BRPI0912159B1 - copolímero compreendendo um primeiro bloco que compreende uma unidade hidrofílica em ph fisiológico e um segundo bloco que compreende grupos hidrofóbicos, e uso do dito copolímero para liberação intracelular de um polinucleotídeo - Google Patents

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Abstract

copolímero compreendendo um primeiro bloco que compreende uma unidade hidrofílica em ph fisiológico e um segundo bloco que compreende grupos hidrofóbicos, e uso do dito copolímero para liberação intracelular de um polinucleotídeo descritos aqui são copolímeros, e métodos de preparar e utilizar tais copolímeros. tais copolímeros têm pelo menos dois blocos: um primeiro bloco que tem pelo menos uma unidade que é hidrofílica em ph fisiológico, e um segundo bloco que tem grupos hidrofóbicos. este segundo bloco também tem pelo menos uma unidade com um grupo que é aniônico em cerca de ph fisiológico. os copolímeros descritos são disruptivos de uma membrana celular, incluindo uma membrana extracelular, uma membrana intracelular, uma vesícula, uma organela, um endossoma, um lipossoma, ou uma célula de eritrócito. preferivelmente, em certos exemplos, o copolímero rompe a membrana e entra no ambiente intracelular. em exemplos específicos, o copolímero é endossomolítico.

Description

“COPOLÍMERO COMPREENDENDO UM PRIMEIRO BLOCO QUE COMPREENDE UMA UNIDADE HIDROFÍLICA EM PH FISIOLÓGICO E UM SEGUNDO BLOCO QUE COMPREENDE GRUPOS HIDROFÓBICOS, E USO DO DITO COPOLÍMERO PARA LIBERAÇÃO INTRACELULAR DE UM POLINUCLEOTÍDEO”
REFERÊNCIA CRUZADA [001]Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S.No.
61/052.908, depositado em 13 de Maio de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/052.914, depositado em 13 de Maio de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/091.294, depositado em 22 de Agosto de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/112.054, depositado em 06 de Novembro de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/112.048, depositado em 06 de Novembro de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/120.769, depositado em 12 de Dezembro de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/140.779, depositado em 24 de Dezembro de 2008, Pedido Provisório U.S.No.
61/140.774, depositado em 24 de Dezembro de 2008, e Pedido Provisório U.S. No. 61/171.377, depositado em 21 de Abril de 2009, os conteúdos de todos estes documentos estão aqui incorporados por referência em sua totalidade
DECLARAÇÃO DE ACORDO COM PESQUISA FEDERALMENTE PATROCINADA [002]Esta invenção foi feita com suporte do governo sob Contrato No. 5 R01 EB 2991 -03, premiado pelo National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.
CAMPO [003]Esta invenção refere-se a campos de química orgânica, química de polímero, bioquímica, biologia molecular, e medicina. Em particular refere-se a copolímeros (por exemplo, copolímeros de dibloco) e complexos dos mesmos com polinucleotídeos a ser usados como veículos para liberação dos polinucleotídeos em célu
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2/87 las vivas
ANTECEDENTE DA INVENÇÃO [004]Em certos exemplos, é benéfico fornecer agentes terapêuticos (por exemplo, oligonucleotídeos) às células vivas. Em alguns exemplos, liberação de tais polinucleotídeos a uma célula viva fornece um benefício terapêutico
SUMÁRIO [005]Em algumas modalidades, fornecidas aqui são copolímeros compreendendo pelo menos dois blocos, o primeiro bloco compreendendo pelo menos uma unidade constitucional que é hidrofílica (por exemplo, em cerca de pH fisiológico), e o segundo bloco compreendendo uma pluralidade de porções hidrofóbicas. Em certas modalidades, o segundo bloco também compreende uma espécie carregável, no estado carregado ou não carregado, que é aniônico em pH fisiológico. Entretanto, quando o pH está em cerca de pKa da espécie carregável, existirá uma distribuição em equilíbrio de espécie carregável em ambas as formas, em que cerca de 50 % será aniônica e cerca de 50% será não carregada. O outro pH é do pKa da espécie carregável, será uma troca correspondente neste equilíbrio tal que em valores de pH mais altos, a forma aniônica predominará e em valores de pH mais baixos, a forma não carregada predominará. As modalidades descritas aqui incluem a forma dos copolímeros em qualquer valor de pH. Em um valor de pH de um endossoma (um pH endossômico), a espécie carregável será predominantemente não carregada.
[006]Preferivelmente, em certos exemplos, em que um polímero descrito aqui está em contato com uma membrana celular, interrompe ou de outra maneira desestabiliza a membrana e entra no ambiente intracelular. Em modalidades específicas, um polímero fornecido aqui é endossomolítico ou de outra maneira desestabilizador de uma membrana endossômica.
[007]Em certas modalidades, fornecida aqui é um copolímero de desestabilização de membrana celular (por exemplo, uma desestabilização endossomolítica ou
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3/87 uma membrana de endossoma) compreendendo (a) um primeiro bloco, o primeiro bloco sendo um bloco hidrofílico, e (b) um segundo bloco, o segundo bloco sendo um bloco hidrofóbico de desestabilização de membrana compreendendo (i) uma primeira espécie carregável que é aniônica em cerca de pH fisiológico (ii) uma segunda espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico [008]Em algumas modalidades, fornecido aqui é um copolímero de desestabilização de membrana celular (por exemplo, uma desestabilização endossomolítica ou uma membrana de endossoma) compreendendo (a) um primeiro bloco, o primeiro bloco sendo um bloco hidrofílico compreendendo uma primeira espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico, (b) um segundo bloco, o segundo bloco sendo um bloco hidrofóbico de desestabilização de membrana (i) uma segunda espécie carregável que é aniônica em cerca de pH neutro, e (ii) uma terceira espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico, e (c) um oligonucleotídeo associado com o primeiro bloco.
[009]Em certas modalidades, fornecido aqui é copolímero de desestabilização de membrana celular (por exemplo, uma desestabilização endossomolítica ou uma membrana de endossoma) compreendendo (a) um primeiro bloco, o primeiro bloco sendo um bloco hidrofílico, (b) um segundo bloco, o segundo bloco sendo um bloco hidrofóbico de desestabilização de membrana compreendendo um resíduo de ácido acrílico ou resíduo de ácido alquilacrílico.
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4/87 [0010]Em um aspecto a presente invenção refere-se a um copolímero (por exemplo, copolímero de dibloco) compreendendo:
um primeiro bloco compreendendo uma primeira unidade constitucional que é hidrofílica em pH fisiológico normal;
um segundo bloco compreendendo uma segunda unidade constitucional que é catiônica em pH fisiológico normal e que pode ser o mesmo como ou diferente da primeira unidade constitucional;
uma terceira unidade constitucional que é aniônica em pH fisiológico normal;
uma porção intensificadora de hidrofobicidade em que:
a porção intensificadora de hidrofobicidade é covalentemente ligada à segunda unidade constitucional; ou, a porção intensificadora de hidrofobicidade é covalentemente ligada à terceira unidade constitucional; ou, a porção intensificadora de hidrofobicidade é compreendida em uma quarta unidade constitucional do segundo bloco; ou, qualquer combinação dos acima; e, o segundo bloco é substancialmente neutro na carga total.
[0011]Em várias modalidades, a primeira unidade constitucional é catiônica em pH fisiológico normal (isto é, cerca de pH fisiológico), é aniônica em pH fisiológico normal, é neutra em pH fisiológico normal, ou é híbrida em pH fisiológico normal. Em algumas modalidades, o primeiro bloco do copolímero é policatiônico em pH fisiológico normal, é polianiônico em pH fisiológico normal, é neutro em pH fisiológico normal, ou é poli-zwitteriônico em pH fisiológico normal. Em outras modalidades, o primeiro bloco do copolímero tem substancialmente as mesmas propriedades iônicas em pH endossômico como em pH fisiológico normal, por exemplo, é policatiônico em pH endossômico, é polianiônico em pH endossômico, é neutro em pH endossômico, ou é poli-zwitteriônico em pH endossômico.
Petição 870190075177, de 05/08/2019, pág. 15/125
5187 [0012]Em um aspecto a presente invenção refere-se a um copolímero (por exemplo, copolímero de dibloco) compreendendo:
um primeiro bloco compreendendo uma primeira unidade constitucional que é catiônica em pH fisiológico normal;
um segundo bloco compreendendo:
uma segunda unidade constitucional que é catiônica em pH fisiológico normal e que pode ser igual ou diferente da primeira unidade constitucional;
uma terceira unidade constitucional que é aniônica em pH fisiológico normal;
uma porção intensificadora de hidrofobicidade em que;
a porção intensificadora de hidrofobicidade é covalentemente ligada à segunda unidade constitucional; ou, a porção intensificadora de hidrofobicidade é covalentemente ligada à terceira unidade constitucional; ou, a porção intensificadora de hidrofobicidade é compreendida em uma quarta unidade constitucional do segundo bloco; ou, qualquer combinação dos acima; e, o segundo bloco é substancialmente neutro na carga total.
[0013]Em um aspecto desta invenção, a primeira unidade constitucional compreende uma espécie de nitrogênio catiônica (isto é, uma espécie de nitrogênio que é catiônica em pH fisiológico normal). Em um aspecto desta invenção, a espécie de nitrogênio catiônica é uma espécie de amônio. Em um aspecto desta invenção, a segunda unidade constitucional é a mesma como a primeira unidade constitucional. Em um aspecto desta invenção, a espécie aniônica compreende um ânion de ácido carboxílico. Em um aspecto desta invenção, o primeiro bloco também compreende uma unidade constitucional neutra de carga randomizadamente entremeada entre as primeiras unidades constitucionais. Em um aspecto desta invenção, o primeiro e/ou segundo bloco compreende pelo menos um grupo reativo ou ameno à modificação.
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6/87
Em um aspecto desta invenção, se presente, a quarta unidade constitucional compreende de cerca de 10% a cerca de 60% em peso do segundo bloco.
[0014]Em certas modalidades, o primeiro bloco de polímero é de aproximadamente 10.000 daltons no tamanho, ou cerca de 2.000 daltons a cerca de 30.000 daltons, ou cerca de 8.500 daltons a cerca de 13.000 daltons. Em algumas modalidades, o primeiro bloco de polímero tem uma carga positiva líquida similar no valor absoluto à carga negativa líquida, na molécula de siRNA a ser liberada.
[0015]Em algumas modalidades, o segundo bloco de polímero é aproximadamente igual ao primeiro bloco de polímero no peso molecular, ou cerca de 0,2-5 vezes, ou cerca de 1-3 vezes o tamanho do primeiro bloco de polímero e em modalidades mais preferidas o segundo bloco de polímero é aproximadamente 2-3 (duas a três) vezes o tamanho do primeiro bloco de polímero.
[0016]Em algumas modalidades, o bloco hidrofílico, carregado é complexado com (intercambialmente usado aqui com associado com ou ligado a, por exemplo, por uma ou mais ligações covalentes, uma ou mais interação iônica, uma combinação dos mesmos, ou similares) pelo menos um nucleotídeo, incluindo um polinucleotídeo, por exemplo, um siRNA.
[0017]Em um aspecto desta invenção, o bloco de polinucleotídeo é ligado a um dos blocos de polímero através de uma ligação covalente opcionalmente clivável. Em um aspecto desta invenção, o ácido de polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em DNA, RNA e análogos naturais e sintéticos dos mesmos. Em um aspecto desta invenção, o polinucleotídeo é antissentido. Em um aspecto desta invenção, o polinucleotídeo é RNA. Em um aspecto desta invenção, o RNA é selecionado a partir do grupo consistindo em mRNA, piRNA, miRNA e siRNA. Em um aspecto desta invenção, o RNA é siRNA.
[0018]Em um aspecto desta invenção, cada uma das unidades constitucionais é independentemente derivada de um monômero etilênico e a síntese do copoPetição 870190075177, de 05/08/2019, pág. 17/125
7/87 límero compreende a polimerização viva.
[0019]Em um aspecto desta invenção, o monômero etilênico é um monômero acrílico.
[0020]Fornecido em certas modalidades aqui é um copolímero de dibloco, tendo a Fórmula química I:
[0021 ]Em algumas modalidades
Ao, Ai, A2, A3 e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-C-, C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e -O(C)bO-, em que, a é 1 - 4, b é 2 - 4,
Y4 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1010C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O(1C-10C)alquila, C(O)NRe(1 C-10C) e arila, qualquer de qual é opcionalmente substituído com um ou mais grupos flúor,
Yo, Yi e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -0(0)0(20-10C)alquil-, -00(0)(1 ΟΙ OC)alquil-, -0(20-10)alquil- e -S(2C-10)alquil-, -C(O)NR6(2C-10C)alquila-;
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (10-1 OC)alquila e (60-1 OC)arila, em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R5 e
Y0-Y4 são considerados com um número apropriado de átomos de hidrogênio,
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8/87 cada Ri, R2, R3, R4, R5, e Re são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -CN, alquila, alquinila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila e heteroarila, quaisquer dos quais podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais átomos de flúor;
Q0 é um resíduo selecionado a partir do grupo consistindo em resíduos que são hidrofílicos em pH fisiológico e são pelo menos parcialmente positivamente carregados em pH fisiológico (por exemplo, amino, alquilamino, amônio, alquilamônio, guanidina, imidazolila, piridila, ou similares), pelo menos parcialmente negativamente carregados em pH fisiológico, porém sofrem protonação em pH inferior (por exemplo, carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, ou similares), substancialmente neutro (ou não carregado) em pH fisiológico (por exemplo, hidróxi, alquila polioxilada, polietileno glicol, polipropileno glicol, tiol, ou similares), pelo menos parcialmente zwitteriônicos em pH fisiológico (por exemplo, um resíduo monomérico compreendendo um grupo fosfato e um grupo amônio em pH fisiológico), resíduos conjugáveis ou funcionalizáveis (por exemplo, resíduos que compreendem um grupo reativo, por exemplo, azida, alcina, éster de succinimida, éster tetrafluorofenílico, éster pentafluorofenílico, éster p-nitrofenílico, piridil dissulfeto, ou similares), ou hidrogênio,
Qi é um resíduo que é hidrofílico em pH fisiológico, e é pelo menos parcialmente positivamente carregado em pH fisiológico (por exemplo,, amino, alquilamino, amônio, alquilamônio, guanidina, imidazolila, piridila, ou similares); pelo menos parcialmente negativamente carregado em pH fisiológico, porém, sofre protonação em pH inferior (por exemplo, carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, ou similares), substancialmente neutro em pH fisiológico (por exemplo, hidróxi, alquila polioxilada, polietileno glicol, polipropileno glicol, tiol, ou similares), ou pelo menos parcialmente zwitteriônico em pH fisiológico (por exemplo, um resíduo monomérico que compreende um grupo fosfato e um grupo amônio em pH fisiológico),
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Q2 é um resíduo que é positivamente carregado em pH fisiológico, incluindo, porém não limitado a amino, alquilamino, amônia, alquilamônio, guanidina, imidazolila, e piridila,
Q3 é um resíduo que é negativamente carregado em pH fisiológico, porém sofre protonação em pH inferior, incluindo, porém não limitado a carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, e fosfato, m é 0 a menos do que 1,0 (por exemplo, 0 a cerca de 0,49), n é maior do que 0 a 1,0 (por exemplo, cerca de 0,51 a cerca de 1,0), em que m + n = 1 p é cerca de 0,1 a cerca de 0,9 (por exemplo, cerca de 0,2 a cerca de 0,5) q é cerca de 0,1 a cerca de 0,9 (por exemplo, cerca de 0,2 a cerca de 0,5) em que:
r é 0 a cerca de 0,8 (por exemplo, 0 a cerca de 0,6), em que p + q + r = 1 v é de cerca de 1 a cerca de 25 kDa, e, w é de cerca de 1 a cerca de 50 kDa [0022]Em uma modalidade específica, v é cerca de 5 a cerca de 25 kDa Em outras ou modalidades específicas alternativas, w é cerca de 1 a cerca de 50 kDa [0023]Em algumas modalidades, o número ou relação de resíduos monoméricos representados por p e q está dentro de cerca de 30% um do outro, cerca de 20% um do outro, cerca de 10% um do outro, ou similares. Em modalidades específicas, p é substancialmente o mesmo como q. Em certas modalidades, pelo menos parcialmente carregado geralmente inclui mais do que uma quantidade de traço de espécies carregadas, incluindo, por exemplo, pelo menos 20% dos resíduos são carregados, pelo menos 30% dos resíduos são carregados, pelo menos 40% dos resíduos são carregados, pelo menos 50% dos resíduos são carregados, pelo menos
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60% dos resíduos são carregados, pelo menos 70% dos resíduos são carregados, ou similares.
[0024]Em certas modalidades, m é 0 e Qi é um resíduo que é hidrofílico e substancialmente neutro (ou não carregado) em pH fisiológico. Isto é, em pH fisiológico, qualquer espécie carregável em Q1 está predominantemente em uma forma neutra. Em algumas modalidades, substancialmente não carregado inclui, por exemplo, menos do que 5% são carregados, menos do que 3% são carregados, menos do que 1% são carregados, ou similares. Em certas modalidades, m é 0 e Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é 0 e Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente aniônico em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e um dentre Q0 ou Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico e o outro de Q0 ou Q1 é um resíduo que é hidrofílico e é substancialmente neutro em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e um dentre Q0 ou Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente aniônico em pH fisiológico e o outro de Q0 ou Q1 é um resíduo que é hidrofílico e é substancialmente neutro em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico e Q0 é um resíduo que é conjugável ou resíduos funcionalizáveis. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e Q1 é um resíduo que é hidrofílico e substancialmente neutro em pH fisiológico e Q0 é um resíduo que é conjugável ou resíduos funcionalizáveis.
[0025]Fornecido em certas modalidades aqui é copolímero tendo pelo menos dois blocos, o primeiro bloco tendo a Fórmula química Ia, o segundo bloco tendo a Fórmula química Ib, em que cada um dos termos descritos aqui é como descrito acima:
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(Ia)
(lb) [0026]Em certas modalidades, fornecido aqui é um composto de Fórmula II:
Qi Q2 Q3 [0027]Em algumas modalidades:
Ao, Ai, A2, A3 e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-C-, C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O) - e -O(C)bO em que, a é 1 - 4;
b é 2 - 4;
Yo e Y4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, ((1C-10C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O(1C10C)alquila, C(O)NRe(1C-10C) e arila, qualquer dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais grupos flúor;
Yi e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, -OC(O)(1C10C)alquil-, -O(2C-10C)alquil- e -S(2C-10C)alquil- -C(O)NRe(2C-1 OC) alquila;
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1 C-1 OC)alquila e (6C-10C)arila; em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R51 e Y0-Y4 são completados com um número apropriado de átomos de hidrogênio;
cada R1, R2, R3, R4, Rs, e Re são independentemente selecionados a partir
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12/87 do grupo consistindo em hidrogênio, -CN, alquila, alquinila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila e heteroarila qualquer dos quais pode ser opcionalmente substituído com um ou mais átomos de flúor;
Qi e Q2 são resíduos que são positivamente carregados em pH fisiológico, incluindo porém não limitado a amino, alquilamino, amônia, alquilamônio, guanidina, imidazolila, e piridila;
Q3 é um resíduo que é negativamente carregado em pH fisiológico, porém sofre protonação em pH inferior, incluindo porém não limitou a carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, e fosfato;
m é 0 a cerca de 0,49;
n é cerca de 0,51 a cerca de 1,0; em que m + n = 1 p é cerca de 0,2 a cerca de 0,5;
q é cerca de 0,2 a cerca de 0,5; em que:
p é substancialmente 0 mesmo como q;
r é 0 a cerca de 0,6; em que p + q + r = 1 v é de cerca de 5 a cerca de 25 kDa; e, w é de cerca de 5 a cerca de 50 kDa.
[0028]Fornecido aqui em algumas modalidades é um copolímero de dibloco, tendo (em pH fisiológico normal) a fórmula química III:
+ NR6R7Re ♦NRsRioR,, COO’ [0029]Em algumas modalidades, Ao, Ai, A2, A3 e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e - O(C)bO-, em que, a 1 é - 4,
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13/87 b é 2 - 4;
Ri, R2, R3, R4, Rs, Re, R7, R8, Rg, Rio e Rii são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C-5C)alquila, (3CeC)cicloalquila e fenila, qualquer dos quais pode ser opcionalmente substituído com um ou mais átomos de flúor;
Yo e Y4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (iC-ioC)alquila, (3C-eC)cicloalquila, O-(iC-ioC)alquila, -C(O)O(iC10C)alquila e fenila qualquer dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais grupos flúor
Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, -OC(O)(1C-10C)alquil-, -O(2C10C)alquil- e -S(2C-10C)alquil-,
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1 C-5C)alquila e fenila, em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R7-R11 e Y0-Y4 são completados com um número apropriado de átomos de hidrogênio,
Z é um contra-íon fisiologicamente aceitável, m é 0 a cerca de 0,49, n é cerca de 0,51 a cerca de 1,0, em que m + n = 1 p é cerca de 0,2 a cerca de 0,5, q é cerca de 0,2 a cerca de 0,5, em que p é substancialmente o mesmo como q, r é 0 a cerca de 0,6, em que p + q + r = 1
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14/87 v é de cerca de 5 a cerca de 25 kDa, e, w é de cerca de 5 a cerca de 50 kDa [0030]Em um aspecto desta invenção,
A, é -C-C-
Y, é -C(O)OCH2CH3-,
R6 é hidrogênio,
R7 e R8 são cada qual -CH3, e,
R2 é -CH3 [0031]Em um aspecto desta invenção,
A2 é -C-C-;
Y2 é -C(O)OCH2CH2-;
R9 é hidrogênio;
R10 e R11 são cada qual -CH3, e,
R3 é -CH3.
