ES2525346T3 - Métodos para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas - Google Patents

Abstract

Método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende: cultivar las células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en un número limitado y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas, siendo el número de células plasmáticas cultivadas igual a 10 o inferior

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas.

ANTECEDENTES

Las células plasmáticas son células terminalmente diferenciadas, no proliferantes, que segregan anticuerpos a gran velocidad (miles de moléculas por segundo, correspondientes a aproximadamente 30-50 pg por célula al día). 5

Minges Wols y col. (Minges Wols y col., The J. of Immunology 2002, 169: 4213-4221) describen el papel de las células estromales derivadas de médula ósea en el mantenimiento de la longevidad de las células plasmáticas. Los autores suponen en su estudio que las células plasmáticas de médula ósea no tienen intrínsecamente una larga vida, sino que las células plasmáticas entran en contacto con las células estromales de médula ósea y las modifican para proporcionar factores de supervivencia. 10

También se ha comprobado que la supervivencia de las células plasmáticas está influenciada por efectos sinérgicos de citoquinas y señales dependientes de la adhesión (Cassese y col., The Journal of Immunology, 2003, 171: 1684-1690).

El aislamiento de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, a partir de células plasmáticas se basa en la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. Esto se puede llevar a cabo utilizando bibliotecas phage 15 display de genes VH y VL aleatorizados aislados de células plasmáticas o mediante aislamiento de pares de genes VH y VL de células plasmáticas individuales utilizando PCR de células individual. Sin embargo, con el fin de seleccionar los anticuerpos producidos por células plasmáticas es necesario clonar los genes de inmunoglobulina y expresar éstos en una forma recombinante con el fin de determinar la especificidad y las propiedades funcionales del anticuerpo codificado. Este método es incómodo, costoso, requiere mucho tiempo, no es adaptable a una alta 20 capacidad de procesamiento y es ineficaz para recuperar anticuerpos raros producidos por una fracción menor del repertorio total de células plasmáticas.

Por consiguiente, existe la necesidad de identificar un método más eficiente adaptable a una alta capacidad de procesamiento para el aislamiento y la selección de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos monoclonales, a partir de células plasmáticas. 25

SUMARIO

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un método eficiente y con alta capacidad de procesamiento para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas que permite caracterizar los anticuerpos sin acudir a la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. Los anticuerpos producidos utilizando la presente invención se pueden caracterizar mediante la realización de múltiples selecciones, incluyendo ensayos de unión, funcionales 30 y/o de neutralización. La invención proporciona un método para la identificación de anticuerpos raros producidos por células plasmáticas.

Así, en un aspecto de la invención, ésta proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que consiste en cultivar las células plasmáticas en un número limitado. En una realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal a partir de células plasmáticas que incluye cultivar 35 las células plasmáticas en cultivos de células individuales. Los métodos de la invención pueden incluir además la caracterización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. La caracterización de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo incluye, sin limitarse a, la realización de ensayos funcionales para determinar la función del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, ensayos de unión para determinar la especificidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o el epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y/o ensayos de neutralización 40 para determinar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para neutralizar una toxina o un patógeno.

En otra realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método consiste en cultivar un número limitado de células plasmáticas, identificar aquellos cultivos que producen un anticuerpo con las características deseadas, aislar ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido y expresar el ácido nucleico en una célula huésped. 45

En otro aspecto de la invención, ésta proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de anticuerpo producido mediante un método de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: muestra la producción acumulativa de IgG por células plasmáticas CD138+ aisladas de sangre periférica y cultivadas sobre monocapas de células estromales mesenquimales durante 50 días. 50

Figura 2: muestra la producción acumulativa de IgG por células plasmáticas CD138+ en cultivos que contienen células plasmáticas individuales aisladas de (A) sangre periférica y (B) médula ósea.

Figura 3: muestra los resultados de los análisis el día 10 de sobrenadantes de células plasmáticas CD138-alto aisladas de sangre periférica y cultivadas sobre monocapas de células estromales mesenquimales para detectar la presencia de IgG, IgA, IgM e IgE. 5

Figura 4: muestra la eficiencia del cultivo en placas de células secretoras de anticuerpos (ASC) que producen IgG, IgA o IgM cuando son cultivadas sobre células hMSC-TERT, expresada como porcentaje de células plasmáticas que sobreviven durante un tiempo suficiente para producir cantidades detectables de anticuerpos en el sobrenadante.

Figura 5: muestra la identificación de células plasmáticas que secretan IgG específica de toxoide tetánico a 10 partir de células plasmáticas aisladas de sangre periférica recogida 7 días después de una dosis de inmunización con toxoide tetánico (TT).

Figura 6: muestra la unión al toxoide tetánico de un anticuerpo recombinante producido mediante clonación y expresión de genes VH y VL recuperados de una célula plasmática cultivada aislada de la sangre de un donante 10 años después de la vacunación con toxoide tetánico. 15

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se basa en el descubrimiento de un método eficiente y de alto rendimiento para producir anticuerpos a partir de células plasmáticas que permite caracterizar los anticuerpos sin acudir a la clonación y expresión de los genes de inmunoglobulina. En un aspecto, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende cultivar las células plasmáticas en número limitado. Los anticuerpos 20 producidos utilizando la presente invención se pueden caracterizar convenientemente con múltiples selecciones, incluyendo ensayos de unión, funcionales y/o de neutralización, y dicha caracterización se puede realizar incluso in situ, es decir, en los pocillos donde se han cultivado las células plasmáticas.

Tal como se utiliza aquí, el concepto "célula plasmática" incluye todas las células secretoras de anticuerpos (ASC) primarias que se encuentran en sangre periférica, médula ósea, tejidos o fluidos corporales, o que se generan in 25 vitro a partir de células B. Recientemente, las células plasmáticas generadas se denominan "plasmablastos". En general, los plasmablastos generados de forma natural se encuentran en la sangre, en particular en sangre periférica. También es posible generar plasmablastos in vitro mediante la estimulación de células B con diversos estímulos, incluyendo activadores policlonales tales como agonistas de TLR. Aquí se debe considerar que el concepto "célula plasmática" o "células plasmáticas" incluye tanto "células plasmáticas" como "plasmablastos" y 30 ASC.

Teóricamente, en el medio de cultivo se puede cultivar cualquier número de células plasmáticas para producir e identificar un anticuerpo de características deseadas. En la práctica, el número de células plasmáticas que puede cultivarse está limitado por la tecnología disponible para clonar y expresar las múltiples secuencias de genes VH y VL y sus combinaciones presentes en el cultivo de células policlonales. En una realización, el concepto "número 35 limitado de células plasmáticas" se refiere a un número de células plasmáticas que es aproximadamente 100 o inferior, por ejemplo 90 o menos, 80 o menos, 70 o menos, 60 o menos, 50 o menos, 45 o menos, 40 o menos, 35 o menos, 30 o menos, 25 o menos, 20 o menos, 17 o menos, 15 o menos, 12 o menos, 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, 2 o menos, o 1...

En una realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas 40 que incluye cultivar las células plasmáticas a una baja concentración de células plasmáticas por cultivo. En general, una baja concentración de células plasmáticas por cultivo comprende entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 40, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50, entre 45 aproximadamente 1 y aproximadamente 60, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 70, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 80, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 90, o entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 células por cultivo.

En otra realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende cultivar las células plasmáticas donde éstas han sido diluidas a una baja concentración de células 50 por cultivo. En otra realización más, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que incluye cultivar cantidades reducidas de células plasmáticas. La cantidad de células plasmáticas aisladas, por ejemplo de una fuente biológica, se puede reducir tal como se describe más abajo. Tal como se utiliza aquí, el concepto "cantidad reducida de células plasmáticas" se utiliza indistintamente con "número limitado de células plasmáticas" tal como se describe más arriba. 55

En la técnica son bien conocidos métodos para obtener la cantidad de células deseada en un cultivo. Estas técnicas incluyen, de forma no exclusiva, dilución limitativa o clasificación y deposición celular. Por ejemplo, se pueden obtener cultivos que incluyan una cantidad limitada o reducida de células plasmáticas mediante deposición de células individuales utilizando un clasificador celular o mediante dilución de una suspensión de células plasmáticas con suficiente medio de cultivo para que estén presentes 1, 2, 3 o más células, por ejemplo 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 5 50, 60, 70, 80, 90 0 100 células en cada pocillo de una placa de cultivo microtitulada.

