93 RAZÕES E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2521 MSE2521 (CZ DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2521-9 16,5 6,5 21,2 41,2 14,6 6,9 2521-19 16,2 6,8 23,0 38,5 15,5 5,8 2521-23 17,3 6,1 23,9 37,5 15,2 5,7 2521-30 17,0 6,0 21,2 38,3 17,5 5,6 2521-14 16,3 6,7 24,7 37,3 14,9 5,5 2521-20 166 6,1 24,0 38,1 15,2 5,5 2521-13 15,9 6,0 22,5 39,4 16,1 5,5 2521-10 16,4 5,7 23,7 39,0 15,3 5,5 2521-29 17,1 5,9 211 39,3 16,6 5,2 2521-3 16,7 5,5 19,9 40,2 117,7 5,0 2521-26 16,4 6,7 22,4 38,5 16,0 4,9 2521-31 17,2 6,1 19,9 38,9 17,9 4,8 2521-24 16,7 5,8 21,0 38,8 17,7 4,8 2521-6 171 5,4 214 37,8 18,3 4,7 2521-12 164 5,6 23,0 37,7 17,3 47 2521-5 16,7 6,4 23,3 37,2 16,4 4,5

| PD a 293 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2521-11 16,9 5,6 20,0 38,5 19,1 4,4 2521-2 17,1 5,7 20,2 39,8 17,3 4,4 2521-8 18,1 6,0 20,3 38,0 17,6 4,2 2521-16 17,7 5,2 19,1 38,9 19,0 41 2521-1 17,8 6,4 221 36,0 17,7 4,0 2521-21 17,1 4,8 17,9 39,7 20,4 3,8 2521-17 17,7 5,0 19,2 38,8 19,4 3,8 2521-28 16,0 4,6 18,9 40,3 20,2 3,5 2521-27 17,0 5,0 7,7 38,7 21,6 3,5 2521-22 17,5 4,6 17,1 39,7 21,2 3,3 2521-25 17,3 4,9 17,4 38,7 21,7 3,0 2521-7 17,6 4,7 147 39,7 23,3 3,0 2521-18 17,4 4,8 184 38,1 21,3 2,9 . 2521-4 17,1 4,9 16,4 38,6 23,1 2,8 2521-15' 20,5 4,5 12,8 37,4 24,8 2,4 Média 17,1 5,6 20,3 38,7 18,4 4,4 TABELA 94 RAZÕES E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2522 MSE2522 (MC DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2522-2 15,1 5,1 20,2 44,4 15,1 8,6 2522-28 14,9 67 25,1 38,1 15,1 6,3 2522-5 14,4 5,1 19,1 41,7 19,7 5,7 2522-19 15,8 77 28,2 35,0 13,3 5,6 2522-21 16,4 72 21,9 37,8 16,7 5,2 2522-23 17,0 4,8 19,7 41,0 17,4 5,2 2522-6 15,9 5,8 20,0 40,4 17,8 5,2 2522-1 17,3 6,4 19,3 36,6 20,5 4,8 2522-17 15,0 5,4 19,0 42,1 18,6 4,7 2522-18 16,0 5,3 18,0 39,6 21,0 4,7 2522-111 15,0 5,3 19,0 40,4 20,3 4,6 2522-12 15,5 4,9 161 40,8 22,8 4,5 2522-8 16,7 8,5 21,6 37,8 15,5 4,4

