BRPI0914116A2 - diferenciação de células-tronco pluripotentes - Google Patents

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Abstract

diferenciação de células-tronco pluripotentes a presente invenção refere-se a métodos para diferenciar células-tronco pluripotentes. em particular, a presente invenção refere-se a métodos e composições para diferenciar células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo que compreendem o cultivo das células-tronco pluripotentes em meio que compreende uma quantidade suficiente de gdf-8 para ocasionar a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo .

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES.
A presente invenção reivindica a prioridade ao pedido de número de série 61/076.900, depositado em 30 de junho de 2008, pedido de número de série 61/076.908, depositado em 30 de junho de 2008, e pedido de número de série 61/076.915, depositado em 30 de junho de 2008.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos para diferentciar células-tronco pluripotentes. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos e composições para diferenciar células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo que compreendem o cultivo das células-tronco pluripotentes em meio que compreende uma quantidade suficiente de GDF-8 para ocasionar a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo.
ANTECEDENTES
Os avanços na terapia de reposição celular para a diabetes melito tipo I e a escassez de ilhotas de Langerhans transplantáveis concentraram interesses no desenvolvimento de fontes de células produtoras de insulina, ou células β, adequadas para enxerto. Uma abordagem trata da geração de células β funcionais a partir de células-tronco pluripotentes, como, por exemplo, células-tronco embrionárias.
No desenvolvimento embrionário de vertebrados, uma célula pluripotente dá origem a um grupo de células compreendendo três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme), em um processo conhecido como gastrulação. Tecidos como tireoide, timo, pâncreas, intestinos e fígado se desenvolvem a partir da endoderme, por meio de um estágio intermediário. O estágio intermediário nesse processo consiste na formação da endoderme definitivo. As células de endoderme definitiva expressam inúmeros marcadores, como HNF-3beta, GATA4, MIXL1, CXCR4 e SOX17.
A formação do pâncreas tem origem na diferenciação da endoderme definitiva em endoderme pancreática. As células da endoderme
2/247 pancreática expressam o gene homeobox pancreático-duodenal, Pdx1. Na ausência de Pdx1, o pâncreas não desenvolve além da formação dos ramos ventral e dorsal. Portanto, a expressão do Pdx1 marca uma etapa de importância crítica na organogênese pancreática. O pâncreas maduro contém, entre outros tipos de célula, tecido exócrino e tecido endócrino. Os tecidos exócrino e endócrino têm origem na diferenciação da endoderme pancreática.
Há relatos de que células dotadas de características das célulasilhota tenham sido obtidas a partir de células embrionárias de camundongo. Por exemplo, Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) relataram a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em estruturas secretoras de insulina similares a ilhotas pancreáticas. Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) relatam que células secretoras de insulina derivadas de células-tronco embrionárias de camundongo normalizam a glicemia em camundongos com diabetes induzida por estreptozotocina.
Em um exemplo, Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) descreve que o tratamento de células-tronco embrionárias de camundongo com inibidores de fosfoinositídieo 3-quinase (LY294002) produziu células que se assemelhavam às células β.
Em outro exemplo, Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) relatam a geração de células produtoras de insulina a partir de células-tronco embrionárias de camundongo expressando constitutivamente Pax4.
Micallef et al., dizem que o ácido retinoico pode regular as células-tronco embrionárias comprometidas com a formação do endoderma pancreático positivo Pdx1. O ácido retinoico é mais eficaz para induzir a expressão de Pdx1 quando adicionado a culturas no dia 4 da diferenciação da célula-tronco embrionária durante um período correspondente ao final da gastrulação no embrião (Diabetes 54:301, 2005).
Miyazaki et al. relatam uma linhagem de célula-tronco embrionária de camundongo que superexpressa Pdx1. Seus resultados mostram que a expressão exógena do Pdx1 intensificou claramente a expressão dos genes de insulina, somatostatina, glicoquinase, neurogenina3, P48, Pax6 e
3/247
HNF6 nas células diferenciadas resultantes (Diabetes 53: 1030, 2004).
Skoudy et al. relatam que a ativina A (um membro da superfamília TGF-β) regula para cima a expressão de genes pancreáticos exócrinos (p48 e amilase) e endócrinos (Pdx1, insulina e glucagon) em células-tronco embrionárias de camundongo.
O efeito máximo foi observado com o uso de 1 nM de ativina A. Observou-se também que o nível de expressão de mRNA de insulina e Pdx1 não foi afetado pelo ácido retinoico; entretanto, o tratamento com 3 nM de FGF7 resultou em um nível aumentado da transcrição para Pdx1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
Shiraki et al. estudaram os efeitos de fatores de crescimento que acentuam especificamente a diferenciação das células-tronco embrionárias nas células positivas para Pdx1. Observou-se que o TGFp2 rendeu, reprodutivelmente, uma maior proporção de células positivas para Pdx1 (Genes Cells., junho de 2005, 10(6): 503 a 16).
Gordon et al. demonstraram a indução de células de endoderma braquiúria [positivo]/ HNF-3beta [positivo] a partir de células-tronco embrionárias de camundongo, na ausência de soro e na presença de ativina juntamente com um inibidor de sinalização Wnt (US 2006/0003446A 1).
Gordon et al. (PNAS, Volume 103, página 16806, 2006) declaram que foi necessária a sinalização simultânea de Wnt e TGF-beta/nodal/ativina para a geração da linha primitiva anterior.
Entretanto, o modelo de camundongo para desenvolvimento de célula-tronco embrionária pode não imitar exatamente o programa de desenvolvimento em mamíferos superiores, como seres humanos.
Thomson et al. isolou células-tronco embrionárias de blastocistos humanos (Science 282:114, 1998). Ao mesmo tempo, Gearhart e seus colaboradores derivaram linhagens de células germinativas embrionárias humanas (hEG) a partir do tecido gonadal de feto (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13726, 1998). Ao contrário das células-tronco embrionárias de camundongo, cuja diferenciação pode ser impedida simplesmente por realizar-se cultura com o Fator Inibitório de Leucemia
4/247 (LIF), as células-tronco embrionárias de seres humanos têm que ser mantidas sob condições muito especiais (patente U.S. n° 6.200.806; WO
99/20741; WO 01/51616).
D'Amour et al. descreve a produção de culturas enriquecidas de endoderma definitivo derivado de células-tronco embrionárias humanas na presença de uma alta concentração de ativina e baixo teor de soro (D'Amour K A et al. 2005). O transplante dessas células sob a cápsula renal de camundongos resultou na diferenciação em células mais maduras com características de alguns órgãos endodémnicos. As células de endoderma definitivo derivadas de células-tronco embrionárias humanas podem ser ainda diferenciadas em células positivas para Pdx1, após a adição de FGF10 (US 2005/0266554A1).
D'Amour et al., (Nature Biotechnology - 24, 1392 a 1401 (2006)) declaram: desenvolvemos um processo de diferenciação que converte células-tronco embrionárias de ser humano (hES) em células endócrinas capazes de sintetizarem a insulina dos hormônios pancreáticos, glucagon, somatostatina, polipeptídeo pancreático e grelina. Este processo imita a organogenese pancreática in vivo, mediante o direcionamento das células através de estágios que se assemelham ao endoderma definitivo, ao endoderma do tubo gastrointestinal, ao endoderma pancreático e ao precursor endócrino, em rota para células que expressam hormônios endócrinos.
Em outro exemplo, Fisk et al. relata um sistema para a produção de células de ilhota pancreática a partir de células-tronco embrionárias humanas (US2006/0040387A1). Nesse caso, a via de diferenciação foi dividida em três estágios. As células-tronco embrionárias humanas foram primeiro diferenciadas em endoderme com o uso de uma combinação de nbutirato e ativina A. As células foram então cultivadas com antagonistas de TGF-β como noguina em combinação com EGF ou betacelulina para gerar células positivas para Pdx1. A diferenciação terminal foi induzida por nicotinamida.
Em um exemplo, Benvenistry et al. declaram: concluímos que a
5/247 superexpressão de PDX1 acentuou a expressão de genes pancreáticos enriquecidos, a indução da expressão de insulina pode requerer sinais adicionais que só estão presentes in vivo (Benvenistry et ai., Stem Cells
2006; 24:1923-1930).
A ativina A é um membro da família TGF-beta que exibe uma ampla gama de atividades biológicas, inclusive regulação de proliferação e diferenciação celular, bem como promoção da sobrevivência neuronal. O isolamento e a purificação da ativina A são frequentemente complexos e podem, frequentemente, resultar em um rendimento insatisfatório. Por exemplo, Pangas, S.A. e Woodruff, T.K. declaram: a inibina e a ativina são hormônios proteicos com papéis fisiológicos diversos, inclusive a regulação da secreção de FSH pela hipófise. Como outros membros da família do gene para fator de transformação do crescimento β, sofrem processamento a partir de moléculas precursoras maiores, bem como montagem em dímeros funcionais. O isolamento de inibina e ativina a partir de fontes naturais só pode produzir quantidades limitadas de proteína bioativa. (J. Endocrinol. 172 (2002) 199-210).
Em outro exemplo, Arai, K. Y. et al. declaram: as ativinas são fatores de crescimento multifuncionais que pertencem à superfamília do fator de transformação do crescimento β. O isolamento de ativinas a partir de fontes naturais requer muitas etapas e só produz quantidades limitadas. Embora preparações recombinantes venham sendo usadas em estudos recentes, a purificação de ativinas ainda exige múltiplas etapas. (Protein Expression and Purification 49 (2006) 78-82).
Portanto, ainda permanece uma necessidade significativa por alternativas à ativina A para facilitar a diferenciação de células-tronco pluripotentes.
SUMÁRIO
Em uma modalidade, a presente invenção apresenta um método para diferenciar células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, compreendendo o cultivo das células-tronco pluripotentes em um meio que
6/247 compreende uma quantidade suficiente de GDF-8 para ocasionar a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Em uma modalidade, o meio que compreende uma quantidade suficiente de GDF-8 também contém pelo menos um outro composto. Em uma modalidade, esse pelo menos um outro composto é uma anilinapiridinotriazina. Em uma modalidade alternativa, esse pelo menos um outro composto é uma anilina-piridinotriazina cíclica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 mostra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas H1 em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. A diferenciação foi determinada mediante a medição do número de células (Painel A) e da intensidade de SOX17 (Painel B) com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). As células-tronco embrionárias humanas foram tratadas durante um total de quatro dias com um meio contendo 20 ng/mL de Wnt3a, mais ativina A, nas concentrações indicadas (barras pretas), ou com um meio desprovido de Wnt3a mas com ativina A nas concentrações indicadas (barras brancas).
A figura 2 mostra a relação entre dose e resposta de ativina A e GDF8 usados para diferenciar células da linhagem H1 de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. As células foram tratadas por um total de três dias com ativina A ou GDF8 nas concentrações mostradas, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a no primeiro dia de teste. A diferenciação foi determinada mediante a medição da intensidade de SOX17, com o uso de uma sonda de anticorpo fluorescente e análise de alto conteúdo em um equipamento de análise celular GE Healthcare IN Cell Analyzer.
A figura 3 mostra a expressão de CXCR4 nas células, em seguida à primeira etapa de diferenciação, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 12. As células H1 foram tratadas com 100 ng/mL de
7/247 ativina A ou 200 ng/mL de GDF-8 durante um total de três dias, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ do Composto 56, durante todos os três dias. A expressão de CXCR4 foi medida com o uso de uma sonda de anticorpo fluorescente e citometria de fluxo, produzindo as porcentagens mostradas de células positivas.
A figura 4 mostra a expressão de SOX17 em células após três dias de diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 12. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias com 100 ng/mL de ativina A ou 200 ng/mL de GDF-8 em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ do Composto 56, durante todos os três dias. A diferenciação foi determinada mediante a medição da intensidade de SOX17 (barras pretas) e o número de células resultante (barras brancas) com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo em um equipamento de análise celular GE Healthcare IN Cell Analyzer.
A figura 5 mostra a expressão de proteína PDX1 e CDX2 nas células, em seguida à terceira etapa de diferenciação, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 12. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias com 100 ng/mL de ativina A ou 200 ng/mL de GDF-8 em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ do Composto 56, durante todos os três dias, seguido de subsequente diferenciação por meio das segunda e terceira etapas de diferenciação. A expressão de proteína e os números de células, conforme determinado com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, são representados para cada grupo de tratamento. Para propósitos de comparação, os valores são normalizados em relação ao tratamento com ativina A/Wnt3a.
A figura 6 mostra a expressão de proteína PDX1 (barras brancas) e o número de células (barras pretas) para células em seguida à quarta etapa de diferenciação, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 12. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias com
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100 ng/mL de ativina A ou 200 ng/mL de GDF-8 em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ de Composto 56, durante todos os três dias, seguido de subsequente diferenciação por meio das segunda, terceira e quarta etapas de diferenciação. A expressão de proteína e os números de células, conforme determinado com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, são representados para cada grupo de tratamento. Para propósitos de comparação, os valores são normalizados em relação ao tratamento com ativina A/Wnt3a.
A figura 7 mostra a expressão de proteína para insulina e glucagon, bem como o número de células, para células diferenciadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 12. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias com 100 ng/mL de ativina A ou 200 ng/mL de GDF-8 em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ de Composto 56, durante todos os três dias, seguido de subsequente diferenciação por meio das segunda, terceira, quarta e quinta etapas de diferenciação. A expressão de proteína e os números de células, conforme determinado com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, são representados para cada grupo de tratamento. Para propósitos de comparação, os valores são normalizados em relação ao tratamento com ativina A/Wnt3a.
A figura 8 mostra a expressão de proteína SOX17 e o número de células para células-tronco embrionárias humanas, após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo
13. As células H1 foram tratadas durante um total de quatro dias com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de um fator de crescimento GDF em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 34, ou 2,5 μΜ de Composto 56 durante os primeiros dois dias de teste. A expressão de proteína SOX17 (barras pretas) e os números de células (barras brancas), conforme determinado com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, são representados para cada grupo de tratamento. Para propósitos de comparação, os valores são
9/247 normalizados em relação ao tratamento com ativina A/Wnt3a. O painel 8A mostra uma série de condições de controle para diferenciação na ausência de quaisquer fatores de crescimento (NENHUM), ou com tratamento de ativina A/Wnt3a (AA/Wnt3a), ou com reagentes individuais por si sós. O painel 8B mostra a diferenciação com GDF-3, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56. O painel 8C mostra a diferenciação com GDF-5, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56. O painel 8D mostra a diferenciação com GDF-8, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56. O painel 8E mostra a diferenciação com GDF-10, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56. O painel 8F mostra a diferenciação com GDF-11, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56. O painel 8G mostra a diferenciação com GDF-15, por si só ou em múltiplas combinações com Wnt3a, Composto 34 ou Composto 56.
A figura 9 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 14. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias com 100 ng/mL de ativina A, ou vários fatores de crescimento nas concentrações mostradas, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a, ou 2,5 μΜ de Composto 34 durante o primeiro dia do teste. A expressão de proteína SOX17 (barras pretas) e os números de células (barras brancas), conforme determinado com sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, são representados para cada grupo de tratamento. Para propósitos de comparação, os valores são normalizados em relação ao tratamento com ativina A/Wnt3a. O painel 9A mostra uma série de condições de controle para diferenciação com Wnt3a por si só, ou na ausência de quaisquer fatores de crescimento (Nenhum), ou com tratamento de ativina A/Wnt3a (AA/Wnt3a). O painel 9B mostra a diferenciação com GDF-8 (fornecedor: PeproTech), nas concentrações mostradas, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a. O painel 9C mostra a diferenciação com GDF-8 (fornecedor: Shenendoah), nas concentrações
10/247 mostradas, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a. O painel 9D mostra a diferenciação com ΤΘΕβ1, nas concentrações mostradas, em múltiplas combinações com Wnt3a ou Composto 34. O painel 9E mostra a diferenciação com BMP2, nas concentrações mostradas, em múltiplas combinações com Wnt3a ou Composto 34. O painel 9F mostra a diferenciação com BMP3, nas concentrações mostradas, em múltiplas combinações com Wnt3a ou Composto 34. O painel 9G mostra a diferenciação com BMP4, nas concentrações mostradas, em múltiplas combinações com Wnt3a ou Composto 34.
A figura 10 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias em várias exposições temporizadas com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a. A expressão de proteína SOX17, conforme determinada por sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, é mostrada sob a forma de valores de intensidade total para cada grupo de tratamento, sendo as condições de controle testadas quanto à diferenciação sem a adição de quaisquer fatores de crescimento (nenhum tratamento), com Wnt3a por si só, com ativina A ou GDF-8 por si só, ou com tratamento por ativina A/Wnt3a ou GDF-8/Wnt3a, sendo que o Wnt3a foi adicionado somente durante o primeiro dia do teste, ou durante os três dias de teste, conforme mostrado.
A figura 11 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de ativina A em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado somente no
11/247 primeiro dia do teste. A expressão de proteína para SOX17, conforme determinado por sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, é representada por valores de intensidade total.
A figura 12 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de ativina A em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado durante todos os três dias do teste. A expressão de proteína para SOX17, conforme determinado por sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, é representada por valores de intensidade total.
A figura 13 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de GDF-8 em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado somente no primeiro dia do teste. A expressão de proteína para SOX17, conforme determinado por sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, é representada por valores de intensidade total.
A figura 14 mostra a expressão de proteína SOX17 em célulastronco embrionárias humanas após a diferenciação para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de GDF-8 em combinação com o composto
12/247 de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado durante todos os três dias do teste. A expressão de proteína para SOX17, conforme determinado por sondas de anticorpo fluorescentes e análise de alto conteúdo, é representada por valores de intensidade total.