En una realización se cultiva una célula plasmática individual. Dada la naturaleza monoclonal de los anticuerpos producidos por una célula plasmática individual, el cultivo de células plasmáticas en cultivos celulares individuales produciría una población de anticuerpos monoclonales. Por consiguiente, en una realización la invención proporciona un método para producir un anticuerpo monoclonal a partir de células plasmáticas que incluye cultivar 10 las células plasmáticas en cultivos celulares individuales.

Tal como se utiliza aquí, el concepto "cultivo celular individual" se utiliza indistintamente con "cultivo de una célula plasmática individual" y se refiere a un cultivo que incluye, en promedio, una única célula plasmática. Por consiguiente, en una placa de múltiples pocillos, por ejemplo una placa de 96 pocillos, una placa de 384 pocillos o una placa de 1.536 pocillos, la mayor parte de los pocillos contendrá una única célula plasmática, algunos no 15 contendrán ninguna célula plasmática y otros contendrán más de una célula plasmática. En algunas realizaciones, las células plasmáticas se pueden cultivar en cultivos que tienen de promedio menos de 1 célula por pocillo, por ejemplo 0,8 células/pocillo, 0,6 células/pocillo, 0,5 células/pocillo, 0,3 células/pocillo o 0,1 células/pocillo. Las técnicas para obtener una célula individual en un cultivo son similares a las arriba descritas, excepto que en este caso hay un promedio de 1 o menos de 1 célula por pocillo en una placa de cultivo microtitulada. 20

La invención también proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método incluye cultivar una cantidad limitada de células plasmáticas de acuerdo con cualquier método de la invención, identificación los cultivos que producen un anticuerpo con una característica deseada, aislar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido y expresar el ácido nucleico en una célula huésped.

A diferencia de las células B de memoria, que se pueden expandir en clones de anticuerpo que producen células por 25 inmortalización (Traggiai y col., 2004, Nat Med 10:871-875; Lanzavecchia y col., 2007, Curr Opin Biotechnol. 18:523-528), las células plasmáticas no se dividen y no pueden ser estimuladas o inmortalizadas. Por ello, con el fin de aprovechar el uso de estas "fábricas de anticuerpos" de algún modo que merezca la pena, las células plasmáticas se deben mantener vivas en el cultivo. Las células plasmáticas producen y segregan anticuerpos de forma continua y, por ello, el tamaño de la población de anticuerpos aumenta con el tiempo. Aunque las células plasmáticas 30 sobreviven durante períodos muy largos in vivo, no sobreviven mucho más de un día in vitro (datos experimentales no mostrados). Por consiguiente, la invención proporciona un método para producir anticuerpos mediante el cultivo de células plasmáticas, incluyendo, de forma no exclusiva, una célula plasmática individual, en un medio de cultivo que incluye uno o más componentes exógenos que prolongan la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas.

En general, la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas se prolonga durante un tiempo suficiente para 35 producir el anticuerpo en cantidades necesarias para su caracterización, es decir, el medio de cultivo contiene suficientes anticuerpos para poder utilizarse en ensayos de selección, incluyendo, de forma no exclusiva, ensayos de unión, ensayos de neutralización u otros ensayos que determinan la función de los anticuerpos o caracterizan éstos de otro modo. Después se pueden aislar los cultivos que contienen un anticuerpo con la especificidad deseada y los genes de inmunoglobulina se pueden amplificar, secuenciar y expresar para producir un anticuerpo 40 monoclonal.

La supervivencia de las células plasmáticas en cultivo, incluyendo, de forma no exclusiva, una célula plasmática individual, se puede prolongar durante un corto plazo o un largo plazo. Tal como se utiliza aquí, "corto plazo" se refiere a un período de entre al menos dos días y aproximadamente 9 días, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o aproximadamente 9 días. Tal como se utiliza aquí, "largo plazo" se refiere a un período de al menos diez días, por 45 ejemplo 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o aproximadamente 150 días.

Aunque prolongar la supervivencia de las células plasmáticas durante un corto plazo puede no producir tantos anticuerpos como los producidos cuando la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante un largo plazo, la prolongación de la supervivencia de las células plasmáticas durante un corto plazo, tal como se describe aquí, es más fácil, rápida y económica y resulta particularmente útil para seleccionar los anticuerpos en ensayos 50 sensibles. La prolongación de la supervivencia de las células plasmáticas durante un largo plazo es particularmente adecuada en aquellas circunstancias donde la caracterización de anticuerpos requiere múltiples ensayos de selección o ensayos de baja sensibilidad.

En una realización, el componente exógeno presente en el medio de cultivo prolonga la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas durante un corto plazo. En otra realización, el componente exógeno prolonga la supervivencia 55 de las células plasmáticas cultivadas durante un largo plazo. El componente exógeno puede consistir en uno o más ligandos para un receptor expresado por la célula plasmática o una o más células no plasmáticas.

Ejemplos de ligandos para un receptor expresado por las células plasmáticas útiles para prolongar la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas incluyen, de forma no exclusiva, citoquinas, quimioquinas y otros ligandos. En una realización, el ligando es IL-5, IL-6, factor-1 derivado de células estromales (SDF-1), TNF- o un ligando para CD44, por ejemplo ácido hialurónico. En otra realización, el componente exógeno incluye uno o más ligandos seleccionados de entre el grupo consistente en IL-5, IL-6, factor-1 derivado de células estromales (SDF-1), TNF-, 5 ligandos para CD44, por ejemplo ácido hialurónico, y combinaciones de los mismos, y es útil para prolongar la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas durante un corto plazo o un largo plazo.

Ejemplos de células no plasmáticas útiles para prolongar la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas incluyen, de forma no exclusiva, células estromales mesenquimales, fibroblastos u osteoclastos. En una realización, las células no plasmáticas son células estromales mesenquimales, fibroblastos u osteoclastos y son útiles para 10 prolongar la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas durante un corto plazo o un largo plazo. En otra realización, las células no plasmáticas son células estromales mesenquimales y son útiles para prolongar la supervivencia de las células plasmáticas cultivadas durante un corto plazo o un largo plazo. Las células estromales mesenquimales pueden ser células estromales mesenquimales de mamífero, incluyendo, de forma no exclusiva, células estromales mesenquimales humanas. Opcionalmente, las células estromales mesenquimales se pueden 15 inmortalizar antes de su uso en el cultivo.

En una realización de la invención, las células plasmáticas se cultivan, por ejemplo, en un cultivo de células individuales, durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7, o durante aproximadamente 5 a aproximadamente 9 días en cultivo en presencia de uno o más ligandos para un receptor expresado por la célula plasmática. En otra realización, las células plasmáticas se cultivan por ejemplo en un cultivo de células individuales durante 20 aproximadamente 5 a aproximadamente 7, o durante aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45 o más de 50 días en cultivo en presencia de uno o más tipos de células no plasmáticas. En otra realización, las células plasmáticas se cultivan por ejemplo en un cultivo de células individuales durante aproximadamente 5-7, o durante aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, 25 aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45 o más de 50 días en cultivo en presencia de células estromales mesenquimales. En otra realización más, las células plasmáticas se cultivan por ejemplo en un cultivo de células individuales durante aproximadamente 5-7, o durante aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65 o 30 más de 70 días en cultivo en presencia de uno o más tipos de células no plasmáticas y uno o más ligandos para un receptor expresado por la célula plasmática.

En una realización, la eficiencia del cultivo en placas de las células cultivadas puede ser de al menos aproximadamente un 30%, en otra realización la eficiencia del cultivo en placas de las células cultivadas puede ser de al menos aproximadamente un 40%, en otra realización la eficiencia del cultivo en placas de las células 35 cultivadas puede ser de al menos aproximadamente un 50%, en otra realización la eficiencia del cultivo en placas de las células cultivadas puede ser de al menos aproximadamente un 55%, en otra realización la eficiencia del cultivo en placas de las células cultivadas puede ser de al menos aproximadamente un 60% o más.

