BRPI0913612B1 - composição injetável de vacina, método para obter a composição e uso da composição - Google Patents

Abstract

composição, método para obter composição e uso de composição. a presente invenção fornece uma composição que compreende: um antígeno; lipossomos; um polinucleotídeo polil: c e um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba. também são fornecidos processos para a obtenção e a utilização das composições.

Description

Referência Cruzada aos Pedidos de Patente Relacionados

[0001] Este pedido de patente reivindica o privilégio e a prioridade do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos N° 61/059.043, depositado em 5 de junho de 2008.

Campo da Invenção

[0002] O presente pedido de patente refere-se a composições que compreendem lipossomos, um antígeno, um polinucleotídeo polil: C e um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba e uso dos mesmos.

Fundamentos da Invenção

[0003] As vacinas convencionais podem compreender um antígeno, um adjuvante e um veículo farmaceuticamente aceitável. É sabido que um polinucleotídeo polil: C pode ser útil como um adjuvante. Também é sabido que os lipossomos podem ser úteis em composições para vacinas (ver a patente US 6.793.923 concedida ao Requerente). No entanto, que seja do conhecimento do Requerente, a técnica não ensina nem sugere a combinação de um antígeno, um polinucleotídeo polil: C, lipossomos e um veículo hidrófobo em uma composição para vacina.

Sumário da Invenção

[0004] Os Requerentes descobriram agora que uma composição que compreende um antígeno, um polinucleotídeo polil: C, lipossomos e um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba pode fornecer títulos de anticorpo surpreendentemente mais altos e uma percentagem mais alta de células T CD8+ ativadas ou de memória do que as de uma das composições de vacina convencionais que contenham polinucleotídeos polil: C em um veículo aquoso ou composições que compreendem lipossomos, um veículo hidrófobo e um adjuvante alúmen.

[0005] Consequentemente, em um aspecto, a invenção fornece uma composição que compreende: (a) um antígeno; (b) lipossomos; (c) um polinucleotídeo polil: C e (d) um veículo que compreenda uma fase contínua de uma substância hidrófoba.

[0006] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para a obtenção de uma composição, o dito método compreendendo a combinação, em qualquer ordem, de: (a) um antígeno; (b) lipossomos; (c) um polinucleotídeo polil: C e (d) um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba. Em uma modalidade, o antígeno é encapsulado nos lipossomos. Em uma modalidade, o polinucleotídeo polil: C é encapsulado nos lipossomos.

[0007] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição preparada de acordo com os métodos descritos acima.

[0008] Em um outro aspecto, a invenção fornece um processo que compreende administrar uma composição como descrito acima a um sujeito. Em uma modalidade, o método é um processo para induzir uma resposta do anticorpo ou uma resposta imunológica mediada pela célula ao antígeno no sujeito.

[0009] Outros aspectos e características da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os peritos na técnica pela revisão da descrição a seguir de modalidades específicas da invenção em associação com as figuras anexas.

Breve Descrição das Figuras

[00010] Nas figuras, que ilustram as modalidades da invenção por meio de exemplos apenas:

[00011] A Figura 1 é um gráfico que apresenta os resultados de vacinação de três grupos de camundongos (n = 9 ou 10) como a seguir: Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: Cem uma dose de 30 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo (Vacina B, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com a Vacina A que compreende 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de alúmen em uma dose de 30 microlitros de formulação de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo. Os camundongos do Grupo 3 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de alúmen por dose de 30 microlitros de vacina de alúmen de controle. As respostas imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso. para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões calculados para ponto do tempo. Os valores de P foram calculados usando o teste T de Student.

[00012] A Figura 2 é um gráfico que apresenta os resultados de vacinação de dois grupos de camundongos (n = 9 ou 10) como a seguir: Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C em uma dose de 30 microlitros formulada como uma vacina com lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo (Vacina B, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C por dose de 30 microlitros de vacina de polil: C de controle. As respostas imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões para cada ponto do tempo. Os valores de P foram calculados usando- se o teste T de Student.

[00013] A Figura 3 é um gráfico que apresenta os resultados de vacinação de dois grupos de camundongos (n = 8 ou 9) como a seguir os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com uma dose única de 1 micrograma de rHA e 10 microgramas de polil C em uma dose de 50 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina C, da invenção) os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 1 micrograma de rHA e 100 microgramas de alúmen por dose de 50 microlitros de vacina de alúmen de controle, os camundongos receberam reforços 21 dias após a vacinação. As respostas imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de Valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões calculados para cada ponto do tempo.

Figura 4

[00014] As respostas melhoradas anticorpo anti-rHA depois da vacinação com antígeno de rHA formulado em um lipossomo/polil C/veículo oleoso vacina Dois grupos de camundongos (n = 9 ou 10) foram vacinados como a seguir. Os Camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil C em uma dose de 30 microlitros formulada como uma vacina com lipossomo/polil C/veículo hidrófobo (Vacina B, da invenção). Os Camundongos do Grupo 2 foram tratados com Vacina A, 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de alúmen em uma dose de 30 microlitros de formulação de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo. As resposta imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões para cada ponto do tempo P foram calculados usando-se o teste T de Student.

Figura 5

[00015] Respostas melhoradas de anticorpo anti-rHA depois da vacinação com antígeno de rHA formulado em uma vacina de lipossomo/polil C/veículo oleoso. Dois grupos de camundongos (n = 9 ou 10) foram vacinados como a seguir. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil C em uma dose de 30 microlitros formulados como uma vacina de lipossomo/polil C/veículo hidrófobo (Vacina B, da invenção); Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil C por dose de 30 microlitros de controle. As respostas imunológicas humorais da vacina de polil C foram medidas por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, os valores de log 10 foi calculada a média dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões para cada ponto do tempo P foram calculados usando-se o teste T de Student.

Figura 6

[00016] Respostas melhoradas de anticorpo anti-rHA depois da vacinação com antígeno de rHA formulado em uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo oleoso. Dois grupos de camundongos (n = 9 ou 10) foram imunizados como a seguir. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com uma única dose de 1 5 micrograma de rHA e 12 5 microgramas de polil C em uma dose de 50 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina D, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 1 5 microgramas de rHA e 100 microgramas de alúmen por 50 microlitros de dose de vacina de alúmen de controle, os camundongos receberam reforço 28 dias (4 semanas) depois da vacinação. As respostas imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e os desvios padrões para cada ponto do tempo P foram calculados usando-se o teste T de Student.

Figura 7

[00017] Número de células CD8 antígeno-específicas dentro de uma população de célula T CD8-positiva depois da vacinação. Três grupos de Camundongos BALB/c (n = 4) foram vacinados como a seguir. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 1 5 microgramas de rHA e 12 5 microgramas de adjuvante polil C à base de RNA em uma dose de 50 microlitros formulada como vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina D, da invenção) intramuscularmente. Os camundongos do Grupo 2 foram vacinados com 50 microlitros de Vacina D subcutaneamente. Os camundongos do Grupo 3 foram vacinados com 1 5 microgramas de rHA e 100 microgramas de Imject Adjuvant alum em 50 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) intramuscularmente. Todas as vacinas foram fornecidas uma vez sem reforço. Foram detectadas células T CD8 antígeno-específicas vinte e dois dias depois da vacinação nos esplenócitos de animais com o uso de análise citométrica de fluxo tricolor. As células foram coradas com anti-CD8β-APC, anti-CD19- FITC e um PE-pentâmero específico para H2-Dd que contém o epitopo imunodominante de rHA, Os resultados I9L são expressos como por cento idade em média de células pentâmero positivas em uma população de célula CD8β-positiva/CD19-negativa, +/- desvio padrão. O fundo corado detectado nos esplenócitos isolados de células naive foi subtraído *p = < 0 025, ** p = < 0 005, comparado ao Grupo 3

Figura 8

[00018] Títulos de inibição de hemaglutinação (HAI) depois de uma única vacinação contra rHA formulados na invenção. Um grupo de camundongos e um grupo de coelhos (n = 5) foram vacinados como a seguir. O grupo de camundongos foram vacinados com 0,5 micrograma de rHA e 12 microgramas de polil C em uma dose de 50 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina E, da invenção). O grupo de coelhos foi tratado com Vacina F (da invenção), 2 microgramas de rHA e 50 microgramas de polil C em uma dose de 200 microlitros de formulação de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo. As respostas imunológicas humorais foram medidas por ensaio de inibição de hemaglutinação, como descrito neste caso; antes da vacinação (pré vacinação) e a 4 (coelhos) ou 5 (camundongos) semas depois. Para cada grupo de animais, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de HAI e do desvio padrão calculado.

Figura 9.

[00019] Respostas melhorada de anticorpo anti-β-amil0ide depois da vacinação com uma mistura de e-amilóide e peptídeos F21 E formulados em uma vacina de lipossomo/polil:C/veículo oleoso. Dois grupos de camundongos (n = 9) foram vacinados como a seguir: Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 10 microgramas de β- amilóide, 20 microgramas F21 E e 200 microgramas de alúmen a 100, microlitros dose formulado como um lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo vacina (Vacina G). Camundongos do Grupo 2 foram tratados com 10 microgramas de e-amilóide, 20 microgramas de F21 E e 10 microgramas de polil C por dose de 100 microlitros formulada como lipossomo/polil C/veículo hidrófobo (Vacina H, da invenção). As respostas imunológicas humorais foram medidas por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e o desvio padrão calculado para cada ponto do tempo. Os valores de P foram calculados usando o teste T de Student.

Figura 10.

[00020] As vacinas apresentadas em uma formulação de lipossomo/polil:C/veículo hidrófobo são capazes de aumentar as respostas imunológicas celulares e humorais. Dois grupos de camundongos (n = 5) foram vacinados como a seguir: Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 0,5 micrograma de rHA e 12 microgramas de polil: C em uma dose de 50 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo liofilizado/polil: C (alto)/veículo hidrófobo (Vacina E, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 0,5 micrograma de rHA e 2,5 microgramas de dose de polil: C por 50 microlitros formulada como lipossomo liofilizado/polil: C (baixo)/veículo hidrófobo (Vacina I, da invenção). Os indicadores humoral (IgGI) e celular (lgG2A) foram medidos por ELISA como descrito neste caso. Para cada grupo de tratamento, foi calculada a média dos valores de log 10 dos títulos de anticorpo do ponto final e desvios padrões calculados para cada ponto do tempo.

[00021] A Figura 11 é um gráfico que apresenta o volume médio do tumor de camundongos C57BL/6 implantados com HPV16 E7 que expressam células C3 e vacinados oito dias depois como a seguir: Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com 100 microlitros contendo 15 microgramas de antígeno FP e 150 microgramas de polil C à base de RNA formulado em uma emulsão com veículo hidrófobo (Vacina de Controle em Emulsão). Os camundongos do Grupo 2 foram vacinados com 100 microlitros contendo 15 microgramas de antígeno FP e 150 microgramas de polil C formulado em lipossomo/Polil : C/veículo hidrófobo (Vacina K, da invenção). Os camundongos do Grupo 3 receberam 100 microlitros de PBS apenas. Todos os grupos continham oito camundongos. O tamanho do tumor foi medido uma vez por semana durante cinco semanas depois da implantação. A Figura 11 apresenta o volume médio do tumor calculado para cada grupo +/- SEM. Os valores de P foram calculados para o Grupo 1 e Grupo 2 usando Teste T de Student, *p = < 0,1, **p = < 0,05.

[00022] A Figura 12 é um gráfico que apresenta o volume médio do tumor de camundongos C57BL/6 implantados com HPV16 E7 que expressam células C3 células e vacinados cinco dias depois como a seguir. Os camundongos do Grupo 1 receberam 100 microlitros que contêm 10 microgramas de antígeno FP e 20 microgramas de polil C à base de DNA formulado em lipossomo/poIiI C/veículo hidrófobo (Vacina L, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 receberam 50 microlitros contendo 10 microgramas de antígeno FP e 20 microgramas de polil C à base de DNA formulado em lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina M, da invenção). Os camundongos do Grupo 3 receberam 50 microlitros contendo 10 microgramas de antígeno FP formulado em lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo (Adjuvante de controle). Os camundongos do Grupo 4 receberam 100 microlitros de PBS apenas. Todos os grupos continham dez (10) camundongos. O tamanho do tumor foi medido uma vez por semana durante cinco semanas depois do implante. A Figura 12 apresenta o volume médio do tumor calculado para cada grupo +/-. Os valores de SEM P foram calculados para o Grupo 2 e Grupo 3 usando o teste T de Student, 8p = < 0,05

Figura 13

[00023] Resposta celular anti-rHA melhorada depois da vacinação com antígeno de rHA formulado em uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo oleoso. Dois grupos de camundongos (n = 9 ou 10) foram imunizados como a seguir. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com uma única dose de 1 5 microgramas de rHA e 12,5 microgramas de polil C em uma dose de 50 microlitros formulada como uma vacina de lipossomo liofilizado/polil C/veículo hidrófobo (Vacina D, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram tratados com 1 5 microgramas de rHA e 100 microgramas de alúmen por 50 microlitros de dose de vacina de alúmen de controle, os camundongos receberam reforço 28 dias (semana 4) depois da vacinação. As respostas celulares específicas para antígeno foram medidas por pentâmero com corante de células CD8+ T células específicas para o epitopo H2-Kd IYSTVASSL e citrometria de fluxo. Os camundongos vacinados com a invenção como descrito geraram valores P de resposta celular duradoura antígeno-específica foram calculados usando o teste T de Student.

Descrição Detalhada

[00024] O presente pedido de patente refere-se a composições que compreendem lipossomos, um antígeno, um polinucleotídeo polil C e um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba e seu uso.

[00025] As composições da invenção, que combinam um antígeno, um polinucleotídeo polil C, lipossomos e um veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba forneceram títulos de anticorpo surpreendentemente mais altos do que uma das composições convencionais de vacina que contenham polinucleotídeos polil: C em um veículo aquoso ou as composições que compreendem lipossomos, um veículo hidrófobo e um adjuvante alúmen.

[00026] Os dados descritos nos Exemplos 1 e 2 neste caso estão resumidos na Tabela 1: Tabela 1

rHA = glicoproteína de hemaglutinina da H5N1 influenza recombinante PBS = veículo soro fisiológico tamponado com fosfato

[00027] Será observado pela tabela acima (Tabela 1) que as composições da invenção (3) forneceram títulos de anticorpo que foram mais do que o efeito de aditivo da combinação de lipossomos mais veículo hidrófobo (1) ou o uso de polil: C(2). O efeito de aditivo de (1) e (2) seria um título de anticorpo "não logado" de 256.000 + 1.024.000 = 1.280,000, Ao contrário, a substituição do adjuvante alúmen em (3) com polil: C forneceu um título de anticorpo não logado inesperadamente alto de 8.192.000, 6,4 vezes o efeito de aditivo esperado. Além disso, a resposta do anticorpo gerada com a composição (3) era duradoura e o efeito observado no ponto de tempo anterior (semana 4 depois da vacinação) descrito acima foi mantido na semana 16 depois da vacinação (Exemplos 4 e 5). Os dados data descritos nos Exemplos 4 e 5 neste caso estão resumidos na Tabela 2: Tabela 2

[00028] O efeito de aditivo de (1 ) e (2) seria um título médio de anticorpo não logado de 128.824 + 169.824 = 298.648. Em vez disso, a substituição do adjuvante alúmen em (3) por polil: C forneceu um título médio de anticorpo não logado inesperadamente alto de 1.612.810, 5,4 vezes o efeito de aditivo esperado.

[00029] Os resultados observados com a composição (3) descrita acima foram duplicados em um estudo separado que usou uma composição que consiste em antígeno (rHA), polil: C, lipossomos liofilizados e um veículo hidrófobo e descritos no Exemplo 3. O título médio de anticorpo observado com esta composição na semana 8 depois da vacinação era de 2.884.031 (não logado) comparado com 147.910 (não logado) título médio observado com uma vacina padrão com adjuvante de alúmen aplicada duas vezes para melhorar a sua atividade. Este aumento de 19,4 vezes em título foi observado com uma imunização da composição descrita.

[00030] As composições de vacina que contêm polil: C, lipossomos e um veículo hidrófobo têm o potencial para gerar respostas de anticorpo e/ou respostas celulares contra uma ampla faixa de antígenos. Exemplos 1 a 6 e Exemplos 8 e 9 demonstram a capacidade de elevar uma resposta de anticorpo significativamente maior quando se combinam todos os componentes da composição contra uma proteína recombinante (rHA) ou um peptídeo curto (β- amilóide). Estes títulos de anticorpo surpreendentemente altos não foram observados sem o uso de um polinucleotídeo polil: C especificamente na composição da vacina (Exemplos 1, 4 e 9), nem foram observados na ausência de lipossomos e de um veículo hidrófobo apesar do uso de polil C sozinho com um antígeno (Exemplos 2 e 5). Similarmente, a combinação de todos os componentes da composição geravam uma resposto imunológica celular significativamente mais eficaz e mais duradoura como ilustrado no Exemplo 7 e nos Exemplos 11 a 13 contra uma proteína recombinante ou um peptídeo curto que contenha um epitopo CTL conhecido. Foram detectadas respostas imunológicas antígeno- específicas significativas quando se imunizam com a composição pelo menos por duas vias de imunização (Exemplo 7). A eficácia inabitual no controle do crescimento do tumor com a invenção descrita não foi observada sem o uso de um polinucleotídeo polil: C especificamente na composição (Exemplo 12) e não foi observada sem o uso de lipossomos e apesar do uso de um polinucleotídeo polil: C e de um veículo hidrófobo com o antígeno (Exemplo 11). A capacidade de se aumentar respostas humorais e celulares robustas e duradouras simultaneamente com pelo menos uma imunização que usa todos os componentes da composição descrita (Exemplos 6, 7, 10 e 13) ilustra a utilidade em particular da composição em uma ampla faixa de aplicações em medicina inclusive doenças infecciosas e cânceres.

[00031] É evidente pela coleção de exemplos aqui descritos que as composições de vacina que consistem em um antígeno, lipossomos, um veículo hidrófobo e ribo- ou desoxirribo-polinucleotídeos contendo resíduos de inosina e de citosina em mais do que uma configuração química são capazes de induzir respostas imunológicas não habitualmente fortes. Os exemplos também descrevem mais do que um método para se obter a composição desejada.

Antígenos

[00032] As composições da invenção compreendem um ou mais antígenos. Como usado neste caso, o termo "antígeno" refere-se a uma substância que possa se ligar especificamente a um anticorpo ou a um receptor de célula T.

