BRPI0913178B1 - método para produzir um hidrolisado de caseína, e, uso de um hidrolisado de caseína - Google Patents
método para produzir um hidrolisado de caseína, e, uso de um hidrolisado de caseína Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0913178B1 BRPI0913178B1 BRPI0913178A BRPI0913178A BRPI0913178B1 BR PI0913178 B1 BRPI0913178 B1 BR PI0913178B1 BR PI0913178 A BRPI0913178 A BR PI0913178A BR PI0913178 A BRPI0913178 A BR PI0913178A BR PI0913178 B1 BRPI0913178 B1 BR PI0913178B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- endopeptidase
- casein
- protein
- fact
- hydrolysis
- Prior art date
Links
- 239000005018 casein Substances 0.000 title claims description 47
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 47
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 title claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 76
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 30
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 29
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 21
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 241000203622 Nocardiopsis Species 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 38
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 37
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 37
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 20
- 229940066758 endopeptidases Drugs 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 11
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 241001221335 Nocardiopsis sp. Species 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229940071162 caseinate Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 5
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000520851 Nocardiopsis alba Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 3
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 3
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000203616 Nocardiopsis prasina Species 0.000 description 2
- 241001373674 Periconia sp. Species 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 235000021245 dietary protein Nutrition 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241001134261 Brachysporiella gayana Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000223211 Curvularia lunata Species 0.000 description 1
- 241000768015 Gliocladium sp. Species 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000223250 Metarhizium anisopliae Species 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 241000756502 Nocardiopsis alkaliphila YIM 80379 Species 0.000 description 1
- 241000203619 Nocardiopsis dassonvillei Species 0.000 description 1
- 241000923014 Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 108010033929 calcium caseinate Proteins 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000009841 combustion method Methods 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 235000015897 energy drink Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N norethisterone Chemical compound O=C1CC[C@@H]2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VIKNJXKGJWUCNN-XGXHKTLJSA-N 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000002268 wool Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
- A23J3/343—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins
- A23J3/344—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins of casein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
método para produzir um hidrolisado de caseína, e, uso de um hidrolisado de caseína a presente invenção diz respeito a um método para produzir um hidrolisado de caseína usando-se uma endopeptidase microbiana.
Description
“MÉTODO PARA PRODUZIR UM HIDROLISADO DE CASEÍNA, E, USO DE UM HIDROLISADO DE CASEÍNA”
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
Este pedido contém uma listagem de sequência em uma forma legível em computador. A forma legível em computador é incorporada neste por referência.
CAMPO TÉCNICO
A presente invenção diz respeito a um método par a produção de um hidrolisado de caseína usando-se uma endopeptidase microbiana.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os hidrolisados de caseína são usados para a fortificação de proteína, por exemplo, em bebidas esportivas e em outras bebidas dietéticas, bebidas combinadas secas, barras nutricionais, fórmulas infantis, etc. Os hidrolisados de caseína têm, foram, em alguns casos, observados serem menos alergênicos do que os hidrolisados de proteína de soro de leite que os tornam potencialmente mais úteis em, por exemplo, fórmula infantil. Os hidrolisados de caseína podem ser fabricados usando-se as enzimas proteolíticas para hidrolisar a caseína. Na fabricação industrial de hidrolisados de caseína, solubilidade ou suspensibilidade alta da proteína hidrolisada são importantes tanto a partir de um ponto de vista de processamento, quanto a partir de um ponto de vista de rendimento/econômico puro e por causa de atributos de impressão sensorial deixada pelo alimento na boca e sensoriais. Portanto, foi um objetivo para os presente inventores identificar enzimas proteolíticas que são úteis para a preparação de hidrolisados de caseína tendo uma solubilidade alta, tal como uma solubilidade alta, em pH baixo e/ou uma solubilidade alta em grau baixo ou moderado de hidrólise.
