BRPI0913972A2

BRPI0913972A2 - Proteínas de fusão e seus usos no diagnóstico e tratamento de leishmaniose

Info

Publication number: BRPI0913972A2
Application number: BRPI0913972-9A2A
Authority: BR
Inventors: Ajay Bhatia; Steven G Reed
Original assignee: Infectious Disease Res Inst
Priority date: 2008-07-03
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2014-09-30
Also published as: CN102083853B; EP2291394A1; CN102083853A; US8771710B2; US20130071862A1; US8231881B2; BRPI0913972B1; AR073452A1; US20150017200A1; EP2291394B1; WO2010003085A1; US20100008924A1; ES2628743T3; PT2291394T; US9279005B2

Description

“PROTEÍNAS DE FUSÃO E SEUS USOS NO DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE LEISHMANIOSE”

REFERÊNCIA CRUZADA RELACIONADA AO PEDIDO

Este pedido reivindica o benefício sobre USC §119(e) do Pedido de Patente Provisório dos EUA No. 61/078.255 depositada em 3 de Julho de 2008, onde este pedido provisório é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO SOBRE LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

A Listagem de Seqüências associada com este pedido é provida em formato de texto no ligar de uma cópia em papel e é por este meio incorporada por referência dentro da 10 especificação. O nome do arquivo de texto contendo a Listagem de Seqüência é 480239_406PC_SEQUENCE_LISTING.txt. O arquivo de texto tem 53KB, foi criado em 2 de Julho de 2009, e está sendo eletronicamente submetido através da EFS-Web, concomitantemente com o preenchimento da especificação.

ANTECEDENTE Campo Técnico

A presente invenção geralmente se relaciona com proteínas de fusão feitas de uma construção de gene quimérico sintético compreendendo seqüências de K26, K39 e K9 e seu uso no diagnóstico e tratamento de leishmaniose.

Descrição da Técnica Relacionada Organismos Leishmania são parasitas protozoários intracelulares de macrófagos

que causam uma ampla variedade de doenças clínicas em humanos e animais domésticos, principalmente cachorros. Em algumas infecções, o parasita pode ficar dormente por vários anos. Em outros casos, o hospedeiro por desenvolver uma de uma variedade de formas de leishmaniose. Por exemplo, a doença pode ser assintomática ou por se manifestar como 25 leishmaniose visceral sub clínica, o que é caracterizada por sintomas leves de mal estar, diarréia e hepatomegalia intermitente. Pacientes com doenças sub clínicas ou assintomáticas geralmente têm baixos títulos de anticorpos, fazendo ser difícil detectar a doença com técnicas padrão. Alternativamente, leishmaniose pode ser manifestada como uma doença cutânea, o que é um problema médico severo, mas é geralmente auto limitada, ou como 30 uma doença mucosa altamente destrutiva, a qual não é auto limitada. Finalmente, e mais seriamente, a doença pode ser manifestada como uma infecção visceral aguda envolvendo o baço, fígado e linfonodos, os quais, se deixados sem tratamento, são geralmente uma doença fatal. Sintomas de leishmaniose visceral aguda incluem hepatoesplenomegalia, febre, leucopenia, anemia e hipergamaglobulinemia.

Três principais variantes clínicas desta doença são conhecidas: cutânea, mucocu

tânea e visceral. Leishmaniose cutânea por manifestar-se como uma única ulceração da pele no local da picada de fIebotomíneos aparecendo logo após infecções ou meses mais tarde como lesões disseminadas. A síndrome mucocutânea se desenvolve como a forma cutânea, mas progride meses ou anos mais tarde para lesões na boca, nariz ou faringe. Os maiores efeitos de longo prazo das doenças cutâneas e mucocutâneas são cicatrizes. Leishmanioses viscerais têm um período deincubação de 3 a 6 meses e envolvem o sistema reticuloendotelial.

Manifestações clínicas da leishmaniose visceral incluem alargamento do fígado e do baço, febre, anemia e perda de peso. Na ausência de tratamento, a doença visceral sintomática muitas vezes termina em morte. Em anos recentes, a coexistência de HIV e espécies de Leishmania causando doenças viscerais tem resultado em vários milhares de casos 10 de indivíduos duplamente infectados (Berman, J.D., (1997) Clin. Infect. Dis. 24:684). A Organização Mundial de Saúde recentemente estimou em 2000 que a leishmaniose afeta pessoas em 88 países, com 350 milhões em risco de contrair a doença e cerca de dois milhões de novos casos a cada ano. O impacto devastador desta doença é exemplificado pela recente epidemia de Ieishmanioses viscerais no Sudão, o que reivindicou um estimado de 15 100.000 vidas (Seaman, J., et al. (1996) Int. J. Epidemol 25:862). Essa doença é frequentemente uma ameaça a operações militares, como demonstrado pelo surto de Ieishmanioses viscerotrópicas durante a Guerra do Golfo (Magill, J., et al. (1993) N Engl J Med 328:1383).

Leishmaniose é um problema sério em grande parte do mundo, incluindo Brasil, China, Africa Oriental, índia e áreas do Oriente Médio. A doença é também epidêmica na 20 região Mediterrânea, incluindo o sul da França, Itália, Grécia, Espanha, Portugal e Norte da África. O número de casos de leishmaniose tem crescido dramaticamente nos últimos 20 anos e milhões de casos dessa doença existem hoje ao redor do mundo. Cerca de 2 milhões de novos casos são diagnosticados a cada ano, 25% dos quais são Ieishmanioses viscerais. No entanto, não há vacinas ou tratamentos efetivos disponíveis atualmente.

Leishmaniose é causada por várias espécies de Leishmania. Esses organismos u

nicelulares da ordem Kinetoplatida estão relacionados a tripanossomos, os organismos causadores da Doença do Sono na África e Doença de Chagas na América no Sul. Parasitas Leishmania existem comumente em duas formas distintas, as promastigotas móveis do inseto vetor e as amastigotas sésseis presentes nos hospedeiros mamíferos. Promastigotas são 30 transmitidas aos humanos pelas picadas de inseots Flebotomíneos infectados, os quais são encontrados pelas regiões intertropicais e temperadas do mundo. No momento da distribuição ao hospedeiro mamífero, promastigotas infectam os macrófagos do sistema reticuloendotelial e se transformam em amastigotas.

Diagnósticos precisos de Ieishmanioses são frequentemente difíceis de se conseguir. Existem 20 espécies de Leishmania que infectam humanos, incluindo L donovani, L chagasi, L. infantum, L. major, L. amazonesis, L. braziiiensis, L panamensis, L mexicana, L. trópica e L guyanensis, e não há sinais distintos ou simtomas que indicam inequivocadamente a presença de infecção Leishmania. Métodos de detecção parasita têm sido usados, mas tais métodos não são nem sensíveis, nem clinicamente práticos. Atualmente testes de pele tipicamente usam parasitas inteiros ou lisados. Tais testes são geralmente insensíveis, irreprodutíveis e inclinados a reações cruzadas com uma variedade de outras doenças. Além disso, a preparação empregada em tais testes é muitas vezes instáveis.

Assim, existe a necessidade de métodos de detecção da infecção de Leishmania melhorados. Por exemplo, existe uma necessidade de métodos de detecção da infecção de Leishmania mais sensíveis e específicos na técnica, e para identificar as infecções de Leishmania assintomáticas que são parecidas com o progresso de infecções viscerais agudas. 10 A invenção presente cumpre essas necessidades e prevê ainda outras vantagens relacionadas.

BREVE RESUMO

A invenção presente se relaciona em geral a composições compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, polipeptídeos de fusãocompreendendo 15 antígenos e polinucleotídeos codificando os antígenos e fusões, em que os antígenos de Leishmania são selecionados a partir de K39, K26 e/ou K9. A invenção presente também relata métodos de utilização de polipeptídeos e polinucleotídeos da invenção no diagnóstico, tratamento e prevenção da leishmaniose. Os antígenos da invenção, quando empregados em combinação e/ou como polipeptídeos ou polinucleotídeos de fusão como aqui descrito, 20 oferecem vantagens melhores e inesperadas, e são particularmente úteis no contexto de diagnóstico de leishmaniose e desenvolvimento de vacina.

Além disso, de acordo com uma modalidade, a invenção presente provê um polipeptídeo de fusão isolado compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados de um grupo consistido de K26, K39 e K9, ou porções imunogênicas ou suas varian25 tes. Em modalidades relacionadas, um polipeptídeo de fusão isolado compreende pelo menos três dos antígenos de Leishmania acima, em que pelo menos um dos antígenos é isolado de Leishmania donovani.

Em modalidades particulares, polipeptídeos de fusãoda invenção compreende uma primeira porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 142-267 de K26 (SEQ 30 ID NO: 5); uma segunda porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 2110- 2343 de K39 (SEQ ID NO: 6); e uma terceira porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 1-399 de K9 (SEQ ID NO:7). Em mais modalidades particulares, um polipeptídeo de fusão da presente invenção compreende uma seqüência aminoácida como revelado em resíduos aminoácidos 10-262 da SEQ IN NO: 8. Em certas modalidades, o polipeptídeo 35 de fusão compreende uma seqüência aminoácida N-terminal de MHHHHHHTS (SEQ IN NO: 21). Em certas outras modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência aminoácida como revelado na SEQ ID NO: 8. Em várias modalidades, a invenção presente provê polinucleotídeos isolados codificando um polipeptídeo de fusão da presente invenção.

A presente invenção também provê um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação do antígeno que liga especificamente o polipeptídeo de fusão como descritos aqui.

Em outra modalidade, a invenção contempla a composição farmacêutica compre

endendo um polipeptídeo de fusão da presente invenção, ou um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação de antígeno reconhecendo um polipeptídeo de fusão da presente invenção, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de fusão da presente invenção, em combinação com um veículo fisiologicamente aceitável.

Em modalidade relacionada, a presente invenção contempla composições de vaci

na compreendendo um polipeptídeo de fusão da presente invenção, ou um anticorpo isolado ou um fragmento de ligação do antígeno reconhecendo um polipeptídeo de fusão da presente invenção, ou um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de fusão da presente invenção, em combinação com um aumentador da resposta imune não específica.

Em modalidades particulares, a presente invenção provê métodos para detectar in

fecções de Leishmania assintomáticas ou sub clínicas em uma amostra biológica selecionada a partir um grupo consistindo de soros, sangue e saliva, compreendendo: contatar uma amostra biológica com um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados a partir de um grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou suas 20 porções imunogênicas; e detectando na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo de fusão, assim detectando infecções de Leishmania ativas ou sub clínicas assintomáticas na amostra biológica. Em mais modalidades particulares, um método para detectar infecções de Leishmania sub clínicas ou assintomáticas em uma amostra biológica emprega um polipeptídeo de fusão compreendendo: uma primeira porção imunogêni25 ca compreendendo pelo menos resíduos 147-267 de K26 (SEQ ID NO: 5); uma segunda porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 2110-2343 de K39 (SEQ ID NO:6): e uma terceira porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 1-399 de K9 (SEQ ID NO: 7). Em modalidades ainda mais particulares, o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos como revelado nos resíduos 10-262 de SEQ ID 30 NO: 8. Em modalidades ainda mais particulares relacionadas, o polipeptídeo de fusão compreende ainda uma seqüência de aminoácidos N-terminais de MHHHHHHTS (SEQ ID NO: 21).

Em modalidades relacionadas, métodos para detecção de infecções de Leishmania sub clínicas ou assintomáticas em uma amostra biológica utiliza um polipeptídeo de fusão ligado a um suporte sólido, em que o suporte sólido com compreender, por exemplo, nitrocelulose, látex ou material plástico. Em certas modalidades, os métodos ainda compreendem i) remoção de amostras não ligadas a partir de um suporte sólido; ii) adição de reagente de detecção ao suporte sólido; e iii) determinação do nível de detecção do reagente ligado ao suporte sólido, relativo ao valor de corte pré determinado, assim detectando infecções de Leishmania sub clínicas ou assintomáticas na amostra biológica.

Em várias modalidades, a invenção presente provê métodos de identificar um paci5 ente afligido com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática que é suscetível a desenvolver leishmaniose visceral aguda, compreendendo: contatar uma amostra biológica obtida de um paciente afligido com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática com um primeiro polipeptídeo que é um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou suas porções 10 imunogênicas, a amostra biológica sendo selecionada a partir do grupo consistindo de soro, sangue e saliva; e independentemente contatar a amostra biológica com um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos como revelado nas SEQ ID Nos:

6, 10 ou 11; e detectar na amostra a presença de anticorpos que são vinculados a pelo menos um do primeiro e segundo polipeptídeo, assim identificando um paciente afligido com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática que é suscetível a desenvolver leishmaniose visceral aguda.

Em modalidades particulares, os métodos de identificação de pacientes afligidos com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática que são suscetíveis a desenvolver leishmaniose visceral aguda empregam um polipeptídeo compreendendo uma primeira por20 ção imunogênica incluindo pelo menos resíduos 142-267 (SEQ ID NO: 5); uma segunda porção imunogênica compreendendo pelo menos resíduos 2110-2343 de K39 (SEQ ID NO: 6) e uma terceira porção compreendendo pelo menos resíduos de 1-399 de K9 (SEQ ID NO:7). Em modalidades ainda mais particulares, o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência de aminoácido como revelado em resíduos aminoácidos 10-262 SEQ ID NO: 8. 25 Em modalidades ainda mais particulares relacionadas, o polipeptídeo de fusão compreende ainda uma seqüência de aminoácido N-terminal de MHHHHHHTS (SEQ ID NO: 21).

Em modalidades relacionadas, métodos de identificação de pacientes afligidos com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática que é suscetível a desenvolver leishmaniose visceral aguda empregam um polipeptídeo de fusão ligado a um suporte sólido, em 30 que o suporte sólido pode compreender, por exemplo, nitrocelulose, látex ou material plástico. Em certas modalidades relacionadas, os métodos ainda compreendem i) remoção de amostra não ligada a partir de cada suporte sólido; ii) adição de um reagente de detecção a cada suporte sólido; e iii) comparação do nível de detecção do reagente ligado a cada suporte sólido, relativo ao valor de corte pré determinado, assim identificando um paciente afli35 gido com leishmaniose sub clínica ou assintomática que é suscetível a desenvolver leishmaniose visceral aguda.

Em modalidades particulares, o regente de detecção compreende um grupo repórter conjugado a um agente ligado. Em modalidades relacionadas o agente de ligação é selecionado a partir do grupo consistindo de antiimunoglobulina, Proteína G, Proteína A e Iectinas. Em modalidades mais relacionadas, o grupo repórter é selecionado a partir do grupo consistindo de radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminescentes, enzimas, ouro coloidal, biotina e partículas de corante.

Em várias outras modalidades, a invenção presente provê kits de diagnóstico para detecção de leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática em uma amostra biológica. Em modalidades particulares, kits para detecção de leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática em uma amostra biológica, em que a amostra é selecionada a partir de um 10 grupo consistindo de soro, sangue e saliva compreende um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos Leishmania selecionados a partir do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou suas porções imunogênicas; e um reagente de detecção.

Em certas modalidades, um kit de diagnóstico para identificação de um paciente afligido com leishmaniose visceral sub clínica ou assintomática que é suscetível a desenvol15 ver leishmaniose visceral aguda, contém um primeiro polipeptídeo que é um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados de um grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou suas porções imunigênicas; e um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido como revelado em SEQ ID NOs: 10 ou 11; e um reagente de detecção.

Kits da presente invenção podem ainda compreender, um reagente de detecção

compreendendo um grupo repórter conjugado a um agente de ligação e/ou um agente de ligação selecionado a partir de um grupo consistindo de antiimunoglobina, Proteína G, Proteína A e Iectinas e/ou um grupo repórter é selecionado a partir de um grupo consistindo de radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminescentes, enzimas, ouro coloidal, biotina e partículas de corante.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISÕES DOS DESENHOS Figura 1 mostra um diagrama esquemático da construção do gene de fusão K28, o qual compreende um motivo de 9 aminoácidos N-terminal incluindo uma marcador 6X HIS (isto é, 6 resíduos histidina), polinucleotídeos 142-267 de uma seqüência de gene LdK26 (SEQ ID NO: 1), polinucleotídeos 2110-2343 de uma seqüência do gene LdK39 (SEQ ID NO: 2), e polinucleotídeos 1-399 de uma seqüência do gene LdK9 (SEQ ID NO: 3).

A figura 2 mostra uma comparação da habilidade dos antígenos K28, K39 e K9 em detectar LV no soro de pacientes humanos da Venezuela.

