BRPI0914092B1 - Método de produção de um anticorpo a partir de células plasmáticas, método de produção de um anticorpo monoclonal a partir de células plasmáticas e método de produção de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo - Google Patents

Abstract

método de produção de um anticorpo a partir de células plasmática, método de produção de um anticorpo monoclonal a partir de células plasmáticas, método de produção de um anticorpo ou de um fragmento de anticorpo, anticorpo isolado ou fragmento de antigeno de ligação do mesmo, anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo e anticorpo ou fragmento de anticorpo. a inevenção se refere a métodos de produção de anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, que compreende cultivar um número limitado de células plasmáticas. ela também se refere a métodos de identificação de anticorpos através da realização de ensaios nos anticorpos produzidos pelas células plasmáticas cultivadas para determinar a sua função, especificidade de ligação, especificidade de epítopo e/ou sua capacidade de neutralizar um toxina ou um agente patogênico. a invenção também se refere a anticorpos e fragmentos de anticorpos produzidos pelos métodos da invenção, bem como a métodos de utilização dos anticorpos e dos fragmentos de anticorpos.

Description

Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente GB No 0819376.5, requerido em 22 de outubro de 2008, o Pedido de Patente Provisória Norte Americana com número de série 61/181.582, requerido em 27 de maio de 2009, o Pedido de Patente PCT número PCT/US2009/051851 e os Pedidos de Patente US com números de série 12/509.731, ambos requeridos em 27 de julho de 2009.

ANTECEDENTES

As células plasmáticas são células terminalmente diferenciadas e não-proliferativas, que secretam anticorpos a uma taxa muito elevada (milhares de moléculas por segundo, correspondendo a cerca de 30-50 pg por célula por dia).

O isolamento de anticorpos como os anticorpos monoclonais, a partir de células plasmáticas, conta com a clonagem e a expressão dos genes de imunoglobulina. Isso pode ser feito com a utilização de bibliotecas de exibição de fagos de genes VH e VL misturados, isolados de células plasmáticas ou pelo isolamento de genes VH e VL emparelhados de células plasmáticas únicas usando PCR de células única. No entanto, a fim de fazer a triagem dos anticorpos produzidos por células plasmáticas, os genes de imunoglobulinas precisam ser clonados e expressos em uma forma recombinante, a fim de determinar a especificidade e as propriedades funcionais do anticorpo codificado. Este método é trabalhoso, caro, demorado, não adaptável a alto rendimento e ineficiente na recuperação de anticorpos raros que são produzidos por uma pequena fração do repertório total de células plasmáticas.

Assim, existe a necessidade de identificar um método mais eficiente que seja adaptável a alto rendimento para o isolamento e a triagem de anticorpos, por exemplo, s‘ anticorpos monoclonais de células plasmáticas. 5 ‘

SUMÁRIO

A invenção é baseada, em parte, na descoberta de um método eficiente e de alto rendimento de produzir anticorpos a partir de células plasmáticas que permitem a caracterização dos anticorpos sem depender de clonagem e expressão dos genes 10 de imunoglobulinas. Os anticorpos produzidos pela presente invenção podem ser caracterizados pela realização de várias triagens, incluindo ensaios de ligação, funcionais e/ou de neutralização. A invenção provê um método para a identificação de anticorpos raros produzidos pelas células 15 plasmáticas.

Assim, em um aspecto da invenção, a invenção provê um método para produzir um anticorpo de células plasmáticas^ que compreende cultivar células plasmáticas em número limitado. Em uma realização, a invenção provê um método para 20 produzir um anticorpo monoclonal de células plasmáticas que compreende cultivar as células plasmáticas em culturas celulares únicas. Os métodos da invenção podem compreender adicionalmente a caracterização dos anticorpos ou dos fragmentos de anticorpos. A caracterização dos anticorpos ou 25 dos fragmentos de anticorpos inclui, entre outros, a realização de ensaios funcionais para determinar a função do anticorpo ou do fragmento de anticorpo, ensaios de ligação para determinar a especificidade de ligação do anticorpo ou f- do fragmento de anticorpo ou o epítopo reconhecido pelo 30 anticorpo ou fragmento de anticorpo, e/ou ensaios de neutralização para determinar a capacidade do anticorpo ou do ~ fragmento de anticorpo para neutralizar uma toxina ou um patógeno.

Em outra realização, a invenção provê um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. O método compreende o cultivo de um número limitado de células plasmáticas, identificando as culturas que produzem um 5 anticorpo com uma característica desejada, isolando o ácido nucleico que codifica os anticorpos produzidos, e expressando o ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Em outro aspecto da invenção, a invenção provê um anticorpo isolado ou um fragmento de anticorpo produzido por 10 um método da invenção. A invenção também provê métodos para diagnosticar e/ou tratar uma variedade de estados ou doenças usando os anticorpos isolados ou os fragmentos de anticorpos da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a produção acumulada de IgG pelas células plasmáticas CD 138+ isoladas do sangue periférico e cultivadas em monocamadas de células^estrqmais mesenquimais por 50 dias.

A Figura 2 mostra a produção acumulada de IgG pelas 20 células plasmáticas CD 138+ em culturas contendo células plasmáticas únicas isoladas a partir (A) do sangue periférico e (B) da medula óssea.

A Figura 3 mostra os resultados dos testes do sobrenadante de culturas de 10 dias de células plasmáticas 25 CD138-alta isoladas do sangue periférico e cultivadas em monocamadas de células estromais mesenquimais para a presença *r‘ de IgG, IgA, IgM e IgE.

A Figura 4 mostra a eficiência de plaqueamento de f células secretoras de anticorpos (ASC) que produzem anticorpos IgG, IgA ou IgM, quando cultivadas em células hMSC-TERT e expressas como porcentagem de célulasplasmáticas ~ que sobrevivem o tempo suficiente para produzir quantidades detectáveis de anticorpos no sobrenadante.

A Figura 5 mostra a identificação de células plasmáticas secretoras de IgG específico anti-toxóide tetânico de células plasmáticas isoladas do sangue periférico coletado 7 dias após a vacinação de reforço contra o toxóide 5 tetânico (TT).

A Figura 6 mostra a ligação ao toxóide tetânico de um anticorpo recombinante produzido através de clonagem e expressão de genes VH e VL recuperados de uma cultura de células plasmáticas isoladas do sangue de um doador de 10 10 anos após a vacinação com o toxóide tetânico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção é baseada na descoberta de um método eficiente e de alto rendimento de produzir anticorpos a partir de células plasmáticas que permite a caracterização 15 dos anticorpos sem depender de clonagem e expressão dos genes de imunoglobulinas. Em um aspecto, a invenção provê um método para produzir um^_ anticorpo^ de célula.s plasmátiças_ que _ compreende cultivar células plasmáticas em número limitado. Os anticorpos produzidos com a presente invenção podem ser 20 caracterizados convenientemente com várias triagens, incluindo ensaios de ligação, funcionais e/ou de neutralização, e podem até mesmo ser realizados in situ, ou seja, nos poços onde as células plasmáticas foram cultivadas.

Conforme utilizado aqui, o termo "célula 25 plasmática" inclui todas as células secretoras de anticorpos primários (ASC) que são encontradas no sangue periférico, na medula óssea, nos tecidos ou nos fluidos corporais, ou são gerados in vitro de células B. As células plasmáticas recém- geradas são conhecidas como "descargas plasmáticas".

As descargas plasmáticas geradas naturalmente são geralmente encontradas no sangue, principalmente nosangue periférico. As descargas plasmáticas também podem ser geradas in vitro, pela estimulação das células B com uma variedade de estímulos, incluindo ativadores policlonais como os agonistas dos TLR. Aqui, os termos "célula plasmática" ou "células plasmáticas" devem ser considerados para incluir tanto "células plasmáticas", como "descargas plasmáticas" e ASCs.

Teoricamente, qualquer número de células plasmáticas pode ser cultivado em meio de cultura para produzir e identificar anticorpos com a característica desejada. Na prática, o número de células plasmáticas que pode ser cultivado é limitado pela tecnologia disponível para a clonagem e a expressão de sequências de genes VH e VL múltiplos e de suas combinações presentes na cultura de células policlonais. Em uma realização, um "número limitado de células plasmáticas" se refere a um número de células plasmáticas que é de cerca de lOOou inferior, por exemplo, 90 ou menos, 8 0 ou menos, 7 0 ou menos, 6 0 ou menos, 5 0 ou menos, 45 ou menos, 40 ou menos, 35 ou menos, 30 ou menos, 25 ou menos, 2 0 ou menos, 17 ou„menos ,_15 ou.menos, 12_ou menos, 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, 2 ou menos, qu 1 ou menos.