As endopeptidases observadas serem aplicáveis de acordo com a presente invenção foram previamente descritas. Por exemplo, a
Petição 870180011217, de 09/02/2018, pág. 11/17 endopeptidase derivada de Nocardiopsis sp. O NRRL 18262 é divulgado no WO88/03947 (aqui, a cepa é referida como Nocardiopsis sp. cepa 10R) e WOOl/58276. Outras endopeptidases relacionadas que são úteis de acordo com a invenção são divulgados no WO88/03947, WO04/111220, WO04/111222, WO04/111223, WO05/123911 e WO04/072279.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os presentes inventores identificaram endopeptidases que são observadas serem aplicáveis na fabricação de caseína tendo uma solubilidade alta a dando suspensões uniformes. Tais endopeptidases são mais funcionalmente eficientes do que outras endopeptidases usadas na técnica quando comparado com uma quantidade igual de proteína de enzima, que resulta em economia de produto melhor para os produtores de hidrolisados caseína. Consequentemente, a presente invenção diz respeito a um método para produzir um hidrolisado de caseína, que compreende: a) adicionar a uma composição que compreende caseína, uma endopeptidase tendo pelo menos 50 % de identidade para a SEQ ID N°: 1 e b) incubação a fim de hidrolisar a caseína.
DIVULGAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Endopeptidase
O termo endopeptidase como usado neste é uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeo internas (tem atividade de endopeptidase).
Não existem limitações na origem da endopeptidase para o uso de acordo com a invenção. Desta maneira, o termo endopeptidase inclui não apenas endopeptidase naturais ou do tipo selvagem, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos etc. destes que apresentam atividade de endopeptidase, bem como endopeptidases sintéticas, tais como endopeptidases embaralhadas. Variantes de endopeptidases geneticamente projetadas podem ser preparadas como, em geral, é conhecido na técnica, por exemplo, pela mutagênese direcionada ao local, por PCR (usando-se um fragmento de PCR contendo a mutação desejada como um dos iniciadores nas reações de PCR) ou pela mutagênese aleatória. Os exemplos de variantes de endopeptidase, como usado no presente contexto, são endopeptidases em que um ou mais aminoácidos foram anulados, inseridos ou substituídos por outros aminoácidos.
Exemplos de endopeptidases para o uso de acordo com a invenção são as (i) endopeptidases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, divulgado no WOO 1/58276, a sequência de que é mostrado como a SEQ ID N°: 1 do presente documento;
(ii) endopeptidases tendo pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, ou pelo menos 95 % de identidade de aminoácido a endopeptidase de (i);
(iii) mutantes, variantes ou fragmentos endopeptidases de (i) ou (ii) que exibe a atividade de endopeptidase.
Para os propósitos da presente invenção, o alinhamento das sequências de aminoácido podem se determinadas pelo uso do programa Needle do pacote EMBOSS (http://emboss.org) versão 2.8.0. O programa Needle implementa o algoritmo de alinhamento global descrito em Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de substituição usada é BLOSUM62, penalidade de abertura de fenda é 10 e penalidade de extensão de fenda é de 0,5.
O grau de identidade entre duas sequências de aminoácido é calculado como o número de pontos exatos em um alinhamento de duas sequências, divididas pelo comprimento dos mais curtos de duas sequências. O resultado é expresso na identidade de percentual.
Um ponto exato ocorre quando as duas sequências tem resíduos de aminoácidos idênticos na mesma posição de sobreposição. O comprimento de uma sequência é um número de resíduos de aminoácidos na sequência (por exemplo o comprimento da SEQ ID N°: 1 é 188).
Como exemplos de endopeptidases bacterianas aplicáveis para o uso de acordo com a invenção também podem ser mencionadas a endopeptidase de Nocardiopsis alba (previamente Nocardiopsis dassonvillei) NRRL 18133 divulgado em WO88/03947, a endopeptidases de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis alba DSM 15647, Nocardiopsis sp. DSM 16424 e a Protease 22 sintética, todas as quatro divulgadas em W004/111220, a endopeptidase de Nocardiopsis prasina DSM 15648 divulgada em WO04/111222, a endopeptidase de Nocardiopsis prasina DSM 15649 divulgada em W004/111223, as endopeptidases de Nocardiopsis prasina (previamente Nocardiopsis alba) DSM 14010, Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 e Nocardiopsis /ucentensis DSM 44048, todos as três divulgadas no WO05/123911, a endopeptidases de Brachysporiella gayana CGMCC 0865, Metarhizium anisopliae, Gliocladium sp. CBS 114001, Periconia sp. CBS 114002, Periconia sp. CBS 114000 e Curvularia lunata CBS 114003, todos 6 divulgados em WO04/072279, e mutantes, variantes ou fragmentos de qualquer um destes que exibem a atividade de endopeptidase.