A figura 3 mostra a comparação da habilidade de antígenos K9, K26, K28, e K39 em detectar LV no soro de caninos da Venezuela.

BREVE DESCRIÇÃO DA SEQÜÊNCIA DE IDENTIFICADORES

SEQ ID NO: 1 representa polinucleotídeos 142-267 de uma L. donovani de sequência do gene K26, a qual codifica uma porção imunogênica de antígeno K26.

SEQ ID NO: 2 representa polinucleotídeos 2110-2343 de uma L donovani de seqüência do gene K39, a qual codifica uma porção imunogênica de antígeno K39.

SEQ ID NO: 3 representa polinucleotídeos 1-399 de uma L donovani de seqüência do gene K9, a a qual codifica uma porção imunogênica e um antígeno KO de comprimento total.

SEQ ID NO: 4 representa a seqüência polinucleotídia de uma gene sintético, K28, o qual compreende um motivo de 9 aminoácidos N-terminal compreendendo um marcador 6X HIS, a seqüência polinucleotídia de SEQ ID NO: 1, fusionada à seqüência polinucleotídia de SEQ ID NO: 2, a qual é fusionada a seqüência polinucleotídia SEQ ID N03. O ORF começa no nucleotídio 4.

SEQ ID NO: 5 representa a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo imunogênico codificado por polinucleotídeos 142-267 de um antígeno K26 de L. donovani.

SEQ ID NO: 6 representa uma seqüência de aminoácido de um polipeptídeo imunigênico codificado por polinucleotídeos 2110-2343 de um antígeno K39 de L. donovani.

SEQ ID NO: 7 representa a seqüência de aminoácido do polipeptídeo imunogênico de comprimento total codificado pelos polinucleotídeos 1-399 de um antígeno K9 de L. donovani.

SEQ ID NO: 8 representa a seqüência de aminoácido do polipeptídeo K28 codificada pelo SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 9 representa a seqüência de aminoácido de uma única unidade de repetição de um antígeno K39 de L donovani.

SEQ ID NO: 10 representa a seqüência de aminoácido de uma única unidade de repetição de um antígeno K39 de L. donovani.

SEQ ID NO: 11 representa a seqüência de aminoácido de uma única unidade de

repetição de um antígeno K39 de L. donovani.

SEQ ID NO: 12 representa uma seqüência polinucleotídia codificando uma única unidade de repetição de um antígeno K26 de L donovani de acordo com a SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 13 representa uma seqüência polinucleotídia de uma única unidade de repetição de um antígeno K26 de L donovani de acordo com a SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 14 representa uma seqüência polinucleotídia codificando a única unidade de repetição de um antígeno K39 de L. donovani de acordo com a SEQ ID NO: 10.

SEQ ID NO: 15 representa uma seqüência polinucleotídica codificando a única unidade de repetição de um antígeno K39 de L donovani de acordo com a SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 16 representa a seqüência polinucleotídia de comprimento total de um

gene K26 de L. donovani.

SEQ ID NO: 17 representa a seqüência polinucleotídia de comprimento total de um δ gene Κ39 de L donovani.

SEQ ID NO: 18 representa a seqüência polinucleotídia de comprimento total de um gene K9 de Ldonovani.

SEQ ID NO: 19 representa a seqüência de aminoácido codificada por SEQ ID NO: 16.

SEQ ID NO: 20 representa a seqüência de aminoácido codificada por SEQ ID NO:

17.

SEQ ID NO: 21 representa um marcador histidina N-terminal ilustrativo utiliazado na produção recombinante de polipeptídeos na presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

ANTÍGENOS DE LEISHMANIA E SUAS FUSÕES

A presente invenção geralmente se relaciona a composições e métodos de utilização dos antígenos Leishmania. As composições da presente invenção geralmente compreendem pelo menos dois antígenos heterólogos ou suas porções imunogênicas de uma es15 pécie de Leishmania. Seqüência de antígeno de Leishmania pode ser obtida, por exempo, a partir do banco de dados do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) para uma variedade de espécies de Leishmania, incluindo L. donovani, L. chagasi, L infantum, L. major, L amazonesis, L. venezueiensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. mexicana, L. tropica e L. guianensis.

Em um aspecto, a presente invenção provê polipeptídeo de Leishmania isolado,

como aqui descrito, incluindo fusão de polipeptídeos, e composições contendo os mesmos. Geralmente, um polipeptídeo da presente invenção será um polipeptídeo isolado e pode compreender uma fragmento de polipeptídeo (por exemplo, uma porção antigênica/imunigênica), múltiplos fragmentos polipeptídeos (por exemplo, polipeptídeo de fusão), 25 ou um polipeptídeo de comprimento total de uma seqüência de aminoácido a partir de dois ou mais genes Leishmania, incluindo, mas não limitado a K26, K39 e/ou K9. Um dos versados na técnica apreciará que fragmentos de polipeptídeos antigênicos podem também ser obtidos a partir daqueles já disponíveis na técnica. Polipeptídeos da invenção, seus fragmentos antigênicos/imunogênicos, a outras variantes podem ser preparados utilizando téc30 nicas de recombinações e/ou sintéticas convencionais.

Em certas modalidades, os polipeptídeos da presente invenção são polipeptídeos de fusão. Em modalidades particulares, os polipeptídeos de fusão compreendem antígenos K26, K39 e/ou K9 ou suas porções imunogênicas, as quais são antigênicas/imunogênicas, isto é, elas reagem detectavelmente dentro de um imunoensaio (tal como um ELISA ou en35 saio de estimulação de células T) com antisoro e/ou células T a partir de um paciente infectado. Triagem para atividade imunogênica pode ser realizada utilizando-se técnicas bem conhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, tais triagens podem ser realizadas utilizando-se métodos tais como aqueles descritos em Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Em um exemplo ilustrativo, um polipeptídeo da presente invenção (por exemplo, um polipeptídeo de fusão) pode ser imobilizado em um suporte sólido e contatado com soro paciente para permitir a ligação dos anticorpos 5 com o soro para o polipeptídeo imobilizado. Soro não ligado pode então ser removido e ligar anticorpos utilizando, por exemplo, Proteína A marcada com125|.

Como pode ser reconhecida por um versado na técnica, o polipeptídeo de fusão da presente invenção pode compreender porções ou fragmentos antigênicos ou imunogênicos de polipeptídeos K26, K39 e/ou K9 de Leishmania aqui revelados. Uma “porção imunogênica”, como utilizado aqui, é um fragmento de um polipeptídeo imunogênico da invenção que é reativa imunologicamente por si mesmo (isto é, se liga especificamente) com os receptores de antigenos de superfície de células B e/ou células T que reconhecem o polipeptídeo. Porções imunogênicas podem geralmente ser identificadas utilizando-se técnicas bem conhecidas, tais como aquelas resumidas em Paul, Fundamental Immunology, 5a ed., Lippincott Williams e Wilkid, 2003 e referências aqui citadas. Tais técnicas incluem triagem de polipeptídeos para a habilidade de reagir com anticorpos com antígenos específicos, antosoros e/ou linhagens ou clones de células T. como aqui utilizados, antisoros e anticorpos são “antígenos específicos” se eles estão especificamente ligados a um antígenos (isto é, eles reagem com a proteína em imunoensaios, e não reagm diretamente with proteínas não relacionadas). Tais antisoros e anticorpos podem ser preparados como aqui descrito e utilizandose técnicas bem conhecidas.

Em uma modalidade particular, uma porção imunogênica/antigênica ou fragmento polipeptídeo de um polipeptídeo de fusão da presente invenção é uma porção que reage com antisoros e/ou células T em um nível que não é substancialmente menor que a reatividade do polipeptídeo de fusão de comprimento total (por exemplo, em uma ELISA e/ou ensaio de reatividade na célula T). Preferivelmente, o nível de atividade imunogênica da porção antigênica/imunogênica dentro um polipeptídeo de fusão é pelo menos cerca de 50%, preferivelmente pelo menos cerca de 70% e mais preferivelmente melhor do que cerca de 90% da imunogenicidade para o polipeptídeo de fusão de comprimento total. Em alguns exemplos, porções imunogênicas preferidas serão identificadas as que tem nível de atividade imunogênica maior que o polipeptídeo de fusão de comprimento total correspondente, por exemplo, tendo mais que cerca de 100% ou 150% ou mais atividade imunogênica. Em modalidades particulares, a imunogenicidade do polipeptídeo de fusão de comprimento total terá imunogenicidade aditiva contribuída para cada uma das porções antigênicas/ imunogênicas aqui contidas.

Um polipeptídeo de fusão pode também compreender um ou mais polipeptídeos que são imunologicamente reativos com células T e/ou anticorpos gerados contra um polipeptídeo da invenção, particularmente um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido aqui revelada, ou a um fragmento imunogênico e suas variantes. Em modalidades particulares, o polipeptídeo é um polipeptídeo de fusão com aqui descrito.

Em outra modalidade da invenção, polipeptídeos de fusão são providos e compre5 endem dois ou mais polipeptídeos que são capazes de elicitar células T e/ou anticorpos que são imunologicamente reativos com dois ou mais polipeptídeos aqui descritos, ou dois ou mais polipeptídeos codificados por seqüências polinucleotídias contíguas contidas na seqüência polinucleotídia aqui revelada, ou fragmentos imunogênicos ou suas variantes, ou duas ou mais seqüências polinucleotídicas as quais hibridizam para duas ou mais destas 10 seqüências sob condições de moderado a alto rigor.

A presente invenção também provê polipeptídeos de fusão compreendendo fragmentos de polipeptídeos K26, K29 e/ou K9, incluindo fragmentos imunogênicos/antigênicos compreendendo pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300 ou 350 aminoácido contíguos, ou mais, incluindo todos os comprimentos intermediários, de um 15 antígeno K26, K39 e ou K9 de Leishmania, tais como aqueles aqui revelados, ou aqueles codificados por uma seqüência polinucleotídia aqui revelada.

Em outro aspecto, polipeptídeos de fusão da presente invenção contêm múltiplas cópias de fragmentos de polipeptídeos, repetições de fragmentos de polipeptídeos, ou fragmentos de polipeptídeos multiméricos, incluindo fragmentos antigênicos/imunogênicos tais 20 como polipeptídeos K26, K39, e/ou K9 de Leishmania, compreendendo pelo menos cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais fragmentos contíguos, em qualquer ordem, e incluindo todos os comprimentos de uma composição de polipeptídeos aqui revelados, ou aqueles codificados por uma seqüência polinucleotídica aqui revelada. Em outro aspecto, polipeptídeos de fusão da presente invenção podem compreender dois ou mais fragmentos de antí25 genos de Leishmania como recitado em SEQ ID NO:5-7, e 9-11. Em um aspecto relacionado, o polipeptídeo de fusão compreende a seqüência de aminoácido revelada na SEQ ID NO: 8 ou aminoácidos 10-262 da SEQ ID NO: 8.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção provê polipeptídeos de fusão compreendendo duas ou mais variantes de polipeptídeos K26, K29 e/ou K9 de Leishmania aqui 30 descritos. Variantes de polipeptídeos geralmente compreendidos pela presente invenção exibirão tipicamente cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade ou mais (determinado como descrito abaixo), a longo de seu comprimento, para uma seqüência de polipeptídeo aqui revelada. Preferivelmente, tais variantes terão a mesmo, ou similar ou melhorada atividade imunológica relativa a uma se35 quência K26, K29 e/ou K9 nativa.

Um polipeptídeo“variante”, como o termo aqui utilizado, é um polipeptídeo que tipicamente difere de um polipeptídeo especificamente aqui revelado (por exemplo, polipeptídeos Κ26, Κ29 e/ou K9 de Leishmania) em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem estar ocorrendo naturalmente ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, através da modificação uma ou mais seqüências de polipeptídeos da invenção acima e avaliação de suas atividades imunogênicas como aqui descrito utilizando qualquer de um número de técnicas bem conhecidas pela técnica.

Em muitos exemplos, uma variante irá conter substituições conservadas. Uma “substituição conservada” é uma em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que tem propriedades similares, tais que um técnico versado na técnica de química peptídica pode esperar a estrutura secundária e natureza hidropática dos polipeptídeos a serem 10 substancialmente inalterados. Como descrito acima, modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção e ainda obterem uma molécula funcional que codifica um polipeptídeo variante ou derivado com características desejáveis,por exemplo, com características imunogênicas. Quando é desejado alterar a seqüência de aminoácido de um polipeptídeo para criar uma equivalente, ou até uma porção ou 15 variante imunogênica melhorada de um polipeptídeo da invenção, um versado na técnica modificará tipicamente um ou mais códons da seqüência do DNA codificante de acordo com a Tabela 1.

Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura protéica sem perdas apreciáveis de capacidade de ligação interativa com 20 estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação de antígenos de anticorpos ou sítios de ligação em moléculas substrato. Desde que seja a capacidade interativa e natureza de uma proteína a definir que a atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de seqüências de aminoácidos podem ser feitas em uma seqüência protéica, e, claro, sua seqüência de DNA codificante subjacente, e no entanto, obter uma proteína com proprieda25 des parecidas. É assim contemplado que várias mudanças que podem ser feitas em seqüências peptídicas das composições reveladas, ou seqüências de DNA correspondentes que codificam codificam os referidos peptídeos sem perdas apreciáveis de suas atividades ou utilidades biológicas.

Tabela 1

Aminoácidos Códons Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido Aspár- Asp D GAC GAU tico Acido Glu- Glu E GAA GAG tâmico Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina Ile I AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU T riptofano Trp W UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Fazendo-se tais modificações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice aminoácido hidropático em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica (Kyte e Doolitle, 1982, aqui incorporado por referência). É aceitável que o caráter hidropático relativo do aminoácido contribua 5 para a estrutura secundária da proteína resultante, a qual define por sua vez a interação da proteína com a outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos e semelhantes. Cada aminoácido tem sido atribuído a um índice hidropático baseado em sua hidrofobicidade ou característica de carga (Kyte e Doolittle, 1982). Esses valores são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); Ieucina (+3,8), fenilalanina (+2,8); cisteí10 na/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); Iisina (-3,9); e arginina (-4,5).

É conhecido na técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo o mesmo índice ou pontuação hidropático e ainda resultar em uma prote15 ína de atividade biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína de funcionalidade biológica equivalente. Fazendo-se tais mudanças, a substituição de aminoácidos, dos quais os índices hidropáticos estão entre ±2 é preferido, aqueles entre ±1 são particularmente preferidos, e aquele que estão entre ±0.5 são ainda mais particularmente preferidos. É também entendido na técnica que a substituição de um aminoácido parecido pode ser feita efetivamente na base de hidrofilicidade.

Como detalhado na Patente dos EUA 4.554.101 os valores de hidrofilicidade a seguir têm sido atribuídos a resíduos aminoácidos: arginina (+3,0); Iisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ±1); serina (+3,0); asparagina (+0,2): glutamina (+0,2); glicina (0);

treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (1,3): valina (-1,5); Ieucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano -3,4). É entendido que um aminoácido pode ser substituído por outro tendo hidrofilicidade de valor semelhante a ainda obter-se um equivalente biológico, e em particular, uma proteína imunologicamente equivalente. Em tais mudanças, a substituição de um aminoácido cujos 10 valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2 é preferido, aqueles dentro de ±1 são particularmente preferidos e aqueles dentro de ±0.5 são ainda mais particularmente preferidos.

Como delineado acima, substituições de aminoácidos são geralmente baseadas na similaridade relativa dos substituintes de aminoácidos de cadeia lateral, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilidade, carga, tamanho e semelhança. Substituições exemplares que 15 levam várias das características precedentes em consideração são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: argina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, Ieucina e isoleucina.

Em adição, qualquer polinucleotídeo pode ser ainda modificado para aumentar a estabilidade in vivo. Possíveis modificações incluem, mas não estão limitadas a, adição de 20 seqüências flanqueadoras na terminação 5’ e/ou 3’; o uso de fosforotioato ou 2’ O-metil ao invés de ligações fosfodiesterase na estrutura; e/ou a inclusão de bases não tradicionais tais como inosina, queosina e wybotusine, bem como acetil-metil, tio e outras forma modificadas de adenina, citidina, guanina, timina e uridina.