Tal como se utiliza aquí, el concepto "eficiencia del cultivo en placas" se refiere al porcentaje de células plasmáticas que sobreviven durante un tiempo suficiente para producir cantidades detectables de anticuerpo en el sobrenadante. 40

Es posible obtener células plasmáticas cultivadas de cualquier especie deseada. En una realización, las células plasmáticas son células de ratón, rata, conejo, camello o mono. En otra realización, las células plasmáticas cultivadas son células plasmáticas humanas y los anticuerpos producidos son anticuerpos humanos. En otra realización se producen anticuerpos monoclonales humanos mediante el cultivo de células plasmáticas humanas en cultivos celulares individuales. 45

Las células plasmáticas, por ejemplo células plasmáticas humanas, se pueden aislar de la sangre periférica de un ser humano. Estas células plasmáticas humanas se pueden denominar "células plasmáticas de sangre periférica" o "células plasmáticas circulantes". Las células plasmáticas, por ejemplo células plasmáticas humanas, también se pueden aislar de médula ósea, tejidos o fluidos corporales, incluyendo, de forma no exclusiva, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo y exudados de un ser humano. El término "tejido" abarca cualquier tejido presente en el 50 cuerpo humano y puede incluir tejido cardíaco, nervioso, muscular, epitelio, tejido conjuntivo y órganos linfoides, tales como el timo, el bazo y los ganglios linfáticos.

En general, las células plasmáticas se caracterizan por la expresión de CD 138, y opcionalmente por la expresión adicional de CD27, CD38, CD9, CD44 y moléculas MHC (complejo principal de histocompatibilidad) de clase II. En una realización, las células se pueden aislar de sangre periférica, tejidos, médula ósea o fluidos corporales de 55 acuerdo con la expresión de CD138. También es posible utilizar marcadores de superficie como CD27, CD38, CD9, CD44 y moléculas MHC de clase II para mejorar el procedimiento de aislamiento e identificar subgrupos de células plasmáticas (Arce y col., 2004, J Leukoc Biol, 75:1022-1028). En otra realización, las células plasmáticas se pueden

aislar utilizando microperlas magnéticas. En una realización más, las células plasmáticas se pueden aislar utilizando microperlas magnéticas revestidas con anticuerpos anti-CD138 inmovilizados. En otra realización, después del enriquecimiento de las células plasmáticas utilizando microperlas magnéticas se puede realizar una clasificación celular.

En una realización, las células plasmáticas se pueden aislar de la sangre periférica de un donante humano después 5 de una vacunación. El término "vacunación" se refiere a la administración de un antígeno capaz de inducir una respuesta inmune. La vacuna puede ser cualquier vacuna conocida en la actualidad o disponible más adelante para los expertos en la técnica e incluye, de forma no exclusiva, vacunas de toxoide tetánico, gripe, fiebre amarilla, tétanos-difteria, hepatitis B, viruela y cáncer. En otra realización, la vacunación puede consistir en una revacunación. Las células plasmáticas se pueden aislar del donante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más días después de la vacunación. En 10 una realización, las células plasmáticas se pueden aislar de un donante que está respondiendo a un patógeno conocido. En otra realización, las células plasmáticas se pueden aislar de un donante que está respondiendo a un patógeno desconocido. En una realización más, las células plasmáticas se pueden aislar de un donante con una alergia. En otra realización, las células plasmáticas se pueden aislar de un donante bajo condiciones de estado estacionario. En otra realización más, las células plasmáticas se pueden aislar de un donante con una enfermedad 15 autoinmune.

En otra realización, las células plasmáticas pueden ser generadas in vitro mediante la estimulación de células B. Esta estimulación se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo estimulación policlonal o específica de antígeno de células naive o células B de memoria (Bemasconi y col., 2002, Science, 298:2199-2202). 20

El método de la presente invención se puede utilizar para cultivar células plasmáticas que segregan cualquier anticuerpo de cualquier isotipo. En una realización, las células plasmáticas pueden ser células plasmáticas de IgG; en otra realización, las células plasmáticas pueden ser células plasmáticas de IgA; en otra realización, las células plasmáticas pueden ser células plasmáticas de IgM; en otra realización, las células plasmáticas pueden ser células plasmáticas de IgD; y en otra realización, las células plasmáticas pueden ser células plasmáticas de IgE. En una 25 realización más, la población aislada de células plasmáticas puede ser una población mixta de células plasmáticas que incluye dos o más isotipos.

Las células plasmáticas humanas aisladas se pueden contar utilizando un ensayo de mancha de inmunoadsorción enzimática (ELISPOT) (Bernasconi y col., 2002, Science, 298:2199-2202). Este ensayo consiste en visualizar un producto segregado por la célula de interés, representando cada mancha producida por el ensayo una célula 30 individual.

En una realización, las células plasmáticas humanas pueden ser sembradas como célula individual mediante dilución limitativa o mediante deposición celular individual. En un aspecto, las células plasmáticas humanas se pueden sembrar como células individuales en presencia de células estromales mesenquimales. En otra realización, las células plasmáticas humanas se pueden sembrar como un cultivo policlonal. Las células plasmáticas se pueden 35 sembrar como un cultivo celular policlonal en presencia de células estromales mesenquimales. Alternativamente, el cultivo celular plasmático humano policlonal se puede separar en un cultivo celular individual utilizando dilución limitativa. En otro aspecto, el cultivo celular plasmático humano policlonal se puede separar en un cultivo celular individual utilizando deposición celular individual.

Las células estromales mesenquimales son células similares a fibroblastos, pero tienen mayor potencial de 40 diferenciación que los fibroblastos y se pueden diferenciar en osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Las células estromales mesenquimales se encuentran como poblaciones heterólogas y forman la estructura soporte del tejido en el que residen. En la médula espinal, las células estromales mesenquimales son necesarias para el crecimiento y la diferenciación de células hematopoyéticas y para el mantenimiento de células leucémicas. Las células estromales mesenquimales primarias se pueden aislar en medios apropiados y cultivar en varios pasos, pero sólo durante un 45 tiempo limitado antes de experimentar la senescencia. Para inmortalizar células estromales mesenquimales que se expanden indefinidamente in vitro manteniendo su tasa de crecimiento fisiológico y sus características funcionales se ha utilizado la transducción con transcriptasa inversa de la telomerasa (TERT).

Las células estromales mesenquimales utilizadas en los cultivos pueden ser células estromales mesenquimales derivadas de médula ósea. Las células estromales mesenquimales pueden ser células estromales mesenquimales 50 de mamífero, por ejemplo células estromales mesenquimales humanas. Las células estromales mesenquimales a utilizar en los métodos de la invención se pueden aislar de células de médula ósea adherentes mediante cultivo en un medio apropiado. Este medio puede contener hidrocortisona. Las células estromales mesenquimales también se pueden derivar de otros tejidos.

Por razones prácticas, las células estromales mesenquimales se pueden inmortalizar antes de utilizarlas en los 55 métodos de la invención. Tal como se utiliza aquí, el término "inmortalizado" significa que las células estromales mesenquimales tienen una capacidad proliferativa mejorada manteniendo al mismo tiempo todas las características

que les hacen capaces de mantener células plasmáticas, incluyendo la capacidad de experimentar una inhibición del crecimiento dependiente del contacto. En una realización, las células estromales mesenquimales pueden sobrevivir durante al menos aproximadamente 1 semana después de haber alcanzado la confluencia. En otra realización, las células estromales mesenquimales pueden sobrevivir durante al menos aproximadamente 2 semanas después de haber alcanzado la confluencia, o durante al menos aproximadamente 3 semanas después de haber alcanzado la 5 confluencia, o durante al menos aproximadamente 4 semanas o más después de haber alcanzado la confluencia.

Las células estromales mesenquimales se pueden inmortalizar por cualquier medio conocido en la técnica. En una realización, las células estromales mesenquimales se pueden inmortalizar mediante transducción con el gen de transcriptasa inversa de la telomerasa. En otra realización, las células estromales mesenquimales se pueden inmortalizar mediante transducción con el gen TERT de acuerdo con el método descrito en Mihara y col., 2003 Br J 10 Haematol 120: 846-849.