Uma endopeptidase para o uso de acordo com a invenção é uma endopeptidase microbiana, preferivelmente uma endopeptidase bacteriana, o termo bacteriana que indica que a endopeptidase é derivada de, ou originada de, uma bactéria, ou é um análogo, um fragmento, uma variante, um mutante, ou uma endopeptidase sintética derivada de uma bactéria. Este pode ser produzido ou expressado na cepa bacteriana de tipo selvagem original, uma outra cepa microbiana, ou em uma planta; isto é o termo cobre a expressão da endopeptidase de ocorrência natural, de tipo selvagem, bem como a expressão em qualquer hospedeiro de endopeptidase sintética, geneticamente projetada ou recombinante.
No processo da invenção, a endopeptidase pode ser purificada. O termo purificada como usado neste cobre as preparações de proteína de enzima onde a preparação foi enriquecida para a proteína de enzima em questão. Tal enriquecimento deve ser por exemplo: a remoção das células do organismos de que uma proteína de enzima extracelular foi produzida, a remoção do material de não proteína por uma precipitação específica de proteína ou o uso de um procedimento cromatográfico onde a proteína de enzima em questão é seletivamente eluida a partir de uma matriz cromatográfica. A endopeptidase pode ser purificada a uma extensão deste modo que apenas quantidades menores de outras proteínas estão presentes. A expressão outras proteínas relatam em particular a outras enzimas. Uma endopeptidase a ser usada no método da invenção pode ser substancialmente pura, isto é substancialmente livre de outros componentes a partir do organismo em que foi produzido, que pode ser um microorganismo de ocorrência natural ou um microorganismo hospedeiro geneticamente modificado para a produção recombinante da endopeptidase.
Entretanto, para os usos de acordo com a invenção, a endopeptidase não necessita ser pura. Esta pode, por exemplo, incluir a outras enzimas, ainda outras endopeptidases.
Em um aspecto preferido, a endopeptidase a ser usada no método da invenção foi purificada por conter pelo menos 20 %, preferivelmente pelo menos 30 %, pelo menos 40 % ou pelo menos 50 %, (p/p) da endopeptidase em questão da proteína total. A quantidade da endopeptidase pode ser calculada a partir da medição da atividade da preparação dividida da atividade específica da endopeptidase (atividade/mg EP), ou pode ser quantificado por SDS-PAGE ou qualquer outro método conhecido na técnica. A quantidade da proteína total pode ser, por exemplo, medida pela análise de aminoácido.
O uso de endopeptidase de acordo com a presente invenção pode ser combinado com o uso de outras enzimas, por exemplo outras proteases. Em uma forma de realização preferida, uma endopeptidase, por exemplo um derivado de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, é combinado com uma exopeptidase, ou uma preparação de protease tendo atividade de exopeptidase, por exemplo uma preparação de protease derivado de Aspergillus oryzae, como divulgado em WO94/25580, tal como Flavourzyme® (Novozymes NS, Dinamarca).
Em uma forma de realização particular, a endopeptidase para o uso de acordo com a invenção tem ótima atividade de pH próximo ao neutral, quando determinado pela hidrólise de caserna e reação subsequente de peptídeos solúveis em TCA com o-ftaldialdeído e 2-mercaptoetanol seguido pela medição da absorbância do completo resultante a 340 nm.
O termo ótima atividade pH próximo ao neutro pode significar que a endopeptidase tem um ótimo pH no intervalo de pH 5.5 a 11, preferivelmente pH 7 a 11, mais preferivelmente pH 8 a 11, ainda mais preferivelmente pH 9.5 a 10.5 e mais preferivelmente em tomo de pH 10.
Em uma outra forma de realização particular, a endopeptidase para o uso de acordo com a invenção é termoestável.
O termo termoestável pode significar que a temperatura a pH 9 é pelo menos 50 °C ou pelo menos 55 °C, preferivelmente pelo menos 60 °C, mais preferivelmente pelo menos 65 °C e ainda mais preferivelmente pelo menos 67 °C, tal como cerca de 70 °C, quando determinado pela hidrólise de caseína como descrito acima.