Substituições de aminoácidos podem ainda ser feitas nas bases de similaridade de 25 polaridades, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoácidos negativamente carregados incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos positivamente carregados incluem lisina e arginina; e grupos de aminoácidos com cabeças polares não carregadas tendo valores de hidrofilicidade similares incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparigina e glutamina; e serina, 30 treonina, fenilalanina e tirosina. Outro grupos de aminoácidos que podem representar mudanças conservadoras incluem: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr;

(3) vai, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his, e (5) phe, tyr, trp, his. Uma variante pode também, ou altenativamente, conter mudanças não conservativas. Em uma modalidade preferida, polipeptídeos variantes diferem de uma seqüência nativa por substituição, deleção, ou 35 adição de cinco aminoácidos ou menos. Variantes podem também (ou alternativamente) serem modificadas por, por exemplo, a deleção ou adição de aminoácidos que têm mínima influencia na imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo. Como anotado acima, polipeptídeos podem compreender uma seqüência sinal (ou líder) no terminação N-terminal da proteína, a qual co-traducionalmente ou pós traducionalmente direciona a transferência da proteína. O polipeptídeo pode também estar conjugado a um Iigador ou outra seqüência para facilitar a síntese, purificação ou identificação do 5 polipeptídeo (por exemplo, marcador de poli-histidina (6XHis), GST, MBP, TAP/TAG, epítopo FLAG, epítopo MYC, epítopo V5, epítopo VSV-G etc.), ou para aumentar a ligação do polipeptídeo a um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode estar conjugado a uma região Fc de imunoglobulina.

Quando comparando seqüências de polipeptídeos, duas seqüências são ditas serem “idênticas” se a seqüência de aminoácidos nas duas seqüências forem a mesma quando alinhadas pelo máximo de correspondência, como descrito abaixo.

Comparações entre duas seqüências são tipicamente realizadas pela comparação de seqüências sobre uma janela de comparação para indentificar e comparar regiões locais de uma seqüência de similaridade. Uma “janela de comparação” como aqui utilizado, refere15 se ao segmento de pelo menos 20 posições contíguas, usualmente 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, nas quais a seqüência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas seqüências são idealmente alinhadas.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido utilizando-se do programa Megalign no programa adequado Lasergene de bioinformáticos (DNASTAR, Inc., Madison, Wl) utilizando-se parâmetros padrões. Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas referências a seguir: Dayhoff, M.O (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC ol. 5, Supl. 3, PP. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes PP. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc. San Diego, CA, Higgins, D. G. e Sharp, P.M (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E.W. e MulIer W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., (1971) Comb. Theor 7 7:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Bioi Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A e Sokal, R.R (1973) Numerical Taxonomy - The Principies and Practice of Numerieal Taxonomy, Impressão Freemas, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. e Lipman, D. J. (1983) Proe. Nat1IAcad., Sei. USA 80:726-730.

Alternativamente, o alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser conduzido pelo algorítimo de identidade local de Smith e Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, pelo algorítimo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. 35 Biol. 48:443, pela procura de métodos similares de Pearson e Lipman (1988) Proe. Nat’l Aead. Sei. USA 85: 2444, por implementação computadorizada destes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA no Pacote de Programa de Genética Wisconsin, Grupo Computadores Genéticos (GCG), 575 Science, Dr., Madison, Wl), ou por inspeção.

Um exemplo preferido de algoritmos que são adequados para determinar o percentual de identidade de seqüência e similaridade de seqüência são os algorítimos BLAST e o BLAST 2.0, os quais são descritos em Altschul etal{1977) NucL Acids Res. 25:3389-3402 e Altschul et ai (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser utilizados, por exemplo, com os parâmetros aqui descritos, para determinar percentual de identidade de seqüência para os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Programa BLAST para realizar análises é publicamente disponível pelo Centro Nacional de Informação Biotecnológica. Para seqüências aminoácidas, uma matriz de pontos pode ser utilizada para calcular os pontos cumulativos. Extensão da palavra atinge em cada direção são interrompidas quando: o alinhamento dos pontos cumulativos cai pela quantidade de X do seu valor máximo atingido; os pontos cumulativos vão a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontos negativos; ou o final de qualquer seqüência é alcançado. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibiIidade e velocidade do alinhamento.

Em um alinhamento preferencial, a “porcentagem de identidade de seqüência” é determinada pela comparação de duas seqüências alinhadas idealmente sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção de seqüência polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, gaps) de 20 porcento 20 ou menos, usualmente de 5 a 15 porcento, ou de 10 a 12 porcento, como comparado com as seqüências de referência (a qual não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal de duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais o resíduo aminoácido idêntico ocorre em ambas as seqüências para produzir o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições corres25 pondentes pelo total do número de posições nas seqüências de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüência.

Em certas modalidade preferidas da invenção, existem polipeptídeos de fusão de Leishmania fornecidos , e polinucleotídeos codificando fusões polipeptídicas, onde a poli30 peptídeo de fusão compreende duas ou mais seqüências de polipeptídeos K26, K39 e/ou K9, ou suas porções imunogênicas. Fusão polipeptídica e proteína de fusão referem-se a um polipeptídeo tendo pelo menos dois polipeptídeos heterólogos de Leishmania sp., tais como polipeptídeos de Leishmania donovani ligados covalentemente, ou diretamente ou via um Iigador aminoácido. As seqüências antigênicas K26, K39 e/ou K9 podem, mas não pre35 cisam ser derivadas da mesma espécie de Leishmania. Os polipeptídeos formando a proteína de fusão são tipicamente ligados a C-terminal a N-terminal, embora eles também possam ser ligados C-terminal a C-terminal, N-terminal a N-terminal ou N-terminal a C-terminal. Os polipeptídeos da proteína de fusão podem estar em qualquer ordem e podem conter múltiplas cópias, repetições de, ou multímeros de cada um ou qualquer um dos polipeptídeos compreendendo a proteína de fusão. Polipeptídeos de fusão ou proteínas de fusão podem também incluir variantes conservadoramente modificadas, variantes polimórficas, alelos, 5 mutantes, subseqüências, interespécies homólogas, e fragmentos imunogênicos dos antígenos que compõem a proteína de fusão. Em modalidades particulares, polipeptídeos de fusão da presente invenção podem compreender um ou mais fragmentos de antígenos de Leishmania como recitado nas SEQ ID NOs: 5-7 e 9-11. Em modalidades relacionadas, o polipeptídeo de fusão inclui a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID NO: 8 ou ami10 noácidos 10-262 da SEQ ID NO: 8.

Antígenos de outra espécie de Leishmania que correspondem a antígenos de Leishmania donovani podem também ser utilizados e podem ser identificados, por exemplo, utilizando-se a seqüência de comparação de algorítimos, como aqui descrito, ou outros métodos conhecidos pelos versados na técnica, por exemplo,ensaios de hibridização e ensaios de ligação de anticorpos.

Os polipeptídeos de fusão da invenção geralmente compreendem pelo menos duas porções ou fragmentos antigênicos/imunogênicos de polipeptídeos K26, K39, e/ ouK9 como aqui descrito, e podem ainda compreender outras seqüências não relacionadas, tais como a seqüência que auxilia o fornecimento de epítopos auxiliares T (um parceiro de fusão imuno20 lógica), preferivelmente epítopos auxiliares T reconhecidos por humanos, ou que auxiliam em proteínas inexpressivas (um aumentador de expressões) em rendimentos maiores do que proteínas recombinantes nativas. Certos parceiros de fusão preferidas são ambos parceiros de fusão imunológica e aumentadores de expressão. Outros parceiros de fusão podem ser selecionados assim como para aumentar a solubilidade da proteína ou para permitir 25 a proteína ser alvo para compartimentos intracelulares desejados. Ainda parceiros de fusão adicionais podem incluir marcadores de afinidade tais como V5, 6XHIS, MYC, FI_AG e GST, os quais facilitam a purificação da proteína. Isso poderia ser entendido por um versado na técnica que aquelas seqüências não relacionadas podem, mas não precisam estar presentes em um polipeptídeo de fusão utilizado em acordo com a presente invenção.

Proteínas de fusão podem geralmente ser preparadas usando técnicas padrão. Pre

ferivelmente, uma proteína de fusão é expressa como uma proteína recombinante. Por exemplo, seqüências de DNA codificando os componentes do polipeptídeo de uma fusão desejada podem ser unidos separadamente, e ligados a um vetor de expressão apropriado. A terminação 3’ da seqüência de DNA codificando um componente de polipeptídeo é ligada, 35 com ou sem um peptídio de ligação, à terminação 5’ de seqüência de DNA codificando o segundo componente de polipetídio para que a os quadros de leitura da seqüência estejam em fase. Isso permite a tradução em uma única proteína de fusão que retém a atividade biológica de ambos os polipeptídeos componentes.

Uma seqüência Iigadora de polipeptídeos pode ser empregada para separar o primeiro e o segundo componente de peptídio por uma distância suficiente para assegurar que cada polipeptídeo dobre-se em sua estrutura secundária e terciária, se desejado. Tal se5 quência Iigadora peptídica é incorporada na proteína de fusão utilizando-se técnicas padrões bem conhecidas na técnica. Certas seqüências Iigadoras de peptídeos podem ser escolhidas baseadas nos seguintes fatores: (1) sua habilidade de adotar uma conformação estendida flexível; (2) sua inabilidade em adotar uma segunda estrutura que pode interagir com epítopos funcionais no primeiro e no segundo polipeptídeo; e (3) a falta de resíduos 10 carregados ou hidrofóbicos que podem reagir com os epítopos funcionais polipeptídeos. Seqüências Iigadoras de peptídeos preferidas contêm resíduos Gly, Asn e Ser. Outros aminoácidos neutros próximos, tais como Thr e Ala podem também ser utilizados na seqüência ligadora. Seqüências de aminoácidos as quais podem ser empregadas utilmente como Iigadores incluem aquelas reveladas em Maratea et al, Gene 40:39 46 (1985): Murphy et al, 15 Proe. NatL Acad. Sei. USA 83:8258 8262 (1986); Pat.dos EUA No. 4,935,233 e Pat. Dos EUA No. 4,751,180. A seqüência ligadora pode geralmente ser de 1 a cerca de 50 aminoácidos em comprimento. Seqüências Iigadoras não são requisitadas quando o primeiro e o segundo polipeptídeo têm regiões aminoácidas N-terminal não essenciais que podem ser utilizadas para separar os domínios funcionais e prevenir interferências estéricas.

As seqüências de DNA ligadas são operacionalmente ligadas a elementos regulató

rio traducional ou transcricional adequado. Os elemento regulatórios responsáveis pela expressão do DNA são localizados em apenas 5’ para a seqüência do DNA codificando o primeiro peptídio. Similarmente, códons de parada necessários para terminar a tradução e os sinais de terminação da transcrição estão presentes apenas em 3’ para a seqüência de DNA codificando o segundo polipeptídeo.

Dentro de modalidades preferidas, um parceiro imunológico de fusão para uso num polipeptídeo de fusão da invenção é derivado de um a proteína D, umaproteína de superfície da bactéria gram negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Preferivelmente, a proteína D derivada compreende aproximadamente o primeiro terço da proteína (por exemplo,o 30 primeiro aminoácido N-terminal 100 110), e uma proteína D derivada pode ser Iipidada . Dentro de certas modalidades preferidas, os primeiros 109 resíduos de um parceiro de fusão lipoproteína D no N-terminal para prover o polipeptídeo de fusão com epítopos de células T exógenos adicionais e para aumentar o nível de expressão em E. coli (assim funcionando como um potencializador de expressão). A cauda lipídica garante a ótima apresentação do 35 antígeno para células apresentadoras de antígeno. Outros parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus influenza, NS1 (Hhemaglutinin). Tipicamente os aminoácidos 81 N-terminal são utilizados, embora diferentes fragmentos que incluem epítopos de T auxiliar possam ser utilizados. Em outra modalidade, um parceiro de fusão imunológico compreende uma seqüência de aminoácido derivada da proteína conhecida como LYTA, ou sua porção (preferivelmente uma porção C-terminal). LYTA é derivada do Streptococcus pneumoniae, a qual sintetiza uma amidase N-acetil-L-alanina conhecida como amidase LYTA (codificada 5 pelo gene LytA; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA é uma autolisina que especificamente degrada certas ligações na estrutura peptidoglicana. O domínio C-terminal da proteína LYTA é responsável pela afinidade com a colina ou a algum análogo de colina tal como DEAE. Essa propriedade tem sido explorada para o desenvolvimento de E. coli C-LYTA expressando plasmídeos úteis para expressão de proteínas de fusão. Purificação de proteínas híbridas 10 contendo o fragmento C-LYTA no terminal amino tem sido descrita (ver Biotechnology 10.795-798 (1992)). Dentro de uma modalidade preferida, uma porção repetida de LYTA pode ser incorporada ao polipeptídeo de fusão da presente invenção, como aqui descrito. Uma porção repetida é encontrada em região C-terminal começando no resíduo 178. Uma particularmente preferida repetida incorpora resíduos 188-305.

Em geral polipeptídeos e polipeptídeos de fusão (assim como seus polinucleotídeos

codificantes) são isolados. Um polipeptídeo “isolado” ou polinucleotídeos é um que é removido do seu ambiente original. Por exemplo uma proteína que ocorre naturalmente é isolada se for separada de alguns ou todos os materiais coexistentes no sistema natural. Preferivelmente, tais polipeptídeos são pelo menos 90% puros, mais preferivelmente pelo menos 20 cerca de 95% puro e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% puro. Um polinucleotídeo é considerado ser isolado se, por exemplo, é clonado em um vetor que não é parte do ambiente natural.

Em certas modalidades, o polipeptídeo de fusão da invenção incluirá pelo menos um epítopo de cada K26, K39 e K9. Epítopos podem geralmente ser determinados pela geração de polipeptídeos contendo porções ou fragmentos de seqüências e avaliando a reatividade dos polipeptídeos com soro de indivíduos infectados com Leishmania utitlizando-se, por exemplo, um ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA). Ensaios adequados para avaliação de reatividade de um polipeptídeo com soro infectado de Leishmania são descritos em mais detalhes abaixo. Dentro de tais ensaios representativos, porções de sequências que geram um sinal que diferencia entre soros negativos e positivos em maneira substancialmente similar ao comprimento total são considerados conter um epítopo. Em outras palavras, uma porção de antígeno que contém um epítopo gerará um sinal indicando infecção de Leishmania em substancialmente todas as amostras (isto é, pelo menos cerca de 80%, e preferivelmente pelo menos cerca de 90%) das amostras biológicas para as quais tal infecção seria indicado utilizando-se antígeno de comprimento total e será gerado um sinal indicando a ausência de infecção de Leishmania em todas aquelas amostras que podem negativas com polipeptídeo de comprimento total. Em um aspecto relacionado, polipeptídeo de fusão compreendendo epítopos de múltiplos polipeptídeos de Leishmania são revelados. Em certas modalidades particulares, epítopos de diferentes polipeptídeos de Leishmania, repetidos, ou suas variantes, são unidos através de uma ligação peptídica em uma única cadeia de aminoácido. Os epítopos 5 podem ser unidos diretamente (por exemplo,sem intervensão de aminoácidos) ou podem ser unidos por meio de seqüência ligadora (por exemplo,Gly-Cys-Gly) o que não significa alterar as propriedades antigênicas do epítopo. Em modalidades particulares o polipeptídeo de fusão é derivado de duas ou mais porções ou fragmentos antígenos/imunogênicos. Em outro aspecto, polipeptídeos de fusão da presente invenção podem conter dois ou mais 10 fragmentos de antígenos de Leishmania como recitado em SEQ ID Nos: 5-7 e 9-11. Em um aspecto relacionado, o polipeptídeo de fusão inclui a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID NO: 8 ou resíduos de aminoácidos 10-262 SEQ ID NO: 8.

Os polipeptídeos de fusão desta invenção podem ser gerados utilizando-se técnicas bem conhecidas por um versado na técnica. Polipeptídeos da presente invenção tendo me15 nos de cerca de 100 aminoácidos e geralmente menos de cerca de 50 aminoácidos, podem ser sintetizados utilizando-se, por exemplo, o método sintético de fase sólida Merrifield, onde aminoácidos são sequêncialmente adicionados a uma cadeia crescente de aminoácidos (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963). Equipamento para sínteses automáticas dos polipeptídeos são comercialmente disponíveis de provedores tais como Applied 20 Byosistems, Inc. Foster City, Calif. Assim, por exemplo, antígenos de Leishmania K26, K39 e/ou K9 ou suas porções, podem ser sintetizadas por este método.

