BRPI0908665A2 - método para a determinação da eficácia de um antagonista de integrina beta7 para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal, método de predição da responsividade de um paciente, método para a determinaçao da dosagem de um antagonista de integrina beta7, método para determinaçao do regime terapêutico de um antagonista de integrina beta7, método para predição de prognóstico de uma doença inflamatória intestinal, método de elaboração de um tratamento e método de identificação de uma população de linfócitos - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7 PARA O TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO INFLAMATÓRIO GASTROINTESTINAL, MÉTODO DE PREDIÇÃO DA RESPONSIVIDADE DE UM PACIENTE, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA DOSAGEM DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DO REGIME TERAPÊUTICO DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7, MÉTODO PARA A PREDIÇÃO DO PROGNÓSTICO DE UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL, MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE UM TRATAMENTO E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS A presente invenção é direcionada aos métodos de utilização de biomarcadores para avaliar o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais com antagonistas beta7, Mais especificamente, a presente invenção está relacionada aos métodos de uso do nível de linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico, o nível de ocupação de droga nos linfócitos de retorno intestinal, e/ou o nível de receptores integrina beta7 nos Iinfócitos de retorno intestinal como indicadores (ou biomarcadores) do efeito, eficácia, segurança, prognóstico e/ou dosagem de agentes terapêuticos, tais como antagonistas de integrina beta7, para o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais.

Description

% 1 "MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7 PARA O TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO INFLAMATÓRIO GASTROINTESTINAL, MÉTODO DE PREDIÇÃO DA RESPONSIVIDADE DE UM PACIENTE, MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA DOSAGEM DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7, MÉTODO

PARA A DETERMINAÇÃO DO REGIME TERAPÊUTICO DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7, MÉTODO PARA A PREDIÇÃO DO PROGNÓSTICO DE UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL, MÉTODO

DE ELABORAÇÃO DE UM TRATAMENTO E MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos métodos de avaliação do efeito, eficácia, segurança e/ou dosagem de agentes terapêuticos (ou drogas), tais como antagonistas de integrina beta7, para o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais, A presente invenção se refere, mais especificamente, aos métodos de uso do nível de linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico de um paciente, o nível de ocupação de uma droga nos linfócitos de retorno intestinal, e/ou o nível de receptores , integrina beta7 em linfócitos de retorno intestinal como indicadores ("biomarcadores") do efeito, eficácia, segurança e/ou dosagem de agentes terapêuticos tais como antagonistas de integrina beta7 para o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais. Tais métodos incluem, por exemplo, a avaliação da responsívidade de um paciente ao tratamento de um distúrbio gastrointestinal com um antagonista de integrina beta7, usando um ou mais desses biomarcadores. Adicionalmente, a presente invenção fornece métodos de uso de tais biomarcadores para a elaboração de um tratamento medicamentoso e/ou regime terapêutico, ou para o prognóstico. |

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ANTECEDENTES DA INVENÇÃO : A fim de proteger o organismo contra substâncias estranhas, as células do sistema imunológico circulam pelo corpo através do sangue periférico e residem dentro de linfonodos e tecidos onde o antígeno está concentrado. Em geral, existem dois sistemas distintos de retorno (homing): retorno periférico e retorno mucosal, que fornecem a imunidade a antígenos tanto sistêmicos como de mucosa. As células inicialmente ativadas em locais de origem gastrointestinal irão preferencialmente para o tecido mucoso e nodos (ou gânglios). Em contraste, as células ativadas em linfonodos periféricos trafegam preferencialmente para locais periféricos, (Butcher ef al. Adv Immunol (1999)). Células em circulação entram nos linfonodos intestinais e tecidos por extravasamento através das vênulas endoteliais altas (VEA). Isso ocorre através de interações entre moléculas de adesão na superfície dos linfócitos e receptores (adressinas) na VEA. (Butcher et al., Adv Immuno! (1999) As integrinas são receptores de superfície celular heterodiméricos alfa/ beta envolvidas em vários processos celulares desde a adesão celular até a regulação gênica (Hynes, R.O., Cell, 1992, 69:11-25; e Hemler, M.E., Annu Rev. Immunol, 1990, 8:365-368). No sistema imune, as integrinas estão envolvidas no deslocamento de leucócitos, adesão e infiltração durante processos inflamatórios (Nakajima, H. et al. J. Exp. Med. 1994, 179:1145- 1154). A expressão diferencial das integrinas regula as propriedades adesivas das células e diferentes integrinas estão envolvidas em diferentes respostas inflamatórias, (Butcher, E. C. et a!., Science, 1996, 272:60-66). As integrinas contendo beta7 (ou seja, alfaábetar e alfalbeta/) são expressas principalmente em monócitos, linfócitos, eosinófilos, basófilos e macrófagos, mas não em neutrófilos (Elices, M.J. ef al. Cell, 1990, 60:577-584). Os ligantes primários para as integrinas alfa4beta7 são as proteinas da superfície endotelial “Molécula de Adesão Celular Adressina das Mucosas” (MadCAM-1)

MDL

% % 3 e "molécula de adesão vascular” (VCAM-1) (Makarem, R. et al.

J.

Biol.

Chem., 1994, 269 :4005-4011). A ligação da integrina alfa4betaz à MadCAM-1 e/ou | VCAM-1 expressa em vênulas endoteliais altas (VEA) nos locais de inflamação supostamente resulta em forte adesão dos leucócitos ao endotélio; esta forte adesão é seguida pelo extravasamento das células para o tecido inflamado (Chuluyan H.E. et al.

Springer Semin.

Immunopathol. 1995, 16:391404). Um ligante primário para a integrina alfaEbeta7 (que é expressa em linfócitos intra- epiteliais (IEL)) é a E-caderina, que supostamente facilita a adesão das células que trazem alfaEbeta7 com as células epiteliais, Embora a E-caderina não desempenhe um papel no retorno (homing) para o intestino, acredita-se que as interações entre a E-caderina e a alfaEbeta7 desempenha um pape! na fixação dos linfócitos ao epitélio intestinal. | A DIl é um grupo de doenças inflamatórias, autoimunes do intestino grosso e, em alguns casos, do intestino delgado.

As principais formas de doença inflamatória intestinal (DII) são; doença de Crohn (DC) e colite ulcerativa (CU). Como uma doença autoimune, a DIl é caracterizada pela infiltração aumentada de leucócitos no trato gastrointestinal, o que leva ao espessamento do intestino e destruição celular.

A inibição desta infiltração pelo bloqueio do retorno leucocitário pode modular negativamente a inflamação e a destruição celular associada com a doença.

Linfócitos circulantes com retorno para mucosa estão supostamente alterados nos pacientes com inflamação do cólon (Meenan et al Gut 1997;. 40:241-246). Os anticorpos monocionais direcionados contra alfa4beta7, MadCAM-1 ou VCAM-1 são declaradamente moduladores eficazes em modelos animais de doenças inflamatórias crônicas tais como a colite (Viney et al, J.

Immunol, 1996, 157:2488-2497 ) e doenças inflamatórias intestinais (DI; Podolsky, D.K., N.

Eng Med JJ. 1991, 325:928-937; Powrie, F. et al, Ther.

Immunol., 1995, 2:115-123), A administração de anticorpos monoclonais contra alfaEbeta7 |

- FS 4 supostamente previne e melhora da colite induzida por imunização em camundongos IL-2"”, sugerindo que o aparecimento e manutenção da doença inflamatória intestinal depende da localização colônica de linfócitos CD4* na lâmina própria expressando alfaEbeta7 (Ludviksson et al. , J Immunol. 1999, 162(8):4975-82) Um anticorpo anti-B4 (natalizumab), de acordo com as informações disponíveis, possui eficácia no tratamento de pacientes com DC (Sandborn et a , N Engl J Med 2005;353:1912-25) e um anticorpo anti- B4 B7 (MLN-02) de acordo com as informações disponíveis é eficaz em pacientes com CU (Feagan et al, N Engl J Med 2005;352:2499-507). Estes resultados validam a B4B7 como alvo terapêutico e apoia à ideia de que a interação entre B4 B7 e MadCAM-1 medeia da patogênese da doença inflamatória intestinal (DI). Assim, os antagonistas de integrina beta7 possui um grande potencial como agente terapêutico no tratamento da DII. A fim de desenvolver terapias com um efeito, segurança e/ou eficácia desejado, é importante avaliar a resposta do paciente e o prognóstico | em resposta ao tratamento com um agente terapêutico, tal como um antagonista de integrina beta7. Portanto, é desejável desenvolver um biomarcador que possa predizer com precisão e/ou rastrear a resposta do paciente ao tratamento com um agente terapêutico, Tal predição é essencial para o desenvolvimento de regimes de tratamento eficazes para pacientes humanos em estudos de pesquisa clínica e tratamento da doença.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos métodos de avaliação do efeito, eficácia, segurança, prognóstico e/ou dosagem de agentes terapêuticos (ou drogas), tais como antagonistas de integrina beta7, para o tratamento de distúrbio inflamatório gastrointestinal. Especialmente, a presente invenção refere-se a métodos de uso do nível de linfócitos de retorno intestinal (“gut- homing") no sangue periférico de pacientes, o nível de ocupação de uma droga | TI

" * 5 sobre os linfócitos de retorno intestinal, e/ou o nível de receptores integrina beta7 em linfócitos de retorno intestinal como indicadores (ou biomarcadores) do efeito, eficácia, segurança, prognóstico e/ou dosagem de agentes terapêuticos, tais como antagonistas de integrina beta7 para o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais.

Tais métodos incluem, por exemplo, a avaliação da responsividade de um paciente no tratamento de um distúrbio gastrointestinal com um antagonista de integrina beta7, usando um ou mais desses biomarcadores.

Adicionalmente, a presente invenção fornece métodos de uso de tais biomarcadores para a elaboração de um tratamento medicamentoso e/ou regime terapêutico, ou para o prognóstico.

Em alguns aspectos, o nível de biomarcadores antes do tratamento do paciente com um agente terapêutico é comparado com o nível dos mesmos biomarcadores durante e/ou após o tratamento do paciente, e uma mudança (por exemplo, aumento ou diminuição) do nível deste biomarcador no paciente é indicativo do efeito, eficácia, segurança e/ou prognóstico do agente terapêutico, por exemplo, um antagonista de integrina beta7, para o tratamento de um distúrbio inflamatória gastrointestinal em um paciente, Adicionalmente, tais métodos da presente invenção podem ser usados para o delineamento de um tratamento medicamentoso ou regime terapêutico para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a determinação da eficácia de um antagonista de integrina beta7 no tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, o método compreendendo a comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com o antagonista de integrina beta7, com uma quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do |

1 % 6 biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia do antagonista no tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método de predição da responsividade de um paciente possuindo um distúrbio inflamatório gastrointestinal ao tratamento com um antagonista de integrina beta7, o método compreendendo a comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com o antagonista de integrina beta7, com a quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da responsividade do dito paciente ao tratamento com o dito antagonista.

Ainda em outro aspecto, a invenção diz respeito a um método paraa determinação da dosagem de um antagonista de integrina beta7 para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, o método compreendendo o ajuste da dosagem do antagonista de integrina beta7 com base em uma comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com uma dosagem do antagonista de integrina beta7, com uma quantidade do biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia ou responsividade às dosagens do antagonista de integrina beta7 para o tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente.

Ainda em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para a determinação do regime terapêutico de um antagonista de integrina beta7 para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal | N—

: % 7 em um paciente, o método compreendendo ajustar o regime terapêutico do antagonista de integrina beta7 com base em uma comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com um regime terapêutico do antagonista de integrina beta7, com uma quantidade do biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia ou responsividade ao regime terapêutico do antagonista de integrina beta7 para o tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente.

Em um exemplo de realização, a alteração da quantidade de biomarcador é um aumento.

Em outro exemplo de realização, a alteração da quantidade de biomarcador é uma diminuição.

Ainda em outro exemplo de realização, a amostra é uma amostra de sangue periférico do paciente.

Em um exemplo de realização, a quantidade de biomarcador em uma amostra de sangue do dito paciente que após receber o antagonista de integrina beta7 é mensurada no prazo de 100 dias após ter recebido a primeira dose do antagonista de integrina beta7.

Em outro exemplo de realização, a quantidade de biomarcador em uma amostra de sangue do dito paciente que após receber o antagonista de integrina beta7 é mensurada em cerca de 50 dias da administração do antagonista de integrina beta7.

Em outro exemplo de realização, a quantidade de biomarcador em uma amostra de sangue do dito paciente que após receber o antagonista de integrina beta7 é mensurada em cerca de 24 horas após a administração do antagonista de integrina beta7.

Em um exemplo de realização, o distúrbio gastrointestinal |

: " 8 inflamatório é uma doença inflamatória intestinal (DI!).

Em um exemplo de realização adicional, a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohn (DC) ou colite ulcerativa (CU).

Em outro exemplo de realização, o antagonista de integrina beta7 éumanticorpo anti-integrina beta7.

Em outro exemplo de realização, o dito paciente é um humano, Em um exemplo de realização, a dita mudança na quantidade é um aumento de pelo menos cerca de 30%, cerca de 50%, cerca de uma vez mais, ou cerca de três vezes mais na quantidade dos ditos biomarcadores.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-integrina beta7 é administrado em uma quantidade de cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg.

Em um exemplo de realização adicional, essa quantidade é de 5 ma/kg a 50 mg/kg.

Em um exemplo de realização, o tratamento compreende adicionalmente a administração de uma quantidade eficaz de um ou mais medicamentos adicionais.

Em um exemplo de realização adicional, o medicamento adicional é um agente imunossupressor, um agente de controle da dor, um agente antidiarréico, um antibiótico, ou uma combinação de um ou mais dos agentes mencionados.

Em um exemplo de realização adicional, o dito agente imunossupressor é sulfasalazinay ácido S5-aminossalicílico (5-ASA), Metroidazol, ciprofloxacina, azatioprina ou 6-mercaptopurina.

Em outro exemplo de realização, a dita medicação adicional é outro anticorpo anti-integrina beta7.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-integrina beta7 é administrado no dito paciente por via parenteral.

Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-integrina beta7 é o —————————— “0.R/—-———m=

: * 9 administrado no dito paciente por via intravenosa e/ou subcutânea.

Em um exemplo de realização, o dito anticorpo anti-integrina beta7 é administrado em uma frequência de pelo menos uma vez a cada 1, 2, 3,4,5,6,8 ou 12 semana(s).

Em um exemplo de realização adicional, o dito o anticorpo anti- integrina beta7 é administrado semanalmente, Em outro exemplo de realização, o dito anticorpo anti- beta7 é administrado por pelo menos 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36 ou 52 semana(s).

Em um exemplo de realização, o anticorpo é monoclonal.

Em outro exemplo de realização, o dito anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.

Em outro exemplo de realização, o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo.

Em um exemplo de realização, o dito anticorpo inibe a interação de uma subunidade da integrina beta7 humana com uma segunda subunidade da integrina e/ou um ligante da integrina.

Em um exemplo de realização, a segunda subunidade da integrina é uma subunidade da integrina alfa4, e em que o ligante é MadCAM, VCAM ou fibronectina.

Em um exemplo de realização, a subunidade de integrina alfa4 é de um ser humano.

Em um exemplo de realização, a segunda subunidade de integrina é a subunidade de integrina alfaE, e em que o ligante é a E-caderina.

Em um exemplo de realização, o ligante é de um ser humano.

Em um exemplo de realização, a subunidade de integrina alfaE é de humano.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo anti-integrina beta7 compreende três sequências de regiões hipervariáveis de cadeia pesada |

| Doo : 10 | (HVR-H1-H3) e três sequências de região hipervariável de cadeia leve (HVR- | L1-L3), em que uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVR) são selecionadas a partir do grupo consistindo em: (i) HVR-L1 compreendendo a sequência A1-A11, em que A1-A11 éRASESVDTYLH(SEQ ID NO: 1); (ii) HVR-L2 compreendendo a sequência B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID NO: 2); (ii) HVR-L3 compreendendo a sequência C1-C9, em que C1- C9 é QOGNSLPNT (SEQ ID NO: 3); (iv) —" HVR-H1 compreendendo a sequência D1-D10, em que D1- D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4); (v) —HVR-H2 compreendendo a sequência E1-E17, em que E1- E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5); e (vi) HVR-H3 compreendendo a sequência F1-F11, em que F1- F11é MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6).

Em outro exemplo de realização ainda, o anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis (HVRs) selecionadas a partir do grupo consistindo em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que: () HVR-L1 compreende sequência de aminoácidos A1-A11, em que A1I-A11 é RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8) ou RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9) ou uma variante das SEQ ID Nos: 1, 7, 8 e 9 em que o aminoácido A2 é selecionado a partir do grupo consistindo em A, G, S, T, e V e/ou o aminoácido A3 é selecionado a partir do grupo consistindo em S, G, 1, K N, P, 0, R e T, —elouA4é selecionado a partir do grupo consistindo em E, V, Q, A, D/ G, HI K, L, N, e R, e/ou o aminoácido AS é selecionado a partir do grupo consistindo em S,Y, A, D, G, HI, K N, P, R, T, e V, e/ou o aminoácido A6 é selecionado a partir do grupo consistindo em V, R, 1, A, G, K, L, M, e Q, e/ou o aminoácido A7 | o ————mp

Do E é selecionado a partir do grupo consistindo em D, V, S, A, E, G, HA L K LN, P, S, e T, e/ou o aminoácido AS é selecionado a partir do grupo consistindo em D, GN E T.PesS, e/ouo aminoácido A9 é selecionado a partir do grupo consistindo em L, Y, | e M, e/ou o aminoácido A10 é selecionado a partir do grupo consistindo em L, A, |, M, e V e/ou o aminoácido A11 é selecionado a partir do grupo consistindo em H, Y, F, e S,; (ii) HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID NO: 2), RYASQSIS (SEQ ID NO: 20), ou XaaYASQSIS (SEQ ID NO: 21), onde Xaa representa qualquer aminoácido, ou uma variante da SEQ ID Nos: 2, 20 ou 21 em que o aminoácido B1 é selecionado a partir do grupo consistindo em K, R, N, V A, F, 0, HP, Il, L, Ye Xaa (onde Xaa representa qualquer aminoácido), e/ou o aminoácido B4 é selecionado a partir do grupo consistindo em S e D, e/ou o aminoácido B5 é selecionado a partir do grupo consistindo em Q e S, e/ou o aminoácido B6 é | 15 — selecionado a partir do grupo consistindo em S, D, L, e R, e/ou o aminoácido B7 é selecionado a partir do grupo consistindo em |, V, E, e K; (iii) HVR-L3 compreende a sequência de aminoácidos C1-C9, em | que C1-C9 é QOGNSLPNT (SEQ ID NO: 3) ou uma variante da SEQ ID NO; 3 onde o aminoácido C8 é selecionado a partir do grupo que consiste em N, V, WYRS TAF HILM eXY; (iv) HVR-H1 compreende sequência de aminoácidos D1-D10, em que D1-D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4); (v) HVR-H2 compreende sequência de aminoácidos E1-E17, em que E1-E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5), ou uma variante da —SEQIDNO: 5 onde o aminoácido E2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Y, F, V, e D, e/ou o aminoácido E6 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e G, e/ou o aminoácido E10 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e Y, e/ou o aminoácido E12 é selecionado a partir do grupo a —————————.

Doo 12 que consiste em N, T, A, e D, e/ou o aminoácido 13 é selecionado a partir do grupo que consiste em P, H, D, e A, e/ou o aminoácido E15 é selecionado a partir do grupo que consiste em L e V, e/ou o aminoácido E17 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e G; e (vi) HVR-H3 compreende sequência de aminoácidos F2-F11, em que F2-F11 é MTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 19); ou compreende sequência de aminoácidos F1-F11, em que FI-F11 é ' AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 17), ou AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 18), ou uma variante das SEQ ID Nos: 6, 16, 17, 18 0u19 onde o aminoácido F2 é de R, M, A, E, G, Q, S, e/ou o aminoácido F11 é selecionado a partir do grupo que consiste em F e Y, Em outro exemplo de realização, o anticorpo compreende ainda uma região estrutural, onde o aminoácido na posição 71 da região estrutural é R ou A, e o aminoácido na posição 73 da região estrutural é N ou T, e o aminoácido na posição 78 da região estrutural é F ou A ou L.

Em outro exemplo de realização, o anticorpo: compreende ainda uma sequência consenso da região estrutural de cadeia pesada subgrupo UU humana compreendendo uma substituição na posição 71, 73 e/ou 78.

Em um exemplo de realização, a substituição é R71A, N73T, L78AouL78F.

Em outro exemplo de realização, uma sequência da região estrutural entre a sequência HVR-H2 posições E1-E1 e HVR-H3 posições F1- F11 é HFR3-1-HFR3-31 e no qual HFR3-6 é A ou R, HFR3-8 é N ou T, e HFR3-13 é Lou A ou F.

Em outro exemplo de realização, a posição 71 da região estrutural de cadeia pesada compreende o aminoácido R ou A, e/ou posição 73 da região estrutural de cadeia pesada compreende T ou N, e/ou posição 78 da região estrutural de cadeia pesada compreende F ou A ou L. sequencia compreendida CC A aaa LL

Po 13 na posição 71 da região estrutural de cadeia pesada.

Em um exemplo de realização, o anticorpo compreende três sequências de regiões hipervariáveis de cadeia pesada (HVR-H1-H3) e três sequências de regiões hipervariáveis de cadeia leve (HVR-L1-L3), em que: (1) HVR-L1 compreende a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 or SEQ ID NO:8; (ii) HVR-L2 compreende a SEQ ID NO: 2; (iii) HVR-L3 compreende a SEQ ID NO:3; (iv) HVR-H1 compreende a SEQ ID NO:4; ' 10 (v) —HVR-H2 compreende a SEQ ID NO:5; e (vi) HVR-H3 compreende a SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:16 ou | SEQ ID NO:17 ou SEQ ID NO:19. Em outro exemplo de realização, o dito anticorpo humanizado compreende uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 24,e uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 25.

Em um exemplo de realização, o dito anticorpo se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo que compreende as sequências de cadeia leve e cadeia pesada variável SEQ 1D NO: 10 e SEQ ID NO: 11, respectivamente.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de elaboração de um tratamento com um agente candidato para um paciente humano diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal, compreendendo a determinação de uma dosagem eficaz para o paciente humano com base em uma dosagem que aumenta de maneira eficaz a quantidade de um biomarcador no sangue periférico de um indivíduo não 26 humano em resposta a um tratamento com o dito agente candidato.

Em um exemplo de realização, o dito indivíduo não humano é um Macaco, Em outro aspecto, a presente invenção está relacionada a um |

' * 14 método para a predição do prognóstico de uma doença inflamatória intestinal | para um paciente, compreendendo a comparação de uma relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e a quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue do dito paciente com uma relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue de um indivíduo saudável, de modo que uma relação diminuída do dito paciente quando comparada com a relação do indivíduo saudável é indicativa do prognóstico da doença.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de identificação de uma população de linfócitos compreendendo linfócitos expressando integrina alfaEbeta7 e linfócitos expressando integrina alfa4beta7, compreendendo a ligação dos ditos linfócitos com um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo que compreende uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10, e uma sequência da região. variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11.

Em um exemplo de realização, os ditos linfócitos estão no sangue periférico de um paciente diagnosticado com uma doença inflamatória intestinal, Em outro exemplo de realização, os ditos linfócitos estão no linfonodo e tecidos do intestino de um paciente diagnosticado com uma doença inflamatória intestinal.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 exibe as subpopulações de linfócitos CD4* no sangue periférico de macaco cinomolgo.

A Figura 2 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CD45RA- beta7aito CDA4+ no sangue periférico após 12 doses intravenosas de 5, 15 ou 50 mg/kg de rhnuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de

LL

À % 15 veículo para macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL), Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), para o qual n = 10; Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, para o qual n = 13; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) após o Dia de Estudo 15, para o qual n =13,DoDia81 até 184,n=8em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), para o qual n = 4; Grupo 1 (veículo), para o qual n = 7; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) para o qual n = 7. Do Dia 185 até o 288, n= 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (Smg/Kkg IV) em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg |V) no qual n = 3, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção

5.9.1).

A Figura 3 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CD45RA- beta7alto CD4+ no sangue periférico após 12 doses subcutâneas de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de —veículopara macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL). Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, para os quais n = 13, Do Dia 81 até 184, n= 8 em cada grupo, exceto para o Grupo 1 (veículo) para o qual n = 7, Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV) em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo) no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) no qual n = 3. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1).

A Figura 4 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CD4+ beta7baixo CD45RA- no sangue periférico após 12 doses intravenosas de 5, 15 ou50 mg/kg derhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo para macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL). Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n= 14 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV) para os quais n = 10; Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, |

: 16 para o qual n = 13; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) após o Dia de Estudo 15, para o qual n = 13. Do Dia 81 até 184, n = 8 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), para os quais n = 4; Grupo 1 (veículo), para o qual n = 7; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), para o qual n = 7, Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg |V) em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n=3, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1). A Figura 5 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CD4+ beta7baixo CD45RA- no sangue periférico após 12 doses subcutâneas de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo para macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL). Notas: À partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, para o qual n = 13, Do Dia 81 até 184, n=8 em cada grupo, exceto para o Grupo 1 (veículo), para o qual n=7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n = 3. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1). A Figura 6 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CD45RA- ' beta7intermediário CD4+ no sangue periférico após 12 doses intravenosas de | 5, 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo para macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL). Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), para o qual n = 10; Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, para o qual n = 13; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) após o Dia de Estudo 15, para o qual n = 13. Do Dia 81 até 184, n = 8 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), para os quais n = 4; Grupo 1 (veículo), para o qual n =7; | ro 117 e Grupo 3 (15 mg/kg IV) para o qual n = 7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV) em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n=3. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (videseçãoS.9.1). A Figura 7 exibe a Média do Grupo (+ DP) de linfócitos CDASRA- beta7intermediário CD4+ no sangue periférico após 12 doses subcutâneas de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo para macacos cinomolgos (Contagens Absolutas,% BL). Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada grupo, exceto para o Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, para os quais n = 13. Do Dia 81 até 184, n = 8 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo), para o qual n =7, Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5mg/kg |V), | em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n= 3; e | 15 Grupo3(15 mg/kg IV), no qual n= 3. Essas avaliações foram realizadas com o | anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1). A Figura 8 exibe o aumento transitório na contagem de linfócitos CD45RA' beta7** CD4* de retorno intestinal de memória/efetores do sangue periférico após a administração de rhuMAb Beta7 - 4 doses |.V. semanais de mg/kgderhuMAb Beta7 ou veículo (Contagens Absolutas,% BL). A Figura 9 (A-D) exibe a concentração de rhuMAb Beta7 no soro (microgramas/microlitro) e de ocupação de receptores B7 em linfócitos do sangue periférico CD45RA- beta7alto de memória/efetores CD45RA-CDA4+. Notas: Dados obtidos a partir de macacos cinomolgos que receberam quatro 25 doses intravenosas de 25 mg/kg rhuMAb Beta7, administrados semanalmente, Números absolutos de Células T CD4+ CD45R- B7alto do sangue periférico ocupadas pelo rhuMAb Beta7 foi quantificado como uma percentagem do números absoluto de Células T CD4+ CD45R- B7alto do sangue períférico na |

SA 18 pré-dose.

A Figura 10 (A-D) exibe que o aumento transitório de linfócitos de retorno intestinal CD45RA- fB7alto de memória/efetores CD4+ no sangue periférico se correlaciona com a ocupação do receptor B7 nos linfócitos CD45RA- B7alto de memória/efetores CD4+. Notas: Macacos cinomolgos receberam quatro doses semanais em bolus IV de 25 mg/kg rºhuMAb Beta7 A Figura 11 mostra que o rhuMAb Beta7 inibe in vivo o retorno de linfócitos para o cólon inflamado, mas não no baço de camundongos SCID reconstituído com CD45RBº*"* (modelo de colite em camundongo).

As Figuras 12A e 12B exibem o alinhamento das sequências dos domínios variáveis de cadeia leve para os seguintes: sequência consenso kappa | subgrupo humano de cadeia leve (FIG. 12A, SEQ ID NO; 12), ' sequência consenso subgrupo Ill humana de cadeia pesada (FIG. 12B, SEQ ID NO: 13), cadeia leve variável (Fib504) do anticorpo de rato anti- beta7 de camundongo (FIG. 12A, SEQ ID NO: 10), cadeia pesada variável (FibS04) do anticorpo de rato anti- beta7 de camundongo (Fig. 12B, SEQ ID NO: 11), e os variantes de anticorpo humanizados: Humanizado enxertado com à cadeia leve variável hus04K (FIG, 12A, SEQ ID NO: 14), humanizado enxertado com a cadeia pesada variável hus04K (Fig, 12B, SEQ ID NO: 15), as variantes huso4- 5, hus04-16, e hu504-32 (variações de aminoácidos no enxerto huS04K humanizado são indicadas na FIG. 12A) (cadeia leve) (SEQ ID NOS :22-24, respectivamente, na ordem em que aparecem) e FIG, 12B (cadeia pesada) para as variantes hu504-5, hu504-16, e hu504-32 (SEQ ID NO: 25).

A Figura 13 exibe linfócitis CD45RA Betazalto de —memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos após 12 doses por via intravenosa ou subcutânea de veículo. Notas: % BL = percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos mensuráveis. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não | A voo 19 bloqueador (vide seção 5.9.1).

A Figura 14 exibe línfócitis CD45RA Beta7alto de | memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos após 12 doses por via intravenosa de 5 mg/kg de rhuMAb Beta 7. Notas: % BL l 56 = percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos | mensuráveis. todos os animais no Grupo 2 foram sacrificados no Dia184, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9,1).

A Figura 15 exibe linfócitis CD45RA Beta7alio de | 10 memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos após 12 doses por via intravenosa de 15 mg/kg de rhuMAb Beta 7. Notas: % BL=percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos mensuráveis, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1).

A Figura 16 exibe linfócitos CD45RA Beta7zalto de memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos após 12 doses por via intravenosa de 50 mg/kg de rhuMAb Beta 7. Notas: % BL = percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos mensuráveis, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1), A Figura 17 exibe linfócitos CD45RA Betazalto de memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos após 12 doses por via subcutânea de 15 mg/kg de rhuMAb Beta 7. Notas: % BL = percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos mensuráveis. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1), A Figura 18 exibe linfócitis CD45RA Beta7zalto de memória/efetores CD4+ (Contagens Absolutas,% BL) em macacos cinomolgos | DDD

: : 20 | após 12 doses por via subcutânea de 50 mg/kg de rhuMAb Beta 7. Notas: % BL=percentagem basal; asteriscos indicam animais com títulos de anticorpos | mensuráveis, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não | bloqueador (vide seção 5.9.1). A Figura 19 exibe linfócitos CD45RA- B7alto CD4+ em macacos | cinomolgos após 12 doses intravenosas de 5, 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo (MOEF [% | basal], Média do Grupo + DP); MOEF = moléculas de fluorescência | equivalente.

Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada grupo, | 10 exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), no qual n = 10; Grupo 1 (veículo) após o | Dia de Estudo 57, no qual n = 13, e Grupo 3 (15 mg/kg |V) após o Dia de Estudo 15, no qual n = 13. Do Dia 81 até 184, n = 8 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), no qual n = 4; Grupo 1 (veículo), no qual n=7; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) no qual n = 7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5mg/kg IV), em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n = 3. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1). A Figura 20 exibe linfócitos CD45RA'" B7*"*º CD4* em macacos cinomolgos após 12 doses subcutâneas de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo (MOEF [% basal], o Média do Grupo + DP); MOEF = moléculas de fluorescência equivalente, Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, no qual n = 13, Do Dia 81 até 184, n=8emcada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo), no qual n = 7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n = 3. Essas avaliações foram realizadas com o | E o 21 anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1), A Figura 21 exibe linfócitos CD45RA* p7'emedáto CD4* em macacos cinomolgos após 12 doses intravenosas de 5, 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo (MOEF [% basal, o Média do Grupo + DP); MOEF = moléculas de fluorescência equivalente. Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n = 14 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), no qual n = 10; Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, no qual n= 13, e Grupo 3 (15 mg/kg |V) após o Dia de Estudo 15, no qual n = 13, Do Dia 81 até 184, n= 8 em cada grupo, exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), no qual n = 4; Grupo 1 (veículo), no qual n = 7; e Grupo 3 (15 mg/kg IV) no qual n = 7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), em que todos os animais | foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n = 3; e Grupo 3 (15 mg/kg |V), : no qual n = 3, Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção 5.9.1), A Figura 22 exibe linfócitos CD45RA* p7intemedáio CD4* em macacos cinomolgos após 12 doses subcutâneas de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 ou 12 doses por via intravenosa e subcutânea de veículo (MOEF [% basal], o Média do Grupo + DP); MOEF = moléculas de fluorescência equivalente. Notas: A partir da pré-dose até o Dia 80, n= 14 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo) após o Dia de Estudo 57, no qual n = 13. Do Dia 81 até 184, n = 8 em cada Grupo exceto para o Grupo 1 (veículo), no qual n = 7. Do Dia 185 até 288, n = 4 em cada Grupo exceto para o Grupo 2 (5 mg/kg IV), em que todos os animais foram sacrificados; Grupo 1 (veículo), no qual n= 3; e Grupo 3 (15 mg/kg IV), no qual n = 3. Essas avaliações foram realizadas com o anticorpo 9D8 não bloqueador (vide seção

5.9.1). A Figura 23 exibe as concentrações séricas médias (+ DP) de | o

: % 22 rhuMAb 87 após quatro doses semanais em bolus |.V, de 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos.