Hidrolisado de caseína
Caseína no contexto da presente invenção é o grupo predominante de proteínas no leite, que pode contra por 75 a 80 % de todas as proteínas no leite e queijo. A forma solúvel de caseína pode ser coagulado por ácidos e/ou por coalho.
Em uma forma de realização preferida, a caseína é de leite de vaca.
Caseína a ser usada no método da invenção pode, por exemplo, ser na forma de caseinato de sódio, caseinato de potássio ou caseinato de cálcio.
No método da invenção, o material de caseína é tipicamente misturado ou dispersado em água para formar uma pasta que compreende cerca de 1 % a cerca de 25 % de proteína em peso. Em uma forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 1 % a cerca de 5 % de proteína em peso. Em outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 6 % a cerca de 10 % de proteína em peso. Em uma forma de realização adicional, a pasta pode compreender cerca de 11 % a cerca de 15 % de proteína em peso. Ainda em outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 16 % a cerca de 20 % de proteína em peso. Ainda em outra forma de realização, a pasta pode compreender cerca de 21 % a cerca de 25 % de proteína em peso. Em uma forma de realização preferida, a pasta pode compreender cerca de 5 % a cerca de 25 % de proteína em peso.
Após o material de proteína ser dispersado em água, o pH e/ou a temperatura de pasta de proteína pode ser ajustado deste modo como para otimizar a reação de hidrólise e em particular, para garantir que a endopeptidase usada nas funções de reação de hidrólise próximo a este ótimo nível de atividade. O pH da pasta de proteína pode ser ajustado e monitorado de acordo com os métodos geralmente conhecidos na técnica. O pH da pasta de proteína pode ser ajustado de cerca de 5 a cerca de 10. Em uma forma de realização, o pH da pasta de proteína pode ser ajustado de cerca de 6 a cerca de 9. Em uma forma de realização preferida, o pH da pasta de proteína pode ser ajustado de cerca de 6,5 a cerca de 8. O pH da pasta de proteína pode ser mantido em tal nível durante a reação de hidrólise ou pode ser deixado diminuir como a reação de hidrólise procede. A temperatura da pasta de proteína é preferivelmente ajustado e mantido de cerca de 45 °C a cerca de 70 °C durante a reação de hidrólise de acordo com os métodos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização preferida, a temperatura da pasta de proteína pode ser ajustada e mantida de cerca de 63 °C a cerca de 70 °C durante a reação de hidrólise. Em geral, as temperaturas acima desta faixa pode inativar endopeptidase, enquanto as temperaturas abaixo ou acima desta faixa tende-se a diminuir a atividade de endopeptidase.
A reação de hidrólise é geralmente iniciada pela adição de endopeptidase a uma pasta do material de proteína. Altemativamente, a enzima pode ser dispersada em água e o material de proteína adicionado levemente após agitação. O método posterior pode ser vantajoso quando a preparação de uma pasta de proteína concentrada para evitar que a viscosidade tomar-se muito alto.
Preferivelmente, a quantidade de endopeptidase usado no método de invenção é de cerca de 0,005 a cerca de 100 AU (como definido abaixo) por kg de caseína, preferivelmente de cerca de 0,01 a cerca de 50 AU por kg de caseína, mais preferivelmente de cerca de 0,02 a cerca de 30 AU por kg de caseína.
Uma unidade Anson (AU) é definida como uma quantidade de enzima que está sob condições padrão (isto é 25 °C, pH 7.5 e 10 minutos do período de reação) digere a hemoglobina em uma taxa inicial tal que esta é liberada por minuto em uma quantidade de produto solúvel TCA que dá a mesma cor com reagente de fenol como um miliequivalente de tirosina. Quando a determinação da atividade AU, a concentração de hemoglobina pode preferivelmente ser em tomo de 1,3 %.
A quantidade de endopeptidase adicionada ao material de proteína pode e variará dependendo da fonte do material de proteína, o grau desejado de hidrólise e a duração da reação de hidrólise. A quantidade de endopeptidase pode variar de cerca de 1 mg da proteína de enzima a cerca de 5000 mg da proteína de enzima por kg de caseína. Em uma forma de realização preferida, a quantidade pode variar de 1 mg da proteína de enzima a cerca de 1000 mg da proteína de enzima por kg de caseína. Em outra forma de realização preferida, a quantidade pode variar de cerca de 5 mg de proteína de enzima a cerca de 500 mg de proteína de enzima de kg por caseína.
