BRPI0909823B1

BRPI0909823B1 - Conjugados antagonistas de peptídeo análogo de bombesina, seu uso e seu processo de preparação, composição farmacêutica, processo para formação de imagem de receptores de bombesina e kit

Info

Publication number: BRPI0909823B1
Application number: BRPI0909823-2A
Authority: BR
Inventors: Helmut Maecke; Jean Claude Reubi; Rosalba Mansi
Original assignee: Universitätsspital Basel; Universität Bern
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2009-02-27
Publication date: 2022-04-19
Also published as: CO6290707A2; EP2100900A1; KR20110014565A; EP2252628B1; PA8818501A1; JP2011515338A; EP2252628A1; US9035023B2; WO2009109332A1; CY1118687T1; AR070809A1; CN101965358B; ES2615805T3; US20110097266A1; ZA201006385B; HUE032980T2; CN101965358A; KR20160128425A; CR11671A; RU2523531C2

Abstract

CONJUGADOS ANTAGONISTAS DE PEPTÍDEO ANÁLOGO DE BOMBESINA. A presente invenção refere-se a um medicamento terapêutico e diagnóstico, um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina é provido o qual tem a fórmula genérica (I): [A -(B)n]x-C, onde A é um quelante metal compreendendo pelo menos um metal radionuclídeo, B é um espaçador ligado a terminal N de C ou uma ligação covalente e C é um antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo uma sequência como reivindicada, onde ainda x é um inteiro de 1 a 3 e n é um inteiro de 1 a 6.

Description

INTRODUÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a radiofarmacêuticos terapêuticos ou diagnósticos/formação de imagem, preparação e uso dos mesmos em que os radiofarmacêuticos terapêuticos ou diagnósticos são definidos como metades ligantes tendo uma afinidade para e são capazes de ligação a receptores de bombesina e mais particularmente a receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP). As metades de ligação são rotuladas para grupo de complexação de metal para isótopos emitindo alfa-, beta-, gama- e positron. O uso inclui tratamento de um sujeito tendo uma doença neoplástica compreendendo a etapa de administração ao sujeito de uma quantidade efetiva de um radiofarmacêutico terapêutico tendo um metal quelado com um grupo quelante ligado a uma metade capaz de ligação a receptores de bombesina e, mais particularmente, a receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP) superexpresso sobre células de tumor. O uso inclui diagnóstico ou formação de imagem de um sujeito tendo uma doença neoplástica usando um rádio - farmacêutico diagnóstico/formação de imagem tendo um metal quelado com um grupo quelante ligado a uma metade capaz de ligação a receptores de bombesina e mais particularmente a receptor de peptídeo liberando gastrina (GRP) superexpresso sobre células de tumor. O processo consiste na formação de um composto terapêutico ou diagnóstico a partir de um composto precursor consistindo em um grupo quelante de metal ligado covalentemente com uma metade capaz de ligação de receptores de bombesina e, mais particularmente, a receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP).

ANTECEDENTES

[002] No desenho de um efetivo traçador rádio - farmacêutico para uso como um agente diagnóstico, é imperativo que os fármacos tenham apropriadas propriedades farmacocinéticas e de orientação para o alvo in vivo. Fritzberg et al. (1992, J. Nucl. Med., 33:394) estabelece ainda que química de radionuclídeo e ligações associadas acentuam a necessidade para otimizar a ligação e marcação de modificações químicas do veículo de biomolécula. Portanto o tipo de radionuclídeo, o tipo de biomolécula e o processo usado para ligação dos mesmos uns aos outros pode ter um efeito crucial sobre as propriedades de rádio - traçador.

[003] Peptídeos são biomoléculas que desempenham um papel crucial em muitos processos fisiológicos incluindo ações como neurotransmissores, hormônios, e antibióticos. Pesquisa mostrou sua importância em campos tais como neurociência, imunologia, farmacologia, e biologia celular. Alguns peptídeos podem atuar como mensageiro químico. Eles se ligam a receptor sobre a superfície de célula-alvo e o efeito biológico do ligante é transmitido para o tecido- alvo. Portanto, a propriedade de ligação de receptor específico do ligante pode ser explorada através de marcação do ligante com um radionuclídeo. Teoricamente, a alta afinidade do ligante para o receptor facilita retenção do ligante marcado com rádio em tecidos expressando receptor. Entretanto, ainda está sob investigação quais peptídeos podem ser eficientemente marcados e sob quais condições a marcação deve ocorrer. É bem conhecido que especificidade receptora de peptídeo ligante pode ser alterada durante reação química. Por isso uma construção peptídica ótima tem de ser determinada.

[004] Tumores superexpressam vários tipos de receptores aos quais peptídeos se ligam especificamente. As seguintes publicações de Boerman et al., Seminar in Nuclear Medicine , 2000, 30(3), 195); Reubi et al. J. Nucl. Med. , 1005, 46, (suppl) 67S; Reubi, J.C., Endocrine Reviews, 2003, 24(4), 389 proporcionam uma lista não-exaustiva de peptídeos que se ligam especificamente a receptores de superfície de célula em neoplasmas, isto é, somatostatina, peptídeo intestinal vasoativo (VIP), ligação de bombesina a receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP), gastrina, colecistocinina (CCK), e calcitonina.

[005] A potencial utilidade de peptídeos específicos de receptor marcado com metal para formação de imagem cintigráfica e radioterapia é exemplificada por análogos de somatostatina, por exemplo, octreotídeo conjugado com 111In-DTPA, um agente de formação de imagem diagnóstico aprovado por FDA, Octreoscan, comercializado por Covidien nos Estados Unidos (Lowbertz et al., Seminars in Oncology, 1994, 1) e Reubi et al., J. Nucl. Med., 2005, 46, 67S-75S e referências ali, respectivamente. Octreotídeo e seus análogos foram ligados covalentemente a vários isótopos de metal de formação de imagem (99mTc, 111In, 68Ga) e a isótopos de metais terapêuticos (105Rh, 186/188Re, 153Sm, 90Y, 166Ho, 177Lu). Os conjugados marcados com metal se ligam especificamente ao receptor, e com ligação ao receptor, a construção é internalizada pelo receptor e os peptídeos específicos de receptor marcado com metal ou seus metabólitos são arrastados nas células- alvo.

[006] O princípio anterior é ainda estendido para peptídeos ávidos por receptor GRP (peptídeos tendo alta afinidade para o receptor) nos quais agonistas de bombesina conjugados com metal são usados para formação de imagem cintigráfica e radioterapia (Smith et al., Anticancer Res,, 23 (2003), 63-70; Baidoo et al., Bioconjug. Chem., 9 (1998), 218225; Gali et al., Bioconjug. Chem., 12 (2001), 354-363; Smith et al., Bioconjug. Chem., 14 (2003), 93-102, Cancer Res., 63 (2003), 4082- 4088; Rogers et al., In, M. Nicolini and U. Mazzi, Editors, Technetium, rhenium and other metals in chemistry and nuclear medicine, SGE Editoriali, Italy (1999), 519-525; Zhang et al., Cancer Res., 64 (2004), 6707-6715; Lantry et al., EANM, Helsinki (Finland) (2004); Linder et al., J. Nucl. Med., 45, (2004) (5), 169P [abstract 482]. Chen et al., J. Nucl. Med., 45 (2004), 1390-1397; Johnson et al., Cancer Biother Radiopharm. 2006, 21(2), 155-66, Smith et al., Nucl. Med. Biol., 2005, 32 733-40).

[007] Em Chen et al. (Appl. Radiat. Isot., 2007, (In Press)), Waser et al. (Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2007 34, 95-100) e Lantry et al. (J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52) formação de imagem e radioterapia de um agonista de bombesina, 177Lu-DOTA acoplado a -NH-CH2-CO- [4-amino benzoil]-QWAVGHLM-NH2))(177Lu-AMBA), foi descrito.

[008] Várias patentes e pedidos de patentes referem-se a agonistas de bombesina marcados com metal. Volkert et al.(U.S. 2007/0065362 A) reivindica agonistas de bombesina marcados com metal da estrutura genérica metade de marcação de metal - grupo espaçador - agonista de bombesina para formação de imagem e uso terapêutico. Outras patentes e pedidos de patentes pelos mesmos inventores incluem: U.S. 6 921 526 B (2005), U.S. 7 060 247 B, US 7 147 838 B (2006) e WO 2002/087631 A1.

ESTADO DA TÉCNICA

[009] O princípio subjacente para a seleção de agonistas como um radiofarmacêutico em todas as publicações acima é que eles produzem ou elicitam uma resposta pelos receptores de GRP com interação onde o rádio-farmacêutico é subsequentemente internalizado na célula através de endocitose. Antagonistas de GRP contrabalançam o efeito de um agonista e não são internalizados na célula e, portanto, é assumido que antagonistas não podem ser bem apropriados para propósitos de formação de imagem radiocintigráfica e radioterapêuticos. Até agora, o consenso tem sido desenvolver compostos com boas propriedades de internalização de radioligante, conduzindo a alta acumulação in vivo de radioligantes nos tumores que pareceu ser requerida para ótima visualização e terapia de radionuclido in vivo. É bem conhecido a partir de investigações farmacológicas - moleculares que eficiente internalização é usualmente provida predominantemente por agonistas (Bodei et al., J. Nucl. Med., 2006;47, 375-377; Koenig et al., Trends Pharmacol. Sci., 1997;18, 276-287, Cescato et al., J. Nucl. Med., 2006;47, 502-511. Ginj et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103, 16436-16441) e recentemente, foi demonstrado que, no caso de receptores de somatostatina, antagonistas de receptor de somatostatina marcados com metal de alta afinidade internalizam pobremente em células de tumor e desempenham igualmente ou mesmo melhor em termos de tomada in vivo em tumor em modelos de tumor animal que os correspondentes agonistas, que internalizam massivamente. Receptores de GRP são superexpressos em vários neoplasmas (Cornélio et al., Ann. Onco., 2007, 18, 1457-1466 e referências ali) como câncer de próstata e metástase, câncer de mama e metástase, tumores estromais gastrointestinais, carcinomas de pulmão de célula pequena, carcinomas de célula renal, tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos, cânceres de célula escamosa de cabeça e pescoço,. neuroblastomas e carcinomas de célula escamosa esofageal. Receptores de GRP também são expressos em vasos sanguíneos associados com tumor de ovário humano, cânceres endometrial e pancreático. (Fleischmann et al., Cell Onc., 2007, 29, 421-33). Por isso, é altamente desejável projetar potentes radiofarmacêuticos com propriedades antagonistas para formação de imagem e radioterapia.

[010] Jensen et al. (Pharma. Reviews, 2008 (in Press)) recentemente reviu a farmacologia de receptor de três diferentes subtipos de receptor de bombesina do quais receptor de GRP pertence a subtipo 2.

[011] Em uma publicação recente Cescato et al. (J. Nucl. Med., 2008, 49, 318-26) demonstraram que antagonista de bombesina marcado com 99mTc-Na pode ser preferido sobre agonistas para alvejamento de tumor.

[012] Investigações anteriores no campo de compostos alvejados para receptor de GRP são descritos em WO 2007/109475 A2, WO 2007/095443 A2, U.S. 2008/0008649 A1 e U.S. 7 226 577 B2 com metal quelado - ligador - bombesina com um esquema genérico mostrado abaixo.

[013] Metal - quelante - ligador - análogo de bombesina

[014] De acordo com WO 2007/095443 A2, amostra L70 com a particular sequência 177Lu-DOTA-Gly-4-amino benzoil-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-Met-NH2 comportou-se como um agonista onde a tomada em 1 e 24 horas foi medida. A tomada não é ótima para propósitos terapêuticos e precisa ser aperfeiçoada.

[015] Além destas patentes e pedidos de patentes, estudos pré- clínicos e clínicos são incluídos nas publicações (Waser et al., Eur. J. Nucl. Medicine, 2007, 34, 95-100; J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52).

[016] Em virtude de seleção de um antagonista que alveje receptor de GPR em um diferente sítio com alta afinidade, é mostrado nesta invenção que uma combinação de estratégia espaçadora resulta em inesperada alta e persistentetomada de tumor combinada com uma baixa tomada e rápida depuração em órgão que não são alvos. Em um estudo comparativo, tomada maior acentuável (>2 X) no tumor foi observada quando um ligador similar foi usado. Partindo de ensaios in vitro validando as propriedades antagonísticas dos análogos de bombesina foi verificado que mesmo após adição de um espaçador terminalmente-N, um quelante e um metal destes efeitos antagonísticos foram retidos e traduzidos em excelente comportamento in vivo com relação a razões de tumor-para-fundo.

[017] Por isso, é um objeto da presente invenção prover novos conjugados antagonistas de peptídeo bombesina mostrando alta tomada e alta estabilidade in vivo (soro e tecido humanos).

SUMÁRIO DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[018] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a conjugados de antagonista de peptídeo análogo a bombesina que se ligam seletivamente a receptores de bombesina e mais particularmente a receptor de GRP sem disparar internalização na célula e sem sinalização através de mobilização de cálcio enquanto antagonizando os efeitos induzidos por agonista nestes dois sistemas, onde o conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tem a fórmula genérica (I):(I) [A-(B)n]x-C

[019] em que

[020] x é um inteiro de 1 a 3,

[021] n é um inteiro de 1 a 6,

[022] A é um quelante metal compreendendo pelo menos um metal radionuclídeo, preferivelmente apropriado para uso diagnóstico ou terapêutico, mais preferivelmente para formação de imagem ou radioterapia,

[023] B é um espaçador ligado a terminal-N de C ou uma ligação covalente,

[024] C é um antagonista de peprtídeo análogo a bombesina de sequência C-1 a C-4, em que

[025] C-1: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414-ZH,

[026] em que

[027] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala,

[028] Xaa3 é estatina, análogos e isômeros de estatina, 4-Am, 5- MeHpA, 4-Am, 5-MeHxA ou aminoácidos alfa - substituídos,

[029] Xaa4 é Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, ou iso-Bu-Gly, e

[030] Z é NH ou O;

[031] C-2: Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leuv(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, em que 4:H2)2-CHJ Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 é ‘

[032] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

[033] K é F, Cl, I, ou NO2,

[034] Xaa2 é Gly ou β-Ala;

[035] C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa5 13-Xaa6 14-ZH,

[036] em que

[037] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo.

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala, Xaa5 é Leu^-CH2NH-, Xaa6 é Cys, Phe, Trp, Tpi ou Tac, em que Tpi e Tac têm o seguinte significado:

e Z é NH, ou O;

[038] C-4: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa7, em que

[039] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala, Xaa7 é Leu-O-Alquila, ou Leu-NH-alquila.

