BRPI0910338A2 - uso de variantes peguiladas de igf-i para o tratamento de distúbios neuromusculares - Google Patents

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Abstract

USO DE VARIANTES PEGUILADAS DE IGF-I PARA O TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEUROMUSCULARES. A presente invenção refere-se ao uso farmacêutico de variantes polietilenoglicol-(PEG)uiladas de IGF-I para o tratamento, prevenção e/ou retardo da progressão de distúrbios neuromusculares, em particular esclerose lateral amiotrófica (ALS). Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao uso de uma variante PEGuilada de IGF-I para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção e/ou retardo de distúrbios neuromusculares, em particular ALS em que a variante PEGuilada de IGF-I é caracterizada pelo fato de que é derivada da sequência de aminoácidos de IGF-I humano do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e carrega uma ou duas alterações de aminoácido nas posições de aminoácido 27, 65 e 68 para que um ou dois aminoácidos nas posições 27, 65 e 68 seja/sejam um aminoácido poIar mas não lisina e PEG seja ligado a pelo menos um resíduo lisina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "USO DE VA- RIANTES PEGUILADAS DE ÍGF-I PARA O TRATAMENTO DE DlS- TÚRBIOS NEUROMUSCULARES". A presente invenção refere-se ao uso farmacêutico de variantes 5 de polietilenoglico1-(PEG)uüadas de IGF-I para o tratamento, prevenção e/ou retardo da progressão de distúrbios neuromusculares, em particular escle- rose lateral amiotrófica (ALS). Mais especificamente, a presente invenção refere-se ao uso de uma variante PEGuilada de IGF-I para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção e/ou retardo de distúrbios neuromusculares, em particular ALS em que a variante PEGuilada de IGF-I é caracterizada pelo fato de que é derivada da sequência de ami- noácidos de IGF-I humano do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e transporta uma ou duas alterações de aminoácidos nas posições de aminoácido 27, 65 e 68 para que um ou dois aminoácidos nas posições 27, 65 e 68 seja/sejam um aminoácido poIar mas não lisina e PEG é ligado a pelo menos um resí- duo lisina.
Distúrbios neuromusculares cobrem uma faixa de condições in- cluindo neuropatias (adquiridas ou herdadas), distrofias musculares, ALS, atrofia muscular espinhal (SMA), bem como uma faixa de distúrbios muscu- Iares muito raros.
Distúrbios neuromusculares afetam os nervos que contro- lam músculos voIuntários.
Quando os r)eurônios tornam-se doentes ou mor- rem, a comunicação entre o sistema nervoso e músculos entra em coIapso.
Como resultado, músculos enfraquecem-se e definham.
A fraqueza pode levar à contração, espasmos, sofrimentos e dores, e problemas de movi- mento e articulação.
Às vezes também afeta a função cardíaca e sua capa- cidade de respiração.
Há muitas causas de fraqueza muscular progressiva, que pode atacar em qualquer momento da infância até a idade adulta.
Distrofia muscular (MD) é um subgrupo de distúrbios neuromus- culares.
MD representa uma família de doenças hereditárias dos músculos.
Aigumas formas afetam crianças (por exemplo, distrofia de Duchenne) e são letais em duas a três décadas.
Outras formas se apresentam na vida adulta e são mais lentamente progressivas.
Os genes para várias distrofias foram identificados, incluindo a distrofia de Duchenne (causada por mutações no gene da distrofina) e o início adolescente e adulto da distrofia de Miyoshi ou sua variante, distrofia de cinturas tipo 2B ou LGMD-2B (causado por muta- ções no gene da disferlina). Estas são mutações com "perda da função" que 5 impedem a expressão da proteína relevante no músculo e por meio disso causam a disfunção muscular.
Modelos de camundongo destas mutações existem, surgindo espontaneamente na natureza ou gerados por inativação ou deleção dos genes relevantes, Estes modelos são úteis para testar tera- pias que poderiam substituir a proteina ausente no músculo e restaurar a função muscular normal.
Distúrbios neuromusculares também incluem doenças de neurô- nio motor (MND) que pertencem a um grupo de distúrbios neurológicos atri- buídos à destruição de neurônios motores do sistema neNoso central e mo- dificações degenerativas na via de neurônio motor, e são diferentes de ou- tras doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Parkinson, doença de Alzheimer, atrofia olivopontocerebelar, etc., que são causadas pela des- truição de neurônios além de neurônios motores.
O National lnstitute of Neu- rological Diseases and Stroke (NINDS) chama os distúrbios degenerativos progressivos de doenças do neurônio motor (MNDs), que afetam nervos nas partes superiores ou inferiores do corpo.
Alguns são herdados, de acordo com o NINDS.
Geralmente, MNDS atacam na meia-idade.
Sintomas podem incluir dificuldade de engolir, fraqueza de membros, discurso pronunciado indistintamerite, marcha prejud icada, fraqueza facial e espasmos muscula- res.
Respiração pode ser afetada nos estágios tardios destas doenças.
A causa(s) da maioria das MNDS não é conhecida, mas fatores ambientais, tóxicos, virais ou genéticos são todos suspeitos.
Formas de MND incluem Atrofia Muscular Espinhal Adulta (SMA), Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS) que também é conhecida como Doença de Lou Gehrig, Atrofia Muscular Es- pinhal Progressiva lnfantil (SMAI) que também é conhecida como SMA Tipo 1 ou Werdnig-Hoffman, Atrofia Muscular Espinhal lntermediária (SMA2) que também é conhecida como SMA Tipo 2, Atrofia Muscular Espinhal Juvenil (SMA3) que também é conhecida como SMA Tipo 3 ou Kugelberg-Welander,
Atrofia Muscular Bulbar Espinhal (SBMA) que também é conhecida como Doença de Kennedy ou SBMA ligada ao X.
Doenças de neurônio motor são distúrbios nos quais os neurônios motores degeneram-se e morrem.
Neurô- nios motores, incluindo neurônios motores superiores e neurônios motores 5 inferiores, afetam múscubs voluntários, estimulando-os a contrair-se.
Neu- rônios motores superiores originam-se no córtex cerebral e enviam fibras através do tronco encefálico e medula espinhal, e estão envolvidos no con- trole de neurônios motores inferiores- Neurônios motores inferiores estão localizados no tronco encefálico e na medula espinhal e distribuem fibras aos músculos- Doenças de neurônio motor inferiores são doenças que en- voIvem degeneração de neurônio motor inferior- Quando um neurônio motor inferior degenera-se, as fibras musculares que normalmente se ativam ficam desligadas e não se contraem, causando fraqueza muscular e reflexos dimi- nuídos.
A perda de qualquer tipo de neurônio resulta em fraqueza, atrofia muscular (prejudicial) e fraqueza indolor são características clinicas incon- fundíveis de MND.
ALS é uma doença do neurônio motor fatal caracterizada pela perda seletiva e progressiva de neurônios motores na medula espinhaj, tron- co encefálico e córtex cerebral.
Tipicamente leva à fraqueza muscular pro- gressiva e falência respiratória neuromuscular.
Aproximadamente 1O°/j de ALS estão associadas com mutações pontuais no gene codificante da en- zima superóxido dismutase-l Cu/Zn (SODl). A descoberta desta causa ge- nética primária de ALS forneceu uma base para testar várias possibilidades terapêuticas.
As atividades neuroprotetoras potentes de fatores neurotróficos (NTFS), variando de prevenção de atrofia neuronal, degeneração axonal e morte celular, geraram uma grande esperança para o tratamento de ALS no início dos anos 90. Fator neurotrófico ciliar (CNTF), fator neurotrófico deri- vado do cérebro (BDNF) e fator de crescimento similar à insulina 1 (IGF-I) já foram avaliados em pacientes com ALS. a justificativa para testar estes fato- res em pacientes com ALS foi baseada nos seus efeitos tróficos sobre para- digmas de morte celular que ocorrem naturalmente durante o desenvolvi- mento, dano de nervo traumático ou em modelos animais que se parecem com ALS, tais como camundongos pmn ou wobbler.
Exceto por IGF-I (Lai EC et al.
Neurology 1997, 49: 1621-1630), a distribuição distribuição sistê- mica destas proteínas recombinantes não levou a efeitos clinicamente bené- ficos em pacientes com ALS (Turner MR. et al.
Semin.
Neurol. 2001: 21: 5 167-175)- Efeitos coIaterais indesejáveis e biodisponibilidade limitada com- plicaram a avaliação de seus beneflcios clínicos potenciais.
Uma dificuldade prática na aplicação de neurotrofinas consiste em que estas proteínas todas têm uma meia-vida relativamente curta enquanto as doenças neurodegene- rativas são crônicas e requerem tratamento a longo prazo.
Contemporaneamente, várias cepas de camundongos transgê- nicos superexpressando diferentes mutações de SODI ligadas a ALS foram geradas (Newbery HJ et al.
Trends Genet. 2001; 17: S2-S6). Através de imi- tação com atenção, muitas das caracteristicas clínicas e neuropatológicas de ALS, estes camundongos forneceram modelos animais mais relevantes para investigar o potencial pré-clínico de fatores neurotróficos.
Administração direta de proteinas tróficas recombinantes foi decepcionante.
Efeitos benéfi- cos sobre neuropatologia do neurônio motor são sutis ou nulos (Azari MF et al.
Brain Res- 2003: 982: 92-97; Feeney SJ et al.
Cytokyne 2003; 23: 108- 118; Dreibelbis JE et al.
Muscle Nerve 2002; 25: 122-123). Distribuição me- diada por vetor viral de fatores neurotróficos, tais como fator neurotrófico de- rivado de Iinhagem celular glial (GDNF), IGF-I ou cardiotrofina-l (CT-l), en- tretanto, revelou melhora comportamental ou neuropatológica (Wang LJ et al.
J.
