BRPI0910599B1 - Uso de um substituto carbonoso para a produção de leveduras - Google Patents

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Jean-Luc Fuentes
Georges René Marcel Parasie
Emmanuel Poilpre
Anne-Dominique Quipourt-Isnard
Gilles Georges Albert Stien
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Lesaffret Et Compagnie
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USO DE UM SUBSTITUTO CARBONOSO PARA A PRODUÇÃO DE LEVEDURAS. A presente invenção se relaciona a novas cepas de Saccharomyces que podem ser produzidas em um substrato carbonoso que torna possível substituir o uso de açúcar total e/ou parcialmente e o uso derivado para a produção de leveduras, em particular em escala industrial. A invenção também se relaciona a um método para a produção de leveduras do gênero Saccharomyces em um substrato carbonoso que torna possível substituir o uso de açúcar total ou parcialmente.

Description

CAMPO TÉCNICO
A presente invenção diz respeito à produção de leveduras, em particular em escala industrial. Um assunto da invenção presente é o uso de um substrato carbonoso, tornando possível substituir parcialmente ou totalmente o uso de açúcar para a produção de leveduras, em especial em uma escala industrial.
FUNDAMENTO TECNOLÓGICO
A produção de leveduras assume o fornecimento de diferentes elementos nutritivos capaz de garantir seu crescimento. Estes diferentes elementos nutritivos em especial são carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, minerais e vitaminas. Entre os meios naturais que podem ser usados para a produção de levedura, melaço ocupa uma posição especial. Na verdade, o melaço constitui um meio relativamente completo capaz de assegurar o suprimento desses elementos nutritivos. A composição média do melaço é a seguinte: 66 a 73% de açúcares, 15% a 23% de compostos orgânicos e 10% a 12% de compostos minerais (em porcentagem de matéria seca total). A fonte carbonosa fornecida pelo melaço é essencialmente constituída por sacarose ou açúcares resultantes da sua hidrólise (glicose e frutose).
No entanto, a crescente escassez de melaço de cana e de beterraba, em especial associada à sua utilização extensiva para a produção de bioetanol, põe em risco este tipo de produção. É particularmente necessário encontrar novos substratos carbonosos para substituir a sacarose fornecida pelo melaço.
A produção de leveduras também pode ser realizada em xaropes de glicose ou frutose, por exemplo, obtidos a partir da hidrólise de amido e em especial provenientes de cereais (milho, trigo, arroz) ou batata. No entanto, estes xaropes são relativamente caros e não representam uma solução economicamente rentável para substituir a sacarose do melaço dentro do contexto de produção industrial de levedura.
Levedura do gênero Saccharomyces é capaz de sintetizar glicerol em condições anaeróbicas ou em uma situação de estresse intenso, por exemplo, no caso de estresse térmico ou osmótico. Além disso, a levedura Saccharomyces é capaz de degradar o glicerol, mas em um metabolismo puramente oxidativo e na ausência de repressão catabólica por açúcares. Assim, a levedura Saccharomyces, colocada na presença de glicerol e açúcar em uma cultura em lote, não é capaz de consumir o glicerol, enquanto o açúcar permanece no meio.
Além disso, em um metabolismo oxidativo, a levedura Saccharomyces cultivada num substrato carbonoso constituída exclusivamente por glicerol consome o glicerol muito lentamente, o que não é compatível com a produção de levedura em escala industrial. (Lages and Lucas, 1997, Biochimica and Biophysica Acta).
Por conseguinte, há uma real necessidade de novas cepas para a produção de leveduras que tornam possível substituir total ou parcialmente o açúcar como um substrato carbonoso, com rendimentos da produção de levedura compatíveis com a exploração econômica e industrial e/ou sem perda na qualidade das leveduras produzidas.
RESUMO DA INVENÇÃO
Um objeto da presente invenção é fornecer novas cepas de Saccharomyces capazes de serem produzidas em um substrato carbonoso, tornando possível substituir total e/ou parcialmente o uso de açúcar.
Um objeto da invenção também é a utilização destas cepas para a produção de leveduras, em especial em uma escala industrial.
Outro objeto da invenção refere-se a um método para a produção de leveduras do gênero Saccharomyces em um substrato carbonoso, tornando possível substituir total ou parcialmente a utilização de açúcar, dito método também tornando possível obter um rendimento semelhante ao de uma produção em um substrato do tipo de açúcar e/ou tornando possível obter leveduras de qualidade semelhante.
Um objeto da presente invenção é uma cepa de Saccharomyces, caracterizada por que na presença de um meio de cultura, constituído por uma mistura de glicerol e de açúcar, em condições aeróbias, consome pelo menos 80% do glicerol da dita mistura, dita mistura composta por uma proporção de glicerol de pelo menos 20% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção também é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada por consumir pelo menos 85% do glicerol na mistura, preferivelmente pelo menos 90% do glicerol na mistura, mais preferivelmente pelo menos 95% do glicerol na mistura, mesmo mais preferivelmente pelo menos 98% do glicerol na mistura.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa, conforme definido acima, caracterizada pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 30% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 40% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente pelo menos 50% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 60% como equivalente em sacarose, mesmo mais preferivelmente pelo menos 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% como equivalente em sacarose.
A presente invenção refere-se em especial a uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser escolhida das espécies cerevisiae, boulardii, carlsbergensis e uvarum.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser escolhida de uma variante natural e/ou de uma cepa geneticamente modificada.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizado por ser escolhida da: - cepa depositada na Collection Nationale de Cultures de. Microorganismes (CNCM) em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM 1-3886, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3887, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3888, - cepa depositada na CNCM em CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I- 4132 e - cepa depositada na CNCM em CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I- 4133.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizado por ser escolhida da: cepa depositada na CNCM em CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I- 4129, cepa depositada na CNCM em CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I- 4130 e a cepa depositada na CNCM em CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I- 4131.
Um objeto da presente invenção é também o uso de uma cepa conforme definido acima para a produção de leveduras na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é o uso de uma mistura de glicerol e açúcar para a produção de leveduras de pelo menos uma cepa de Saccharomyces, caracterizada por dita cepa consumir pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção também é um método para a produção de leveduras compreendendo as etapas de: - introdução de uma cepa de levedura do gênero Saccharomyces em um fermentador, e - multiplicação da dita cepa em condições aeróbias em meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da invenção presente é um método, conforme definido acima, caracterizado por pelo menos 80% do glicerol na dita mistura ser consumido pela dita cepa, preferivelmente pelo menos 85% do glicerol na dita mistura, mais preferivelmente pelo menos 90% do glicerol na dita em mistura, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% do glicerol na dita mistura, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% do glicerol na dita mistura.
Um objeto da presente invenção é um método conforme definido acima, caracterizado pela multiplicação da dita cepa ser realizada de acordo com um modo semicontínuo ou de acordo com um modo contínuo.
Um objeto da presente invenção também é um método conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 8% como equivalente em sacarose, preferivelmente de pelo menos 10% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de pelo menos 12% como equivalente em sacarose, mesmo mais preferivelmente de pelo menos 15% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de pelo menos 17% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de pelo menos 20% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é um método conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 30% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é um método conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 40%. como equivalente em sacarose, preferivelmente de pelo menos 50% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de pelo menos 60% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de pelo menos 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de pelo menos 80% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de pelo menos 90% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é um método conforme definido acima, caracterizado pela dita cepa de levedura ser uma cepa conforme definido acima.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1: Diagrama do cassete de expressão usado para integrar o gene STL1 no genoma das cepas de leveduras.
O gene STL1 está sob controle do promotor pADH1 e ele é seguido pelo terminador CYC1 da levedura. Dois fragmentos recombinogênicos (BUD5-A e BUD5-B) cada um dos 500 nuc|eotídeos formam o cassete de expressão, a fim de assegurar a inserção por recombinação homóloga do cassete no genoma da levedura, após transformação, no lócus BUD5 (YCR038c) localizado no cromossoma III. O gene que confere resistência a geneticina KANMX é inserido a jusante do gene STL1, formado por dois sites loxP.
Figura 2: Nível de expressão do gene STL1 nas cepas geneticamente modificadas para expressar o gene STL1, após cultura na presença de açúcar.
O gráfico representa a relação do nível de mRNA da cepas mutantes das leveduras expressando o gene STL1 e o nível de mRNA da cepa não-mutante correspondente (no eixo y). 1: relação entre o nível de mRNA da cepa depositada na CNCM com o número I 3887 e aquela cepa não-mutante NCYC 996; 2: relação entre o nível de mRNA da cepa depositada na CNCM com o número I-3888 e aquela cepa não-mutante NCYC 995; 3: relação entre o nível de mRNA da cepa depositada na CNCM com o número I-3886 e aquela cepa não-mutante I-3399.
Figura 3: Quantidade residual de glicerol, depois de cultura no modo semicontínuo, da cepa I-3887 comparada com a da cepa não mutante NCYC 996, em função do tempo.
A mistura compreendida por 20% de glicerol como equivalente em sacarose. O eixo y no lado esquerdo indica a quantidade de glicerol (em gramas) e o eixo y no lado direito indica a quantidade de etanol (em gramas) no meio livre de leveduras. O eixo x indica o tempo (em horas). A curva com triângulos representa a quantidade residual de glicerol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 996 e a curva com quadrados da cepa I-3887. A curva com círculos representa á quantidade residual de etanol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 996 e a curva com diamantes da cepa-3887.
Figura 4: Quantidade residual de glicerol, depois de cultura no modo semicontínuo, da cepa I-3888 comparada com a da cepa não mutante NCYC 995, em função do tempo.
A mistura formada por 20% de glicerol como equivalente em sacarose. O eixo y no lado esquerdo indica a quantidade de glicerol (em gramas) e o eixo y no lado direito da quantidade de etanol (em gramas) no meio de livre de leveduras. O eixo x indica o tempo (em horas). A curva com triângulos representa a quantidade residual de glicerol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 995 e a curva com quadrados da cepa I-3888. A curva com círculos representa a quantidade residual de etanol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 995 e a curva com diamantes da cepa-3888.