[040] A invenção ainda refere-se a sais farmaceuticamente aceitáveis destes conjugados antagonistas de peptídeo análogo de bombesina de um seu ácido inorgânico ou orgânico, e ainda a hidratos, complexos, ésteres, amidas, solvatos e profármacos destes compostos tendo fórmula química genérica (I).

DESCRIÇÃO A (QUELANTE DE METAL):

[041] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o quelante de metal (A) é um quelante de metal para metais trivalentes ou para metais pentavalentes e seus análogos próximos.

[042] Preferivelmente, o quelante de metal (A) para metais trivalentes é selecionado do grupo compreendendo quelantes baseados em DOTA-, NODASA-, NODAGA-, NOTA-, DTPA-, EDTA-, TETA-, e TRITA e seus análogos próximos, em que

[043] DOTA representa ácido 1,4,7,10-tetra aza ciclo dodecano- N,N',N",N"'-tetra acético,

[044] DTPA representa ácido dietilenotriaminopenta-acético,

[045] EDTA representa ácido etileno diamino-N,N'-tetra acético,

[046] TETA representa ácido 1,4,8,11-tetra-azaciclododecano- 1,4,8,11-tetra-acético, e

[047] NOTA representa ácido 1,4,7-triazaciclononano triacético.

[048] Mais preferivelmente, o quelante de metal (A) para metais trivalentes é selecionado do grupo compreendendo:

[049] quelantes baseados em DOTA, NOTA, DTPA, e TETA e seus análogos próximos.

[050] As estruturas destes ligantes quelantes em suas formas inteiramente desprotonadas são mostradas abaixo.

[051] Mesmo mais preferivelmente, o quelante de metal (A) para metais trivalentes é selecionado do grupo compreendendo DTPA (ácido dietilenotriaminopenta-acético) e macrociclos poliaza policarboxilatos como DOTA (ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-N,N',N",N"'-tetra- acético) e análogos próximos dos mesmos.

[052] Preferivelmente, o quelante d e metal (A) para metais pentavalentes é selecionado do grupo compreendendo 2-hidrazino nicotinamida (HYNIC), quelantes-N4 (N4 pode ser linear ou macrocíclico e X pode ser uma azida amina, OH, halogênio, o-, m-, p-amino benzil met paracarboxibenzila, e carbóxi (Nock, B. et al. (2003 [99mTc] Demobesin 1, um novo análogo de bombesina para formação de imagem de tumor alvejada parra receptor de GRP. Eur. I. Nucl. Mol. Imaging, 30, 247-258)), Desferrioxamin (DFO), e quelantes NrS(4-r), e

em que

[053] R1-R15 são independentemente um do outro átomos de hidrogênio ou grupos C1-4 alquila, em que, na metade

da fórmula acima, t é 1 ou 2 ou 3 e pelo menos um dos átomos de carbono na dita metade

está substituído com Y ou não está substituído com Y,

[054] R16 é um átomo de hidrogênio ou um grupo CO2 (C1-4) alquila;

[055] R17 e R18 são independentemente um do outro grupos C1-4 alquila ou grupos fenila;

[056] R19 é CH2-COOH ou um seu derivado funcional;

[057] E é C1-4 alquileno, ou fenileno;

[058] opcionalmente C1-4 alquileno está substituído com CO2- alquila, CH2-COalquila, CONH2 ou CONHCH2-CO2-alquila;

[059] opcionalmente fenileno está substituído com CO2-alquila,

[060] onde os grupos alquila têm 1 a 4 átomos de carbono;

[061] G é NH ou S;

[062] Y é um grupo funcional capaz de ligação com um grupo amino livre do peptídeo (N-terminal) ou com o espaçador; e

[063] Z' é S ou O.

[064] Quelantes-N4 são preferivelmente,

em que

[065] m significa um inteiro de 1 a 4.

[066] Quelantes NrS(4-r) são definidos em que r é um inteiro de 1 a 4.

[067] O dito grupo funcional Y preferivelmente compreende isocianato, isotiocianato, formila, halonitrofenila, diazônio, epóxi, tricloro-s-triazinila, etileno imino, clorossulfonila, alcoxicarbim-idoíla, alquilcarboniloxicarbonila (substituído ou não-substituído),alquilcarbonilimidazolila, succinimido-oxicarbonila; o dito grupo estando ligado a um bi-radical hidrocarboneto C1-10. Apropriados exemplos de bi- radicais hidrocarbonetos são bi-radicais derivados de benzeno , C1-6 alcanos, C2-6 alquenos e C1-4 alquilbenzenos, e análogos próximos dos mesmos.

[068] Preferivelmente, quelantes NtS(4-t) são selecionados do grupo compreendendo quelantes baseados em bisamino bistiol (BAT) para metal radionuclídeo tecnécio, mercapto-acetil-glicil-glicil-glicina (MAG3) para metal radionuclídeo tecnécio e análogos próximos dos mesmos.

[069] Mais preferivelmente, o quelante de metal (A) para metais pentavalentes é selecionado do grupo compreendendo

[070] e análogos próximos dos mesmos,

[071] em que R1-R19, Z', Y, G e t são definidos como acima.

[072] Preferivelmente, r é um inteiro de 2 a 4 e mais preferivelmente r é 2 ou 3.

[073] Preferivelmente, m significa um inteiro de 1 a 2, mais preferivelmente m é 1.

[074] Quelantes de metais bem conhecidos tais como quelantes lineares, macrocíclicos, tetra piridina e Na3S, N2S2 ou N4 são mostrados em U.S. 5 367 080 A, U.S. 5 364 613 A, U.S. 5 021 556 A, U.S. 5 075 099 A, U.S. 5 886 142 A, as exposições das quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

[075] Quelantes de metais bem conhecidos como HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, TETA, quelantes baseados em bia amino bis tiol (BAT) são mostrados em US 5 720 934 A a exposição da qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[076] Quelantes de metais bem conhecidos como Desferrioxamina (DFO) é mostrado em Doulias et al. (2003) Endosomal and lysosomal effects of desferrioxamine: protection of HeLa cells from hydrogen peroxide-induced DNA damage and induction of cell-cycle arrest. Free Radic. Biol. Med., Vol. 35, Issue 7:719-28.

[077] Uma ampla variedade de agentes quelantes é disponível e revista por Banerjee et al. (Nucl. Med. And BIology, 2005, 32, 1-20 e referências ali) aqui incluído por referência.

[078] 2-hidrazino nicotinamida (HYNIC) é uma outra classe de grupo quelante (A), na presença de um coligante que foi amplamente usado para incorporação de 99mTc e 186,188Re (Schwartz et al. Bioconj. Chem., 1991, 2, 333-6; Babich et al., J. Nucl. Med., 1993, 34, 1964-70; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, 25-30; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, pp. 32, pp. 1-10)

[079] DTPA é usado em Octreoscan (comercializdo por Covidian) para complexação de 111In e várias m0odificações são descritas na literatura (Brechbiel et al., Biocon. Chem., 1991, 2, 187-194; Li et al., Nucl. Med. Biol., 2001, 28, 145-154).

[080] Quelatos tipo DOTA para aplicações de radioterapia são descritos por Tweedle et al., patente U.S. 48885363. Outros macrociclos poliaza para quelação de metais isótopos trivalentes são descritos por Maeccke et al. em Bioconj. Chem., 2002, 13, 530 e aqui incluído por referência.

[081] Quelantes - N4, 99mTc-N4-quelante têm sido usados para marcação de peptídeo no caso de minigastrina para alvejamento de receptores de CCK-2 (Nock et al., J. Nucl. Med. , 2005, 46, 1727-36).

[082] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o metal radionuclídeo é apropriado para ser complexado com um quelante de metal e conduzindo o quelante de metal radioativo para formação de imagem. Preferivelmente, o metal radionuclídeo é selecionado do grupo compreendendo 133mIn, 99m Tc, 67Ga,

[083] 52 Fe, 68 Ga, 72 As, 111In, 97 Ru, 203 Pb, 62 Cu, 64 Cu, 51 Cr, 52m Mn, 157 Gd, 123I, 124I, 131 I, 75 Br, 76Br, 77Br, 64Cu and 82Br. Mais preferivelmente, o metal radionuclídeo é selecionado do grupo compreendendo 99mTc, 67Ga, 68Ga, 111In, e 123I. Mesmo mais preferivelmente o metal radionuclídeo é 68Ga. Mesmo mais preferivelmente o metal radionuclídeo é 99mTc.

[084] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o metal radionuclídeo é apropriado para complexação com um quelante de metal e condução de quelante de metal radioativo para radioterapia. Preferivelmente, o metal radionuclídeo é selecionado do grupo compreendendo 186Re, 90Y, 67Cu, 68 Ga , 69 Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 188Rd, 186Re, 188Re, 77As, 166Dy, 166Ho, 149 Pm, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 172Tm, 90Y, 111In, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag, , 125I, 123I, ,213Bi, 225Ac, 129I , 64Cu e 177mSn. Mais preferivelmente, o metal radionuclídeo é selecfionado do grupo compreendendo 186Re, 188Re, 90Y, 153Sm, 68 Ga , e 177Lu.

[085] Ainda em uma alternativa do primeiro aspecto o apropriado metal radionuclídeo é um halogênio radioativo (isótopos de iodo e bromo), o halogênio radioativo está ligado diretamente ao peptídeo, tal como através de reação química para metade Tyr ou Trp dentro de peptídeo, ou opcionalmente A pode ser Tyr ou Trp.

[086] Agentes radiodiagnósticos preferidos (67Ga, 111In) e agentes radioterapêuticos (90Y, 153Sm, 177Lu) opcionalmente contêm um íon de metal +3 quelado da classe de elementos conhecidos como lantanídeos. Metais radioativos típicos nesta classe incluem os isótopos 90ítrio, 111Índio, 149Promécio, 153Samário, 166Disprósio, 166Holmio, 175Itérbio, e 177Lutécio. Todos estes metais (e outros nas séries lantanídeos) têm químicas muito similares, em que eles permanecem no estado de oxidação +3 e preferem quelar para ligantes que transportam átomos doadores difíceis (oxigênio/nitrogênio).

DESCRIÇÃO B (ESPAÇADOR):

[087] B é um espaçador ligado a terminal-N de C ou uma ligação covalente.

[088] Em uma modalidade preferida da presente invenção B é um composto tendo Fórmula (II) (II) Bi - B2 em que

[089] Bi é uma ligação covalente, um aminoácido natural, um aminoácido não-natural, uma diamina linear ou uma diamina cíclica,

[090] B2 é uma ligação covalente, um aminoácido natural, um aminoácido não-natural, um ácido carboxílico linear ou um ácido carboxílico cíclico,

[091] com a condição de que ambos Bi e B2 não podem ser ligações covalentes ao mesmo tempo e que, quando Bi é uma diamina, B2 é um ácido carboxílico (isto é, B2 não pode ser uma ligação ou um aminoácido natural ou não-natural neste caso).

[092] Preferivelmente, o aminoácido não-natural é um composto tendo uma das fórmulas (III), (IV), (V) ou (VI) em que

0 em que a é um inteiro de 0 a 3, b é um inteiro de 0 a 3,

[093] e padrões de substituição relativos ou opcionalmentei,2-, i,3- ou i,4-. Preferivelmente, a é 0 ou i, b é 0 ou i,

em que c é um inteiro de 1 a 24, d é um inteiro de 1 a 6. Preferivelmente, c é um inteiro de 1 a 15, mais preferivelmente de 1 a 8, d é um inteiro de 1 a 3, mais preferivelmente d é 1.

em que E' é NH, ou CH2, f é um inteiro de 0 a 6, g é um inteiro de 0 a 6;

[094] quando E' é CH2, então o anel de 6 membros está opcionalmente substituído em qualquer posição do anel de 6 membros sobre o mesmo carbono do anel ou sobre diferentes carbonos,

[095] quando E' é NH, então o anel de 6 membros está opcionalmente substituído em qualquer posição de carbono do anel de 6 membros sobre o mesmo átomo de carbono do anel ou sobre diferentes átomos de carbono e/ou sobre o átomo de nitrogênio com a condição de que f ou g é um inteiro igual ou maior que 1. Preferivelmente, E' é NH, f é um inteiro de 0 a 3, g é um inteiro de 0 a 3;

em que i é um inteiro de 1 a 6, j é um inteiro de 1 a 6, P é O ou H2. Preferivelmente, i é um inteiro de 1 a 3, j é um inteiro de 1 a 3, P é O.

[096] Mais preferivelmente o espaçador é selecionado do grupo compreendendo 4-amino-1-carboximetilpiperidina, ácido (R,S)-diamino acético, PEG1-24, Sar5-10, ácido 8-amino-octanoico, ácido 6-amino caproico, 4-(2-aminoetil)-1-carboximetil piperazina, ácido diaminobutírico, ácido hipúrico, ácido 4-amino-1-Boc-piperidino-4- carboxílico, ácido Gly-amino benzoico, ácido 5-amino-3-oxa-pentil succinâmico, Peg1-24-4-amino-1-carboximetil piperidina, Dab (ácido shikimic), (D-Gln)x, (D-Asn)x.

[097] Descrição C (antagonista de peptídeo análogo a bombesina de sequência)

[098] Em uma modalidade preferida da presente invenção, a sequência antagonista de peptídeo análogo a bombesina é selecionada do grupo compreendendo C-1 a C-3, preferivelmente C-1 a C-2.

[099] Preferivelmente, a sequência de antagonista de peptídeo análogo a bombesina é selecionada do grupo compreendendo:

[0100] Composto 1 Seq: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu- NH2 ;

[0101] Composto 9 Seq: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3;

[0102] Composto 12 Seq: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu^(CH2NH)-Phe-NH2;

[0103] Composto 13 Seq: Dphe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu^(CH2NH)-Cys-NH2.

[0104] Preferivelmente, o conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula (I) compreendendo pelo menos um metal radionuclídeo é selecionado do grupo compreendendo pelo menos um metal radiconuclido selecionado do grupo compreendendo:

[0105] Composto 1: DOTA-Gly-amino benzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0106] Composto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil piperidino-D- Phe-Glen-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0107] Composto 3: DOTA-ácido-4-amino-1-piperidino-4- carboxílico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0108] Composto 4: DOTA-ácido 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0109] Composto 5: DOTA-(ácido 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanóico)-(4-amino-1-carboximetil-piperidino)-D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0110] Composto 6: DOTA-ácidodiaminobutírico-D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0111] Composto 7: DOTA-4-(2-aminoetil)-1- carboximetilpiperazina-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0112] Composto 8: DOTA-ácido 5-amino-3-oxapentil)- succinâmico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0113] Composto 9: DOTA-4-amino-1-carboximetil piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3;

[0114] Composto 10: DOTA-(15-amino-4,7,10,13-tetraoxapenta decanoico)-4-amino-1-carboxi metil piperidina-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3;

[0115] Composto 11: DOAT-ácido -15-amino-4,7,10,13-tetra oxa pentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)- (CH2)2-CH3;

[0116] Composto 12: DOTA-4-amino-1-carboximetil piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Phe-NH2;

[0117] Composto 13: DOTA-4-amino-1-carboximetil piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Cys-NH2;

[0118] Composto 14: N4-triazóis-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Sta-Leu-NH2.