Em uma realização, a invenção provê um método para produzir um anticorpo de células plasmáticas que compreende cultivar as células plasmáticas em baixa concentração de células plasmáticas por cultura. A baixa concentração de células ; plasmáticas por cultura geralmente compreende cerca de 1 a cerca de 10, ou cerca de 1 a cerca de 15, ou cercê 1 de 1 a cerca de 20, ou cerca de 1 a cerca de 25, ou cerca de 1 a cerca de 30, ou cerca de 1 a cerca de 40, ou cerca de 1 a cerca de 50, ou cerca de 1 a cerca de 60, ou cerca de 1 a cerca de 70, ou cerca de 1 a cerca de 80, ou cerca de 1 a cerca de ■ 90 , ou cerca de 1 a cerca de 100 células por cultura.

Em outra realização, a invenção provê um método para produzir um anticorpo de células plasmáticas que compreende cultivar as células plasmáticas, onde as células plasmáticas foram diluídas a uma baixa concentração de células por cultura. Ainda em outra realização, a invenção 5 provê um método para produzir um anticorpo de células plasmáticas que compreende cultivar um número reduzido de células plasmáticas. O número de células plasmáticas isoladas, por exemplo, de origem biológica, pode ser reduzido, como descrito abaixo. Como usado aqui, "número de 10 células plasmáticas reduzido" é usado alternadamente com "número limitado de células plasmáticas", como descrito acima. As técnicas de obtenção do número de células desejado em uma cultura são bem conhecidas na técnica. Tais técnicas incluem, entre outras, a diluição limitante, ouaseparação e 15 a deposição de células. Por exemplo, as culturas que compreendem um número limitado ou reduzido de células plasmáticas podem ser conseguidas_pela^deposição _ de células únicas com a utilização de um separador de células ou pela diluição de uma suspensão de células plasmáticas com meio de 20 cultura suficiente, de tal forma que 1, 2, 3 ou mais células, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 células estejam presentes por poço de uma placa de cultura de microtitulação.

Em uma realização, uma célula plasmática únicas é 25 cultivada. Dada a natureza monoclonal dos anticorpos produzidos por uma única célula plasmática, o cultivo de células plasmáticas em cultura celular única produziria uma população de anticorpos monoclonais. Assim, em uma realização, a invenção provê um método para produzir um 30 anticorpo monoclonal de células plasmáticas que compreende cultivar as células plasmáticas em culturas celulares únicas.

Conforme utilizado aqui, o termo "cultura celular única" é usado alternadamente com "cultivo de uma célula plasmática única", e se refere a uma cultura que compreende, em média, uma célula plasmática única. Assim, em uma placa multipoços, por exemplo, uma placa de 96 poços, uma placa de 384 poços ou uma placa de 1536 poços, a maioria dos poços irá 5 conter uma célula plasmática única, alguns não irão conter células plasmáticas e alguns outros irão conter mais de uma célula plasmática. Em algumas realizações, as células plasmáticas podem ser cultivadas em culturas onde há, em média, menos de 1 célula por poço, por exemplo, 0,8 célula/poço, 0,6 célula/poço, 0,5 célula/poço, 0,3 célula/poço ou 0,1 célula/poço. As técnicas de obtenção de uma única célula em uma cultura são semelhantes ãs descritas acima, exceto que agora uma média de 1 ou menos de 1 célula _ está presente . por poço de uma placa de cultura de 15 microtitulação.

A invenção adicionalmente provê um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. O método compreende o cultivo de um número limitado de células plasmáticas, de acordo com qualquer método da invenção, 20 identificando as culturas que produzem um anticorpo com uma característica desejada, isolando o ácido nucleico que codifica os anticorpos produzidos, e expressando o ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Ao contrário das células B de memória, que podem 25 ser expandidas em clones de células produtoras de anticorpos por imortalização (Traggiai et al., 2004, Nat Med 10:871-875; Lanzavecchia et al, 2007, Curr Opin Biotechnol. 18:523-528), as células plasmáticas não se dividem, e não podem ser estimuladas ou imortalizadas. Portanto, a fim de aproveitar o 30 uso dessas "fábricas de anticorpos" de forma significativa, a célula plasmática deve ser mantida viva em cultura. As células plasmáticas produzem e secretam anticorpos de forma contínua, e o tamanho da população de anticorpos, por conseguinte, aumenta em função do tempo. Embora as células plasmáticas sobrevivam por períodos muito longos in vivo, elas não sobrevivem por muito mais tempo do que um dia in vitro (dados experimentais não mostrados). Assim, a invenção 5 provê um método de produzir anticorpos pelo cultivo de células plasmáticas, incluindo, entre outras, uma célula plasmática únicas, em meio de cultura que compreende um componente exógeno, ou componentes que prolonguem a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas.

Em geral, a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas é prolongada por tempo suficiente para que o anticorpo seja produzido em quantidades necessárias para a caracterização dos anticorpos, ou seja, o meio de cultura contém anticorpos suficientes para que possam ser usados para 15 testes de triagem, incluindo, entre outros, ensaios de ligação, ensaios de neutralização ou outros ensaios que determinem„a função, Iou_que„caracterizeni_,os_anticorpos. As. culturas que contêm um anticorpo da especificidade' desejada podem então ser isoladas, e os genes de imunoglobulinas podem 20 ser multiplicados, sequenciados e expressos, para produzir um anticorpo monoclonal.

A sobrevivência das células plasmáticas, entre outras, uma célula plasmática única, em cultura, pode ser prolongada por um curto período ou por um longo período. Como 25 usado aqui, o termo "curto período" se refere a um período de pelo menos dois dias, a cerca de 9 dias, ou seja, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou cerca de 9 dias. Como usado aqui, o termo "longo período" se refere a um período de pelo menos dez dias, ou seja, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 30 100, 110, 120, 130, 140, ou cerca de 150 dias.

Apesar de o prolongamento da sobrevivência das células plasmáticas por um curto período poder não produzir tantos anticorpos como os produzidos quando a sobrevivência das células plasmáticas é prolongada por um longo período, o prolongamento da sobrevivência das células plasmáticas por um curto período, como descrito aqui, é mais fácil, mais rápido e mais econômico, e é particularmente útil para a triagem de 5 anticorpos em ensaios que são sensíveis. O prolongamento da sobrevivência das células plasmáticas por um longo período é particularmente adequado nas circunstâncias em que a caracterização de anticorpos requer vários testes de triagem ou ensaios de baixa sensibilidade.

Em uma realização, o componente exógeno presente no meio de cultura prolonga a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas por um período curto. Em uma realização, o componente exógeno prolonga a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas por um período longo. O 15 componente exógeno pode ser um ou mais ligantes de receptores expressos pela célula plasmática, ou uma ou mais célula não- plasmática.' ... .. -. ^.... .. ., _ ... ,

Os exemplos de ligantes para um receptor expresso pelas células plasmáticas útil para prolongar a sobrevivência 20 das células plasmáticas cultivadas incluem, entre outros, as citocinas, as quimiocinas e outros ligantes. Em uma outra realização, o ligante é IL-, IL-6, fator-1 derivado de célula estromal (SDF-1), TNF-a, ou um ligante para CD44, por exemplo, o ácido hialurônico. Em outra realização, o 25 componente exógeno compreende um ou mais ligantes selecionados do grupo constituído por IL-5, IL-6, fator-1 derivado de célula estromal (SDF-1), TNF-a, ligantes para CD44, por exemplo, ácido hialurônico, e suas combinações, e é útil para prolongar a sobrevivência das células plasmáticas 30 cultivadas por um período curto ou um período longo.

Os exemplos de células não plasmáticas úteis para prolongar a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas incluem, entre outros, as células estromais mesenquimais, os fibroblastos e os osteoclastos. Em uma realização, as células não plasmáticas são células estromais mesenquimais, fibroblastos ou osteoclastos, e são úteis para prolongar a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas por um período curto ou um período longo. Em uma outra realização, as células não plasmáticas são células estromais mesenquimais, e são úteis para prolongar a sobrevivência das células plasmáticas cultivadas por um período curto ou um período longo. As células estromais mesenquimais podem ser células estromais mesenquimais de mamíferos, incluindo, entre outras, as células estromais mesenquimais humanas. As células estromais mesenquimais podem, opcionalmente, ser imortalizadas antes de sua utilização na cultura.