A Figura 24 exibe a média atual (+ DP) das concentrações séricas a partir da recuperação de 4 animais e concentrações em um modelo de —prediçãoderhuMAb B7 após quatro doses semanais em bolus IV de 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos, A Figura 25 exibe as subpopulações de células T CD4 no sangue periférico de macaco cinomolgo.

A Figura 26 exibe a média (+ DP) absoluta no sangue periférico da contagem de células T CD4+ beta7alto CD45R- (expresso como percentagem de pré-dose basal), após quatro doses semanais em bolus |.V. (IV = intravenoso) de veículo ou 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos. Nota: n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28, e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 27 exibe a média (+ DP) absoluta da contagem de células T CD4+ CD45R+ B7intermediário no sangue periférico (expresso como percentagem de pré-dose basal), após quatro doses semanais em bolus LW. (IV = intravenoso) de veículo ou 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos. Nota: n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28, e então 4/Grupo após o Dia2z8.

A Figura 28 exibe a média (+ DP) absoluta da contagem de células T CD4* B7ºº CD45R no sangue periférico (expresso como percentagem de pré-dose basal), após quatro doses semanais em bolus L.V. (IV = intravenoso) de veículo ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos, A Figura 29 exibe a média (+ DP) absoluta da contagem de linfócitos (expresso como percentagem de pré-dose basal), após quatro doses semanais em bolus |.V. (IV = intravenoso) de veículo, 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos, Nota: n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28, LL —s.A--—— |

': ' 23 e então 4/Grupo após o Dia 28. A Figura 30 exibe a média (+ DP) absoluta da contagem de células T CD3* no sangue periférico (expresso como percentagem de pré-dose basal), após quatro doses semanais em bolus |.V. (IV = intravenoso) de S ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 para cada grupo de macacos cinomolgos, Nota: n = 6- 10/Grupo para os Dias 0-28, e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 31 exibe a média (t+ DP) absoluta da contagem de células B CD20* no sangue periférico (expresso como percentagem de pré- dose basal), após quatro doses semanais em bolus |.V. (IV = intravenoso) de 5 ou25 mg/kg de rhuMAb 67 para cada grupo de macacos cinomolgos. Nota: n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28, e então 4/Grupo após o Dia 28, A Figura 32A exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMAb B7 e células T CD4+ B7alto CD45R- desocupadas no sangue periférico ao longo do tempo em um macaco cinomolgo individual após quatro doses intravenosas de 25 mg/kg de rhuMAb B7 administrado semanalmente (Animal 23). Expressão do receptor B7 não ocupado em células T CD4+ CDA4A5RA- B7alto foi mensurado como números absolutos de células T CD4+ CDASRA- B7alto e expressos como uma percentagem do valor de pré-dose de cada Macaco.

A Figura 32B exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMAb B7 e células T CD4+ B7alto CD45R- desocupadas no sangue periférico ao longo do tempo em um macaco cinomolgo individual após quatro doses intravenosas de 25 mg/kg de rhuMAb B7 administrado semanalmente (Animal 24). Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- —B7altodo sangue periférico foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7aito do sangue periférico e expressos como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco.

A Figura 32C exibe a relação entre as concentrações séricas de | o ——————s»s»—»————————————

i ' 24 rhuMAb B7 e células T CD4+ B7alto CD45R- desocupadas no sangue periférico ao longo do tempo em um macaco cinomolgo individual após quatro doses intravenosas de 25 mg/kg de rhuMAb B7 administrado semanalmente (Animal 25). Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- fB7alto foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expressos como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco, A Figura 32D exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMAb B7 e células T CD4+ B7alto CD45R- desocupadas no sangue periférico ao longo do tempo em um macaco cinomolgo individual após quatro doses intravenosas de 25 mg/kg de rhuMAb B7 administrado semanalmente (Animal 26). Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco.

A Figura 33 exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMAb B7 e células T CD4+ B7alto CD45R- desocupadas no sangue periférico ao longo do tempo em um macaco cinomolgo individual após quatro doses intravenosas de 25 mg/kg de rhuMAb B7 administrado semanalmente.

Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco.

A Figura 34A exibe a relação absoluta entre Células T CD4+ (CD45R-) de memória/efetoras expressando B7alto e células T CD4+ B7alto CD45R- do sangue periférico desocupadas ao longo do tempo em cada um dos macacos cinomolgos após quatro doses semanais em bolus IV (IV = intravenoso) de 25 mg/kg de rhuMAb B7 (Animal 23). Expressão do receptor b7

MM |

7 % 25 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco.

A Figura 34B exibe a relação absoluta entre Células T CD4+ | (CD45R-) de memória/efetoras expressando B7alto e células T CD4+ B7alto | CDA45R- do sangue periférico desocupadas ao longo do tempo em cada um dos | macacos cinomolgos após quatro doses semanais em bolus |V (IV = intravenoso) de 25 mg/kg de rhuMAb B7 (Animal 24). Expressão do receptor b7 | 10 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi | mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco. A Figura 34C exibe a relação absoluta entre Células T CD4+ (CD45R-) de memória/efetoras expressando B7alto e células T CD4+ B7alto CD45R- do sangue periférico desocupadas ao longo do tempo em cada um dos macacos cinomolgos após quatro doses semanais em bolus IV (IV = intravenoso) de 25 mg/kg de rhuMAb B7 (Animal 25), Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi mensurado como número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco, A Figura 34D exibe a relação absoluta entre Células T CD4+ (CD45R-) de memória/efetoras expressando B7alto e células T CD4+ B7alto —CD45R-do sangue periférico desocupadas ao longo do tempo em cada um dos macacos cinomolgos após quatro doses semanais em bolus IV (IV = intravenoso) de 25 mg/kg de rhnuMAb B7 (Animal 26). Expressão do receptor b7 não ocupado em células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico foi aa |

' ' 26 mensurado como um número absoluto de células T CD4+ CD45RA- B7alto do sangue periférico e expresso como uma percentagem do valor de pré-dose de cada macaco. A Figura 35 exibe a média absoluta da contagem de células T CD4+ B7alto CD45R- no sangue periférico. Nota: A contagem de células Té expressa como uma percentagem da pré-dose basal; n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28 e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 36 exibe a média absoluta da contagem de células T CDB+ B7alto CD45R- no sangue periférico. Nota: A contagem de células T é expressa como uma percentagem da pré-dose basal; n = 6-10/Grupo para os Dias 0-28 e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 37 exibe a média absoluta da contagem de células T CD4+ B7intermediário CD45R- no sangue periférico, Nota: A contagem de células T é expressa como uma percentagem da pré-dose basal; n = 6- 10/Grupo para os Dias 0-28 e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 38 exibe a média absoluta da contagem de células T CD8+ B7intemediário CD45R- no sangue periférico. Nota; A contagem de células T é expressa como uma percentagem da pré-dose basal; n = 6- 10/Grupo para os Dias 0-28 e então 4/Grupo após o Dia 28.

A Figura 39 exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMab B7 e células T CDa4p7?*" CD45R- no sangue periférico expressando B7 disponíveis.

A Figura 40 exibe a relação entre as concentrações séricas de rhuMab 67 e células T CD8 B7º"º CDA5R- no sangue periférico expressando B7 disponíveis,

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO |. DEFINIÇÕES Conforme utilizado na presente invenção, com relação à resposta nn

: : 27 do paciente ou a responsividade do paciente, o termo "predição" ou "predizer" é utilizado no presente para se referir à possibilidade de que um paciente irá responder tanto favoravelmente como desfavoravelmente, a uma droga ou um conjunto de drogas. Em um exemplo de realização, a predição refere-se à extensãodetaisrespostas. Em um exemplo de realização, a predição refere-se à possibilidade e/ou a probabilidade de que um paciente irá sobreviver ou melhorar após o tratamento, por exemplo, o tratamento com um agente terapêutico, por exemplo, anticorpo anti-integrina beta7, e sem a recorrência da doença durante um determinado período de tempo, Por exemplo, os métodos de predição da presente invenção podem ser usados clinicamente para tomar decisões de tratamento, pela escolha das modalidades de tratamento mais adequadas para um paciente específico, Os métodos de predição da presente invenção são ferramentas valiosas para predizer se um paciente é susceptível de responder favoravelmente a um regime de tratamento, incluíndo, por exemplo, a administração de um determinado agente terapêutico ou uma combinação, a intervenção cirúrgica, tratamento com esteroides e etc., ou se a sobrevida a longo-prazo do paciente, seguindo um esquema terapêutico é provável.

“Tratamento” se refere a intervenções clínicas em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula que está sendo tratada, e pode ser realizado para profilaxia ou durante o desenvolvimento da patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de qualquer consequência patológica direta ou indireta da doença, redução da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado doentio, e remissão ou prognóstico melhorado. "Regime de tratamento" refere-se a uma combinação de dosagens, frequência de administração, ou duração do tratamento, com ou |

' ' 28 sem adição de uma segunda medicação, "Regime de tratamento eficaz" referese a um regime de tratamento que irá oferecer uma resposta benéfica para um paciente que recebe tal tratamento.

"Modificação de um tratamento" refere-se a alterar o regime de tratamento, incluíndo, a alteração na dosagem, frequência de administração, ou duração do tratamento e/ou adição de uma segunda medicação.

"Resposta do paciente" ou "responsíividade do paciente" pode ser avaliada através de qualquer parâmetro, indicando um benefício para O paciente, incluindo, sem se limitar a, (1) inibição, até certa medida, da progressão da doença, incluindo a desaceleração e parada completa 2; redução do número de episódios e/ou sintomas da doença, (3) redução do tamanho da lesão; (4) inibição (ou seja, redução, retardamento ou parada completa) da infiltração de células em órgãos periféricos e/ou tecidos adjacentes ao doente; (5) inibição (ou seja, redução, retardamento ou parada completa) da propagação da doença; (6) diminuição da resposta autoimune, que pode, mas não necessariamente, resulta na regressão ou ablação da lesão da doença (7); alívio, em algum grau, de um ou mais sintomas associados com o distúrbio; (8) aumento do tempo de apresentação livre da doença após o tratamento e/ou (9) diminuição da mortalidade em um determinado período após o tratamento. O termo "“responsividade" refere-se a uma resposta mensurável, incluindo a resposta completa (RC) e a resposta parcial (RP).

Pela expressão "resposta completa" ou "RC" pretende-se dizer o desaparecimento de todos os sinais de inflamação ou remissão em resposta ao tratamento. Isso nem sempre significa que a doença foi curada.

"Resposta parcial" ou "RP" refere-se a uma diminuição de pelo menos 50% na gravidade da inflamação, em resposta ao tratamento, Uma "resposta benéfica" de um paciente ao tratamento com um o

, : 29 antagonista de integrina beta7 e expressões similares refere-se ao benefício clinico ou terapêutico dado a um paciente com risco, ou sofrendo de um distúrbio inflamatório gastrointestinal a partir ou como um resultado do tratamento com o antagonista, tal como um anticorpo anti-integrina beta7, Esse benefício inclui respostas celulares ou biológicas, uma resposta completa, resposta parcial, uma doença estável (sem progressão ou recidiva), ou uma resposta com um tempo de recidiva pelo ou como resultado do tratamento com o antagonista. "Um paciente mantém responsividade ao tratamento", quando a responsividade do paciente não diminui com o tempo durante o curso de um tratamento.

O termo "diagnóstico" é utilizado na presente invenção para se referir a identificação ou a classificação de um estado molecular ou patológico, doença ou condição, Por exemplo, "diagnóstico" pode referir-se à identificação de um tipo particular de distúrbio inflamatório gastrointestinal e, mais especificamente, a classificação de um determinado subtipo de distúrbio inflamatório gastrointestinal, por comprometimento do tecido/órgão (por exemplo, doença inflamatória intestinal), ou por outras características (por exemplo, uma subpopulação de pacientes caracterizados pela responsividade (capacidade de resposta) a um tratamento, tal como um tratamento com um antagonista de integrina beta7).

O termo "prognóstico" é utilizado no presente para se referir à predição de uma probabilidade de sintomas da doença, incluindo, por exemplo, reincidência, surtos, e resistência às drogas de um distúrbio inflamatório — gastrointestinal.

O termo "amostra", conforme utilizado no presente, refere-se a uma composição que é obtida ou derivada de um indivíduo de interesse que contém uma entidade celular e/ou molecular que deve ser caracterizada e/ou [rr

| : ' 30 | identificada, por exemplo, com base nas características físicas, bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas, Por exemplo, a frase "amostra da doença”, e variações desta, refere-se a qualquer amostra obtida a partir de um indivíduo de inferesse em que se espera, ou que sabe possuir a entidade celular e/ou molecular que está sendo caracterizada.

A amostra pode ser obtida a partir de um tecido do indivíduo de interesse ou a partir do sangue periférico do indivíduo.

Um “antagonista de integrina beta7” ou “antagonista beta7" refere- se a uma molécula que inibe uma ou mais atividades biológicas ou bloqueia a ligação da integrina beta7 com uma ou mais de suas moléculas associadas.

Antagonistas da invenção podem ser usadas para modular um ou mais aspectos dos efeitos associados ao beta7, incluindo, mas não se limitando, a associação com a subunidade alfaá4 da integrina, associação com a subunidade alfaE da integrina, ligação da integrina alfa4beta? ao MadCAM, VCAM-1 e fibronectina e a ligação da integrina alfaEbeta7 à E-caderina.

Estes efeitos podem ser modulados por qualquer mecanismo biologicamente relevante, incluindo a ruptura da ligação do ligante à subunidade beta7 ou à integrina dimérica alfa4beta7 ou alfaEbeta e/ou interromper a associação entre as subunidades alfa e beta da integrina de modo que a formação da integrina dimérica é inibída.

Em um exemplo de realização da presente invenção, o antagonista beta7 é um anticorpo anti-integrina beta7 (ou anticorpo anti- beta7). Em um exemplo de realização, o anticorpo anti-integrina beta7 é um anticorpo anti-integrina beta7 humanizado e mais especificamente um anticorpo anti- beta7 monoclonal humanizado recombinante (ou rhuMAb beta7). Em alguns exemplos de realização, os anticorpos anti- beta7 da presente invenção são anticorpos anti-integrina beta7 antagônicos que inibem ou bloqueiam a ligação da subunidade beta7 com a subunidade de integrina alfa4, a associação com a subunidade de integrina alfaE, a ligação da integrina alfa4beta7 ao MadCAM, |

CN 31 VCAM-1 ou fibronectina, e a ligação da integrina alfaEbeta7 à E-caderina.

"Subunidade beta7" ou "subunidade .Beta. 7" significa a subunidade de integrina beta 7 humana (Erle et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). A subunidade beta7 associa-se com a subunidade alfa4 da integrina, tal como a subunidade Alfa. 4 humana (Kilger e Holzmann (1995) J. Mol. Biol. 73:347-354). A integrina alfa4beta7, segundo consta, é expressa na maioria dos linfócitos maduros, bem como em uma pequena população de timócitos, células da medula óssea e mastócitos, (Kilshaw e Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish et a!., (1992) 149: 1964-1972; e Shaw, S. K, e Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335). A subunidade beta7 também associa-se com a subunidade alfaE, tal como a subunidade .Alfa, E da integrina humana (Cepek, K. L, et al, (1993) J. ímmunol. 150:3459). A integrina alfaEbeta7 é expressa em linfócitos epiteliais intra-intestinais (IlELs) (Cepek, KL (1993) supra).

“Subunidade alfaE” ou “subunidade alfak de integrina” ou “subunidade .Alfa.E” ou “subunidade de integrina .alfa.E" ou “CD103” significa uma subunidade de integrina encontrada por estar associada com a integrina beta7 em linfócitos intra-epiteliais, de modo que a integrina alfaEbeta7 medeia a ligação dos IELs ao epitélio intestinal expressando a E-caderina (Cepek, KL etal Immunol. 150:3459; Shaw, S. K. e Brenner, M. B. (1995) Semin. Immunol. 7:335).

"MadCAM" ou "MadCAM-1" são utilizados de forma indiferenciada no contexto da presente invenção e referem-se à proteína molécula de adesão celular adressina-1, que é um polipeptídeo de cadeia simples compreendendo uma pequena cauda citoplasmática, uma região transmembrana e uma sequência extracelular composta de três domínios similares à imunoglobulina. Os cDNAs para a MadCAM-1 murina, humana e de macacos foram clonados (Briskin, et al, (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan et al, (1996) J. Immunol o ÔÔ f

. 32 156:2851-2857) .

"VCAM-1" ou “molécula de adesão celular vascular-1", "CD106" referem-se a um ligante de alfa4beta7 e alfa4beta1, expresso no endotélio ativado e importante nas interações leucócito-endotélio, tal como a ligação e transmigração dos leucócitos durante a inflamação.

"CD45" refere-se a uma proteína da família proteína tirosina fosfatase (PTP). As PTPs são conhecidas como moléculas de sinalização que regulam uma variedade de processos celulares, incluíndo o crescimento celular, diferenciação, ciclo mitótico, e a transformação oncogênica. Esta PTP contém um domínio extracelular, um segmento transmembrana único e dois domínios catalíticos intracitoplasmáticos tandem e, portanto, pertencem ao receptor do tipo PTP, Este gene é expresso especificamente nas células hematopoiéticas, Foi demonstrado que esta PTP é um regulador essencial da sinalização receptor antígeno de células T e B. Ela funciona através de qualquer interação direta com os componentes do complexo receptor antígeno, ou pela ativação de diversas cinases da família Src necessárias para a sinalização receptor antígeno. Esta PTP também suprime as quinases JAK, e, portanto, funciona como um regulador da sinalização receptor citocina. Foram descritos quatro variantes com “splicing" alternativo deste gene, que codificam isoformas distintas. (Tchilian EZ, Beverley PC (2002). “CD45 in memory and disease” Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, et al. (2004). “interleukin-6, CD45 and the sre-kinases in myeloma cell proliferation", Leuk. Lymphoma 44 (9):1477-81, Existem diversas isoformas de CD45: CD45RA, CDA45RB, —CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CDA45R (ABC). O CD45 também é altamente glicosilado. A CD45R é a maior proteína e migra à 200 kDa quando isolada de células T. As células B também expressam CD45R com glicosilação mais acentuada, trazendo o peso molecular para 220 kDa, daí o |

NM 33 nome B220; a isoforma de células B de 220 kDa. A expressão da B220 não estã restrita às células B e também pode estar expressa em células T ativadas, em um subconjunto de células dendríticas e outras células apresentadoras de antígenos. Stanton T, Boxall S, Bennett A, ef al. (2004). “CD45 variant alleles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV | seropositive Ugandans”. Immunogenetics 56 (2): 107-10, A expressão “Linfócitos de retorno intestinal" refere-se a um subgrupo de linfócitos com a característica de retorno seletivo para os linfonodos e tecidos intestinais, mas que não apresentam retorno para | 10 finfonodos e tecidos periféricos. Este subgrupo de linfócitos é caracterizado por um padrão de expressão único de uma combinação de múltiplas moléculas da superfície celular, incluindo, mas não se limitando a, combinação de CDA, CD45RA e Beta7. Normalmente, pelo menos dois subconjuntos de linfócitos CDA4”* no sangue periférico podem ser subdivididos com base nos marcadores CD45RA e Beta7; de células CD4* CD45RA'" B7º*"* e CDASRA" 7º”. Células CD4* CDA45RA' B7º"º migram preferencialmente para os linfonodos e tecidos intestinais, enquanto que as células CD4' CD45RA' B7"** migram preferencialmente para os linfonodos e tecidos periféricos (Rott ef a/ 1996; Rott et al 1997; Williams ef a/ 1998; Rosé et al 1998;. Williams e Butcher, 1997; Butcher et a!, 1999). Linfócitos de retorno intestinal são portanto um subgrupo distinto de linfócitos identificados como CD45RA” B7º"* CD4* em um ensaio de citometria de fluxo. Os métodos para a identificação deste grupo de linfócitos são bem conhecidos no estado da técnica e também divulgados em detalhes nos Exemplos do presente pedido.

Conforme utilizado no presente, com relação a um marcador de superfície celular, o símbolo “" indica a expressão positiva de um marcador de superfície celular. Por exemplo, linfócitos CD4* são um grupo de linfócitos que têm CD4 expresso na superfície de suas células.

| x J 34 Conforme utilizado no presente, com relação a um marcador de superfície celular, o símbolo “-” indica a expressão negativa de um marcador de superfície celular. Por exemplo, linfócitos CD45RA' é um grupo de linfócitos que não têm CD44RA expresso na superfície de suas células.

Conforme utilizado no presente, com relação à expressão de um marcador de superfície celular, o símbolo "baixo" indica um nível de expressão de um marcador de superfície celular relativamente baixo sobre os linfócitos, enquanto que "alto" indica um nível de expressão de um marcador de superfície celular relativamente elevado sobre os linfócitos. Em um citômetro de fluxo, a intensidade de B7º"º é de pelo menos cerca de 10 ou 100 vezes maior do que a intensidade de B7º***, Desse modo, conforme previsto nos exemplos de realização, os linfócitos CD4 CD45RA” B7º*** e CD4* CD45RA" B7*"º são alocados em partes distintas de um gráfico de pontos ou histograma em uma análise por citometria de fluxo, onde no eixo X é a intensidade da expressão de CD415AReeixooYéa intensidade de expressão de Beta7.

A expressão “Linfócitos de retorno periférico" refere-se a um subgrupo de linfócitos com características de retorno seletivo para os linfonodos e tecidos periféricos, mas que não apresentam retorno para linfonodos e tecidos intestinais. Em um exemplo de realização, como explicado acima, linfócitos de retomo intestinal são um grupo distinto de linfócitos identificados como células CD45RA" B7º*** CD4* em um ensaio de citometria de fluxo. Os métodos para a identificação deste grupo de linfócitos são bem conhecidos no estado da técnica e também divulgados em detalhes no presente pedido.

Uma "quantidade" ou "nível' de biomarcador pode ser determinado usando métodos conhecidos no estado da técnica, Por exemplo, em exemplos de realização, a "quantidade" ou "nivel" de linfócitos de retorno intestinal, a qual está associada com a resposta de um paciente a um | z % 35 tratamento com antagonista de integrina beta7 é um nível detectável em uma amostra biológica, preferencialmente em uma amostra de sangue periférico. À quantidade de linfócitos de retorno intestinal pode ser quantificada por métodos conhecidos por técnicos hábeis no assunto e divulgada pela presente invenção, talcomoa análise por citometria de fluxo.

Em alguns exemplos de realização, uma quantidade "elevada" ou "aumentada" ou nível de um biomarcador, é em relação a uma quantidade de referência/comparação do biomarcador, O aumento é preferencialmente maior do que cerca de 10%, preferencialmente maior do que cerca de 30%, —preferencialmente maior do que cerca de 50%, preferencialmente maior do que cerca de 100%, preferencialmente maior do que cerca de 300% em função do valor para a quantidade de referência ou de comparação. Por exemplo, uma quantidade de referência ou de comparação pode ser a quantidade de biomarcador antes do tratamento e, mais especificamente, pode ser a quantidade basal ou pré-dose, Por exemplo, em um exemplo de realização, uma "quantidade" ou "nível" de linfócitos de retorno intestinal denota um aumento suficiente no número de linfócitos de tal forma que um técnico hábil no assunto consideraria que tal aumento deve possuir significância estatística no contexto da característica biológica mensurada pelos ditos valores. O aumento é preferencialmente maior do que cerca de 10%, preferencialmente maior do que cerca de 30%, preferenciamente maior do que cerca de 50%, preferencialmente maior do que cerca de 100%, preferencialmente maior do que cerca de 300% em função do valor para a quantidade de —referência/comparação de linfócitos.

Em alguns exemplos de realização, uma "diminuição" na quantidade ou nível de um biomarcador, é em relação a uma quantidade de referência/comparação do biomarcador. A diminuição é preferencialmente |

| : : 36 menor do que cerca de 10%, preferencialmente menor do que cerca de 30%, preferencialmente menor do que cerca de 50%, preferencialmente menor do que cerca de 100%, preferencialmente menor do que cerca de 300% em função do valor para a quantidade de referência ou de comparação, Por exemplo, uma quantidade de referência ou de comparação pode ser a quantidade de biomarcador antes do tratamento e, mais especificamente, pode ser a quantidade basal ou pré-dose.

Por exemplo, um "tratamento que aumenta de maneira eficaz a quantidade de linfócitos de retorno intestinal" refere-se a um tratamento que aumenta suficientemente o número de linfócitos de tal forma que um técnico hábil no assunto consideraria o aumento como sendo de significância estatística dentro do contexto das características biológicas mensuradas pelos ditos valores. O aumento é preferencialmente maior do que cerca de 10%, preferencialmente maior do que cerca de 30%, preferencialmente maior do que cerca de 50%, preferenciamente maior do que cerca de 100%, preferencialmente maior do que cerca de 300% em função do valor para a quantidade de referência/comparação de linfócitos antes do tratamento, A frase "não altera substancialmente", conforme utilizado na presente invenção, denota um grau insignificante de alteração de modo que um técnico hábil no assunto não consideraria que tal alteração tivesse significância estatística no contexto das características biológicas mensurada pelos referidos valores (por exemplo, a quantidade de linfócitos) A alteração é preferencialmente inferior a cerca de 10%, preferencialmente inferior a cerca de 5%, e preferencialmente inferior a 1%.

"Distúrbios inflamatórios gastrointestinais" é um grupo de distúrbios crônicos que causam inflamação e/ou ulceração na membrana mucosa. Estes distúrbios incluem, por exemplo, a doença inflamatória intestinal (por exemplo, a doença de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite |

- % 37 infecciosa), mucosite (por exemplo, a mucosite oral, mucosite gastrointestinal, mucosite nasal e proctife), enterocolite necrosante e esofagite. Em um exemplo de realização preferido, o distúrbio inflamatório gastrointestinal é uma doença inflamatória intestinal (DII).

As expressões "Doença Inflamatória Intestinal" ou "Dil" são usadas indistintamente no presente para se referir a doenças do intestino que causam a inflamação e/ou ulceração e inclui sem se limitar, a doença de Crohn e a colite ulcerativa, "Doença de Crohn (CD)" ou “colite ulcerativa (CU)" são doenças inflamatórias intestinais de etiologia desconhecida. A doença de Crohn, diferentemente da colite ulcerativa, pode afetar qualquer parte do intestino. À característica mais proeminente da doença de Crohn é a granular, espessamento edematoso vermelho púrpuro da parede intestinal, Com o desenvolvimento da inflamação, esses granulomas frequentemente perdem | 15 suas fronteiras limitadas e se integram ao tecido circundante, A diarreia e a obstrução do intestino são as características clínicas predominantes. Assim como acontece com a colite ulcerosa, o curso da doença de Crohn pode ser contínuo ou recidivante, leve ou grave, mas ao contrário da colite ulcerosa, a doença de Crohn não é curável através de ressecção do segmento do intestino envolvido. À maior parte dos pacientes com doença de Crohn necessita de cirurgia em algum momento, mas a recidiva é comum e o tratamento médico contínuo é frequente, A doença de Crohn pode envolver qualquer parte do trato digestivo desde a boca até o ânus, embora normalmente apareça nas regiões ileocólicas, no intestino delgado ou anoretal-coliônica, Histopatologicamente, a doença se manifesta por granulomatomas descontínuos, abscessos de cripta, fissuras e úlceras aftosas, O infiltrado inflamatório é misto, composto de linfócitos (tanto de células T como células B), plasmócitos, macrófagos e |

Í ' 38 neutrófilos. Há um aumento desproporcional nas células plasmáticas que secretam IgM e IgG, macrófagos e neutrófilos.

Drogas anti-inflamatórias sulfasalazina e ácido S-aminossaliícílico (5-ASA) são úteis para o tratamento com atividade leve da doença de Crohn no | 5 cólone são comumente prescritas para controlar a remissão da doença. O metroidazol e a ciprofloxacina são similares em eficácia a sulfasalazina e | parecem ser particularmente úteis no tratamento da doença perianal. Em casos | mais graves, corticosteroides são eficazes no tratamento das exacerbações ativas e podem até mesmo preservar a remissão. A azatioprina e 6- mercaptopurina também têm demonstrado sucesso em pacientes que necessitam a administração crônica de corticosteroides. Também é possível que essas drogas possam desempenhar um papel na profilaxia a longo prazo. Infelizmente, pode haver uma demora muito longa (até seis meses) antes do início da ação em alguns pacientes. Medicamentos antidiarreicos podem também proporcionar alívio dos sintomas em alguns pacientes. A terapia nutricional ou dieta elementar pode melhorar o estado nutricional dos doentes e induzir a melhora sintomática da doença aguda, mas não é capaz de induzir a remissão clínica, Os antibióticos são usados no tratamento secundário do crescimento excessivo de bactérias no intestino delgado e no tratamento de complicações piogênicas, "A colite ulcerativa (CU)" atinge o intestino grosso. O curso da doença pode ser contínuo ou recidivante, leve ou grave. A lesão inicial é um infiltrado inflamatório com formação de abscesso na base das criptas de Lieberkuhn. A coalescência dessas criptas dilatadas e que sofreram ruptura 256 tendem a separar a mucosa sobrejacente a partir de seu suprimento sanguíneo, levando à ulceração. Os sintomas da doença incluem cólicas, dor abdominal inferior, sangramento retal, e frequentes eliminações soltas compostas principalmente de sangue, pus e muco com escassas partículas |

& .

' ' 39 fecais. A colectomia fotal pode ser necessária para a colite ulcerativa ininterrupta aguda, grave ou crônica.

As características clínicas da CU são altamente variáveis e, o início pode ser insidioso ou abrupto, e pode incluir diarreia, tenesmo e sangramento retal recidivante. Com a complicação fulminante de todo o cólon, megacólon tóxico, pode ocorrer uma situação de emergência com risco de vida. Manifestações extra-intestinais incluem artrite, pioderma gangrenoso, uveite e eritema nodoso, O tratamento para a CU inclui a sulfassalazina e medicamento contendo salicilato relacionados para casos leves e medicamentos corticosteroides em casos graves. A administração tópica tanto de um salicilato como de corticosteroides é às vezes eficaz, principalmente quando a doença é limitada ao intestino distal, e está associada com a diminuição de efeitos colaterais, em comparação com o uso sistêmico. As medidas de suporte tais como a administração de ferro e agentes antidiarreicos são por vezes indicadas. A azatioprina, 6-mercaptopurina e metotrexato são também prescritas ocasionalmente para uso em casos refratários dependentes de corticosteroides.

Uma “dosagem eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, nas dosagens e períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático ou terapêutico desejado.

Conforme usado no presente, o termo "paciente" refere-se a qualquer animal único, mais preferencialmente um mamífero (incluindo os animais não humanos como, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de zoológico, vacas, porcos, ovelhas, e primatas não humanos) para os quais o tratamento é desejado. Mais preferivelmente, o paciente no presente é um ser humano, A expressão "indivíduo não humano" refere-se a qualquer animal | único não humano, mais preferivelmente um mamífero (incluindo os animais não humanos como, por exemplo, cães, gatos, cavalos, coelhos, animais de zoológico, vacas, porcos, carneiros, e primatas não humanos).