[0119] Outras realizações preferidas:

[0120] Em uma modalidade preferida da presente invenção, para o composto tendo Fórmula (I), x é um inteiro de 1 a 2, preferivelmente x é 1.

[0121] Quando x é igual a ou maior que 2, então (B)n é um espaçador linear ou um espaçador ramificado ligado ao terminal-N do antagonista de peptídeo análogo a bombesina (C).

[0122] Em uma modalidade preferida da presente invenção, para o composto tendo Fórmula (I), n 'é um inteiro de 1 a 4, preferivelmente n é 1 ou 3, mais preferivelmente 1.

[0123] Em uma modalidade preferida da presente invenção, para o composto tendo Fórmula (I), A é adicionalmente um quelante de metal compreendendo pelo menos um átomo de metal frio correspondendo ou equivalente ao metal radionuclídeo listado acima. Tais compostos são úteis para ensaios de ligação in vitro e in vivo e como compostos referências. As modalidades preferidaslistadas acima são aplicadas aqui.

[0124] Em uma modalidade preferida da presente invenção, para o composto tendo Fórmula (I), K é adicionalmente H ou preferivelmente H.

[0125] Em um segundo aspecto, a invenção refere-se a precursores de conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina que se ligam seletivamente a receptores de bombesina e que mais particularmente se ligam a receptor de GRP sem dispararem internalização na célula e sem sinalização através de mobilização de cálcio enquanto antagonizando os efeitos induzidos por agonista nestes dois sistemas, onde o conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tem fórmula genérica (I') (I') [A'-(B)n]x-C em que x é um inteiro de 1 a 3, n é um inteiro de 1 a 6, A' é um quelante de metal,

[0126] B é um espaçador ligado a terminal-N de C ou uma ligação covalente,

[0127] C é um antagonista de peptídeo análogo de bombesina de sequência C-1 a C-4.

[0128] O quelante de metal A' é um quelante de metal livre de metal radionuclídeo como definido no primeiro aspecto para A.

[0129] O espaçador B e o antagonista de peptídeo análogo de bombesina C são definidos como acima no primeiro aspecto.

[0130] A invenção ainda refere-se a sais farmaceuticamente aceitáveis dos conjugados de antagonista de peptídeo análogo a bombesina de um seu ácido inorgânico ou orgânico, e a hidratos, complexos, ésteres, amidas, solvatos e profármacos destes compostos tendo fórmula química genérica (I').

[0131] Em uma modalidade preferida da presente invenção, x é um inteiro de 1 a 2, preferivelmente x é 1. Quando x é igual a ou maior que 2, então (B)n é um espaçador linear ou um espaçador ramificado ligado ao terminal-N do antagonista de peptídeo análogo a bombesina (C).

[0132] Em uma modalidade preferida da presente invenção, na Fórmula (I'), n é um inteiro de 1 a 4, preferivelmente n é 1 ou 3, mais preferivelmente 1.

[0133] Em um terceiro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo conjugados antagonistas de peptídeo análogo a bombesina tendo Fórmula (I) ou (I') e um veículo farmacêutico aceitável.

[0134] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se ao uso de conjugados antagonistas peptídeo análogo de bombesina tendo Fórmula (I) ou (I') para ligação a receptores de bombesina e mais particularmente receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP) e/ou para inibição de receptores de bombesina e mais particularmente receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP).

[0135] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a um processo para preparação de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula genérica (I) (I) [A-(B)n]x-C

[0136] em que n,x, A, B e C são como definidos acima,

[0137] compreendendo a etapa de

[0138] radioquelação de conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula genérica (I') como definida acima com um apropriado metal radionuclídeo ou átomo de metal correspondendo a metal radionuclídeo listado acima.

[0139] Preferivelmente, o processo para preparação de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula genérica (I) compreende a etapa de radioquelação com um apropriado metal radionuclídeo.

[0140] Ainda em uma realização, o processo para preparação de um conjugado de antagonista de peptídeo análogo de bombesina tendo a fórmula genérica (I) (II) [A-(B)n]x-C

[0141] em que n, x, A, A', B e C são definidos como acima,

[0142] compreende adicionalmente as etapas: a) acoplamento de um espaçador B a um antagonista de peptídeo análogo a bombesina C para obtenção de um antagonista de peptídeo análogo a bombesina - espaçador de sequência C-1 a C-4, opcionalmente repetindo etapa a); e b) acoplamento de um antagonista de peptídeo análogo à bombesina - espaçador com um quelante de metal A' para obtenção de conjugado de antagonista de peptídeo análogo à bombesina tendo fórmula genérica (I'), opcionalmente repetindo a etapa b),

[0143] as etapas acima ocorrendo antes de radioquelação do conjugado de antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula genérica (I') com um apropriado metal radionuclídeo ou átomo de metal correspondendo ou equivalente a metal radionuclídeo listado acima.

[0144] Em uma modalidade preferida da presente invenção, n, x, quelante de metal A, quelante de metal A', espaçador B e antagonista de peptídeo análogo a bombesina C são definidos como acima.

[0145] Em um sexto aspecto, a invenção refere-se a um processo para formação de imagem de receptores de bombesina e mais particularmente células de tumor expresssando receptor GRP e/ou vasos tumorais e peritumorais em um paciente, compreendendo as etapas de: - administração a um paciente de uma quantidade radiofarmacêutica efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo Fórmula (I); e - formação de imagem de metal radionuclídeo no paciente.

[0146] Uma modalidade preferida do sexto aspecto refere-se ao uso de uma quantidade radiofarmaceuticamente efetiva de um conjugado de antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fóormula (I) para a fabricação de um agente de formação de imagem para formação de imagem de receptores de bombesina e mais particularmente células de tumor expressando receptor de GRP e/ou vasos tumorais e peritumorais.

[0147] Em uma modalidade preferida as células de tumor referem- se a cânceres que são selecionados do grupo compreendendo: - câncer de próstata, incluindo metástases, - câncer de mama, incluindo metástases, - tumores estromais gastrointestinais, - carcinomas de pulmão de célula pequena, - carcinomas de células renais, - tumores neuroendócrinos gastroenteropáticos, - cânceres de células escamosa de cabeça e pescoço, - neuroblastomas, e - carcinomas de célula escamosa esofageal.

[0148] Mesmo mais preferivelmente, células de tumor referem-se a cânceres que são selecionados de - câncer de próstata, incluindo metástases, e - câncer de mama, incluindo metástases.

[0149] Ainda em uma modalidade preferida vaosos tumorais e peritumorais referem-se a cânceres que são selecionados de - cânceres de ovário, - cânceres endometriais, e - cânceres pancreáticos.

[0150] Preferivelmente, os vasos tumorais e peritumorais referem- se a cânceres ovarianos.

[0151] Em um sétimo aspecto, a invenção refere-se a um processo para tratamento ou prevenção de doenças relacionadas a vaso peritumoral e tumoral e/ou célula de tumor compreendendo a etapa de: - administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo de bombesina tendo a fórmula (I).

[0152] Uma modalidade preferida do sétimo aspecto refere-se ao uso de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula (I) para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doenças relacionadas com vaso peritumoral e tumoral.

[0153] Em uma modalidade preferida a as doenças relacionadas com célula de tumor referem-se a cânceres que são selecionados do - carcinomas de célula renal, - tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos, - cânceres de célula escamosa de cabeça e pescoço, - neuroblastomas, e

[0154] Carcinomas de célula escamosa esofageal.

[0155] Mesmo mais preferivelmente, as doenças relacionadas com célula de tumor referem-se a cânceres que são selecionados do grupo compreendendo: - câncer de próstata, incluindo metástases, e - câncer de mama, incluindo metástases.

[0156] Ainda em uma modalidade preferida doenças relacionadas a vaso tumoral e peritumoral referem-se a cânceres que são selecionados do grupo compreendendo: - cânceres de ovário, - cânceres endometriais, e - cânceres pancreáticos.

[0157] Preferivelmente, as doenças relacionadas com vaso tumoral e peritumoral referem-se a cânceres de ovário.

[0158] Em um oitavo aspecto, a invenção refere-se a um kit para a preparação de um agente radioterapêutico ou agente de formação de imagem radiofarmacêutico tendo fórmula (I), cujo kit compreende um frasco contendo uma quantidade predeterminada de conjugado de antagonista de peptídeo análogo a bombesina de fórmula (I') e um veículo, diluente, excipiente ou adjuvante aceitável para a radiomarcação de um quelante de metal.

[0159] Em um nono aspecto, a invenção refere-se a antagonista de peptídeo análogo a bombesina de sequência C-1 a C-4, em que

[0160] C-1: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414- ZH, em que

[0161] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala,

[0162] Xaa3 é estatina, análogos e isômeros de estatina, 4-Am, 5- MeHpA, 4-Am, 5-MeHxA ou aminoácidos alfa - substituídos, Xaa4 é Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, ou iso-Bu-Gly, e Z é NH ou O;

[0163] C-2: Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leuv(CHOH- CH2)-(CH2)2-CH3, em que Leu^(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 é

[0164] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

e K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala; C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa5 13-Xaa6 14- ZH, em que

[0165] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo.

Z é NH, ou O; C-4: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa7, em que

[0166] Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

DEFINIÇÕES

[0167] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "alquila", por si próprio ou como parte de um outro grupo, refere-se a um grupo alquila de cadeia reta ou cadeia ramificada com 1 a 20 átomos de carbono, tal como, por exemplo, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, t-butila, pentila, isopentila, neopentila, heptila, hexila, decila. Grupos alquila também podem estar substituídos, tal como com átomos de halogênio, grupos hidroxila, grupos C1-4 alcóxi ou grupos C6-12 arila. Mais preferivelmente alquila é C1-10 alquila, C1-6 alquila ou C1-4 alquila.

[0168] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "alquil(eno) ramificado ou não-ramificado inferior" deve ter o seguinte significado: um radical substituído ou não- substituído,de cadeia reta ou ramificada monovalente, divalente ou trivalente consistindo em carbono e hidrogênio, não contendo insaturação e tendo de um a oito átomos de carbono, por exemplo, mas não limitado a metila, etila, n-propila, n-pentila, 1,1-dimetil etila (t-butila), n-heptila e similares. Esta metade pode ser não-substituída ou substituída, tal como com átomos de halogêenio, átomos hidroxila, grupos C1-4 alcóxi ou grupos C6-12 arila.

[0169] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo grupo "fenileno" é baseado em um anel benzeno di- ou opcionalmente trissubstituído. Por exemplo, poli(p-fenileno) é um polímero desenvolvido a partir de unidades de repetição para-fenileno. Fenileno pode ser substituído ou não-substituído. Ele pode estar substituído com halogênio, OH, alcóxi, preferivelmente C1-4 alcóxi, carbóxi, éster, preferivelmente C1-4 éster, amida, nitro.

[0170] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "alqueno" deve ter o seguinte significado: um composto químico insaturado alifático ou alicíclico contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-para-carbono. Os alquenos acíclicos mais simples, com somente uma ligação dupla e nenhum outro grupo funcional, formam uma série homóloga de hidrocarbonetos com a fórmula genérica CnH2n, por exemplo, etileno (C2H4), propileno (C3H6). Os alquenos podem ser substituídos ou não-substituídos. Se os alquenos são substituídos, eles podem estar substituídos com átomos de halogênio, grupos hidroxila, grupos C1-4 alcóxi, grupos C6-12 arila ou similares.

[0171] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "arila" deve ter o significado de um sistema de anéis insaturado, preferivelmente um sistema de anel aromático, mais preferivelmente tendo de 6 a 12 átomos de carbono no esqueleto de anel. Seus exemplos são fenila e naftalenila. As metades arila podem ser substituídas ou não-substituídas, tal como com átomos de halogênio, grupos hidroxila, grupos C1-4 alcóxi ou grupos C6-12 arila.

[0172] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "benzeno" deve ter o seguinte significado: um composto químico orgânico com a fórmula C6H6. Benzeno é um hidrocarboneto aromático e o segundo [n]-anuleno ([6]-anuleno), um hidrocarboneto cíclico com uma ligação pi contínua. Benzeno pode ser não-substituído ou substituído, tal como com átomos de halogênio, grupos hidroxila, grupos C1-4 alcóxi ou grupos C6-12 arila.

[0173] Como aqui usados na descrição da invenção e nas reivindicações, os termos "alquenila" e "alquinila" são similarmente definidos como para alquila, mas contêm pelo menos uma ligação dupla, ou uma ligação tripla carbono - carbono, respectivamente. Alquenila pode mais preferivelmente ser C2-6 alquenila e alquinila pode mais preferivelmente ser C2-6 alquinila.

[0174] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "halogênio" deve ter o significado de F, Cl, Br ou I.

[0175] Como usados a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, os termos "sais de ácidos inorgânicos ou orgânicos", "ácido inorgânico" e "ácido orgânico" refere-se a ácidos minerais, incluindo, mas não sendo limitado a ácidos tais como: ácido carbônico, nítrico, fosfórico, clorídrico, perclórico ou sulfúrico ou os seus sais ácidos como os sais de potássio, sódio, cálcio, magnésio, por exemplo, hidrogeno sulfato de potássio, ou a apropriados ácidos orgânicos que incluem, mas não são limitados a: ácidos tais como ácidos alifáticos, ciclo alifáticos, aromáticos, aralifáticos, heterocíclicos, carboxílicos e sulfônicos, exemplos dos quais são ácido fórmico, acético, triflúor acético, propiônico, succínico, glicólico, glicônico, lático, málico, fumárico, pirúvico, benzoico, antranílico, mesílico, fumárico, salicílico, fenil acético, mandélico, embônico, metano sulfônico, etano sulfônico, benzeno sulfônico, pantotênico, tolueno sulfônico, triflúor metano sulfônico e sulfanílico, respectivamente. Da mesma maneira, ácidos orgânicos também podem estar presentes como os seus sais, como os sais de potássio, sódio, cálcio, magnésio.

[0176] Como aqui usado na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a sais de ácidos inorgânicos e orgânicos, tais como ácidos minerais, mas não limitado a, ácidos tais como ácido carbônico, nítrico ou sulfúrico, ou ácidos orgânicos, incluindo, mas não limitado a, ácidos tais como ácidos alifáticos, ciclo alifáticos, aromáticos, aralifáticos, hetero cíclicos, carboxílicos e sulfônicos, exemplos dos quais sãoácido fórmico, acético, triflúor acético, propiônico, succínico, glicólico, glicônico, lático, málico, fumárico, pirúvico, benzoico, antranílico, mesílico, salicílico, fenil acético, mandélico, embônico, metano sulfônico, etano sulfônico, benzeno sulfônico, pantotênico, tolueno sulfônico e sulfanílico.