Em uma. realização da invenção, as células plasmáticas são cultivadas, por exemplo, em uma cultura celular única, por cerca de 3 a cerca de 7 ou cerca de 5 a =cerca_.de9 dias na__cultura, na presença., de um ou mais ligantes para um receptor expresso pela célula plasmática. Em outra realização, as células plasmáticas são cultivadas, por exemplo, em uma cultura celular única por cerca de 5 a 7, ou cerca de 10, ou cerca de 15, ou cerca de 20, ou cerca de 25, ou cerca de 30, ou cerca de 35, ou cerca de 40, ou cerca de 45, ou mais de 50 dias na cultura, na presença de um ou mais tipos de células não plasmáticas. Ainda em outra realização, as células plasmáticas são cultivadas, por exemplo, em uma cultura celular única por cerca de 5 a 7, ou cerca de 10, ou cerca de 15, ou cerca de 20, ou cerca de 25, ou cerca de 30, ou cerca de 35, ou cerca de 40, ou cerca de 45, ou mais de 50 dias na cultura, na presença de células estromais mesenquimais. Ainda em outra realização, as células plasmáticas são cultivadas, por exemplo, em uma cultura celular única por cerca de 5 a 7, ou cerca de 10, ou cerca de 15, ou cerca de 20, ou cerca de 25, ou cerca de 30, ou cerca de 35, ou cerca de 40, ou cerca de 45, ou cerca de 50, ou cerca de 55, ou cerca de 60, ou cerca de 65, ou mais de 70 dias na cultura, na presença de um ou mais tipos de células não plasmáticas e urn ou mais ligantes para um receptor 5 expresso pela célula plasmática.

Em uma realização, a eficiência de plaqueamento das células cultivadas pode ser de pelo menos cerca de 3 0%, em outra realização a eficiência de plaqueamento pode ser de pelo menos cerca de 40%, em outra realização a eficiência de 10 plaqueamento pode ser de pelo menos cerca de 5 0%, em outra realização a eficiência de plaqueamento pode ser de pelo menos cerca de 55%, em outra realização a eficiência de plaqueamento pode ser de pelo menos cerca de 60% ou mais.

Conforme utilizado aqui, o termo "eficiência de 15 plaqueamento" se refere a porcentagem de células plasmáticas que sobrevivem o tempo suficiente para produzir quantidades .— ___detectáveis de ant icorpos„no_s,obrenadante . ,

As células plasmáticas que são cultivadas podem ser obtidas de qualquer espécie desejada. Em uma realização, as 20 células plasmáticas são de camundongo, rato, coelho, camelo, ou células plasmáticas de macaco. Em outra realização, as células plasmáticas cultivadas são células plasmáticas humanas, e os anticorpos produzidos são anticorpos humanos. Ainda em outra realização, os anticorpos monoclonais humanos 25 são produzidos pela cultura de células plasmáticas humanas em culturas celulares únicas.

As células plasmáticas, como as células plasmáticas humanas, podem ser isoladas do sangue periférico de um ser humano. Estas células plasmáticas humanas podem ser 30 conhecidas como "células plasmáticas de sangue periférico" ou "células plasmáticas circulantes".Ascélulasplasmáticas, como células plasmáticas humanas, também podem ser isoladas da medula óssea, dos tecidos ou dos fluidos corporais, incluindo, entre outros, o líquido sinovial, o líquido cefalorraquidiano e os exsudatos de um ser humano. O termo "tecido" é destinado a cobrir qualquer tecido presente no corpo humano, e pode incluir o tecido cardíaco, o tecido 5 nervoso, tecido muscular, o epitélio, o tecido conjuntivo e os órgãos linfóides, como o timo, o baço e os linfonodos.

As células plasmáticas são geralmente caracterizadas pela expressão de CD138 e, opcionalmente, pela expressão adicional de CD27, CD38, CD9, CD44 e moléculas de 10 MHC de classe II. Em uma realização, as células podem ser isoladas do sangue periférico, dos tecidos, da medula óssea ou dos fluidos corporais, de acordo com a expressão de CD138. Os marcadores de superfície, tais como CD27, CD38, CD9, CD44 e as moléculas de MHC de classe IItambémpodem ser usados em 15 conjunto com o CD138 para melhorar o processo de isolamento e identificação de subpopulações de células plasmáticas (Arce et al. , 2004, J Leiikoc Biol. 75 : 1022 -1028) . Em outra realização, as células plasmáticas podem ser isoladas por meio de partículas micro-esféricas magnéticas. Ainda em outra 20 realização, as células plasmáticas podem ser isoladas por meio de partículas micro-esféricas magnéticas que são revestidas com anticorpos anti CD-138 imobilizados. Ainda em outra realização, o enriquecimento das células plasmáticas utilizando partículas micro-esféricas magnéticas pode ser 25 seguido pela separação de células.

Em uma realização, as células plasmáticas podem ser isoladas do sangue periférico de um doador humano após a .. vacinação. A vacinação se refere à administração de qualquer antígeno capaz de induzir uma resposta imune. A vacina pode 30 ser qualquer vacina conhecida agora ou disponível no futuro ao técnico no assunto e inclui, entre outras,asvacinas contra toxóide tetânico, gripe, febre amarela, difteria, tétano, hepatite B, varíola e câncer. Em outra realização, a vacinação pode ser uma vacinação de reforço. As células plasmáticas podem ser isoladas do doador 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias após a vacinação. Em uma realização, as células plasmáticas podem ser isoladas de um doador que esteja 5 respondendo a um patógeno conhecido. Em outra realização, as células plasmáticas podem ser isoladas de um doador que esteja respondendo a um patógeno desconhecido. Em outra realização, as células plasmáticas podem ser isoladas de um doador com uma alergia. Ainda em outra realização, as células 10 plasmáticas podem ser isoladas de um doador em estado estável. Ainda em outra realização, as células plasmáticas podem ser isoladas de um doador com uma doença autoimune.

Em outra realização, as células plasmáticas podem ser geradas in vitro por estimulação das células B. Esta 15 estimulação pode ser feita por qualquer método conhecido na técnica, incluindo a estimulação policlonal ou a estimulação antígeno-específica de célula.s B não tratadas anteriormente ou de memória (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199- 2202) .

O método da presente invenção pode ser usado para cultivar células plasmáticas secretoras de qualquer anticorpo de qualquer isotipo. Em uma realização, as células plasmáticas podem ser células plasmáticas de IgG, em outra realização, as células plasmáticas podem ser células plasmáticas de IgA, em outra realização, as células plasmáticas podem ser células plasmáticas de IgM, em outra realização, as células plasmáticas podem ser células plasmáticas de IgD, e em outra realização, as células plasmáticas podem ser células plasmáticas de IgE. Ainda em 30 outra realização, a população isolada de células plasmáticas pode ser uma população mista de células plasmáticas que compreende dois ou mais isotipos.

As células plasmáticas humanas isoladas podem ser contadas usando um ensaio de manchas de imunização ligadas à enzima (ELISPOT) (Bernasconi et al, 2002, Science, 298:2199- 2202). Este ensaio trabalha visualizando um produto secretado pela célula de interesse, onde cada mancha produzida pelo 5 ensaio representa uma única célula.

Em uma realização, as células plasmáticas humanas podem ser semeadas como uma única célula pela limitação da diluição ou pela deposição de uma única célula. Em um aspecto, as células plasmáticas humanas podem ser semeadas 10 como uma única célula na presença de células estromais mesenquimais. Em outra realização, as células plasmáticas humanas podem ser semeadas como uma cultura policlonal. As células plasmáticas humanas podem ser semeadas como uma cultura de células policlonais na presença de células 15 estromais mesenquimais. A cultura de células plasmáticas policlonais humanas pode, alternativamente, ser separada em cultura de células individuais através de diluição limitante. Em outro aspecto, a cultura de células plasmáticas policlonais humanas pode ser separada em uma cultura de 20 células individuais através da deposição de uma única célula.

As células estromais mesenquimais são células do tipo fibroblasto, mas que têm um maior potencial de diferenciação do que os f ibroblastos, e são capazes de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos e células de 25 gordura. As células estromais mesenquimais são encontradas como populações heterólogas, e formam a estrutura de suporte do tecido no qual residem. Na medula óssea, as células estromais mesenquimais são necessárias para o crescimento e a diferenciação de células hematopoiéticas e para a manutenção 30 das células leucêmicas. As células estromais mesenquimais primárias podem ser isoladas em meios apropriados, e cultivadas por várias passagens, mas apenas por um tempo limitado antes de serem submetidas ã senescência. A transdução com a transcriptase reversa da telomerase (TERT) tem sido utilizada para imortalizar as células estromais mesenquimais que se expandem indefinidamente in vitro, mantendo a sua taxa de crescimento fisiológico e suas 5 características funcionais.

