BRPI0910036B1

BRPI0910036B1 - kit compreendendo um primeiro administrador para via intra-venosa de um complexo de lipídio catiônico-dna (cldc) e um segundo administrador de uma vacina

Info

Publication number: BRPI0910036B1
Application number: BRPI0910036-9A
Authority: BR
Inventors: Jeffery FAIRMAN; Maria Vaughn
Original assignee: Juvaris Biotherapeutics, Inc
Priority date: 2008-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2020-07-21
Also published as: EP2257306A1; US8945590B2; WO2009120811A1; JP5759890B2; CA2719614C; CA2719614A1; US20090263423A1; JP2011515490A; BRPI0910036B8; BRPI0910036A2; EP2257306B1

Abstract

KIT COMPREENDENDO UM PRIMEIRO ADMINISTRADOR PARA VIA INTRA-VENOSA DE UM COMPLEXO DE LIPÍDIO CATIÔNICO-DNA (CLDC) E UM SEGUNDO ADMINISTRADOR DE UMA VACINA A presente invenção refere-se a um método para vacinação que é eficaz para gerar uma resposta imune específica para o antígeno intensificada em um mamífero, peixe ou pássaro. O método é particularmente eficaz para proteger um mamífero, peixe ou pássaro de uma doença, incluindo câncer, uma doença associada à inflamação alérgica, ou uma doença infecciosa. Também são apresentadas composições terapêuticas úteis neste método.

Description

KIT COMPREENDENDO UM PRIMEIRO ADMINISTRADOR PARA VIA INTRA-VENOSA DE UM COMPLEXO DE LIPÍDIO CATIÔNICO-DNA (CLDC) E UM SEGUNDO ADMINISTRADOR DE UMA VACINA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[001] A invenção refere-se, geralmente, à intensificação da imunogenicidade e, portanto, o tratamento de condições de doença com vacinas e mais especificamente à utilização de um complexo de lipossomo catiônico-DNA (CLDC) para fortalecer as capacidades imunogênicas de vacinas.

INFORMAÇÕES ANTECEDENTES

[002] No início da década de 1990 estava sendo desenvolvido um sistema de liberação de gene que empregava o uso de lipossomas complexados a DNA plasmidial (codificante) com o objetivo de gerar expressão do produto gênico liberado nos tecidos-alvo. Logo no início, foi reconhecido que a injeção do complexo de DNA plasmidial e lipossomas resultou em uma profunda ativação da imunidade inata do hospedeiro. Esta ativação imune ocorreu independentemente do componente plasmidial ser um vetor codificante ou um vetor não codificante ‘vazio’. Este efeito também foi significativamente dependente da formação do complexo de plasmídio e lipídios catiônico, uma vez que nenhuma entidade sozinha tinha propriedades estimulantes significativas, exceto em doses extremamente altas in vivo. Desde estas observações precoces, ficou reconhecido que a estimulação da imunidade inata disparada por complexos de lipídio catiônico-DNA (CLDC) era devida, em parte, a uma potencialização mediada pelos lipossomos da capacidade de resposta inerente do sistema imune do mamífero, peixe ou pássaro a motivos CpG não metilados dentro do DNA bacteriano dos plasmídios. Recentemente, foi reconhecido que os motivos CpG funcionam através da interação com o receptor Toll-like 9 (TLR-9), uma interação que exige internalização -um evento que é facilitado significativamente pelo componente de lipídio. Mostrou-se que os lipossomos acentuam a atividade imunoestimulatória dos oligonucleotídeos CpG (ODN) em 15 a 40 vezes. O grau de imunoestimulação por CLDC foi tão profundo e previsível que ele se tornou conhecido no campo da terapia gênica como o efeito do ‘vetor vazio’. Este efeito sensível à via e dose-dependente foi reconhecido em várias espécies e é caracterizado por regulação positiva quase imediata de uma ampla gama de defesas celulares e solúveis do hospedeiro. Em adição à regulação positiva da imunidade inata, o efeito imune estimulatório serve como um potente adjuvante para vacinas microbianas e à base de antígenos do ‘câncer’.

[003] A hiporresponsividade a uma estimulação imune inata excessiva foi extensamente estudada in vitro e documentada no tratamento clínico de pacientes com sepse. A caracterização das células destes pacientes hiporresponsivos indicou baixa produção de citocina inflamatória em resposta ao estímulo, expressão reduzida de HLA-DR e, geralmente, uma capacidade reduzida de apresentação de antígenos. Este estado hiporresponsivo também tem sido demonstrado in vitro com o uso de células humanas usando lipopolissacarídeo e ácido lipoteicoico e, recentemente, em células RAW264.7 de murino com o uso de oligonucleotídeos CpG.

[004] Há uma necessidade contínua para fornecer vacinas melhores que possam produzir uma resposta imune segura, antígeno-específica e eficaz para evitar e/ou tratar doenças suscetíveis a tratamento através da criação de uma resposta imune, tais como doenças infecciosas, alergia e câncer.

[005] A presente invenção auxilia o desenvolvimento de vacinas e estratégias de vacina nas quais um alto nível de títulos protetores são necessários após única ou múltipla vacinação ou uma combinação de proteção e resposta imune inata e adaptativa é desejada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006] A presente invenção inclui métodos para gerar uma resposta imune intensificada à vacinação em mamíferos, peixe ou pássaros quando um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) é administrado por uma via intravenosa, intraperitoneal, inalatória ou in ovo junto com ou seguido de imunização com um antígeno de vacina combinado com ou sem um adjuvante. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a métodos para gerar uma resposta imune não-antigênica específica em um mamífero, peixe ou pássaro com o uso de complexos de DNA lipossoma catiônico como o estimulante imune e adjuvante de vacina.

[007] Uma modalidade da presente invenção inclui um método para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro, pela qual uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) é administrada através de uma via intravenosa, intraperitoneal, inalatória ou in ovo ao mamífero, peixe ou pássaro. Simultaneamente ou após o CLDC ser administrado, uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante é administrada através de uma via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou in ovo. O aumento resultante na imunogenicidade pode ser o resultado de uma resposta imune antígeno-específica intensificada.

[008] Quando o indivíduo a ser tratado é um mamífero, a via de administração do CLDC é através da via IV, IP ou inalatória, com administração IV sendo da máxima preferência. As vias de administração contempladas da vacina com adjuvante ou sem adjuvante são as vias IV, SC, IM ou intranasal, com as vias IM ou SC sendo da máxima preferência.

[009] Quando o indivíduo a ser tratado é um pássaro ou peixe, a via de administração do CLDC é através da via IV, IP, inalatória ou in ovo, com IV ou in ovo sendo da máxima preferência. As vias de administração contempladas da vacina com adjuvante ou sem adjuvante são as vias IV, SC, IM, intranasal ou in ovo com as vias IM, SC ou in ovo sendo da máxima preferência.

[0010] Quando a vacina é uma vacina com adjuvante, a vacina pode ser adjuvantada com um ou mais dos seguintes adjuvantes: um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), alume, monofosforil lipídio A (MPL), QS21, ou oligonucleotídeo CpG (CPG-ODN). O adjuvante da máxima preferência é CLDC. Em algumas modalidades contempladas, o adjuvante pode incluir CLDC e pelo menos um outro adjuvante.

[0011] Os protocolos de administração contemplados nos métodos da presente invenção exigem que uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante seja administrada ao mamífero, peixe ou pássaro concomitantemente ou 0 a 7 dias após a administração do CLDC. De preferência, a vacina é administrada concomitantemente ao CLDC, dentro de horas após ou dentro de 1 a 3 dias. Com a máxima preferência, a vacina é administrada concomitantemente ou dentro de 36 horas após a administração do CLDC.

[0012] Modalidades adicionais incluem métodos em que a vacina é administrada para o tratamento de doenças autoimunes, câncer, inflamação alérgica ou doenças infecciosas. Algumas modalidades incluirão métodos nos quais a dita vacina é administrada para a prevenção e tratamento de cânceres de pulmão primários, doenças pulmonares metastáticas, asma alérgica e doenças virais

[0013] Modalidades adicionais incluem métodos nos quais a vacina compreende um vírus influenza A inativado, uma vacina trivalente de influenza inativada, uma vacina de influenza fragmentada, uma proteína glicosilada, uma vacina de hepatite B, ou um lipopolissacarídeo.

[0014] Quando a vacina compreende um vírus influenza A inativado, um vírus preferencial é HKx31. Quando a vacina contém uma vacina trivalente de influenza, uma vacina preferencial é a vacina trivalente ajustada periodicamente Fluzone® ou uma equivalente. Quando a vacina compreende uma proteína glicosilada é preferencial que seja a vacina de proteína glicosilada usada para prevenir ou tratar Staphylococcus aureus resistente à metacilina (MRSA). Uma proteína glicosilada preferencial é a proteína A1s3p-N. Quando a vacina compreende uma vacina de influenza fragmentada, uma vacina de influenza fragmentada preferencial é a vacina de H5N1 fragmentada. Quando a vacina compreende um antígeno de superfície de hepatite B uma vacina preferencial é a ENGERIX-B ou equivalente. Quando a vacina compreende um lipopolissacarídeo, um polissacarídeo glicosilado é preferencial. Adicionalmente, polissacarídeos preferenciais incluem um polissacarídeo de Francisella e um polissacarídeo de Francisella tularemia LVS.

[0015] Outra modalidade contemplada é um método de tratar um mamífero, peixe ou pássaro com uma condição de doença através da geração de uma resposta imune antígeno-específica intensificada no dito mamífero, peixe ou pássaro através da estimulação da resposta imune por administrar uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC); e administrar uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante. A administração do CLDC é tipicamente, através de uma via intravenosa, intraperitoneal, inalatória ou in ovo; e a vacina é, tipicamente, administrada através de uma via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou in ovo, concomitantemente ao dito complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), ou 0 a 7 dias após o dito complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC). Modalidades preferenciais administram o CLDC intravenosamente e a vacina por via IM ou SC para mamíferos, e incluem administração in ovo para o CLDC e para a vacina em peixes ou pássaros.

