BRPI0912865B1 - Método para analisar oticamente células raras suspensas em um meio fluido. - Google Patents
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Abstract
método para analisar oticamente células raras suspensas em um meio fluido a presente invenção refere-se a um método para a remoção do excesso de ferrofluidos não ligados e a formação de imagem de células tumorais enriquecidas de modo imunomagnético. um recipiente tendo sulcos pré-formados na superfície de visualização é projetado para otimizar o alinhamento e a formação de imagem de células. após a separação por centrifugação das partículas não ligadas, forças aplicadas externamente são empregadas para transportar o complexo ctc-partícula responsiva magneticamente em direção à parede transparente de coleta. a superfície interna sulcada da face de visualização da câmara fornece uma distribuição uniforme das partículas para facilitar a formação de imagem. a invenção também é útil para conduzir a análise quantitativa e preparação de amostra em conjunto com técnicas de enumeração de células automatizadas como na análise quantitativa de ctc relacionada à doença.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA ANALISAR OTICAMENTE CÉLULAS RARAS SUSPENSAS EM UM MEIO FLUIDO.
REFERÊNCIA CRUZADA DOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica prioridade ao, e o benefício de, pedido de patente Provisório U.S. copendente, número de série 61/054.219, depositado em 19 de maio de 2008, pedido esse aqui incorporado na íntegra, a título de referência.
ANTECEDENTES [002] A presente invenção refere-se a um aparelho e métodos aprimorados para realizar análises qualitativas e quantitativas de espécimes biológicos microscópicos. Em particular, a invenção refere-se a tais aparelhos e métodos para isolamento, coleta, imobilização, e/ou análise de espécimes ou substâncias biológicas microscópicas que são suscetíveis à ligação imunoespecífica ou não específica com partículas magnético-responsivas que têm um agente de ligação para produção de espécimes marcadas magneticamente dentro de um meio fluido. Conforme usado na presente invenção, termos como espécime marcado magneticamente deve referir-se a tais espécimes ou substâncias biológicas de interesse investigativo que são suscetíveis a tal marcação magnética.
[003] A patente n° 5.985.153 descreve um aparelho e um método sendo que um gradiente magnético externo é empregado para atrair espécimes alvo marcadas magneticamente, presentes em uma câmara de coleta, para uma de suas superfícies, e onde um gradiente magnético interno é empregado para obter um alinhamento preciso daqueles espécimes sobre sua superfície. O movimento dos espécimes biológicos marcados magneticamente é obtido pela aplicação de um gradiente magnético vertical para mover os espécimes biológicos marcados magneticamente para a superfície de coleta. A superfície de coleta
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2/10 é dotada de uma estrutura de captura ferromagnética, como uma pluralidade de linhas ferromagnéticas mantidas sobre uma face oticamente transparente (visualização) de uma câmara de amostra.
[004] Uma vez que os espécimes biologicamente marcados são puxados suficientemente para perto da superfície por um gradiente aplicado externamente, eles ficam sob a influência de um gradiente local intenso produzido por uma estrutura de coleta ferromagnética e são imobilizados em uma posição lateralmente adjacente a isso. O gradiente local excede, de preferência, as forças de adesão que podem reter os espécimes biológicos na superfície transparente após eles colidirem com a superfície. Altemativamente, a adesividade da superfície deve ser suficientemente fraca para permitir que a força magnética horizontal mova os espécimes biológicos marcados magneticamente em direção a estruturas ferromagnéticas. A lisura e a natureza hidrofóbica ou hidrofílica da superfície são fatores que podem influenciar o material escolhido para a superfície de coleta ou para o tratamento dessa superfície para obter uma superfície escorregadiça.
[005] Os pedidos de patente U.S. 10/733829 e U.S. 6.790.366 descrevem métodos e aparelho para separar, imobilizar, e quantificar substâncias biológicas em uma amostra fluida, incorporando os princípios do gradiente aplicado externamente descritos acima, e incorporando adicionalmente uma estrutura de captura magnética de alto gradiente interno na parede transparente de coleta. A estrutura de captura encoraja um alinhamento uniforme de substâncias biológicas capturadas para análise quantitativa com técnicas de enumeração automatizadas.