A figura 15 mostra os rendimentos do número de células após a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias em várias exposições temporizadas com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a. Os números de células, conforme determinado por uma sonda nuclear fluorescente e por análise de alto conteúdo, são mostrados para cada grupo de tratamento, testando-se as condições de controle para diferenciação sem a adição de nenhum fator de crescimento (nenhum tratamento), com Wnt3a por si só, com ativina A ou GDF-8 por si só, ou com tratamento por ativina A/Wnt3a ou por GDF8/Wnt3a, sendo que o Wnt3a foi adicionado somente para o primeiro dia do teste, ou para todos os três dias do teste, conforme mostrado.
A figura 16 mostra os rendimentos do número de células após a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de ativina A em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado somente no primeiro dia do teste. São mostrados os rendimentos do número de células, conforme determinado por uma sonda nuclear fluorescente e por análise de alto conteúdo.
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A figura 17 mostra os rendimentos do número de células após a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de ativina A em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado durante todos os três dias do teste. São mostrados os rendimentos do número de células, conforme determinado por uma sonda nuclear fluorescente e por análise de alto conteúdo.
A figura 18 mostra os rendimentos do número de células após a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de GDF-8 em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado somente no primeiro dia do teste. São mostrados os rendimentos do número de células, conforme determinado por uma sonda nuclear fluorescente e por análise de alto conteúdo.
A figura 19 mostra os rendimentos do número de células após a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas para endoderma definitivo, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 15. As células H1 foram tratadas durante um total de três dias, em várias exposições temporizadas, com 100 ng/mL de GDF-8 em combinação com o composto de teste (Composto 181 (Painel A), Composto 180 (Painel B), Composto 19 (Painel C), Composto 202 (Painel D), Composto 40 (Painel E), Composto 34 (Painel F) ou inibidor de GSK3 BIO (Painel G)) nas concentrações
14/247 mostradas, sendo que o composto de teste foi adicionado durante todos os três dias do teste. São mostrados os rendimentos do número de células, conforme determinado por uma sonda nuclear fluorescente e por análise de alto conteúdo.
A figura 20 mostra a expressão de vários marcadores de proteína em células através das múltiplas etapas de diferenciação, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 16. As células H1 foram tratadas com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8 durante um total de três dias, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de vários compostos (Composto 19, Composto 202, Composto 40 ou inibidor GSK3 BIO) adicionados somente no primeiro dia. A figura 20, painel A mostra a análise de FACS para o marcador de endoderma definitivo, CXCR4, em células após a primeira etapa de diferenciação. A expressão de CXCR4 foi medida com o uso de uma sonda de anticorpo fluorescente e citometria de fluxo, produzindo as porcentagens de células positivas conforme mostrado. A figura 20, painel B mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína SOX17 normalizada (barras pretas) e números de células recuperadas (barras brancas) resultantes da primeira etapa de diferenciação, testando os tratamentos correspondentes mostrados. A figura 20, painel C, mostra a análise de imagens de alto conteúdo para números relativos de células recuperadas de culturas tratadas por meio da etapa de diferenciação 5. A figura 20, painel D, mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína glucagon a partir de culturas tratadas por meio da etapa de diferenciação 5. A figura 20, painel E, mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína insulina a partir de culturas tratadas por meio da etapa de diferenciação 5. A figura 20, painel F mostra a razão entre as expressões de glucagon e de insulina em células de culturas tratadas por meio da etapa de diferenciação 5. Para propósitos de comparação, os valores de expressão nos painéis B, C, D, E e F são normalizados em relação ao tratamento de controle com ativina A e Wnt3a durante a etapa 1.
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A figura 21 mostra a expressão de vários marcadores de proteína e de RT-PCR em células através das múltiplas etapas de diferenciação, de acordo com os métodos descritos no Exemplo 17. As células H1 foram tratadas com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8 durante um total de três dias, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou vários compostos nas concentrações apresentadas a seguir (Composto 181, Composto 180, Composto 19, Composto 202, Composto 40, Composto 56 ou inibidor GSK3 BIO) adicionados somente no primeiro dia. A análise FACS quanto ao marcador de endoderma definitivo CXCR4 é mostrada em células após a primeira etapa de diferenciação, em que o tratamento combinou ativina A (Painel A) ou GDF-8 (Painel B) com Wnt3a ou vários compostos. A expressão de CXCR4 foi medida com o uso de uma sonda de anticorpo fluorescente e citometria de fluxo, produzindo as porcentagens de células positivas conforme mostrado. Nos painéis subsequentes da figura 21, valores normalizados de RT-PCR para vários marcadores de diferenciação são mostrados com os respectivos tratamentos usando ativina A ou GDF-8 durante a primeira etapa de diferenciação, conforme exposto a seguir: marcadores ao final da primeira etapa de diferenciação para tratamentos combinando ativina A (Painel C) ou GDF-8 (Painel D); marcadores ao final da terceira etapa de diferenciação para tratamentos combinando ativina A (Painel E) ou GDF-8 (Painel F); marcadores ao final da quarta etapa de diferenciação para tratamentos combinando ativina A (Painel G) ou GDF-8 (Painel H); marcadores ao final da quinta etapa de diferenciação para tratamentos combinando ativina A (Painel I) ou GDF-8 (Painel J). Na conclusão da quinta etapa de diferenciação, realizou-se uma análise de alto conteúdo para medir os números de células recuperadas para os tratamentos correspondentes durante a primeira etapa de diferenciação usando ativina A (Painel K) ou GDF-8 (Painel Μ). A análise de alto conteúdo foi, também, usada para medir a intensidade de glucagon e insulina nas populações de células recuperadas ao final da quinta etapa de diferenciação, correspondente ao tratamento com ativina A (Painel L) ou
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GDF-8 (Painel N) durante a primeira etapa de diferenciação.
A figura 22 mostra a expressão de vários marcadores de proteína e RT-PCR em células tratadas de acordo com os métodos descritos no Exemplo 18. As células H1 foram tratadas com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8 durante um total de três dias, em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a durante o primeiro dia, ou 2,5 μΜ de Composto 40, ou
2,5 μΜ de Composto 202, somente no primeiro dia. A figura 22, painel A mostra a análise de FACS quanto ao marcador de endoderma definitivo, CXCR4, em células após a primeira etapa de diferenciação. A expressão de CXCR4 foi medida com o uso de uma sonda de anticorpo fluorescente e citometria de fluxo, produzindo as porcentagens de células positivas conforme mostrado. Na figura 22, painel B, valores normalizados de RTPCR para vários marcadores de diferenciação em células recuperadas após a quarta etapa de diferenciação são mostrados correspondendo aos respectivos tratamentos usando ativina A/Wnt3a, ou GDF-8/Composto 40, ou GDF-8/Composto 202, durante a primeira etapa de diferenciação.
A figura 23 mostra o teor de peptídeo C detectado em camundongos SCID beges que receberam células ao final da quarta etapa do protocolo de diferenciação, conforme descrito no Exemplo 18.
A figura 24, painel A, mostra a expressão de CXCR4, conforme determinado por FACS, em células ao final da primeira etapa do protocolo de diferenciação descrito no Exemplo 19. O painel B mostra a expressão de vários genes, conforme determinado por RT-PCR em células ao final da quarta etapa do protocolo de diferenciação descrito no Exemplo 19. São mostradas duas réplicas experimentais diferentes (Rep-1 e Rep-2), cada qual submetida a protocolos de tratamento idênticos. O painel C mostra o teor de peptídeo C detectado em camundongos SCID beges que receberam células ao final da etapa quatro do protocolo de diferenciação, conforme tratado com GDF-8 e Wnt3a durante a primeira etapa da diferenciação in vitro. O painel D mostra o teor de peptídeo C detectado em camundongos SCID beges que receberam células ao final da etapa quatro do protocolo de diferenciação, conforme tratado com GDF-8 e Composto 28 durante a
17/247 primeira etapa da diferenciação in vitro.
A figura 25 mostra o número de células (painel A) e a expressão de CXCR4 (painel B) oriundos de células cultivadas em microesferas portadoras, tratadas de acordo com os métodos da presente invenção, conforme descrito no Exemplo 22. As células foram cultivadas sobre microesferas de Cytodex3 sem tratamento (não diferenciadas), ou com tratamento combinando 100 ng/mL de ativina A com 20 ng/mL de Wnt3a (AA/Wnt3a), ou com vários tratamentos combinando GDF-8, conforme mostrado: 50 ng/mL de GDF-8 com 2,5 μΜ de Composto 34 (Cmp 34+8); ou 50 ng/mL de GDF-8 com 2,5 μΜ de Composto 34 e 50 ng/mL de PDGF (Cmp 34+8+D); ou 50 ng/mL de GDF-8 com 2,5 μΜ de Composto 34, 50 ng/mL de PDGF e 50 ng/mL de VEGF (Cmp 34+8+D+V); ou 50 ng/mL de GDF-8 com 2,5 μΜ de Composto 34, 50 ng/mL de PDGF, 50 ng/mL de VEGF e 20 ng/mL de muscimol (Cmp 34+8+D+V+M).
A figura 26 mostra a proliferação de células em seguida ao tratamento dos compostos da presente invenção, conforme descrito no Exemplo 23. Os painéis B a I mostram resultados de teste para tratamento com o uso de um composto em combinação com GDF-8 e medindo-se as leituras de MTS OD a 1 dia, 2 dias e 3 dias após o início do teste de diferenciação.
A figura 27 mostra a expressão de várias proteínas e genes oriundos de células cultivadas em microesferas portadoras, tratadas de acordo com os métodos da presente invenção. O painel A mostra a porcentagem de expressão positiva de CXCR4, CD99 e CD9, conforme determinado por FACS em células ao final da primeira etapa do protocolo de diferenciação descrito no Exemplo 24. O painel B mostra células recuperadas de tratamentos conforme mostrado, diferenciadas através da etapa três do protocolo de diferenciação. O painel C mostra os valores de ddCT para vários marcadores genéticos expressos nas células tratadas conforme mostrado na etapa, e diferenciado através da etapa três do protocolo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Com propósitos de esclarecimento da descrição, e sem propó18/247 sitos de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas subseções a seguir que descrevem ou ilustram determinadas características, modalidades ou aplicações da presente invenção.
Definições
Células-tronco são células não diferenciadas definidas por sua capacidade, em nível unicelular, tanto para autorrrenovação como para diferenciação a fim de produzir células-progênie, inclusive progenitoras autorrenováveis, progenitoras não renováveis e células terminalmente diferenciadas. As células-tronco são também caracterizadas por sua capacidade de se diferenciar, in vitro, em células funcionais de várias linhagens celulares de múltiplas camadas germinativas (endoderma, mesoderma e ectoderma), bem como por sua capacidade de originar, após transplante, tecidos de múltiplas camadas germinativas e de contribuir substancialmente para a maioria, senão todos, dos tecidos após a injeção em blastocistos.
As células-tronco são classificadas de acordo com seu potencial de desenvolvimento como: (1) totipotentes, o que significa que são capazes de dar origem a todos os tipos de células embrionárias e extraembrionárias; (2) pluripotentes, o que significa que são capazes de dar origem a todos os tipos de célula embrionária; (3) multipotentes, o que significa que são capazes de dar origem a um subconjunto de linhagens celulares, porém todos dentro de um tecido, órgão ou sistema fisiológico específico (por exemplo, células-tronco hematopoiéticas (HSC) podem produzir progênie que inclui HSC (autorrenovação), progenitoras oligopotentes restritas a células sanguíneas e todos os tipos de células e elementos (por exemplo, plaquetas) que são componentes normais do sangue); (4) oligopotentes, o que significa que são capazes de dar origem a subconjuntos de linhagens celulares mais restritos que aqueles das células-tronco multipotentes; e (5) unipotentes, o que significa que são capazes de dar origem a uma única linhagem celular (por exemplo, células-tronco espermatogênicas).
A diferenciação é o processo pelo qual uma célula não especializada (não comprometida) ou menos especializada adquire as características de uma célula especializada, como uma célula nervosa ou muscular.
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Uma célula diferenciada ou induzida por diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada (comprometida) dentro da linhagem de uma célula. O termo comprometida, quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que avançou na rota de diferenciação até um ponto em que, sob circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo específico de célula, ou em um subconjunto de tipos de célula, e não poderá, sob circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente, ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado. A desdiferenciação refere-se ao processo pelo qual uma célula reverte a uma posição menos especializada (ou menos comprometida) dentro da linhagem celular. Para uso na presente invenção, a linhagem de uma célula define a hereditariedade da mesma, isto é, de quais células se originou e a quais células pode dar origem. A linhagem de uma célula a coloca dentro de um esquema hereditário de desenvolvimento e diferenciação. Um marcador específico de linhagem refere-se a uma característica especificamente associada ao fenótipo das células de uma linhagem em questão, e pode ser usado para avaliar a diferenciação de uma célula não comprometida em relação à linhagem em questão.
A expressão linhagem de células β refere-se a células com expressão gênica positiva para o fator de transcrição PDX-1 e pelo menos um dentre os seguintes fatores de transcrição: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 beta, MAFA, PAX4 ou PAX6. Células que expressam marcadores característicos da linhagem de célula β incluem células β.
A expressão células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, ou células em Estágio 1, ou Estágio 1, para uso na presente invenção, refere-se a células que expressam pelo menos um dentre os seguintes marcadores: SOX17, GATA4, HNF-3 beta, GSC, CER1, Nodal, FGF8, braquiúria, proteína homeobox similar a Mix, FGF4 CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 ou OTX2. Células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo incluem
20/247 células precursoras da linha primitiva, células da linha primitiva, células de mesendoderma e células do endoderma definitivo.
A expressão células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático, para uso na presente invenção, refere-se a células que expressam pelo menos um dentre os seguintes marcadores: PDX1, HNF-1 beta, PTF1 alfa, HNF6 ou HB9. Células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática incluem células endodérmicas pancreáticas, células do tubo intestinal primitivo, e células do trato digestivo superior posterior.
A expressão células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, ou células em Estágio 5, ou Estágio 5, para uso na presente invenção, refere-se a células que expressam pelo menos um dentre os seguintes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 ou PTF-1 alfa. As células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática incluem células pancreáticas endócrinas, células pancreáticas expressoras de hormônio e células pancreáticas secretoras de hormônio, bem como células da linhagem de células β.
A expressão endoderma definitivo, para uso na presente invenção, refere-se a células que apresentam as características de células oriundas do epiblasto durante a gastrulação, e que formam o trato gastrointestinal e seus derivados. As células de endoderma definitivo expressam os seguintes marcadores: HNF-3 beta, GATA4, SOX-17, Cerberus, OTX2, goosecoide, C-Kit, CD99 ou MIXL1.
A expressão endoderma extraembrionário, para uso na presente invenção, refere-se a uma população de células que expressam pelo menos um dentre os seguintes marcadores: SOX7, AFP ou SPARC.
Marcadores, para uso na presente invenção, são moléculas de ácido nucléico ou polipeptídeo que são expressas diferencialmente em uma célula de interesse. Nesse contexto, expressão diferencial significa um nível aumentado para um marcador positivo e um nível diminuído para um marcador negativo. O nível detectável do ácido nucléico ou polipeptídeo do
21/247 marcador é suficientemente maior ou menor nas células em questão, em comparação com outras células, de modo que a célula em questão pode ser identificada e distinguida de outras células com o uso de qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
A expressão célula de mesendoderma, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dentre os seguintes marcadores: CD48, eomesodermina (EOMES), SOX17, DKK4, HNF-3 beta, GSC, FGF17 ou GATA-6.
Os termos célula pancreática endócrina, ou célula que expressa hormônio pancreático, para uso na presente invenção, referem-se a uma célula capaz de expressar pelo menos um dentre os seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostatina e polipeptídeo pancreático.
A expressão célula de endoderma pancreático, ou células em Estágio 4, ou Estágio 4, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de expressar pelo menos um dentre os seguintes marcadores: NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, PAX4 ou NKX2.2.
Célula produtora de hormônio pancreático, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de produzir pelo menos um dos seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostatina, e polipeptídeo pancreático.
A expressão célula pancreática secretora de hormônio, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de secretar pelo menos um dentre os seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostatina e polipeptídeo pancreático.
A expressão célula posterior do intestino anterior, ou células em Estágio 3, ou Estágio 3, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de secretar pelo menos um dentre os seguintes marcadores: PDX1, HNF1, PTF-1 alfa, HNF6, HB-9 ou PROX-1.
Célula pré-linha primitiva, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dos seguintes marcadores: Nodal, ou FGF8.
A expressão célula do tubo intestinal primitivo, ou células em
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Estágio 2, ou Estágio 2, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula capaz de secretar pelo menos um dentre os seguintes marcadores:
HNF1, HNF-4 alfa.
Célula da linha primitiva, para uso na presente invenção, refere-se a uma célula que expressa pelo menos um dos seguintes marcadores: Brachyury, proteína Mix-like homeobox, ou FGF4.
Isolamento, expansão e cultura de células-tronco pluripotentes
Caracterização de células-tronco pluripotentes
A pluripotência das células-tronco pluripotentes pode ser confirmada, por exemplo, injetando-se as células em camundongos com imunodeficiência combinada grave (SCID), fixando-se os teratomas que se formam com o uso de 4% de paraformaldeído e, então, examinando-os histologicamente quanto a evidências dos tipos de célula oriundos das três camadas germinativas. Alternativamente, a pluripotência pode ser determinada criando-se corpos embroides e avaliando-os quanto à presença de marcadores associados às três camadas germinais.
As linhagens de células-tronco pluripotentes propagadas podem ser submetidas a cariotipagem com o uso de uma técnica-padrão de bandamento G, sendo então comparadas aos cariótipos publicados das espécies de primata correspondentes. É desejável a obtenção de células que tenham um cariótipo normal, o que significa que as células são euploides, em que todos os cromossomos humanos estão presentes e sem alterações perceptíveis.