Neurosci. 2002; 22: 6920-6928; Bordet T et al.
Hum- Mol.
Genet. 2001; 10: 1925-1933 e Kaspar BK et al.
Science 2003, 301: 839-842) sugerindo que com um regime de aplicação apropriado, eficácia pode ser alcançada.
Fator de crescimento similar à insulina (IGF-I) é um hormônio anabólico circulante estruturalmente relacionado à insulina- Na circulação, mais de 99% de IGF-I está Iigado a proteinas de Iigação a IGF-I (IGFBP'S), que têm afinidades muito altas a IGF'S e modulam a função de IGF-I.
O fator pode ser localmente liberado a partir de IGFBP'S pela proteólise através de proteases específicas.
A fonte principal de IGF-I sérico (-75°6) é o fígado (Sjõgren, K., et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci. 94 (1999) 7088-7092; Yakar, S., et al-, Proc.
Natl- Acad.
Sci. 96 (1999) 7324-7329) embora IGF-I seja local- mente produzido em cada célula do corpo.
Além de sua função endócrina, IGF-I tem um papel parácrino no desenvolvimento e maturação cerebral (VVerther, G.A., et al., Mol.
Endocrinol. 4 (1990) 773-778). Es'tudos in vitroin 5 vitro indicam que IGF-I é um agente trófico não seletivo potente para vários tipos de neurônios no SNC (Knusel, B., et al., J.
Neurosci. 10 (1990) 558- 570; Svrzic, D. and Schubert, D., Biochem.
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Res.
Commun. 172 (1990) 54-60), incluindo neurônios dopaminérgicos (Knusel, B., et al., j.
Neu- rosci. 10 (1990) 558-570), oligodendrócitos (McMorris, F.A., and Dubois- lO Dalcq, M., J.
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Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., et al., Proc.
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Acad.
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Res. 30 (1991) 382-390) e motoneurônios espinhais (Hughes, R.A., et al., J.
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Neurobiol. 24 (1993) 1578-1588; Li, L., et al., j.
Neurobiol. 25 (1994) 759- 766). A entrada de IGF-I periférico no cérebro através do transporte mediado por receptor através da barreira hematoencefálica (BBB) foi demonstrada (Rosenfeld, R.G. et al., Biochem.
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Clin.
Exp- 37 (1988) 136-140; Pan, W. and Kastin, A.J.
Neuroendocrinology 72 (2000) 171-178). Dados pré-clínicos ge- rados principalmente em camundongos transgênicos para SODl fornecem forte evidência que IGF-I mostra eficácia em parâmetros relacionados a ALS quando distribuido intratecalmente ou através de dispositivos de liberação lenta ou abordagens gênicas terapêuticas (Kaspar et al., Science 301:839, 2003; Boillee and Cleveland, Trends Neurosci 27:235, 2004; Dobrowolny et al., J Cell Biol 168:193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235:61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82:452, 2005). Isto sugere que uma distribuição cons- tante de IGF-I seja necessária já que dados não publicados existem para eficácia em modelos de ALS na aplicação parenteral de doses de IGF-I ade- quadas para uso em seres humanos.
Patente U.S.
No. 5.093.317 menciona que a sobrevivência de células neuronais coIinérgicas é aumentada pela administração de IGF-I- É conhecido ainda que IGFJ estimula a regeneração de neNo periférico (Kan-
je, M., et al., Brain Res. 486 (1989) 396-398) e aumenta a atividade de orni- tina descarboxilase (Patente U.S. No. 5.093.317). Patente U.S. No.
5.861.373 e WO 93/02695 Al mencionam um método de tratamento de da- nos ou doenças do sistema nervoso central que afetam predominantemente 5 as células gliais e/ou neuronais não colinérgicas pelo aumento da concen- tração(ões) ativa de IGFJ e/ou análogos do mesmo no sistema nervoso cen- tral do paciente. WO 02/32449 A1 é direcionado a métodos para redução ou prevenção de dano isquêmico no sistema nervoso central de um mamífero pela administração à cavidade nasal do mamífero de uma composição far- lO macêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de IGF- l ou variante biologicamente ativa do mesmo. O IGF-I ou variante do mesmo é absorvido pela cavidade nasal e transportado para o sistema nervoso cen- tral do mamífero em uma quantidade eficaz para reduzir ou prevenir dano isquêmico associado a um evento isquêmico. EP 0 874 641 Al reivindica o uso de um IGF-I ou um IGF-II para a produção de um medicamento para tratar ou prevenir dano neuronal no sistema nervoso central, devido à de- mência relacionada à AIDS, AD, Doença de Parkinson, Doença de Pick, Do- ença de Huntington, encefalopatia hepática, sindromes gangliônicas córtico- basais, demência progressiva, demência familial com paraparesia espasmó- dica, paralisia supranuclear progressiva, esclerose múltipla, esclerose cere- bral de Schilder ou encefalomielite necrosante hemorrágica aguda, em que o medicamento está em uma forma para administração parenteral de uma quantidade eficaz do dito IGF de fora da barreira hematoencefálica ou barrei- ra sangue-medula espinhal. Para uso clínico, entretanto, a meia-vida curta de IGF-I na perife- ria após apiicação exógena é uma desvantagem clara e requer alta frequên- cia de dosagem que gera questões severas. Efeitos colaterais (como hipo- glicemia, vista frequentemente em testes clínicos com IGF-I, também vide relatório NDA 21-839 (http://www.fda.gov/cder/foi/nda/2005/021839 _ SOOO _ lncreiex Pharm.pdf) devido à sobrecarga aguda com IGF-I limita a dose tolerada máxima a um nível onde a eficácia sustentada ainda não é alcançada. Para superar esta desvantagem e alcançar doses mais altas para melhor atividade, um IGF-I modificado com taxa de absorção mais lenta, residência no sangue mais longa e estável, mas mantendo a bioatividade seria necessário.
A fim de as- segurar que o d ito IGF-I modificado ainda possa exercer sua ação neuropro- 5 tetora, é também requerido que o transporte da barreira hematoencefálica esteja em pleno fúncionamento.
No uso pré-clinico, foi tentado visar pelo menos algumas das di- ficuldades acima mencionadas pelo encapsulamento de IGF-I em dispositi- vos de liberação lenta como minibombas e microesferas para suprimento constante sem grande flutuação de composto no sangue (Carrascosa C et al.
Biomaterials 25; 707-714; WO 03/077940 Al). Entretanto, usando esta abordagem um aumento forte inicial de IGF-I sanguíneo foi observado que gerará os mesmos efeitos colaterais agudos em seres humanos como inje- ção s.c. de IGF-I.
Surpreendentemente, foi veiificado que especificamente varian- tes PEGuiladas de IGF-I (PEG-IGF-I) quando injetadas parenteralmente têm o perfil farmacocinético necessário.
As ditas variantes PEGuiladas de IGF-) não têm nenhuma atividade hipoglicêmica aguda até doses e/ou concentra- ções plasmáticas > 10 vezes superiores a IGF-I não PEGilado.
Seria clara- mente esperado que PEGuilação prejudicasse Iigação e penetração da bar- reira hematoencefálica mediada por receptor de IGF-I.
As variantes PEGui- ladas de IGF-I descritas após isto em detalhes são surpreendentemente neuroprotetoras e funcionais em animal, isto é, modelos de camundongo de distúrbios neuromusculares em doses muito mais baixas usadas do que a requerida com IGF-I não PEGuilado, mostrando 1) que o transporte na bar- reira hematoencefálica está em pIeno funcionamento, 2) que a molécula mantém totalmente sua atividade biológica in vivo e 3) que a hipoglicemia é vista somente em doses superiores "10 vezes de PEG-IGF-I em compara- ção com IGFJ que permite a dosagem ainda mais alta de PEG-IGF-I para a melhor eficácia no homem.
Sumário da lnvenção Em uma primeira modalidade, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de distúrbios neuromusculares pela adminis- tração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma variante PEGui- 5 lada de IGF-I descrita a seguir a um paciente em necessidade da mesma.
Em uma modalidade preferencial, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de MND, em particular ALS pela administra- ção de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma variante PEGuila- da de IGF-I descrita a seguir a um paciente em necessidade da mesma.
Em outra modalidade, a presente invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreendendo uma variante PEGuilada de IGF-I descrita a seguir em conjunto com um veículo farmaceuticamente acei- tável em que a dita composição farmacêutica é útil no tratamento, prevenção e/ou retardo da progressão de distúrbios neuromusculares, preferencialmen- te MND, e ainda mais preferencialmente ALS.
Um aspecto adicional da invenção refere-se ao uso de uma vari- ante PEGuilada de IGF-I descrita a seguir para a produção de um medica- mento para o tratamento de distúrbios neuromusculares, preferencialmente MND, e ainda mais preferencialmente ALS.
Descrição Detalhada da Invenção A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni- cos e científicos usados neste pedido têm os mesmos significados que co- mumente entendidos por um versado na técnica à qual esta invençâo per- tence.
Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste pedido possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferenciais são descritos a seguir.
Definições O termo "distúrbios neuromusculares" engloba doenças e en- fermidades que prejudicam diretamente (através da patologia muscular in- trinseca) ou indiretamente (através da patologia do neNo) o funcionamento do músculo.