[006] O pedido de patente U.S. 11/447562 descreve pequenos sulcos em formato de V sobre o lado fluido da face oticamente transparente (visualização) da câmara para alinhar os espécimes alvo para análise ótica automatizada. Os pequenos sulcos em formato de V so
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3/10 bre o lado fluido da face oticamente transparente (visualização) da câmara, e a diluição ótima dos espécimes marcados magneticamente fornecem uma superfície de alinhamento para a análise ótica automatizada. Os espécimes marcados magneticamente e as partículas magnéticas não ligadas movem-se em direção à superfície interna da face de visualização da câmara, sob influência do gradiente magnético aplicado externamente. Quando eles aproximam-se da superfície, eles entram em contato com o declive do sulco em formato de V, que forçam os espécimes marcados magneticamente e partículas magnéticas não ligadas a mover-se para o topo do sulco.
[007] O pedido de patente U.S. 11/344757 descreve um dispositivo e método para coleta automatizada e análise de imagem de células alvo raras marcadas de modo detectável. Essas raras células alvo marcadas magneticamente estão sujeitas à formação de imagem por integração do tempo de atraso (TDI) na Plataforma CellTracks. Entretanto, durante a avaliação de células tumorais circulantes (CTC) no sangue de pacientes com câncer, com o objetivo de correlacionar a avaliação com a atividade da doença, as partículas magnéticas não ligadas que sobram da separação imunomagnética distorcerão a imagem e interferirão na confirmação de um alvo capturado como uma CTC.
[008] A presente invenção apresenta uma configuração de sulco pequeno que permite a remoção completa da partículas magnéticas não ligadas na análise de células raras marcadas com o uso de TDI na plataforma CellTracks.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [009] A figura 1 é um diagrama esquemático de uma estrutura de alinhamento de células.
[0010] A figura 2 mostra um desenho da estampa de PDMS com o uso de um microscópio eletrônico de varredura com um alinhamento
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4/10 liso e superfície de formação de imagens.
[0011] A figura 3 mostra o espectro de transmissão de um uma placa de PDMS de 1,3 mm e uma placa de PMMA de 0,5 mm de espessura comparadas com uma lâmina de vidro para microscópio de 1,0 mm de espessura.
[0012] A figura 4 mostra o efeito do excesso de partículas magnéticas não ligadas sobre a intensidade da imagem. Níveis crescentes de ferrofluidos EpCAM resultam em uma diminuição na intensidade da imagem e um aumento na variação na intensidade da avaliação.
[0013] A figura 5 mostra a diferença nas intensidades totais com e sem a presença de 40 ug/ml de ferrofluidos. A distribuição é pior com ferrofluidos presentes.
[0014] A figura 6 mostra a imagem combinada em campo claro, DAPI e PE mostrando o alinhamento das células SKBR3. DESCRIÇÕES DETALHADAS [0015] As células tumorais circulantes (CTC) no sangue de pacientes com câncer são conhecidas por sua correlação com a atividade da doença. A plataforma CellTracks fornece um enriquecimento magnético e uma análise de imagem de células alvo suspeitas para enumeração e correlação com estados doentios. Alvos como células, restos de células, e componentes de células são coletados junto à superfície de coleta de um recipiente sem alinhamento subsequente, adjacente à estrutura ferromagnética. Essas células incluem leucócitos, células de origem epitelial, células endoteliais, células fúngicas, e células bacterianas. A superfície de coleta é orientada de modo perpendicular ao gradiente de campo magnético produzido por magnetos externos. A imagem resultante inclui nanopartículas magnéticas e espécimes biológicos marcados magneticamente e coletados com uma distribuição substancialmente homogênea na face oticamente transparente da câmara, enquanto as entidades não selecionadas permanecem abaixo
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5/10 no meio fluido.