[0016] As condições de doença contempladas para tratamento e/ou prevenção na presente invenção podem ser selecionadas a partir de doenças autoimunes, câncer, inflamação alérgica e doenças infecciosas. Modalidades preferenciais são direcionadas para a prevenção e tratamento de cânceres de pulmão primários, doenças pulmonares metastáticas, asma alérgica e doenças virais

[0017] Outra modalidade apresenta um método para gerar uma resposta imune antígeno-específica intensificada em um mamífero em que uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) é administrada intravenosamente a uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante é administrada intramuscularmente ou subcutaneamente, concomitantemente ou 0 a 7 dias após a dita administração do CLDC

[0018] Outra modalidade apresenta um kit que compreende os materiais necessários para praticar os métodos apresentados da presente invenção. O kit incluiria um primeiro administrador que compreende uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) para um mamífero, peixe ou pássaro; um segundo administrador que compreende uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante para um mamífero, peixe ou pássaro; e um protocolo de instruções para identificar o cronograma e as vias de administração para cada um dos administradores. O administrador preferencial é uma seringa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] Os desenhos anexos, que estão incorporados e formam uma parte do relatório descritivo, ilustram a modalidade preferencial da presente invenção, e junto com a descrição servem para explicar os princípios da invenção.

Nos desenhos:

[0020] A figura 1 ilustra graficamente que há um período refratário a múltiplas dosagens com CLDC através de administração intravenosa que é terminado em um prazo de 14 dias.

[0021] A figura 2 ilustra graficamente que o período refratário a múltiplas dosagens com CLDC através de administração intravenosa tem magnitude dose-dependente.

[0022] A figura 3 ilustra graficamente que a administração de uma vacina sem adjuvante contendo um vírus inativado como o antígeno (vírus influenza HKx31) dentro de 1 a 7 dias após a administração IV do CLDC resulta em uma resposta de anticorpo antiviral intensificada.

[0023] A figura 4 ilustra graficamente que a administração de uma vacina purificada com adjuvante de CLDC (vacina trivalente de influenza - Fluzone®, Sanofi Pasteur) concomitantemente ou dentro de 1 a 7 dias após a administração IV de CLDC resultados em uma resposta de anticorpo antiviral intensificada.

[0024] A figura 5 ilustra graficamente que a administração de uma vacina sem adjuvante contendo um vírus inativado e o antígeno (vírus influenza HKx31) um dia após a administração IV de CLDC resulta em velocidade e intensidade aumentadas da resposta de anticorpos.

[0025] A figura 6 ilustra graficamente que ocorre uma intensificação da vacinação quando há a administração de uma vacina trivalente de influenza de CLDC com adjuvante simultaneamente ou após a administração IV de CLDC.

[0026] A figura 7 ilustra graficamente que a administração IM de uma vacina sem adjuvante contendo um vírus inativado como o antígeno (vírus influenza HKx31) dentro de 1 a 7 dias após a administração IV do CLDC resulta em uma resposta de anticorpo antiviral intensificada.

[0027] As figuras 8a e 8b ilustram graficamente que o pré-tratamento subcutâneo (SC) 8a ou IM 8b com CLDC foram ineficazes para a intensificação da vacina.

[0028] A figura 9 ilustra graficamente que o pré-tratamento IV com CLDC melhora a resposta da vacinação a Staphylococcus aureus resistente à metacilina (MRSA).

[0029] A figura 10 ilustra graficamente que o pré-tratamento IV com CLDC melhora a resposta da vacinação ao influenza H5N1 da “gripe das aves”.

[0030] A figura 11 ilustra graficamente que o pré-tratamento IV com CLDC melhora a resposta da vacinação ao antígeno de superfície de hepatite B.

[0031] A figura 12 ilustra graficamente que o pré-tratamento IV com CLDC melhora a resposta da vacinação ao polissacarídeo Francisella tularemia LVS.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] A presente invenção refere-se, de modo geral, a uma nova estratégia de imunização e composições terapêuticas para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro, e, em particular, em um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma doença suscetível ao tratamento pela criação de uma resposta imune. As doenças que são particularmente suscetíveis a tratamento com o uso do método da presente invenção incluem doenças autoimunes, câncer, inflamação alérgica e doenças infecciosas. Em uma modalidade, o método e a composição da presente invenção são particularmente úteis para a prevenção e tratamento de cânceres de pulmão primários, doenças pulmonares metastáticas, asma alérgica e doenças virais.

[0033] Uma modalidade da presente invenção refere-se a um método de vacinação. O método contempla a administração de um estimulante imune de complexo de lipídio catiônico-DNA a um mamífero, peixe ou pássaro através da via intravenosa seguido da administração de uma vacina de complexo de lipídio catiônico-DNA com adjuvante resultando em uma resposta imune intensificada ao antígeno incluído na vacina.

[0034] Os exemplos da presente invenção mostram que a administração intravenosa (IV) de CLDC induz um curto período refratário (7 a 10 dias) a uma ativação imune inata a uma segunda administração, com 50% de capacidade de resposta restaurada após três dias e 100% em 10 a 14 dias. Este período refratário foi observado em camundongos knockout para interferon-gama e receptor de interferon-gama bem como camundongos pré-administrados com interferon-γ ou depletados de células NK ou células dendríticas plasmocitoides. Ao contrário da capacidade reduzida para apresentação de antígenos observada em pacientes com sepse, a administração IV de CLDC simultaneamente ou até sete dias antes da vacinação com vários antígenos como: vírus influenza HKx31 inativado pelo calor, vacina trivalente de influenza Fluzone®, proteína glicosilada A1s3p-N, vacina de H5N1 fragmentada, antígeno de superfície de hepatite B, e um polissacarídeo de Francisella tularemia LVS; adjuvantada com ou sem CLDC, de fato, aumentou significativamente tanto a resposta imune humoral quanto celular. A intensificação da resposta adaptativa à vacinação foi maior nos pontos de tempo nos quais o período refratário máximo foi observado, sugerindo uma relação inversa entre estas duas observações. Portanto, apesar da vacina ter sido administrada quando os níveis de interferon gama estavam sumprimidos, de acordo com o exemplo 1/figura 1, as vacinas testadas foram surpreendentemente mais responsivas imunogenicamente apesar de terem sido administradas durante este período refratário. Foi constatado que o período refratário durou cerca de 7 a 10 dias após uma dose sistêmica de CLDC ter sido administrada. Os exemplos também demonstraram claramente que quando uma vacina é administrada concomitantemente ou 0 a 7 dias após a administração do CLDC (o período de tempo no qual os níveis de interferon-gama estavam mais suprimidos) o maior estímulo de imunogenicidade foi encontrado com múltiplas vacinas.

[0035] Adicionalmente, os exemplos demonstraram que uma imunogenicidade aumentada é encontrada com algumas vacinas que não possuem adjuvante (vide Exemplo 3). O exemplo 4 demonstrou que algumas vacinas sem adjuvante podem não ter a mesma imunogenicidade aumentada que a vacina com adjuvante. Geralmente, é preferível usar uma vacina com adjuvante, e é mais preferível usar CLDC como o adjuvante.

[0036] Exemplos adicionais demonstraram que a via de administração do pré-tratamento ou tratamento ou do tratamento concomitante com CLDC é um componente necessário. Conforme descrito adicionalmente no Exemplo 8 e mostrado nas figuras 8a e 8b, nem a administração subcutânea nem a intramuscular de CLDC resultaram em efeitos imunogênicos intensificados associados à administração sistêmica. Os resultados do experimento 8 são adicionalmente benéficos para mostrar porque uma única vacina SC ou IM adjuvantada com CLDC não resulta em uma imunogenicidade aumentada. Ainda que tecnicamente a vacina SC ou IM adjuvantada com CLDC seja administrada concomitantemente ao CLDC (o adjuvante), o exemplo 8 mostra que uma resposta imunogênica intensificada não é vista, portanto, a imunogenicidade intensificada da presente invenção não é devida ao efeito do adjuvante sozinho. E é preferível que o pré-tratamento ou tratamento concomitante com CLDC seja administrado sistemicamente.

[0037] Para uso na presente invenção, uma vacina sem adjuvante significa que nem a formulação de vacina nem composição de vacina injetada no indivíduo inclui qualquer um dos adjuvantes conhecidos em concentrações suficientes para modificar o efeito da vacina. Os termos sem adjuvante e não-adjuvantado são usados de maneira intercambiável por todo o relatório descritivo e são considerados iguais para os propósitos da presente invenção. Adjuvantes conhecidos incluem, mas não se limitam a: um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), alume, monofosforil lipídio A (MPL), QS21 (o adjuvante QS21 é uma saponina atóxica derivada da árvore quilaia (Quillaja saponaria), ou oligonucleotídeo CpG (CPG-ODN). O adjuvante da máxima preferência é CLDC.

[0038] Modalidades da presente invenção incluem protocolos de administração para administrar CLDC a um indivíduo concomitantemente ou após uma administração de uma vacina dentro de 0 a 7 dias após a administração do CLDC, o que resulta em uma resposta imunogênica intensificada no indivíduo.

[0039] Uma modalidade da presente invenção inclui um método para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro, pela qual uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) é administrada através de uma via intravenosa, intraperitoneal, inalatória ou in ovo ao mamífero, peixe ou pássaro. Simultaneamente ou após o CLDC ser administrado, uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante é administrada através de uma via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou in ovo. O aumento resultante na imunogenicidade pode ser o resultado de uma resposta imune antígeno-específica intensificada.