Exemplos de distúrbios neuromusculares induem, mas não são limitados a:
Doenças de neurônio motor como ALS (também conhecida co- mo Doença de Lou Gehrig), Atrofia Muscular Espinhal Tipo 1 (SMAI, Doen- ça de Werdnig-Hoffmann), Atrofia Muscular Espinhal Tipo 2 (SMA2), Atrofia Muscular Espinhal Tipo 3 (SMA3, Doença de Kugelberg-Welander), Atrofia 5 Muscular Bulbar Espinha) (SBMA, também conhecida como Doença de Ken- nedy e SBMA ligada ao X), Distrofias Musculares como Distrofia Muscular de Duchenne (DMD, também conhecida como Pseudo-hipertrófica), Distrofia Muscular de Becker (BMD), Distrofia Muscular de Emery-Dreifuss (EDMD), Distrofia Mus- lO cular do tipo Cinturas (LGMD), Distrofia Muscular Facioescapuloumeral (FSH ou FSHD, também conhecida como Landouzy-Dejerine), Distrofia Miotônica (MMD, também conhecida como Doença de Steinert), Distrofia Muscular Oculofaringea) (OPMD), Distrofia Muscular Distal (DD, Miyoshi), Distrofia Muscular Congênita (CMD). Doenças metabólicas de músculo como Deficiência de fosforila- se (MPD ou PYGM, também conhecida como Doença de McArdle), Defici- ência de Maltase Ácida (AMD, também conhecida como Doença de Pompe), Deficiência de Fosfofrutoquinase (também conhecida como Doença de Ta- rui), Deficiência de Enzima de Desramificação (DBD, também conhecida como Doença de Cori ou Forbes), Miopatia Mitocondrial (MITO), Deficiência de Carnitina (CD), Deficiência de Carnitina Palmitil Transferase (CPT), Defi- ciência de Fosfogíicerato Quinase, Deficiência de Fosfoglicerato Mutase, Deficiência de Lactato Desidrogenase, Deficiência de Mioadenilato Deami- nase, Deficiência de Palmitil Transferase (CPT), Deficiência de Fosfoglicera- to Quinase, Deficiência de Fosfoglicerato Mutase, Deficiência de Lactato De- sidrogenase, Deficiência de Mioadenilato Deaminase; Doenças de nervo periférico como Doença de Charcot-Marie- Tooth (CMT, também conhecida como Neuropatia Motora e Sensorial Here- ditária (HMSN) ou Atrofia MLiscu|ar Peroneal (PMA), Ataxia de Friedreich (FA), Doença de Dejerine-Sottas (DS), Miopatias inflamatórias como Dermatomiosite (DM), Polimiosite (PM), Miosite de Corpos de lnclusão (IBM),
Doenças da Iigação neuromuscular como Miastenia Gravis (MG), SÍndrome de Lambert-Eaton (LES), Sindrome Miastênica Congênita (CMS), Miopatias devido à a anormalidades endócrinas como Miopatia 5 Hipertireoidiana (HYPTM), Miopatia Hipotireoidiana (HYPOTM) Outras miopatias como Miotonia Congênita (MC, também Doen- ça de Thomsen e Becker), Paramiotonia Congênita (PC), Doença de Parte Central (CCD), Miopatia da Nemalina (NM) Miopatia Miotubular/Miopatia Centronuclear (MTM ou CNM), Pa- lO ralisia Periódica (PP, duas formas: Hipocalêmica e Hipercalêmica). Por "MND" é entendido uma doença que afeta um neurônio com função motora, isto é, um neurônio que transmite impulsos motores.
Tais neurônios também são denominados "neurônios motores". Estes neurônios incluem, sem limitação, neurônios alfa da medula espinhal anterior que dão origem às fibras alfa que enervam as fibras musculares esqueléticas; neurô- nios beta da medula espinhal anterior que dão origem às fibras beta que e- nervam fibras musculares extrafusais e intrafusais; neurôn ios gama da me- dula espinhal anterior que dão origem a fibras gama (fusimotores) que ener- vam fibras intrafusais do fuso muscular; neurônios heterônimos que suprem músculos além daqueles dos quaís os impulsos aferentes se originam; neu- rônios homônimos que suprem músculos a partir dos quais os impuísos afe- rentes se originam: neurônios periféricos inferiores cujos corpos celulares estão nas colunas cinzentas ventrais da medula espinhal e cujas termiria- ções estão nos músculos esqueléticos; neurônios periféricos que recebem impulsos de interneurônios; e neurônios superiores no górtex cerebral que conduzem impulsos do córtex motor a núcleos motores dos nervos cerebrais ou às colunas cinzentas ventrais da medula espinhal.
Exemplos não limitantes de distúrbios de motoneurônios incluem várias amiotrofias, tais como amiotrofias hereditárias incluindo atrofia muscu- lar espinhal hereditária, atrofia muscular espinhal infantil aguda, tal como doença de Werdnig-Hoffman, atrofia muscular progressiva em crianças, tal como tipo proximal, distal e tipos bulbares, atrofia muscular espinhal de iní-
cio adolescente ou adulto incluindo os tipos proximal, escapuloperoneal, fa- cioescapuloumeral e distal, esclerose lateral amiotrófica (ALS) e esclerose lateral primária (PLS). Também incluído no termo está dano motoneuronal.
O termo "Esclerose Lateral Amiotrófica" (ou "ALS"), também 5 chamada de doença de Lou Gehrig, é uma doença fatal que afeta os neurô- nios motores do córtex, tronco cerebral e medula espinhal. (Hirano, (1996) Neurology, 47 (4 Suppl. 2): S63-6)- Embora a etiologia da doença seja des- conhecida, uma teoria consiste em que a morte celular neuronal em ALS é o resultado de superexcitação de células neuronais devido ao excesso de glu- lO tamato extracelular.
Glutainato é um neurotransmissor que é liberado por neurônios glutaminérgicos, e é absorvido em células gliais onde é convertido em glutamina pela enzima glutamina sintetase, glutamina então se reintro- duz nos neurônios e é hidrolisada por glutaminase para formar glutamato, dessa forma enchendo novamente o agrupamento de neurotransmissores- Em uma medula espinhal e tronco cerebral normais, o nivel de glutamato extracelular é mantido em baixos níveis micromolares no fluido extracelular porque as células gliais, que funcionam em parte para suportar os neurônios, usam proteína transportadora de aminoácido excitatório tipo 2 (EAAT2) para absorvide glutamato imediatamente.
Uma deficiência na proteína EAAT2 normal em pacientes com ALS foi identificada como sendo importante na patologia da doença (Vide, por exemplo, Meyer et al. (1998) J.
Neurol.
Neurosurg- Psychiatry, 65: 594-596; Aoki et al. (1998) Ann.
Neurol. 43: 645- 653; Bristol et al. (1996) Ann Neurol. 39: 676-679). Uma explicação para os níveis reduzidos de EAAT2 consiste em que EAAT2 é unida aberrantemente (Lin et al. (1998) Neuron, 20: 589-602). a junção aberrante produz uma vari- ante de junção com uma deleção de 45 a 107 aminoácidos localizados na região C-terminal da proteína EAAT2 (Meyer et al. (1998) Neurosci Lett. 241: 68-70). Devido à falta de, ou defeito em EAAT2, glutamato extracelular acu- mula-se, fazendo neurônios dispararem continuamente.
O acúmulo de glu- tamato tem um efeito tóxico sobre células neuronais porque o disparo contí- nuo dos neurônios leva à morte celular precoce.
Embora muito seja conheci- do sobre a patologia de ALS pouco é conhecido sobre a patogênese da for-
ma esporádica e sobre as propriedades causais da proteína SOD mutante em ALS familial (Bruijn, et al. (1996) Neuropathol.
Appl.
Neurobiol, 22: 373- 87; Bruijn, et al. (1998) Science 281: 1851-54). Muitos modelos foram espe- culados, incluindo toxicidade de glutamato, hipóxia, estresse oxidativo, agre- 5 gados proteicos, neurofilamentos e disfunção mitocondrial CIeveland, et ai. (1995) Nature 378: 342-43; Cleveland, et al.
Neurology, 47 (4 Suppl. 2): S54- 61, discussão S61-20996); Cleveland, (1999) Neuron, 24: 515-20; Cleveland, et al. (2001) Nat.
Rev.
Neurosci., 2: 806-19; Couillard-Despres, et al. (1998) Proc.
Natl.
Acad.
SCL USA, 95: 9626-30; Mitsumoto, (1997) Ann.
Pharmacother., 31: 779-81; Skene, et al. (2001) Nat.
Genet. 28: 107-8; Willi- amson, et al (2000) Science, 288: 399). Neste instante, não há cura para ALS, nem há uma terapia que tenha sido provada eficaz para prevenir ou reverter o curso da doença.
Vá- rios fármacos foram recentemente aprovados pela Food and Drug Adminis- tration (FDA). Até agora, tentativas para tratar ALS envolveram tratamento da degeneração neuronal com álcoois graxos de cadeia longa que têm efei- tos citoprotetores (Vide Patente U.S.
No. 5.135.956); ou com um sal de ácido pirúvico (Vide Patente U.S.
No- 5.395-822): e uso de uma glutamina sinteta- se para bloquear a cascata de glutamato (Vide Patente U.S.5.906.976). Por exemplo, Riluzol, inibidor de liberação de glutamato, foi aprovado nos EUA para o tratamento de ALS, e parece estender a vida de pelo menos alguns pacientes com ALS em três meses.
Entretanto, alguns relatos indicaram que embora a terapia com Riluzol prolongue marginalmente o tempo de sobrevi- da, não parece fornecer qualquer melhora da força muscular nos pacientes.
Por isso, o efeito de Riluzol é limitado em que a terapia não modifica a quali- dade de vida do paciente (Borras-8lasco et al. (1998) Rev.
Neurol, 27: 1021- 1027). Como usado a seguir, "peso molecular" significa peso molecular médio de PEG. "PEG ou grupo PEG" de acordo com a invenção significa um re- sÍduo contendo poli(etilenoghcol) como uma parte essencial.
Tal PEG pode conter grupos quimicos adicionais que são necessários para reações de Ii-
gação; que resulta da sÍntese química da molécula; ou que é um espaçador para distância ótima das partes da molécula entre si.
Além disso, tal PEG pode consistir em uma ou mais cadeias laterais de PEG que são ligadas em conjunto.