Alternativamente, os polipeptídeos desta invenção podem ser preparados pela expressão de DNA recombinante codificando o polipeptídeo em células hospedeiras em cultura. Preferivelmente, as células hospedeiras são E. coli, levedura, uma linhagem celular de inseto (tais como Spodoptera ou Trichoplusia) ou uma linhagem celular de mamífero, incluindo (mas não limitado a) CHO, COS, HEK-293T e NS-1. A seqüência de DNA expressa desta maneira pode codificar proteínas ocorrendo naturalmente, e proteínas de fusão compreendendo antígenos de Leishmania como K26, K9 e/ou K39, suas porções e repetições ou variantes de tais proteínas. Polipeptídeos de fusão expressos desta invenção são geralmente isolados substacialmente em forma pura. Preferivelmente, os polipeptídeos de fusão são isolados a uma pureza de pelo menos 80% por peso, mais preferivelmente, a uma pureza de pelo menos 95% por peso, e mais preferivelmente a uma pureza de pelo menos 99% por peso. Em geral, tais purificações podem ser conseguidas utilizando-se, por exemplo, o técnicas padrão de fracionamento de sulfato de amônio, electroforese em SDS-PAGE, e cromatografia de afinidade.

COMPOSIÇÃO DE POLINUCLEOTÍDEOS

A presente invenção também provê polinucleotídeos isolados, particularmente aqueles codificando os polipeptídeos de fusão da invenção, bem como composições contendo tais polinucleotídeos. Como aqui utilizado, os termos “DNA” e “polinucleotídeos” e “ácido nucléico” referem-se a uma molécula de DNA que tenha sido isolada livre do DNA genômico total de espécies particulares. Portanto, um segmento de DNA codificando um polipeptídeo 5 refere-se a um segmento de DNA que contém uma ou mais seqüências codificadoras ainda é substancialmente isolada de, ou purificada de, DNA genômico total de espécies das quais o segmento de DNA é obtido. Incluído dentro do termo “segmento de DNA” e “polinucleotídeo” estão segmentos de DNA e fragmentos menores de tais segmentos, e também, vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagemídeos, fago, vírus e 10 semelhantes.

Como será entendido pelos versados na técnica, as seqüências de polinucleotídeos desta invenção podem incluir seqüências genômicas, extra genômicas, seqüências codificadas por plasmídeos e segmentos de engenharia genética que expressam, ou podem ser adaptados para expressar, proteínas, polipeptídeos de fusão, peptídeos e semelhantes. 15 Tais segmentos podem ser naturalmente isolados, recombinados, ou modificados sinteticamente pelas mãos do homem.

Como será reconhecido pelo versado na técnica, polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificante ou anti-senso) ou de fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômica, cDNA ou sintética) ou moléculas de RNA. Codificação adicional ou seqüências não 20 codificantes podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não rpecisa, ser vinculado a outra molécula e/ou material de suporte.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica o antígeno de Leishmania ou sua porção) ou pode incluir uma varian25 te, ou um biológico ou antígeno funcional equivalente de tais seqüências. Em modalidades particulares, polinucleotídeos podem ser codificados por duas ou mais porções antígenicas/ imunogênicas, fragmentos ou variantes derivadas dos antígenos de Leishmania K26, K39 e/ou K9. Em certas modalidades polinucleotídeos codificando polinucleotídeos de fusão da presente invençção podem codificar dois ou mais fragmentos de antígenos de Leishmania 30 como recitado em SEQ ID Nos: 5-7 e 9-11. Em aspecto relacionado, o polipeptídeo de fusão é codificado pelos polipeptídeos codificando a seqüência de aminoácidos revelada em SEQ ID NO: 8 ou aminoácidos 1-262 da SEQ ID NO: 8.

Polinucleotídeos variantes podem conter uma ou mais substituições, adições, supressões e/ou inserções, como ainda descrito abaixo, preferivelmente tais que a imunogenicidade do polipeptídeo codificado não é diminuída, relativa a proteína nativa. O efeito na imunogenicidade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser acessado como descrito aqui. O termo “variantes” também compreende genes homólogos de origem xenogênica. Em modalidades adicionais, polinucleotídeos de fusão isolados irão incluir vários comprimentos de trechos contíguos de seqüências idênticas as, ou complementares a dois ou mais K26, K39 e/ou K9, tais como aquelas seqüências reveladas aqui, suas variantes e porções. Por exemplo, polinucleotídeo são providos por essa invenção que compreende 5 pelo menos 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos contíguos de duas ou mais seqüências aqui reveladas bem como todos os comprimentos entre eles. Será prontamente entendido que “comprimento intermediário”, neste contexto, significa qualquer comprimento entre os valores entre aspas, tais como 16, 17, 18, 19 etc.; 21, 22, 23 etc.; 30, 31, 32 etc.; 50, 51, 52, 53 etc.; 100, 101, 102, 103 etc.; 150, 151, 10 152, 153, etc.; incluindo todos inteiros por meio de 200-500; 500-1.000, e semelhantes.

Os polinucleotídeos de fusão da presente invenção, ou seus fragmentos, independentemente do comprimento da própria seqüência codificada, podem ser combinados com outras seqüências de DNA, tais como promotores, sinais de poliadenilação, enzimas locais de restrição adicional, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos codificados e seme15 lhantes, tais que seus comprimentos globais podem variar consideravelmente. É portanto contemplado que o fragmento de polinucleotídeo de quase qualquer comprimento pode ser emprepegado; com o comprimento total preferivelmente sendo limitado pela facilidade de preparação e uso na recombinação do protocolo de DNA tencionado.

Além disso, será apreciado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degeneração do código genético, existem tantas seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo como aqui descrito. Alguns destes polinucleotídeos tem homologia mínima à seqüência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. Não obstante, polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização de códons são especificamente contemplados pela presente invenção, por exemplo, polinucleotídeos que são idealizados para seleçao de códon humanos e/ou primatas. Ainda, alelos dos genes compreendendo seqüências de polinucleotídeos providos aqui estão dentro do objetivo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como um resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA resultante e a proteína podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Alelos podem ser identificados utilizando-se técnicas padrões (tais como hibridização, amplificação e ou banco de dados de comparações de seqüências).

Polinucleotídeos de Leishmania e suas fusões podem ser preparados, manipulados e/ou expressos utilizando-se qualquer uma das variadas técnicas bem estabelecidas conhecidas e disponíveis na técnica. Por exemplo, seqüências de polinucleotídeos ou seus frag35 mentos os quais podem codificar polipeptídeos da invenção, ou proteínas de fusão ou seus equivalentes funcionais, podem ser utilizados em molécula de DNA recombinante para direcionar expressões de um polipeptídeo em células hospedeiras apropriadas. Devido a degeneração inerente do código genético, outra seqüência de DNA que substancialmente codifica o mesmo ou equivalente funcional da seqüência de aminoácido pode ser produzido e estas seqüências podem ser utilizadas para clonar e expressar um dado polinucleotídeo da presente invenção.

Como será entendido pelos versados na técnica, pode ser vantajoso em alguns e

xemplos produzir seqüências de nucleotídeos codificando polipeptídeo de fusão possuindo códons não ocorrentes naturalmente. Por exemplo, códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico podem ser selecionados para aumentar a taxa de expressão de proteína ou para produzir um RNA recombinante transcrito tendo propriedades desejáveis, 10 tais como uma meia vida que é mais longa do que um transcrito gerado da seqüência de ocorrência natural.

Além disso, as seqüências de polinucleotídeos da presente invenção podem ser construídas utilizando-se métodos geralmente conhecidos na técnica de modo a alterar o polipeptídeo de fusão codificando seqüências por uma variedade de razões, incluindo mas não se limitando a, alterações as quais modificam a clonagem, processamento, expressão e/ou a imunogenicidade do gene produto.

De modo a expressar o polipeptídeo de fusão desejado incluindo dois ou mais fregmentos antigênicos/imunogênicos ou porções de polipeptídeos K26, K39 e/ou K9, uma seqüência de nucleotídio codificando o polipeptídeo de fusão, ou um equivalente funcional, 20 pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contenha os elementos necessários para a transcrição e a tradução da seqüência codificada inserida. Métodos que são bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo seqüências codificadoras de polipeptídeos de interesse e elementos de controle transcricional e traducional apropriados. Estes métodos inclu25 em técnicas in vitro de DNA recombinantes, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em Smabrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Janeiro de 2008, edição atualizada).

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiros são conhecidos e 30 podem ser utilizados para conter e expressar seqüências de polinucleotídeos. Estas incluem, mas não estão limitadas a microorganismos tais como bactérias transformadas com bacteriófago recombinante, plasmídio, ou de vetor de expressão de DNA cosmídios; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus (por exe/7?pto,baculovírus); sistemas de células 35 de plantas transformadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo,vírus mosaico de couve flor, CaMV; vírus mosaico tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacteriano (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. O “controle de elementos” ou “seqüências regulatórias” presentes em um vetor de expressão são aquelas regiões não traduzidas do vetor - aumentadores, promotores, regiões não traduzidas 5’ e 3’ - as quais interagem com proteínas celulares hospedeiras para realizar a transcrição ou tradução. Tais elementos podem variar em sua força e especifici5 dade. Dependendo do sistema do vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrições e traduções adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, podem ser utilizados. Por exemplo, quando clonando sistemas bacterianos, promotores induzíveis tais como promotor IacZ híbrido do fagomídeo PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) ou plasmídeo PSP0RT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md) e semelhantes podem ser 10 utilizados. Em sistemas celulares de mamíferos, promotores de genes mamíferos ou de vírus mamíferos são geralmente preferidos. Se for neessário gerar uma linhagem celular que contenha múltiplas cópias da seqüência codificando um polipeptídeo, vetores baseados em SV40 ou EBV podem ser vatajosamente utilizados com um marcador selecionável apropriado.

Em sistemas bacterianos, um número de vetores de expressão pode ser seleciona

do dependendo do uso tencionado para o polipeptídeo expresso. Por exemplo, quando grandes quantidades são necessárias, vetores o quais direcionam altos níveis de expressões de proteínas de fusão que são facilmente purificados podem ser utilizados. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, clonagem multifuncional de E. coli e vetores de expressão tais como PBLUESCRIPT (Stratagene), no qual a seqüência codificando o polipeptídeo de interesse pode ser ligada ao vetor no quadro com seqüências para o Met amino terminal e o resíduo 7 subsequente de β-galactosidase para que uma proteína híbrida seja produzida; vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Vetores pGEX (Promega, Madison, Wis.) podem também ser utilizados para expressar polipeptídeos externos como proteínas de fusão com glutationa S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser purificadas de células Iisadas por adsorção para esferas glutationa-agarose seguidos por aluição na presença de glutationa livre. Proteínas feitas em tais sistemas podem ser desenhadas para incluir heparina, trombina ou sítios de clivagem da protease fator XA para que o polipeptídeo clonado de interesse possa ser liberado a partir a fração GST quando queira.

Na levedura, Saccharomyces cerevisiae, um número de vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis tais como fator alfa, álcool oxidase, e PGH podem ser utilizados. Para revisões, veja Ausubel et al, (acima) e Grant et al, Methods EnzymoL 153:526-544 (1987).

Em casos em que vetores de expressão de plantas são utilizados, a expressão de

seqüências codificando polipeptídeos pode ser direcionada por qualquer um do número de promotores. Por exemplo, promotores virais tais como os promotores 35S e 19S do CaMV podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com a seqüência ômega líder de TMV (Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, promotores de plantas tais como pequenas subunidades de RUBISCO ou promotores de choque térmico podem ser utilizados (Coruzzi et al, EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie et al, Science 224: 834-843 5 (1984); e Winter et al, Results. Prob. Cell Differ 77.85-105 (1991)). Estas construções podem ser introduzidas em células de plantas por transformação direta de DNA ou transfecção mediada por patógeno. Tais técnicas são descritas em um número de revisões geralmente disponíveis (veja, por exemplo,Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196(1992)).

Um sistema de inseto pode também ser usado para expressar um polipeptídeo de

interesse. Por exemplo, em um sistema, Autographa californica vírus poliedrose nuclear (AcNPV) é utilizado como vetor para expressar genes externos em células Spodoptera frugiperda ou em larvas Trichoplusia. As seqüências codificando os polipeptídeos podem ser clonadas em regiões não essenciais dos vírus, tais como o gene poliedrino, e colocadas sob 15 controle do promotor poliedrino. Inserções bem sucedidas da seqüência de codificando polipeptídeos dará o gene poliedrino inativo e produzirá vírus recombinantes com falta de capa protéica. Os vírus recombinantes podem então ser utilizados para infectar, por exemplo, células S. frugiperda ou larva Trichoplusia na qual o polipeptídeo de interesse pode ser expresso (Engelhard et al, Proe. NatL Acad. Sei. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).

Em células hospedeiras de mamíferos, um número de sistemas de expressão ba

seados em vírus estão geralmente disponíveis. Por exemplo, em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, seqüências codificando um polipeptídeo da presente invenção podem ser ligadas em um complexo transcrição/tradução de adenovírus consistindo no último promotor e seqüência líder tripartida.

Inserção em uma região não essencial E1 ou E3 do genoma viral pode ser utilizada

para obter vírus viáveis que são capazes de expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectadas (Logan 7 Shenk, Proe. Natl. Acad. Sei. U.S.A 81:3655-3659 (1984)). Em adição, aumentadores de transcrição, tais como o aumentador vírus sarcoma Rous (RSV), pode ser utilizado para melhorar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

Sinais de iniciação específicos podem também ser utilizados para conseguir tradu

ções mais eficientes das seqüências codificando um polipeptídeo de fusão de interesse. Tais sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Em casos onde seqüências codificando o polipeptídeo, seus códons de iniciação e seqüências montantes são inseridas dentro do vetor de expressão apropriado, nenhum outro sinal adicional de controle 35 de transcrição ou de tradução pode ser necessário. Entretanto, em casos onde apenas a seqüência codificadora, ou sua porção, é inserida, sinais de controle de tradução exógenos incluindo o códon de inciação ATG deverá ser fornecido. Além disso, o códon de iniciação deverá estar no quadro de leitura correto para assegurar a translação da inserção inteira. Elementos traducionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, tanto naturais quanto sintéticas. A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de aumentadores que são apropriados para sistemas celulares particulares, os quais são utili5 zados, tas como aqueles descritos na literatura (Scharf. et al, Results Probl. Cell Differ. 20:125-162(1994)).

Em adição, uma cepa da célula hospedeira pode ser escolhida por sua habilidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou para processar a proteína de fusão expressa de forma desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não estão 10 limitadas a acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Processamento pós traducional o qual cliva uma forma “pre-pro” da proteína pode também ser utilizada para facilitar inserções corretas, dobraduras e/ou funções. Diferentes células hospedeiras tais como CHO, HeLA, MDCK, HEK23 e W138 as quais possuem máquinas celulares específicas e mecanismos característicos para tais atividades pós traducionais, podem ser 15 escolhidas para assegurar a modificação correta e o processamento da proteína externa.

Para produção de longo prazo, e alto rendimento de proteínas recombinantes, expressões estáveis são geralmente preferidas. Por exemplo, linhagens celulares, que de forma estável expressam um polinucleotídeo de fusão da presente invenção podem ser transformadas utilizando-se vetores de expressão os quais podem conter origens virais de repli20 cação e/ou elementos de expressão endógena e um gene marcador selecionável no mesmo ou em vetor separado. Seguindo a introdução do vetor, células podem ser permitidas crescer por 1 -2 dias em um meio enriquecido antes de eles serem trocadas para um meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir a resistência para seleção, e sua presença permite o crescimento e a recuperação de células que expressam com sucesso as 25 seqüências introduzidas. Clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados utilizando-se a técnica de cultura de tecidos apropriada para o tipo de célula.

Qualquer número de sistemas selecionados pode ser utilizado para recuperar linhagens celulares transformadas. Estes incluem, mas não estão limitados a, genes do vírus herpes simples timidina quinase (Wigler et al, Cell 11:223-232 (1977)) e adenina fosforibosil30 transferase (Lowe et al, Cell 22:817-823 (1990)) que podem ser empregados em células tkou aprt-, respectivamente. Também, resistência antimetabólica, a antibiótico e herbicida pode ser utilizada como a base para seleção; por exemplo, dhfr que confere resistência a metotrexato (Wigler et al, Proe. Natl. Acad. Sei. U.S.A 77:3567-70 (1980)); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos, neomycin e G-418 (Colbere-Garapin et al, J. Mol. Biol. 150: 35 1-14 (1981)); e ais ou Pat, que confere resistência ao clorosulfurona e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente (Murry, acima). Genes selecionáveis adicionais têm sido descritos, por exemplo, trpB, o qual permite que células utilize indol no lugar de triptofano, ou hisD, o qual permite as células utilizarem histinol no lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proe. Natl. Acad. Sci U.S.A 85:8047-51 (1988)). A utilização de marcadores visíveis tem ganhado popularidade com tais marcadores como antocianinas, β-glucuronidase e seu substrato GUS e Iuciferase e seu substrato luciferina, sendo amplamente utilizados não apenas 5 para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de proteínas de expressão transitórias ou estáveis atribuíveis a um sistema vetor específico (Rhodes et al, Methods Mol. BioL 55:121-131 (1955)).