Como será apreciado pela pessoa habilitada, a duração da reação de hidrólise pode e variará. Geralmente falando, a duração da reação de hidrólise pode variar de poucos minutos a muitas horas, tal como, de cerca de 30 minutes a cerca de 48 horas.
Preferivelmente, o tratamento com endopeptidase resulta em um hidrolisado de caseína tendo um grau de hidrólise (DH) de cerca de 0,1 % a cerca de 20 %, mais preferivelmente de cerca de 0,5 % a cerca de 10 % ou de cerca de 0,5 % a cerca de 8 %, ainda mais preferivelmente de cerca de 2 % a cerca de 8 %.
O grau de hidrólise (DH) expressa a extensão da hidrólise de proteína obtida pelo método. No contexto da invenção, o grau de hidrólise (DH) é definido como seguem:
DH = (número de ligações de peptídeos clivadas / número total de ligações de peptídeos) x 100 %
A pessoa habilitada conhecerá como para medir o DH. Este pode, por exemplo, ser feito usando um método como descrito em AdlerNissen, J., 1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins, Capítulo 5, pp. 122124.
Após completar a etapa b), a endopeptidase pode ser inativada. Tal inativação pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo pelo aquecimento de pelo menos 75 °C, tal como pelo menos 80 °C ou pelo menos 85 °C.
Em uma forma de realização, o método da invenção ainda compreende o tratamento da composição de caseína com uma ou mais enzimas adicionais tendo atividade de protease. Tal enzima proteolítica adicional pode ser um ou mais endopeptidases e/ou um ou mais exopeptidases. Um ou mais exopeptidase pode ser, por exemplo, um ou mais aminopeptidases e/ou um ou mais carboxipeptidase.
Incubação com a endopeptidase tendo pelo menos 50 % de identidade a SEQ ID N°: 1 e incubação com uma ou mais enzimas adicionais tendo a atividade de protease não pode ser simultaneamente realizado. Isto é, se as enzimas proteolíticas não realizam o mesmo pH e/ou a mesma temperatura, a composição de caseína pode ser incubada com uma (ou mais) enzimas proteolíticas como primeiro, seguido pelo ajuste opcional de pH e/ou temperatura e incubação subsequente com outras enzimas proteolíticas.
Quando usando uma ou mais enzimas adicionais tendo a atividade de protease, o hidrolisado de caseína resultante pode ter um grau mais alto de hidrólise (DH) do que indicado acima. Este pode, por exemplo, ter um grau de hidrólise de cerca de 5 a 25 %.
Um hidrolisado de caseína obtido pelo método da invenção pode ser usado em um produto alimentício, por exemplo em uma bebida. Um produto alimentício de acordo com a presente invenção pode ser qualquer produto pretendido para o consumo humano. Exemplos não limitantes de tais produtos alimentícios incluem barras de nutrição, bebidas misturadas secas, bebidas esportivas, bebidas energéticas e fórmula infantil. Um hidrolisado de caseína obtido pelo método da invenção também pode ser usado na nutrição clínica, por exemplo em hospitais.
EXEMPLO 1
Comparação de hidrólise de caseinato de sódio com endopeptidase de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 tem a sequência mostrada na SEQ ID N°: 1 e Alcalase® 2.4L (Novozymes A/S, Dinamarca)
Hidrólise com protease:
Preparação de proteína:
Caseinato de sódio, Miprodan 30 de Aria Foods, Dinamarca, % de proteína: 15 g + 285 g de água. O produto de caseinato foi recolocado em suspensão a uma suspensão de 5 % p/v com água desmineralizada (Milli Q). A água foi aquecida a 60 °C e a proteína adicionada a água Milli Q enquanto a agitação em um misturador, 1 a 2 minutos ou até a proteína foi recolocada em suspensão/solubilizada.
Ajuste de pH:
O pH foi ajustado a 8.0 com 4 N de NaOH e foi mantido durante a reação de hidrólise.
Dosagem de enzima:
A protease Nocardiopsis e Alcalase 2.4L foram dosados a 10, 50 e 100 mg de proteína de enzima (ep)/kg de proteína. A enzima foi armazenada em gelo durante o manuseio.