As células estromais mesenquimais utilizadas nas culturas podem ser células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea. As células estromais mesenquimais podem ser células estromais mesenquimais de mamíferos, como as células 10 estromais mesenquimais humanas. As células estromais mesenquimais para uso nos métodos da invenção podem ser isoladas das células aderentes da medula óssea, pela cultura em um meio apropriado. Este meio pode conter hidrocortisona. As células estromais mesenquimais também podem ser derivadas 15 ~ de outros tecidos.

Por razões práticas, as células estromais mesenquimais podem ser imortalizadas antes da utilização_ dos métodos da invenção. Como usado aqui, "imortalizado" significa que as células estromais mesenquimais têm maior 20 capacidade de proliferação, mantendo todas as características que as tornam capazes de sustentar as células plasmáticas, incluindo a capacidade de sofrer inibição de crescimento dependente de contato. Em uma realização, as células estromais mesenquimais podem sobreviver por pelo menos cerca 25 de 1 semana depois de terem atingido confluência. Em outra realização, as células estromais mesenquimais imortalizadas podem sobreviver por pelo menos cerca de 2 semanas depois de terem atingido confluência, ou pelo menos cerca de 3 semanas depois de terem atingido confluência, ou por pelo menos cerca 30 de 4 semanas ou mais depois de terem atingido confluência.

As células estromais mesenquimais podemser imortalizadas por qualquer meio conhecido na técnica. Em uma realização, as células estromais mesenquimais são imortalizadas por transdução com o gene da transcriptase reversa da telomerase. Em outra realização, as células estromais mesenquimais podem ser imortalizadas por transdução com o gene TERT, de acordo com o método descrito em Mihara et 5 al., 2003 Br J Haematol 120: 846-849.

Como discutido acima, a invenção provê um método para produzir um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. O método compreende a cultura de um número limitado de células plasmáticas, identificando as culturas que produzem um 10 anticorpo com uma característica desejada, isolando o ácido nucleico que codifica os anticorpos produzidos, e expressando o ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Como usado aqui, os termos "fragmento" e "fragmento de anticorpo" são usados alternadamente para se referir a 15 qualquer fragmento de um anticorpo da presente invenção. Em uma realização, o fragmento de anticorpo retém a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo. Em outra realização, um _ ... -i-T—rr~ r--. - - - • - •- • -- - •- ~ ■--- - -=™ = X. , fragmento de anticorpo pode incluir 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,. 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 20 ou 1000 ou mais aminoácidos consecutivos. Os fragmentos de anticorpos exemplares podem compreender um ou mais dos fragmentos Fc, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, a cadeia pesada, a cadeia leve, a região da dobradiça, o sítio de ligação do antígeno, os anticorpos de cadeia simples ou qualquer porção 25 deles.

Como usado aqui, o termo "ácido nucleico" abrange todas as formas de ácidos nucleicos, incluindo, entre outros, o DNA genômico, o cDNA e o mRNA. A clonagem e a expressão heteróloga do anticorpo ou do fragmento de anticorpos podem 30 ser realizadas usando as técnicas convencionais de biologia molecular e DNA recombinante que estão dentro da habilidade da técnica (Wrammert et al. , 2008 Nature 453, 667-671 &

Meijer et al. , 2006 J Mol Biol 358, 764-772). Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, por exemplo, em Sambrook, 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edição. Para a recuperação e a expressão das sequências VH/VL, o método de Tiller et al. , J Immunol 5 Methods 2008 329: 112-124 pode ser usado.

Em uma realização, o anticorpo é expresso utilizando um vetor apropriado, ou um vírus de uma célula eucariótica. A célula eucariótica pode ser CHO, 293T, 293 F, ou uma célula de levedura. Em uma outra realização, o 10 anticorpo é expresso utilizando um vetor apropriado, ou um fago em uma célula procariótica. A célula procariótica pode ser uma célula bacteriana, por exemplo, uma célula de E.coli. Em outra realização, o sistema de expressão heteróloga pode ser um sistema livre de células.

Os anticorpos e os fragmentos de anticorpos produzidos pelos métodos da invenção podem ser facilmente isolados com as metodologias bem estabelecidas (Coligan et al Eds Current Protocol in Immunology 1: 2.7) . Em uma realização, os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos, 20 incluindo anticorpos monoclonais ou os fragmentos de anticorpos da invenção, podem ser isolados do sobrenadante da cultura por centrifugação ou por cromatografia de afinidade. Em outra realização, os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos podem ser isolados de acordo com sua 25 especificidade de ligação. Por exemplo, os anticorpos podem ser isolados sendo aplicados a um suporte sólido que compreende um antígeno imobilizado adequado. Em outra realização, os anticorpos podem ser isolados com um anticorpo anti-IgG, -IgE, -IgA, -IgD e -IgM, que pode, em alguns casos, 30 ser imobilizado.

A Ig secretora de plasma ou os anticorpos específicos podem ser isolados com um método de imunoafinidade. Em primeiro lugar, o produto secretado pode ser capturado na superfície da célula secretora com os reagentes de captura de ligação covalente adequados. Em seguida, os produtos capturados podem ser revelados com um è. anticorpo secundário ou um antígeno com marcação fluorescente (Manz et al. 1998 Int Immunol 10, 1703-1711).

CARACTERIZAÇÃO DO ANTICORPO

As células plasmáticas não expressam imunoglobulina de superfície e, portanto, não podem ser selecionadas de acordo com a especificidade do isotipo ou do antígeno. Os 10 anticorpos produzidos por uma célula plasmática devem ser isolados para serem caracterizados. Atualmente existem dois métodos que são utilizados principalmente na técnica para produzir anticorpos monoclonais humanos de células plasmáticas. O primeiro deles éfazer a triagem das 15 bibliotecas de exibição de anticorpos preparados a partir de medula óssea total de doadores imunes (Williamson et al., 1993 Proç Natl Acad Sçj U S A 90, 4141-4145). No entanto, . este método é limitado pela disponibilidade' de amostras de medula óssea.

O segundo método envolve o isolamento de células plasmáticas circulantes após uma imunização de reforço seguida de recuperação dos genes de Ig de células plasmáticas individuais com PCR de célula única (Wrammert et al. , 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al. , 2006 J Mol Biol 358, 764- 772) . Este método tem base no fato de que 6-8 dias após a imunização de reforço uma fração considerável de células plasmáticas circulantes é específica para o antígeno imunizante. Esta abordagem exige, contudo, extensiva clonagem de genes e trabalho de expressão a ser realizado antes da especificidade do anticorpo poder ser avaliada e não é, portanto, muito prática quandoa respostada célula plasmática é dirigida contra antígenos múltiplos, tais como os patógenos complexos. O desenvolvimento de um sistema de cultura de longo período para as células plasmáticas humanas é especialmente útil para recuperar anticorpos suficientes para realizar ensaios de ligação in vitro, ensaios funcionais e caracterização de anticorpos, a fim de ser capaz de 5 selecionar as células plasmáticas que produzem os anticorpos de interesse.

Os métodos alternativos para isolar os anticorpos de células plasmáticas ou outras células secretoras de anticorpos têm base na micromanipulação e incluem uma 10 primeira etapa na quais as células são incubadas em meio semi-sólido (Harriman WD et al J Immunol Methods 341; 135-145 2009) ou em chips de microarray (Jin A et al Nat Medicine 15; 1088 2009) e os anticorpos secretados são detectados in situ com sondas fluorescentes. Uma vez identificada, a célula 15 plasmática é obtida através de micromanipulação, e os genes VH e VL são multiplicados e sequenciados. Estes métodos, que têm base na cultura de curto período e na detecção local de anticorpos secretados, requerem equipamentos especiais para a micromanipulação de células secretoras de anticorpos, e não 20 são adequados para testar os anticorpos para propriedades funcionais, tais como a neutralização de vírus ou toxinas. Os métodos da presente invenção não têm base em, nem exigem qualquer micromanipulação e permitem que o anticorpo que é produzido seja triado em ensaios múltiplos que incluem, entre 25 outros, os ensaios de ligação, os ensaios funcionais e/ou os testes de neutralização. Em uma realização, a invenção provê um método de produzir um anticorpo de células plasmáticas que compreende cultivar as células plasmáticas em números limitados e caracterizar os anticorpos, no qual o método não 30 compreende a micromanipulação para recuperar as células plasmáticas secretoras de anticorpos.

A invenção inclui a caracterização do anticorpo ou do fragmento de anticorpo isolado pelos métodos da invenção.

Em uma realização, a caracterização do anticorpo pode compreender a determinação da especificidade de ligação do anticorpo ou do fragmento de anticorpo. Em outra realização, a caracterização do anticorpo pode compreender a determinação 5 do epítopo reconhecido pelo anticorpo ou pelo fragmento de anticorpo. A especificidade de ligação de um anticorpo isolado ou de um fragmento de anticorpo, e/ou o epítopo reconhecido pelo anticorpo ou pelo fragmento de anticorpo pode ser determinada por qualquer meio conhecido na técnica.