Uma variedade de protocolos para detecção e mensuração de expressão de produtos codificados por polinucleotídeos, utilizando anticorpos policlonais e monoclonais especí10 ficos para o produto são conhecidos na técnica. Exemplos incluem ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). Estes e outros ensaios são descritos, entre outros lugares, em Hampton et al, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) e Maddox et al, J. Exp. Med. 158: 1211-1216(1983).

Uma ampla variedade de marcadores e técnicas de conjugação são conhecidas por

versados na técnica e devem ser utilizados em vários ensaios de ácidos nucléicos e aminoácidos. Meios que para produção de hibridização marcada ou sondas PCR para detecção de seqüências relacionadas a polinucleotídeos incluem oligomarcação, tradução Nick, marcação terminal ou amplificação de PCR utilizando-se nucleotídeos marcados. Alternativa20 mente, as seqüências, ou qualquer uma de suas porções podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, são comercialmente disponíveis e podem ser utilizados para sintetizar sondas mRNA in vitro por adição de uma RNA polimerase apropriada, tal como T7, T3 ou SP6 e nucleotídeos rotulados. Estes procedimentos podem ser conduzidos utilizaando uma variedade de kits comer25 cialmente disponíveis. Moléculas repórteres adequadas ou marcadores, os quais podem ser utilizados, incluem radionuclídeos, enzimas, fluorescentes, quimioluminescente, ou agentes cromogênicos, bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes.

Células hospedeiras transformadas com seqüência de polinucleotídeos de interesse 30 podem ser cultivadas sob condições adequadas para a expressão e recuperação da proteína a partir da cultura de célula. A proteína produzida por uma célula recombinante pode ser secretada ou contida intracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor utilizado. Como será entendido pelos versados na técnica, vetores de expressão contendo polinucleotídeos da invenção podem ser desenhados para conter seqüências de sinais que direcionam 35 secreção do polipeptídeo codificado através da membrana celular procariótica e eucariótica. Outras construções recombinantes podem ser utilizadas para unir seqüências codificando um polipeptídeo de interesse para seqüência de nucleotídeo codificando um domínio polipeptídeo que facilitará a purificação de proteínas solúveis.

Em adição a métodos recombinantes de produção, polipeptídeos de fusão da invenção, e seus fragmentos, podem ser produzidos por síntese direta de peptídeos utilizando-se técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 55:2149-2154 (1963)). Síntese 5 de proteínas podem ser realizadas utilizando-se técnicas manuais ou por automação. Sínteses automatizadas podem ser alcançadas, por exemplo, utilizando-se Applied Biosystems 431A Sintetizador de Peptídeos (Perkin Elmer). Alternativamente, vários fragmentos, por exemplo, dois ou mais fragmentos antigênicos/imunogênicos dos antígenos de Leishmania K26, K39 e/ou K9, podem ser sintetizados quimicamente separadamente e combinados utili10 zando-se métodos químicos para produzir a molécula de comprimento total.

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E KITS

Em outro aspecto, esta invenção provê compostos e métodos para detecção de Ieishmanoise em indivíduos e em fornecimento de sangue. Em uma modalidade particular, o indivíduo é um mamífero. Em uma modalidade mais particular o mamífero é humano ou canino.

Em um aspecto, são providos métodos para detecção de Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica em uma amostra biológica, compreendendo: (a) contatando uma amostra biológica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde os antígenos de Lei20 shmania são selecionados de K39, K26, e/ou K9 ou sua variante que difere apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detecção na amostra biológica da presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo de fusão, assim detectando infecções de Leishmania viscerais assintomáticas ou sub clínicas na amostra biológica.

Em um aspecto particular, a presente invenção provê métodos para detecção de 25 Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica em uma amostra biológica, compreendendo: (a) contatando uma amostra biológica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde o antígeno de Leishmania é selecionado a partir de seqüências polipeptídicas K39, K26 e/ou K9 de acordo com qualquer uma da SEQ ID Nos: 5-7, e 9-11, em qualquer combi30 nação, ou uma variante que difere apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detectar na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo, assim detectando infecção visceral por Leishmania assintomáticas ou sub clínicas na amostra biológica. Em modalidades relacionadas, pelo menos um dos antígenos de Leishmania K26, K39 e k9 é da espécie Leishmania donovani.

Em certos aspectos, a presente invenção provê métodos para detecção de infecção

visceral de Leishmania em amostras biológicas, compreendendo: (a) contatar uma amostra biológica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo,incluindo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde a proteína de fusão compreende a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID NO: 8 ou aminoácidos 10-262 da SEQ IN NO: 8 ou suas variantes que diferem apenas em substituições e/ou modificações conservadas; e (b) detectar na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo, assim detectando infecção visceral por Leishmania na amostra biológica.

Em ainda outro aspecto relacionado, métodos são providos para identificar um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica suscetível a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda. Em uma modalidade, o método compreende: (a) contatar uma amostra biológica obtida de um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomá10 tica ou sub clínica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde os antígenos de Leishmania são selecionados de K39, K26 e/ou K9, ou suas variantes que diferem apenas em substituições e/ou modificação conservadoras; (b) detectar na amostra biológica obtida do paciente a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo de fusão na etapa (a), assim 15 identificando um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica suscetível a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda (LV).

Dentro de aspectos relacionados, kits de diagnóstico para diagnóstico de Ieishmaniose são providos. Em uma modalidade, por exemplo, existem kits providos para detecção de Ieishmaniose visceral em amostras biológicas, compreendendo: (a) um polipeptídeo de 20 fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde antígenos Leishmania são selecionados de K39, K26 e/ou K9 ou suas variantes que diferem apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detectando na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo, assim detectando Ieishamniose visceral na amostra biológica.

Em ainda outro aspecto relacionado, métodos são providos para identificar um pa

ciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica suscetível a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda. Em outra modalidade, o método compreende: (a) contatar amostra biológica obtida de paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo 30 pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde os antígenos de Leishmania são selecionados de seqüências de polipeptídeo K39, K26 e/ou K9 de acordo com qualquer das SEQ ID NOs: 5-7 E 9-11, em qualquer combinação, ou suas variantes que diferem apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detectar na amostra biológica obtida de um paciente a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo de fusão na eta35 pa (a), assim identificando um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica suscetível a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda (LV).

Dentro de aspectos relacionados, kits de diagnóstico para diagnóstico de Ieishmaniose são fornecidos. Em uma modalidade, existem kits providos para detecção de Ieishmanoise visceral em amostras biológicas, compreendendo: (a) um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde os anígenos de Leishmania são selecionados de seqüências de polipeptí5 deos K39, K26 e/ou K9 de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-7 e 9-11, em qualquer combinação, ou sua variante que difere apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; ou uma variante que difere apenas em substituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detectando na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo detectando assim a Ieishmaniose visceral na amostra biológica.

ciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica suscetível a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda. Em uma modalidade, o método compreende: (a) contatar uma amostra biológica obtida de um paciente afligido com Ieishmaniose assintomática ou sub clínica com um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo 15 pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde a proteína de fusão compreende a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID NO: 8 ou aminoácidos 10-262 da SEQ ID NO: 8, ou suas variantes que diferem apenas em substituições e/ou modificações conservadas; e (b) detectando na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam ao polipeptídeo, assim detectando Ieishmaniose visceral não amostra biológica.

Dentro de aspectos relacionados, kits de diagnóstico para diagnóstico de Ieishma

niose são providos. Em uma modalidade, são providos kits para detecção de Ieishmaniose visceral em uma amostra biológica, compreendendo: (a) um polipeptídeo de fusão como aqui descrito, por exemplo, compreendendo pelo menos dois antígenos heterólogos de Leishmania, onde a proteína de fusão inclui a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID 25 NO: 8 ou aminoácido 10-262 da SEQ ID NO: 8, ou suas vairantes que diferem apenas em susbtituições e/ou modificações conservadoras; e (b) detectando na amostra biológica a presença de anticorpos que ligam aos polipeptídeo, detectando assim Ieishmaniose visceral na amostra biológica.

Em outro aspectos desta invenção, métodos são revelados para detecção e monito30 ramento de infecção Leishmania, bem como para se distinguir entre tipos de infecções de Leishmania, em indivíduos e fornecimento de sangue. Em geral, a infecção de Leishmania pode ser detectada em qualquer amostra biológica que contenha anticorpos. Preferivelmente, a amostra é sangue, soro, plasma, saliva, fluído cefalorraquidiano, fezes e urina. Mais preferivelmente, a amostra é sangue ou amostra de soro obtida de um paciente ou de forne35 cimento de sangue.

Em outro aspecto, a infecção de Leishmania pode ser detectada utilizando-se um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais polipeptídeos contendo um ou mais dos epítopos discutidos acima, repetições, ou suas variantes. Se múltiplos epítopos são empregados, estes epítopos podem estar presentes em um ou mais antígenos de Leishmania. Por exemplo, em um aspecto, o polipeptídeo de fusão da presente invenção compreende dois ou mais polipeptídeos antigênicos K26, K39 e/ou K9. O polipeptídeo de fusão é então utili5 zado para determinar a presença ou ausência de anticorpos para o mesmo polipeptídeo antigênico na amostra, relativo ao valor de corte pré-determinado.

Existem uma variedade de formatos de ensaios conhecidos pelos versados na técnica utilizando um polipeptídeo de fusão para detectar anticorpos na amostra. Veja, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, o qual é incorporado aqui por referência. Em uma modalidade preferida, o ensaio envolve o uso de polipeptídeo de fusão imobilizado num suporte sólido para ligar e remover o anticorpo da amostra. A ligação do anticorpo pode ser detectada utilizando-se um reagente de detecção que se liga ao complexo do anticorpo/peptídeo e contém grupos repórter detectável. Reagentes de detecção adequados incluem anticorpos que se ligam ao complexo do anticorpo/peptídeo e polipeptídeos livres marcados com um grupo repórter. (por exemplo, em um ensaio semi competitivo). Grupos repórteres adequados incluem marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, radioisótopos, marcadores quimioluminescentes, marcadores eletroquimioluminescentes, marcadores bioluminescentes, polímeros, partículas polímericas, partículas de metal, haptenos e corantes. Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado, no qual um anticorpo que liga a um polipeptídeo de fusão da presente invenção marcada com um grupo repórter e permitido a ligar-se ao polipeptídeo de fusão imobilizado depois da incubação do polipeptídeo de fusão com a amostra. A extensão a qual os componentes das amostra inibem a ligação do anticorpo marcado ao polipeptídeo de fusão é indicativa da reatividade da amostra com o polipeptídeo de fusão imobilizado.

O suporte sólido pode ser de qualquer material conhecido pelos versados na técnica ao qual o polipeptídeo de fusão deve ser anexado. Por exemplo, o suporte pode ser um poço teste em uma placa de microtitulação, ou uma membrana de nitrocelulose, ou outra membrana adequada. Alternativamente, o suporte pode ser uma esfera ou um disco, tal co30 mo vidro, fibra de vidro, látex, ou material plástico tal como poliestireno ou polivinilcloreto. O suporte pode também ser uma partícula magnética ou sensor de fibra óptica, tais como aqueles revelados, por exemplo, na Pat. Dos EUA No. 5.359.681.

O polipeptídeo de fusão pode estar ligado ao suporte sólido utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas na técnica, as quais são amplamente descritas na patente e na literatura científica. No contexto da presente invenção, o termo “ligado” se refere a ambas associações não covalentes, tais como adsorção e ligações covalente (as quais podem estar ligadas direto entre o antígeno e os grupos funcionais no suporte, ou podem estar ligadas por meio de um agente de ligação cruzada). Ligação por adsorção a um poço em uma placa de microtitulação ou a uma membrana é preferido. Em tais casos, adsorção pode ser conseguida por em contato o polipeptídeo, em um tampão adequado, com o suporte sólido por uma quantidade adequada de tempo. O tempo de contato varia com a temperatura, mas 5 está tipicamente entre 1 hora e 1 dia. Em geral, contatar um poço de placa de microtitulação de plástico (tal como poliestireno ou polivinilcloreto) com uma quantidade de polipeptídeo de fusão variando de cerca de 10 ng a cerca de 1 pg, e preferivelmente cerca de 100 ng, é suficiente para ligar uma quantidade adequada de antígeno. Nitrocelulose ligaraá aproximadamente 100 pg de proteína por cm3.

Ligação covalente do polipeptídeo de fusão a um suporte sólido pode geralmente

ser alcançado por primeiro reagir o suporte com um reagente bifuncional que irá reagir a ambos, suporte e grupo funcional, tais como hidroxila ou grupo amina, no polipeptídeo de fusão. Por exemplo, o polipeptídeo de fusão pode ser ligado a um suporte tendo um revestimento de polímero apropriado utilizando benzoquinona ou por condensação de um grupo 15 aldeído no suporte com uma amina e um hidrogênio ativo no polipeptídeo {veja, por exemplo, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook (1991) em A12-A13).

Em certas modalidades, o ensaio é uma enzima ligada a um ensaio imunoenzimático (ELISA). Este ensaio pode ser realizado por primeiro contatar o polipeptídeo de fusão da presente invenção que tenha sido imobilizado em um suporte sólido, comumente o poço de 20 placa de microtitulação, com a amostra, tais que os anticorpos aos antígenos de Leishmania do polipeptídeo de fusão dentro da amostra são permitidos a ligar-se ao polipeptídeo de fusão imobilizado. A amostra não ligada é então removida do polipeptídeo de fusão imobilizado e um reagente de detecção capaz de ligar aos complexo polipeptídeo-anticorpo imobilizado é adicionado. A quantidade de reagentes de detecção que permanecem ligados ao 25 suporte sólido é então determinada utilizando-se um método apropriado para a detecção específica do reagente.

Uma vez que o polipeptídeo de fusão é imobilizado no suporte, os sítios de ligação da proteína remanesentes no suporte são tipicamente bloqueados. Qualquer agente bloqueador adequado conhecido pelos versados na técnica, tais como albumina bovino sérica 30 (BSA) ou Tween 20® (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo.) podem ser empregados. O polipeptídeo imobilizado é então incubado com a amostra, e o anticorpo (se presente na amostra) é permitido ligar-se ao antígeno. A amostra deve ser diluída com diluente adequado, tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. Em geral, o tempo de contato apropriado (por exemplo, tempo de incubação) é aquele período de tempo que é 35 suficiente para permitir a detecção da presença de anticorpo dentro da amostra infectada por Leishmania. Preferivelmente, o tempo de contato é suficiente para se atingir um nível de ligação que é pelo menos 95% do atingido no equilíbrio entre anticorpo ligado e não ligado. Aqueles versados na técnica reconhecerão que o tempo necessário para se atingir o equilíbrio pode ser facilmente determinado por ensaio de nível de ligação que ocorre após um período de tempo. Na temperatura ambiente, um tempo de incubação de cerca de 30 minutos é geralmente suficiente.

Amostra não vinculada pode então ser removida através da lavagem do suporte só

lido com um tampão apropriado, tal como PBS contendo 0.1% Tween 20®. O reagente de detecção pode então ser adicionado ao suporte sólido. Um reagente de detecção apropriado é qualquer composto que se liga ao complexo de polipeptídeo-anticorpo imobilizado e que pode ser detectado por qualquer uma variedade de meios conhecidos por aqueles versados 10 na técnica. Preferivelmente, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tais como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, lectina, ou antígeno livre) conjugado ao um grupo repórter. Grupos repórteres preferidos incluem enzimas (tais como peroxidase de rábado silvestre), substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação de um agente de ligação a 15 um grupo repórter pode ser alcançada utilizando-se métodos padrões conhecidos por aqueles versados na técnica. Agentes de ligação comuns podem também ser comprados conjugados a um a variedade de grupos repórteres de várias fontes (por exemplo, Zymed Laboratories, San Francisco, Calif. e Pierce, Rockford, Ill.).