Grupos PEG com mais de uma cadeia de PEG são chamados de PEGs multibraços ou ramificados.
PEGs ramificados podem ser preparados, por exemplo, pela adição de óxido de poIietileno a vários poIióis, incluindo glicerol, pentaeritriol e sorbitol.
Por exemplo, um PEG ramificado de quatro braços pode ser preparado de óxido de etileno e pentaeritriol.
PEGS ramifi- cados normalmente têm 2 a 8 braços e são descritos em, por exemplo, EP-A 0 473084 e Patente U.S.
No. 5.932.462. Especialmente preferenciais são PEGs com duas cadeias Iaterais de PEG (PEG2) ligadas através de grupos atnino primários de uma lisina (Monfardini, C, et al-, Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)- "Substaricialmente homogêneo" como usado neste pedido signi- fica que somente moléculas de variantes PEGuiladas de IGF-I produzidas, contidas ou usadas são aquelas tendo um ou dois grupos de PEG ligados.
A preparação pode conter pequenas quantidades de proteína não reagida (isto é, sem grupo PEG). Como apurado por mapeamento peptídico e sequenci- amento N-terminal, um exemplo abaixo fornece a preparação que é pelo menos 9Ò°/o conjugado variante de PEG-IGF-I e a maior parte de 5°/0 de pro- teína não reagida. lsolamento e purificação de tais preparações homogê- neas de variante PEGuilada de IGF-I podem ser realizados por métodos de purificação habituais, preferencialmerite cromatografia de exclusão por ta- manho. "MonoPEGuilado" como usado neste pedido sign ifica que a vari- ante de IGF-I é PEGuilada em somente uma lisina por molécula variante de IGF-I, pelo que somente um grupo PEG é ligado covalentemente neste sÍtio.
A variante monoPEGuüada pura de IGF-I (sem PEGuilação N-terminal) é pelo menos 80% da preparação, preferencialmente 90°/o, e ainda mais prefe- rencialmente, monovariante PEGuilada de IGF-I são 92%, ou mais, da pre- paração, o resto sendo, por exemplo IGF-I não reagido (não PEGuilado) e/ou no N-terminal da variante PEGuilada de IGF-L As preparações de vari-
antes monoPEGuiladas de IGF-I de acordo com a invenção são, por isso, homogêneas o suficiente para exibir as vantagens de uma preparação ho- mogênea, por exemplo, em uma aplicação farmacêutica.
O mesmo aplica-se às espécies diPEGuiladas. 5 "Variantes PEGuiladas de ÍGF-I" ou "PEGuilação aminor-reativa" como usado neste pedido significa que uma variante de IGF-I está ligada covalentemente a um ou dois grupos poli(eti|enog|ico|) pela Iigação aminor- reativa a uma ou duas Iisinas da molécula variante de IGF-L O grupo(s) de PEG é/são ligado aos sÍtios da molécula variante de IGF-I que são os grupos [épsilonj-amino primários das cadeias laterais de lisina.
É ainda possÍvel que a PEGuilação ocorra além do grupo [alfa]-amino N-terminal.
Devido ao mé- todo de sintese e variante usados, variante PEGuilada de IGF-I pode consis- tir em uma mistura de variantes de IGF-I, PEGuiladas em K65, K68 e/oL| K27 com ou sem PEGuilação N-terminal, pelo que os sÍtios de PEGuilação po- dem ser diferentes em moléculas diferentes ou podem ser substancialmente homogêneos com respeito à quantidade de poli(etilenoglicol) nas cadeias Iaterais por molécula e/ou o sÍtio de PEGuilação na molécula.
Preferencial- mente as variantes de IGF-I são mono- e/ou diPEGuiladas e especialmente purificadas a partir de variantes PEGuiladas de IGF-I no N-terminal. "PEG ou po|j(eti|enog|ico|)" como usado neste pedido significa um polimero solúvel em água que está disponível comercialmente ou pode ser preparado pela polimerízação por abertura de anel de etilenoglicol de acordo com métodos bem conhecídos na técnica (Kodera, Y., et al., Pro- gress in Polymer Science 23 (1998) 1233-1271; Francis, G.E., et al., lnt.
J.
Hematol. 68 (1998) 1-18. O termo "PEG" é usado largamente para englobar qualquer rnolécula de polietilenoglicoL em que a quantidade de unidades de etilenoglicol (EG) seja pelo menos 460, preferencialmente 460 a 2300 e es- pecialmente preferencialmente 460 a 1840 (230 unidades de EG se referem a um peso molecular de aproximadamente 10 kDa). A quantidade superior de unidades de EG somente é limitada pela soIubilidade das varíantes PE- Guiladas de IGF-I.
Normalmente PEGs que são maiores do que PEGs con- tendo 2300 unidades não são usados.
Preferencialmente, um PEG usado na invenção termina em uma extremidade com hidróxi ou metóxi (metóxi PEG, mPEG) e está em outra extremidade ligada covalentemente a uma porção ligante através de uma ligação oxigênio éter.
O polímero é linear ou ramifi- cado.
PEGS ramificados são, por exemplo, descritos em Veronese, F.M., et 5 al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12 (1997) 196-207. Um aspecto da presente invenção refere-se a um método para o tratamento de distúrbios neuromusculares, preferencialmente uma doença de neurônio motor e ainda mais preferencialmente ALS pela administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma variante PEGuilada de IGF-I a um paciente em neoessidade da mesma.
Em uma modalidade ainda mais preferencial, a doença a ser tratada é ALS que é causada por um defei- to genético que leva à mutação da sLlperóxido dismutase l- Esta variante PEGuilada de IGF-I é caracterizada pelo fato de que PEG é Íigado a um resíduo lisina de uma muteína de IGF-I humano re- combinante que transporta uma ou duas alterações de aminoácido nas posi- ções de aminoácido 27, 65 e 68 da sequência de aminoácidos de IGF-I hu- mano selvagem (SEQ ID NO: 1) para que um ou clois aminoácidos nas posi- ções 27, 65 e 68 seja/sejam um aminoácido polar mas não lisina.
Um "aminoácido polar" como usado neste pedido refere-se a um aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido g|LItâmico (E), histidina (H), asparagina (N), glutamina (Q), arginina (R), serina (S) e treonina (T). Lisina é também um aminoácido poIar, mas excluído, já que lisina é substituida de acordo com a invenção.
Arginina é preferencialmente usada como aminoácido polar.
Preferenciais são formas PEGuiladas de muteínas de IGF-I hu- mano recombinante que são caracterizadas pelas seguintes alterações de aminoácido da sequência de aminoácidos de IGF-I selvagem (SEQ ID NO: 1): (a) K65R e K68R (SEQ ID NO: 2) (b) K27R e K68R (SEQ ID NO: 3) (C) K27R e K65R (SEQ ID NO: 4). Preferência especial é dada à forma PEGuilada da muteína de
IGF-I humano recombinante com alterações de aminoácido K27R e K65R (SEQ ID NO: 4) caracterizada pela monoPEGuilação em K68. Preferência também é dada a composições de uma variante de IGF-I PEGuilada na lisina como descrito acima e uma variante de IGF-I que 5 é PEGuilada N-terminalmente, em que as ditas variantes de IGF-I são idênti- cas quanto à sequência de aminoácidos primária e em que carregam uma ou duas alterações de aminoácido nas posições de aminoácido 27, 65 e 68 da sequência de aminoácidos de IGF-I humano selvagem (SEQ ID NO: 1) para que um ou dois aminoácidos nas posições 27, 65 e 68 seja/sejam um aminoácido polar mas não lisina.
Preferencialmente a razão molecular é 9:1 a 1:9 (razão significa variante de IGF-I PEGuilada na lisina / variante de IGF- | N-terminalmente PEGuilada). É ainda preferencial uma composição em que a razão molar é pelo menos 1:1 (pelo menos uma parte de variante de IGF-I PEGuilada na lisina por uma parte de variante de IGF-I N-terminalmente PEGuilada), preferencialmente pelo menos 6:4 (pelo menos seis partes de variante de IGF-I PEGuilada na Iisina por quatro partes de variante de IGF-I N-terminalmente PEGuilada). Preferencialmente tanto variante de IGF-I PE- Guilada na lisina como a variante de IGF-I N-terminalmente PEGuilada são monoPEGuiladas.
Preferencialmente, nesta composição a variante é idênti- ca tanto na variante de IGF-I PEGuilada na Íisina como na variante de IGF-I N-terminalmente PEGuilada.
A variante de IGF-I é preferencialmente sele- cionada a partir de muteínas de IGF-I tendo as seguintes alterações de ami- noácido da sequência de aminoácidos de IGF-I humano selvagem (SEQ ID NO: 1): (a) K65R e K68R (SEQ ID NO: 2) (b) K27R e K68R (SEQ ID NO: 3) (C) K27R e K65R (SEQ ID NO: 4). Formas PEGuiladas preferenciais de muteínas de IGF-I humano recombinante de acordo com as SEQ ID NOS 2 a 4 são obteníveis seguindo o procedimento para produzir um IGF-I PEGuilado na lisina ou uma variante de IGF-I PEGuilada na lisina, a dita variante compreendendo um ou dois a- minoácido(s) selecionados a partir do grupo consistindo em Iisina 27, 65 e/ou
68 substituídos independentemente por outro aminoácido poIar como descri- to em WO 2008/025528 Al que é completamente incorporado neste pedido por referência.
O processo(s) descrito em WO 2008/025528 A1 permite(m) a preparação de muteinas de IGF-I humano recombinante de acordo com as 5 SEQ ID Nos 2 a 4, que não carregam PEGuilação N-terminal.
É ainda preferencial, que a variante PEGuilada de IGF-I seja uma variante na qual até três (preferencialmente todos os três) aminoácidos no N-terminal sejam truncados.