Figura 5: Rendimento e concentração residual de glicerol depois de cultura em quimiostato da cepa 1-3887 e da cepa NCYC 996, em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar no meio de crescimento.
O eixo y no lado esquerdo indica o rendimento da cepa como um percentual em relação do rendimento da cepa NCYC 996 cultivada na ausência de glicerol. O eixo y na direita indica a concentração residual de glicerol no meio livre de leveduras (em ppm). O eixo x indica a proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar como equivalente em sacarose. O rendimento de produção é representado por quadrados e a concentração residual de glicerol por círculos. Os resultados da estirpe não mutante NCYC 996 (controle) são mostrados em branco e aqueles da cepa mutante correspondente 1-3887 em preto.
Figura 6: Rendimento e concentração residual de glicerol depois de cultura em quimiostato da cepa 1-3888 e da cepa NCYC 995, em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar no meio de crescimento.
O eixo y no lado esquerdo indica o rendimento da cepa como um percentual em relação do rendimento da cepa NCYC 995 cultivada na ausência de glicerol. O eixo y na direita indica a concentração residual de glicerol no meio livre de leveduras (em ppm). O eixo x indica a proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar como equivalente em sacarose. O rendimento de produção é representado por quadrados e a concentração residual de glicerol por círculos. Os resultados da estirpe não mutante NCYC 995 (controle) são mostrados em branco e aqueles da cepa mutante correspondente 1-3888 em preto.
Figura 7: Percentual de glicerol consumido depois de cultura em quimiostato da cepa 1-3887 ,e da cepa NCYC 996, em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar no meio de crescimento.
O percentual de glicerol consumido (no eixo y) é dado em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar como equivalente em sacarose (no eixo x). O percentual de glicerol consumido pela cepa não mutante NCYC 996 (controle) é representado em branco e o correspondente da cepa mutante 1-3887 achurado.
Figura 8: Percentual de glicerol consumido depois de cultura em quimiostato da cepa 1-3888 e da cepa NCYC 995, em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar no meio de crescimento.
O percentual de glicerol consumido (no eixo y) é dado em função da proporção de glicerol na mistura de glicerol e açúcar como equivalente em sacarose (no eixo x). O percentual de glicerol consumido pela cepa não mutante NCYC 995 (controle) é representado em branco e o correspondente da cepa mutante 1-3888 achurado.
Figura 9: Percentual de glicerol consumido depois da cultura no modo semicontínuo de variantes naturais na presença de uma mistura de glicerol e açúcar compreendendo 20% de glicerol como equivalente em sacarose.
O percentual de glicerol consumido (no eixo y) é indicado por diferentes variantes naturais testadas (1 a 53). O percentual de glicerol consumido pela cepa não mutante da qual as variantes naturais (denotado T) são obtidas também é indicado.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Um objeto da presente invenção é uma cepa de Saccharomyces, caracterizada em que na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e açúcar, em condições aeróbias, ela consome pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 20% como equivalente em sacarose, a soma das porcentagens de glicerol e açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Surpreendente e inesperadamente, os inventores obtiveram cepas da levedura Saccharomyces capazes de consumir pelo menos 80% do glicerol em uma mistura de glicerol e açúcar, simultaneamente ao seu consumo de açúcar, em condições aeróbias, numa cultura pelo modo contínuo ou semicontínuo.
Os inventores na verdade mostraram que esse padrão industrial de leveduras de panificação, tais como as cepas depositadas na NCYC (National Collection of Yeast Cultures) com os números NCYC995 e NCYC996, consomem glicerol apenas parcialmente na presença de uma mistura de glicerol e açúcar na cultura semicontínua e/ou cultura contínua (ver exemplo 2). No final da cultura, o meio de cultura que é livre de leveduras então contém uma grande quantidade residual de glicerol que acumulou durante a cultura.
As cepas de acordo com a invenção são caracterizadas pelo fato de que, na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e açúcar, consomem pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, a porcentagem sendo dada em peso/peso. Em outras palavras, a cepa de acordo com a invenção consome pelo menos 80% da massa total de glicerol presente na mistura de glicerol e açúcar.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa de Saccharomyces, caracterizada em que na presença de um meio de cultura compreendido por uma mistura de glicerol e açúcar, em condições aeróbias, ela consome pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de 20% como equivalente em sacarose, a soma das porcentagens de glicerol e açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
A determinação do consumo de glicerol pode ser realizada medindo a quantidade residual de glicerol no meio de cultura, depois de uma cultura semicontínua, ou medindo a quantidade residual de glicerol no meio drenado no caso de uma cultura contínua.
No caso de uma cultura semicontínua, a medição da quantidade residual de glicerol no meio de cultura é realizada no final da cultura.
Por "final da cultura" entende-se o momento quando o suprimento de açúcar é interrompido.
A duração da cultura é em particular menor ou igual à duração de uma cultura da mesma cepa em uma mistura compreendendo 100% de açúcar como equivalente em sacarose.
A duração de cultura é em particular menos do que 24 horas.
A duração de cultura é em particular menos do que 20 horas.
A duração da cultura é, por exemplo, 22 horas.
No caso de uma cultura contínua, a quantidade residual de glicerol é medida a qualquer momento, uma vez que o estado estacionário seja atingido.
O estado estacionário é atingido quando as concentrações no fermentador são estáveis por pelo menos 3 tempos de permanência, o tempo de permanência, sendo a ralação 1 / [taxa de diluição].
Convencionalmente, as condições de cultura são tais que o metabolismo da cepa de levedura é essencialmente respiratório e/ou tais que essencialmente não há produção de etanol.
A palavra "essencialmente" significa que estas condições são satisfeitas ao longo da duração total da cultura, mas é possível que de tempos em tempos essas condições não sejam satisfeitas no modo semicontínuo, por exemplo, durante as primeiras horas da cultura, em particular para uma duração compreendida entre 1/4 e 1/3 da duração da cultura e, em particular durante as primeiras 5 horas de uma cultura no modo semicontínuo.
Em um quimiostato, as condições de cultura são tais que o metabolismo da cepa de levedura é respiratório e/ou tais que não há produção de etanol quando o estado estacionário é atingido.
A expressão "o metabolismo da cepa de levedura é essencialmente respiratório" significa que o carbono é oxidado e não fermentado, durante o período total da cultura, parte do carbono poder ser fermentado de forma temporária.
A expressão "essencialmente não há produção de etanol" significa que a concentração de etanol no final da cultura é inferior a 1%, preferivelmente menos de 0,1%, mais preferivelmente inferior a 0,01%, mais preferivelmente inferior a 0,001%.
Uma pessoa versada na arte sabe como ajustar os parâmetros para a cultura de uma determinada cepa de levedura, a fim de que as condições de cultura sejam tais que o metabolismo da dita cepa seja essencialmente respiratório e/ou tais que essencialmente não haja produção de etanol.
A quantidade residual de glicerol é preferivelmente medida no meio de cultura que seja livre de leveduras.
A quantidade residual de glicerol do meio de cultura, por exemplo, é medida por HPLC ou cromatografia CG, ensaio enzimático ou qualquer outro método apropriado.
As cepas de leveduras de acordo com a invenção, portanto, são particularmente úteis, já que elas são capazes de consumir glicerol continuamente, durante um período de produção compatível com a exploração industrial.
A expressão "capazes de consumir glicerol continuamente" significa que essencialmente não há acúmulo de glicerol durante o período total da cultura, mas que de tempos em tempos o acúmulo se torna possível se o metabolismo da levedura não for essencialmente respiratório e/ou se houver uma produção de álcool.
Pela expressão "mistura de glicerol e açúcar", entende-se uma mistura constituída por glicerol e açúcar em proporções variáveis, a soma das proporções de glicerol e açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
A mistura de glicerol e açúcar constitui a única fonte de açúcar e glicerol do meio de cultura.
A mistura de glicerol e açúcar é, preferivelmente preparada antes da sua introdução no meio de cultura. Glicerol, também chamado de glicerina ou propan-1,2,3-triol, é um poliol. Glicerol puro é apresentado sob a forma de um líquido viscoso e transparente e é solúvel em água.
O glicerol segundo a invenção pode ser usado na forma pura e/ou na forma de um produto que contenha o glicerol, e/ou ser suprido em qualquer forma capaz de produzir glicerol.
O açúcar é preferivelmente um açúcar que possa ser imediatamente assimilado pela levedura, em particular, um açúcar simples de glicose, frutose ou tipo de sacarose e/ou uma mistura desses açúcares.
O açúcar pode ser suprido sob a forma de xaropes de glicose e/ou xaropes de frutose e/ou féculas hidrolisadas e/ou sob a forma de melaço e/ou sob a forma de uma substância capaz de produzir açúcares que possam ser assimilados pela cepa de levedura e/ou sob a forma de uma mistura derivada.
O açúcar preferivelmente é suprido sob a forma de melaço.
A mistura de glicerol e de açúcar constitui pelo menos 90% da fonte de carbono para levedura, preferivelmente pelo menos 95% da fonte de carbono, mais preferivelmente pelo menos 98% da fonte de carbono. A fonte carbonosa no meio de cultura, com exceção da mistura de glicerol e de açúcar, compreende, por exemplo, aminoácidos, lipídios, ácidos orgânicos naturalmente presentes no melaço ou hidrolisados brutos de origem agrícola.
A expressão "a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose" significa que quando a proporção de glicerol expressa em equivalente em sacarose é x%, a proporção de açúcar na mistura expressa em equivalente em sacarose é (100-x)%.
A equivalência é aqui determinada em relação ao metabolismo glicolítico, de acordo com o qual um mol de sacarose é convertido em um mol de frutose e um mol de glicose que são convertidos em quatro móis de piruvato (cf. Príncipes de la Biochimie, Lehninger, 1994).
Portanto um mol de glicose é convertido em dois móis de piruvato e um mol de frutose em dois móis de piruvato.
De acordo com este mesmo metabolismo, um mol de glicerol é convertido em um mol de piruvato.
Assim, quatro móis de glicerol correspondem a um mol de equivalente em sacarose.
Dois móis de glicose correspondem a um mol de equivalente em sacarose.
Dois móis de frutose correspondem a um mol de equivalente em sacarose. 1,076 g de glicerol corresponde aqui a um grama de equivalente em sacarose.