[00033] Os antígenos úteis nas composições da invenção incluem, sem limitação, polipeptídeos, um microorganismo ou uma parte dos mesmos, tais como uma bactéria, um vírus ou um protozoário vivo, atenuado, inativado ou morto ou uma parte dos mesmos.

[00034] Como usado neste caso e nas reivindicações, o termo "antígeno" também inclui um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que funciona como um antígeno. São conhecidas estratégias de vacinação à base de ácido nucléico, em que a composição da vacina que contém um polinucleotídeo é administrada a um sujeito. O polipeptídeo antigênico codificado pelo polinucleotídeo é expresso no sujeito, tal que o polipeptídeo antigênico esteja definitivamente presente no sujeito, como se a própria composição da vacina contivesse o polipeptídeo. Para as finalidades da presente invenção, o termo "antígeno", quando o contexto confirmar, abrange tais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo que funciona como o antígeno.

[00035] Os polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos que possam ser úteis como antígenos na invenção incluem, sem limitação, aqueles derivados de toxóide de Cholera, toxóide tetânico, toxóide diftérico, antígeno superficial da hepatite B, hemaglutinina, neuraminidase, proteína da influenza M, PfHRP2, pLDH, aldolase,MSP1, MSP2, AMA1,Der-p-1, Der-f-1, Adipofilina, AFP, AIM-2, ART-4, BIDADE, α- fetoproteína, BCL-2, Bcr-Abl, BING-4, CEA, CPSF, CT, ciclina DI Ep- CAM, EphA2, EphA3, ELF-2, FGF-5, G250, Hormônio Liberador de Gonadotrofina, HER-2, carboxila esterase intestinal (iCE), IL13Rα2, MIDADE-1, MIDADE-2, MIDADE-3, MART- 1, MART-2, M-CSF, MDM- 2, MMP-2, MUC-1, NY-EOS-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, p53, PBF, PRAME, PSA, PSMA, RIDADE-1, RNF43, RU1, RU2AS, SART-1, SART-2, SART-3, SIDADE-1, SCRN 1, SOX2, SOX10, STEAP1, sobrevivente, Telomerase, TGFβRII, TRAG-3, TRP-1, TRP-2, TERT e WT1.

[00036] Vírus ou partes dos mesmos, úteis como antígenos na invenção incluem, sem limitação, vírus causador da catapora, vírus da Vaccinia (varíola), vírus da paravaccinia (Pseudocowpox), vírus do Herpes humano 1, vírus do Herpes humano 2, Citomegalovírus, adenovírus A-F humano, poliomavírus, papilomavírus humano, Parvovírus, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus da Imunodeficiência Humana, Ortoreovírus, Rotavírus, vírus Ebola, vírus da parainfluenza, vírus da influenza A, vírus da influenza B, vírus da influenza C, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola, vírus causador de pneumonia (Pneumovirus), vírus sincial respiratório humano, vírus da Raiva, vírus da encefalite da Califórnia, vírus da encefalite japonesa, vírus Hantaan, vírus da coriomeningite linfocítica, Coronavírus, Enterovírus, Rhinovírus, Poliovírus, Norovírus, Flavivrus, vírus da Dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela e da varicela.

[00037] As bactérias ou partes das mesmas úteis como antígenos na invenção incluem, sem limitação, Anthrax, Brucella, Candida, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Cholera, Clostridium botulinum, Coccidioides immitis, Cryptococcus, Diphtheria, Escherichia coli 0157: H7, Enterohemorrhagic Escherichia coli enterohemorrágica, Escherichia coli enterotoxigênica, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella, Leptospira, Listeria, Meningococcus, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium, Pertussis, Pneumonia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae e Yersinia enterocolitica.

[00038] O antígeno pode alternativamente ser de origem protozoária, por exemplo, Plasmodium falciparum, que causa malária.

[00039] O termo "polipeptídeo"abrange qualquer cadeia de aminoácidos, sem levar em conta o comprimento (por exemplo, pelo menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 ou 20 aminoácidos) ou modificação pós translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação) e inclui, por exemplo, proteínas naturais, polipeptídeos e peptídeos sintéticos ou recombinantes, polipeptídeos e peptídeos desnaturados, epitopos, moléculas híbridas, variantes, homólogos, análogos, peptóides, peptidomiméticos etc. Uma variante ou um derivado da mesma inclui

[00040] Eliminações, inclusive cortes e fragmentos, introduções e adições, por exemplo, substituições conservadoras, mutantes sítio- dirigidos e variantes alélicas e modificações, que incluem peptóides que possuem um ou mais grupos acila não amino (por exemplo, açúcar, lipídeo etc.) ligados covalentemente ao peptídeo e modificações pós translacionais. Como usado neste caso, o termo "substituições conservadoras de aminoácido"ou "substituições conservadoras" refere-se à substituição de um aminoácido por outro a uma dada locação no peptídeo, em que a substituição pode ser feita sem perda substancial da função relevante. Na realização de tais mudanças, podem ser feitas substituições de resíduos de aminoácido similares na base de similaridade relativa de substituintes de cadeia lateral, por exemplo, o seu tamanho, a sua carga, hidrofibicidade, hidrofilicidade e similares e tais substituições podem ser experimentadas para se efeito sobre a função do peptídeo por testagem rotineira. Exemplos específicos, não limitativos de uma substituição conservadora incluem os seguintes exemplos: Substituições Conservadoras de Resíduo Original Arg Lys Asn GIn, His Asp GIu Cys Ser GIn Asn GIu Asp His Asn; GIn Ne Leu, VaI Leu Ile; VaI Lys Arg; GIn; GIu Met Leu; Ile Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe VaI Ile; Leu

[00041] Podem ser usados os polipeptídeos ou os peptídeos que possuem identidade substancial a uma sequência de antígeno preferida. Duas sequências são consideradas como tendo identidade substancial se, quando alinhadas de modo eficiente (com espaços permitidos), eles compartilham pelo menos aproximadamente 50% de identidade de sequência ou se as sequências compartilharem motivos funcionais definidos. Em modalidades alternativas, as sequências alinhadas de modo eficiente podem ser consideradas como sendo substancialmente idênticas (isto é, tendo identidade substancial) se elas compartilharem pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade em uma região especificada. O termo "identidade" refere-se à similaridade de sequência entre duas moléculas de polipeptídeos. A identidade pode ser determinada por comparação de cada posição nas sequências alinhadas. Um grau de identidade entre as sequências de aminoácido é uma função do número de aminoácidos idênticos ou adequados em posições compartilhadas pelas sequências, por exemplo, em uma região especificada. O alinhamento ótimo de sequências para comparações de identidade pode ser conduzido usando uma variedade de algoritmos, como são conhecidos na técnica, inclusive o programa ClustalW, disponível em http://clustalw.genome.ad.jp, o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, 1970, J. MoI. Biol. 48:443, o método de pesquisa para similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 e as implementações computadorizadas destes algoritmos (tais como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wl, U.S.A.). A identidade de sequência também pode ser determinada usando-se o algoritmo de BLAST, descrito em Altschul e outros, 1990, J. MoI. Biol. 215:403-10 (que usa os ajustes pré determinados publicados). Por exemplo, pode ser usada a ferramenta "BLAST 2 Sequence" tool, disponível pelo National Center for Biotechnology Information (pela internet em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cqi), selecionando o programa "blastp" nos ajustes pré determinados a seguir: limite esperado 10; tamanho da palavra 3; matriz BLOSUM 62; existência de custos de espaço 11, extensão 1. em uma outra modalidade, a pessoa perita na técnica pode alinhar facilmente e apropriadamente qualquer sequência dada e deduzir a identidade de sequência e/ou a homologia por uma simples inspeção visual.

[00042] Os polipeptídeos e peptídeos usados para a prática da invenção podem ser isolados de fontes naturais, sejam polipeptídeos sintéticos ou gerados recombinantemente. Os peptídeos e as proteínas podem ser expressos recombinantemente in vitro ou in vivo. Os polipeptídeos e peptídeos usados para a prática da invenção podem ser obtidos e isolados usando qualquer método conhecido na técnica. Os polipeptídeos e peptídeos usados para a prática da invenção também podem ser sintetizados, globalmente ou em parte, usando métodos químicos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A. K, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, Pa. Por exemplo, a síntese do peptídeo pode ser realizada usando várias técnicas em fase sólida (ver, por exemplo, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) e síntese automatizada pode ser conseguida, por exemplo, usando o ABI 431 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

[00043] Em algumas modalidades, o antígeno pode ser um antígeno purificado, por exemplo, desde aproximadamente 25% até 50% puro, desde aproximadamente 50% até aproximadamente 75% puro, desde aproximadamente 75% até aproximadamente 85% puro, desde aproximadamente 85% até aproximadamente 90% puro, desde aproximadamente 90% até aproximadamente 95% puro, desde aproximadamente 95% até aproximadamente 98% puro, desde aproximadamente 98% até aproximadamente 99% puro ou maior do que 99% puro.

[00044] Como observado acima, o termo "antígeno" também inclui um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que funciona como um antígeno. São conhecidas estratégias de vacinação à base de ácido nucléico, em que a composição da vacina que contém um polinucleotídeo é administrada a um sujeito. O polipeptídeo antigênico codificado pelo polinucleotídeo é expresso no sujeito, tal que o polipeptídeo antigênico esteja definitivamente presente no sujeito, da mesma forma se a composição da própria vacina tivesse contido o polipeptídeo. Para as finalidades da presente invenção, o termo "antígeno", em que o contexto ordena, abrange tais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo que funciona como o antígeno.

[00045] Como usado neste caso e nas reivindicações, o termo "polinucleotídeo"abrange uma cadeia de nucleotídeos de qualquer comprimento (por exemplo, 9, 12, 18, 24, 30, 60, 150, 300, 600, 1500 ou mais nucleotídeos) ou o número de filamentos (por exemplo, de filamento simples ou de filamento duplo).

[00046] Os polinucleotídeos podem ser DNA (por exemplo, DNA genômico ou cDNA) ou RNA (por exemplo, mRNA) ou combinações dos mesmos. Eles podem ser de origem natural ou sintética (por exemplo, quimicamente sintetizados). É considerado que o polinucleotídeo pode conter modificações de uma ou mais bases nitrogenadas, açúcares pentose ou grupos fosfato na cadeia de nucleotídeo. Tais modificações são bem conhecidas na técnica e podem ter a finalidade de, por exemplo, melhorar a estabilidade do polinucleotídeo.

[00047] O polinucleotídeo pode ser aplicado em várias formas. Em algumas modalidades, pode ser usado um polinucleotídeo visível, seja em forma linear ou introduzido em um plasmídeo, tal como em plasmídeo de expressão. Em outras modalidades, pode ser usado um vetor vivo tal como um vetor viral ou bacteriano.

[00048] Uma ou mais sequências reguladoras que ajudam na transcrição de DNA em RNA e/ou na tradução de RNA em um polipeptídeo podem estar presentes. Em alguns casos, tal como no caso de um polinucleotídeo que é uma molécula de RNA mensageiro (mRNA), as sequências reguladoras que se referem ao processo de transcrição (por exemplo, um promotor) não são necessárias e a expressão da proteína pode ser efetuada na ausência de um promotor. O perito na técnica pode incluir sequências reguladoras adequadas como requerem as circunstâncias.

[00049] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está presente em um cassete de expressão, em que ele está operavelmente ligado a sequências reguladoras que irão permitir que o polinucleotídeo seja expresso no sujeito ao qual é administrada a composição da invenção. A escolha de cassete de expressão depende do sujeito ao qual é administrada a composição assim como as características desejadas para o polipeptídeo expresso.

[00050] Tipicamente, um cassete de expressão inclui um promotor que seja funcional para o sujeito e possa ser constitutivo ou induzível; um sítio de ligação de ribossomo; um códon de partida (ATG), se necessário; o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse; um códon de interrupção e opcionalmente uma região 3' terminal (terminador de tradução e/ou de transcrição). Podem ser incluídas sequências adicionais tal como uma região que codifica um peptídeo de sinal. O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de interesse pode ser homólogo ou heterólogo a qualquer uma das outras sequências reguladoras no cassete de expressão. As sequências a serem expressas juntamente com o polipeptídeo de interesse, tal como um peptídeo de sinal que codifica a região, são tipicamente localizados adjacentes ao polinucleotídeo que codifica a proteína a ser expressa e colocada em quadro de leitura apropriado. O quadro de leitura aberta constituído pelo polinucleotídeo que codifica a proteína a ser expressa sozinha ou juntamente com qualquer outra sequência a ser expressa (por exemplo, o peptídeo de sinal), é colocado sob o controle do promotor de modo que a transcrição e a tradução ocorram no sujeito ao qual é administrada a composição.

[00051] Em uma modalidade relacionada, o antígeno pode ser um alergênio e pode ser derivado, sem limitação, de células, extratos de célula, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeo, peptídeo imitadores não peptídeo de polissacarídeos e de outras moléculas, moléculas pequenas, lipídeos, glicolipídeos e carboidratos de plantas, de animais, de fungos, de insetos, de alimentos, de fármacos, de pó e de ácaros. Os alergênios incluem, porém não estão limitados a aeroalergênios ambientais; pólen de plantas (por exemplo, ambrósia americana/febre do feno); alergênios do pólen de erva daninha; alergênios do pólen de gramíneas; grama Johnson; alergênios do pólen de árvores; raigrás; alergênios de aracnídeos (por exemplo, alergênios do ácaro da poeira doméstica); alergênios do ácaro de armazenagem; pólen do cedro do Japão/febre do feno; alergênios de esporos de bolor/de fundos; alergênios de animais (por exemplo, alergênios de cão, de cobaia, de hamster, de gerbil, de rato, de camundongo etc.,); alergênios de alimentos (por exemplo, de crustáceos; de nozes; de frutas cítricas; de farinha de trigo, de café); alergênios de insetos (por exemplo, de pulgas, de baratas); de venenos: (Hymenoptera, "camisa amarela", abelhas, vespas, um tipo de vespa "hornet", formiga de fogo); alergênios bacterianos (por exemplo, antígenos a estreptococos; alergênios de parasitas tais como antígeno para Ascaris); antígenos virais; alergênios para fármacos (por exemplo, a penicilina); hormônios (por exemplo, insulina); enzimas (por exemplo, estreptoquinase); e fármacos ou substâncias químicas capazes de agir como antígenos incompletos ou haptenos (por exemplo, os anidridos de ácido e os isocianatos).

Polinucleotídeos Polil: C

[00052] Os polinucleotídeos Polil: C são moléculas de polinucleotídeo de filamento duplo (RNA ou DNA ou uma combinação de DNA e RNA) contendo resíduos de ácido inosínico (I) e resíduos de ácido citidílico (C) e que induzem a produção de citocinas inflamatórias, tal como interferon. Eles são tipicamente compostos de um filamento que consiste inteiramente em nucleotídeos contendo citosina e de um filamento que consiste inteiramente em nucleotídeos contendo inosina embora outras configurações sejam possíveis. Por exemplo, cada filamento pode conter tanto nucleotídeos contendo citosina como nucleotídeos contendo inosina. Em alguns casos, um ou ambos os filamentos podem adicionalmente conter um ou mais nucleotídeos sem ser de citosina ou sem ser de inosina.

[00053] Foi relatado que os polil: C pode ser segmentado a cada 16 resíduos sem um efeito sobre o seu potencial de ativação de interferon (Bobst, 1981). Além disso, o potencial de indução de interferon de uma molécula de polil: C combinada de maneira errônea por introdução de um resíduo de uridina a cada 12 resíduos de repetição do ácido citidílico (Hendrix, 1993), sugere que uma molécula mínima de polil: C de filamento duplo de 12 resíduos é suficiente para promover a produção de interferon. Outros também sugeriram que as regiões tão pequenas quanto 6-12 resíduos, que correspondem a do polinucleotídeo de filamento duplo, são capazes de acionar o processo de indução (Greene, 1978). Se obtido sinteticamente, os polinucleotídeos polil: C são tipicamente aproximadamente de 20 ou mais resíduos de comprimento (comumente 22, 24, 26, 28 ou 30 resíduos de comprimento). Se obtidos semi sinteticamente (por exemplo, usando uma enzima), o comprimento do filamento pode ser de 500, 1000 ou mais resíduos.

[00054] Polil: C idade como imitadores de genomas virais e são particularmente úteis para modular o sistema imunológico in vivo. Os homopolímeros sintéticos de poli l: poli C, por exemplo, foi relatado para melhorar a imunidade inata por indução de interferon gama não especificamente quando aplicado sistemicamente in vivo por injeção intravenosa ou intramuscular (Krown 1985, Zhu 2007). Diversas variantes de polímeros de ácido poli inosínico e citidílico foram descritas durantes todos estes anos (de Clercq 1978, Bobst 1981, De Clercq 1975, Guschlbauer 1977, Fukui 1977, Johnston 1975, US3906092 1971, Kamath 2008, lchinohe 2007), alguns dos quais incluíam o uso de resíduos modificados covalentemente, o uso de resíduos ribo e desóxi-ribo inosínico e citidílico, o uso de homopolímeros e de copolímeros alternando-se que contenham resíduos de ácido poli inosínico e citidílico e a introdução de resíduos específicos para criar polímeros que não se combinam.

[00055] O uso de polinucleotídeos de filamento duplo que contêm ácidos inosínicos e citidílicos foi relatado para o tratamento de algumas doenças virais (Kende 1987, Poast 2002, 6,468,558 2002, Sarma 1969, Stephen 1977, Levy 1978), câncer (Durie 1985, Salazar 1996, Theriault 1986, Nakamura 1982, Talmadge 1985, Droller 1987), doença autoimune como esclerose múltipla (Bever 1986) e outras doenças infecciosas tal como malária (Awasthi 1997, Puri 1996). A eficácia de moléculas polil C foi melhorada ainda em alguns caos por complexação da molécula com poli-lisina e carboximetil celulose carregadas positivamente, protegendo eficazmente o polinucleotídeo contra degradação pela nuclease in vivo (Stephen 1977, Levy 1985) ou por formação de complexo de polil: C com peptídeos sintéticos carregados positivamente (Schellack 2006).