O reagente de detecção é então incubado com o complexo polipeptídeo-anticorpo imobilizado por uma quantidade de tempo suficiente para detectar a ligação do anticorpo. Uma quantidade de tempo apropriada pode geralmente ser determinada pelas instruções do fabricante, ou por ensaios do nível de ligação que ocorre acima de um período de tempo. Reagente de detecção não ligado é então removido e o reagente de detecção ligado é detectado utilizando-se o grupo repórter. O método empregado para detecção do grupo repórter depende da natureza do grupo repórter. Para grupos radioativos, métodos de contagem de cintilação ou auto radiográficos são geralmente apropriados. Métodos pectroscópicos podem ser utilizados detectar corantes, grupos luminescentes e grupos fluorescentes. Biotina pode ser detectada utilizando-se avidina acoplada a um grupo repórter diferente (comumente um grupo radioativo ou fluorescente ou uma enzima). Grupos repórteres de enzima podem ser geralmente detectados pela adição de substrato (em geral para um período de tempo específico), seguido por análise espetroscópica ou outras análises de produtos de reação.

Para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-Leishmania na amostra, o sinal detectado pelo grupo repórter que permanece ligado ao suporte sólido é geralmente comparado a um sinal que corresponde a um valor de corte pré determinado. Em uma modalidade preferencial, o valor de corte é preferivelmente a média do sinal médio obtido quando o polipeptídeo imobilizado é incubado com amostras de pacientes não infectados. Em gerai, a amostra gerando um sinal que tem três desvios-padrão acima do valor de corte pré determinado é considerado positivo (por exemplo, reativo com o polipeptídeo). Em uma modalidade preferida alternada, o valor de corte é determinado utilizando uma Curva Operadora Receptora, de acordo com o método de Sackett et al, Clinicai Epidemiology: A Basic 5 Science for Clinicai Medicine, p. 106-7 (Little Brown e Co., 1985). Brevemente, nesta modalidade, o valor de corte pode ser determinado de um gráfico de pares de taxas positivas verdadeiras (isto é, sensibilidade) e taxas falso positivas (100% especificamente) que correspondem a cada valor de corte possível para o resultado do teste de diagnóstico. O valor de corte nos gráficos é o mais próximo ao canto esquerdo superior (isto é, o valor que anexa a 10 maior área), é o valor de corte mais preciso, e uma amostra gerando sinal maior que o valor de corte determinado por esse método pode ser considerado positivo. Alternativamente, o valor de corte pode ser deslocado para a esquerda ao longo do gráfico, para minimizar as taxas falsas positivas, ou para a direita para minimizar as taxas de falsos negativos.

Em uma modalidade relacionada, o ensaio é realizado em um formato de escoa15 mento ou teste de tira, onde o antígeno é imobilizado em uma membrana tal como nitrocelulose. No teste de escoamento, anticorpos dentro da ligação da amostra se ligam ao polipeptídeo imobilizado a medida que a amostra passa pela membrana. Um reagente de detecção (por exemplo, Proteína A - ouro coloidal) então liga-se ao complexo polipeptídeo-anticorpo a medida que a solução contendo reagentes de detecção escoa pela membrana. A detecção 20 do reagente de detecção vinculado pode então ser realizado como descrito acima. No teste em formato de tira, uma terminação da membrana ao qual o polipeptídeo é ligado é imersa em uma solução contendo a amostra. A amostra migra ao longo da membrana através da região contendo o reagente de detecção e à área do polipeptídeo de fusão imobilizado. A concentração de reagente de detecção no polipeptídeo de fusão indica a presença de anti25 corpos contra Leishmania na amostra. Tipicamente, a concentração de reagente de detecção naquele local gera um padrão, como uma linha, que pode ser lida visualmente. A ausência de tal padrão indica resultado negativo. No geral a quantidade de polipeptídeos de fusão imobilizados na membrana é selecionada para gerar padrões de discernimento visuais quando a amostra biológica contém um nível de anticorpos que seriam suficientes para ge30 rar um sinal positivo em um ELISA, como discutido acima. Preferivelmente, uma quantidade de polipeptídeo de fusão imobilizado na membrana varia de cerca de 25 ng a cerca de 1pg, e mais preferivelmente de cerca de 50 ng a cerca de 500 ng. Tais testes podem tipicamente ser realizados com uma quantidade muito pequena (por exemplo, uma gota) de soro ou sangue de paciente.

Claro que numerosos outros protocolos de ensaios são adequados para uso com o

polipeptídeo de fusão da presente invenção existem. As descrições acima têm intenção apenas de exemplificar. Em um aspecto da invenção, o ensaio discutido acima pode ser utilizado para especificamente detectar Ieishmaniose visceral. Neste aspecto, anticorpos na amostra podem ser detectados utilizando-se polipeptídeos de fusão compreendendo a seqüência de aminoácido de dois ou mais fragmentos antígenos/imunogênicos ou epítopos de um antígeno de 5 Leishmania K26, K39 e/ou K9. Em outro aspecto, anticorpos na amostra podem ser detectados utilizando-se um polipeptídeo de fusão compreedendo a seqüência de aminoácido de dois ou mais fragmentos imunogênicos ou epítopos como revelado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-7 e 9-11. Em outro aspecto, anticorpos na amostra podem ser detectados utilizando-se polipeptídeos de fusão compreedendo a seqüência de aminoácido revelada na 10 SEQ ID NO: 8 ou aminoácidos 10-262 da SEQ ID NO: 8. Preferivelmente, os antígenos de Leishmania são imobilizados por adsorção a um suporte sólido tal como um poço de placas de microtítulos ou uma membrana, como descrito acima, em quantidades aproximadamente similares tais que a quantidade total de polipeptídeo de fusão em contato com o suporte varia de certa de 10 ng a cerca de 100 pg. O restante das etapas no ensaio pode geralmente 15 ser realizada como descrito acima. Será facilmente aparente para aqueles versados na técnica que, combinando polipeptídeos aqui descritos com outros polipeptídeos que podem detectar Ieishmanioses cutâneas e de mucosa, os polipeptídeos revelados aqui podem ser utilizados em métodos que detectam todos os tipos de leishmaniose.

Em outro aspecto na invenção, pacientes com LV assintomática ou sub clínica de quem a doença é suscetível a progredir para leishmaniose visceral aguda pode ser distinguido de pacientes infectados de quem a doença não é suscetível a essa progressão. Tal progressão pode ocorrer dentro de um ano (e tipicamente de 5 a 12 meses) para doenças sub clínicas, ou dentro de muitos anos nos casos de pacientes assintomáticos. Essa determinação pode ser feita utilizando-se várias abordagens. Em uma modalidade, o ensaio é realizado utilizando-se um polipeptídeo aqui descrito, por exemplo,que compreende pelo menos uma unidade repetida do antígeno K39, como revelado em SEQ ID NOs: 6, 10, ou 11, por exemplo. Em uma modalidade relacionada, o polipeptídeo compreende uma unidade de antígeno repetida K39 codificada pela seqüência de polinuclieotídio recitada em SEQ ID NOs: 2, 14 ou 15. Enquanto uma unidade de antígeno repetido K39 gera uma resultado positivo (relativo ao valor de corte pré determinado) quando reagido com soro de mais de 97% dos pacientes com leishmaniose visceral aguda, pacientes com leishmaniose assintomática reagem muito fracamente, se reagem, com esse antígeno. Aqueles soros que reagem fracamente são suscetíveis a indicar infecções que estão nos processos de progressão, ou estão suscetíveis a progredir, a leishmaniose visceral aguda (ou infecções que estão em remissão ou respondendo a tratamento, o que pode ser distinguido baseando-se na historia do paciente).

Em outra modalidade, o ensaio é separadamente realizado com um polipeptídeo de fusão da invenção, por exemplo, compreendendo a seqüência de aminoácido de dois ou mais fragmentos antigênicos/imunogênicos ou epítopos de um antígeno de Leishmania K26, K39 e/ou K9, tal como K28 por exemplo, e com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma unidade repetida de antígeno K39. Nesta modalidade, a densidade óptica (DO) 5 obtida no ensaio utilizando-se o polipeptídeo de fusão K28 é comparada ao valor obtido utilizando-se o polipeptídeo K39. Uma DO significantemente maior no ensaio utilizando-se o polipeptídeo de fusão K28, quando comparado com a DO no ensaio utilizando o polipeptídeo K39 indica uma detecção mais robusta e confiável de uma infeção LV assintomática ou sub clínica. Aqueles pacientes assintomáticos ou sub clínicos para quem ambos os valores 10 são relativamente altos são suscetíveis ao processo de desenvolvimento de leishmaniose visceral aguda (ou no processo de recuperação da infecção). Em outro aspecto, o ensaio é separadamente realizado com um polipeptídeo de fusão compreendendo a seqüência de aminoácido de dois ou mais fragmentos imunogênicos ou epítopos como revelado em qualquer das SEQ ID NOs: 5-7 e 9-11 e com um polipeptídeo que compreende pelo menos uma 15 unidade de repetição de um antígeno K39. Em outro aspecto, o ensaio é separadamente realizado com um polipeptídeo de fusão compreendendo a seqüência de aminoácido revelada em SEQ ID NO: 8 ou aminoácido 10-262 da SEQ ID NO: 8 e com um polipeptídeo que compreede pelo menos uma unidade de repetição antígeno K39.

Em outra modalidade, pacientes assintomáticos ou sub clínicos que são suscetíveis a desenvolver leishmaniose visceral aguda podem ser identificados utilizando-se polipeptídeos de fusão separados (por exemplo, K28) e ensaios de polipeptídeos K39 (como descrito acima) que são realizados por um período de tempo. Por exemplo, os ensaios podem ser realizados a cada 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 meses por um período de meses ou anos. Pacientes assintomáticos ou sub clínicos que são suscetíveis a permanecerem assintomáticos ou subclínicos irão geralmente ter soro que mostra uma reatividade alta com K28 e baixa reatividade com o polipeptídeo K39, como discutido acima, a cada ponto de tempo. Entretanto, pacientes que estão progredindo em direção a leishmaniose visceral aguda mostrarão um aumento na reatividade de ambos os peptídeos K28 e K39 durante o período de tempo dos ensaios. Monitorando um paciente individual desta maneira, o desenvolvimento de leishmaniose visceral aguda pode ser identificado antes que outros sintomas se tornem aparentes. Essa identificação precoce permite tratamento seletivo apenas daqueles pacientes assintomáticos pré dispostos a desenvolver formas mais sérias de doença.

Em outro aspecto desta invenção, polipeptídeos de fusão imobilizados podem ser utilizados para purificar anticorpos que se ligam respectivamente. Tais anticorpos podem ser preparados por qualquer uma das variedades de técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Veja, por exemplo, Harlow e Land, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Em uma destas técnicas, um imunógeno compreendendo um polipeptídeo de fusão da presente invenção é inicialmente injetado em qualquer um de uma ampla variedade de mamíferos (por exemplo, camundongos, ratos, coelhos, ovelhas e caprinos). Nesta etapa, o polipeptídeo pode servir de imunógeno sem modificação. Alternativamente, particularmente para polipeptídeos relativamente pequenos, uma resposta imune 5 superior pode ser eliciada se o polipeptídeo estiver ligado em uma proteína transportadora, tais como albumina de soro bovino ou “keyhole Iimpef hemocianina. O imunógeno é injetado no animal hospedeiro, preferivelmente de acordo com um cronograma pré-determinado incorporando um ou mais reforços de imunizações, e os animais são sangrados periodicamente. Anticorpos policlonais específicos para os polipeptídeos podem então ser purificados 10 a partir de tais soros por, por exemplo, afinidade cromatográfica utilizando o polipeptídeo acoplado a um suporte sólido adequado.

Anticorpos monoclonais específicos para os polipeptídeos de fusão antigênicos de interesse podem ser preparados, por exemplo, utilizando-se a técnica de Kohler e Misltein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976, e melhoramentos da mesma. Brevemente, estes métodos 15 envolvem a preparação de linhagens celulares imortais capazes de produzir anticorpos tendo especificidade desejada (isto é, reatividade com o polipeptídeo de interesse). Tais células podem ser produzidas, por exemplo, a partir de células do baço obtidas de um animal imunizado, como descrito acima. As células do baço são imortalizadas por, por exemplo, fusão com uma célula mieloma de fusão parceira, preferivelmente uma que seja singêneica com o 20 animal imunizado. Uma variedade de técnicas de fusão podem ser empregadas. Por exemplo, as células do baço e as células mielomas podem ser combinadas com um detergente não iônico por alguns minutos e depois plaqueadas em baixa densidade em um meio seletivo que suporta o crescimento de células híbridas, mas não células de mielomas. Uma técnica de seleção preferida utiliza seleção HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Depois de 25 um tempo suficiente, geralmente cerca de 1 a 2 semanas, colônias de híbridos são observadas. Colônias únicas são selecionadas e testadas para atividades de ligação de polipeptídeos. Hibridomas tendo alta reatividade e especificidade são preferidos.

Anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de sobrenadantes do crescimento de colônias hibridomas. Neste processo, várias técnicas podem ser empregadas para 30 potencializar a produção, tais como injeção da linhagem celular hibridomas na cavidade peritoneal de um hospedeiro vertebrado adequado, tal como um camundongo. Anticorpos monoclonais podem então ser coletados dos fluídos ascite ou do sangue. Contaminantes podem ser removidos dos anticorpos por técnicas convencionais, como cromatografia, filtração em gel, precipitação e extração. Um ou mais polipeptídeos podem ser utilizados nos proces35 sos de purificação em, por exemplo, uma etapa de cromatográfica afinidade.

Anticorpos mono-específicos que ligam-se a um polipeptídeo de fusão compreendendo duas ou mais porções imunogênicas de antígenos de Leishmania K26, K39 e/ou K9 podem ser usados, por exemplo, para detectar infecções de Leishmania em uma amostra biológica usando uma de uma variedade de imunoensaios, os quais podem ser diretos ou competitivos. Brevemente, em um ensaio de formato direto, um anticorpo monoespecífico pode ser imobilizado em um suporte sólido (como descrito acima) e contatado com a amos5 tra a ser testada. Depois da remoção de uma amostra não ligada, um segundo anticorpo monoespecífico, o qual foi marcado com um grupo repórter, pode ser adicionado e usado para detectar a ligação antigênica. Em um ensaio competitivo exemplar, a amostra pode ser combinada com o anticorpo monoclonal ou policlonal, o qual tem sido marcado com um grupo repórter adequado. A mistura de amostras e anticorpos pode então ser combinada com o 10 antígeno polipeptídeo imobilizado em um suporte sólido adequado. O anticorpo que não foi ligado a um antígeno na amostra é permitido se ligar ao antígeno imobilizado e o restante da amostra e de anticorpo são removidos. O nível de ligação de anticorpo ao suporte sólido é inversamente relacionado ao nível de antígeno na amostra. Então, um nível mais baixo de ligação ao anticorpo ao suporte sólido indica a presença de Leishmania na amostra. Outros 15 formatos para utilização de anticorpos monoespecíficos para detectar Leishmania nas amostras serão aparentes àqueles versados na técnica, e os formatos acima são providos apenas para propósito de exemplo.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E VACINA

Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a formulações de um ou mais 20 polinucleotídeos, polipeptídeos de fusão ou outras composições revelaoas aqui em soluções farmaceuticamente aceitáveis e fisiologicamente aceitáveis para administração a uma célula ou um animal, tanto sozinho quanto em combinação com uma ou mais modalidades de terapia. Tais composições farmacêuticas são particularmente preferidas para uso como vacinas quando formuladas com sistema imunoestimulante/adjuvante. As composições são 25 também adequadas para uso em contexto de diagnóstico.

Também será entendido que, se desejado, as composições da invenção podem ser administradas em combinação com outros agentes também, tais como, por exemplo, outras proteínas ou polipeptídeos ou vários agentes farmaceuticamente ativos. Não há limites virtuais para outros componentes que podem também ser incluídos, provido que os agentes adicionais não causam efeito adverso significante nos objetivos de acordo com a invenção.

Em certas modalidades, as composições da invenção são usadas como vacinas e são formuladas em combinação com um ou mais imunoestimulantes. Um imunoestimulante pode ser qualquer substância que aumenta ou potencializa uma resposta imune, (anticorpo e/ou mediada por célula) a um antígeno exógeno. Exemplos de imunoestimulantes incluem 35 adjuvantes, microesferas biodegradáveis (por exemplo, galactídeo polilático) e Iipossomas (dentro dos quais o composto é incorporado; veja, por exemplo, Fullerton, Pat. Dos EUA No. 4.235.877). Preparação de vacina é geralmente descrita em, por exemplo, Powell & Newman, Eds. Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach) (1995).