[0177] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "profármaco" significa qualquer composto ligado covalentemente, que libera o composto farmacêutico parente ativo de acordo com a fórmula (I).

[0178] O termo "pró-fármaco" como usado por todo este pedido de patente também compreende derivados farmacologicamente aceitáveis como ésteres, amidas, e fosfatos, de modo que o resultante produto de biotransformação do derivado é o fármaco ativo como definido na Fórmula (I). A referência por Goodman and Gilman (The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8 ed., McGraw-HiM, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs", 13-15) descreve pró-fármacos, a exposição da qual é aqui incorporada por referência. Profármacos de um composto da presente invenção são preparados através de modificação de grupos funcionais presentes no composto, de modo que as modificações sejam clivadas, tanto em manipulação de rotina como in vivo, para o composto parente. Profármacos dos compostos da presente invenção incluem aqueles compostos onde, por exemplo, um grupo hidroóxi, tal como o grupo hidróxi sobre o átomo de carbono assimétrico, ou um grupo amino está ligado a qualquer grupo que, quando a profármaco é administrada a um paciente, cliva para formar uma hidroxila livre ou amino livre, respectivamente.

[0179] Exemplos típicos de profármacos são descritos, por exemplo, em WO93/33795 A, WO 99/33815 A, WO 99/33793 A e WO 99/33792 A, as exposições dos quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

[0180] Profármacos são caracterizados por excelente solubilidade aquosa, aumentada biodisponibilidade e são facilmente metabolizados nos inibidores ativos in vivo.

[0181] Como aqui usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, os termos "sequência de aminoácidos" e "peptídeo" são aqui definidos como uma poliamida obtenível através de (poli)condensação de pelo menos dois aminoácidos.

[0182] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "aminoácido" significa qualquer molécula compreendendo pelo menos um grupo amino e pelo menos um grupo carboxila, mas nenhuma ligação peptídica dentro da molécula. Em outras palavras, um aminoácido é uma molécula que tem uma funcionalidade ácido carboxílico e um nitrogênio amina tendo pelo menos um hidrogênio livre, preferivelmente em posição alfa, mas nenhuma ligação amida na estrutura de molécula. Assim, um dipeptídeo tendo um grupo amino livre no término-N e um grupo carboxila livre no término-C não é considerado como um "aminoácido" simples dentro da definição acima. A ligação amida entre dois resíduos aminoácido adjacentes que é obtida a partir de uma tal condensação é definida como uma "ligação peptídica".

[0183] Uma ligação amida como aqui usado significa qualquer ligação covalente tendo a estrutura -C(=O)-NH-CH- ou -HC-HN-(O=)C-

[0184] em que o grupo carbonila é provido por uma molécula e o grupo NH- é provido pela outra molécula a ser ligada. Uma ligação amida entre dois resíduos aminoácido adjacentes que é obtida a partir de uma tal policondensação é definida como uma "ligação peptídica". Opcionalmente, os átomos de nitrogênio da cadeia principal poliamida (indicada como NH acima) podem ser independentemente alquilados, por exemplo, com C1-6 alquila, preferivelmente com -CH3.

[0185] Como aqui usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, um resíduo aminoácido é derivado do correspondente aminoácido através de formação de uma ligação peptídica com um outro aminoácido.

[0186] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, um aminoácido é um aminoácido ocorrendo naturalmente ou não-natural onde aminoácido não-natural é um resíduo de aminoácido sintético/artificial, resíduo de aminoácido proteinogênico e/ou não-proteinogênico. Os resíduos de aminoácidos não- proteinogênicos ainda podem ser classificados como (a) homo análogos de aminoácidos proteinogênicos, (b) análogos beta-homo de resíduos de aminoácidos proteinogênicos e (c) ainda resíduos de aminoácidos não-proteinogênicos.

[0187] Da mesma maneira, os resíduos de aminoácidos são derivados dos corespondentes aminoácidos, por exemplo, deaminoácidos proteinogênicos, por exemplo, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val; ou

[0188] aminoácidos não-proteinogênicos, tais como homo análogos de aminoácidos proteinogênicos em que a cadeia lateral foi estendida por um grupo metileno, por exemplo, homoalanina (Hal), homoarginina (Har), homocisteína (Hcy), homoglutamina (Hgl), homo-histidina (Hhi), homosioleucina (Hil), homoleucina (Hle), homolisina (Hly), homometionina (Hme), homofenilalanina (Hph), homoprolina (Hpr), homoserina (Hse), homotreonina (Hth), homotriptofano (Htr), homotirosina (Hty) e homovalina (Hva).

[0189] Beta-homoanálogos de aminoácidos proteinogênicos onde um grupo metileno foi inserido entre o carbono alfa e o grupo carboxila rendendo beta aminoácidos, por exemplo, beta-homoalanina (βHal), β- homoarginina (βHar), β-homoasparagina (βHas), β-homocisteina (βHcy), β-homoglutamina (βHgl), β-homohistidina (βHhi), β- homoisoleucina (βHil), β-homoleucina (βHle), β-homolisina (βHly), β- homometionina (βHme), β-homofenilalanina (βHph), β-homoprolina (βHpr), β-homoserina (βHse), β-homotreonina (βHth), β-homotriptofano (βHtr), β-homotirosina (β-Hty) e β-homovalina (βHva).

[0190] Ainda aminoácidos não-proteinogênicos, por exemplo, ácido alfa-aminoadípico (Aad), ácido beta aminoadípico (beta Aad), ácido alfa aminobutírico ((Abu), ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), beta alanina (βAla), ácido 4-aminobutírico (4-Abu), ácido 5-aminovalérico (5-Ava), ácido 6-amino-hexanoico (6-Ahx), ácido 8-amino-octanoico (8-Aoc), ácido 9-aminononanoico (9-Anc), ácido 10-amino decanoico (10-Adc), ácido 12-aminododecanoico (12-Ado), ácido alfa-aminosubérico (Asu), ácido azetidino-2-carboxílico ((Aze), beta-ciclo-hexilalanina (Cha), citrulina (Cit), desidroalanina (Dha), ácido Y-carboxiglutâmico (Gla), alfa- ciclo-hexil glicina (Chg), propargil-glicina (Pra), ácido piroglutâmico (Glp), alfa-t-butil-glicina (Tle), 4-benzoilfenilalanina (Bpa), δ-hidroxilisina (Hyl), 4-hidroxiprolina (Hyp), aloisoleucina (alle), lantionina (Lan), (1- naftil) alanina (1-Nal), (2-naftil) alanina (2-Nal), norleucina (Nle), norvalina (Nva), ornitina (Orn), fenil-glicina (Phg), ácido pipecólico (Pip), sarcosina (Sar), selenocisteína (Séc), estatina (Sta), beta-tienil alanina (Thi), ácido 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolino-3-carboxílico (Tic), alotreonina (aThr), ácido tiazolidino-4-carboxílico (Thz), ácido Y-amino butírico (GABA), isocisteína (isso-Cys), ácido diamino propiônico (Dpr), ácido 2,4-diamino butírico (Dab), ácido 3,4-diamino butírico (YβDab), bifenil alanina (Bip), fenil alanina substituída na posição para com C1-6 alquila, -haleto, -NH2, -CO2H ou Phe(4-R) (onde R = C1-6 alquila, -haleto, —NH2, ou -CO2H); ácido s nucléicos peptídeo (PNA, cf., P.E. Nielsen, Acc. Chem. Res., 32, 624-30); ou seus análogos N-alquilados, tais como seus análogos N-metilados.

[0191] Aminoácidos cíclicos podem ser proteinogênicos ou não- proteinogênicos, tais como pro, Aze, Glp, Hyp, Pip, Tic, e Thz.

[0192] Para ainda exemplos e detalhes pode ser feita referência a, por exemplo, J.H. Jones, J. Peptide Sci., 2003, 9, 1-8 a exposição do qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[0193] Como usados a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, os termos "aminoácido não-proteinogênico" e "resíduo de aminoácido não-proteinogênico" também abrangem derivados de aminoácidos proteinogênicos. Por exemplo, a cadeia lateral de um resíduo de aminoácido proteinogênico pode ser derivada pelo que tornando o resíduo de aminoácido proteinogênico "não-proteinogênico". O mesmo se aplica aos derivados do término-C e/ou o término-N de um resíduo de aminoácido protenogênico terminando a sequência de aminoácidos.

[0194] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, um resíduo de aminoácido proteinogênico é derivado de um aminoácido proteinogênico selecionado do grupo consistindo em Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr e Val tanto em configuração L como D; o segundo centro quiral em Thr e Ile pode ter tanto configuração R como S. Por isso, por exemplo, qualquer modificação pós-traducional de uma sequência de aminoácidos, tal como N-alquilação, que pode ocorrer naturalmente torna o correspondente resíduo de aminoácido modificado "não-proteinogênico", embora na natureza o dito resíduo de aminoácido seja incorporado em uma proteína. Preferivelmente aminoácidos modificados são selecionados de aminoácidos N-alquilados, beta- aminoácidos, Y-aminoácidos, lationinas, desidro aminoácidos, e aminoácidos com metades guanidina alquiladas.

[0195] Como usado a seguir na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "ácido carboxílico" ou "ácido dicarboxílico" significa compostos orgânicos tendo uma metade COOH ou duas metades COOH, respectivamente, tal como, por exemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido ciclo- hexano carboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido lático (ácidos carboxílicos) ou ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido adípico, ácido fumárico, ácido maléico, ácido málico, ácido ftálico (ácidos dicarboxílicos), respectivamente.

[0196] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "diamina" significa compostos orgânicos tendo duas metades NR'R", onde R' e R" podem ser independentemente um do outro alquila, alquenila, alquinila, arila. Diaminas podem, por exemplo, ser etileno diamina, 1,4-ciclo hexano diamina, piperazina.

[0197] Tanto quanto aminoácidos, ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos ou diaminas anteriores são referidos, isto também inclui especificamente os respectivos radicais obtidos quando tais aminoácidos, ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos ou diaminas, respectivamente, são compreendidos nos compostos da invenção, isto é, -HN-...-CO- (aminoácido), -OC...(ácido carboxílico), -OC-...-CO- (ácido dicarboxílico), -HN-...-NH- (diamina), por exemplo.

[0198] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "quelante de metal" é definido como uma molécula que complexa um metal radionuclídeo para formar um complexo de metal que é estável sob condições fisiológicas e que também pode ser conjugado com um grupo alvejante através de um espaçador. O quelante de metal é complexado ou não complexado com um radionuclídeo metal.

[0199] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, as palavras "metal radionuclídeo" são definidas como um radionuclídeo que é um átomo com um núcleo instável, o núcleo sendo caracterizado por excesso de energia que é disponível para proporcionar uma partícula de radiação recentemente criada dentro do núcleo, ou também para um elétron atômico (vide conversão interna). Os metais radionuclídeos aqui usados são especialmente apropriados para uso diagnóstico ou terapêutico, mais preferivelmente para formação de imagem ou radioterapia. O radionuclídeo, neste processo, sofre decaimento radioativo, e emite (a) raios gama e/ou partículas subatômicas.

[0200] Estas partículas constituem radiação ionizante. Radionuclídeos podem ocorrer naturalmente, mas também podem ser produzidos artificialmente.

[0201] Estes metais radionuclídeos incluem, mas não são limitados a gálio (por exemplo, 67Ga, 68Ga), cobre (por exemplo, 67Cu e 64Cu); tecnécio (por exemplo, 99mTc e 94mTc); rênio (por exemplo, 186Re e 188Re); chumbo (por exemplo, 212Pb); bismuto (por exemplo, 212Bi); e paládio (por exemplo, 109Pd). Processos para preparação destes isótopos são conhecidos. Geradores molibdênio/tecnécio para produção de 99mTc são comercialmente disponíveis. Procedimentos para produção de 186Re incluem os procedimentos descritos por Deutsch et al. (Nucl. Med. Biol., Vol. 13:4:465-477, 1986) e Vanderheyden et al. (Inorganic Chemistry, Vol. 24:1666-1673, 1985), e processos para produção de 188Re foram descritos por Blachot et al. (Intl. J. of Applied Radiation and Isotopes, Vol. 20:467-470, 1969) e por Klofutar et al. (J. of Radioanalytical Chem, Vol. 5:3-10, 1970). Produção de 212Pd é descrita em Fawwaz et al., J. Nucl. Med, (1984), 25:796. Produção de 212Pb e 21 Bi é descrita em Gansow et al., Amer. Chem. Soc. Symp, Ser. (1984), 241:215-217, e Kozah et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, (January 1986), 83:474-478. 99mTc é preferido para uso diagnóstico, e os outros radionuclídeos listados acima têm uso terapêutico.

[0202] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "espaçador" é definido como um grupo ligante entre o quelante de metal e os antagonistas de peptídeo bombesina.

[0203] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações; o termo "agonista" significa uma substância (ligante) que se liga a um específico sítio em uma molécula receptora de uma célula e assim ativa transdução de sinal na célula. Isto conduz a um efeito mensurável.

[0204] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "antagonista" significa uma substância (ligante) que se liga a um sítio em célula receptora que é específico para uma substância agonista, assim bloqueando este sítio para o agonista, sem atuação de um efeito. Assim o antagonista inibe o efeito do agonista.

[0205] Como usado daqui por diante na descrição da invenção e nas reivindicações, o termo "análogo de estatina" é definido como um mimético di-peptídico com a seguinte estrutura genérica:

[0206] Estatina R2 = OH, R1 pode ser significantemente variado mas tipicamente são os mesmos como cadeias laterais de aminoácidos

[0207] Análogos de Estatina R2=H, R1 pode ser significantemente variado mas tipicamente são idênticos como cadeias laterais de aminoácidos

ABREVIATURAS:

[0208] NODASA = ácido 1,4,7-triazaciclononano-1-succínico - ácido 4,7-diacético

[0209] NODAGA = ácido 1,4,7-triazaciclononano-N-glutárico - ácido N',N"-diacético

[0210] TRITA = ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclotridecano- 1,4,7,10,N,N',N",N"'-tetra acético

[0211] Cpa = (S)-4-carboxamidofenilalanina

[0212] 4-Am-5-MeHpA = ácido 4-amino-5-metil-heptanoico

[0213] 4-Am-5-MeHxA = ácido 4-amino-5-metil-hexanoico

[0214] DFO = N'-[5-(acetil-hidroxiamino)pentil]-N-[5-[3-(5- aminopentil-hidroxi-carbamoil)propanoilamino]pentil]-N-hidroxi-butano- diamida

triamida monotiol (MAG3) bisamina bistiol (BAT)

[0215] Sem ainda elaboração, é acreditado que aqueles versados na técnica podem, usando a descrição anterior, utilizar a presente invenção para sua maior extensão. As seguintes realizações específicas preferidas são, por isso, para serem construídas como meramente ilustrativas, e não limitativas do restante da exposição de qualquer maneira.