Fontes de células-tronco pluripotentes
Os tipos de células-tronco pluripotentes que podem ser usados incluem linhagens estabelecidas de células pluripotentes derivadas de tecido formado após a gestação, inclusive tecido pré-embrionário (como um blastocisto), tecido embrionário ou tecido fetal coletado a qualquer tempo durante a gestação, tipicamente porém não necessariamente antes de aproximadamente 10 a 12 semanas de gestação. Alguns exemplos não limitadores consistem em linhagens estabelecidas de células-tronco embrionárias humanas ou células germinativas embrionárias humanas, como as
23/247 linhagens de célula-tronco embrionária humana H1, H7 e H9 (WiCell). É também contemplado o uso das composições desta descrição durante o estabelecimento inicial ou a estabilização dessas células, caso no qual as células-fonte seriam células pluripotentes primárias coletadas diretamente dos tecidos-fonte. São adequadas, também, as células coletadas de uma população de células-tronco pluripotentes já cultivadas na ausência de células mantenedoras. São adequadas, também, as linhagens de célulatronco embrionária humana mutantes, como BG01v (BresaGen, Athens, GA, EUA).
Em uma modalidade, as células-tronco embrionárias humanas são preparadas conforme descrito por Thomson et al. (patente US n° 5.843.780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92:7844, 1995).
Em uma modalidade, as células-tronco pluripotentes são preparadas conforme descrito por Takahashi et al. (Cell 131: 1-12, 2007).
Cultura de células-tronco pluripotentes
Em uma modalidade, as células-tronco pluripotentes são tipicamente cultivadas sobre uma camada de células alimentadoras que de várias maneiras oferecem suporte às células-tronco pluripotentes. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes são cultivadas em um sistema de cultura que é essencialmente isento de células nutrizes mas que, mesmo assim, suporte a proliferação de células-tronco pluripotentes sem que ocorra uma diferenciação substancial. A proliferação de células-tronco pluripotentes em um meio de cultura isento de células nutrizes sem diferenciação é suportado com o uso de um meio condicionado pelo cultivo prévio com outro tipo de célula. Alternativamente, o crescimento de células-tronco pluripotentes em meio de cultura isento de células nutrizes sem diferenciação é suportado com o uso de um meio quimicamente definido.
As células-tronco pluripotentes podem ser aplicadas sobre um substrato de cultura adequado. Em uma modalidade, o substrato de cultura adequado é um componente de matriz extracelular, como aqueles derivados de membrana basal, que possa fazer parte dos acoplamentos receptor
24/247 ligante das moléculas de adesão. Em uma modalidade, o substrato de cultura adequado consiste em MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® é uma preparação solúvel feita a partir de células tumorais Engelbreth-Holm-Swarm, que se gelifica à temperatura ambiente para formar uma membrana basal reconstituída.
Outros componentes e misturas de componentes de arranjo extracelular são adequados como alternativa. Dependendo do tipo de célula sendo submetido à proliferação, isto pode incluir laminina, fibronectina, proteoglicano, entactina, sulfato de heparano, e similares, sozinhos ou em várias combinações.
As células-tronco pluripotentes podem ser aplicadas sobre o substrato em uma distribuição adequada e na presença de um meio que promova a sobrevivência, a propagação e a retenção das características desejáveis. Todas essas características se beneficiam da cuidadosa atenção à distribuição da semeadura, e podem ser prontamente determinadas pelo versado na técnica.
O meio de cultura adequado pode ser produzido a partir dos seguintes componentes, como o meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM), Gibco n° 11965-092; meio Eagle modificado Knockout da Dulbecco (KO DMEM), Gibco n° 10829-018; meio basal DMEM F12/50% da Ham; 200 mM de L-glutamina, Gibco n° 15039-027; solução de aminoâcidos não essenciais, Gibco 11140-050; β-mercapto etanol, Sigma n° M7522; fator de crescimento de fibroblastos básico recombinante humano (bFGF), Gibco n° 13256-029.
Formação de células produtoras de hormônio pancreático a partir de células-tronco pluripotentes
Em uma modalidade, a presente invenção apresenta um método para produção de células produtoras de hormônio pancreático a partir de células-tronco pluripotentes, compreendendo as etapas de:
a. cultivar células-tronco pluripotentes,
b. diferenciar as células-tronco pluripotentes nas células que expressam características de marcadores da linhagem endodérmica
25/247 definitiva,
c. diferenciar as células que expressam características de marcadores da linhagem endodérmica definitiva em células que expressam características de marcadores da linhagem endodérmica pancreática, e
d. diferenciar as células que expressam características de marcadores da linhagem endodérmica pancreática em células que expressam características de marcadores da linhagem endodérmica pancreática.
Em um aspecto da presente invenção, a célula pancreática endócrina é uma célula produtora de hormônio pancreático. Em um aspecto alternativo, a célula pancreática endócrina é uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem de células β. Uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem de células β expressa PDX1 e pelo menos um dentre os seguintes fatores de transcrição: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF-3 beta, MAFA, PAX4 ou Pax6. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem de células β é uma célula β.
As células-tronco pluripotentes adequadas ao uso na presente invenção incluem, por exemplo, a linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (código NIH: WA09), a linhagem H1 de células-tronco embrionárias humanas (código NIH: WA01), a linhagem H7 de células-tronco embrionárias humanas (código NIH: WA07) e a linhagem SA002 de célulastronco embrionárias humanas (Cellartis, Suécia). São adequadas ao uso na presente invenção, também, as células que expressam pelo menos um dentre os seguintes marcadores característicos de células pluripotentes: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, Conexina43, Conexina45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, ou Tra1-81.
As células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas sobre uma camada de células nutrizes. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas sobre uma matriz extracelular. A matriz extracelular pode consistir em uma preparação de membrana basal solubilizada, extraída de células de sarcoma de camundongo (conforme vendida pela BD Biosciences sob o nome comercial de MATRIGEL®). Alternativamente, a
26/247 matriz extracelular pode consistir em MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento. Alternativamente, a matriz extracelular pode consistir em fibronectina. Em uma modalidade alternativa, as células-tronco pluripotentes são cultivadas e diferenciadas sobre substrato para cultura de tecidos revestido com soro humano.
O arranjo extracelular pode ser diluída antes do revestimento do substrato para cultura de tecidos. Exemplos de métodos adequados para diluição da matriz extracelular e para revestimento do substrato para cultura de tecidos podem ser encontrados em Kleinman, H.K., et al., Biochemistry 25:312 (1986), e em Hadley, M.A., et al., J.Cell.Biol. 101:1511 (1985).
Em uma modalidade, a matriz extracelular consiste em MATRIGEL®. Em uma modalidade, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® a uma diluição de 1:10. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® a uma diluição de 1:15. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® a uma diluição de 1:30. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® a uma diluição de 1:60.
Em uma modalidade, a matriz extracelular consiste em MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento. Em uma modalidade, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento a uma diluição de 1:10. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento a uma diluição de 1:15. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento a uma diluição de 1:30. Em uma modalidade alternativa, o substrato para cultura de tecidos é revestido com MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento a uma diluição de 1:60.
Marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são selecionados a partir do grupo consistindo em SOX17, GATA4, 3HNF-, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, proteína Mix-like homeobox, FGF4
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CD48, eomesodermina (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, e OTX2. Uma célula que expressa pelo menos um dos marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo é adequada para uso na presente invenção. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula precursora da linha primitiva. Em um aspecto alternativo, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula do mesendoderma. Em um aspecto alternativo, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo é uma célula do endoderma definitivo.
Os marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático são selecionados a partir do grupo consistindo em PDX1, HNF-1 beta, PTF1 alfa, HNF6, HB9 e PROX1. Uma célula que expressa pelo menos um dos marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática é adequada para uso na presente invenção. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem do endoderma pancreático é uma célula do endoderma pancreático.
Os marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática são selecionados a partir do grupo consistindo em NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4 e PTF-1 alfa. Em uma modalidade, uma célula pancreática endócrina é capaz de expressar pelo menos um dentre os seguintes hormônios: insulina, glucagon, somatostatina e polipeptídeo pancreático. É adequada ao uso na presente invenção uma célula que expressa pelo menos um dos marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática. Em um aspecto da presente invenção, uma célula que expressa marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática é uma célula pancreática endócrina. A célula pancreática endócrina pode ser uma célula pancreática que expressa de hormônio. Alternativamente, a célula pancreática endócrina pode ser uma célula pancreática secretora de hormônio.
Formação de células que expressam marcadores característicos
28/247 da linhagem de endoderma definitivo
Em um aspecto da presente invenção, as células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo mediante cultivo das células-tronco pluripotentes em um meio compreendendo uma quantidade suficiente de GDF-8 para causar a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
As células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia a cerca de sete dias. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia a cerca de seis dias. Alternativamente, as célulastronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia a cerca de cinco dias. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia a cerca de quatro dias. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF8 durante cerca de um dia a cerca de três dias. Alternativamente, as célulastronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia a cerca de dois dias. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser cultivadas no meio contendo uma quantidade suficiente de GDF-8 durante cerca de um dia.
Em uma modalidade, o GDF-8 é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o GDF-8 é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o GDF-8 é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 25 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o GDF-8 é usado a uma concentração de cerca de 25 ng/mL.
Em uma modalidade, o meio compreendendo uma quantidade suficiente de GDF-8 também contém pelo menos um outro fator. Em uma
29/247 modalidade, o pelo menos um outro fator é selecionado do grupo consistindo em: EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, VEGF, muscimol,
PD98059, LY294002, U0124, U0126 e butirato de sódio.
Em uma modalidade, o EGF é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o EGF é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o EGF é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o FGF4 é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o FGF4 é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o FGF4 é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o PDGF-A é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-A é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-A é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o PDGF-B é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-B é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-B é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o PDGF-C é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-C é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-C é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o PDGF-D é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-D é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o PDGF-D é usado a uma
30/247 concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o VEGF é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 500 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o VEGF é usado a uma concentração de cerca de 5 ng/mL a cerca de 50 ng/mL. Em uma modalidade alternativa, o VEGF é usado a uma concentração de cerca de 50 ng/mL.
Em uma modalidade, o muscimol é usado a uma concentração de cerca de 1 pM a cerca de 200 pM. Em uma modalidade alternativa, o muscimol é usado a uma concentração de cerca de 1 pM a cerca de 20 pM. Em uma modalidade alternativa, o muscimol é usado a uma concentração de cerca de 20 pM.
Em uma modalidade, o PD98059 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pM a cerca de 10 pM. Em uma modalidade alternativa, o PD98059 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pMa cerca de 1 pM. Em uma modalidade alternativa, o PD98059 é usado a uma concentração de cerca de 1 pM.
Em uma modalidade, o LY294002 é usado a uma concentração de cerca de 0,25 pM a cerca de 25 pM. Em uma modalidade alternativa, o LY294002 é usado a uma concentração de cerca de 0,25 pM a cerca de 2,5 pM. Em uma modalidade alternativa, o LY294002 é usado a uma concentração de cerca de 2,5 pM.
Em uma modalidade, o U0124 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pM a cerca de 10 pM. Em uma modalidade alternativa, o U0124 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pMa cerca de 1 pM. Em uma modalidade alternativa, o U0124 é usado a uma concentração de cerca de 1 pM.
Em uma modalidade, o U0126 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pM a cerca de 10 pM. Em uma modalidade alternativa, o U0126 é usado a uma concentração de cerca de 0,1 pM a cerca de 1 pM. Em uma modalidade alternativa, o U0126 é usado a uma concentração de cerca de 1 pM.
Em uma modalidade, o butirato de sódio é usado a uma
31/247 concentração de cerca de 0,05 μΜ a cerca de 5 μΜ. Em uma modalidade alternativa, o butirato de sódio é usado a uma concentração de cerca de 0,05 μΜ a cerca de 0,5 μΜ. Em uma modalidade alternativa, o butirato de sódio é usado a uma concentração de cerca de 0,5 μΜ.
Em uma modalidade alternativa, esse pelo menos um outro fator é selecionado do grupo consistindo em: uma anilina-piridinotriazina, uma anilina-piridinotriazina cíclica, N-{[1-(fenil metil)azepan-4-il]metil}-2-piridin-3ilacetamida, 4-{[4-(4-{[2-(piridin-2-ilamino)etil]amino}-1,3,5-triazin-2-il)piridin2-il]óxi}butan-1 -ol, 3-({3-[4-({2-[metil(piridin-2-il)amino]etil}amino)-1,3,5triazin-2-il]piridin-2-il}amino)propan-1-ol, N~4~-[2-(3-fluorofenil)etil]-N~2~-[3(4-metil piperazin-1-il)propil]pirido[2,3-d]pirimidina-2,4-diamina, 1-metil-N-[(4piridin-3-il-2-{[3-(trifluorometil)fenil]amino}-1,3-tiazol-5-il)metil]piperidina-4carboxamida, {2-[4-({5-[3-(3-hid róxi propil)fenil]-4H-1,2,4-triazol-3-il}amino)fenil]etil}carbamato de 1,1-dimetiletila, {[3-({5-[5-(3-hidróxi propil)-2(metilóxi)fenil]-1,3-oxazol-2-il}amino)fenil]metil}carbamato de 1,1-dimetiletila, 1-({5-[6-({4-[(4-metil piperazin-1-il)sulfonil]fenil}amino)pirazin-2-il]tiofen-2i IJmeti l)p i perid i n-4-ol, 1 -({4-[6-({4-[(4-metil piperazin-1 -il)sulfonil]fenil}amino)pirazin-2-il]tiofen-2-il}metil)piperidina-4-carboxamida, e 2-{[4-( 1 metiletil)fenil]amino}-N-(2-tiofen-2-iletil)-7,8-diidropirido[4,3-d]pirimidina6(5H)-carboxamida.
Os compostos da presente invenção
A presente invenção apresenta compostos que são capazes de diferenciar células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Em uma modalidade, o composto que é capaz de diferenciar células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo é uma anilina-piridinotriazina com a Fórmula (1):
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Figure BRPI0914116A2_D0001
As formas de N-óxido, os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereoquimicamente isoméricas da mesma, em que:
m representa um número inteiro de 1 a 4; n representa um número inteiro de 1 a 4; Z representa N ou C;
cada um dentre R1 e R8 representa, independentemente, hidrogênio, Het14, ciano, halo, hidróxi, Ci^alcóxi-, Ci^alquil-, mono ou di(C-|. 4alquil)amino-carbonil-, mono ou di(Ci^alquil)amino-sulfonila, Ci^alcóxisubstituído com halo ou R1 representa C^alquila substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidróxi ou halo;
cada um dentre R2 e R9 representa, independentemente, hidrogênio, Ci^alquila, C2^alquenila, Het3, Het4-Ci^alquil-, Het5-Ci_ 4alquilcarbonil-, mono ou d^C^alquiOamino-Ci^alquil-carbonil- ou fenila opcionalmente substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, amino ou Ci_ 4alquilóxi-;
cada um dentre R3 e R7 representa, independentemente, hidrogênio, Ci^alquila, Het6, Hef-C^alquil-, C2^alquenilcarbonil-opcionalmente substituído com Het8-C1^alquilaminocarbonil-, C2^alquenilsulfonil-, 4alquilóxi, Ci^alquil- ou fenila opcionalmente substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, amino ou Ci^alquilóxi-;
cada um dentre R4, R5, R6 e R10 representa, independentemente, hidrogênio ou C^alquila opcionalmente substituído com hidróxi, Het9 ou Ci^alquilóxi;
cada um dentre Het1 e Het2 representa, independentemente, um
33/247 heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que os ditos Het1 e Het2 são, opcionalmente, substituídos com amino, hidróxi, Cv 4alquila, hidróxi-CMalquil-, fenila, fenil-C^alquil-, Ci^alquil-óxi-Ci^alquilmono ou di(Ci^alquil) amino- ou amino-carbonil-;
cada um dentre Het3 e Het6 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila ou piperidinila, sendo que os ditos Het3 e Het6 são, opcionalmente, substituídos com um ou, quando possível, dois ou mais substítuintes selecionados de Ci^alquila, C3_ 6cicloalquila, hidróxi-C^alquil-, Ci^alquilóxi C^alquila ou poliidróxi-Cv 4alquil-;
cada um dentre Het4, Het7 e Het9 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperidinila, sendo que os ditos Het4, Het7 e Het9 são, opcionalmente, substituídos com um ou, quando possível, dois ou mais substítuintes selecionados de Ci^alquila, C3^cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, Ci^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-;
Het5 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperidinila, sendo que o dito Het5 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substítuintes selecionados a partir de C^alquila, C3.6cicloalquila, hidróxi-Ci_ 4alquil-, Ci^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-;
cada um dentre Het10, Het11 e Het13 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que os ditos Het10, Het11 e Het13 são, opcionalmente, substituídos com amino, hidróxi, CMalquila, hidróxi-C^alquil-, fenila, fenil-C^alquil-, Ci. 4alquil-óxi-Ci^alquil-, amino-carbonil- ou mono ou di(C-i^alquil)amino-;
Het12 representa um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que o dito Het12 é, opcionalmente, substituído com amino, hidróxi, CMalquila, hidróxi-C^alquil-, fenila, fenil-C^alquil-, ϋμ
34/247 4alquil-0xi-Ci^alquil-; mono ou di(Ci^alquil)amino- ou amino-carbonil-;
Het14 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila, imidazolila, pirrolila, 2,3,4-triazapirrolila,
1,2,3-triazolila, pirazolila ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de C^alquila, C^cicloalquila, hidróxi-C^alquil-, Ci^alquilóxi C^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-; particularmente, Het14 representa urn heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, pirrolila, 2,3,4-triazapirrolila, piperazinila ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de Ci^alquila, C3^cicloalquila, hidróxi-Ci_ 4alquil-, Ci^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-; mais particularmente, Het14 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de C^alquila, C^cicloalquila, hidróxi-C^alquil-, Ci 4alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci_4alquil-.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (1).
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (2).