Tratamento de enzima:
Temperatura: 60 °C +/- 1 °C
Tempo: 120 minutos.
A enzima foi adicionada a suspensão de proteína em um agitador magnético em um banho de água. A enzima foi adicionada quando a temperatura na solução de proteína tem reagido a 60 °C.
Inativação de calor / armazenagem:
Imediatamente após o tratamento de enzima, as amostras foram aquecidas, tratadas em 15 minutos a 85 °C em um banho de água de agitação. As amostras foram esfriadas em gelo e refrigeradas a 4 °C durante a noite.
Após incubação a 4 °C durante a noite a solubilidade e grau de hidrólise foram avaliados.
Solubilidade:
A solubilidade foi medida a pH 4.0 e 6.5 usando um analisador de proteína/nitrogênio Leco FP 528 medindo um teor de proteína e nitrogênio por um método de combustão. O teor de nitrogênio foi medido na fração solúvel e solubilidade foi calculada como o teor de nitrogênio na porcentagem do teor de substância seca total.
Grau de hidrólise:
O grau de hidrólise da suspensão foi medido por pH stat como descrito em Adler-Nissen, J., 1986, Enzymatic Hydrolysis of Food Proteins, Capítulo 5, pp. 122-124.
Resultados:
Grau de hidrólise:
| Concentração de protease (mg/kg de material caseinado) | Alcalase | Endopeptidase Nocardiopse |
| 0 (referência) | 0,62 | |
| 10 | 2,87 | 2,42 |
| 50 | 7,17 | 5,61 |
| 100 | 10,92 | 7,30 |
Solubilidade pH 6.5:
| Concentração de protease (mg/kg de material caseinado) | Solubilidade | Solubilidade/DH | ||
| Alcalase | Endopeptidase Nocardiopse | Alcalase | Endopeptidase Nocardiopse | |
| 0 (referência) | 98,7 | - | ||
| 10 | 76,5 | 92,1 | 26,7 | 38,1 |
| 50 | 79,0 | 90,3 | 11,0 | 16,1 |
| 100 | 86,9 | 95,2 | 8,0 | 13,0 |
Solubilidade pH 4.0:
| Concentração de protease (mg/kg de material caseinado) | Solubilidade | Solubilidade/DH | ||
| Alcalase | Endopeptidase Nocardiopse | Alcalase | Endopeptidase Nocardiopse | |
| 0 (referência) | 5,4 | - | ||
| 10 | 29,3 | 42,0 | 10,2 | 17,4 |
| 50 | 73,3 | 70,4 | 10,2 | 12,6 |
| 100 | 84,5 | 73,9 | 7,7 | 10,1 |
Conclusão:
E visto que em uma dada concentração de protease, a endopeptidase de Nocardiopsis dá um grau similar ou moderadamente baixo de hidrólise do que Alcalase. Entretanto, na solubilidade pH 6.5 foi visto ser geralmente mais alto com Nocardiopsis endopeptidase do que com Alcalase ambos na dada concentração de protease e em um dado grau de hidrólise.
Também ao pH 4.0, a solubilidade / DH foi claramente mais alto para o hidrolisado obtido com a endopeptidase Nocardiopsis do que para o hidrolisado obtido com Alcalase. No pH 6.5, a solubilidade do controle não hidrolisado foi mais alto do que dos produtos hidrolisados. Mas de um ponto funcional de vista, isto é com relação a capacidade de emulsificação e alergenicidade, é frequentemente desejável ter uma certa hidrólise de proteína (aumento em DH). Considerando a partir de um ponto sensorial de vista, o DH não deve ser muito alto, como DH aumentado frequentemente resulta na severidade aumentada de hidrolisados de caseína.
Além disso, a inspeção visual revela uma suspensão uniforme quando o uso de endopeptidase Nocardiopse como o catalisador enquanto Alcalase sob as dadas condições não foi uniforme (formação de massa uniforme).
Claims (11)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para produzir um hidrolisado de caseína, que compreende:a) adicionar, à uma composição que compreende caseína,b) incubar a fim de hidrolisar a caseína, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 1, e o grau de hidrólise do hidrolisado de caseína é de 0,1 a 20%.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pH ótimo da endopeptidase está entre pH 9,5 e pH 10,5.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a temperatura ótima da endopeptidase em pH 9 é pelo menos 60 °C.