Os termos “anticorpo” e "imunoglobulina” são utilizados de forma alternada no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos contanto que estes apresentem a atividade biológica desejada), e pode ainda incluir determinados fragmentos de anticorpos (conforme descrito em maiores detalhes no presente). Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou maturado por afinidade.

“Fragmentos de anticorpos” compreendem apenas uma porção de anticorpo intacto, em que a dita porção retém preferencialmente pelo menos um, e preferenciamente a maioria ou todas as funções normalmente associadas a essa porção quando presente em um anticorpo intacto, Em uma realização, o fragmento de anticorpo compreende de um sítio de ligação ao antígeno do anticorpo intacto mantendo assim a capacidade de se ligar ao antígeno. Em outra realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo, um que compreende a região Fc, retém ao menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a região Fc quando presente em um anticorpo intacto, tal como a ligação de FcRn, modulação da meia vida do anticorpo, função ADCC e ligação do complemento. Em um exemplo de realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que possui uma meia vida in vivo substancialmente similar ao de um anticorpo intacto. Por exemplo, tal fragmento de anticorpo pode compreender de um braço de ligação ao antígeno para uma sequência Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento.

A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de |

- * " anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que poderiam estar presentes em quantidades menores, Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um único antígeno.

Além disso, ao contrário das preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem especificamente anticorpos “quiméricos" nos quais uma porção da cadeia leve elou pesada é idêntica com, ou homóloga a, sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica, ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da cadeia é idêntico com, ou homóloga as, sequências correspondentes em anticorpos derivados de outras espécies, ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos destes anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 81:6851-6855 (1984)). Formas “humanizadas”" de anticorpos não humanos (tal como, murino) são anticorpos quiméricos que contém uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana.

Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano possuindo a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada(s) Em alguns casos, resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por residuos não humanos correspondentes.

Adicionalmente, anticorpos |

1 * " humanizados podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações podem ser feitas para refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas das alças (loops) hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas | ou substancialmente todas as FRs são de uma sequência lo de imunoglobulina | humana. O anticorpo humanizado poderá também compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para maiores detalhes, vide Jones ef al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et a/., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Veja também os artigos de revisão e as referências citadas nos mesmos: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5;428-433 (1994).

Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácido que corresponde à sequência de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido pelo uso de qualquer técnica para a produção de anticorpos humanos conforme descrito no presente. Tais técnicas incluem triagem de bibliotecas combinatórias derivadas de humanos, como bibliotecas de exibição por fagos (vide, por exemplo, Marks ef al. J. Mol. Biol., 222: 581- 597 (1991) e Hoogenboom et al. Nucl. Acids Res ., 19: 4133-4137 (1991)); utilizando linhagens de células de mieloma humano e heteromieloma de — camundongos para à produção de anticorpos monoclonais humanos (vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur ef al ., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 55-93 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1987); e Boerner et al. J. Immunol., 147: 86 (1991)); e |

' : 43 geração de anticorpos monoclonais em animais transgênicos (por exemplo, camundongos), que são capazes de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena (vide, por exemplo, Jakobovits ef al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993 ); Jakobovits et al. Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al. Year in Immunol., 7: 33 (1993)). Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno de um animal não humano, Um anticorpo “isolado” é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos. Em exemplos de realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) em mais de95%em peso de anticorpo, conforme determinado através do método Lowry e, de preferencialmente, em mais de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para a obtenção de pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos interna ou N-terminal, através do uso de um sequenciador do tipo spinning cup; ou (3) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições redutoras ou não-redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, coloração de prata, Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado é preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

O termo “região hipervariável”, “HVR", ou “HV”, quando utilizado no presente refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis na sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; sendo VOS —n

* : 44 três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Diversos delineamentos da região hipervariável são utilizados e englobados neste documento.

As regiões determinantes de complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade das sequências e são as mais comumente usadas (Kabat et al.

Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed, National Institute of Health, Bethesda, Md. 1991). Chothia por sua vez refere-se a localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J.

Mol.

Biol. 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariável do ADM representam um acordo entre os CDRs de Kabat e as alças (loops) estruturais de Chothia, e são utilizados pelo programa “Oxford Molecular ABM antibody modeling software". O "contato" das regiões hipervariáveis é baseado em uma análise das estruturas de complexo cristalino | disponíveis.

Os resíduos de cada uma destas HVRs são descritas a seguir.

Alça (loop) Kabat ABM Chothia Contato | L124-L34 L124-134 L26-L32 L30-L36 156 L2 L50-LS6 L50-L56 L50-L52 LA46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-€H32 —H30-H35B (Numeração de Kabat) H1 H31-H35 — H26-61355 —H2a6-€H32 —H30-H35 (Numeração de Chothia) H2 H50-H65 — H50H58 H53-H55 —H47-H58 Ha H95-H102 H9os-H102 Hos-H101 Hos-H101 As regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis alongadas", como as seguintes: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou — 49-56 ou 50-56 ou 52-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) no VH, Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com a Kabat et al, supra para cada uma dessas definições. |

' 5 45 Resíduos da "região estrutural" (framework) ou "FR" são aqueles resíduos do domínio variável que não são resíduos da região hipervariável conforme definido no presente. | Uma "região estrutural de consenso humano" é uma região estrutural que representa os mais comumente resíduos de aminoácidos que ocorrem em uma seleção de sequências da região estrutural V; ou Vi da | imunoglobulina humana.

Geralmente, a seleção das sequências Vy ou Vida imunoglobulina humana é originada de um subgrupo de sequências de | domínios variáveis.

Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em kKabat et al Em um exemplo de realização, para o V,, o subgrupo é subgrupo kappa | como em Kabat et al.

Em um exemplo de realização, para o V., o subgrupo é subgrupo Ill como em Kabat et a/. Um anticorpo “maturado por afinidade” é um anticorpo que possui uma ou mais alterações em um ou mais CDRs do mesmo que resulta na melhora da afinidade de ligação do anticorpo ao antígeno, comparado ao anticorpo parental que não possui tal(ais) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo.

Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos no estado da técnica.

Marks, et a/., Biotechnology 10:779-783 (1992) descrevem a maturação por afinidade através da mistura (shuffling) do dominio VL e VH.

A mutagênese aleatória da CDR efou resíduos da região estrutural é descrita, por exemplo, em: Barbas, et al., Proc.

Nat, Acad.

Sci, USA 91:3809-3813(1994): Shier et al., Gene 169:147-155 (1996); Yelton ef al., /. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson ef al, J.

Immunol, 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J.

Mol.

Biol. 226:889-896 (1992). A frase “substancialmente semelhante”, “substancialmente a mesma", conforme utilizada no presente, denota um grau de semelhança e —..n————— | o ' ' 46 suficientemente elevado entre dois valores numéricos (geralmente, uma associada a um anticorpo da invenção e a outra associada a um anticorpo de referência/comparação) de tal forma que um técnico hábil no assunto iria considerar a diferença entre os dois valores como de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística no contexto da característica biológica mensurada pelos valores citados (por exemplo, valores Kd). A diferença entre os dois valores é, por exemplo, inferior a 50%, preferencialmente menor que | 40%, preferencialmente inferior a 30%, preferencialmente menor que 20% e/ou preferencialmente inferior a 10% em função do valor do anticorpo de ' referência/comparação. “Afinidade de ligação” refere-se, em geral, à força da soma total de interações não-covalentes entre um sítio de ligação isolado de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno), A “afinidade de ligação” a menos que indicado de outro modo, refere-se a afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre os membros do par ligante (por exemplo, anticorpo e antígeno). À | afinidade da molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida através de métodos conhecidos no estado da técnica, incluindo os métodos descritos na presente invenção. Anticorpos de baixa afinidade ligam de forma fraca o antígeno e tendem a dissociar rapidamente, enquanto os anticorpos de alta afinidade ligam o antígeno de forma mais forte e permanecem ligados por mais tempo. Uma variedade de métodos para mensurar a afinidade de ligação é conhecida no estado da técnica, de modo que qualquer um destes métodos — pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção. O termo "variável" refere-se ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem amplamente na sequência entre os anticorpos e são utilizados na especificidade de ligação de cada anticorpo específico para o seu

RSRS | o " | ' 47 antígeno específico, No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente ao longo de todos os domínios variáveis de anticorpos. Ela é concentrada em três segmentos denominados de regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções maisbem conservadas de domínios variáveis são denominadas de regiões estruturais (frameworks) (FR). Os domínios variáveis nativos de cadeias leves e pesadas compreendem 4 FRs cada, adotando em grande parte configuração de folha- B, conectadas por 3 regiões hipervariáveis, que formam alças (/oops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha B. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em grande proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuindo para a formação do sítio de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a ” participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos | (ADCC). A digestão de anticorpos pela papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, denominados fragmentos “Fab”, cada qual com um único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. O tratamento com a pepsina gera um fragmento F(ab'), que contém dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno. “Fv” é o menor fragmento de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação ao antígeno. Esta região consiste em um dímero de uma região variável de cadeia pesada e de cadeia leve em estreita associação não covalente. É nesta configuração que as três regiões

ENE |

] : 48 hipervariáveis de cada domínio variável interage para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero Vx-V,. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis conferem a especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo.

Entretanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno), possui a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora em menor afinidade do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contem o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (Cy1) da cadeia pesada.

Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns residuos na extremidade carbóxi-terminal do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas a partir da região de articulação do anticorpo.

Fab'-SH é a designação da presente invenção para o Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteina dos domínios constantes sustenta(m) pelo menos um grupo tiol livre.

Os fragmentos de anticorpos F(ab'), foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiças de cisteínas entre si, Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos, As “cadeias leves” de anticorpos a partir de qualquer espécie de vertebrado podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa (x) e lambda (A), com base nas sequências de aminçácidos de seus domínios constantes.

Dependendo das sequências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes.

Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, 1gG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG, 1962, I9Gs, I9Ga, I9A, e I19A2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes |

' : 49 classes de imunoglobulinas são denominados de B, 8, £& 7, e À, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e descritas de maneira geral, por exemplo, em Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4º Ed. (WB. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma : molécula de fusão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais proteínas ou peptídeos diferentes. As expressões “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são utilizadas no presente de forma alternada, para se referir a um anticorpo na sua forma substancialmente intacta, e não como fragmentos de anticorpos como descrito abaixo. As expressões se referem particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que possui uma região Fc. Um “anticorpo nú” para os propósitos da presente invenção é um anticorpo que não está conjugado a uma fração citotóxica ou radiomarcador. O termo "região Fc" é usado no presente para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a sequência nativa de regiões Fc e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc da cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada dalgG humana é normalmente definida como se estendendo a partir de um resíduo de aminoácidos na posição Cys226, ou a partir da Pro230, até a região carboxi-terminal desta. A lisina C-terminal (resíduo 477 de acordo com sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou pela construção de um ácido nucleico 26 recombinante que codifca uma cadeia pesada do anticorpo, Consequentemente, uma composição de anticorpos intactos podem incluir populações de anticorpos com todos resíduos K447 removidos, populações de anticorpos sem a remoção dos resíduos K447, e populações de anticorpos com

ND a

' ' 50 | uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

Salvo quando indicado de outra forma no presente, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada da imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º Ed.

NationallnstítutesofHealth, Bethesda, MD (1991), expressamente incorporada ao presente pela referência. O “índice EU como em Kabat" refere-se a numeração do resíduo do anticorpo humano IgG1 EU.

' Uma "região Fc funcional” possui pelo menos uma "função | efetora" de uma sequência nativa da região Fc. Exemplos de "função efetora" incluem a ligação do componente C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; infra-regulação “down reguíation" dos receptores da superfície celular (por exemplo, receptor célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras requerem geralmente que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável do anticorpo) e podem ser avaliadas usando os vários ensaios conhecidos no estado da técnica.

Uma “região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc encontrada na natureza, Região Fc humana de sequência nativa inclui uma região Fc de IgG, humano de sequência nativa (alótipos não-A e A); região Fc de IgG; humano de sequência nativa; região Fc de IgG; humano de sequência nativa, região Fc de IgG, humano de sequência nativa, bem como as variantes de ocorrência natural destas.

Uma *região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da região Fc de sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, de preferência, uma ou mais substituição(ões) de aminoácido(s). Preferivelimente, a região Fc variante

A | possui pelo menos uma substituição de aminoácido quando comparada a uma região Fc de sequência nativa ou a uma região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e preferencialmente cerca de 1 a cerca de 5 substituições de aminoácido em uma regiãoFc de sequência nativa ou em uma região Fc do anticorpo parental. A região Fc variante da presente invenção, irá possuir preferencialmente pelo menos cerca de 80% de homologia com uma sequência da região Fc nativa elou com uma região Fc de um polipeptídeo parental, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de homologia com esta, e mais preferivelmente pelo menos cercade 95% de homologia com esta.

Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, anticorpos intactos podem ser atribuídos a diferentes “classes”, Existem cinco classes principais de anticorpos intactos: IgA, 1gD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em “subclasses”" (isotipos), por exemplo, IgG1, 1962, 1963, 19G4, IgA; e IgA2z. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem as diferentes classes de anticorpos são denominados de a, 3, e, y, e pu, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

"“Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo" e “ADCC” referem-se a uma reação mediada por célula na qual células citotóxicas inespecíficas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconheçam um anticorpo ligado sobre uma célula alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula- alvo As principais células mediadoras da ADCC, as células NK, expressam apenas FeyRill, enquanto monócitos expressam FeyRlI, FeyRII e FeyRiIll. À expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch et al, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). Para

NNSSEEREEESSESEEEEEE EEE e o o

! ; 52 avaliar a afividade ADCC de uma molécula de interesse, podem ser realizados testes ADCC in vitro, tais como os descritos nas Patentes US 5.500,362 ou US

5.821.337. As células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como descrito em Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRill e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), células matadoras naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; de modo que PBMCs e células NK são preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa desta, porexemplo, do sangue ou PBMCs como descrito no presente.

Os termos “receptor Fc" ou "FcR” são utilizados na presente invenção para descrever um receptor que se liga a uma região Fe de um anticorpo. O FcR preferido é um FCcR de sequência nativa humana. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FeyRI, FeyRII, e FoyRilIl, incluindo variantes alélicas e formas que sofreram splicing alternativo destes receptores. Receptores FcyRIl incluem FeyRIA (um "receptor de ativação") e FeyRIIB (um "receptor de inibição"), que possuem sequências similares de aminoácidos que diferem entre si principalmente em seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FCyRIIA possui um motivo de ativação com base em imunoreceptor tirosina (ITAM), no seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FeyRIIB possuí um motivo de inibição com base em imunoreceptor tirosina (ITIM) no seu domínio citoplasmático (vide revisão em Daêron, Annu. Rev. Immunol.

EEE | o ' 53 ! 15:203-234 (1997)). FoRs são revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994); e deHaas ef al., J. Lab, Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outras FCRs, incluindo aquelas a serem identificadas no futuro, são englobadas pelo termo “FcR" na presente invenção. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternos ao feto (Vide Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et a!., J. Immunol. 24:249(1994)), e regula a homeostase das imunoglobulinas. Anticorpos com ligação melhorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), e meia-vida aumentada, são descritos no documento WO0O0/42072 (Presta, L.) e US 2005/0014934A1 (Hinton ef al.). Estes anticorpos compreendem uma região Fc, com uma ou mais substituições neste local que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Por exemplo, a região Fc pode ter substituições em uma ou mais das posições 238, 250, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 314, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428 ou 434 (numeração de resíduos Eu). O anticorpo compreendendo a região Fc preferida com ligação ao FocRn melhorada compreende as substituições de aminoácidos em uma, duas ou três das posições 307, 380 e 434 da região Fc desta (numeração de resíduos Eu). Fragmentos de anticorpo “Fy de cadeia única" ou “scFV" compreendem os domínios Vy e Vi de anticorpo, no qual estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um polipeptídeo ligante entre os domínios Vu e V. permitindo que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv vide Pluckthun, em The Pharmacology of — Monoclonal Antibodies, vol. 113, Eds Rosenburg e Moore., Springer-Verlag, Nova lorque, págs. 269-315 (1994). Fragmentos scFV de anticorpos HER2 estão descritos no documento WOS93/16185; Patente US 5.571.894 e Patente US 5.587 458.

NM |

' : 54 O termo “diacorpos” refere-se a pequenos fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno, em que tais fragmentos compreendem um domínio de cadeia pesada variável (V4) conectado a um domínio de cadeia leve variável (V1) na mesma cadeia polipeptídica (Vu — V1).

—Pormeiodo uso de um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, e criar dois sitios de ligação ao antígeno. Diacorpos estão descritos em maiores detalhes, por exemplo, na Patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et a!., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Um anticorpo “maturado por afinidade” é um anticorpo que possui uma ou mais alterações em um ou mais regiões hipervariáveis do mesmo que resulta na melhora da afinidade de ligação do anticorpo para o antígeno, quando comparado com um anticorpo parental que não possuí tal(ais) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Anticorpos maturados por afinidade são produzidos por procedimentos conhecidos no estado da técnica. Marks, ef a/., 1992, Biotechnology 10:779-783 descrevem a maturação por afinidade através da mistura (shuffling) do domínio VL e VH. À mutagênese aleatória de CDR e/ou resíduos da região de arcabouço é descrita por: Barbas, ef al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Shier et al, Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Um anticorpo com "sequência de aminoácido variante" é no presente um anticorpo com uma sequência de aminoácido que difere das principais espécies de anticorpos. Normalmente, a sequência de aminoácido variante que possuem pelo menos, cerca de 70% de homologia com o NR o

* . : ' 55 anticorpo das principais espécies e, preferencialmente, possuindo no mínimo cerca de 80%, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de homologia com as principais espécies de anticorpos.

A sequência de aminoácido variante possuem substituições, deleções e/ou adições em determinadas posições dentro ou junto as sequência de aminoácidos das principais espécies de anticorpos.

Exemplos de sequência de aminoácidos variante na presente invenção inclui uma variante ácida (por exemplo, uma variante de anticorpo desamidado), uma variante básica, um anticorpo com uma extensão líder amino-terminal (VHS- por exemplo) em uma ou duas cadeias leves deste anticorpo, um anticorpo com uma extremidade C-terminal de resíduos de lisina em uma ou duas cadeias pesadas deste anticorpo e etc, e incluem combinações de variações nas sequências de aminoácidos das cadeias pesadas e/ou cadeias leves.

O anticorpo variante de interesse especial para a presente invenção é o anticorpo que compreende uma extensão líder amino- terminal em uma ou duas cadeias leves deste, e opcionalmente, compreendendo ainda de outra sequência aminoácido e/ou diferenças de glicosilação em comparação com as principais espécies de anticorpo.

Um anticorpo com "glicosilação variante" no presente é um anticorpo com uma ou mais moléculas de carboidratos anexas a ele, que diferem de uma ou mais moléculas de carboidratos ligadas a uma das principais espécies de anticorpo.

Exemplos de variantes de glicosilação no presente incluem anticorpos com uma estrutura de oligossacarídeos G1 ou G2, em vez de uma estrutura de oligossacarídeos GO anexada a uma região Fc deste, anticorpos com uma ou duas moléculas de carboidratos ligados a uma —ouduas cadeias leves deste, anticorpos sem carboidratos acoplados a uma ou duas cadeias pesadas do anticorpo, e etc, e combinações das alterações de glicosilação.

Quando o anticorpo tem uma região Fc, uma estrutura de oligossacaríideo pode ser acoplada a uma ou duas cadeias pesadas do

NEED o |

' í 56 anticorpo, por exemplo, no resíduo 299 (298 pela numeração dos resíduos Eu). A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada na presente invenção, indica uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa a destruição de células. O termo é utilizado para incluir isótopos radioativos (por exemplo, AE", 1991, 125, Yºº e Re", Re", sm', BP'?, Pr e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal e/ou variantes destas, O termo “citocina” é um termo genérico para proteínas liberadas poruma população de células que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas e | hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluídos entre as citocinas estão os hormônios do crescimento; tais como hormônio do crescimento humano; hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pró- relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônio folículo-estimulante (FSH); hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento dos fibroblastos; prolactina; lactogênio da placenta; fator de necrose tumoral a e B; substância inibidora muleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongos; inibina; activina: fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento neural como; por exemplo; NGF- £; fator de crescimento plaquetário; fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-a e TGF- B; fator de crescimento similar à insulina-l e Il; eritropoletina (EPO); fatores osteoindutivos; interferons; tais como interferon-a, - B e -y; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais como de macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, I1L-3, 1-4, IL-5, 1L-6, 1L-7, 1L-8, IL-

RES |

- % 57 9, IL-10, IL-11, 11-12; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF e ligante de kit (KL). Conforme utilizado no presente, o termo cíitocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de sequências nativas. S O termo "agente imunossupressor”, da forma como é utilizado no presente, refere-se às substâncias que atuam para suprimir ou mascarar o sistema imunológico do indivíduo que está sendo tratado. Isto inclui substâncias que suprimem a produção de citocinas, regulam negativamente (down-regulate) ou suprimem a expressão de auto-antigenos, ou mascaram os antigenos de MHC, Exemplos destes medicamentos incluem pirimidinas substituídas 2-amino-6-aril-5-(vide Patente US 4.665.077); drogas anti inflamatórias não esteróides (NSAIDs); ganciclovir; tacrolimus; glicocorticóides como o cortisol ou aldosterona; agentes antiinflamatórios tal como um inibidor da ciclooxigenase, inibidor da S-Hlipoxigenase, ou um antagonista dos | 15 receptores dos leucotrienos; antagonistas das purinas, tais como a azatioprina ou mofetil micofenolato (MMF); agentes alquilantes como a ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldeído (que mascara os antigenos | MHC, conforme descrito na Patente US 4.120.649); anticorpos anti-idiotípicos para antígenos MHC e fragmentos de MHC, ciclosporina, 6-mercaptopurina, esteróides como os corticosteroides ou corticóides ou análogos de | glicocorticóides, por exemplo, prednisona, metilprednisolona, incluindo SOLU- MEDROLO; succinato sódico de metilprednisolona e dexametasona, inibidores da diidrofolato redutase, tais como o metotrexato (via oral ou subcutânea), agentes anti-maláricos, como a cloroquina e hidroxicloroquina, sulfassalazina, —leflunomida, anticorpos ou antagonistas de citocinas ou receptores de citocinas, incluindo anticorpos anti-interferon-alfa, beta, ou gama; anticorpos anti-fator de necrose tumoral (TNF)-alfa (infliimab (REMICADE?) ou adalimumabe), imunoadesina anti-TNF-alfa (etanercept); anticorpos anti-TNF- beta, anticorpos

NENE

' ' 58 anti-interleucina-2 (IL-2) e anticorpos anti-receptor de IL-2 e anticorpos e antagonistas anti-receptor de interleucina-6 (IL-6); anticorpos anti-LFA-1, incluindo o anticorpo anti-CD11a e anti-CD18, anticorpos anti-L3T4; globulina heteróloga anti-linfócitos; anticorpos pan-T, preferencialmente, anticorpos anti- CD3 ou anticorpos anti-CD4/CD4a; peptídeo solúvel contendo um domínio de ligação LFA-3 (documento WO 90/08187 publicado em 26 de julho de 1990); estreptoquinase; fator de crescimento transformante- beta (TGF- beta); streptodomase; RNA ou DNA a partir do hospedeiro; FK506, RS-61443;, clorambucil; deoxiespergualina; rapamícina; receptor de célula T (Cohen et al, Patente US 5.114.721), fragmentos do receptor de células T (Offner et al, Science., 251:430-432 (1991); documento WO 90/11294; laneway, Nature, 341:482 (1989) e documento WO 91/01133); antagonistas de BAFF tais como anticorpos ou imunoadesinas BAFF ou BR3 e antagonistas de zZTNF4 (para revisão, vide Mackay e Mackay, Trends. Immunol., 23:113-5 (2002)vide também a definição abaixo); agentes biológicos que interferem com os sinais de células T heíper, tais como ligante anti-CD40 ou anti-receptor de CD4 ou ligante anti-CD40 (CD154), incluindo anticorpos de bloqueio ligante CD40- CD40 (por exemplo, Durie ef al Science, 261:1328-1330 (1993), Mohan et al, Immunol, J., 154:1470-1480 (1995)) e CTLA4-lg.. (Finck et al, Science, 265:. 1225-7 (1994)); e anticorpos para receptor de células T (Patente EP 340.109), como o T10B9.

Il - DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A. ANTAGONISTAS DE INTEGRINA BETA 7 A presente invenção é direcionada a métodos para a predição da —responsividade de um paciente para o tratamento com antagonistas de integrina beta7. Exemplos de antagonistas potenciais incluem um oligonucleotídeo que se liga às fusões de imunoglobulina com a integrina beta7, e, especificamente, a anticorpos, incluindo, sem se limitar, aos

EEE | e

. : 59 anticorpos poli- e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotípicos e quiméricos ou versões humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos de anticorpos, bem como anticorpos e fragmentos de anticorpos humanos. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma proteína intimamente relacionada, por exemplo, uma forma mutada da integrina beta7 que reconhece o ligante, mas que não confere efeito algum, inibindo, desse modo, a ação da integrina beta7 de maneira competitiva. Outro antagonista potencial para a integrina beta 7 é uma construção de RNA ou DNA antisense preparada a partir do uso da tecnologia antisense, em que, por exemplo, uma molécula de DNA ou RNA antisense atua para bloquear diretamente a tradução do mMRNA através de hibridização ao MRNA alvo, prevenindo assim a tradução da proteina. A tecnologia antisense pode ser utilizada para controlar a expressão gênica através da formação de uma tripla-hélice ou antisense de DNA ou RNA, que são métodos baseados na ligação de um polinucleotideo ao DNA ou RNA. Por exemplo, a porção codificadora 5' da sequência de polinucleotídeo, que codifica a integrina beta 7 da presente invenção, é utilizada para preparar um oligonucleotideo de RNA antisense de cerca de 10 a 40 pares de base de comprimento. Um —oligonucleotíideo de DNA é designado a ser complementar à região do gene envolvida na transcrição (para tripla-hélice - vide Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney ef al., Scienice, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), prevenindo desta forma a transcrição e a produção da integrina beta7. O oligonucleotíideo de RNA antisense se hibridiza ao MRNA in vivoe bloqueia a tradução da molécula de MRNA na proteína integrina beta7 (antisense - Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Os oligonucleotídeos descritos acima podem também ser fornecidos às células

RR |

. 4 ão de forma que o RNA ou DNA antísense possa ser expresso in vivo para inibir a produção do polipeptíideo PRO. Quando o DNA antísense é utilizado, os | oligodeoxirribonucleotídeos derivados do sítio de início de tradução, por exemplo, entre cerca de -10 e +10 posições da sequência gênica do —nucleotídeo,são preferidos. Outro antagonísta potencial inclui uma molécula pequena que se ' liga ao sitio ativo, o ligante ou sítio de ligação da molécula ligante, bloqueando assim a atividade biológica normal da integrina beta7. Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não se limitam a, peptídeos pequenos ou moléculas similares a peptídeos, de preferência peptídeos solúveis, e compostos sintéticos orgânicos ou inorgânicos não-peptídicos. | Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticas capazes de | catalisar a clivagem específica de RNA. Ribozimas atuam através de hibridização sequência-específica ao RNA alvo complementar, seguida por clivagem endonucleolítica, Sítios de clivagem específicos de ribozima no RNA ' alvo podem ser identificados através de técnicas conhecidas. Para maiores detalhes vide, por exemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), e documento WO 97/33551 (publicado em 18 de setembro de 1997). Moléculas de ácido nucleico na conformação de tripla-hélice utilizadas para inibir a transcrição devem ser de transformadas em fita simples e compostas de deoxinucleotídeos. A composição base de ditos oligonucleotídeos é designada de forma que promova a formação da tripla- hélice por meio das regras de pareamento de bases de Hoogsteen, que geralmente requer tamanhos expandidos de purinas ou pirimidinas ou uma fita deumduplexo, Para detalhes adicionais vide, por exemplo, a Publicação PCT WO 97/33551, Estas moléculas pequenas podem ser identificadas a partir de um ou mais ensaios de seleção discutidos acima e/ou através de qualquer outra técnica de seleção bem conhecida pelos técnicos no assunto,

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' 61 Testes de rastreio para antagonistas são desenvolvidos para identificar compostos que se ligam ou formam complexos com a integrina beta7 codificada pelos genes identificados no presente, ou interferem com a interação dos polipeptídeos codificados com outras proteínas celulares, Tais ensaios de rastreio incluirão ensaios propícios para o rastreio em alto rendimento de bibliotecas químicas, fazendo-as particularmente apropriadas para àa | identificação de fármacos de molécula pequena candidatas. | ' Os ensaios podem ser realizados em uma série de formatos, incluindo ensaios de ligação proteina-proteína, ensaios de seleção bioquímica, imunoensaios, e ensaios baseados em células, que são bem caracterizados no estado da técnica. B. ANTICORPOS ANTI-INTEGRINA BETAZ7 Em um exemplo de realização, os antagonistas de integrina beta7 da presente invenção são anticorpos anti- beta7. Exemplos de anticorpos incluem anticorpo policional, monoclonal, humanizado, humano, biespecífico, anticorpos heteroconjugados e etc. conforme descrito abaixo.

1. ANTICORPOS POLICLONAIS Os anticorpos policlonais são, de preferência, criados em animais por meio de múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, tal como, o conjugado de hemocianina (keyhole limpet hemocyanin), albumina de soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja utilizando um agente bifuncional ou de derivatização, por exemplo, maleimidobenzoil sulfosucinimida éster (conjugação através de resíduos de cisteina), N-hidroxisucinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOC», ou R'N=C=NR, onde R e R' são grupos alquila diferentes. Animais são imunizados contra o antígeno, conjugados

NE |

« " 62 imunogênicos, ou derivados através da combinação de, por exemplo, 100 ug ou 5 ug da proteina ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injeção da solução intradérmica em diversos locais. Aproximadamente um mês depois, os animaissão sangrados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeo ou conjugado no adjuvante completo de Freund através de injeção subcutânea em diversos locais. De 7 a 14 dias após os animais são sangrados e o soro é testado para título de anticorpo, Os animais são sangrados até o título platô. De preferência, os animais são sangrados com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugados a uma proteina diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser produzidos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, agentes de agregação tais como alúmen são utilizados de forma apropriada para melhorar a resposta imune.

2. ANTICORPOS MONOCLONAIS Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados através do uso do método de hibridoma descrito primeiramente por Kohler et al, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser produzidos através de técnicas de DNA recombinante (Patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo, ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como hamster, é tipicamente imunizado como descrito acima para suscitar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam de forma específica a proteína utilizada para imunização, Alternativamente, linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após a imunização, os linfócitos são isolados e, em seguida, fundidos com uma linhagem de células de mieloma utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monocional Antibodies: Principles and Practice, págs. 59 - 103 (Academic

ERES —

. » 63 Press, 1986)).

As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura apropriado de modo que o meio contenha uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida de células de mieloma parentais não fundidas (também denominadas de parceiras de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT, Células de mieloma parceiras de fusão preferidas são aquelas que se fundem de forma eficaz, suportam a produção de anticorpos de maneira estável e em alto nível pelas células produtoras de anticorpos selecionadas, e são sensíveis a um meio seletivo, que as selecionam contra as células parentais não fundidas. As linhagens de células de mieloma preferidas são linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis pelo Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, células SP-2 e derivados, X63- Ag8-653 disponíveis pelo American Type Culture Collection, Manassas, Va., EUA Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para a produção de anticorpos monocilonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) e Brodeur et al., Monocional Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1987)).

O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra ' o antígeno. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de nus eo | o 64 imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinado, por exemplo, através da análise de Scatchard descrita em —Munson et al, Anal. Biochem., 107: 220 (1980). Uma vez que as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas sã identificadas, os clones podem ser subclonados através da de procedimentos de diluição limitante e cultivadas por meio de métodos- padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, págs.59-103 (Academic Press, 1986)). Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores ascíticos em um animal, por exemplo, por injeção i.p. das células em camundongos. Os anticorpos = monoclonais secretados pelo subclones são devidamente separados do meio de cultura, líquido ascítico ou soro por meio de processos convencionais de purificação de anticorpos, por exemplo, por cromatografia de afinidade (por exemplo, usando a proteína A ou proteina G sepharose) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise e etc, O DNA codificador dos anticorpos monocionais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotfídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos murinos)., As células de hibridoma servem como fonte preferida do dito DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem

EEE AA - :

proteina do anticorpo para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Artigos de revisão sobre a expressão recombinante de DNA codificador de anticorpo em bactérias incluem Skerra et al. Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) e Pluckthun, Immunol. Revs.