Figure BRPI0914116A2_D0002
Fórmula (2): ácido 3-{3-[(4-piridin-3-il-1,3,5-triazin-2-il)amino]feniljpropanoico. Chamado, na presente invenção, de Composto 1.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
35/247
Fórmula (3).
Figure BRPI0914116A2_D0003
Fórmula (3): 2-{3-[(4-piridin-3-il-1,3,5-triazin-2-il)amino]fenil}etanol. chamado, na presente invenção, de Composto 2.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Fórmula (4).
Figure BRPI0914116A2_D0004
Fórmula (4): {2-[3-({4-[2-(3-hidroxiprop-1 -in-1 -il)piridin-4-il]-1,3,5triazin-2-il}amino)fenil]etil}carbamato de 1,1-dimetiletila. Chamado, na 10 presente invenção, de Composto 3.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (5).
Figure BRPI0914116A2_D0005
Fórmula (5): {4-[4-(4-{[3-(hidroximetil)fenil]amino}-1,3,5-triazin-2
36/247 il)piridin-2-il]butil}carbamato de 1,1 -dimetiletila. Chamado, na presente invenção, de Composto 4.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (6).
Figure BRPI0914116A2_D0006
Fórmula (6): {3-[{[5-(2-{[3-bromo-5-(hidroximetil)fenil]amino}pirimidin-4-il)-2-(metilóxi)fenil]metil}(metil)amino]propil}carbamato de 1,1-dimetiletila. Chamado, na presente invenção, de Composto 5.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Figure BRPI0914116A2_D0007
Fórmula (7): ácido 4-{[3-(3-fluorofenil)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5d]pirimidin-5-il]amino}benzoico. Chamado, na presente invenção, de 15 Composto 6.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Fórmula (8).
37/247
Figure BRPI0914116A2_D0008
Fórmula (8): ácido 2-fluoro-5-[(3-fenil-3H-[1,2,3]triazolo[4,5d]pirimidin-5-il)amino]benzoico. Chamado, na presente invenção, de Composto 7.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Fórmula (9).
Figure BRPI0914116A2_D0009
Fórmula (9): N-{[3-(5-{[3-(2-aminopirimidin-4-il)fenil]amino}-3H[1,2,3]triazolo[4,5-d]pirimidin-3-il)fenil]metil}ciclopropanocarboxamida.
Chamado, na presente invenção, de Composto 8.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Fórmula (10).
Figure BRPI0914116A2_D0010
Fórmula (10): 4-[(1-ciclo-hexil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-615 il)amino]-N-[3-(metilóxi)propil]benzenossulfonamida. Chamado, na presente invenção, de Composto 9.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (11).
38/247
OH
Figure BRPI0914116A2_D0011
Cl
Fórmula (11): 4-cloro-2-[(6-{[3-(clorometil)-4-metoxifenil]amino}pirimidin-4-il)amino]fenol. Chamado, na presente invenção, de Composto 10.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da
Fórmula (12).
Figure BRPI0914116A2_D0012
Fórmula (12): 4-{[4-(4-metil-3,4-di-hidroquinoxalin-1 (2 H)-il)pirimidin-2-il]amino}-N-(1-metilpiperidin-4-il)benzamida. Chamado, na presente 10 invenção, de Composto 11
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina é um composto da Fórmula (13).
Figure BRPI0914116A2_D0013
Fórmula (13): N-(2-metóxi-4-{[(3-metóxi propil)amino]metil}fenil)15 4-(1H-pirrolo[2,3-b]piridin-3-il)pirimidin-2-amina. Chamado, na presente invenção, de Composto 12.
Em uma modalidade, o composto que é capaz de diferenciar células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores caracte
39/247 rísticos da linhagem de endoderma definitivo é uma anilina-piridinotriazina cíclica com a Fórmula (14):
Figure BRPI0914116A2_D0014
1 Fórmula (14).
As formas de N-óxido, os sais de adição farmaceuticamente aceitáveis e as formas estereoquimicamente isoméricas da mesma, em que:
m representa um número inteiro de 1 a 4; n representa um número inteiro de 1 a 4; Z representa N ou C;
Y representa -NR2-Ci_6alquil-CO-NR4-, -Ci^alkyl-NR9-Ci^alquil-, Ci_6alquil-CO-Het10-, -Het11-CO-Ci^alquil-, -Het12-C^alquil-, -CO-Het13-Ci_ 6alquil-, -CO-NR10-CV6alquil-, -Het1-Ci^alquil-CO-NR5-, or-Het^CO-NR6-, sendo que o ligante -Ci^alquil- em -NR2-C1 6alquil-CO-NR4- ou -Het1-Ci_ ealquil-CO-NR5- é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de hidróxi, metóxi, amino carbonila, halo, fenila, indolila, sulfeto de metila, tiol, hidróxi fenila, cianofenila, amino e hidroxicarbonila;
X1 representa uma ligação direta, Ci^alquila, Ci^alquilóxi-, Ci4alquil-CO-, C^alquenila, C2-4alquinila, ou Ci^alquil-NR3-, sendo que a dita Ci^alquila ou C^alquenila é, opcionalmente, substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes halo;
X2 representa uma ligação direta, Ci^alquila, C^alquilóxi-, Ci. 4alquil-CO-, C^alquenila, C2^alquinila, ou C^alquil-NR7-, sendo que a dita Cí^alquila ou C^alquenila é, opcionalmente, substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes halo;
cada um dentre R1 e R8 representa, independentemente,
40/247 hidrogênio, Het14, ciano, halo, hidróxi, Ci^alcóxi-, Ci^alquil-, mono ou di(Ci. 4alquil)amino-carbonil-, mono ou di(Ci^alquil)amino-sulfonila, C^alcóxisubstituído com halo ou R1 representa Ci^alquila substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidróxi ou halo;
cada um dentre R2 e R9 representa, independentemente, hidrogênio, Ci^alquila, C2^alquenila, Het3, Het4-Ci^alquil-, Het5-Ci^alquil carbonil-, mono ou di(C1^alquil)amino-Ci^alquil-carbonil- ou fenila opcionalmente substituída com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, amino ou Ci^alquilóxi-;
cada um dentre R3 e R7 representa, independentemente, hidrogênio, C^alquila, Het6, Hef-C^alquil-, C2^alquenilcarbonil-opcionalmente substituído com He^-C^alquilaminocarbonil-, C24alquenilsulfonil-, Ci_ 4alquilóxi, Ci^alquil- ou fenil opcionalmente substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de hidrogênio, hidróxi, amino ou C^alquilóxi-;
cada um dentre R4, R5, R6 e R10 representa, independentemente, hidrogênio ou C^alquila opcionalmente substituído com hidróxi, Het9 ou Ci_4alquilóxi;
cada um dentre Het1 e Het2 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que os ditos Het1 e Het2 são, opcionalmente, substituídos com amino, hidróxi, 4alquila, hidróxi-Ci^alquil-, fenila, fenil-Ci^alquil-, Ci^alquil-óxi-Ci^alquilmono ou di(Ci^alquil) amino- ou amino-carbonil-;
cada um dentre Het3 e Het6 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila ou piperidinila, sendo que os ditos Het3 e Het6 são, opcionalmente, substituídos com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de C^alquila, C3_6cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, C^alquilóxi C^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-;
cada um dentre Het4, Het7 e Het9 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, pipera41/247 zinila ou piperidinila, sendo que os ditos Het4, Het7 e Het9 são, opcionalmente, substituídos com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de Ci^alquila, C3^cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, C^alquilóxi
Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci^alquil-;
Het5 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila ou piperidinila, sendo que o dito Het5 é, opeionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados a partir de C^alquila, C3_6cicloalquila, hidróxi-Ci_ 4alquil-, C^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-C^alquil-;
cada um dentre Het10, Het11 e Het13 representa, independentemente, um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que os ditos Het10, Het11 e Het13 são, opeionalmente, substituídos com amino, hidróxi, Ci^alquila, hidróxi-Ci^alquil-, fenila, fenil-Ci^alquil-, Cv 4alquil-0xi-Ci^alquil-, amino-carbonil- ou mono ou d^C^alquiQamino-;
Het12 representa um heterociclo selecionado a partir de pirrolidinila, piperidinila, piperazinila, piridinila, pirimidinila, pirazinila, imidazolidinila ou pirazolidinila, sendo que o dito Het12 é, opeionalmente, substituído com amino, hidróxi, C-i^alquila, hidróxi-C-i^alquil-, fenila, fenil-Ci^alquil-, C-j. 4alquil-óxi-Ci^alquil-; mono ou di(Ci-4alquil)amino- ou amino-carbonil-;
Het14 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, piperazinila, imidazolila, pirrolila, 2,3,4-triazapirrolila, 1,2,3triazolila, pirazolila ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opeionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de Ci^alquila, C3^cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, C14alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci-^alquil-; particularmente, Het14 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila, pirrolidinila, pirrolila, 2,3,4triazapirrolila, piperazinila ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de Ci^alquila, C3_6cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, C^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-Ci_4alquil-; mais particularmente, Het14 representa um heterociclo selecionado a partir de morfolinila', pirrolidinila, piperazinila
42/247 ou piperidinila, sendo que o dito Het14 é, opcionalmente, substituído com um ou, quando possível, dois ou mais substituintes selecionados de Ci^alquila,
C3-6cicloalquila, hidróxi-Ci^alquil-, C^alquilóxi Ci^alquila ou poli-hidróxi-C-i4alquil-.
Os compostos de Fórmula (7) são descritos em W02007/003525, atribuída à Janssen Pharmaceutica N.V.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (14).
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (15).
Figure BRPI0914116A2_D0015
Fórmula (15): 1,8,10,12,17,19,23,27,33-nona-azapentaciclo[25.2.2.1 -3,7-.1 -9,13-.1-14,18~]tetratriaconta-3(34),4,6,9(33), 10,12, 14(32),15,17-nonaen-24-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 13.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (16).
Figure BRPI0914116A2_D0016
Fórmula (16): 10-cloro-14-etil-3,5,7,14,17,22,27-hepta-azatetraci
43/247 clo[19.3.1.1-2,6-.1-8,12~]heptacosa-1 (25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 14.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (17).
Figure BRPI0914116A2_D0017
Fórmula (17): 14-etil-3,5,7,14,17,27-hexa-azatetraciclo[19.3.1.1 -2,6-.1 -8,12~]heptacosa-1 (25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 15.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um 10 composto da Fórmula (18).
Figure BRPI0914116A2_D0018
Fórmula (18): 10-cloro-14-etil-3,5,7,14,17,27-hexa-azatetraciclo[19.3.1.1-2,6-.1-8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 16.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (19).
44/247
Figure BRPI0914116A2_D0019
Fórmula (19): 3,5,7,14,20,26,31-hepta-azapentaciclo[22.3.1.1 ~2,6~. 1 ~8,12~. 1 ~14,18~]hentriaconta-1 (28),2(31 ),3,5,8(30),9,
11,24,26-nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 5 17.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (20).
Figure BRPI0914116A2_D0020
Fórmula (20): (18S)-3,5,7,14,20,26,30-hepta-azapentaci10 clo[22.3.1.1~2,6~.1~8,12-0-14,18~]triaconta-1(28),2(30),3,5,8(29),9,11,
24,26-nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 18.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (21).
45/247
Figure BRPI0914116A2_D0021
Fórmula (21): 14-metil-3,5,7,14,18,24,28-hepta-azatetraciclo[20.3.1.1~2,6~.1~8,12~]octacosa-1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24nonaen-17-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 19.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (22).
Figure BRPI0914116A2_D0022
Fórmula (22): 14-metil-3,5,7,14,19,25,29-hepta-azatetraciclo[21.3.1.1 ~2,6~. 1-8,12~]nonacosa-1 (27),2(29),3,5,8(28),9,11,23,2510 nonaen-18-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 20.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (23).
Figure BRPI0914116A2_D0023
Fórmula (23):
14-metil-3,5,7,14,18,22,29-hepta-azatetraci46/247 clo[21.3.1.1-2,6-.1-8,12~]nonacosa-1(27),2(29),3,5,8(28),9,11,23,25nonaen-17-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 21.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (24).
Figure BRPI0914116A2_D0024
Fórmula (24): 1,8,10,12,16,22,30-hepta-azapentaciclo[22.2.2.1 -3,7-. 1-9,13-.1-14,18~]hentriaconta-3(31 ),4,6,9(30), 10,12, 14(29),15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 22.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (25).
Figure BRPI0914116A2_D0025
Fórmula (25): 1,8,10,12,16,22,26,32-octa-azapentaciclo[24.2.2.1 -3,7-. 1-9,13-.1-14,18~]tritriaconta-3(33),4,6,9(32), 10,12,
14(31),15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de
Composto 23.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (26).
47/247
Figure BRPI0914116A2_D0026
Fórmula (26): 5-cloro-17-fluoro-1,8,10,12,22,26,32-heptaazapentaciclo[24.2.2.1 -3,7-. 1-9,13-1-14,18~]tritriaconta-3(33),4,6,9(32), 10,12,14(31),15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de 5 Composto 24.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (27).
Figure BRPI0914116A2_D0027
Fórmula (27): 10-cloro-14-etil-22-fIuoro-3,5,7,14,17,27-hexa10 azatetraciclo[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]heptacosa-1(25),2(27),3,5,8(26),9, 11,21,23-nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 25.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (28).
48/247
Figure BRPI0914116A2_D0028
Fórmula (28): 10-cloro-25-fluoro-3,5,7,14,20,31-hexa-azapentaciclo[22.3.1.1~2,6~.1~8,12~.1~14,18~]hentriaconta-1(28),2(31),3,5,8(30),9,
11,24,26-nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 5 26.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (29).
Figure BRPI0914116A2_D0029
Fórmula (29): 4-cloro-1,8,10,12,17,22,26,32-octa-azapentaciclo[24.2.2.1 -3,7-.1 ~9,13~. 1-14,18~]tritriaconta-3(33),4,6,9(32), 10,12, 14(31), 15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 27.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (30).
49/247
Figure BRPI0914116A2_D0030
Fórmula (30): 18-metil-3,5,7,15,18,28-hexa-azatetraciclo[20.3.1.1-2,6-.1-8,12~]octacosa-1 (26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 28.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (31).
Figure BRPI0914116A2_D0031
Fórmula (31): 18-etil-3,5,7,15,18,28-hexa-azatetraciclo[20.3.1.1~2,6~.1~8,12~]octacosa-1(26),2(28),3,5,8(27),9,1 í,22,2410 nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 29.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (32).
Figure BRPI0914116A2_D0032
Fórmula (32): 1,8,10,12,17,19,23,27,33-nona-azapentaci50/247 clo[25.2.2.1-3,7-.1-9,13-.1-14,18~]tetratriaconta-3(34),4,6,9(33), 10,12,
14(32),15,17-nonaen-24-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 30.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um 5 composto da Fórmula (33).
Figure BRPI0914116A2_D0033
Fórmula (33): 1,11,13,15,23,31-hexa-azapentaciclo[23.2.2.1-5,9-1-10,14~. 1 -16,20~]dotriaconta-5(32),6,8,10(31), 11, 13,16(30),17,19-nonaen-24-ona. Chamado, na presente invenção, de 10 Composto 31.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (34).
Figure BRPI0914116A2_D0034
Fórmula (34): 15-etil-13,14,15,16,18,19-hexa-hidro-1H-6,215 (azeno)-7,11 -(meteno)-1,3,5,15,18-benzopenta-azaciclo-henicosin-17(12H)ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 32.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (35).
51/247
Figure BRPI0914116A2_D0035
Fórmula (35): 20-metil-3,5,7,15,20,30-hexa-azatetraciclo[22.3.1.1-2,6-.1 ~8,12~]triaconta-1 (28),2(30),3,5,8(29),9,11,24,26nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 33.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (36).
Figure BRPI0914116A2_D0036
Fórmula (36): 5-cloro-1,8,10,12,16,22,26,32-octa-azapentaciclo[24.2.2.1 ~3,7~. 1 ~9,13~. 1 ~14,18~]tritriaconta-3(33),4,6,9(32), 10,12,
14(31),15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 34.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (37).
52/247
Figure BRPI0914116A2_D0037
Fórmula (37): 10-cloro-14-etil-3,5,7,14,17,23,27-hepta-azatetraciclo[ 19.3.1.1-2,6-.1-8,12~]heptacosa-1 (25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 35.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (38).
Figure BRPI0914116A2_D0038
Figure BRPI0914116A2_D0039
Fórmula (38): (18S)-10-cloro-3,5,7,14,20,26,30-hepta-azapentaciclo[22.3.1.1 -2,6-. 1-8,12-.0-14,18~]triaconta10 1(28),2(30),3,5,8(29),9,11,24,26-nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 36.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (39).
53/247
Cl
Figure BRPI0914116A2_D0040
Fórmula (39): 10-cloro-3,5,7,14,20,26,31-hepta-azapentaciclo[22.3.1.1-2,6-.1-8,12-.1-14,18~]hentriaconta-1(28),2(31),3,5,8(30),9,
11,24,26-nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 37.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (40).
α
Figure BRPI0914116A2_D0041
Fórmula (40): 5-cloro-1,8,10,12,16,22,30-hepta-azapentaciclo[22.2.2.1 -3,7-.1-9,13-.1-14,18~]hentriaconta-3(31 ),4,6,9(30), 10,12, 14(29),15,17-nonaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 38.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (41).
54/247
Figure BRPI0914116A2_D0042
Fórmula (41): 9-metil-2,3,4,5,7,8,9,10-octa-hidro-16H-17,21(azeno)-11,15-(meteno)pirido[3,2-g][1,3,5,9,13,17]hexa-azaciclotricosin6(1H)-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 39.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (42).
Figure BRPI0914116A2_D0043
Fórmula (42): 14-prop-2-en-1-il-3,5,7,14,17,23,27-hepta-azatetraciclo[19.3.1.1 ~2,6~. 1 -8,12~]heptacosa-1 (25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,2310 nonaen-16-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 40.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (43).