Por exemplo, um quilograma de uma mistura finalmente contendo 250 g/kg de equivalente em sacarose e uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, portanto, é constituída por 50 g de equivalente em sacarose na forma de glicerol e 200 g de equivalente em sacarose sob a forma de açúcar. Um dado melaço bruto com um teor de açúcar de 500 g/kg como equivalente em sacarose, para o preparo de um quilograma desta mistura, em primeiro lugar são misturados de 50 x 1,076 g = 54 g de glicerol puro (o que corresponde a 50 g de equivalente em sacarose sob a forma de glicerol) e 400 g do dito melaço bruto (o que corresponde a 200 g de equivalente em sacarose sob a forma de açúcar), então é adicionada água pura para atingir uma massa final da mistura de 1 quilograma.
O meio de cultura aqui é chamado de meio de cultura fresco quando não foi posto na presença de cepas da levedura
O meio de cultura aqui é chamado de meio de cultura de reação q foi posto na presença de cepas da levedura.
A cepa de levedura de acordo com a invenção é posta na presença do meio de cultura ob condições aeróbias.
Preferivelmente, a cepa de levedura de acordo com a invenção é colocada na presença do meio de cultura em um fermentador adequado para a produção de levedura. O volume do fermentador pode variar de uns poucos mililitros a vários metros cúbicos.
O fermentado também é chamado um reator daqui por diante.
O fermentador preferivelmente é adequado para uma cultura sob condições aeróbias.
A cepa de levedura preferivelmente é posta na presença do meio de cultura dentro do contexto de uma cultura em modo semicontínuo e/ou em modo contínuo.
Pela expressão "cultura em modo semicontínuo" ou "cultura semicontínua", ou "modo semicontínuo" também chamado de "batelada alimentada", entende-se aqui uma cultura em um fermentador que é alimentado progressivamente pelo meio de cultura, mas nenhum volume do meio é drenado. Em tal método, o volume de cultura é variável (e geralmente crescente) no fermentador. O índice de alimentação em uma cultura no modo semicontínuo é constante ou variável.
Um exemplo de cultura semicontínua é uma cultura realizada sob as condições descritas no livro de referência “Yeast Technology’, Capitulo 6, 2a edição, 1991, G. Reed and T. l/V. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442- 31892-8.
Pela expressão "cultura pelo modo contínuo" ou "cultura permanente" ou "modo contínuo", entende-se aqui uma cultura em um fermentador durante a qual o fermentador é alimentado com meio de cultura fresco e em que parte do meio de reação é drenado. Em uma cultura pelo modo contínuo, o volume da cultura do fermentador é variável ou constante.
De acordo com uma incorporação particular da cultura pelo modo contínuo, o índice de alimentação e o índice de drenagem são iguais.
Um exemplo de cultura contínua é uma cultura realizada sob as condições descritas no livro de referência “Yeast Technology, Capítulo 6, 2a edição, 1991, G. Reed and T. W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442- 31892-8.
A cultura em quimiostato é uma forma particular de cultura contínua.
Em uma cultura em quimiostato, os diferentes parâmetros tais como o nível de oxigênio dissolvido, as concentrações dos nutrientes, pH, densidade celular, são mantidos constantes.
O meio de cultura compreende como constituintes a mistura de glicerol e açúcar e os outros elementos necessários para o crescimento de leveduras.
Os outros elementos necessários para o crescimento das leveduras são os seguintes: pelo menos uma fonte de nitrogênio, pelo menos uma fonte de enxofre, pelo menos uma fonte de fósforo, pelo menos uma fonte de vitaminas e/ou pelo menos uma fonte de minerais.
Esses outros elementos são supridos em quantidades suficientes para que não se constituam um fator de limitação do crescimento de leveduras e para manter um metabolismo essencialmente respiratório.
A fonte de nitrogênio, por exemplo, é suprida na forma de sulfato de amónia, hidróxido de amónia, di-amônio fosfato, amónia, uréia e/ou uma combinação dos mesmos.
A fonte de enxofre, por exemplo, é suprida na forma de sulfato de amónia, sulfato de magnésio, ácido sulfúrico e/ou uma combinação dos mesmos.
A fonte de fósforo, por exemplo, suprida na forma de ácido fosfórico, fosfato de potássio, di-amônio fosfato, mono-amónio fosfato, ou uma combinação dos mesmos.
A fonte de vitaminas, por exemplo, é suprida na forma de melaço, hidrolisado de levedura, solução pura de vitamina ou uma mistura de vitaminas puras e/ou uma combinação‘dos mesmos.
A fonte de vitaminas supre todas as vitaminas para a levedura em quantidades pelo menos equivalentes às recomendadas nas obras de referência. Várias fontes de vitaminas podem ser combinadas.
A fonte de minerais, por exemplo, é suprida na forma de melaço, uma mistura de sais minerais e/ou uma combinação dos mesmos.
A fonte de minerais supre todas as macroelementos e oligoelementos para a levedura em quantidades pelo menos equivalentes aos recomendados nas obras de referência. Várias fontes de minerais podem ser combinadas.
As mesmas substâncias podem suprir vários elementos diferentes.
As cepas de leveduras de acordo com a invenção em particular são escolhidas das cepas que tornam possível produzir leveduras de panificação, leveduras de cerveja, levedura de vinificação, levedura para a produção de álcool e/ou levedura para a produção de proteínas recombinantes, por exemplo, para a produção de proteínas terapêuticas.
O consumo de glicerol de uma cepa de Saccharomyces pode, por exemplo, ser medido nas condições descritas no exemplo 2, a fim de determinar se dita cepa, na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, em condições aeróbias, consome pelo menos 80% de glicerol na mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa de Saccharomyces, caracterizada em que na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, em condições aeróbias, consome pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de 30% de glicerol como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa de Saccharomyces, caracterizada em que na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, em condições aeróbias, consome pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de 40% de glicerol como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada por consumir pelo menos 85% do glicerol na mistura, preferivelmente pelo menos 90% do glicerol na mistura, mais preferivelmente pelo menos 95% do glicerol na mistura, mesmo mais preferivelmente pelo menos 98% do glicerol na mistura.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada em que a dita mistura compreende uma proporção de glicerol de pelo menos 30% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 40% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente pelo menos 50% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 60% como equivalente em sacarose, mesmo mais preferivelmente pelo menos 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa, conforme definido acima, caracterizada em que a proporção de glicerol na dita mistura é no máximo 95% como equivalente em sacarose, preferivelmente no máximo 90% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente no máximo 85% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada em que a proporção de glicerol na dita mistura é de 20% a 90% como equivalente em sacarose, preferivelmente de 20% a 80% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de 30% a 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente de 30% a 60% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser escolhida das espécies cerevisiae, boulardii, carlsbergensis e uvarum.
Uma cepa preferida de acordo com a invenção é uma cepa de Saccharomyces cerevisiae.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizado por ser escolhida de uma variante natural e/ou de uma cepa geneticamente modificada.
O termo "variante natural" aqui denota uma cepa obtida por cruzamento e/ou hibridização das cepas de leveduras e/ou obtida por mutação espontânea e/ou mutagênese aleatória, por exemplo, após exposição a condições de estresse, um tratamento UV ou a um tratamento com agentes mutagênicos.
O pool de genes de uma variante natural não foi modificado através da engenharia genética.
Dois métodos de mutagênese aleatória, por exemplo, podem ser usados para obter variantes naturais de acordo com a invenção (ver exemplo 3 abaixo).
O primeiro método consiste em uma seleção das variantes naturais com base no seu consumo de glicerol e de seu rendimento, logo após uma exposição à radiação UV seguido pelo isolamento de clones.
O segundo método compreende: - um primeiro estágio de exposição à radiação UV, - um segundo estágio de cultura em quimiostato na presença de uma mistura de açúcar e glicerol, - um terceiro estágio de isolamento dos clones, e - um quarto estágio de seleção das variantes naturais com base no seu consumo de glicerol e seu rendimento.
Este segundo método torna possível enriquecer a cultura com variantes naturais consumindo glicerol na presença de açúcar, antes de dar início ao estágio de seleção.
Um objeto particular da invenção é, então, a cepa depositada na CNCM em 3 de Março de 2009 com o número CNCM 1-4129, a cepa depositada na CNCM em 3 de Março de 2009 com o número CNCM 1-4130 e a cepa depositada na CNCM em 3 de Março de 2009 com o número CNCM 1-4131.
Estes três cepas foram obtidas por mutagênese aleatória seguindo um tratamento UV e seleção com base em seu consumo de glicerol e seu rendimento (ver exemplo 3).
Um objeto da presente invenção é uma variante natural conforme definido acima, caracterizada por ser a cepa número CNCM 1-4129.
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM 1-4129 consome mais de 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM 1-4129 consome mais de 80% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 50%.
Um objeto da presente invenção é uma variante natural, conforme definido acima, caracterizada por ser a cepa número CNCM 1-4130.
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM 1-4130 consome mais de 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM 1-4130 consome mais de 80% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 50%.
Um objeto da presente invenção é uma variante natural conforme definido acima, caracterizada por ser a cepa número CNCM 1-4131.
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e açúcar com uma proporção de glicerol de 20% como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM 1-4131 consome mais de 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM 1-4131 consome mais de 80% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 50%.
Pela expressão “cepa geneticamente modificada” ou cepa GMO, entende-se o pool de genes de uma cepa que tenha sido modificado pela engenharia genética.
Uma cepa geneticamente modificada pode sofrer uma modificação do seu ADN endógeno, por exemplo, mutação de um ponto, parcial ou total, de um gene. A mutação pode consistir de uma inserção, deleção e/ou substituição de pelo menos um nucleotídeo.
A mutação preferivelmente induz a uma modificação do produto do gene após transcrição e/ou tradução. A mutação em particular pode levar a um truncamento do produto do gene, uma modificação de pelo menos um aminoácido na seqüência do produto do gene e/ou mudança de um quadro de leitura durante a transcrição.
Uma cepa geneticamente modificada pode compreender um DNA exógeno, integrado ou não em pelo menos um dos cromossomas da levedura e/ou em pelo menos um plasmídeo da levedura.