[00056] Além de seus usos como um melhorador não específico de imunidade inata, o polil: C também é útil como adjuvante em composições de vacina. A melhoria da imunidade inata pode levar a uma imunidade melhorada de adaptação específica do antígeno, possivelmente por um mecanismo que envolve, pelo menos em parte células NK, macrófagos e/ou células dendríticas (Chirigos 1985, Salem 2006, Alexopoulou 2001, Trumpfheller 2008). A evidência para o uso de moléculas de polil C neste contexto se origina de vários estudos em vacina para o controle de doenças infecciosas (Houston 1976, Stephen 1977, lchinohe 2007, Sloat 2008, Agger 2006, Padalko 2004) e a prevenção ou o tratamento de câncer por uma variedade de modalidades de vacina (Zhu 2007, Cui 2006, Salem 2005, Fujimura 2006, Llopiz 2008). Estes estudos demonstram que o polil: C melhora as respostas humorais como evidente pelas respostas de anticorpo melhoradas para antígenos específicos para doença infecciosa. Polil: C é também um potenciador de respostas celulares antígeno- específicas (Zhu 2007, Zaks 2006, Cui 2006, Riedl 2008). Acredita-se que ocorram efeitos adjuvantes de moléculas de Polil C, pelo menos parcialmente, por indução de interferon-gama através de sua interação com receptores toll like (TLR) tais como TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 e TLR9 (Alexopoulou 2001, Trumpfheller 2008, Schellack 2006, Riedl 2008), com TLR3 sendo particularmente relevantes para a maioria das moléculas de polil : C. Evidência também sugere que as moléculas de polil: C podem exercer o seu efeito, pelo menos em parte, pela interação com receptores sem ser TLRs, tal como proteína I induzida por ácido retinóico da RNA helicase (RIG-l)/gene 5 associado à diferenciação do melanoma (MDA5) (Alexopoulou 2001, Yoneyama 2004, Gowen 2007, Dong 2008).O mecanismo de ação de moléculas de polil: C permanece como sendo completamente entendido.

[00057] Consequentemente, como usado neste caso, um "polil : C" ou "polinucleotídeo polil : C"é uma molécula de polinucleotídeo de filamento duplo (RNA ou DNA ou uma combinação de DNA e RNA), cada filamento que contém pelo menos 6 resíduos contíguos de ácido inosínico ou citidílico ou 6 resíduos contíguos selecionados entre ácido inosínico ou citidílico em qualquer ordem (por exemplo, MCIIC ou ICICIC) e que seja capaz de induzir ou de melhorar a produção de pelo menos uma citocina inflamatória, tal como interferon, em um sujeito mamífero. Polinucleotídeos polil: C terão tipicamente um comprimento de aproximadamente 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 500, 1000 ou mais resíduos. Não se acredita que o limite superior seja essencial. Os polinucleotídeos polil: C preferidos podem ter um comprimento mínimo de aproximadamente 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30 nucleotídeos e um comprimento máximo de aproximadamente 1000, 500, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45 ou 40 nucleotídeos.

[00058] Cada filamento de um polinucleotídeo polil: C pode ser um homopolímero de resíduos inosínicos ou citidílicos ou cada filamento pode ser um heteropolímero que contenha ambos os resíduos de ácido inosínico e citidílico. Em qualquer caso, o polímero pode ser interrompido por um ou mais resíduos de ácido não inosínico ou não citidílico (por exemplo, uridina), é fornecida pelo menos uma região contígua de resíduos 6 I, 6 C ou 6 I/C como descrito acima. Tipicamente, cada filamento de um polinucleotídeo polil: C não conterá mais do que 1 resíduo não-l/C por 6 I/C resíduos, mais preferivelmente, não mais do que 1 non-l/C resíduo para cada 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30 I/C resíduos.

[00059] Os resíduos de ácido inosínico ou citidílico (ou de outros) no polinucleotídeo polil: C pode ser derivatizado ou modificado como é sabido na técnica, contanto que seja mantida a capacidade do polinucleotídeo polil: C de promover a produção de uma citocina inflamatória, tal como interferon. Exemplos não limitativos de derivados ou de modificações incluem, por exemplo, modificações de azido, modificações de fluoro ou o uso das ligações de tioéster (ou similares) em vez disso das ligações naturais de fosfodiéster para melhorar a estabilidade in vivo. O polinucleotídeo polil: C também pode ser modificado, por exemplo, para melhorar a sua resistência à degradação in vivo, por exemplo, por formação de complexo da molécula com polilisina carregada positivamente e com carboximetilcelulose ou com um peptídeo sintético carregado positivamente.

[00060] O polinucleotídeo polil: C será tipicamente incluído nas composições da invenção em uma quantidade de desde aproximadamente 0,001 mg até 1 mg por dose unitária da composição.

Lipossomos

[00061] Os lipossomos são membranas de lipídeo em bicamada completamente fechadas que contêm um volume aquoso aprisionado. Os lipossomos podem ser vesículas unilamelares (que possuam uma única membrana em bicamada) ou vesículas multilamelares caracterizadas por bicamadas de multimembrana, cada bicamada podendo ou não estar separada da próxima por uma camada aquosa. Uma discussão geral de lipossomos pode ser encontrada em Gregoriadis G. Immunol. Today, 11 : 89-97, 1990 e em Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181-189, 1999. Como usado neste caso e nas reivindicações, pretende-se com o termo "lipossomos" abranja todas tais estruturas vesiculares como descrito acima, inclusive, sem limitação, aquelas descritas na técnica como "niossomos", "transfersomos" e "virossomos".

[00062] Embora quaisquer lipossomos possam ser usados nesta invenção, inclusive os lipossomos obtidos partindo de lipídeos arquibacterianos, particularmente os lipossomos úteis usam fosfolipídeos e colesterol não esterificado na formulação do lipossomo. O colesterol é usado para estabilizar os lipossomos e qualquer outro composto que estabilize os lipossomos pode substituir o colesterol. Outros compostos estabilizadores são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, os fosfolipídeos saturados produzem lipossomos com temperaturas de transição mais altas indicando maior estabilidade.

[00063] Os fosfolipídeos que são usados de preferência na preparação de lipossomos são aqueles com pelo menos um grupo principal selecionado do grupo que consiste em fosfoglicerol, fosfoetanolamina, fosfosserina, fosfocolina e fosfoinositol. São mais preferidos os lipossomos que compreendem lipídeos que são 94 - 100% de fosfatidilcolina. Tais lipídeos são comercialmente disponíveis na lecitina Fosfolipon® 90 G. Quando também for usado colesterol não esterificado na formulação do lipossomo, o colesterol é usado em uma quantidade equivalente a aproximadamente 10% da quantidade de fosfolipídeo. Se for usado um composto sem ser o colesterol para estabilizar os lipossomos, um perito na técnica pode facilmente determinar a quantidade necessária na composição.

[00064] As composições de lipossomo podem ser obtidas, por exemplo, pelo uso de lipídeos naturais, lipídeos sintéticos, esfingolipídeos, éter lipídeos, esteróis, cardiolipina, lipídeos catiônicos e lipídeos modificados com poli (etileno glicol) e outros polímeros. Os lipídeos sintéticos podem incluir os seguintes constituintes de ácido graxo; lauroíla, miristoíla, palmitoíla, estearoíla, araquidoíla, oleoíla, linoleoíla, erucoíla ou combinações destes ácidos graxos.

Veículos

[00065] O veículo da composição compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba, de preferência uma substância líquida hidrófoba. A fase contínua pode ser uma substância hidrófoba essencialmente pura ou uma mistura de substâncias hidrófobas. Além disso, o veículo pode ser uma emulsão de água em uma substância hidrófoba ou uma emulsão de água em uma mistura de substâncias hidrófobas, contanto que a substância hidrófoba constitua a fase contínua. Além disso, em outra modalidade, o veículo pode funcionar como um adjuvante.

[00066] As substâncias hidrófobas que são úteis nas composições como descrito neste caso são aquelas que são farmaceuticamente e/ou imunologicamente aceitáveis. O veículo é de preferência um líquido porém certas substâncias hidrófobas que não forem líquidas à temperatura da atmosfera podem ser liquefeitas, por exemplo, por aquecimento e também são úteis nesta invenção. Em uma modalidade, o veículo hidrófobo pode ser uma emulsão de Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato/Adjuvante Incompleto de Freund (PBS/FIA).

[00067] As emulsões oleosas ou de água em óleo são veículos particularmente adequados para uso na presente invenção. Os óleos deviam ser farmaceuticamente e/ou imunologicamente aceitáveis. Os óleos adequados incluem, por exemplo, óleos minerais (especialmente óleo mineral leve ou de baixa viscosidade tal como Drakeol® 6VR), óleos vegetais (por exemplo, óleo de soja), óleos de nozes (por exemplo, óleo de amendoim) ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade, o óleo é um oleato de manitol em solução em óleo mineral, comercialmente disponível como Montanide® ISA 51. também podem ser usados gorduras animais e também podem ser usados materiais artificiais poliméricos hidrófobos, particularmente aqueles que sejam líquidos à temperatura da atmosfera ou que possam ser liquefeitos relativamente facilmente.

Outros Componentes

[00068] A composição também pode compreender um ou mais adjuvantes, excipientes farmaceuticamente aceitáveis etc., como são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) e The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada em 1999.

[00069] O termo "adjuvante" refere-se a um composto ou a uma mistura que melhora a resposta imunológica a um antígeno. Um adjuvante pode servir como um depósito de tecido que libera lentamente o antígeno e também como um sistema linfóide ativador que melhore não especificamente a resposta imunológica (Hood e outros, Immunology, 2a. ed., Benjamin/Cummings: Menlo Park, C.A., 1984; ver Wood e Williams, Em: Nicholson, Webster e May (eds.), Textbook of Influenza, Capítulo 23, pp. 317-323). Frequentemente, um teste primário somente com um antígeno, na ausência de um adjuvante, irá falhar em provocar uma resposta imunológica humoral.

[00070] Os adjuvantes adequados incluem, porém não estão limitados a, alúmen alúmen, outros compostos de alumínio, Bacillus de Calmette e Guerin (BCG), TiterMax®, Ribi®, adjuvante incompleto de Freund (IFA), saponina, substâncias tenso ativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, Corynebacteriumparvum, QS- 21, Adjuvantes Completos de Freund (FCA), adjuvantes da família de agonista TLR tais como CpG, falgelina, lipopeptídeos, peptidoglicanos, imidazoquinolinas, RNA simples filamentado, lipopolissacarídeos (LPS), proteínas de choque térmico (HSP) e ceramidas e derivados tal como αGal-cer. Os adjuvantes adequados também incluem citocinas ou quimiocinas em seu polipeptídeo ou formas de codificação de DNA tais como, porém não limitadas a, GM-CSF, TNF-α, IFN-Y, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21. Um adjuvante adequado para alúmen é comercializado sob o nome comercial Imject Alum® (Pierce, Rockford, IL), que consiste em uma solução aquosa de hidróxido de alumínio (45 mg/ml) e hidróxido de magnésio (40 mg/ml) mais estabilizadores inativos.

[00071] A quantidade de adjuvante usada depende da quantidade de antígeno e do tipo de adjuvante. Uma pessoa perita na técnica pode facilmente determinar a quantidade de adjuvante necessária em uma aplicação em particular.

[00072] Uma resposta imunológica provocada em sujeitos aos quais foi administrada uma composição da invenção pode ser formulada para dirigir a resposta imunológica para um anticorpo ou a uma resposta imunológica mediada pela célula. Isto pode ser conseguido usando-se agentes, tais como adjuvantes, que induzem predominantemente uma resposta Th1 ou Th2. Por exemplo, oligonucleotídeos que contenham CpG (em que o dinucleotídeo CpG é não metilado) pode ser usado para induzir uma resposta predominantemente Th1, desse modo favorecendo uma resposta mediada pela célula.

Composições

[00073] Os processos para a obtenção de lipossomos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Gregoriadis (1990) e Frezard (1999) ambos citados anteriormente. Qualquer método adequado para a obtenção de lipossomos pode ser usado na prática da invenção ou os lipossomos podem ser obtidos de uma fonte comercial. Os lipossomos são tipicamente preparados por hidratação dos componentes do lipossomo que irão formar a bicamada de lipídeo (por exemplo, fosfolipídeos e colesterol) com uma solução aquosa, que pode ser água pura ou uma solução de um ou mais componentes dissolvidos em água, por exemplo, soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), soro fisiológico livre de fosfato ou qualquer outra solução aquosa fisiologicamente compatível.

[00074] Em uma modalidade, um componente lipossomo ou uma mistura de componentes lipossomos, tal como um fosfolipídeo (por exemplo, Fosfolipon® 90G) e colesterol, pode ser solubilizada em um solvente orgânico, tal como uma mistura de clorofórmio e metanol, seguida por filtração (por exemplo, um filtro PTFE de 0,2 μm) e secagem, por exemplo, por evaporação rotativa, para remover os solventes.

[00075] A hidratação da mistura de lipídeo resultante pode ser efetuada, por exemplo, por injeção da mistura de lipídeo em uma solução aquosa ou por tratamento com ondas sonoras da mistura de lipídeo e uma solução aquosa. Durante a formação de lipossomos, os componentes de lipossomos formam bicamadas simples (unilamelares) ou bicamadas múltiplas (multilamelares) circundando um volume da solução aquosa com a qual os componentes de lipossomo são hidratados.

[00076] Em algumas modalidades, os lipossomos são então desidratados, tais como secagem por congelamento ou liofilização.

[00077] Os lipossomos são combinados com o veículo que compreende uma fase hidrófoba contínua. Isto pode ser realizado em uma variedade de maneiras.

[00078] Se o veículo for composto unicamente de uma substância hidrófoba ou de uma mistura de substâncias hidrófobas (por exemplo, uso de um veículo oleoso 100% mineral), os lipossomos podem simplesmente ser misturados com a substância hidrófoba ou se houver múltiplas substâncias hidrófobas, misturadas com qualquer uma ou com uma combinação das mesmas.

[00079] Se em vez disso o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba contiver uma fase aquosa descontínua, o veículo irá tipicamente assumir a forma de uma emulsão da fase aquosa na fase hidrófoba, tais como uma emulsão de água-em-óleo. Tais composições podem conter um emulsificante para estabilizar a emulsão e para promover uma distribuição uniforme dos lipossomos. Sob este aspecto, os emulsificantes podem ser úteis mesmo se for usado um veículo livre de água, com a finalidade de promover uma distribuição uniforme dos lipossomos no veículo. Os emulsificantes típicos incluem oleato de manida (Arlacel® A), lecitina, Tween® 80 e Spans® 20, 80, 83 e 85. Tipicamente, a proporção em volume (v/v) de substância hidrófoba para emulsificante está na faixa de desde aproximadamente 5:1 até aproximadamente 15:1 com uma proporção de aproximadamente 10:1 sendo preferida.

[00080] Os lipossomos podem ser adicionados à emulsão acabada ou eles podem estar presentes na fase aquosa fase aquosa ou na fase hidrófoba antes da emulsificação.

[00081] O antígeno pode ser introduzido a vários estágios diferentes do processo de formulação. Mais do que um tipo de antígeno pode ser incorporado à composição (por exemplo, um vírus inativado, um vírus vivo atenuado, proteína ou polipeptídeo).

[00082] Em algumas modalidades, o antígeno está presente na solução aquosa usada para hidratar os componentes que são usados para formar as bicamadas de lipídeo dos lipossomos (por exemplo, fosfolipídeo(s) e colesterol). Neste caso, o antígeno será encapsulado no lipossomo, presente em seu interior aquoso. Se os lipossomos resultantes não forem lavados ou secos, tal que haja uma solução aquosa residual presente que seja definitivamente misturada com o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba, é possível que o antígeno adicional possa estar presente fora dos lipossomos no produto final. Em uma técnica relacionada, o antígeno pode ser misturado com os componentes usados para formar as bicamadas de lipídeo dos lipossomos, antes da hidratação com a solução aquosa.

[00083] Em uma abordagem alternativa, o antígeno pode ao contrário ser misturado com o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba, antes, durante ou depois que o veículo é combinado com os lipossomos. Se o veículo for uma emulsão, o antígeno pode ser misturado com uma das fases aquosa ou hidrófoba antes da emulsificação. Alternativamente, o antígeno pode ser misturado com o veículo depois da emulsificação.

[00084] A técnica de combinar o antígeno com o veículo pode ser usada juntamente com a encapsulação do antígeno nos lipossomos como descrito acima, tal que o antígeno esteja presente tanto dentro dos lipossomos como no veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba.

[00085] Os procedimentos descritos acima para a introdução do antígeno na composição se aplicam também ao polil C. Isto é, o polil C pode ser introduzido por exemplo, em qualquer um ou mais de: (1) a solução aquosa usada para hidratar os componentes que forem usados para formar as bicamadas de lipídeo dos lipossomos; (2) os componentes usados para formar as bicamadas de lipídeo dos lipossomos ou (3) o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba, antes, durante ou depois do veículo ser combinado com os lipossomos. Se o veículo for uma emulsão, o polil: C pode ser misturado com uma ou com ambas as fases aquosa ou hidrófoba antes da emulsificação. Alternativamente, o polil: C pode ser misturado com o veículo depois da emulsificação.

[00086] A técnica de combinação do polil: C com o veículo pode ser usada juntamente com a encapsulação do polil: C nos lipossomos, tal que polil: C esteja presente tanto dentro dos lipossomos como no veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba.

[00087] O polil: C pode ser incorporado na composição juntamente com o antígeno na mesma etapa de processamento ou separadamente, em uma diferente etapa de processamento. Por exemplo, o antígeno e o polil: C podem ambos estar presentes na solução aquosa usada para hidratar os componentes do lipossomo que formam a bicamada de lipídeo, tal que tanto o antígeno como o polil: C se tornem encapsulados nos lipossomos. Alternativamente, o antígeno pode ser encapsulado nos lipossomos e o polil: C misturado com o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba. Será considerado que são possíveis muitas tais combinações.

[00088] Se a composição contiver um ou mais adjuvantes, o adjuvante pode ser incorporado à composição juntamente com o antígeno na mesma etapa de processamento ou separadamente, a uma etapa de processamento diferente.

[00089] Por exemplo, o antígeno e o adjuvante podem ambos estar presentes na solução aquosa usada para hidratar os componentes lipossomos que formam bicamada de lipídeo, tal que tanto o antígeno como o adjuvante se tornem encapsulados nos lipossomos. Alternativamente, o antígeno pode ser encapsulado nos lipossomos e o adjuvante misturado com o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba.

[00090] Estabilizadores tais como açúcares, antioxidantes ou conservantes que mantenham a atividade biológica ou melhorem a estabilidade química para prolongar o prazo de validade do antígeno, o adjuvante, os lipossomos ou o veículo hidrófobo contínuo, podem ser adicionados a tais composições.