Figure BRPI0914116A2_D0044
55/247
Fórmula (43): 18-oxo-14-oxa-2,4,8,17,25-penta-azatetraciclo[17.3.1.1-3,7-.1-9,13~]pentacosa-1 (23),3(25),4,6,9(24), 10,12,19,21nonaeno-6-carbonitrila. Chamado, na presente invenção, de Composto 41.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (44).
Figure BRPI0914116A2_D0045
Fórmula (44): 14,21-dioxa-2,4,8,18,28-penta-azatetraciclo[20.3.1.1-3,7-.1-9,13~]octacosa-1 (26),3(28),4,6,9(27), 10,12,22,24nonaen-19-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 42.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (45).
Figure BRPI0914116A2_D0046
Fórmula (45): 21-metil-1,8,10,11,21,24,30-hepta-azapentaciclo[22.2.2.1 -3,7-.1-9,12-.1-13,17~]hentriaconta-3(31 ),4,6,9,11,13(29), 14,
16-octaen-23-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 43.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (46).
56/247
Figure BRPI0914116A2_D0047
ο
Fórmula (46): (18S)-11-(morfolin-4-ilcarbonil)-5,7,14,20,28penta-azapentaciclo[20.3.1.1 ~2,6~. 1 ~8,12~.0~14,18~]octacosa1(26),2(28),3,5,8(27),9,11,22,24-nonaen-19-ona. Chamado, na presente 5 invenção, de Composto 44.
Em uma modalidade, a anilina-piridinotriazina cíclica é um composto da Fórmula (47).
Figure BRPI0914116A2_D0048
Fórmula (47): 10-metóxi-17-metil-2,14,15,17,18,19,20,22-octa10 hidro-6H-19,21 -metano-7,11 -(meteno)-12-oxa-2,3,5,6,17,21 -hexa-azacicloicosa[1,2,3-cd]inden-16(13H)-ona. Chamado, na presente invenção, de Composto 45.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (48):
57/247
Figure BRPI0914116A2_D0049
Fórmula (48). N-{[1 -(fenilmetil)azepan-4-il]metil}-2-piridin-3-ilacetamida. Chamado, na presente invenção, de Composto 46.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (49):
Figure BRPI0914116A2_D0050
Fórmula (49). 4-{[4-(4-{[2-(piridin-2-ilamino)etil]amino}-1,3,5-triazin-2-il)piridin-2-il]óxi}butan-1-ol. Chamado, na presente invenção, de Composto 47.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (50):
Figure BRPI0914116A2_D0051
Fórmula (50). 3-({3-[4-({2-[metil(piridin-2-il)amino]etil}amino)1,3,5-triazin-2-il]piridin-2-il}amino)propan-1-ol. Chamado, na presente inven58/247 ção, de Composto 48.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (51):
Figure BRPI0914116A2_D0052
Fórmula (51). N~4~-[2-(3-fluorofenil)etil]-N~2~-[3-(4-metil piperazin-1-il)propil]pirido[2,3-d]pirimidina-2,4-diamina. Chamado, na presente invenção, de Composto 49.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (52):
Figure BRPI0914116A2_D0053
Fórmula (52).
1-metil-N-[(4-piridin-3-il-2-{[3-(trifluorometil)fenil]amino}-1,3-tiazol-5-il)metil]piperidina-4-carboxamida. Chamado, na presente invenção, de Composto 50.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (53):
59/247
Figure BRPI0914116A2_D0054
Fórmula (53). {2-[4-({5-[3-(3-hidróxi propil)fenil]-4H-1,2,4-triazol3-il}amino)fenil]etil}carbamato de 1,1-dimetiletila. Chamado, na presente invenção, de Composto 51.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (54):
Figure BRPI0914116A2_D0055
Fórmula (54). {[3-({5-[5-(3-hidróxi propil)-2-(metilóxi)fenil]-1,3oxazol-2-il}amino)fenil]metil}carbamato de 1,1-dimetiletila. Chamado, na 10 presente invenção, de Composto 52.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (55):
Figure BRPI0914116A2_D0056
Fórmula (55). 1-({5-[6-({4-[(4-metil piperazin-1-il)sulfonil]fe
60/247 nil}amino)pirazin-2-il]tiofen-2-il}metil)piperidin-4-ol. Chamado, na presente invenção, de Composto 53.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (56):
NH»
Figure BRPI0914116A2_D0057
Fórmula (56). 1 -({4-[6-({4-[(4-metilpiperazin-1 -il)suIfoniljfenil}amino)pirazin-2-il]tiofen-2-il}metil)piperidina-4-carboxamida. Chamado, na presente invenção, de Composto 54.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (57):
Figure BRPI0914116A2_D0058
Fórmula (57). 2-{[4-(1 -metiletil)fenil]amino}-N-(2-tiofen-2-iletil)7,8-di-hidropirido[4,3-d]pirimidina-6(5H)-carboxamida. Chamado, na presente 15 invenção, de Composto 55.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (58):
61/247
Figure BRPI0914116A2_D0059
Fórmula (58). 6-[(2-{[4-(2,4-diclorofenil)-5-(4-metil-1 H-imidazol-2il)pirimidin-2-il]amino}etil)amino]piridina-3-carbonitrila. Chamado, na presente invenção, de Composto 56.
Em uma modalidade, esse pelo menos um outro fator é um composto da Fórmula (59):
Figure BRPI0914116A2_D0060
b]piridazin-3-il)-N-[2-(dimetilamino)etil]benzamida. Chamado, na presente 10 invenção, de Composto 57.
Detecção de células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
A formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitiva pode ser determinada 15 testando-se quanto à presença dos marcadores antes e depois de seguir um determinado protocolo. As células-tronco pluripotentes tipicamente não expressam esses marcadores. Portanto, a diferenciação das células pluripotentes é detectada quando as células começam a expressá-los.
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se
62/247 uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína e de ácido nucléico em células cultivadas ou isoladas são padrão na técnica. Estes incluem reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa quantitativa (RT-PCR), Northern blots, in situ hibridização (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Editores, suplemento de 2001)), e imunoensaios como análise imuno-histoquimica de material seccionado, Western blotting e, para marcadores que são acessíveis em células intactas, análise de citometria de fluxo (FACS) (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Por exemplo, as características de células-tronco pluripotentes são bem-conhecidas dos versados na técnica, e características adicionais de células-tronco pluripotentes continuam a ser identificadas. Os marcadores de células-tronco pluripotentes incluem, por exemplo, a expressão de um ou mais dentre os seguintes: ABCG2, cripto, FOXD3, Conexina43, Conexina45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, ou Tra1-81.
Após o tratamento das células-tronco pluripotentes com os métodos da presente invenção, as células diferenciadas podem ser purificadas mediante exposição de uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína, como CXCR4, expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Formação de células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática
As células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pan
63/247 creática por meio de qualquer método na técnica, ou por meio de qualquer método proposto na presente invenção.
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo podem ser diferenciados em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática, de acordo com os métodos apresentados em D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 a 1401 (2006).
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática, tratando-se as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com um fator de crescimento de fibroblastos e o inibidor da rota de sinalização hedgehog KAAD-ciclopamina, então removendo-se o meio contendo o fator de crescimento de fibroblastos e o KAAD-ciclopamina e, subsequentemente, cultivando-se as células em um meio contendo ácido retinoico, um fator de crescimento de fibroblastos e KAAD-ciclopamina. Um exemplo desse método é descrito em Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006).
Em um aspecto da presente invenção, células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são diferenciadas, adicionalmente, em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática, mediante tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com ácido retinoico e pelo menos um fator de crescimento de fibroblasto durante um período de tempo, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US No. de série 11/736,908, atribuído a LifeScan, Inc.
Em um aspecto da presente invenção, células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são diferenciadas, adicionalmente, em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática, por tratar as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
64/247 com ácido retinoico e pelo menos um fator de crescimento de fibroblasto durante um período de tempo, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US No. de série 11/779.311, atribuído a LifeScan, Inc.
Em um aspecto da presente invenção, as células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo são diferenciadas, adicionalmente, em células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática, mediante tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo de acordo com os métodos descritos no pedido de patente com n° de série US 60/990.529.
As células que expressam marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo podem ser tratadas com pelo menos um outro fator adicional que pode aumentar a formação de células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática. Alternativamente, o pelo menos um outro fator adicional pode otimizar a proliferação das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática formada pelos métodos da presente invenção. Adicionalmente, esse pelo menos um outro fator adicional pode otimizar a capacidade das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática formada pelos métodos da presente invenção para formar outros tipos de célula, ou otimizar a eficiência de quaisquer outras etapas adicionais de diferenciação.
Esse pelo menos um fator adicional pode ser, por exemplo, nicotinamida, membros de TGF-β família, inclusive TGF-βΙ, 2 e 3, albumina sérica, membros da família do fator de crescimento de fibroblastos, fatores AA e BB de crescimento derivados de plaqueta, plasma rico em plaquetas, fator de crescimento similar a insulina (IGF-I, II), fator de diferenciação de crescimento (como GDF-5, 6, 8, 10, 11), peptídeo I e II similar a glucagon (GLP-I e II), mimetocorpo GLP-1 e GLP-2, exendina-4, ácido retinoico, hormônio da paratiroide, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, fator de crescimento epidérmico (EGF), gastrina I e II, queladores de cobre, como trietileno pentamina, forscolina,
65/247
Na-butirato, ativina, betacelulina, ITS, noguina, fator de crescimento de neuritos, nodal, ácido valproico, tricostatina A, butirato de sódio, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos N2 e B27 (Gibco, CA), alcalóide esteroidal, como ciclopamina (EMD, CA), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), família de proteínas Dickkopf, extrato de hipófise bovina, proteína associada à neogênese de ilhotas (INGAP), Indian hedgehog, Sonic hedgehog, inibidores de proteassoma, inibidores da via notch, inibidores de sonic hedgehog ou combinações dos mesmos.
Esse pelo menos um outro fator adicional pode ser fornecido pelo meio condicionado obtido a partir de linhagens de células pancreáticas, como PANC-1 (ATCC n°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC n°: HTB-79), BxPC-3 (ATCC n°: CRL-1687), HPAF-II (ATCC n°: CRL-1997), linhagens de células hepáticas, como HepG2 (ATCC n°: HTB-8065), e linhagens de células intestinais, como FHs 74 (ATCC n°: CCL-241).
Detecção de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderme pancreática
Os marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são bem-conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem endodérmica pancreática continuam a ser identificados. Esses marcadores podem ser usados para confirmar que as células tratadas de acordo com a presente invenção se diferenciaram para adquirir as propriedades características da linhagem endodérmica pancreática. Os marcadores específicos para linhagem endodérmica pancreática incluem a expressão de um ou mais fatores de transcrição, como Hlxb9, PTF-1a, PDX-1, HNF-6 e HNF-1beta.
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína
66/247 e de ácido nucleico em células cultivadas ou isoladas são padrão na técnica. Estes incluem reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa quantitativa (RT-PCR), Northern blots, in situ hibridização (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Editores, suplemento de 2001)), e imunoensaios como análise imuno-histoquimica de material seccionado, Western blotting e, para marcadores que são acessíveis em células intactas, análise de citometria de fluxo (FACS) (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Formação de células expressoras de marcadores da linhagem endócrina pancreática
As células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática por meio de qualquer método na técnica, ou por meio de qualquer método descrito nesta invenção.
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática podem ser diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, de acordo com os métodos descritos em D’Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392a1401 (2006).
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, cultivando-se as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática em meio contendo DAPT e exendina 4, então removendo-se o meio contendo DAPT e exendina 4 e, subsequentemente, cultivando-se as células em um meio contendo exendina 1, IGF-1 e HGF. Um exemplo desse método é descrito em Nature Biotechnology 24, 1392 -1401 (2006).
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferen
67/247 ciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, cultivando-se as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática em meio contendo exendina 4, então removendo-se o meio contendo exendina 4 e, subsequentemente, cultivando-se as células em um meio contendo exendina 1, IGF-1 e HGF. Um Exemplo desse método é descrito em D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Por exemplo, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, cultivando-se as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática em um meio contendo DAPT e exendina 4. Um Exemplo desse método é descrito em D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Por exemplo, células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, através do cultivo das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática em meio contendo exendina 4. Um Exemplo desse método é descrito em D’ Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Em um aspecto da presente invenção, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, através do tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática com um fator que inibe a via de sinalização de Notch, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US No. de série 11/736.908, atribuído a LifeScan, Inc.
Em um aspecto da presente invenção, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores carac
68/247 terísticos da linhagem endócrina pancreática, através do tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática com um fator que inibe a via de sinalização de Notch, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US No. de série 11/779.311, atribuído a LifeScan, Inc.
Em um aspecto da presente invenção, as células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática são adicionalmente diferenciadas em células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, através do tratamento das células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática com um fator que inibe a via de sinalização de Notch, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US No. de série 60/953.178, atribuído a LifeScan, Inc.
Em um aspecto da presente invenção, as células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático são adicionalmente diferenciadas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática, mediante tratamento das células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático de acordo com os métodos descritos no pedido de patente com n° serial 60/990.529.
As células que expressam marcadores característicos da linhagem endodérmica pancreática podem ser tratadas com pelo menos um outro fator adicional que pode amplificar a formação de células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática. Alternativamente, esse pelo menos um outro fator adicional pode otimizar a proliferação das células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática formada pelos métodos da presente invenção. Além disso, o pelo menos um outro fator adicional pode melhorar a capacidade das células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática formadas pelos métodos da presente invenção em formar outros tipos de células, ou aperfeiçoar a eficiência de quaisquer outras etapas de diferenciação adicional.
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O pelo menos um fator adicional pode ser, por exemplo, nicotinamida, membros de TGF-β família, inclusive TGF-βΙ, 2 e 3, albumina sérica, membros da família do fator de crescimento de fibroblastos, fatores AA e BB de crescimento derivados de plaqueta, plasma rico em plaquetas, fator de crescimento similar a insulina (IGF-I, II), fator de diferenciação de crescimento (como GDF-5, -6, -8, -10, -11), peptídeo I e II similar a glucagon (GLP-I e II), mimetocorpo GLP-1 e GLP-2, exendina-4, ácido retinoico, hormônio da paratiroide, insulina, progesterona, aprotinina, hidrocortisona, etanolamina, beta mercaptoetanol, fator de crescimento epidérmico (EGF), gastrina I e II, queladores de cobre, como trietileno pentamina, forscolina, Na-butirato, ativina, betacelulina, ITS, noguina, fator de crescimento de neuritos, nodal, ácido valproico, tricostatina A, butirato de sódio, fator de crescimento de hepatócitos (HGF), esfingosina-1, VEGF, MG132 (EMD, CA), suplementos N2 e B27 (Gibco, CA), alcalóide esteroidal, como ciclopamina (EMD, CA), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), família de proteínas Dickkopf, extrato de hipófise bovina, proteína associada à neogênese de ilhotas (INGAP), Indian hedgehog, Sonic hedgehog, inibidores de proteassoma, inibidores da via notch, inibidores de sonic hedgehog ou combinações dos mesmos.
O pelo menos um outro fator adicional pode ser fornecido pelo meio condicionado obtido a partir de linhagens de células pancreáticas, como PANC-1 (ATCC n°: CRL-1469), CAPAN-1 (ATCC n°: HTB-79), BxPC-3 (ATCC n°: CRL-1687), HPAF-II (ATCC n°: CRL-1997), linhagens de células hepáticas, como HepG2 (ATCC n°: HTB-8065), e linhagens de células intestinais, como FHs 74 (ATCC n°: CCL-241).
Detecção de células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática
Os marcadores característicos das células da linhagem endócrina pancreática são bem-conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem endócrina pancreática continuam a ser identificados. Esses marcadores podem ser usados para confirmar que as células tratadas de acordo com a presente invenção se diferenciaram
70/247 para adquirir as propriedades características da linhagem endócrina pancreática. Os marcadores específicos para linhagem endócrina pancreática incluem a expressão de um ou mais fatores de transcrição, como NGN3,
NEURO ou ISL1
Os marcadores característicos das células da linhagem celular β são bem-conhecidos dos versados na técnica, e marcadores adicionais característicos da linhagem celular β continuam a ser identificados. Esses marcadores podem ser usados para confirmar que as células tratadas de acordo com a presente invenção foram diferenciadas para adquirir as propriedades características da linhagem de célula β. As características específicas da linhagem de células β incluem a expressão de um ou mais fatores de transcrição como PDX1, NKX2.2, NKX6.1, ISL1, PAX6, PAX4, NEUROD, HNF1 beta, HNF6, HNF3 beta ou MAFA, entre outros. Esses fatores de transcrição são bem-estabelecidos na técnica para identificação de células endócrinas. Vide, por exemplo, Edlund (Nature Reviews Genetics 3: 524-632 (2002)).
A eficiência da diferenciação pode ser determinada expondo-se uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso por células que expressam marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática. Alternativamente, a eficiência de diferenciação pode ser determinada expondo-se uma população de células tratadas a um agente (como um anticorpo) que especificamente reconhece um marcador de proteína expresso pelas células expressoras de marcadores característicos da linhagem celular β.
Os métodos para avaliar a expressão de marcadores de proteína e de ácido nucléico em células cultivadas ou isoladas são padrão na técnica. Estes incluem reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa quantitativa (RT-PCR), Northern blots, in situ hibridização (vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Editores, suplemento de 2001)), e imunoensaios como análise imuno-histoquimica de material seccionado, Western blotting e, para marcadores que são acessíveis em
71/247 células intactas, análise de citometria de fluxo (FACS) (vide, por exemplo,
Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Em um aspecto da presente invenção, a eficiência da diferenciação é determinada mediante a medição da porcentagem de células positivas para insulina em uma determinada cultura celular após tratamento. Em uma modalidade, os métodos da presente invenção produzem cerca de 100% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 90% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 80% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 70% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 60% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 50% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 40% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 30% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 20% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 10% de células positivas para insulina em uma determinada cultura. Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente invenção produzem cerca de 5% de células positivas para insulina em uma determinada cultura.