Qualquer dos vários imunoestimulantes podem ser empregados nas vacinas desta invenção. Por exemplo, um adjuvante pode ser incluído. Muitos adjuvantes contêm uma substância desenhada para proteger o antígeno do catabolismo rápido, tal como hidróxido 5 de alumínio ou óleo mineral, e um estimulador de respostas imunes, como lipídio A (natural ou sintético), espécies Bortadella pertussis ou proteínas derivadas de Mycobacterium. Adjuvantes adequados são comercialmente disponíveis como, por exemplo, Adjuvante Completo e Incompledo do Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); Adjuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc. Rahway, N. J.); AS-2 e seus derivados (SmithKIine Beecham, Philadelphia, 10 Pa); CWS, TDM, Leif, sais alumínios tais como gel hidróxido de alumínio (alúmen) ou fosfato de alumínio; sais de cálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilado; açúcar acilado; polissacarídeos derivados cationicamente ou anionicamente ; polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; monofosforil lipídio A e quil A. Citocinas, tais como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, podem também ser utilizadas com adjuvantes.

Outros adjuvantes ilustrativos úteis no contesto da invenção incluem agonistas do

receptor do tipo Toll, tal como agonistas TLR7, agonistas TLR7/8, e semelhantes. Ainda outros adjuvantes ilustrativos incluem imiquimod, gardiquimod e resiquimod e compostos relacionados.

Certas vacinas empregam sistemas adjuvantes desenhados para induzir uma res20 posta imune predominantemente do tipo Th1. Altos níveis de citocina tipo Th1 (por exemplo, IFN-y, TNF-α, IL-2 e IL-12) tendem a favorecer a indução da respostas imunes mediada por célula a um antígeno administrado. Em contraste, altos níveis de citocina tipo Th2 (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunes humoral. Seguindo a aplicação de uma vacina como aqui provido, um paciente irá suportar uma res25 posta imune que inclui respostas tipo Th1 e Th2. Dentro da modalidade, em que a resposta é predominantemente tipo Th1, o nível de citocina tipo Th1 aumentará a uma extensão melhor que o nível de citocina tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser prontamente acessados usando ensaios padrão. Para uma revisão das famílias de citocinas, veja Mossman & Coffman, Ann. Ver. Immunol. 7:145-173 (1989).

Certos adjuvantes para uso em elicitar uma resposta predominantemente do tipo

Th1 inclui, por exemplo, uma combinação de monofosforil lipídio A, preferivelmente monofosforil lipídio 3-de-O-acilados A (3D-MPL®), juntos com um sal alumínio (Pat. Dos EUA Nos. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034; e 4.912.094). Oligoinucleotídeos contendo CpG (nos quais o CpG dinucleotídeo é não metilado) também induz uma resposta predominantemente Th1. 35 Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, em WO 96/02555, WO 99/33488 e Pat. dos EUA Nos. 6.008.200 e 5.856.462. Seqüências DNA imunoestimulatórias também são descritas, por exemplo, por Sato et al, Science 273:352 (1996). Outro adjuvante ilustrativo inclui uma saponina tal como Quil A, ou seus derivados, incluindo QS21 e QS7, Aquila Biofarmacêutica Inc. Framingham, Mass.); Escina; Digitonina; ou Gypsophila ou Chenopodium quinoa. Outras formulações ilustrativas incluem mais de uma saponina nas combinações adjuvantes da presente invenção, por exemplo, combinações de pelo menos dois dos seguintes grupos incluindo QS21, QS7, Quil A, escina, ou digitonina.

Em uma modalidade, o sistema adjuvante inclui a combinação de um lipídio A monofosforil e uma saponina derivada, tal como a combinação de QS21 e 3D-MPL®. Adjuvante, como descrito em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol, como descrito em WO 96/33739. Outras formulações compreendem 10 uma emulsão de óleo em água e tocoferol. Outra formulação adjuvante empregando QS21, 3D-MPL® adjuvante e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita em WO 95/17210.

Outro sistema adjuvante aumentado envolve a combinação de um oligonucleotídeo contendo CpG e uma saponina derivada como revelado em WO 00/09159.

Outros adjuvantes ilustrativos incluem Montanida ISA 720 (Seppic, França), SAF

(Chifron, Calif. Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), as séries adjuvantes SBAS (por exemplo,SBAS-2, AS2’, AS2”, SBAS-4, ou SBAS6, disponíveis por SmithKIine Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox, RC-529 (Corixa, Hamilton, Mont.) e outro aminoalquila glicosaminida 4-fosfato (AGPs), tais como aqueles descritos no pedido de patente pendente 20 Ser. dos EUA Nos. 08/853.826 e 09/074.720 as revelações das quais estão aqui incorporadas por referências em suas totalidades, e adjuvante éter de polioxioetileno tais como aqueles descritos em WO 99/52549A1.

Composições da invenção podem também, ou alternativamente, compreender células T específicas para um polipeptídeo de fusão de Leishmania como aqui descrito. Tais 25 células podem geralmente ser preparadas in vivo ou ex vivo, usando-se procedimentos padrões. Por exemplo, células T podem ser isoladas a partir da medua óssea, sangue periférico ou uma fração da medula óssea ou sangue periférico de um paciente. Alternativamente, células T podem derivar de humanos relacionados e não relacionados, mamíferos não humanos, linhagens celulares ou culturas.

Células T podem ser estimuladas com um polipeptídeo de fusão compreendendo,

duas ou mais porções imunogênicas de antígenos de Leishmania K26, K39 e/ou K9, polinucleotídeos codificando tal polipeptídeo de fusão, e/ou uma célula apresentadora de antígeno (APC) que expressa tal polipeptídeo de fusão. Tal estimulação é realizada sob condições e por um tempo suficiente para permitir a geração de células T que são específicas para o 35 polipeptídeo de fusão. Preferivelmente, o polipeptídeo de fusão ou polinucleotídeo está presente dentro de um veículo de entrega, tal como uma microsfera, para facilitar a geração de células T específicas. Células T são consideradas ser específicas para um polipeptídeo de fusão da invenção se células T proliferam especificamente, secretam citosina ou matam células alvo revestidas com o polipeptídeo ou expressando um gene codificando o polipeptídeo. As especificidades das células T podem ser avaliadas usando qualquer uma das variedades de 5 técnicas padrão. Por exemplo, dentro de um ensaio de liberação de cromo ou ensaio de proliferação, um índice de estimulação de mais de duas vezes aumenta na Iise e/ou proliferação, comparado com controles negativos, indicam especificidades de células T. Tais ensaios podem ser realizados, por exemplo, como descrito em Chen et al, Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)). Alternativamente, a detecção da proliferação de células T pode ser 10 conseguida por uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, proliferação de células T pode ser detectadas medindo-se um aumento na taxa de síntese de DNA (por exemplo, culturas de pulso-marcação de células T com timidina tritiada e medindo a quantidade de timidina tritiada incorporada ao DNA). O contato com um polipeptídeo da invenção (100ng/mL-1 OOMg/mL, preferivelmente 200ng/mΙ_-25μg/mL) por 3-7 dias deveria resultar em 15 pelo menos um aumento de duas vezes na proliferação de células T. Contato como é descrito acima por 2-3 horas deve resultar em ativação das células T, como medido usado ensaios de citocina padrão nos quais um aumento de duas vezes no nível de liberação de citocina (por exemplo,TNFa ou IFN-y) é indicativo de ativação de células T (veja Coligan et al, Current Protocols in Immunology νο\Λ (1988)). Células T têm sido ativadas em resposta a um 20 polipeptídeo de fusão, polunucleotídio ou APC expressando polipeptídeo de fusão pode ser CD4+ e/ou CD8+. Proteínas específicas de células T podem ser expandidas usando técnicas padrões. Dentro de modalidades preferidas, as células T são derivadas de um paciente, um doador relacionado ou um doador não relacionado, e são administrados para o paciente seguindo simulação e expansão.

Na composição farmacêutica da invenção, formulação de excipientes farmaceuti

camente aceitáveis e soluções de veículo são bem conhecidas para os versados na técnica, como é o desenvolvimento de dosagem adequadas e regimes de tratamento para uso de composições particulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo, por exemplo, administração e formulação oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.

Em certas aplicações, as composições farmacêuticas aqui reveladas podem ser distribuídas via administração oral a um paciente. Como tal, estas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um transporte comestível assimilável, ou eles podem ser inclusos em cápsula gelatinosa com revestimento duro ou mole, ou eles podem 35 ser compressos em comprimidos, ou eles podem ser incorporados diretamente com a comida da dieta.

Em certas circunstâncias será desejável distribuir as composições farmacêuticas aqui reveladas parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, ou até intraperitonealmente como descrito, por exemplo, na Pat. dos EUA No. 5.543.158; Pat. dos EUA No. 5.641.515 e Pat. dos EUA No. 5.399.363 (cada especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade). Soluções de compostos ativos como base livre ou sais farmaco5 logicamente aceitáveis podem ser preparados em água devidamente misturada com um tensoativo, tal como hidroxipropilcelulose. Dispersões podem também ser preparadas em polietilenoglicóis líquidos e suas misturas e em óleos. Sob condições comuns de armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas adequadas por uso injetável incluem soluções aquosas

estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções estéreis injetáveis ou dispersões (Pat. dos EUA No. 5.466.468, especificamente incorporada aqui por referência em sua totalidade). Em todos os casos a forma precisa ser esterilizada e deve ser fluído da medida que fácil seringabilidade existe. Ela deve ser estável sob as condições de 15 fabricação e armazenamento e deve ser conservada contra a ação contaminante de microorganismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou dispersão média contendo, por exemplo, água, etanol, poliol, {por exemplo, glicerol, propileno glicol e poIietileno glicol líquido e semelhantes), misturas adequadas dos mesmos e/ou óleos vegetais. Fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento, tal como Ieciti20 na, pela manutenção do tamanho da partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser facilitada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em vários casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis 25 podem ser trazida pelo uso na composição de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o líquido diluente primeiro processado isotônico com solução salina ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são especial30 mente adequadas para administrações intravenosas, intramusculares, subcutâneas, e intraperitoneal. Nesta conexão, um meio aquoso estéril que pode ser empregado será conhecido por versados na técnica à Iuz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1mL de solução NaCI isotônica e adicionado ou não a 1000 ml_ de hipodermóclise fluída ou injetado no local proposto de infusão (veja, por exemplo, Remington’s 35 Pharmaceutical Sciences, 15a edição, pp. 1035-1038 e 1570-1580). Algumas variações na dosagem ocorrerão necessariamente dependendo da condição que o paciente for tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer evento, a dose apropriada para o paciente individual. Além disso, para administração humana, preparações devem encontrar esterilidade, pirogenicidade e a segurança geral e padrões de pureza como requerida pelos padrões do Escritório de Biológicos do FDA.

Soluções estéreis injetáveis são preparadas pela incorporação dos componentes a5 tivos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização por filtração. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação de vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril o qual contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis 10 estéreis, os métodos preferidaos de preparação são secagem à vácuo e técnicas de Iiofilização que rendem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma de suas soluções estéreis filtradas previamente.

As composições aqui reveladas podem ser formuladas em forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem a adição ácida de sais (formados com grupos 15 amino livres da proteína) e os quais são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou tal como ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Sais formados com grupos carboxilas livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxido de sódio, potássio, amônio, cálcio, férrico e tais bases orgânicas como isopropilamina, timetilamina, 20 histidina, procaína e semelhantes. Sobre formulação, soluções serão administradas de maneira compatível com a formulação da dosagem e em tais quantidades como é terapeuticamente efetivas. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem tais como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de drogas e semelhantes.

Como utilizado aqui, “veículo inclui todos e quaisquer solventes, meios de disper25 são, , veículos, revestimento, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, tampões, veículos de soluções, suspensões, colóides e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o ingrediente ativo, seu uso na composição terapêutica é contemplado. 30 Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

A frase “farmaceuticamente aceitável” se refere as entidades moleculares e composições que não produzem reações alérgicas ou inconvenientes semelhantes quando administrados a um humano. A preparação de uma composição aquosa que contenha uma proteína como um ingrediente ativo é bem entendido na técnica. Tipicamente, tais composições 35 são preparadas como injetáveis, quer como soluções líquidas, quer como suspensões; formas sólidas adequadas a solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção podem também ser preparadas. A preparação também pode ser emulsificada. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser distribuídas por pulverizadores intranasais, inalação e/ou outro veículo de entrega aerosol. Métodos para entrega de genes, polinucleotídeos e composições de peptídios diretamente aos pulmões via pulverizadores aerossóis nasais têm sido descritos, por exemplo, na Pat. dos EUA No.

5.756.353 e Pat. dos EUA No. 5.804.212 (cada uma especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade). Da mesma forma, a dsitribuição de drogas utilizando resinas micropartículas intranasais (Takenaga et al, 1998) e compostos lisofosfatidil-glicerol (Pat. dos EUA No. 5.725.871, especificamente incorporado aqui por referência em sua totalidade) são também bem conhecidos na técnica farmacêutica. Da mesma forma, distribuição de 10 drogas transmucosas na forma de matriz de apoio politetrafluoretileno é descrita na Pat. dos EUA No. 5.780.045 (especificamente aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Em certas modalidades, a distribuição pode ocorrer pelo uso de lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas lipídicas, vesículas, e semelhantes, para a introdução das composições da presente invenção em células hospedeiras adequadas. 15 Em particular, as composições da presente invenção podem ser formuladas por distribuição de quer encapsulada em uma partícula de lipídio, um lipossoma, uma vesícula, uma nanosfera, uma nanopartícula ou semelhante. A formulação e uso de tais veículos de distribuição podem ser realizados usando técnicas conhecidas e convencionais.

Em outro aspecto desta invenção, vacinas e composições farmacêuticas são forne20 cidas pela prevenção de infecção de Leishmania e suas complicações, em um mamífero, preferivelmente um humano ou cachorro. Composições farmacêuticas geralmente compreendem um ou mais polipeptídeos de fusão como aqui descrito e um veículo fisiologicamente aceitável. As vacinas compreendem um ou mais dos polipeptídeos de fusão e um adjuvante, para aumento da resposta imune.

Vias e freqüência da administração e doses de polipeptídeo de fusão vão variar de

indivíduo para indivíduo e podem ser paralelas aos atuais sendo utilizados na imunização contra outras infecções de protozoários. Em geral, as composições farmacêuticas e as vacinas podem ser administradas por injeção (por exemplo, intramuscular, intravenosa ou subcutânea), intranasalmente (por exemplo, por aspiração) ou oralmente. Entre 1 e 4 doses 30 devem ser administradas por um período de 2-6 semanas. Preferivelmente, duas doses são administradas, com a segunda dose sendo de 2-4 semanas depois da primeira. Uma dose adequada é uma quantidade de polipeptídeos de fusão que é efetiva para aumentar anticorpos em um mamífero tratado que sejam suficientes para proteger o mamífero da infecção de Leishmania por um período de tempo. Em geral a quantidade de polipeptídeos de fusão pre35 sente na dose varia de cerca de 1 pg para 100 mg por kg do hospedeiro, tipicamente de cerca de 10 pg para cerca de 1 mg, e preferivelmente de cerca de 100 pg a cerca de 1 pg. Tamanhos adequados de doses vão variar com o tamanho do animal, mas tipicamente variam de cerca de 0.01 mL a cerca de 5 mL por 10-60 Kg de animal.

Enquanto qualquer veículo adequado conhecido pelos versados na técnica podem ser empregados nas composições farmacêuticas desta invenção, o tipo de veículo vai variar dependendo do modo de administração. Para administração parenteral, tal como injeção 5 subcutânea, o veículo preferivelmente inclui água, solução salina, álcool, uma gordura, uma cera ou um tampão. Para administração oral, qualquer dos veículos acima, ou veículos sólidos, tais como manitol, lactose, amido, estearato, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sacarose e carbonato de magnésio, podem ser empregados. Microesferas biodegradáveis {por exemplo, galactídeo polilático) podem também ser empregadas como veículos para as 10 composições farmacêuticas desta invenção.