Uma cepa geneticamente modificada preferida compreende um exógeno DNA integrado em pelo menos um dos cromossomas da levedura.
O DNA exógeno pode ser um fragmento de DNA, - por exemplo um fragmento de gene, um cassete de expressão completo ou parcial-, e/ou um plasmídeo.
Quando a cepa geneticamente modificada compreende um DNA exógeno integrado, é uma integração única ou integração multicópia.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser uma variedade geneticamente modificada a nível de pelo menos um gene envolvido em pelo menos uma via metabólica do glicerol.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser uma variedade geneticamente modificada a nível de pelo menos um gene envolvido no catabolismo do glicerol ou na regulamentação do catabolismo do glicerol.
Um objeto mais específico da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizado por ser uma cepa geneticamente modificada no nível de pelo menos um gene escolhido entre os genes STL1, GUP1, GUP2, GUT1, GUT2, FPS1 e/ou ADR1 e/ou um gene envolvido na repressão por glicose e/ou de uma combinação dos mesmos.
Uma cepa geneticamente modificada de acordo com a invenção apresenta em particular um aumento na expressão de um gene e/ou uma redução na expressão de um gene e/ou uma expressão constitutiva e/ou uma expressão diferencial de um gene, e/ou a expressão de um gene ausente na estirpe original de levedura.
Um objeto mais específico da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada por ser uma cepa geneticamente modificada no nível de pelo menos um gene escolhido entre os genes STL1, GUP1, GUP2, GUT1, GUT2 e/ou uma combinação dos mesmos.
A modificação das cepas de acordo com a invenção é realizada utilizando técnicas bem conhecidas por pessoas versadas na arte (ver Molecular Cloning, 3a edição, Sambrook and Russel).
Uma cepa de levedura geneticamente modificada de acordo com a invenção preferivelmente consome mais de 90% de glicerol na mistura de glicerol e açúcar.
O gene STL1 codifica a permease do glicerol que em particular permite que o glicerol entre na célula.
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada no nível do gene STL1 expressa o gene STL1 na presença de açúcar.
Uma cepa preferida geneticamente modificada no nível do gene STL1 de acordo com a invenção superexpressa o gene STL1 na presença de açúcar em comparação com a cepa não mutante correspondente.
O gene STL1 em uma cepa geneticamente modificada de acordo com a invenção é, por exemplo, colocada sob o controle de um promotor constitutivo ou um promotor induzido por glicose.
Uma cepa preferida geneticamente modificada no nível do gene STL1 de acordo com a invenção possui uma taxa de transcrição do gene STL1 multiplicada pelo menos por 100 em relação à cepa não mutante correspondente, preferivelmente multiplicada pelo menos por 200, mais preferivelmente pelo menos por 250, a taxa de transcrição sendo calculada após teste de PCR quantitativo no cDNA obtido por transcrição reversa.
O gene GUP1 codifica uma proteína de membrana envolvida no transporte ativo do glicerol na célula.
Uma cepa geneticamente modificada de acordo com a invenção a nível do gene GUP1 expressa o gene GUP1 na presença de açúcar.
O gene GUP2 codifica uma proteína de membrana envolvida no transporte ativo do glicerol na célula.
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada a nível do gene GUP2 GUP1 expressa o gene GUP2 GUP1 na presença de açúcar.
O gene FPS1 ou YLL043W codifica uma proteína de membrana que permite em particular a exportação do glicerol.
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada no nível do gene FPS1 hão expressa o gene FPS1, por exemplo, seguido da deleção do gene.
O gene ADR1 ou YDR216W codifica um ativador de transcrição envolvido na expressão dos genes envolvidos nas vias de utilização do etanol, glicerol e ácidos graxos. Tais genes em particular são regulados pela repressão de glicose.
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada no nível do gene ADR1 expressa o gene ADR1 na presença de açúcar.
O gene GUT1 ou YHL032C codifica uma glicerol quinase que converte o glicerol em glicerol-3-fosfato.
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada no nível do gene GUT1 expressa o gene GUT1 na presença de açúcar.
O gene GUT2 ou YIL155C codifica o glicerol-3-fosfate desidrogenase que converte o glicerol-3-fosfato em DHAP (diidroxiacetona fosfato).
Uma cepa de acordo com a invenção geneticamente modificada no nível do gene GUT2 expressa o gene GUT2 na presença de açúcar.
Uma cepa de acordo com a invenção, por exemplo, é modificada por conversão com um cassete de expressão permitindo a expressão de um gene conforme definido acima, em particular na presença de açúcar.
O cassete de expressão compreende um promotor, um gene de interesse e um terminador. O terminador é uma seqüência artificial ou uma seqüência de terminação de levedura.
O promotor é um promotor constitutivo ou induzível.
Um promotor preferido de acordo com a invenção é o promotor induzível por glicose pADH1.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser a cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007, com o número CNCM I-3886.
A cepa de levedura número CNCM I-3886 foi obtida por integração do cassete de expressão representado na Figura 2 no genoma da cepa depositada na CNCM com o número CNCM I-3399.
A cepa de levedura número CNCM I-3886 expressa fortemente o gene STL1 na presença de açúcar (nível de mRNA mais do que 270 vezes maior do que a cepa não mutante I-3399).
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM I-3886 consome mais do que 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM I-3886 consome mais do que 90% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 80%.
Um objeto da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizado por ser a cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007, com o número CNCM I-3887.
A cepa de levedura número CNCM I-3887 foi obtida por integração do cassete de expressão representado na Figura 2 no genoma da cepa depositada na NCYC (National Collection of Yeast Cultures) com o número NCYC 996.
Cepa de levedura número CNCM I-3887 expressa fortemente o gene STL1 na presença de açúcar (nível de mRNA mais de 270 vezes maior do que de a cepa não mutante NCYC 996).
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM I-3887 consome mais de 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM I-3887 consome mais de 90% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 80%.
Um objeto da presente invenção é uma cepa, conforme definido acima, caracterizada por ser uma cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007, com o número CNCM I-3888.
A cepa de levedura número CNCM I-3888 foi obtida através da integração do cassete de expressão representado na Figura 2 no genoma da cepa depositada na NCYC (National Collection of Yeast Cultures) com o número NCYC 995.
A cepa de levedura número CNCM 1-3888, portanto, expressa fortemente o gene STL1 na presença de açúcar (nível de mRNA mais de 300 vezes maior do que a cepa não mutante NCYC 995).
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM I-3888 consome mais de 95% do glicerol na mistura.
Na cultura contínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, a cepa de levedura CNCM I-3888 consome mais de 90% do glicerol na mistura, quando a proporção de glicerol na dita mistura varia entre 20% a 80 %.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizada por ser a cepa depositada na CNCM em 3 de Março de 2009, com o número CNCM 1-4132.
A cepa de levedura número CNCM I-3886 foi obtida através da integração do cassete de expressão representado na Figura 2 no genoma da cepa depositada na CNCM com o número CNCM I-3399.
A cepa de levedura número CNCM 1-4132, portanto, expressa fortemente o gene STL1 na presença de açúcar (nível de mRNA mais de 200 vezes maior do que a cepa não mutante I-4072).
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM 1-4132 consome mais de 80% do glicerol na mistura.
Um objeto da presente invenção é uma cepa conforme definido acima, caracterizadβ por ser a cepa depositada na CNCM em 3 de Março de 2009, com o número CNCM 1-4133.
A cepa de levedura CNCM 1-4133 foi obtida através da integração do cassete de expressão representado na Figura 2 no genoma da cepa depositada na CNCM em 4 de setembro de 2008, com o número 1-4071.
A cepa de levedura número CNCM 1-4133 expressa fortemente o gene STL1 na presença de açúcar (nível de mRNA mais de 200 vezes maior do que a cepa não mutante 1-4071).
Na cultura semicontínua, em um meio de cultura contendo uma mistura de glicerol e de açúcar, com uma proporção de glicerol de 20% como equivalente em sacarose, a cepa de levedura CNCM 1-4133 consome mais de 80% do glicerol na mistura.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa de Saccharomyces derivado da cepa CNCM I-3886, da cepa CNCM I-3887, da cepa CNCM I-3888, da cepa CNCM 1-4132, da cepa CNCM 1-4133 da cepa CNCM 1-4129, da cepa CNCM I- 4130 ou da cepa CNCM 1-4131, caracterizada por que na presença de um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, consumir pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 20% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na mistura referida sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é também uma cepa de Saccharomyces derivada da cepa CNCM I-3886, da cepa CNCM I-3887, da cepa CNCM I-3888, da cepa CNCM 1-4132, da cepa CNCM 1-4133, da cepa CNCM 1-4129, da cepa CNCM I- 4130 ou da cepa CNCM 1-4131, caracterizada por que na presença de um meio de cultura compreendendo uma mistura de glicerol e açúcar, consumir pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, a dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de 20% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Pela expressão “cepa derivada”, entende-se uma cepa derivada por que conversão qual seja, como por exemplo, por um ou mais cruzamentos e/ou por mutação e/ou por transformação genética.
Um objeto da presente invenção também é o uso de uma cepa de levedura como definido acima, para a produção de leveduras, na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Um objetivo da presente invenção é o uso de uma cepa de levedura como definido acima, para a produção industrial de leveduras, na presença de uma mistura de glicerol e açúcar.
Um objeto da presente invenção é o uso de uma cepa de levedura como definido acima, para a produção de leveduras, a produção sendo realizada de acordo com um sistema padrão bem conhecido pelas pessoas versadas na arte, mas realizado em condições aeróbias e usando uma mistura de glicerol e de açúcar como uma fonte de carbono.
Um objeto da presente invenção também é o uso de uma mistura de glicerol e açúcar para a produção de leveduras de pelo menos uma cepa de Saccharomyces, caracterizada por dita cepa consumir pelo menos 80% do glicerol na dita mistura, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
Tal uso é de interesse particular para a produção de leveduras em uma escala industrial.
A expressão pelo menos uma cepa de Saccharomyces significa que a produção de leveduras pode ser realizada de varias cepas de leveduras diferentes, da mesma espécie ou de diferentes espécies.