Em um aspecto da presente invenção, a eficiência da diferenciação é determinada mediante a medição da secreção de insulina estimulada por glicose, conforme detectado mediante a medição da quantidade de
72/247 peptídeo C liberado pelas células. Em uma modalidade, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 1000 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 900 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 800 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 700 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 600 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 500 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 400 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 500 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 400 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 300 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 200 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 100 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 90 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 80 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 70 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 60 ng
73/247 de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 50 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 40 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 30 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 20 ng de peptídeo C/pg DNA. Em uma modalidade alternativa, as células produzidas pelos métodos da presente invenção produzem cerca de 10 ng de peptídeo C/pg DNA.
Terapias
Em um aspecto, a presente invenção apresenta um método para tratar um paciente que sofre de, ou que está em risco de desenvolver, diabetes tipo 1. Esse método envolve cultivar células-tronco pluripotentes, diferenciar as células-tronco pluripotentes in vitro em uma linhagem celular β, e implantar em um paciente as células de uma linhagem celular β.
Em ainda um outro aspecto, esta invenção apresenta um método para tratamento de um paciente que sofra de, ou esteja em risco de desenvolver, diabetes tipo 2. Esse método envolve cultivar células-tronco pluripotentes, diferenciar as células cultivadas in vitro em uma linhagem celular β, e implantar no paciente as células da linhagem celular β.
Se for adequado, o paciente pode ser adicionalmente tratado com agentes farmacêuticos ou bioativos que facilitem a sobrevivência e a função das células transplantadas. Esses agentes podem incluir, por exemplo, insulina, membros da família TGF-β, inclusive TGF-βΙ, 2 e 3, proteínas morfogênicas ósseas (BMP-2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12 e 13), fatores 1 e 2 de crescimento de fibroblastos, fatores AA e BB de crescimento derivado de plaqueta, plasma rico em plaquetas, fator de crescimento similar a insulina (IGF-I, II), fator de diferenciação de crescimento (como GDF-5, 6, 7, 8, 10, 15), fator de crescimento derivado de célula endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina e endotelina, entre outros. Outros compostos farmacêuticos podem incluir, por exemplo, nicotinamida, peptídeo-l tipo glucacon (GLP-1) e
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II, mimeticorpo GLP-1 e 2, Exendina-4, ácido retinoico, hormônio da paratiroide, inibidores MAPK, por exemplo os compostos descritos no pedido publicado US 2004/0209901 e no pedido publicado US 2004/0132729.
As células-tronco pluripotentes podem ser diferenciadas em uma célula produtora de insulina, antes do transplante para um recipiente. Em uma modalidade específica, as células-tronco pluripotentes são totalmente diferenciadas em células β, antes de serem transplantadas para um recipiente. Alternativamente, as células-tronco pluripotentes podem ser transplantadas para um recipiente em um estado não diferenciado ou parcialmente 10 diferenciado. Uma diferenciação adicional pode ocorrer no recipiente.
As células de endoderme definitiva ou, alternativamente, as células de endoderme pancreática ou, alternativamente, as células β, podem ser implantadas sob a forma de células dispersas ou formadas em agrupamentos que podem ser aplicados ao paciente por infusão pela veia porta 15 hepática. Alternativamente, as células podem ser fornecidas em suportes poliméricos biocompatíveis e degradáveis, dispositivos porosos não degradáveis, ou encapsulados para proteção contra a resposta imunológica do hospedeiro. As células podem ser implantadas em um sítio adequado do recipiente. Os sítios de implantação incluem, por exemplo, o fígado, o pân20 creas natural, o espaço subcapsular renal, o omento, o peritônio, o espaço subseroso, o intestino, o estômago ou um bolso subcutâneo.
Para otimizar a diferenciação adicional, a sobrevivência ou a atividade das células implantadas, fatores adicionais como fatores de crescimento e agentes antioxidantes ou anti-inflamatórios podem ser admi25 nistrados antes, simultaneamente, ou após a administração das células. Em certas modalidades, os fatores de crescimento são usados para diferenciar in vivo as células administradas. Esses fatores podem ser secretados por células endógenas e expostos in situ às células administradas. As células implantadas podem ser induzidas a se diferenciar por qualquer combinação 30 de fatores de crescimento conhecidos na técnica, tanto endógenos como administrados exogenamente.
A quantidade de células usadas na implantação depende de
75/247 inúmeros fatores diferentes, inclusive a condição de saúde do paciente e sua resposta à terapia, e pode ser determinada pelo versado na técnica.
Em um aspecto, a presente invenção apresenta um método para tratar um paciente que sofra de, ou que esteja em risco de desenvolver, diabetes. Esse método envolve cultivar células-tronco pluripotentes, diferenciar as células cultivadas in vitro em uma linhagem celular β, e incorporar as células a um suporte tridimensional. As células podem ser mantidas in vitro nesse suporte, antes da implantação no paciente. Alternativamente, o suporte contendo as células pode ser diretamente implantado no paciente sem cultura in vitro adicional. O suporte pode, opcionalmente, ser incorporado com pelo menos um agente farmacêutico que facilite a sobrevivência e o funcionamento das células transplantadas.
Os materiais de suporte adequados ao uso para os propósitos da presente invenção incluem modelos de tecidos, conduítes, barreiras e reservatórios úteis para reparo de tecidos. Em particular, materiais sintéticos e naturais sob a forma de espumas, esponjas, géis, hidrogéis, produtos têxteis e estruturas não tecidas, que têm sido usadas in vitro e in vivo para reconstruir ou regenerar tecido biológico, bem como para liberar agentes quimiotácticos a fim de induzir a proliferação de tecidos, são adequadas ao uso na prática dos métodos da presente invenção. Vide, por exemplo, os materiais descritos nas patentes US n° 5.770.417, 6.022.743, 5.567.612, 5.759.830, 6.626.950, 6.534.084, 6.306.424, 6.365.149, 6.599.323, 6.656.488, no pedido de patente publicado US 2004/0062753 A1, e nas patentes US n° 4.557.264 e 6.333.029.
Para formar um suporte incorporado com um agente farmacêutico, este pode ser misturado à solução de polímero antes da formação do suporte. Altemativamente, um agente farmacêutico podería ser aplicado como revestimento sobre um suporte fabricado, de preferência na presença de um portador farmacêutico. O agente farmacêutico pode estar presente sob a forma de um líquido, um sólido finamente dividido, ou qualquer outro formato físico adequado. Alternativamente, os excipientes podem ser adicionados ao suporte para alterar a taxa de liberação do agente farmacêutico.
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Em uma modalidade alternativa, o suporte é incorporado a pelo menos um composto farmacêutico que é um composto anti-inflamatório, como os compostos apresentados na patente US n° 6.509.369.
O suporte pode ser incorporado a pelo menos um composto farmacêutico que é um composto antiapoptótico, como os compostos descritos na patente US n° 6.793.945.
O suporte pode, também, ser incorporado a pelo menos um composto farmacêutico que é um inibidor de fibrose, como os compostos descritos na patente US n° 6.331.298.
O suporte pode, também, ser incorporado a pelo menos um composto farmacêutico que é capaz de acentuar a angiogênese, como os compostos descritos nos pedidos de patente publicados US 2004/0220393 e US 2004/0209901.
O suporte pode, também, ser incorporado a pelo menos um composto farmacêutico que é um composto imunossuppressivo, como os compostos descritos no pedido publicado US 2004/0171623.
O suporte pode, também, ser incorporado com pelo menos um composto farmacêutico que é um fator de crescimento, como os membros da família TGF-β, inclusive TGF-βΙ, 2 e 3, proteínas morfogênicas ósseas (BMP-2, 3, 4, 5, 6, 7, 11, 12 e 13), fatores 1 e 2 de crescimento de fibroblastos, fatores AA e BB de crescimento derivado de plaqueta, plasma rico em plaquetas, fator de crescimento similar a insulina (IGF-I, II), fator de diferenciação de crescimento (como GDF-5, 6, 8, 10, 15), fator de crescimento derivado de célula endotelial vascular (VEGF), pleiotrofina e endotelina, entre outros. Outros compostos farmacêuticos podem incluir, por exemplo, nicotinamida, fator 1-alfa induzível por hipóxia, peptídeo-l (GLP-1) similar a glucagon, mimeticorpo GLP-1, GLP-2 e II, exendina-4, nodal, noguina, NGF, ácido retinoico, hormônio da paratiroide, tenascina-C, tropoelastina, peptídeos derivados de trombina, catelicidinas, defensinas, laminina, peptídeos biológicos contendo domínios de ligação a célula e a heparina das proteínas adesivas da matriz extracelular, como fibronectina e vitronectina, inibidores MAPK, como os compostos descritos nos pedidos
77/247 publicados US 2004/0209901 e US 2004/0132729.
A incorporação das células da presente invenção em um arcabouço pode ser obtida mediante a simples deposição das células sobre o mesmo. As células podem entrar no arcabouço por difusão simples (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2): 3 a 9 (1988)). Várias outras abordagens foram desenvolvidas para acentuar a eficiência da semeadura de células. Por exemplo, frascos de agitação foram usados na semeadura de condrócitos sobre arcabouços de ácido poliglicólico (Biotechnol. Prog. 14(2): 193 a 202 (1998)). Uma outra abordagem para a semeadura de células é o uso de centrifugação, que resulta em estresse mínimo para as células semeadas, otimizando a eficiência da semeadura. Por exemplo, Yang et al. desenvolveu um método para semeadura de células (J. Biomed. Mater. Res. 55(3): 37986 (2001)), chamado de imobilização centrifugacional da célula (CCI, ou Centrifugational Cell Immobilization).
A presente invenção é ilustrada com mais detalhes pelos exemplos a seguir, porém não é limitada pelos mesmos.
Exemplos
Para esclarecimento da descrição, e sem propósitos de limitação, a descrição detalhada da invenção é dividida nas subseções a seguir que descrevem ou ilustram determinadas características, modalidades ou aplicações da presente invenção.
Exemplo 1
Cultura de célula-tronco embrionária humana
As linhagens H1, H7 e H9 de células-tronco embrionárias humanas foram obtidas junto ao WiCell Research Institute, Inc., (Madison, Wl, EUA) e cultivadas de acordo com as instruções fornecidas pelo instituto de origem. As células-tronco embrionárias humanas foram, também, semeadas sobre placas revestidas com uma diluição a 1:30 de MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), e cultivadas em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As células cultivadas sobre MATRIGEL® foram rotineiramente passadas como aglomerados com o uso
78/247 de colagenase IV (Invitrogen/GIBCO, Cat. n° 17104-019), Dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) ou enzima Liberase Cl (Roche, Cat. n°
11814435001). Em alguns casos, as células foram passadas como células individuais com o uso de ACCUTASE (Sigma, Cat. n° A6964).
As células-tronco embrionárias humanas usadas nesses exemplos foram mantidas em um estado não diferenciado, pluripotente, com passagem em média a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de colagenase (1 ou 10 mg/mL, Sigma-Aldrich) durante 10 a 30 minutos a 37°C, seguida de raspagem suave com a ponta de uma pipeta para recuperar aglomerados celulares. Os aglomerados foram deixados sedimentar por gravidade, sendo em seguida lavados para remover a colagenase residual. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 para cultura de manutenção de rotina ou a uma razão de 1:1 para teste posterior. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao fenótipo cariotípico normal e à ausência de contaminação por micoplasma.
Exemplo 2
Bioensaio para formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
A ativina A é um importante mediador da diferenciação em uma ampla gama de tipos de célula, inclusive na diferenciação de células-tronco embrionárias para endoderma definitivo. Quando as células-tronco embrionárias humanas são tratadas com uma combinação de ativina A e Wnt3a, vários genes representativos do endoderma definitivo são regulados para cima. Um bioensaio que mede essa diferenciação em células-tronco embrionárias humanas foi adaptado em um formato miniaturizado para placas com 96 poços para propósitos de triagem. A validação foi concluída usando-se o tratamento com fontes comerciais de ativina A e Wnt3a proteínas recombinantes e medindo-se a expressão de proteína do fator de transcrição SOX17, considerado como sendo um marcador representativo do endoderma definitivo.
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Live Cell Assay, em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados em plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzimas, e folheadas a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, Perkin Elmer, Cat. n° 6005182). As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados e, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de 100 μΙ, por poço, de meio condicionado com fibroblasto embriônico de camundongo (MEF) suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB).
O teste foi iniciado com a lavagem dos poços de cada placa duas vezes em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), seguida pela adição, a cada poço, de uma alíquota (100 μΙ) da amostra de teste em meio basal DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032). As condições de teste foram realizadas em triplicata, com alimentação em dias alternados mediante aspiração e substituição do meio de cada poço com amostras para teste, ao longo de um período de teste total de quatro dias. No primeiro e no segundo dias de teste, as amostras para teste adicionadas aos poços de teste foram diluídas em DMEM:F12 com 0,5% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN). No terceiro e no quarto dias de teste, as amostras para teste adicionadas aos poços de teste foram diluídas em DMEM:F12 com 2% de FCS, sem qualquer Wnt3a. As amostras de controle positivo consistiam em ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14) adicionada a uma concentração de 100 ng/mL por todo o teste, mais Wnt3a (20 ng/mL) nos dias 1 e 2. Nas amostras de controle negativo foi omitido o tratamento tanto com ativina A como com Wnt3a.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de
80/247 cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anticabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para captura de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, coradas somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida
81/247 como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A figura 1 mostra a validação do teste de triagem, testando uma curva de diluição dupla de uma fonte comercial de ativina A (PeproTech) e medindo tanto o número de células (figura 1A) como a intensidade de SOX17 (figura 1B). Os efeitos ideais da ativina A para indução da expressão de SOX17 foram geralmente observados na faixa de 100 a 200 ng/mL, com um EC50 de 30 a 50 ng/mL. Omitindo-se o Wnt3a do tratamento nos dias 1 e 2 do teste, deixou de produzir uma expressão mensurável de SOX17 (figura 1B, barras brancas). A ausência de ativina A também deixou de resultar na expressão de SOX17 (figura 1B).
Exemplo 3
Triagem primária: efeitos dos compostos da presente invenção sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo na ausência de ativina A
A diferenciação de células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo é mediado através de uma série de interações receptor-ligante que, por sua vez, ativam as quinases receptoras levando à fosforilação e à translocação nuclear de substratos a jusante, eventualmente regulando a expressão de genes-alvo específicos. A ativação ótima dessas cascatas de sinalização em alguns tipos de célula pode requerer a inibição de rotaspadrão opostas. Em outros casos, as rotas redundantes envolvendo membros alternativos de uma família quinase maior podem substituir, em parte, uma ou mais moléculas sinalizadoras. Em outros casos, as rotas canônicas e não canônicas podem divergir com diferentes estímulos iniciadores, mas podem levar a um resultado funcional similar.
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As triagens funcionais baseadas em células são uma abordagem para identificação de alvos e métodos inovadores que podem ter um impacto sobre respostas celulares específicas. Uma abordagem muito poderosa envolve uma série de triagens iterativas por meio das quais as pistas ou os acertos de uma triagem são integrados a outra triagem subsequente. Alternativamente, uma série de variáveis diferentes é integrada de maneira combinatória (por exemplo, fatores de crescimento com inibidores da quinase) para identificar efeitos inovadores sobre a diferenciação celular. Nesse caso, uma biblioteca de moléculas pequenas, compreendendo anilina-piridinotriazinas, anilina-piridinotriazinas cíclicas e estruturas intermediárias em sua síntese, foi testada quanto a propriedades importantes durante a diferenciação do endoderma definitivo de células-tronco embrionárias humanas, especificamente quanto a efeitos para reter ou otimizar o número de células na conclusão de uma ‘primeira’ etapa de diferenciação em meio com baixo teor de soro e na ausência do fator de crescimento ativina A.
Teste de triagem
Semeadura para teste das células: em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do
83/247 ensaio.
Preparação de compostos e teste: os compostos testados foram disponibilizados como estoques de 5 mM no formato de placas com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenados a -80°C. Os compostos da biblioteca foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. As condições de teste foram realizadas em triplicata, com alimentação em dias alternados ao longo de um período de teste de quatro dias. Ensaios de triagem primários foram iniciados por se aspirar o meio de cultura de cada um dos poços seguido de três lavagens em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190) para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. No primeiro dia do teste, os volumes de teste de 200 pl por poço foram adicionados de volta contendo o meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032), suplementado com 0,5% FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN), mais 2,5 mM do composto de teste. No terceiro dia do teste, os volumes de teste de 200 μΙ por poço foram adicionados de volta contendo o meio base DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS mais 2,5 mM de composto de teste, sem Wnt3a. As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com FCS, substituindo-se 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14) pelo composto de teste por todo o período de testes de quatro dias, juntamente com Wnt3a (20 ng/mL) adicionadas somente nos dias 1 e 2. As amostras de controle negativo continham meio base DMEM:F12 suplementado com FCS, adicionando-se Wnt3a nos dias 1 e 2, mas omitindo-se a ativina A.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As
84/247 células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anticabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram
85/247 calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 1 mostra os resultados da triagem primária para os compostos testados, mostrando seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, na ausência de ativina A. Os resultados incluem medidas quantitativas tanto do número de células como da intensidade de SOX17, tendo sido calculada a média dos respectivos pontos de dados a partir de poços em triplicata, e analisada quanto a cada parâmetro com o uso de campos idênticos em cada poço. A expressão do fator de transcrição SOX17 é considerada indicativa de diferenciação do endoderma definitivo. Os resultados da triagem primária foram capturados a partir de oito placas de triagem com 96 poços. A variabilidade de uma placa para outra foi reduzida com a inclusão de controles positivo e negativo individuais em cada placa. Os resultados são normalizados e expressos como uma porcentagem do controle positivo. Deu-se ênfase à retenção ou amplificação do número de células na conclusão do teste.