[0040] Quando o indivíduo a ser tratado é um mamífero, a via de administração do CLDC é através da via IV, IP ou inalatória, com administração IV sendo da máxima preferência. As vias de administração contempladas da vacina com adjuvante ou sem adjuvante são as vias IV, SC, IM ou intranasal, com as vias IM ou SC sendo da máxima preferência.

[0041] Quando o indivíduo a ser tratado é um pássaro ou peixe, a via de administração do CLDC é através da via IV, IP, inalatória ou in ovo, com IV ou in ovo sendo da máxima preferência. As vias de administração contempladas da vacina com adjuvante ou sem adjuvante são as vias IV, SC, IM, intranasal ou in ovo com as vias IM, SC ou in ovo sendo da máxima preferência.

[0042] Quando a vacina é uma vacina com adjuvante, a vacina pode ser adjuvantada com um ou mais dos seguintes adjuvantes: um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), alume, monofosforil lipídio A (MPL), QS21, ou oligonucleotídeo CpG (CPG-ODN). O adjuvante da máxima preferência é CLDC. Em algumas modalidades contempladas, o adjuvante pode incluir CLDC e pelo menos um outro adjuvante.

[0043] Os protocolos de administração contemplados nos métodos da presente invenção exigem que uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante seja administrada ao mamífero, peixe ou pássaro concomitantemente ou 0 a 7 dias após a administração do CLDC. Para uso na presente invenção, administração concomitante significa que o CLDC é administrado simultaneamente ou ao mesmo tempo em que a vacina com adjuvante ou sem adjuvante. Dia 0 significa que o CLDC é administrado menos de 24 horas antes da vacina com adjuvante ou sem adjuvante. Dia 1, para uso na presente invenção, significa que o CLDC é administrado entre 24 horas e 48 horas antes da vacina com adjuvante ou sem adjuvante. Cada um dos dias seguintes até o dia 7 são medidos como incrementos de 24 horas a partir do momento em que o CLDC é administrado.

[0044] De preferência, a vacina é administrada concomitantemente ao CLDC, dentro de horas após ou dentro de 1 a 3 dias. Com a máxima preferência, a vacina é administrada concomitantemente ou dentro de 36 horas após a administração do CLDC.

[0045] Modalidades adicionais incluem métodos em que a vacina é administrada para o tratamento de doenças autoimunes, câncer, inflamação alérgica ou doenças infecciosas. Algumas modalidades incluirão métodos nos quais a dita vacina é administrada para a prevenção e tratamento de cânceres de pulmão primários, doenças pulmonares metastáticas, asma alérgica e doenças virais

[0046] Modalidades adicionais incluem métodos nos quais a vacina compreende um vírus influenza A inativado, uma vacina trivalente de influenza inativada, uma vacina de influenza fragmentada, uma proteína glicosilada, uma vacina de hepatite B, ou um lipopolissacarídeo.

[0047] Quando a vacina compreende um vírus influenza A inativado, um vírus preferencial é HKx31. Quando a vacina contém uma vacina trivalente de influenza, uma vacina preferencial é a vacina trivalente ajustada periodicamente Fluzone® ou uma equivalente. Quando a vacina compreende uma proteína glicosilada é preferencial que seja a vacina de proteína glicosilada usada para prevenir ou tratar Staphylococcus aureus resistente à metacilina (MRSA). Uma proteína glicosilada preferencial é a proteína A1s3p-N. Quando a vacina compreende uma vacina de influenza fragmentada, uma vacina de influenza fragmentada preferencial é a vacina de H5N1 fragmentada. Quando a vacina compreende um antígeno de superfície de hepatite B uma vacina preferencial é a ENGERIX-B ou equivalente. Quando a vacina compreende um lipopolissacarídeo, um polissacarídeo glicosilado é preferencial. Adicionalmente, polissacarídeos preferenciais incluem um polissacarídeo de Francisella e um polissacarídeo de Francisella tularemia LVS.

[0048] Outra modalidade contemplada é um método de tratar um mamífero, peixe ou pássaro com uma condição de doença através da geração de uma resposta imune antígeno-específica intensificada no dito mamífero, peixe ou pássaro através da estimulação da resposta imune por administrar uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC); e administrar uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante. A administração do CLDC é tipicamente, através de uma via intravenosa, intraperitoneal, inalatória ou in ovo; e a vacina é, tipicamente, administrada através de uma via intravenosa, subcutânea, intramuscular, intranasal ou in ovo, concomitantemente ao dito complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), ou 0 a 7 dias após o dito complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC). Modalidades preferenciais administram o CLDC intravenosamente e a vacina por via IM ou SC para mamíferos, e incluem administração in ovo para o CLDC e para a vacina em peixes ou pássaros.

[0049] As condições de doença contempladas para tratamento e/ou prevenção na presente invenção podem ser selecionadas a partir de doenças autoimunes, câncer, inflamação alérgica e doenças infecciosas. Modalidades preferenciais são direcionadas para a prevenção e tratamento de cânceres de pulmão primários,doenças pulmonares metastáticas, asma alérgica e doenças virais

[0050] Outra modalidade apresenta um método para gerar uma resposta imune antígeno-específica intensificada em um mamífero em que uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) é administrada intravenosamente a uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante é administrada intramuscularmente ou subcutaneamente, concomitantemente ou 0 a 7 dias após a dita administração do CLDC.

[0051] A geração de uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro pode ser um tratamento eficaz para uma ampla variedade de transtornos médicos, e, em particular, para câncer, inflamação alérgica e/ou doenças infecciosas. Para uso na presente invenção, o termo "gerar" pode ser usado de maneira intercambiável com os termos "ativar", "estimular", "criar" ou "regular positivamente". De acordo com a presente invenção, "gerar uma resposta imune" em um mamífero, peixe ou pássaro refere-se, especificamente, ao controle ou influência sobre a atividade da resposta imune, e pode incluir ativar uma resposta imune, regular positivamente uma resposta imune, intensificar uma resposta imune e/ou alterar uma resposta imune (como pela geração de um tipo de resposta imune que, por sua vez, altera o tipo prevalente de resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro a partir de um que é nocivo ou ineficaz para um que é benéfico ou protetor). Por exemplo, a geração de uma resposta do tipo Th1 em um mamífero, peixe ou pássaro que está sendo submetido a uma resposta do tipo Th2, ou vice versa, pode mudar o efeito geral da resposta imune de nociva para benéfica. Gerar uma resposta imune que altera a resposta imune geral em um mamífero, peixe ou pássaro pode ser particularmente eficaz no tratamento de inflamação alérgica, infecções por micobactérias, ou infecções por parasitas. De acordo com a presente invenção, uma doença caracterizada por uma resposta imune do tipo Th2 (alternativamente chamada de uma resposta imune Th2), pode ser caracterizada como uma doença que está associada com a ativação predominante de um subconjunto de linfócitos T auxiliares conhecidos na técnica como linfócitos T do tipo Th2 (ou linfócitos Th2), em comparação com a ativação linfócitos T do tipo Th1 (ou linfócitos Th1). De acordo com a presente invenção, os linfócitos T do tipo Th2 podem ser caracterizados por sua produção de uma ou mais citocinas, coletivamente conhecidas como citocinas do tipo Th2. Para uso na presente invenção, as citocinas do tipo Th2 incluem interleucina-4 (IL-4), interleucina-5 (IL-5), interleucina-6 (IL-6), interleucina-9 (IL-9), interleucina-10 (IL-10), interleucina-13 (IL-13) e interleucina-15 (IL-15). Em contrapartida, os linfócitos do tipo Th1 produzem citocinas que incluem IL-12 e IFNy. Alternativamente, uma resposta imune do tipo Th2 pode, algumas vezes, ser caracterizada pela produção predominante de isotipos de anticorpo que incluem lgG1 (cujo equivalente humano aproximado é lgG4) e IgE, enquanto que uma resposta imune do tipo Th1 pode, algumas vezes, ser caracterizada pela produção de um isotipo de anticorpo lgG2a ou lgG3 (cujo equivalente humano aproximado é lgG1, lgG2 ou lgG3).

[0052] Mais especificamente, uma composição terapêutica aqui descrita, quando administrada a um mamífero, peixe ou pássaro pelo método da presente invenção, produz, de preferência, um resultado que pode incluir alívio da doença, eliminação da doença, redução de um tumor ou lesão associada à doença, eliminação de um tumor ou lesão associada à doença, prevenção de uma doença secundária resultante da ocorrência de uma doença primária (por exemplo, câncer metastático resultante de um câncer primário) prevenção da doença, e estimulação de imunidade de célula efetora contra a doença.

[0053] Lipossomos adequados para uso com a presente invenção incluem qualquer lipossomo. Informações adicionais referentes aos lipossomos e a fazer uso do CLDC usado na presente invenção são descritas na patente US No. 6,693,086 e está aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.

[0054] Os lipossomos preferenciais da presente invenção incluem os lipossomos comumente usados, por exemplo, em métodos de aplicação de gene conhecidos dos versados na técnica. Os veículos para aplicação de lipossomo preferenciais compreendem lipídios de vesícula multilamelar (MLV) e lipídios extrudados. Os métodos para a preparações de MLV's são bem conhecidos na técnica. De acordo com a presente invenção, "lipídios extrudados" são lipídios que são preparados de maneira similar aos lipídios de MLV, mas que são subsequentemente extrudados através de filtros de tamanho decrescente, conforme descrito em Templeton et al., 1997, Nature Biotech., 15:647-652, que é aqui incorporado, por referência na sua totalidade. Os veículos para aplicação de lipossomo mais preferenciais compreendem lipossomos que tem uma composição de lipídio policatiônico (isto é, lipossomos catiônicos) e/ou lipossomos que tem um esqueleto de colesterol conjugado a polietileno glicol. As composições de lipossomo catiônico preferenciais incluem, mas não se limitam a DOTMA e colesterol, DOTAP e colesterol, DOTIM e colesterol, e DDAB e colesterol. Uma composição de lipossomo da máxima preferência para uso como um veículo de aplicação no método da presente invenção inclui DOTIM e colesterol.