O respectivo mutante selvagem é denomi- nado Des( 1-3)-IGF-I e não tem os resíduos de aminoácido glicina, prolina e glutamato no N-termma| (Kummer, A., et al., lnt.
J.
Exp.
Diabesity Res. 4 (2003) 45-57). Preferencialmente o(s) grupo(s) poli(etilenog1icol) têm um peso molecular total de pelo menos 20 kDa, mais preferencialmente de aproxima- damente 20 a 100 kDa e especialmente preferencialmente de 20 a 80 kDa.
O grupo(s) poli(etilenoghcol) é/São linear(es) ou ramificado(s). PEGuilação aminorreativa como usada neste pedido indica um método de ligação randômica de cadeias de po|i(eti|enog|ico|) ao grupo(s) amino primário lisina de variante de IGF-I pelo uso de poli(etilenoglicol) reati- vo (ativado), preferencialmente pelo uso de ésteres de N- hidroxissuccinimidila de, preferencialmente, metoxjpoli(eti|enog|ico|). A rea- ção de ligação acopla poli(etilenoglicol) aos grupos reativos [épsilon]-amino dos resíduos Iisina e opcionalmente grupo [alfa]-amino do aminoácido N- terminal de IGF-I.
Tal conjugação do grupo amino de PEG a proteínas é bem-conhecida na técnica.
Por exemplo, revisão de tais métodos é fornecida por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. De acordo com Vero- nese, a conjugação de PEG a grupos amino primários de proteínas pode ser realizada pelo uso de PEGS ativados que realizam uma alquilação dos ditos grupos amino primários.
Para tal reação, PEGS alquilantes ativados, por e- xemplo, PEG aldeido, PEG-cloreto de tresila ou PEG epóxido podem ser usados.
Reagentes úteis adicionais são PEGS acilantes, tais como ésteres de hidroxissuccinimidila de PEGS carboxilados ou PEGS nos quais o grupo hidróxi terminal é ativado por cloroformiatos ou carbonilimidazol.
Reagentes de PEG ainda úteis são PEGS com braços de aminoácido.
Tais reagentes podem oonter os chamados PEGS ramificados, pebs quais pelo menos duas moléculas de PEG idênticas ou diferentes são ligadas em conjunto por um espaçador peptidico (preferencialmente lisina) e, por exemplo, ligados à va- 5 riante de IGF-I como carboxilato ativado do espaçador de lisina.
A ]igaçãD mono-N-terminal também é descrita por Kinstler, O., et al., Adv.
Drug Deliv.
Rev. 54 (2002) 477-485. Reagentes de PEG úteis, por exemplo, estão disponíveis em Nektar Therapeutics lnc.
Qualquer massa molecular de um PEG pode ser usada como praticamente desejada, por exemplo, de aproximadamente 20 kDa a 100 kDa (n é 460 a 2300). A quantidade de unidades de repetição "n" no PEG para massa molecular descrita em Dáltons.
Por exemplo, se duas moléculas de PEG estão ligadas a um ligante, onde cada molécula de PEG tem a mesma massa molecular de 10 1cDa (cada n é aproximadamente 230), então a massa molecular total de PEG no ligante é aproximadamente 20 kDa.
As massas moleculares de PEG ligadas ao ligante também podem ser diferen- tes, por exemplo, das duas moléculas em um ligante, uma molécula PEG pode ter 5 kDa e uma molécula PEG pode ter 15 kOa.
Massa molecular sig- nifica sempre massa molecular média.
Processos adequados e reagentes preferenciais para a produ- ção de variantes PEGuiladas de IGF-I aminorreativas são descritos em WO 2006/066891. É entendido que modificações, por exemplo, com base nos métodos descritos por Veronese, F.M., Biomater'ials 22 (2001) 405-417, po- dem ser feitas nos procedimentos enquanto o processo resulta em variantes PEGuiladas de IGF-I descritas acima.
Processos particularmente preferenci- ais de preparação de variante PEGuilada de IGF-I de acordo com a presente invenção são descritos em WO 2008/025528 Al, que é completamente in- corporado neste pedido por referência.
A ocorrência de até três grupos amino primários potencialmente reativos na proteína alvo (até duas lisinas e um aminoácido terminal) Ieva a uma série de isômeros de variantes PEGuiladas de IGF-I que se diferenciam no ponto de ligação da cadeia de poli(etilenoglicol). Variantes PEGuiladas de IGF-I contêm um ou dois grupos PEG lineares ou ramificados e randomicamente ligados a elas, pelo qual o peso molecular total de todos os grupos PEG na variante PEGuilada de IGF-I é 5 preferencialmente aproximadamente 20 a 80 kDa.
Pequenos desvios desta faixa de peso molecular são possíveis.
Entretanto, é esperado que a ativida- de diminua conforme o peso molecular aumenta devido à ativação de recep- tor de IGF-I e transporte de barreira hematoencefálica reduzidos.
Por isso, a faixa de 20 a 100 kDa de peso molecular de PEG tem que ser entendida como a faixa otimizada para um conjugado de PEG e variante de IGF-I úteis para um tratamento eficiente de MND, em particular ALS.
Formulações Farmacêuticas As variantes PEGuiladas de IGF-I descritas anteriormente são caracterizadas por uma estabilidade melhorada na circulação permitindo um acesso sustentado aos receptores de IGF-I em ao longo do corpo com bai- xos intervalos de aplicação, isto é, intervalos prolongados.
Variantes PEGuiladas de IGF-I podem ser formuladas de acordo com métodos para a preparação de composições farmacêuticas, métodos os quais são conhecidos pelo versado na técnica.
Para a produção de tais composições, uma variante PEGuilada de IGF-I de acordo com a invenção é combinada em uma mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, preferencialmente pela diálise contra uma solução aquosa contendo os in- gredientes desejados das composições farmacêuticas- Tais veículos aceitáveis são descritos, por exemplo, em Reming- ton's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Com- pany, editado por Oslo et al. (por exemplo, pp. 1435 a 1712). Composições típicas contêm uma quantidade eficaz de substância de acordo com a inven- ção, por exemplo, de aproximadamente 0,1 a 100 mg/ml, em conjunto com uma quantidade adequada de um veículo- As composições podem ser admi- nistradas parenteralmente.
O IGF-I PEGuilado de acordo com a invenção é administrado preferencialmente através de aplicação intraperitoneal, subcu- tânea, intravenosa ou intranasal.
As formulações farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
Normalmen- te, soluções de variante PEGuilada de IGF-I são dialisadas contra o tampão destinado a ser usado na composição farmacêutica e a concentração protei- ca finai desejada é ajustada por concentração ou diluição.
Tais composições farmacêuticas podem ser usadas para admi- nistração por injeção ou infusão, preferencialmente através de aplicação in- traperitoneal, subcutânea, intravenosa ou intranasal e conter uma quantida- de eficaz da variante PEGuilada de IGF-I em conjunto com diluentes, con- lO seNantes, solubilizantes, emulsificantes, ad juvantes e/ou veículos farmaceu- ticamente aceitáveis.
Tais composições incluem diluentes de vários conteú- dos de tampão (por exemplo, arginina, acetato, fosfato), pH e força iônica, aditivos, tais como detergentes e agentes solubilizantes (por exemplo Tween (TM) 80/polissorbato, pIuronic (TM) F68), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (Timersol(TM), álcool de benzila) e substâncias de vojume (por exemplo sacarose, manitol), incorpo- ração do material em preparações particuladas de compostos poliméricos, tais como ácido polilático, ácido poliglicólico, etc- ou em lipossomas.
Tais composições podem influenciar a taxa de estabilidade do estado físico de liberação e depuração de variantes PEGuiladas de IGF-I.
Dosaqens e Concentrações de Fármaco Tipicamente, em um regime de tratamento padrão, os pacientes são tratados com dosagens na faixa entre 0,001 a 20 mg, preferencialmente 0,01 a 8 mg de variante PEGuilada de IGF-I por kg por semana ao longo de certo período de tempo, durando de uma semana a aproximadamente 3 me- ses ou ainda mais longo.
O fármaco é aplicado como uma injeção em bolus s.c., i.v.
Olj i.p. (intraperitoneal) semanal única ou infusão de uma formulação farmacêutica contendo 0,1 a 100 mg de uma variante PEGuilada de IGF-I descrita anteriormente por ml.
Este tratamento pode ser combinado com qualquer tratamento padrão (por exempb, quimioterápico), pela aplicação de IGF-I PEGuilado antes, durante ou após tratamento padrão. lsto resulta em um resultado melhorado em comparação com o tratamento padrão sozinho.
Foi verificado que as variantes PEGuiladas de IGF-I descritas anteriormente podem ser administradas somente uma ou duas vezes por semana para tratamento bem-sucedido.
Um método de tratamento de uma distúrbio neuromuscular, preferencialmente uma MND, e ainda mais prefe- 5 rencial ALS, por isso, deve cornpreender administração a um paciente em necessidade das mesmas de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma variante PEGuilada de IGF-I descrita anteriormente com uma dosagem na faixa entre 0,001 e 3 mg, preferencialmente 0,01 e 3 mg de variante PE- Guilada de IGF-I por kg e por 3 a 8 dias, preferencialmente por 7 dias.
Como variante PEGuilada de IGF-I é preferencialmente usada uma variante de IGF-I monoPEGuilada.
As variantes PEGuiladas de IGF-I descritas anteriormente po- dem ser usadas para a preparação de um medicamento para tratamento de uma distúrbio neuromuscular, preferencialmente uma MND, e ainda mais preferencial ALS que é administrada a um paciente em necessidade das mesmas em uma quantidade terapeuticamente eficaz e com uma ou duas dosagens na faixa entre 0,001 e 3 mg, preferencialmente 0,01 e 3 mg de variante PEGuilada de IGF-I por kg e por 6 a 8 dias, preferencialmente por 7 dias.