[00091] Em algumas modalidades, pode ser usada uma mistura de antígeno/polil : C, em cujo caso o antígeno e o polinucleotídeo polil: C são incorporados à composição ao mesmo tempo. Uma mistura de "antígeno/polil : C" refere-se a uma modalidade em que o antígeno e o polinucleotídeo polil: C estão no mesmo diluente pelo menos antes da incorporação à composição. O antígeno e o polinucleotídeo polil: C em uma mistura de antígeno/polil: C pode, porém não é, necessariamente ligada quimicamente, tal como por ligação covalente.

[00092] Similarmente, em algumas modalidades, pode ser usada uma mistura de antígeno/adjuvante, em cujo caso o antígeno e o adjuvante são incorporados à composição ao mesmo tempo. Uma "mistura de antígeno/adjuvante"refere-se a uma modalidade em que o antígeno e o adjuvante estão no mesmo diluente pelo menos antes da incorporação à composição. O antígeno e o adjuvante em uma mistura de antígeno/adjuvante pode, porém não precisa, estar necessariamente ligada quimicamente, tal como por ligação covalente.

[00093] Em algumas modalidades, o veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba pode ele mesmo ter uma atividade como adjuvante. O adjuvante incompleto de Freund, é um exemplo de um veículo hidrófobo com efeito de adjuvante. Como usado neste caso e nas reivindicações, quando for usado o termo "adjuvante", pretende-se que este indique a presença de um adjuvante além de qualquer atividade como adjuvante fornecida pelo veículo que compreende uma fase contínua de uma substância hidrófoba.

[00094] As composições como descritas neste caso podem ser formuladas em uma forma que seja adequada para administração oral, nasal, retal ou parenteral. A administração parenteral inclui modos de administração intravenosa, intraperitoneal, intradermal, subcutânea, intramuscular, transepitelial, intrapulmonar, intratecal e tópica. As vias preferidas incluem intramuscular, subcutânea e intradermal para se conseguir um efeito de depósito. Em modalidades em que a composição da invenção for para o tratamento de tumores cancerosos, a composição pode ser formulada para aplicação por injeção diretamente no tumor ou adjacente ao tumor. Em algumas modalidades, a composição pode ser aplicada uniformemente sobre ou através do tumor para melhorar a biodistribuição e portanto melhorar o benefício terapêutico.

[00095] Em outras modalidades, uma composição da invenção pode ser formulada com polil: C à base de DNA, polil: C à base de RNA ou uma mistura de polil: C à base de RNA e de DNA. Neste contexto, uma mistura de RNA e DNA pode se referir a nucleotídeos, tal que cada filamento possa compreender nucleotídeos de DNA e RNA; aos filamentos, tal que cada polinucleotídeo com filamento duplo tenha um filamento de DNA e um filamento de RNA filamento; ao polinucleotídeo, tal que uma composição contenha polinucleotídeos polil: C, cada um dos quais é composto totalmente de RNA ou composto totalmente de DNA ou de combinações dos mesmos.

[00096] Em outras modalidades, as composições da invenção podem ser formuladas para uso em combinação com um epitopo de célula T ou com um epitopo de célula B. O epitopo de célula T pode ser um epitopo de célula T universal e o epitopo de célula B pode ser um epitopo de célula B universal, Como usado neste caso, um "epitopo universal" pode ser qualquer epitopo que seja amplamente reconhecido, por exemplo, por células T ou por células B de múltiplas variedades de um animal. Em uma modalidade, o epitopo de célula T pode ser peptídeo toxóide tetânico tal como F21 E. Em uma outra modalidade, o epitopo de célula T pode ser PADRE, um epitopo de célula T de helper universal. Outros epitopos universais que podem ser adequados para uso no contexto da invenção são conhecidos da pessoa perita na técnica ou pode ser facilmente identificado usando-se técnicas de rotina.

[00097] Em modalidades relacionadas, uma composição da invenção compreende um polinucleotídeo polil: C e um antígeno, em que a presença do polinucleotídeo polil: C e do antígeno em termos de peso ou de número de moléculas esta em uma proporção menor do que 1 para 1.000, menor do que 1 para 900, menor do que 1 para 800, menor do que 1 para 700, menor do que 1 para 500, menor do que 1 para 400, menor do que 1 para 300, menor do que 1 para 200, menor do que 1 para 100, e menor do que 1 para 50, e menor do que 1 para 10, menor do que 1 para 5, menor do que 1 para 2, de aproximadamente 1 para 1, maior do que 2 para 1, maior do que 5 para 1, maior do que 10 para 1, maior do que 50 para 1, maior do que 100 para 1, maior do que 200 para 1, maior do que 300 para 1, maior do que 400 para 1, maior do que 500 para 1, maior do que 600 para 1, maior do que 700 para 1, maior do que 800 para 1, maior do que 900 para 1, maior do que 1.000 para 1.

[00098] A quantidade ótima de polinucleotídeo polil: C para antígeno para provocar uma resposta imunológica ótima pode depender de alguns fatores inclusive, sem limitação, a composição, a doença, o sujeito e pode ser facilmente confirmada pela pessoa perita na técnica que usa estudos padronizados inclusive, por exemplo, observações de títulos de anticorpo e de outras respostas imunogênicas no hospedeiros.

Kits e Reagentes

[00099] A presente invenção é opcionalmente fornecida um usuário como um kit. Por exemplo, um kit da invenção contém uma ou mais das composições da invenção. O kit também pode compreende um ou mais reagentes adicionais, material para embalagem, recipientes para conter os componentes do kit e um conjunto de instruções ou um manual para o usuário que apresenta em detalhes os métodos preferidos de utilização dos componentes do kit.

Métodos de Uso

[000100] A invenção encontra aplicação em qualquer caso em que for desejado administrar um antígeno a um sujeito. O sujeito pode ser um vertebrado, tal como um peixe, uma ave ou um mamífero, de preferência um ser humano.

[000101] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas a um sujeito para provocar e/ou melhorar uma resposta do anticorpo ao antígeno.

[000102] Como usado neste caso, "provocar" uma resposta imunológica é induzir e/ou potenciar uma resposta imunológica. Como usado neste caso, "melhorar" uma resposta imunológica é elevar, melhorar ou reforçar a resposta imunológica para benefício do hospedeiro em relação ao status anterior da resposta imunológica, por exemplo, antes da administração de uma composição da invenção.

[000103] Um "anticorpo" é uma proteína que compreende um ou mais polipeptídeos substancialmente ou parcialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante K, À, α, v, δ, ε e μ, assim como muitos genes da região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como K ou À. As cadeias pesadas são classificadas como Y, μ, α, δ ou ε, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) típica compreende uma proteína que contém quatro polipeptídeos. Cada unidade estrutural de anticorpo é composta de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada uma tendo uma cadeia "leve" e uma "pesada". O terminal N de cada cadeia define uma região variável principalmente responsável por reconhecimento do antígeno. As unidades estruturais de anticorpo (por exemplo, das classes IgA e IgM) podem também se reunir em formas oligoméricas entre si e as cadeias de polipeptídeo adicionais, por exemplo como pentâmeros IgM em associação com o polipeptídeo da cadeia J.

[000104] Os anticorpos são os produtos de glicoproteína antígeno específicos de um subconjunto de células brancas do sangue denominadas linfócitos B (células B). O encaixe de antígeno com o anticorpo expresso sobre a superfície de células B pode induzir uma resposta do anticorpo que compreende estimular as células B para se tornarem ativadas, para sofrer mitose e para se diferenciar terminalmente em células de plasma, que são especializadas para síntese e secreção de anticorpo antígeno específico.

[000105] Como usado neste caso, o termo "resposta de anticorpo" refere-se a um aumento na quantidade de anticorpos antígeno específicos no corpo de um sujeito em resposta à introdução do antígeno no corpo do sujeito.

[000106] Um método de avaliar uma resposta do anticorpo é medir os títulos de anticorpos que reagem com um antígeno em particular. Isto pode ser realizado usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica tal como o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) de substâncias contendo anticorpo obtidas de animais. Por exemplo, os títulos de anticorpos do soro que se ligam a um antígeno em particular podem ser determinados em um sujeito tanto antes como depois da exposição ao antígeno. Um aumento estatisticamente significativo no título de anticorpos antígeno-específicos após exposição ao antígeno indicaria que o sujeito tinha apresentado uma resposta do anticorpo ao antígeno.

[000107] Outros ensaios que podem ser usados para detectar a presença de um anticorpo antígeno-específico include, sem limitação, ensaios imunológicos (por exemplo, radioimunoensaio (RIA)), ensaios de imunoprecipitação e ensaios blot de proteína (por exemplo, Western blot) e ensaios de neutralização (por exemplo, neutralização de infectividade viral em um ensaio in vitro ou in vivo).

[000108] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem ser administradas a um sujeito para provocar e/ou melhorar uma resposta imunológica mediada pela célula ao antígeno. Como usado neste caso, o termo "resposta imunológica mediada pela célula" refere-se a um aumento na quantidade de linfócitos T citotóxicos antígeno-específicos, macrófagos, células exterminadoras naturais ou citocinas no corpo de um sujeito em resposta à introdução do antígeno no corpo do sujeito.

[000109] Historicamente, o sistema imunológico foi separado em duas ramificações: imunidade humoral, para a qual a função protetora de imunização podia ser encontrada no humor (fluido do corpo livre de célula ou soro que contém anticorpos) e imunidade celular, para a qual a função protetora de imunização estava associada com as células.

[000110] A imunidade mediada pela célula é uma resposta imunológica que envolve a ativação de macrófagos, células exterminadoras naturais (NK), linfócitos T citotóxicos antígeno- específicos e a liberação de várias citocinas em resposta a um 'antígeno não-self'. A imunidade celular é um componente importante de resposta imunológica de adaptação e depois do reconhecimento de antígeno ou células através de sua interação com células que apresentam antígeno tais como células dendríticas, linfócitos B e até uma menor extensão, macrófagos, protege o corpo por vários mecanismos tais como: 1. ativação de linfócitos-T citotóxicos antígeno-específicos que sejam capazes de induzir apoptose em células do corpo que apresentam epitopos de antígeno estranho sobre a sua superfície, tais como células infectadas por vírus, células com bactérias intracelulares e células cancerosas que apresentam antígenos para tumor; 2. ativação de macrófagos e de células exterminadoras naturais, permitindo que estas destruam patógenos intracelulares e 3. estimulação de células para produzir uma variedade de citocinas que influenciam a função de outras células envolvidas em respostas imunológicas de adaptação e em respostas imunológicas inatas.

[000111] A imunidade mediada pela célula é a mais eficaz para a remoção de células infectadas por vírus, porém também participa na defesa contra fungos, protozoários, cânceres e bactérias intracelulares. Ela também representa um papel principal em rejeição de transplante.

Detecção de resposta imunológica mediada por célula após a vacinação

[000112] Como a imunidade mediada pela célula envolve a participação de vários tipos de célula e é mediada por diferentes mecanismos, podiam ser usados vários métodos para demonstrar a indução de imunidade depois da vacinação. Estes podiam ser amplamente classificados em detecção de: i) células que apresentam antígeno específico; ii) células efetoras específicas e suas funções e iii) liberação de mediadores solúveis tais como citocinas.

[000113] i) Células que apresentam antígeno: Células dendríticas e células B (e até uma menor extensão, macrófagos) são equipadas com receptores imuno-estimuladores especiais que são responsáveis pela ativação melhorada de células T e são denominadas células que apresentam antígeno profissional (APC). Estas moléculas imuno- estimulantes (também denominadas moléculas co-estimulantes) são reguladas sobre estas células após infecção ou vacinação, durante o processo de apresentação do antígeno para células efetoras tais como células T citotóxicas CD4 e CD8. Tais moléculas co-estimulantes (tais como CD80, CD86, MHC classe I ou MHC classe II) podem ser detectadas usando-se citometria de fluxo com anticorpos conjugados a fluorocromo dirigidos contra estas moléculas juntamente com anticorpos que identificam especificamente APC (tal como CD11c para células dendríticas).

[000114] ii) Células T citotóxicas: (também conhecidas como Tc, célula T exterminadora ou linfócito T citotóxico (CTL)) são um sub- grupo de células T que induzem a morte de células que são infectadas com vírus (e com outros patógenos) ou que expressam antígenos de tumor. Estes CTLs atacam diretamente outras células que contêm certas moléculas estranhas ou anormais sobre a sua superfície. A capacidade de tal citotoxicidade celular pode ser detectada usando ensaios citolíticos in vitro (ensaio de liberação de cromo). Desse modo, a indução da imunidade celular de adaptação pode ser demonstrada pela presença de tais células T citotóxicas, em que, quando as células alvo carregadas com antígeno são lisadas por CTLs específicas que são geradas in vivo após a vacinação ou a infecção.

[000115] As células T citotóxicas naive são ativadas quando o seu Receptor de célula T (TCR) interage fortemente com uma molécula de classe I MHC ligada a peptídeo. Esta afinidade depende do tipo e da orientação do complexo antígeno/MHC e é o que mantém a CTL e a célula infectada ligadas. Uma vez ativada a CTL sofre um processo denominado expansão clonal em que ela ganha funcionalidade e se divide rapidamente, para produzir um exército de células efetoras "armadas". A CTL irá então trafegar através do corpo à procura de células que contenham aquela MHC Classe I + peptídeo. Isto podia ser usado para identificar tais CTLs in vitro utilizando os tetrâmetros da Classe I de peptídeo-MHC em ensaios de citometria de fluxo.

[000116] Quando expostas a estas células somáticas infectadas ou disfuncionais, CTL efetoras liberam perforina e granulisina: citotoxinas que formam poros na membrana do plasma da célula alvo, permitindo que íons e água escoem para a célula infectada e fazendo com que esta exploda ou lise. CTL granzima de liberação, uma serina protease que entra nas células pelos poros para induzir apoptose (morte da célula). A liberação destas moléculas de CTL pode ser usada como uma medida de indução bem sucedida de resposta imunológica celular depois da vacinação. Isto pode ser feito pelo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou pelo ensaio imunospot ligado a enzima (ELISPOT) em que CTLs podem ser medidas quantitativamente. Como CTLs também são capazes de produzir importantes citocinas tal como IFN-Y, a medida quantitativa de células CD8 produtoras de IFN-Y pode ser conseguida por ELISPOT e por medida fluxocitométrica de IFN-Y intracelular nestas células.

[000117] Células T CD4+ "helper": linfócitos CD4+ ou células T helper, são mediadores de resposta imunológica e representam um papel importante em estabelecer e maximizar as capacidades da resposta imunológica de adaptação. Estas células não têm atividade citotóxica ou fagocítica e não podem matar as células infectadas ou os patógenos transparentes, porém, em essência "controlam" a resposta imunológica, dirigindo outras células para realizar estas tarefas. Dois tipos de respostas de célula T efetora CD4 helper podem ser induzidos por um APC profissional, designados Th1 e Th2, cada um designado para eliminar os diferentes tipos de patógenos.

[000118] As células helper T expressam receptores de célula Ts (TCR) que reconhecem o antígeno ligado ás moléculas MHC da Classe Il. A ativação de uma célula T helper naive faz com que esta libere citocinas, o que influencia a atividade de muitos tipos de célula, inclusive a APC que ativou a mesma. Como as células T helper requerem um estímulo muito mais brando de ativação do que as células T citotóxicas. As células T helper podem fornecer sinais extra que "ajudam" a ativar as células citotóxicas. Dois tipos de respostas de célula T helper CD4+ efetora podem ser induzidas por um APC profissional, designados Th1 e Th2, cada um designado para eliminar os diferentes tipos de patógenos. As duas populações de célula Th diferem no padrão das proteínas efetoras (citocinas) produzido. Em geral, As células Th1 ajudam a resposta imunológica celular por ativação de macrófagos e de células T citotóxicas; ao passo que As células Th2 promovem a resposta imunológica humoral por estimulação de Células B para conversão em células de plasma e pela formação de anticorpos. Por exemplo, uma resposta regulada pelas células Th1 pode induzir lgG2a e lgG2b em camundongo (IgGI e lgG3 em seres humanos) e favorecer a resposta imunológica mediada pela célula para um antígeno. Se a resposta IgG a um antígeno for regulada pelas células do tipo Th2, esta pode melhorar predominantemente a produção de IgGI em camundongo (lgG2 em seres humanos). A medida de citocinas associada com as respostas Th1 ou Th2 dará uma medida da vacinação bem sucedida. Isto pode ser conseguido por ELISA específico projetado para citocinas Th1 tais como IFN-Y,IL-2, IL-12, TNF-α e outros ou citocinas Th2 tais como IL- 4, IL-5, IL10 entre outros.

[000119] iii) A Medida de citocinas: liberadas de nódulos linfáticos regionais fornece uma boa indicação de imunização bem sucedida. Como um resultado de apresentação de antígeno e maturação de APC e de células imunológicas efetoras tais como as células CD4 e CD8 T, diversas citocinas são liberadas por células do nódulo linfático. Pela cultura destas LNC in vitro na presença de antígeno, a resposta imunológica antígeno específica pode ser detectada medindo a liberação de certas citocinas importantes tais como IFN-y, IL-2, IL-12, TNF-α e GM-CSF. Isto podia ser feito por ELISA usando-se os sobrenadantes da cultura e as citocinas recombinantes como padrões.

[000120] A imunização bem sucedida pode ser determinada de algumas maneiras conhecidas da pessoa paerita na técnica inclusive, porém não se limitando a, inibição da hemaglutinaçao (HAIJ e ensaios de neutralização de soro para detectar anticorpos funcionais; estudos de desafio, em que sujeitos vacinados são testados com o patógeno associado para determinar a eficiência da vacinação e o uso de escolha de célula ativada por fluorescência (FACS) para determinar a população de células que expressam um marcador específico da superfície da célula, por exemplo, na identificação de linfócitos ativados ou de memória. Uma pessoa perita na técnica também pode determinar se a com uma composição da invenção provocaria um anticorpo e/ou a resposta imunológica mediada pela célula usando-se outros métodos conhecidos. Ver, por exemplo, Current Protocols in Immunology, Coligan e outros, ed. (Wiley Interscience, 2007).

[000121] Em outras modalidades, as composições da invenção podem ser administradas a um sujeito para provocar e/ou melhorar um anticorpo e uma resposta imunológica mediada pela célula ao antígeno.