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2522-16 148 6,5 21,6 38,2 189 4,4 2522-22 16,6 5,9 20,4 38,4 188 4,2 2522-9 15,9 71 19,2 40,0 17,8 4,2 2522-29 14,6 4,7 16,8 41,0 22,8 4,0 2522-26 16,9 4,2 14,7 42,2 221 4,0 2522-14 13,4 3,9 13,6 40,6 28,5 3,9 2522-30 16,0 4,8 20,3 36,7 22,2 3,9 2522-15 15,3 5,4 16,7 39,7 22,9 3,7 2522-10 141 4,1 13,9 40,6 27,3 3,7 2522-4 15,9 4,4 14,6 43,3 21,8 3,5 2522-25 15,7 6,1 22,0 36,2 20,1 3,5 2522-27 16,2 5,2 14,4 42,1 221 3,5 | 2522-3 16,4 7,2 20,7 39,9 15,8 3,5 2522-31 15,9 5,7 19,8 39,1 19,5 3,4 2522-13 15,2 5,5 15,1 39,5 24,7 3,2 2522-24 17,7 6,2 21,2 38,1 16,7 3,2 2522-20 15,4 5,3 15,5 39,6 24,3 2,9 2522-7 17,2 3,6 9,8 41,9 27,5 2,8 Média 15,7 5,6 18,6 39,8 20,2 4,4 TABELA 95 | CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2523 | MSE2523 (MC DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 181 18:2 18:3 Porcentagem | de óleo 2523-1 14,7 5,8 24,2 42,7 12,7 8,0 2523-5 15,4 5,7 27,2 39,9 11,9 8,0 2523-25 16,0 5,5 23,7 40,3 14,5 6,5 2523-18 16,4 5,9 231 39,3 15,3 6,0 2523-20 15,8 5,8 247 39,0 14,7 6,0 2523-19 17,2 5,8 237 37,6 15,7 5,5 2523-2 16,8 6,2 22,1 38,7 16,2 5,3 2523-23 164 5,4 24,3 38,6 15,3 5,2 2523-16 17,0 5,7 22,5 38,5 16,4 5,1 fá 295 Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2523-17 16,8 5,5 23,4 37,7 16,7 5,1 2523-7 17,4 5,4 17,6 43,7 15,9 51 2523-22 17,0 5,6 217 38,8 17,0 4,7 2523-4 16,5 7,0 19,6 40,1 16,8 4,6 2523-29 17,3 5,4 20,5 39,0 17,7 4,5 2523-6 17,2 5,9 23,3 37,6 16,0 4,5 2523-27 17,2 5,2 20,1 41,3 16,2 4,5 2523-28 16,8 5,3 214 38,8 17,7 4,5 2523-13 171 5,4 19,6 39,6 18,3 4,4 2523-14 17,2 5,2 21,0 37,9 18,7 41 2523-21 16,4 5,4 18,9 39,7 19,6 3,9 2523-30 16,8 5,6 16,7 40,0 21,0 3,8 2523-15 17,6 4,8 17,1 40,2 20,3 3,8 | 2523-8 17,2 5,5 17,5 41,6 18,2 3,7 2523-10 17,8 5,0 18,5 38,8 19,9 3,5 2523-3 17,3 4,7 17,2 39,2 21,5 3,5 2523-12 17,8 4,6 15,2 38,5 23,8 3,0 2523-9 16,6 43 15,0 39,8 24,2 2,9 2523-26 17,4 5,8 19,6 38,7 18,5 2,5 Média 16,8 5,5 20,7 39,5 17,5 4,7 A otimização de códon de CZ DGAT2 e MC DGAT2 aumentou levemente a atividade quando expressa em soja.

Os resultados para pKR1427 (CC DGAT2; SEQ ID NO: 361; Experimento MSE2525) e pKR1522 (CC DGAT2cod; SEQ ID NO: 373; Experimento MSE2526) são mostrados na tabela 96 e tabela 97,