Como variante PEGuilada de IGF-I é preferencialmente usada uma variante de IGF-I monoPEGuilada.
As variantes PEGuiladas de IGFJ descritas anteriormente tam- bém podem ser usadas separadamente, sequencialmente ou simultanea- mente em uma combinaçâo combiriada com um segundo composto farma- coIogicamente ativo para o tratamento de uma distúrbio neuromuscular, pre- ferencialmente uma MND, e ALS até mais preferencial.
Preferencialmente, o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação ê pelo menos um neuroprotetor tendo um efeito inibitório sobre a Iiberaçáo de glutamato ou efeito de inativação de canais de sódio dependentes de voltagem ou a capa- cidade de interferir em eventos intracelulares que seguem a ligação do transmissor em receptores de aminoácido excitatórios.
O segundo composto farmacologicamente ativo é preferencial- mente riluzol.
Riluzol bloqueia canais de sódio i lX-S, que estão associados a neurônios danificados (Song JH, Huang CS, Nagata K, Yeh JZ, Narahashi T.
Differential action of riluzole on tetrodotoxin-sensitive and tetrodotoxin- resistant sodium channels J.
Pharmacol- Exp.
Ther. 1997; 282: 707-14). lsto reduz o influxo de Íons cálcio e previne indiretamente a estimulação de re-
5 ceptores de glutamato.
Em conjunto com o bioqueio direto de receptor de glutamato, o efeito do neurotransmissor de glutamato em neurônios motores é reduzido.
O termo "riluzol" como usado neste pedido refere-se a 2-amino- 6-(trifluorometóxi)benzotiazol, 6-(trifluorometóxi)benzotiazol-2-amina ou CAS-1744-22-5. Em um ampb sentido desta modalidade, o termo "riluzol" também compreende ingredientes ativos tendo pelo menos uma propriedade farmacológica também observada com riluzol selecionado a partir de um e- feito inibitório sobre liberação de glutamato, inativação de canais de sódio dependentes de voltagem e capacidade de interferir em eventos intracelula-
res que seguem a ligação do transmissor em receptores de aminoácido exci- tatórios.
O uso de riiuzol em ALS é descrito em US 5.527.814, o composto e sua preparação são descritos em EP 050 551. Outros compostos neuropro- tetores podem ser preparados como descrito, por exemplo, por Yagupolskii et al em Zhurnal Obschei Khimii 33 (7), 2301-7 (1963)-
Os seguintes exemplos, referências e figuras são fornecidos pa- ra auxiliar a compreensão da presente invenção, o escopo verdadeiro do qual é apresentado nas reivindicações adicionadas- É entendido que modifi-
cações podem ser feitas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.
Listagem de Sequências SEQ ID NO:I Sequência de aminoácidos de IGF-I humano selvagem (aminoá- cidos 1 a 70 da proteina precursora IGF-I de acordo com SwissProt
PO1343). SEQ ID NO: 2 Sequência de aminoácidos da muteína de IGF-I humano carre- gando trocas de aminoácido K65R e K68R.
SEQ ID NO: 3 Sequência de aminoácidos da muteína de IGF-I humano carre- gando trocas de aminoácido K27R e K68R.
SEQ ID NO: 4 5 Sequência de aminoácidos da muteína de IGF-I humano carre- gando trocas de aminoácido K27R e K65R.
Breve Descrição das Fiçjuras A figura 1 mostra a detecção sérica após injeção s.c. de 100 µ- g/kg de rhIGF-l ou PEG-IGF-I em camundongos.
Os níveis séricos de PEG- lO IGF-I ou rhIGF-l foram detectados em pontos de tempo indicados por técni- cas ELISA.
A figura 2 mostra imunorreatividade de IGF-I em neurônios CAl do hipocampo após injeção s.c. de rhIGF-l ou PEG-IGF-I (100 µg/kg) em camundongos.
Em pontos de tempo indicados, os cérebros foram removidos e imunomarcados com hlGF-l.
As imagens digitais da região CAl do hipo- campo foram analisadas para marcar a intensidade dentro dos neurônios.
A figura 3 mostra níveis de glicose plasmática após injeção s.c. de PEG-IGF-I (200 a 5000 µg/kg) em cães beagle.
Níveis de glicose foram estimados de gotas de sangue nos respectivos pontos de tempo usando o dispositivo Roche AkkuCheck.
A flecha ind ica a única ocorrência significante de hipoglicemia severa no cão macho na dose de 5000 µg/kg.
A figura 4 mostra a sobrevivência in vitroin vitro de motoneurô- nios primários de camundongo após tratamento de 5 dias com rhlGF I ou PEG-IGF-I.
Os motoneurônios primários de camundongos C57Bl/6 foram cultivados em presença ou ausência de PEG-IGF-I ou rhIGF-l em concentra- ções diferentes e sobrevivência estimada pela microscopia de contraste de fase em 5 dias in vitro.
A figura 5 mostra força de aperto de camundongos pmn tratados com veículo ou 150 µg/kg de PEG-IGF-I s.c. q2d.
Os animais foram testados semanalmente quanto à força muscular de membros dianteiros, números indicam animais analisados por ponto de tempo (**, p <O,O1)- A figura 6 mostra que o desempenho de rotarod de camundon-
gos pmn tratados com veículo ou 150 µg/kg de PEG-IGF-I s.c. q2d.
Animais foram testados semanalmente quanto à coordenação motora, números indi- cam animais por ponto de tempo (*, p "0,05). A figura 7 mostra que a sobrevivência de motoneurônio no nú- 5 cleo facial de camundongos pmn tratados com veículo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg s.c. q2d). Os animais foram mortos no dia 34 pós-natal e tecido pro- cessado para histologia.
Exame estereológico de números de motoneurônio foi realizado às cegas, valores expressos de números totais por camundon- go (**, p "0,01). A figura 8 mostra que a sobrevivência de motorieurônio na me- dula espinhal lombar de camundongos pmn tratados com veículo ou PEG- IGF-I (150 µg/kg s.c. q2d). Os animais foram mortos no dia 34 pós-natal e tecido processado para histologia.
Exame estereológico de números de mo- toneurônio foi realizado às cegas, valores expressos de números totais por camundongo (***, p "0,001). A figura 9 mostra que os números de axônios mielinizados no nervo frênico proximal de camundongos pmn tratados com veículo ou PEG- IGF-I (150 µg/kg s.c. q2d). Os animais foram mortos no dia 34 pós-natal e tecido processado para histologia- Exame estereológico de números de axô- nios mielinizados foi realizado às cegas, valores expressos de números to- tais por nervo frênico (*, p "0,05). A figura 10 mostra que os números de axônios mielinizados no neNo frênico distal de camundongos pmn tratados com veículo ou PEG-IGF- l (150 µg/kg s.c- q2d)- Os animais foram mortos no dia 34 pós-natal e tecido processado para histologia.
Exame estereológico de números de axônios mielinizados foi realizado às cegas, valores expressos de números totais por nervo frênico (**, p "0,01). A figura 11 mostra análise de peso corporal de camundongos SODl (G93A) tratados com velculo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg s.c. q3.5d). O peso corporal foi avaliado semanalmente e os valores foram normalizados para o peso corporal no primeiro exame que foi estabelecido em 100% (*, p "0,05).
A figura 12 mostra início de doença em camundongos SODl (G93A) tratados com veículo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg s.c. q3.5d). Os ani- mais foram examinados semanalmente e inicio de doença definido por fra- queza do membro traseiro, andadura anormal e dificuldade de manter-se em 5 uma rede de arame invertida.
O gráfico de Kaplan-Meier mostra início de doença em camundongos individuais tratados a partir da semana 34 pós- natal.
O gráfico de barras mostra a idade média no início da doença de am- bos os grupos (p "0,05). A figura 13 mostra força de aperto de camundongos SODl (G93A) tratados com veículo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg s.c. q3.5d). Os ani- mais foram testados semanalmente para força muscular de membros dian- teiros.
Análise de LOCF de animais que morrem durante o curso de tempo foi realizada pela inclusão dos últimos valores medidos nos dados adicionais (*, p "0,05; *7 p "0,01). A figura 14 mostra desempenho de rotarod de camundongos SODl (G93A) tratados com veículo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg s.c. q3.5d). Animais foram testados semanalmente para coordenação motora.
Análise de LOCF de animais que morrem durante o curso de tempo foi realizada pela inclusão dos últimos valores medidos nos dados adicionais (*, p "0,05; *7 P <0,01). A figura 15 mostra ações in vivo de PEG-IGFJ relacionado à u- nidade neuromuscular como demonstrado nos modelos de camundongo de ALS- Foi mostrado que PEG-IGF-I melhora a função neuromuscular bem como também protege axônios motores e motoneurônios no tronco cerebral e medula espinhal e por isso é sugerido atuar sobre todas as partes respon- sáveis pela manutenção da junção neuromuscular.
Métodos: Culturas de camundonqo de motoneurônio embrionário Culturas de motoneurônios espinhais de camundongos embrio- nários do dia 12,5 foram preparadas por uma técnica de seieção usando um anticorpo monoclonal anti-p75 de rato (Chemicon, Hofheim, Alemanha). As partes ventrolaterais de medulas espinhais Iombares individuais foram dis-
secadas e transferidas para HBSS contendo 2-mercaptoetanol a 10 µM- A- pós tratamento com tripsina {0,05°6, 10 minutos), suspensões de célula úni- ca foram geradas por trituração.
As células foram plaqueadas em um prato de cultura recoberto com anti-p75 de rato (Greiner, Nurtingen, Alemanha) e 5 deixadas à temperatura ambiente por 30 minutos.