[000122] A invenção encontra ampla aplicação na prevenção e no tratamento de qualquer doença suscetível de prevenção e/ou de tratamento por meio de administração de um antígeno. As aplicações representativas da invenção incluem tratamento e prevenção de câncer, terapia genética, terapia auxiliar, tratamento e prevenção de doença infecciosa, tratamento e prevenção de alergia, tratamento e prevenção de doença autoimune, tratamento de doença neurodegenerativa e tratamento de arterosclerose, tratamento e prevenção de dependência de drogas, controle de hormônio para tratamento e prevenção de doença, controle de um processo biológico com a finalidade de contracepção.

[000123] A prevenção ou o tratamento de doença inclui a obtenção de resultados benéficos ou desejados, inclusive de resultados clínicos. Os resultados clínicos benéficos ou desejados podem incluir, mas não estão limitados a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas ou condições, diminuição da extensão da doença, estabilização do estado da doença, prevenção do desenvolvimento da doença, prevenção de crescimento ou difusão da doença, atraso ou retardamento da progressão da doença, atraso ou retardamento do início da doença, conferindo imunidade protetora contra um agente causador da doença e melhoria ou medidas paliativas do estado da doença. A prevenção ou o tratamento também pode significar prolongar a sobrevivência de um paciente além do esperado na ausência de tratamento e pode também significar a inibição do progresso da doença temporariamente, embora mais preferivelmente, isto envolva a prevenção da ocorrência da doença tal como ou prevenção da infecção em um sujeito.

[000124] O perito na técnica pode determinar regimes de tratamento adequados, vias de administração, dosagens etc., para qualquer aplicação em particular para se conseguir o resultado desejado. Os fatores que podem ser levados em conta incluem, por exemplo, a natureza do antígeno; o estado da doença a ser prevenido ou tratado; a idade, a condição física, peso do corpo, sexo e dieta do sujeito e outros fatores clínicos. Ver, por exemplo, "Vaccine Handbook", editado por Researcher's Associates (Gaku-yuu-kai) de The National Institute de Health (1994); "Manual of Prophylactic Inoculation, 8a. Edição", editado por Mikio Kimura, Munehiro Hirayama e Harumi Sakai, Kindai Shuppan (2000); "Minimum Requirements for Biological Products", editado pela Association de Biologicals Manufacturers de Japan (1993).

Respostas imunológicas

[000125] Uma composição da invenção pode ser usada para induzir uma resposta do anticorpo e/ou uma resposta imunológica mediada pela célula ao antígeno que é formulado na composição em um sujeito em necessidade do mesmo. Uma resposta imunológica pode ser provocada e/ou melhorada em um sujeito em necessidade do mesmo a qualquer antígeno e/ou à célula que expresse o mesmo. Desse modo, nas modalidades da invenção, uma composição pode compreender um antígeno derivado de uma bactéria, de um vírus, de um fungo, de um parasita, de um alergênio ou de uma célula tumoral e pode ser formulado para uso no tratamento e/ou na prevenção de uma doença causada por uma bactéria, por um vírus, por um fungo, por um parasita, por um alergênio ou por uma célula tumoral, respectivamente.

[000126] Uma composição da invenção pode ser adequada para uso no tratamento e/ou na prevenção de câncer em um sujeito em necessidade do mesmo. O sujeito pode ter câncer ou pode estar sob risco de desenvolver câncer. Os cânceres que podem ser tratados e/ou prevenidos pelo uso ou pela administração de uma composição da invenção incluem, sem limitação, carcinoma, adenocarcinoma, linfoma, leucemia, sarcoma, blastoma, mieloma e tumores da célula germinativa. Em uma modalidade, o câncer pode ser causado por um patógeno, tal como por um vírus. Os vírus ligados ao desenvolvimento de câncer são conhecidos da pessoa perita na técnica e incluem, porém não estão limitados a, vírus do papiloma humano (HPV), vírus de John Cunningham (JCV), vírus 8 herpes humano, Vírus de Epstein Barr (EBV), vírus de polioma da célula de Merkel, Vírus da Hepatite C e vírus-1 de célula T de leucemia humana. Uma composição da invenção pode ser usada para o tratamento ou para a profilaxia de câncer, por exemplo, na redução da gravidade de câncer ou na prevenção de recorrências de câncer. Os cânceres que podem se beneficiar pelas composições da invenção incluem qualquer célula maligna que expresse um ou mais antígenos específicos de tumor.

[000127] Uma composição da invenção pode ser adequada para uso no tratamento e/ou na prevenção de uma infecção viral em um sujeito em necessidade do mesmo. O sujeito pode ser infectado com um vírus ou pode estar sob risco de desenvolver a infecção viral. As infecções virais que podem ser tratadas e/ou prevenidas pelo uso ou pela administração de uma composição da invenção incluem, sem limitação, vírus Cowpox (da varíola bovina), vírus da Vaccinia, vírus Pseudocowpox da pseudovaríola, vírus Herpes 1 humano, vírus Herpes 2 humano, Citomegalovírus, adenovírus A-F humano, vírus de polioma, vírus do papiloma humano, Parvovírus, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite B, vírus da Hepatite C, vírus da imunodeficiência humana, Orthoreovírus, Rotavírus, vírus Ebola, vírus da parainfluenza, vírus da influenza A, vírus da influenza B, vírus da influenza C, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus da rubéola, Pneumovírus, vírus sincial respiratório humano, vírus da raiva, vírus da encefalite da Califórnia, vírus da encefalite japonesa, vírus Hantaan, vírus da coriomeningite linfocítica, vírus Corona, Enterovírus, Rinovírus, Poliovírus, Norovírus, Flavivírus, vírus da Dengue, vírus do Nilo ocidental, vírus da febre amarela varicela.

[000128] Em uma modalidade, uma composição da invenção pode ser usada para tratar e/ou para prevenir uma infecção causada pelo vírus da influenza em um sujeito em necessidade do mesmo. A influenza é um vírus RNA filamentado simples da família Orthomyxoviridae e é frequentemente caracterizado baseado em duas grandes glicoproteínas no lado de fora da partícula viral, hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). Foram identificados numerosos subtipos de HA de influenza A (Kawaoka e outros, Virology (1990) 179:759-767; Webster e outros, "Antigenoic variation among type A influenza viruses," p. 127-168. In: P. Palese e D. W. Kingsbury (ed.), Genetics de influenza viruses. Springer-Verlag, New York).

[000129] Uma composição da invenção pode ser adequada para uso no tratamento e/ou na prevenção de uma doença neurodegenerativa em um sujeito em necessidade do mesmo, em que a doença neurodegenerativa está associada com a expressão de um antígeno. O sujeito pode ter a doença neurodegenerativa ou pode estar sob risco de desenvolver a doença neurodegenerativa. As doenças neurodegenerativas que podem ser tratadas e/ou prevenidas pelo uso ou pela administração de uma composição da invenção incluem, sem limitação, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e esclerose amiotrófica lateral (ALS).

[000130] Em uma modalidade, uma composição da invenção pode ser usada para tratar e/ou evitar doença de Alzheimer em um sujeito em necessidade do mesmo. A doença de Alzheimer é caracterizada pela associação de placas e-amilóides e/ou de proteínas tau nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer (ver, por exemplo, Goedert e Spillantini, Science, 314: 777-781, 2006). Foi proposto que o vírus Herpes simplex do tipo 1 também representa um papel causador em pessoas que apresentam as versões suscetíveis do gene apoE (Itzhaki e Wozniak, J Alzheimers Dis 13: 393-405, 2008).

[000131] Um sujeito ao qual foi administrado ou que foi tratado com uma composição da invenção pode resultar no aumento de um anticorpo e/ou de resposta imunológica mediada pela célula ao antígeno em relação a um sujeito tratado com uma composição de controle. Como usado neste caso, uma "composição de controle" pode se referir a qualquer composição que não contenha pelo menos um componente da composição reivindicada. Desse modo, a composição de controle não contém pelo menos um de 1) um antígeno, 2) lipossomo, 3) polil : Cor 4) um veículo hidrófobo. Em uma modalidade, a composição de controle não contém polil: C/. Em outras modalidades, a composição de controle pode conter alúmen em vez de polil: C.

[000132] Um sujeito ao qual foi administrado ou que foi tratado com uma composição da invenção pode provocar uma resposta imunológica do anticorpo que seja de pelo menos 1,50 x, de pelo menos 1,75 x, de pelo menos 2 x, de pelo menos 2,5 x, de pelo menos 3 x, de pelo menos 3,5 x, de pelo menos 4 x, de pelo menos 4,5 x ou de pelo menos 5 x mais alta em relação a um sujeito tratado com a composição de controle. Em uma modalidade, o título de anticorpo (expresso em termos de valor de Iog 10) do soro de um sujeito tratado com uma composição da invenção é de pelo menos 0,05, de pelo menos 0,10, de pelo menos 0,15, de pelo menos 0,20, de pelo menos 0,25 ou de pelo menos 0,30 mais alto do que de um sujeito tratado com uma composição de controle.

[000133] Um sujeito ao qual foi administrado ou que foi tratado com uma composição da invenção pode provocar uma resposta imunológica mediada pela célula que seja de pelo menos 1,50 x, de pelo menos 1,75 x, de pelo menos 2 x, de pelo menos 2,5 x, de pelo menos 3 x, de pelo menos 3,5 x, de pelo menos 4 x, de pelo menos 4,5 x ou de pelo menos 5 x mais alta em relação a um sujeito tratado com uma composição de controle.

[000134] Um sujeito ao qual foi administrado ou que foi tratado com uma composição da invenção pode provocar uma população de célula T de memória que seja de pelo menos 1,50 x, de pelo menos 1,75 x, de pelo menos 2 x, de pelo menos 2,5 x, de pelo menos 3 x, de pelo menos 3,5 x, de pelo menos 4 x, de pelo menos 4,5 x ou de pelo menos 5 x mais alta em relação a um sujeito tratado com uma composição de controle.

[000135] Um sujeito ao qual foi administrado ou que foi tratado com uma composição da invenção pode evitar o desenvolvimento e/ou retardar o início de um tumor em um sujeito, em relação a um sujeito tratado com uma composição de controle.

[000136] A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1

[000137] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000138] A proteína hemaglutinina recombinante H5N1, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante possui um peso molecular aproximado de 72.000 dáltons e corresponde à glicoproteína hemaglutinina, uma proteína antigênica presente na superfície do vírus H5N1 da influenza. Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usada a 1 micrograma por dose de 30 microlitros.

[000139] A eficiência da vacina foi avaliada pelo o ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), um processo que permite a detecção de níveis de anticorpo antígeno-específico no soro de animais imunizados. A realização de ELISA nos soros coletados de camundongos imunizados em um intervalo regular (a cada quatro semanas por exemplo), é útil para monitorar as respostas do anticorpo para uma dada formulação de vacina. Em resumo, uma placa de microtítulo com 96 poços é revestida com antígeno (rHA, 1 micrograma/mililitro) durante toda a noite a 4 graus Celsius, bloqueado com 3% de gelatina durante 30 minutos, então incubada durante toda a noite a 4 graus Celsius com diluições em série de soros, tipicamente iniciando a uma diluição de 1/2000. Um reagente secundário (proteína G conjugada a fosfatase alcalina, EMD chemicals, Gibbstown, NJ, USA) é então adicionado a cada poço a uma diluição de 1/500 durante uma hora a 37 graus Celsius. Depois de uma incubação durante 60 minutos com uma solução que contém 1 miligrama/mililitro de sal dissódico de fosfato de 4-nitrofenila hexahidratado (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça), a absorvância de 405 nanômetros de cada poço é medida que usa uma placa leitora de microtítulo (ASYS Hitech GmbH, Áustria). Os títulos de ponto final são calculados como descrito em Frey A. e outros (Journal de Immunological Methods, 1998, 221: 35-41). Os títulos calculados representam a mais alta diluição na qual um aumento estatisticamente significativo em absorvância é observado em amostras de soro provenientes de camundongos imunizados versus amostras de soro provenientes de camundongos de controle não imunizados, naive. Os títulos são apresentados como valores de log 10 da diluição do ponto final.

[000140] Para formular a vacina aqui descrita, uma mistura homogênea de 10:1 em peso : peso de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de uma solução de rHA em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) para formar lipossomos com rHA encapsulado. Em resumo, 33 microgramas de rHA foram primeiro suspensos em 300 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas de mistura de lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 450 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. Para cada 450 microlitros de suspensão de lipossomo contendo rHA, foram adicionados dois miligramas de Imject Adjuvant alum (Pierce, Rockford, IL, USA). Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral equivalente a adjuvante incompleto de Freund (conhecido como Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) foi adicionado para formar a emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e no óleo que forma a fase hidrófoba contínua. Cada dose de vacina consistia de 30 microlitros da emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante alúmen e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo.

[000141] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos descritos acima com a seguinte exceção: depois da formação de lipossomos que encapsulam rHA e depois da extrusão da suspensão de lipossomo através da membrana de policarbonato de 200 nanômetros, foram adicionados 133 microgramas de adjuvante polil: C (Pierce, Rockford, IL, USA) para cada 450 microlitros de lipossomos. Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, foi adicionado um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) para formar uma emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e o óleo que forma a fase contínua. Cada dose de vacina consistia em 30 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação em particular será denominada lipossomo/polil : C/veículo hidrófobo.

[000142] A eficiência das duas formulações de emulsão descritas acima foi comparada à eficiência de uma vacina de controle que consiste em 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de adjuvante alúmen em 30 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4). Dois grupos de camundongos (9 ou 10 camundongos por grupo) foram injetados uma vez (sem reforço) com formulações de vacina com lipossomo, intramuscularmente, como a seguir: camundongos do Grupo 1 foram vacinados com Vacina B que compreende 1 micrograma de antígeno de rHA formulado em 30 microlitros de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Cada dose de vacina continha efetivamente 4 microgramas de polil: C/. Camundongos do Grupo 2 foram vacinados com Vacina A que compreende 1 micrograma de rHA formulado em 30 microlitros de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo como descrito acima. Cada dose de vacina continha efetivamente 60 microgramas de alúmen. O grupo de controle de camundongos (Grupo 3, n = 10) foi injetado intramuscularmente com a vacina de alúmen de controle que consiste em 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de alúmen suspensos em soro fisiológico tamponado com fosfato. Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 18 dias e 28 dias depois da imunização. Os títulos de anticorpo nestes soros foram examinados por ELISA como descrito acima.

[000143] Camundongos do Grupo 3 geraram uma resposta detectável de anticorpo antígeno-específico como era de se esperar depois da administração de uma vacina de controle com adjuvante alúmen. Não surpreendentemente, os Camundongos do Grupo 2 vacinados com uma formulação de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo geraram uma resposta de anticorpo consideravelmente mais alta. Embora estes resultados fossem esperados, o uso de adjuvante polil: C em vez de adjuvante alúmen em uma formulação de lipossomo/polil : C/veículo hidrófobo (camundongos do Grupo 1), forneceram algum resultado inesperado; os títulos de anticorpo foram significativamente mais altos do que aqueles gerados pela formulação de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo (Grupo 2).

[000144] Camundongos do Grupo 3, vacinados com a formulação aquosa de controle descrita acima, geraram títulos de ponto final de até 1/32.000 e 1/64.000 a 18 e 28 dias depois da vacinação (valores de Iog10 de 4,51 e 4.81 respectivamente). Os títulos de ponto final a 18 e 28 dias depois da vacinação no Grupo 2 eram de até 1/256.000 (valor de log 10 de 5,41). A presença de tais respostas de anticorpo a 18 e 28 dias (4 semanas) depois da vacinação confirma que foi gerada uma resposta imunológica genuína como um resultado da vacinação. Camundongos do Grupo 1 aos quais foi injetada a formulação correspondente à invenção foram capazes de gerar uma resposta imunológica melhorada com títulos de ponto final que atingem até 1/1.024.000 (valor de log 10 de 6,01) a 18 dias depois da vacinação e 1/8.192.000 (um valor de Iog 10 de 6,91 a quatro semanas depois da imunização. Estes resultados indicam que as formulações de lipossomo/veículo hidrófobo que contêm um adjuvante polil: C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo significativamente melhorada comparada a lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo e vacinações aquosas/alúmen de controle.

Exemplo 2

[000145] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000146] Como no Exemplo 1, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirido de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1 micrograma por dose de 30 microlitros.

[000147] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos como descrito no exemplo um. No resumo, 33 microgramas de rHA foram suspensos em 300 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas de uma mistura de Lecitina S100/colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) para formar aproximadamente 450 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini- extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. Para cada 450 microlitros de suspensão de lipossomo contendo rHA, foram adicionados 133 microgramas de adjuvante polil: C (Pierce, Rockford, IL, USA). Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) foi adicionado para formar uma emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida dentro da fase aquosa da emulsão e o óleo que forma a fase hidrófoba contínua. Cada dose de vacina consistia de 30 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação em particular será denominada lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo.

[000148] A eficiência da vacina de lipossomo/polil C/veículo hidrófobo descrita acima foi comparada à eficiência de uma vacina aquosa de controle que contém adjuvante polil : C. Dois grupos de camundongos (9 ou 10 camundongos por grupo) foram injetados uma vez, intramuscularmente, com 30 microlitros por dose. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com Vacina B que compreende 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C formulados em 30 microlitros de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Os camundongos do Grupo 2 foram injetados com 30 microlitros da vacina de polil: C de controle que compreende 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C formulado em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4). Amostras de soro foram coletadas de todos os camundongos a 18 e 28 dias depois da imunização. Os títulos de anticorpo de rHA das amostras de soros foram examinados por ELISA como descrito em exemplo 1.

[000149] Os camundongos do Grupo 2 geraram uma resposta anticorpo antígeno-específico detectável depois da administração de uma vacina de controle com adjuvante polil : C. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a formulação de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo, forneceram títulos de ponto final significativamente melhorados comparados àqueles dos Grupo 2. Os camundongos do Grupo 2 geraram títulos para 1/128.000 (valor de log 10 de 5,11) a 18 dias depois da vacinação e de 1/1.024.000 (log 10 igual a 6,01) a 28 dias (4 semanas) depois da vacinação. Como observado no exemplo 1, a presença de tais respostas de anticorpo confirma uma resposta imunológica genuína gerada como um resultado da vacinação. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a vacina correspondente à invenção, foram capazes de gerar títulos de ponto final que atingem até 1/1.024.000 (valor de Log 10 de 6,01) a 18 dias depois da vacinação e 1/8.192.000 (um valor de Log 10 de 6,91) a quatro semanas depois da imunização. Estes resultados indicam que as formulações de lipossomo/veículo hidrófobo que contém um adjuvante polil C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo significativamente melhorada em comparação com uma vacina aquosa de polil: C de controle.

Exemplo 3

[000150] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000151] Como nos exemplos 1 e 2, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1 micrograma por dose de 50 microlitros.