130:151-188(1992).

Em um exemplo de realização adicional, os anticorpos monocionais ou fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas através de técnicas descritas em MecCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624- 628 (1991), e Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos humanos e murinos, respectivamente, utilizando | bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de alta afinidade (na faixa de nM) de anticorpos humanos através da combinação de cadeias (Marks et al, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), bem como a infecção combinatória e recombinação in vivo como uma estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse ef al., Nucl, Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Desta forma, tais técnicas são alternativas viáveis para as técnicas tradicionais de hibridoma de anticorpo monocional para o isolamento de anticorpos monocionais.

O DNA que codifica o anticorpo pode ser modificado para produzir palipeptídeos de anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, por meio da substituição das sequências do domínio constante de cadeia de cadeia pesada e leve humana (Cy e Cy) pelas sequências homólogas de murinos (Patente US 4,816.567, e Morrison, ef al. Proc, Natfl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou pela fusão da sequencia codificadora da imunoglobulina com a totalidade ou parte da sequência codificadora de um polipeptídeo não imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). O polipeptídeo que não é imunoglobulina pode substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou são substituídos pelos

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| MM ' 66 domínios variáveis de um sítio de combinação do antígeno a um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação ao antígeno possuindo especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação ao antígeno possuindo especificidade para um antígeno diferente. Anticorpos anti-beta7 exemplares são Fib504, Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. J !Immunol 1 de agosto de 1997; 159(3): 1497-505) ou derivados humanizados destes. Anticorpos humanizados de Fib504 foram divulgados em detalhe na Publicação de Patente US 20060093601 (emitida como Patente US | 10 7.528.236), cujo conteúdo está incorporado ao presente pela referência em sua | totalidade (vide também a discussão abaixo). | 3. ANTICORPOS HUMANOS E HUMANIZADOS Os anticorpos anti-integrina beta7 da presente invenção podem | ainda compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab'), ou outras subsequências de anticorpos de ligação ao antígeno) que contêm a sequência mínima derivada da imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos a partir de uma região | determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por | resíduos de uma CDR de espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade e a capacidade desejada. Em alguns casos, resíduos da região estrutural Fv da imunoglobulihna humana são substituidos por resíduos não humanos correspondentes. Os anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas sequências do CDR ou região estrutural importada, Em geral, o anticorpo humanizado

ED

, * 67 compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDRs correspondem a de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são de uma sequência de — imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado ideal também incluirá, pelo menos, uma porção de uma região constante (Fc) de imunoglobulina, tipicamente, de uma imunoglobulina humana [Jones et a/, Nature, 321:522-5625 (1986); Riechmann et a/, Nature 332:323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596] (1992).

Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos no estado da técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzido a partir de uma fonte que é não humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes denominados de resíduos “importados”, que são tipicamente retirados de um domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores [Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), por meio de substituição de sequencia(s) CDR ou CDRs pelas sequências correspondentes do anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (US 4.816.567), em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDRe, possivelmente, alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves como pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade e

UU SS SS |

: 68 resposta HAMA (anticorpo humano anticamundongo) quando o anticorpo destina-se ao uso terapêutico humano.

De acordo com o então chamado método de “melhor adequação” (best-fif), a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de sequências de domínio variável humano conhecidas.

A sequência de domínio V humano que é mais próxima da sequência do roedor é identificada e a sua região estrutural humana (FR) é aceita para o anticorpo humanizado (Sims ef al.

J.

Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J.

Mol.

Biol., 196: 901 (1987)). Outro método utiliza uma região estrutural específica derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leve ou pesada.

A mesma região estrutural pode ser utilizada para

| vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc.

Natl.

Acad.

Sci. | USA, 89:4285 (1992); Presta ef al, J.

Immunol.,, 151:2623 (1993)). É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com a conservação de alta afinidade de ligação ao antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis, Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados por meio de um processo de análise das sequências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas.

Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os técnicos do assunto.

Programas de computador estão disponíveis e mostram e ilustram a provável estrutura conformacional tridimensional de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas.

A inspeção dessas exibições permite a análise do

— provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos. que influenciam na capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar ao seu antígeno.

Desta forma, os resíduos

FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências receptora e a ——————-m=—m=m

| ; . 6o | importada, de forma que seja atingida a característica de anticorpo desejada, tal como maior afinidade para o(s) antigeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência de ligação aos antígenos.

Várias formas de um anticorpo anti-integrina beta7 humanizado são contempladas, Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxicos(s) a fim de gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, tal comoum anticorpo IgG, intacto.

Exemplos de anticorpos anti- beta7 humanizados incluem, mas não estão limitados a, rhuMAb Beta7, que é um anticorpo monocional humanizado contra a subunidade B7 da integrina e foi obtido a partir do anticorpo monoclonal FIBSO4 rato anti-camundongo/humano (Andrew et al.

1994 J Immunol 1994 ; 153:3847-61), Ele foi projetado para incluir a região estrutural de cadeia pesada e a cadeia leve «1 da imunogliobulina humana (lg) e é produzida pelas células de Ovário de Hamster Chinês. Este anticorpo se liga a duas integrinas, B4 B7 (Holzmann et a/ 1989 Cell, 1989; 56:37-46;. Hu et al, 1992, Proc Acad nacional Sci USA, 1992; 89:825-8) e BE B7 (Cepek et a/., 1993 J immunol 1993; 150:3459-70), que regula o tráfico e retenção de linfócitos no trato gastrointestinal e está envolvida com doenças inflamatórias intestinais (DII), tais como a colite ulcerativa (CU) e doença de Crohn (CD). O rhuMAb Beta7 é um potente bloqueador in vitro da interação celular entre B4 B7 e seus ligantes (Molécula de Adesão Celular Adressina das Mucosas—1 [MadCAM]—1, molécula de adesão celular vascular [VCAM]— 41 e fibronectina), bem como a interação entre BE B7 e seus ligante (E—caderina). O rhuMAb Beta7 se liga de maneira reversível, com alta afinidade similar, ao B7 em linfócitos de coelhos, macacos cinomolgos e seres humanos. Ele também se | O —m——mm+ o 7O liga ao B7 de camundongo com alta afinidade. A sequência de aminoácidos, a | produção e o uso do rhuMAb Beta7 e seus variantes estão detalhadamente divulgados na publicação do Pedido de Patente US 20060093601 (emitida como Patente US 7,528.236), cujo conteúdo está incorporado ao presente pela referência em sua totalidade, As Figuras 12A e 12B ilustram o alinhamento de sequências das cadeias variáveis leve e pesada para os seguintes: sequência consenso kappa | subgrupo humano de cadeia leve (FIG, 12A, SEQ ID NO: 12), sequência consenso subgrupo Ill humana de cadeia pesada (FIG. 12B, SEQ ID NO: 13), cadeia leve variável (Fib504) do anticorpo de rato anti- beta7 de camundongo (FIG. 12A, SEQ ID NO: 10), cadeia pesada variável (Fib504) do anticorpo de rato anti- beta7 de camundongo (Fig. 12B, SEQ ID NO: 11), e os variantes de anticorpo humanizados: Humanizado enxertado com a cadeia leve variável hu504K (FIG. 12A, SEQ ID NO: 14), humanizado enxertado com a cadeia pesada variável hu504K (Fig. 12B, SEQ ID NO: 15), as variantes hu504-5, hu504-16, e hu5s04-32 (variações de aminoácidos no enxerto huS504K humanizado são indicadas na FIG. 12A) (cadeia leve) (SEQ ID NOS :22-24, respectivamente, na ordem em que aparecem) e FIG. 12B (cadeia pesada) para as variantes hu504-5, hu504-16, e hu504-32 (SEQ ID NO: 25).

4. ANTICORPOS HUMANOS Como uma alternativa para a humanização, anticorpos humanos podem ser gerados. Por exemplo, é agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (J;)) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na complete inibição da produção de anticorpos a —————--=m—m—-mss—

endógenos.

A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana dentro de tais linhagens germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos.

Vide, por exemplo, Jakobovits et al, Proc.

Natl.

Acad.

Sci, USA, 90:2551 (1993); —Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes US 5.545,806, US 5.569.825, US 5.591.669

(Todas da GenPharm), US 5.545.807; e documento WO 97/17852. Alternativamente, pode-se utilizar a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al, Nature 348:552-553 [1990]) para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios. gênicos de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados.

De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados no quadro de leitura no gene da proteina de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula do fago.

Como as partículas filamentosas contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma do fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica os anticorpos que exibem essas propriedades.

Desse modo, o fago mimetiza algumas das propriedades da célula-B.

A exibição por fago pode ser realizada em uma variedade de formas, revisadas em, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição do fago, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongos imunizados.

Um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo

| ã : 72 autoantígenos) podem ser isolados essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993), Vide também as Patentes US 5.565,332 e US | 5.573.905. Como discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados in vitro em células B ativadas (vide as Patentes US 5.567,610 e US

5.229.275).

5. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS Em determinadas circunstâncias, há vantagem de se utilizar fragmentos de anticorpos ao invés de anticorpos completos. O menor o tamanho dos fragmentos permite a depuração rápida, e pode levar a um melhor acesso aos tumores sólidos. Foram desenvolvidas diversas técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide por exemplo, Morimoto et al,, Journal of Biochemícal and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan ef al., Science 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados, por exemplo, a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E, coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab'), (Carter ef a/,, Bio/Technology 10:163-167 (1992)) De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')) podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes, Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo selecionado é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Vide, documento WO 93/16185; Patente US 5.571.894 e Patentes US | oO 73

5.587.458. O fragmento de anticorpo pode ser também um "anticorpo linear”, por exemplo, conforme descrito na Patente US 5.641.870, por exemplo. Taís fragmentos de anticorpos lineares podem ser monoespecífico ou biespecíficos.

6. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS Anticorpos — biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epítopos diferentes da integrina beta7 como descrito no presente. Os outros anticorpos podem combinar um sítio de ligação de TAT com um sítio de ligação a outra proteína.

Alternativamente, um braço na integrina beta7 pode ser combinado a um braço que se liga a uma molécula ativadora em um leucócito, tal como uma molécula do receptor da célula T (por exemplo, CD3), ou a receptores Fc para IgG (FeyR), como o FeyRI (CD64), FeyRII (CD32) e FeyRIll (CD 16) para focar e localizar os mecanismos celulares de defesa nas célula expressando TAT. Os anticorpos biespecíficos podem também ser usados para concentrar agentes citotóxicos nas células que expressam TAT. Estes anticorpos possuem um braço de ligação ao TAT e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, uma saporina, anti-interferon-a, alcalóide de vinca, cadeia A de ricina, metotrexato ou hapteno marcado com isótopo radioativo). Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento completo ou fragmentos destes (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2). Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve-cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein ef al, Nafure, 305:537-539 (1983)). Devido a classificação aleatória de cadeias pesadas e leves de imunoglobulinas, ditos hibridomas (quadromas) produzem uma mistura |

' ' 74 potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada por cromatografia de afinidade, é inconveniente e produz rendimentos baixos. Procedimentos similares estão descritos no | 5 documento WO 93/08829, e em Traunecker et al, EMBO Jy., 10:3655-3659 (19971).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios combinando antigeno-anticorpo) são fundidos às sequências de domínio constante de imunoglobulina. Preferencialmente, a fusão está com um domínio constante de cadeia pesada de lg, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, Cu2 e Cr3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH;,) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, de cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em uma célula hospedeira apropriada. Isso permite uma maior flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos polipeptídicos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos ' 20 utilizadas na construção fornecem o rendimento ótimo do anticorpo biespecífico desejado. É, contudo, possível inserir as sequências codificadoras para 2 ou todas as 3 cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em proporções iguais resulta em alto rendimento ou quando as proporções não foram afetaram o rendimento da combinação de cadeia desejada.

Em um exemplo de realização da presente abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um |

' : 75 braço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado a partir de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, poisa presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica proporciona uma forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690. Para mais detalhes de produção de anticorpos biespecíficos vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita na Patente US

5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser elaborada para maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Cuz. Neste método, uma ou mais das cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). As “Cavidades” compensatórias de tamanhos similares ou idênticos para cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo através da substituição de cadeias laterais de aminoácidos grandes com cadeias menores (tal como alanina ou treonina). Esta realização fornece um mecanismo para o aumento no rendimento do heterodimero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos “heteroconjugados” ou reticulados, Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, e outro a biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejadas (Patente US 4.676.980), e para o tratamento da infecção por HIV (WO oO 76 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados através do uso de quaisquer métodos convenientes de reticulação. Agentes de reticulação apropriados são conhecidos no estado da técnica, e são descritos na patente US 4.676.980, dentre uma variedade de técnicasde reticulação.

Técnicas para a geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados, por exemplo, utilizando ligações químicas. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab'). Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar ditióis vicinais e evitar a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são, em seguida, convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos ! 15 derivados de Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por meio da redução - com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado de Fab-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Progressos recentes possibilitaram a recuperação direta dos fragmentos Fab'-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby ef al, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula F(ab'), de um anticorpo biespecífico totalmente humanizado, Cada fragmento Fab' foi secretado da E.

coliseparadamente e submetido ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, bem como iniciar a atividade lítica de linfócitos citotóxicos a

' 77 humanos contra alvos de tumor de mama humano. Diversas técnicas de produção e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente a partir de cultura de células recombinante também foram descritas, Anticorpos biespecíficos foram produzidos, por exemplo, utilizando zíperes de leucina. Kostelnyetal, J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteinas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por meio de fusão gênica. Os homodimeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e, em seguida, novamente oxidados para formar os heterodímeros de anticorpos. Este método pode também ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpos, A tecnologia de “diacorpo” descrita por Hollinger ef al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um Vx conectado a um V, por um ligante que é curto demais para permítiroemparelhamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia. Consequentemente, os domínios V, e Vi de um fragmento são forçados a emparelhar-se com os domínios V, e Vx complementares de outro fragmento, de maneira a formar dois sítios de ligação de antígenos. Também foi relatada outra estratégia para a fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos utilizando dímeros Fv de cadeia simples (sFv). Vide Gruber et al., J. Immunol,, 152: 5368 (1994). Anticorpos com mais de duas valências também são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt ef al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

7. ANTICORPOS HETEROCONJUGADOS Anticorpos heteroconjugados também estão dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Tais anticorpos foram, por exemplo, a ———-—-—ms |

: ' 78 propostos para direcionar células do sistema imune para células indesejadas (Patente US 4.676.980), e para o tratamento da infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373; EP 03089). Contempla-se que os anticorpos também podem ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação., Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles descritos, por exemplo, na Patente US

4676.980.

8. ANTICORPOS MULTIVALENTES Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno para o qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes daqueles da classe IgM), com três ou mais sítios de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalente), que podem ser facilmente produzidos pela expressão recombinante de ácidos nucleicos que codificam as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode incluir um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação ao antígeno, O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc, três ou mais sítios de ligação ao antígeno amino-terminal a região Fc. O anticorpo multivalente preferido na presente invenção compreende (ou consiste em)trêsa oito, mas preferencialmente, quatro sítios de ligação antigênicos. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferencialmente duas cadeias polipeptídicas) onde a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende(m) dois ou mais domínios variáveis, Por exemplo, o ————————--.—" |

Do 7o a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) conter VD1-(X1))-VD2-(X2),-Fc, onde VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) — polipeptídica(s) pode(m) compreender; cadeia da região VH-CH1-ligante flexivel-VH-CH1-Fc, ou cadeia região VH-CH1-VH-CH1-Fce. O anticorpo multivalente na presente invenção, preferencialmente compreende ainda de pelo menos dois (e preferencialmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve, O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender entre cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável de cadeia leve contemplados na presente invenção compreendem um domínio | variável de cadeia leve e compreendem, opcionalmente, um domínio CL.

9. ENGENHARIA DA FUNÇÃO EFETORA Pode ser desejável modificar o anticorpo da presente invenção com relação à função efetora, por exemplo, de forma a aumentar a citotoxicidade mediada por células dependente de antigeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser obtido por meio da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos emuma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteina pode(m) ser introduzido(s) na região Fc, de forma a permitir a formação de ligações dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico gerado desta forma pode possuir capacidade de internalização aprimorada e/ou morte celular mediada por complemento aprimorada e citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Vide, Caron et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B., J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade antitumoral aumentada também podem ser preparados utilizando reticulantes heterobifuncionais, o ————-—-—-—-——— |

. . so conforme descrito em Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que possui regiões Fc duplas e pode, portanto, apresentar capacidades aprimoradas de ADCC e lise por complemento. Vide, Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um epítopo de ligação tipo receptor de recuperação nos anticorpos (especialmente um fragmento de anticorpo), conforme descrito na Patente US 5.739.277, por exemplo. Da forma como utilizada no presente, a expressão “epítopo de ligação do receptor de recuperação” designa um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IgG, IgG>2, IgG3 ou IgG«) que é responsável pelo aumento da meia vida da molécula de IgG in vivo no soro.

10. IMUNOCONJUGADOS O antagonista ou anticorpo utilizado nos métodos da presente invenção é opcionalmente conjugado com outro agente, tal como um agente — citotóxico, ou citocina, A conjugação normalmente será alcançada por meio de uma ligação covalente, a natureza precisa das quais será determinada pela molécula alvo e o sítio de ligação sobre o antagonista de integrina beta7 ou polipeptídeo anticorpo. Normalmente, um agente não peptídico é modificado pela adição de um ligante que permite a conjugação do anticorpo anti-integrina beta7 pelas suas cadeias laterais de aminoácidos, cadeias de carboidratos, ou grupos reativos introduzidos em anticorpos por modificação química. Por exemplo, uma droga pode ser acoplada através do grupo amino-e de um resíduo de lisina, por meio de um grupo amíino-a livre, por traça de dissulfeto em um resíduo de cisteina, ou pela oxidação do 1,2-dióis em uma cadeia de carboidratos com ácido periódico para permitir a ligação de medicamentos contendo vários nucleófilos através de uma ligação de base de Schiff, Vide, por exemplo, a Patente US 4.256.833. Agentes de modificação de proteina incluem ne |

Do 81 | reagentes amina-reativos (por exemplo, ésteres reativos, isotiocianatos, aldeíidos e haletos de sulfonila), reagentes tióis-reativos (por exemplo, derivados haloacetil e maleimidas), e ácido carboxílico reativos e aldeído reativos. Os polipeptídeos anticorpos ou antagonistas de integrina beta7 podem serligados covalentemente a agentes peptídicos por meio do uso de reagentes de reticulação bifuncionais. Reagentes heterobifuncionais são mais comumente usados e permitem o acoplamento controlado de duas proteínas diferentes com o uso de duas metades reativas (por exemplo, tiol mais amino-reativo, iodoacetamida ou maleimida). A utilização dos referidos agentes de ligação é bem conhecida no estado da técnica. Vide, por exemplo, Brinkley supra, e Patente US 4.671.958. Ligantes peptídicos também podem ser empregados. Alternativamente, um polipeptíideo anticorpo anti-integrina beta7 pode ser ligado a uma fração peptídica pela preparação de um polipeptídeo de fusão. Exemplos adicionais de agentes de acoplamento de proteína bifuncional incluem propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio)) (SPDP), succinimidil-4-(N maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como cloreto de adipimidato de dimetila), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeido), compostos bis-azido (tais como bis-(p-azidobenzoila)- hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolieno) e compostos fluorados bis-ativos (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno),

11. IMUNOLIPOSSOMAS Os anticorpos anti-integrina beta7 descritos na presente invenção podem também ser formulados na forma de imunolipossomas. Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos elou surfactantes que são úteis para a entrega de uma droga a um mamífero. Os componentes do lipossoma são comumente arranjados em uma formação e o ——m—m—-—-—-—-—e e- ep | i 82 de dupla camada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas. Os lipossomas que contêm o anticorpo são preparados por meio de métodos conhecídos no estado da técnica, conforme descrito, por exemplo, em Epstein et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 77:4030 (1980); Patentes US 4,485.045 e US 4.544.545 e o documento WO 97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Os lipossomas com maior tempo de circulação também são descritos na patente US

5.013.556. Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados por meio do método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipideos que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrudados através de filtros com tamanho de poro definido para gerar lipossomas com o diâmetro desejado.

Os fragmentos Fab' de um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser conjugados com os lipossomas conforme descritos em Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) por meio de uma reação de intercâmbio de dissulfetos. Um agente quimioterápico está opcionalmente contido no interior do lipossoma. Vide Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989).

12. VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES PARA À

PRODUÇÃO DE ANTICORPO A invenção também fornece ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos anti-beta7 ou agentes polipeptídicos descritos no presente, vetores e células hospedeiras contendo os ácidos nucleicos e técnicas recombinantes para a produção de anticorpos.

Para a produção recombinante do anticorpo, os ácidos nucleicos que codificam este podem ser isolados e inseridos em um vetor de clonagem replicável para clonagem adicional (amplificação do DNA), ou para expressão,

RM | o

Do 83 Em outro exemplo de realização, o anticorpo pode ser produzido por recombinação homóloga, por exemplo, conforme descrito na Patente US

5.204.244, especificamente incorporada ao presente pela referência. O DNA codificador do anticorpo monocional é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes vetores, geralmente incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição (por exemplo, como a descrita na Patente US 5.534.615 emitida em 9 de julho de 1996, especificamente incorporada ao presente pela referência). Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores da presente invenção são células de procariotos, leveduras, ou células eucarióticas superiores descritas acima. Células hospedeiras apropriadas para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como a Escherichia ou, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Enwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, tal como a Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli tal como o B. subtiis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrita na DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989), Pseudomonas tal como a P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é a E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas sejam apropriadas, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estes exemplos são ilustrativos e não limitántes, Além dos procariotos, micróbios eucariotos tais como fungos

NNE |

: i 84 filamentosos e leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores que codificam o anticorpo anti-integrina beta7. | Saccharomyces cereviísiae ou fermento comum é o microorganismo eucarioto mais comumente utilizado dentre os microorganismos hospedeiros eucariotos inferiores.

Entretanto, uma variedade de outros gêneros, espécies e cepas são comumente disponíveis e úteis para a presente invenção, tal como, Schizosacecharomyces pombe; Kluyveromyces; hospediros como, por exemplo, K,. factis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltil (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K . fhermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Píchia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Sechwanniomyces como, por exemplo, Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus, tal como A. nídulans e A. niger.

Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos anti- beta7 glicosilados são derivadas de organismos eucariotos multicelulares.

Exemplos de células de invertebrados incluem células de vegetais e de insetos.

Foram identificadas numerosas cepas de baculovírus e células hospedeiras de insetos variantes e correspondentes permissivos a partir de hospedeiros como, Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquitos), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de fruta) e Bombyx mori.

Uma variedade de cepas virais para a transfecção está disponível publicamente, por exemplo, a variante L-1 da Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 da Bombyx mori NPV, e esses vírus podem ser usados como o vírus de acordo coma b presente invenção, particularmente na transfecção de células da Spodoptera frugiperda.

Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiras.

RS Ca Ea |

' ' 85 Entretanto, há um maior interesse em células de vertebrados e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornaram- se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares de hospedeiros mamíferos incluem linhagem CV1 de rim de macaco transformada com SV40(COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et a/., J. Gen. Virol, 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TMA4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de rim de rato “buffalo ral” (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor da mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCLS51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpos anti- integrina beta7 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as sequências desejadas.

As células hospedeiras utilizadas para a produção de anticorpos anti-integrina beta7 para os métodos desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios de cultura, Meios de crescimento comercialmente disponíveis, tais como o meio Ham's F10 (Sigma), Meio Essencial Mínimo |

| Do 86 | (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM, Sigma) são adequados para o cultivo de células hospedeiras, Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enzymol. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 1: 255 (1980), Patente US 4.767.704, US

4.657.866, US 4.927.762, US 4.560.655, US 5.122.469 documentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou o pedido de Patente US 30.985, podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado, se necessário, com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como a insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como a adenosina e timidina), antibióticos (como o fármaco GENTAMYCINAS), oligoelementos (definidas como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte equivalente de energia. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos em concentrações adequadas que seria conhecida pelos técnicos no assunto. As condições de cultura tais como, temperatura, pH, e similares são aquelas. anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e será evidente para o técnico hábil no assunto.

Quando técnicas recombinantes são utilizadas, os anticorpos podem ser produzidos intracelularmente, no espaço periplasmático ou secretados diretamente no meio. Se o anticorpo é produzido de forma intracelular, como uma primeira etapa, os residuos particulados, tanto de células hospedeiras quanto fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, através de centrifugação ou ultra-filtração. Carter et al., Bio/Technology 10:163- 167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos secretados no espaço periplasmático da E. coli Em resumo, a pasta celular é fundida na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fenilmetilsulfonilfluoreto

RR |

: ' 87 (PMSF) durante 30 minutos. Os resíduos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é secretado no meio, o sobrenadante destes sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados através do uso de um filtro de concentração protéico comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de utrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor ! de protease tal como o PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acima para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes indesejados. A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada através do uso, por exemplo, de cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína À pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas y,, Y2, Ou ya humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth, 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongos e para a ys humana (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). A matriz ao qual o ligante de afinidade é acoplado é mais frequentemente, agarose, mas também outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro com poros controlados ou polifestirenodivinil)benzeno permitem velacidade de fluxo mais rápido e tempo de processamento mais curto do que aqueles que podem ser alcançados com a agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio Cu3, a resina Bakerbond ABXº (J. T. Baker, —Phillipsburg, NJ) é útil para purificação, Outras técnicas para a purificação de proteína tais. como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE?, cromatografia em uma resina de troca catiônica ou

E |

' 88 aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocusação, SDS-PAGE, e precipitação em sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado. Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica em PH baixo utilizando um tampão de eluição com um pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sal (tal como, cerca de 0 a 0,25 M de sal).

C. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS As formulações terapêuticas compreendendo os agentes terapêuticos, antagonistas ou anticorpos da presente invenção são preparadas para o armazenamento misturando o anticorpo que possui o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington's Pharmaceutical Sciences 16º edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de soluções aquosas, liofilizada ou em outras formulações secas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de — octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, ácool butílico ou benzilico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunogiobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluíndo à glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açucares tais como sacarose, manitol, Mn |

Do 89 trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tal como sódio; complexos metálicos (tal como, complexos Zn-proteina); e/ou tensoativos não-iônicos tais como TWEENº, PLURONICS* ou polietileno glicol (PEG). A presente formulação também pode conter mais de um composto ativo de acordo com a necessidade para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não prejudique um ao outro, Tais moléculas estão adequadamente presentes na combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser armazenados em microcápsula preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por meio de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões, Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16º Edição, Osol, A.

Ed. (1980). As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis.

Isso é facilmente obtido por meio da filtragem através de membranas de filtragem estéreis, Podem ser fabricadas preparações de liberação sustentada, Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contenham a imunoglobulina da presente invenção, em que as matrizes se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas, Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli- (metacrilato de 2-hidroxietila) ou álcool polí-(vinílico)), poli-lactídeos (patente US 3.773.919), copolimeros de ácido L-glutâmico e y-etil L-glutamato, acetato teh |

Do 90 | de etilenovinila não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico - ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOTº (microesferas injetáveis compostas de copolimero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácidoláctico-ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas. por períodos de tempo mais curtos. Quando encapsulados, as imunoglobulinas permanecem no corpo por um longo período, elas podem desnaturar ou se agregarem como resultado da exposição à umidade a 37 ºC, resultando na perda da atividade biológica e possíveis em mudanças na sua imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser concebidas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se é descoberto que mecanismo de agregação é a formação de pontes S-S intermoleculares através do intercâmbio tio-dissulfeto, a estabilização poderia ser obtida pela modificação de resíduos sufidrila, liofiização de soluções ácidas, controlando o conteúdo de umidade, utilizando aditivos adequados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas. D. MÉTODOS DE TRATAMENTO Os antagonistas de integrina beta7, tais com anticorpos anti- beta7 da invenção (e agentes terapêuticos adjuntos) podem ser administrados por qualquer via adequada, que inclui as vias parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para o tratamento local, a administração intralesionall.. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é administrado adequadamente por meio de infusão pulsada, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. Preferencialmente, a dosagem é fornecida, por exemplo, por meio de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte se a

NR

Do 91 administração é breve ou crônica.

A composição dos agentes terapêuticos da invenção pode ser formulada, dosada, e administrada de forma consistente com a boa prática médica. Fatores que devem ser considerados neste contexto Incluem o distúrbio específico a ser tratado, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica do paciente o local de entrega do agente, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O agente terapêutico não precisa ser, mas opcionalmente é, formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar os distúrbios em questão. À quantidade eficaz dos outros agentes mencionados depende da quantidade de anticorpos da invenção presentes na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos anteriormente. Estes são geralmente utilizados na mesma dosagem e com as vias de administração utilizadas conforme mencionado anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens até entãoempregadas.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um antagonista de beta7 da invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes tais como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o agente é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, se houve e qual foi a terapia anterior, do histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e o critério do médico atendente. O antagonista de beta7, tal como um anticorpo beta7 é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou ao longo de uma sériedetratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 mg/kg a 15 mg/kg de anticorpo é uma dose inicial candidata para a administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Uma dosagem

MRE | o 92 diária típica poderá variar em cerca de 1 mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima, Para as administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra a supressão pretendida dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estará na faixa de cerca de 5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 15 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg ou 50 mg/kg (ou qualquer combinação destas) podem ser administradas ao paciente, Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou pelo menos a cada dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, dez, vinte semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses de anticorpo). Pode ser administrada uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Um regime terapêutico exemplar compreende a administração de uma dose de ataque inicial de cerca de4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes terapêuticos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e ensaios convencionais, Dependendo do resultado desejado do tratamento, o paciente pode ser tratado por cerca de pelo menos 1, 2, 6, 12, 24, 36 ou 52 semanas.

O padrão de cuidado para pacientes com CU moderada-grave ativa envolve a terapia com doses padrão de: um aminossalicilato, um corticosteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e/ou azatioprina. A terapia com um antagonista de integrina beta7, tal como um anticorpo anti-integrina beta7 conforme divulgado no presente, resultará em uma melhora na remissão da doença (controle rápido da doença e/ou remissão prolongada), e/ou resposta clínica, superior quando comparada com aquela alcançada com padrão de tratamento para estes pacientes.

RR |

! ' 93 Em um exemplo de realização, o tratamento da presente invenção para a doença inflamatória intestinal (DII) em um paciente humano com DII compreende a administração de uma quantidade eficaz de um agente terapêutico ao paciente, tal como um anticorpo anti-integrina beta7, e compreende ainda a administração de uma quantidade eficaz de um segundo medicamento ao paciente, que é um imunossupressor, um agente de controle da dor, um agente antidiarréico, um antibiótico, qu uma combinação destes.

Em um exemplo de realização, o segundo medicamento mencionado é selecionado do grupo constituído por aminossalicilato, corticosteróide oral, 6-mercaptopurina (6-MP) e azatioprina. Em outro exemplo de realização, o dito segundo medicamento é outro antagonista de integrina beta7, tal como outro anticorpo anti-integrina beta7 ou anticorpo contra uma | citocina.

Todos segundos medicamentos podem ser usados em combinações entre si ou sozinhos com o primeiro medicamento, de modo que a expressão "segundo medicamento", conforme usado no presente, não significa que o segundo medicamento é apenas “uma” medicação além do primeiro medicamento, respectivamente. Assim, o segundo medicamento não precisa ser um medicamento, mas pode constituir ou representar mais de um medicamento.

Estes são segundos medicamentos conforme estabelecido anteriormente, são geralmente utilizados na mesma dosagem e com as mesmas vias de administração utilizadas conforme mencionado anteriormente Ou cerca de 1 a 99% das dosagens até então empregadas. Se tais segundos medicamentos são utilizados, opcionalmente, eles são usados em quantidades menores do que se o primeiro medicamento não estivesse presente, especialmente nas dosagens subsequentes além da dosagem inicial com o primeiro medicamento, de modo a eliminar ou reduzir os efeitos colaterais tee |

' ' 94 provocados por este.

Por exemplo, a terapia com anticorpos anti-integrina beta7 permite a redução ou a suspensão da administração de esteroides.

A administração combinada no presente inclui a coadministração, utilizando formulações separadas ou uma única formulação farmacêutica e a administração consecutiva em qualquer ordem, onde preferencialmente existe um período de tempo quanto ambos (ou todos) os agentes ativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.