[0016] A incorporação da integração do tempo de atraso (US 11/344757) na plataforma CellTracks na análise de células raras é usada para detectar e caracterizar rapidamente as CTC. A separação imunomagnética de células alvo raras (CTC) é realizada por seleção positiva de EpCAM. As células circulantes que expressam o antígeno para a molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM) são selecionadas pelos anticorpos monoclonais específicos ou EpCAM e ligados covalentemente a nonopartículas magnéticas. O complexo é separado dos constituintes de sangue remanescentes quando exposto a um campo magnético.
[0017] A análise subsequente do alvo capturado é determinada por meio de uma série de marcações fluorescentes de componentes dentro da célula. O corante fluorescente DAPI é usado para marcar os núcleos da CTC e dos leucócitos selecionados de modo não específico, sendo que o citoesqueleto da CTC é marcado com citoqueratinaPE e os leucócitos com CD45-APC. As células marcadas são manipuladas magneticamente para alinhar-se ao longo de uma superfície de análise. Entretanto, nesse sistema, as partículas magnéticas não ligadas que sobram da separação imunomagnética causarão a distorção e reduzirão a capacidade de confirmar a presença de uma CTC.
[0018] Para fornecer uma coleta de espécimes alvo dotada de um padrão espacial para a análise qualitativa e quantitativa de amostras biológicas microscópicas, a presente invenção refere-se à produção e uso de estruturas pré-moldadas na superfície interna da câmara de formação de imagem. Em geral, sulcos pré-moldados são sulcos longos em formato de V, pré-moldados dentro de uma porção interna da superfície de visualização da câmara de formação de imagem. Essas estruturas fornecem um alinhamento de células tão bom quanto, ou até melhor, que as linhas Ni anteriormente relatadas. Além disso, elas
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6/10 são produzidas por um material altamente transparente, oticamente adequado para formação da imagem de célula inteira.
[0019] A figura 1 ilustra o princípio do alinhamento celular com o uso de sulcos da presente invenção. O movimento celular magneticamente induzido dentro da câmara ocorre na presença de um gradiente magnético. Neste ponto, as células marcadas magneticamente colidirão com a superfície inclinada da estrutura (superfície de alinhamento) e deslizarão para dentro do topo do sulco (superfície de formação de imagem indicada), ou atingirão diretamente o topo da superfície de formação de imagem. Em uma ou outra situação, as células irão alinhar-se no sulco, permitindo a formação de imagem subsequente.
[0020] Para haver movimento suficiente ao longo da superfície inclinada do sulco, a superfície deve ser plana e as células impedidas de aderir às paredes. Para alcançar uma configuração precisamente liso, são usadas tecnologias conhecidas de desbaste de pastilhas. Entretanto, devido aos requisitos óticos e de custos, pastilhas de silício não são apropriadas, em vez disso, a moldagem de réplicas em polidimetilsiloxano (PDMS) fornece uma composição que irá satisfazer esses requisitos. As composições que irão satisfazer esse critério também são consideradas na presente invenção. As estruturas, gravadas sobre uma pastilha de silício, apresentam o inverso da configuração consequente e fornecem o molde de PDMS com o formato correto quando derramadas sobre o molde de silício. Após a cura, esse formato é cortado em dimensões que devem permitir a substituição da superfície de vidro da câmara de formação de imagem.
[0021] O desbaste pode ser realizado sobre um material oticamente transparente que pode ser usado na fabricação da câmara. Por exemplo, pastilhas de silício podem ser usadas no desbaste devido à facilidade de precisão, detalhe final, e por serem facilmente reproduzíveis. Qualquer material com características similares e conhecidos na
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7/10 técnica é considerado na presente invenção. O desbaste da estrutura usa duas técnicas de desbaste comuns. Primeiro, é necessária a criação de uma máscara de desbaste para desbastar os sulcos. Essa máscara é criada com o uso de desbaste com BHF (ácido hidrofluórico tamponado). Uma vez que o desbaste com BHF esteja completo, finas camadas de SiO2 são depositadas sobre a pastilha de silício em locais onde nenhum sulco deveria ser desbastado. O desbaste anisotrópico também é usado para desbastar os sulcos. Neste ponto, KOH é usado com desbastador. Quando esse processo é aplicado a uma pastilha propriamente orientada, os sulcos em formato de V são desbastados, o que é limitado pelo plano de cristal da pastilha de silício. Consequentemente, um ângulo de desbaste constante e altamente reproduzível é produzido. O ângulo depende da orientação da pastilha em uma modalidade, conforme mostrado na figura 1 de 70,5 graus. Outra técnica é a corrosão intensa por íon reativo (DRIE). Pelo uso dessa técnica, é possível desbastar as estruturas com alta razão de aspecto (razão entre o comprimento e largura da estrutura). A DRIE alterna ciclicamente as etapas de desbaste e deposição formando paredes laterais recortadas.