' 296 respectivamente. TABELA 96

CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDOS GRAXOS PARA EVENTOS DE MSE2525 MSE2525 (CC DGAT2) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2525-20 161 5,6 19,2 44,2 14,9 77 | 2525-2 16,6 6,1 20,6 42,2 14,4 6,2 2525-8 16,5 5,6 217 41,3 15,0 5,9 2525-10 16,6 6,9 26,5 35,8 14,3 5,9 2525-13 17,2 5,0 17,7 42,3 17,8 5,2 2525-21 17,2 6,7 24,2 35,9 16,1 51 2525-26 16,7 6,6 23,8 38,1 14,8 5,0 2525-14 16,6 6,1 21,3 38,8 17,2 4,9 2525-27 17,3 6,4 23,0 37,6 15,7 4,7 2525-30 18,0 4,8 15,2 42,5 19,4 4,7 2525-25 16,7 4,9 18,7 39,7 20,1 4,5 2525-7 17,6 5,7 22,5 37,5 16,8 4,4 2525-4 17,4 5,5 19,2 41,0 16,9 4,4 2525-22 19,4 4,9 184 38,0 19,3 4,4 2525-18 17,5 5,9 21,2 37,5 17,9 4,4 2525-3 17,6 4,8 17,5 37,7 22,3 41 2525-11 15,8 5,1 20,6 42,0 16,6 4,0 2525-29 18,4 4,9 16,0 42,6 181 3,9 2525-9 17,5 5,3 18,6 40,0 18,6 3,9 2525-19 16,7 5,6 20,4 38,3 19,0 3,9 2525-6 17,5 5,4 19,7 38,0 19,4 3,8 2525-24 17,3 5,3 18,7 39,7 19,1 3,7

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2525-16 17,4 4,6 15,7 41,3 211 3,7

2525-15 16,8 4,5 16,9 39,4 22,4 3,6

2525-1 17,6 5,5 18,8 40,9 17,1 3,6

2525-5 16,2 4,9 17,1 40,5 21,2 3,4

2525-17 18,7 51 15,9 38,0 22,4 2,5 : Média 17,2 5,5 19,6 39,7 18,1 4,5

TABELA 97 CONCENTRAÇÕES DE ÓLEO E PERFIS DE ÁCIDO GRAXO PARA EVENTOS DE MSE2526 MSE2526 (CC DGAT2cod) Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo

2526-29 15,7 6,6 26,0 38,3 13,4 75

2526-28 15,3 5,8 28,9 36,9 13,2 7,0

2526-10 17,1 6,1 21,5 40,5 14,7 6,7

2526-5 15,5 5,8 27,8 36,6 14,3 6,6

2526-14 16,4 6,7 25,1 36,9 14,9 6,1

2526-22 17,1 5,7 20,9 40,7 15,5 6,1

2526-2 16,8 7,4 23,1 38,0 14,7 6,0

2526-6 16,7 6,6 25,0 38,0 13,7 5,8

2526-17 17,2 5,4 20,3 38,9 18,2 5,4

2526-7 17,2 5,4 19,8 40,5 17,0 5,3

2526-3 17,9 6,4 23,2 36,2 16,3 5,3

2526-23 17,0 7,0 24,2 36,4 15,4 5,2

2526-20 16,1 5,1 23,4 38,1 17,3 5,2

2526-9 17,1 6,7 24,8 35,6 15,9 5,2

2526-27 17,6 5,7 20,5 38,3 17,9 4,9

2526-26 17,1 6,9 24,7 37,4 13,9 4,8

2526-8 16,8 5,6 24,1 37,3 16,2 4,8

2526-19 15,6 6,1 25,4 36,1 168 . 48

2526-12 19,9 6,1 21,5 34,1 184 4,7

2526-21 18,2 5,9 18,6 39,2 18,2 4,6

2526-168 17,8 5,0 16,3 40,4 20,5 4,3

2526-11 17,1 6,8 23,2 36,3 16,7 4,3

Evento 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 Porcentagem de óleo 2526-1 17,4 5,9 20,2 38,5 18,0 4,0 2526-4 17,1 7,0 25,6 34,9 15,3 3,7 | 2526-24 17,8 4,7 13,0 44,3 20,1 3,3 2526-15 17,9 5,0 16,8 39,3 20,9 3,3 2526-18 17,7 5,2 16,0 39,2 21,9 3,2 Média 17,1 6,0 22,2 38,0 16,6 5,1 A otimização de códon de CC DGAT2 aumentou levemente a atividade quando expressa em soja.