A administração combinada de um segundo medicamento inclui a | coadministração — (administração — concomitante), utilizando formulações º 10 separadas ou uma única formulação farmacêutica, e administração consecutiva ; em qualquer ordem, onde preferencialmente existe um período de tempo quanto ambos (ou todos) os agentes ativos (medicamentos) exercem | simultaneamente suas atividades biológicas.

E, Uso DE BIOMARCADORES PARA AVALIAR O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS INFLAMATÓRIOS GASTROINTESTINAIS COM ANTAGONISTAS DE INTEGRINA BETA7 A presente invenção diz respeito aos métodos de avaliação do efeito, eficácia, segurança, prognóstico e/ou dosagem de agentes terapêuticos (ou drogas), tais como antagonistas de integrina beta7, para o tratamento de distúrbio inflamatório gastrointestinal.

Especialmente, a presente invenção refere-se a métodos de uso do nível de linfócitos de retorno intestinal (“gut- homing") no sangue periférico de pacientes, o nível de ocupação de uma droga sobre os linfócitos de retorno intestinal, e/ou o nível de receptores integrina beta7 em linfócitos de retorno intestinal como indicadores (ou “biomarcadores”) . do efeito, eficácia, segurança, prognóstico e/ou dosagem de agentes 1 25 terapêuticos, tais como antagonistas de integrina beta7 para o tratamento de distúrbios inflamatórios gastrointestinais.

Tais métodos incluem, por exemplo, à avaliação da responsividade de um paciente no tratamento de um distúrbio gastrointestinal com um antagonista de integrina beta7, usando um ou mais |

' ' 95 | | desses biomarcadores. Adicionalmente, a presente invenção fornece métodos | de uso de tais biomarcadores para a elaboração de um tratamento | medicamentoso e/ou regime terapêutico, ou para o prognóstico. | Em alguns aspectos, o nível de biomarcadores antes do | 5 tratamento do paciente com um agente terapêutico é comparado com o nível dos mesmos biomarcadores durante e/ou após o tratamento do paciente, e : uma mudança (por exemplo, aumento ou diminuição) do nível deste biomarcador no paciente é indicativo do efeito, eficácia, segurança e/ou prognóstico do agente terapêutico, por exemplo, um antagonista de integrina “10 beta7, para o tratamento de um distúrbio inflamatória gastrointestinal em um . paciente. Adicionalmente, tais métodos da presente invenção podem ser usados para o delineamento de um tratamento medicamentoso ou regime terapêutico para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente,

1. PREDIÇÃO E/OU ACOMPANHAMENTO DA RESPONSIVIDADE Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para determinar a eficácia de um antagonista de integrina beta7 no tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, compreendendo o dito o método a comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com o antagonista de integrina beta7, pela quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com amostra ' obtida antes do tratamento, é indicativa da eficácia do antagonista no tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para predição da responsividade de um paciente que possui uma doença gastrointestinal inflamatória ao tratamento com um antagonista de integrina | O ———

! Do 96 f í beta7, compreendendo o dito o método na comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com o antagonista de integrina beta7, pela quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, de modo que uma mudança na quantidade de biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com a amostra obtida antes do tratamento é indicativa da capacidade de resposta (responsividade), do dito paciente ao tratamento com o dito antagonista, Em um exemplo de realização específico, a presente invenção fornece um método para predizer se um paciente diagnosticado com um | “10 distúrbio inflamatório gastrointestinal será sensível a um tratamento que - compreende a administração de uma beta7, O método compreende a comparação de uma quantidade de linfócitos de retorno intestinal em uma amostra de sangue do paciente após o tratamento com a quantidade de linfócitos de retorno intestinal antes do tratamento, de modo que uma quantidade elevada após o tratamento com o antagonista de integrina beta7 indica que o paciente responde ao tratamento. A quantificação da quantidade de biomarcadores, incluindo linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, a ocupação do ' antagonista de integrina beta7 sobre os linfócitos de retorno intestinal, e os receptores integrina beta7 em linfócitos de retorno intestinal, oferece a vantagem de predizer a responsividade de um paciente ao tratamento com um antagonista de beta7 nos estágios iniciais durante o curso de tratamento, bem como logo após o paciente receber a primeira dose do antagonista de beta7, Desse modo, um paciente e o médico do paciente não precisam esperar até : 25 queotratamento seja concluído para descobrir se o tratamento ofereceu algum benefício ao paciente, ! Em um exemplo de realização da presente invenção, o método 1 para predizer a responsividade ao tratamento com um antagonista de beta7 |

O |

| MD MM . Do 97 compreende as etapas de: a) obtenção de uma amostra de sangue de um | paciente antes do tratamento; b) quantificação da quantidade de biomarcador em uma amostra de sangue; c) administração de um antagonista de integrina beta7 ao paciente; d) obtenção de uma amostra de sangue do paciente após receber o antagonista de integrina beta7, e) quantificação da quantidade de biomarcadores na amostra de sangue; f) comparação entre a quantidade de biomarcador dosando em b) e a quantidade de biomarcador dosado em e). Se ' ' uma quantidade elevada entre e) e b) é observada, o paciente será responsivo ao tratamento. o Para estabelecer um nível basal de pré-tratamento dos - biomarcadores, a dosagem da quantidade de biomarcadores em diferentes períodos antes do tratamento é preferível, por exemplo, pelo menos, 1, 2,5, 10, 20, 30, 40 dias antes do tratamento.

Em um exemplo de realização, a quantidade de linfócitos de retorno intestinal na amostra de sangue do paciente é dosadaem 5, 10,20, 30,60 dias antes do tratamento.

A média dos valores da quantidade mensurada em cada intervalo é calculada e será usada como o nível basal de pré-tratamento de línfócitos de retorno intestinal.

Para predizer a responsividade do paciente ao tratamento com antagonistas de integrina beta7, a quantidade de biomarcadores no sangue do paciente pode ser mensurada em qualquer período durante o curso do tratamento, e preferencialmente, nos estágios iniciais durante o curso do tratamento, por exemplo, mas não se limitando a, no prazo de cerca de 8 horas, 12 horas, 1, 2, 4, 10, 20, 50, 100, 300 e 500 dias após o paciente ter Na recebido a primeira dose, e preferencialmente de 1 a 50 dias após o paciente ter recebido a primeira dose.

Em um exemplo de realização, a quantidade de | biomarcadores é mensurada em um único momento de interesse durante o. curso do tratamento.

O valor obtido no momento mensurado é comparado com o nível basal pré-tratamento para gerar o valor diferencial para este momento. es eo 2 e ne | o |

Do 98 Em outro exemplo de realização, a quantidade de biomarcadores é mensurada em diferentes períodos (pontos temporais) (por exemplo, em pelo menos 2, 4, 6, 8, 10, 16, 20, 40 pontos temporais) durante o curso de tratamento.

O valor obtido no momento mensurado é comparado com o nível basal pré-tratamento parageraro valor diferencial para cada período mensurado.

A responsividade ao tratamento será avaliada com base na análise desses valores diferenciais.

Os linfócitos de retorno intestinal são identificados pelos níveis de expressão de uma combinação de biomarcadores, por exemplo, mas não se limitando a, CD4, CD45RA e Beta7, utilizando os métodos disponíveis no “10 estadoda técnica, por exemplo, pela análise por citometria de fluxo (FACS) e : etc.

O subconjunto de população de linfócitos com diferentes padrões de expressão destes marcadores são identificados por meio de técnicas padrões usadas no estado da técnica, tal como a citometria de fluxo (FACS). A separação de células ativadas por fluorescência (FACS) fornece um método para classificar uma mistura heterogênea de células biológicas em dois ou mais recipientes, uma célula de cada vez, com base no espalhamento de luz específico e características fluorescentes de cada célula.

É um instrumento científico útil, pois proporciona a gravação rápida, objetiva e quantitativa de sinais fluorescentes a partir de células individuais, bem como a separação física das células de particular interesse.

A suspensão de células é arrastada no centro de um fluxo estreito com rápido escoamento de líquido, O fluxo é disposto de modo que há uma grande separação entre as células em relação ao diâmetro destas.

Um mecanismo de vibração faz com que o fluxo de . células quebre em gotas individuais, O sistema é ajustado de modo que haja uma baixa probabilidade de mais de uma célula esteja em uma gota.

Pouco antes da quebra do fluxo em gotas, o fluxo passa através de uma estação de medição de fluorescência onde a característica fluorescente de interesse de cada célula é mensurada.

Um anel de carregamento elétrico de carga elétrico é |

| | l Vo so colocado exatamente no ponto onde o fluxo é quebrado em gotas.

A carga é colocada no anel com base na medição de intensidade de fluorescência imediatamente anterior e a carga oposta é presa na gota enquanto o fluxo é quebrado, As gotas carregadas caem então através de um sistema de deflexão — eletrostática que desvia as gotas em recipientes com base em suas cargas.

Em alguns sistemas a carga é aplicada diretamente no fluxo e a gota separada retém a carga de mesmo sinal que o fluxo.

O fluxo então retorna ao ponto neutro após a separação da gota.

Os dados gerados pelo citômetro de fluxo pode ser plotado em uma única dimensão para produzir um histograma, ou em gráficos de pontos . de duas dimensões ou mesmo três dimensões.

As regiões nestes gráficos podem ser sequencialmente separadas, com base na intensidade de fluorescência, criando uma série de subconjunto de extrações, denominadas "gates", Existem protocolos específicos utilizando a estratégia “gate” para fins diagnósticos e clínicos.

Os gráficos são frequentemente feitos em escala logarítmica.

Como os diferentes corantes fluorescentes emitem sinais com espectros que se sobrepõem, os detectores precisam ser eletronicamente, bem como computacionalmente compensados.

Muitas vezes, os dados acumulados utilizando o citômetro de fluxo podem ser reanalisados em outro lugar, liberando a máquina para que outras pessoas possam utilizar (Loken MR "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting" 341-53. Wiley. (1990). Normalmente, em uma amostra de sangue de pacientes : humanos, três subconjuntos de linfócitos CD4* no sangue periférico podem ser —distinguidos pela citometria de fluxo com os biomarcadores da presente invenção: Células CD45RA” B7*"º, que retornam preferencialmente para os linfonodos e tecidos intestinais, células CD45RA” B7º***, que retornam preferencialmente para linfonodos e tecidos periféricos, e células CD45RA* |

NEN | , 100 g7íntemedíário que não se localizam preferencialmente em linfonodos e tecidos linfáticos e periféricos.

Assim, os linfócitos de retorno intestinal podem ser identificados pelo menos por CD4* CD45RA" B7*'º, ou outros marcadores de superfície celular ou uma combinação destes, tais como CD8* CD45RA" B7*"*º emuma citometria de fluxo.

Esses três subgrupos de linfócitos localizados em partes distintas de um gráfico de pontos ou histograma de uma análise de FACS e, portanto, são distinguíveis por um técnico hábil no assunto.

A quantidade de linfócitos de retorno intestinal pode ser quantificada de várias maneiras no estado da técnica.

A contagem absoluta “10 comouma percentagem dos níveis basais na pré-dose pode ser calculada para - as subpopulações de linfócitos CD4* de retorno intestinal em cada momento nas amostras coletadas de um paciente.

Também pode ser calculado são os números absolutos para cada subconjunto respectivo de linfócitos, o que equivale com à contagem absoluta de linfócitos (um valor obtido a partir de quantificações hematológicas expressas como linfócitos por microlitro de sangue periférico) vezes o percentual de linfócitos capturados para cada subconjunto (obtido a partir da citometria de fluxo). Os linfócitos de retorno intestinal também podem ser quantificados por meio da contagem de anticorpos, que são contagens absolutas como uma percentagem da contagem de anticorpo basal obtida antes da administração; calculada como a contagem de anticorpo dividida pela média da contagem absoluta na pré-dose.

Como controle, a quantidade de outro subconjunto de linfócitos, como a quantidade de linfócitos de retorno periférico, também pode ser mensurada para a mesma ' amostra em cada momento (ponto temporal). A quantidade de ocupação do antagonista de integrina beta 7 i sobre os linfócitos de retorno intestinal e a quantidade de receptores integrinas beta 7 em linfócitos de retorno intestinal também pode ser mensurada usando técnicas conhecidas e divulgadas nos Exemplos do presente pedido, |

| ' 101 Um tratamento que provavelmente irá fornecer uma resposta benéfica ao paciente deverá aumentar significativamente a quantidade de linfócitos de retorno intestinal no sangue do paciente, sem aumentar substancialmente a quantidade de linfócitos de retorno periférico na amostra de | 5 sanguedo paciente. Preferencialmente, o tratamento aumenta a quantidade de biomarcadores em cerca de pelo menos 30%, 50%, ou em 1,2, 3, 4 ou 5 | veze(s) em 1, 2, 4, 6, 8, 20, 30, 50, 100 dias após o tratamento, em comparação com o nível de basal pré-tratamento. Em um exemplo de | realização específico, um aumento de pelo menos 3 ou 5 vezes é indicativo de “10 umaresposta eficaz ao tratamento.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de prognóstico para predizer a probabilidade de resposta benéfica em um paciente diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal submetido a um tratamento que compreende a administração de um antagonista de integrina beta7 ao dito paciente, compreendendo a comparação da quantidade de biomarcadores em uma amostra de sangue do dito paciente após ter recebido o antagonista de integrina beta7 com a quantidade antes do tratamento, de modo que uma quantidade aumentada de biomarcadores na amostra de sangue após o paciente ter recebido o antagonista de integrina beta7 é indicativo de uma probabilidade de resposta benéfica. Assim como na predição da capacidade de resposta (responsividade) ao tratamento, a quantificação de marcadores no sangue periférico pode ser usada para predizer a probabilidade de respostas benéficas . à longo prazo. As respostas benéficas incluem, mas não se limitam a, redução ou eliminação de um ou mais sintomas típicos do distúrbio inflamatório i gastrointestinal, tal como dor abdominal, náuseas, vômitos, diarreia, movimentos intestinais frequentes, febre, fadiga e perda de peso, ou alcançando a remissão total ou parcial das doenças. A quantidade de linfócitos | i ' 102 de retorno intestinal nas amostras de sangue do paciente pode ser quantificada com os mesmos métodos descritos no presente.

Um tratamento que provavelmente irá fornecer respostas benéficas a longo prazo ao paciente deverá aumentar significativamente a quantidade de biomarcadores no sangue do paciente, sem aumentar substancialmente a quantidade de linfócitos de retorno periférico.

Preferencialmente, o tratamento aumenta a quantidade de biomarcadores em cerca de pelo menos 1, 2, 3, 5, 8, 10 veze(s) em 1,2,4,6, 8, 20, 30, 50, 100 dias após a primeira administração do antagonista de integrina beta7 ao paciente em comparação ao nível basal pré-tratamento.

Ao Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método - de monitoramento da responsividade de um paciente diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal a um tratamento com um antagonista de integrina beta7 compreendendo o acompanhamento da quantidade de | marcadores no sangue períférico do dito paciente durante o dito tratamento, de modo que uma quantidade elevada mantida em relação ao período anterior ao do tratamento indica que a resposta a esse tratamento é mantida, Especificamente, o nível basal de pré-tratamento da quantidade de biomarcadores em um paciente testado é calculado como descrito no presente.

Para monitorar a resposta do paciente a um tratamento com um antagonista de integrina beta7, a quantidade de biomarcadores nas amostras de sangue do paciente pode ser mensurada em qualquer ponto temporal dado durante o curso do tratamento e, preferivelmente em vários pontos temporais ao longo do curso do tratamento, Por exemplo, a quantidade de biomarcador é mensurada pelo menos a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 dias, dependendo da duração do tratamento ou eficácia desejada do tratamento.

A i responsívidade ao tratamento em reação a uma intervenção ocorrida também pode ser monitorada usando essa abordagem.

Por exemplo, a quantidade dos biomarcadores nas amostras de sangue do paciente pode ser mensurada logo

| i ' 103 após a administração de um segundo medicamento ou iniciando uma dosagem alterada, ou quaisquer alterações nos estados físico ou mental do paciente e etc.

Idealmente, um nível elevado de manutenção dos linfócitos de retorno intestinal deve ser observado para se manter uma responsividade ao tratamento.

Se o nível de biomarcadores diminuir em algum momento durante o tratamento ou em reação a certos eventos, é indicativo de que o paciente tem uma capacidade de resposta reduzida ao tratamento.

O regime de tratamento deve ser modificado adequadamente para manter uma quantidade elevada de biomarcadores, A presente invenção, portanto, também inclui um método de - modificação de um tratamento com um antagonista de beta7 para um paciente diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal compreendendo: a) o monitoramento da responsividade do dito paciente ao dito tratamento com o método descrito acima, e b) a alteração do dito tratamento para que uma quantidade elevada dos ditos linfócitos seja mantida.

A presente invenção inclui um método para determinação da dosagem ou regime terapêutico de um antagonista de integrina beta7 para o tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, compreendendo o método no ajuste da dose ou regime terapêutico de antagonista de integrina beta7 com base na comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra do paciente após ou durante o tratamento com uma dosagem ou regime terapêutico de antagonista de integrina beta7, pela quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do . tratamento, de modo que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com o valor obtido antes do | tratamento, é indicativa da eficácia ou responsividade na dose ou regime i terapêutico do antagonista de integrina beta7 para o tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente. | i 104 |

2. ELABORAÇÃO DOS REGIMES DE TRATAMENTO O desenvolvimento de medicamentos é um processo complexo e | caro. O custo de trazer uma nova droga ao mercado é estimado entre 800 milhões e 1 bilhão de Dólares. Menos de 10% dos medicamentos na fase | de ensaios clínicos conseguem chegar a fase de aprovação. As duas razões principais pelas quais as drogas fracassam nas fases finais são uma falta de compreensão da relação entre a concentração dose-resposta e eventos de segurança imprevistos. Diante desse cenário, é fundamental possuir ferramentas que auxiliem na predição de como será o desempenho da droga in i 10 vivo e auxiliar no sucesso de um candidato terapêutico clinico (Lakshmi : Kamath, “Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development" (2006)). A farmacocinética (PK) caracteriza as propriedades de absorção, distribuição, metabolismo e eliminação de uma droga. A farmacodinâmica (PD) definearesposta fisiológica e biológica para o fármaco administrado. O modelo PK/PD estabelece uma relação matemática e teórica entre estes dois processos e ajuda a prever melhor a ação da droga. O modelo PK/PD integrado e o desenvolvimento de ensaios clínicos assistido por computador por meio de simulação estão sendo incorporados nos programas de desenvolvimento de fármacos e muitos estão tendo um impacto crescente (Lakshmi Kamath, "Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development” (2006)). A experimentação PK/PD é geralmente realizada em todas as - fases do processo de desenvolvimento de fármacos. Como o desenvolvimento —estáse tornando cada vez mais complexo, demorada e oneroso, as empresas i pretendem fazer melhor uso dos dados PIK/PD para eliminar candidatos terapêuticos falhos no início e identificar aqueles com melhores chances de sucesso clínico. (Lakshmi Kamath, supra). |

| MN | OO 105 As abordagens do modelo PI/PD têm se demonstrado úteis na determinação das relações entre a resposta de biomarcadores, os níveis de drogas e os regimes terapêuticos, O perfil PK/PD de um fármaco candidato e a capacidade de predizer a resposta de um paciente é fundamental para o sucesso dos ensaios clínicos.

Recentes avanços em técnicas de biologia molecular e uma melhor compreensão de alvos para diversas doenças têm validado biomarcadores como um bom indicador clínico da eficácia terapêutica dos medicamentos.

Ensaios de biomarcadores ajudam a identificar uma resposta biológica a um fármaco candidato.

Uma vez que um biomarcador é clinicamente validado, simulações de ensaios podem ser delineadas de forma - eficaz, Os biomarcadores têm o potencial para alcançar o status de substituto que um dia poderá substituir os resultados clínicos no desenvolvimento de medicamentos. (Lakshmi Kamath, supra). A quantidade de marcadores no sangue periférico pode ser utilizada na identificação da resposta biológica ao tratamento com os antagonistas de integrina beta7 e pode, portanto, funcionar como um bom indicador clínico para a eficácia terapêutica de um tratamento candidato.

A presente invenção inclui um método de elaboração de um tratamento com um agente candidato a um paciente humano diagnosticado comum distúrbio inflamatório gastrointestinal, que compreende em determinar uma dosagem eficaz para o paciente humano com base em uma dosagem que aumenta de maneira eficaz a quantidade de um biomarcador no sangue periférico de um paciente não humano em resposta ao tratamento com o . agente candidato mencionado, em que o biomarcador é selecionado a partir de um grupo que consiste em linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação do dito agente terapêutico nos linfócitos de retorno intestinal, e receptores integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal.

Em um exemplo de realização, um método de elaborar um a i ' 106 tratamento com um antagonista de integrina beta7 para um paciente | diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal compreende as | etapas: a) de quantificação da quantidade de biomarcadores em amostra de sangue de um indivíduo não humano em resposta a um tratamento candidato compreendendo a administração de uma dose de um antagonista de integrina | beta7 candidatos ao dito indivíduo não humano, b) determinar se a dosagem | candidata pode aumentar de maneira eficaz a quantidade de biomarcadores no | sangue periférico do indivíduo não humano; c) identificar a dosagem que | aumenta eficazmente a quantidade dos biomarcadores no sangue periférico do indivíduo não humano, e d) determinar uma dosagem eficaz para um paciente . humano com base na dosagem identificada, Em um exemplo de realização, o método da presente invenção é utilizado para identificar as dosagens candidatas que podem proporcionar uma | resposta benéfica desejável em um ensaio clinico de Fase || e/ou de Fase Ill.

A amostra de sangue do indivíduo não humano testado é coletada antes de receber o tratamento candidato no ensaio clínico de Fase |, e um nível basal dos biomarcadores no sangue periférico do indivíduo é estabelecido conforme descrito na Seção E1 do presente pedido. O indivíduo não humano testado recebe em seguida um tratamento candidato compreendendo a administração de uma dose candidata de um antagonista de integrina beta7 ao indivíduo testado. A amostra de sangue é novamente coletada do indivíduo em todos os pontos temporais (intervalos) desejados durante o curso do tratamento, conforme descrito na Seção E1, ou após o término do tratamento.

- A quantidade de biomarcadores em resposta ao tratamento candidato será primeiramente comparada com o valor basal de pré-tratamento para determinar o valor diferencial em comparação ao valor basal de pré-tratamento para o tratamento candidato. Se o tratamento candidato suscitar um aumento significativo, por exemplo, em pelo menos um aumento de 50%, 1, 2,3,5, 8 ou | oO 107 10 vezes, na quantidade de biomarcadores, a dose será selecionada como uma dose candidata para o tratamento nos ensaios clínicos de Fase || ou Fase . Os linfócitos de retorno intestinal podem ser identificados por meio de técnicas convencionais na tecnologia atual e conforme descrito na seção E1 do presente pedido, especialmente por meio de marcadores de superfície celular, tais como CD45AR, CD4 (CD8) e beta7. A quantidade de biomarcadores pode ser quantificada por meio de abordagens disponíveis no estado da técnica e descrita na Seção E1, O processo descrito acima pode ser usado por várias vezes para | i 10 avaliar a pureza de tratamentos candidatos, especialmente uma pureza de - doses candidatas, A dosagem candidata gera o aumento ótimo na quantidade : de linfócitos das dosagens candidatas testadas que serão selecionadas para o | delineamento do tratamento nos ensaios clínicos de Fase || ou Fase Ill, Em um exemplo de realização, o mesmo indivíduo não humano pode ser testado para cada uma das purezas de dosagens candidatas, Após o término de um tratamento candidato, o efeito residual do tratamento será avaliado utilizando métodos do presente pedido, por exemplo, analisando se a quantidade de biomarcadores retorna para o nível basal pré-tratamento. Após o retorno da quantidade de biomarcadores para o nível basal pré-tratamento, outro tratamento candidato pode ser entregue ao mesmo indivíduo para verificar o seu efeito sobre os linfócitos de retorno intestinal. Em outra modalidade, uma pureza de tratamento candidato poderá ser testada em diversos indivíduos ao mesmo tempo, com cada tratamento candidato dado para cada indivíduo.

- Vários indivíduos precisam ser testados para o mesmo regime candidato para eliminar as diferenças individuais entre os indivíduos em resposta ao mesmo tratamento.

A dosagem candidata selecionada no ensaio clinico Fase | será usada para desenvolver a dosagem ideal para os ensaios clínicos Fase 1! e Ill |

' ' 108 usando abordagens padrão no estado da técnica, incluindo, mas não se limitando, ao modelo PK/PD. O modelo PK/PD tradicional no desenvolvimento de medicamentos define parâmetros como a concentração da dose de fármaco, efeitos de exposição ao fármaco, meia-vida do fármaco, concentrações de fármacos contra o tempo e os efeitos dos fármacos contra o tempo. Quando usados de forma mais ampla, as técnicas quantitativas, tais como modelos de fármacos, modelos de doenças, modelos de avaliação e modelos de mercado podem apoiar o processo de desenvolvimento, que resulta em melhores decisões pela consideração explícita do risco e melhor utilização do conhecimento. Uma variedade de ferramentas de modelos PK/PD - estão à disposição dos pesquisadores de desenvolvimento de fármacos, por exemplo, a base de dados “WinNonlin and the Knowledgebase Server" (PKS), desenvolvida pela Pharsight, Inc,., Mountain View, Califórnia. F. BIOMARCADOR PARA RESPONSIVIDADE AO TRATAMENTO DE OUTROS AGENTES

CANDIDATOS A quantidade dos biomarcadores também pode ser usada para predizer a responsividade ao tratamento com um agente terapêutico candidato que não seja o antagonista de integrina beta7. Especificamente, os métodos para a predição do resultado de um tratamento com um antagonista de | 20 integrina beta7 descritos no presente podem ser usados da mesma maneira para: 1) predizer se um paciente responderá a um tratamento compreendendo a administração de um agente terapêutico candidato ao paciente, 2) predizer a probabilidade de benéfico do tratamento, 3) monitorara a responsividade do - paciente ao tratamento, e 4) modificar o tratamento com o agente terapêutico candidato. A quantidade dos biomarcadores também pode ser usada para i elaborar um tratamento com um agente terapêutico candidato que não seja o antagonista de integrina beta7 utilizando os métodos descritos acima. Preferencialmente, o agente candidato oferece um efeito benéfico |

| ' 109 aos pacientes com doença inflamatória intestinal, tal como um agente imunossupressor descrito no presente, Mais preferivelmente, o agente inibe a infiltração dos linfócitos de retorno intestinal para dentro do intestino do paciente, seja direta ou indiretamente.

G.

PREDIÇÃO DO PROGNÓSTICO Além da predição da responsividade ao tratamento, a quantidade de biomarcadores também é útil na predição do prognóstico de uma doença inflamatória intestinal.

A presente invenção inclui, portanto, um método de predição do prognóstico de uma doença inflamatória intestinal em um paciente, que - compreende: a) em mensurar a relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e a quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue do mesmo paciente, e b) mensurar a relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e a quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue de um indivíduo saudável, de modo que uma mudança na relação no dito paciente quando comparada com a do indivíduo saudável é indutiva do prognóstico da doença.

A fim de predizer o prognóstico, as amostras de sangue de uma variedade de indivíduos saudáveis são obtidas, A quantidade de linfócitos de retorno intestinal, especificamente células CD4* CD45RA' B7º"º, é mensurada com métodos da presente invenção.

A quantidade de linfócitos de retomo períférico (CDA5SRA' B7** CD4") também são mensuradas nas mesmas amostras de sangue, A relação da quantidade de linfócitos de retorno intestinal ' versus a quantidade de linfócitos de retorno periféricos é então calculada para cada amostra de sangue, Uma relação basal média de indivíduos saudáveis é estabelecida com base na relação de cada indivíduo sadio.

Esta relação basal será usada como um controle para determinar se uma relação diminuída é observada em um paciente analisado.

A amostra de sangue é obtida a partir do | i ' 110 paciente testado e a relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal contra a quantidade de linfócitos de retorno periférico é calculada.

Se uma alteração significativa (aumento ou diminuíção) da relação é observada | para o paciente em comparação com o controle basal, como uma alteração de pelomenos cerca de 30%, 50%, 100%, 200%, o paciente provavelmente terá | um mau prognóstico, por exemplo, uma baixa probabilidade de remissão, alta probabilidade de reincidência, surto ou resistência às drogas.

H.

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS O anticorpo humanizado anti-integrina beta7, rhuMAb Beta7, se ' 10 liga à subunidade beta 7 da integrina independentemente de seu parceiro de - ligação.

Desse modo, o rhuMAbBeta7 se liga a beta7 quando ela está sozinha, ou quando está associada a alfa4 ou alfaE, Assim, este anticorpo e os variantes deste são bons marcadores para identificar a população de linfócitos compreendendo linfócitos que expressam a integrina alfaEbeta7 e/ou a integrina alfa4beta7. Em um exemplo de realização preferido, a população identificada de linfócitos compreende linfócitos expressando a integrina alfaEbeta7, linfócitos expressando a integrina alfaábetar e linfócitos expressando tanto a integrina alfa4beta7 como a integrina alfaEbeta7. Este é diferente dos anticorpos anti- beta7 encontrados na tecnologia atual, como o ACT1I (Meenan ef al., Supra), que só podem se ligar à subunidade beta7 quando ela está conectado a alfad4. A presente invenção está relacionada a um método para a identificação de uma população de linfócitos que compreende linfócitos a expressando a integrina alfaEbeta7 e/ou alfa4beta7, compreendendo a ligação —dosditos linfócitos com um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopo de um anticorpo que compreende uma sequência da região variável de cadeia leve SEQ ID NO: 10, e uma sequência da região variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 11. |

Em um exemplo de realização, o método da presente invenção é utilizado para identificar linfócitos expressando beta7 no sangue periférico de um paciente. Especificamente, a amostra de sangue do paciente é coletada e a população de linfócitos compreendendo células que expressam a integrina alfalbeta7, células que expressam a integrina alfa4beta7 e células que expressam ambas integrinas pode ser identificada e isolada usando citometria | de fluxo com beta7, CD4 e CD4A5AR como marcadores de superfície celular. | Em outro exemplo de realização, o método da presente invenção | é utilizado para visualizar população de linfócitos que compreende células que expressam a integrina alfaEbeta7 e células que expressam a integrina alfa4beta7 em linfonodos e tecidos intestinais de um paciente através de um procedimento padrão utilizado no estado da técnica, tal como a imuno- coloração com o rhuMAbBeta7, O método descrito na presente invenção é particularmente útil paraadetecçãode uma população de linfócitos intimamente relacionada com o desenvolvimento e a progressão da doença inflamatória intestinal, A população identificada, especialmente a população obtida a partir do sangue periférico de um paciente, pode ser usada como um biomarcador na predição da responsividade do paciente ao tratamento, bem como no delineamento de regimes de tratamento, conforme descrito nas Seções E e F.