Preferivelmente, a produção de leveduras é realizada de uma única cepa de levedura.
A mistura de glicerol e açúcar é como definido acima.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada pela produção de leveduras ser efetuada de acordo com um modo contínuo ou semicontínuo.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada pela produção de leveduras ser realizada em condições aeróbias.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada pela produção de leveduras ser realizada por um período preferivelmente menor do que 48 horas, mais preferivelmente menor do que 36 horas, ainda mais preferivelmente menor do que 24 horas.
Vantajosamente, o período de produção é compreendido entre 10 horas e 24 horas.
O período de produção é, por exemplo, 22 horas.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada pelo rendimento da produção ser similar à obtida com uma cepa padrão de levedura produzida nâ ausência de glicerol.
Por exemplo, o rendimento da produção de leveduras de acordo com a invenção é superior a 85%, preferivelmente superior a 90%, mais preferivelmente superior a 95% do rendimento de uma cepa padrão produzida na ausência de glicerol.
Por cepa padrão, entende-se, por exemplo, a levedura de panificação depositada na NCYC com o número NCYC 995.
Por “rendimento” ou “rendimento de produção” ou “rendimento de produção de biomassa”, entende-se a taxa da massa de levedura produzida pela massa de equivalente em sacarose utilizada.
A massa de equivalente em sacarose utilizada é constituída pela massa de equivalente em sacarose consumida e aquela não consumida.
O meio de cultura é como definido acima.
Segundo outra incorporação, um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura’de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada pelo meio de cultura compreender outra fonte de carbono que pode ser assimilado pela cepa de levedura. Outra fonte de carbono que pode ser assimilado pela cepa de levedura é, por exemplo, o etanol. Em tal incorporação a mistura de glicerol e de açúcar constitui pelo menos 70% da fonte de carbono para a levedura, preferivelmente pelo menos 80% da fonte de carbono para a levedura, mais preferivelmente pelo menos 90% da fonte de carbono para a levedura.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras conforme definido acima, caracterizada por nem todo o meio de cultura ser colocado na presença da cepa de levedura desde o início da cultura.
O meio de cultura preferivelmente é colocado na presença da cepa de levedura de maneira parcelada ao longo do tempo, em ma taxa constante ou variável, os diferentes elementos constitutivos do meio de cultura que podem ser supridos ao mesmo tempo ou separadamente.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizada pela mistura de glicerol e de açúcar ser introduzida no meio de cultura de uma forma parcelada ao longo do tempo.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizada pela mistura de glicerol e de açúcar ser introduzida no meio de cultura separadamente dos outros componentes do meio de cultura.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizada pela mistura de glicerol e de açúcar ser preparada antes da sua introdução no meio de cultura e/ou ser formada no meio de cultura, quando o glicerol e o açúcar forem fornecidos separadamente.
Um objeto da presente invenção é a utilização de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizada pela cepa não ser colocada na cultura, na presença de todo o glicerol e/ou de todo o açúcar na mistura a partir do início da cultura.
Um objeto particular da presente invenção é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras de pelo menos uma cepa de Saccharomyces, caracterizada pela dita cepa consumir pelo menos 85% do glicerol na mistura, preferivelmente pelo menos 90% do glicerol na mistura, mais preferivelmente pelo menos 95% do glicerol na mistura, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% do glicerol na mistura.
Um objeto da presente invenção também é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, caracterizada pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 8% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 10% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente pelo menos 12% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente menos 15% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 17% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 20% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, caracterizada pela proporção de glicerol na dita mistura compreender de 8% a 30% como equivalente em sacarose, preferivelmente de 10% a 20% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de 12% a 17% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é também o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, caracterizada pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 30% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 40% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente pelo menos 50% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 60% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção também é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, pela proporção de glicerol na dita mistura ser no máximo 95% como equivalente em sacarose, preferivelmente no máximo 90% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente no máximo 85% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras, caracterizada pela proporção de glicerol na dita mistura compreender de 30% a 90% como equivalente em sacarose, preferivelmente de 40% a 80% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de 50% a 70% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é o uso conforme definido acima de uma mistura de glicerol e de açúcar para a produção de leveduras de uma cepa, caracterizada por dita cepa ser escolhida das espécies cerevisiae, boulardii, carlsbergensis e uvarum.
Um objeto da presente invenção é a utilização como definido acima de uma mistura de glicerol e açúcar para a produção de leveduras de pelo menos uma cepa de Saccharomyces, caracterizada por dita cepa ser escolhida de uma variante natural e/ou de uma cepa geneticamente modificada.
Um objeto da presente invenção é a utilização como definido acima de uma mistura de glicerol e açúcar para a produção de leveduras de pelo menos uma cepa de Saccharomyces, caracterizada por dita cepa ser escolhida da: - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3886, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3887, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3888, - cepa depositada na CNCM em 3 de Marco de 2009 com o número 1-4132, - cepa depositada na CNCM em 3 de Marco de 2009 com o número 1-4133, - cepa depositada na CNCM em 3 de Marco de 2009 com o número 1-4129, - cepa depositada na CNCM em 3 de Marco de 2009 com o número 1-4130 ou - cepa depositada na CNCM em 3 de Marco de 2009 com o número 1-4131, ou uma mistura derivada.
Um objeto da presente invenção também são as leveduras obtidas pelo uso conforme definido acima de uma mistura de açúcar e glicerol.
Um objeto da presente invenção também um método para a produção de leveduras compreendendo as etapas de: introdução de uma cepa de levedura do gênero Saccharomyces em um fermentador, e multiplicação da dita cepa sob condições aeróbias em um meio de cultura compreendendo uma mistura de glicerol e açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose.
A mistura de glicerol e açúcar é como definido acima.
O meio de cultura é como definido acima.
Um objeto da presente invenção é um método para a produção de leveduras como definido acima, caracterizado pela multiplicação da dita cepa ser realizada de acordo com um modo semicontínuo ou de acordo com um modo contínuo, os modos contínuo ou semicontínuo sendo conforme definido acima.
A duração da cultura do método para a produção de leveduras de acordo com a invenção é preferivelmente menos do que 48 horas, mais preferivelmente menos do que 36 h, ainda mais preferivelmente menos do que 24 horas.
Vantajosamente, a duração da cultura do método para a produção de leveduras de acordo com a invenção é compreendida entre 10 e 24 horas.
O período de produção, por exemplo, é 22 horas.
O pH preferivelmente é ajustado em um valor compreendido entre 4,0 e 6,5, por exemplo, pelo suprimento simultâneo de ácidos ou bases.
A temperatura preferivelmente é ajustada em um valor compreendido entre 30°C e 34°C, por exemplo, por aquecimento ou arrefecimento do fermentador.
Vantajosamente, o método de produção de leveduras de acordo com a invenção produz rendimentos similares aos obtidos com cepas padrão de levedura produzida na ausência de glicerol.
Por exemplo, o rendimento da produção de leveduras segundo a invenção é superior a 85%, preferivelmente superior a 90%, mais preferivelmente superior a 95% do rendimento de uma cepa padrão produzida na ausência de glicerol.
Por cepa padrão, por exemplo, pode ser mencionada a levedura de panificação depositada na NCYC com o número NCYC 995.
Por "rendimento", entende-se a taxa entre a massa de levedura produzida e a massa de equivalente em sacarose utilizada.
A massa de equivalente em sacarose utilizada é constituída pela massa de equivalente em sacarose consumida e a não consumida.
As leveduras obtidas pela cultura de cepas de acordo com a invenção na presença de uma mistura de glicerol e açúcar e/ou leveduras obtidas de acordo com o método de produção da levedura da invenção têm qualidades semelhantes às leveduras utilizadas de forma padrão e produzidas em um substrato carbonoso do tipo do açúcar (na ausência de glicerol).
Pelo termo “qualidade”, entende-se ambos, a qualidade funcional e as qualidades de preservação.
Por exemplo, ditas leveduras têm qualidades similares em termos de resistência à secagem, em termos de rendimento de produção, em termos de poder de fermentação das leveduras de panificação, em termos de produção de álcool e/ou de resistência a fortes concentrações de álcool para as leveduras de álcool para as leveduras utilizadas de forma padrão e produzidos em um substrato carbonoso tipo do de açúcar (na ausência de glicerol).
As leveduras obtidas pela cultura de cepas de acordo com a invenção na presença de. uma mistura de glicerol e açúcar e/ou leveduras obtidas de acordo com o método de produção de levedura da invenção tem uma concentração de glicerol intracelular preferivelmente menos de 1,5% em massa de seca, mais preferivelmente menos de 1 %.
Esta baixa concentração de glicerol intracelular reflete a ausência de acúmulo de glicerol no meio e, portanto, o fato de que foi metabolizado.
Em uma incorporação particular, o meio de cultura compreende outra fonte de carbono que pode ser assimilada pela cepa de levedura. Outra fonte de carbono que possa ser assimilada pela cepa de levedura é, por exemplo, o etanol. Em tal incorporação, a mistura de glicerol e de açúcar constitui pelo menos 70% da fonte de carbono para a levedura, preferivelmente pelo menos 80% da fonte de carbono para a levedura, mais preferivelmente pelo menos 90% da fonte de carbono para a levedura.
Em uma incorporação preferida, nem todo o meio de cultura é colocado na presença da cepa de levedura desde o início da cultura. O meio de cultura preferivelmente é colocado na presença da cepa de levedura de uma forma parcelada ao longo do tempo, em uma taxa constante ou variável, sendo possível que os diferentes elementos constitutivos do meio de cultura sejam supridos ao mesmo tempo ou separadamente.
Em uma incorporação preferida de acordo com a invenção, a mistura de glicerol e açúcar é introduzida no meio de cultura de modo parcelado ao longo do tempo.
Em uma incorporação preferida de acordo com a invenção, a mistura de glicerol e de açúcar é introduzida no meio de cultura separadamente dos outros componentes do meio de cultura.
A mistura de glicerol e de açúcar pode ser preparada antes da sua introdução no meio de cultura e/ou ser formada no meio de cultura, quando o glicerol e o açúcar são supridos separadamente.