[0055] Em uma modalidade da presente invenção, a dose terapêutica do complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) pode ser substituída por qualquer ligante de receptor de reconhecimento pretendido para gerar uma resposta imune sistêmica.

[0056] A complexação de um lipossomo com uma molécula de ácido nucleico da presente invenção pode ser obtida com o uso de métodos padrão na técnica. De acordo com a presente invenção, um complexo de lipídio catiônico-DNA também é chamado aqui de CLDC, e um complexo de lipídio catiônico RNA também é chamado aqui de CLRC. Uma concentração adequada de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção para ser adicionada a um lipossomo inclui uma concentração eficaz para aplicar uma quantidade suficiente de molécula de ácido nucleico no mamífero, peixe ou pássaro tal que seja criada uma resposta imune sistêmica. Quando a molécula de ácido nucleico codifica um imunógeno ou uma citocina, uma concentração adequada da molécula de ácido nucleico para adicionar a um lipossomo inclui uma concentração eficaz para liberar uma quantidade suficiente da molécula de ácido nucleico em uma célula de modo que a célula possa produzir proteína de imunógeno e/ou citocina suficiente para regular a imunidade de células efetoras de uma forma desejada. De preferência, de cerca de 0,1 μg a cerca de 10 μg de molécula de ácido nucleico da presente invenção é combinado com cerca de 8 nmol de lipossomos, com mais preferência de cerca de 0,5 μg a cerca de 5 μg de molécula de ácido nucleico é combinado com cerca de 8 nmol de lipossomos, e com mais preferência ainda cerca de 1,0 μg de molécula de ácido nucleico é combinado com cerca de 8 nmol de lipossomos. Em uma modalidade, a razão entre os ácidos nucleicos e os lipídios (μg de ácido nucleico: nmol de lipídios) em uma composição da presente invenção é, de preferência, pelo menos cerca de 1:1 ácido nucleico:lipídio, em peso (isto é, 1 μg de ácido nucleico: 1 mmol de lipídio) e, com mais preferência, pelo menos cerca de 1:5, e com mais preferência pelo menos cerca de 1:10, e, com mais preferência ainda, pelo menos cerca de 1:20. As razões expressas aqui são com base na quantidade de lipídio catiônico na composição, e não na quantidade total de lipídio na composição. Em outra modalidade, a razão entre os ácidos nucleicos e os lipídios em uma composição da presente invenção é, de preferência, de cerca de 1:1 a cerca de 1:64 ácido nucleico:lipídio, em peso; e, com mais preferência, de cerca de 1:5 a cerca de 1:50 ácido nucleico:lipídio, em peso; e, com mais preferência ainda, de cerca de 1:10 a cerca de 1:40 ácido nucleico:lipídio, em peso; e, com mais preferência ainda, de cerca de 1:15 a cerca de 1:30 ácido nucleico:lipídio, em peso. Outra razão particularmente preferencial de ácido nucleico:lipídio é de cerca de 1:8 a 1:16, com 1:8 a 1:32 sendo mais preferencial. Tipicamente, enquanto vias de administração não-sistêmicas de ácido nucleico (isto é, intramuscular, intratrecal, intradérmica) usariam uma razão de cerca de 1:1 a cerca de 1:3, as vias de administração sistêmicas de acordo com a presente invenção podem usar muito menos ácido nucleico em comparação ao lipídio e obter resultados equivalentes ou melhores do que os as vias não-sistêmicas. Além disso, composições pretendidas para terapia gênica/substituição de gene, mesmo quando administradas por administração intravenosa, usam tipicamente mais ácido nucleico (por exemplo, de 6:1 a 1:10, com 1:10 sendo a menor quantidade de DNA usado) em comparação à composição e método para ativação imune sistêmica da presente invenção.

[0057] Em outra modalidade da presente invenção, uma composição terapêutica compreende, adicionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável. Para uso na presente invenção, um excipiente farmaceuticamente aceitável refere-se a qualquer substância adequada para aplicar uma composição terapêutica útil no método da presente invenção a um local adequado in vivo. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis preferenciais são capazes de manter uma molécula de ácido nucleico da presente invenção em uma forma que, pela chegada da molécula de ácido nucleico a uma célula, a molécula de ácido nucleico é capaz de entrar na célula e ser expressa pela célula caso a molécula de ácido nucleico codifique uma proteína a ser expressa. Os excipientes adequados da presente invenção incluem excipientes ou fórmulas que transportam, mas não direcionam uma molécula de ácido nucleico especificamente para uma célula (também chamada aqui de veículos não-direcionadores). Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a água, solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, soluções contendo soro, solução de Hank, outras soluções aquosas fisiologicamente balanceadas, óleos, ésteres e glicóis. Os veículos aquosos podem conter substâncias auxiliares adequadas necessárias para se aproximar às condições fisiológicas do receptor, por exemplo, por acentuar a estabilidade química e isotonicidade. Os excipientes particularmente preferenciais incluem diluentes não-iônicos, com um tampão não-iônico preferencial sendo 5% de dextrose em água (DW5).

[0058] Substâncias auxiliares adequadas incluem, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, lactato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, e outras substâncias usadas para produzir tampão de fosfato, tampão Tris, e tampão de bicarbonato. As substâncias auxiliares podem também incluir conservantes, como timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool de benzol. As composições terapêuticas da presente invenção podem ser esterilizadas por métodos convencionais e/ou liofilizadas.

[0059] De acordo com a presente invenção, um protocolo de administração eficaz (isto é, administrar uma composição terapêutica de uma forma eficaz) compreende parâmetros de dose e modos de administração adequados que resultem na geração de respostas imunes em um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma doença, de preferência, para que o mamífero, peixe ou pássaro seja protegido da doença. Os parâmetros de dose eficaz podem ser determinados com o uso de métodos padrão na técnica para uma doença particular. Estes métodos incluem, por exemplo, a determinação das taxas de sobrevida, efeitos colaterais (isto é, toxicidade) e progressão ou regressão da doença. Em particular, a eficácia dos parâmetros de dose de uma composição terapêutica da presente invenção ao tratar câncer pode ser determinada pela avaliação das taxas de resposta. Estas taxas de resposta referem-se à porcentagem dos pacientes tratados em uma população de pacientes que respondem com remissão parcial ou completa. A remissão pode ser determinada, por exemplo, por medir o tamanho do tumor ou um exame microscópico para a presença de células de câncer em uma amostra de tecido.

[0060] De acordo com a presente invenção, um tamanho de dose única adequado é uma dose que é capaz de gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro com uma doença quando administrada uma ou mais vezes ao longo de um período de tempo adequado. As doses podem variar dependendo da doença que está sendo tratada. No tratamento de câncer uma dose única adequada pode ser dependente de se o câncer que está sendo tratado é um tumor primário ou uma forma metastática de câncer. As doses de uma composição terapêutica da presente invenção adequadas para uso com técnicas de administração intravenosa ou intraperitoneal podem ser usadas por um versado na técnica para determinar os tamanhos de dose única apropriados para administração sistêmica com base no tamanho de um mamífero, peixe ou pássaro.

[0061] Em uma modalidade preferencial, uma dose única adequada de um complexo de ácido nucleico:lipossomo da presente invenção é de cerca de 0,1 μg a cerca de 100 μg por kg de peso corporal do mamífero, peixe ou pássaro ao qual o complexo está sendo administrado. Em outra modalidade, uma dose única adequada é de cerca de 1 μg a cerca de 10 μg por kg de peso corporal. Em outra modalidade, uma dose única adequada de complexo de ácido nucleico:lipídio é de pelo menos cerca de 0,1 μg de ácido nucleico para o mamífero, peixe ou pássaro , com mais preferência pelo menos cerca de 11g de ácido nucleico, com mais preferência ainda pelo menos cerca de 10 μg de ácido nucleico, com mais preferência ainda pelo menos cerca de 50 μg de ácido nucleico, e, com mais preferência ainda, pelo menos cerca de 100 μg de ácido nucleico para o mamífero, peixe ou pássaro.

[0062] De preferência, quando o complexo de ácido nucleico:lipossomo da presente invenção contém uma molécula de ácido nucleico que deve ser expressa no mamífero, peixe ou pássaro, uma dose única adequada de um complexo de ácido nucleico:lipossomo da presente invenção resulta em pelo menos cerca de 1 μg de proteína expressa por mg de proteína tecidual total por μg de ácido nucleico aplicado. Com mais preferência, uma dose única adequada de um complexo de ácido nucleico:lipossomo da presente invenção é uma dose que resulta em pelo menos cerca de 10 μg de proteína expressa por mg de proteína tecidual total por μg de ácido nucleico aplicado; e, com mais preferência ainda, pelo menos cerca de 50 μg de proteína expressa por mg de proteína tecidual total por μg de ácido nucleico aplicado; e, com a máxima preferência, pelo menos cerca de 100 μg de proteína expressa por mg de proteína tecidual total por μg de ácido nucleico aplicado. Quando a via de aplicação de um complexo de ácido nucleico:lipídio da presente invenção é intraperitoneal, uma dose única adequada de um complexo de ácido nucleico:lipossomo da presente invenção é uma dose que resulta em no mínimo 1 fg de proteína expressa por mg de proteína tecidual total por μg de ácido nucleico aplicado, com as quantidades acima sendo as mais preferenciais.