FIGURAS

[0216] figura 1: Curvas de dose - resposta de análogos de bombesina determinadas através do ensaio de liberação de cálcio. O ensaio de liberação de cálcio foi realizado como descrito em Materiais e Processos. Células PC3 foram tratadas com bombesina em concentrações variando entre 0,01 nmol/L e 10 μmols/L (ç) sozinho, ou na presença de 10 μmols/L dos análogos de bombesina Composto 1 (▲), ou Em-Composto 1 (■), ou análogos de bombesina Composto 1a (H). Composto 1, testado sozinho em 1 μmol/L e 10 μmols/L Composto 1 (Δ), Em-Composto 1 (X) e composto 1a (□) não têm efeito sobre liberação de cálcio em células PC3. Composto 1a refere-se a sequência ligante de 1, sem o ligador e quelato (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Sta-Leu-NH2). Composto 1 refere-se a quelato ((D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Sta-Leu-NH2). Em-Composto 1 refere-se a Em-quelado (D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2).

[0217] figura 2: microscopia de imunofluorescência de células HEK- GRPR

[0218] Microscopia de imunofluorescência de Composto 1, Em- Composto 1, Composto 1b e GRPR-ANTAG usando o anticorpo epítopo-HA monoclonal de camundongo e células HEK-GRPR. (a) sem peptídeo, (b) 10 nmols/L de bombesina, (c) Composto 1(b), (d) Composto 1b + 10 nmols/L de bombesina, (d, f, h, j) células tratadas com 10 nmols/L de bombesina na presença de 1 μmol/L dos análogos Composto 1b, GRPR-ANTAG, Composto 1, e Em-Composto 1, (c, e, g, i) células tratadas com Composto 1b, GRPR-ANTAG, e Composto 1.

[0219] figura 3a, 3b, 4a, 4b: PET - formação de imagem em PC-3 (3) e LNCaP (4) - camundongos transportando tumor de Ga-68-DOTA Composto 2. a) 1 h após injeção de 10 MBq de rádio-traçador, b) bloqueado com 100 μg de bombesina.

[0220] figura 6: imagem SPECT/CT de 99mTc-ARN4-06 (15 MBq/200 pmoles) em camundongos transportando tumor PC-3

[0221] figura 8: imagem SPECT/CT de 99mTc-ARN4-05 (15 MBq/200 pmoles) em camundongos transportando tumor PC-3.

[0222] figura 9: análises de HPLC de Ga-68-DOTA Composto 2 sobre uma coluna de fase reversa.

[0223] figura 10a, b, c, d, e: ensaio de estabilidade de Ga-68-DOTA Composto 2 em plasma e urina de camundongo analisadas por HPLC.

[0224] figura 11: estabilidade em soro humano de Lu-177-DOTA Composto 2.

[0225] figura 12: comparação de tumor/tecido Ga-68 RM2 com F18 FDG e F18 colina.

[0226] A inteira exposição(ões) de todos os pedidos de patente, patentes e publicações, aqui citados são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

[0227] Os exemplos que se seguem podem ser repetidos com sucesso similar através de substituição de reagentes específica ou genericamente descritos e/ou condições de operação desta invenção para aquelas usadas nos exemplos precedentes.

[0228] A partir da descrição anterior, aqueles versados na técnica podem facilmente determinar as características essenciais desta invenção e, sem fugir do seu espírito e escopo, podem fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptar a mesma a várias utilizações e condições.

EXEMPLOS

[0229] em que A tem o significado de A mas também A' quando apropriado para todos os exemplos mostrados abaixo.

Exemplo 1 (A-B-C)

[0230] em que A tem o significado de A mas também A' quando apropriado para todos os exemplos mostrados abaixo.

a) Síntese de conjugados antagonistas de peptídeo bombesina com a sequência genérica (A = DOTA, B = espaçador Bi - B2, C = peptídeo com amida Z terminal-N [Z = NH])

[0231] DOTA-Espaçador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Sta13-Leu14-NH2

[0232] Peptídeos foram sintetizados manualmente sobre fase sólida usando estratégia Fmoc. Para obter amidas terminal-N, Rink amida MBHA resina LL (100-200 mesh) (resina 4-(2',4'-dimetoxifenil-Fmoc- aminometil)fenoxiacetamido-norleucil-4-metilbenzidrilamina) foi usada. Em geral, resina MBHA amida Rink com uma carga teórica de 0,34 mmol/g foi alimentada para o reator. N,N-dimetil formamida (DMF) foi adicionada ao reator e foi agitada por 30 minutos para permitir intumescimento da resina. Após remoção de solvente, uma solução de piperidina 20% em DMF foi adicionada e a resina foi agitada por 15 minutos para remoção de grupo de proteção 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Esta etapa foi repetida duas vezes. Após este procedimento, a resina foi lavada três vezes por 5 minutos com DMF. A solução de piperidina e a solução de DMF das últimas três lavagens foram coletadas e completadas com etanol para 100 mL. A partir desta solução uma alíquota foi tomada para determinar a quantidade de grupos de proteção-Fmoc removidos espectrofotometricamente.

[0233] Antes de acoplamento de derivado aminoácido-Fmoc aresina foi lavada duas vezes por 2 minutos com DMF. 2 equivalentes de Fmoc-aminoácidos, pré-ativados com 2 equivalentes de N,N-di-isopropil carbodi-imida (DIC)/N-hidroxi benzotriazol (HOBt) foram adicionados à resina e o pH foi ajustado para um valor de 8-9 pela adição de cerca de 4 equivalentes de N-etil diisopropil amina (DIPEA). A reação foi incubada por 2 horas sob agitação suave. Após a reação, a solução foi removida e a fase sólida foi lavada duas vezes por 5 minutos com DMF. A reação foi monitorada através de teste Kaiser. Uma certa quantidade de contas da resina foram lavadas 3 vezes com etanol, 50 μL da solução 1 (20 g fenol em 10 mL de etanol foram misturados com 1 mL de uma soluçãode KCN a 0,01M em 49 mL de piridina) e 50 μL de solução 2 (500 g de nin-hidrina em 10 mL de etanol) foram adicionados e as pérolas foram aquecidas por 10 minutos a 95oC. Pérolas azuis indicaram funções amino livres desacopladas.

[0234] Todos os aminoácidos foram usados como derivados protegidos com Fmoc com terminal-N e eles foram acoplados em uma maneira similar. Triptofano foi usado com grupo de proteção t-butiloxi carbonila (Boc) sobre a cadeia lateral enquanto histidina e glutamina foram protegidas com Trt. Se teste Kaiser realizado após acoplamento de cada aminoácido, indicou acoplamento incompleto de funções amino, o acoplamento foi repetido.

[0235] Após construção da inteira sequência de peptídeo desejada,a resina foi lavada 5 vezes com DCM seguido por lavagem 5 vezes com éter dietílico, cada uma por 2 minutos e seca sob vácuo.

b) Acoplamento com Espaçador e pró-quelante DOTA(tBu)3

[0236] O pró-quelante DOTA (tBu)3 foi adquirido de Macrocyclics Inc., Dallas, USA. Antes de acoplamento do ESPAÇADOR, a proteção Fmoc terminal-N foi removida dos peptídeos ligados à resina. A resina foi intumescida por 15 minutos em DMF, tratada duas vezes com uma solução de piperidina 20% em DMF (15 minutos) e lavada três vezes com DMF. A solução dos tratamentos de piperidina e as seguintes lavagens com DMF foi coletada para determinar a quantidade de grupos Fmoc clivada.

[0237] 2 equivalentes do Espaçador, pré-ativado com hexa flúorfosfato de 2-(1H-9-aza benzo triazol-1-il)-1,1,3,3-tetra metil aminium (HATU) por 20 minutos em DMF, foram adicionados à resina. O pH foi ajustado para 8-9 através de adição de DIPEA. A mistura de reação foi agirtada por 2 horas e o acoplamento foi monitorado por teste Kaiser. O pró-quelante DOTA(tBu)3 foi acoplado na mesma maneira após remoção de Fmoc como descrito anteriormente. O acoplamento DOTA(tBu)3 foi agitado por toda noite. Após remoção de solução, a resina foi lavada 3 vezes com DMF, 5 vezes com DCM seguido por 5 vezes lavagem com éter dietílico, cada uma por 2 minutos e secada sob vácuo.

c) Desproteção, clivagem e purificação

[0238] A resina - peptídeo foi tomada em uma seringa equipada com um sinterizado. Uma solução de ácido triflúor acético (TFA)/tioanisol/tri-isopropil silano (TIS)/H2O (94/2/2/1) foi adicionada e a seringa foi agitada por 2 horas. A solução foi adicionada a uma mistura de 50% éter di-isopropílico e 50% éter dietílico sobre gelo para permitir a precipitação do peptídeo. O peptídeo foi coletado por centrifugação em 3000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi decantado. O precipitado foi lavado várias vezes com éter dietílico e secado em vácuo. O produto bruto foi dissolvido em água e purificado por RP-HPLC semi - preparativa sobre um Metrohm HPLC system LC-CaDI 22-14 (Herisau, Switzerland) com uma coluna Macherey-Nagel VP 250/21 Nucleosil 100-5 C18 (eluentes: eluente 1 = 0,1% TFA em água e eluente 2 = acetonitrila; gradiente: 0-20 minutos, 90%-50% eluente 1; fluxo: 15 mL/minuto).

[0239] Os conjugados foram analisados por RP-HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESI-MS).A-B-C-1

[0240] DOTA-Espaçador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12- Xaa313- Xaa414-ZH (Z = NH)

[0241] Composto 1: A = DOTA, B1 = Gly, B2 = 4-aminobenzoíla; Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu,

[0242] DOTA-Gly-amino benzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His- Sta-Leu-NH2 ; C80H114N20O20, calculado (m/z): 1675.8, encontrado [M+K]+: 1715.1.

[0243] Composto 2: A = DOTA, B1 = 4-amino-1-carboximetil- piperidinila; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0244] DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C79H118N20O19; calculado (m/z): 1639.9, encontrado [M+K]+: 1678.1

[0245] Composto 3: A = DOTA, B1 = 4-amino-1-piperidino-4- carbóxi; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0246] DOTA-ácido 4-amino-1-piperidino-4-carboxílico-D-Phe-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

[0247] C77H116N20O19, calculado (m/z): 1624.9, encontrado [M+K]+: 1663.7

[0248] Composto 4: A = DOTA, B1 = 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoíla; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0249] DOTA-ácido 15-amino-4,7,10,13-tetra oxa penta decanoico- D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C82H127N19O23, calculado (m/z): 1747.8 encontrado [M+K]+: 1785.1

[0250] Composto 5: A = DOTA, B1 = 15-amino-4,7,10,13-tetra oxa penta decanoíla; B2 = 4-amino-1-piperidino-4-carbóxi, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0251] DOTA-(ácido 15-amino-4,7,10,13-tetra oxa penta decanoico)-(4-amino-1-carboximetil piperidina)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Sta-Leu-NH2; C89H139N21O24, calculado (m/z): 1886.0, encontrado [M+K]+: 1924.9

[0252] Composto 6: A = DOTA, B1 = ácido diaminobutírico; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0253] DOTA-ácido diaminobutírico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Sta-Leu-NH2; C75H114N20O19, calculado (m/z): 1598.9, encontrado [M+K]+: 1638.4

[0254] Composto 7: A = DOTA, B1 =4-(2-aminoetil)-1-carboximetil piperazinila; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0255] DOTA-4-(2-amino etil)-1-carboxi metil piperazina-D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C79H121N21O19, calculado (m/z): 1667.9, encontrado [M+Na]+: 1691.2

[0256] Composto 8: A = DOTA, B1 = (ácido 5-amino-3- oxapentil)succinâmico; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0257] DOTA-(ácido 5-amino-3-oxapentil)succinâmico-D-Phe-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

[0258] C79H120N20O21, calculado (m/z): 1685.9, encontrado [M+K]+: 1723.7

Exemplo 2 (A-B-C) a) Síntese de conjugados antagonistas de peptídeo bombesina com a sequência genérica

[0259] (A = N4-azido, B = Espaçador Bi - B2, C = Peptídeo com amida Z terminal-N [Z = NH2])

[0260] N4-triazoles-dPEG1-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12- Sta13-Leu14-NH2

a) Síntese dos peptídeos: Fmoc-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10- Xaa211-His12-Sta13-Leu14-NH2

[0261] Peptídeos foram sintetizados manualmente sobre fase sólida usando estratégia Fmoc. Para obter amidas terminais-N, foi usada resina MBHA amida Rink LL (100-200 mesh). A síntese foi realizada como descrito no Exemplo 1.

b) Acoplamento com o grupo alquila de propargil-dPEG1- NHS-éster

[0262] Antes de acoplamento com o grupo alquila, a proteção Fmoc terminal_N foi removida dos peptídeos ligados a resina. A resina foi intumescida por 15 minutos em DMF, tratada duas vezes com uma solução de piperidina 20% em DMF (15 minutos) e lavada três vezes com DMF. A solução do tratamento com piperidina e as seguintes lavagens com DMF foram coletadas para determinação de Fmoc.

[0263] 2 equivalentes do propargil-dPEG1-NHS-éster foram adicionados à resina. O pH foi ajustado para 8-9 através de adição de DIPEA. A mistura de reação foi agitada por 24 horas e o acoplamento foi monitorado por teste Kaiser.

c) Desproteção, clivagem e purificação

[0264] A resina - peptídeo foi tomada em uma seringa equipada com uma frita. Uma solução de TFA/TIS/H2O (94/2,5/2,5) foi adicionada e a seringa foi agitada por 2 horas. A solução foi adicionada a uma mistura de 50% éter di-isopropílico e 50% éter dietílico sobre gelo para permitir a precipitação do peptídeo

[0265] O peptídeo foi coletado por centrifugação em 3000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi decantado. O precipitado foi lavado várias vezes com éter dietílico secado sob vácuo. O produto bruto foi dissolvido em água e purificado por RP-HPLC semipreparativa como descrito anteriormente.