Em uma incorporação preferida de acordo com a invenção, a cepa não é colocada na cultura, na presença de todo o glicerol e/ou todo o açúcar na mistura desde o início da cultura.
Um objeto da presente invenção também é um método para a produção de levedura como definido acima que compreende as etapas de: introdução de uma cepa de levedura do gênero Saccharomyces em um fermentador, opcionalmente a multiplicação da dita cepa em condições aeróbias em um meio de cultura sem glicerol, multiplicação da dita cepa em condições aeróbias, de acordo com o modo semicontínuo ou contínuo, em meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose, opcionalmente a multiplicação da dita cepa em condições aeróbias em um meio de cultura sem glicerol.
Um objeto da presente invenção é um método para a produção de leveduras compreendendo as etapas de: introdução de uma cepa de levedura do gênero Saccharomyces em um fermentador, opcionalmente a multiplicação da dita cepa em condições aeróbias em um meio de cultura sem glicerol, multiplicação da dita cepa em condições aeróbias, em meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol de pelo menos 5% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose, opcionalmente a multiplicação da dita cepa em condições aeróbias em um meio de cultura sem glicerol, e separação por centrifugação da levedura de panificação então produzida deste meio de cultura, obtendo um líquido “creme de levedura” contendo aproximadamente entre 14 e 25% de massa seca, ou mesmo mais massa seca se o creme de levedura estiver misturado com produtos osmóticos.
Um objeto da presente invenção também é o método para a produção de leveduras como definido acima compreendendo as etapas subseqüentes opcionais de: filtração do líquido creme levedura assim obtido, em geral em um filtro rotativo a vácuo, obtendo uma levedura fresca desidratada contendo aproximadamente 26 a 35% de massa seca, mexer dita levedura fresca desidratada de modo a obter uma massa bem homogênea. extrusão da levedura assim obtida, obtendo uma levedura prensada θm forma de nacos de levedura fresca ou de levedura fresca esmigalhada, comercializado com aproximadamente 30% de massa seca, ou se a levedura destina-se a secar, sob a forma de aletria, secagem de forma controlada, em uma corrente de ar quente, por exemplo, por fluidificação das partículas de leveduras obtidas por extrusão, e empacotamento.
Um objeto particular da presente invenção é um método para a produção de leveduras como definido acima, caracterizado por pelo menos 80% do glicerol da dita mistura ser consumido pela dita cepa, preferivelmente pelo menos 85% do glicerol da dita mistura, mais preferivelmente pelo menos 90% do glicerol da dita mistura, ainda mais preferivelmente pelo menos 95% do glicerol da dita mistura, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% do glicerol da dita mistura.
Um objeto da presente invenção também é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 8% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 10% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente pelo menos 12% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 15% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 17% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 20% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela proporção de glicerol na dita mistura compreender de 8% a 30% como equivalente em sacarose, preferivelmente de 10% a 20% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente de 12% a 17% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 30% como equivalente em sacarose.
O objeto mais particular da invenção presente é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela dita mistura compreender uma proporção de glicerol de pelo menos 40% como equivalente em sacarose, preferivelmente pelo menos 50% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente no mínimo, 60% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 70% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% como equivalente em sacarose, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção também é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela proporção de glicerol na dita mistura ser no máximo 95% como equivalente em sacarose, preferivelmente no máximo 90% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente no máximo 85% como equivalente em sacarose.
Um objeto particular da presente invenção é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela proporção de glicerol na dita mistura compreender 30% a 90% como equivalente em sacarose, preferivelmente 40% a 80% como equivalente em sacarose, mais preferivelmente 50% a 70% como equivalente em sacarose.
Um objeto da presente invenção é um método para a produção de leveduras, conforme definido acima, caracterizado pela dita a cepa de levedura ser escolhida das espécies cerevisiae, boulardii, carlsbergensis e uvarum.
Um objeto da presente invenção é um método para a produção de leveduras como definido acima, caracterizado pela dita cepa de levedura ser escolhida de uma variante natural e/ou de uma cepa geneticamente modificada.
Um objeto da presente invenção é um método para a produção de leveduras, como definido acima, caracterizado pela dita a cepa de levedura ser escolhida da: - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3886, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3887, - cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I- 3888, - cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número 1-4132, - cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número 1-4133, - cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número 1-4129, - cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número 1-4130 ou - cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número 1-4131, ou uma mistura derivada.
Um objeto da presente invenção é um método, conforme definido acima, caracterizado pela dita cepa de levedura ser uma cepa como definido acima.
Um objeto da presente invenção também são leveduras que podem ser obtidas pela implementação do método de produção de leveduras como definido acima.
Em incorporação particular da invenção, o glicerol residual é reciclado para ser usado em uma mistura de glicerol e açúcar.
De acordo com outra incorporação, a mistura constituída por glicerol e açúcar pode comportar uma proporção de glicerol na faixa até 99,9% como equivalente em sacarose, ou praticamente mesmo até 100% como equivalente em sacarose.
Os exemplos a seguir ilustram a invenção sem limitá-la.
EXEMPLOS Exemplo 1: Obtenção de cepas de leveduras geneticamente modificadas de acordo com a invenção Material e Métodos
O gene STL1 (YDR536w) codifica a permease ativa do glicerol. Este gene foi amplificado do DNA genômico de uma levedura industrial e seqüenciado.
A seqüência do gene STL1 amplificado, composta de 1710 nucleotídeos estava alinhada com a seqüência dos nucleotídeos da ORF YDR536w proveniente da levedura S288c (banco de dados do SGD). O alinhamento demonstrou a presença de 7 nucleotídeos diferentes sobre a seqüência inteira, que corresponde a uma porcentagem de identidade de 99,6 %.
A tradução da seqüência dos nucleotídeos do gene STL1 proveniente da levedura industrial, leva a uma proteína de 570 aminoácidos. O alinhamento da seqüência da proteína do gene STL1 proveniente da levedura industrial com a seqüência da proteína da ORF YDR536w proveniente da levedura S288c demonstrou a presença de 3 aminoácidos diferentes, que corresponde a uma porcentagem de identidade de 99,5%.
A construção de cepas de leveduras industriais geneticamente modificadas é baseada em uma ferramenta molecular adequada para as leveduras industriais construídas pelo requerente.
Esta ferramenta em particular permite: - a clonagem de um gene de interesse, aqui o gene STL1, entre o promotor ADH1 e o terminador CYC1 da levedura, que permite a expressão deste gene na levedura, - a presença em ambos os lados do cassete de expressão de 2 fragmentos recombinogênicos (BUD5-A e BUD5-B, cada um dos 500 nucleotídeos), que permitem a inserção por recombinação homóloga do cassete no genoma da levedura,, após transformação, no lócus BUD5 (YCR038c) localizado no cromossoma III, - a presença do marcador de seleção KANMX, enquadrado por sítios de loxP 2, que permite a seleção de clones de leveduras, tendo integrado o cassete de expressão contendo o gene STL1 em seu genoma; esses mesmos clones são então transformados com um plasmídeo contendo a codificação do gene Cre para uma recombinase colocada sob o controle do promotor Gal1; após a indução da expressão deste gene pela cultura no meio contendo galactose, a ação do recombinase induzirá a perda do fragmento do DNA que contém o marcador de seleção KANMX.
O cassete de expressão é mostrado na Figura 1.
As 5 cepas iniciadoras usadas são as seguintes: a cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada na CNCM com o número I-3399, a cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada na NCYC com o número NCYC996, a cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada na NCYC com o número NCYC995, a cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada na CNCM com o número I-4072, e a cepa de Saccharomyces cerevisiae depositada na CNCM com o número 1-4071.
Cada uma das cepas iniciais é transformada com o cassete de expressão. Os clones resistentes à geneticina são selecionados. Então, para cada clone selecionado, é verificado por PCR a integração do cassete de expressão no genoma da levedura no lócus correto. Os clones selecionados são então transformados com um plasmídeo contendo a codificação do gene Cre por uma recombinase colocada sob controle do promotor Gal1. Após a indução da expressão deste gene Cre por cultura em meio contendo galactose, a ação da recombinase torna possível induzir a perda do fragmento do DNA contendo o marcador de seleção KANMX. A perda do dito marcador de seleção KANMX no sitio da integração no cromossoma então é verificada por PCR, a presença do cassete de expressão contendo o gene STL1 no genoma da levedura no lócus correto por PCR, assim como a perda da resistência a geneticina. A perda do plasmídeo Cre é verificada pela perda de resistência à nourseotricina.
Finalmente, a transcrição do gene STL1 na presença de açúcar na cepa geneticamente modificada é verificada medindo o nível de mRNA proveniente da transcrição do gene STL1 colocado sob controle do promotor ADH1. Para este fim, a cepa modificada é cultivada na presença de açúcar (meio de cultura de laboratório YPG contendo 2% de glicose). O mRNA é extraído das ditas cepas e o nível de mRNA correspondente a transcrição do gene STL1 é medido por PCR quantitativo. O nível de mRNA da cepa mutante então é expressa em função do nível de mRNA da cepa não mutante correspondente (fixado em 1).
Resultados
As cepas geneticamente modificadas para expressar o gene STL1 assim obtido foram depositadas na CNCM com os seguintes números: cepa número I-3886, originária da cepa inicial depositada na CNCM com o número I-3399, cepa número I-3887, originária da cepa inicial depositada na NCYC com o número NCYC996, cepa número I-3888, originária da cepa inicial de Saccharomyces cerevisiae depositada na NCYC com o número NCYC995, cepa número 1-4132, originária da cepa inicial depositada na CNCM com o número I-4072, e cepa número 1-4133, originária da cepa inicial depositada na CNCM com o número 1-4071.
As taxas de transcrição indicadas na Figura 2 mostram um grande aumento (de 270 a 300 vezes) na transcrição do gene STL1 em três cepas modificadas geneticamente I-3886, I-3887 e I-3888 cultivadas na presença de açúcar, em comparação com a taxa de transcrição do gene na cepa não mutante correspondente de controle cultivada no mesmo meio.