Em uma realização, a especificidade de ligação e/ou reconhecida pelo epítopo pode ser determinada por marcação do anticorpo ou do fragmento de anticorpo isolado, apresentando o anticorpo ou o fragmento de anticorpo marcado a uma biblioteca de antígenos, e por detecção do anticorpoou do 15 fragmento de anticorpo marcado ligado ao seu antígeno cognato. Em outra realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo_ marcado pode ser aplicado em uma coluna de purificação contendo as moléculas de antígeno imobilizado, e a presença ou a ausência do anticorpo ou dos fragmentos de 20 anticorpo marcado na coluna pode ser usada como uma indicação da especificidade do anticorpo e/ou um epítopo reconhecido. Torna-se evidente para os técnicos no assunto que as células plasmáticas isoladas do sangue periférico de um doador que tenham sido imunizadas com um determinado antígeno ou que tenham sido expostas a um determinado patógeno, irão produzir anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam ao antígeno ou ao patógeno. No entanto, os patógenos, * particularmente os patógenos complexos, são susceptíveis a compreender um número de antígenos, e a especificidade de 30 ligação e/ou o epítopo reconhecido de um determinado anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ainda ser averiguado. O método de cultura de célula única da invenção provê uma célula plasmática única que produz um anticorpo específico a partir do qual o ácido nucleico que codifica o anticorpo pode ser facilmente isolado através de metodologias bem estabelecidas (Wrammert et al. , 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer et al. , 2006 J Mol Biol 358, 764-772) . Em uma realização, a caracterização de anticorpos pode envolver o sequenciamento do ácido nucleico que codifica os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos. O sequenciamento de ácidos nucleicos pode ser realizado por qualquer método conhecido na técnica. Em uma realização, o sequenciamento de ácidos nucleicos pode ser realizado utilizando o encerramento da cadeia, onde corantes radioativos, fluorescentes ou outros podem ser usados. Em outro aspecto, o sequenciamento de ácidos nucleicos pode ser realizado através de um método de sequenciamento automatizado.

Em outra realização, a caracterização pode envolver o sequenciamento da proteína do anticorpo. A proteína do anticorpo pode ser sequenciada por qualquer método_conheeido na técnica. Em uma realização, ã proteína dó anticorpo pode ser sequenciada por análise de N-terminal, análise de C- terminal ou degradação de Edman. A análise de N-terminal pode compreender: i) reagir a proteína com um reagente que marcará seletivamente o aminoácido amino terminal; ii) hidrolisar a proteína, e iii) determinar o aminoácido amino terminal por cromatografia e compará-lo com os padrões. Sob esse aspecto, qualquer reagente de marcação pode ser utilizado, incluindo, entre outros, o reagente de Sanger, os derivados dansilados como o cloreto de dansyl e o fenilisotiocianato. A análise C- s terminal pode compreender a incubação da proteína com uma carboxipeptidase e o recolhimento de amostras em intervalos regulares, para produzir um gráfico da concentração de aminoácidos em função do tempo.

Após o sequenciamento da proteína do anticorpo, a invenção também inclui sintetizar quimicamente uma proteína de ligação com base na sequência de anticorpos identificada. A síntese química pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Em uma realização, a síntese ã química pode ser realizada anexando-se o grupo carboxilo de 5 um aminoácido a um suporte sólido insolúvel, e reagindo-se o grupo amino do anticorpo imobilizado com o grupo carbóxi do anticorpo seguinte na sequência. Este método pode ser repetido até que a sequência de aminoácido necessária tenha sido produzida, etapa na qual a proteína completa pode ser 10 clivada do suporte sólido, e permitida ou induzida a adotar a dobra de proteína correta.

A invenção também inclui anticorpos ou fragmentos de anticorpos produzidos por qualquer um dos métodos da invenção.

USOS FARMACÊUTICOS DO ANTICORPO

A invenção provê um anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido por qualquer um dos métodos da invenção para uso em terapia, por exemplo, para uso no tratamento de alergias, estados ou doenças infecciosas, câncer e estados ou 20 doenças autoimunes.

O termo "alergia" inclui todas as formas de reação de hipersensibilidade causadas por um antígeno não parasítico, incluindo, entre outros, dermatite alérgica, rinite alérgica, angioedema, anafilaxia, sensibilidade à 25 aspirina, asma, dermatite atópica, alergia à pássaros, alergia ã canários, a alergia à gatos, sensibilidade química, alergias à frango, conjuntivite, fadiga crônica, dermatite de contato, alergia cosmética, alergia ao leite de vaca, dermatite, alergia à cães, reação a drogas, alergia à patos, 30 alergia à poeira, alergia à ácaros, eczema, alergias à gansos, alergia à grama, rinite alérgica, doresdecabeça, irregularidade cardíaca, urticária, hiperatividade em crianças, hipoglicemia, alérgenos respiratórios e de contato, intolerância à lactose, enxaqueca, alergia ao leite, alergia aos ácaros, urticaria, alergia à papagaios, alergia a periquitos, rinite perene, alergia a pombos, alergia ao pólen, rinite, alergia a árvore de Rhus, sensibilidade ao „ 5 salicilato, sinusite, erupção cutânea, alergia a pardais, alergia a perus, ucaria, e alergia a leveduras.

O termo "doenças infecciosas" inclui qualquer doença clinicamente evidente, resultante da presença de um agente patogênico microbiano, incluindo, entre outros, vírus, 10 bactérias, protozoários, parasitas e fungos. O termo "doenças infecciosas" inclui, entre outros, AIDS, complexo relacionado à AIDS, catapora, resfriado comum, infecção por citomegalovírus, febre do Colorado, dengue, febre de ebola hemorrágica, febre aftosa, hepatite, herpes simplex, herpes 15 zoster, HPV, influenza (gripe), febre de Lassa, sarampo, febre hemorrágica de Marburg, mononucleose infecciosa, ___ caxumba, norovirus, poliomielite leuconcef alopatia multifocal progressiva, raiva, rubéola, a SARS, variola, encefalite viral, gastroenterite viral, meningite viral, 20 pneumonia viral, doença do oeste do Nilo, febre amarela, carbúnculo, meningite bacteriana, botulismo, brucelose, campilobacteriose, doença da arranhadura do gato, cólera, difteria, tifo, gonorréia, impetigo, lepra (hanseníase), leptospirose, listeriose, doença de lyme, melioidose, febre 25 reumática, infecção por MRSA, nocardiose, pertussis (tosse convulsa), peste, pneumonia pneumocócica, psitacose, febre Q, febre maculosa (RMSF), salmonelose, escarlatina, shigelose, sífilis, tétano, tracoma, tuberculose, tularemia, febre tifoide, tifo, infecção do trato urinário, tripanossomíase 30 africana, amebíase, ascaridíase, babesiose, doença de Chagas, clonorquiase, criptosporidiose, cisticercose, difílobotriase, dracunculose, equinococose, enterobíase, fasciolose, fasciolopsiase, filariose, infecção amebiana de vida livre, giardíase, gnatostomiase, himenolepíase, isosporíase, calazar, leishmaniose, malária, metagonimiase, miíase, oncocercose, pediculose, infecção por parasitas, sarna, esquistossomose, teníase, toxocaríase, toxoplasmose, „ triquinelose, triquinose, tricuríase, tricomoníase, tripanossomíase, aspergilose, blastomicose, candidíase, coccidioidomicose, criptococose, histoplasmose, tinea pedis, encefalopatia espongiforme transmissível, encefalopatia espongiforme bovina, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), kuru, 10 insônia familiar fatal e síndrome de Alpers.