[0032]Em um aspecto desta invenção,
A3 é -C-C-;
R3 é CH3CH2CH2-;
Y3 é uma ligação covalente, e
Z é um ânion fisiologicamente aceitável (por exemplo, policátion ou pluralidade de cátions) [0033]Em certas modalidades:
A4 é -C-C-;
R5 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e -CH3, e,
Y4 é -C(O)O(CH2)3CH3.
[0034]Em algumas modalidades
A0 é C-CR1 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e (1CPetição 870190075177, de 05/08/2019, pág. 25/125
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3C)alquila, e
Yo é selecionado a partir do grupo consistindo em -C(O)O(1C-3C)alquila.
[0035]Em algumas modalidades, m é 0. Em certas modalidades, r é 0. Em algumas modalidades, m e r são ambos 0.
[0036]Em certas modalidades, fornecido aqui é um método de liberar um polinucleotídeo em uma célula, compreendendo contatar a célula com um complexo de polímero: polinucleotídeo do mesmo. Em modalidades específicas, o complexo de polímero: polinucleotídeo é ligado de qualquer maneira adequada incluindo, por meio de exemplo não limitante, interações iônicas e não iônicas, tal como uma ou mais ligações covalentes, combinações das mesmas, ou similares. Em uma modalidade específica, fornecido aqui é um método de liberar um polinucleotídeo em uma célula, compreendendo contatar a célula com um conjugado covalente do polímero e polinucleotídeo.
[0037]Em um aspecto desta invenção, o polinucleotídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em DNA, RNA e análogos naturais e sintéticos dos mesmos [0038]Em um aspecto desta invenção, o DNA, RNA ou análogos naturais ou sintéticos dos mesmos são antissentido. Em um aspecto desta invenção, o polinucleotídeo é RNA. Em um aspecto desta invenção, o RNA é siRNA. Em um aspecto desta invenção, o siRNA é liberado a uma célula in vivo. Em um aspecto desta invenção, o polímero desta invenção é ligado ou complexado a uma porção de alvejamento. Em um aspecto desta invenção, a porção de alvejamento é covalentemente ligada à extremidade α do copolímero (por exemplo, copolímero de dibloco). Em um aspecto desta invenção, a porção de alvejamento é covalentemente ligada à extremidade ω do copolímero, ou é covalentemente ligada a um grupo pendente do copolímero (por exemplo, copolímero de dibloco). Em um aspecto desta invenção, a porção de alvejamento é forma selecionada porém não limitada a anticorpos, fragmentos de anticorpo, moléculas semelhantes a anticorpo, peptídeos, peptídeos cíclicos,
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16/87 e moléculas pequenas.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0039]Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta especificação estão aqui incorporados por referência para os propósitos citados a mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado a estar incorporado por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0040]As novas características da invenção são mencionadas com particularidade nas reivindicações anexas. Um melhor entendimento das características e vantagens da presente invenção será obtido por referência a seguinte descrição detalhada que menciona modalidades ilustrativas, em que os princípios da invenção são utilizados, e os desenhos acompanhantes dos quais:
A Figura 1 é um sumário ilustrativo de vários polímeros descritos aqui.
A Figura 2 é uma síntese ilustrativa de [PEGMAw]-[B-P-D]
A Figura 3 é uma caracterização ilustrativa de P7-PEGMA 100-40 kDa
A Figura 4 é uma descrição ilustrativa da composição e propriedades de copolímeros de PEGMA- DMAEMA
A Figura 5 é uma síntese ilustrativa de [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-P-D]
A Figura 6 é uma copolimerização de RAFT ilustrativa de PEGMA e MAANHS
A Figura 7 é uma copolimerização de RAFT ilustrativa de DMAEMA e MAANHS
A Figura 8 é uma síntese ilustrativa de PDSMA
A Figura 9 é uma síntese ilustrativa de copolímero de HPMA-PDSMA para conjugação de siRNA
A Figura 10 ilustra a hemólise de (A) polímeros e (B) construções de polímero/siRNA
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A Figura 11 ilustra internalização de célula HeLa de complexos de polímero/siRNA e siRNA rotulado por FAM.
A Figura 12 ilustra a citotoxicidade de HeLa não específica (A) e redução de GAPDH (B) como uma função de veículo de polímero de siRNA
A Figura 13 ilustra a redução de GAPDH em HeLas
A Figura 14 ilustra o planejamento de polímero para Poly[HPMA]-b[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]
A Figura 15 ilustra a síntese de piridil dissulfeto-CTA
A Figura 16 ilustra a reação de grupo terminal de polímero de piridil dissulfeto com o peptídeo cisteína.
A Figura 17 ilustra Um gel SDS PAGE para caracterizar os conjugados de peptídeo-polímero.
A Figura 18 ilustra um ensaio de rompimento de membrana para medir a capacidade do polímero ativar o rompimento dependente de pH de membranas de bicamada de lipídio.
A Figura 19 ilustra a localização intracelular de peptídeo seguindo a conjugação de polímero
A Figura 20 ilustra os conjugados que necessitaram do bloco sensível ao pH que foram similares a ambos os grupos de controle e não resultaram em toxicidade significante
A Figura 21 ilustra a bioatividade de conjugados de peptídeo
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0041]Enquanto as modalidades preferidas da presente invenção foram mostradas e descritas aqui, ficará óbvio para aqueles versados na técnica que tais modalidades são fornecidas apenas por meio de exemplo. Numerosas variações, mudanças, e substituições ocorrerão agora por aqueles versados na técnica sem afastarem-se da invenção. Deveria ser entendido que várias alternativas para as modali
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18/87 dades da invenção descritas aqui podem ser empregadas praticando a invenção. Pretende-se que as seguintes reivindicações definam a extensão da invenção e métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações, e seus equivalentes sejam desse modo abrangidos.
[0042]Fornecido em certas modalidades, a presente invenção fornece polímeros de veículo e construções de polímero:polinucleotídeo. Em certos exemplos, estes polímeros e construtores de polímero:polinucleotídeo encontram a necessidade quanto a um sistema seguro, forte para liberar os polinucleotídeos terapêuticos em células [0043]Em certas modalidades, fornecido aqui é copolímero de desestabilização de membrana celular (por exemplo, uma desestabilização endossomolítica ou de endossoma-membrana) compreendendo:
(a) um primeiro bloco, o primeiro bloco sendo um bloco hidrofílico, e (b) um segundo bloco, o segundo bloco sendo um bloco hidrofóbico de desestabilização de membrana compreendendo:
(i) uma primeira espécie carregável que é aniônica em cerca de pH fisiológico (ii) uma segunda espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico [0044]Em algumas modalidades, fornecido aqui é um copolímero de desestabilização de membrana celular (por exemplo, uma desestabilização endossomolítica ou de endossoma-membrana) compreendendo:
(a) um primeiro bloco, o primeiro bloco sendo um bloco hidrofílico compreendendo uma primeira espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico, e (b) um segundo bloco, o segundo bloco sendo um bloco hidrofóbico de desestabilização de membrana compreendendo
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19/87 (i) uma segunda espécie carregável que é aniônica em cerca de pH neutro, e (ii) uma terceira espécie carregável que é catiônica em cerca de pH fisiológico, e (c) um oligonucleotídeo associado com o primeiro bloco [0045]Em modalidades específicas dos polímeros descritos aqui, cada espécie carregável está presente em uma unidade constitucional diferente. Em algumas modalidades, uma primeira unidade constitucional compreende a primeira espécie carregável. Em outra ou modalidades alternativas, uma segunda unidade constitucional compreende a segunda espécie carregável. Em outra ou modalidades alternativas, uma terceira unidade constitucional compreende a terceira espécie carregável [0046]Algumas das unidades constitucionais desta invenção são determinadas para serem catiônicas ou aniônicas em pH fisiológico normal. Desse modo, em certos exemplos, pH fisiológico normal, a espécie tem pKa que resulta em ser protonada (catiônica, positivamente carregada) ou desprotonada (aniônica, negativamente carregada). Presentemente, espécie catiônica preferida em pH fisiológico é a espécie de nitrogênio tal como amônio, -NRR’R”, guanidínio (-NRC(=NR'H)+NRR, ignorando formas canônicas que são conhecidas por aqueles versados na técnica) em que os grupos R são independentemente hidrogênio, alquila, cicloalquila ou arila ou dois grupo R ligados aos mesmos ou átomos de nitrogênio adjacentes podem ser da mesma forma ligados um ao outro para formar uma espécie heterocíclica tais como pirrol, imidazol, indol e similares. Resíduos monoméricos ou unidades constitucionais descritas aqui como catiônicos em pH fisiológico normal compreendem uma espécie carregada ou carregável em um cátion, incluindo uma espécie catiônica desprotonável.
[0047]Em várias modalidades descritas aqui, unidades constitucionais, que são catiônicas ou positivamente carregadas em pH fisiológico (incluindo, por exemplo, certas unidades hidrofílicas constitucionais) descritas aqui compreendem um ou
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20/87 mais grupos amino, grupos alquilamino, grupos guanidina, grupos imidazolila, grupos piridila, ou similares, ou as formas protonadas, alquiladas ou de outra maneira carregadas dos mesmos. Em algumas modalidades, unidades constitucionais que são catiônicas em pH fisiológico normal que são utilizadas aqui incluem, por meio de exemplo não limitante, resíduos monoméricos de dialquilaminoalquilmetacrilatos (por exemplo, DMAEMA). Em várias modalidades descritas aqui, unidades constitucionais, que são aniônicas ou negativamente carregadas em pH fisiológico (incluindo, por exemplo, certas unidades constitucionais hidrofílicas) descritas aqui compreendem um ou mais grupo ácido ou base de conjugado dos mesmos, incluindo, por meio de exemplo não limitante, carboxilato, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, ou similares. Em algumas modalidades, unidades constitucionais que são aniônicas ou negativamente carregadas em pH fisiológico normal que são utilizadas aqui incluem, por meio de exemplo não limitante, resíduos monoméricos de ácido acrílico, ácido alquil acrílico (por exemplo, ácido metil acrílico, ácido etil acrílico, ácido propil acrílico, etc), ou similares. Em várias modalidades descritas aqui, unidades constitucionais hidrofílicas que são neutras em pH fisiológico compreendem um ou mais grupos hidrofílicos, por exemplo, hidróxi, alquila polioxilada, polietileno glicol, polipropileno glicol, tiol, ou similares. Em algumas modalidades, unidades constitucionais hidrofílicas que são neutras em pH fisiológico normal que são utilizadas aqui incluem, por meio de exemplo não limitante, resíduos monoméricos de ácido acrílico peguilado, ácido metacrílico peguilado, ácido hidroxialquilacrílico, ácido hidroxialcacrílico (por exemplo, HPMA), ou similares. Em várias modalidades descritas aqui, unidades constitucionais hidrofílicas que são híbridas em pH fisiológico compreendem um grupo aniônico ou negativamente carregado em pH fisiológico e um grupo catiônico ou positivamente carregado em pH fisiológico. Em algumas modalidades, unidades constitucionais hidrofílicas que são híbridas em pH fisiológico normal que são utilizadas aqui incluem, por meio de exemplo não limitante, resíduos monoméri
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21/87 cos compreendendo um grupo fosfato e um grupo amônio em PH fisiológico, tal como mencionado em US 7.300.990, que está aqui incorporado para tal descrição similar.
[0048]Em certas modalidades, polímeros fornecidos aqui também compreendem uma ou mais unidades constitucionais compreendendo uma cadeia lateral conjugável ou funcionalizável (por exemplo, um grupo pendente de um resíduo monomérico). Em alguns exemplos, uma cadeia lateral conjugável ou funcionalizável é um grupo suportando um ou mais grupos reativos que podem ser usados para introdução pós-polimerização de funcionalidades adicionais por meio de químicas conhecidas na técnica, por exemplo, química de “estalo” (por exemplo de reações de estalo, veja Wu, P.; Fokin, V. V. Catalytic Azide-Alkyne Cycloaddition: Reactivity and Applications. Aldrichim. Acta, 2007, 40, 7-17). Em certas modalidades, cadeias laterais conjugáveis ou funcionalizável fornecidas aqui compreendem um ou mais dentre qualquer grupo ativado adequado, tal como porém não limitado a éster de Nhidroxissuccinimida (NHS), éster de HOBt (1-hidroxibenzotriazol), éster pnitrofenílico, éster tetrafluorofenílico, éster pentafluorofenílico, grupo piridil dissulfeto ou similares.
[0049]Em algumas modalidades, unidades constitucionais que são aniônicas em pH fisiológico normal compreendem ácidos carboxílicos tais como, sem limitação, resíduos monoméricos de ácido 2-propil acrílico (isto é, a unidade constitucional derivada de, ácido 2-propilpropiônico, -CH2C((CH2)2CHs)(COOH)- (PAA)), embora qualquer ácido orgânico ou inorgânico que pode estar presente, como uma espécie protegida, por exemplo, um éster, ou como o ácido livre, no processo de polimerização selecionado está da mesma forma dentro da consideração desta invenção. Resíduos monoméricos aniônicos ou unidades constitucionais descritas aqui compreendem uma espécie carregada ou carregável em um ânion, incluindo uma espécie aniônica protonável. Em certos exemplos, resíduos monoméricos aniônicos podem
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22/87 ser aniônicos em pH 7,0 neutro.
[0050]Monômeros tais como anidrido maleico, (Scott M. Henry, Mohamed E., H. El-Sayed, Christopher M. Pirie, Allan S, Hoffman, e Patrick S. Stayton Poly(styrene-alt pH-responsive- Poly(styrene-alt-maleic anhydride) Alkylamide Copolimers for Intracelular Drug Delivery Biomacromolecules 7:2407-2414, 2006) podem da mesma forma ser usados para introdução de unidades negativamente carregadas (por exemplo, a terceira unidade constitucional) no segundo bloco. Em tais modalidades, a unidade constitucional negativamente carregada é um resíduo monomérico de anidrido maleico.
[0051 ]Uma modalidade desta invenção é um polímero tendo a seguinte estrutura geral de Fórmula I:
[0052]Em algumas modalidades :
Ao, Ai, A2, As e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-, -CC-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e -O(C)bO-, em que,
A é 1 - 4;
B é 2 - 4;
Y4 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C10C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O (1C-10)alquila, C(O)NR6(1C-10C), (4C-10C)heteroarila e (6C-10C)arila qualquer dos quais são opcionalmente substituídos com um ou mais grupos flúor
Yo, Yi e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo que consistindo em uma ligação covalente, (1 C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, OC(O)(1C-10C)alquil-, -O(2C-10)alquil- e -S(2C-10C)alquil-, -C(O)NR6(2C10C)alquil-, -(4C-10C)heteroaril- e -(6C-10C)arila-;
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Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -(4C-10)heteroaril- e -(6C-10C)aril-, em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R5 e
Y0-Y4 são considerados com um número apropriado de átomos de hidrogênio;
R1, R2, R3, R4, R5, e Re são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -CN, alquila, alquinila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila e heteroarila, quaisquer do qual podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais átomos de flúor;
Qo é um resíduo selecionado a partir do grupo consistindo em resíduos que são hidrofílicos em pH fisiológico, e é pelo menos parcialmente positivamente carregado em pH fisiológico (por exemplo, amino, alquilamino, amônio, alquilamônio, guanidina, imidazolila, piridila, ou similares), pelo menos parcialmente negativamente carregado em pH fisiológico porém sofre protonação em pH inferior (por exemplo, carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, ou similares), substancialmente neutro (ou não carregado) em pH fisiológico (por exemplo, hidróxi, alquila polioxilada, polietileno glicol, polipropileno glicol, tiol, ou similares), pelo menos parcialmente zwitteriônico em pH fisiológico (por exemplo, um resíduo monomérico compreendendo um grupo fosfato e um grupo amônio em pH fisiológico), resíduos conjugáveis ou funcionalizáveis (por exemplo, resíduos que compreendem um grupo reativo, por exemplo, azida, alcina, éster de succinimida, éster tetrafluorofenílico, éster pentafluorofenílico, éster p-nitrofenílico, piridil dissulfeto, ou similares), ou hidrogênio;
Q1 é um resíduo que é hidrofílico em pH fisiológico, e é pelo menos parcialmente positivamente carregado em pH fisiológico (por exemplo, amino, alquilamino, amônia, alquilamônio, guanidina, imidazolila, piridila, ou similares); pelo menos parcialmente negativamente carregado em pH fisiológico porém sofre protonação em
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24/87 pH inferior (por exemplo, carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, fosfato, ou similares); substancialmente neutro em pH fisiológico (por exemplo, hidróxi, alquila polioxilada, polietileno glicol, polipropileno glicol, tiol, ou similares); ou pelo menos parcialmente zwitteriônico em pH fisiológico (por exemplo, compreendendo um grupo fosfato e um grupo amônio em pH fisiológico);
Q2 é um resíduo que é positivamente carregado em pH fisiológico, incluindo porém não limitado a amino, alquilamino, amônia, alquilamônio, guanidina, imidazolila, e piridila;
Q3 é um resíduo que é negativamente carregado em pH fisiológico, porém sofre protonação em pH inferior, incluindo porém não limitado a carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, e fosfato;
m é cerca de 0 a menos do que 1,0 (por exemplo, 0 a cerca de 0,49);
n é maior do que 0 a cerca de 1,0 (por exemplo, cerca de 0,51 a cerca de
1,0); em que m + n = 1 p é cerca de 0,1 a cerca de 0,9 (por exemplo, cerca de 0,2 a cerca de 0,5);
q é cerca de 0,1 a cerca de 0,9 (por exemplo, cerca de 0,2 a cerca de 0,5); em que:
r é 0 a cerca de 0,8 (por exemplo, 0 a cerca de 0,6); em que p + q + r = 1 v é de cerca de 1 a cerca de 25 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 25 kDa; e, w é de cerca de 1 a cerca de 50 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 50 kDa, [0053]Em algumas modalidades, o número ou relação de resíduos monoméricos representados por p e q está dentro de cerca de 30% um do outro, cerca de 20% um do outro, cerca de 10% um do outro, ou similares. Em modalidades específicas, p é substancialmente o mesmo como q. Em certas modalidades, pelo menos parcialmente geralmente carregado inclui mais do que uma quantidade de traço de
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25/87 espécies carregadas, incluindo, por exemplo, pelo menos 20% dos resíduos são carregados, pelo menos 30% dos resíduos são carregados, pelo menos 40% dos resíduos são carregados, pelo menos 50% dos resíduos são carregados, pelo menos 60% dos resíduos são carregados, pelo menos 70% dos resíduos são carregados, ou similares.
[0054]Em certas modalidades, m é 0 e Qi é um resíduo que é hidrofílico e substancialmente neutro (ou não carregado) em pH fisiológico. Em algumas modalidades, substancialmente não carregado inclui, por exemplo, menos do que 5% são carregados, menos do que 3% são carregados, menos do que 1% são carregados, ou similares. Em certas modalidades, m é 0 e Q1 é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é 0 e Qi é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente aniônico em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e um dentre Q0 ou Qi, é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico e o outro de Q0 ou Qi é um resíduo que é hidrofílico e é substancialmente neutro em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e um dentre Q0 ou Qi é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente aniônico em pH fisiológico e o outro de Q0 ou Qi é um resíduo que é hidrofílico e é substancialmente neutro em pH fisiológico. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e Qi é um resíduo que é hidrofílico e pelo menos parcialmente catiônico em pH fisiológico e Q0 é um resíduo que é um resíduo conjugável ou funcionalizável. Em certas modalidades, m é >0 e n é >0 e Qi é um resíduo que é hidrofílico e substancialmente neutro em pH fisiológico e Q0 é um resíduo que é um resíduo conjugável ou funcionalizável.