Qualquer uma da variedade de adjuvantes pode ser empregada nas vacinas desta invenção para aumento não específico da resposta imune. A maioria dos adjuvantes contém uma substância designada para proteger o antígeno de rápido catabolismo, tal como hidróxido de alumínio ou óleo mineral e um estimulador não específico de resposta imune, como 15 lipídio A, Bordella pertussis ou Mycobacterium turbeculosis. Tais adjuvantes são comercialmente disponíveis como, por exemplo, adjuvantes Completos e Incompletos de Freund (Difco Laboratories Detroit, Mich) e Merck Adjuvante 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J-)

As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para prover modali20 dades adicionais. Todas as patentes dos EUA, publicações de pedidos de patentes dos EUA, pedidos de patentes dos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patenteadas referidas nesta especificação e/ou listadas na Ficha de Dados do Pedido, são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário para empregar conceitos de várias pa25 tentes, pedidos e publicações para provêr ainda mais modalidades.

EXEMPLOS

EXEMPL01

CLONANDO E EXPRESSANDO POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO DE LEISHMANIA

A presente invenção relaciona-se a uma construção de gene sintético, referido co30 mo K28, compreendendo seqüências derivadas de 3 genes de Leishmania donovani. O gene sintético compreende seqüências de DNA parciais dos genes K26 e K39 e as seqüências de DNA completas do gene K9. Adicionalmente, o gene sintético compreende um motivo Nterminal de nove aminoácidos, que inclui 6 histidinas {por exemplo, um epítopo marcador 6X HIS). A contrução do DNA sintético foi clonada para dentro do local Ndel / Xhol do plasmídio 35 pCRX2.1 a fim de expressar a proteína de fusão deste gene. O gene sintético contém três repetições de 14 aminoácidos do K26 codificado por SEQ ID NO: 1, duas repetições de 39 aminoácidos de K39 codificado por SEQ ID NO: 2, e um quadro de leitura completa para o gene K9 codificado por SEQ ID NO: 3. Esta construção de fusão foi desenhada para melhorar o potencial diagnóstico de cada uma destas únicas proteínas em uma molécula e oferecer uma cobertura mais ampla, sensibilidade melhorada e custos reduzidos em termos de fabricação de uma única proteína ao invés de todas as três.

EXEMPLO 2

DETECÇÃO DE INFECÇÕES DE LEISHMANIOSE VISCERAL ASSINTOMÁTICA OU SUB CLÍNICA EM HUMANOS UTILIZANDO POLIPEPTÍDEO K28

Este exemplo ilustra a aumentada sensibilidade de detecção da infecção de Leishmania em humanos usando um polipeptídeo de fusão da invenção, preparado como descrito no Exemplo 1, em um formato ELISA.

Os ensaios ELISA foram realizados como se segue. Três séries de placas de 96 poços Polysorp (Nunc, Rochester, NI) onde cada uma foi revestida com 2 Mg/mL de um antígeno recombinante diferente em tampão bicarbonato por uma noite a 4°C e bloqueadas por duas horas em temperatura ambiente com PBST com 1% (p/v) de BSA em um agitador de placas. Soro foi diluído apropriadamente para 1/200 em PBST com 0.1% BSA adicionado a cada poço e placas foram incubadas em temperatura ambiente por duas horas com agitação. Placas foram lavadas com PBST com 0.1% BSA e então imunoglobina IgG conjugada com HRP (Sigma, St. Louis, MO), diluída 1:10000 em PBST e 0.1% BSA, foi adicionada a cada poço e incubado em temperatura ambiente por 60 minutos com agitação. Depois da lavagem, placas foram desenvolvidas com substrato de cor peroxidase (KPL, Baltimore MD) com reação extinta por adição de 1N de H2SO4 depois de 10 minutos. A densidade óptica correta de cada poço em 450-570nm foi lida usando um leitor de microplaca VERSAmax® (Molecular Devices, Sunnyvale CA). O valor de corte foi determinado por cada teste calculando a média dos controle negativo Conjugados a Enzima mais três desvios padrões (EC). Indivíduos venezuelanos com Ieishmaniose visceral (LV) foram identificados basea

dos em sorologia (por exemplo,|FAT ou IHA imunoflorescência ou hemaglutinação), sintomas clínicos (por exemplo,mal estar, diarréia, esplenomegalia e hepatomegalia) e todo Iisado ELISA. De 52 amostras de soro de pacientes com LV1 94% dos testes foram positivos usando o ensaio acima. Entretanto, o teste do antígeno K28 mostrou Dos significantemente 30 maiores em 33% das amostras fracas ou marginalmente detectadas utilizando o antígeno K39 sozinho. Em adição, 3 amostras que foram inicialmente caracterizadas como negativas usando o ensaio K39 foram detectadas com segurança usando o teste antígeno K38.

Esses resultados são revelados na FIG. 2, que mostra a distribuição dos valores de absorbância em 450-570 nm para as 52 amostras de soro LV ensaiadas com K26, K28 e K39. Esses resultados indicam que usando K28 provê-se sensibilidade aumentada do que usando K39 sozinho para detectar Ieishmaniose visceral assintomática ou sub clínica. EXEMPLO 3 DETECÇÃO DE INFECÇÃO VISCERAL DE LEISHMANIA ASSINTOMÁTICA OU SUB CLÍNICA EM CANINOS USANDO O POLIPEPTÍDEO K28

Este exemplo ilustra o aumento na sensibilidade de detecção de infecção de Leishmania em caninos usando o polipeptídeo de fusão da invenção, preparado como descrito j no Exemplo 1, em um formato ELISA.

Os ensaios ELISA foram realizados como descrito no Exemplo 2, exceto que 4 antígenos recombinantes foram utilizados. Quatro séries de placas de 96 poços Polysorp foram cada revestidas com 2pg/mL de antígeno recombinante K9, K26, K28, ou K39. Caninos venezuelanos com Ieishmaniose visceral (LV) foram identificados baseados na sorologia ) (por exemplo,IFAT ou IHA imunofluorescência ou hemaglutinação), sintomas clínicos (por exemplo,mal estar, diarréia, esplenomegalia e hepatomegalia) e ELISA com Iisado total.

Os resultados revelador na FIG 3. mostra que K28 identificou um número de casos significantemente maior do que os outros três antígenos usados sozinhos. Isto indica que usando K28 provê-se um aumento da sensibilidade em caninos em detectar Ieishmaniose sub clínica ou assintomática, e além disso, ο K28 provê sensibilidade aumentada de detecção sobre o uso dos antígenos K9, K26 e K39 sozinhos.

EXEMPLO 4

DETECÇÃO DE INFECÇÕES DE LEISHMANIA VISCERAL EM HUMANOS USANDO UM POLIPEPTÍDEO K28 OU UM POLIPEPTÍDEO K39 EM UM FORMATO DE 3 TESTE RÁPIDO DE VIA DUPLA COMPARADO AO ENSIAO DE AGLUTINAÇÃO DIRETA

Este exemplo ilustra o aumento da sensibilidade de detecção da infecção de Leishmania em humanos usando o polipeptídeo de fusão da invenção (K28), preparado como descrito no Exemplol, versus um único antígeno (K39) em um formato de teste rápido de via dupla, como comparado com um ensaio de aglutinação direta (DAT) usando soro do Sudão.

O teste rápido de via dupla foi realizado essencialmente como descrito na Patente

dos EUA No. 7.189.522, a qual é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Brevemente, K28 ou K39 foram revestidos em tiras de nitrocelulose. Uma gota de soro humano diluído apropriadamente foi adicionada ao poço da amostra no cartucho teste contendo nitrocelulose impregnado com antígeno. Duas gotas de amostra de tampão foram adicionadas O ao poço da amostra e a amostra foi permitida migrar por ação capilar até as linhas na janela de detecção do cartucho de teste desaparecerem. Duas gotas de tampão foram adicionadas ao poço do reagente de detecção no cartucho de teste para reconstruir o reagente de detecção imobilizado (proteína A Estafilocócica conjugada com ouro coloidal).

O reagente de detecção migra por fluxo capilar para a janela de detecção. Se a amostra contiver anticorpos ao teste de antígeno, eles ligam ao antígeno imobilizado na janela de detecção, onde eles serão visualizados como duas linhas rosas por ligação do reagente de detecção. Uma única linha rosa indica que não há nenhum anticorpo na amostra e que o reagente de detecção é ligado a imunoglobina (LG) controle imobilizada na janela de detecção. A ausência de qualquer linha rosa é um indicativo de um teste defeituoso.

O teste DAT foi realizado essencialmente como descrito por Sundar e Rai em Clin Diag Lab Immunol 9: 951-958, 2002.

Os resultados desta análise demonstram que K28 identificou um número significan

temente maior de casos de humanos LV do que fez K39 sozinho. Mais especificamente, K28 proveu aumento da sensibilidade em humanoo (66/69 amostras, 95.6%) para detectar Ieishmaniose visceral versus K39 sozinho (61/69 amostras, 88.4%) quando empregado em um formato de teste rápido de via dupla. Em adição, 4 amostras de pacientes com títulos DAT 10 muito baixos (<3200) foram corretamente identificados pelo teste rápido K28, enquanto apenas 2 de 4 foram corretamente identificados pelo teste rápido K39.

Estas e outras mudanças podem ser feitas às modalidades à Iuz da descrição detalhada acima. Em geral, nas reivindicações seguintes, os termos usados não devem ser construídos para limitar as reivindicações às modalidades específicas reveladas na especifi15 cação e as reivindicações, mas deve ser construído para incluir todas as modalidades possíveis ao longo do inteiro objetivo de equivalência para o qual tais reivindicações são intituladas. Consequentemente, as reivindicações não são limitadas pela revelação.

As várias modalidades descritas acima podem ser combinadas para prover modalidades adicionais. Todas as patentes dos EUA, publicações de pedidos de patentes dos 20 EUA, pedidos de patentes dos EUA, patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações não patentes referidas nesta especificação e/ou listadas na Ficha de Dados do Pedido são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Aspectos das modalidades podem ser modificados, se necessário, para empregar conceitos de várias patentes, aplicações e publicações para provêr ainda modalidades adicionais.

Claims

1. Polipeptídeo de fusão isolado, CARACTERIZADO pelo fato de compreender dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados a partir do grupo consistindo K26, K39 e K9, ou porções imunogênicas ou variantes dos mesmos, em que pelo menos um dos antígenos é isolado a partir de Leishmania donovani.

2. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência K26 compreendendo SEQ ID N0:5, uma seqüência K39 compreendendo SEQ ID N0:6 e uma seqüência K9 compreendendo SEQ ID N0:7.

3. Polipeptídeo de fusão, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência aminoácida conforme revelado em 10-262 da SEQ ID NO:8.

4. Polipeptídeo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão ainda compreende uma sequência aminoácida N-terminal de MHHHHHHTS (SEQ ID NO:21).

5. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de codificar um polipeptídeo de fusão conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 -4.

6. Anticorpo isolado, ou fragmento Iigador de antígeno CARACTERIZADO pelo fato de especificamente se ligar a um polipeptídeo de fusão conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 -4.

7. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de compreender, (a) um polipeptídeo de fusão conforme descrito na reivindicação 1, ou (b) um anticorpo isolado ou um fragmento Iigador de antígeno conforme descrito na reivindicação 6; ou (c) um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 5, e um veículo fisiologicamente aceitável.

8. Vacina CARACTERIZADA pelo fato de compreender, (a) um polipeptídeo de fusão conforme descrito na reivindicação 1, ou (b) um anticorpo isolado ou fragmento de ligação de antígeno conforme descrito na reivindicação 6; ou (c) um polinucleotídeo conforme descrito na reivindicação 5; e um aumentador da resposta imune não específica.

9. Método para detecção de infeção por Leishmania assintomática ou sub-clínica em uma amostra biológica selecionada a partir do grupo consistindo de soro, sangue, e saliva, CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) por em contato uma amostra biológica com um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishamania selecionados a partir do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou porções imunogênicas ou variantes das mesmas; e (b) detecção na amostra biológica da presença de anticorpos que se ligam ao polipeptídeo de fusão, assim detectando infecção por Leishmania assintomática ou sub-clínica na amostra biológica.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende as seqüências aminoácidas reveladas na SEQ ID NOs 5-7.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência aminoácida conforme revelado em 10- 262 da SEQ ID NO:8.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende uma seqüência aminoácida N-terminal de MHHHHHHTS (SEQ ID NO: 21).

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de fusão está ligado a um suporte sólido.

14. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte sólido compreende nitrocelulose, látex ou um material plástico.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o passo de detecção compreende: (a) remoção da amostra não ligada a partir do suporte sólido; (b) adição de um reagente de detecção ao suporte sólido; e (c) determinação do nível de detecção reagente ligado ao suporte sólido, relativo a um valor de corte pré-determinado.

16. Método de identificar um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub-clínica que é propenso a desenvolver Ieishmaniose visceral aguda CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) colocar uma amostra biológica obtida a partir de um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub-clínica com um primeiro polipeptídeo que é um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados a partir do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou porções imunogênicas ou variantes dos mesmos, a amostra biológica sendo selecionada a partir do grupo consistindo de soro, sangue e saliva; e (b) independentemente colocar em contato a amostra biológica com um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência aminoácida conforme revelado nas SEQ ID N0s:10e11;e (c) detectar na amostra a presença de anticorpos que se ligam a pelo menos um dos primeiro e segundo polipeptídeos, assim identificando um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintorMtica ou sub-clfnica que e propenso ao desenvolvimento da Iei-shmaniose visceral aguda.

17. Metodo, de acordo com a reivindicagao 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo de fusao compreende as sequencias aminoacidas reveladas nas SEQ ID NOs: 5-7.

18. Metodo, de acordo com a reivindicagao 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo de fusao compreende uma sequencia aminoacida conforme revelado em 10-262 da SEQ ID NO:8.

19. Metodo, de acordo com a reivindicagao 18，CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo de fusao ainda compreende uma sequencia aminoacida N-terminal de MHHHHHHTS (SEQ ID NO:21).

20. Metodo, de acordo com a reivindicagao 16, CARACTERIZADO pelo fato de que os primeiro e segundo polipeptideos sao cada Iigados a um suporte solido separado.

21. Metodo, de acordo com a reivindicagao 20，CARACTERIZADO pelo fato de que o suporte solido compreende nitrocelulose, Iatex ou um material plastico.

22. Metodo, de acordo com a reivindicagao 16, CARACTERIZADO pelo fato de que o passo de detecgao compreende: (a) remogao da amostra nao Iigada a partir de cada suporte solido; (b) adigao de um reagente de detecgao a cada suporte solido; e (c) comparar o nfvel de detecgao do reagente Iigado a cada suporte solido, relativo a um valor de corte pre-determinado.

23. Metodo1 de acordo com quaisquer das reivindicagoes 15 ou 22， CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de detecgao compreende um grupo reporter conjugado a um agente de ligagao.

24. Metodo, de acordo com a reivindicagao 23，CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de liga9a0 e selecionado a partir do grupo consistindo de anti-imunoglobulina, Pro-teina G, Protefna A e lectinas.

25. Metodo, de acordo com a reivindicagao 23, CARACTERIZADO pelo fato de que 0 grupo reporter e selecionado a partir do grupo consistindo de radiois6topos, grupos fluo-rescentes, grupos luminescentes, enzimas, biotina e particulas corantes.

26. Kit diagnostico para detecgao de Ieishmaniose visceral assintomatica ou sub-clfnica em uma amostra biologica selecionada a partir de um grupo consistindo de soro, sangue, e saliva CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) um polipeptideo de fusao compreendendo dois ou mais antigenos de Leishma-nia selecionados a partir do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou p0r50es imunogenicas ou variantes dos mesmos; e (b) um reagente de detecgao.

27. Kit diagnóstico para identificar um paciente afligido com Ieishmaniose visceral assintomática ou sub-clínica que é propenso de desenvolver Ieishmaniose visceral aguda CARACTERIZADO pelo fato de compreender: (a) um primeiro polipeptídeo que é um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais antígenos de Leishmania selecionados a partir do grupo consistindo de K26, K39 e K9, ou porções imunogênicas ou variantes dos mesmos; (b) um segundo polipeptídeo compreendendo uma seqüência aminoácida conforme revelado nas SEQ ID NOs: 10 ou 11; e (c) um reagente de detecção.

28. Kit, de acordo com quaisquer das reivindicações 26 ou 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de detecção compreende um grupo repórter conjugado a um agente de ligação.

29. Kit, de acordo com quaisquer das reivindicações 26 ou 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de ligação é selecionado a partir do grupo consistindo de antiimunoglobulina, Proteína G, Proteína A e lectinas.

30. Kit, de acordo com quaisquer das reivindicações 26 ou 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo repórter é selecionado a partir do grupo consistindo de radioisótopos, grupos fluorescentes, grupos luminescentes, enzimas, biotina e partículas corantes.