[0266] Os conjugados foram analisados por RP-HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESI-MS). d) Síntese de quelante N4-azido. A síntese envolve 3 etapas. i) Síntese de N,N',N'',N'''-tetraquis-(t-butilóxicarbonil)-6- (azido)-1,4,8,11-tetra-azaundecano (N4(Boc)4-N3) [3]: a) N,N',N'',N'''-tetraquis-(t-butilóxicarbonil)-6-(hidróxi)- 1,4,8,11-tetra- azaundecano (N4(Bob)4-OH) [1]: Uma solução de 6- (hidróxi-1,4-8,11-tetra-azaundecano (1 g, 3,1 mmols) em DMF (10 mL) foi resfriada para 0oC. A esta foi adicionada uma solução de dicarbonato de di-t-butila (3,32 mL, 15,5 mmols) em DMF (5 mL) seguida por DIPEA (2,7 mL, 15,5 mmols). A mistura de reação foi então agitada em temperatura ambiente por 18 horas. Após este tempo de reação, a mistura de reação foi particionada entre água e acetato de etila. A camada aquosa foi extraída três vezes com acetato de etila e a fase de acetato de tila combinada foi lavada com solução de cloreto de sódio e secada sobre sulfato de sódio anidro. Filtração e evaporação do solvente sob pressão reduzida renderam o composto do título em 84% de rendimento. ii) N,N',N'',N'''-tetraquis-(t-butilóxicarbonil)-6-(O-metil sulfonil))-1,4,8,11-tetra-azaundecano (N4(Bob)4-O-SO2CH3) [2]:

[0267] A uma solução de 1 (300 mg, 0,54 mmol) em piridina (3 mL) foi adicionado cloreto de metilsulfonila (84 μL, 10,08 mmols). A mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente até ser completada como monitorado por TLC. O solvente foi evaporado sob pressão reduzida, o resíduo foi tomado em acetato de etila. O acetato de etila foi lavado três vezes com NaHCO3 a 10% e água e secado sobre sulfato de sódio anidro. Filtração e evaporação do solvente sob pressão renderam o produto bruto, que foi ainda purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel para render o composto do título em 84%. iii) N,N',N'',N'''-tetraquis-(t-butilóxicarbonil)-6-(azido)- 1,4,8,11-tetra-azaundecano (N4(Boc)4-N3) [3]

[0268] Uma suspensão de 2 (250 mg, 0,38 mmol) e azida sódica (100 mg, 1,52 mmol) em DMF (3 mL) foi agitada a 75oC por 5 horas. A seguir a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 18 horas. A mistura de reação foi então particionada entre água e acetato de etila. A camada aquosa foi extraída três vezes com acetato de etila e o acetato de etila combinado foi lavado com solução de cloreto de sódio e secado sobre sulfato de sódio anidro. Filtração e evaporação do solvente sob pressão reduzida renderam produto bruto, que foi então purificado por cromatografia de coluna (rendimento de 88%).

d) Acoplamento em solução

[0269] O peptídeo (6,2 mg, 5 μm) com grupo alquila terminal e 3 (3 mg, 5 μm) foram dissolvidos em uma mistura 1:1 de água e álcool t- butílico (1 mL). Cobre pulverizado (10 mg) foi adicionado seguido por penta-hidrato de sulfato de cobre (II) aquoso a 0,1 M (60 μL, 6 μm, 1,2 equiv.) e a mistura de reação foi agitada em temperatura ambiente por 24 horas. O cobre pulverizado foi filtrado, o solvente removido sob pressão reduzida. O peptídeo bruto foi purificado por RP-HPLC semipreparativa.

[0270] O conjugado peptídeo - quelante foi tratado com TFA:TIS:H2O (95:2:3) por 2 horas. O solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto bruto foi triturado com éter dietílico e purificado por RP-HPLC semipreparativa como descrito acima.

[0271] Os conjugados foram analisados por RP-HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESI-MS).

[0272] Composto 14: A= N4-azido, B1= propargil-dPEG1-NHS-éster; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu

[0273] N4-triazóis-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C68H105N21O13, calculado (m/z): 1424,7, encontrado [M+M]+:1425,5

Exemplo 3 (A-B-C2)

[0274] DOTA-Espaçador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leu^(CHOH)-(CH2)2-CH3

[0275] Todos os pseudopeptídeos foram sintetizados em fase de solução através de condensação do heptapeptídeo Fmoc-D-Phe-Gln- Trp-Ala-Val-Xaa2-His-OH com o aminoácido modificado H- Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3.

a) Síntese do heptapeptídeo Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Xaa2-His-OH

[0276] Peptídeos foram sintetizados manualmente sobre resina de cloreto de 2-cloro tritila usando estratégia Fmoc. Em geral, resina de cloreto de 2-cloro tritila com uma carga teórica de 1,4 mmol/g de resina foi colocada no reator. A resina foi intumescida em DCm por 30 minutos e o primeiro aminoácido foi acoplado por adição de 1 equivalente de aminoácido, misturado com 4 vezes excesso molar de DIPEA em DCM. A mistura de reação de acoplamento foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas e então a resina foi lavada duas vezes com uma mistura de DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1), duas vezes com DCM e finalmente intumescida em DMF. O Fmoc foi desprotegido usando piperidina 20% em DMF e a quantidade de grupo de proteção Fmoc removida foi determinada espectrofotometricamente em 300 nm. O aminoácido seguinte foi acoplado através de adição de 2 vezes excesso molar de aminoácido, misturado com quantidades equimolares de DIC/HOBt, e 4 vezes excesso molar de DIPEA em DMF. A resina foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas e o acoplamento foi monitorado através de teste de ninhidrina Kaiser. Cada aminoácido foi acoplado usando a mesma estratégia.

b) Acoplamento com Espaçador e pró-quelante DOTA (tBu)3 Os acoplamentos foram realizados como descrito acima. c) Clivagem e purificação

[0277] Os peptídeos inteiramente protegidos foram clivados do suporte sólido através de suspensão de resina em uma mistura de TFA/TIS/DCM (1/5/94) Várias vezes foram retirados um volume de 5 mL da solução de clivagem com a seringa, incubados 10 minutos e as frações clivadas foram coletadas em um frasco de 50 mL. Após todas as frações serem coletadas 3x10 mL de tolueno foram adicionados no frasco, os solventes foram evaporados e o produto foi secado a seguir por 1 hora no vácuo de bomba de óleo.

d) Síntese de Boc-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3. A síntese envolve três etapas. i) Síntese de Boc-Leu-N(OCH3)CH3

[0278] Boc-Leu-OH (1 g, 4,3 mmols) foi dissolvido em DCM (30 mL)e tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (TBTU) (1,380 g, 4,3 mmols), HOBt (0,581 g, 4,3 mmols) e DIPEA (743 μL, 4,43 mmols) foram adicionados a 0oC. Após 5 minutos de agitação, cloridrato de O,N-dimetilhidroxilamina (0,461 g, 4,73 mmols) e DIPEA (817 μL, 4,73 mmols) foram adicionados. Todo material sólido dissolveu dentro de 10 minutos e a mistura foi agitada por toda noite em temperatura ambiente. O solvente foi evaporado, a mistura de reação novamente dissolvida em AcOEt e lavada com H2O, ácido cítrico a 5%, H2O, solução aquosa a 5% de NaHCO3, solução saturada de NaCl várias vezes. A solução foi secada sobre sulfato de magnésio e o solvente removido em vácuo. O composto desejado foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel. ESI-MS: calcd. 269; encontrado: 292 [M+Na]+.

ii) Síntese de Boc-Leu-(CH2)3-CH3

[0279] Magnésio (0,330 g, 13,6 mmols) foi ativado através de suspensão em tolueno por 30 minutos sob N2. O tolueno foi removido e o Mg foi secado sob N2. À suspensão de Mg em THF (20 mL) foi adicionado bromo butano (1,46 mL, 13,6 mmols) em gotas e a mistura foi aquecida em refluxo. Quando todo o magnésio foi dissolvido, Boc- Leu-N(OCH3)CH3 em THF foi adicionado em gotas e a reação foi agitada por 2 horas a 0oC. HCl a 1 M (150 mL) foi adicionado seguido por acetato de etila (100 mL). A camada orgânica foi lavada com hidrogeno sulfato de potássio a 1 M, água, secada (sulfato de sódio) e concentrada em vácuo. O produto esperado foi purificado por cromatografia de coluna de sílica-gel. O produto foi caracterizado por 1H-RMN e 13C-RMN. ESI-MS: calcd. 271; encontrado: 293,3 [M+Na]+.

iii) Síntese de Boc-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3

[0280] A uma solução de Boc-Leu-(CH2)3-CH3 (0,190 g, 0,7 mmol) em metanol (5 mL), NaBH4 (0,104 g, 2,8 mmols) foi adicionado. A mistura de rea\ção foi ainda agitada por 1 h, então neutralizada com ácido acético e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto esperado foi precipitado com solução saturada de bicarbonato. O peptídeo foi coletado por filtração, lavado com água, hexano e secado. O produto foi caracterizado por 1H-RMN e 13C-RMN. ESI-MS: calcd. 272; encontrado: 273 [M+H]+; 547,7 [2M+H]+.

iv) Acoplamento em solução

[0281] Boc-LeuΦ(CHOH)-(CH2)3-CH3 foi desprotegido usando uma solução de 80% TFA em DCM. Após 1 hora a solução foi concentrada, lavada várias vezes com DCM e secada. O quelante-espaçador- peptídeo foi dissolvido em DMF, HATU (1,2 equivalentes) foi adicionado e a mistura foi agitada por 1 h. H-Leu^(CHOH)-(CH2)3-CH3 foi dissolvido em DMF e adicionado ao peptídeo. O pH foi ajustado para 8 usando DIPEA e a reação foi agitada por 4 horas em temperatura ambiente.

[0282] O solvente foi concentrado e o peptídeo, inteiramente protegido, foi obtido por precipitação com H2O sobre gelo. O peptídeo bruto foi precipitado, resfriado, centrifugado, e separado do solvente por decantação. De modo a obter o peptídeo inteiramente desprotegido ele foi solubilizado em uma mistura de DCM/TFA/TIS/H2O 10/85/2,5/2,5. Após 4 horas a solução foi concentrada e o peptídeo foi precipitado usando uma mistura de éter dietílico a 50% e éter di-isopropílico a 50% sobre gelo. O peptídeo foi então coletado por centrifugação em 3000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi decantado. O precipitado foi lavado várias vezes com éter dietílico e o produto bruto foi mantido então em um vácuo por toda noite para remoção de solventes restantes. O produto bruto foi dissolvido em água e purificado por preparativa como descrito anteriormente.

[0283] Os conjugados foram analisados por RP-HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESI-MS).

[0284] Composto 9: A = DOTA, B1 = 4-amino-1-carboximetil- piperidina; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly;

[0285] DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, C74H112N18O17,calculado (m/z): 1524,8, encontrado [M+K]+: 1564,3

[0286] Composto 10: A = DOTA, B1 = 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoíla; B2 = 4-amino-1-carboximetil-piperidina, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly;

[0287] DOTA-PEG4-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D-Phe-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; C86H135N19O22,calculado (m/z): 1786,9, encontrado [M+K]+: 1811,1

[0288] Composto 11: A = DOTA, B1 = 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoíla; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly;

[0289] DOTA-PEG4-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH- CH2)-(CH2)2-CH3; C78H121N17O21, calculado (m/z): 1632,8, encontrado [M+K]+: 1672,2

Exemplo 4 (A-B-C-3)

[0290] DOTA-Espaçador- Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12- Xaa313-Xaa414-NH2

[0291] Síntese de conjugados de bombesina com sequência genérica: DOTA-Espaçador-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leu^(CH2NH)-Phe-NH2

a) Síntese do peptídeo : Fmoc- Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10- Xaa211-His12- Leu^(CH2NH)-Phe-NH2

[0292] Peptídeos foram sintetizados manualmente sobre resina MBHA LL (100-200 mesh) HCl usando estratégia Boc. Em geral, resina MBHA com uma carga teórica de 0,59 mmol/g foi enviada para o reator e ela foi intumescida em DCM por 30 minutos. A resina foi tratada 3 vezes (10 minutos) com uma solução de 10% DIPEA em DCM. O primeiro acoplamento do Boc-Leu^(CH2NH)-Phe-OH foi obtido usando 2 equivalentes de Boc-aminoácido ativados com 2 equivalentes de HOBt e 2 equivalentes de DIC. A mistura de reação de acoplamento foi agitada em temperatura ambiente por 2 horas e a reação foi monitorada com o teste de ninhidrina Kaiser. O Boc foi desprotegido usando 30% de TFA em DCM e esta etapa foi repetida duas vezes. A resina foi então tratada com uma solução de DIPEA a 10% em DCM e os acoplamentos foram realizados como descrito acima.

[0293] (H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Phe-NH2: C56H76N14O9, calculado (m/z): 1089.3, encontrado [M+H]+: 1089,8

b) Acoplamento com Espaçador e pró-q uelante DOTA (tBu)3 Os acoplamentos foram realizados como descrito acima. c) Desproteção, clivagem e purificação

[0294] O peptídeo foi tratado com TFA (1 mL) e TIS (30 μL) e a mistura foi agitada em temperatura ambiente por 5 minutos. A mistura foi então resfriada em um banho de gelo e ácido triflúor metano sulfônico (TFMSA) (100 μL) adicionado em gotas com agitação. O frasco foi selado com uma rolha e a mistura agitada em temperatura ambiente por 2 horas. O volume foi reduzido sob vácuo e o peptídeo foi precipitado adicionando-se éter dietílico frio. O precipitado foi lavado várias vezes com éter dietílico e o produto bruto foi secado sob vácuo. O produto bruto foi dissolvido em água e purificado por HPLC preparativa como descrito acima.

[0295] Os conjugados foram analisados por RP-HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESI-MS).

[0296] Composto 12: A = DOTA, B1 = 4-amino-1-carboximetil- piperidina; B2 = nenhum, Xaa1 = Dphe; Xaa2 = Gly; Xaa3 =Leu^(CH2NH); Xaa4 = Phe

[0297] DOTA-4-amino-1-carboximetal-piperidina-D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Phe-NH2

[0298] C79H114N20O17, calculado (m/z): 1615.9, encontrado [M+K]+: 1654,9

[0299] Síntese de conjugados bombesina com sequência genérica: DOTA-Espaçado-Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Leu^(CH2NH)-Cys-NH2

a) Síntese do peptídeo: Fmoc- Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-LeuΦ(CH2NH)-Cys-NH2

[0300] Peptídeos foram sintetizados manualmente através de fase sólida sobre resina MBHA (0,59 mmol/g) usando estratégia Boc. Boc- Cys(4-MeOBzl)-OH (2,5 eq.) foi acoplado à resina usando DIC (2,5 eq.) e HOBt (2,5 eq.) como reagente ativante. O pH foi ajustado para 8 com DIPEA (5 eq.). Introdução de ligação reduzida 13^14(CH2-NH) foi realizada usando Boc-Leu-aldeído (2,5 eq.) dissolvido em dimetilformamida acidulada. NaBH3CN (2,5 eq.) em DMF foi adicionado lentamente, em 20 minutos, e a reação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. Após a formação de uma ligação peptídica reduzida, todas as reações de acoplamento foram realizadas usando aminoácidos protegidos com N-Boc.

b) Acoplamento com Espaçador e pró-quelante DOTA (tBu)3

[0301] Os acoplamentos foram realizados como descrito acima.

c) Desproteção, clivagem e purificação

[0302] A desproteção, clivagem e purificação foram realizadas como descrito anteriormente. Os conjugados foram analisados por RP- HPLC analítica e caracterizados por espectroscopia de massa (ESIMS).