[0063] Uma dose única adequada de uma composição terapêutica da presente invenção para gerar uma resposta imune não-antigênica específica sistêmica em um mamífero, peixe ou pássaro é uma quantidade suficiente de uma molécula de ácido nucleico complexada a um veículo para aplicação de lipossomo, quando administrada intravenosamente ou intraperitonealmente, para gerar uma resposta imune celular e/ou humoral in vivo em um mamífero, peixe ou pássaro, em comparação a um mamífero, peixe ou pássaro que não foi administrado com a composição terapêutica da presente invenção (isto é, um mamífero, peixe ou pássaro de controle). As dosagens preferenciais das moléculas de ácido nucleico a serem incluídas em um complexo de ácido nucleico:lipídio da presente invenção foram discutidas acima.

[0064] Uma dose única adequada de uma composição terapêutica para gerar uma resposta imune contra um tumor é uma quantidade suficiente de uma molécula recombinante que codifica um antígeno tumoral, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina, para reduzir e, de preferência, eliminar o tumor após lipofecção das moléculas recombinantes nas células do tecido do mamífero, peixe ou pássaro que tem câncer.

[0065] De acordo com a presente invenção, uma dose única de uma composição terapêutica útil para gerar uma resposta imune contra uma doença infecciosa e/ou contra uma lesão associada com tal doença, que compreende uma molécula recombinante que codifica um patógeno, combinada com lipossomos, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina com lipossomos, é substancialmente similar às doses usadas para tratar um tumor (conforme descrito em detalhes acima). De maneira similar, uma dose única de uma composição terapêutica útil para gerar uma resposta imune contra um alérgeno, que compreende uma molécula recombinante que codifica um alérgeno, combinada com lipossomos, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina com lipossomos, é substancialmente similar às doses usadas para tratar um tumor.

[0066] Será óbvio para um versado na técnica que o número de doses administradas a um mamífero, peixe ou pássaro é dependente da extensão da doença e da resposta do paciente individual ao tratamento. Por exemplo, um tumor grande pode exigir mais doses do que um tumor menor. Em alguns casos, entretanto, um paciente que tem um tumor grande pode exigir menos doses do que um paciente com um tumor menor, caso o paciente com o tumor grande responda de forma mais favorável à composição terapêutica do que o paciente com o tumor menor. Desta forma, está dentro do escopo da presente invenção que um número adequado de doses inclui qualquer quantidade necessária para tratar uma dada doença.

[0067] Deve ser observado que o método da presente invenção difere, adicionalmente, de protocolos de terapia gênica/reposição gênica descritos anteriormente, porque o tempo entre a administração e o reforço do complexo de ácido nucleico:lipídio é significativamente mais longo que o protocolo de administração típico para terapia gênica/reposição gênica. Por exemplo, a geração de uma resposta imune com o uso das composições e métodos da presente invenção inclui, tipicamente, uma administração inicial da composição terapêutica, seguida de imunizações de reforço 3 a 4 semanas após a administração inicial, opcionalmente seguida de imunizações de reforço subsequentes a cada 3 a 4 semanas após o primeiro reforço, conforme necessário para tratar uma doença de acordo com a presente invenção. Em contrapartida, os protocolos de terapia gênica/reposição gênica exigem, tipicamente, uma administração mais frequente de um ácido nucleico de modo a obter expressão gênica suficiente para gerar ou repor a função do gene desejado (por exemplo, administrações semanais).

[0068] Um número preferencial de doses de uma composição terapêutica que compreende uma molécula recombinante que codifica um antígeno tumoral, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina, complexada com um veículo para aplicação de lipossomo, para gerar uma resposta imune contra um câncer metastático, é de cerca de 2 a cerca de 10 administrações por paciente, com mais preferência de cerca de 3 a cerca de 8 administrações por paciente, e, com mais preferência ainda, de cerca de 3 a cerca de 7 administrações por paciente. De preferência, estas administrações são dadas uma vez a cada 3 a 4 semanas, conforme descrito acima, até que os sinais de remissão apareçam, e, então, uma vez por meses até que a doença não exista mais.

[0069] De acordo com a presente invenção, o número de doses de uma composição terapêutica para gerar uma resposta imune contra uma doença infecciosa e/ou uma lesão associada com tal doença, que compreende uma molécula recombinante que codifica um antígeno de patógeno, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina, complexada com um veículo para aplicação de lipossomo, é substancialmente similar ao número de doses usado para tratar um tumor (conforme descrito em detalhes acima).

[0070] Uma composição terapêutica é administrada a um mamífero, peixe ou pássaro de uma forma a gerar uma resposta imune não-antigênica específica sistêmica em um mamífero, peixe ou pássaro, e quando a molécula de ácido nucleico na composição codifica um imunógeno, para permitir a expressão da molécula recombinante administrada da presente invenção em uma proteína imunogênica (no caso do tumor, antígeno de patógeno ou alérgeno) ou proteína imunorreguladora (no caso da citocina) no mamífero, peixe ou pássaro a ser tratado para a doença. De acordo com o método da presente invenção, uma composição terapêutica é administrada por injeção intravenosa ou intraperitoneal e, de preferência, intravenosamente. Injeções intravenosas podem ser realizadas com o uso de métodos padrão na técnica. De acordo com o método da presente invenção, a administração dos complexos de ácido nucleico:lipídio pode ser em qualquer local no mamífero, peixe ou pássaro em que a administração sistêmica (isto é, administração intravenosa ou intraperitoneal) é possível, particularmente quando o veículo para aplicação de lipossomo compreende lipossomos catiônicos. A administração em qualquer local em um mamífero, peixe ou pássaro gerará uma resposta imune potente quando a administração intravenosa ou intraperitoneal for usada e, particularmente, quando a administração intravenosa for usada. Locais adequados para administração incluem locais nos quais o sítio alvo para ativação imune não é restrito ao primeiro órgão que tem um leito capilar próximo ao local de administração (isto é, as composições podem ser administradas em um local de administração que é distai ao local alvo da imunização). Em outras palavras, por exemplo, administração intravenosa de uma composição da presente invenção que é usada para tratar um tumor renal em um mamífero, peixe ou pássaro pode ser administrada intravenosamente em qualquer local no mamífero, peixe ou pássaro e ainda irá gerar uma forte resposta imune antitumoral e será eficaz na redução ou eliminação do tumor, ainda que os rins não sejam o primeiro órgão que tem um leito capilar próximo do local de administração. Quando um efeito antitumoral específico é desejado (isto é, a redução ou eliminação de um tumor) e a via de administração é intravenosa, o local de administração novamente pode ser qualquer local no qual uma composição pode ser administrada intravenosamente, independentemente da localização do tumor em relação ao local de administração. Para administração intraperitoneal em relação à eficácia antitumoral (mas não ativação imune/imunização), é preferível usar este modo de administração quando o tumor é na cavidade peritoneal, ou quando o tumor é um tumor pequeno.

[0071] No método da presente invenção, as composições terapêuticas podem ser administradas a qualquer membro da classe de vertebrados, Mammalia, incluindo, sem limitação, primatas, roedores, animais criados em fazenda e animais de estimação. Animais criados em fazenda incluem mamíferos que serão consumidos ou que produzem produtos úteis (por exemplo, ovelha para produção de lã). Os mamíferos preferenciais para proteger incluem seres humanos, cachorros, gatos, camundongos, coelhos, ratos, ovelhas, gado, cavalos e porcos, com seres humanos e cachorros sendo particularmente preferenciais, e seres humanos sendo da máxima preferência. Embora uma composição terapêutica da presente invenção seja eficaz para gerar uma resposta imune contra uma doença em espécies naturais de mamíferos, a composição é particularmente útil para gerar uma resposta imune em espécies não consanguíneas de mamíferos.

[0072] Adicionalmente, para a presente invenção os métodos e composições terapêuticas podem ser usadas para tratar pássaro e peixe, e o mais particularmente, aves domésticas e/ou pássaros selvagens que podem ser portadores de doenças infecciosas como a gripe aviária.

[0073] Conforme discutido acima, uma composição terapêutica da presente invenção administrada pelo presente método é útil para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma variedade de doenças, e particularmente, câncer, inflamação alérgica e doenças infecciosas. Uma composição terapêutica da presente invenção, quando aplicada intravenosamente ou intraperitonealmente, é vantajosa para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem câncer em que a composição supera os mecanismos pelos quais as células do câncer evitam a eliminação imune (isto é, pelos quais as células de câncer evitam a resposta imune efetuada pelo mamífero, peixe ou pássaro em resposta à doença). As células do câncer podem evitar a eliminação imune, por exemplo, por ser apenas levemente imunogênicas, por modular antígenos de superfície celular e induzir supressão imune. Uma composição terapêutica adequada para uso na geração de uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem câncer compreende um complexo de ácido nucleico:lipídio da presente invenção, em que o ácido nucleico não é operativamente ligado a uma sequência de controle de transcrição, ou, com mais preferência, codifica uma molécula recombinante que codifica um antígeno tumoral operativamente ligada a uma sequência de controle de transcrição, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina (separadamente ou juntas). Uma composição terapêutica da presente invenção, gera uma resposta imunessistêmica inespecífica no mamífero, peixe ou pássaro e, mediante entrada em células direcionadas do fígado, baço ou pulmonares, leva à produção de antígeno tumoral (e, em modalidades particulares, proteína de citocina) que ativam células T citotóxicas, células natural killer, células T auxiliares e macrófagos. Esta ativação celular superar a de outro modo relativa falta de resposta imune às células de câncer, levando à destruição destas células.