O termo "doença autoimune"abrange todas as formas da doença nas quais o sistema imunológico reage a um antígeno próprio, incluindo, entre outros, artrite reumatóide, diabetes mellitus tipo 1, tireoiditede Hashimoto, doença de 15 Graves, esclerodermia, doença celíaca, doença de Crohn, ulcerativa colite, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, síndrome de ^Guillain-Barré, síndrome de Goodpasture, _doença de Addison, granulomatose de Wegener, esclerose biliar primária, colangite esclerosante, hepatite autoimune, artrite 20 reumatóide, doenças autoimunes da tireóide, lúpus eritematoso sistêmico, psoríase, artrite psoriática, oftalmite Simpática, neuropatias autoimunes, ooforite autoimune, orquite autoimune, síndrome linfoproliferativa autoimune, síndrome antifosfolípidica, lúpus, síndrome da deficiência 25 poliendócrina, síndrome de deficiência poliendócrina tipo 1, síndrome de deficiência poliendócrina tipo 2, púrpura trombocitopênica imunológica, anemia perniciosa, miastenia grave, doença mista do tecido conjuntivo, glomerulonefrite primária, vitiligo, uveíte autoimune, anemia hemolítica 30 autoimune, trombocitopenia autoimune, doença celíaca, ermatite herpetiforme, ênfigo, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, penfigóide bolhoso, miocardites autoimunes, vasculite autoimune, doenças oculares autoimunes, alopecia areata, aterosclerose autoimune, doença de Behcet, mielopatia autoimune, hemofilia autoimune, cistite intersticial autoimune, diabetes insipidus autoimune, endometriose autoimune, policondrite recidivante, espondilite 5 anquilosante, urticarias autoimunes, sindromes paraneoplásticas autoimunes, dermatomiosite, sfndrome de

Miller Fisher, e nefropatia por IgA.

A invenção provê um anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido por qualquer um dos métodos da invenção 10 para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de alergias, estados ou doenças infecciosas, câncer e estados ou doenças autoimunes.

A invenção provê ainda um método para o tratamento de alergiasestados _ou doenças infecciosas, e estados ou 15 doenças autoimunes que compreende a administração de um anticorpo ou fragmento de anticorpo produzido por qualquer um dos métodos_da invenção _ ...

A invenção também inclui a formulação de um anticorpo ou um fragmento de anticorpos produzido por 20 qualquer um dos métodos da invenção, ou uma codificação de ácidos nucleicos como um anticorpo ou fragmento de anticorpo em uma composição farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados 25 produzidos por qualquer um dos métodos da invenção. Em outra realização, a composição farmacêutica pode compreender 2, 3, 4, 5, ou mais dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados produzidos por qualquer um dos métodos da invenção.

Uma composição farmacêutica também pode conter um 30 veículo farmaceuticamente aceitável para permitir a administração. O veículo não deve induzir a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxicos. Os veículos adequados podem incluir grandes macromoléculas metabolizadas lentamente, como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e as partículas virais inativas.

Em certas realizações, os sais farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, os sais de ácidos minerais como cloridratos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, e os sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos podem ser usados.

Em algumas realizações, a composição farmacêutica também pode conter líquidos, como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Além disso, as substâncias auxiliares, como os agentes umectantes e emulsificantes, ou as substâncias de tamponamento de pH, podem estar presentes na 15 composição, e podem permitir que as composições farmacêuticas sejam formuladas na forma de tabletes, comprimidos, drágeas, ^cápsulas, líquidos, géis, _xaropes, pastas e suspensões, para a ingestão pelo paciente. A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer número de vias, incluindo, entre 20 outras, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal ou retal.

A composição farmacêutica pode ter um pH entre 5,5 25 e 8,5, em algumas realizações entre 6 e 8, e em outras realizações cerca de 7. O pH pode ser mantido com o uso de um tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirógenos. A composição pode ser isotônica em relação aos seres humanos.

Em outra realização, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolado produzido por qualquer um dos métodos da invenção pode ser combinado com um excipiente de diagnóstico para formar um reagente de diagnóstico. Em uma realização, o reagente de diagnóstico pode compreender um ou mais dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados produzidos por qualquer um dos métodos da invenção. Por exemplo, o •K: reagente de diagnóstico pode compreender 2, 3, 4, 5, ou mais t. 5 dos anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados produzidos por qualquer um dos métodos da invenção.

O excipiente de diagnóstico pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável para permitir a administração do reagente de diagnóstico ao paciente. O 10 veículo não deve induzir a produção de anticorpos prejudiciais ao indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxicos. Os veículos adequados podem incluir grandes macromoléculas metabolizadas lentamente, como proteínas, _polipeptídeos, lipossomas polissacarídeos, ácidos poliláticos, ácido poliglicólico, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e as partículas virais inativas. _ , Em certas realizações.,^ os sais farmaceuticamente aceitáveis como, por exemplo, os sais de ácidos minerais como cloridratos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos, e os sais de 20 ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos podem ser usados.

Em algumas realizações, o reagente farmacêutico também pode conter líquidos, como água, soro fisiológico, glicerol e etanol. Além disso, as substâncias auxiliares, 25 como os agentes umectantes ou emulsificantes, ou as substâncias de tamponamento de pH, podem estar presentes.

Os reagentes de diagnóstico podem ser utilizados no diagnóstico in vivo, in vitroou ex vivo. Para utilização in vivo, o reagente de diagnóstico pode ser administrado por 30 qualquer número de vias, incluindo, entre outras, via oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea, tópica, subcutânea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal ou retal.

Os reagentes de diagnóstico podem ter um pH entre 5,5 e 8,5, em algumas realizações entre 6 e 8, e em outras íi. realizações cerca de 7. O pH pode ser mantido com o uso de um - 5 tampão. A composição pode ser estéril e/ou livre de pirógenos. O reagente de diagnóstico pode ser isotônico em relação aos seres humanos.

Em uma realização, o reagente de diagnóstico pode incluir a marcação do anticorpo. A marcação pode ser 10 selecionada a partir de uma marcação fluorescente, uma marcação de rádio, uma marcação de hapteno e uma marcação biológica, incluindo uma marcação enzimática.

O reagente de diagnóstico pode ser usado para determinar a presençaou a ausência^de um antígeno 15 específico. Esta informação pode ser extrapolada para determinar a presença ou a ausência de um determinado patógeno,„e, portanto, de_um .transtorno ouL_doença específica.. Em um aspecto da invenção, a doença pode ser uma alergia, uma doença ou estado infeccioso, ou uma doença ou estado 20 autoimune. A informação obtida com o uso do reagente de diagnóstico pode ser usada para determinar um curso adequado de tratamento para um paciente específico. Em particular, os reagentes de diagnóstico podem ser utilizados para determinar a presença ou a ausência de alérgenos.

O termo "alérgeno" inclui todos os antígenos não parasitários capazes de estimular uma reação de hipersensibilidade em um indivíduo, incluindo, entre outros, ■ gatos, pêlo, pele, cálice de barata, lã, ácaros da poeira, excreção de ácaros, penicilina, sulfonamidas, salicilatos, 30 anestésicos, incluindo anestésicos locais, aipo, milho, trigo, ovos, albumina, frutas, abóbora, legumes,feijões, ervilhas, nozes, amendoim, soja, leite, mariscos, gergelim, nozes, amêndoas, picadas de inseto, veneno de picada de abelha, veneno da picada de vespa, picadas de mosquito, esporos de mofo, látex, metal, pólens de plantas, grama, incluindo azevém e capim-Timóteo, ervas daninhas, incluindo ambrósia, urtiga, plantago, Artemisia vulgaris, chenopodium 5 album e azeda, e árvores, incluindo bétula, aveleira, a carpa, Aesculus, salgueiros, choupos, plátanos, tilia, olea, zimbro Ashe.

UTILIZAÇÃO DE ANTICORPOS ISOLADOS EM PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

A invenção também inclui um método de imobilização em um suporte sólido de um anticorpo ou de fragmento de anticorpo isolado produzido por qualquer um dos métodos da invenção. O termo "suporte sólido" abrange ambos os suportes sólidos e semi-sólidos, e abrange qualquer tipo de suporte que possa ser usado para imobilizar o anticorpo ou o fragmento de anticorpo isolado. O suporte sólido pode incluir um gel, uma malha, partículas esféricas que incluem esferas de„yidro ou partículas esféricas magnéticas, colunas, tubos, ~ o poço de uma placa de microtitulação, ou' uma folha de plástico. O anticorpo ou o fragmento de anticorpo imobilizado produzido por qualquer um dos métodos da invenção pode ser utilizado na purificação de proteínas. Em uma realização, o anticorpo imobilizado pode ser utilizado em cromatografia de imunoafinidade. Uma solução que compreende a proteína de interesse pode ser aplicada em um suporte sólido que compreende os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos imobilizados produzidos por qualquer um dos métodos da invenção, e que são conhecidos por terem especificidade para a proteína de interesse. Os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos podem, por exemplo, ser imobilizados em esferas que podem, em algumas realizações, ser presas dentro de uma coluna.

GERAL

O termo "compreende" abrange "inclui", bem como "consiste", por exemplo, uma "composição" que compreende X pode consistir exclusivamente de X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X+Y.

A palavra "substancialmente" não exclui 5 "completamente", por exemplo, uma composição que é "substancialmente livre" de Y pode ser completamente livre de Y. Sempre que necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da invenção.

O termo "cerca de", em relação a um valor numérico 10 x significa, por exemplo, x±10%.