[0303] Composto 13: A = DOTA, B1 = 4-amino-1-carboximetil-piperidina; B2 = nenhum, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 =Leu^(CH2NH)-; Xaa4 = Cys

[0304] DOTA-4-amino-1-carboximetil- piperidina-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Cys-NH2; C73H110N20O17S, calculado (m/z): 1571.8, encontrado [M+Na]+: 1593.6

Exemplo 4

[0305] Radiomarcação dos conjugados sintetizados (Compostos 113)

Procedimento Genérico

[0306] A uma alíquota de 10 μg do conjugado de antagonista de peptídeo bombesina - quelante em água foi adicionado 1-2 mCi de uma solução aquosa de (111InCl3, 177LuCl3 ou 67/68GaCl3) e 250-500 μL de tampão acetato de sódio 0,4 M (pH = 5). Esta solução foi aquecida por 30 minutos a 95oC e resfriada para temperatura ambiente por 10 minutos. Uma alíquota de 5 μL da mistura de reação foi adicionada a 25 μL de solução Ca-DTPA (0,1 M, pH 5,2) e analisada por HPLC para determinação de quantidade de radionuclídeo não-marcado.

Exemplo 5

[0307] Marcação dos conjugados sintetizados com 115In.

[0308] A complexação dos análogos de bombesina com natIn foi realizada seguindo o mesmo protocolo. O natIn foi usado na forma de solução de natInCl3 e em uma razão molar de 1:1.

Exemplo 6 (ensaios in vitro)

[0309] Materiais e processos para a caracterização in vitro de antagonistas de receptor de GRP

Reagentes e peptídeos

[0310] Todos os reagentes foram do melhor grau disponível e foram adquiridos de fornecedores comuns. O anticorpo epitopo hemaglutinina (HA) monoclonal de camundongo foi adquirido de Covance (Berkeley, CA). Os anticorpos secundários Alexa Flúor 488 cabra anticamundongo IgG (H+L) foi de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Bombesina e o antagonista [D-Phe6, Leu-NHEt13, dês-Met14]-bombesina(6-14) (GRPR- ANTAG) foram adquiridos de Bachem (Bubendorf, Switzerland). RM26, RM1b, In-RM1b, e 175Lu-AMBA foram providos por H.R. Macke (Basel, Switzerland). O kit de ensaio Fluo-4NW Calcium foi de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR).

Linhas de Células

[0311] Células 293 de rim embriônico humano (HEK293) expressando estavelmente o receptor de GRP humano marcado com epitopo HA (HEK-GRPR), foram geradas como descrito anteriromente (Cescato et al., 2008) e cultivadas a 37oC e 5% de CO2 em meio Eagle modificado de Dulbecco com GlutaMAX-I (DMEM) contendo 10% (v/v) soro bovino fetal (FBS), 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL estreptomicina e 750 μg/mL de G418. Células de câncer de próstata humanas (células PC3) foram obtidas de DSMZ (Deutsche Sammlung von Miroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ No: ACC465) e cultivadas a 37oC e 5% de CO2 em F12K de Ham contendo L-glutamina a 2 mM e suplementado com 10% (v/v) de FBS, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Todos os reagentes de cultura foram de Gibco BRL (Grand Island, NY).

Medições de afinidade de ligação

[0312] A afinidade de ligação de receptor de GRP dos vários compostos foi determinada através de autorradiografia de receptor in vitro sobre seções criostáti9cas de carcinomas de próstata bem caracterizados, ou sobre seções de pelotas de células PC3 ou HEK- GRPR como descrito anteriormente (Markwalder et al., Can. Res., 1999; 59, 1152-1159; Reubi et al., Eur. J. Nucl. Med., 2000;27: 273-282; Reubi et al., Clin. Cancer Res. 2002;8 1139-1146). Os radioligantes usados foram 125I-[Tyr4]-bombesina, conhecido marcar preferencialmente receptores GRP (Vigna et al., Gastroenterology. 1987;93: 1287-1295) and 125I-[D-Tyr6, a-Ala11, Phe13, Nle14]-bombesin(6-14) as universal bombesin receptor ligand (Gastroenterology. 1987;93: 1287-1295).

[0313] Vide resultados na tabela 1.

Microscopia de imunofluorescência

[0314] Microscopia de imunofluorescência baseada em ensaios de internalização com células HEK-GRPR foi realizada como descrito anteriormente (Cescato et al., 2006; Cescato et al., 2008). Em resumo, células HEK-GRPR foram crescidas sobre placas de quatro poços de 35 mm (Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany) revestidas com poli-D-lisina (20 μg/mL) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Para o experimento, células foram tratadas com bombesina a 10 nM, ou com 1 μM dos vários análogos de bombesina, ou, para avaliar potencial antagonismo, com bombesina a 10 nM na presença de um excesso de 100 vezes destes vários análogos por 30 minutos a 37oC e 5% de CO2 em meio de crescimento, e então processadas parra microscopia de imunofluorescência usando o anticorpo epitopo-HA monoclonal de camundongo em uma diluição de 1:1000 como primeiro anticorpo e Alexa Flúor 488 cabra anticamundongo IgG (H+L) em uma diluição de 1:600 como anticorpo secundário. As células foram feitas imagens usando um microscópio de imunofluorescência Leica DM RB e uma câmera Olympus DP10.

[0315] Internalização de receptor GRP induzida por bombesina é eficientemente antagonizada pelos análogos de bombesina, Composto 1, In-Composto 1, Composto 1b e GRPR-ANTAG. Células HEK-GRPR foram tratadas por 30 minutos com veículo (sem peptídeo, a), ou com 10 nmols/L de bombesina (b), uma concentração induzindo um efeito de internalização sub-máxima. Painéis (d, f, h, j) mostram células tratadas com 10 nmols/l de bombesina na presença de 1 μmol/L dos análogos, Composto 1b, GRPR-ANTAG, Composto 1, e In-Composto 1. O efeito de Composto 1b, GRPR-ANTAG, Composto 1, e In-Composto 1 sozinhos em uma concentração de 1 μmol/L é mostrado em painéis (c, e, g, i, k). Seguindo incubação com os peptídeos, as células foram processadas para imunocitoquímica como descrito acima. Um manchamento perinuclear pontilhado claro é detectável para células tratadas com bombesina. Este manchamento pontilhado é eficientemente abolido por um excesso dos análogos Composto 1, In- Composto 1, Composto 1b, e GRPR-ANTAG. Composto-1, In- Composto 1, Composto 1b e GRPR-ANTAG dados sozinhos não tiveram efeito sobre internalização de receptor GRP. Vider resultados na tabela 1 e figura 2.

Ensaio de liberação de cálcio

[0316] Liberação de cálcio intracelular foi medida em células PC3 usando o kit de ensaio Fluo-4NW Calcium como descrito anteriormente (Magrys et al., J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel et al.,; Cescato et al., J. Nucl. Med. 2008; 49: 318-326). Em resumo, células PC3 foram semeadas (10 000 células por poço) em placas de 96 poços e cultivadas por 2 dias a 37oC e 5% de CO2 em meio de cultura. No dia do experimento, as células foram lavadas com tampão de ensaio (1xHBSS, HEPES a 20 mM) contendo probenecid a 2,5 mM, e então carregadas com 100 uL/poço de corante Fluo-4NW em tampão de ensaio contendo probenecid a 2,5 mM por 30 minutos a 37oC e 5% de CO2 e então por ainda 30 minutos em temperatura ambiente. Para medir a mobilização intracelular de cálcio após estimulação com os análogos de bombesina a serem testados, as células carregadas com corante foram transferidas para um SpectraMax M2e (Molecular devices, Sunnyvale, CA). Mobilização de cálcio intracelular foi anotada em um cinético por 60 s em temperatura ambiente monitorando emissão de fluorescência em 520 nm (com Aθx = 485 nm) na presença dos análogos nas concentrações indicadas. Fluorescência máxima (F-max) foi medida após a adição de ionomicina a 25 uM. Medições de linha base (F-linha base) foram tomadas para células não-tratadas, carregadas com corante. Dados são mostrados como porcentagem de resposta máxima de cálcio (F-max - F-linha base = 100% de resposta máxima de cálcio) como previamente reportado (Magrys et al., J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel et al., Cescato et al., J. Nucl. Med. 2008; 49:318-326). Todos os experimentos foram repetidos pelos menos três vezes.

[0317] A figura 1 mostra que In- Composto 1 e composto 1a comportam-se como antagonistas desviando a curva de dose - resposta para a direita na presença de bombesina (BB). Vide resultados na tabela 1 e figura 1.

[0318] Composto 1: DOTA-Gly-aminobenzoil-D-Phe-Gln-Trp-Ala- Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0319] Composto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Glen-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0320] Composto 3: DOTA-ácido-4-amino-1-piperidina-4- carboxílico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0321] Composto 4: DOTA-ácido 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0322] Composto 5: DOTA-(ácido 15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoioco)-(4-amino-1-carboximetil- piperidina)-D-Phe- Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0323] Composto 6: DOTA-ácido diaminobutírico-D-Phe-Gln-Trp- Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0324] Composto 7: DOTA-4-(2-aminoetil)-1-carboximetil- piperazina-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0325] Composto 8: DOTA-ácido 5-amino-3-oxa-pentil) succinâmico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2;

[0326] Composto 9: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3;

[0327] Composto 10: DOTA-(15-amino-4,7,10,13- tetraoxapentadecanoico)-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D-Phe-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3;

[0328] Composto 11: DOAT-ácido -15-amino-4,7,10,13-tetraoxapentadecanoico-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CHOH- CH2)-(CH2)2-CH3;

[0329] Composto 12: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Phe-NH2;

[0330] Composto 13: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-LeuΦ(CH2NH)-Cys-NH2;

[0331] Composto 14: N4-triazóis-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Sta-Leu-NH2. Tabela 1. Propriedades de ligação, sinalização e intrernalização de receptor GRP in vitro de manálogos de BN

[0332] Afinidades de ligação de Compostos 1, 2 e 9 foram medidas após complexação com isótopo não-radioatico 115In. Os dados revelam que complexação com isótopo não afeta a afinidade de ligação para o receptor assim como propriedades de antagonista.

Processo padrões em publicações relevantes:

[0333] Cescato R, Schulz S, Waser B, et al. Internalization of sst2,sst3 and sst5 receptors: Effects of somatostatin agonists and antagonists. J. Nucl. Med., 2006;47:502-511.

[0334] Cescato R, Maina T, Nock B, Nikolopoulou A, Charalambidis D, Piccand V, Reubi JC. Bombesin Receptor Antagonists May Be Preferable to Agonists for Tumor Targeting. J. Nucl. Med.. 2008; 49:318-326.

[0335] Magrys, A.; Anekonda, T.; Ren, G.; Adamus, G. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune- mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192.

[0336] Markwalder R, Reubi JC. Gastrin-releasing peptide receptors in the human prostate: relation to neoplastic transformation. Cancer Res. 1999;59:1152-1159.

[0337] Michel, N.; Ganter, K.; Venzke, S.; Bitzegeio, J.; Fackler, O.T.; Kepplet, O. T. The Nef protein of human immunodeficiency virus is a broad-spectrum modulator of chemokine receptor cell surface levels that acts independently of classical motifs for receptor endocytosis and Galphai signaling. Mol. Biol. Cell. 2006, 17, 3578-3590

[0338] Reubi JC, Schaer JC, Waser B, et al. Affinity profiles for human somatostatin receptor sst1-sst5 of somatostatin radiotracers selected for scintigraphic and radiotherapeutic use. Eur. J. Nucl. Med., 2000;27:273-282.

[0339] Reubi JC, Wenger S, Schmuckli-Maurer J, et al. Bombesin Receptor Subtypes in Human Cancers: Detection with the Universal Radioligand (125)I-[D-TYR(6), beta-ALA(11), PHE(13), NLE(14)] Bombesin(6-14). Clin. Cancer Res., 2002;8:1139-1146.

[0340] Vigna SR, Mantyh CR, Giraud AS, et al. Localization of specific binding sites for bombesin in the canine gastrointestinal tract. Gastroenterology. 1987;93:1287-1295.

Exemplo 7

[0341] Experimentos de biodistribuição em camundongo nu transportando tumor PC-3

[0342] Camundongos nus fêmeas foram implantados subcutaneamente com 10 milhões de células de tumor PC-3, que foram recentemente expandidas em uma solução salina tamponada com solução de fosfato esterilizada (PBS, pH 7,4). Onze dias após inoculação os camundongos foram injetados na veias de cauda com 10 pmols de peptídeos marcados com rádio (cerca de 0,18 MBq), diluídos em NaCl ( albumina de soro bovino a 0,1%, pH 7,4, volume total injetado = 100 uL). Para a determinação da tomada não-específica em tumor ou em órgãos positivos receptores, um grupo de 4 animais foi pré-injetado com 0,02 umol de peptídeo não-marcado em solução 0,9% de NaCl e após 5 minutos peptídeo marcado com rádio foi injetado. Em intervalos de 1, 4, 24, 48, e 72 horas, os camundongos (em grupos de 3-4) foram sacrificados e os órgãos de interesse foram coletados, rinsados de excesso de sangue, pesados e contados em um contador-Y.

Exemplo 8

[0343] Experimento de biodistribuição, formação de imagem -PET/CT em camundongo transportando tumor-LNCaP e PC-3 de Ga- 68-DOTA Composto 2, afinidade de ligação e estabilidade

[0344] Formação de Imagem + Biodistribuição

[0345] Composto 2: DOTA-4amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Glys-His-Sta-Leu-NH2

Fórmula empírica:: C78H115N20O19Ga; Peso Molecular: 1704,89

[0346] Ga-68-DOTA-Composto 2 foi feito imagem sobre uma microPET/CT (Inveon, siemens) em camundongos transportando tumor LNCaP e PC-3 1 hora após injeção de 10 MBq de radiotraçador. Devido à rápida depuração renal deste antagonista de bombesina atividade de fundo muito baixa foi observada com somente alguma tomada de rim e bexiga. Alto contraste de tumor visível em ambos xenoenxertos foi efetivamente bloqueado pó bombesina a 100 ug ou o próprio Composto 2 não-radioativo. Receptores de bombesina foram bloqueados com sucesso com bombesina conduzindo a uma crítica perda de sinal em tumor de figura 3a e 3b em camundongos transportando tumor PC-3 + figura 4a e 4b camundongos transportando tumor LNCaP).