[000152] Para formular a vacina correspondente à invenção, uma mistura homogênea de 10:1 de peso : peso de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de uma solução de rHA e de um adjuvante polil C (Pierce, Rockford, IL, USA) em tampão de fosfato para formar lipossomos com rHA encapsulado e adjuvante. Em resumo, 20 microgramas de rHA e 200 microgramas de polil: C foram primeiros suspensos em 250 microlitros de tampão de fosfato 50 mil imolar (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas da mistura de Lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 400 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA e adjuvante polil : C. A preparação do lipossomo foi diluída à metade usando-se tampão de fosfato 50 mil imolar (pH 7,4) e então extrusada por passagem do material através de uma mini- extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. Os lipossomos classificados em tamanho foram então liofilizados com o uso da secadora com congelamento Verdes Avantaje feixe dryer (SP Industries, Warminister, PA, USA). Para cada 800 microlitros de suspensão de lipossomo original que contém rHA e polil : C, foi usado um mililitro de um veículo oleoso mineral equivalente ao Adjuvante Incompleto de Freund (conhecido como Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) para reconstituir os lipossomos liofilizados. Cada dose de vacina consistiu de 50 microlitros da formulação descrita acima que combina lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo.

[000153] A eficiência da formulação de lipossomo liofilizado descrita acima foi comparada com a eficiência de uma vacina de controle que consiste em 1 micrograma de rHA e 100 microgramas de Imject Adjuvant alum (Pierce, Rockford, IL, USA) em 50 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,4). Os camundongos do Grupo 1 (N = 8) foram injetados uma vez (sem reforço) com Vacina C que compreende 1 micrograma de antígeno de rHA e 10 microgramas de adjuvante polil: C formulado em 50 microlitros de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Os camundongos do Grupo 2 (N = 9) foram vacinados duas vezes (no dia 0 e no dia 21) com a vacina de alúmen de controle que compreende 1 micrograma de rHA e 100 microgramas de adjuvante alúmen suspensos em tampão de fosfato 50 milimolar. Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 3, 4 e 8 semanas depois da imunização. Os títulos de anticorpo rHA nestes soros foram examinados por ELISA como descrito em exemplo 1.

[000154] Os camundongos do Grupo 2 geraram uma resposta anticorpo antígeno-específico detectável depois da administração de uma vacina de controle com adjuvante alúmen. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com uma única dose da formulação de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo, forneceram títulos de ponto final significativamente melhorados em comparação com aqueles do Grupo 2, apesar de que Os animais do Grupo 2 foram vacinados duas vezes (imunização primária mais reforço). Os camundongos do Grupo 2 geraram títulos para 1/128.000 (valor de log 10 de 5,11) a três semanas depois da vacinação (antes do reforço) e até 1/1,024.000 (Iog 10 igual a 6,01) e 1/512.000 (Iog 10 igual a 5,71) a quatro e oito semanas respectivamente (depois do reforço). Como observado no exemplo 1, a presença de tais respostas de anticorpo confirma a resposta imunológica genuína gerada como um resultado da vacinação. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a vacina correspondente à invenção, foram capazes de gerar títulos de ponto final que atingem até 1/2.048.000 (valor de log 10 de 6,31) a três semanas depois da vacinação e 1/8.192.000 (um valor de log 10 de 6,91) a quatro e oito semanas depois da imunização. Estes resultados indicam que as formulações em dose única de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo contendo um adjuvante polil: C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo significativamente melhorada em comparação com uma vacina de controle reforçada, aquosa de alúmen. As respostas imunológicas geradas neste exemplo são equivalentes às respostas imunológicas geradas por uma vacina da invenção apresentada nos Exemplos 1 e 2.

Exemplo 4

[000155] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000156] Como nos exemplos anteriores, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1 Protein Sciences (Meridien, CT, USA) correspondente à glicoproteína hemaglutinina presente na superfície do vírus H5N1 da influenza, aqui a seguir designado rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1 micrograma por dose de 50 microlitros.

[000157] As vacinas aqui descritas foram formuladas como descrito no Exemplo 1. Em resumo, 33 microgramas de rHA foram suspensos em 300 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas de uma mistura homogênea (10:1, peso : peso) de Lecitina S100/colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) para formar aproximadamente 450 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. Para cada 450 microlitros de suspensão de lipossomo contendo rHA, foram adicionados dois miligramas de Imject Adjuvant alum (Pierce, Rockford, IL, USA). Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) foi adicionado para formar a emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e no óleo que forma a fase hidrófoba contínua. Cada dose de vacina consistia em 30 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante alúmen e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo.

[000158] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos como descrito acima com a seguinte exceção: depois da formação de lipossomos que encapsulam rHA e depois da extrusão da suspensão de lipossomo através da membrana de policarbonato de 200 nanômetros, foram usados 133 microgramas de adjuvante polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA) foram adicionados para cada 450 microlitros de lipossomos. Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) foi adicionado para formar a emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão no óleo que forma a fase contínua. Cada dose de vacina consistia de 30 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação em particular será denominada lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo.

[000159] A eficiência das duas formulações em emulsão descritas acima foi comparada como descrito no Exemplo 1. Dois grupos de camundongos (9 ou 10 camundongos por grupo) foram injetados uma vez (sem reforço) com formulações de vacina de lipossomo, intramuscularmente, como a seguir: Camundongos do Grupo 1 foram vacinados com Vacina B que compreende 1 micrograma de antígeno de rHA e 4 microgramas de adjuvante polil: C formulado em 30 microlitros de lipossomo/polil C/veículo hidrófobo (da invenção). Os camundongos do Grupo 2 foram vacinados com 1 micrograma de rHA e 60 microgramas de adjuvante alúmen formulados em 30 microlitros de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo. A vacina do Grupo 2 era uma formulação de controle (Vacina A) que contém o adjuvante genérico alúmen. Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 18 e 28 dias depois da imunização e então a cada quatro semanas durante um total de 16 semanas. Os títulos de anticorpo nestes soros foram examinados por ELISA como descrito em Exemplo 1.

[000160] Os títulos de ponto final no Grupo 2 eram de até 1/256.000 a 8 e 12 semanas e 1/512.000 a 16 semanas depois da imunização (Valores de log 10 de 5,41 e 5,71 respectivamente). Os camundongos do Grupo 1 que foram injetados com a formulação correspondente à invenção foram capazes de gerar uma resposta imunológica melhorada com títulos de ponto final que atingem até 1/4.096.000 (valor de log 10 de 6,61) a 8, 12 e 16 semanas depois da vacinação. Estes resultados confirmam que as formulações de lipossomo/veículo hidrófobo que contêm um adjuvante polil: C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo significativamente melhorada que é em média 10 times maior do que é conseguido usando uma vacina de controle em que falta polil C (valores de P < do que 0,01 em todos os pontos do tempo entre as semanas 4 e 16 depois da vacinação). A melhoria drástica na resposta imunológica gerada foi um resultado do uso do adjuvante polil: C especificamente em vez de alúmen na composição de antígeno/lipossomo/adjuvante/veículo oleoso mineral. A resposta imunológica mais forte gerada com a vacina desta invenção era robusta, pois esta persistiu a níveis significativamente superiores em comparação à vacina que contém alúmen durante um mínimo de 16 semanas.

Exemplo 5

[000161] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000162] Como nos exemplos anteriores, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina sobre a superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1 micrograma por dose de 30 microlitros.

[000163] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos como descrito em Exemplo 2. em resumo, 33 microgramas de rHA foram suspensos em 300 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas de uma mistura de Lecitina S100/colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) para formar aproximadamente 450 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através da membrana de policarbonato de 200 nanômetros. Para cada 450 microlitros de suspensão de lipossomo contendo rHA, foram adicionados 133 microgramas de adjuvante polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA) foi adicionado. Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) foi adicionado para formar uma emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e no óleo que forma a fase contínua. Cada dose de vacina consistiu de 30 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação em particular será denominada lipossomo/polil : C/veículo hidrófobo.

[000164] A eficiência da vacina de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo descrita acima foi comparada com a eficiência de uma vacina aquosa de controle que contém antígeno de rHA e adjuvante polil: C à base de RNA. Dois grupos de camundongos (9 ou 10 camundongos por grupo) foram injetados uma vez, intramuscularmente, com 30 microlitros por dose. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com Vacina B que compreende 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C formulado como lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Os camundongos do Grupo 2 foram injetados com a vacina de polil: C de controle que compreende 1 micrograma de rHA e 4 microgramas de polil: C formulado em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4). Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 18 e 28 dias depois da imunização e então a cada quatro semanas durante um total de 16 semanas. As amostras de soros dos títulos de anticorpo de rHA foram examinadas por ELISA como descrito no Exemplo 1.

[000165] Os camundongos do Grupo 2 geraram uma resposta anticorpo antígeno-específica detectável depois da administração de vacina de controle com polil: C/com adjuvante. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a formulação de the lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo , forneceram títulos de ponto final significativamente melhorados em comparação com aqueles do Grupo 2. Os camundongos do Grupo 2 geraram títulos para 1/512.000 (Valor de log 10 de 5,71) a 8 semanas e a 1/2,048.000 (Iog 10 igual a 6,31) a 12 e 16 semanas depois da vacinação. Como observado anteriormente, a presença de tais respostas de anticorpo confirma a resposta imunológica genuína gerada como um resultado da vacinação. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a vacina correspondente à invenção, foram capazes de gerar títulos de ponto final que atingem até 1/4.096.000 (Valor de log 10 de 6,61) a 8, 12 e 16 semanas depois da imunização. Estes resultados confirmam que as formulações de lipossomo/veículo hidrófobo que contém um adjuvante polil: C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo durável e substancialmente superior comparada a uma vacina aquosa/polil: C de controle (Valor e P < 0,02 na semana 4 e na semana 16 depois da vacinação). Os títulos de anticorpo que eram 7 vezes mais altos em média nos pontos do tempo de início (semana 4 depois da vacinação) e 9 vezes mais altos em média no final (semana 16 depois da vacinação) foram conseguidos na presença de lipossomos e de um veículo hidrófobo na vacina. Isto sugere que os componentes lipossomo e veículo hidrófobo são importantes para gerar as fortes respostas imunológicas observadas.

Exemplo 6

[000166] Camundongos CD1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000167] Como nos Exemplos 1 a 5, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1 microgramas por dose de 50 microlitros.

[000168] Para formular a vacina correspondente à invenção, uma mistura homogênea de 10:1 (peso : peso) de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de rHA em tampão fosfato para formar lipossomos com rHA encapsulado e seguido pela adição polil: C (Pierce, Rockford, IL, USA). Em resumo, 30 microgramas de rHA foram suspensos em 750 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) então adicionados a 132 miligramas da mistura de Lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 900 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma extrusora semi- automática (Avestin, Ottawa, ON, Canadá) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros a uma vazão de 100 mililitros por minuto. 250 microgramas de Adjuvante polil: C à base de RNA em tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) foi adicionado a lipossomos classificados pelo tamanho para diluir a preparação até 1 mililitro. Os lipossomos foram então liofilizados com o uso do secador com congelamento Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, USA). Para cada 1 mililitro de suspensão de lipossomo original que contém rHA e polil : C, foram usados 800 microlitros de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) para reconstituir os lipossomos liofilizados. Cada dose de vacina consistia de 50 microlitros da formulação descrita acima que contém lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo.

[000169] A eficiência da formulação de lipossomo liofilizado descrita acima foi comparada com a eficiência de uma vacina de controle que consiste em 1,5 micrograma de rHA e 100 microgramas de Imject Adjuvante alum (Pierce, Rockford, IL, USA) em 50 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0). Os camundongos do Grupo 1 (N = 10) foram injetados intramuscularmente, uma vez (sem reforço), com a Vacina D que compreende 1,5 micrograma de antígeno rHA e 12,5 microgramas de adjuvante polil: C à base de RNA formulado em 50 microlitros de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Os camundongos do Grupo 2 (N = 10 nas semanas 3 e 4 reduziram-se a N = 9 nas semanas 6 e 9 devido à terminação relacionada a não vacina não planejada de um animal) foram vacinados duas vezes (dia 0 e dia 28) com a vacina de alúmen de controle que compreende 1,5 micrograma de rHA e 100 microgramas de adjuvante alúmen suspensos em tampão fosfato 50 milimolar. Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 3, 4, 6 e 9 semanas depois da imunização. Os títulos de anticorpo rHA nestes soros foram examinados por ELISA como descrito em Exemplo 1.

[000170] Os camundongos do Grupo 2 geraram uma resposta anticorpo antígeno-específica somente depois da administração de 2 doses (imunização primária e reforço) de uma vacina de controle com adjuvante alúmen. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com uma única dose da formulação de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo, forneceram títulos de ponto final significativamente melhorados em comparação com aqueles do Grupo 2 em todos os pontos do tempo testados apesar de que os animais do Grupo 2 foram vacinados duas vezes. Os camundongos do Grupo 2 registraram títulos de base 3 semanas depois da vacinação primária e um indivíduo gerou um título máximo de 1/8.000 (Iog 10 igual a 3,39) a 4 semanas. Depois do reforço, os camundongos do Grupo 2 geraram títulos para 1/64.000 (valor de log 10 de 4,81) a 6 e 9 semanas depois da imunização. Os camundongos do Grupo 1, vacinados com a vacina correspondente à invenção, foram capazes de gerar títulos de ponto final até de 1/128.000 (Iog 10 de 5,11) a 3 e 4 semanas depois da vacinação e de 1/512.000 (um valor de log 10 de 5,71) a 6 e 9 semanas depois da imunização. Estes resultados confirmam, usando uma espécie de camundongo diferente do que aquela usada no Exemplo 3, que uma única dose de formulações de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo que contém um adjuvante polil: C é capaz de gerar uma resposta imunológica humoral in vivo significativamente melhorada comparada até mesmo a uma vacina de reforço aquosa/de alúmen de controle. Os níveis de anticorpo eram 24 vezes mais altos do que uma única dose de uma vacina de controle na semana 4 depois da vacinação (Valor de P < 0,001) e 9 vezes mais altos do que duas doses da vacina de controle no tempo posterior de 9 semanas depois da vacinação (Valor de P < 0,01). Além disso, os resultados dos Exemplos 3 e 6 indicam que o adjuvante polil: C pode ser incorporado à formulação de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo antes ou depois da extrusão do lipossomo.

Exemplo 7

[000171] Camundongos BALB/c fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000172] Como nos Exemplos 1 a 6, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1,5 micrograma por dose de 50 microlitros.

[000173] Neste exemplo, o lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo foi administrado intramuscularmente uma vez (sem reforço) ou subcutaneamente uma vez (sem reforço) para avaliar a geração de resposta de linfócito citotóxico antígeno específica.

[000174] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos como descrito em Exemplo 6. Em resumo, os lipossomos foram formulados por hidratação de uma mistura homogênea a 10:1 (peso: peso) de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) na presença de rHA em tampão fosfato seguido pela adição de Polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA). A suspensão de lipossomo foi liofilizada e ressuspensa em um veículo oleoso mineral (Montanide ISA 51 (TM), SEPPIC, França). Cada dose de vacina (Vacina D) consistia de 50 microlitros da formulação descrita acima contendo lipossomos (6,6 mg de S100/lipídeos de colesterol), antígeno de rHA (1,5 micrograma), adjuvante polil: C (12,5 microgramas) e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo liofilizado/polil : C/veículo hidrófobo. Os camundongos no Grupo 1 (n = 4) receberam esta formulação intramuscularmente como no Exemplo 6. Os camundongos do Grupo 2 (n = 4) receberam esta vacina subcutaneamente.

[000175] Os camundongos no Grupo 3 (n = 4) foram vacinados com a vacina de alúmen de controle que consiste em 1,5 micrograma de rHA e 100 microgramas de Imject Adjuvant alum (Pierce, Rockford, IL, USA) em 50 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0). Os camundongos foram injetados intramuscularmente uma vez (sem reforço). Os camundongos do Grupo 4 (n = 2) eram naive e não receberam imunização.

[000176] Vinte e dois dias depois da vacinação, os animais foram submetidos a eutanásia com asfixia induzida por dióxido de carbono. Os baços foram coletados e suspensões de célula simples individuais preparadas usando-se procedimentos padronizados. As células vermelhas do sangue foram dissolvidas usando-se tampão ACK para lise (NH4CI 0,15 M, 10 mM, Na2EDTA 0,1 mM em H2O destilada). Para aumentar as células T antígeno específicas, esplenócitos foram cultivados a 1x10A6 células por mililitro em RPMI 1640 (Invitrogen, Burlington, ON, Canadá) meios completos contendo 1% de Penicilina/Estreptomicina/Glutamina, 0,1% de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, USA) suplementado com 20 unidades por mililitro de IL-2 humano recombinante (Sigma-Aldrich) e 10 microgramas por mililitro de rHA durante 4 dias a 37°C, 5% de dióxido de carbono. Foi realizada análise citométrica de fluxo tricolor nos esplenócitos para detectar células T CD8+ antígeno específicas. As células foram bloqueadas com um tratamento durante 10 minutos à temperatura ambiente de FC-block (eBioscience, San Diego, CA, USA). As células foram então coradas com pentâmero IYSTVASSL (I9L)/H2-Kd marcado com ficoeritrina (PE) obtido de Proimmune (Bradenton, FL, USA) durante 20 minutos a 4°C. I9L é o epitopo de rHA H2-Kd imunodominante (518-528) e o reagente pentâmero detecta a apresentação de MHC I deste epitopo pelo camundongo. As células foram então coradas com isotiocianato anti-CD19-fluoresceína (FITC) (eBioscience) e Aloficocianina (APC) anti-CD8β- (eBioscience) durante 30 minutos a 4°C protegido da luz, lavadas e fixadas em tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) com 0,1% de paraformaldeído. 5x10A5 células foram adquiridas em um citômero de fluxo FACSCalibur (TM) (BD Bioscience, Missisauga, ON, Canadá) e analisadas usando- se o programa para computador WinList 6.0 software (Verity Inc, Topsham, ME, USA). Os resultados foram apresentados com base em difusão para frente e lateral e as células CD8 T antígeno específicas foram definidas como pentâmero positivas, CD8β positivas e CD19 negativa. A análise estatística foi realizada usando-se o teste T de Student com duas vias.