[0074] Uma composição terapêutica da presente invenção que inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno tumoral é útil para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem câncer, incluindo tumores e formas metastáticas de câncer. O tratamento com a composição terapêutica supera as desvantagens dos tratamentos tradicionais para cânceres metastáticos. Por exemplo, as composições da presente invenção podem atingir células de câncer metastático dispersas que não podem ser tratadas com o uso de métodos cirúrgicos. Além disso, a administração destas composições não resulta nos efeitos colaterais nocivos causados pela quimioterapia e radioterapia, e elas podem ser administradas repetidamente. Além disso, as composições administradas pelo método da presente invenção atingem, tipicamente, as vesículas dos tumores, para que a expressão de um antígeno tumoral ou citocina dentro da célula tumoral em si não seja necessária para fornecer eficácia contra o tumor. De fato, uma vantagem geral da presente invenção é que a liberação da composição em si gera uma resposta imune poderosa e a expressão da molécula de ácido nucleico pelo menos nas adjacências do sítio alvo (no local ou adjacente a ele) fornece ativação imune eficaz e eficácia contra o alvo.

[0075] Uma composição terapêutica da presente invenção que inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica um antígeno tumoral é usada, de preferência, para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem um câncer que inclui, mas não se limita a, melanomas, carcinoma de célula escamosa, cânceres de mama, carcinomas de cabeça e pescoço, carcinomas de tiroide, sarcomas de tecidos moles, sarcomas ósseos, cânceres testiculares, cânceres prostáticos, câncer de ovário, câncer de bexiga, câncer de pele, câncer cerebral, angiosarcomas, hemangiosarcomas, tumores de mastócitos, cânceres hepáticos primários, cânceres pulmão, cânceres pancreáticos, cânceres gastrointestinais, carcinomas de célula renal, neoplasias hematopoiéticas, e cânceres metastáticos dos mesmos. Os cânceres particularmente preferenciais para tratar com uma composição terapêutica da presente invenção incluem cânceres de pulmão primários e cânceres pulmonares metastáticos. Uma composição terapêutica da presente invenção é útil para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro para tratar tumores que podem se formar nestes cânceres, incluindo tumores malignos e benignos. De preferência, a expressão do antígeno tumoral em um tecido pulmonar de um mamífero, peixe ou pássaro que tem câncer (isto é, por aplicação intravenosa) produz um resultado selecionado a partir do grupo de alívio do câncer, redução de um tumor associado ao câncer, eliminação de um tumor associado ao câncer, prevenção de câncer metastático, prevenção do câncer e estimulação de imunidade de células efetoras contra o câncer.

[0076] Uma composição terapêutica da presente invenção que inclui uma molécula de ácido nucleico que codifica um imunógeno de um patógeno de doença infecciosa é vantajosa para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem doenças infecciosas que respondem a uma resposta imune. Uma doença infecciosa que responde a uma resposta imune é uma doença causada por um patógeno no qual a geração de uma resposta imune contra o patógeno pode resultar em um efeito profilático ou terapêutico, conforme anteriormente descrito na presente invenção. Este método fornece uma terapia direcionada em longo prazo para lesões primárias (por exemplo, granulomas) que resultam na propagação de um patógeno. Para uso na presente invenção, o termo "lesão" refere-se a uma lesão formada pela infecção de um mamífero, peixe ou pássaro com um patógeno. Uma composição terapêutica para uso na geração de uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma doença infecciosa compreende uma molécula recombinante que codifica um antígeno de patógeno, sozinha ou em combinação com uma molécula recombinante que codifica uma citocina da presente invenção, combinada com um veículo para aplicação de lipossomo. De forma similar ao mecanismo descrito acima para o tratamento de câncer, a geração de uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro, que tem uma doença infecciosa, com imunógenos dos patógenos de doenças infecciosas, com ou sem citocinas, pode resultar em atividade aumentada de células T, células natural killer, e macrófagos, que superam a relativa falta de resposta imune a uma lesão formada por um patógeno. De preferência, a expressão do imunógeno em um tecido de um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma doença infecciosa, produz um resultado que inclui alívio da doença, regressão de lesões estabelecidas associadas com a doença, alívio dos sintomas da doença, imunização contra a doença, e estimulação de imunidade de células efetoras contra a doença.

[0077] Uma composição terapêutica da presente invenção é particularmente útil para gerar uma resposta imune em um mamífero, peixe ou pássaro que tem uma doença infecciosa causada por patógenos, incluindo, mas não se limitando a, bactérias (incluindo bactérias intracelulares que residem nas células hospedeiras), vírus, parasitas (incluindo parasitas internos), fungos (incluindo fungos patogênicos) e endoparasitas. As doenças infecciosas preferenciais para tratar com uma composição terapêutica da presente invenção incluem doenças infecciosas crônicas e, com mais preferência, doenças infecciosas pulmonares, como tuberculose. As doenças infecciosas particularmente preferenciais para tratar com uma composição terapêutica da presente invenção incluem vírus da imunodeficiência humana (HIV), Mycobacterium tuberculosis, herpesvirus, papilomavírus e Candida.

[0078] Em uma modalidade, uma doença infecciosa para ser tratada com uma composição terapêutica da presente invenção é uma doença viral e, de preferência, é uma doença viral causada por um vírus que inclui, vírus da imunodeficiência humana, e vírus da imunodeficiência de felino.

[0079] As doenças preferenciais associadas com inflamação alérgica que são preferíveis para tratar com o uso do método e composição da presente invenção incluem, doenças alérgicas das vias aéreas, rinite alérgica, conjuntivite alérgica e alergia alimentar.

[0080] Um veículo para aplicação de lipossomo da presente invenção pode ser modificado para atingir um local particular em um mamífero, peixe ou pássaro, direcionado assim e fazendo uso de uma molécula de ácido nucleico da presente invenção naquele local. Modificações adequadas incluem manipulação da fórmula química da porção lipídica do veículo de aplicação. A manipulação da fórmula química da porção lipídica do veículo de aplicação pode gerar o direcionamento extracelular ou intracelular do veículo de aplicação. Por exemplo, um produto químico pode ser adicionado à fórmula lipídica de um lipossomo, o qual altera a carga da bicamada lipídica do lipossomo para que o lipossomo funda com células particulares que tem características de carga particulares. Outros mecanismos de direcionamento, como direcionamento pela adição de moléculas de direcionamento exógenas a um lipossomo (isto é, anticorpos), não são um componente necessário do veículo para aplicação de lipossomo da presente invenção, uma vez que a ativação imune eficaz nos órgãos imunologicamente ativos já é fornecida pela composição e via de aplicação das presentes composições sem o auxílio de mecanismos de direcionamento adicionais. Adicionalmente, para eficácia, a presente invenção não exige que uma proteína codificada por uma dada molécula de ácido nucleico seja expressa dentro da célula-alvo (por exemplo, célula tumoral, patógeno, etc.). As composições e método da presente invenção são eficazes quando as proteínas são expressas na adjacência do (isto é, próximo do) sítio alvo, incluindo quando as proteínas são expressas por célula não-alvo.

[0081] Um veículo para aplicação de lipossomo preferencial da presente invenção tem entre cerca de 100 e 500 nanômetros (nm), com mais preferência entre cerca de 150 e 450 nm e com mais preferência ainda entre cerca de 200 e 400 nm de in diâmetro.

Preparação de complexos de lipídio catiônico-DNA (CLDC)

[0082] Os lipossomos catiônicos usados nos experimentos a seguir (exceto onde indicado em contrário) consistiam em DOTAP (1,2 dioleoil-3-trimetilamoniopropano) e colesterol misturados em uma razão molar 1:1, secos em tubos de fundo redondo e, então, reidratados em solução de dextrose a 5% (D5W) por aquecimento a 50 °C durante 6 horas, conforme descrito anteriormente (Solodin et al., 1995, Biochemistry 34:13537-13544, aqui incorporado na íntegra, a título de referência). Outros lipídios (por exemplo, DOTMA) foram preparados de maneira similar para alguns experimentos, conforme indicado. Este procedimento resulta na formação de lipossomos que compreendem vesículas multilamelares (MLV), que os presentes inventores observaram fornecer ótima eficiência de transfecção quando comparadas com vesículas unilamelares pequenas (SUV). A produção de MLVs e "lipídios extrudados" relacionados também é descrita em Liu et al., 1997, Nature Biotech. 15:167-173; e Templeton et al., 1997, Nature Biotech. 15:647-652; ambos os quais estão aqui incorporados a título de referência nas suas totalidades. DNA plasmidial (pCR3.1, Invitrogen) foi purificado a partir de E. coli conforme descrito anteriormente, com o uso de lise alcalina modificada e precipitação com polietileno glicol (Liu et al., 1997, supra). O DNA para injeção foi ressuspenso em água destilada. DNA eucariótico (testículo de salmão e timo de bezerro) foi adquirido junto à Sigma Chemical Company. Para muitos dos experimentos relatados aqui, o DNA plasmidial não continha um inserto de gene (exceto onde especificado em contrário) e é, desta forma, chamado de DNA "não-codificante" ou "vetor vazio".

[0083] Os complexos de lipídio catiônico-DNA (CLDC) usados nos experimentos abaixo foram preparados por adicionar gentilmente DNA a uma solução de lipídio em solução de dextrose a 5% (D5W) à temperatura ambiente e, então, pipetar gentilmente para cima e para baixo várias vezes para garantir mistura apropriada. A proporção de DNA:lipídio foi de 1:8 (1,0 μg de DNA para 8 nmol de lipídio). Os CLDC foram usados dentro de 30 a 60 minutos após a preparação. Para preparar vesículas unilamelares pequenas (SUV) usadas em alguns experimentos (conforme indicado), os CLDC que foram formados com o uso de lipossomos MLV conforme descrito acima foram submetidos a sonicação durante 5 minutos, conforme descrito anteriormente (Liu et al., 1997, supra).

[0084] Vacinas e estados de doença exemplificadores, mas sem constituir limitação, são apresentados abaixo.