O relatório descritivo descrito acima é considerado como sendo suficiente para permitir que técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas construções depositadas, uma vez que as realizações depositadas tem a intenção apenas de ilustrar alguns aspectos da invenção e quaisquer construções. que são funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da presente invenção. O depósito de material no presente não constitui uma admissão de que a descrição escrita e nele contida é suficiente para permitir a | prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o melhor modo de realização desta, nem é para ser interpretada como limitante do escopo das reivindicações, Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partirda descrição acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Considera-se que a execução dos ensinamentos da presente invenção para um problema ou situação específica estará dentro das capacidades de um especialista no assunto perante os ensinamentos contidos nestedocumento, ' Detalhes adicionais da invenção são ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes. As divulgações de todas as citações no relatório descritivo são expressamente incorporadas ao presente pela referência,

EXEMPLOS EXEMPLO 1 | ESTUDO DA SEGURANÇA E TOXICOCINÉTICA DE 12 SEMANAS COM RHUMAB BETA7 | ADMINISTRADO SEMANALMENTE POR VIA ENDOVENOSA E INJEÇÃO SUBCUTÂNEA EM MACACOS CINOMOLGOS COM UMA FASE DE RECUPERAÇÃO DE 15 SEMANAS E UMA

FASE DE EXTENSÃO PARA AVALIAR A REVERSÃO DOS EFEITOS FARMACODINÂMICOS

1. RESUMO O rhuMAb Beta7 é um anticorpo monoclonal humanizado anti- integrina B7 humana que se liga à integrina BE B7 e B4 B7. As células que expressam estas integrinas têm sido associadas com doenças inflamatórias do intestino, como a colite ulcerativa e a doença de Crohn (Feagan ef al 2005;, Sandbom ef al 2005). O rhuMAb Beta7 está sendo investigado como um potencial terapêutico para doenças mediadas pelo sistema imune, como a doença inflamatória intestinal. O objetivo deste estudo foi avaliar a segurança, toxicocinética e farmacodinâmica do rhuMAb Beta7 quando administrado np

| i 113 semanalmente por via intravenosa (1,V.) ou por injeção subcutânea (SC) a macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) por pelo menos 12 semanas e avaliar a reversibilidade, persistência e ao aparecimento tardio dos efeitos relacionados com a droga após uma recuperação de 15 semanas. Além disso, os subconjuntos de animais do grupo controle, grupos de dose-alta e dose- | média foram observados por um período adicional antes da necropsia (durante ' a fase de extensão) para avaliar a reversão de efeitos farmacodinâmicos. Macacos cinomolgos Naives foram distribuídos em seis grupos (7 animais/sexo/grupo nos Grupos 1, 3,4, 5e 6 e 5 animais/sexo no Grupo 2). Os animais do grupo 1 receberam um total de 12 doses semanais de veículo por injeção iv e sc. A animais do grupo 2-6 receberam um total de 12 doses semanais de rhuMAb Beta7 a 5 mg/kg por via IV (Grupo 2), 15 mg/kg por via IV (Grupo 3), 50 mg/kg por via IV (Grupo 4), 15 mg/kg por via SC (Grupo 5), ou 50 mglkg por via SC (Grupo 6), respectivamente, Após a fase de administração de 12 semanas, três machos e três fêmeas de cada grupo de tratamento foram necropsiados no Dia 80 do estudo, que foi dois dias após a última dose. O restante dos animais foi observado durante 15 semanas adicionais durante a fase de recuperação. Ao final da fase de recuperação (no Dia 184 do Estudo), 2 animais/sexo/grupo foram necropsiados. Após a necropsia realizada na recuperação de 15 semanas, os animais restantes (2 machos e uma fêmea de cada um dos Grupos 1 e 3; e 2 machos e 2 fêmeas de cada um dos grupos 4, 5 e 6) foram observados para avaliar a reversão dos efeitos PD. Os parâmetros PD foram monitorados durante esta fase de extensão e os resultados foram utilizados para determinar o fim da fase em vida do estudo.

Três subconjuntos de linfócitos CD4* do sangue periférico, subdivididos de acordo com suas propriedades de retorno, foram monitorados por citometria de fluxo como marcadores exploratórios da PD. Células CD4*: CD45RA: B7º*º, CD45RA" B7º** e CDA5RA* pz7itemedário (vide Fígura 1). As |

| 114 células CD4* CD45RA" B7*"º são fenotipicamente semelhante aos linfócitos | efetores/de memória de humanos e camundongos que se direcionam preferencialmente para os linfonodos e tecidos intestinais, enquanto que as células CD4* CD45RA' B7º***º são fenotipicamente semelhantes aos linfócitos | 5 efetores/de memória de humanos e camundongos que se direcionam preferencialmente para os linfonodos e tecidos periféricos (Rott ef a/ 1996;, Rott | et al 1997;. Williams et al 1998;. Rosé et al 1998;. Williams e Butcher, 1997; | Butcher et al, 1999). As células CD4* CD45RA” p7'temédio são fenotipicamente | similares aos linfócitos naive de humanos e camundongos, transitam sem preferência aparente para ambos linfonodos intestinais e periféricos (Rott ef al. | 1996;. Rott et al. 1997;. Williams et al. 1998... Rosé et al. 1998. ; Williams e Butcher, 1997; Butcher ef a/., 1999). Os valores médios dos grupos de linfócitos CD4* CD45RA' p7*"º aumentou em aproximadamente 4 a 5 vezes em relação aos níveis basais durante o período de dosagem, após a administração intravenosa de 5 mg/kg de rhuMAb Beta7. A administração de 15 mg/kg ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 (IV ou SC) resultou em um aumento um pouco maior (cerca de 5 a 6 vezes) no número médio do grupo de linfócitos CD4* CD45RA' B7º"º durante a fase de administração, em comparação com níveis basais.

Em geral, a maioria dos animais que receberam 15 ou 50 mg/kg (IV ou SC) tiveram efeitos PD prolongados durante a fase de administração, ao contrário da maioria dos animais dos grupos com dosagem de 5 mg/kg.

Os animais que receberam veículo não apresentaram alterações significativas no número médio do grupo de linfócitos CD4* CD45RA” B7º"* no sangue periférico.

O número médio do grupo de linfócitos CD4* CD45RA* grintemediário = linfócitos CD4" CD45RA B7º*"** não foram substancialmente diferentes nos macacos cinomolgos administrados com veículo ou rhuMAb Beta7. Estes resultados são consistentes com o mecanismo de ação proposto pelo rhuMAb Beta7 - a | inibição do retorno em linfócitos B7 positivos para o intestino, através da prevenção da ligação do B4 B7 com seus ligantes. Este mecanismo proposto deverá levar ao acúmulo de linfócitos CD4" CD45RA" B7º*"º na circulação periférica.

Até o final da fase de recuperação de 15 semanas (no Dia 15 do estudo), o número de linfócitos CD4" CD45RA” B7*"º regressaram aos níveis basais em todos os animais que receberam 5 mg/kg em doses IV de rhuMAb Beta7 (10 de 10). Nos grupos que receberam doses [V de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7, o número de linfócitos CD4* CD45RA' B7*"* regressaram aos níveis basais em 7 de 13 e 2 de 14 animais, respectivamente. Nos grupos que receberam doses SC de 15 ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7, o número de CD4* | CD45RA* preto regressaram aos níveis basais em 6 de 14 e 1 de 14 animais, respectivamente, Assim, a taxa de retorno do número absoluto de linfócitos CD4* CD45RA' B7*"º aos níveis basais pareceu ser dependente da dose. Até o final da fase de extensão da PD (Dia 288 do Estudo), todos os macacos cinomolgos que permaneceram no estudo (n = 3 no grupo que recebeu 15 mg/kg IV e n = 4 em cada um dos grupos que recebeu 50 mg/kg IV , 15 mg/kg via SC ou 50 mg/kg via SC) demonstraram que houve reversão dos efeitos de PD (retorno aos níveis basais de linfócitos CD4* CD45RA' B7º"), Além disso, os efeitos da PD parecem estar relacionados com a farmacocinética, devido à reversibilidade observada e o retorno aos níveis. basais de linfócitos CD4* CD45RA" B7º"* correlacionados com a depuração do rhuMAb Beta7 e a reversibilidade pareceu ser dose-dependente.

A variabilidade entre os animais do mesmo grupo nas mesmas doses quanto a taxa de retorno de efeitos PD para os níveis pré-dose se correlacionou com as alterações na depuração do rhuMAb Beta7.

2. SEGURANÇA, TOXICOCINÉTICA E FARMACODINÂMICA A segurança, toxicocinética e farmacodinâmica do rhuMAb Beta7 e O —p—-—-— | foi avaliada quando administrado semanalmente por injeção intravenosa (IV) ou injeção subcutânea (SC) em macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) por pelo menos 12 semanas e avaliado a reversibilidade, persistência e aparecimento tardio dos efeitos da droga após uma recuperação 15 semanas. — Além disso, os subconjuntos de animais do grupo controle, dose-alta e dose- média foram observados por um período adicional antes da necropsia (durante a fase de extensão) para avaliar a reversão dos efeitos farmacodinâmicos.

2.1 MATERIAL DE ENSAIO O rhuMAb Beta7, lote M3-TOX165, foi fornecido pela Genentech como um líquido claro em uma concentração de 150 ma/ml (1,8 mL por frasco). Antes de sua utilização no estudo, o agente de teste foi armazenado em geladeira para permanecerem em uma faixa de temperatura de 2 ºC a 8 ºC. O veículo, veículo do rhuMAb Beta7, Lote M3-TOX166, foi : fornecido pela Genentech como um líquido claro em 25 mL. Antes da sua utilização no estudo, o veículo foi armazenado em geladeira para permanecerem em uma faixa de temperatura de 2 ºC a 8 ºC. 2,2 EsPÉCIES Macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) Naíves, originários da Maurício, foram obtidos a partir da Covance Research Products, Inc. (Harrisburg, PA). Os animais foram aclimatados por cerca de quatro semanas antes do inicio da administração.

Quarenta e sete machos e 47 fêmeas foram inicialmente climatizados para possivel utilização no presente estudo. Os dados coletados durante a aclimatação (fase pré-dose) foi usado para eliminar os animais a — partirdas considerações para a seleção do estudo para produzir uma variação mínima. Quarenta macacos cinomolgos machos e 40 fêmeas foram classificados para o estudo utilizando um procedimento informatizado concebido para atingir o equilíbrio de peso corporal em relação aos grupos. —

2.3 ELABORAÇÃO DO ESTUDO Este estudo compreendeu três fases: uma fase de administração de 12 semanas, uma fase de recuperação de 15 semanas e uma fase de | extensão. A fase de administração de 12 semanas terminou na necropsia no | 5 Dia80 do Estudo, dois dias após a última dose de rhuMAb Beta7 que foi administrada, A fase de recuperação de 15 semanas seguinte a fase de administração de 12 semanas terminou na necropsia no Dia 184 do Estudo. Após a fase de recuperação de 15 semanas, houve um período adicional (uma fase de extensão até o Dia 288 do Estudo) para avaliar a reversão dos efeitos 10 dePD,A elaboração do estudo completo está resumido na Tabela 1. TABELA 1

RESUMO DO ESTUDO . Nível da Conc. Da Volume da Via de Nº./ b t ' Grupo o Dose Dose Dose administração — Sex? (ma/kg/dose) (ma/mL) (ml/kg/dose) 1(Controle)* IVISC 7IM, 7/F o o 0,33 2 (Baixo) WN S/M, S/F 5 15 0,33 3 (Médio) WN TIM, 7/F 15 45 0,33 4 (Alto) WN 7IM, 7/F 50 150 0,33 (Médio) * se 7IM, 7/F 15 45 0,33 6(Alto)* sc 7IM, 7/F 50 150 0,33 IV = intravenosa; SC = subcutânea. * Após uma fase de administração de 12 semanas (2 dias após a últimadose), 3 animais/sexo/grupo foram sacrificados. O restante dos animais foram submetidos a uma fase de recuperação, Após a fase de recuperação de 15 semanas, 2 animais sexo/grupo foram sacrificados. Dois animais sexo/grupo dos Grupos 4, 5 e 6; e 2 animais machos e 1 fêmea / grupo dos Grupos 1 e 3 foram observados por um período adicional antes da necropsia para determinar areversão dos efeitos de PD. Os parâmetros de PD foram monitorados durante |

' 118 esta fase de extensão e os resultados foram utilizados para determinar o momento do término. ?” Os animais foram administrados nos Dias 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71 e 78 do Estudo. * Animais do Grupo 1 receberam veículo (controle) com injeções IV e SC. º* Grupos 5 e 6 receberam apenas injeções SC de rhuMAb Beta7.

2.5 Dose DE ADMINISTRAÇÃO Os animais receberam 12 injeções semanais |V através da veia | safena ou por injeção SC em nos Djas 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64,71 e | 10 78 do Estudo. Os locais das injeções administradas SC foram documentados. As doses foram determinadas com base no peso corporal mais recente registrado. Os animais foram dosados com volume de 0,33 ml por quilo de peso corporal. As injeções |V, foram seguidas por uma descarga de solução salina de aproximadamente 1 mL. Estes desvios foram documentados e não afetaram a interpretação dos resultados da PD.

2.6 COLETA DE AMOSTRAS DE SANGUE PARA PD Amostras de sangue (aproximadamente 1 mL) para análise da PD foram coletadas de cada animal por punção venosa da veia femoral uma vez durante a fase de pré-dose (aproximadamente seis dias antes do início da administração), antes administração no Dia 1 do Estudo, no Dia 2 (24 horas após a primeira dose), antes da administração nos Dias 15, 29, 43, 57, 71 e 78 do Estudo, e no Dia 80 do Estudo, antes das necropsias. Durante a fase de recuperação de 15 semanas (R), as amostras foram coletadas nos Dias 92 (R13) 106 (R27), 120 (R41), 134 (R55), 148 (R69), 162 (R83) e 184 (R105) do Estudo. Durante a fase de extensão, as amostras de sangue foram coletadas da cada de todos os animais duas semanas após o Dia 190 (R111) do Estudo, até e incluindo o dia da necropsia final (Dia 288 do Estudo), para avaliar a o UT — | reversão dos efeitos da PD.

2.7 PROCESSAMENTO DA AMOSTRA DE SANGUE PARA PD As amostras para análise da PD foram embalados em pacotes de gel refrigerado para permanecerem a uma temperatura de cerca de 2 ºC a 15 ºC porpelomenos 72 horas e enviadas para a Genentech no dia da coleta.

2.8 ENSAIOS DE CITOMETRIA DE FLUXO PARA PD Três subconjuntos de linfócitos CD4* do sangue periférico foram : avaliados por citometria de fluxo como biomarcadores exploratória da PD: l Células CD4* CD45RA” B7º"*º (fenotipicamente semelhante aos linfócitos efetores/de memória que se direcionam preferencialmente para os linfonodos e | tecidos intestinais), células CD4' CD45RA' pB7”** (fenotipicamente semelhantes aos linfócitos efetores/lde memória que se direcionam preferencialmente para os linfonodos e fecidos periféricos e células CD4” CD45RA' g7intemédio rfenotipicamente similares aos linfócitos naíve de humanos que se localizam sem preferência aparente em linfonodos e tecidos intestinais e periféricos) (Rott et a/. 1996; Rott et al. 1997; Williams et al. 1998; Rosé et al. 1998; Williams e Butcher 1997; Butcher ef al. 1999). Um gráfico representativo da citometria de fluxo dos subconjuntos de linfócitos CD4" em macacos cinomolgos é exibido na Figura 1. Subconjuntos de linfócitos CD8* do sangue periférico (linfócitos CD8*: CD45RA” B7º"º, CD45RA” B7º**, e CD45RA* grintemediário) foram examinados de forma semelhante, mas não foram utilizados nas avaliações de PD,

2.8.1 ENSAIO DE EXPRESSÃO: AVALIAÇÃO DE SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS EXPRESSANDO B7 NO SANGUE PERIFÉRICO Linfócitos CD45RA' B7ºº, CD45RA' B7**, e CD45RA* pgrintemediário CD4* ou CD8 + foram avaliados por citometria de fluxo utilizando um anticorpo anti- B7?não bloqueador (9D8), que se liga a B7 na presença do rhuMAb Beta7. A configuração do painel para a análise de amostras de sangue e CO —p—— a] | total é apresentada na Tabela 2. Todos os anticorpos foram adquiridos da BD Biosciences (BD, San Jose, CA), com exceção da estreptavidina-aloficocianina (S-APC), que foi adquirida da Invitrogen Corp (Carlsbad, CA) e 9D8-Biotina que foi fornecido pela Genentech. TABELA 2 | CONFIGURAÇÃO DO PAINEL DE SANGUE TOTAL PARA MENSURAR LINFÓCITOS | EXPRESSANDO B7 Isotipo usado para capturar à população IgG-FITC, IgG-PE, CD4-PerCP-Cy5.5, SA- 1 na SSC e FSC e para definição de

APC marcadores de quadrante CD45RA-FITC, CD49d-PE, Subconjunto de células expressando 04 e ? CD4-PerCP-Cy5,5, 9D8-Biatina/SA-APC? B7 de linfócitos CD4* CDASRA-FITC, CD49d-PE, Subconjunto de células expressando a4 e ? CDS-PerCP-Cy5.5, 9D8-Biotina /SA-APCº B7 de linfócitos CD8* APC = aloficocianina; FICT = isotiocianato de fluoresceina; FSC = dispersão frontal; IgG = imunoglobulina G; PE = ficoeritrina =; PerCP-Cy55 = proteína peridinina clorofila-cianina-5,55/ SA = estreptavidina; SSC = dispersão lateral. * 9D8- Biotina foi primeiro incubado, antes da adição de S-APC Para todas as amostras de sangue total, o ensaio de citometria de fluxo foi realizado de acordo com o Procedimento 55,656 43. Paracada amostra, os tubos 2 e 3 foram previamente incubados com uma concentração saturada de 9D8-Biotina. Os tubos controle para ajuste do instrumento (controle isotípico e coloração única) e os tubos teste (tubos 1, 2 e 3) foram preparados manualmente. Após a primeira incubação, 2 mL de solução de lise foram adicionados para lisar as hemácias, seguido de um ciclo de lavagem da célula. Para a segunda incubação, as |

| | 121 amostras (tubos 2 e 3) foram incubadas com concentrações saturadas de anticorpos monoclonais conjugados com fluorescência, tanto para CD4 (clone L200) (tubo 2) como para CD8 (Clone SK1) (tubo 3), juntamente com CD45RA (Clone 5H9 ) e CD49d (clone 9F10), ou anticorpos isotipo | 5 controle (tubo 1). Cada um dos anticorpos indicado acima, com exceção dos anticorpos de controle isotípico, reagem cruzadamente com : leucócitos de macacos cinomolgos.

A S-APC também foi adicionada aos tubos 1, 2 e 3 para detecção de anticorpos Biotina.

As incubações foram realizadas no escuro, em gelo triturado por 30 + 5 mínutos.

Uma série de etapas de lavagem foi realizada e as células foram ressuspendidas em tampão fixador.

As amostras foram realizadas entre 2 ºC e 4 ºC por um período mínimo de 30 minutos e adquiridas no mesmo dia.

A aquisição da citometria de fluxo foi realizada em um FACSCAaliburO (BD, número de série E2020). Vinte e cinco mil eventos de linfócitos foram adquiridos usando um gráfico de pontos de dispersão frontal (FSC) / dispersão lateral (SSC). A análise dos dados foi baseada nos linfócitos capturados nos “gates” seleionados no FSC/SSC tanto com linfócitos gated CD4* / SSCP*** como com linfócitos CD8* / SSCcP*e usando o programa de computador “CellQuest software Pro" (BD CellQuest Pro, versão 5.2.1). Os citogramas de fluxo foram gerados para estabelecer a fração de células positivas para cada marcador de superfície celular.

As subpopulações de B7 foram analisadas como uma percentagem de células com definições de seleção "gate” CD4* e “gate” CD83*, e separadamente, como a média geométrica da intensidade de fluorescência (MGIF). Para analisar os níveis relativos de B7 na superfície das células CD4* e CD8', moléculas de fluorescência equivalente solúveis (MOEF) foi calculada multiplicando-se a MGIF de cada o o O —p—mp—--—pJ-—-uJa) | população, com uma curva padrão gerada usando esferas Spherotech (Spherotech, Inc.; Lake Forest, IL). A MGIF e a percentagem de células no "gate" selecionado foram monitoradas durante todo o estudo para avaliar o efeito do artigo teste em cada um dos três subgrupos de | 5 linfócitos CD4*'* e CD8*. A contagem absoluta foi calculada para cada amostra em cada período, com base na contagem de linfócitos por microlitro de sangue periférico (fornecido pelo Covance).

2.8.2 ENSAIO DE OcuPAÇÃO: LinFóciTos CD45R- B7º""º DISPONÍVEIS NO SANGUE

PERIFÉRICO A ocupação de B7 em linfócitos CD4* CD45RA' B7*"* e linfócitos CD8* CD45RA' B7º*"* foi mensurada usando um anticorpo anti- B7 bloqueador (artigo teste marcado com fluorescência, r»huMAb Beta7) que não se liga na presença de concentrações saturantes de rhuMAb Beta7. O HerceptinO conjugado com fluorescência, um anticorpo I9G1 humanizado, foi utilizado como controle isotípico para o rhuMAb Beta7.

A configuração do painel para a análise de amostras de sangue total é apresentada na Tabela 3, Todos os anticorpos foram adquiridos da BD, com exceção do Herceptin Alexa-647 e rhuMAb Beta7 Alexa-B47, que foram fornecidos pela Genentech, TABELA 3 CoNFIGURAÇÃO DO PAINEL DE SANGUE TOTAL PARA MENSURAR À OCUPAÇÃO DE B7 Nos LiNFóciToS 1 CDA4-FITC, CD4SRA-PE, CD8PerCP, Her- Her-Alx647 utilizado como controle Abx647 isotípico para rhuMAb Beta7 2 CDA4-FITC, CD45RA-PE, CD8PerCP, rhuMAb — Insaturados, para detectar a ocupação Beta7-AIx647 de B7 3 CDA4-FITC, CDASRA-PE, CD8PerCP, rhuMAb — Saturado com 10 ug/mL de rhuMAb Beta7-Alx647 Beta7 ————————p—p——————---—P—m—n.a |

AlXx647 = Alexa-647; FITC = isotiocianato de fluoresceina; Her = Herceptina, PE = ficoeriterina; PerCP = proteína clorofila peridinina Amostras de sangue foram coradas de acordo com o Processo 55656-50, com concentrações saturantes dos seguintes anticorpos conjugados: CD4 conjugado com isotiocianato de fluoresceina (FITC; clone M-T477), CD45RA conjugado com ficoeritrina (PE; clone 5H9), CD8 conjugado com PerCP (clone SK1) e Herceptina conjugada com Alexa-647 ou rhuMAb Beta7 conjugado com Alexa-647. No tubo 3, o rhuMAb Beta7 foi adicionado nas amostras de sangue periférico em concentrações saturantes (10 pg/ml). Todas as incubações foram realizadas sobre o gelo e no escuro por 30 a 35 minutos. Após a coloração, o eritrócitos foram lisados, as amostras | foram lavadas e as células foram ressuspensas em tampão de fixação usando a solução Lyse Lavar Assistant (BD). Vinte e cinco mil eventos de linfócitos | 15 “gated” foram adquiridos através de um gate FSC / SSC no FACSCaliburº - BD. Os linfócitos foram identificados a partir de um diagrama SSC/FSC. As células CD4* e CD8* foram identificados através de um gráfico SSC/CD4 FITC ou SSC/CD8 PerCP, respectivamente. O Tubo 1 foi utilizado como controle negativo para as definições de seleção “gating”. O as células CD4 e CD8: CD45RA' B7º*º, CDASRA" B7ºº* e CD45RA* p7intemediário foram identificadas por tubos com e sem a concentração saturada de rhuMAb Beta7. A Figura 1 exibe as subpopulações de linfócitos CD4 no sangue periférico de Macacos cinomolgos.

2.9 ANÁLISE DE DADOS DA PD A contagem absoluta como percentagem dos níveis basais na pré- dose (contagens Abs, BL%) foi calculada para cada um dos subgrupos de linfócitos CD4* (CD45RA' B7ºº, CD45RA' B7ºº** e CD45RA* p7itemedáto) e o DC ———ccccc | subpopulações de linfócitos CD8'* (CD45RA' B7º"º, CDA45RA' B7º** e CD45RA” pimtemediário) em cada ponto temporal, nas amostras coletadas dos animais que receberam veículo ou rhuMAb Beta7. Os valores médios de cada um dos números absolutos, como percentagem dos valores basais, foram determinados para cada grupo Para fêmeas, dois valores de pré-dose foram utilizadas para calcular os valores iniciais para todas as avaliações de citometria de fluxo. Para os machos, devido a dificuldades técnicas (falha do instrumento), apenas um valor pré-dose (do Dia 1 do Estudo) foi utilizado para calcular os valores de referência para ensaios de expressão com o anticorpo 9D8 não bloqueador. Os valores capturados para linfócitos CD4* totais e CD8* totais obtidos (em percentagem) a partir da análise de citometria de fluxo com as configurações do painel exibido na Tabela 3 foram utilizados para calcular a contagem absoluta de linfócitos CD4* total e CD8* total, respectivamente, em tanto no ensaio de ocupação quanto de expressão. A Figura 1 exibe as. subpopulações linfocitárias CD* no sangue periférico de macacos cinomolgos. As definições dos valores determinados pela análise de citometria de fluxo são as seguintes: Contagens Abs: contagem absoluta de cada subconjunto respectivo de linfócitos; igual à contagem absoluta de linfócitos (um valor obtido | a partir de medições hematológicas, expressa em linfócitos por microlitro de sangue periférico) vezes o percentual de linfócitos capturados para cada subconjunto (obtido pela análise de citometria de fluxo).

Contagens Abs (% BL): contagem absoluta como uma percentagem da contagem Abs basal obtidas antes da dosagem; calculada como a contagem Abs dividida pela média da contagem absoluta da pré-dose.

MOEF: moléculas de fluorescência equivalente, calculada usando a inclinação do canal FL4 vezes a média geométrica da intensidade de fluorescência.

MOEF (% pré-dose): MOEF como uma percentagem de MOEF é a SS

| i 125 antes da dosagem; calculada como a MOEF na ponto temporal respectivo após a administração dividido pela MOEF média antes da dosagem.

3. RESULTADOS E DiscussÃo Média do Grupo (+ DP) e contagens absolutas (% BL) de macacos cinomolgos indivíduais para subconjuntos de linfócitos CD4* do sangue periférico avaliados com anticorpos 9D8 não bloqueadores são apresentadas nas Figuras 2-7, Os números dos valores médios do grupo de linfócitos CD4* CD45RA” B7º"* aumentou aproximadamente de 4 a 5 vezes em relação aos níveis basais após a administração intravenosa de 5 mg/kg de rhuMAb Beta7 (vide Figura 2). A administração de 15 mg/kg ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 (IV ou SC) resultou em um aumento um pouco maior (cerca de 5 a 6 vezes) no número dos valores médios do grupo linfócitos CD4* CD45RA' B7*", em comparação com níveis basais (vide Figuras 2 e 3). Em geral, a maioria dos animais que recebeu 150u50mg/kg (IV ou SC) apresentaram efeitos prolongados de PD durante a fase de dosagem, ao contrário da maioria dos animais do grupo com dosagens de 5 mg/kg (vide, Figuras 14-18). Os animais que receberam veículo não apresentaram | alterações significativas no número dos valores médios do grupo de linfócitos CDa+ CD45RA” B7º** (vide figuras 2 e 3). A médio do grupo de linfócitos CD4* CD4A5SRA" —B7ºº aumentou em cerca de 4 a 6 vezes em comparação aos níveis basais após a administração |V de 25 mg/kg de rhuMAb Beta7 (vide Figura 8).

Estes resultados são consistentes com o mecanismo de ação proposto do rhuMAb Beta7: inibição do tráfico de linfócitos CD45RA" B7*"* para o intestino, levando ao acúmulo dessas células na circulação periférica (vide Figura 11). Também —suportaomecanismo de ação proposto, em que não houve diferença significativa nos níveis médio do grupo de linfócitos CD4* CD45RA* B7intemedíáio 511 linfócitos CD4* CDA5RA” B7º** nos animais que receberam veículo em comparação com os animais que receberam rhuMAb Beta7 (vide Figuras 4-8).

EEE

Até o final da fase de recuperação de 15 semanas (Dia 184 do Estudo), o número de linfócitos CD4* CD45RA' B7** no sangue periférico regressaram aos niveis basais em 10 dos 10 animais no grupo recebeu doses de 5 mg/kg de rhuMAb Beta7 por via IV (vide Figura 14). Nos grupos que receberam doses de 15 mg/kg e 50 —mg/kgporvialV,a quantidade de linfócitos CD4* CD45RA' B7*** no sangue periférico ' retomou ao normal em 7 de 13 e 2 de 14 animais, respectivamente (vide Figuras 15- 16). Nos animais que receberam doses de 15 mg/kg e 50 mg/kg por via SC, o número de linfócitos CD4* CD45RA' B7*" voltou para níveis pré-dose em 6 de 14 e 1 de 14 animais, respectivamente (vide Figuras 17-18). Assim, o regresso aos valores iniciais dos efeitos da PD observada parece ser dose-dependente.

Não houve alterações substanciais no número de linfócitos CD4" CD45RA' B7º*** no sangue periférico de animais que receberam apenas veículo, com exceção de um animal, que exibiu uma ligeira variação (vide Figura 13). Até o final da fase de extensão da PD (Dia 288 do Estudo), todos os macacos cinomolgos administrados com rhuMAb Beta7 que permaneceram no estudo (n = 3 no grupo com dose de 15 mg/kg por via IV, n = 4 por grupo nos grupos com dose de 50 ma/kg por via IV, 15 ma/kg por via SC, e 50 mg/kg por via SC) demonstraram uma reversão dos efeitos da PD (retomo aos níveis basais de linfócitos CD4"* CD45RA' B7***; vide Figuras 15-18). Os subconjuntos de linfócitos CD8* do sangue periférico (linfócitos CD8* CD45RA' B7*º, CD45RA' BT, e CDA45RA* p7itemedáro) também foram examinados e foram observados resultados semelhantes.

Os níveis relativos da expressão de B7 nos linfócitos CD4* do sangue periférico foram examinados como MOEF.

Não houve evidências de modulação negativa (downmodulation) de B7 nos linfócitos CD4* do sangue periférico em macacos cinomolgos nas seguintes dosagens de 5, 15 ou 50 mg/kg por via IV de MhuMAb Beta7 ou dosagens de 15 ou 50 mg/kg por via SC de rhuMAb Beta7 (vide Figuras 19-22). CO —.—e—e+Õ—*Anm—— |

Em conclusão, a taxa de retomo aos níveis basais de linfócitos CD4* CD45RA gro no sangue periférico parece ser dose-dependente em macacos cinomolgos que receberam rhuMAb Beta7. Além disso, a maioria dos animais que receberam 15 ou 50 mg/kg (por via IV ou SC) apresentaram efeitos sustentados de PD durante afasede dosagem, ao contrário da maioria dos animais no grupo com dose de 5 mg/kg.

Além disso, os efeitos PD parecem estar relacionados com a farmacocinética, devido à reversibilidade observada e o retomo aos níveis basais de linfócitos CD4* CD45RA' B7**º correlacionado com a depuração de rhuMAb Beta7 e parece ser dose-dependente.

A variabilidade na taxa de retomo de efeitos PD até os níveis pré-dose entre os animais do mesmo grupo de dose está correlacionado com as alterações na depuração do rhuMAb Beta7. Estas alterações na depuração do MmMhuMAb Beta7 eram geralmente associadas à presença de anticorpos anti- terapêuticos (ATAs) em alguns animais (vide Figuras 14-18). 7, CONCLUSÕES Grupo médio de linfócitos CD4' CD45RA B7º*"* (características fenotípicas similares às células de retorno intestinal) aumentou cerca de 4 a 6 vezes em comparação com os niveis pré-dose, após dosagens de 5, 15 ou 50 mg/kg de rMhuMAb Beta7 por via IV ou SC em macacos cinomolgos.

Em contraste, os animais que foram tratados com veículo não apresentaram alterações significativas nos — vlaores médio dom grupo de linfócitos CD4* CD45RA' B7*"* no sangue periférico até o Dia 184 do Estudo.

Estes resultados são consistentes com o mecanismo de ação do TmhuMAb Beta7 na inibição do retomo (homing) de linfócitos B7 positivos para o intestino, através da prevenção da ligação do a4 B7 com seus ligantes.

Este mecanismo proposto deverá levar ao acúmulo de linfócitos CD4* CD45RA BT na circulação periférica, o que foi observado no estudo.

Os resultados apoia também o mecanismo de ação proposto, de modo que não houve diferença significativa no valores médio do grupo de linfócitos CD4* CD45RA* p7temedáro (características a —m—DArmr. |

' 128 fenotípicas similares às células CD4* naive) ou linfócitos CD4"” CD45RA” B7”* (características fenotípicas similares às células CD4* de retorno periférico) em macacos cinomolgos que receberam apenas veículo, em comparação com animais que receberam rhuMAb Beta7. Até o final da fase de recuperação de 15 semanas (no Dia 184 do Estudo ), o número linfócitos CD4* CD45RA' B7º* no sangue periférico voltou para os | níveis pré-dose em todos os animais (10 de 10) no grupo que recebeu doses de 5 mg/kg de rhuMAb Beta7 por via IV. Nos animais que receberam 15 mg/kg ou 50 mg/kg de rhuMAb Beta7 por via IV, o número de linfócitos CD4* CD45RA' B7** no sangue periférico voltou para níveis pré-dose em 7 de 13 e 2 de 14 animais no grupo administrados por via IV (respectivamente) e em 6 de 14 e 1 de 14 animais nos grupos administrados por via SC (respectivamente). Até o final da fase de extensão PD (DIA 288 do Estudo) todos os macacos cinomolgos administrados com rhuMAb Beta7 que permaneceram no estudo exibiram uma reversão dos efeitos PD. Estes resultados indicam um efeito dose-dependente no retomo aos níveis basais de linfócitos CD4* CD45RA' B7*"º no sangue periférico. Além disso, os efeitos PD parecem estar relacionados com a farmacocinética, devido à reversibilidade observada e retomo aos níveis basais do número de linfócitos CD4* e se correlacionaram com a depuração de rhuMAb Beta7. A taxa de variabilidade do — retomo dos efeitos PD até os níveis pré-dose entre os animais do mesmo grupo se correlacionou com alterações na depuração do rhuMAb Beta7, que foi associado com a presença de ATAs em alguns animais.