O termo "doença" usado aqui se destina a ser geralmente sinônimo, e é usado alternadamente com os termos "distúrbio" e "estado" (como em estado clínico), onde todos refletem um estado anormal do corpo humano ou animal ^pu,de 15 uma de suas partes, o que prejudica seu funcionamento normal e é geralmente manifestado pela distinção de sinais e _ sintomas ,_e _faz_com que çt ser humano ou o animal tenha uma duração ou uma qualidade de vida reduzida.

Como usado aqui, a referência ao "tratamento" de um 20 paciente se destina a incluir a prevenção e a profilaxia, bem como a terapia. O termo "paciente" engloba todos os mamíferos, incluindo os seres humanos. Geralmente, o paciente é um ser humano.

EXEMPLOS

As realizações exemplares da presente invenção são providas nos exemplos a seguir.

Os exemplos a seguir são apresentados apenas a título de ilustração e para ajudar os técnicos no assunto na utilização da invenção. Os exemplos não pretendem de forma 30 alguma limitar o âmbito da invenção.

Exemplo 1. Células plasmáticas em cultura de células estromais mesenquimais

Os inventores observaram que as culturas primárias de células estromais mesenquimais humanas estabelecidas a partir da medula óssea normal, de acordo com métodos padrão (Pittenger et al, 1999, Science 284:143-147; Bieback et al, 2004 Stem cells 22:625-634; Dominici et al, 2006, Cytotherapy 5 8:315-317; Sotiropoulou et al 2006, Stem cells 24:462-471), continham células de secreção de anticorpos. Essas células foram detectadas por ELISPOT, e identificadas como células plasmáticas. As células plasmáticas na cultura de células estromais mesenquimais ainda eram detectáveis após 3 semanas 10 in vitro (dados não mostrados).

Exemplo 2. Cultura de células plasmáticas humanas por até 50 dias.

A fim de desenvolver um sistema de cultura onde as células plasmáticas individuais poderiam ser mantidas vivas 15 para que o anticorpo produzido.pudesse acumular em função do tempo de cultura, os inventores testaram diferentes fontes de células estromais mesenquimais primárias preparadas de acordo com os métodos padrão. Resumidamente, frascos de cultura de tecidos foram pré-revestidos com FCS por 1 hora. As células 20 da medula óssea foram deixadas para aderir durante a-noite em meio IMDM completo suplementado com 30% FCS e dexametasona 10'8M. AS células não aderentes foram lavadas, e as células aderentes foram cultivadas em FCS completo com DMEM-10%. Três das sete linhagens testadas favoreceram a sobrevivência das 25 células plasmáticas humanas, mas pararam de proliferar depois de algumas passagens.. Em experiências posteriores, as células estromais mesenquimais imortalizadas por transdução com o gene de transcriptase reversa da telomerase (MSC-TERT) foram utilizadas. Essas células foram isoladas por Mihara et al. (Br J Haematol 2003, 120, 846-849).

As células mononucleares de sangue periférico foram marcadas com anticorpo monoclonal anti-CD 138 marcado com PE, enriquecido com partículas micro-esféricas anti-PE (Miltenyi) e posteriormente purificadas por separação de células para isolar células positivas para CD138. O número de células plasmáticas secretoras de IgG recuperadas foi determinado utilizando um ELISPOT de isotipo específico. Diferentes números de células positivas para CD138 foram semeadas em uma monocamada de células estromais mesenquimais em placas de cultura de 96 poços com RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino 10% (Hyclone) , aminoácidos não essenciais, piruvato e Glutamax (GIBCO). Com base no ELISPOT realizado no momento do plaqueamento, a cultura representada na Figura 1 continha sete células secretoras de IgG. Metade do sobrenadante da cultura foi coletada em diferentes momentos e substituído por meio fresco. Além disso, nos dias 18 e 34 o meio foi totalmente removido e substituído por um novo. A taxa diária de produção de IgG por cultura e à taxa diária estimada de produção de IgG por célula plasmática foram determinadas. Conforme mostrado na Figura 1, a quantidade de IgG^produzido por uma população de cultura da presente invenção é de cerca de 7 células, aumentada como uma função linear do tempo da cultura de mais de 50 dias, consistente com uma taxa de produção de 676 pg/dia e uma produção estimada de 96 pg/célula/dia.

Exemplo 3. Cultura de células plasmáticas individuais por 3 semanas.

As células plasmáticas do sangue periférico ou da medula óssea foram isoladas com um anticorpo anti-CD138 conjugado com PE, seguido por partículas micro-esféricas de anti-PE, e as células foram separadas e semeadas em monocamadas de células estromais mesenquimais em placas de 96 poços a 0,5 célula/poço. As culturas contendo IgG foram monitoradas por um período de 22-23 diaspor amostragem regular. O meio foi trocado no dia 16. A taxa de produção de IgG em culturas monoclonais foi constante, variando de 72 a 134 pg/célula/dia durante todo o período de cultura (Figura 2a, derivadas do sangue periférico (4 culturas); Figura 2b, derivadas da medula óssea (5 culturas)).

Em cinco experimentos de diluição limitantes, a 5 eficiência de plaqueamento de sangue e células plasmáticas da medula óssea variou entre 30% a 65% (dados não mostrados). Além disso, as células plasmáticas recuperadas de culturas policlonais puderam ser re-plaqueadas em culturas celulares únicas, onde mantiveram secreção de Ig constante (dados não 10 mostrados) . O acúmulo linear de IgG é consistente com a preservação das células secretoras de IgG individuais a uma taxa constante alta. A produção de IgG por célula plasmática cultivada não foi afetada pela irradiação em um nível que „._-„aboliu completamente a„ proliferação e a diferenciação de 15 células B de memória estimuladas por agonistas TLR (dados não mostrados).

Exemplo -4*.— Cultura—.. de células. plasmáticas produtoras de IgG, IgA, IgM e IgE

As células positivas para CD138 do sangue 20 periférico que produzem IgG, IgA, IgM e IgE foram isoladas a partir de um doador saudável e banhadas a 5 células/poço em placas de 384 poços contendo monocamadas de células estromais mesenquimais em 617 culturas de replicação. No dia 10 o sobrenadante das culturas foram testados para a presença de 25 IgG, IgA, IgM e IgE por ELISA de isotipo específico. A quantidade total dos quatro isotipos foi medida no sobrenadante das culturas (vide Figura 3) . O valor médio de produtividade para células plasmáticas IgG, IgA, IgM e IgE foi de 860, 770, 1100 e 1800 pg em 10 dias, ou seja, 86, 77, 30 110 e 180 pg/célula/dia, respectivamente.

Exemplo 5. Eficiência de sobrevivênciadecélulas plasmáticas in vitro

As células plasmáticas humanas derivadas do sangue periférico foram isoladas de sete doadores, de acordo com a expressão de CD138, e semeadas a 1 ou 25 células/poço. O número de células secretoras de anticorpos IgG, IgA e IgM no início das culturas foi calculado pelo ELISPOT do isotipo específico. A eficiência do plaqueamento foi calculada com células secretoras de anticorpos IgG, IgA e IgM de acordo com a análise da distribuição de Poisson, e variou de 50% a 74% para IgG, de 31% a 78% para IgA e de 0 a 26% para IgM (vide Figura 4). Além disso, as células plasmáticas recuperadas de culturas policlonais puderam ser re-plaqueadas em culturas celulares únicas, onde mantiveram taxa de secreção de Ig constante (dados não mostrados).

Exemplo 6. Isolamento de anticorpos monoclonais IgE raros

As células plasmáticas foram*' isoladas - do sangue periférico de um indivíduo alérgico e plaqueadas a 1 célula/poço em monocamadas hMSC-TERT em microplacas de dez a 384 poços. Cinco sobrenadantes de cultura"’ apresentaram resultados positivos para a produção de IgE. As culturas 20 positivas para IgE foram submetidas a RT-PCR, e dois genes VH/VL pareados foram recuperados e sequenciados (Tabela 1) .

Os genes V foram clonados em vetores de expressão para a expressão de uma cadeia leve (kappa ou lambda) ou uma cadeia pesada IgGl ou IgE humana, de acordo com o método descrito no 25 Wardemann et al. (Science 301, 1374-1377, 2003) . Os anticorpos IgG ou IgE foram produzidos por transfecção transiente de células 293T. Este exemplo ilustra a possibilidade de recuperar células plasmáticas raras e isolar anticorpos monoclonais IgE representativos. Tabela 1. Dois anticorpos monoclonais IgE recuperados de células plasmáticas circulantes.