AFINIDADE DE LIGAÇÃO

[0347] A afinidade de ligação de Ga-68-DOTA-Composto 2 para GRPr foi determinada via dois diferentes processos compreendendo autorradiografia de receptor sobre tecidos humanos e um ensaio celular usando células PC-3. Ambos processos renderam alta afinidade de ligação de Composto 2 com uma IC50 de ~8 nM baseado no peptídeo DOTA-Composto 2 não-radioativo.

Estabilidade em plasma de camundongo e microssomas

[0348] Ga-68-DOTA-Composto 2 mostra boa estabilidade metabólica medida através de diferentes processos in vitro e in vivo. Estabilidade em plasma in vivo de Ga-68-DOTA-Composto 2 foi investigada em plasma de camundongos não-transportando tumor e urina foi analisada por HPLC em 1, 3, 5, 10 e 15 minutos após injeção intravenosa de aproximadamente 20 MBq de Ga-68-DOTA-Composto 2 (figura 10a, b, c, d, e). Após alguns minutos, menor degradação em plasma do radiotraçador foi verificada mostrando dois metabólitos polares/muito pequenos em 1,3 minutos e 1,5 minutos de tempo de retenção que também ocorreram como principais metabólitos na urina. O próprio composto apareceu com um tempo de retenção de 11,6-11,7 mostrando um pico duplo partindo 5 minutos p.i.

[0349] Estabilidade microssomal de Ga-68-DOTA-Composto 2 foi determinada usando microssomas humanas e de camundongo incubadas com o radiotraçador e analisadas por HPLC. Nenhuma degradação por microssomas humanas ou de camundongo de Ga-68- DOTA-Composto 2 foi verificada. Menores impurezas detectadas sobre os cromatogramas também ocorreram sem o cofator microssomal.

Exemplo 9

[0350] Experimento de biodistristribuição e formação de imagem - SPECT/CT em camundongos transportando tumor PC-3 de 99mTc- ARN4-6 Ver protocolo de experimento acima. Radioligante: 99mTc-ARN4-6 Animal: camundongos nus transportando tumor PC-3; 3 camundongos/grupo Quantidade de injeção: 10 uCi/10 pmols/100 uL/camundongo Ponto de tempo: 1h, 4h e 24h

f

[0351] Figura 6 mostra uma imagem SPECT/CT of 99mTc-ARN4-06 (15 MBq/200 pmol) Exemple 10 Experimento de biodistribuição e formação de imagem- SPECT/CT em camundongos transportando tumor PC-3 de 99mTc-ARN4-05 Ver experimento acima Radioligante: 99mTc-ARN4-05 Animal: camundongo nu transportando tumor PC-3; 6-9 camundongos/grupo Quantidade de injeção: 10 uCi/10 pmols/100 uL/camundongo Ponto de tempo: 1h, 4h, 24h

[0352] A figura 8 mostra uma imagem SPECT/CT de 99mTc-ARN4- 05 (15 MBq/200 pmols) Exemplo 11 Síntese de Ga-68-DOTA Composto 2 Etapa 1:

[0353] Peptídeos não-radioativos foram sintetizados por síntese de peptídeo de fase sólida (SPPS) seguindo estratégia Fmoc padrão usando resina amida Rink suportada em poliestireno. Etapa 2: 350 μL HEPES a 0,25M em frasco Wheaton V . Adicionar [68Ga]GaCl3 em 400 μL de 97,6% acetona/HCl a 0,05 N . Ajustar para pH ~3,5 com HCl a 0,1 M . Adicionar 40 μg de peptídeo em 40 μL de água . Aquecer 75W (95oC) por 30s . Repousar por 30s . Repetir aquecimento e descanso mais três vezes . Adicionar 5 mL de água à mistura de reação . Imobilizar sobre tC18 Light SPE . Lavar com água (5 mL) . Eluir com EtOH (500 μL)

Rendimento radioquímico (não otimizado) 79 –231 MBq (32 – 60% d.c.) Atividade Inicial Não de marcadores Falhas Pureza radioquímica Atividade específica

[0354] Figura 9 mostra análise de HPLC de Ga-68-DOTA Composto 2 sobre uma coluna de fase reversa. Pureza de Produto Coluna: ACE a 5μ C18 50 x 4,6mm Solvente: Solvente A: H2O + TFA a 0,1% Solvente B: MeCN + TFA a 0,1% Gradiente: 5 - 95% em 7 minutos Fluxo: 2ml/minuto

Exemplo 12 Estabilidade em soro de Lu-177-DOTA Composto 2

[0355] Composto 2: DOTA-4-amino-1-carboximetil-piperidina-D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2

[0356] Estabilidade em soro de Lu-177-DOTA Composto 2 radiomarcado com Lu-177 também foi investigada em soro humano. Após 96 horas de incubação de Lu-177-DOTA Composto 2 em soro humano ainda 70% do composto estavam intactos como analisado por processos de HPLC (figura 11). A 1 mL de soro humano recentemente preparado, previamente equilibrado em um ambiente de 5% de CO2 a 37oC, foi adicionado 0,03 nmol de solução padrão de peptídeo marcada com 177Lu. A mistura foi incubada em um ambiente de 5% de CO2, 37oC. Em diferentes pontos de tempo, alíquotas de 100 uL (em triplicata) foram removidas e tratadas com 200 uL de EtOH para precipitar proteínas de soro. Amostras foram então centrifugadas por 15 minutos em 5000 rpm. 50 μLde sobrenadante foram removidos para contagem de atividade em um contador de poço-Y, o sedimento foi lavado duas vezes com 1 mL de EtOH e contado, e a atividade no sobrenadante foi comparada à atividade no pélete para render a porcentagem de peptídeos não ligados a proteínas ou radiometal transferido para proteínas de soro. O sobrenadante foi analisado com HPLC (eluentes: A = ácido trifluoroacético a 0,1% em água e B = acetonitrila; gradiente: 0 minuto A a 95%; 20 minutos A a 50%) para determinar a estabilidade do peptídeo em soro.

[0357] A figura 11 mostra estabilidade de Lu-177-DOTA Composto 2 em soro humano.

Exemplo 13 Comparação a F-18 Colina e F18-FDG

[0358] Biodistribuição de Ga-68 RM2 vide tabela abaixo

[0359] Em 1h p.i. em camundongo transportando tumor PC-3 foi comparado ao traçador F-18

[0360] [18F]Fluoroetilcolina (FEC) usado para formação de imagem de câncer de próstata, e FDG o padrão de ouro

[0361] F18 traçador em oncologia. Altas razões de tumor-para- tecido sublinham a utilidade diagnóstica do Ga-68 composto RM2 para formação de imagem PET Vide figura 12.

Claims

1. Conjugado antagonista de peptídeo análogo de bombesina, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula geral (I) (I) [A-(B)n]x-C em que: x é um inteiro de 1 A é um quelante metal radionuclídeo, B é um espaçador ligado ao N terminal de C ou uma ligação covalente, C é um antagonista de peptídeo análogo a bombesina de sequência C-1 a C-3, onde C-1: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa313-Xaa414- ZH, em que Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp ou um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo:

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala, Xaa3 é estatina, análogos e isômeros de estatina, 4-Am, 5- MeHpA, ou 4-Am,5-MeHxA, Xaa4 é Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, ou iso-Bu-Gly, e Z é NH ou O; C-2: Xaai6-Gln7-Trp8-Ala9-Valw-Xaa211-His12-Leuy(CHOH- CH2)-(CH2)2-CH3, onde eLeu(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 é

Xaa1 é D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp o um resíduo tendo qualquer uma das fórmulas descritas abaixo

K é F, Cl, I, ou NO2, Xaa2 é Gly ou β-Ala; C-3: Xaa16-Gln7-Trp8-Ala9-Val10-Xaa211-His12-Xaa5 13-Xaa6 14- ZH, em que Xaa1 é D-Phe, Xaa2 é Gly, Xaa5 é Leui^-CH2NH-, Xaa6 é Cys or Phe, e Z is NH, e sais farmaceuticamente aceitáveis de um ácido inorgânico ou orgânico dos mesmos, hidratos, complexos, ésteres, amidas e solvatos dos mesmos.

2. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o quelante de metal (A) é um quelante de metal para metais trivalentes ou para metais pentavalentes e os seus análogos próximos.

3. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o quelante de metal para metais trivalentes é selecionado do grupo compreendendo quelantes baseados em DOTA-, NODASA-, NODAGA- , NOTA-, DTPA-, EDTA-, TETA-, e TRITA.

4. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o quelante de metal para metais pentavalentes é selecionado do grupo compreendendo:

em queR1-R15 são independentemente um do outro átomos de hidrogênio ou grupos C1-4 alquila, em que, na metade

está substituído com Y ou não está substituído com Y, R16 é um átomo de hidrogênio ou um grupo CO2 (C1-4) alquila; R17 e R18 são independentemente um do outro grupos C1-4 alquila ou grupos fenila; R19 é CH2-COOH ou um seu derivado funcional; E é C1-4 alquileno, ou fenileno; opcionalmente C1-4 alquileno está substituído com CO2- alquila, CH2-Coalquila, CONH2 ou CONHCH2-CO2-alquila; opcionalmente fenileno está substituído com CO2-alquila, em que os grupos alquila têm 1 a 4 átomos de carbono; G é NH ou S; Y é um grupo funcional capaz de ligação com um grupo amino livre do peptídeo (N-terminal) ou com o espaçador; e Z' é S ou O.

5. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o metal radionuclídeo para formação de imagem é selecionado do grupo compreendendo 133mIn, 99m Tc, 67Ga, 52Fe, 68 Ga, 72 As, 111In, 97 Ru, 203 Pb, 62Cu, 64 Cu, 51 Cr, 52m Mn, 157 Gd, 123I, 124I, 131 I, 75 Br, 76Br, 77Br, and 82Br.

6. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o metal radionuclídeo para radioterapia é selecionado do grupo compreendendo 186 90 67 69 121 127 142 143 198 199 161 109 Re, Y, u, Er, n, Te, Pr, Pr, Au, Au, Tb, Pd, 188Rd, 186Re, 188Re, 77As, 166Dy, 166Ho, 149 Pm, 151Pm, 153Sm, 159Gd, 172Tm, 90Y, 111In, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag, 125I, 123I, 213Bi, 225Ac, 129 I e 177mSn.

7. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espaçador B ligado ao terminalN de C tem fórmula geral II: (II) B1-B2 em que B1 é uma ligação covalente, um aminoácido natural, um aminoácido não-natural, uma diamina linear ou uma diamina cíclica, B2 é uma ligação covalente, um aminoácido natural, um aminoácido não-natural, um ácido carboxílico linear ou um ácido carboxílico cíclico, com a condição de que ambos B1 e B2 não podem ser ligações covalentes ao mesmo tempo e que, quando B1 é uma diamina, B2 é um ácido carboxílico.

8. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o aminoácido não-natural é um composto tendo qualquer uma de fórmulas gerais III, IV, V ou VI em que

em que a é um inteiro de 0 a 3, b é um inteiro de 0 a 3, e padrões de substituição relativos ou opcionalmente1,2-, 1,3- ou 1,4-.

em que c é um inteiro de 1 a 24, d é um inteiro de 1 a 6.

em que E' é NH, ou CH2, f é um inteiro de 0 a 6, g é um inteiro de 0 a 6; quando E' é CH2, então o anel de 6 membros está opcionalmente substituído em qualquer posição do anel de 6 membros sobre o mesmo carbono do anel ou sobre diferentes carbonos, quando E' é NH, então o anel de 6 membros está opcionalmente substituído em qualquer posição de carbono do anel de 6 membros sobre o mesmo átomo de carbono do anel ou sobre diferentes átomos de carbono e/ou sobre o átomo de nitrogênio com a condição de que f ou g é um inteiro igual ou maior que 1.

9. Conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é com a condição de que o conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tem a fórmula (I') (I') [A'-(B)n]x-C em que A' é incluído ao invés de A e tem o mesmo significado como A exceto que ele é um quelante de metal livre de metal radionuclídeo.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende qualquer um dos conjugados antagonistas de peptídeo análogo a bombesina como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

11. Uso de qualquer um dos conjugados antagonistas de peptídeo análogo a bombesina como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para ligação a receptores de bombesina, preferivelmente a receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP) e/ou para inibição de receptores de bombesina, preferivelmente receptor de peptídeo de liberação de gastrina (GRP).

12. Processo para preparação de qualquer um dos conjugados antagonistas de peptídeo análogo a bombesina como definidos na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de - radioquelação de conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina tendo fórmula geral (I') como definida acima com um apropriado metal radionuclídeo ou um átomo de metal.

13. Processo para formação de imagem de receptores de bombesina, preferivelmente células de tumor expressando receptor de GRP e/ou vasos tumorais e peritumorais, em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - administração a um paciente de uma quantidade radiofarmacêutica efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, como definido em qualquer uma de reivindicações 1 a 8; - formação de imagem de metal radionuclídeo no paciente.

14. Uso de uma quantidade radiofarmaceuticamente efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um agente de formação de imagem para fazer imagem de receptores de bombesina, preferivelmente células de tumor expressando receptor de GRP e/ou vasos tumorais e peritumorais.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as ditas células de tumor referem-se a cânceres que - carcinomas de célula renal, - tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos, - cânceres de célula escamosa de cabeça e pescoço, - neuroblastomas, e - carcinomas de célula escamosa de esôfago e em que os ditos vasos tumorais e peritumorais referem-se a cânceres que são selecionados do grupo compreendendo: - cânceres de ovário, - cânceres endometriais, e - cânceres pancreáticos.

16. Uso de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doenças relacionadas a vaso tumoral e peritumoral e/ou célula de tumor.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que as ditas doenças relacionadas à célula de tumor são selecionadas do grupo compreendendo: - câncer de próstata, incluindo metástases - câncer de mama, incluindo metástases - tumores estromais gastrointestinais - carcinomas de pulmão de célula pequena - carcinomas de célula renal, - tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos, - cânceres de célula escamosa de cabeça e pescoço, - neuroblastomas, e - carcinomas de célula escamosa de esôfago e em que os ditos vasos tumorais e peritumorais referem-se a cânceres que são selecionados do grupo compreendendo: - câncer de próstata, incluindo metástases, e - câncer de mama, incluindo metástases.

18. Kit para a preparação de agente radioterapêutico ou de um agente de formação de imagem radiofarmacêutico, caracterizado pelo fato de que compreende um frasco contendo uma quantidade predeterminada do conjugado antagonista de peptídeo análogo a bombesina, como definido na reivindicação 9, e um veículo, diluente, excipiente ou adjuvante aceitável para a radiomarcação de um quelante de metal.