[000177] Os camundongos vacinados com a formulação de controle à base de alúmen geraram uma pequena população das células CD8 T antígeno específicas (0,045%). Os camundongos vacinados com a formulação de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo da presente invenção, aplicada por via intramuscular ou subcutânea, geraram uma população significativamente maior das células CD8 T antígeno específicas (0,23% e 0,17% respectivamente; p = < 0,025 para ambos os casos em comparação com o controle de alúmen). Estes resultados demonstram que rHA formulados na invenção podem ser aplicados intramuscularmente ou subcutaneamente e geram uma população significativamente maior de célula CD8 T antígeno específica representativa da resposta imunológica celular comparada a uma formulação de vacina convencional que usa alúmen.

Exemplo 8

[000178] Camundongos CD-1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade e coelhos brancos da Nova Zelândia, com 2-3 quilogramas de peso, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000179] Como nos Exemplos 1 a 7, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 0,5 micrograma por dose de 50 microlitros em camundongos e de 2 microgramas por dose de 200 microlitros em coelhos.

[000180] A eficiência da vacina foi avaliada por ensaios de inibição de hemaglutinação (HAI) conduzidos por Benchmark Biolabs (Lincoln, NE, USA). Em resumo, amostras de soro foram pré-tratadas com uma enzima que destrói o receptor e pré-absorvido por células vermelhas do sangue de galinha para evitar quaisquer reações não específicas de inibição de hemaglutinação. As diluições em série de soro foram então incubadas com 0,7% de células vermelhas de sangue equino, 0,5% de albumina de soro bovino e 8 unidades de HA de vírus da influenza AΔ/ietnam/1203/2004[H5N1]. Os títulos calculados representam a maior diluição na qual a amostra de soro pode inibir completamente a hemaglutinação das células vermelhas do sangue.

[000181] Para formular a primeira vacina correspondente à invenção, uma mistura homogênea de 10:1 (peso : peso ) de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de rHA em tampão fosfato para formar lipossomos com rHA encapsulado e seguido pela adição de Polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA). Em resumo, 10 microgramas de rHA foram primeiro suspensos em 650 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) então adicionados a 132 miligramas da mistura de Lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 800 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi então extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. 240 microgramas de adjuvante polil: C em tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) foram adicionados a lipossomos classificados por tamanho. Os lipossomos foram então liofilizados com o uso de secador com congelamento Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, USA). O material liofilizado foi reconstituído com um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) até o volume original de 1 mililitro de lipossomos solubilizados. Cada dose de vacina como aplicada a camundongos, consistiu em 50 microlitros da formulação descrita acima que combina lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Estas formulações de vacina serão denominadas lipossomo liofilizado/polil: C//veículo hidrófobo.

[000182] Para formular a segunda vacina, também correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos descritos acima com as seguintes exceções: depois da formação de lipossomos que encapsula antígeno de rHA, a preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual adaptada com duas membranas de policarbonato com 400 nanômetros. 250 microgramas do adjuvante Polil: C à base de RNA em tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) foi adicionado aos lipossomos classificados em tamanho para diluir a preparação até 1 mililitro. Os lipossomos foram então liofilizados com o uso do secador com congelamento Virtis Advantage e o material liofilizado reconstituído até 1 mililitro original usando um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França). Cada dose de vacina aplicada aos coelhos consistia em 200 microlitros da formulação descrita acima contendo lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina também será denominada lipossomo liofilizado/polil : C/veículo hidrófobo.

[000183] A eficiência da formulação de lipossomo liofilizado descrita acima foi testada usando-se dois diferentes modelos de animal. Os animais foram vacinados com formulações comparáveis; o volume da injeção foi ajustado quando apropriado ao tamanho dos animais. Um grupo de camundongos (N = 5) foram injetados intramuscularmente com Vacina F que compreende 0,5 microgramas de antígeno de rHA e 12 microgramas de adjuvante polil: C formulado em 50 microlitros de lipossomo liofilizado/polil : C/veículo hidrófobo como descrito acima. Um grupo de coelhos (N = 5) foi injetado subcutaneamente com a Vacina E que compreende 2 microgramas de antígeno de rHA e 50 microgramas de adjuvante polil: C formulado em 200 microlitros de lipossomo liofilizado/polil: C//veículo hidrófobo como descrito acima. Todos os animais foram sangrados antes da injeção e então de novo a 4 ou 5 semanas depois da imunização. Os títulos de HAI nestes soros foram examinados por um ensaio de inibição de hemaglutinação de H5N1 descrita acima.

[000184] Cerca de 4 ou 5 semanas depois da vacinação com formulações de lipossomo liofilizado/polil : C/veículo hidrófobo tanto os camundongos como os coelhos geraram títulos de HAI que indicam proteção contra influenza H5N1. Um título de soro de HAI de 40 (log 10 igual a 1,60) é tipicamente aceito para significar que um indivíduo possui um nível protetor de anticorpos visando uma cepa de influenza específica. A 5 semanas depois da vacinação os camundongos geraram títulos na faixa de 128 (log 10 de 2,11 ) até 512 (log 10 de 2,71). A 4 semanas depois da imunização os coelhos geraram títulos de HAI na faixa de 64 (log 10 igual a 1,81 ) até 1024 (log 10 de 3,01). De modo geral é aceito que uma única vacinação de rHA usada às dosagens descritas acima é incapaz de induzir os altos títulos de HAI conseguidos em todos os sujeitos vacinados. Os títulos desta grandeza, gerados em dois modelos de animal diferentes, demonstram que a formulação de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo é particularmente eficaz na geração de níveis de anticorpo forte na faixa protetora (HAI > 20 ou valor de log > 1,3) em todos os sujeito vacinados apenas em 4 semanas depois da vacinação.

Exemplo 9

[000185] Camundongos CD-1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000186] O fragmento (1-43) de proteína β amilóide foi adquirido da Anaspec (San Jose, CA, USA) e usado como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. Este peptídeo, aqui a seguir denominado e-amilóide, tem um peso molecular de aproximadamente 4.600 dáltons e está associado à formação de placas nos cérebros de pacientes com Alzheimer, e-amilóide foi usado a 10 microgramas por dose de 100 microlitros dose.

[000187] O peptídeo FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE com 21 aminoácidos, aqui a seguir denominado F21 E, foi adquirido da NeoMPS (San Diego, CA, USA). Este peptídeo toxóide tetânico (com 947-967 aminoácidos) é identificado como sendo um epitopo T-helper. F21 E foi usado como um epitopo modelo T-helper para testar a eficiência de formulações de vacina; ele foi usado a 20 microgramas por dose de 100 microlitros.

[000188] Como nos Exemplos 1 a 6, a eficiência da vacina foi avaliada por ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Os mesmos procedimentos como descrito em Exemplo 1 foram usados com mudanças para permitir a detecção de anticorpos β-amil0ide específicos. Em resumo, uma placa de microtítulo com 96 poços é revestida com antígeno (β-amil0ide, 1 micrograma/mililitro) durante toda a noite a 4 graus Celsius, bloqueado com 3 % de gelatina durante 30 minutos, então incubada durante toda a noite a 4 graus Celsius com diluições em série de soros, tipicamente iniciando a uma diluição de 1/1000. Um reagente secundário (proteína G conjugada a fosfatase alcalina, EMD chemicals, Gibbstown, NJ, USA) é então adicionado a cada poço a uma diluição de 1/500 durante uma hora a 37 graus Celsius. Depois de uma incubação durante 60 minutos com uma solução que contém 1 miligrama/mililitro de sal dissódico de fosfato de 4-nitrofenila hexahidratado (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça), a absorvância de 405 nanômetros de cada poço é medida que usa uma placa leitora de microtítulo (ASYS Hitech GmbH, Áustria). Os títulos de ponto final são calculados como descrito em Frey A. e outros (Journal de Immunological Methods, 1998, 221: 35-41). Os títulos calculados representam a mais alta diluição na qual um aumento estatisticamente significativo em absorvância é observado em amostras de soro provenientes de camundongos imunizados versus amostras de soro provenientes de camundongos de controle não imunizados, naive. Os títulos são apresentados como valores de log 10 da diluição do ponto final.

[000189] Para formular a vacina aqui descrita, uma mistura homogênea a 10:1 peso : peso de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de uma solução de β- amilóide e F21 E em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) para formar lipossomos com o antígeno e o T-helper encapsulados. Em resumo, 100 microgramas de e-amilóide e 200 microgramas de F21 E foram primeiro suspensos em 300 microlitros de soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7,4) então adicionados a 132 miligramas da mistura de Lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 450 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o β-amil0ide antígeno e o T-helper F21 E. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 400 nanômetros. Para cada 450 microlitros de suspensão de lipossomo que contém e-amilóide e F21 E, foram adicionados 2 miligramas de Imject Adjuvante alum (Pierce, Rockford, IL, USA). Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/T-helper/adjuvante, foi adicionado um volume igual de um veículo oleoso mineral (conhecido como Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) para formar a emulsão de água-em- óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e o óleo que forma a fase hidrófoba contínua. Cada dose de vacina consistia de 100 microlitros da emulsão descrita acima que contém lipossomos, antígeno e-amilóide, F21 E T-helper, adjuvante alúmen e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo.

[000190] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos descritos acima com a seguinte exceção: após a formação de lipossomos que encapsulam o β- amilóide e o F21 E e depois da extrusão da suspensão de lipossomo através de uma membrana de policarbonato de 400 nanômetros, foram adicionados 100 microgramas de Adjuvante polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA) para cada 450 microlitros de lipossomos. Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/T- helper/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França) foi adicionado para formar a emulsão de água-em-óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e o óleo que forma a fase contínua. Cada dose de vacina consistia de 100 microlitros de emulsão descrita acima que contém lipossomos, β-amil0ide antígeno, F21 E T-helper, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação em particular será denominada lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo.

[000191] Foi comparada a eficiência das duas formulações em emulsão descrita acima. Dois grupos de camundongos (9 camundongos por grupo) foram injetados intraperitonealmente com formulações de vacina de lipossomo como a seguir: os camundongos do Grupo 2 foram vacinados com Vacina G que compreende 10 microgramas de β-amil0ide e 20 microgramas de F21 E formulado em 100 microlitros de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo como descrito acima. Cada dose de vacina continha efetivamente 200 microgramas de alúmen. Os camundongos do Grupo 1 foram vacinados com Vacina H que compreende 10 microgramas de e-amilóide antígeno e 20 microgramas F21 E formulado em 100 microlitros de lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Cada dose de vacina continha efetivamente 10 microgramas de polil : C. Foram coletadas amostras de soro de todos os camundongos a 4, 8 e 12 semanas depois da imunização. Os títulos de anticorpo nestes soros foram examinados por ELISA como descrito acima.

[000192] Os camundongos do Grupo 2, vacinados com uma única dose de uma formulação de lipossomo/alúmen/veículo hidrófobo, geraram uma resposta anticorpo antígeno-específico detectável como era de se esperar. Os títulos de ponto final a 4 e 8 semanas depois da vacinação eram de até 1/32.000 (valor de log 10 de 4,51) e a 12 semanas eles eram de até 1/64.000 (log 10 de 4,81). A presença de tais respostas de anticorpo confirma que foi gerada uma resposta imunológica genuína como um resultado da vacinação. Os camundongos do Grupo 1 que foram injetados uma vez com a formulação correspondente à invenção foram capazes de gerar uma resposta imunológica melhorada com títulos de ponto final que atingem até 1/256.000 (valor de log 10 de 5,41) a 4, 8 e 12 semanas depois da vacinação. Os títulos gerados com a invenção eram 7 vezes mais altos em média em cada ponto do tempo em relação aos títulos gerados pela formulação de controle que contém o adjuvante alúmen genérico. O aumento em títulos conseguido com a invenção era estatisticamente significativo (Valor e P < 0,01 a semanas 8 e 12 depois da vacinação). Estes resultados são confirmados pelo uso de um modelo de antígeno diferente das formulações de lipossomo/veículo hidrófobo que contém um adjuvante polil: C são capazes de gerar uma resposta imunológica in vivo significativamente melhorada comparada à vacinação hidrófoba de um lipossomo/alúmen.

Exemplo 10

[000193] Camundongos CD-1 fêmeas, livres de patógenos, com 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000194] A proteína hemaglutinina recombinante H5N1 foi adquirida de Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante possui um peso molecular aproximado de 72.000 dáltons e corresponde à glicoproteína hemaglutinina, uma proteína antigênica presente na superfície do vírus H5N1 da influenza. Esta proteína recombinante, aqui a seguir designado rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 0,5 micrograma por dose de 50 microlitros.

[000195] Tanto as respostas imunológicas humoral (TH1 ) como a celular (TH2) foram avaliadas pelo ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) (ELISA), um processo que permite a detecção de níveis de anticorpo antígeno-específico no soro de animais imunizados. Em resumo, uma placa de microtítulo com 96 poços é revestida com antígeno (rHA, 1 micrograma/mililitro) durante toda a noite a 4 graus Celsius, bloqueado com 3 % de gelatina durante 30 minutos, então incubada durante toda a noite a 4 graus Celsius com diluições em série de soros, tipicamente iniciando a uma diluição de 1/2000. Um anticorpo secundário, anti-lgG é então adicionado a cada poço a uma diluição de 1/2000 durante uma hora a 37 graus Celsius. Para a detecção de anticorpos lgG2A, indicadores de uma resposta celular TH 1, foi usado lgG2A anticamundongo de bode (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Para a detecção de uma resposta humoral TH2 foi usada uma resposta IgGI anticamundongo de bode (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA) foi usado um reagente secundário. Depois de uma incubação durante 60 minutos com uma solução que contém 1 miligrama/mililitro de sal dissódico de fosfato de 4-nitrofenila hexahidratado (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Suíça), a absorvância de 405 nanômetros de cada poço é medida que usa uma placa leitora de microtítulo (ASYS Hitech GmbH, Áustria). Os títulos de ponto final são calculados como descrito em Frey A. e outros (Journal de Immunological Methods, 1998, 221: 35-41). Os títulos calculados representam a mais alta diluição na qual um aumento estatisticamente significativo em absorvância é observado em amostras de soro provenientes de camundongos imunizados versus amostras de soro provenientes de camundongos de controle não imunizados, naive. Os títulos são apresentados como valores de log 10 da diluição do ponto final.

[000196] Para formular as vacinas correspondentes à invenção, uma mistura homogênea a 10:1 peso : peso de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de uma solução de rHA em tampão fosfato para formar lipossomos com rHA encapsulado e seguido pela adição de Polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA) como descrito em Exemplo 8. Em resumo, 10 microgramas de rHA foram primeiro suspensos em 650 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) então adicionados a 132 miligramas da mistura de Lecitina S100/colesterol para formar aproximadamente 800 microlitros de uma suspensão de um lipossomo que encapsula o antígeno de rHA. A preparação do lipossomo foi então extrusada por passagem do material através de uma mini- extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. O Adjuvante polil: C em tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) foi adicionado a lipossomos classificados em tamanho para diluir a preparação até 1 mililitro. Para a formulação de polil: C com "alta dose", foram adicionados 240 microgramas de polil: C em tampão fosfato e para formulação de polil: C com "baixa dose", foram adicionados 50 microgramas de polil : C. os lipossomos foram então liofilizados com o uso de secador com congelamento Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, USA). O material liofilizado foi reconstituído com um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) até o volume original de 1 mililitro de lipossomos solubilizados. Cada dose de vacina consistia de 50 microlitros da formulação descrita acima que combina lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Estas formulações de vacina serão denominadas lipossomo liofilizado/polil: C (alto)/veículo hidrófobo e lipossomo liofilizado/polil: C (baixo)/veículo hidrófobo.

[000197] As respostas TH1 e TH2 geradas, como um resultado da vacinação com o lipossomo liofilizado formulações contendo adjuvante polil : C, foram comparadas. Dois grupos de camundongos (N = 5 por grupos) foram injetados intramuscularmente com 50 microlitros ou de Vacina E que compreende 0,5 micrograma de rHA e 12 microgramas de polil: C formulado como lipossomos liofilizados/polil: C (alto)/veículo hidrófobo (Grupo 1) ou Vacina I que compreende 0,5 micrograma de rHA e 2,5 micrograma de polil: C formulado como lipossomos liofilizados/polil: C (baixo)/veículo hidrófobo (Grupo 2). As amostras de soro foram coletadas a 5 semanas depois da imunização e os títulos de anticorpo IgGI e lgG2A examinados como descrito acima.

[000198] Os camundongos do Grupo 1 geraram títulos de IgGI até 2,048.000 (valor de log 10 de 6,31) a 5 semanas depois da imunização que é comparável aos resultados da resposta humoral da formulação similar de lipossomos liofilizados/polil: C/veículo hidrófobo usada no Exemplo 3. Os títulos de lgG2A, indicadores de uma resposta celular, eram de até 4,096.000 (log 10 igual a 6,61) a 5 semanas depois da vacinação. Os camundongos do Grupo 2, vacinados com uma dose inferior de polil: C/, geraram a 5 semanas depois da vacinação títulos de IgGI de até 4,096.000 (log 10 de 6,61) e títulos de lgG2A também de até 4,096.000. Os resultados mostram que o adjuvante polil: C formulado a várias concentrações em uma formulação de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo é capaz de gerar tanto resposta imunológica humoral (TH2) como celular (TH1). Estes resultados sugerem que as formulações descritas acima são capazes de gerar respostas imunológicas celular e humoral em sujeitos vacinados.

Exemplo 11

[000199] Camundongos C57BL6 fêmeas, livres de patógenos, com 4 - 6 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000200] O antígeno usado nas formulações de vacina era uma proteína de fusão que consistem no epitopo H2-Db imunodominante de HPV16 E7 (49-57; RAHYNIVTF) fundido ao epitopo T helper universal PADRE. Este antígeno, aqui a seguir denominado FP, foi sintetizado por Anaspec Inc. (San Jose, CA). O adjuvante foi uma molécula de RNA poli inosina-citosina à base de RNA fornecida por Sigma-Genosys (St. Louis, MO).

[000201] A eficiência da invenção que compreende lipossomos, uma molécula de polil: C à base de RNA e um veículo hidrófobo foi testada in vivo usando um modelo de teste com tumor C3. as células de C3 contêm genoma do vírus do papiloma humano 16 (HPV16) e como um resultado, presente na sua superfície o epitopo HPV16 E7 (aminoácidos 49-57; RAHYNIVTF) que podem ser atingidos por vacinação. As células C3 crescem em tumores sólidos mensuráveis quando injetados subcutaneamente. Três grupos de camundongos (n = 8 por grupo) foram implantados subcutaneamente no flanco com o HPV16 E7 expressando a linhagem da célula de tumor C3 (5x10A5 células/camundongo) no dia 0. No dia 8, os camundongos nos Grupos 1 e 2 foram vacinados subcutaneamente no flanco oposto com 100 microlitros de vacina. Os camundongos do Grupo 3 receberam PBS apenas e serviram como o controle do crescimento do tumor. O volume do tumor foi medido uma vez por semana usando calibres para registrar o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo durante 5 semanas depois da implantação. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula a seguir: medida mais longa * (medida mais curta)A2 dividido por 2.