Os poços individuais fo- ram posteriormente lavados com solução salina balanceada de Harik (HBSS; 3 vezes), e as células de Iigação então foraní isoladas da placa com solução salina despolarizante (NaCl 0,8%, KCl a 35 mM e 2-mercaptoetanol a 1 µM). As células foram plaqueadas em uma densidade de 3000 células/poço em pIacas de cultura de 4 poços (Greiner), pré-recobertas com poliornitina e la- minina como descrito (Miller, T.
M. et al., J.
Biol.
Chem. 272, 9847-9853, 1997). Células foram cultivadas em meio Neurobasal (Life Technologies, Karlsruhe, Alemanha), suplemento B27, soro de cavalo 1O°/j, glutamax a 500 µM e 50 µg/ml de apotransferrina a 37°C em uma atmosfera de CO2 , 5°/j.
Cinquenta por cento do meio foram primeiro substituídos no dia um e então de dois em dois dias.
Contagem inicial de células plaqueadas foi feita quan- do todas as células foram ligadas à placa de cultura, após 4 horas.
As célu- las na fase brilhante então foram adicionalmente contadas no dia cinco.
Dez campos (1,16 mm2/campo) foram contados em cada poço em cada ponto de tempo.
Níveis séricos de rhlGF-l ou PEG-IGF-I e marcação de IGF-I intraneuronal em neurônios CAl Para estimativa de níveis séricos de rhIGF-l ou PEG-IGF-I, a- mostras de sangue de camundongos C57Bl/6 foram tomadas em pontos de tempo diferentes (n=4 camundongos por ponto de tempo) após uma injeção s.c. única de 100 µg/kg de rhlGF-l ou de PEG-IGF-I.
O soro foi preparado e processado por ensaios de ELISA.
Para detecção de rhlGF-l, um ensaio de rhIGF-l comercial (DSL) foi usado.
Para detecção de PEG-IGF-I, microplacas de ensaio recobertas com estreptavidina foram recobertas com um anticorpo de captura anti-PEG (lgM) biotinilado.
Amostras séricas foram incubadas por 15 h com (GFBP-4 digoxigenada para substituir qualquer ligação de IGF-I por IGFBP's endógenas por IGFBP-4. Após lavagem, as placas foram incu-
badas com anti-Dig-POD (Fab) e detectadas pela reação de cor ABTS.
Si- nais de absorvância foram quantificados com Ieitor SpectraMax M2" em 405 nm e 490 nm.
Em pontos de tempo diferentes após uma injeção s.c. única de 5 100 µg/kg de rhIGF-I ou de PEG-IGF-I, camundongos C57BI/6 foram decapi- tados sob anestesia com isoflurano e cérebros removidos.
Os hemisférios foram congelados instantaneamente em gelo seco e pós-fixados em para- formaldeído (4% em solução salina tamponada em fosfato, PBS). Posterior- mente, cortes sagitais de 40 µm foram cortadas com um vibrátomo (Zeiss). Para análise semiquantitativa de imunorreatividade, 24 cortes foram corta- dos começando a 2 mm da borda lateral- Todo quarto corte foi usado para contagem, revelando 6 cortes no total por camundongo.
Os cortes foram i- munomarcados com um anticorpo de Cabra anti-hlGF-l (R&D Systems) e contramarcados com corante nuclear.
Detecção secundária foi realizada pe- la marcação com anti-Cy3 de Cabra de burro (Jackson). Fotos digitais de rieurônios CAl foram avaliadas totalmente às cegas usando uma câmera PixelFly (Klughammer) em intensidade e marcação de intensidade idênticas através da camada celular CAl semiautomaticamente adquirida usando o programa lmagePro 4.5 (Media Cybernetics). Foi calculada a méd ia dos va- lores de intensidade de 6 cortes por camundongo.
Estimativa de qlicose sançjuínea Cães beagle foram tratados com PEG-IGF-I (200 a 5000 µg/kg S-c-) e amostras de sangue tomadas após intervalos de tempo diferentes até 6 dias (144 h). Glicose sanguínea foi avaliada de gotas de sangue usando o dispositivo AkkuCheck (Roche). Avaliação funcional Camundongos foram regularmente monitorados para avaliar o início de doença que foi definido quando os camundongos exibiram fraqueza do membro traseiro, andadura anormal e dificuldade de manter-se em uma rede de arame invertida.
O início da doença em camundongos transgênicos SODl (G93A) é variável (Gurney et al., Science 264 (5166):1772-1775, 1994) enquanto ocorre em camundongos pmn durante a terceira semana após nascimento (Schmalbruch et al., J Neuropathol Exp Neurol 50 (3):192- 204, 1991). A fim de avaliar a fraqueza que se desenvoíve, camundongos mutantes foram submetidos semanalmente a testes motores funcionais co- meçando no dia 24 pós-natal (camundongos pmn mutantes) ou semana 34 5 pós-nata) (camundongos mutantes SOD de G93A). A força de aperto de pata dianteira (em Newtons) foi registrada pelo cálculo da média de 5 testes de um medidor de força de aperto eletrônico (Columbus Instruments, Columbus, Ohio). Além disso, camundongos foram testados quanto a sua capacidade de manter o equilíbrio em um aparelho rotarod (Hugo Basile Bio.
Res- App-) enquanto a haste sofreu uma aceleração linear de 4 a 40 rpm (ciclos por mi- nuto). O tempo (segundos) mantido na haste por cada camundongo (latên- cia) foi registrado 3 vezes por sessão.
Valores médios em 24 dias pós-natal (camundongos pmn) ou semana 34 pós-natal (camundongos SODl) foram considerados como 100% e os resultados das análises subsequentes foram normalizadas contra este valor.
Análise histolóqica O número de corpos celulares de motoneurônios no núcleo facial e medula espinhal lombar de camundongos pmn tratados com PEG IGF-I e veículo (isto é, respectivo tampão sem PEG IGF-I) foi determinado no dia 34 pós-natal.
Além disso, o número de axônios mielinizados na parte proximal e distal de nervos frênicos foi contado nestes mutantes de camundongo.
Ani- mais foram perfundidos transcardialmente com paraformaldeído 4% (PFA) em tampão fosfato a 0,1 M em pH 7,4 e tronco encefálico e medula espinhal lombar (Ll a L6) foram dissecados.
Seções seriadas foram cortadas da regi- ão de tronco cerebral (7 µm) incluindo os núcíeos faciais e da medula espi- nhal lombar (12,5 µm)- Após marcação de Nissl, os motoneurônios foram contados em cada 5' (núcleo faciai) ou 10' seção (medula espinhal) e as contagens brutas foram corrigidas para núcleos de divisão (Masu et al., Na- ture 365:27-32, 1993). Nervos frênicos foram pós-fixados durante a noite em tampão cacodilato a 0,1 M contendo paraformaldeído a 4°/0 e glutaraldeído a 2%. Após osmificação e desidratação, todas as amostras foram introduzidas em meio de Spurr.
Seções de cruzamento semifinas (0,5 µm) para exame em microscopia ótica foram cortadas com uma faca de vidro e marcadas com azur-metilenoblue.
O número de fibras mielinizadas intactas foi determi- nado a partir de fotografias tomadas de seções de cruzamento de nervo sob um microscópio ótico Leica (Nussloch, Alemanha) equipado com uma câme- 5 ra digital (ActionCam; Agfa, Mortsel, Bélgica). Exemplos Exemplo 1: Para estimar a exposição sistêmica de rhlGF-l e PEG-IGF-I, ní- veis de fármaco após injeção s.c. única de 100 µg/kg de rhIGF-l ou PEG- lO IGF-I foram estimados em camundongos C57BU6 usando ensaios de detec- ção específicos- Por meio disso, PEG-IGF-I mostrou tanto uma meia-vida fortemerite prolongada bem como exposição sérica superior em comparação ao rhlGF-l (figural). Para investigar ainda se esta exposição periférica au- mentada traduz-se no cérebro, cortes cerebrais destes camundongos foram imunomarcados com um anticorpo que reconhece IGF-I humano e marcação intraneuronal na região CAl foi avaliada- A marcação de IGF-I de neurônios CAl foi aumentada em 2 e 6 h após injeção s.c. de rhIGF-l mas voltou a ni- veis basais após 24 h (figura 2). Ao contrário, a marcação de IGF-I aumen- tada foi obseNada em 24 e 48 h após injeção de PEG-IGF-I e alcançando niveis superiores em 48 h (figura2). Estes dados mostram que a entrada ce- rebrai tanto de rhlGFl como de PEG-IGF-I mostra cinética similar à exposi- ção periférica e indica que a exposição periférica muito mais alta de PEG- IGF-I em comparação com rhlGF-l se traduz na entrada cerebral melhor e mais sustentada de PEG-IGF-I em comparação a rhÍGF-l.
Exempio 2: Em testes toxicológicos em cães beagle, rhlGF-l mostrou um grande potencial para induzir agudamente hipoglicemia até em doses relati- vamente baixas de 150 µg/kg dadas s.c. (relato 21-839 de NDA). Para anali- sar o potencial hipoglicêmico de PEG-IGF-I, cães beagle machos e fêmeas foram tratados com uma dose única de PEG-IGF-I variando de 200 a 5000 µg/kg s.c.
Como mostrado na figura 3, até 2000 µg/kg nenhuma hipoglicemia consistente foi observada.
Entetanto, na dose de 5000 µg/kg um dos dois cães sofreu uma hipoglicemia severa (vide flecha na figura 2) e teve que ser recuperado por infusão de glicose; consequentemente, o teste de glicose foi parado neste ponto de tempo.
Tomado em conjunto, estes dados demons- tram que até 2000 µg/kg s.c. de PEG-IGF-I não tem um potencial hipoglicê- 5 mico similar à hipoglicemia observada com rhIGF-l em 150 µg/kg (relato 21- 839 de NDA). Exemplo 3: Para investigar a atividade in vitro de PEG-IGF-I relacionado a rhIGF-l, ambos os compostos foram comparados quanto a sua eficácia na sobrevivência de motoneurônio.