- 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a3, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase é de Nocardiopsis.
- 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a4, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase é adicionada em uma concentração de 10 a 100 mg de proteína de enzima por kg de caseína.
- 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que a endopeptidase é adicionada em uma atividade entre 0,02 e 30 AU por kg de caseína.
- 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 5% a 25% de caseína.
- 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a7, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de caseína tem um grau de hidrólise de pelo menos 2%.
- 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 aPetição 870190026695, de 20/03/2019, pág. 6/78, caracterizado pelo fato de que ainda compreende o tratamento da composição de caseína com uma ou mais enzimas tendo atividade de protease.
- 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreende tratamento da composição de caseína com uma ou mais exopeptidases.
- 11. Uso de um hidrolisado de caseína produzido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser em um produto alimentício.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP08157453 | 2008-06-03 | ||
| PCT/EP2009/056644 WO2009147105A2 (en) | 2008-06-03 | 2009-05-29 | Method for producing a casein hydrolysate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0913178A2 BRPI0913178A2 (pt) | 2015-08-04 |
| BRPI0913178B1 true BRPI0913178B1 (pt) | 2020-05-19 |
Family
ID=41259415
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0913178A BRPI0913178B1 (pt) | 2008-06-03 | 2009-05-29 | método para produzir um hidrolisado de caseína, e, uso de um hidrolisado de caseína |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8153396B2 (pt) |
| EP (1) | EP2300606B1 (pt) |
| CN (1) | CN102046782A (pt) |
| AT (1) | ATE539150T1 (pt) |
| AU (1) | AU2009254004B2 (pt) |
| BR (1) | BRPI0913178B1 (pt) |
| DK (1) | DK2300606T3 (pt) |
| ES (1) | ES2378377T3 (pt) |
| NZ (1) | NZ589030A (pt) |
| PL (1) | PL2300606T3 (pt) |
| WO (1) | WO2009147105A2 (pt) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE602004030595D1 (de) | 2003-10-10 | 2011-01-27 | Novozymes As | Proteasevarianten |
| ES2380105T3 (es) | 2004-06-21 | 2012-05-08 | Novozymes A/S | Proteasas de Nocardiopsis |
| BRPI0720527B1 (pt) * | 2006-12-22 | 2017-06-13 | Novozymes A/S | Method for producing a yeast extract |
| AU2010230165B2 (en) * | 2009-04-02 | 2015-02-12 | Novozymes A/S | Process for making a milk-based protein hydrolysate |
| EP2436389A1 (en) * | 2010-10-01 | 2012-04-04 | Nestec S.A. | Milk-based protein hydrolysates and infant formulae and nutritional compositions made thereof |
| CA2967538A1 (en) * | 2014-12-01 | 2016-06-09 | Novozymes A/S | Method for producing a protein hydrolysate |
| AU2016369883B2 (en) * | 2015-12-18 | 2021-04-29 | Société des Produits Nestlé S.A. | Heat sterilized high protein compositions with hydrolyzed protein from a continuous process with at least one endopeptidase |
| WO2021171061A1 (es) | 2020-02-25 | 2021-09-02 | Universidad de Valparaíso | Grupo de microorganismos compuesto por lactobacillus sp. cepa k03d08, bacillus sp. cepa k03b01 y kazachstania sp. cepa k03k02g y sus composiciones; un proceso de obtención de un derivado lácteo libre de caseína que contenga ácidos grasos de cadena corta y ácidos grasos de cadena corta hidroxilados generados por el metabolismo del grupo de microorganismos |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK564086A (da) | 1986-11-25 | 1988-06-17 | Novo Industri As | Enzymatisk detergent-additiv |