[000202] A vacina de controle (emulsão convencional usada para imunizar o Grupo 1 foi formulada por misturação de 300 microgramas de antígeno FP e 3 miligramas de Adjuvante polil: C em 1 mililitro de PBS. Para cada 500 microlitros de suspensão de antígeno/adjuvante, um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) foi adicionado para formar a emulsão de água-em-óleo. Cada dose de vacina consistia em 100 microlitros da emulsão descrita que contém antígeno FP (15 microgramas) e adjuvante polil: C (150 microgramas) e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada polil: C//veículo hidrófobo.

[000203] Para formular a vacina (Vacina K) correspondente à invenção para o Grupo 2, foram usados os mesmos procedimentos como descrito em Exemplo 1. Em resumo, 150 microgramas de antígeno FP foram misturados com uma mistura de lecitina DOPC/colesterol (10:1, peso : peso ; Lipoid GmbH, Alemanha) dissolvida em terc-butanol e liofilizada. Os lipossomos foram formulados por adição de 1 mililitro de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0) contendo 1,5 miligrama de polil : C. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material através de uma mini-extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com uma membrana de policarbonato de 200 nanômetros. O tamanho do lipossomo foi confirmado a 200 nanômetros usando um Malvern Particle Size Analyzer (Worchestershire, Reino Unido). Para cada 500 microlitros de uma suspensão de lipossomo/antígeno/adjuvante, foi adicionado um volume igual de um veículo oleoso mineral (Montanide(TM) ISA 51, fornecido por Seppic, França) para formar uma emulsão de água-em- óleo com a suspensão de lipossomo contida na fase aquosa da emulsão e o óleo que forma a fase hidrófoba contínua. Cada dose de vacina consistia de 100 microlitros da emulsão descrita que contém lipossomos (13,2 miligramas de DOPC/colesterol), antígeno FP (15 microgramas), adjuvante polil: C (150 microgramas) e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo.

[000204] Os resultados deste experimento são apresentados na Figura 11. Os camundongos do Grupo 1 tinham proteção parcial contra crescimento do tumor e começou a desenvolver tumores mensuráveis na semana 4 depois da implantação. Os camundongos no Grupo 2, vacinados com a invenção, desenvolveram tumores significativamente menores que foram detectáveis somente na semana 5 (p < 0,1). Os camundongos no grupo de controle desenvolveram tumores com cinética esperada, iniciando na semana 3 depois da implantação.

[000205] Estes resultados indicam que os antígenos tumor- específicos formulado na formulação do lipossomo/polil: C/veículo hidrófobo era mais eficaz tratando terapeuticamente um tumor estabelecido em camundongos do que quando formulado com polil: C/veículo hidrófobo. O efeito terapêutico ótimo podia somente ser conseguido quando os lipossomos estavam presentes na formulação, indicando claramente que os lipossomos são um componente crítico da invenção.

Exemplo 12

[000206] Camundongos C57BL6 fêmeas, livres de patógenos, com 4 - 6 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000207] Como no Exemplo 11, o antígeno usado em formulações de vacina foi uma proteína de fusão que consiste no epitopo H2-Db imunodominante de HPV16 E7 (49-57; RAHYNIVTF) fundido ao epitopo T helper universal PADRE. Este antígeno, aqui a seguir denominado FP, foi sintetizado por Anaspec Inc. (San Jose, CA). O adjuvante foi uma molécula de DNA poli inosina-citosina à base de DNA que consiste em 13 repetições (IC) e sintetizado por Operon MWG (Huntsville, AL, USA).

[000208] A eficiência da invenção que compreende lipossomos, um polil: C à base de DNA e um veículo hidrófobo foi testado in vivo usando o modelo de testes de tumor C3 descrito anteriormente. Quatro grupos de camundongos (n = 8 por grupo) foram implantados subcutaneamente no flanco com a linhagem de célula C3 de tumor que expressa HPV16 E7 (5x10A5 células/camundongo) no dia 0. No dia 5, os camundongos nos Grupos 1 a 3 foram vacinados subcutaneamente no flanco oposto com vacina. Os camundongos do Grupo 4 receberam somente PBS e serviram como controle do crescimento do tumor. O volume do tumor foi medido uma vez por semana usando calibres para registrar o diâmetro mais curto e o diâmetro mais longo durante 5 semanas depois da implantação. O volume do tumor foi calculado usando a fórmula a seguir: medida mais longa * (medidas mais curtas divididas por 2.

[000209] Os camundongos no Grupo 1 foram vacinados com Vacina L que compreende um lipossomo/antígeno/polil C/veículo hidrófobo. A vacina foi formulada como no Exemplo 11. Cada volume de dose era de 100 microlitros e continha lipossomos, FP (10 microgramas), polil C (20 microgramas) e foi emulsificada com o veículo oleoso mineral. Os camundongos no Grupo 2 foram vacinados com Vacina M que compreende um lipossomo liofilizado/antígeno/polil C/veículo hidrófobo. Em resumo, uma mistura homogênea a 10:1 (peso : peso ) de lecitina DOPC e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de 200 microgramas de FP e 400 microgramas de polil C em 0,5% de PEG/água para formar 1 mililitro de lipossomos com antígeno e adjuvante encapsulados. A preparação do lipossomo foi extrusada por passagem do material 20 vezes através de uma extrusora manual (Avanti, Alabaster, AL, USA) adaptada com duas membranas de policarbonato com 400 nanômetros. O tamanho do lipossomo foi confirmado a 200 nanômetros usando um Malvern Particle Size Analyzer (Worchestershire, Reino Unido). Os lipossomos que contêm antígeno e adjuvante foram liofilizados usando secador com congelamento Virtis Advantage (SP Industries, Warminister, PA, USA). O material liofilizado foi reconstituído em óleo até o volume original de lipossomos solubilizados com um veículo oleoso mineral (Montanide (TM) ISA 51, Seppic, França). Cada volume da dose era de 50 microlitros e continha lipossomos (6,6 mg de DOPC/colesterol), FP (10 microgramas), polil: C (20 microgramas) e o veículo oleoso mineral. Os camundongos no Grupo 3 foram vacinados com um lipossomo liofilizado/antígeno/veículo hidrófobo formulado como para o Grupo 2, exceto sem o adjuvante polil C (adjuvante de controle).

[000210] Os resultados deste experimento são apresentados na Figura 12. Os camundongos do Grupo 1 e do Grupo 2 não desenvolveram tumores mensuráveis durante todo o período de tempo do estudo. Os camundongos no Grupo 3, que foram vacinados com a formulação de lipossomo liofilizado com FP porém sem adjuvante, começaram a desenvolver tumores na semana 3 depois da implantação. Os camundongos grupo de controle de PBS desenvolveram tumores com cinética esperada, iniciando na semana 3 depois da implantação.

[000211] Estes resultados indicam que as formulações de vacina da presente invenção requerem que um adjuvante polil C seja eficaz em um modelo de teste de tumor. Neste exemplo, um adjuvante polil: C à base de DNA formulado em um lipossomo/veículo hidrófobo ou em uma formulação de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo geraram uma resposta imunológica eficaz com efeito terapêutico tão pequeno como com uma imunização.

Exemplo 13

[000212] Camundongos BALB/c fêmeas, livres de patógenos, com, 6 - 8 semanas de idade, foram obtidos de Charles River Laboratories (St Constant, QC, Canadá) e foram abrigados de acordo com linhas de instrução institucionais com água e alimento à vontade, sob circulação de água controlada com filtro.

[000213] Como nos exemplos anteriores, a proteína hemaglutinina recombinante H5N1, correspondente à glicoproteína hemaglutinina na superfície do vírus H5N1 da influenza, foi adquirida da Protein Sciences (Meridien, CT, USA). Esta proteína recombinante, aqui a seguir designada rHA, foi usada como um antígeno modelo para testar a eficiência de formulações de vacina. rHA foi usado a 1,5 micrograma por dose de 50 microlitros.

[000214] A eficiência da vacina foi avaliada por corante com imunofluorescência de células CD8 de memória, similar ao método descrito no Exemplo 7. Os esplenócitos singênicos de camundongos BALB/c foram ativados durante 48 horas a 37 graus Celsius com 10 microgramas/mililitro de lipopolissacarídeo e os blastos resultantes foram tratados com 50 microgramas/mililitro de mitomicina C durante 20 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavagens repetidas, as células blastos ativadas foram usadas como antígeno que apresenta células estimulantes para expansão de células CD8 de memória flu- específicas de camundongos vacinados. Células de baço de camundongos naive ou imunizados foram cultivadas com células blastos a uma proporção de 5:1 e as culturas foram estimuladas com rHA a 0,1 micrograma/mililitro durante 6 dias a 37 graus Celsius, 5 por cento de dióxido de carbono. Células colhidas foram usadas para uso de corante com imunofluorescência isotiocianato anti-CD8- fluoresceína (FITC) (eBioscience, San Diego, CA, USA) anticorpos e ficoeritrina reagente pentâmero Pro5 Flu- (PE)-conjugado (H2-Kd, IYSTVASSL, Proimmune, Oxford, UK). 19-Aloficocianina (APC) anti- CD (eBioscience) também foi usada para excluir qualquer ligação não específica de pentâmero para células B. As células coradas foram coletadas em um citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Bioscience, Mississauga, ON, Canadá) e foi feita a análise dos dados usando-se programa de computador WinList 6.0 software (Verity Software House, Topsham, ME, USA). Os resultados foram apresentados com base em difusão para a frente e lateral e as células CD8 T antígeno específicas foram definidas como pentâmero positivas, CD8β positivas e CD19 negativas. A análise estatística foi realizada usando o Teste T de Student.

[000215] Para formular a vacina correspondente à invenção, foram usados os mesmos procedimentos como descrito nos Exemplos 6 e 7. em resumo, a mistura homogênea a 10:1 (peso: peso) de Lecitina S100 e colesterol (Lipoid GmbH, Alemanha) foi hidratada na presença de rHA em tampão fosfato (pH 7,0), para formar lipossomos que encapsulam rHA e seguido pela adição de Polil: C à base de RNA (Pierce, Rockford, IL, USA). A suspensão de lipossomo foi extrusada através de uma extrusora semi-automática (Avestin, Ottawa, ON, Canadá) e os lipossomos classificados em tamanho liofilizados (secadora com congelamento Virtis Advantage, SP Industries, Warminister, PA, USA) e reconstituídos em um veículo oleoso mineral (Montanide ISA 51 (TM), SEPPIC, França). Cada dose de vacina consistia de 50 microlitros da formulação descrita acima contendo lipossomos, antígeno de rHA, adjuvante polil: C e o veículo oleoso mineral. Esta formulação de vacina será denominada lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo.

[000216] A eficiência da formulação de lipossomo liofilizado descrita acima foi comparada com a eficiência de uma vacina de controle que consiste em 1,5 micrograma de rHA e 100 microgramas de Imject Adjuvante alum (Pierce, Rockford, IL, USA) em 50 microlitros de tampão fosfato 50 milimolar (pH 7,0). Os camundongos do Grupo 1(N = 5) foram injetados intramuscularmente, uma vez (sem reforço), com 1,5 micrograma de antígeno de rHA e 12.5 microgramas de adjuvante polil: C formulado em 50 microlitros de lipossomo liofilizado/polil: C/veículo hidrófobo como descrito acima. Esta vacina corresponde à mesma vacina usada nos Exemplos 6 e 7 (vacina D, da invenção). Os camundongos do Grupo 2 (N = 5) foram vacinados duas vezes (dia 0 e dia 28) com uma vacina de controle que consiste em 1,5 micrograma de rHA e 100 microgramas de adjuvante alúmen suspensos em tampão fosfato 50 milimolar. Vinte e uma semanas após a vacinação, os animais foram submetidos a eutanásia por asfixiação induzida por dióxido de carbono, os baços foram coletados e foram preparadas suspensões simples individuais de célula preparadas usando-se procedimentos padronizados. A presença de células T de memória CD8 flu-específicas foi então avaliada com corante flu pentâmero com imunofluorescência como descrito acima.

[000217] Os camundongos vacinados com a formulação de controle à base de alúmen geraram uma pequena população de células T de memória CD8 antígeno-específicas, tamanho médio da população de 0,02 por cento e fundo considerado (desvio padrão de 0,02 por cento). Os camundongos vacinados com a formulação de lipossomo liofilizado/polil : C/veículo hidrófobo correspondente à invenção por outro lado geraram uma população significativamente maior (P < 0,02) de células T de memória CD8 antígeno-específicas, tamanho médio da população de 0,51 por cento (desvio padrão de 0,10 por cento). Estes resultados são significativos pois eles demonstram que uma única dose de formulações de lipossomo liofilizado/veículo hidrófobo contendo adjuvante polil: C gera uma grande população de célula T de memória CD8 antígeno específica duradoura ao passo que uma vacina aquosa/de alúmen de controle não podia gerar resposta celular significativa e duradoura mesmos depois de duas imunizações. 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[000218] Todas as publicações e os pedidos de patente citados neste relatório descritivo são aqui incorporadas como referência como se cada publicação individual ou cada pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência. A citação de qualquer publicação é para a sua divulgação antes da data do depósito e não devia ser considerada como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior.

[000219] Como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas no "um", "uma" e "o, a" incluem a referência no plural a não ser se o contexto indique claramente de outra maneira. A não ser que seja definido de outra maneira todos os termos técnicos e científicos usados neste caso possuem o mesmo significado como comumente entendido por um perito na técnica à qual pertence esta invenção.

[000220] Embora a invenção anterior tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustração e de exemplos para as finalidades de clareza e compreensão, é facilmente evidente para os peritos na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas variações e modificações podem ser feitas sem sair do espírito ou do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (23)

1. Composição injetável de vacina caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um antígeno ao qual uma resposta imune deve ser induzida em um individuo em necessidade da mesma, em que o antígeno é selecionado do grupo consistindo em um antígeno derivado de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita ou uma célula tumoral; um antígeno de doença infecciosa; um antígeno derivado de um alergênio animal, um alergênio alimentício, um alergênio de inseto, um alergênio de bactéria, um alergênio de fármacos, um hormônio ou uma enzima; e um polipeptídeo derivado de hormônio liberador de gonadotrofina, sobrevivente ou peptídeo beta-amiloide; (b) lipossomos; (c) um polinucleotídeo polil:C e (d) um veículo que consistindo essencialmente de óleo ou o qual é uma emulsão de água em óleo.

2. Composição injetável de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo polil:C compreende RNA e/ou DNA.

3. Composição injetável de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo polil:C é um homopolímero ou um heteropolímero.

4. Composição injetável de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo polil:C compreende a polinucleotídeo polil:C homopolimérico e um polinucleotídeo polil:C heteropolimérico.

5. Composição injetável de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o antígeno é encapsulado nos lipossomos, ou o polinucleotídeo polil:C é encapsulado nos lipossomos, ou ambos o antígeno e o polinucleotídeo polil:C são encapsulados nos lipossomos.

6. Método para a obtenção da composição injetável de vacina, caracterizado pelo fato de que compreende combinar, em qualquer ordem: a) um antígeno ao qual uma resposta imuno deve ser induzida em um individuo em necessidade da mesma, em que o antígeno é selecionado do grupo consistindo em um antígeno derivado de uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita ou uma célula tumoral; um antígeno de doença infecciosa; um antígeno derivado de um alergênio animal, um alergênio alimentício, um alergênio de inseto, um alergênio de bactéria, um alergênio de fármacos, um hormônio ou uma enzima; e um polipeptídeo derivado de hormônio liberador de gonadotrofina, sobrevivente ou peptídeo beta-amiloide; (b) lipossomos; (c) um polinucleotídeo polil: C e (d) um veículo consistindo essencialmente de óleo ou o qual é uma emulsão de água em óleo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito antígeno é encapsulado nos ditos lipossomos.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo polil:C é encapsulado nos ditos lipossomos.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo polil:C é adicionado fora dos ditos lipossomos.

10. Uso de uma composição injetável de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de ser para uso na preparação de um medicamento.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na indução de uma resposta de anticorpo a ditoantígeno em um individuo em necessidade da mesma.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na indução de uma resposta imune mediada por célula a dito antígeno em um individuo em necessidade da mesma.

13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser no tratamento e/ou prevenção de uma doença causada por uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita, em que o antígeno na composição de vacina é derivado da bactéria, vírus, fungo ou parasita.

14. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser no tratamento e/ou prevenção de uma doença causada por um alergênio animal, um alergênio alimentício, um alergênio de inseto, um alergênio de bactéria ou um alergênio de fármacos, em que o antígeno na composição de vacina é derivado do alergênico.

15. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser no tratamento e/ou prevenção de uma doença causada por uma célula tumoral que expressa o antígeno na composição de vacina.

16. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o tratamento e/ou prevenção compreende induzir um anticorpo e/ou uma resposta imune mediada por célula ao antígeno em um indivíduo, em que o indivíduo possui ou está em risco de desenvolver uma infecção viral.

17. Uso de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a infecção viral é uma infecção por um vírus da influenza.

18. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tratamento e/ou precenção compreende induzir um anticorpo e/ou uma resposta imune mediada por célula ao antígeno em um indivíduo, em que o indivíduo porrui ou está em risco de desenvolver câncer.

19. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser no tratamento e/ou prevenção de uma doença neurodegenerativa, em que a doença neurodegenerativa está associada com a expressão do antígeno na composição de vacina.

20. Uso de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a doença neurodegenerativa é a doença de Alzheimer.

21. Composição injetável de vacina de acordo com a reivindicação 1 ou o método para a obtenção da composição injetável de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o antígeno é um antígeno específico de tumor.

22. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende formar os lipossomos na presença do antígeno, ou na presença do polinucleotídeo polil:C, ou na presença de ambos o antígeno e o polinucleotídeo polil:C, e então combinar os lipossomos com o veículo para produzir a composição injetável de vacina.

23. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende (i) formar os lipossomos, (ii) combinar os lipossomos com o antígeno ou com o polinucleotídeo polil:C, ou com ambos o antígeno e o polinucleotídeo polil:C para formar uma mistura lipossomal, e (iii) combinar a mistura lipossomal com o veículo para produzir a composição injetável de vacina.

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