Tal como se indica más arriba, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. El método incluye cultivar una cantidad limitada de células plasmáticas, identificarlos cultivos que producen un anticuerpo con una característica deseada, aislar el ácido nucleico que codifica el anticuerpo producido y expresar el ácido nucleico en una célula huésped. 15

Tal como se utilizan aquí, los conceptos "fragmento" y "fragmento de anticuerpo" se emplean indistintamente para hacer referencia a cualquier fragmento de un anticuerpo de la presente invención. En una realización, el fragmento de anticuerpo conserva la actividad de unión de antígeno del anticuerpo. En otra realización, un fragmento de anticuerpo puede comprender 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más aminoácidos consecutivos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo pueden comprender uno o más de 20 los fragmentos Fc, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, la cadena pesada, la cadena ligera, la región bisagra, el sitio de unión de antígeno, anticuerpos de cadena simple o cualquier parte de los mismos.

Tal como se utiliza aquí, el concepto "ácido nucleico" incluye todas las formas de ácido nucleico, incluyendo, de forma no exclusiva, ADN genómico, ADNc y ARNm. La clonación y la expresión heteróloga del anticuerpo o fragmento de anticuerpo se pueden llevar a cabo utilizando técnicas convencionales de biología molecular y ADN 25 recombinante, que forman parte del estado actual de la técnica (Wrammert y col., 2008 Nature 453, 667-671 & Meijer y col., 2006 J Mol Biol 358, 764-772). Estas técnicas están explicadas con todo detalle en la literatura, por ejemplo en Sambrook, 1989 Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición. Para la recuperación de secuencias de VH/VL y la expresión se puede emplear el método de Tiller y col., J Immunol Methods 2008 329:112-124. 30

En una realización, el anticuerpo se expresa utilizando un vector o virus apropiado en una célula eucariota. La célula eucariota puede ser una célula CHO, 293T, 293 F o una célula de levadura. En otra realización, el anticuerpo se expresa utilizando un vector o fago apropiado en una célula procariota. La célula procariota puede ser una célula bacteriana, por ejemplo una célula de E. coli. En otra realización, el sistema de expresión heteróloga puede consistir en un sistema libre de células. 35

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo producidos mediante los métodos de la invención se pueden aislar fácilmente utilizando metodologías bien establecidas (Coligan y col. Eds Current Protocol in Immunology 1: 2.7). En una realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerposde la invención, incluyendo los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoclonales, se pueden aislar del sobrenadante del cultivo por centrifugación o por cromatografía de afinidad. En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden aislar de 40 acuerdo con su especificidad de unión. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden aislar aplicándolos a un soporte sólido que incluye un antígeno inmovilizado apropiado. En otra realización, los anticuerpos se pueden aislar utilizando un anticuerpo anti-IgG, -IgE, -IgA, -IgD o -IgM, que en algunos casos puede estar inmovilizado.

Un plasma secretor de Ig o anticuerpos específicos puede ser aislado con un método de inmunoafinidad. En primer lugar, el producto segregado se puede capturar sobre la superficie de la célula secretora utilizando reactivos de 45 captura apropiados unidos de forma covalente. Después, los productos capturados se pueden revelar utilizando un anticuerpo o antígeno secundario marcado de modo fluorescente (Manz y col., 1998 Int Immunol 10, 1703-1711).

Caracterización de anticuerpos

Las células plasmáticas no expresan inmunoglobulina de superficie y, en consecuencia, no se pueden seleccionar de acuerdo con el isotipo o la especificidad de antígeno. Por consiguiente, los anticuerpos producidos por una célula 50 plasmática se deben ser aislados para su caracterización. Actualmente existen dos métodos utilizados principalmente en la técnica para producir anticuerpos monoclonales humanos a partir de células plasmáticas. El primero consiste en explorar bibliotecas display de anticuerpos preparados a partir de médula ósea total de donantes inmunes (Williamson y col., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90, 4141-4145). Sin embargo, este método está limitado por la disponibilidad de muestras de médula ósea. 55

El segundo método implica el aislamiento de células plasmáticas circulantes después de una reinmunización, seguido de la recuperación de genes de Ig de células plasmáticas individuales utilizando PCR de células individuales (Wrammert y col., 2008 Nature 453,667-671 y Meijer y col., 2006 J Mol Biol 358, 764-772). Este método se basa en el hecho de que, 6-8 días después de una reinmunización, una fracción importante de células plasmáticas circulantes es específica del antígeno inmunizador. Sin embargo, este planteamiento requiere la realización de 5 extensos trabajos de clonación y expresión genética antes de poder evaluar la especificidad de anticuerpo y, por ello, no es muy práctico cuando la respuesta de las células plasmáticas está dirigida contra antígenos múltiples, como patógenos complejos. Así, el desarrollo de un sistema de cultivo a largo plazo de células plasmáticas humanas resulta particularmente útil para recuperar anticuerpos suficientes con el fin de realizar ensayos de unión in vitro, ensayos funcionales y de caracterización de otros anticuerpos, con el fin de seleccionar las células plasmáticas que 10 producen los anticuerpos de interés.

Métodos alternativos para aislar anticuerpos de células plasmáticas u otras células secretoras de anticuerpos se basan en la micromanipulación e incluyen un primer paso donde las células se disponen en placas en medios semisólidos (Harriman WD y col.J Immunol Methods 341; 135-145 2009) o en chips de micromatrices (Jin A y col.Nat Medicine 15; 1088 2009) y los anticuerpos segregados se detectan in situ utilizando sondas fluorescentes. Una vez 15 identificada, la célula plasmática se recupera por micromanipulación y los genes VH y VL se amplifican y secuencian. Estos métodos, que se basan en cultivos a corto plazo y detección local del anticuerpo segregado, requieren equipos especiales para la micromanipulacion de células secretoras de anticuerpos y no son adecuados para analizar las propiedades funcionales de los anticuerpos, como la neutralización de virus o toxinas. Los métodos de la presente invención no se basan en una micromanipulación, ni la requieren, y permiten seleccionar el 20 anticuerpo producido en múltiples ensayos, incluyendo, de forma no exclusiva, ensayos de unión, ensayos funcionales y/o ensayos de neutralización. En una realización, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas, que incluye cultivar las células plasmáticas en cantidades limitadas y caracterizar los anticuerpos, no incluyendo dicho método ninguna micromanipulación para recuperar las células plasmáticas secretoras del anticuerpo. 25

La invención incluye la caracterización del anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado mediante los métodos de la invención. En una realización, la caracterización del anticuerpo puede incluir determinar la especificidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otra realización, la caracterización del anticuerpo puede incluir determinar el epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La especificidad de unión de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado y/o el epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede 30 determinar por cualquier medio conocido en la técnica. En una realización, la especificidad de unión y/o el epitopo reconocido se pueden determinar por marcado del anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, la presentación del anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado en una biblioteca de antígenos y la detección del anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado unido a su antígeno conocido. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se puede aplicar a una columna de purificación que contiene moléculas de antígeno 35 inmovilizadas, pudiendo utilizarse la presencia o ausencia del anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado en la columna como una indicación de la especificidad de anticuerpo y/o el epitopo reconocido. Los expertos en la materia conocen qué células plasmáticas aisladas de la sangre periférica de un donante que ha sido inmunizado con un antígeno particular o que ha estado expuesto a un patógeno particular producirán anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen a dicho antígeno o patógeno. No obstante, es probable que los patógenos, en particular los 40 patógenos complejos, incluyan una serie de antígenos y la especificidad de unión y/o el epitopo reconocido de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo particular todavía están por determinar.

El método de cultivo celular individual de la invención proporciona una célula plasmática individual que produce un anticuerpo específico a partir del cual se puede aislar fácilmente el ácido nucleico que codifica el anticuerpo empleando metodologías bien establecidas (Wrammert y col., 2008 Nature 453, 667-671 y Meijer y col., 2006 J Mol 45 Biol 358, 764-772). En una realización, la caracterización del anticuerpo puede incluir la secuenciación del ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La secuenciación del ácido nucleico se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la secuenciación del ácido nucleico se puede llevar a cabo utilizando la terminación de cadena, pudiendo utilizarse tintes radiactivos, fluorescentes o de otro tipo. En otro aspecto, la secuenciación del ácido nucleico se puede llevar a cabo utilizando un método de 50 secuenciación automática.