Vacina trivalente de influenza

[0085] A vacina trivalente de influenza que é definida como uma vacina sintética que consiste em três vírus influenza inativados, duas cepas diferentes de influenza tipo A e uma cepa de influenza tipo B. A vacina trivalente de influenza é formulada anualmente, com base nas cepas de influenza projetadas para serem as prevalentes na próxima época de gripe. Um exemplo de uma vacina trivalente de influenza é Fluzone®. Fluzone® é o nome comercial de uma vacina para o vírus influenza, distribuída pela Sanofi Pasteur, EUA. É uma vacina de vírus fragmentado, que é produzida por ruptura química do vírus influenza. Portanto, ela é incapaz de causar gripe. Como aprovado pelo US Food and Drug Administration (FDA), Fluzone® é uma vacina isenta de conservantes administrada em uma dose única por injeção intramuscular. Ela é recomendada para vacinação contra influenza tipo A e B e é regularmente otimizada para várias épocas de gripe.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)

[0086] O Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma bactéria responsável por infecções de difícil tratamento em seres humanos. Pode também ser chamado de Staphylococcus aureus resistente a multiplos fármacos ou Staphylococcus aureus resistente à oxacilina (ORSA). O MRSA é, por definição, uma cepa de Staphylococcus aureus que é resistente a um grande grupo de antibióticos chamados beta-lactamas, que incluem as penicilinas e as cefalosporinas. Novas cepas de MRSA se espalharam rapidamente nos Estados Unidos e se tornaram a causa mais comum de infecções de pele cultivadas entre indivíduos que buscam cuidado médico para estas infecções nas emergências nas cidades. Estas cepas também causam comumente infecções de pele em atletas, presos e detentos, e soldados.

A1s3p-N

[0087] A1s3p-N é uma proteína altamente glicosilada usada como uma vacina fungicida e é derivada da terminação N recombinante da proteína Als3p. Mostrou-se que ela protege camundongos contra a bactéria Staphylococcus aureus e pode ser eficaz no tratamento de cepas de MRSA.

vírus influenza A subtipo H5N1

[0088] O vírus influenza A subtipo H5N1, também conhecida como "gripe aviária," A (H5N1) ou simplesmente H5N1, é um subtipo do vírus da influenza A que pode causar doença em seres humanos e muitas outras espécies de animais. Uma cepa adaptada para aves de H5N1, chamada HPAI A(H5N1) para "vírus influenza de aves do tipo A subtipo H5N1 altamente patogênico", é o agente causados da gripe H5N1, comumente conhecida como "influenza das aves" ou "gripe das aves". Ela é enzoótica em muitas populações de aves, especificamente no sudeste da Ásia. Ela é epizoótica (epidêmica em não-humanos) e panzoótica (afeta animais de muitas espécies, especificamente ao longo de uma grande área), matando dezenas de milhões de aves e estimulando a seleção de centenas de milhões de outras para causar sua disseminação.

[0089] HPAI A(H5N1) é uma doença de aves. Há algumas evidências de transmissão limitada humano-humano do vírus. Um fator de risco para contrair o vírus é o manuseio de aves domésticas infectadas, mas a transmissão do vírus das aves infectadas para seres humanos é ineficiente. Ainda, cerca de 60% dos humanos conhecidamente infectados com a cepa atual asiática de HPAI A(H5N1) morreram por causa da doença, e ο H5N1 pode mutar ou resselecionar em uma cepa capaz de efetuar transmissão eficaz humano-para-humano.

[0090] Devido a alta letalidade e virulência HPAI A(H5N1), sua presença endêmica, seu reservatório de hospedeiros progressivamente maior, e suas mutações significativas existentes, o vírus H5N1 é a maior ameaça pandêmica atual do mundo, e bilhões de dólares estão sendo gastos na pesquisa do H5N1 e preparação para uma potencial pandemia de gripe.

Hepatite B

[0091] A hepatite B é uma doença causada pelo vírus da hepatite B, que infecta o fígado de hominoidae, incluindo seres humanos, e causa uma inflamação chamada hepatite. Originalmente conhecida como "hepatite sérica", a doença causou epidemias em partes da Ásia e África, e é endêmica na China. Cerca de um terço da população mundial, mais de 2 bilhões de pessoas, se infectaram com o vírus da hepatite B. Isto inclui 350 milhões de portadores crônicos do vírus. A transmissão do vírus da hepatite B resulta da exposição a sangue infectado ou fluidos corporais contendo sangue. A infecção pode ser prevenida pela vacinação.

ENGERIX-B

[0092] ENGERIX-B [Vacina de hepatite B (recombinante)] é uma vacina de hepatite B de DNA recombinante não infecciosa desenvolvida e produzida pela GlaxoSmithKline Biologicals. Ela contém antígeno de superfície purificado do vírus obtido por cultivo de células de Saccharomyces cerevisiae geneticamente manipuladas, que transportam o gene do antígeno de superfície do vírus da hepatite B. O antígeno de superfície expresso nas células de Saccharomyces cerevisiae é purificado por várias etapas físico-químicas e formulado como uma suspensão do antígeno adsorvido em hidróxido de alumínio. ENGERIX-B é indicada para imunização contra infecções causada por todos os subtipos conhecidos do vírus da hepatite B. Como a hepatite D (causada pelo vírus delta) não ocorre na ausência de infecção por hepatite B, pode-se esperar que a hepatite D também seja prevenida pela vacinação com ENGERIX-B.

Francisella tularensis

[0093] Francisella tularensis é uma espécie patogênica de bactérias gram-negativas e oi agente causador de tularemia ou ou febre dos coelhos. F. tularensis é capaz de infectar inúmeros mamíferos pequenos como arganazes, coelhos, e ratos silvestres, bem como seres humanos. Apesar disto, nenhum caso de tularemia foi observado sendo iniciado por transmissão humano-humano. Ao contrário, a tularemia é causada pelo contato com animais ou vetores infectados como carrapatos, mosquitos, e moscas do cervo. A infecção com F. tularensis pode ocorrer através de várias vias. A mais comum ocorre através do contato com a pele, gerando uma forma ulceroglandular da doença. A inalação de bactérias - particularmente biovar tularensis, leva a tularemia pneumônica potencialmente letal. Embora as forms pulmonares e ulceroglandulares da tularemia sejam mais comuns, outras vias de inoculação foram descritas e incluem infecção orofaríngea devido ao consumo de alimentos contaminados e infecção pela conjuntiva devido à inoculação no olho.

Exemplos

[0094] Os exemplos do presente pedido pretendem exemplificar os vários aspectos da execução da invenção e não se destinam a limitar a invenção de nenhuma maneira.

Exemplo 1 Um período refratário é observado em resposta a múltiplas dosagens com CLDC através de administração intravenosa, que é terminado em um prazo de 10 a 14 dias.

[0095] Mostrou-se que a administração repetida de CLDC produz um período refratário a uma dose secundária. Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC no dia 0 seguido de uma segunda dose IV de 5μg de CLDC no dia especificado. O soro foi coletado 6 horas após a segunda dose e a ativação imune foi medida por ELISA para lnterferon-γ. Como pode ser visto na figura 1, nos dias 1, 3, e 7 a segunda dose de CLDC resultou em um nível sistêmico inferior de lnterferon-γ. Como também pode ser visto, o interferon-γ sistêmico inferior não foi tão pronunciado nos dias 10 e 14. Desta forma, foi constatado que quando doses IV de CLDC são administradas próximas dentro de 1 a 7 dias da primeira dose de CLDC a resposta de lnterferon-γ é suprimida, mas esta supressão não foi tão pronunciada nos dias 10 e 14.

Exemplo 2 O período refratário a múltiplas dosagens com CLDC através de administração intravenosa tem magnitude dose-dependente.

[0096] Estudos adicionais mostraram que a magnitude do período refratário inicial é dependente da dose (figura 2). Camundongos CD-1 foram administrados intravenosamente com uma a quatro doses crescentes de CLDC no dia 0 seguido de uma segunda dose IV de 10μg no dia 1. A ativação imune inata foi medida por ensaio ELISA para lnterferon-γ sérico 6 horas após a segunda dose. Estes estudos motraram que o período refratário devido ao CLDC tem magnitude, mas não duração, dose-dependente.

Exemplo 3 A administração de uma vacina sem adjuvante contendo um vírus inativado como o antígeno (vírus influenza HKx31) dentro de 1 a 7 dias após a administração IV do CLDC resulta em uma resposta de anticorpo antiviral intensificada.

[0097] Camundongos CD-1 foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC no dia 0 seguido de uma vacinação subcutânea de 5μg de vírus influenza HKx31 inativado pelo calor no dia especificado. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). Conforme mostrado na figura 3, apesar da falta de capacidade de resposta à administração repetida ao CLDC, a administração da vacina de CLDC/HKx31 resultou em um aumento na resposta da vacina anti-HKx31. Além disso, a imunogenicidade intensificada vista nos dias 1, 3 e 7 parece estar inversamente correlacionada com os dados do período refratário discutidos no exemplo 1 e mostrados na figura 1. Portanto, apesar da vacina ser administrada quando os níveis de interferon gama estão suprimidos de acordo com a figura 1 a vacina é surpreendentemente responsiva imunogenicamente apesar de ser administrada durante este período refratário.

Exemplo 4 Vacinação com influenza trivalente A administração de uma vacina purificada (vacina trivalente de influenza - Fluzone®, Sanofi Pasteur) concomitantemente ou dentro de 1 a 7 dias após a administração IV de CLDC resulta em uma resposta de anticorpo antiviral intensificada

[0098] Um grupo de camundongos CD-1 foi administrado intravenosamente com 5μg de CLDC no dia 0 seguido de uma vacinação subcutânea de 5μg de Fluzone® (Sanofi Pasteur) com adjuvante CLDC no dia especificado. Um segundo grupo de camundongos CD-1 foi administrado intravenosamente com 5μg de CLDC no dia 0 seguido de uma vacinação subcutânea de 5μg de Fluzone® (Sanofi Pasteur) sem adjuvante adicional no dia especificado. Um terceiro grupo de controle não recebeu pré-tratamento IV de CLDC, mas foi administrado com uma vacinação subcutânea de Fluzone® com ou sem adjuvante. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por HAI com o uso de Fluzone como o antígeno. Como pode ser visto na figura 4, a resposta imune anti-Fluzone® intensificada foi ampliada aproximadamente 8 vezes mais do que sem tratamento IV com CLDC. Como também pode ser visto, a intensificação da imunogenicidade não foi observada nos camundongos administrados com CLDC através de tratamento IV seguido de Fluzone® sem adjuvante.