[0055]Em algumas modalidades, o grupo positivamente carregado ou pelo menos parcialmente positivamente carregado em pH fisiológico é um grupo -NR’R”, em que R' e R” são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila, cicloalquila, ou heteroalquila que podem ser opcionalmente substituídos com um ou
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26/87 mais grupos halogênio, amino, hidroxila e/ou compreendem uma ou mais ligações insaturadas, em algumas modalidades, R’ e R” são empregados juntos para formar um substituído de heteroarila não substituída ou heterociclo alicíclico. Em algumas modalidades, grupos descritos aqui como positivamente carregados ou pelo menos parcialmente positivamente carregados em pH fisiológico podem incluir, por meio de exemplo não limitante, amino, alquil amino, dialquil amino, amino cíclico (por exemplo, piperidina ou piperidina N-alquilada), imino alicíclico (por exemplo, diidro-piridinil, 2,3,4,5-tetraidro-piridinila, ou similares), heteroaril imino (por exemplo, piridinila), ou similares. Em algumas modalidades, grupos descritos aqui como negativamente carregados ou pelo menos parcialmente negativamente carregados em pH fisiológico porém sofrem protonação em pH inferior, tal como, por meio de exemplo não limitante, ácido carboxílico (COOH), sulfonamida, ácido borônico, ácido sulfônico, ácido sulfínico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido fosfínico, ácido fosfórico, ácido car bônico, a base de conjugado desprotonada do mesmo, ou similares.
[0056]Em certas modalidades, fornecido aqui é um composto de Fórmula II
(ID [0057]Em algumas modalidades:
Ao, Ai, A2, A3 e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-C-, C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e -O(C)bO-, em que, a é 1 - 4;
b é 2 - 4;
Yo e Y4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C-10C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O(1C10C)alquila, C(O)NRe(1C-10C) e arila qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais grupos flúor;
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Yi e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, -OC(O)(1C10C)alquil-, -O(2C-10C)alquil- e -S(2C-10)alquil-, -C(O)NR6(2C-10C) alquila;
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquila e (6C-10C)arila; em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 não são completamente substituídos com R1-R5 e
Y0-Y4 são completados com um número apropriado de átomos de hidrogênio;
R1, R2, R3, R4, R5, e R6 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -CN, alquila, alquinila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila e heteroarila quaisquer das quais podem ser opcionalmente substituídas com um ou mais átomos de flúor;
Q1 e Q2 são resíduos, que são positivamente carregados em pH fisiológico, incluindo porém não limitado a amino, alquilamino, amônia, alquilamônio, guanidina, imidazolila, e piridila.
Q3 é um resíduo que é negativamente carregado em pH fisiológico, porém sofre protonação em pH inferior, incluindo porém não limitado a carboxila, sulfonamida, boronato, fosfonato, e fosfato, m é 0 a cerca de 0,49;
n é cerca de 0,51 a cerca de 1,0; em que m + n = 1 p é cerca de 0,2 a cerca de 0,5;
q é cerca de 0,2 a cerca de 0,5; em que:
p é substancialmente o mesmo como q;
r é 0 a cerca de 0,6; em que p + q + r = 1 v é de cerca de 1 a cerca de 25 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 25 kDa; e, w é de cerca de 1 a cerca de 50 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 50 kDa.
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28/87 [0058]Em certas modalidades, o copolímero de bloco é um copolímero de dibloco, tendo a fórmula química (em pH fisiológico normal ou cerca de neutro) de Fórmula III:
+ NR6R7Rg +NRgRioRu COO' [0059]Em certas modalidades, Ao, Ai, A2, A3, e A4, substituído como indicado compreendem as unidades constitucionais (intercambialmente usados aqui com “unidades monomérica” e “resíduos monoméricos”) do polímero de Fórmula III. Em modalidades específicas, as unidades monoméricas de construção dos grupos A de Fórmula III são polimerizavelmente compatíveis sob condições apropriadas. Em certos exemplos, uma cadeia principal etilênica ou unidade constitucional, polímero -(CC-)m-, em que cada C é dissubstituído com H e/ou qualquer outro grupo adequado, é polimerizada usando monômeros contendo uma ligação dupla carbonocarbono, >C=C<. Em certas modalidades, cada grupo A (por exemplo, cada um dentre Ao, Ai, A2, A3, e A4) pode ser (isto é, independentemente selecionado a partir de) -C-C- (isto é, uma unidade monomérica etilênica ou cadeia principal de polímero), C(O)(C)aC(O)O- (isto é, uma unidade monomérica de polianidrido ou cadeia principal de polímero), -O(C)aC(O)- (isto é, uma unidade monomérica de poliéster ou cadeia principal de polímero), -O(C)bO- (isto é, uma unidade monomérica de polialquileno glicol ou cadeia principal de polímero), ou similar (em que cada C é dissubstituído com H e/ou qualquer outro grupo adequado tal como descrito aqui, incluindo R12 e/ou R13 como descrito acima). Em modalidades específicas, 0 termo a é um número inteiro de 1 a 4, e b é um número inteiro de 2 a 4. Em certos exemplos, cada grupo Y e R ligado à cadeia principal de Fórmula III (isto é, qualquer um dentre Yo, Υι, Y2, Υι, Y4, Ri, R2, R3, R4, Rs) é ligado a qualquer C (incluindo qualquer (C)a ou (C)b) da unidade monomérica específica. Em modalidades específicas, igualmente 0
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Y e R de uma unidade monomérica específica são ligados ao mesmo C. Em certas modalidades específicas, igualmente o Y e R de uma unidade monomérica específica são ligados ao mesmo C, o ‘’C’’ sendo alfa ao grupo carbonila da unidade monomérica, se presente.
[0060]Em modalidades específicas, R1-R11 são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila (por exemplo, 1C-5C alquila), cicloalquila (por exemplo, 3C-6C cicloalquila), ou fenila, em que qualquer um dentre R1-R11 é opcionalmente substituído com um ou mais flúor, cicloalquila, ou fenila que pode opcionalmente ser também substituído com um ou mais grupo alquila.
[0061]Em certas modalidades específicas, Yo e Y4 são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, alquila (por exemplo, 1C-10C alquila), cicloalquila (por exemplo, 3C-6C cicloalquila), O-alquila (por exemplo, O-(2C-10C)alquila, C(O)O- alquila (por exemplo, -C(O)O-(2C-10)alquila), ou fenila qualquer dos quais são opcionalmente substituídos com um ou mais flúor.
[0062]Em algumas modalidades, Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir de uma ligação covalente, alquila, preferivelmente presentemente uma (1C-10C)alquila, -C(O)O-alquila, preferivelmente presentemente -C(O)O-(2C10)alquila, -OC(O)alquila, preferivelmente presentemente -OC(O)-(2C-10C)alquila, O-alquila, preferivelmente presentemente -O(2C-10)alquila e -S-alquila, preferivelmente presentemente -S-(2C-10)alquila. Em certas modalidades, Y3 é selecionado a partir de uma ligação covalente, alquila, preferivelmente presentemente (1C5C)alquila e fenila.
[0063]Em algumas modalidades, Z- está presente ou ausente. Em certas modalidades, em que R1 e/ou R4 é hidrogênio, Z- é OH-. Em certas modalidades, Z’ é qualquer contra-íon (por exemplo, um ou mais contra-íon), preferivelmente um contra-íon biocompatível, tal como, por meio de exemplo não limitante, cloreto, fosfato inorgânico ou orgânico, sulfato, sulfonato, acetato, propionato, butirato, valerato, ca
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30/87 proato, caprilato, caprato, laurato, miristato, palmato, estearato, palmitolato, oleato, linolato, araquidato, gadoleato, vacinato, lactato, glicolato, salicilato, desamionfenilalanina, desaminosserina, desaminotreonina, ε-hidroxicaproato, 3-hidroxibutilrato, 4hidroxibutirato ou 3-hidroxivalerato. Em algumas modalidades, quando cada Y, R e flúor opcional for covalentemente ligado a um carbono da cadeia principal selecionada, quaisquer carbonos que não são completamente substituídos são considerados com o número apropriado de átomos de hidrogênio. Os números m, n, p, q e r representam a fração em mol de cada unidade constitucional em seu bloco e v e w fornecem o peso molecular de cada bloco.
[0064]Em certas modalidades,
A0, A1, A2, A3 e A4 são selecionados a partir do grupo consistindo em -C-, -CC-, -C(O)(CR12R13)a(O)O-, -O(CR12R13)aC(O)- e O(CR12R13)bO; em que, a é 1 - 4;
b é 2 - 4;
R1, R2, R3, R4, R5, Re, R7, R8, R9, R10, R11, R12, e R13 são independentemente selecionadas a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C-5C)alquila, (3C6C)cicloalquila, (5C-10C)arila, (4C-10)heteroarila, qualquer dos quais que podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais átomos de flúor, Y0 e Y4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C10C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O(1C-10C)alquila e fenila qualquer dos quais são opcionalmente substituídos com um ou mais grupos flúor;
Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, -OC(O) (1C10C)alquil-, -O(2C-10)alquil- e -S(2C-10)alquila-;
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-5C)alquila e fenila; em que os átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R5 e Y0-Y4 são considerados com um
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31/87 número apropriado de átomos de hidrogênio;
Z é um ou mais contra-íons fisiologicamente aceitáveis, m é 0 a cerca de 0,49;
n é cerca de 0,51 a cerca de 1,0; em que m + n = 1 p é cerca de 0,2 a cerca de 0,5;
q é cerca de 0,2 a cerca de 0,5; em que:
p é substancialmente o mesmo como q;
r é 0 a cerca de 0,6; em que p + q + r = 1 v é de cerca de 1 a cerca de 25 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 25 kDa; e, w é de cerca de 1 a cerca de 50 kDa, ou cerca de 5 a cerca de 50 kDa. [0065]Em uma modalidade específica,
Ao, Ai, A2, A3 e A4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e -O(C)bO-; em que, a é 1 - 4;
b é 2 - 4;
Ri, R2, R3, R4, Rs, Re, R7, R8, R9, R10 e R11, são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C-5C)alquila, (3C6C)cicloalquila e fenila quaisquer dos quais podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais átomos de flúor;
Yo e Y4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (1C-10C)alquila, (3C-6C)cicloalquila, O-(1C-10C)alquila, -C(O)O(1C10C)alquila e fenila qualquer um dos quais é opcionalmente substituído com um ou mais grupos flúor;
Y1 e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1C-10C)alquil-, -C(O)O(2C-10C)alquil-, -OC(O)(1CPetição 870190075177, de 05/08/2019, pág. 42/125
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10C)alquil-, -O(2C-10C)alquil- e -S(2C-10)alquila-;
Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (1 C-5C)alquila e fenila; em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R5 e Y0-Y4 são completados com um número apropriado de átomos de hidrogênio;
Z é um contra-íon fisiologicamente aceitável, m é 0 a cerca de 0,49;
n é cerca de 0,51 a cerca de 1,0; em que m + n = 1 p é cerca de 0,2 a cerca de 0,5;
q é cerca de 0,2 a cerca de 0,5; em que:
p é substancialmente o mesmo como q;
r é 0 a cerca de 0,6; em que p + q + r = 1 v é de cerca de 5 a cerca de 25 kDa; e w é de cerca de 5 a cerca de 25 kDa.
[0066]Em algumas modalidades,
Ai é -C-CY, é -C(O)OCH2CH2-;
Re é hidrogênio;
R7 e R8 são cada qual -CH3; e,
R2 é -CH3.
[0067]Em algumas modalidades,
A2 -C-C-;
Y2 é -C(O)OCH2CH2-;
R9 é hidrogênio;
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Rw e Ri 1 são cada qual -CH3; e,
R3 é -CH3.
[0068]Em algumas modalidades,
A3 é -C-C-;
R4 é CH3CH2CH2-;
Y3 é uma ligação covalente;
e Z' é um ânion fisiologicamente aceitável.
[0069]Em algumas modalidades,
A4-C-C-;
Rs é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e -CH3; e,
Y4 é -C(O)O(CH2)3CH3.
[0070]Em algumas modalidades,
Ao é C-CR1 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio e (1C3C)alquila; e,
Yo é selecionado a partir do grupo consistindo em -C(O)O(1C-3C)alquila.
[0071 ]Em algumas modalidades, m é 0.
[0072]Em algumas modalidades, r é 0.
[0073]Em algumas modalidades, m e r são ambos 0.
[0074]Fornecido em algumas modalidades, é um polímero exemplar porém não limitante desta invenção:
IVl
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34/87 [0075]Em certos exemplos, as unidades constitucionais de composto 1 são como mostradas dentro do colchete quadrado à esquerda e os parênteses curvados na direita e eles são derivados dos monômeros:
O p o
II II II
H2C=Ç-C-O-CH2CH2-N(CH3)2 H2C=Ç-C-OH H2C=Ç-C-O(CH2)3CH3 CH3 _ (CH?)2CH3 θ CH3 [0076]Como discutido acima, as letras p, q e r representam a fração em mol de cada unidade constitucional dentro de seu bloco. As letras v e w representam o peso molecular (numérico médio) de cada bloco no copolímero de dibloco.
[0077]Fornecido aqui em algumas modalidades, um composto fornecido aqui é um composto tendo a estrutura:
ch3
IV2 [0078]Como discutido acima, as letras p, q e r representam a fração em mol de cada unidade constitucional dentro de seu bloco. As letras v e w representam o peso molecular (numérico médio) de cada bloco no copolímero de dibloco.
[0079]Em algumas modalidades, fornecido aqui os seguintes polímeros:
[DMAEMA],-[Bp-/-P,-/-Dr]w IV3
[PEGMA],-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV4
[PEGMAra-/-DMAEMAJ,-[Bp-/-P(|-/-DI]w IV5
[PEGMAn)-AMAA(NHS)l)]v-|Bp-/-P1|-/-D,]w IV6
[DMAEMAm-/-MAA(NHS)Jv-[Bp-/-P<l-/-E>r]w IV7
(HPMAm-APDSM„]v-[Bp7-P</-DfL IV8
[PEGMAm-/-PDSMn]v-[Bp-/-Pq-/-Dr]w IV9
[0080]Em algumas modalidades, B é resíduo de metacrilato de butila; P é resíduo de ácido propil acrílico; D e DMAEMA são resíduo de metacrilato de dimeti
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35/87 laminoetila; PEGMA é resíduo de metacrilato de polietilenoglicol (por exemplo, com
1-20 unidades de óxido de etileno, tal como ilustrado em composto IV-2, ou 4-5 unidades de óxido de etileno, ou 7-8 unidades de óxido de etileno); MAA(NHS) é resíduo de ácido metacrílico-N-hidróxi succinimida; HPMA é resíduo de N-(2hidroxipropil) metacrilamida; e PDSM é resíduo de metacrilato de piridil dissulfeto. Em certas modalidades, os termos m, n, p, q, r, w e v são como descritos aqui. Em modalidades específicas, w é cerca de 0,1 vez a cerca de 5 vezes v, ou cerca de 1 vez a cerca de 5 vezes v.
[0081]Polímeros que IV1-IV9 são exemplos de polímeros fornecidos aqui compreendendo uma variedade de unidade(s) constitucional(is) preparando o primeiro bloco do polímero. Além disso, polímeros mencionados nas Figuras e Tabela, bem como polímeros estruturalmente selecionados (tais como variações nas relações de resíduo monomérico e/ou MW) são especificamente fornecidos aqui. Em algumas modalidades, a(s) unidade(s) constitucional(is) do primeiro bloco é(são) variada(s) ou quimicamente tratada(s) para criar polímeros onde o primeiro bloco é ou compreende uma unidade constitucional que é neutra (por exemplo, PEGMA), catiônica (por exemplo, DMAEMA), aniônica (por exemplo, PEGMA-NHS onde a NHS é hidrolisado ao ácido, ou ácido acrílico), anfolíticas (por exemplo, DMAEMANHS onde a NHS é hidrolisada ao ácido), ou híbrida (por exemplo, fosfato de poli[2metacriloilóxi-2'trimetilamôniometila]). Em algumas modalidades, polímeros compreendendo funcionalidade de piridil dissulfeto no primeiro bloco, por exemplo, [PEGMA-PDSM]-[B-P-D], os quais podem ser e são opcionalmente reagidos com um siRNA tiolado para formar um conjugado de polímero-siRNA [0082]Em algumas modalidades, os polímeros desta invenção são “copolímeros de dibloco”. O termo “copolímero” significa que o polímero é o resultado de polimerização de dois ou mais monômeros diferentes. Em alguns exemplos, um “copolímero de bloco” refere-se a uma estrutura em que sub-combinações distintas de
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36/87 unidades constitucionais são ligadas juntamente. Em certos exemplos, um “bloco” refere-se a um segmento ou porção de um polímero tendo características particulares (por exemplo, um segmento hidrofílico ou um segmento hidrofóbico de um copolímero de gradiente). Em alguns exemplos, um copolímero de dibloco compreende justamente dois blocos, uma generalização esquemática de um tal polímero sugere [AaBbCc...]m - [XxYyZz]n em que cada letra representa uma unidade constitucional, cada subscrição para uma unidade constitucional representa a fração em mol daquela unidade no bloco particular, os três pontos indicam que pode haver mais (porém, claramente, que pode da mesma forma haver menos) unidades constitucionais em cada bloco e m e n indicam o peso molecular de cada bloco no copolímero de dibloco. Como sugerido pelo esquemático, o número e a natureza de cada unidade constitucional são separadamente controlados para cada bloco. Entende-se que o esquemático não é pretendido e não deveria ser interpretado para deduzir qualquer relação que esteja entre o número de unidades constitucionais ou o número de tipos diferentes de unidades constitucionais em cada um dos blocos. Não é pretendido que o esquemático descreva qualquer disposição particular das unidades constitucionais dentro de um bloco particular. Isto é, em cada bloco, as unidades constitucionais podem estar dispostas em uma configuração puramente randomizada, randomizada alternada, alternada particular, um bloco regular, ou um bloco randomizado a menos que expressamente declarado estar de outra maneira. Uma configuração puramente randomizada, por exemplo, seria: x-x-y-z-x-y-y-z-y-z-z-z... ou y-z-x-y-z-y-zx-x... Uma configuração randomizada alternada seria: x-y-x-z-y-x-y-z-y-x-z..., e uma configuração alternada regular seria: x-y-z-x-y-z-x-y-z... Configuração de bloco regular tem a seguinte configuração regular: ...x-x-x-y-y-y-z-z-z-x-x-x..., enquanto uma configuração de bloco randomizada tem a configuração geral: ...x-x-x-z-z-x-x-y-y-y-yz-z-z-x-x-z-z-z-... Em nenhum dos exemplos genéricos anteriores está a justaposição particular de blocos ou unidades constitucionais individuais ou o número de unida
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37/87 des constitucionais em um bloco ou o número de blocos significa que nenhum deles seriam interpretados como de qualquer maneira suportando ou limitando a estrutura atual de copolímeros de dibloco desta invenção.
[0083]É também entendido que os parênteses curvados que fecha as unidades constitucionais não são pretendidos e não devem ser interpretados para significar que as unidades constitucionais por si próprias formam os blocos. Isto é, as unidades constitucionais dentro do bloco, isto é, configurações puramente randomizadas, randomizadas alternadas, alternadas regulares, bloco regular, ou bloco randomizado. Desse modo, no copolímero de dibloco 1, p, q e r representam a fração em mol dessa unidade constitucional no bloco e não são pretendidos e não devem ser interpretados, como indicando ou sugerindo que as unidades constitucionais dentro dos parênteses compreendam um bloco dentro de um bloco.
[0084]Desse modo, quando é declarado que aqui uma unidade constitucional neutra de carga pode ser “randomizadamente entremeada” entre as primeiras unidades constitucionais do primeiro bloco de um copolímero de dibloco desta invenção, significa que o primeiro bloco teria uma estrutura geneticamente similar àquela descrita acima para uma configuração puramente randomizada.
[0085]Em algumas modalidades, a solubilidade de quaisquer dos copolímeros de bloco descritos aqui em solução aquosa ou meio em cerca de pH neutro é mais do que 1 mg/mL, mais do que 5 mg/mL, mais do que 10 mg/mL, mais do que 25 mg/mL, mais do que 50 mg/mL, mais do que 100 mg/mL e mais do que 500 mg/mL. Em algumas modalidades, em particular para polímeros de dibloco tendo um primeiro bloco hidrofílico (por exemplo, um catiônico hidrofílico), as três espécies presentes no bloco hidrofóbico (aniônicas, catiônicas e hidrofóbicas) estão presentes como um bloco de copolímero randomizado, ou estão de outra maneira presentes em uma sequência entremeada tal que o bloco é de carga líquida aproximadamente neutra sobre seu comprimento. Em alguns exemplos, esta orientação fornece solubi
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38/87 lidade aumentada do copolímero de bloco.
[0086]Em certas modalidades, os copolímeros de dibloco mencionados na Tabela 1 são fornecidos aqui; em certos exemplos, tais polímeros são usados como agentes de complexação de polinucleotídeo e veículos. Entende-se que as características de copolímeros de dibloco descritas na Tabela 1 e de outra maneira aqui serão traduzíveis a outros copolímeros de dibloco deste tal que, com base nas descrições aqui, aqueles versados na técnica serão capazes de preparar tais copolímeros, que portanto estarão dentro do escopo desta invenção.
[0087]O primeiro bloco de copolímeros de dibloco exemplares é composto de resíduos monoméricos de dimetilaminoetilmetacrilato (DMAEMA), que eficazmente liga-se e condensa ácidos nucleicos em pH fisiológico. O segundo bloco de um polímero exemplar descrito aqui continha resíduos monoméricos de DMAEMA como uma unidade constitucional catiônica; resíduos monoméricos de ácido propil acrílico (PAA) como uma unidade constitucional aniônica e, devido ao substituinte de propila hidrofóbico, um contribuinte à porção intensificadora de hidrofobicidade; e resíduos monoméricos de metilacrilato de butila (BMA) como uma unidade constitucional separada, constituindo ou compreendendo uma porção intensificadora de hidrofobicidade. Em certos exemplos, o segundo bloco permite o escape endossômico do ácido nucleico ligado através de uma mudança conformacional induzida por pH que, em alguns exemplos, resulta na desestabilização de membrana. Em alguns exemplos, sob condições fisiológicas, o segundo ou bloco de núcleo hidrofóbico tem igualmente resíduos positivos (por exemplo, DMAEMA protonado) e negativos (por exemplo, PAA desprotonado) em quantidades similares, resultando em neutralidade de carga aproximada e estabilização de carga do núcleo pela formação de pares de íon. Em certos exemplos, na captação de uma composição de polímero-ácido nucleico descrita aqui em compartimentos endossômicos da célula, o pH inferior do ambiente endossômico faz os resíduos aniônicos da terceira unidade constitucional
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39/87 (por exemplo, grupos PAA carboxilato) tornarem-se protonados e desse modo romper a membrana. Em alguns exemplos, protonação ou neutralização alguns ou todos os resíduos aniônicos resultam na [0088]Tabela 1. Pesos moleculares, polidispersidades, e composições de monômero para o poli(DMAEMA) macroCTA, os copolímeros de dibloco resultantes e sua nomenclatura.
Mna Mna % de % de % de % de % de % de
Políme- 1o. 2o. BMA PAA DMAEM BMA PAA Ex- DMAE
ro Bloco Bloco PDI Teórico Teórico A Teórico Experi- perimen- MA Ex-
(g/mol) (g/mol) a 2o. 2o. 2o. Bloco mentalb talb peri-
Bloco Bloco 2o. Bloco 2o. Bloco mentalb
2o. Blo-
co
9100 - 1,16 - - - - - -
mCTA
P1 9100 6900 1,58 0 50 50 - 47 53
P2 9100 8900 1,56 5 47,5 47,5 1 48 51
P3 9100 8300 1,54 10 45 45 12 40 48
P4 9100 9300 1,46 15 42,5 42,5 19 44 37
P5 9100 10100 1,51 20 40 40 24 40 36
P6 9100 10000 1,48 30 35 35 27 37 36
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P7 9100 11300 1,45 40 30 30 48 29 23
a Como determinado por SEC Tosoh TSK-GEL R-3000 e colunas R-4000 (Tosoh Bioscience, Mongomeriville, PA) conectado em série a um Viscotek GPCmax VE2001 e refractômetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX). Grau de HPLC DMF contendo 0,1% em peso de LiBr foi usado como a fase móvel. Os pesos moleculares dos copolímeros sintetizados foram determinados usando uma série de padrões de metacrilato de polimetila.
b Como determinado por espectroscopia de 1H NMR (3% em peso em CDCL3; Bruker DRX 499) neutralização carregada dos resíduos ácidos de PAA e, em certos exemplos, em uma mudança conformacional no polímero em uma forma de desestabilização de membrana hidrofóbica.
[0089]PoIi(DMAEMA) e outras entidades poliméricas usadas aqui (por exemplo, copolímeros ou blocos de copolímero de BMA, DMAEMA e PAA) são preparadas de qualquer maneira adequada. Em um exemplo, poli(DMAEMA) foi preparado por polimerização de DMAEMA na presença da RAFT CTA, ECT, e um iniciador de radical. Em alguns exemplos, um bloco, poli(DMAEMA) (9,100 g/mol, DP 58), foi usado para preparar uma série de copolímeros de dibloco onde o teor de BMA foi aumentado e quantidades equimolares de DMAEMA e PAA foram mantidas. Características dos polímeros resultantes são mostradas na Tabela 1. Tamanhos de bloco similares foram observados para todos os sete diblocos dando aos polímeros um peso molecular total em torno de 20.000 g/mol. Em certas modalidades, pesos moleculares inferiores são escolhidos. Em alguns exemplos, os polímeros de peso molecular inferior minimizam a toxicidade de polímero e permitem a depuração renal dos polímeros para garantir a translação amena ao teste in vivo. Da mesma forma mostrado na Tabela 1 estão as composições de monômero teóricas e experimen
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41/87 talmente derivadas do segundo bloco. Cada polímero listado é um exemplo de uma classe de polímeros relacionados. Por exemplo, polímeros da classe P7 têm várias versões uma da qual é caracterizada na Tabela 1. Enquanto todos os polímeros estão relativamente próximos da composição teórica, alguma divergência é observada em todos os casos e é provável devido a diferenças nas relações de reatividade de monômero.
[0090]Alternativamente, a orientação dos blocos no polímero de dibloco é invertida, tal que a extremidade ω do polímero é o bloco hidrofílico. Em várias modalidades, isto é obtido de qualquer maneira adequada, incluindo várias maneiras sinteticamente. Por exemplo, a síntese dos copolímeros de bloco da presente invenção começa com a preparação do bloco hidrofóbico PAA/BMA/DMAEMA, e o bloco hidrofílico, carregado é adicionado pela segunda etapa sintética submetendo-se o PAA/BMA/DMAEMA macroCTA resultante a uma segunda etapa de polimerização de RAFT. Abordagens alternadas incluem reduzir o PAA/BMA/DMAEMA macroCTA para formar uma extremidade de tiol e em seguida covalentemente ligar um polímero hidrofílico pré-formado, carregado ao tiol formado. Esta abordagem sintética fornece um método para introdução de um grupo reativo na extremidade ω da extremidade hidrofílica da reivindicação polimérica desse modo fornecendo abordagens alternadas à conjugação química ao polímero.
[0091]O copolímero de dibloco P7, um exemplo de um polímero da presente invenção, consiste em dois blocos, um é poli(DMAEMA), que é hidrofílico e carregado em pH fisiológico, e o outro bloco é um copolímero randomizado de unidades de monômero: hidrofóbicas (BMA) e unidades ionizadas/hidrofóbicas ou ionizáveis/hidrofóbicas (PAA, DMAEMA)
Definições e Modalidades [0092]Entende-se que, com respeito a este pedido, uso do singular inclui o plural e vice versa a menos que expressamente declarado de outra maneira. Isto é,
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42/87 um e “o refere-se a um ou mais dentre qualquer que seja as modificações das palavras. Por exemplo, o polímero ou um nucleotídeo pode se referir-se a um polímero ou nucleotídeo ou a uma pluralidade de polímeros ou nucleotídeos. Pela mesma indicação, polímeros e nucleotídeos deveriam referir-se a um polímero ou a um nucleotídeo bem como a uma pluralidade de polímeros ou nucleotídeos a menos que, novamente, seja expressamente declarado ou óbvio a partir do contexto que tal não seja pretendido.
[0093]Quando aqui usado, palavras de aproximação tais como, sem limitação, cerca de”, substancialmente, “essencialmente” e aproximadamente significa que o elemento de limitação desse modo modificado não necessita ser exatamente aquele que é escrito, porém, pode variar a partir dessa descrição escrita em alguma extensão. A extensão da qual a descrição pode variar dependerá de quão grande uma mudança alguém de experiência ordinária na técnica aceitará e ainda considerará o elemento a ter as características e capacidades desse elemento ou limitação. Em geral, porém submeter à discussão precedente, um valor numérico aqui que é modificado por uma palavra de aproximação pode variar do valor declarado por pelo menos ±15%, cerca de ±15%, cerca de ±10%, cerca de ±5%, cerca de ±3%, cerca de ±2%, ou cerca de ±1%. Como um exemplo não específico desta invenção, o segundo bloco de um copolímero de dibloco desta invenção, que contém ambas as espécies catiônicas e aniônicas em pH fisiológico normal, é descrito como sendo substancialmente neutro na carga total e substancialmente hidrofóbico. Experimentalmente, entretanto, é extremamente difícil obter a neutralidade exata e as espécies catiônicas ou as aniônicas podem predominar em alguma extensão como ilustrado na Tabela 1. Alguém de experiência ordinária na técnica, entretanto, aceitará um segundo bloco com um excesso leve de uma ou outra espécie carregada como ainda sendo substancialmente neutra [0094]Quando aqui usado, um 'polímero' refere-se a uma molécula composta
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43/87 de uma ou mais moléculas menores chamadas monômeros. Um monômero pode reagir sozinho para criar um homopolímero ou pode reagir com um ou outros monômeros para criar copolímeros. Grupos de monômeros podem ser reagidos para formar “pré-polímeros”, que são em seguida combinados para formar o polímero. Os monômeros compreendem as “unidades constitucionais” do polímero.
[0095]Uma unidade constitucional de carga neutra ou não carregada refere-se àquela em que nenhum átomo suporta uma carga positiva ou negativa total em pH fisiológico, isto é, moléculas dipolares são ainda consideradas carga neutra ou não carregada. Um exemplo não limitante de uma unidade constitucional de carga neutra seria aquele derivado a partir de metacrilato de butila, monômero CH2=C(CH3)C(O)O(CH2)3CH3.
[0096]Quando aqui usado, alquila refere-se a uma cadeia linear ou ramificada totalmente saturada (nenhuma ligação dupla ou tripla) grupo hidrocarboneto (carbono e hidrogênio apenas). Exemplos de grupos alquila incluem, porém não são limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, sec-butila, butila terciária, pentila e hexila. Quando aqui usado, “alquila” inclui grupos alquileno, que se referem a grupos hidrocarboneto lineares ou ramificados totalmente saturados tendo duas em vez de uma valência aberta para ligação a outros grupos. Exemplos de grupos alquileno incluem, porem não são limitados a metileno, -CH2-, etileno, CH2CH2-, propileno, -CH2CH2CH2-, n-butileno, -CH2CH2CH2CH2-, sec-butileno, CH2CH2CH(CH3)- e similares. Um grupo alquila desta invenção pode opcionalmente ser substituído com um ou mais grupos flúor.
[0097]Quando aqui usado, mC a nC, em que m e n são números inteiros, refere-se ao número de átomos de carbono possíveis no grupo indicado. Isto é, o grupo pode conter de m a n, inclusive, átomos de carbono. Um grupo alquila desta invenção pode compreender de 1 a 10 átomos de carbono, isto é, m é 1 e n é 10. Claro que, um grupo alquila particular pode ser mais limitado. Por exemplo sem limi
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44/87 tação, um grupo alquila desta invenção pode consistir em 3 a 8 átomos de carbono, caso no qual seria designado como um grupo (3C-8C)alquila. Os números são inclusivos e incorporam todas as estruturas de cadeia linear ou ramificada tendo o número indicado de átomos de carbono. Por exemplo sem limitação, um grupo “Ci a C4 alquila” refere-se a todos os grupos alquila tendo de 1 a 4 carbonos, isto é, CH3-, CH3CH2-, CH3CH2CH2-, CH3CH(CH3)-, CH3CH2CH2CH2-, CH3CH2CH(CH3)-, (CH3)2CHCH2- e (CH3)3CH-.
[0098]Quando aqui usado, um grupo cicloalquila refere-se a um grupo alquila em que átomos de carbono finais da cadeia de alquila são covalentemente ligados um ao outro. Os números “m” e “n” referem-se ao número de átomos de carbono no anel formado. Desse modo por exemplo, um grupo (3C-8C) cicloalquila refere-se a anel de três, quatro, cinco, seis, sete ou oito membros, isto é, ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e ciclooctano. Um grupo cicloalquila desta invenção pode opcionalmente ser substituído com um ou mais grupos flúor e/ou um ou mais grupos alquila [0099]Quando aqui usado, “fenila” simplesmente refere-se a um grupo
Qx que, como mostrado, pode opcionalmente ser substituído com um ou mais grupos flúor.
[00100]Quando aqui usada, a porção intensificadora de hidrofobicidade é usada intercambialmente aqui com uma espécie hidrofóbica e refere-se a um substituinte covalentemente ligado a uma unidade constitucional de um copolímero de dibloco, com tais unidades constitucionais suportando as referidas porções intensificadoras de hidrofobicidade resultando no copolímero de dibloco tornando mais desestabilização disruptiva de membrana ou de outra maneira mais de membrana do que seria sem a adição da porção. Exemplos de tais porções incluem, sem limitação, grupos alquila, grupos cicloalquila, e grupos fenila, qualquer dos quais podem ser substituídos com um ou mais átomos de flúor. Em algumas modalidades, a porção
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45/87 intensificadora de hidrofobicidade tem um valor de π de cerca de um ou mais. O calor de π de Composto é uma medida de seu valor hidrofílico-lipofílico relativo (veja, por exemplo, Cates, L.A , Calculation of Drug Solubilities by Pharmacy Students Am. J. Pharm. Educ. 45:11-13 (1981)). Resíduos monoméricos hidrofóbicos ou unidades constitucionais descritas aqui compreendem uma ou mais espécies hidrofóbicas. Entretanto, resíduos monoméricos hidrofílicos compreendem uma ou mais espécies hidrofílicas.
[00101]Com respeito ao polímero exemplar não limitante desta invenção IV1 mostrado acima, um tal polímero seria caracterizado como sendo etilênico em que as unidades constitucionais são derivadas da reação de um etileno, -C=C-, funcionalidade de cada um dos monômeros. Os monômeros etilênicos particulares do exemplo acima podem ser também descritos como sendo acrílicos em que eles são todos derivados de ácido acrílico, CH2=CHC(O)OH, o primeiro monômero acima sendo metacrilato de dimetilaminoetila, o segundo sendo ácido 2-propilacrílico e o terceiro sendo metacrilato de butila.
[00102]Quando aqui usado, “pH fisiológico normal” refere-se ao pH dos fluidos predominantes do corpo de mamífero tal como sangue, soro, o citosol de células normais, etc. Entretanto, quando aqui usado, “pH fisiológico normal”, usado intercambialmente com cerca de pH fisiológico ou cerca de pH neutro, geralmente refere-se a um pH cerca de neutro (isto é, cerca de pH 7), incluindo, por exemplo, em pH que é cerca de 7,2 a cerca de 7,4. Em exemplos específicos, um “pH fisiológico normal” refere-se a um pH que é cerca de neutro em um meio aquoso, tal como sangue, soro ou similares.
[00103]Quando aqui usado, RNA refere-se a um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos A, C, G ou U e DNA refere-se a um polinucleotídeo compreendendo dA, dC, dG e dT, o d indicando que o açúcar é desoxirribose.
[00104]Quando aqui usado, um análogo de DNA natural ou um “análogo
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46/87 de RNA natural, um polinucleotídeo em que um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural são substituídos para os nucleotídeos naturais de um DNA ou RNA particular porém que ainda exibe a funcionalidade do DNA ou RNA original. Isto inclui um nucleotídeo de ocorrência natural em um ambiente não natural, por exemplo, um ribonucleotídeo substituído por um desoxirribonucleotídeo em uma molécula de DNA ou um desoxirribonucleotídeo substituído por um ribonucleotídeo em uma molécula de RNA.
[00105]Quando aqui usado, um análogo de DNA sintético ou um “análogo de RNA sintético” refere-se a um polinucleotídeo compreendido de um ou mais nucleotídeos modificados. Um “nucleotídeo modificado” refere-se a um nucleotídeo de ocorrência natural que compreende uma base quimicamente alterada, açúcar e/ou ligação de fosfodiéster. Alteração química pode envolver a adição, deleção ou substituição de átomos individuais de um nucleotídeo de ocorrência natural ou a adição, deleção de substituição de grupos funcionais inteiros do nucleotídeo. Para os propósitos desta invenção um nucleotídeo modificado pode realmente compreender uma molécula que se assemelha pouco a um nucleotídeo natural, se não todos, porém é todavia capaz de ser incorporado em um polinucleotídeo tendo a estrutura genérica descrita acima. Uma propriedade de um análogo de DNA ou RNA sintético que é tipicamente mantido é que a molécula é geralmente negativamente carregada como são todos os polinucleotídeos naturais de forma que pode complexar-se com um copolímero de dibloco desta invenção.
[00106]Sem ser ligado por teoria não expressamente recitado nas reivindicações, um polímero de desestabilização de membrana pode diretamente ou indiretamente obter uma mudança (por exemplo, uma mudança de permeabilidade) em uma estrutura de membrana celular (por exemplo, uma membrana endossômica) de forma que permita um agente (por exemplo, polinucleotídeo), em associação com ou independente de um polímero, passar através da tal estrutura de membrana - por
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47/87 exemplo entrar uma célula ou sair uma vesícula celular (por exemplo, um endossoma). Um polímero de desestabilização de membrana pode ser (porém não necessariamente) um polímero de ruptura de membrana. Um polímero de ruptura de membrana pode diretamente ou indiretamente obter lise de uma vesícula celular ou ruptura de uma membrana celular (por exemplo, como observado para uma fração substancial de uma população de membranas celulares).
[00107]Geralmente, as propriedades de desestabilização de membrana ou ruptura de membrana de polímeros podem ser avaliadas por vários meios. Em uma abordagem não limitante, uma mudança em uma estrutura de membrana celular pode ser observada avaliando-se em ensaios que mede (diretamente ou indiretamente) a liberação de um agente (por exemplo, polinucleotídeo) de membranas celulares (por exemplo, membranas endossômicas) - por exemplo, determinando-se a presença ou ausência de tal agente, ou uma atividade de tal agente, em um ambiente externo a tal membrana. Outra abordagem não limitante envolve medir lise de eritrócito (hemólise) - por exemplo, como um ensaio substituto para uma membrana celular de interesse. Tais ensaios podem ser feitos em um único valor de pH ou sobre uma faixa de valores de pH.
[00108]É preferido que um copolímero de dibloco fornecido aqui seja biocompatível. Quando aqui usado, “biocompatível” refere-se a uma propriedade de um polímero caracterizado por, ou seus produtos de degradação in vivo, não sendo, ou pelo menos minimamente e/ou reparavelmente, prejudicial a tecido vivo, e/ou não, ou pelo menos minimamente e controláveis, causando uma reação imunológica em tecido vivo. Com respeito a sais, é presentemente preferido que ambas as espécies catiônicas e aniônicas sejam biocompatíveis. Quando aqui usado, fisiologicamente aceitável é intercambiável com biocompatíveis.
[00109]Em certos aspectos, as composições e/ou agentes descritos aqui são usados como agentes terapêuticos in vivo. Por “in vivo” é significado que são pre
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48/87 tendidos ser administrados a indivíduos em necessidade de tal terapia. “Indivíduos” referem-se a qualquer entidade viva que poderia beneficiar-se de tratamento usando os complexos desta invenção. Quando aqui usado, “indivíduo” e “paciente” podem ser usados intercambialmente. Um indivíduo ou paciente refere-se em particular a um mamífero tal como, sem limitação, gato, cachorro, cavalo, vaca, ovelha, coelho, etc, e preferivelmente no momento, um ser humano.
[00110]Quando aqui usado, “agente terapêutico” refere-se a um complexo que, quando administrado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um indivíduo sofrendo de uma doença, tem um efeito benéfico terapêutico na saúde e bemestar do indivíduo. Um efeito benéfico terapêutico na saúde e bem-estar de um indivíduo inclui, porém não é limitado a (1) curar a doença, (2) reduzir o progresso da doença, (3) fazer a doença retroceder, ou, (4) aliviar um ou mais sintomas da doença. Quando aqui usado, um agente terapêutico da mesma forma inclui qualquer complexo aqui que quando administrado a um paciente, conhecido ou suspeito de ser particularmente suscetível a uma doença particular presentemente uma doença genética, tem um efeito benéfico profilático na saúde e bem-estar do paciente. O efeito benéfico profilático na saúde e bem-estar de um paciente inclui, porém não é limitado a (1) prevenir ou atrasar o início da doença em primeiro lugar, (2) manter uma doença em um nível retrogrado uma vez que tal nível foi obtido por uma quantidade terapeuticamente eficaz do complexo, ou, (3) prevenir ou atrasar retorno da doença depois de um curso de tratamento com uma quantidade terapeuticamente eficaz que o complexo concluiu. Em alguns exemplos, um agente terapêutico é um polinucleotídeo terapeuticamente eficaz (por exemplo, um polinucleotídeo de RNAi), um peptídeo terapeuticamente eficaz, um polipeptídeo terapeuticamente eficaz, ou alguma outra biomolécula terapeuticamente eficaz. Em modalidades específicas, um polinucleotídeo de RNAi é um polinucleotídeo que pode mediar inibição de expressão de gene através de um mecanismo de RNAi e inclui porém não é limitado a RNA
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49/87 mensageiro (mRNA), siRNA, microRNA (miRNA), RNA curto em forma de grampo (shRNA), RNA assimetricamente interferente (aiRNA), substrato de dicer e precursores dos mesmos.
[00111]Quando aqui usado, “polimerização viva” refere-se a um método de sintetizar polímeros usando o conceito bem conhecido de polimerização de adição, isto é, polimerização em que os monômeros são adicionados um a um a um sítio ativo na cadeia de polímero crescente porém um em que os sítios ativos para continuar adição de outro monômero nunca são totalmente eliminados de outra maneira do propósito. Isto é, a cadeia de polímero é virtualmente sempre capaz de outra extensão pela adição de mais monômeros à mistura reacional a menos que o polímero fosse tampado, que pode ser reversível para permitir polimerização continuar ou extinguir, que é normalmente permanente. Enquanto numerosos gêneros de polimerizações vivas são conhecidos, atualmente os tipos predominantes são aniônicos, catiônicos e polimerizações vivas de radical. Destes, presentemente polimerização de radical é de interesse particular com respeito a esta invenção. Polimerização de radical envolve um iniciador de radical livre que extrai um dos pi-elétrons da ligação dupla de um monômero etilênico resultando em um elétron não pareado reativo no carbono na outra extremidade da ligação dupla anterior àquela com a qual o iniciador reagiu. O elétron não pareado em seguida reage com a ligação dupla de outro monômero criando uma ligação de sigma estável e outro radical livre assim por diante. Com iniciadores convencionais a sequência é eventualmente parada por uma reação de terminação, geralmente uma reação de combinação em que os elétrons não pareados de duas cadeias de propagação combinam para formar uma cadeia de ligação de sigma estável ou uma desproporção em que um radical em uma cadeia ativa extrai um átomo de hidrogênio de outra cadeia ativa ou de uma impureza na mistura reacional para produzir uma molécula não reativa estável e uma molécula contendo uma ligação dupla. Em uma polimerização in vivo, a capacidade das ca
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50/87 deias crescentes entrar em uma reação de terminação é eliminada, eficazmente limitando a polimerização somente pela quantidade de monômero presente, isto é, a polimerização continua até que o fornecimento de monômero foi exaurido. Neste momento, a espécie de radical livre restante torna-se substancialmente menos ativa devido ao tamponamento do grupo de extremidade de radical livre com tais entidades, sem limitação, radicais de nitroxila, moléculas de halogênio, espécies de oxigênio tais como peróxido e metais ou simplesmente por interação com solvente e similares. Se, porém, mais monômero é adicionado à solução, a reação de polimerização pode resumir exceto como notado acima.
Síntese [00112]Polímeros descritos aqui podem ser preparados de qualquer maneira adequada. Por exemplo, em certas modalidades, em que polímeros desta invenção, enquanto não estando de maneira nenhuma limitados à espécie etilênica, com respeito a tais polímeros, é presentemente particularmente preferido que eles sejam preparados por polimerização viva [00113]Usando a polimerização viva, polímeros de polidispersidade muito baixa ou diferenças no comprimento de cadeia podem ser obtidos. Polidispersidade é normalmente medida dividindo-se o peso molecular médio ponderado das cadeias de polímero pelo seu peso molecular numérico médio. O peso molecular numérico médio é soma de pesos moleculares de cadeia individuais dividido pelo número de cadeias. O peso molecular médio ponderado é proporcional ao quadrado do peso molecular dividido pelo número de moléculas daquele peso molecular. Visto que o peso molecular médio ponderado é sempre maior do que o peso molecular numérico médio, polidispersidade é sempre maior do que ou igual a um. Quando os números chegam mais perto e mais perto de ser o mesmo, isto é, como a polidispersidade aproxima-se de um valor de um, o polímero torna-se mais perto de ser monodisperso em que cada cadeia tem exatamente o mesmo número de unidades constitucio
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51/87 nais. Valores de polidispersidade aproximando-se de um são obteníveis usando polimerização viva de radical. Métodos de determinar polidispersidade tais como, sem limitação, cromatografia de exclusão de tamanho, difusão de luz dinâmica, desabsorção a laser assistida por matriz/cromatografia de ionização e cromatografia de massa de eletrovaporização são bem conhecidos na técnica e não serão também descritos aqui.
[00114]Adição reversível - transferência de cadeia de fragmentação ou RAFT é uma técnica de polimerização viva presentemente preferida para uso na sintetização de polímero de cadeia principal etilênico desta invenção. RAFT é bem conhecida por aqueles versados na técnica e será apenas brevemente descrita aqui. RAFT compreende um processo de transferência de cadeia degenerativa de radical livre. A maioria dos procedimentos de RAFT empregam compostos de tiocarboniltio tais como, sem limitação, ditioésteres, ditiocarbamatos, tritiocarbonatos e xantatos para mediar polimerização por um mecanismo de transferência de cadeia reversível. Reação de um radical polimérico com o grupo C=S de quaisquer dos compostos anteriores leva a formação de intermediários de radial estabilizados. Estes intermediários de radical estabilizados não sofrem as reações de terminação típicas de polimerização de radical padrão porém, de preferência, re-introduzir um radical capaz de re-iniciação ou propagação com monômero, reformando a ligação de C=S no processo. Este ciclo de adição à ligação de C=S seguido por fragmentação do radical garantido continua até que todos os monômero fossem consumidos ou a reação seja extinguida. A baixa concentração de radicais ativos em qualquer tempo particular limita as reações de terminação normais. Em outras modalidades, polímeros são sintetizados por projeto Macromolecular por meio de adição reversível - transferência de cadeia de fragmentação de Xantatos (MADIX) (Direct Synthesis of Double Hydrophilic Statistical Di - and Triblock Copolymers Comprised of Acrylamide and Acrylic Acid Units via the MADIX Process, Daniel Taton, e outro, Macromolecular
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Rapid Communications, 22, No. 18, 1497-1503 (2001).)
Construtores de Polímero:Biomolécula [00115]Fornecidos em certas modalidades aqui são os construtores de polímero:polinucleotídeo, ou outros construtores incluindo, por exemplo, construtores de polímero:biomolécula, construtores de polímero:polipeptídeo ou outros tipos de construtores de polímero:biomolécula. Em certas modalidades, um ou mais polinucleotídeo (por exemplo, siRNA) é associado com qualquer polímero descrito aqui. Em várias modalidades, polinucleotídeo, peptídeos, polipeptídeos, ou outras biomoléculas são conjugadas ao polímero de qualquer maneira adequada (por exemplo, por interações covalentes e/ou não covalentes), e tal conjugação está em qualquer local adequado, incluindo, por exemplo, a extremidade alfa do polímero, a extremidade ômega do polímero, a extremidade hidrofílica do polímero, a extremidade hidrofóbica do polímero, ou em um grupo pendente ligado a uma cadeia lateral de monômero do polímero.
[00116]Quando aqui usado, um polinucleotídeo refere-se a um membro do gênero de moléculas de polímero orgânicas compreendido de uma cadeia linear de monômeros de nucleotídeo covalentemente ligada em uma cadeia, tal como é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Em resumo, um nucleotídeo compreende um nucleosídeo que ligado a um único grupo fosfato (ou, por convenção, ao referir-se a sua incorporação em um polinucleotídeo, uma taquigrafia para um trifosfato de nucleosídeo que é a espécie que atualmente sofre polimerização na presença de uma polimerase). Um nucleosídeo, por sua vez, compreende uma base ligada a uma porção de açúcar. Para polinucleotídeos de ocorrência natural, isto é, polinucleotídeos produzidos por entidades vivas não modificadas, a porção de açúcar é ribose, que dá origem a ácidos ribonucleicos ou RNAs ou desoxirribose, que dão origem a ácidos desoxirribonucleicos ou DNA. As bases de ocorrência natural são adenina (A), guanina (G) ou sua inosina substituta natural (1), citosina (C) ou timina (T) ou sua
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53/87 uracila substituta natural (U). Um polinucleotídeo, em seguida, compreende uma pluralidade de nucleosídeos conectada por uma ligação de fosfodiéster entre o grupo 3hidroxila da porção de açúcar de um nucleosídeo e a 5'-hidroxila da porção de açúcar de um segundo nucleosídeo que por sua vez é ligado através de sua 3'-hidroxila à 5'- de ainda outro nucleosídeo e assim por diante.
[00117]Um DNA ou um RNA desta invenção pode ser sentido ou antissentido. DNA é de filamento duplo, um filamento sendo o filamento de sentido e o outro sendo seu complemento ou filamento antissentido. O filamento de sentido é caracterizado pelo fato de que uma versão de RNA da mesma sequência pode ser transladada em uma proteína. O filamento antissentido não pode participar na mesma sequência. A consequência disto é que a produção de proteína por um DNA particular ou seu RNA mensageiro pode ser interrompida introduzindo-se um polinucleotídeo complementar ou antissentido no estágio apropriado de produção de proteína.
[00118]Em resumo, produção de proteína ocorre em duas fases, transcrição e translação. Em transcrição, DNA é usado como um padrão para criar RNA mensageiro ou mRNA. Na fase de translação, os cursos de mRNA em uma região da célula onde comunica a mensagem genética fornecida pelo DNA ao ribossoma, que é a maquinaria celular que atualmente reúne a proteína codificada pelo DNA. Um polinucleotídeo antissentido, que compreende uma sequência de ácido nucleico que é complementar aquela de um mRNA pode ligar ou hibridizar ao mRNA e o mRNA hibridizado é subsequentemente degradado por um ou mais mecanismos bioquímicos desse modo prevenindo as instruções de mRNA's de alcançar o ribossoma. É presentemente preferido que um polinucleotídeo desta invenção seja um RNA.
[00119]O RNA desta invenção pode ser mRNA de sentido ou antissentido, micro ou miRNA ou RNA de interferência curta, siRNA, mRNA é discutido acima. miRNAs são moléculas de RNA de filamento único cerca de 21 - 23 nucleotídeos no comprimento. Sua função é regular a expressão de gene. miRNAs são codificados
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54/87 por genes que são transcritos a partir de DNA porém não são translados em proteína. De preferência, eles são processados a partir de transcrições primárias conhecem um pri-miRNA em estruturas caule-alça curtas chamadas pre-miRNA e finalmente em miRNA funcional. miRNAs funcionais são parcialmente complementares a um ou mais mRNAs. Como tal, eles realizam os polinucleotídeos antissentido discutidos acima e impedem as instruções de mRNAs de alcançar o ribossoma. Eles desse modo são capazes de sub-regular a expressão de gene.
[00120]Enquanto miRNAs são transcritos a partir do genoma sozinhos, siRNAs, RNAs interferente pequeno ou interferente curto, não são siRNA, visto que sua descoberta em 1999, tornou um dos polinucleotídeos mais estudados no arsenal de biologias moleculares e são atualmente considerados um candidato principal para uma próxima geração de fármacos, visto que eles são potencialmente capazes de silenciar a expressão virtualmente de qualquer gene. Para os propósitos desta invenção, qualquer siRNA atualmente conhecido ou visto que pode tornar-se conhecido no futuro, pode ser usado para formar complexos desta invenção com os copolímeros de dibloco aqui e por isso pode ser transportado no interior de células vivas para, sem limitação, propósitos terapêuticos, profiláticos ou diagnósticos. Inicialmente pensou-se que siRNAs exogenamente adicionados têm que ser de um comprimento específico (21 -23bp) com projeções de 2 bases muito específicas a ser ativas como siRNAs, porém é agora claro que extremidades cegas mais longas ou mais curtas, bem como 27+bp RNAs são exatamente eficazes no silenciamento de gene em células mamíferas. Os siRNAs mais curtos podem ser carregados diretamente no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), enquanto os RNAs de filamento duplo longos podem ser clivados pela endonuclease Dicer de múltiplos domínios citoplásmicos em siRNAs mais curtos no citoplasma. Em resumo, RNA de filamento duplo entra no citoplasma de uma célula. O RNA de filamento duplo longo é processado em 20 a 25 siRNAs de nucleotídeo por uma enzima semelhante à
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RNase III chamada Dicer. O siRNA em seguida reune-se em complexos contendo endorribonuclease conhecidos como complexo de silenciamento induzido por RNA ou RISC. Depois da integração no RISC, o filamento de sentido dos siRNAs de filamento duplo é desenrolado e/ou clivado levando o filamento antissentido de siRNA que guia o RISC em uma molécula de mRNA complementar. O siRNA em seguida liga-se ao mRNA complementar e uma vez que ligado, o RISC cliva o mRNA alvo, eficazmente silenciando o gene associado com este RNA. Outro subgênero de polinucleotídeos que pode formar complexos com copolímeros de diblocos desta invenção e desse modo transportado em células vivas são os assim chamados “ácidos nucleicos fechados” ou polinucleotídeos de LNA. Polinucleotídeos de ácido nucleico fechado podem ser preparados por um número de mecanismos, um dos quais é a formação de uma ligação de metileno de 2'-oxigênio ao 4'-carbono na porção de açúcar de um nucleosídeo, entretanto, o uso de polinucleotídeo de ácido nucleico fechado está dentro do escopo desta invenção. Uma característica de LNAs é sua estabilidade térmica realçada quando hibridizada com DNAs ou RNAs complementares comparados ao DNA:DNA não modificado ou DNA:RNA duplos bem como reconhecimento de ácido nucleico realçado. Estas propriedades tornam os polinucleotídeos de LNA potencialmente úteis em um hospedeiro de aplicação molecular. Por exemplo, uma comparação de um construtor de LNA-DNA-LNA com siRNA, fosforotioato e construtores de 2'-O-metil RNA-DNA contra expressão de subtipo 1 do receptor vanilóide (VRl) em células Cos-7 revelou que, enquanto o siRNA onde os agentes antissentido mais potentes contra expressão de VRl, o construtor de LNADNA-LNA foi 175- e 550- vezes mais potente na supressão de VRl do que o fosforotioato isossequencial e 2'O-metil oligonucleotídeos Grunweller, A, e outro, 2003, NAR, 31:2185-3193.
[00121]Um aspecto desta invenção é um polinucleotídeo ou uma pluralidade de polinucleotídeos que são ligados a ou associados com (por exemplo, de uma
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56/87 maneira covalente e/ou não covalente, incluindo interações iônicas, interações de ligação de hidrogênio, e/ou interações de van der Waals) qualquer polímero descrito aqui. Em certas modalidades, a associação entre o polímero e polinucleotídeo é obtido por ligações covalentes, interações não covalentes, ou combinações dos mesmos. Em modalidades específicas, associações não covalentes do polímero (por exemplo, do primeiro bloco do mesmo) com o polinucleotídeo são usadas. Interações não covalentes incluem, sem limitação, interações iônicas, ligação de hidrogênio e forças de van der Waals porém para os propósitos da presente invenção a interação não covalente compreende interações iônicas. A interação iônica surge entre a unidade constitucional catiônica de um polímero (por exemplo, do primeiro bloco do mesmo) e o polinucleotídeo, que está negativamente carregado em virtude das ligações de fosfodiéster:
[00122]Associação não covalente pode ser obtida por vários métodos adicionais. Os polinucleotídeos e/ou o polímero podem ser modificados com porções químicas que os leva ter uma afinidade para um ao outro, tal como uma ligação, ácido arilborônico - ácido salicilidroxâmico, ziper da leucina ou outros motivos de peptídeo, interações iônicas entre cargas positivas e negativas no polímero e polinucleotídeo, ou outros tipos de ligações de afinidade química não covalente. Adicionalmente, um polinucleotídeo de filamento duplo pode ser complexado a um polímero da presente invenção formando-se um polímero com uma ligação de ranhura secundária ou um agente de intercalação covalentemente ligado ao polímero.
[00123]Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser quimicamente
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57/87 conjugado ao polímero por qualquer técnica de conjugação química padrão. A ligação covalente entre o polímero e o polinucleotídeo pode ser não clivável, ou ligações cliváveis podem ser usadas. Ligações cliváveis particularmente preferidas são ligações de dissulfeto que se dissociam no ambiente de redução do citoplasma. Associação covalente é obtida através de métodos de conjugação químicos, incluindo porém não limitado a ligantes de amina-carboxila, ligantes de amina-sulfidrila, ligantes de amina-carboidrato, ligantes de amina-hidroxila, ligantes de amina-amina, ligantes de carboxila-sulfidrila, ligantes de carboxila-carboidrato, ligantes de carboxilahidroxila, ligantes de carboxila-carboxila, ligantes de sulfidrila-carboidrato, ligantes de sulfidril- hidroxila, ligantes de sulfidrila-sulfidrila, ligantes de carboidrato-hidroxila, e ligantes de carboidrato-carboidrato. Conjugação de ligantes de hidroxila-hidroxila pode da mesma forma ser realizada com ligações sensíveis a pH e ligantes, incluindo, porém não limitada a, hidrazona e ligações de acetal. Uma ampla variedade de químicas de conjugação é estabelecida na técnica (veja, por exemplo, Bwconjugation, Aslam e Dent, Eds, Macmillan, 1998 e capítulos aqui). Polinucleotídeos podem ser conjugados as extremidades alfa ou omega do polímero, ou aos grupos pendentes nos monômeros de polímero.
[00124]Uma série de polímeros e suas respectivas partículas condensadas por siRNA para tamanho e carga de superfície e os dados resultantes são mostrados na Tabela 2.
[00125]Em certos exemplos, polímeros parecem uniméricos (< 10 nm) em solução. Complexos formados a partir de polímeros e siRNA em relações de carga teóricas de 4:1 variados em tamanhos de 85-236 nm, Lá semeado não seria tendência definitiva para os tamanhos complexos com respeito ao teor de BMA. Entretanto, polímero P7 com 48% de teor de BMA no bloco endossomolítico exibiu o tamanho de partícula menor de 85 nm ± 0,20. O restante das partículas tiveram tamanhos de 144 a 236 nm, onde as partículas de tamanho maior foram formadas a partir de po
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58/87 límero 6 que teve 27% de conteúdo de BMA no bloco endossomolítico.
[00126]Tamanhos de partícula de polímero P7/siRNA foram também examinados com relações de carga variando de 1:1 a 8:1, e dados são mostrados na Tabela 3. Tamanhos de partícula de Polímero/siRNA diminuiram dramaticamente quando a relação de carga aumenta com valores de 643 nm ± 0,09 a 1:1 a 54 nm ± 0,27 a 8:1.
[00127]TABELA 2: Tamanho e medidas ζ-potenciais de partículas formuladas com siRNA em uma relação de carga teórica de 4:1 como uma função de composição de metacrilato de butila.
Polímero # Diâmetro (nm) PDI Potencial Zeta (mV) Erro Padrão
P1 166 0,14 1,1 1,32
P2 189 0,09 0,13 0,69
P3 197 0,06 0,47 0,59
P4 144 0,11 0,41 1,2
P5 193 0,32 0,52 0,77
P6 236 0,06 0,67 0,95
P7 85 0,20 0,18 1,0
TABELA 3: Tamanho e medidas ζ-potenciais de partículas formuladas com polímero 7, a composição com o maior teor de butila, e siRNA como uma função de relação de carga.
Relação de Carga Teórica (+-) Diâmetro (nm) PDI Potencial Zeta (mV) Erro Padrão
1:1 643 0,09 0,27 1,1
2:1 530 0,16 0,99 0,91
4:1 85 0,2 0,18 1,01
8:1 54 0,27 0,41 0,81
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59/87 [00128]Em certos exemplos, carga de superfície de complexos de siRNA/polímero, com base em medidas ζ-potenciais, é constatada ser similar e ligeiramente positiva para todos os polímeros (~0,5 mV com uma faixa de 0,13 - 1,1 mV). Além disso, em alguns exemplos, complexos formados a ± de 1:1, 2:1, 4:1, e 8:1 usando polímero 7 não mostrou diferença em cargas de superfície, novamente com valores ligeiramente positivos (0,18-0,99 mV) sem tendência com respeito à relação de carga. Em alguns exemplos, em relações de carga de 1:1, partículas são esperadas ter muito pouca carga de superfície, visto que as cargas de PAA e DMAEMA no segundo bloco equilibram-se entre si. Em vários exemplos, quando a relação de carga aumenta para 2:1, 4:1, e 8:1, alguém esperaria ver aumentos em carga de superfície positiva, porém interessantemente, tal não foi observado. Em alguns exemplos, com quantidades crescentes de polímero, as partículas mudam a morfologia, tornam-se mais firmemente empacotadas. Com relação de carga crescente, é possível que a carga de superfície não seja afetada devido à proteção eficaz das cargas positivas de DMAEMA, visto que muitas cadeias de polímero e siRNA tornam-se empacotadas dentro do núcleo das partículas.
[00129]Em certas modalidades, as alterações em tamanho de partícula e carga de superfície podem ser critérios de projeto relevantes com respeito à captação de complexo por uma célula. Em alguns exemplos, nanopartículas suportando uma carga de superfície positiva facilita a captação por interações eletrostáticas com membranas celulares negativamente carregadas.
[00130]Tanto o polímero quanto complexos de siRNA/polímero foram avaliados quanto a sua capacidade de induzir hemólise de eritrócito em valores de pH relevantes para a série de reação de tráfego endossômico/lisossômico. Hemólise significante não ocorreu para polímeros 1-3. Entretanto, atividade hemolítica dependente de pH relevante foi evidente com polímero 4, e responsabilidade realçada foi encontrada como teor de BMA do bloco endossomolítico aumentado. Polímero 7 exibiu
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60/87 a maior hemólise dependente de pH com essencialmente nenhuma atividade em pH = 7,4, cerca de 25% de hemólise em pH = 6,6, e 85% de hemólise em pH = 5,8. Polímeros 5-7 foram subsequentemente avaliadas para atividade hemolítica em sua forma complexada de siRNA. Complexos formados com polímeros 5-7 em todas as relações de carga testadas foram constatados ser hemolíticos de uma maneira dependente de pH relevante. Além disso, a hemólise exibida por complexos foi aumentada quando comparada com o polímero livre e foi maior em uma relação de carga de 4:1 versus 1:1. Polímero 7 mostrou a maior atividade hemolítica em uma relação de carga de 4:1, sem essencialmente hemólise em pH = 7,4, 60% de hemólise em pH = 6,8, e 100% de hemólise em pH 5,8. Estes dados sugerem que a atividade hemolítica sensível ao pH destes polímeros seja ligado à incorporação da porção intensificadora de hidrofobicidade, metacrilato de butila. Esta descoberta confirma relatórios anteriores sobre polímeros de desestabilização de membrana, sensíveis ao pH que utilizaram a incorporação de porções hidrofóbicas tais como alquil aminas ou grupos aromáticos para realçar a transição hidrofóbica dependente de pH de polímeros funcionalizados de carboxilato.
Rompimento de Membrana e/ou Desestabilização de Membrana [00131]Em certas modalidades, um polímero ou construtor de polímero: polinucleotídeo (isto é, compreendendo qualquer polímero descrito aqui associado com um ou mais polinucleotídeo) é um polímero de rompimento ou desestabilização de membrana celular (isto é, é desestabilização ou rompimento de uma membrana celular). Em certas modalidades, a membrana celular é, por meio de exemplo não limitante, uma membrana extracelular, uma membrana intracelular, uma vesícula, uma organela, um endossoma, um lipossoma, ou uma célula de eritrócito. Em algumas modalidades, quando administrado a uma célula, o polímero de rompimento de membrana ou polímero:polinucleotídeo é liberado na célula. Em certas modalidades, siRNA é um polinucleotídeo preferido a ser associado com um polímero desta inven
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61/87 ção e subsequentemente endocitosado com o polímero no interior de células vivas.
[00132]Endocitose é o processo pelo qual uma substância (por exemplo, um polímero, ou ácido nucleico da presente invenção) ganha entrada em uma célula sem ter que atravessar a membrana plasmática. A substância é envolvida por uma porção da membrana celular que em seguida é comprimida formando uma vesícula intracelular. Uma vez a substância foi endocitosada e o endossoma acidificado, a composição química do polímero é alterada porque o pKa do polímero é selecionado tal que, no pH dentro de um endossoma maduro, aproximadamente 5 - 6,5, o equilíbrio entre as formas não ionizadas e ionizadas das unidades ácidas, isto é, as unidades constitucionais aniônicas de um polímero desta invenção, é trocado para a forma não ionizada. Em contraste com a forma ionizada do polímero, que é relativamente hidrofílica, a forma não ionizada é substancialmente hidrofóbica e capaz de interação, isto é, rompimento de, a membrana endossômica que resulta na liberação da substância no citosol.
[00133]Internalização celular de complexos de siRNA em relações de carga de 4:1 foi investigada usando citometria de fluxo para polímeros P4-P7 com base em suas características endossomolíticas responsivas de pH relevantes. Seguindo 4 horas de exposição a 25 nM de siRNA complexado de polímero, captação celular foi encontrada para positivamente correlatar com teor de BMA do segundo bloco, com polímero P7 mostrando o nível mais alto de captação (23% de células positivas de siRNA) durante este prazo. Complexos positivamente carregados foram previamente demonstrados afetar internalização de complexos de polímero catiônico/ácido nucleico, com complexos positivamente carregados alcançando taxas de internalização mais altas e expressão de transgene. Estes resultados não são provavelmente uma função de carga de superfície ou tamanho, quando todas as partículas exibem a mesma, tamanhos e cargas líquidas ligeiramente positivas (85-236 nm) bem dentro dos limites para endocitose não específica (Tabela 2). De preferência, o efeito sobre
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62/87 a captação pode ser uma função da eficácia endossomolítica do bloco contendo BMA. Com base em resultados de hemólise, quando teor de BMA aumenta, o escape endossômico ocorre em uma extensão maior, desse modo reciclando a partir das diminuições celulares e acúmulo de líquido de siRNA dentro dos aumentos de célula, similar a outros bioconjugados contendo ácido propilacrílico. Com base na repulsão electrostática entre siRNA e membranas celulares, todas as formulações de polímero mostraram captação muito maior (até 25x) por célula do que siRNA não complexado com um veículo (siRNA nu). Internalização de siRNA complexados por até 23% de células apenas depois de 4 horas é extremamente promissora para eficácia terapêutica, visto que a captação cumulativa é provável ser muito maior depois do total de 48 horas de tratamento. Além disso, a atividade de siRNA é considerada ser catalítica, pode ser reciclada dentro do citoplasma para destruir as transcrições de mRNA múltiplo, portanto tendo um efeito multi-geracional a longo prazo.
[00134]A citotoxicidade não específica dos veículos de polímero foi investigada incubando-se células de HeLa na presença dos complexos em relações de carga de 4:1 durante 24 horas. Sobrevivência relativa alta foi observada (>90% depois de 24 horas) para todos os polímeros testados. Polímeros sintéticos, em particular polímeros catiônicos, podem ser associados com citotoxicidade apreciável. Por exemplo, PEI mostrou causar apoptose e/ou necrose em uma variedade de linhagens celulares. Esta toxicidade pode ser reduzida quimicamente modificando-se o segmento de policátion com segmentos hidrofílicos, entretanto, é normalmente um intercâmbio entre a eficácia e toxicidade. Nesta abordagem, o uso de um segundo bloco neutralizado por carga do veículo de liberação de polímero presumivelmente manteve alta sobrevivência de células de HeLa cultivadas in vitro.
[00135]A capacidade dos veículos de efetivamente liberar siRNA foi investigada com experiências de knockdown contra GAPDH com complexos formados a partir de todos os polímeros em relações de carga teóricas de 4:1. Níveis de proteí
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63/87 na de GAPDH foram avaliados 48 horas depois do tratamento com os complexos. Veículos de polímero 1-3 foram ineficazes em redução de extração de níveis de proteína, provavelmente devido a sua incapacidade para mediar fuga endossômica. Entretanto, redução de proteína de GAPDH torna-se evidente com o uso de polímero 4 como um veículo de siRNA. O knockdown da proteína também aumento quando o teor de BMA dos veículos aumentou para 48% do bloco endossomolítico (polímero P7). Polímero P7 mostrou a maior capacidade para mediar o knockdown de siRNA de proteína quando GAPDH foi reduzido para 32% de controle. Além disso, siRNA de controle mostrou redução negligível em níveis de proteína de GAPDH.
[00136]Para também caracterizar a eficácia de veículo, os polímeros foram analisados quanto a sua capacidade de knockdown os níveis de GAPDH mRNA. Similar às medidas de proteína, os polímeros 1-3 obtêm muito pouca redução de sinal de mRNA, como avaliado por RT-PCR. Novamente, os polímeros P4-P7 mostraram o knockdown aumentado de GAPDH quando o teor de BMA do bloco endossomolítico aumentou. Especificamente, o knockdown de GAPDH foi reduzido a 39%, 30%, 31%, e 21 % de controle em uma relação de carga de 4:1, para polímeros P4, P5, P6, e P7, respectivamente. Em geral, os resultados são consistentes com as descobertas de outros grupos que exploram as estratégias de liberação para DNA que tem constatado que a adição de domínios hidrofóbicos, especificamente porções de N-oleíla, resíduos de fenilalanina, e metacrilato de butial, quando utilizados aqui, realça a transfecção.
[00137]Outra investigação na capacidade de P7, que inclui o polímero da Tabela 2 e estruturas similares (incluindo várias versões de P7, tal como P7v6, que é usada intercambialmente aqui com PRx0729v6), para mediar o knockdown de gene foi realizada com respeito à relação de carga e dose de siRNA. Alteração de relações de carga teórica foi constatada afetar grandemente o knockdown de gene. GAPDH foi reduzido para 51%, 42%, 21 %, e 14% de níveis de controle com rela
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64/87 ções de carga de 1:1,2:1,4:1, e 8:1, respectivamente. Particularmente em relações de carga de 4:1 e 8:1, o knockdown de gene foi similar ao veículo comercialmente disponível HiPerFect, onde os níveis de GAPDH foram reduzidos em 80%. De maneira importante, os efeitos em níveis de GAPDH são específicos ao siRNA que é liberado, como quando um siRNA de controle é utilizado em uma relação de carga de 8:1, não há efeito significante em níveis de GAPDH. Alteração da relação de carga pode ter resultado em níveis diferentes de condensação do siRNA dentro das nanopartículas. Experiências de DLS indicaram que teor de copolímero crescente nos complexos resultou em partículas mais condensadas (Tabela 3), e estes estudos funcionais sugerem que mais partículas compactas podem ser interiorizadas mais eficazmente ou com biodisponibilidade de siRNA aumentada. Estas descobertas são consistentes com relatórios anteriores indicando que complexos de DNA/polietilenoimina e DNA/polilisina mais compactos interiorizam em taxas mais altas e alcançam eficiências de transfecção mais altas. Um estudo de dose-resposta usando P7 em uma relação de carga de 4:1 foi conduzida. Embora houvesse pequena resposta em expressão de gene GAPDH em 1 nM ou 5 nM de siRNA, expressão foi reduzida em 77%, 21%, e 12% de controle quando 1o nM, 25 nM, ou 50 nM de siRNA foram liberados usando polímero 7. Este nível de knockdown aproxima-se daquele visto usando 50 nM de HiPerFect, um controle positivo comercialmente disponível. Entretanto, todos os polímeros, incluindo polímero 7, demonstraram biocompatibilidade realçada, quando medidos por citotoxicidade não específica comparada a HiPerFect. Embora os níveis significantes de knockdown de gene com doses mais altas de siRNA (25-50 nM) fossem obtidos, para translação às aplicações in vivo, pode ser mais desejável obter redução significante usando doses inferiores de siRNA para evitar os efeitos sem alvo. Em algumas modalidades, isto é realizado por captação mais eficiente das partículas de polímero/siRNA, talvez melhor realizado por alvejamento de ligantes.
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Usos [00138]Em certas modalidades, os polinucleotídeos desta invenção que são administrados a um indivíduo e finalmente liberados nas células do indivíduo são preferivelmente DNA, RNA ou análogos naturais ou sintéticos dos mesmos. Com respeito ao DNA/RNA e análogos dos mesmos que são capazes de inibir a expressão de genes alvo, estes incluem tais espécies como, sem limitação, polinucleotídeos antissentido, miRNA e siRNA [00139]Doenças que são opcionalmente tratadas usando polímeros e/ou complexos de polímero: polinucleotídeo desta invenção incluem, sem limitação, distúrbios patogênicos, cânceres, doenças inflamatórias, deficiências de enzima, erros inatos de metabolismo, infecções, doenças autoimunes, doenças cardiovasculares, doenças neurológicas, neurodegenerativas, doenças neuromusculares, distúrbios sanguíneos e distúrbios de coagulação.
[00140]Os seguintes exemplos são para propósitos de ilustração e não serão interpretados como limitando a invenção. Todas as publicações recitadas aqui estão aqui incorporadas por referência para a informação para a qual as publicações são citadas.
Exemplos [00141]Em toda a descrição da presente invenção, vários acrônimos e abreviações são usados para descrever monômeros ou resíduos monoméricos derivados de polimerização de tais monômeros. Sem limitação, a menos que de outra maneira notado: BMA (ou a letra B como anotação de taquigrafia equivalente) representa metacrilato de butila ou resíduo monomérico derivado disto, DMAEMA (ou a letra D como anotação de taquigrafia equivalente) representa metacrilato de N,Ndimetilaminoetila ou resíduo monomérico derivado disto, Gal refere-se a galactose ou um resíduo de galactose, opcionalmente incluindo porções de proteção de hidroxila (por exemplo, acetila) ou a um derivado peguilado das mesmas (como descrito
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66/87 abaixo), HPMA representa metacrilato de 2-hidroxipropila ou resíduo monomérico derivado disto, MAA representa ácido metilacrílico ou derivado de resíduo monomérico disto; “MAA(NHS)” representa éster de N-hidroxil-succinimida de ácido metacrílico ou derivado de resíduo monomérico disto, PAA (ou a letra “P” como anotação de taquigrafia equivalente) representa ácido 2-propilacrílico ou resíduo monomérico derivado disto, PEGMA refere-se ao monômero metacrílico peguilado, CH3O(CH2O)7-8OC(O)C(CH3)CH2 ou derivado de resíduo monomérico disto. Em cada caso, qualquer tal designação indica o monômero (incluindo todos os sais, ou análogos iônicos dos mesmos), ou um resíduo monomérico derivado de polimerização do monômero (incluindo todos os sais ou análogos iônicos dos mesmos), e a forma indicada específica é evidente pelo contexto a uma pessoa de experiência na técnica.
Exemplo 1: Preparação de polímeros e copolímeros de dibloco [00142]Polímeros e copolímeros de dibloco da seguinte fórmula geral são preparados:
[A1x-/-A2y]n - [B1X-/-B2y-/-B3z]1-5n
Onde [A1-A2] é o primeiro copolímero de bloco, composto de resíduos de monômeros A1 e A2 [B1-B2-B3] é o segundo copolímero de bloco, composto de resíduos de monômeros B1, B2, B3 x, y, z é a composição de polímero em resíduo de monômero de % em mol n é peso molecular [00143]Copolímeros de dibloco exemplares: [DMAEMA]-[B-/-P/-D] [PEGMAw]-[B-/-P-/-D] [PEGMAw-DMAEMA]-[B-/-P-/-D] [PEGMAw-MAA(NHS)]-[B-/-P-/-D] [DMAEMA-/-MAA(NHS)]-[B/-P-/-D]
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67/87 [HPMA-/-PDSM]-[B-/-P-/-D]
Onde:
B é metacrilato de butila
P é ácido propil acrílico
D é DMAEMA é metacrilato de dimetilaminoetila
PEGMA é metacrilato de polietilenoglicol onde, por exemplo, w = 4-5 ou 7-8 unidades de óxido de etileno)
MAA(NHS) é ácido metilacrílico-N-hidroxi succinamida
HPMA é N-(2-hidroxipropil) metacrilamida
PDSM é metacrilato de piridil dissulfeto [00144]Estes polímeros representam estruturas onde a composição do primeiro bloco do polímero ou copolímero é variada ou quimicamente tratada para criar polímeros onde o primeiro bloco é neutro (por exemplo, PEGMA), catiônico (DMAEMA), aniônico (PEGMA-NHS onde a NHS é hidrolisado ao ácido), anfolítico (DMAEMA-NHS onde a NHS é hidrolisada ao ácido), ou zwitteriônico (por exemplo, fosfato de poli[2-metacriloiloxi-2'trimetilamôniometila]). Além disso, o polímero [PEGMA-PDSM]-[B-P-D] contém uma funcionalidade de piridil dissulfeto no primeiro bloco que pode ser reagida com um siRNA tiolado para formar um conjugado de polímero-siRNA.
Exemplo 1.1: Procedimentos sintéticos gerais para preparação de copolímeros de bloco por RAFT.
A. Agente de transferência de cadeia de RAFT.
[00145]A síntese do agente de transferência de cadeia (CTA), ácido 4Ciano-4-(etilsulfaniltiocarbonil) sulfanilpentanóico (ECT), utilizada para as seguintes polimerizações de RAFT, foi adaptada a partir de um procedimento por Moad e outro, Polymer, 2005, 46(19): 8458-68. Brevemente, etano tiol (4,72 g, 76 mmols) foi adicionado durante 10 minutos a uma suspensão agitada de hidreto de sódio (60% em
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68/87 óleo) (3,15 g, 79 mmols) em éter dietílico (150 ml) a 0°C. A solução foi em seguida permitida agitar durante 10 minutos antes da adição de dissulfeto de carbono (6,0 g, 79 mmols). Tritiocarbonato de S-etila de sódio cru (7,85 g, 0,049 mol) foi coletado por filtração, suspenso em éter dietílico (100 mL), e reagido com Iodo (6,3 g, 0,025 mol). Depois de 1 hora a solução foi filtrada, lavada com tiossulfato de sódio aquoso, e secada em sulfato de sódio. O dissulfeto de bis (etilsulfaniltiocarbonila) cru foi em seguida isolado por evaporação giratória. Uma solução de dissulfeto de bis(etilsulfaniltiocarbonil) (1,37 g, 0,005 mol) e ácido 4,4'-azobis(4-cianopentanóico) (2,10 g, 0,0075 mol) em acetato de etila (50 mL) foi aquecida em refluxo durante 18 horas. Seguindo evaporação giratória o solvente, o ácido 4-Ciano-4 (etilsulfaniltiocarbonil) sulfanilpentanóico cru (ECT) foi isolado por cromatografia de coluna usando sílica gel como a fase estacionária e 50:50 acetato de etila:hexano como o eluente.
B. Agente de transferência de macro-cadeia de metacrilato de Poli(N,Ndimetilaminoetil) (poliDMAEMA (macroCTA) [00146]A polimerização de RAFT de DMAEMA foi conduzida em DMF a 30°C sob uma atmosfera de nitrogênio durante 18 horas usando ECT e 2,2'Azobis(4-metoxi-2,4-dimetil valeronitrila) (V-70) (Wako chemicals) como o iniciador de radical. O monômero inicial para relação de CTA ([CTA]0/[M]0 foi tal que o Mn teórico a conversão a 100% foi 10.000 (g/mol). O CTA inicial para relação de iniciador ([CTAu/[I]u) foi 10 a 1. O agente de transferência de macro cadeia de poliDMAEMA resultante foi isolado por precipitação em 50:50 v:v éter dietílico/pentano. O polímero de resultante foi redissolvido em acetona e subsequentemente precipitado em pentano (x3) e secado durante a noite em vácuo
C. Copolimerização de bloco de DMAEMA, PAA, e BMA de um poli(DMAMEA) macroCTA.
[00147]As quantidades estequiométricas desejadas de DMAEMA, PAA, e
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BMA foram adicionadas a poli(DMAEMA) macroCTA dissolvido em N,Ndimetilformamida (25% em peso de monômero e macroCTA a solvente). Para todas as polimerizações [M]o/[CTA]o e [CTA]o/[I]o foram 250:1 e 10:1 respectivamente. Seguindo a adição de V70 as soluções foram purgadas com nitrogênio durante 30 minutos e permitidas reagir a 30°C durante 18 horas. Os copolímeros de dibloco resultantes foram isolados por precipitação em 50:50 em v:v de éter dietílico/pentano. Os polímeros precipitados foram em seguida redissolvidos em acetona e subsequentemente precipitados em pentano (x3) e secados durante a noite em vácuo. Cromatografia de permeação em gel (GPC) foi usada para determinar os pesos moleculares e polidispersidades (PDI, Mw/Mn) de ambas as amostras de poli(DMAEMA) macroCTA e copolímero de dibloco em DMF com respeito aos padrões de metacrilato de polimetila (SEC Tosoh TSK-GEL colunas de R-3000 e R-4000 (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA) conectado em série a um Viscotek GPCmax VE2001 e refractômetro VE3580 (Viscotek, Houston, TX). DMF de grau de HPLC contendo 1,0% em peso de LiBr foi usado como a fase móvel. Figura 1A resume os pesos moleculares e composições de alguns dos polímeros de RAFT sintetizados (PRx0729v6 é usado intercambialmente com P7v6 neste pedido e em vários pedidos de prioridade.) A Figura 1B resume os pesos moleculares, tamanho de partícula e composições de alguns polímeros sintetizados por RAFT.
Exemplo 1.2. Preparação da copolimerização de segundo bloco (B1-B2-B3) de DMAEMA, PAA, e BMA de um poli(PEGMA) macroCTA.
[00148]As quantidades estequiométricas desejadas de DMAEMA, PAA e BMA foram adicionados ao poli(PEGMA) macroCTA dissolvido em N,Ndimetilformamida (25 % em peso de monômero e macroCTA para solvente). Para todas as polimerizações, [M]o/[CTA]o e [CTA]o/[I]o têm 250:1 e 10:1 respectivamente. Seguindo a adição de AIBN, as soluções foram purgadas com nitrogênio durante 30 min e permitidas reagir a 68oC durante 6-12 h (Figura 2). Os copolímeros de dibloco
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70/87 resultantes foram isolados por precipitação em 50:50 em v:v de dietil éter/pentano. Os polímeros precipitados foram em seguida redissolvidos em acetona e subseqüentemente precipitados em pentano (x3) e secados durante a noite em vácuo. Cromatografia de permeação de gel (GPC) foi usada para determinar os pesos moleculares e polidispersidades (PDI, Mw/Mn) igualmente de poli(PEGMA) macroCTA e amostras de copolímero de dibloco em DMF usando um Viscotek GPCmax VE2001 e refractômetro VE358O (Viscotek, Houston, TX). DMF de grau de HPLC contendo 1,0 % em peso LiBr foi usada como a fase móvel. Espectroscopia de NMR em CDCl3 foi usada para confirmar a estrutura de polímero e calcular a composição dos 2o bloco. Figura 2 resume a síntese de polímero de [PEGMAw]-[B-P-D] onde w = 7-8. As Figuras 3A, 3B e 3C resumem a caracterização do polímero de [PEGMAw]-[B-P-D] onde w = 7-8.
Exemplo 1.3. Preparação e caracterização de co-polímeros de PEGMADMAEMA [00149]Síntese de polímero foi realizada para usar um procedimento similar àquele descrito nos Exemplos 1.1 e 1.2. A relação do PEGM e DMAEMA no primeiro bloco foi variada usando relações de alimento diferentes dos monômeros individuais para criar os co-polímeros descritos na Figura 4.
Exemplo 1.4. Preparação e caracterização de co-polímeros de PEGMAMAA(NHS).
[00150]Síntese de polímero foi realizada como descrito nos Exemplos 1.1 e
1.2 (e resumidos na Figura 5), usando relações de alimentação de monômero para obter a composição desejada do copolímero de 1o bloco. As Figuras 6A, 6B e 6C resumem a síntese e caracterização do polímero de [PEGMAW-MAA(NHS)]-[B-P-D] onde a relação de co-polímero de monômeros no 1o bloco é 70:30. Polímeros contendo NHS podem ser incubados em tampão aquoso (fosfato ou bicarbonato) em pH entre 7,4 e 8,5 durante 1 -4 hrs em temperatura ambiente ou 37oC para gerar a for-
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71/87 ma hidrolisada (ácido).
Exemplo 1.5. Preparação e caracterização de co-polímeros de DMAEMAMAA(NHS).
[00151]Síntese de polímero foi realizada como descrito nos Exemplos 1.1 e 1.2, usando relações de alimentação de monômero para obter a composição desejada do copolímero de 1o bloco. As Figuras 7A, 7B e 7C resumem a síntese e caracterização do polímero de [DMAEMA-MAA(NHS)]-[B-P-D] onde a relação de copolímero de monômeros no 1o bloco é 70:30. Polímeros contendo NHS podem ser incubados em tampão aquoso (fosfato ou bicarbonato) em pH entre 7,4 e 8,5 durante 1-4 hrs em temperatura ambiente ou 37oC para gerar a forma hidrolisada (ácida),
Exemplo 2. Preparação e caracterização de conjugados de co-polímero de HPMA-PDS(RNA) para liberação de fármaco de siRNA
A. Síntese de monômero de metacrilato piridil dissulfeto (PDSMA) [00152]O esquema de síntese para PDSMA é resumido na Figura 8. Aldritiol2TM (5 g, 22 59 mmol) foi dissolvido em 40 ml de metanol e 1,8 ml de AcOH. A solução foi adicionada como uma solução de HCl de 2-aminoetanotiol (1,28 g, 11,30 mmol) em 20 ml de metanol durante 30 min. A reação foi agitada sob N2 durante 48h em R.T. Depois da evaporação de solventes, o óleo residual foi lavado duas vezes com 40 ml de éter dietílico. O composto cru foi dissolvido em 10 ml de metanol e o produto foi precipitado duas vezes com 50 ml de éter dietílico para adquirir o composto desejado 1 como sólido amarelo leve. Rendimento 95%.
[00153]Piridina ditioetilamina (1, 6,7 g, 30,07 mmol) e trietilamina (4,23 ml, 30,37 mmol) foi dissolvido em DMF (25ml) e piridina (25 ml) e cloreto de metacriloíla (3,33 ml, 33,08 mmol) foi adicionado lentamente por meio de seringa a 0oC. A mistura reacional foi agitada durante 2 h em R.T. Depois da reação, a reação foi extinguida por NaHCO3 sat. (350 ml) e extraída por acetato de etila (350 ml). A camada orgânica combinada foi também lavada por HCl a 10% (100 ml, 1 vez) e água pura
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72/87 (100 ml, 2 vezes) e secada por MaSO4. O produto puro foi purificado por cromatografia de coluna (EA/Hex 1/10 a 2/1) como xarope amarelo Rf = 028 (EA/Hex = 1/1). Rendimento 55%.
B. Síntese de co-polímero de HPMA-PDSMA [00154]A polimerização de RAFT de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) e metacrilato de piridil dissulfeto (tipicamente em uma relação de monômero de 70:30) é conduzida em DMF (50 peso por cento de monômero:solvente) a 68oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante 8 horas usando 2,2'-azo-d/s-isobutirilnitrila (AIBN) como o iniciador de radical livre (Figura 9). A relação molar de CTA para AIBN é de 10 a 1 e a relação de monômero para CTA é fixada de forma que um peso molecular de 25.000 g/mol seria obtido no caso da conversão a 100%. O poli(HPMA-PDS) macro-CTA foi isolado por precipitação repetida em éter dietílico de metanol.
[00155]O macro-CTA é secado sob vácuo durante 24 horas e em seguida usado para copolimerização de bloco de metacrilato de dimetilaminoetila (DMAEMA), ácido propilacrílico (PAA), e metacrilato de butila (BMA). Quantidades equimolares de DMAEMA, PAA, e BMA ([M]o/[CTA]o = 250) são adicionadas ao HPMA-PDS macroCTA dissolvido em N,N-dimetilformamida (25 % em peso de monômero e macroCTA ao solvente). O iniciador de radical AIBN é adicionado com uma relação de CTA para iniciador de 10 para 1. A polimerização é permitida proceder sob uma atmosfera de nitrogênio durante 8 horas a 68oC. Posteriormente, o polímero de dibloco resultante é isolado por precipitação 4 vezes em 50:50 de éter dietílico/pentano, redissolvendo em etanol entre as precipitações. O produto é em seguida lavado 1 vez com éter dietílico e secado durante a noite em vácuo.
C. Conjugação de siRNA em co-polímero para co-polímero de HPMAPDSMA [00156]siRNA tiolado foi obtido comercialmente (Agilent, Boulder, CO) como
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73/87 um RNA dúplex com um filamento de 5'-sentido modificado por dissulfeto. A forma de tiol livre para conjugação é preparada dissolvendo-se o composto liofilizado em água e tratada durante 1 hora com o agente de redução de dissulfeto TCEP imobilizado dentro de um gel de agarose. O RNA reduzido (400 μΜ) foi em seguida reagido durante 24 horas com o polímero funcionalizado de piridil dissulfeto em tampão de fosfato (pH 7) contendo 5 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) (Figura 9)· [00157]A reação do polímero de piridil dissulfeto com o RNA tiol cria 2piridinationa, que pode ser espectrofotometricamente medida para caracterizar a eficiência da conjugação. Para também validar a troca de dissulfeto, os conjugados são conduzidos em um gel de tricina a 16,5% de SDS-PAGE. Em paralelo, as alíquotas das reações da conjugação com TCEP imobilizado antes de SDS-PAGE para verificar a liberação do RNA do polímero em um ambiente de reação. As reações da conjugação são conduzidas em estequiometrias de polímero/RNA de 1, 2, e 5. Medidas de absorvência espectrofotométrica de UV em 343 nm para liberação de 2piridinationa são usadas para medir as eficiências da conjugação.
Exemplo 3: Caracterização de complexo de siRNA/polímero.
[00158]Após a verificação da complexação de siRNA estável ao soro, completa por meio do retardamento de gel de agarose, complexos de siRNA/polímero foram caracterizados quanto ao tamanho e potencial zeta usando um detector de ZetaPALS (Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, laser de 15 mW, feixe incidente = 676 nm). Brevemente, o polímero foi formulado em 0,1 mg/ml em solução salina tamponada por fosfato (PBS, Gibco) e os complexos foram formados por adição de polímero em siRNA de GAPDH (Ambion) nas relações de carga teórica indicadas com base em DMAEMA positivamente carregado, que é 50% protonado em pH=7 4 e siRNA negativamente carregado. As funções da correlação foram coletadas em um ângulo de dispersão de 90oC, e os tamanhos de partícula foram
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74/87 calculados usando a viscosidade e índice refrativo de água a 25oC. Tamanhos de partícula são expressos como diâmetros eficazes que assumem uma distribuição normal de log. As mobilidades eletroforéticas médias foram medidas a 25oC usando o software de análise potencial zeta ZetaPALS, e os potenciais zeta foram calculados usando o modelo de Smoluchowsky para suspensões aquosas.
Exemplo 4: Cultura de célula HeLa [00159]Células de carcinoma cervical humano, HeLas (ATCC CCL-2), foram mantidas em meios essenciais mínimos (MEM) contendo L-glutamina (Gibco), 1% de penicilina-estreptomicina (Gibco), e 10% de soro bovino fetal (FBS, Invitrogen) à 37oC e 5% de CO2.
Exemplo 5: Rompimento de membrana dependente de pH de veículos e complexos de siRNA/polímero.
[00160]Hemólise foi usada para determinar a atividade endosomolítica de potencial de ambos polímero livre e conjugados de siRNA/polímero em valores de pH que imitam o tráfego endossômico (pH extracelular = 7,4, pH de endossoma precoce = 6,6, e pH de endossoma recente = 5,8). Brevemente, o sangue humano total foi coletado em vaccutainers contendo EDTA. O sangue foi centrifugado, o plasma aspirado, e lavado três vezes em NaCl a 150 mM para isolar as hemácias (RBC). RBC foram em seguida ressuspensas em tampão de fosfato (PB) em pH 7,4, pH 6,6, ou pH 5,8. Os polímeros (10 ug/ml) ou complexos de polímero/siRNA foram em seguida incubados com as RBC nos três valores de pH durante 1 hora a 37oC. RBC intactas foram em seguida centrifugadas e a hemoglobina liberada em sobrenadante foi medida por absorvência em 541 nm como uma indicação de lise de membrana de RBC dependente de pH. Figura 10A mostra a hemólise de polímeros em uma concentração de 10 pg/ml e Figura 10B mostra os complexos de polímero/siRNA de polímeros 5-7 em relações de carga teórica de 1:1 e 4:1. A atividade hemolítica foi normalizada em relação a um controle positivo, 1% em v/v de Triton X-100 e são
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75/87 dados representativos de uma única experiência conduzida em triplicate + desvio padrão.
Exemplo 6: Medida de captação de siRNA mediada por veículo [00161]Captação intracelular de complexos de siRNA/polímero foi medida usando citometria de fluxo (analisador de bancada Becton Dickinson LSR). HeLas foram semeadas em 15.000 células/cm2 e permitidas aderir durante a noite. SiRNA rotulado por FAM (5-carboxifluorescina) (Ambion) foi complexado com polímero em uma relação de carga teórica de 4:1 durante 30 mm em temperatura ambiente e em seguida adicionado às HeLas semeadas em uma concentração de siRNA final de 25 nM. Após a incubação com os complexos durante 4 h, as células foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS com 0,5% de BSA e 0,01% de azul tripano. Azul tripano foi utilizado como previamente descrito para extinção da fluorescência extracelular e a discriminação dos complexos que foram endocitosados por células. 10.000 células foram analisadas por amostra e a passagem da fluorescência foi determinada usando amostras que não receberam tratamento e polímero não complexado com siRNA rotulado por FAM. Figura 11 mostra as internalização de célula HeLa de SiRNA rotulado por FAM e complexos de polímero/siRNA formados com 4-7 polímeros e liberados durante 4 h. Os dados são das três experiências independentes conduzidas em triplicata com barras de erro representado o erro padrão da média (SEM).
Exemplo 7: Citotoxicidade de complexo de siRN A/polímero [00162]A citotoxicidade de complexo de siRNA/polímero foi determinada usando o kit de detecção de citotoxicidade de lactato desidrogenase (LDH) (Roche). As células HeLa foram semeadas em placas de 96 cavidades em uma densidade de 12.000 células por cavidade e permitidas aderir. Os complexos foram formados por adição de polímero (0,1 mg/ml de soluções de matéria-prima) em siRNA de GAPDH em relações de carga teórica de 4:1 e para atingir uma concentração de 25 nM de siRNA/cavidade. Os complexos (relação de carga = 4:1) foram adicionados em cavi
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76/87 dades em triplicata. Depois que as células foram incubadas durante 24 horas com os complexos de polímero, os meios foram removidos e as células foram lavadas duas vezes com PBS. As células foram em seguida lisadas com tampão de lise (100 uL/cavidade, 20 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de Na2EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de βglicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio) durante 1 hora a 4oC. Depois de misturar através de pipetagem, 20 uL do lisado celular foram diluídos 1:5 em PBS e quantificados para lactato desidrogenase (LDH) misturando com 100 uL da solução de substrato de LDH. Depois de uma incubação de 10-20 min para formação da cor, a absorvência foi medida em 490 nm com a referência fixada em 650 nm.
[00163]Figura 12A mostra a citotoxicidade de HeLa não específica e Figura 12B mostra o knockdown de GAPDH como uma função de veículo de polímero de siRNA. As células HeLa foram transfectadas com siRNA contra GAPDH em 25 nM usando complexos de polímero/siRNA formulados em relações de carga teórica de 4:1. (A) Depois de 24 h, o lisado celular foi coletado e analisado quanto ao lactato desidrogenase, uma medida da viabilidade celular, e os dados são mostrados em relação às células não tratadas. (B) Depois de 48 h, ambos níveis de proteína (preta) e de mRNA (branco) foram examinados usando um ensaio de atividade de enzima de GAPDH e RT-PCR, respectivamente, e os dados são mostrados em relação às células que não recebem tratamento. Os dados são de três experiências independentes administradas em triplicata com barras de erro que representam o desvio padrão.
Exemplo 8: Avaliação de proteína de GAPDH e knockdown de gene por complexos de siRNA/polímero [00164]A eficácia das séries de polímeros para liberação de siRNA foi avaliada usando um ensaio de atividade de GAPDH (Ambion). HeLas (12.000 células/cm2) foram semeadas em placas de 96 cavidades. Após 24 h, os complexos (re
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11/81 lações de carga = 4:1) foram adicionados às células em uma concentração de siRNA final de 25 nM na presença de 10% de soro. A extensão da redução de proteína de GAPDH mediada por siRNA foi avaliada 48 h. pós-transfecção. Como um controle positivo, experiências de knockdown paralelas foram conduzidas usando HiPerFect (Qiagen) seguindo as condições do fabricante. A atividade de GAPDH restante foi medida como descrito pelo fabricante que usa o método de aumento de fluorescência cinético durante 5 min. e foi calculada de acordo com a seguinte equação: % de expressão restante = fluorescência, GAPDH / fluorescência, nenhum tratamento onde _fluorescência = fluorescência-5min-fluorescência 1min. O procedimento de transfecção não afetou a expressão de GAPDH significativamente quando uma sequência não alvejadora de siRNA foi usada. Figura 13A mostra o knockdown de GAPDH em HeLas medidas por RT-PCR em tempo real 48 h depois do tratamento com complexos como uma função de relação de carga (1:1-8:1) e Figura 13B mostra o knockdown de GAPDH em HeLas medidas por RT-PCR em tempo real 48 h depois do tratamento com complexos como uma função da dose de siRNA de (1-50 nM) com polímero 1 como o veículo. siRNA #1 de controle negativo (Ambion) e um reagente de transfecção comercialmente disponível, HiPerFect (Qiagen), foram usados como controles positivos e negativos, respectivamente.
[00165]Depois da avaliação inicial para identificar o veículo que produziu o knockdown de GAPDH mediado por siRNA mais robusto, a reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa em tempo real (RT-PCR) foi usada para avaliar diretamente a liberação de siRNA. Depois de 48 horas de incubação com complexos como formado acima, as células foram enxaguadas com PBS. O RNA total foi isolado usando Qiagen's Qiashredder e mini kit Rneasy. Qualquer DNA genômico residual nas amostras foi digerido (RNase-Free Dnase Set, Qiagen) e RNA foi quantificado usando o ensaio de RiboGreen (Molecular Probes) com base nas instruções do fabricante.
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78/87 [00166]A transcrição reversa foi realizada usando o kit Omniscript RT (Qiagen). Uma amostra de RNA total de 25 ng foi usada para síntese de cDNA e PCR foi conduzida usando o Sistema de Detecção de Sequência de ABI 7000 usando o iniciador pré-projetado e conjuntos de sonda (Assays on Demand, Applied Biosystems) para GAPDH e beta-actina como o gene de manutenção. As reações (20 pl total) consistiram em 10 pL de 2X Taqman Universal PCR Mastermix, 1 pL de iniciador/sonda, e 2 pL de cDNA, trazidos até 20 pL com água livre de nuclease (Ambion). Os seguintes parâmetros de PCR foram utilizados: 95oC durante 90 s seguido por 45 ciclos de 95oC durante 30 s e 55oC durante 60 s. A análise do ciclo limiar (CT) foi usada para quantificar GAPDH, normalizada em beta-actina e em relação à expressão de HeLas não tratadas.
Exemplo 9. Projeto Funcional de poli[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)].
[00167]Figura 14 mostra o projeto de polímero para Poli[HPMA]-b[(PAA)(BMA)(DMAEMA)]. Propriedades multifuncionais foram incorporadas por meio de estratégias de síntese de polímero de RAFT usando um CTA funcionalizado em extremidade de piridil dissulfeto para formar uma arquitetura de dibloco projetada para possuir solubilidade aquosa e propriedades de desestabilização de membrana dependente de pH. As funcionalidades químicas de monômero realçadas na Figura 14 foram selecionadas para produzir as propriedades desejadas para cada bloco de polímero. De maneira importante, o módulo 3 foi projetado para ficar próximo a neutralidade de carga em pH fisiológico (aproximadamente 50% de protonação de DMAEMA e 50% de desprotonação predita de PAA) e sofrer uma transição para um estado positivamente carregado e mais hidrofóbico em ambientes de pH inferiores.
Exemplo 10. Síntese de piridil dissulfeto-CTA.
[00168]O precursor de ácido 4-ciano-4-(etilsulfaniltiocarbonil) sulfanilpentanoico (ECT) foi sintetizado como mostrado na Figura 15. O agente de transferência de cadeia de RAFT funcionalizado de piridil dissulfeto (CTA) foi sintetizado conver
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79/87 tendo-se primeiro ECT ao éster de NHS seguido por reação com piridilditio-etilamina. ECT (1,05 g, 4 mmol) e N-hidroxissuccinimida (0,460 g, 4 mmol) foram dissolvidos em 100 mL de clorofórmio. Uma mistura foi em seguida resfriada a 0oC tempo no qual N,N' dicicloexilcarbodiimida (0,865 mg, 4,2 mmol) foi adicionada. A solução foi mantida a 0oC durante 1 hora e em seguida permitida reagir em temperatura ambiente durante 22 horas. A solução foi em seguida filtrada para removedor a dicicloexil ureia e a solução concentrada por meio de evaporação giratória. O sólido resultante foi em seguida secado sob vácuo e usado sem qualquer outra purificação. NHS ECT (1,80 g, 5,0 mmol) e piridilditio-etilamina (0,90 g, 5,0 mmoL) foi em seguida separadamente dissolvido em 200 e 300 mL de clorofórmio, respectivamente. A solução de piridilditio-etilamina foi em seguida adicionada gota a gota como três frações 20 minutos separadamente. A mistura foi em seguida permitida reagir em temperatura ambiente durante 2 horas. Depois da remoção do solvente, duas cromatografias de coluna sucessivas (Sílica gel 60, Merk) foram realizadas (acetato de etila:hexano 50:50; acetato de etila:hexano 70:30 em v/v) produzindo um sólido laranja viscoso. 1H NMR 200MHz (CDC13, RT, ppm) 1,29-1,41 [t, CH3CH2S: 3H], 1,85-1,93 [s, (CH3)C(CN): 3H], 2,33-2,59 [m, C(CH3)(CN)(CH2CH2): 4H], 2,86-2,97 [t, CH2SS: 2H], 3,50-3,61 [t, NHCH2: 2H], 7,11-7,22 [m, Ar meta CH: 1H], 7,46-7,52 [m, Ar CH Orto: 1 H], 7,53-7,62 [br, NH: 1H], 7,53-7,68 [m, Ar meta CH: 1 H], 8,47-8,60 [m, meta CHN, 1 H].
[00169]Preparação de Polímero Reativo ao Tiol:Polimerização de RAFT de poli[HPMA]-b-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)] Funcionalizado de Piridil Dissulfeto. A polimerização de RAFT de N-(2-hidroxipropil) metacrilamida (HPMA) foi conduzida em metanol (50 por cento em peso de monômero:solvente) a 70oC sob uma atmosfera de nitrogênio durante 8 horas usando 2,2'-azo-bis-isobutirilnitrila (AIBN) como iniciador de radical livre. A relação molar de CTA para AIBN foi de 10 para 1 e a relação de monômero para CTA foi fixada de forma que um peso molecular de 25.000 g/mol
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80/87 seja obtido no caso de uma conversão a 100%. O Poli(HPMA) macro-CTA foi isolado por precipitação repetida em éter dietílico de metanol.
[00170]O macro-CTA foi secado sob vácuo durante 24 horas e em seguida usado para copolimerização de bloco de metacrilato de dimetilaminoetila (DMAEMA), ácido propilacrílico (PAA), e metacrilato de butila (BMA). Quantidades equimolares de DMAEMA, PAA, e BMA ([M]o/[CTA]o = 250) são adicionadas ao HPMA macroCTA dissolvido em N,N-dimetilformamida (25 % em peso de monômero e macroCTA ao solvente). O iniciador de radical V70 foi adicionado com uma relação de CTA para iniciador de 10 para 1. A polimerização foi permitida proceder sob uma atmosfera de nitrogênio durante 8 horas a 30oC. Posteriormente, o polímero de dibloco resultante foi isolado por precipitação 4 vezes em 50:50 de éter dietílico/pentano, redissolvendo em etanol entre as precipitações. O produto é em seguida lavado 1 vez com éter dietílico e secado durante a noite em vácuo.
[00171]Cromatografia de permeação de gel (GPC) foi usada para determinar os pesos moleculares e polidispersidades (Mw/Mn) igualmente de poli(HPMA) macroCTA e o copolímero de dibloco em DMF. Os cálculos do peso molecular foram baseados nas vezes de eluição de coluna em relação aos padrões de metacrilato de polimetila usando DMF de grau de HPLC contendo 0,1 % em peso de LiBr a 60oC como a fase móvel. Cloridrato de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) foi usado para reduzir o piridil dissulfeto de extremidade de polímero, liberando 2-piridinationa. Com base no peso molecular de polímero experimentalmente determinado e o coeficiente de extinção molar de 2-piridinationa em 343 nm (8080 M-1 cm-1) em solventes aquosos, o percentual da preservação do grupo final foi determinado para o poli(HPMA) macroCTA e o copolímero de dibloco.
Exemplo 11. Conjugação de Polímero-Peptídeo [00172]A fusão com o transporte de peptídeo de domínio de transdução de peptídeo (da mesma forma conhecido como a sequência de peptídeo de Antenna
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81/87 pedia (Antp) na sequência foi utilizada para sintetizar uma forma de internalização de célula do peptídeo Bak-BH3 (Antp-BH3) contendo um resíduo de cisteína de terminal carbóxi (NH2-RQIKIWFQNRRMKWKKMGQVGRQLAIIGDDINRRYDSCCOOH). Para garantir os tióis livres para conjugação, o peptídeo foi reconstituído em água e tratado durante 1 hora o agente de redução de dissulfeto TCEP imobilizado dentro de um gel de agarose. O peptídeo reduzido (400 pM) foi em seguida reagido durante 24 horas com o polímero funcionalizado de extremidade de piridil dissulfeto em tampão de fosfato (pH 7) contendo 5 mM de ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA).
[00173]Como mostrado na Figura 16, a reação do grupo final de polímero de piridil dissulfeto com o peptídeo cisteína cria 2-piridinationa, que pode ser espectrofotometricamente medida para caracterizar a eficiência da conjugação. Para também validar a troca de dissulfeto, os conjugados foram conduzidos em um gel de tricina a 16,5% de SDS-PAGE. Em paralelo, as alíquotas das reações de conjugação foram tratadas com TCEP imobilizado antes de SDS-PAGE verificar a liberação do peptídeo do polímero em um ambiente de redução.
[00174]As reações de conjugação foram conduzidas em estequiometrias de polímero/peptídeo de 1, 2, e 5. Medidas de absorvência espectrofotométrica de UV em 343 nm para liberação de 2-piridinationa indicou eficiências de conjugação de 40%, 75%, e 80%, respectivamente (mols de 2-piridinationa/mols de peptídeo). Um gel de SDS PAGE foi utilizado para também caracterizar os conjugados de peptídeopolímero (Figura 17). Em uma relação molar de polímero/peptídeo de 1, uma quantidade detectável do peptídeo formou dímeros por ponte de dissulfeto através da cisteína terminal. Entretanto, a reação de tiol para o piridil dissulfeto foi favorecida, e a faixa de peptídeo livre não foi mais visível em relações de polímero/peptídeo iguais a ou maior que 2 (Figura 17 A). Tratando-se os conjugados com o agente de redução TCEP, foi possível clivar as ligações de dissulfeto de polímero-peptídeo como indi
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82/87 cado pelo aparecimento da faixa de peptídeo nestas amostras (Figura 17 B).
EXEMPLO 12. PROPRIEDADES DE DESESTABILIZAÇÃO DE MEMBRANA DEPENDENTE DE PH DE POLI[HPMA]-B-[(PAA)(BMA)(DMAEMA)] [00175]Para avaliar o potencial do polímero para atividade endosomolítica, um ensaio de rompimento de membrana foi utilizado para medir capacidade do polímero ativar o rompimento dependente de pH das membranas de bicamada de lipídio como mostrado na Figura 18. Sangue humano total foi retirado e centrifugado para remoção do plasma. Os eritrócitos restantes foram lavados três vezes com 150 mM de NaCl e ressuspensos em tampões de fosfato que correspondem aos ambientes de endossoma (pH 6,6) precoce, fisiológico (pH 7,4), e endossoma recente (pH 5,8). O polímero (1-40 pg/mL) ou 1% de Triton X-100 foi adicionado às suspensões de eritrócito e incubado durante 1 hora a 37oC. Eritrócitos intactos foram peletados por centrifugação, e o teor de hemoglobina dentro do sobrenadante foi medido por meio de absorvência em 541 nm. O percentual de hemólise foi determinada em relação a Triton X-100. Hemólise do polímero foi quantificada em concentrações que variam de 1-40 pg/mL em relação a 1% em v/v de Triton X-100. Esta experiência foi concluída 2 vezes em triplicata, produzindo resultados similares. Os dados mostrados representam uma única experiência conduzida em triplicata + desvio-padrão.
[00176]Hemólise de hemácias mede as propriedades de rompimento de membrana dependentes de pH do copolímero de dibloco em valores de pH imitando os ambientes endossômicos (6,6) precoce, fisiológico (7,4), e endossômicos recentes (5,8). Em pH fisiológico, nenhum rompimento de membrana de hemácias significante foi observado até mesmo em concentrações de polímero tão altas quanto 40 pg/mL (Figura 18). Entretanto, quando o pH foi diminuído para valores endossômicos, um aumento significante na hemólise foi detectado, com maior rompimento de membrana em pH 5,8 comparado a 6,6. O comportamento hemolítico do polímero correlacionou-se à concentração do polímero, com quase 70% de lise de eritrócito
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83/87 ocorrendo em 40 pg/mL de polímero em tampão de pH 5,8. Esta “mudança” abrupta em uma conformação de desestabilização de membrana em pH endossômico combinado com atividade de membrana desprezível na faixa de pH fisiológico indica o potencial para este polímero como um veículo de liberação intracelular não tóxico.
EXEMPLO 13. CARACTERIZAÇÃO DE LIBERAÇÃO INTRACELULAR EM CÉLULAS HELA [00177]Células de carcinoma cervical humano, HeLas (ATCC CCL-2), foram mantidas em meios essenciais mínimos (MEM) contendo L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina, e 10% de FBS. Antes das experiências, as HeLas foram permitidos aderir durante a noite em lâminas de câmara de 8 cavidades (20.000 células/cavidade) para microscopia ou placas de 96 cavidades (10.000 células/cavidade) para de outros ensaios. Os conjugados de polímero-peptídeo e os controles foram adicionados em MEM com 1% de FBS.
[00178]O potencial de liberação intracelular de polímero foi avaliado após a bioconjugação ao peptídeo Bak-BH3 fundido com o peptídeo de penetração de célula de Antp (penetratin). A fusão de BH3 em Antp foi estudada extensivamente como um domínio de translocação de célula e foi previamente constatada ativar a sinalização apoptótica (Li e outro, Neoplasia (New York, N.Y. 2007; 9(10):801-811). Entretanto, acredita-se que terapêuticos liberados por meio de domínios de transdução peptídicos podem sofrer de potência impedida devido ao seqüestro dentro de vesículas intracelulares (Sugita e outro, British Journal of Pharmacology. 2008, 153(6): 1143-1152). Os seguintes estudos in vitro demonstram que a liberação citoplásmica de peptídeo Antp-BH3 combinada e uma funcionalidade pró-apoptótica foram realçadas por conjugação ao polímero de dibloco.
[00179]Análise Microscópica de Escape Endossômico de Conjugado Um éster de succinimidila de Alexa-488 reativo à amina foi misturado em uma relação molar de 1 para 1 com o peptídeo de Antp-BH3 em dimetil formamida anidrosa (DMF).
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Fluoróforo não reagido e solvente orgânico foram removidos usando uma coluna de dessalinização de PD10, e o peptídeo fluorescentemente rotulado foi liofilizado. Antp-BH3 rotulado por Alexa-488 foi conjugado ao polímero como descrito acima. O conjugado de peptídeo livre ou polímero-peptídeo foi aplicado em HeLas crescidas em lâminas de microscópio em câmaras em uma concentração de 25 ,uM de AntpBH3. As células foram tratadas 15 minutos, lavadas duas vezes com PBS, e incubadas em meios frescos durante mais 30 minutos. As amostras foram lavadas novamente e fixadas com 4% de paraformaldeído durante 10 minutos a 37oC. As lâminas foram montados com reagente ProLong Gold Antifade contendo DAPI e imageadas usando um microscópio fluorescente.
[00180]Para estudar os efeitos de conjugação de polímero em escapes endossômicos de peptídeo, o peptídeo rotulado por Alexa-488 foi analisado por microscopia fluorescente. O peptídeo fluorescentemente rotulado foi liberado sozinho ou como o bioconjugado de polímero. A análise microscópica revelou diferenças claras na localização intracelular de peptídeo após a conjugação de polímero (Figura 19). O peptídeo sozinho mostrou o manchamento pontilhado, indicativo da compartimentalização endossômica. O conjugado de polímero-peptídeo liberado de amostras exibiu um padrão de fluorescência dispersa, consistente com a difusão de peptídeo ao longo do citoplasma. Imagens representativas que ilustram (Figura 19A) o manchamento de peptídeo pontilhado (verde) no peptídeo liberado das amostras sozinho e (Figura 19B) fluorescência de peptídeo disperso dentro do citosol após a liberação do conjugado de peptídeo-polímero. As amostras foram tratadas durante 15 minutos com 25 uM de peptídeo e preparadas para exame microscópico após manchamento nuclear de DAPI (azul).
[00181]Medida de Citotoxicidade de Conjugado. A eficácia do bioconjugado para ativar a morte de célula de tumor foi determinada usando um ensaio de citotoxicidade de lactato desidrogenase (LDH). Ao término de cada ponto de tempo, as
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85/87 células foram lavadas duas vezes com PBS e em seguida lisadas com tampão de lise celular (100 pL/cavidade, 20 mM de Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de Na2EDTA, 1 mM de EGTA, 1% de Triton, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sódio) durante 1 hora a 4oC. 20 pl de lisado de cada amostra foram diluídos em 80 pl de PBS, e LDH foi quantificada misturando-se com 100 uL da solução de substrato de LDH. Após uma incubação de 10 minutos, LDH foi determinada medindo-se a absorvência em 490 nm. O percentual da viabilidade foi expressa em relação às amostras que não recebem tratamento.
[00182]Para avaliar o bioatividade do conjugado de polímero-peptídeo, um estudo de citotoxicidade foi conduzido em células de câncer cervical HeLa. O conjugado de polímero Antp-BH3 foi constatado ativar potencialmente a morte de célula HeLa em um aspecto dependente de dose. Menos que 50% de viabilidade HeLa foi detectadas após 6 horas de tratamento com 10 uM de conjugado de peptídeo (Figura 20A), as amostras que recebem 25 ,uM de conjugado de peptídeo (Figura 20B) mostraram pouca no caso de quaisquer células viáveis após tão pouca quanto 4 horas de exposição. Amostras de controle que recebem peptídeo ou polímero mostraram apenas o efeito de tratamento desprezível, e não houve diferença entre nestes grupos de tratamento de controle. De maneira importante, conjugados de Antp-BH3 poli(HPMA) que necessitaram do bloco sensível ao pH foram semelhantes igualmente aos grupos de controle e não resultaram em toxicidade significante, também validando a funcionalidade do bloco endossomolítico (Figura 20).
[00183]Avaliação de Citometria de Fluxo do Potencial de Membrana Mitocondrial. A perda de potencial da membrana mitocondrial, um indicador conhecido para apoptose, que usou foi avaliada usando a tintura JC-1. JC-1 exibe a fluorescência verde quando dispersa no citosol, e em células saudáveis, forma agregados fluorescentes vermelhos na membrana mitocondrial (Cossarizza e outro, Biochemical and biophysical research communications. 1993; 197(1): 40-45). HeLas foram
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86/87 incubadas durante 2 horas com 10 μΜ de peptídeo ou conjugado equivalente ou apenas polímero. JC-1 foi adicionado em uma concentração final de 5 μg/mL e incubado durante 15 minutos. As células foram lavadas 2 vezes com PBS, tripsinizadas, e ressuspensas em 0,5% de BSA para análise citométrica de fluxo. O percentual das células que exibem a despolarização mitocondrial foi quantificado com base no número de células fluorescentes verdes que foram negativas para fluorescência vermelha. Aqui, uma perda significante de agregados de JC-1 fluorescentes vermelhos e portanto uma perda na polarização mitocondrial foi detectadas após o tratamento tanto com o conjugado de Antp-BH3 peptídeo quanto o de polímero-peptídeo (Figura 21 A). Os controles de polímero foram similares às células que não recebem tratamento enquanto Antp-BH3 isolado e em um conjugado de polímero resultou em um aumento de aproximadamente 4 e 10 vezes, respectivamente, no percentual de células que exibem a perda da polaridade mitocondrial.
[00184]Ensaio de Atividade de Caspase 3/7. A ativação de caspase 3/7 foi medida usando um kit de ensaio comercialmente disponível. Este ensaio utiliza um substrato de caspase 3/7 pró-fluorescente que logo que clivado enzimaticamente torna-se fluorescente permitindo a determinação da atividade de enzima relativa usando um leitor de placa fluorescente. Aqui, HeLas foram incubadas 30 minutos com 25 μΜ de peptídeo (sozinho ou como conjugado de polímero) além do polímero isolado em uma quantidade equivalente às amostras de conjugado. Posteriormente, o indicador fluorigênico de caspase 3/7 foi adicionado diretamente aos meios de cultura para cada amostra. As placas agitadas durante 1 hora e em seguida analisadas usando uma leitora de placa fluorescente. Os dados foram expressos como o percentual de atividade de caspase em relação às amostras que não recebem tratamento.
[00185]A ativação de caspases 3 e 7, que é indicativa da sinalização próapoptótica, pode ser medida usando um substrato pró-fluorescente específico para
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87/87 estas proteases. Figura 21 B mostra que controles contendo o polímero isolado exibiu atividade de caspase equivalente em relação aos controles negativos que não recebem tratamento. Entretanto, a ativação de caspase rápida (aproximadamente
2,5 vezes) foi detectada após o tratamento com o peptídeo Antp-BH3 por si mesmo ou na forma de conjugado de polímero. Os efeitos similares de Antp-BH3 isolado ou como um conjugado de polímero poderiam indicar que a sinalização de caspase é saturada por tratamento com o peptídeo isolado ou que outros mecanismos de realimentação positivos existem para amplificação de perturbações no estado de ativação de caspase. Minimamente, estes resultados sugerem que não houve impedimento estérico ou outras reduções na atividade de caspase induzida por peptídeo como um resultado da conjugação ao polímero.

Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Copolímero CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a fórmula química I:
    Fórmula (I)
    Ao, Ai, A2, A3 e A4 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em -C-, -C-C-, -C(O)(C)aC(O)O-, -O(C)aC(O)- e -O(C)bO-; em que:
    a é 1 a 4;
    b é 2 a 4;
    Y4 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogênio, (Ci-Cio)alquila, (C3-C6)cicloalquila, 0-(Ci-Cio)alquila, -C(0)0(Ci-Cio)alquila, C(0)NRe(Ci-Cio) e arila, qualquer uma das quais é opcionalmente substituída com um ou mais grupos flúor;
    Yo, Yi e Y2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (Ci-Cio)alquil-, -C(0)0(C2-Cio)alquil-, -OC(O)(CiCio)alquil-, -0(C2-Cio)alquil- e -S(C2-Cio)alquil- e -C(0)NR6(C2-Cio)alquil-;
    Y3 é selecionado a partir do grupo consistindo em uma ligação covalente, (Ci-Cio)alquila e (C6-Cio)arila; em que átomos de carbono tetravalentes de A1-A4 que não são completamente substituídos com R1-R5 e Y0-Y4 são completados com um número apropriado de átomos de hidrogênio;
    R1, R2, R3, R4, Rs e Re são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em hidrogênio, -CN, alquila, alquinila, heteroalquila, cicloalquila, heterocicloalquila, arila e heteroarila, qualquer uma das quais pode ser opcionalmente substituída com um ou mais átomos de flúor;
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  2. 2/3
    Qo é um resíduo selecionado a partir do grupo consistindo em resíduos que são hidrofílicos em pH fisiológico; resíduos conjugáveis ou funcionalizáveis; ou hidrogênio;
    Qi é um resíduo que é hidrofílico em pH fisiológico normal;
    Q2 é um resíduo que é positivamente carregado em pH fisiológico normal;
    Q3 é um resíduo que é negativamente carregado em pH fisiológico normal, porém sofre protonação em pH inferior;
    m é uma fração em mol de cerca de 0 a menos do que 1,0;
    n é uma fração em mol maior do que 0 a cerca de 1,0; em que m + n = 1;
    p é uma fração em mol de cerca de 0,1 a cerca de 0,9;
    q é uma fração em mololar de cerca de 0,1 a cerca de 0,9;
    r está presente até uma fração em mol de 0,8; em que p + q + r = 1;
    v é de cerca de 1 a cerca de 25 kDa; e w é de cerca de 1 a cerca de 50 kDa.
    2. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo bloco é substancialmente neutro na carga total.
  3. 3. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o copolímero é um copolímero de dibloco.
  4. 4. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira unidade constitucional é catiônica.
  5. 5. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro bloco compreende uma pluralidade de primeiras unida des constitucionais.
  6. 6. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo bloco compreende uma pluralidade de segundas unidades constitucionais, uma pluralidade de terceiras unidades constitucionais, e uma pluralidade de porções intensificadoras de hidrofobicidade.
    Petição 870190075177, de 05/08/2019, pág. 100/125
    3/3
  7. 7. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro bloco de polímero é cerca de 2.000 daltons a cerca de 30.000 daltons.
  8. 8. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que Q1 é um resíduo que é positivamente carregado em pH fisiológico normal; negativamente carregado em pH fisiológico normal, porém sofre protonação em pH inferior; neutro em pH fisiológico normal; ou zwitteriônico em pH fisiológico normal.
  9. 9. Copolímero, de acordo com a reivindicação 1 ou 8, em que a relação de v:w é cerca de 1:1 a cerca de 1:3.
  10. 10. Copolímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 8, CARACTERIZADO pelo fato de que também compreende um agente terapêutico.
  11. 11. Copolímero, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico está associado com o copolímero.
  12. 12. Copolímero, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico é um siRNA.
  13. 13. Copolímero, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico é covalentemente ligado ao copolímero.
  14. 14. Copolímero, de acordo com a reivindiacação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico é ionicamente associado com o copolímero.
  15. 15. Uso de um copolímero como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é na produção de um medicamento para liberação intracelular de um polinucleotídeo.
BRPI0912159A 2008-05-13 2009-05-13 copolímero compreendendo um primeiro bloco que compreende uma unidade hidrofílica em ph fisiológico e um segundo bloco que compreende grupos hidrofóbicos, e uso do dito copolímero para liberação intracelular de um polinucleotídeo BRPI0912159B8 (pt)

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