A tabela 2 lista um subconjunto de 27 compostos e seus resultados analisados a partir da triagem primária, onde esses acertos pareceram reter um número de células em teor equivalente a, ou melhor que, o do controle positivo, apesar da ausência de ativina A no teste de triagem.
Em alguns casos, a expressão de SOX17 foi induzida na ausência de ativina A (por exemplo, os Compostos 35 e 22, à base de anilinapiridinotriazinas cíclicas).
Os compostos mostrados na tabela 2 foram selecionados para avaliação adicional quanto aos efeitos sobre a diferenciação de célulastronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, na ausência de ativina A.
Exemplo 4
Triagem secundária: efeitos dos compostos da presente invenção sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em
86/247 células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com EGF/FGF4 na ausência de ativina A
Uma curva de titulação para ativina A com uma quantidade constante de Wnt3a mostrou pelo menos dois efeitos durante a diferenciação de endoderma definitivo: 1) manutenção dos números de células ou prevenção de perda celular, e 2) indução de um marcador de endoderma definitivo, por exemplo expressão de SOX17 (exemplo 2). A triagem primária do exemplo 3 identificou compostos que poderíam manter, em um teste, números de células similares ou otimizados em relação à adição de ativina A/Wnt3a por si sós. Conduziu-se um teste de triagem secundária para avaliar o efeito das combinações dos compostos identificados com outros fatores de crescimento, especificamente EGF e FGF4, sobre a geração de endoderma definitivo.
Semeadura para teste das células: aglomerados de célulastronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e fatores de crescimento: as concentrações de estoque para EGF (R&D Systems Cat. n° 236-EG) e FGF4 (R&D Systems, Cat. n° 235-F4) eram de 250 ng/mL, cada qual solubilizado em
87/247
PBS com 0,1% de BSA (Sigma, Cat. n° A7888). Os compostos foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenados a -80°C. Os compostos foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. Todos os fatores de crescimento e inibidores foram preparados em uma placa de polipropileno com 96 poços profundas, diluídos até 5x com soluções de estoque intermediárias em meio base DMEM:F12 no início do teste, e armazenados a 4°C.
Foi conduzido um teste de triagem secundária, com teste em triplicata e alimentação em dias alternados ao longo do período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada um dos poços, seguida de três lavagens em PBS para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste de 80 pl por poço foram adicionados de volta, contendo meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,625% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems) e
3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento, para produzir uma concentração final de 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 2,5 μΜ de composto mais 50 ng/mL de EGF e 50 ng/mL de FGF4 no teste. Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL de Wnt3a, omitindo-se a ativina A.
No dia 3, os poços foram aspirados e alimentados com 80 μΙ de meio base DMEM:F12 suplementado com 2,5% de FCS (HyClone) e 3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento por poço, para produzir uma concentração final de 2% de FCS e 2,5 μΜ de composto (omitindo-se o Wnt3a), mais 50 ng/mL de EGF e FGF4 no teste. Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base
88/247 suplementado com 2% de FCS e 100 ng/mL de ativina A, omitindo-se
Wnt3a. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base com 2% de FCS, omitindo-se tanto a ativina A como o Wnt3a.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeido (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, coradas somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determi
89/247 nada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 3A mostra os resultados para dois fatores de crescimento, EGF e FGF 4 (50 ng/mL cada), testados em combinação com os compostos de anilina-piridinotriazina mostrados na tabela 2, por seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, na ausência de ativina A. Os resultados são classificados em ordem descendente quanto aos melhores efeitos sobre a expressão de SOX17. Embora os efeitos desses compostos sobre a expressão de SOX17 tenham sido considerados fracos em relação ao controle positivo com ativina A/Wnt3a, as respostas para alguns desses compostos foram consideradas significativas. Por exemplo, uma seleção dos compostos parece ter propriedades exclusivas no que diz respeito à retenção de altos números de células por poço durante o teste, presumivelmente mediante a prevenção da apoptose ou mediante a modulação do ciclo celular. Além disso, esses compostos parecem criar uma sinergia com EGF e FGF4 para promover uma modesta diferenciação do endoderma definitivo, conforme medido pela expressão de SOX17. Os compostos mais potentes são mencionados na tabela 3B. Outros compostos testados em combinação com EGF e FGF4 neste teste foram ineficazes para induzir a expressão de SOX17, mas poderíam reter os números de células em teste (por exemplo o Composto 90, com 85% do número de células e 2% de expressão de SOX17).
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Exemplo 5
Efeitos dos compostos da presente invenção, em combinação com outros fatores, sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo na ausência de ativina A
Um teste secundário foi conduzido para avaliar o efeito dos compostos da presente invenção com combinações de outros fatores de crescimento individuais, ou compostos conhecidos na literatura por regular a diferenciação do endoderma definitivo.
Semeadura para teste das células: aglomerados de célulastronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e fatores de crescimento: os estoques de fatores de crescimento adquiridos junto à R&D Systems foram: EGF (Cat. n° 236-EG), FGF4 (Cat. n° 235-F4), PDGF-A (Cat. n° 221-A-A), PDGF-B (Cat. n° 220-BB), PDGF-C (Cat. n° 1687-CC), PDGF-D (Cat. n° 1159-SB), PDGF-A/B (Cat. n° 222-AB), VEGF (Cat. n° 293-VE), BMP-1 (Cat. n° 1927ZN)BMP-2 (Cat. n° 355-BM), BMP-4 (Cat. n° 314-BP), BMP-6 (Cat. n° 507BP), BMP-7 (Cat. n° 222-AB), BMP-2/7 (Cat. n° 3229-BM). Outros agentes
91/247 testados foram adquiridos conforme exposto a seguir: BMP-7 (Sigma, Cat. n° B1434), LY294002 (Cayman, Cat. n° 70920), PD98059, U0126, U0124 (EMD Biosciences, Cat. n° 453710), muscimol (Tocris, Cat. n° 0289), bicuculina (Tocris, Cat. n° 0130), butirato de sódio (Sigma, Cat. n° B5887). Todos os 5 fatores de crescimento foram solubilizados em PBS com 0,1% de BSA (Sigma, Cat. n° A7888) e armazenados congelados a -80°C. As moléculas pequenas foram solubilizadas em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenadas congeladas a — 80°C. Os compostos foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, 10 solubilizados em 100% de DMSO e armazenados a —80°C. Os compostos da presente invenção foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. Todos os fatores de crescimento e inibidores foram preparados em uma placa de polipropileno com 15 96 poços profundas, diluídos até 5x com soluções de estoque intermediárias em meio base DMEM:F12 no início do teste, e armazenados a 4°C.
Foi conduzido um teste de triagem secundária, com teste em triplicata e alimentação em dias alternados ao longo do período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura 20 de cada um dos poços, seguida de três lavagens em PBS para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste de 80 pl por poço foram adicionados de volta, contendo meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,625% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems) e 25 3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas, para produzir uma concentração final de 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 2,5 μΜ de composto. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, PDGF-A/B, 30 VEGF, BMP-1, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 e BMP-2/7). As concentrações finais de teste das moléculas pequenas testadas eram conforme exposto a seguir: muscimol (20 μΜ), PD98059 (1 μΜ), LY294002 (2,5 μΜ),
92/247
U0124 (1 μΜ), U0126 (1 μΜ), butirato de sódio (0,5 mM). Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL de Wnt3a, omitindo-se a ativina A.
No dia 3, os poços foram aspirados e alimentados com 80 μΙ de meio base DMEM:F12 suplementado com 2,5% de FCS (HyClone) e
3,125 μΜ de composto de anilina-piridinotriazina cíclica mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas por poço, para produzir uma concentração final de 2% de FCS e 2,5 mM de composto (omitindo-se o Wnt3a) e, conforme denotado no primeiro dia para todos os fatores de crescimento ou moléculas pequenas restantes. Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 2% de FCS e 100 ng/mL de ativina A, omitindo-se Wnt3a. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base com 2% de FCS, omitindo-se tanto a ativina A como o Wnt3a.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570)
93/247 durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100pl/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 4 mostra os resultados para a diferenciação de célulastronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, em seguida a tratamento com os compostos da presente invenção, em combinação com fatores de crescimento individuais ou outras moléculas pequenas. Em geral, os membros da família BMP (BMP-1, BMP-2, BMP-4, BMP-6, BMP-7 e BMP-2/7) inibiram ou tiveram efeitos desprezíveis sobre a expressão de
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SOX17. O mesmo era verdadeiro para a maioria dos inibidores de enzimas de molécula pequena testadas nesse ensaio (LY294002, PD98059, U0126, U0124 e butirato de sódio). Entretanto, alguns membros da família PDGF (PDGF-A, AB, C e D) forneceram um aumento na expressão de SOX17 (de 10 a 25% do controle com ativina A/Wnt3a). Outros fatores de crescimento mostrando aumentos similares na expressão de SOX17 incluíam EGF (34%), VEGF (18%) e FGF4 (17%), embora o FGF4 não tenha sido capaz de suportar a retenção dos números de células. O muscimol (agonista do receptor GABAa) de molécula pequena, testado em combinação com o Composto 35, também ofereceu um modesto aumento na expressão de SOX17, enquanto o agonista do receptor GABAa, bicuculina, não teve qualquer efeito sobre a expressão de SOX17. EGF, FGF4, PDGF-A, PDGFB, PDGF-AB, PDGF-C, PDGF-D e muscimol foram selecionados para avaliação adicional durante a diferenciação do endoderma definitivo.
Exemplo 6
Efeitos dos compostos da presente invenção, em combinação com outros fatores, sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo na ausência de ativina A
Um teste secundário foi conduzido para avaliar o efeito das combinações de diferentes compostos com outros agentes individuais sobre a diferenciação do endoderma definitivo. Os outros agentes selecionados para esta triagem tinham previamente mostrado um modesto aumento na formação de endoderma definitivo, conforme testado com o Composto 17 e conforme denotado na tabela 5. Nesta triagem, um painel mais amplo de compostos foi avaliado com esses agentes, seja em comparações individuais em pares, seja em combinações agrupadas.
Semeadura para teste das células: aglomerados de célulastronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e
95/247 raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do teste.
Preparação de compostos e fatores de crescimento: os estoques de fatores de crescimento adquiridos junto à R&D Systems foram EGF (Cat. n° 236-EG), FGF4 (Cat. n° 235-F4), PDGF-A (Cat. n° 221-AA), PDGF-D (Cat. n° 1159-SB), PDGF-A/B (Cat. n° 222-AB) e VEGF (Cat. n° 293-VE). O muscimol foi adquirido junto à Tocris (Cat. n° 0289). Todos os fatores de crescimento foram solubilizados em PBS com 0,1% de BSA (Sigma, Cat. n° A7888) e armazenados congelados a -80°C. O muscimol foi solubilizado em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenado congelado a -80°C. Os compostos foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO e armazenados a -80°C. Os compostos foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. Todos os fatores de crescimento e inibidores foram preparados em uma placa de polipropileno com 96 poços profundos, diluídos até 5x com soluções de estoque intermediárias em meio base DMEM:F12 no início do teste, e armazenados a 4°C.
Foi conduzido um teste de triagem secundária, com teste em triplicate e alimentação em dias alternados ao longo do período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada um dos poços, seguido de três lavagens em PBS para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste
96/247 de 80 μΙ por poço foram adicionados de volta, contendo meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,625% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems) e
3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x de fator de crescimento ou moléculas pequenas, para produzir uma concentração final de 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 2,5 μΜ. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-A/B e VEGF). A concentração final de teste do muscimol era de 20 μΜ. Os poços com controle positivo (100 μ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A. Os poços com controle negativo (100 μ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL de Wnt3a, omitindo-se a ativina A.
No dia 3, os poços foram aspirados e alimentados com 80 μΙ de meio base DMEM:F12 suplementado com 2,5% de FCS (HyClone) e 3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas por poço, para produzir uma concentração final de 2% de FCS e 2,5 μΜ de composto (omitindo-se o Wnt3a) e, conforme denotado no primeiro dia para todos os fatores de crescimento ou moléculas pequenas restantes. Os poços com controle positivo (100 μ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 2% de FCS e 100 ng/mL de ativina A, omitindo-se Wnt3a. Os poços com controle negativo (100 μ/poço) continham o mesmo meio base com 2% de FCS, omitindo-se tanto a ativina A como o Wnt3a.
Análise de alto conteúdo', na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de parafomnaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura
97/247 ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para captura de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
98/247
A tabela 5 mostra compostos previamente identificados como acertos (tabela 2), testados em um bioensaio de endoderma definitivo em várias combinações com fatores de crescimento e muscimol, sem ativina A. Alguns compostos tiveram efeitos mínimos ou fracos sobre a expressão de SOX17 com todas as combinações de fator de crescimento testadas. Entretanto, alguns compostos foram capazes de induzir expressão de SOX17 significativa com algumas, mas não com todas, as combinações de fator de crescimento. Um composto em particular, o Composto 34, teve respostas sinérgicas significativas com todos os fatores de crescimento testados, e mediou aumentos tanto nos números de células como na expressão de SOX17 neste teste: Composto 39 com 1) EGF+FGF4 = 77% da resposta do controle positivo; ou 2) EGF+FGF4+PDGF-AB = 68% da resposta do controle positivo; ou 3) EGF+FGF4+PDGF-A+VEGF = 31% da resposta do controle positivo.
Exemplo 7
Efeitos do Composto 34, em combinação com outros fatores, sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo na ausência de ativina A
Neste exemplo, fez-se um esforço para analisar o número mínimo de fatores de crescimento requeridos, em combinação com o composto de anilina-piridinotriazina cíclica, Composto 34, para produzir uma robusta resposta de SOX17, na ausência de ativina A. Também neste exemplo um novo fator de crescimento, GDF-8, foi adicionado para avaliação. O GDF-8, também conhecido como miostatina, é um membro da família TGF-β e foi demonstrado seu uso nos receptores de ativina tipo II e TGF-β tipo I (ALK4/5) para induzir a fosforilação de SMAD 2/3.
Semeadura para teste das células: aglomerados de célulastronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e
99/247 raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e fatores de crescimento: estoques de fatores de crescimento adquiridos junto à R&D Systems foram: EGF (Cat. n° 236-EG), FGF4 (Cat. n°235-F4), PDGF-A (Cat. n°221-A-A), PDGF-D (Cat. n°1159-SB), PDGF-A/B (Cat. n°222-AB), VEGF (Cat. n°293-VE) e GDF-8 (Cat. n° 788-G8). O muscimol foi adquirido junto à Tocris (Cat. n° 0289). Todos os fatores de crescimento foram solubilizados em PBS com 0,1% de BSA (Sigma, Cat. n° A7888) e armazenados congelados a -80°C. O muscimol foi solubilizado em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenado congelado a -80°C. Os compostos de anilina-piridinotriazina cíclica foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO e armazenados a 80°C. O composto 34 foi adicionalmente diluído até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630080) e 20% de DMSO, e armazenado a 4°C. Todos os fatores de crescimento e inibidores foram preparados em uma placa de polipropileno com 96 poços profundos, diluídos até 5x com soluções de estoque intermediárias em meio base DMEM:F12 no início do teste, e armazenados a 4°C.
Foi conduzido um teste de triagem secundária, com teste em triplicata e alimentação em dias alternados ao longo do período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada uma das poços, seguida de três lavagens em PBS para remover
100/247 quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste de 80 pl por poço foram adicionados de volta, contendo meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,625% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems) e
3,125 μΜ de Composto 27 mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas, para produzir uma concentração final de 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 2,5 μΜ de Composto 34. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-A/B e VEGF), com a exceção de GDF-8, que foi testado a 25 ng/mL. A concentração final de teste do muscimol era de 20 μΜ. Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL de Wnt3a, omitindo-se a ativina A.
No dia 3, os poços foram aspirados e alimentados com 80 μΙ de meio base DMEM:F12 suplementado com 2,5% de FCS (HyClone) e 3,125 μΜ do Composto 34 mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas por poço, para produzir uma concentração final de 2% de FCS e 2,5 μΜ de Composto 34 (omitindo-se o Wnt3a) e, conforme denotado no primeiro dia para todos os fatores de crescimento ou moléculas pequenas restantes. Os poços com controle positivo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 2% de FCS e 100 ng/mL de ativina A, omitindo-se Wnt3a. Os poços com controle negativo (100 μΙ/poço) continham o mesmo meio base com 2% de FCS, omitindo-se tanto a ativina A como o Wnt3a.
Análise de alto conteúdo', na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas
101/247 novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. η·° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, coradas somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados
102/247 foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 6 mostra os resultados desse teste. Quando o GDF-8 estava presente em qualquer combinação com o Composto 34, observou-se um aumento substancial na expressão de SOX17. Além disso, o GDF-8 e o Wnt3a com o Composto 34 foram suficientes para produzir uma expressão de SOX17 (88% do controle) em uma faixa similar àquela observada em um tratamento com 100 ng/mL de ativina A/Wnt3a. Parece que o fator de crescimento GDF-8 pode servir como uma substituição à ativina A durante a diferenciação do endoderma definitivo de células-tronco embrionárias humanas.
Exemplo 8
Triagem adicional para compostos capazes de diferenciar células-tronco pluripotentes em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
Com base nas estruturas de composto para os acertos identificados até então, conduziu-se uma busca por análogos, a fim de encontrar compostos relacionados adicionais para testar no bioensaio de endoderma definitivo. A busca por subestruturas resultou em compostos para triagem. Os parâmetros de triagem para este teste foram designados com a combinação de fatores que rendeu ótimos resultados em testes anteriores, especificamente combinando EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol e GDF-8 com o composto de moléculas pequenas.