Exemplo 5 Pré-tratamento sistêmico com CLDC antes de administrar uma vacina de influenza A sem adjuvante aumenta a velocidade e intensidade da resposta de anticorpos

[0099] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados sistemicamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação subcutânea (SC) de uma vacina de influenza A sem adjuvante no dia seguinte. 5μg de vírus influenza A/HKx31 inativado pelo calor foram administrados um dia após a administração sistêmica de CLDC. O soro foi coletado no dia especificado dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). O soro foi coletado e testado 3, 7,14, e 21 dias após a vacinação. Conforme mostrado na figura 5, uma imunogenicidade aumentada se tornou pronunciada em algum momento entre o dia 7 e o dia 14 para os animais pré-tratados com CLDC. Mas, a imunogenicidade aumentada não ocorreu nos animais de controle até cerca de 14 dias ou após. Além disso, a resposta de imunogenicidade para os controles foi reduzida em todos os pontos de tempo em comparação aos animais pré-tratados com CLDC.

Exemplo 6 A intensificação da vacinação é otimizada com administração IV ocorrendo concomitantemente ou antes da vacinação

[00100] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados sistemicamente com 5μg de CLDC com uma vacinação subcutânea de 5μg de Fluzone + 20μg de CLDC (25μg de vacina trivalente de influenza com adjuvante CLDC) no dia especificado. Os camundongos foram administrados com a vacina trivalente de influenza 7, 3, ou 1 dia antes da administração sistêmica de CLDC ou concomitantemente ou 2 dias após a administração sistêmica de CLDC. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). Conforme mostrado na figura 6, a administração da vacina trivalente de influenza com adjuvante antes da administração sistêmica de CLDC não aumentou a imunogenicidade. Entretanto, a vacinação com a vacina trivalente foi intensificada quando administrada concomitantemente ou após a administração sistêmica de CLDC.

Exemplo 7 Intensificação da vacinação pode ocorrer com várias vias de administração da vacina

[00101] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados sistemicamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação intramuscular (IM) de uma vacina de influenza A sem adjuvante no dia especificado. 5μg de vírus influenza A/HKx31 inativado pelo calor foram administrados sem intervalo/concomitantemente, ou nos dias 1, 3, ou 7. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por uma titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). Conforme mostrado na figura 7, a administração IM da vacina de CLDC/HKx31 resultou em um aumento na resposta da vacina anti-HKx31. Além disso, a imunogenicidade intensificada vista em cada ponto de tempo demonstra que a vacinação IM intensifica a imunogenicidade e combinada com os resultados do exemplo 3 mostrados na figura 3, demonstram que a vacinação é intensificada com administração SC ou IM da vacina quando administrada concomitantemente ou após administração IV sistêmica de CLDC.

Exemplo 8 Estudos das vias de administração do pré-tratamento com CLDC

[00102] Camundongos CD-1 (n=5) foram pré-tratados com uma administração intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) de 20μg de CLDC seguido de uma vacinação SC de uma vacina de influenza A sem adjuvante no dia especificado. 5μg de vírus influenza A/HKx31 inativado pelo calor foram administrados sem intervalo/concomitantemente, ou nos dias 1, 3, ou 7. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por uma titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). Conforme mostrado nas figuras 8a e 8b, nem a administração concomitante SC ou IM nem pré-tratamento com CLDC intensificaram a imunogenicidade. O exemplo a seguir demonstra que a via de administração do CLDC é importante para criar o efeito imunogênico intensificado.

Exemplo 9 O pré-tratamento sistêmico com CLDC intensifica a resposta da vacinação a Staohlococcus aureus resistente à metacilina (MRSA)

[00103] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação intramuscular de 5μg de proteína rA1s3p-N + 20μg de CLDC no dia seguinte. Os animais de controle foram administrados intravenosamente com um volume igual de solução de dextrose a 5% ao invés de CLDC e, então, foram vacinados com uma vacinação intramuscular de 5μg de proteína rA1s3p-N + 20μg de CLDC. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de anticorpo por ELISA, uma EC50 foi calculada com o programa Prism. Como pode ser visto na figura 9, a resposta imune intensificada, conforme medido pela EC50, foi ampliada aproximadamente 6 a 8 vezes mais do que o controle sem tratamento IV com CLDC.

Exemplo 10 O pré-tratamento sistêmico com CLDC intensifica a resposta da vacinação a H5N1 A da "gripe aviária"

[00104] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação intramuscular de 1,5μg H5N1 + 20μg de CLDC no dia seguinte. Os animais de controle foram administrados intravenosamente com um volume igual de solução de dextrose a 5% ao invés de CLDC e, então, foram vacinados com uma vacinação intramuscular de 1,5μg H5N1 + 20μg de CLDC. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de inibição de hemaglutinação (HAI). Como pode ser visto na figura 10, os camundongos mostraram uma melhora de duas vezes sobre os controles e demonstraram, adicionalmente, que a vacina de influenza fragmentada (sazonal ou pandêmica) pode ser intensificada pelo pré-tratamento sistêmico com HLDC.

Exemplo 11 O pré-tratamento sistêmico com CLDC melhora a resposta da vacinação ao antíqeno de superfície de hepatite B.

[00105] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação intramuscular de 2μg de Engerix + 20μg de CLDC no dia seguinte. Os animais de controle foram administrados intravenosamente com um volume igual de solução de dextrose a 5% ao invés de CLDC e, então, foram vacinados com uma vacinação intramuscular de 2μg de Engerix + 20μg de CLDC. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de anticorpo por ELISA, uma EC50 foi calculada com o programa Prism. Como pode ser visto na figura 11, a resposta imune intensificada, conforme medido pela EC50, foi ampliada aproximadamente 6 a 8 vezes mais do que o controle sem tratamento IV com CLDC. A vacina usada foi a vacina de antígeno de superfície de hepatite B Engerix-B produzida pela Merck, que contém um adjuvante de alume. O estudo acima demonstra primeiro, que a administração sistêmica de CLDC pode ser usada para intensificar uma vacina com adjuvante de alume; segundo, que CLDC administrado com a vacina pode ser usado como um adjuvante com vacinas que já possuem adjuvante; e terceiro que a administração sistêmica de CLDC pode ser usada para intensificar a imunogenicidade das vacinas para hepatite.

Exemplo 12 O pré-tratamento sistêmico com CLDC melhora a resposta da vacinação ao polissacarídeo de Francisella tularemia LVS.

[00106] Camundongos CD-1 (n=5) foram administrados intravenosamente com 5μg de CLDC seguido de uma vacinação intramuscular de 5μg de FT-LVS + 20μg de CLDC no dia seguinte. Os animais de controle foram administrados intravenosamente com um volume igual de solução de dextrose a 5% ao invés de CLDC e, então, foram vacinados com uma vacinação intramuscular de 5μg de FT-LVS + 20μg de CLDC. O soro foi coletado 21 dias após a vacinação e a imunogenicidade foi medida por titulação de anticorpo por ELISA, uma EC50 foi calculada com o programa Prism. Como pode ser visto na figura 12, a resposta imune intensificada, conforme medido pela EC50, foi ampliada aproximadamente 6 a 8 vezes mais do que o controle sem tratamento IV com CLDC. A vacina usada foi uma vacina de polissacarídeo de Francisella tularemia LVS, com adjuvante de CLDC. Os resultados da titulação demonstram a capacidade geral do pré-tratamento sistêmico de CLDC intensificar a imunogenicidade de antígenos de sacarídeo e lipopolissacarídeo, e mais especificamente intensificar a imunogenicidade de uma vacina para febre dos coelhos.

[00107] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patente, e publicações, estão aqui incorporadas, por referência nas suas totalidades, quer estivessem anteriormente especificamente incorporadas ou não.

[00108] Embora a invenção tenha sido descrita com relação aos exemplos acima, será compreendido que modificações e variações estão abrangidas dentro do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada apenas pelas reivindicações a seguir.

Claims

Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:
um primeiro administrador para via intra-venosa que compreende uma dose terapêutica de um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC) para um mamífero;
um segundo administrador que compreende uma dose terapêutica de uma vacina com adjuvante ou sem adjuvante para um mamífero; e
um protocolo de instruções.
Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita vacina compreende:
um vírus da influenza A inativado, uma vacina trivalente de influenza inativada, uma vacina de influenza fragmentada, uma proteína glicosilada, uma vacina de hepatite B, ou um lipopolissacarídeo.
Kit, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita vacina com adjuvante compreende um ou mais adjuvantes selecionados do grupo que consiste em um complexo de lipídio catiônico-DNA (CLDC), alume, monofosforil lipídio A (MPL), QS21, ou oligonucleotídeo CpG (CPG-ODN).
Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito vírus da influenza inativado é HKx31; ou a dita vacina de proteína glicosilada é para Staphylococcus aureus resistente à metacilina (MRSA) ou a dita proteína glicosilada é proteína Als3p-N; ou a dita vacina de influenza fragmentada é uma vacina de H5N1 fragmentada; ou o dito lipopolissacarídeo é um polissacarídeo de Francisella ou um polissacarídeo de Francisella tularemia LVS.
Kit, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a dita vacina compreende um antígeno de superfície de hepatite B, opcionalmente, com adjuvantes CLDC e alume.