SHM nt: hipermutação somática de nucleotídeos; aa: aminoácidos

Exemplo 7. Isolamento de anticorpos monoclonais i' antígeno-específicos de células plasmáticas cultivadas na 5 presença de células estromais mesenquimais.

As células plasmáticas foram isoladas do sangue periférico de um doador 7 dias após a vacinação de reforço com toxóide tetânico (TT) e semeadas em condições clonais em monocamadas de MSC-TERT em microplacas de 384 poços. No dia 10 10 o sobrenadante das culturas foi analisado para a presença de IgG total (ng/cultura) , bem como para anticorpos IgG específicos para TT (OD405), e as culturas monoclonais produtoras *de“ anticorpos- -específicos^ para _TT_ foram identificadas (vide Figura 5) . Este exemplo ilustra a 15 possibilidade de identificar um grande número de células plasmáticas antígeno-específ icas -posteriormente- à-imunização _ de reforço.

Exemplo 8. Isolamento de um anticorpo forte e amplamente reativo neutralizador de influenza A, a partir de 20 células plasmáticas cultivadas na presença de IL-6.

As células positivas para CD138 de um doador imunizado 7 dias antes com uma vacina contra gripe sazonal foram semeadas em placas de 384 poços a 0,5 célula/poço na presença de 10 ng/ml de IL-6. Nos dias 6 e 8, o sobrenadante 25 das culturas foi testado em três ELISAs paralelas usando como antígenos recombinantes H5 ou H9 de hemaglutinina recombinante (HA) derivada de baculovírus e o antígeno irrelevante toxóide tetânico (TT). Dos 4.928 sobrenadantes de cultura selecionados, 12 se ligaram a H5 HA, 25 a H9 HA e 54 3'0 a 'H5 e ~H9. Alguns deles, com o maior sinal de OD, foram submetidos a RT-PCR e dois genes VH/VL pareados foram recuperados. Os dois anticorpos monoclonais, FI6 e FI28 compartilharam a maior parte dos fragmentos de gene V, D e J (IGHV3-30 *01, IGHD3- 9 *01, IGHJ4*02 e IGKV4-l*01), mas diferiram nas regiões N, no uso de IGKJ e no padrão de mutações somáticas, e foram, portanto , não relacionados de modo clonal.

Os genes V de FI6 e FI28 foram clonados em vetores de expressão, e os anticorpos recombinantes foram produzidos por transfecção de células 293T. Sua especificidade foi 10 investigada por ELISA, utilizando um painel de HAs recombinantes pertencentes a diferentes subtipos (Tabela 2) . O FI6 se ligou a todos os subtipos de influenza A HA testados, incluindo o grupo 1 (Hl, H5 e H9) e o grupo 2 (H3 e H7) , e não se ligou ao HA de influenza B. Em contrapartida, o 15 FI28 se ligou apenas ao HAs do grupo 1. Tabela 2. Ligação de células plasmáticas derivadas anticorpos monoclonais humanos a influenza Has

Depois testamos o FI6 e o FI28 para sua capacidade de neutralizar os subtipos de influenza A do grupo 1 e do 20 grupo 2 com pseudovirus, bem como com vírus infecciosos.

Notavelmente o FI6 neutralizou todos os pseudovirus testados, incluindo os seis H5 isolados pertencentes aos subtipos antigenicamente divergentes 0, 1, 2.1, 2.2 e 2.3, H7 e os dois H7 isolados de aves (Tabela 3) . Além disso, o FI6 25 neutralizou todos os vírus infecciosos testados, incluindo dois vírus H3N2 e quatro vírus H1N1, abrangendo um período de 70 anos até o recente H1N1 pandémico de origem suína isolado de A/Cal/04/09 (Tabela 4) . Em contraste, o FI28 neutralizou todos os pseudovirus H5, mas não conseguiu neutralizar os pseudovirus H7, bem como todos os vírus infecciosos testados (Tabelas 3 e 4) . Tabela 3. Neutralização dos pseudotipos H5 e H7 por anticorpos monoclonais humanos.

Tabela 4. Neutralização dos vírus da gripe por anticorpos monoclonais humanos, nd, não realizado.

nd, não realizado

Observe .que o.rmétodo detalhado acima fornece 50 μl de anticorpo monoclonal em aproximadamente 8-16 ng/ml nos 10 dias 5-10., Este volume e a concentração de anticorpos são suficientes para realizar os vários ensaios. Estes ensaios compreendem não apenas os ensaios de ligação como o ELISA (que pode ser realizado em uma placa padrão de 3 84 poços com 5 μL) , mas também os ensaios funcionais, tais como a 15 neutralização de pseudotipos, que está na faixa de sensibilidade (vide Tabela 3) . Importante: a capacidade de realizar vários ensaios paralelos é essencial para identificar rapidamente células plasmáticas raras que secretam anticorpos capazes de se ligar a múltiplas variantes 20 do antígeno.

Exemplo 9. Isolamento de um anticorpo monoclonal específico .para o toxóide tetânico de células plasmáticas cultivadas isoladas de sangue periférico após dez anos da vacinação.

As células plasmáticas CD 138+ HLA-DR+ CD62L+ foram isoladas por separação das células do sangue periférico de um doador 10 anos após a vacinação contra toxóide tetânico (TT). Um total de 1.700 células foram semeadas a 0,5 célula/poço em microplacas de 384 poços, e o sobrenadante da cultura celular foi triado no dia 7 por ELISA para a presença de anticorpos IgG específicos para toxóide tetânico. Uma cultura específica de toxóide tetânico foi identificada, e no dia 8 os genes VH/VL foram recuperados por RT-PCR e sequenciados (vide Tabela 5) . Os genes foram clonados em vetores de expressão, e os anticorpos recombinantes (TT14) foram produzidos por transfecção temporária de células 293T. O anticorpo foi testado em diferentes concentrações para a ligação ao toxóide tetânico ou a um antígeno não relacionado" (controle” negativo)- por ELISA (vide Figura 6). Tabela 5. Anticorpo monoclonal específico para * toxóide tetânico recuperado de células plasmáticas "10 ãnos após a vacinação.

SHM nt: hipermutação somática de nucleotídeos; aa: aminoácidos

Deve-se observar que existem formas alternativas de aplicação da presente invenção, e que várias modificações podem ser feitas sem se afastar do âmbito e do espírito da invenção. Assim, as presentes realizações devem ser consideradas como ilustrativa e não restritivas, e a invenção não deve ser limitada aos dados apresentados aqui, mas pode ■ser modificada no âmbito e na equivalência das reivindicações anexas.

Claims (9)

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO A PARTIR DE CÉLULAS PLASMÁTICAS, caracterizado por compreender: o cultivo das células plasmáticas na presença de IL-6 ou células estromais mesenquimais em quantidades limitadas e obter o dito anticorpo a partir do mesmo, em que a quantidade de células plasmáticas cultivadas é de 10 ou menos.

2. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL A PARTIR DE CÉLULAS PLASMÁTICAS, caracterizado por compreender: o cultivo das células plasmáticas na presença de IL-6 ou de células estromais mesenquimais em culturas celulares únicas e obter o dito anticorpo a partir do mesmo.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo anticorpo ser um anticorpo humano e as células plasmáticas serem células plasmáticas humanas.

4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelas células plasmáticas serem cultivadas em um meio de cultura que contém IL-6 ou células estromais mesenquimais que prolongam a sobrevivência das células plasmáticas por tempo suficiente para que o anticorpo seja produzido nas quantidades necessárias para a caracterização do anticorpo.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela sobrevivência das células plasmáticas ser prolongada por um curto período e em que o curto período é de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 dias.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela sobrevivência das células plasmáticas ser prolongada por um longo período e em que o longo período é de pelo menos 10 dias.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 ou 6, caracterizado pela sobrevivência das células plasmáticas ser prolongada por pelo menos 20 dias ou por pelo menos 30 dias.

8. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO OU DE UM FRAGMENTO DE ANTICORPO, caracterizado por compreender as etapas de: a. cultivar uma quantidade limitada de células plasmáticas, de acordo com o método, conforme definido em de qualquer uma das reivindicações de 1 a 7; b. identificar culturas que produzem um anticorpo com uma característica desejada; c. isolar o ácido nucléico que codifica o anticorpo produzido; e d. expressar o ácido nucléico em uma célula hospedeira.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por compreender ainda a caracterização do anticorpo ou fragmento de anticorpo, em que a caracterização do anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende a realização de ensaios funcionais para determinar a função do anticorpo ou fragmento de anticorpo, ensaios de ligação para determinar a especificidade de ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou o epítopo reconhecido pelo anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou ensaios de neutralização para determinar a capacidade do anticorpo ou fragmento de anticorpo de neutralizar uma toxina ou um patógeno.

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