Em relação à taxa de transcrição das cepas 1-4132 e 1-4133 cultivadas na presença de açúcar, também é demonstrado um grande aumento (mais de 200 vezes) na transcrição do gene STL1, em comparação com a taxa de transcrição do gene na cepa não mutante correspondente de controle cultivada no mesmo meio.
EXEMPLO 2: Produção de leveduras de cepas geneticamente modificadas de acordo com a invenção em uma mistura de glicerol e açúcar Material e Métodos (i) Modo Semicontínuo
A produção de levedura fresca é realizada pelo modo descrito no trabalho "Yeast Technology, 2a edição, 1991, G. Reed and T.W. Nagodawithana, publicado por Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
O fermentador usado é semeado com um certo volume inicial contendo água, um pouco de nitrogênio e fósforo, elementos nutritivo tais como vitaminas e minerais.
Antes da semeadura do fermentador com uma certa quantidade de cepas de leveduras vivas, é adicionado um pouco de melaço para iniciar a cultura. O pH e a temperatura são ajustadas respectivamente nos valores compreendidos entre 3,5 e 7,0 para o pH (com suprimentos simultâneos de ácidos ou bases conforme necessário) e entre 30 e 34°C para a temperatura (com aquecimento ou resfriamento do fermentador conforme necessário). A chamada cultura "batelada alimentada" no modo semicontínuo é iniciada através do suprimento de melaço ou uma mistura de melaço e glicerol compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose. A taxa de fluxo do melaço ou a mistura de glicerol e melaço determina a taxa de crescimento de leveduras. Esta taxa de fluxo variável é fixada ao longo do tempo para que o equivalente em sacarose suprido ao longo do tempo possa ser completamente respirado (oxidado) pela levedura. Em tais condições, a produção de etanol pela levedura ao longo do tempo é zero, ou limitada às primeiras horas de ensaio. A fim de atender essas condições, a cultura é, por exemplo, realizada a uma taxa média de crescimento de 0,16 - 1 h para as cepas I-3886, I-3887, I-3888 e as cepas não mutantes correspondentes, e a uma taxa média de crescimento de 0,13 -1 h para as cepas 1-4132 e 1-4133 e as cepas não mutantes correspondentes.
O meio é suficientemente aerado e misturado de modo a não ser limitante em termos do oxigênio.
Em adição o melaço ou a mistura de glicerol e melaço, uma fonte contínua de nitrogênio na forma de uréia e fósforo na forma de ácido fosfórico torna possível responder às necessidades da levedura para a síntese de proteínas e outros constituintes da célula.
O suprimento de melaço ou da mistura de glicerol e melaço é mantida por 22 horas, a fim de obter a quantidade desejada de levedura, levando em conta o equipamento utilizado.
Durante as últimas horas de cultura, o suprimento de melaço ou da mistura de glicerol e melaço é progressivamente reduzido, a fim de reduzir o nível de germinação das leveduras no fermentador.
De acordo com este método de utilização, o abastecimento do substrato de carbono (por exemplo, a mistura de glicerol e melaço compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em açúcar) torna possível multiplicar a biomassa inicial por 40 em 22 horas de cultura, mantendo um metabolismo que é principalmente respiratório e garantindo uma taxa de germinação quando colhida inferior a 5-10%. A quantidade total de substrato carbonoso despejado é uma função da capacidade de transporte de oxigênio e calorias no tanque de fermentação.
A concentração final da biomassa é compreendida entre 5 e 7% e o conteúdo de nitrogênio desta biomassa entre 6 e 9%.
Durante a cultura e no final da cultura, a quantidade de glicerol no meio de cultura é medida por HPLC e é comparada com a quantidade de glicerol suprida.
No final da cultura, a levedura é colhida por centrifugação e a massa de lv é medida.
A levedura produzida (em g de MS) é a diferença entre a levedura colhida (em g de MS) e a levedura no inoculo (em g de MS) (MS significando Massa Seca).
A porcentagem de levedura então é obtida tomando a relação entre "levedura produzida (g de MS)" / "substrato carbonoso introduzido como equivalente em sacarose (g)" e multiplicando por 100.
A porcentagem de glicerol consumido é calculada tomando a relação “quantidade de glicerol medida no final da cultura (g)” “quantidade de glicerol suprida durante e cultura (g)” e multiplicando por 100.
(ii) Em quimiostato
O fermentador é alimentado por uma fonte de carbono constituída por uma mistura de glicerol e de açúcar, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre e uma fonte de fósforo. Vitaminas e minerais são supridos em excesso.
As misturas de glicerol e glicose compreendendo 0% a 80% de glicerol como equivalente em sacarose são testadas.
O fermentador é colocado em uma balança que controla uma bomba de tiragem para manter o volume constante no fermentador, controlando o seu peso. A cultura é limitada pelo substrato carbonoso (glicose e glicerol), os outros constituintes sendo supridos em excesso. O meio é suficientemente aerado e misturado do modo a nunca ser limitante em termos de oxigênio.
O meio é suprido continuamente em uma taxa de fluxo constante, tornando possível obter uma taxa de diluição (= taxa de fluxo/volume) de 0,15 tr1 e, portanto, em estado estacionário uma taxa de crescimento constante de 0,15 h1.
A concentração de equivalente em sacarose no meio de alimentação é igual a 19 g/kg.
O rendimento, assim como a quantidade residual de glicerol, são medidos na cultura no estado estacionário.
O estado estacionário é atingido quando as concentrações no fermentador são estáveis por pelo menos 3 tempos de permanência, o tempo de permanência sendo a relação 1 / [taxa de diluição].
O rendimento de produção de biomassa no açúcar suprido é a relação entre a biomassa produzida e o açúcar suprido. Em estado estacionário, a biomassa produzida por unidade de tempo é igual à taxa de tiragem multiplicada pela concentração da biomassa do fermentador (determinada pela filtragem num volume conhecido do mosto contendo a levedura e pesagem do bolo de levedura que foi previamente lavado e seco).
No momento da determinação do rendimento é tomada uma amostra do mosto contendo a levedura e imediatamente filtrada para remover a biomassa. O filtrado é analisado por HPLC para o ensaio da quantidade residual de glicerol.
Resultados (i) Modo Semi-contínuo
As cepas não mutantes 1-3399, NCYC 996, NCYC 995, 1-4072 e 1-4071 e as cepas mutantes correspondentes I-3886, I-3887, I-3888, 1-4132 e 1-4133 respectivamente, foram produzidas de acordo com o procedimento descrito acima, com melaço puro ou uma mistura de glicerol e melaço como fonte de carbono, compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose.
As Figuras 3 e 4 e as Tabelas 1,2, 3, 4 e 5 ilustram os resultados obtidos com as cepas não mutantes e as cepas mutantes correspondentes.
O rendimento de produção é determinado para cada cepa não mutante na presença de melaço puro (sem glicerol). Nas tabelas 1, 2, 3, 4 e 5, os valores indicados na linha "rendimento" correspondem ao percentual de rendimento em relação ao rendimento da cepa não mutante produzida em melaço puro.
Tabela 1 indica os resultados dos testes realizados com a cepa não mutante NCYC 996 e a cepa mutante correspondente I-3887.
Tabela 2 indica os resultados dos testes realizados com a cepa não mutante I- 3399 e a cepa mutante correspondente I-3886.
Tabela 3 indica os resultados dos testes realizados com a cepa não mutante NCYC 995 e. a cepa mutante correspondente I-3888.
Tabela 4 indica os resultados dos testes realizados com a cepa não mutante I- 4072 e a cepa mutante correspondente 1-4132.
Tabela 5 indica os resultados dos testes realizados com a cepa não mutante I- 4071 e a cepa mutante correspondente 1-4133.
Analisando essas tabelas, nota-se que durante uma produção em uma mistura de glicerol e melaço (compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose) como fonte de carbono, o rendimento de produção obtido com as cepas não mutantes é significativamente menor do que o rendimento de produção obtido no melaço puro. Essa redução no rendimento deve estar ligado à não utilização de uma parte significativa do equivalente em sacarose suprido na forma de glicerol, o glicerol acumulando no meio de cultura conforme indicado nos resultados na linha “suprimento de glicerol consumido".
Estas mesmas tabelas mostram os resultados de testes realizados com as cepas mutantes, quando a fonte de carbono suprida é uma mistura de melaço e glicerol. As medições realizadas indicam que o consumo do glicerol suprido é praticamente total para as três cepas mutantes I-3887, I-3886 e I-3888 (consumo de glicerol superior a 99%), que resulta em rendimentos de produção pelo menos equivalentes aos obtidos com cepas não mutantes produzidas em melaço puro (Tabelas 1 a 3).
No que diz respeito às cepas mutantes 1-4132 e 1-4133, o consumo de glicerol suprido é superior a 80% e o rendimento é superior a 90% do rendimento obtido com a cepa não mutante na ausência de glicerol (Tabelas 4 e 5).
Essa diferença no consumo do glicerol por cepas não mutantes e pelas cepas mutantes correspondentes é ilustrada nas Figuras 3 e 4, que mostram o acúmulo de glicerol ao longo do tempo, durante os testes de produção em uma mistura de glicerol e melaço compreendendo uma proporção de 20% de glicerol como equivalente em sacarose.
A curva com triângulos na Figura 3 representa a quantidade residual de glicerol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 996 e a curva com quadrados a da cepa I-3887.
A curva com triângulos na Figura 4 representa a quantidade residual de glicerol no meio livre de leveduras durante a cultura da cepa não mutante NCYC 996 e a curva com quadrados a da cepa mutante I-3888.
A diferença de consumo entre as cepas não mutantes e as cepas mutantes correspondentes é significativa após as cinco primeiras horas de cultura. Durante as primeiras cinco horas de cultura, a capacidade respiratória das cepas não mutantes e das cepas mutantes está saturada pelo açúcar suprido (efeito "Crabtree"), este fenômeno sendo acompanhado pela produção de etanol. Quando este fenômeno desaparece, ou seja, quando as leveduras têm capacidade respiratória para oxidar todo o açúcar e glicerol supridos, as cepas mutantes virtualmente consomem todo o glicerol suprido simultaneamente com o açúcar, enquanto as cepas não mutantes acumulam o glicerol. Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5
(ii) Modo contínuo
Nas figuras 5 e 6, cada ponto corresponde a um estado estacionário obtido com um meio de alimentação no qual a proporção de glicerol na mistura de glicerol e de açúcar é 0%, 20%, 50% ou 80% como equivalente em açúcar.