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ESTUDO PILOTO DE QUATRO SEMANAS PARA AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA E FARMACOCINÉTICA DO RHUMAB B7 (PRO145223) ADMINISTRADO SEMANALMENTE

POR VIA ENDOVENOSA EM MACACOS CINOMOLGOS COM VINTE E TRÊS SEMANAS DE

RECUPERAÇÃO ResuMO O rhuMAb B7 (também referido como PRO145223) é um anticorpo tipo imunoglobulina G1 (I9G1) humanizada anti- B7 humano que se liga à integrina a4 B7 e aE B7 em linfócitos humanos e de macacos cinomolgos (Macaca fascicularis). Acredita-se que as células que expressam as integrinas a4 B7 e aE B7 tem um papel fundamental nas doenças inflamatórias intestinais, como a colite ulcerativa (CU) e a doença de Crohn (DC). O rhuMAb B7 está sendo investigado como um potencial terapêutico para pacientes com doença inflamatória intestinal, comoabDCe CU. Os objetivos deste estudo foram de avaliar a segurança e os efeitos farmacocinéticos (PK) e farmacodinâmicos (PD) do rhuMAb B7 após a administração intravenosa (IV) uma vez por semana durante 4 semanas em macacos cinomolgos e caracterizar a reversibilidade de qualquer efeito adverso relacionado ao fármaco durante um período de recuperação de 23 semanas. Grupos de macacos cinomolgos receberam quatro doses semanais |V de veículo ou rhuMAb B7 em 5 ou 25 mg/kg. Três machos e três fêmeas de cada grupo de dosagem foram necropsiados sete dias após a última dose, os animais restantes

E ENS |

(2/sexo/grupo) dos grupo com veículo e dosagem de 25 mg/kg foram observados por 23 semanas após a última dose antes das necropsias.

Globalmente, o perfil tempo-concentração sérica de rhuMAb B7 após quatro doses semanais IV foi bifásico, com uma fase de rápida distribuição inicial seguida por uma fase de eliminação mais lenta.

Depois | de quatro doses semanais em bolus IV de 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 | aos macacos cinomolgos, as concentrações séricas aumentaram após a | segunda dose, exceto quando anticorpos anti-terapêuticos (ATAs) foram | detectados.

A área normalizada pela dose no perfil tempo-concentração sérico do dia O ao dia 7 (AUCº.;/dose) após a primeira dose foi semelhante para os grupos de dosagem de 5 mg/kg e 25 mg/kg, sugerindo que a o rhuMAb exibe uma farmacocinética dose-proporcional em macacos cinomolgos nas dosagens testadas.

Para a dosagem de 25 mg/kg, a AUCo-7 e a concentração sérica máxima (Cmax) aumentou cerca de 2 vezes após a última dose, em comparação com a primeira dose.

Ambos os resultados sugerem que houve acúmulo de rhuMAb B7 após quatro doses semanais IV de 25 mg/kg para macacos cinomolgos, no entanto, tal acúmulo é esperado para um anticorpo com uma meia-vida longa nas doses utilizadas, A análise compartimental dos dados em animais recuperados que receberam 25 mg/kg estimou uma depuração lenta de 2,93 mi/kg/ídia e uma meia-vida terminal relativamente longa de 14,5 dias.

No entanto, três dos quatro macacos tinham ATAs que provavelmente contribuiu para a rápida depuração do rhuMAb B7. A saturação de células T no sangue periférico e aumento dos níveis de células T B7* circulantes foram exploradas como marcadores PD.

Os ensaios de ocupação da integrina B7 sugeriu que receptores 87 de subpopulações de células T no sangue periférico foram totalmente saturados após as primeiras quatro doses semanais de 5 ou 25 mg/kg rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos.

À | —

ocupação de receptores B7 nas células T no sangue periférico foi mantida quando as concentrações séricas acima de aproximadamente 1-10 ug /mLea detecção de B7 disponível se correlacionou com a redução nas concentrações séricas de rhuMAb B7. Células-T CD45R- B7º"º (fenotipicamente similares às célulasT de retorno intestinal em humanos e camundongos) aumentou cerca | de 5 vezes em relação aos níveis basais após quatro doses semanais de 25 mg/kg em macacos cinomolgos, Da mesma forma, as Células-T CD45R* ' grvtemedário (fanotipicamente similares às células T naive) também aumentaram após quatro doses semanais de 25 mg/kg (aproximadamente 2,5 vezes em relação aos níveis basais), Em contrapartida, as células T CD45R- B7º** permaneceram estáveis durante o estudo, Estes resultados são consistentes com o mecanismo de ação do rhuMAb B7 Nomeadamente, a inibição do tráfico de linfócitos B7 positivos para o intestino por meio da inibição da ligação do a4 B7 com seus ligantes, que em seguida leva ao acúmulo 15º dessas células na circulação periférica. Esses fenômenos serão mais explorados em estudos futuros com macacos cinomolgos.

INTRODUÇÃO O rhuMAb B7 (também referido como PRO145223) é um anticorpo tipo imunoglobulina G1 (I9G1) humanizada anti- B7 humano que seligaaintegrina BE B7 e B4 B7 em linfócitos humanos e de primatas não humanos. O rhuMAb B7 bloqueia a interação da B4 B7 com a MadCAM-1, VCAM-1 e fibronectina com afinidades (50% da concentração inibitória máxima [ICso]) de 0,07 - 0,1 nM, e também bloqueia a ligação da aE B7 com a E-caderina a ICso de 5 nM. Acredita-se que as células que expressam integrinas BE B7 e B4 B7 possuem um papel importante nas doenças inflamatórias do intestino, tais como a doença de Crohn (DC) e a retocolite ulcerativa (CU). O rhuMAb B7 está sendo investigada como um potencial terapêutico para pacientes com doenças inflamatórias | intestinais, como a DC e a CU.

OBJETIVOS Os objetivos deste estudo foram avaliar a segurança, os efeitos farmacocinéticos (PK) e farmacodinâmicos (PD) do rhuMAb B7 após a administração intravenosa (IV) uma vez por semana durante 4 semanas em macacos cinomolgos (Macaca fascicularis) e caracterizar a reversibilidade de qualquer efeitos adversos relacionados com o artigo testado durante um período de recuperação de 23 semanas. O objetivo deste trabalho é relatar os resultados das análises PK e de citometria de fluxo.

MATERIAIS E MÉTODOS

MATERIAL DE ENSAIO O rhuMAb B7 (PRO145223), Lote M3-TOX132, foi fornecido pela Genentech como um líquido límpido a ligeiramente opalescente, de incolor a ligeiramente amarelado numa concentração de 20 pg/ml (4,5 ml/frasco). O veículo do rhuMAb B7, Lote M3-TOX133, também foi fornecida como um líquido límpido ligeiramente opalescente e incolor ligeiramente amarelado (10,5 mlL/frasco). Antes de ser utilizado no estudo, os artigos foram armazenados em uma em geladeira para permaneceram em uma faixa de temperatura de 2 ºCa8”"C,

ESPÉCIES Vinte e seis macacos cinomolgos virgens de tratamento ao artigo em estudo foram obtidos do estoque de colônia SNBL-USA. Os animais pesavam entre 2-6 kg e tinham de 2-5 anos de idade no início do tratamento. Os animais foram aclimatados por pelo menos uma semana antes do início do tratamento. Apenas os animais que pareciam saudáveis e que estavam livres de anomalias evidentes foram utilizados no estudo. |

ELABORAÇÃO DO ESTUDO Os animais foram distribuídos em três grupos e receberam quatro doses semanais |V do material de ensaio. Os animais do Grupo 1 (5 machos e 5 fêmeas) receberam veículo do rhuMAb 687. Os animais do Grupo 2 (3 machos e 3 fêmeas) e Grupo 3 (5 machos e 5 fêmeas) receberam rhuMAb B7 a 5 e 25 mg/kg, respectivamente, Três machos e três fêmeas de cada grupo tiveram a necropsia terminal 7 dias após a última dose. Dois machos e 2 fêmeas dos grupos administrados com veículo ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 foram seguidos por um período de recuperação de aproximadamente 23 semanas antes da necropsia. À elaboração do estudo está resumida na Tabela 2-1. TABELA 2-1

ELABORAÇÃO DO ESTUDO Nível de Conc. da Volume da (mg/kg) (mg/mL) (mUkg) 1 SM,SF |V VeílculorfhuMAbGB7 o o 1,25 2 3M3F | rhuMAb B7 5 20 0,25 3 SMSFE NV rhuMAb 67 25 20 1,25 Conc. = concentração; IV = intravenoso.

Nota: Três machos e três fêmeas de cada grupo foram designados como animais de necropsia terminal, Os demais animais dos Grupos 1 e 3 foram designados como animais de necropsia de recuperação.

* Volume da dosagem: foi calculado com base no peso corporal mais recente.

PREPARAÇÃO DA DOSE O artigo teste para cada grupo foi fornecido na concentração apropriada pela Genentech. o —].M—m—-—-———

ADMINISTRAÇÃO DA DOSE Os volumes individuais de dosagem foram calculados com base nos pesos corporais que foram gravados no dia da administração da droga. Os animais receberam material de ensaio por via intravenosa pela veia safena. Imediatamente apósa administração da dose, mas antes que a agulha fosse retirada do animal, o aparelho de dosagem foi lavado com cerca de 1 mL de NaCl 0,9%,

COLETA DAS AMOSTRAS DE SANGUE Todas as amostras de sangue foram coletadas utilizando uma agulha e seringa por punção da veia safena, femoral ou cefálica. | 10 ANÁLISE PK O sangue (aproximadamente 1,2 mL) foi coletado de cada animal e o soro foi coletado nos seguintes momentos (pontos temporais) para análise farmacocinética: Pré-dose no Dia do Estudo 1 e 15 minutos e 6, 24, e 72 horas apósa dosagem, Pré-dose no Dia do Estudos 8 e 15, Pré-dose no Dia do Estudo 22 e 15 minutos e 6, 24, e 72 horas após a última dose. Dias 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 106, 113, 120, 127, 134,141,148,155,162,169, 176, e 183 do Estudo, No dia das necropsias terminal e de recuperação (Dia de Estudo 296191). Entretanto, para análise PK, os pontos temporais foram convertidos para se iniciarem no dia O e são referidos neste relatório como Dias 0; 0,0104; 0,25;1;3;7;14;21;21.0104; 21.25; 22; 24; 28; 35; 42; 49; 56; 63; 70; 77; 84; 91; 98; 105; 112; 119; 126; 133; 140; 147; 154; 161; 168; 175; 182 e 190.

ANÁLISE DE ANTICORPOS ANTITERAPÊUTICOS As mesmas amostras de soro para análise PK foram utilizadas | a para a análise de anticorpo antiterapêutico (ATA). A resposta ATA foi analisada nos seguintes momentos: Pré-dose nos Dias 1,8, 15 e 22 do Estudo. Dias 50, 71, 92, 113, 134, 155 e 176 do Estudo No dia das necropsias terminal e recuperação (Dias 29 e 191 do Estudo) Entretanto, para análise de ATA, os pontos temporais foram convertidos para se iniciarem no dia O e são referidos neste relatório como Dias 0,7, 14, 21, 28, 49, 70, 91, 112, 133, 154, 175 e 190.

ANÁLISE DE CITOMETRIA DE FLUXO O sangue (aproximadamente 1,5 mL) foi coletado de cada animal nos momentos a seguir para a contagem total de linfócitos (células B, células T e células Natural Killer [NK]) e para o ensaio de citometria de fluxo: Dia 8 (pré-dose) Pré-dose no Dia 1 e 24 horas após a primeira dose l Pré-dose no dia 15 e 24 horas após a segunda dose Pré-dose no dia 22 e 24 horas após a terceira dose Dias 43, 57, 71, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 e 183 do Estudo No dia da necropsia terminal e de recuperação (Dias 29 e 191 do Estudo) O sangue (aproximadamente 1,5 mL) foi coletado de cada animal nos momentos a seguir para o ensaio de ocupação por citometria de fluxo: Pré-dose no Dia 1 e 24 horas após a primeira dose Pré-dose no dia 15 e 24 horas após a segunda dose Pré-dose no dia 22 e 24 horas após a terceira dose Nos Dias 57, 85, 99, 113, 127, 141, 155, 169 e 183 No dia da necropsia terminal e de recuperação (Dias 29 e 191 do Estudo) LL nnnnn——nn———m-ss— ]

| 137 Para a análise do total de células T CD4* e CD8* expressando B7 nãoocupadas, o sangue (aproximadamente 1,5 mL) foi coletado de cada animal nos seguintes momentos: Pré-dose no Dia 1 e 24 horas após a primeira dose Pré-dose no dia 15 e 24 horas após a segunda dose Pré-dose no dia 22 e 24 horas após a terceira dose Nos Dias 57, 99, 113, 127, 141, 155, 169, e 183 No dia da necropsia terminal e de recuperação (Dias 29 e 191 do Estudo).

PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE SANGUE

ANÁLISE PKE ATA Imediatamente após a coleta, as amostras foram transferidas para tubos separadores de soro e foram deixadas para coagular em temperatura ambiente por 30 a 80 minutos. As amostras foram centrifugadas a 2.000 uy gq por15minutosem temperatura ambiente, O soro foi retirado e transferido para tubos rotulados de 1,5 mL da Eppendorf.

ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO Imediatamente após a coleta, as amostras de sangue total para análise por citometria de fluxo foram transferidas para tubos de sódio- heparinizados em SNBL de acordo com o protocolo de estudo e enviados para a Genentech para análise. As amostras foram colocadas imediatamente em gelo triturado ou armazenadas em uma temperatura entre 2 ºC a -8B ºC até serem analisadas por citometria de fluxo.

ENSAIOS

CONCENTRAÇÕES SÉRICAS As amostras de soro foram analisadas pelo método de ELISA quantitativo para mensurar os níveis totais de rhuMAb B7. Este ensaio foi executado de acordo com o cademo 47886-27 de Resumo do projeto de desenvolvimento do | o —.—nm—--mm—

ensaio e o caderno 47886-22 de processos de procedimento operacional padrão (POP) para todas as amostras. Em primeiro lugar, placas de microtituiação de 96 poços foram revestidas com anticorpo de cameiro anti-cadeia pesada e leve de 19G humana (H&L), pré absorvida com soro de macaco. Este anticorpo foi obtido a partir da Binding Site (Bimingham, Reino Unido; Catálogo AUDO3.CUSO1; lote 086001) e diluída para 1 mg/ml. em carbonato de sódio 0,05 M, pH 9,6. O rhuMAb 67 | recombinante humano (Lote 46994 8, produzido na Genentech) foi utilizado como padrão. A curva padrão variou de 0,781 a 50,0 ng/ml. Os anticorpos usados para | determinar a curva padrão, controles de matriz, e as amostras foram diluídas em | 10 diluente (tampão fosfato [PBS], 0,5%, albumina de soro bovino [ASC], 0,05% de | polissorbato 20, 0,05% de Proclina 300, 0,25% de tampão CHAPS , 5 mM de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA], NaCl 0,35 M), As amostras foram diluídas por um mínimo de 1/20. Anticorpo de cameiro anti-lgG humano marcado com peróxidade de rábano silvestre (HRP) (H&L, absorvido com soro pré macaco) foi obtido a partir da Binding Site (catálogo CUS1684,H; lote 11245) e foi usado como o conjugado. O sinal foi gerado com tetrametil benzidina peroxidase como substrato para a HRP. Os dados para os controles e as amostras foram corrigidos pela diluição, os. valores para cada diluição foram calculados. A concentração mínima mensurável para soro puro de macaco cinomolgo foi determinado em 20 ng/mL, com base no limite do ensaio de 1ngímlediluição mínima de 1/20.

DETERMINAÇÃO DA RESPOSTA ATA As amostras de soro de macacos cinomolgos foram analisadas pelo teste de ligação por eletroquimioluminescência para determinar o nível de resposta de anticorpos contra muMAb B7. Este ensaio foi executado de acordo com o cademo 4788648 do resumo do projeto de desenvolvimento do ensaio para anticorpos contra rhuMAb B7. Anticorpos policionais direcionados: contra IgG humano (H&L, prê absorvidas com soro de macacos) foram obtidos pela Binding Site e foram utilizados como controle positivo substituto. Controles e amostras foram diluídos em diluente de amostra (tampão o ———....] |

HEPES, gelatina de peixe 2%, 0,05% de polissorbato 20, 0,05 de ProClin300, 0,15 M NaCl, 10% de soro fetal bovino) e adicionados a uma, placa de 96 poços de polipropileno de fundo côncavo. As amostras foram diluídas por um mínimo de 1/10.

O rhuMAb B7 Biotina e rhuMAb B7 marcado com BV foram utilizados como | 5 conjugados. No dia seguinte , esferas Dynabeads M280 revestidas estreptoavidina | (Invitrogen Corp , Carlsbad, CA) foram diluídas em diluente (tampão HEPES, gelatina ! de peixe 2%, 0,5% de polissorbato 20, 0,05% de ProClin300, 0,15 M de NaCl) e adicionados às placas, A resposta do ensaio foi mensurada em unidades de ' eletroquimioluminescência. O ponto de corte foi definido com base no valor do controle negativo, e foi usado para calcular os valores de titulação para as amostras de controle positivo. A título mínimo reportado para o teste de anticorpos rhuMAb B7 foi de 1,0.

ANÁLISE DA CITOMETRIA DE FLUXO SUBPOPULAÇÕES DE CÉLULAS T CD4* E CD8* EXPRESSANDO B7 TOTAIS NO

SANGUE PERIFÉRICO O total de células T CD4* e CD8* expressando B7 foi mensurado utilizando 9D8, um anticorpo anti B7 direcionado a um epítopo diferente do rhuMAb B7. À configuração do painel para a análise das amostras de sangue total é apresentada na Tabela 2-2.

TABELA 2-2

CONFIGURAÇÃO DO PAINEL DE SANGUE TOTAL Isotipo usado para modular a seleção 1 IgG-FITC, IgG-PE, CD4-PerCP, SA-APC (gating) da população em SSC e FSC. Definição dos marcadores do quadrante. 2 CD45RA-FITC, CD49d-PE, CD4-PerCP ou Subconjuntos de células T CD4 CD4-PerCP-Cy5,5, 9D8-Biotina/SA-APC”, expressando a4 e B7 3 CDA5SRATFITC, CD49d-PE, CD8-PerCP ou Subconjuntos de células T CD8 CD8-PerCP-Cy5.5, 9D8-Biotina/SA-APC*, expressando a4 e B7 a |

FSC = dispersão frontal; SA = estreptavidina; SSC = dispersão lateral. * 9D8- Biotina foi primeiro incubado, antes da adição de S-APC O ensaio de citometria de fluxo foi realizado em todas as amostrasde sangue total de acordo com procedimentos 48038-28 48038-84., Os tubos 2 e 3 para cada amostra foram previamente incubados com concentrações. saturantes de 9D8-biotina, um anticorpo anti B7 que se liga B7 | na presença de rhuMAb B7. Tubos para estabelecimento dos controles | (controle isotípico e de coloração única) e tubos de ensaio (nº 1, 2 e 3) foram preparados manualmente.

Após a primeira incubação, 2 mL de solução de lise foram adicionados para a lise das hemácias seguida por um ciclo de lavagem das células.

Para a segunda incubação, as amostras (tubos 2 e 3) foram incubadas com concentrações saturantes de anticorpos monoclonais conjugados com fluorescência para CD4 (Clone M-T477), CD8 (Clone SK1), —CD45RA (Clone 5H9), e CD49d (clone 9F10), que são conhecidos por reagirem cruzadamente com leucócitos de macaco cinomolgo, ou anticorpos de controle de isotipo (tubo 1). Estreptavidina-APC (AS-APC) também foi adicionada aos tubos 1, 2 e 3 para detecção de anticorpos Biotina.

Ambas. incubações foram realizadas no escuro, em gelo triturado por 60 + 5 minutos.

Uma série de etapas de lavagem foi realizada com uma etapa final de ressuspenção das células em tampão fixador.

As amostras foram realizadas em 2 ºC a 4 ºC por um período mínimo de 30 minutos e adquiridas no mesmo dia.

A aquisição da citometria de fluxo foi realizada em um FACSCalibur& (BD, Biosciences; San Jose, CA) com um número de série E2020. Vinte e cinco mil eventos de linfócitos foram adquiridos usando um gráfico de pontos de dispersão frontal (FSC) / dispersão lateral (SSC). À análise dos dados foi baseada nos linfócitos selecionados no "gated" FSC/SSC e, dependendo da combinação de coquetel, linfócitos gated CD4*/SSC”*** ou o —s*..n— | linfócitos CD8*/SSC**** usando o programa de computador “Cel/Quest software Pro” (BD CellQuest Pro, versão 5.2). Os citogramas de fluxo foram gerados para estabelecer a fração de células positivas para cada marcador de superfície celular.

As subpopulações de B7 foram analisadas como uma percentagem de células com “gate” CD4* e CD8*, e separadamente, como a média geométrica da intensidade de fluorescência (MGIF). Para cada amostra em cada ponto temporal, moléculas de fluorescência equivalente solúveis (MOEF) foram calculadas multiplicando-se a MGIF de cada população, com uma curva padrão gerada usando esferas Spherotech A MGIF e a percentagem de células no “gate” selecionado para a população de linfócitos T CD4* e CD8* expressando CD49d*9D8"”, CD45R-9D8*", CD45R-9D8"**, CD45RA* e CD45R' foram monitoradas durante todo o estudo para avaliar o efeito do fármaco em cada subgrupos. A contagem absoluta foi calculada para cada amostra em cada período para cada subgrupo de linfócito com base na contagem de linfócitos por yuL de sangue periférico fornecido pelo SNBL.

OcCuPAÇÃO DE B7 SOBRE SUBPOPULAÇÕES DE CÉLULAS T CD4* E CD8* nO

SANGUE PERIFÉRICO A configuração do painel para a análise das amostras de sangue totalé apresentada na Tabela 2-3. TABELA 2-3

CONFIGURAÇÃO DO PAINEL DE SANGUE TOTAL Tubo Marcadores de Antígeno: o 1 CDA-TITO, CDASRA-PE, Controle negativo CD8PerCP, Her-AXx647 2 CD4-FITC, CD45RA-PE, Tubo insaturado para detectar CDBPerCP, rhuMAb B7-Alx647 ocupação de B7 3 CDA4-FITC, CDA5RA-PE, Tubo saturado com 10 pg/ml de CD8PerCP, rhuMAb B7-Alx647 PRO 145223 CC ——m—p——— |

Her = Herceptinº.

As amostras de sangue foram coradas de acordo com o caderno ' | de protocolo do Laboratório 47237, pág. 48, com concentrações saturadas dos | seguintes anticorpos conjugados: CD4 conjugado com FITC (clone M-T477), CD45RA conjugado com ficoeritrina (PE) (clone SH9), CD8 conjugado com PerCP (clone SK1) e Herceptin& conjugada com Alexa-647 ou rhuMAb 87 conjugado com Alexa-647. Para o tubo 3, o artigo de teste rhuMAb B7 (PRO 145223) foi diluído para a concentração saturada (10 ug/mL) e adicionado na amostra de sangue, Todas as incubações foram realizadas sobre o gelo e no escuro por 30 + 5 minutos.

Após a coloração, as células vermelhas (eritrócitos) do sangue foram lisadas, as amostras foram lavadas e as células foram ressuspendidas em tampão fixador *Lyse Wash Assistant” (BD Biosciences). Vinte e cinco mil eventos de linfócitos nos “gates” selecionados foram adquiridos usando um gate de dispersão frontal/dispersão lateral no FACSCalibur” (BD Biosciences). Os linfócitos foram identificados a partir de um diagrama de dispersão SSC/FSC.

As células CD4* e CD8* foram identificadas usando um gráfico SSC/CD4FITC e SSC/CD8 PerCP, respectivamente.

O tubo 1 foi utilizado como controle negativo para a seleção.

Os linfócitos exibindo B7ºº/CD45R-, B7ºº”º/CD45R- e B7intemediáioCDABRA* foram identificados para os tubos com e sem concentração saturada de rhuMAb B7. A MGIF e o percentual de células selecionadas foram anotados e a MGIF foi então expressa como MOEF utilizando a pendente do canal APC, onde MOEF=GMFI =inclinaçãode canalFLA.

Todas as incubações foram realizadas sobre o gelo e no escuro por 30 + 5 minutos.

Após a coloração, os glóbulos vermelhos do sangue foram lisados, as amostras foram lavadas e as células foram ressuspendidas em UU e—————-) | tampão fixador Lyse Wash Assistant (BD Biosciences). Vinte e cinco mil | eventos de linfócitos selecionados foram adquiridos usando um gafe de dispersão fronta/dispersão lateral ni FACSCalibur BD (BD Biosciences).

Os linfócitos foram identificados a partir de um diagrama de dispersão SSC/FSC. As células CD4* e CD8* foram identificadas usando um gráfico SSC/CDA4FITC e um gráfico SSC/CD8 PerCP, respectivamente. O tubo 1 foi utilizado como controle negativo para a seleção, Os linfócitos exibindo B7º"º9/CDA5R-, B7º**º/CDA4SR- e p7itemedárioCDA5RA* foram identificados para os tubos com e sem concentração saturada de rhuMAb B7. A MGIF e o percentual de células selecionadas foram anotados e a MGIF foi então expressa como MOEF utilizando a pendente do canal APC, onde MOEF=GMFI = inclinação do canal FLA,

ANÁLISE DA CITOMETRIA DE FLUXO DOS SUBCONJUNTOS DE LINFÓCITOS NO SANGUE PERIFÉRICO (CÉLULAS B, CÉLULAS T E CÉLULAS NK ToTAIS) A configuração do painel para a análise das amostras de sangue total é exibida na Tabela 244. TABELA 2-4

CONFIGURAÇÃO DO PAINEL DE SANGUE TOTAL Tubo Marcadores de Antígeno: Tipos Celulares Identificados Nº Fluorocromo Isotipo usado para modular a 1 IgG-FITC, IgG-PE, IgG-PerCP, seleção da população em SSC e IgG-APC, FSC. Definição dos marcadores do quadrante 2 CDA4-FITC, CD45-PE, CD3-PerCP, Célula B, Células T e CD20-APC Subconjuntos de células T FSC = dispersão frontal; SSC = dispersão lateral Para todas as amostras de sangue total, o ensaio de citometria de fluxo foi realizado de acordo com o procedimento 48038-36. As amostras foram incubadas com concentrações saturadas de anticorpos monoclonais para CD4 LL —p—pm—m—m—m—mm—m-—m-m-m-m c- ns | conjugados com fluorescência (Clone M-T477), CD45 (Clone TU116), CD3 (clone SP34-2) e CD20 (clone L27), que são conhecidos por reagirem cruzadamente com leucócitos de macaco cinomolgo, juntamente com controles isotípicos adequados. Tubos para estabelecimento dos controles e tubos de ensaioforam preparados manualmente. Todas as incubações foram realizadas em câmara escura em temperatura ambiente por 30 minutos + 5 minutos,

ANÁLISE DOS DADOS PK Os tempos de coleta nominal da amostra foram utilizados na análise de dados, com um desvio mínimo da programação. A média (+ DP) das concentrações de rhuMAb B7 foi calculada para cada amostra de soro usando o software MS Excel” (Microsoft Corp, Redmond, WA), e os dados foram plotados usando o software KaleidaGraphº (Synergy Software; Reading, PA). | Exceto para o período pré-dose, as concentrações séricas determinadas com | sendo menores do que o mínimo reportado (LTR) foram tratadas como ausentes e não utilizadas na apresentação ou na análise dos dados PK. Para os cálculos dos dados PK, o Dia de Estudo 1 foi convertido para o Dia 0 da PK para indicar o início da administração (vide Coleta das Amostras de Sangue).

ANÁLISE PK NÃO COMPARTIMENTAL Os dados de tempo-concentração do soro de cada animal, na dose de 5 mg/kg em até 7 dias após a primeira dose foram analisados utilizando o modelo de administração por bolus IV (Modelo 201, WinNonlin Pro, versão 5.0.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Os dados após a última dose no grupo de dosagem de 5 mg/kg não foram analisados, as concentrações séricas foram afetados pelos ATAs após a segunda ou terceira dose. Os dados de tempo-concentrações séricas de cada animal na dosagem de 25 mg/kg durante 7 dias após a primeira e última dose também foram analisados utilizando o modelo de entrada por bolus IV (Modelo 201). Os seguintes métodos foram utilizados para estimar parâmetros PK específicos: |

Cmax: concentração sérica máxima após um bolus IV.

AUCo7: Área sob a curva tempo-concentração no a partir do Tempo = O até Dia da PK 7 foi calculada usando a regra linear trapezoidal.

AUC21.28: Área sob a curva tempo-concentração no a partir do Dia Pk21atéoDiada PK 28 foicalculada usando a regra linear trapezoidal.

AUCrotar: Área sob a curva tempo-concentração no a partir do Tempo = O até o último dia da dos dados dos animais recuperados foi calculado utilizando a regra linear trapezoidal.

Vi: volume de distribuição no compartimento central (Dose/Cmay- Análise PK de dois compartimentos, Um modelo de dois compartimentos, com entrada em bolus IV, a ; eliminação de primeira ordem, e constantes de micro velocidade (Modelo 7, | WinNonlin Pro, versão 5.0.1) foi utilizada para analisar a média dos dados tempo-concentração a partir de 4 animais recuperados no grupo com dosagem de25mg/kg. As seguintes opções de modelos e métodos foram utilizadas para estimar parâmetros PK específicos: As estimativas iniciais de A, B, a e B foram determinadas graficamente pelo WinNonlin.

A análise ponderada utilizando WEIGHT= -2.

O algoritmo de minimização Nelder-Mead foi usado.

A seleção do modelo foi baseada no grau de ajuste por inspeção visual e pela comparação entre os modelos de comparação do Critério de Informação de Akaike (AIC).

CL: Depuração (dose/AUC) ti. g: Meia-vida da fase beta, meia vida terminal (In[2/ B).

Vss: Volume de distribuição no estado estacionário (MRTs1* CL) As interceptações no tempo zero associadas com as fases alfa e beta (A e B, respectivamente), constante de macro-velocidade ( É e B), e o —-—m— | constantes de micro velocidade intercompartimentais (Kio, 12, E Ka) são fornecidas na Tabela 7.

ANÁLISE DA CITOMETRIA DE FLUXO A contagem absoluta como percentagem dos valores basais foi calculada para cada um dos subconjuntos de células T CD4* e CD8* (CD45R- B7º"º, CD45R- B7º*** e CD45RA* grintemedíárioy e células T CD4*CD3+, CD4-CD3+ (CD8 +), CD3" CD20- (NK) e células B CD20* em cada ponto temporal no estudo nos animais tratados com veículo e rhuMAb B7. As contagens individuais absolutas como percentagem dos valores basais foram calculadas para cada grupo de tratamento (veículo, 5 mg/kg de rhuMAb RB7 e 25 mg/kg rhuMAb B7) para calcular as médias do grupo. As definições dos valores determinados por citometria de fluxo são as seguintes: | Contagem Abs: contagem absoluta de cada subconjunto de linfócitos respectivos; igual à contagem absoluta de linfócitos (um valor obtido a partir de medições hematológicas, expressa em linfócitos por pl de sangue periférico) vezes o percentual de linfócitos capturados para cada subconjunto (obtidos pela análise de citometria de fluxo), Contagens Abs (%BL): contagem absoluta como uma percentagem da contagem Abs basal obtidas antes da dosagem; calculada como a contagem Abs dividida pela média da contagem absoluta da pré- dose.