En otra realización, la caracterización puede implicar la secuenciación de la proteína de anticuerpo. La proteína de anticuerpo se puede secuenciar mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la proteína de anticuerpo se puede secuenciar mediante análisis N-terminal, análisis C-terminal o degradación de Edman. El análisis N-terminal puede incluir: i) la reacción de la proteína con un reactivo que marca selectivamente el 55 aminoácido amino-terminal; ii) la hidrólisis de la proteína; y iii) la determinación del aminoácido amino-terminal mediante cromatografía y comparación con patrones. Dentro de este contexto se puede utilizar cualquier reactivo de marcado, incluyendo, de forma no exclusiva, reactivo de Sanger, derivados de dansilo como cloruro de dansilo, y fenilisotiocianato. El análisis C-terminal puede incluir la incubación de la proteína con una carboxipeptidasa y la toma de muestras a intervalos regulares para producir un gráfico de la concentración de aminoácido en función del 60 tiempo.

A continuación de la secuenciación de la proteína de anticuerpo, la invención también incluye la síntesis química de una proteína de unión basada en la secuencia de anticuerpos identificada. La síntesis química se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la síntesis química se puede llevar a cabo mediante la unión del grupo carboxilo de un aminoácido a un soporte sólido insoluble y reacción del grupo amino del anticuerpo inmovilizado con el grupo carboxilo del siguiente anticuerpo de la secuencia. Este 5 método se puede repetir hasta producir la secuencia de aminoácidos requerida, momento en el que la proteína completa se puede separar del soporte sólido y después se puede permitir que adopte el plegamiento de proteína correcto o inducirla a ello.

Usos farmacéuticos del anticuerpo

La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido mediante cualquiera de los métodos de 10 la invención para su uso en terapia, por ejemplo en el tratamiento de alergias, afecciones o enfermedades infecciosas, cáncer y afecciones o enfermedades autoinmunes.

El término "alergia" incluye todas las formas de una reacción de hipersensibilidad provocada por un antígeno no parasitario, incluyendo, de forma no exclusiva, dermatitis alérgica, rinitis alérgica, angioedema, anfafilaxis, sensibilidad a la aspirina, asma, dermatitis atópica, alergia a las aves, alergia a los canarios, alergia a los gatos, 15 sensibilidad química, alergia a los pollos, conjuntivitis, fatiga crónica, dermatitis de contacto, alergia a los cosméticos, alergia a la leche de vaca, dermatitis, alergia a los perros, reacción a los fármacos, alergia a los patos, alergia al polvo, alergia a los ácaros del polvo, eccema, alergia a los gansos, alergia a la hierba, fiebre del heno, dolores de cabeza, irregularidades coronarias, urticaria, hiperactividad en niños, hipoglucemia, alérgenos respiratorios y de contacto, intolerancia a la lactosa, migrañas, alergia a la leche, alergia a los ácaros, sarpullido por ortigas, alergia a 20 los loros, alergia a los periquitos, rinitis perenne, alergia a las palomas, alergia al polen, rinitis, alergia al mimbre, sensibilidad al salicilato, sinusitis, erupción cutánea, alergia a los gorriones, alergia a los pavos, ucaria y alergia a la levadura.

El concepto "enfermedades infecciosas" incluye cualquier enfermedad clínicamente evidente resultante de la presencia de un agente microbiano patógeno, incluyendo, de forma no exclusiva, virus, bacterias, protozoos, 25 parásitos y hongos. El concepto "enfermedades infecciosas" incluye, de forma no exclusiva, SIDA, complejo relacionado con el SIDA, varicela, resfriado común, infección por citomegalovirus, fiebre del Colorado, dengue, fiebre hemorrágica del Ébola, enfermedad de manos, pies y boca, hepatitis, herpes simple, herpes zoster, VPH, influenza (gripe), fiebre de Lassa, sarampión, fiebre hemorrágica de Marburgo, mononucleosis infecciosa, paperas, norovirus, poliomielitis, leucoencefalopatía multifocal progresiva, rabia, rubeola, SARS, viruela, encefalitis viral, gastroenteritis 30 viral, meningitis viral, neumonía viral, enfermedad del Nilo occidental, fiebre amarilla, ántrax, meningitis bacteriana, botulismo, brucelosis, campilobacteriosis, enfermedad del arañazo del gato, cólera, difteria, tifus epidémico, gonorrea, impétigo - legionelosis, lepra (enfermedad de Hansen), leptospirosis, listeriosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, fiebre reumática; infección por MRSA, nocardiosis, pertussis (tos ferina), peste, neumonía neumocócica, psitacosis, fiebre Q, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas (RMSF), salmonelosis, escarlatina, shigelosis, sífilis, 35 tétanos, tracoma, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus - infecciones del tracto urinario, tripanosomasis africana, amebiasis, ascariasis, babesioisis, enfermedad de Chagas, clonorquiosis, criptosporidiosis, cisticercosis, difilobotriasis, dracunculosis, equinococosis, enterobiasis, fascioliasis, fasciolopsiasis, filariasis, infección por amebas de vida libre, giardiasis, gnatostomiasis, himenolepiasis, isosporiasis, kala-azar, leishmaniosis, malaria, metagonimiasis, miasis, oncocercosis, pediculosis, infección por gusano alfiler, escabiosis, esquistosomiasis, 40 teniasis, toxocariasis, toxoplasmosis, triquenolisis, triquinosis, tricuriasis, tricomoniasis, tripanosomiasis, aspergilosis, blastomicosis, candidiasis, coccidioidomicosis, criptococosis, histoplasmosis, tiña pedis, encefalopatía espongiforme transmisible, encefalopatía espongiforme bovina, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, kuru, insomnio familiar fatal y síndrome de Alpers.

El concepto "enfermedad autoinmune" incluye todas las formas de enfermedad en las que el sistema inmunológico 45 reacciona a un autoantígeno, incluyendo, de forma no exclusiva, artritis reumatoide, diabetes mellitus de tipo 1, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Basedow, escleroderma, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, síndrome de Goodpasture, enfermedad de Addison, granulomatosis de Wegener, esclerosis biliar primaria, colangitis esclerosante, hepatitis autoinmune, artritis reumatoide, enfermedades tiroideas autoinmunes, lupus eritematoso sistémico, psoriasis, artritis 50 psoriásica, oftalmia simpática, neuropatías autoinmunes, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune, síndrome antifosfolípido, lupus, síndrome de deficiencia poliendocrina, síndrome de deficiencia poliendocrina de tipo 1, síndrome de deficiencia poliendocrina de tipo 2, púrpura trombocitopénica inmune, anemia perniciosa, miastenia gravis, enfermedad mixta el tejido conjuntivo, glomerulonefritis primaria, vitíligo, uveitis autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, enfermedad celíaca, 55 dermatitis herpetiforme, pénfigo, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide bulloso, miocarditis autoinmune, vasculitis autoinmune, enfermedades oculares autoinmunes, alopecia areata, aterosclerosis autoinmune, enfermedad de Behcet, mielopatía autoinmune, hemofilia autoinmune, cistitis intersticial autoinmune, diabetes insípida autoinmune, endometriosis autoinmune, policondritis recidivante, espondilitis anquilosante, urticaria

autoinmune, síndromes autoinmunes paraneoplásicos, dermatomiositis, síndrome de Miller Fisher y nefropatía por IgA.

La invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo producido mediante cualquiera de los métodos de la invención para su uso en la producción de un medicamento para el tratamiento de alergias, afecciones o enfermedades infecciosas y de afecciones o enfermedades autoinmunes. 5

La invención también incluye la formulación de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo producido mediante cualquiera de los métodos de la invención, o de un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en una composición farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica puede incluir uno o más de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados producidos mediante cualquiera de los métodos de la invención. En una realización, la composición farmacéutica puede incluir 2, 3, 4, 5 o más de los 10 anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados producidos mediante cualquiera de los métodos de la invención.