Com um meio de alimentação cuja única fonte de carbono é glicose (ausência de glicerol), b rendimento de produção de biomassa da cepa mutante (CNCM-3887) e a da cepa não mutante (NCYC 996) são idênticas. Portanto, a mutação do gene STL1, não modifica o rendimento de produção de biomassa em glicose.
A substituição de 20%, 50% ou 80% da glicose como equivalente em sacarose 15 por glicerol na mistura de glicerol e de açúcar na alimentação é acompanhada, no caso da cepa não mutante, por um crescente acúmulo de glicerol no meio de reação (Figuras 7 e 8). Esta quantidade de glicerol que se acumula no meio de reação leva a uma marcada redução do rendimento de produção de biomassa em equivalente em açúcar derramado (Figuras 5 e 6). Assim, a um nível de substituição de 50%, o rendimento de produção das cepas não mutantes diminuiu em 25% em relação ao rendimento da mesma cepa produzida em um meio contendo apenas glicose.
O consumo de glicerol das cepas não mutantes é inferior a 57% em um nível de substituição de 20%, inferior a 38% em um nível de substituição de 50% e inferior a 22% em um nível de substituição de 80 % (Figuras 7 e 8).
Em contraste, as cepas mutantes consomem quase todo o glicerol suprido, simultaneamente com o açúcar, conforme mostrado pela concentração muito baixa de glicerol residual medido no meio de reação. Assim, as cepas mutantes consomem mais de 95% do glicerol na mistura, até um nível de substituição de 80% (Figuras 7 e 8). Conseqüentemente, o rendimento de produção em equivalente em açúcar suprido não é afetado, ou apenas ligeiramente afetado, pelo nível de substituição do glicerol por açúcar. O rendimento de produção da cepa mutante é sempre maior do que o da cepa correspondente não mutante na presença de uma mistura contendo glicerol (Figuras 5 e 6).
Além disso, na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 20% ou 50% de glicerol como equivalente em sacarose, o rendimento de produção das cepas mutantes é superior a 90% em relação à cepa não mutante cultivada na ausência de glicerol, e é superior a 85% na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 80% de glicerol como equivalente em sacarose (Figuras 5 e 6).
Exemplo 3: Obtenção de variantes naturais de acordo com a invenção Material e Métodos (i) Triagem direta
Uma população de células de uma cepa de levedura de panificação padrão é submetida à radiação UV de 1200 a 2000 J/cm2, levando a uma perda da viabilidade de 99,9%
As variantes naturais obtidas são isoladas em um meio não seletivo (YPG), então, tríadas com base em seu rendimento e consumo de glicerol na presença de uma mistura de glicerol e açúcar.
A triagem é realizada após cultura no modo semicontínuo, na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 20% de glicerol como equivalente em sacarose, em fermentadores de 1 litro e de 7 litros.
As condições experimentais da cultura semicontínua são conforme descritas no Exemplo 2 por um período de 22 horas, com uma taxa de crescimento médio de 0,16 Ir1.
(ii) Triagem após enriquecimento em guimiostatos
Uma população de células da mesma cepa inicial como anteriormente é submetida a níveis crescentes de radiação UV (de 400 a 4400 J/cm2) levando a perdas de viabilidade variando entre 80 de 99,98%.
As variantes naturais submetidas a esses diferentes níveis de radiação então são combinadas e uma parte é utilizada para semeadura de uma cultura em quimiostato..
A fonte de carbono da cultura é constituída por uma mistura de glicerol e glicose compreendendo 50% de glicerol como equivalente em sacarose.
A cultura é realizada até ser obtida a geração de aproximadamente 220 células.
O consumo de glicerol é medido durante a cultura.
Regularmente são tomadas amostras da cultura para a triagem das variantes naturais.
As variantes naturais provenientes das diferentes amostras são isoladas em um meio não seletivo (YPG), então tríadas com base em seu rendimento e seu consumo de glicerol na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar.
A triagem é realizada apos a cultura no modo semicontínuo, na presença de uma misture de glicerol e açúcar compreendendo 20% de glicerol como equivalente em sacarose, em fermentadores de 1 litro e 7 litros.
As condições experimentais da cultura semicontínua são conforme descritas no Exemplo 2 por um período de 22 horas, com uma taxa de crescimento médio de 0,16.
Resultados
As variantes naturais provenientes da triagem direta ou da triagem após enriquecimento em quimiostatos apresentam consumo de glicerol e perfis de rendimento muito variados.
Um exemplo de um resultado obtido em 53 variantes naturais provenientes da triagem após enriquecimento em quimiostatos é mostrado na Figura 9. O consumo de glicerol da cepa inicial (T) também é indicado.
Um certo número de variantes naturais apresenta um consumo de glicerol superior a 80% na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 20% de glicerol como equivalente em sacarose e um rendimento maior ou igual a 85% da cepa inicial.
Estas incluem as variantes naturais depositadas na CNCM com os números I- 4129 (natural variante nQ 4), 1-4130 (natural variante n°.2O) e 1-4131 (variante natural nQ 2) que foram obtidas por triagem após enriquecimento em quimiostato da amostragem correspondente para a obtenção de aproximadamente 145 gerações de células em um quimiostato.
Nota-se que a análise do consumo de glicerol durante a cultura no quimiostato revela que durante as primeiras 100 gerações, o glicerol residual diminui regularmente, o que sugere uma adaptação da cultura à mistura de glicerol e de açúcar.
Além disso, o nível de mRNA correspondente a transcrição do gene STL1 é medido por‘RT-PCR quantitativo, conforme indicado no Exemplo 1, em variantes naturais diferentes de acordo com a invenção. O nível de mRNA obtido então é comparado com o da cepa inicial que não tenha sido submetida a tratamento UV.
Dependendo das variantes naturais, é observado um nível de mRNA similar ao da cepa inicial ou multiplicado por um fator de 2 a um fator de 7.
A capacidade de consumir glicerol na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar das cepas de acordo com a invenção portanto não está necessariamente vinculada a uma superexpressão do gene STL1.
Exemplo 4: Produção de leveduras das variantes naturais de acordo com a invenção em uma mistura de glicerol e de açúcar Material e Métodos
As culturas no modo semicontínuo são realizadas conforme o Exemplo 2, por um período de 22 horas, com uma taxa de crescimento médio de 0,16 h1.
Resultados
As variantes naturais 1-4129, 1-4130, e 1-4131, assim como a cepa inicial da levedura de onde provêm são produzidas de acordo com o procedimento descrito acima, com melaço puro ou uma mistura de glicerol e melaço compreendendo uma proporção de 20% ou 40% de glicerol como equivalente em sacarose como fonte de carbono.
O rendimento de produção para a cepa inicial é determinado na presença de melaço puro (sem glicerol). Nas tabelas 6 e 7, os valores mostrados na linha "rendimento" correspondem ao percentual de rendimento em relação ao rendimento da cepa inicial produzido em melaço puro.
As Tabelas 6 e 7 indicam os resultados dos testes realizados com as variantes naturas e a cepa inicial (T) na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 20% e 40% de glicerol respectivamente. Tabela 6 Tabela 7
As medições realizadas indicam que o consumo de glicerol suprido é praticamente total para as três variantes naturais na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 20% de glicerol como equivalente em sacarose 15 (consumo de glicerol superior a 99%), enquanto que o consumo da cepa inicial é inferior a 40% (Tabela 6).
Na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar compreendendo 40% de glicerol como equivalente em sacarose, as medições realizadas indicam que o consumo do glicerol suprido é praticamente total para a variante natural 1-4129, superior a 85% para a natural variante 1-4130 e superior a 90% para a variante I- 4131.

Claims (5)

1. UMA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae caracterizada por ser selecionada do grupo consistido de: - a cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I-3886, - a cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I-3887, - a cepa depositada na CNCM em 20 de Dezembro de 2007 com o número CNCM I-3888, - a cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I 4132 e - a cepa depositada na CNCM em 03 de Março de 2009 com o número I 4133.
2. USO DE UMA CEPA DE Saccharomyces cerevisiae de acordo com a reivindicação 1, para a produção de leveduras na presença de uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol entre 5% e 90% como equivalente em sacarose, caracterizado pela soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura ser igual a 100% como equivalente em sacarose, em que o açúcar é na forma de xarope de glicose, xarope de frutose, féculas hidrolisadas, melaço, ou qualquer combinação destes, e em que dita cepa de Saccharomyces cerevisiae consome glicerol simultaneamente ao açúcar.
3. O USO de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pela mistura de glicerol e açúcar compreender 20% de glicerol como equivalente em sacarose, e dita cepa de Saccharomyces cerevisiae consumir pelo menos 80% de glicerol na dita mistura.
4. UM MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE LEVEDURAS compreendendo as etapas de: - introduzir uma cepa de Saccharomyces de acordo com a reivindicação 1 em um fermentador, e - multiplicar dita cepa em condições aeróbias de acordo com um modo semicontínuo ou de acordo com um modo contínuo em um meio de cultura, compreendendo uma mistura de glicerol e de açúcar, dita mistura compreendendo uma proporção de glicerol entre 5% e 90% como equivalente em sacarose, a soma das proporções de glicerol e de açúcar na dita mistura sendo igual a 100% como equivalente em sacarose caracterizado por dita cepa de Saccharomyces cerevisiae consumir glicerol simultaneamente ao açúcar, e - em que o açúcar é na forma de xarope de glicose, xarope de frutose, féculas hidrolisadas, melaço, ou qualquer combinação destes.
5. O MÉTODO de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela mistura de glicerol e açúcar compreender 20% de glicerol como equivalente em sacarose, e dita cepa de Saccharomyces cerevisiae consumir pelo menos 80% de glicerol em 10 dita mistura.
BRPI0910599-9A 2008-03-14 2009-03-13 Uso de um substituto carbonoso para a produção de leveduras BRPI0910599B1 (pt)

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