| DK46793D0 (da) | 1993-04-26 | 1993-04-26 | Novo Nordisk As | Enzym |
| ES2213164T3 (es) * | 1994-10-26 | 2004-08-16 | Novozymes A/S | Metodo de produccion de un hidrolizado de proteina de leche. |
| EP0946106B1 (en) | 1996-12-23 | 2002-05-29 | Dsm N.V. | Method for producing a protein hydrolysate |
| NL1005037C2 (nl) * | 1997-01-17 | 1998-07-20 | Nl Zuivelonderzoek Inst | Werkwijze voor het selectief afbreken van melkeiwit, in het bijzonder voor het selectief hydrolyseren van caseïne/caseïnaat in aanwezigheid van andere melkeiwitten, in het bijzonder wei-eiwitten. |
| IES80880B2 (en) | 1997-07-31 | 1999-05-05 | Teagasc | Glutamine enriched peptide products |
| CA2395266C (en) | 2000-02-08 | 2009-04-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| US6855548B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-02-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Use of acid-stable proteases in animal feed |
| RU2292155C2 (ru) * | 2001-07-18 | 2007-01-27 | ДСМ Ай Пи ЭССЕТС Б.В. | Способ гидролиза молочных белков |
| WO2004072279A2 (en) | 2003-02-07 | 2004-08-26 | Novozymes A/S | Proteases |
| WO2004111223A1 (en) | 2003-06-19 | 2004-12-23 | Novozymes A/S | Proteases |
| WO2004111222A1 (en) | 2003-06-19 | 2004-12-23 | Novozymes A/S | Proteases |
| ATE408682T1 (de) | 2003-06-19 | 2008-10-15 | Novozymes As | Proteasen |
| DK1755656T3 (da) * | 2004-05-24 | 2010-10-04 | Novozymes As | Enzymer til farmaceutisk anvendelse |
| ES2380105T3 (es) | 2004-06-21 | 2012-05-08 | Novozymes A/S | Proteasas de Nocardiopsis |
-
2009
- 2009-05-29 ES ES09757486T patent/ES2378377T3/es active Active
- 2009-05-29 WO PCT/EP2009/056644 patent/WO2009147105A2/en not_active Ceased
- 2009-05-29 AU AU2009254004A patent/AU2009254004B2/en active Active
- 2009-05-29 DK DK09757486.7T patent/DK2300606T3/da active
- 2009-05-29 AT AT09757486T patent/ATE539150T1/de active
- 2009-05-29 PL PL09757486T patent/PL2300606T3/pl unknown
- 2009-05-29 EP EP09757486A patent/EP2300606B1/en active Active
- 2009-05-29 NZ NZ589030A patent/NZ589030A/en unknown
- 2009-05-29 CN CN2009801191446A patent/CN102046782A/zh active Pending
- 2009-05-29 BR BRPI0913178A patent/BRPI0913178B1/pt active IP Right Grant
- 2009-05-29 US US12/992,918 patent/US8153396B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2300606B1 (en) | 2011-12-28 |
| US20110097760A1 (en) | 2011-04-28 |
| EP2300606A2 (en) | 2011-03-30 |
| US8153396B2 (en) | 2012-04-10 |
| AU2009254004A1 (en) | 2009-12-10 |
| WO2009147105A2 (en) | 2009-12-10 |
| WO2009147105A3 (en) | 2010-05-06 |
| ATE539150T1 (de) | 2012-01-15 |
| PL2300606T3 (pl) | 2012-05-31 |
| ES2378377T3 (es) | 2012-04-11 |
| AU2009254004B2 (en) | 2015-01-22 |
| BRPI0913178A2 (pt) | 2015-08-04 |
| CN102046782A (zh) | 2011-05-04 |
| NZ589030A (en) | 2012-04-27 |
| DK2300606T3 (da) | 2012-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0913178B1 (pt) | método para produzir um hidrolisado de caseína, e, uso de um hidrolisado de caseína | |
| AU2015357195B2 (en) | Method for producing a protein hydrolysate | |
| US20160316786A1 (en) | Method for Producing a Wheat Protein Hydrolysate | |
| US8222372B2 (en) | Whey protein hydrolysate | |
| JPH06505386A (ja) | 蛋白質の調製 | |
| US20110165305A1 (en) | Method for preparing a protein hydrolysate | |
| CA2670731C (en) | Method for producing a yeast extract | |
| JP4071876B2 (ja) | 新規なセリンプロテアーゼ及びその製造法 | |
| BRPI0810149B1 (pt) | “método para a produção de um hidrolisado de proteína de soro de leite, e, uso de um hidrolisado de proteína de soro de leite |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 19/05/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |