BRPI0913347B1 - Modificações estáveis de cristais de dopc, seu uso, seu processo de preparação e suas misturas, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

MODIFICAÇÕES ESTÁVEIS DE CRISTAIS DE DOPC. A presente invenção refere-se a modificações de cristais de (R,S)-, (R)- e (S)-DOPC, a um processo para a preparação destas modificações e ao uso das mesmas como componentes para a preparação de medicamentos.

Description

[001] A presente invenção se refere a modificações de cristais de DOPC, a processos para produção dos mesmos e a sua utilização para produção de composições farmacêuticas.

[002] DOPC acima e abaixo se refere a 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina de ocorrência natural, também referida como 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina, fosfato de (R)-2,3-bis(oleoilóxi)propil-2-(trimetilamônio)etila, 1,2-dioleoil-L-(alfa)-lecitina ou, (R)-DOPC, o enantiômero do mesmo 2,3-dioleoil-sn-glicerol-1- fosfocolina de não ocorrência natural, misturas racêmicas (R,S)-DOPC e outras misturas dos enantiômeros acima citados.

[003] Números de registro CAS: 4235-95-4 (Forma R) e 8436667-6 (Forma S)

[004] Lipossomas são vesículas de múltiplas camadas sintéticas (membranas esféricas fechadas) compreendendo substâncias anfifíli- cas, principalmente lipídos naturais, em que ambas substâncias hidro- fílicas podem ser encapsuladas no interior aquoso e também substâncias lipofílicas podem ser incorporadas no interior da membrana lipídi- ca.

[005] São usados, em particular, em aplicações cosméticas e médicas, especialmente em dermatologia. Em particular, são encapsulados vitaminas, coenzimas, agentes protetores de pele e protetores solares. Lipossomas são geralmente aplicados topicamente.

[006] Entretanto, os lipossomas estão atingindo cada vez maior importância na tecnologia farmacêutica, pois a aplicação parenteral de lipossomas permite uma distribuição orgânica mais específica que a obtida com os compostos ativos usados em forma livremente dissolvida .

[007] Assim, US 2006/0067998 A1 descreve um método em que uma formulação encapsulada coloidalmente que compreende curcu- mina ou um derivado de curcumina como substância ativa é administrado para o tratamento ou a prevenção de doenças cancerígenas,. Formulações adequadas compreendem tanto sistemas coloidais baseados em lipídios como sistemas coloidais poliméricos como, por exemplo, lipossomas, nanopartículas, micropartículas ou micelas co- políméricas formadas de polímeros em bloco.

[008] Se DNA-, RNA- ou proteínas forem incluídos, lipoplexos são obtidos.

[009] Nanopartículas (nanopartes) são partículas de aproximadamente a mesma ordem de grandeza como lipossomas, mas que não têm fase aquosa, mas uma fase oleosa ou um núcleo sólido em seu interior. São particularmente adequadas para o encapsulamento de substâncias lipofílicas.

[0010] Microemulsões são sistemas monofásicos coloidalmente dispersos compreendendo componentes aquosos similares a lipídios e tensoativos. Eles têm um tamanho de partículas de 1-500 nm, e comportam-se como líquidos.

[0011] O efeito solubilizador nas aplicações acima descritas tem grande importância, em particular, em relação a compostos ativos similares a peptídios normalmente deficientemente solúveis, nucleotí- deos, vacinas e outros biofarmacêuticos.

[0012] Além disso, a degradação dos compostos ativos no corpo pode ser mais lente e desta forma ocorre um efeito de liberação continuada.

[0013] (R)-DOPC pertence à classe das fosfocolinas zwitteriônicas de ocorrência natural. Lipossomas compreendendo lipídios zwitteriôni- cos têm uma superfície neutra, sozinhos ou combinados com outras fosfocolinas ou outros compostos similares a lipídios não carregados.

[0014] Entretanto, é particularmente importante a capacidade de lipossomas e lipoplexos baseados em DOPC de penetrar em células e assim transportar os compostos ativos nelas incluídos para o interior da célula (transfecção). Tais lipossomas compreendem frequentemente lipídios carregados, em particuçar, lipídios catiônicos. Foram, entretanto, também divulgadas aplicações em que os lipoplexos consistem exclusivamente em DOPC como, por exemplo, Sood et al. No Journal of the National Cancer Institute (2008), 100, 359 - 372.

[0015] Todas estas propriedades tornam DOPC muito interessante para a terapia de câncer. Devido a estas propriedades, é oferecida a possibilidade de administração de RNA, DNA ou citostáticos convencionais incluídos em lipossomas de DOPC.

[0016] Aplicações médicas, em particular as parenterais, impõem exigências extremamente altas quanto à qualidade e à pureza dos compostos ativos e auxiliares usados. Existem assim regulamentos oficiais muito estritos sobre a preparação, reprodutibilidade da preparação e perfil de subprodutos destes compostos em parte das autoridades. No caso das substâncias administradas parenteralmente, impurezas microbiológicas devido a germes patogênicos e endotoxinas adicionalmente têm de ser estritamente evitadas e controladas.

[0017] DOPC é instável em temperatura ambiente e, portanto, apresenta dificuldades per se para preparar em pureza aceitável de modo que seja adequada para uso para a preparação de formulações medicamentosas.

[0018] Como todos os lipídios que portam radicais de ácido oleico, como por exemplo os fosfolipídios naturais POPC e DOPE, DOPC é muito sensível à oxidação. Entretanto, os produtos de oxidação de derivados de ácidos graxos não saturados apresentam em geral alta toxicidade.

[0019] São aqui necessários métodos adequados de preparação e purificação. DOPC está, por exemplo, na forma de sólido liofilizado ou ceroso e, portanto, só pode ser obtido industrialmente na qualidade adequada com grande dificuldade.

[0020] Os métodos convencionais para superar a instabilidade como, por exemplo, a adição de antioxidantes na forma de tocoferol ou de L-glutationa reduzida, restringem fortemente a aplicação geral de DOPC visto que interações com os compostos ativos a serem futuramente encapsulados não podem ser excluídas. Uma exclusão completa de oxigênio durante a preparação, armazenamento e uso é quase impossível ou só pode ser realizada com grande esforço.

[0021] Assim o fabricante geralmente recomenda que DOPC liofi- lizado seja armazenado a -20 oC sob gás protetor e somente garanta uma vida útil de cerca de 12 meses. Embora para DOPC ceroso uma vida mais longa seja garantida, é adicionada proteção contra oxidação e armazenamento deve também ocorrer a -20 oC.

[0022] Tanto o DOPC liofilizado como o ceroso tem teor amorfo muito alto.

[0023] Este DOPC amorfo é além de sensível à oxidação também extremamente higroscópico e deliquesce em um tempo extremamente curto a níveis de umidade atmosférica normal para proporcionar um filme oleoso. Além disso, um DOPC ceroso pode ser somente cominu- ído com dificuldade e, como DOPC liofilizado, somente pode ser pesado com dificuldade. Isto torna o manuseio deste composto muito mais difícil.

[0024] A literatura só divulga várias maneiras sintéticas para a preparação de DOPC amorfo:

[0025] Ichihara et al., Chemistry and Physics of Lipids (2005), 137 (1-2), 94-99, mostram a síntese de DOPC a partir de SN-Glicero-3- fosfocolina (GPC)

[0026] Roodsari et al., Journal of Organic Chemistry (1999), 64(21), 7727-7737, descrevem a síntese total de DOPC a partir de tri- tilglicerol.

[0027] Apareceram muitas outras publicações sobre síntese e utilização de DOPC, mas nenhuma delas descreve material cristalino.

[0028] Lewis et al., Biochemistry (1988), 27(3), 880-7, bem como Biochemistry (1989), 28(2), 541-8, tratam de DOPC liofilizado.

[0029] Baer e Kindler mencionam em Biochemistry (1962), 1 (3), 518-21, DOPC ceroso.

[0030] Lekim, Biedermann e Ghyczy, DE 2647395, descrevem genericamente a purificação de ésteres de GPC por cristalização, mas a cristalização explícita de DOPC não é descrita.

[0031] DOPC racêmico pode ser obtido com materiais de partida racêmicos análogos aos processos descritos para os enantiômeros.

[0032] Além disso, nenhuma das muitas publicações menciona o ponto de fusão para DOPC.

[0033] É portanto objetivo da presente invenção, prover DOPC de alta pureza, se possível em forma cristalina. É também objetivo da presente invenção prover este composto com longa vida útil e boas propriedades de manuseio de modo que possa ser usado na preparação de formulações farmacêuticas. Existe, além disso, forte necessi- dade por um processo de reprodução para a preparação de formas estáveis de DOPC que possa ser reproduzido em escala industrial.

[0034] Surpreendentemente foi agora descoberto através de experimentos que DOPC cristalino, tanto racêmico como enantiomerica- mente puro, tendo excelente estabilidade e alta pureza química possa ser obtido de maneira simples. Os produtos cristalinos obtidos desta maneira são estáveis por um tempo virtualmente ilimitado à temperatura ambiente sob gás protetor.

[0035] O DOPC cristalino é também produzido como um material solto de fácil manuseio com higroscopicidade melhorada.

[0036] Eles são, portanto, adequados como componente ou material de partida para preparação de formas medicamentosas.

[0037] Assim, a presente invenção se refere a modificações estáveis de cristais de enantiômeros de DOPC, bem como misturas dos enantiômeros com a mesma forma cristalina.

[0038] As modificações estáveis de cristais podem ocorrer em forma cristalina e parcialmente cristalina. Apresentam uma pureza nunca previamente alcançada de > de 98% com uma estabilidade nunca previamente alcançada de > de 99% com base no valor inicial após 12 meses de armazenamento com exclusão de ar a 40oC e 75% de umidade relativa e após 18 meses a 25 oC e 60% de umidade atmosférica relativa (sem adição de proteção contra oxidação, ver Tabela 1). As modificações de cristais de DOPC têm um teor de menos de 1 equivalente de água ou solvente de cristalização por 1 equivalente de DOPC.

[0039] DOPC enantiomericamente puro está, por exemplo, na modificação de cristal do Tipo 1 e apresenta faixas meio- agudas em medições de difração de raios X em pó (ver Figura 1 e Tabela 2). Valores selecionados de 2θ para várias modificações de cristais são 3,6, 5,3, 18,3, 19,3, e 21,7 (Tipo I), medidos com radiação Cu-Kα. Pequenas diferenças de faixas individuais para estes valores podem ocorrer se forem usados diferentes instrumentos ou métodos de medição como reflexão ou transmissão, ou capilaridade ou janela ou se diferentes condições de medição com relação à umidade atmosférica ou temperatura prevalecerem.

[0040] Algumas das modificações de cristal apresentam teor cristalino muito alto, que é evidenciado por uma entalpia de fusão superior a 48 J/g. O ponto de fusão das modificações de cristais é em geral superior a 60 0C (figura 9).

[0041] Além disso, as modificações de cristal de acordo com a invenção são produzidas como material solto de fácil manuseio (figura 4). O caráter cristalino torna-se claro sno microscópio de polarização (figura 6).

[0042] Misturas de enantiômeros cristalinos de DOPC, como por exemplo, racemato cristalino, podem ter os mesmos espectros de XRD.

[0043] A invenção além disso se refere a um processo para a preparação de modificações de cristais de DOPC, que é caracterizado por ser o DOPC cristalizado a partir de um meio aprótico. Meio aprótico quepode ser usado para este fim são solventes apróticos ou misturas dos mesmos. O meio aprótico pode também conter em pequena proporção solventes próticos, como, por exemplo, água. Em casos excepcionais podem estar presentes até 25 % em peso de solventes próti- cos em condições adequadas. A cristalização de DOPC pode então ser feita diretamente a partir da solução da reação sem purificação prévia. DOPC cristalino pode também ser obtido por recristalização a partir de material amorfo, parcialmente cristalino ou cristalino.

[0044] Solventes apróticos adequados são, em particular, éteres, como por exemplo tetraidrofurano, metiltetraidrofu- rano e dioxano, ésteres, como por exemplo formiato de etila, acetato de me- tila, acetato de etila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetato de butila, acetato de isobutila, carbonato de dimetila, carbonato de die- tila e 1,3- dioxolidin-2-ona, cetonas, como por exemplo acetona, 2-butanona, metili- sobutilcetona, metilisopropilcetona e nitrilas, como por exemplo acetonitrila.

[0045] Adições de solventes próticos consistem tipicamente em alcoóis como por exemplo metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, 2-butanol, t-butanol, 3-metil-1-butanol e etileno glicol, metoxietanol , etoxietanol, água ou misturas dos mesmos.

[0046] A cristalização das modificações de DOPC é geralmente obtida especificamente pelo resfriamento lento da solução preparada até temperaturas inferiores a 30 oC. A forma dos cristais ocorre espontaneamente ou por inoculação com a correspondente modificação de cristal de DOPC.

[0047] As diversas modificações de cristais de DOPC podem ser convertidas umas nas outras. As conversões podem ser obtidas por tratamentos de temperatura das modificações de cristais isoladas em temperatura elevada ou por agitação prolongada de suas suspensões sob condições de cristalização.

[0048] O uso de DOPC amorfo ou parcialmente cristalino como material de partida para a recristalização no processo descrito produz DOPC essencialmente cristalino tendo pureza nunca antes alcançada junto com estabilidadenunca antes alcançada.

[0049] A invenção se refere também ao uso de DOPC cristalino para a preparação de formulações de medicamentos, pois DOPC cristalino apresenta excelente estabilidade em forma sólida nas condições consideradas e qualidade constante e muito boa durante tempo virtualmente ilimitado.

[0050] A invenção se refere além disso consequentemente às composições farmacêuticas resultantes do uso das formas reivindicadas de DOPC. Elas podem estar, por exemplo, na forma de liposso- mas, lipoplexos, microemulsões e nanopartículas e compreender, por exemplo, um composto ativo do grupo dos peptídeos, nucleotídeos, vacinas e citostáticos.

[0051] A presente descrição permite que um versado na técnica use a invenção no seu escopo integralmente. Mesmo sem comentários adicionais é assim assumido que um versado seja capaz de usar a descrição acima em um escopo mais amplo. A presente descrição permite, consequentemente, à pessoa versada utilizar e executar a invenção em seu escopo integral.

[0052] No caso de qualquer falta de clareza é evidente que as publicações e a literatura de patentes citadas devam ser utilizadas. Consequentemente, estes documentos devem ser considerados como parte do conteúdo de divulgação da presente descrição.

[0053] Para melhor entendimento e para ilustrar a invenção são apresentados a seguir exemplos que estão dentro do escopo de proteção da presente invenção. Estes exemplos servem também para ilustrar possíveis variantes. Entretanto dada a validade geral do princípio da invenção, os exemplos não são adequados para reduzirem aos mesmos o escopo de proteção do presente pedido.

[0054] As temperaturas mencionadas nos exemplos e na descrição e nas reivindicações são sempre expressas em graus Celsius. Salvo indicação em contrário, dados sobre teores são expressos em percentagens em peso.

[0055] Além disso, é evidente para um versado na técnica que tanto nos exemplos apresentados como no restante da descrição as quantidades de componente presentes nas composições é de apenas 100% em peso ou 100 % em mol com base na composição como um todo e não podendo exceder isto, mesmo que valores mais altos possam ser obtidos a partir das faixas de porcento dadas. Salvo indicação em contrário dados em % correspondem a % em peso com exceção de relações que são apresentadas com dados de volume.

Exemplos para Ilustração da invenção Exemplo 1 Cristalização de (R)-DOPC

[0056] 200 g de (R)-DOPC amorfo são dissolvidos a 25 oC em 1700 ml de acetonitrila. A solução é resfriada até -10 0C à razão de 0,1 oC/min. A cristalização começa a 10 oC. Quando a cristalização é completada, o produto é isolado por filtração e seco sob vácuo. O rendimento de (R)-DOPC cristalino é 180 g (90%).

[0057] As modificações de cristal (R,S)- e (S)-DOPC podem ser obtidas da mesma maneira.

Exemplo 1a Recristalização de DOPC a partir de acetato de etila

[0058] 20,0 g de DOPC são dissolvidos a 35 oC em 100 ml de ace tato de etila. A solução é resfriada rapidamente até 20 oC e em seguida a - 10 oC a uma taxa de 0,01 oC/min, durante o que começa a cristalização. O cristalizado é separado por filtração e seco em vácuo em temperatura ambiente. O rendimento é 19,6 g de (R)-DOPC cristalino (98,1% de teoria). A uma temperatura de aquecimento de 5 oC /min, o produto apresenta com um ponto de fusão de 71 oC e uma entalpia de fusão de 49,4 J/g

Exemplo 2 Estabilidades

[0059] Para determinação da estabilidade do DOPC cristalino, as substâncias juntamente com amostras comparativas são estocadas a 25 oC e 60% de umidade relativa bem como a 40°C e 75% de umidade relativa com exclusão de ar. O teor residual de DOPC é medido em intervalos periódicos e comparado com o valor inicial.