[0022] A moldagem por PDMS é usada para obter uma estampa positiva sobre a pastilha fabricada. O PDMS ou polidimetilsiloxano (Dow Corning (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, Michigan, EUA) é um polímero que contém uma ligação siloxano entre o Si (Silício) e O (Oxigênio). As moléculas dos polímeros estão reunidas para formar polímeros mais longos com um número médio em torno de 50 a 100. [0023] O PDMS final é obtido com a adição de um reticulador. O reticulador conecta-se com os polímeros para formar longas redes de polímeros, resultando em um material claro, elástico, quimicamente inerte, e termicamente estável. Após a polimerização, o PDMS forma uma substância clara e flexível que adere a muito poucos materiais e
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8/10 não é higroscópica, impedindo, portanto, qualquer adesão das células nas laterais devido ao fato do PDMS aderir a muito poucos materiais. Além do mais, ele é termicamente estável e transparente a partir de aproximadamente 300 a 900 nm. Todas essas características são importantes para seu uso em um sistema de formação de imagem fluorescente e na transmissão de luz visível. Após a formação, os sulcos são cortados nas dimensões da face de visualização da câmara.
[0024] Para remover a maior parte do excesso de partículas magnéticas com a mínima perda celular, a estrutura de alinhamento mostrada na figura 1 foi desenvolvida para a superfície de visualização. A figura 1 fornece uma visão geral da estrutura de alinhamento de células. Uma microestrutura PDMS mostrada na figura 1 foi desenvolvida para alinhar as celulas em áreas pré-determinadas e reduzir o tempo de formação de imagem. A configuração consiste em um chip de PDMS de 30 x 2,7 mm2 contendo 6 canais que têm 80 pm de largura e 30 mm de comprimento. Esses chips de PDMS são estampados a partir de um molde de pastilha. Foi escolhido o PDMS por causa de suas excelentes propriedades de transmissão, capacidades de replicação e facilidade de uso. Essa configuração reduz o tempo de formação de imagem para uma amostra de 32 minutos para 12 minutos.
[0025] A figura 2 mostra uma micrografia eletrônica por varredura de uma estampa de PDMS que tem a estrutura usada na presente invenção. Esse quadro mostra o alinhamento liso e as superfícies de formação de imagem na superfície de visualização.
[0026] A figura 3 compara a transmissão do espectro da espessura do PDMS usada na presente invenção com uma lâmina de vidro para microscópio típica. Com uma espessura de 0,5 mm, o PMMA rastreia a transmissão de uma lâmina de vidro para microscópio entre comprimentos de onda de 400 nm e 800 nm.
[0027] O excesso de partículas magnéticas conjugadas (EpCAM
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9/10 ferrofluido) é usado para assegurar a máxima recuperação de CTC. Entretanto, durante a formação da imagem o excesso de ferrofluidos forma agregados alongados sobre a superfície de formação de imagem, o que influencia a formação de imagem quantitativa e qualitativa das células. A figura 4 mostra o efeito do excesso de partículas magnéticas não ligadas sobre a formação de imagem. A intensidade nuclear total cai nitidamente com concentrações de ferrofluidos mais altas que 2 pg/ml (círculos), enquanto o CV aumenta em 40% para concentrações que são encontradas normalmente em amostras de pacientes, tais como 40 pg/ml (triângulos).