Um resumo para expressão de todos os DGATs de tipo selvagem e otimizados por códon e/ou com motivo alterado em embriões somáticos de —sojaem relação ao tipo selvagem YL DGAT2 é mostrado na Figura 10. Uma versão de TD DGAT2b com motivo alterado/ otimizado por códon não foi testada como importante por ND na Figura 10. Na Figura 10, cada gene de tipo selvagem foi testado como um conjunto de experimentos juntamente com YL DGAT2 como controle e uma atividade de porcentagem em relação ao YL DGAT?2 foi determinada.

Nisto, os 5 primeiros eventos tendo concentrações mais altas de óleo a partir de cada experimento tiveram primeiro média calculada e, então, foram normalizados em relação à média dos 5 primeiros eventos do YL DGAT?2 de tipo selvagem neste experimento (média do teor de óleo dos 5 primeiros eventos para um dado DGAT / média do teor de óleo dos 5 primeiros eventos para YL DGAT?2 (neste conjunto experimental) x 100%). Para genes com alteração de motivos/ otimização de códon, um fator de atividade relativa foi determinado para atividades relacionadas ao tipo selvagem otimizadas por códon neste experimento.

Para isto, os 5 primeiros eventos que têm as concentrações mais altas de óleo primeiro tiveram sua média calculada e, então, foram normalizados em relação à média dos 5 primeiros eventos para o gene de tipo selvagem neste conjunto experimental (média do teor de óleo dos 5 primeiros eventos para DGAT otimizado por códon e/ou de motivo alterado / média do teor de óleo dos 5 primeiros eventos para o DGAT de tipo selvagem).

Í 299

O fator de atividade relativo otimizado por códon/com motivo alterado foi, então, multiplicado pela atividade de porcentagem do gene específico em relação ao YL DGAT?2 a fim de normalizar a atividade otimizada por códon/com motivo alterado para YL DGAT2 (% de atividade em relação a YL DGAT?2 x fator de atividade relativo otimizado por códon). Na Figura 10, para cada gene DGAT, a porcentagem de atividade em relação ao YL DGAT?2 (barra preta sólida) para tipo selvagem é mostrada primeiro (barras quadriculadas) seguida da atividade de porcentagem relativa para otimizados por códon e/ou com motivo alterado (barras brancas ou pontilhadas). As atividades relativas para construções

DGATI1 são mostradas nos três últimos conjuntos da Figura 10.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de nucleotideos que codifica um —polipeptideo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que o polipeptídeo tem pelo menos 80% de identidade de aminoácidos, com base no método Clustal V de alinhamento, quando comparado a uma sequência de aminoácidos conforme descrita nas SEQ ID NO: 135, 136, 147, 162, 176, 215, | 234, 265, 272, 279, 299, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 351 ou363; | (b) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 80% de identidade de sequência, com base no método BLASTN de alinhamento, quando comparada a uma sequência de nucleotídeos conforme descrita nas SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 278, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350 ou 352; (c) uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de diacilglicerol aciltransferase, em que a sequência de nucleotídeos se hibridiza, sob condições estringentes, a uma sequência de nucleotídeos conforme descrita nas SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 278, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 350 ou 352; ou (d) um complemento da sequência de nucleotídeos de (a), (b) —ou(c), em que o complemento e a sequência de nucleotídeos consistem no mesmo número de nucleotídeos e são 100% complementares.

   2. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo têm pelo menos 85% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, quando comparada às SEQ ID NO: 135, 136, 147, 162, 176, 215, 234, 265, 272, 279, 299, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 351 ou 363.

   3. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo tem pelo menos 90% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, quando comparada às SEQ ID NO: 135, 136, 147, 162, 176, 215, 234, 265, 272, 279, 299, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318,320,322,351 ou 363.

   4. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo tem pelo menos 95% de identidade de sequência, com base no método Clustal V de alinhamento, quando comparada às SEQ ID NO: 135, 136, 147,162,176,215, 234, 255, 265, 272, 279, 299, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 351 ou 363.

   i 5. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos compreende as SEQ ID NO: 133, 134, 146, 161, 175, 214, 233, 264, 271, 278, 298,301,303,305,307,309,311,313, 315, 317, 319, 321, 350 ou 352.

   6. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucletídeos que codifica dito polipeptídeo é códon-otimizada para expressão em uma planta.

   7. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dita sequência de nucleotídeos é obtida a partir de um ou mais organismos oleaginosos.

   8. POLINUCLEOTÍDEO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o organismo oleaginoso é selecionado a partir do grupo que consiste em Torulaspora delbrueckii, Pichia anomala, Debaryomyces hansenii, Candida zeylanoides, Lipomyces starkeyi, Mucor circinelloides, Phaffia rhodozyma, Rhodotorula glutinis, Mortierella alpina e Crptococcus curvatus.

   9. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo recombinante, conforme descrito em uma das reivindicações 1 a 6, operativamente ligado a pelo menos uma sequência regulatória.

   10. MÉTODO PARA AUMENTAR O TEOR TOTAL DE ÁCIDO GRAXO DE UMA SEMENTE de uma planta de semente oleaginosa transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) transformar pelo menos uma célula de semente oleaginosa com o polinucleotíideo recombinante conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6, ou a construção de DNA recombinante conforme definida na reivindicação 9; (b) regenerar uma planta de semente oleaginosa transgênica a partir da(s) célula(s) de semente oleaginosa transformada(s) da etapa (a); e (c) selecionar a(s) células) de semente oleaginosa transformada(s) de dita planta transgênica da etapa (b) que tem um teor total de ácidos graxos aumentado quando comparado ao teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa não segregante e não transgênica.

   11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a semente oleaginosa é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, milho, canola, girassol, linho, algodão e açafrão.

   12. PRODUTO OU SUBPRODUTO, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de uma semente oleaginosa transgênica, e que compreende:

   (a) pelo menos uma célula de planta de dita semente de oleaginosa transgênica, em que dita pelo menos uma célula de planta | coompreende o polinucleotídeo recombinante conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6; ou, (b) o polinucleotideo recombinante conforme definido em uma das reivindicações 1 a 6, em que dita semente de oleaginosa transgênica tem teor total de ácidos graxos aumentado quando comparada quando comparado ao teor total de ácido graxo de uma semente oleaginosa não segregante e não transgênica.

   13º MÉTODO PARA PRODUZIR UMA SEMENTE DE OLEAGINOSA COM UM TEOR TOTAL DE ÁCIDOS GRAXOS AUMENTADO, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma semente de oleaginosa transgênica, em que dita semente de oleaginosa transgênica compreende a construção de DNA recombinante conforme definida na reivindicação 9, e em que dita semende de oleaginosa transgênica tem um teor total de ácidos graxos aumentado quando comparado ao teor total de ácidos graxos de semente oleaginosa não segregante e não transgênica; (b) cultivar dita semente de oleaginosa transgênica para regenerar uma planta de semente oleaginosa transgênica; e, (c) —obteruma semente de oleaginosa a partir de dita planta de semente oleaginosa transgênica, em que dita semente oleaginosa tem um teor total de ácidos graxos aumentado quando comparado ao teor total de ácidos graxos de semente oleaginosa não segregante e não transgênica.

   14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a semente de oleaginosa é selecionada a partir do grupo que consiste em soja, milho, canola, girassol, linho, algodão e açafrão.

   15. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 13 ou

   | e | EN ; - | 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de utilizar dita semente oleaginosa para produzir um produto e/ou subproduto.

   16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que dito produto é alimento ou ração. | 5 17. MÉTODO PARA PRODUZIR UM PRODUTO A PARTIR DE UMA SEMENTE DE OLEAGINOSA obtida pela método conforme definido em uma das reivindicações 13 e 14, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) processar dita semente de oleaginosa para produzir um produto processado; e, (b) —obtero produto processado produzido na etapa (a).

   18. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de produzir um alimento ou ração. | |