[0060] Pureza e teor de DOPC são determinados por HPLC.

[0061] Para a modificação de cristal Tipo I foram obtidos os seguintes valores: Tabela 1:

Exemplo 3 Padrões de difração de raios X em pó

[0062] Para caracterização das modificações de cristais de DOPC foram registrados padrões de difração de raios X em pó (espectros de difração XRD) destas substâncias. Para finalidades comparativas foram também registrados padrões de difração de raios X em pó (espectros de difração XRD) de variantes de DOPC liofilizadas e cerosas.

[0063] Para modificações de cristais de DOPC do tipo I são obtidos para lipídios espectros de resolução relativamente alta com faixas meio agudas. Os espectros indicam alto teor cristalino. Não são visíveis componentes amorfos no microscópio de polarização.

[0064] Um espectro ilustrativo pode ser visto na figura 1 (Tipo I). Para comparação, espectros de amostras amorfascomercialmente disponíveis são também registrados em condições análogas e mostrados como figura 2 (liofilizado) e figura 3 (ceroso).

[0065] A Tabela 2 lista valores selecionados de 2θ para a modificação de cristal de DOPC Tipo I: Tabela 2

Exemplo 4 Modificações

[0066] Modificações de cristais de DOPC do Tipo I ocorrem como materiais granulados soltos (figura 4) enquanto amostras comerciais de DOPC são obtidas como liofilizados ou como grumos cerosos (figura 5).

[0067] Em observação com microscópio de polarização, a modificação de cristal de DOPC do Tipo I é claramente reconhecível como material cristalino (figura 6), ao passo que os materiais comparativos liofilizados (figura 7) e cerosos (figura 8) aparecem amorfos.

Exemplo 5 Comportamento em fusão

[0068] Medições por calorimetria diferencial de varredura (Differential Scanning Calorimetry (DSC)) mostram claras diferenças entre a modificação de cristal de DOPC do tipo I (figura 9), e os materiais comparativos liofilizados (figura 10) e cerosos (figura 11).

Claims (13)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que é (R,S)-, (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, apresentando valores 2θ 3,6, 5,3, 18,3, 19,3 e 21,7.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina.

3. Misturas, caracterizadas pelo fato de que compreendem (R)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina e (S)-1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, como definidas na reivindicação 1 ou 2.

4. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é (R)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina.

5. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, apresentando cinco dos valores 2θ 3,6, 5,3, 7,1, 8,8, 11,0, 12,3, 15,3, 17,6, 18,3, 19,3, 20,4, 21,1, 21,7, 22,8 ou 26,4.

6. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, apresentando valores 2θ de 3,6, 5,3, 7,1, 12,3, 17,6, 18,3, 19,3, 21,1, 21,7 ou 22,8.

7. Composto, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, apresentando um ponto de fusão superior a 60oC, e uma entalpia de fusão superior a 48 J/g.

8. Processo para preparação de (R,S)-, (R)- ou (S)-1,2- dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) cristalina, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a cristalização a partir de um ou mais solventes apróticos, sendo que o solvente aprótico é selecionado dentre: (i) um éter selecionado dentre tetraidrofurano, metiltetraidrofurano ou dioxano, (ii) uma cetona selecionada dentre acetona, 2-butanona, metil isobutil cetona ou metil isopropil cetona, ou (iii) uma nitrila selecionada de acetonitrila.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o solvente polar é um éster selecionado do grupo consistindo em formiato de etila, acetato de metila, acetato de etila, acetato de propila, acetato de isopropila, acetato de butila, acetato de isobutila, carbonato de dimetila, carbonato de dietila, 1,3-dioxolidin-2- ona, ou misturas dos mesmos.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o um ou mais solventes apróticos está em uma mistura com um álcool selecionado do grupo consistindo em metanol, etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, 2- butanol, t-butanol, 3-metil-1-butanol, etileno glicol, metoxietanol, etoxietanol, ou misturas dos mesmos.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma recristalização de (R,S)-, (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosforilcolina (DOPC) amorfa ou cristalina.

12. Uso de (R,S)-, (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosforilcolina (DOPC) cristalina, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para preparação de medicamentos.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende (R,S)-, (R)- ou (S)-1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosforilcolina (DOPC) cristalina, como definida na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.