[0028] O efeito do excesso de ferrofluidos sobre a formação da imagem e os resultados do método de remoção são mostrados na figura 5. As células SKBR-3 formadas por imagem com concentrações de 40 pg/ml de ferrofluidos e 0 pg/ml de ferrofluidos. A distribuição das intensidades totais é significativamente pior para a amostra com excesso de ferrofluidos.
[0029] A presente invenção evita essa questão e fornece um método que faz a amostra girar dentro de um tubo cônico a 900 rpm. Isso força todas as células dentro do tubo para fora (força centrífuga). As partículas de ferrofluidos são muito menores (aproximadamente ~175 nm de diâmetro) e permanecem distribuídas de modo aleátorio na amostra. Após vários minutos, 60% da amostra é aspirado automaticamente do fundo do tubo rotativo. Esse processo é repetido 5 vezes e as células SKBR-3 são alinhadas ao longo da superfície de visualização com o uso da estrutura de PDMS na presente invenção. A figura 6 mostra a imagem em campo claro, DAPI e PE combinados das células SKBR-3 capturadas ao longo da superfície de visualização.
[0030] Com o uso do método da presente invenção, 95% a 97% do excesso de ferrofluidos pode ser removido, levando a concentração final em uma amostra de paciente de menos que 2 pg/ml. Isso remove
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10/10 o bastante o excesso de ferrofluidos otimizando as medições quantitativas e gerando um aprimoramento considerável na qualidade das imagens. Além disso, a recuperação das CTC variou entre 95% e 99%. Consequentemente, a remoção de ferrofluidos, com o uso do método da presente invenção, fornece uma remoção suficiente do excesso de ferrofluidos para otimizar as medições quantitativas. A qualidade das imagens é aprimorada e a imagem em campo claro é possível para a obtenção de dados morfológicos adicionais sobre as CTCs individuais.
[0031] Embora certas modalidades preferenciais da presente invenção tenham sido descritas e especificamente exemplificadas acima, não há a intenção de que a invenção fique limitada a essas modalidades. Várias modificações podem ser feitas à mesma sem se afastar do espírito da presente invenção, estando o escopo completo das otimizações delineado nas reivindicações apresentadas a seguir.
Claims (8)
- reivindicações1. Método para analisar oticamente células raras suspensas em um meio fluido, sendo que o método compreende:a. obter de uma amostra sanguínea de um paciente suspeito de sofrer de câncer;b. misturar a dita amostra sanguínea com partículas de ferrofluidos ligadas a anticorpos específicos para o antígeno EpCAM sobre a superfície de células epiteliais;c. remover os ferrofluidos não ligados dos ferrofluidos ligados; e caracterizado pelo fato de que compreende ainda:d. visualizar magneticamente os constituintes responsivos na amostra sanguínea usando a integração de tempo de atraso em uma câmara de visualização, sendo que ditos constituintes estão distribuídos uniformemente dentro da estrutura de alinhamento préformada ao longo da superfície de visualização sobre a superfície interna da face oticamente transparente de dita câmara.
- 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas estruturas de alinhamento são sulcos com formato de trincheira.
- 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas estruturas de alinhamento contêm sulcos tendo uma superfície de visualização de imagem e uma superfície de alinhamento.
- 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita superfície de visualização de imagem é de 80 pm.
- 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita remoção de ferrofluidos não ligados compreende:Petição 870190019792, de 27/02/2019, pág. 15/212/2a. rotacionar a dita amostra sanguínea com partículas de ferrofluidos em um tubo cônico a 900 rpm;b. aspirar a amostra do fundo de dito tubo cônico; ec. repetir as etapas (a) e (b) 5 vezes.
- 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita visualização inclui adicionalmente a confirmação de células epiteliais ligadas como CTC.
- 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita confirmação compreende:a. primeira marcação positiva do núcleo com DAPI;b. segunda marcação positiva do citoesqueleto com citoqueratina-PE; ec. terceira marcação positiva de leucócitos com CD45-APC.
- 8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que inclui, adicionalmente, o exame em campo claro da CTC capturada.
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