Una composición farmacéutica también puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable para posibilitar la administración. El vehículo no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo receptor de la composición y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden incluir macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos 15 poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

En ciertas realizaciones se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos, como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos; sales de ácidos orgánicos, como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica también puede contener líquidos, como agua, solución 20 salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, la composición puede incluir sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tampón de pH, y éstas pueden permitir la formulación de las composiciones farmacéuticas como tabletas, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para ser ingeridas por el paciente.

La composición farmacéutica puede ser administrada a través de múltiples vías, incluyendo, de forma no exclusiva, 25 las vías oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal.

La composición farmacéutica puede tener un pH entre 5,5 y 8,5, en algunas realizaciones entre 6 y 8 y en otras realizaciones aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a los humanos. 30

En otra realización, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado producido mediante cualquiera de los métodos de la invención se puede combinar con un excipiente diagnóstico para formar un reactivo diagnóstico. En una realización, el reactivo diagnóstico puede incluir uno o más de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados producidos mediante cualquiera de los métodos de la invención. Por ejemplo, el reactivo diagnóstico puede incluir 2, 3, 4, 5 o más de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados producidos mediante cualquiera de los 35 métodos de la invención.

El excipiente diagnóstico puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable para posibilitar la administración del reactivo diagnóstico al paciente. El vehículo no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos nocivos para el individuo receptor de la composición y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden incluir macromoléculas grandes metabolizadas lentamente, como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos 40 polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

En ciertas realizaciones se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo sales de ácidos inorgánicos, como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos; sales de ácidos orgánicos, como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos. 45

En algunas realizaciones, el reactivo farmacéutico también puede contener líquidos, como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, el reactivo farmacéutico puede presentar sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tampón de pH.

El reactivo diagnóstico se puede utilizar para la diagnosis in vivo, in vitro o ex vivo. Para el uso in vivo, el reactivo diagnóstico se puede administrar por múltiples vías, incluyendo, de forma no exclusiva, las vías oral, intravenosa, 50 intramuscular, intra-arterial, intramedular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea, tópica, subcutánea, intranasal, enteral, sublingual, intravaginal o rectal.

Los reactivos diagnóstico pueden tener un pH entre 5,5 y 8,5, en algunas realizaciones entre 6 y 8 y en otras realizaciones aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. El reactivo diagnóstico puede ser isotónico con respecto a los humanos.

En una realización, el reactivo diagnóstico puede incluir el marcado del anticuerpo. El marcado se puede seleccionar entre marcado fluorescente, radiomarcado, un hapteno y marcado biológico, incluyendo marcado enzimático. 5

El reactivo diagnóstico se puede utilizar para determinar la presencia o ausencia de un antígeno particular. Esta información se puede extrapolar para determinar la presencia o ausencia de un patógeno particular y, en consecuencia, de un trastorno o enfermedad particular. En un aspecto de la invención, la enfermedad puede ser una alergia, una afección o enfermedad infecciosa o una afección o enfermedad autoinmune. La información obtenida por el uso del reactivo diagnóstico se puede utilizar para determinar un curso de tratamiento apropiado para un 10 paciente particular. En particular, el reactivo diagnóstico se puede utilizar para determinar la presencia o ausencia de alérgenos.

El término "alérgeno" incluye cualquier antígeno no parasitario capaz de estimular una reacción de hipersensibilidad en un individuo, incluyendo, de forma no exclusiva, una reacción de hipersensibilidad a gatos, pelo animal, caspa, cucaracha, lana, ácaros del polvo, excreciones de ácaros del polvo, penicilina, sulfonamidas, salicilatos, anestésicos, 15 incluyendo anestésicos locales, apio, apio-nabo, cereales, maíz, trigo, huevos, albúmina, fruta, calabaza, legumbres, judías, guisantes, nueces, cacahuetes, semillas de soja, leche, marisco, sésamo, soja, frutos de cáscara, pacanas, almendras, picaduras de insectos, veneno de picadura de abeja, veneno de picadura de avispa, picaduras de mosquito, esporas de moho, látex, metal, pólenes de plantas, hierbas, incluyendo avena alta y anea, malas hierbas, incluyendo artemisa grande, zaragatona, ortiga, artemisia vulgaris, chenopodium album y acedera, y árboles, 20 incluyendo abedul, aliso, avellano, carpe, aesculus, sauce, chopo, plátano, tilo, olea, Ashe juniper.

Uso de anticuerpos aislados en la purificación de proteínas

La invención también incluye un método para inmovilizar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado producido mediante cualquiera de los métodos de la invención, sobre un soporte sólido. El concepto "soporte sólido" incluye tanto soportes sólidos como soportes semisólidos, y abarca cualquier soporte que pueda ser utilizado para 25 inmovilizar sobre el mismo el anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado. El soporte sólido puede incluir un gel, una malla, perlas incluyendo esferas de vidrio o perlas magnéticas, una columna, un tubo, un pocillo de una placa de microtitulación o una lámina de plástico. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo inmovilizado producido mediante cualquiera de los métodos de la invención se puede utilizar en la purificación de proteínas. En una realización, el anticuerpo inmovilizado se puede utilizar en cromatografía de inmunoafinidad. Una solución que incluye la proteína 30 de interés se puede aplicar sobre un soporte sólido que comprende los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo inmovilizados producidos mediante cualquiera de los procedimientos de la invención, y de forma conocida presentan especificidad por la proteína de interés. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden inmovilizar por ejemplo sobre perlas, que en algunas realizaciones pueden estar incluidas dentro de una columna.

General 35

El concepto "que comprende" abarca "que incluye" y también "que consiste en", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir un componente adicional, por ejemplo X + Y.

La palabra "esencialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "esencialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. En caso necesario, la palabra "esencialmente" se puede omitir de la definición de la invención. 40

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x  10%.

El término "enfermedad" tal como se utiliza aquí es generalmente sinónimo y se utiliza indistintamente con los términos "trastorno" y "afección" (como en el estado médico), ya que todos estos términos reflejan un estado anómalo del cuerpo humano o animal o de una de sus partes que afecta al funcionamiento normal, se manifiesta normalmente por signos y síntomas distintivos, y provoca en el humano o animal una reducción de la duración o la 45 calidad de vida.

Tal como se utiliza aquí, la referencia a un "tratamiento" de un paciente incluye tanto la prevención y profilaxis como la terapia. El término "paciente" significa cualquier mamífero, incluyendo humanos. En general, el paciente es un humano.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan como ejemplos de realización de la presente invención. Los siguientes ejemplos se presentan únicamente a modo ilustrativo y no ayudan a una persona con una capacidad normal a utilizar la invención. Los ejemplos no están concebidos en modo alguno para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1. Células plasmáticas en cultivo de células estromales mesenquimales 5

Los inventores observaron que cultivos primarios de células estromales mesenquimales humanas establecidos a partir de médula ósea normal de acuerdo con métodos estándar (Pittenger y col., 1999, Science 284:143-147; Bieback y col., 2004 Stem cells 22:625-634; Dominici y col., 2006, Cytotherapy 8:315-317; Sotiropoulou y col. 2006, Stem Cells 24:462-471) contenían células secretoras de anticuerpos. Estas células se detectaron mediante ELISPOT y se identificaron como células plasmáticas. Las células plasmáticas seguían siendo detectables en el 10 cultivo de células estromales mesenquimales después de 3 semanas in vitro (datos no mostrados).

Ejemplo 2. Cultivo de células plasmáticas humanas durante hasta 50 días

Con el fin de desarrollar un sistema de cultivo que permitiera mantener vivas células plasmáticas individuales de modo que el anticuerpo producido se pudiera acumular como una función del tiempo de cultivo, los inventores analizaron diferentes fuentes de células estromales mesenquimales primarias preparadas de acuerdo con métodos 15 estándar. Brevemente, se revistieron previamente matraces de cultivo de tejidos con FCS durante 1 hora. Después se permitió que células de médula ósea se adhirieran a lo largo de una noche en medio IMDM completo complementado con un 30% de FCS y dexametasona 10-8M. Las células no adherentes se eliminaron por lavado y las células adherentes se cultivaron en DMEM completo-10% FCS. Tres de las siete líneas analizadas soportaron la supervivencia de células plasmáticas humanas, pero la proliferación se interrumpió después de unos pocos pases. 20 En experimentos posteriores se utilizaron células estromales mesenquimales inmortalizadas por transducción con el gen de transcriptasa inversa de la telomerasa (MSC-TERT). Estas células eran aquellas aisladas por Mihara y col. (Br J Haematol 2003, 120, 846-849).