Motoneurônios primários de embriões de camundongo C57BI/6 12,5 E de idade foram cuitivados na ausência ou na presença de concentrações diferentes de rhlGF-l ou PEG-IGF-I e sobrevi- vência de motoneurônios contados após 5 dias por microscopia de contraste de fase.
Como mostrado na figura 4, ambos os compostos mostraram eficá- cia idêntica na proteção de motoneurônios.
Os dados indicam que rhlGF-l e PEG-IGF-I têm atividade bioiógica idêntica.
Exemplo 4: Para rhlGF-l, vários regimes de dosagem local ou sustentada mostraram eficácia em camundongos SODI (G93A), um modelo animal am- plamente usado para ALS (Kaspar et al., Science 301:839, 2003: Dobro- wolny et al., J Cell Biol 168:193, 2005; Nagano et al., J Neurol Sci 235:61, 2005; Narai et al., J Neurosci Res 82:452, 2005). Por isso, investigou-se a eficácia in vivo de PEG-IGF I, aplicado s-c- em 150 µg/kg pouco antes do inicio cIínico da doença em dois modelos independentes de ALS, camun- dongos pmn e camundongos SODl (G93A). Para teste de PEG-IGF-I em um modelo de ALS esporádico. camundongos pmn foram usados (Bommel et al., J Cell Biol 159:563, 2002). Este modelo de ALS desenvolve primeiro sintomas de prejuízo funcional por duas semanas após nascimento que resulta em morte em 5 a 6 semanas pós-natal.
Camundongos pmn, por isso, foram tratados de dois em dois dias (q2d) com veículo (n=12) ou 150 µg/kg de PEG-IGF-I (n=13) s.c. a partir do dia 13 pós-natai, isto é, no momento em que a doença somente começou.
Usando estimativa semanal da força muscular dos membros dianteiros pela análise da força de aperto, um efeito claro de PEG-IGF-I foi obseNado no dia 45 pós-natal onde camundongos pmn sobreviventes tratados com PEG- IGF-I mostraram desempenho significativamente mais alto em comparação 5 com animais tratados com veículo (p "0,05, n=4 a 5, figura 5). Análise de coordenação motora pelo teste de tempo gasto em um rotarod revelou que camundongos pmn tratados com PEG-IGF-I executaram melhor do que ca- mundongos tratados com veículo, significante no dia 38 pós-natal (p "0,05, n=8 a 12, figura 6). Além disso, análise histológica foi realizada a partir de camundongos pmn tratados do dia 13 pós-natal com veículo ou PEG-IGF-I (150 µg/kg S.C.) e perfundidos no dia 34 pós-natal.
Contagem estereológica de motoneurônios faciais revelou um número significativamente mais alto de motoneurônios sobreviventes no grupo de tratamento com PEG-IGF-I (p "0,01, n=6 a 12, figura 7). Similarmente, a sobrevivência de motoneurônios na medula espinhal lombar foi significativamente aumentada (p "0,001, n=5 a 6, figura 8). Finalmente, análise do número de axônios mielinizados no neNo frênico revelou um número mais alto significante de axônios mieliniza- dos no nervo frênico proximal (p "0,05, n=4 a 5, figura 9) bem como no distal (p "0,01, n=5 a 6, figura 10) comparando camundongos pmn tratados com veículo contra PEG-IGF-I.
Para teste de PEG-ÍGF-I no modelo ainda mais largamente usa- do de ALS familial, camundongos SODl (G93A) (baixa cópia) foram usados.
Estes camundongos desenvolvem os primeiros sintomas da doença na se- mana 34 a 35 pós-natal e morte aproximadamente 4 a 5 semanas depois.
Camundongos SODl (G93A), então, foram tratados duas vezes por semana (q3.5d) com veículo (n=6) ou 150 µg/kg de PEG-IGF-I (n=7) s.c. na semana 34 pós-natal, isto é, no momento em que a doença apenas começou.
Para assegurar o poder estatístico ao longo do curso do experimento, análise LOCF (última observação remanescente) foi realizada.
Este método (tam- bém usado em testes cIínicos) mantém a última medida de um animal antes da morte de todos os pontos de tempo subsequentes.
Análise de modifica- ções de peso corporal revelou que a redução do peso corpord na primeira fase da doença (por volta da semana 37) foi significativamente retardada em camundongos tratados com PEG-IGF-I (p "0,05 para semanas 37, 38 e 39, n=6 a 7 LOCF, figura 11). O início de doença em si como medido pelos pri- meiros sinais de fraqueza de membros anteriores, andaduras anormais e 5 dificuldade de manter-se em uma rede de arame invertida foi retardado em média por 4 semanas da semana 38,5 pós-natal à semana 42,5 (p <0,05, n=6 a 7, figura 12). Usando a estimativa semanal da força muscular dos membros dianteiros pela análise da força de aperto, um efeito protetor signi- ficante de PEGJGF-I foi observado da semana 35 pós-natal constantemente até a morte de todos os animais (p "0,05 para semanas 35, 38, 42 e 43, p <0,01 para semanas 36, 39, 40 e 41, n=6 a 7 LOCF, figura 13). Análise da coordenação motora pelo teste de tempo gasto em um rotarod revelou que camundongos SODl tratados com PEGJGF-I (G93A) atuaram significativa- mente melhor do que camundongos tratados com veículo (p "0,05 para se- manas 37, 38, 39 e 41, p <0,01 para semanas 40, 42 e 43, n=6 a 7 LOCF, figura 14). Tomado todos os dados in vivo de camundongos pmn e SODl (G93A) em conjunto, os estudos mostraram que PEG-IGF-I interfere na fun- ção neuromuscular em modelos de ALS em todos os alvos relevantes e tem o potencial para atuar em todos os estágio da doença.
Foi mostrado que PEG-IGF-I preserva a força e função muscular sugerindo um efeito anabóli- co sobre o músculo, ainda mais provavelmente pela proteção da junção e conectividade neuromuscular.
Além disto, foi mostrado que PEG-IGF-I res- gata axônios motores e corpos celulares de motoneLlrônio na medula espi- nhal e núcleo facial sugerindo um efeito protetor direto sobre motoneurônios (figura 15). Como estas degenerações ocorrem em um estágio tardio de ALS, PEG-IGF-I pode provavelmente afetar o curso da doença tanto nos estágios precoces quanto tardios.

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Usolde uma variante po1ietilenoglicol-(PEG)ilada de IGF-I para a produção de uma composição farmacêutica para o tratamento, prevenção e/ou retardo de um distúrbio neuromuscular em que a dita variante polietile- ,5 noglicol-(PEG)ilada de IGF-I é caracterizada pelo fato de que é derivada da sequência de aminoácidos de IGF-I humano selvagem (SEQ ID NO: 1) e carrega uma ou duas alterações de aminoácidos nas posições de aminoáci- do 27, 65 e 68 para que um ou dois aminoácidos nas posições 27, 65 e 68 seja/sejam um aminoácido polar mas não Iisina e peg seja Iigado a pelo menos um resíduo lisina.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, em que a dita variante PEGuilada de IGF-I apresenta as seguintes alterações de aminoácido da sequência de aminoácidos de IGF-I humano selvagem (SEQ ID NO: 1): (a) K65R e K68R (SEQ ID NO: 2) (b) K27R e K68R (SEQ (D NO: 3), ou (c) K27R e K65R (SEQ ID NO: 4).
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a dita va- riante PEGuilada de IGF-I é mono-PEGuilada em K68 e caracterizada peías seguintes alterações de aminoácido da sequência de aminoácidos de IGF-Í humano selvagem (SEQ ID NO: 1): K27R e K65R (SEQ ID NO: 4).
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito PEG tem um peso molecular total de 20 a 100 kDa.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que a dita variante PEGuilada de IGF-I é adicionalmente PEGuilada no aminoácido N-terminal.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita variante PEGuilada de IGF-I é monoPEGuilada em K65 ou em K68, ou é diPEGuilada em K65 e K68.
7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a dita variante PEGuilada de IGF-I é caracterizada pelo fato de que três aminoácidos no N-terminal são truncados.
8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, .em que a dita variante PEGuilada de ÍGF-I é caracterizada pelo fato de que o grupo(s) poli(eti|enog|ico|) é/São grupo(s) poH(etilenoglicol) ram ificado.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 5 em que o dito distúrbio neuromuscular é uma doença de neurônio motor (MND).
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, em que a dita MND é esclerose Iateral amiotrófica (ALS).
11. Uso, de acordo com a reivindicaçâo 10, em que a variante PEGuilada de IGF-I é usada separadamente, sequencialmente ou simulta- neamente em uma combinação combinada com um segundo composto far- macologicamente ativo.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, em que o segundo composto farmacologicamente ativo da combinação é pelo menos um neu- roprotetor tendo um efeito inibitório sobre a liberação de glutamato ou efeito de inativação de canais de sódio dependentes de voItagem ou a capacidade de interferir em eventos intraceluiares que seguem a ligação do transmissor em receptores de aminoácidos excitatórios.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, em que o segundo composto farmacologicamente ativo é riluzol.
14. Método para o tratamento, prevenção e/ou retardo da pro- gressão de um distúrbio neuromuscular em um indivíduo em necessidade de tal tratamento, que compreende administração ao dito indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um IGF-I PEGuilado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em uma forma farmaceuticamen- te aceitável.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o dito dis- túrbio neuromuscular é uma MND, preferencialmente ALS.
16. Composição farmacêutica compreendendo uma variante PEGuilada de IGF-I como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 em uma forma farmaceuticamente aceitável para o tratamento, prevenção e/ou retardo da progressão de um distúrbio neuromuscular.
17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16, em que o dito distúrbio neuromuscular é uma MND, preferencialmente ALS.
18. lnvenção como descrita anteriormente.
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