MOEF: moléculas de fluorescência equivalente, calculada usando a inclinação do canal FL4 vezes a média geométrica da intensidade de fluorescência.

MOEF (% pré-dose): MOEF como uma percentagem de MOEF antes da dosagem; calculada como a MOEF na ponto temporal respectivo após a administração divídido pela MOEF média antes da dosagem.

| ss. x 147

RESULTADOS E DISCUSSÃO

ANÁLISE PK Depois de quatro doses semanais em bolus IV de 5 mg/kg de rhuMAb B7 dadas aos macacos cinomolgos, a concentração sérica média 15 minutos após a primeira dose foi de 173 po/mL (variação: de 125-207 pg/ml) em comparação com os valores 15 minutos após a última dose, que foi de 196 pg/ml! (variação de: 70,9 - 326 pg/ml). As concentrações médias mínimas no soro antes da aplicação da segunda, terceira e quarta dose foram: 56,5 pg/ml (variação de 28,7 - 77,1 yg/mL), 35,1 ug/ml (variação de: 0,0401 - 97,1 pg/mL), e60,2 pg/ml (variação de: 4,29 - 137 ug/mL), respectivamente. A variabilidade nas concentrações séricas após a segunda dose pode ser explicada pela presença de ATAs, pois todos os seis macacos neste grupo com dosagem de 5 mg/kg dose grupo desenvolveu uma resposta ATA que foi detectada após a segunda dose, 1 macaco teve título de anticorpo anti-humano positivo antes da primeira dose de rhuMAb B7. Os quatro macacos com as menores concentrações mínimas tiveram os maiores títulos de ATA. Após quatro doses semanais em bolus IV de 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos, a concentração sérica média 15 minutos após a primeira dose foi de 917 upa/ml (variação de: 740 - 1.070 pgml) em comparação com 15 minutos após a última dose , que foi de 1,690 pg/ml (intervalo de: 1130 - 2250 pa/mL). As concentrações médias mínimas no soro antes da aplicação da segunda, terceiro e quarta dose foram de 325 pgíml (variação de : 243 - 677 ug/mL), 535 po/mL (variação de : 240 - 709 pg/ml), e 594 ugiml (variação de; 19 - 776 pg/mL), respectivamente. Houve também uma resposta ATA no grupo de dosagem de 25 ma/Kkg, com 5 dos 10 macacos (3 de 4 macacos da recuperação) neste grupo desenvolveram ATAs dose- resposta que se correlacionou com a diminuição nas concentrações séricas do rhuMAb f7, Os ATAs foram detectados após a segunda dose em alguns |

' | macacos, 1 macaco neste grupo também teve título de anticorpos anti-humano positivo antes da primeira dose de rhuMAb B7. As concentrações séricas ao longo dos 28 dias durante a fase em vida do após quatro doses semanais [V de 5 ou 25 mg/kg são apresentadas na —Figura23,As concentrações séricas sobre a fase em vida (até 7 dias após a última dose) foram comparadas por análise compartimental, porque não houve recuperação na coorte para o grupo com dose de 5 mg/kg para comparação.

Os resultados indicaram que a área dose-normalizada sob perfis tempo- concentração de hormônios séricos do dia O ao 7 dia após a primeira dose (AUCp7/dose) foram semelhantes para os gruos com doses de 5 mg/kg e 25 mg/kg (113 + 17,0 e 119 + 15,8 dias + po/mlímg/kg, respectivamente, vide Tabela 5). Isto sugere que o rhuMAb B7 apresenta farmacocinética proporcional à dose em macacos cinomolgos nas doses testadas.

O volume de distribuição no compartimento central (V,) também foi semelhante após a primeira dose de 5 ou 25 mg/kg (29,0 + 4,30 e 27,7 + 3,54 mL/kg, respectivamente, vide Tabela 5). j Após a administração de 25 mo/kg, AUC21.26 após a última dose foi mais do que duas vezes maior em comparação com AUCox, após a primeira dose (7,024 + 1,958 e 2,987 + 394 dias + paíml, respectivamente, vide Tabela 2 -5) A Cma, após a administração de 25 mg/kg também aumentou cerca de 2 vezes após a última dose em relação após a primeira dose (1710 + 302 e 916 + 111 mgíml, respectivamente, videTabela 5). Ambos os resultados sugerem que houve acúmulo de rhuMAb B7 após quatro doses semanais IV de 25 ma/kg nos macacos cinomolgos, no entanto, esse acúmulo é esperado em um anticorpo com uma meia-vida longa nas dosagens utilizadas.

Os dados após a última dose de 5 mg/kg não puderam ser comparados porque ATAs afetaram o CL do rhuMAb B7 após a segunda dose.

Os valores médios de 4 macacos a partir do período de |

| recuperação de 23 semanas após as quatro doses semanais de 25 mg/kg foram ajustados a um modelo de dois compartimentos (vide Figura 24). O perfil tempo-concentração sérico após a última dose foi bifásico com uma fase de distribuição inicial rápida seguida por uma fase de eliminação mais lenta. À análise compartimental estimada um CL lentp de 2,93 mL/dia/kg e um ti2, | relativamente longo de 14,5 dias seguintes as quatro doses semanais em bolus IV de 25 mg/kg de rhuMAb B7 (vide Tabelas 2 - 6). No entanto, três dos quatro macacos tinham ATAs, o que provavelmente contribuiu para a depuração dos rhuMAb B7. O Vs; foi estimado em 56,9 kg/ml, o que sugere que o rhuMAb B7 permaneceu em sua maior parte no compartimento vascular (vide tabela 2-6). A exposição total (AUCtoa), após quatro doses semanais |V de 25 mg/kg foi estimada em 33.400 dias e pg/ml pela análise não-compartimental dos dados de recuperação dos animais (vide Tabela 2-6). TABELA 2-5 PARÂMETROS PK NÃo COMPARTIMENTAIS DE DADOS INDIVIDUAIS (MÉDIA + DP), APÓS A PRIMEIRA OU ÚLTIMA DOSAGEM EM BoLus IV DO RHUMAS B7 EM MACACOS

CINOMOLGOS Grupo de AUC17.7 (Dia — AUC>2;.26 (Dia CTmax Vr 26/Dose (Dia « Tratamento « pg/mL) e po/mL) (pvg/mL) (mL/kg) pg/mi/mglkg) S mg/kg 1º 563 + 84,8 NA 1134 17,0 175+24,0 29,0+4,30 dose(n=86) mg/kg 1º 2990 £ 394 NA 119+ 15,8 916111 27,73,54 dose (n= 10) 25 mo/kg última dose NA 7020 + 1960 281 478,3 1710302 15,1+3,03 (n=10) AUCo7 = área sob a curva tempo-concentração sérica a partir do | tempo = O até o Dia da PK 7; AUC21.28 = AUC21-28: Área sob a curva tempo-concentração no a partir do Dia Pk 21 até o Dia da PK 28; Cmax = concentração máxima após um bolus IV; IV = intravenoso; NA = não aplicável; PK = farmacocinética; V, = volume de distribuição do compartimento central (Dose/Cmax). TABELA 2-6 PARÂMETROS PK DE DoIls COMPARTIMENTOS (%CV) DOS DADOS MÉDIOS A PARTIR DE 4 ANIMAIS DE RECUPERAÇÃO APÓS QUATRO DOSES SEMANAIS EM BOLUS |V DE 25 MG/KG DE RHUMAB B7 EM MACACOS CINOMOLGOS | (dia e ug/mL) (mL/dia/ka) (dias) (mL/kg) AUC = área sob a curva tempo-concentração sérica; CL = Depuração; IV = intravenoso; PK = farmacocinética, ti2, g = meia-vida beta; Vs. = volume de distribuição no estado estacionário.

TABELA 2-7 PARÂMETROS DO MODELO DE Dois COMPARTIMENTOS (%CV) DA MÉDIA DOS DADOS (& DP) A PARTIR DE 4 ANIMAIS DE RECUPERAÇÃO APÓS QUATRO DOSES SEMANAIS EM BoLus IV DE 25 MG/KG DE RHUMAB B7 EM MACACOS CINOMOLGOS A B a B kz ko, ko (264) (8,64) (57,5) (1,90) (72,5) (51,4) (16,0) | A, B = tempo zero interceptado associado com as fases alfa e beta, respectivamente; B, BB = constantes macro velocidade alfa e beta, respectivamente; k,9 = velocidade de eliminação do compartimento central, K12, Ka = constante da velocidade inter-compartimental. J«CC«—«<C««—«s—«—«..««<<<«<«r sEEOOO——«csÀ—<——« oco |

' ANÁLISE DA CITOMETRIA DE FLUXO (IMUNOFENOTIPAGEM E FARMACODINÂMICA) | As contagens médias (+ DP) dos grupos para os subconjuntos de | células CD4* do sangue periférico e células T CD8* são apresentadas nas Figuras 35-38. As Figuras 39-40 exibem a relação entre as concentrações séricas de rhuMAb B7 e célula T CD4" CD45RA' B7*"*º e célula T CD8* CD45RA' B7º*"º disponíveis no sangue periférico em cada um dos macacos cinomolgos.

As médias (+ DP) das contagens absolutas individuais e do grupo, e a expressão de B7, e a expressão de B7 nos subgrupos de células T CD4'* e CD8' disponíveis são apresentadas no Apêndice E.

A ocupação dos receptores B7 neste estudo foi analisada por citometria de fluxo como B7 disponível em subpopulações de células T CD4* ou CDB8* do sangue periférico definidas como CD45RA+ ou CDA4S5R-. As célula T CD45RA+ e CD45R- são fenotipicamente semelhante a células T Naíves e efetoras/de memória nos seres humanos, expressando níveis intermediários contra níveis altos de B7 (vide Figura 25 para um gráfico de pontos representativo de FACS das subpopulações de células T). Células T CD4* CD45R- 67º" possuem retornam (“home”) preferencialmente para locais intestinais.

Os dados deste ensaio indicam uma saturação de B7 após a primeira dose em ambos os grupos de 5 e 25 mg/kg, e o retorno de B7 livre que se correlacionou com a diminuição das concentrações séricas de rhuMAb B7 (vide figuras 32-33 na seção relação PK/PD acima). Estes dados sugerem que uma saturação da concentração sérica de rhuMAb B7 acima 1-10 pg/ml mantém provavelmente a saturação completa receptor- B7 em células T no sangue periférico.

Os níveis de expressão total de B7 em células T no sangue periférico foram examinados após a administração de rhuMAb B7 usando um anticorpo não competitivo para a detecção de B7 por citometria de fluxo.

Não |

| .. .*s | 152 houve evidências da modulação negativa de B7 nas células T do sangue | periférico de macacos cinomolgos após a administração IV de 5 ou 25 mg/kg | (dados não mostrados). O total de células que expressam B7 no sangue | periférico foi também avaliado após a administração de rºhuMAb B7 utilizando o mesmo anticorpo não competitivo para a detecção de B7. Células T CD4* CD45R' 687º" (fenotipicamente similares às células CD4* de retorno intestinal em humanos e camundongos) aumentou cerca de 5 | vezes em relação aos níveis basais após quatro doses semanais de 25 mg/kg (vide Figura 26). Da mesma forma, células T CD4* CD45R* g7'emesário (fenotipicamente similares às células T naíve) também aumentaram após quatro doses semanais de 25 mg/kg (aproximadamente 2,5 vezes em relação aos níveis basais) (vide Figura 27). Não houve mudanças substanciais nas céluias T CD45R' B7”*** ou em subpopulações de células T dos animais controle que receberam apenas veículo (vide Figuras 26 e 27). Resultados semelhantes foram observados com células T CD8*CD45R B7º*º e CD45R* g7'temesátio Estes resultados são consistentes com a inibição do tráfico de linfócitos expressando B7 para o intestino, que é o mecanismo de ação proposto por este anticorpo terapêutico.

A favor desta hipótese, o aumento da percentagem de células T cD4* CDA45R' B7º* no sangue periférico se correlaciona com a ocupação do receptor B7 de células T pelo rhuMAb B7. Da mesma forma, a perda da ocupação do B7 pelo rhuMAb B7 (detecção de receptores B7 disponíveis) se correlaciona com o retomo aos valores basais de células T CD4* CD45R' B7* no sangue periférico.

Por exemplo, no Dia 99 do Estudo, os percentuais de células T CD4* CD45R B7** no sangue dos animais 24 e 25 diminuiu para níveis basais (vide Figura 6). Esta diminuição está correlacionada com a perda da ocupação do B7 pelo rhuMAb B7 no Dia 99 do Estudo nestes macacos específicos (vide Figuras 32 e 33 na seção relação PK/PD acima). Em contrapartida, os animais 23 e 26 exibiram saturação dos receptores B7 nas células T do sangue periférico no Dia 99 do Estudo (vide —=—=—=——--snm |

Figuras 32 e 33), e o número absoluto de células T CD4* CDASR B7º"* no sangue permaneceu elevado em relação aos níveis pré-dose (vide Figura 28), Resultados semelhantes foram observados com os subconjuntos de células T CD8”. Assim, a ocupação dos receptores B7 se correlaciona com aumento na porcentagem de T CD4º CD45R' B7*º no sangue, este resultado é consistente com a inibição do tráfico para locais intestinais.

O aumento nas subpopulações células CD45R” e CDA45R' no sangue periférico provavelmente contribuiu para o aumento observado nos linfócitos circulantes descritos anteriormente.

A administração semanal de 25 mg/kg de rhuMAb B7 induziu um aumento discreto de linfócitos circulantes em macacos cinomolgos que ficou evidente após a primeira dose e apareceu aumentar após a última dose.

Os macacos cinomolgos do grupo que recebeu 25 mg/kg tiveram um aumento médio de aproximadamente 2,2 vezes do valor inicial em comparação com um aumento médio de 1,3 vezes para o grupo controle que recebeu apenas veículo (vide Figura 29) A contagem absoluta de linfócitos no grupo que recebeu 25 mg/kg voltou para níveis pré-dose ou do veículo, as concentrações séricas de rhuMAb B7 diminuiu, um efeito que se correlacionou com a perda da ocupação dos receptores B7 dos linfócitos pelo rhnuMAb B7. Assim, um ligeiro aumento de linfócitos circulantes evidente neste estudo parece ser transitório, relacionado com a administração de —rhuMAb B7, e foi muito provavelmente devido à inibição do tráfico de linfócitos expressando 37 para o intestino, conforme mencionado acima, O aumento na contagem de linfócitos do sangue periférico foi evidente tanto em células T como em células B, embora o aumento das células T tenha sido mais substancial e exibiu uma duração maior em comparação com as células B (vide Figuras 30 e 31). RELAÇÕES PK/PD A saturação do receptor integrina B7 e os níveis circulantes de célula T B7* foram utilizados como marcadores PD, Depois de quatro doses semanais de 5 ou 25 ma/kg de rhuMAb 67 22 «O qUC«««—««O—p—A—

aos macacos cinomolgos, não houve evidências de modulação negativa (down- modulation) das células T expressando B7 no sangue periférico.

No entanto, a saturação de B7 nas células T no sangue periférico foi observada após a primeira dose de 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 e a dessaturação (detecção de B7 disponível) —pareceuse correlacionar com uma diminuição nos níveis de rhnuMAb B7 abaixo de aproximadamente 10 ug/mL (vide figuras 32A-D para os perfis dos Animais 23-26, respectivamente, e Figura 33). A correlação entre a ocupação de células T CD4* CDA45RA' B7º*"* no sangue periférico e a elevação do número absoluto dessas células também foi observada após a administração de rhuMAb B7 (Figuras 34A-D). Estes resultados sugerem que as concentrações séricas de rhuMAb B7 acima de 1- 10 pg/ml. mantêm a ocupação de B7 sobre as células CD4* de retarno intestinal e bloqueiam o retorno destas células T para o intestino, o que pode causar um acúmulo dessas células na periferia, CoNCcLUSÕES

Após quatro doses semanais em bolus IV de 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 aos macacos cinomolgos, as concentrações séricas aumentaram após a segunda dose, exceto quando foram formados ATAs.

AUCo7/dose após a primeira dose foi semelhante para os grupos com doses de 5 mg/kg e 25 mg/kg, sugerindo: que o rhuMAb B7 exibiu uma farmacocinética dose-proporcional em macacos cinomolgos nas dosagens testadas.

Para o grupo com dosagem de 25 mg/kg, a AUCo.7 & Cmax aumentou aproximadamente duas vezes após a última dose em comparação com a primeira dose.

Ambos achados sugerem um acúmulo de rhuMAb B7, como esperado, após quatro doses semanais IV de 25 mg/kg em macacos cinomolgos.

À análise compartimental dos dados em animais do grupo de — recuperação que recebeu 25 mg/kg estimou uma CL lenta de 2,93 mi/kg/dia e uma tie grelativamente longa de 14,5 dias.

Os ensaios ocupação do receptor integrina B7 sugerem que os receptores B7 nas subpopulações de células T no sangue periférico foram

E s— E »7 â tee totalmente saturados após a primeira das quatro doses semanais de 5 ou 25 mg/kg de rhuMAb B7 nos macacos cinomolgos. A detecção de B7 disponível se corelacionou com a redução das concentrações séricas de rhuMAb B7, sugerindo que a concentração sérica acima de aproximadamente 1 ug/ml é capaz de manter

5. ocupação dos receptores B7 nas células T do sangue periférico. As células-T CD45R- B7*"º (fenotipicamente similares às células T de retorno intestinal em humanos e camundongos) aumentou cerca de 5 vezes em relação aos níveis basais após quatro doses semanais de 25 mg/kg nos macacos cinomolgos. Da mesma forma, as células T CD45RA* p7itemedário (fenotipicamente similares às células T naive) também aumentaram após quatro doses semanais de 25 mg/kg (aproximadamente 2,5 vezes em relação aos níveis basais). Estes resultados são consistentes com o mecanismo de ação do rhuMAb B7-Nomeadamente, a inibição do tráfico de linfócitos B7 positivos para o intestino por meio da inibição da ligação do a4 B7 com seus ligantes, que então leva ao acúmulo dessas. células na circulação periférica. Esses fenômenos serão mais explorados em estudos futuros com macacos cinomolgos. ANEXO 2F QUADRO DE RESUMO DO EsTUDO Lo farmacocinética, Método: Os animais foram distribuídos em três grupos e receberam quatro doses semanais por via intravenosa (IV) do material de ensaio. Os animais do Grupo 1 (5 machos e 5 fêmeas) receberam o veiculo do rhuMAb B7 a 1,25 mL/kg. Os animais do Grupo 2 (3 machos e 3 fêmeas) e Grupo 3 (5 machos e 5 fêmeas) receberam 5 e 25 mg/kg de rhuMAb BEB7, «o——— P s ã & a e... cc respectivamente.

Três machos e três fêmeas de cada grupo tiveram a necropsia terminal uma semana após a última dose.

Dois machos e 2 fêmeas dos grupos que recebeu veículo ou 25 mg/kg rhuMAb B7 foram seguidos por um período de recuperação de aproximadamente 23 semanas antes de necropsia após recuperação.

As amostras de soro foram analisadas pelo método ELISA quantitativo para mensurar os níveis totais de rhuMAb B7 e por um ensaio de ligação de eletroquimioluminescência para determinar o nível de resposta dos anticorpos contra o rºhuMAb B7. O total das subpopulações de células T CD4* e CD8* expressando B7 ocupado e desocupado, a ocupação de B7 sobre a subpopulação de células T CD4* e CD8*, e a subpopulação de linfócitos (total de células B, células T e células natural killer) foram analisados por citometria de fluxo.

Os dados farmacocinéticos foram submetidos à análise não compartimental e de dois compartimentos.

Resultados: Em geral, o perfil tempo-concentração sérico do rhnuMAb B7 após quatro doses semanais IV foi bifásico, com uma fase de rápida distribuição inicial seguida por uma fase de eliminação mais lenta.

As concentrações séricas aumentaram após a segunda dose, exceto quando anticorpos anti-terapêuticos (ATAs) foram detectados.

A área normalizada pela dose no perfil tempo-concentração sérico do Dia 0 ao Dia 7 (AUC,. 7/dose) após a primeira dose foi semelhante para os grupos de dosagem de mg/kg e 25 mg/kg, sugerindo que a o rhuMAb exibe uma farmacocinética dose-proporcional em macacos cinomolgos nas dosagens testadas.

Para o grupo com dosagens de 25 mg/kg, a AUC,º7 e a concentração sérica máxima (CmaJ) aumentou cerca de 2 vezes após a última dose, em comparação com a primeira dose.

Ambos os resultados sugerem que houve acúmulo de rhuMAb B7 após quatro doses semanais [V de 25 mg/kg para macacos cinomolgos, no entanto, tal acúmulo é esperado para um anticorpo p— a rasassemess—MÇ«nEMEE—A——A—À—º<—<EA——«—

| 157 com uma meia-vida longa nas doses utilizadas.

A análise compartimental dos dados em animais recuperados que receberam 25 mg/kg estimou uma depuração lenta de 2,93 mi/kgídia e uma meia-vida terminal relativamente longa de 14,5 dias, No entanto, 3 dos 4 macacos tinham ATAs que provavelmente contribuiu para a rápida depuração do rhuMAb B7. Os ensaios ocupação do receptor integrina B7 sugerem que os receptores B7 nas subpopulações de células T no sangue periférico foram totalmente | saturados após a primeira das quatro doses semanais de 5 ou 25 mg/kg de | rhuMAb B7 nos macacos cinomolgos.

A detecção de B7 disponível se | corelacionou com a redução das concentrações séricas de rhuMAb B7, sugerindo que a concentração sérica acima de aproximadamente 1 pg/ml é | capaz de manter ocupação dos receptores B7 nas células T do sangue periférico, As células-T CD45R- B7*"º (fenotipicamente similares às células T de retorno intestinal em humanos e camundongos) aumentou cerca de 5 vezes em relação aos níveis basais após quatro doses semanais de 25 mg/kg nos macacos cinomolgos.

Da mesma forma, as células T CDA45RA* grintemediário (fanotipicamente similares às células T naíve) também aumentaram após quatro doses semanais de 25 mg/kg (aproximadamente 2,5 vezes em relação aos níveis basais). Estes achados são consistentes com o mecanismo de ação do rhuMAb B7-onde nomeadamente, a inibição do tráfico de linfócitos B7 positivos para o intestino por meio da inibição da ligação do a4 B7 com seus ligantes, que então leva ao acúmulo dessas células na circulação periférica, D———

Claims (1)

1. ' 1

   REIVINDICAÇÕES

   1. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA EFICÁCIA DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7 PARA O TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO INFLAMATÓRIO GASTROINTESTINAL em um paciente, caracterizado pelo fato de que o método compreende a comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante tratamento com o antagonista de integrina beta7, com uma quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, em que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia do antagonista para tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente, e em que o biomarcador é selecionado a partir do grupo consistindo em linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação de antagonista de integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal e receptores integrina beta7 —noslinfócitos de retorno intestinal.

   2. MÉTODO DE PREDIÇÃO DA RESPONSIVIDADE DE UM PACIENTE que possui um distúrbio inflamatório gastrointestinal ao tratamento com um antagonista de integrina beta7, caracterizado pelo fato de que o método compreende a comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com o antagonista de integrina beta7, com a quantidade de biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, em que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da responsividade do dito paciente ao tratamento com odito antagonista, e em que o biomarcador é selecionado a partir do grupo consistindo em linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação de antagonista de integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal e receptores integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal.

   CR

   3. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DA DOSAGEM DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETAZ7 para tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, caracterizado pelo fato de que o método compreende o ajuste da dosagem do antagonista de integrina beta7 com baseem uma comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante o tratamento com uma dosagem ou regime terapêutico do antagonista de integrina beta7, com uma quantidade do biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, em que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia ou responsividade da dosagem ou regime terapêutico do antagonista de integrina beta7 para tratamento do distúrbio gastrointestinal no paciente, e em que o biomarcador é selecionado a partir do grupo consistindo em linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação de antagonista de integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal e receptores integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal.

   4. MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DO REGIME TERAPÊUTICO DE UM ANTAGONISTA DE INTEGRINA BETA7 para tratamento de um distúrbio inflamatório gastrointestinal em um paciente, caracterizado pelo fato de que o método compreende ajustar o regime terapêutico do antagonista de integrina beta7 com base em uma comparação da quantidade de um biomarcador em uma amostra obtida do paciente após ou durante tratamento com um regime terapêutico do antagonista de integrina beta7, com uma quantidade do biomarcador em uma amostra obtida do paciente antes do tratamento, em que uma mudança na quantidade do biomarcador após ou durante o tratamento, em comparação com antes do tratamento, é indicativa da eficácia ou responsividade à dosagem ou regime | terapêutico do antagonista de integrina beta7 para tratamento do distúrbio |

   E gastrointestinal no paciente, e em que o biomarcador é selecionado a partir do grupo consistindo em linfócitos de retorno intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação de antagonista de integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal e receptores integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal.

   5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dita mudança na quantidade do biomarcador é um aumento ou diminuição.

   6, MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita mudança é um aumento na quantidade do dito biomarcador.

   7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade do dito biomarcador é mensurada no prazo de até 100 dias após o recebimento da primeira dose do agente.

   8 MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade do dito biomarcador é mensurada em pelo menos cerca de 24 horas após a administração do agente.

   8. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio inflamatório gastrointestinal é uma doença inflamatória intestinal.

   10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita doença inflamatória intestinal é doença de Crohn (DC) ou colite ulcerativa (CU).

   11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito paciente é um humano.

   12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito antagonista de integrina beta7 é um anticorpo anti- beta7.

   13. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado ———— —— — À —n—— | pelo fato de que o dito anticorpo é monocional.

   14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado.

   15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo.

   16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende seis regiões hipervariáveis (HVRs) selecionadas a partir do grupo consistindo em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que: () HVR-L1 compreende sequência de aminoácidos A1-A11, em que A1-A11 é RASESVDTYLH (SEQ ID NO: 1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8) ou RASESVDDLLH (SEQ ID NO: 9) ou uma variante das SEQ ID NOs: 1, 7, 8 ou 9 em que o aminoácido A2 é selecionado a partir do grupo consistindo em A, G, S, T, e V e/ou o aminoácido A3 é selecionado a partir do grupo consistindo em S, G, , K N, , Q, R e T, | elou A4 é selecionado a partir do grupo consistindo em E, V, 0, A, D, G HI K, | L, N, e R, e/ou o aminoácido A5 é selecionado a partir do grupo consistindo em S, Y, A, D, G, HI, K N, P, R, T, e V, e/ou o aminoácido A6 é selecionado a partirdo grupo consistindo em V, R, 1, A, G, K, L, M, e Q, e/ou o aminoácido A7 é selecionado a partir do grupo consistindo em D, V, S, A, E, G, A L K L N,P, S, e T, e/ou o aminoácido AB é selecionado a partir do grupo consistindo em D, G,N E T Pes, eouo aminoácido A9 é selecionado a partir do grupo consistindo em L, Y, | e M, e/ou o aminoácido A10 é selecionado a partir do grupo consistindo em L, A, |, M, e V e/ou o aminoácido A11 é selecionado a partir do grupo consistindo em H, Y, F, e S; (1) HVR-L2 compreende a sequência de aminoácidos B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID NO: 2), RYASQSIS (SEQ ID NO: 20), ou |

   XaaYASQSIS (SEQ ID NO: 21, onde Xaa representa qualquer aminoácido) ou uma variante da SEQ ID Nos: 2, 20 ou 21 em que o aminoácido B1 é selecionado a partir do grupo consistindo em K, R, N, V, A, F. 0, HP, l, L, Y e Xaa (onde Xaa representa qualquer aminoácido), e/ou o aminoácido B4 é

   5 selecionado a partir do grupo consistindo em S e D, e/ou o aminoácido B5 é selecionado a partir do grupo consistindo em Q e S, e/ou o aminoácido B6 é selecionado a partir do grupo consistindo em S, D, L, e R, e/ou o aminoácido B7 é selecionado a partir do grupo consistindo em |, V, E, e K;

   (iii) HVR-L3 compreende sequência de aminoácidos C1-C9,

   em que C1-C9 é QOGNSLPNT (SEQ ID NO: 3) ou uma variante da SEQ ID NO: 3 onde o aminoácido C8 é selecionado a partir do grupo consistindo em N, VW,Y, RS, TAF HILM eY;,

   (iv) HVR-H1 compreende sequência de aminoácidos D1-D10, em que D1-D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4);

   (1) HVR-H2 compreende sequência de aminoácidos E1-E17, em que E1-E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5), ou uma variante da SEQ ID NO: 5 onde o aminoácido E2 é selecionado a partir do grupo consistindo em Y, F, V, e D, e/ou o aminoácido E6 é selecionado a partir do grupo consistindo em S e G, e/ou o aminoácido E10 é selecionado a partir do grupo consistindo em S$ e Y, e/ou o aminoácido E12 é selecionado a partir do grupo consistindo em N, T, A, e D, e/ou o aminoácido 13 é selecionado a partir do grupo consistindo em P, H, D, e A, e/ou o aminoácido E15 é selecionado a partir do grupo consistindo em L e V, e/ou o aminoácido E17 é selecionado a partir do grupo consistindo em S e G; e

   (vi) HVR-H3 compreende sequência de aminoácidos F2-F11, em que F2-F11 é MTGSSGYFDF (SEQ ID NO; 6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 19); ou compreende sequência de aminoácidos F1-F11, em que F1-F11 é AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 16), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 17), ou

   |

   AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 18), ou uma variante das SEQ ID NOs: 6, 16, 17, 18 ou 19 onde o aminoácido F2 é R, M, A, E, G, Q, S, e/ou o aminoácido F11 ê selecionado a partir do grupo consistindo em F e Y,

   17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende três sequências de regiões hipervariáveis de cadeia pesada (HVR-H1-H3) e três sequências de regiões hipervariáveis de cadeia leve (HVR-L1-L3), em que: (i) HVR-L1 compreende a SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO:9; (ii) HVR-L2 compreende a SEQ ID NO: 2; (iii) HVR-L3 compreende a SEQ ID NO: 3; (iv) HVR-H1 compreende a SEQ ID NO: 4; (v) HVR-H2 compreende a SEQ ID NO: 5; e (vi) HVR-H3 compreende a SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 16 ou SEQIDNO:; 17 ou SEQ ID NO: 19,

   18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que a dita amostra é uma amostra de sangue periférico do dito paciente.

   19. MÉTODO PARA A PREDIÇÃO DO PROGNÓSTICO DE UMA DOENÇA INFLAMATÓRIA INTESTINAL para um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a comparação de uma relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e a quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue do dito paciente com uma relação entre a quantidade de linfócitos de retorno intestinal e quantidade de linfócitos de retorno periférico em uma amostra de sangue de um indivíduo saudável, em que uma relação diminuída do dito paciente quando comparada com a relação do indivíduo saudável! é indicativa do prognóstico da doença.

   20. MÉTODO DE ELABORAÇÃO DE UM TRATAMENTO com | um agente candidato para um paciente humano diagnosticado com um distúrbio inflamatório gastrointestinal, caracterizado pelo fato de que compreende a determinação de uma dosagem eficaz para o paciente humano com base em uma dosagem que aumenta de maneira eficaz a quantidade de um biomarcador no sangue periférico de um indivíduo não humano em resposta a um tratamento com o dito agente candidato, em que o biomarcador é selecionado a partir de um grupo consistindo em linfócitos de retorno | intestinal no sangue periférico do paciente, ocupação do dito agente terapêutico nos linfócitos de retorno intestinal e receptores integrina beta7 nos linfócitos de retorno intestinal.

   21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito indivíduo não humano é um macaco,

   22. "MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o dito agente é um anticorpo anti-integrina beta7.

   23. MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO DE UMA POPULAÇÃO DE LINFÓCITOS, que compreende linfócitos expressando integrina alfaEbeta7 e linfócitos expressando integrina alfaábeta7 e linfócitos expressando ambas integrinas alfaEbeta7 e alfa4beta7, caracterizado pelo fato de compreende a ligação dos ditos linfócitos com um anticorpo isolado que se liga ao mesmo epítopode um anticorpo que compreende uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 10, e uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11,

   24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que os ditos linfócitos são obtidos do sangue periférico de um —pacientediagnosticado com uma doença inflamatória intestinal.

   25. — MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que os ditos linfócitos são obtidos a partir dos linfonodos e tecidos do intestino de um paciente diagnosticado com uma doença inflamatória intestinal.

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