Se tiñeron células mononucleares de sangre periférica con anticuerpo monoclonal anti-CD138 marcado con PE, se enriquecieron utilizando microperlas anti-PE (Miltenyi) y se purificaron adicionalmente mediante clasificación celular 25 para aislar células positivas a CD138. La cantidad de células plasmáticas secretoras de IgG se determinó utilizando un ELISPOT específico de isotipo. Diferentes cantidades de células positivas a CD138 se sembraron sobre monocapas de células estromales mesenquimales en placas de cultivo de 96 pocillos con RPMI 1640 complementado con 10% suero bovino fetal (Hyclone), aminoácidos no esenciales, piruvato y glutamax (GIBCO). De acuerdo con el ELISPOT realizado en el momento de la disposición sobre placas, el cultivo representado en la Fig. 1 30 contenía siete células secretoras de IgG. La mitad del sobrenadante de cultivo se recogió en diferentes momentos y se sustituyó por medio fresco. Además, los días 18 y 34 el medio se retiró por completo y se sustituyó por medio fresco. Se determinó la tasa diaria de producción de IgG por cultivo y la tasa diaria estimada de producción de IgG por célula plasmática. Como muestra la Fig. 1, la cantidad de IgG producida por una población de cultivo de la presente invención, de aproximadamente 7 células, aumentó como una función lineal del tiempo de cultivo a lo largo 35 de 50 días, lo que es coherente con una tasa de producción de 676 pg/día y una producción estimada de 96 pg/célula/día.

Ejemplo 3. Cultivo de células plasmáticas individuales durante 3 semanas

Se aislaron células plasmáticas de sangre periférica o médula ósea utilizando anticuerpo anti-CD138 conjugado con PE, seguido de microperlas anti-PE y clasificación celular y se sembraron sobre monocapas de células estromales 40 mesenquimales a 0,5 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Los cultivos que contenían IgG se controlaron durante un período de 22-23 días mediante toma de muestras regular. El medio se cambió el día 16. La tasa de producción de IgG en cultivos monoclonales era constante, oscilando entre 72 y 134 pg/célula/día a lo largo de todo el período de cultivo (Fig. 2a, derivado de sangre periférica (4 cultivos); Fig. 2b, derivado de médula ósea (5 cultivos)).

En cinco experimentos de dilución limitativa, la eficiencia del cultivo en placas de células plasmáticas de sangre y 45 médula ósea osciló entre el 30% y el 65% (datos no mostrados). Además, células plasmáticas recuperadas de cultivos policlonales pudieron ser dispuestas de nuevo en placas en cultivos de células individuales, donde mantuvieron una tasa constante de secreción de Ig (datos no mostrados). La acumulación lineal de IgG es coherente con la conservación de células individuales que segregan IgG con una tasa alta constante. La producción de IgG por células plasmáticas cultivadas no resultó afectada por irradiación a un nivel que suprimió por completo la 50 proliferación y diferenciación de células B de memoria estimuladas por agonistas de TLR (datos no mostrados).

Ejemplo 4. Cultivo de células plasmáticas que producen IgG, IgA, IgM e IgE

Se aislaron células positivas a CD138 de sangre periférica productoras de IgG, IgA, IgM e IgE de un donante sano y se dispusieron a razón de 5 células/pocillo en placas de 384 pocillos que contenían monocapas de células

estromales mesenquimales en 617 cultivos replicados. El día 10 se analizaron los sobrenadantes de cultivo en cuanto a la presencia de IgG, IgA, IgM e IgE utilizando ELISA específico de isotipo. La cantidad total de los cuatro isotipos se midió en los sobrenadantes de cultivo (véase la Fig. 3). El valor medio de productividad de células plasmáticas de IgG, IgA, IgM e IgE fue de 860, 770, 1.100 y 1.800 pg en 10 días, es decir, 86, 77, 110 y 180 pg/célula/día, respectivamente. 5

Ejemplo 5. Eficiencia de supervivencia de células plasmáticas in vitro

Se aislaron células plasmáticas humanas derivadas de sangre periférica de siete donantes de acuerdo con la expresión de CD138 y se sembraron a razón de 1 o 25 células/pocillo. La cantidad de células secretoras de anticuerpo de IgG, IgA e IgM al comienzo de los cultivos se calculó mediante ELISPOT específico de isotipo. La eficiencia del cultivo en placas se calculó sobre células secretoras de anticuerpo de IgG, IgA e IgM de acuerdo con 10 el análisis de distribución de Poisson y oscilaba entre el 50% y el 74% en el caso de la IgG, entre el 31% y el 78% en el caso de la IgA, y entre el 0% y el 26% en el caso de la IgM (véase la Fig. 4). Además, las células plasmáticas recuperadas de cultivos policlonales pudieron disponerse de nuevo en placas en cultivos de células individuales, donde mantuvieron una tasa constante de secreción de Ig (datos no mostrados).

Ejemplo 6. Aislamiento de anticuerpos monoclonales de IgE raros 15

En primer lugar se aislaron células plasmáticas de sangre periférica de un individuo alérgico, que se dispusieron a razón de 1 célula/pocillo sobre monocapas de hMSC-TERT en diez microplacas de 384 pocillos. Cinco sobrenadantes de cultivo dieron un resultado positivo en cuanto a la producción de IgE. Los cultivos positivos a IgE se sometieron a RT-PCR y dos genes VH/VL emparejados se recuperaron y secuenciaron (Tabla 1). Los genes V se clonaron en vectores de expresión para la expresión de una cadena ligera (kappa o lambda) o de una cadena 20 pesada de IgG1 o IgE humana de acuerdo con el método descrito en Wardemann y col. (Science 301, 1374-1377, 2003). Los anticuerpos de IgG o IgE se produjeron mediante transfección transitoria de células 293T. Este ejemplo ilustra la posibilidad de recuperar células plasmáticas raras y aislar anticuerpos monoclonales de IgE representativos.

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Tabla 1. Dos anticuerpos monoclonales de IgE recuperados de células plasmáticas circulantes

Cadena Pesada Cadena Ligera

Clon

Isotipo Gen V N1 nt Gen D N2 nt Gen J SHM nt (aa) Gen V N nt Gen J SHM nt (aa)

IgE1 IgE2

IgE,  IgE,  3-9*01 3-15*01 4 0 2-15*01 2-2*01 5 9 4*02 6*03 30 (16) 15 (7) 2-14*01 3-11*01 5 1 2*01 5*01 18 (12) 8 (7)

SHM nt: nucleótido de hipermutación somática; aa: aminoácido

Ejemplo 7. Aislamiento de anticuerpos monoclonales específicos de antígeno a partir de células plasmáticas cultivadas en presencia de células estromales mesenquimales

Se aislaron células plasmáticas de sangre periférica de un donante 7 días después de una revacunación con toxoide 30 tetánico (TT) y se sembraron en condiciones de clonación sobre monocapas de MSC-TERT en microplacas de 384 pocillos. El día 10 se analizaron los sobrenadantes de cultivo en cuanto a la presencia de IgG total (ng/cultivo) y anticuerpos de IgG específicos de TT (OD-405) y se identificaron cultivos monoclonales productores de anticuerpos específicos de TT (véase la Fig. 5). Este ejemplo ilustra la posibilidad de identificar grandes cantidades de células plasmáticas específicas de antígeno después de una reinmunización. 35

Ejemplo 8. Aislamiento de un anticuerpo neutralizador de la gripe A potente y muy reactivo a partir de células plasmáticas cultivadas en presencia de IL-6

Se sembraron células positivas a CD138 de un donante inmunizado 7 días antes con una vacuna de la gripe estacional en dieciséis placas de 384 pocillos a razón de 0,5 células/pocillo en presencia de 10 ng/ml de IL-6. Los días 6 y 8, los sobrenadantes del cultivo se analizaron en tres ELISA paralelos utilizando como antígenos 40 hemaglutininas (HA) recombinantes H5 o hemaglutininas recombinantes derivadas de baculovirus H9 y el antígeno irrelevante toxoide tetánico (TT). Entre los 4.928 sobrenadantes de cultivo estudiados, 12 se unieron a HA H5, 25 a HA H9 y 54 tanto a H5 como a H9. Algunos de estos últimos con la señal OD más alta se sometieron a RT-PCR y se recuperaron dos genes VH/VL emparejados. Los dos anticuerpos monoclonales, FI6 y FI28, compartían la mayor parte de los fragmentos de genes V, D y J (IGHV3-30*01, IGHD3-9*01, IGHJ4*02 e IGKV4-1*01), pero se 45 diferenciaban en las regiones N, en el uso de IGKJ y en el patrón de mutaciones somáticas y, en consecuencia, no estaban relacionados en la clonación.

Los genes V de FI6 y FI28 se clonaron en vectores de expresión y se produjeron anticuerpos recombinantes mediante transfección de células 293T. Esta especificidad se investigó mediante ELISA utilizando un panel de HA

recombinantes pertenecientes a diferentes subtipos (Tabla 2). El FI6 se unió a todos los subtipos HA de la gripe A, incluyendo el grupo 1 (H1, H5 y H9) y el grupo 2 (H3 y H7), mientras que no se unió a HA de la gripe B. En cambio, el FI28 solo se unió a HA del grupo 1.

Tabla 2. Unión de anticuerpos monoclonales humanos derivados de células plasmáticas con HA de gripe

Unión a HA mediante ELISA (% de anticuerpos de control específicos de subtipo)

H1 H3 H5 H7 H9

A/NC/ 20/99 A/BR/ 10/07 A/VN/ 1203/04 A/NL/ 219/03 A/HK/ 1073/99

FI6

85,9 68,5 73,7 87,9 98,7

FI28

59,4 1,3 46,3 -0,5 87,7

5

A continuación se analizaron FI6 y FI28 en cuanto a su capacidad para neutralizar los subtipos de la gripe A del grupo 1 y el grupo 2 utilizando pseudovirus y virus infecciosos. Sorprendentemente, FI6 neutralizó todos los pseudovirus analizados, incluyendo seis aislados de H5 pertenecientes a las clases antigénicamente divergentes 0, 1, 2.1, 2.2 y 2.3, y dos aislados aviares H7 (Tabla 3). Además, el FI6 neutralizó todos los virus infecciosos analizados, incluyendo dos virus H3N2 y cuatro virus H1N1, abarcando un período de 70 años hasta el reciente 10 aislado pandémico H1N1 de origen porcino A/Cal/04/09 (Tabla 4). En cambio, FI28 neutralizó todos los pseudovirus H5 pero no neutralizó pseudovirus H7 ni ninguno de los virus infecciosos analizados (Tablas 3 y 4).

Tabla 3. Neutralización de pseudotipos H5 y H7 mediante anticuerpos monoclonales humanos

Neutralización de pseudotipos HA (IC90, µg/ml)

H5N1 H7N1

A/HK/ 491/97 A/HK/ 213/03 A/VN/ 1203/04 A/INDO/ 5/05 A/WS/ MONG/05 A/AH/ 1/05 A/ck/IT/ 13474/99 A/ck/FPV /Ro/34

FI6

0,07 0,02 0,02 0,31 0,03 0,05 1,87 0,09

FI28

0,05 0,33 0,02 0,35 0,04 0,05 > 100 > 100

Tabla 4. Neutralización de virus de la gripe mediante anticuerpos monoclonales humanos. nr, no realizado. 15

Neutralización de virus infecciosos (IC50, µg/ml)

H1N1 H3N2

A/PR/8/34 A/NC/20/99 A/SI/3/06 A/CA/4/09 A/CA/7/04 A/WI/67/05

FI6

2,2 6,3 8,8 12,5 7,9 12,5

FI28

> 100 > 100 > 100 nr > 100 > 100

nr, no realizado

Se ha de señalar que el método arriba detallado proporciona 50 µl de anticuerpo monoclonal a aproximadamente 8-16 ng/ml en 5-10 días. Este volumen y la concentración de anticuerpo son suficientes para realizar múltiples ensayos. Estos ensayos no sólo comprenden ensayos de unión como ELISA (que se puede realizar en un formato de placa 384 plana estándar utilizando 5 µl), sino también ensayos funcionales, como neutralización de pseudotipos, 20 que están dentro del rango de sensibilidad (véase la Tabla 3). Una cuestión importante es que la capacidad de realizar múltiples ensayos paralelos es esencial para identificar con rapidez células plasmáticas raras que segregan anticuerpos capaces de unirse a múltiples variantes de antígeno.

Ejemplo 9. Aislamiento de un anticuerpo monoclonal específico de toxoide tetánico a partir de células plasmáticas cultivadas aisladas de sangre periférica diez años después de la vacunación 25

Se aislaron células plasmáticas CD138+ HLA-DR+ CD62L+ mediante clasificación celular de la sangre periférica de un donante 10 años después de una vacuna con toxoide tetánico (TT). Un total de 1.700 células se sembraron a razón de 0,5 células/pocillo en microplacas de 384 pocillos y los sobrenadantes de cultivo se filtraron el día 7 mediante ELISA en cuanto a la presencia de anticuerpos de IgG específicos de toxoide tetánico. Se identificó un cultivo específico de toxoide tetánico y el día 8 se recuperaron los genes VH/VL mediante RT-PCR y se 30 secuenciaron (véase la Tabla 5). Los genes se clonaron en vectores de expresión y se produjo el anticuerpo recombinante (TT14) mediante transfección temporal de células 293T. En anticuerpo se analizó en diferentes concentraciones en cuanto a la unión con toxoide tetánico o con un antígeno no relacionado (control negativo) mediante ELISA (véase la Fig. 6).

35

Tabla 5. Anticuerpo monoclonal específico de toxoide tetánico recuperado de células plasmáticas circulantes 10 años después de la vacunación

Cadena Pesada Cadena Ligera

Clon

Isotipo Gen V Gen D Gen J SHM nt (aa) Gen V Gen J SHM nt (aa)

TTI4

IgG4, 1 1-2*02 6-19*01 4*02 17 (13) 7-46*01 3*02 9 (7)

SHM nt: nucleótido de hipermutación somática; aa: aminoácido

Las presentes realizaciones deben ser consideradas como ilustrativas y no restrictivas, y la invención no se ha de limitar a los detalles que aquí se dan, sino que se puede modificar dentro del alcance y los equivalentes de las 5 reivindicaciones adjuntas.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Método para producir un anticuerpo a partir de células plasmáticas que comprende: cultivar las células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en un número limitado y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas, siendo el número de células plasmáticas cultivadas igual a 10 o inferior.
2. 2. Método para producir un anticuerpo monoclonal a partir de células plasmáticas que comprende: cultivar las 5 células plasmáticas en presencia de IL-6 o células estromales mesenquimales en cultivos de células individuales y obtener dicho anticuerpo a partir de éstas.
3. 3. Método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humano y las células plasmáticas son células plasmáticas humanas.
4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque las células plasmáticas se 10 cultivan en un medio de cultivo que incluye IL-6 o células estromales mesenquimales que prolongan la supervivencia de las células plasmáticas durante un tiempo suficiente para producir el anticuerpo en las cantidades necesarias para la caracterización de dicho anticuerpo.
5. 5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante un corto plazo, siendo dicho corto plazo de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 15 días.
6. 6. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante un largo plazo, siendo dicho largo plazo de al menos 10 días.
7. 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 6, caracterizado porque la supervivencia de las células plasmáticas se prolonga durante al menos 20 días o al menos 30 días. 20
8. 8. Método para producir un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, que incluye los pasos de:

   a. cultivar un número limitado de células plasmáticas de acuerdo con el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

   b. identificar los cultivos que producen un anticuerpo con una característica deseada;

   c. aislar el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo; y 25

   d. expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped.
9. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que adicionalmente incluye caracterizar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo, comprendiendo la caracterización del anticuerpo o fragmento de anticuerpo la realización de ensayos funcionales para determinar la función del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, ensayos de unión para determinar la especificidad de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo o el 30 epitopo reconocido por el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y/o ensayos de neutralización para determinar la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para neutralizar una toxina o un patógeno.