Semeadura para teste das células: em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates,
103/247
PerkinElmer, Cat n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e teste: os fatores de crescimento adquiridos junto à R&D Systems foram: EGF (Cat. n° 236-EG), FGF4 (Cat. n°235-F4), PDGF-A (Cat. n°221-AA), PDGF-D (Cat. n°1159-SB), PDGF-A/B (Cat. n°222-AB), VEGF (Cat. n°293-VE) e GDF-8 (Cat. n° 788-G8). O muscimol foi adquirido junto à Tocris (Cat. n° 0289). A triagem foi conduzida com o uso de uma biblioteca de compostos que foram disponibilizados como estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenados a -80°C. Os compostos foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. As condições de teste foram realizadas em poços individuais, com alimentação em dias alternados ao longo de um período de teste de quatro dias. Ensaios de triagem primários foram iniciados por se aspirar o meio de cultura de cada um dos poços seguido de três lavagens em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190) para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. No primeiro dia do teste, os volumes de teste de 200 μΙ por poço foram adicionados de volta contendo o meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032), suplementado com 0,5% FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN), mais 2,5 μΜ do composto. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-A/B e VEGF), com a exceção de GDF-8, que foi testado a 25 ng/mL. A concentração final de teste do muscimol era de 20 μΜ. As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS mais 20 ng/mL de
104/247
Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14). As amostras de controle negativo continham o meio base DMEM:F12 suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL Wnt3a. No terceiro dia do teste, os volumes de teste de 200 pl por poço foram adicionados de volta contendo o meio base DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS mais
2,5 μΜ de composto, sem Wnt3a. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-A/B e VEGF), com a exceção de GDF-8, que foi testado a 25 ng/mL. A concentração final de teste do muscimol era de 20 μΜ. As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com 2% de FCS mais 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14). As amostras de controle negativo continham o meio base DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS. As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com FCS, substituindo-se 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14) pelo composto de anilina-piridinotriazina por todo o período de testes de quatro dias, juntamente com Wnt3a (20 ng/mL) nos dias 1 e 2. As amostras de controle negativo continham meio base DMEM:F12 suplementado com FCS, adicionando-se Wnt3a nos dias 1 e 2, mas omitindo-se o tratamento com ativina A.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG,
105/247 sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total da proteína SOX17 foi relatada como a intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula vezes a área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
Na tabela 7, o GDF-8 e uma combinação de fatores de crescimento/agonistas (EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol) foram testados com um novo conjunto de compostos à base de anilinapiridinotriazina. Os resultados de duas placas de teste neste experimento individual são classificadas em relação às respostas de SOX17 (como uma
106/247 porcentagem do tratamento do controle positivo com ativina A e Wnt3a). Foram identificados compostos adicionais que mostram atividade sinérgica significativa com o grupo de fator de crescimento/agonista. Esses compostos foram eficazes tanto para reter o número de células de teste, como para produzir expressão de SOX17 durante a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas na ausência de ativina A. Uma lista desses acertos com atividade maior que 25% do controle positivo é mostrada na tabela 8.
Deve-se observar que quatro acertos oriundos da triagem primária inicial (tabela 2) foram duplicados na biblioteca de análogos. Dois desses compostos repetiram-se como acertos na triagem de análogos (Composto 34 e Composto 35, mostrados em uma caixa na tabela 8), um foi um acerto fraco na triagem de análogos, e um composto não repetiu o resultado.
Exemplo 9
Efeitos dos compostos da presente invenção sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo na presença de baixas concentrações de ativina A
É importante determinar se os compostos que foram identificados como acertos nos bioensaios de endoderma definitivo, acima, também poderíam exibir uma atividade sinérgica com doses muito baixas de ativina A. Realizou-se uma avaliação inicial com o uso da lista curta de acertos dos compostos à base de anilina-piridinotriazina cíclica apontados na tabela 3B.
Semeadura para teste das células: aglomerados de célulastronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas
107/247 unir-se sob a forma de aglomerados para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e fatores de crescimento: estoques de fatores de crescimento adquiridos junto à R&D Systems foram: EGF (Cat. n° 236-EG), FGF4 (Cat. n°235-F4), PDGF-A (Cat. n°221-AA), PDGF-D (Cat. n°1159-SB), PDGF-A/B (Cat. n°222-AB), VEGF (Cat. n°293-VE) e GDF-8 (Cat. n° 788-G8). A ativina A foi adquirida junto à PeproTech (Cat. n°). O muscimol foi adquirido junto à Tocris (Cat. n° 0289). Todos os fatores de crescimento foram solubilizados em PBS com 0,1% de BSA (Sigma, Cat. n° A7888) e armazenados congelados a -80°C. O muscimol foi solubilizado em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenado congelado a -80°C. Os compostos foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO e armazenados a -80°C. Os compostos foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. Todos os fatores de crescimento e inibidores foram preparados em uma placa de polipropileno com 96 poços profundas, diluídos até 5x com soluções de estoque intermediárias em meio base DMEM:F12 no início do teste, e armazenados a 4°C.
Foi conduzido um teste de triagem secundária, com teste em triplicata e alimentação em dias alternados ao longo do período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada um dos poços, seguido de três lavagens em PBS para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste de 80 pl por poço foram adicionados de volta, contendo meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,625% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems),
12,5 ng/mL de ativina A e 3,125 μΜ de composto mais 20 μΙ de estoque a 5x
108/247 de fator de crescimento ou moléculas pequenas para produzir uma concentração final de 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a, 10 ng/mL de ativina A e
2,5 μΜ de composto. Todos os fatores de crescimento restantes foram testados a uma concentração final de teste de 50 ng/mL (EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-A/B e VEGF), com a exceção de GDF-8, que foi usado a 25 ng/mL. A concentração final de teste do muscimol era de 20 μΜ. Os poços com controle positivo (100 pl/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS, 20 ng/mL de Wnt3a e 10 ng/mL (dose baixa) ou 100 ng/mL (dose alta) de ativina A. Os poços com controle negativo (100 pl/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 0,5% de FCS e 20 ng/mL de Wnt3a, omitindo-se a ativina A.
No dia 3, os poços foram aspirados e alimentados com 80 pl de meio base DMEM:F12 suplementado com 2,5% de FCS (HyClone), 12,5 ng/mL de ativina A e 3,125 pM de composto mais 20 pl de estoque a 5x de fatores de crescimento ou moléculas pequenas por poço, para produzir uma concentração final de 2% de FCS, 10 ng/mL de ativina A e 2,5 pM de composto (omitindo-se o Wnt3a) e, conforme denotado no primeiro dia para todos os fatores de crescimento ou moléculas pequenas restantes. Os poços com controle positivo (100 pl/poço) continham o mesmo meio base suplementado com 2% de FCS e 10 ng/mL ou 100 ng/mL de ativina A, omitindose Wnt3a. Os poços com controle negativo (100 pl/poço) continham o mesmo meio base com 2% de FCS, omitindo-se tanto a ativina A como o Wnt3a.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems,
109/247
Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 9 mostra os resultados do teste de vários compostos e
110/247 diferentes combinações de fatores de crescimento com baixas doses de ativina A. Alguns compostos exibiram respostas sinérgicas robustas com vários fatores de crescimento. Em outros casos, os efeitos sinérgicos foram mais modestos, porém significativos em relação a um controle com baixa dose de ativina A. Outros compostos não apresentaram qualquer atividade em relação ao controle com baixa dose de ativina A.
Exemplo 10
Efeitos dos compostos da presente invenção sobre a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas individuais em células expressoras de marcadores da linhagem de endoderma definitivo, na ausência de ativina A
Os compostos à base de anilina-piridinotriazina cíclica foram, também, testados em um formato de triagem usando células dispersas, por meio de tratamento enzimático, em células individuais e folheadas em uma camada única para teste. O teste também fez alterações para eliminar o soro que poderia fornecer fatores de crescimento, ainda que em baixas doses. Para isso, o meio basal foi alterado, e o soro foi substituído por BSA isento de ácido graxo. O teste foi encurtado de quatro dias para três dias, de modo a oferecer um período mais estreito para a medição de resultados. Finalmente, o teste incluiu dois fatores de crescimento, EGF e FGF4, que haviam previamente mostrado efeitos significativos porém abaixo do ótimo sobre a diferenciação do endoderma definitivo na ausência de ativina A.
Teste de triagem
Semeadura para teste das células: em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As culturas foram tratadas com Accutase (Sigma, Cat. n° A6964), usando-se volumes equivalentes a 10 pL por 10 cm2 de área superficial durante 5 minutos a 37°C e, então, foram delicadamente ressuspensas, peletizadas por centrífugação, e ressuspensas em meio condicionado com MEF para contagem. Para semeadura para o teste, as células foram folheadas a 50.000 células/cm2 sobre placas pretas
111/247 com 96 poços revestidas por MATRIGEL® com fator de crescimento reduzido (Packard ViewPlates, Cat. n° 6005182), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se e recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 3 a 5 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e teste: estoques de EGF e FGF4 foram preparados em uma placa de polipropileno com 96 poços (Corning, Inc., Cat. n° 3960). O Composto 22 estava disponível como um estoque de 5 mM solubilizado em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenado a -80°C. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada um dos poços, seguido de três lavagens em PBS para remover quantidades residuais de fatores de crescimento e soro. Os volumes de teste de 80 pl por poço foram adicionados de volta, contendo meio base RPMI 1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400-089) suplementado com 2,5% de BSA isento de ácido graxo (MP Biomedicals LLC, Cat. n° 152401), 10 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc, Cat. n° 100-18B), 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN) e 3,125 μΜ de Composto 22 mais 20 μΙ de estoque a 5x de fatores de crescimento, para produzir uma concentração final de 2% de BSA isento de ácido graxo, 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc; Cat. n° 100-18B), 20 ng/mL de Wnt3a, e 2,5 μΜ de Composto 22 no teste. Os poços de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com 2% de BSA isento de ácido graxo, 8 ng/mL de bFGF, 20 ng/mL de Wnt3a e 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14). Os poços de controle negativo continham o mesmo meio base suplementado com 2% de BSA isento de ácido graxo, 8 ng/mL de bFGF e 20 ng/mL de Wnt3a, mas omitiu-se o tratamento com ativina A.
No segundo dia de teste, os poços foram novamente aspiradas e alimentadas com 80 μΙ por poço que foram adicionados de volta, contendo meio base RPMI 1640 suplementado com 2,5% de BSA isento de ácido graxo, 10 ng/mL de bFGF e 3,125 μΜ de Composto 22 mais 20 μΙ de
112/247 estoque a 5x de fatores de crescimento, para produzir uma concentração final de 2% de BSA isento de ácido graxo, 8 ng/mL de bFGF e 2,5 pM de Composto 22 no teste. Os poços de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com 2% de BSA isento de ácido graxo, 8 ng/mL de bFGF e 100 ng/mL de ativina A humana recombinante. As amostras de controle negativo continham o mesmo meio base suplementado com 2% de BSA isento de ácido graxo e 8 ng/mL de bFGF, mas omitiu-se o tratamento com ativina A.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS, fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 pl/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15
113/247 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
A tabela 10 mostra os resultados desse teste com o Composto 34. As amostras de controle com EGF e/ou FGF4 sozinho, sem o Composto 34, apresentaram baixa expressão de SOX17. A adição do Composto 34 adicionou um otimização significativa da expressão de SOX17.
Exemplo 11
Comparação entre a capacidade da ativina A e do GDF-8 para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
Um exemplo anterior mostrou que o GDF-8 é capaz de substituir a ativina A para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Foi importante conhecer as potências relativas de GDF-8GDF-8 e ativina A, no que se refere a sua capacidade para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Um teste de resposta à dosagem foi conduzido com o uso de concentrações equivalentes de cada fator de
114/247 crescimento, para comparar os resultados durante a diferenciação das células-tronco embrionárias.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL com teor reduzido de fator de crescimento, em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de células tronco embrionárias de ser humano foram mantidas com números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao fenótipo cariotípico normal e quanto à ausência de contaminação por micoplasma.
Os aglomerados celulares usados no teste foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e foram semeados sobre placas com 96 poços Packard VIEWPLATES (PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em volumes de 100 μΙ/poço. Usou-se um meio condicionado MEF suplementado com 8 ng/ml de bFGF para o plaqueamento inicial e expansão. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta uma alíquota de 100 μΙ do
115/247 meio para teste. As condições de teste foram realizadas em quadruplicate ao longo de um período de teste total de três dias, com alimentação nos dias 1 e 2, mediante aspiração e substituição do meio em cada poço com meio de teste sem uso. Duas cubas de polipropileno com 12 canaletas (Argos 5 Technologies, Inc, Cat. n° B3135) foram usadas para produzir o meio de teste contendo diferentes concentrações de ativina A (PeproTech, Cat. n°120-14) ou GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8). As canaletas numeradas de 2 a 12 de cada cuba continham 1 ml_ de meio para teste composto de meio RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n°: 22400) suplementado 10 com 2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401) e 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n°: 100-18B), e com 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems Cat. n° 1324WN/CF) adicionados no dia 1, e omitidos nos dias 2 e 3. A canaleta número 1 de cada cuba continha 1.600 ng/mL de ativina A ou 1.600 ng/mL de GDF15 8, diluídos no mesmo meio para teste. Transferiu-se 1 mL de meio da canaleta número 1 para a canaleta número 2, misturando-se bem. Uma ponta de pipeta sem uso foi usada para transferir um mL do meio da canaleta número 2 ao canal número 3, seguido de misturação cuidadosa. Ο mesmo procedimento foi repetido em sequência até a canaleta número 11, para cada respectiva cuba. A canaleta número 12 de cada cuba continha meio sem ativina A ou GDF-8. Desse modo, criou-se uma série de diluições para teste a duas vezes, contendo ativina A ou GDF-8 a concentrações na faixa de 1,6 ng/mL a 1.600 ng/mL, para adição aos respectivos poços de teste.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de três dias de cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma,
Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à
116/247 temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total de SOX17 em cada poço foram obtidas com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada conjunto de dados quadruplicado. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados da intensidade total de SOX17 foram calculados usando-se GraphPad Prism 4.02 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EUA). Os dados foram normalizados para definir os menores e maiores valores em cada conjunto de dados como 0% e 100%, respectivamente. A tabela 11 mostra os valores normalizados para cada um dentre os conjuntos de dados de ativina A e GDF-8. Duas curvas sigmoidais dose-resposta são mostradas na figura 2 conforme geradas com o uso dos valores normalizados mostrados na tabela 11. Os valores de R2, indicando o ajuste de curva, foram calculados com o uso de GraphPad Prism e determinados como sendo 0,9944 para ativina A e 0,9964 para GDF-8. Usando o GraphPad
117/247
Prism, os valores EC50 para cada fator de crescimento foram calculados e determinados como sendo 13,9 ng/mL para a ativina A e 184,8 ng/mL para o GDF-8. Esses dados indicam que o GDF-8 é menos potente que a ativina A, no que se refere a induzir células-tronco embrionárias humanas à diferenciação para células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Ainda assim, o GDF-8 pode substituir a ativina A e, a concentrações específicas, pode induzir uma população equivalente de células de endoderma definitivo, conforme denotado pela expressão de SOX17.
Exemplo 12
Células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, que são formadas de acordo com os métodos da presente invenção, são capazes de diferenciar-se adicionalmente em células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática
Populações paralelas de células-tronco embrionárias humanas foram diferenciadas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com o uso de GDF-8 em combinação com o Composto 34 ou o Composto 56. Em seguida, um protocolo de diferenciação gradual foi aplicado às células tratadas para promover a diferenciação para endoderma pancreático e linhagens endócrinas. Um controle paralelo, consistindo em células tratadas com ativina A e Wnt3a, foi mantido para propósitos de comparação durante todo o processo de diferenciação gradual. As amostras foram tomadas a cada estágio da diferenciação, para determinar o aparecimento de biomarcadores para proteínas e mRNA, representativos dos vários estágios de diferenciação.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição
118/247 das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e semeado sobre as placas de cultura de paredes pretas com 24 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Arctic White, Cat. n° AWLS-303012) em volumes de 0,5 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por toda a duração do teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta uma alíquota (0,5 mL) de meio para teste. As condições de teste para a primeira etapa de diferenciação foram conduzidos ao longo de um período de três dias, com alimentação diária mediante aspiração e substituição do meio de cada poço com meio de teste sem uso. No primeiro dia do teste, 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n°120-14) ou 200 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) foram adicionados aos respectivos poços de teste nas quais cada fator de crescimento foi diluído em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com 1% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401), 1% de Probumin (Millipore, Cat. n° 81-068-3) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF). No segundo dia de teste, diluiu-se 100 ng/mL de ativina A ou 200 ng/mL de
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GDF-8 em meio RPMI-1640 suplementado com 2% de FAF BSA sem Wnt3a. Em algumas amostras para teste usando GDF-8, o Wnt3a foi substituído por um Composto 34 ou um Composto 56, a uma concentração de 2,5 μΜ, e um Composto 34 ou um Composto 56 foi adicionado diariamente durante todos os três dias de diferenciação do endoderma definitivo. Na conclusão da primeira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de citometria de fluxo, de modo a avaliar os níveis de CXCR4, um marcador de formação de endoderma definitivo. Os poços adicionais foram coletadas para análise RT-PCR, de modo a medir outros marcadores de diferenciação.
Na conclusão da primeira etapa de diferenciação, os conjuntos replicados de poços paralelos de cada grupo de tratamento foram submetidos a uma diferenciação gradual adicional. É importante notar que, após a primeira etapa de diferenciação, todos os poços passando por cultura e diferenciação contínuas receberam o mesmo tratamento. O protocolo para essa diferenciação contínua é descrito abaixo.
A etapa 2 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de dois dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de meio DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) contendo 2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401), 50 ng/mL de FGF7 (PeproTech, Cat. n° 100-19) e 250 nM de ciclopamina (Calbiochem, Cat. n° 239804).
A etapa 3 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de quatro dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM (Invitrogen, Cat. n° 10569) suplementado com 1% de B27 (Invitrogen, Cat. n° 17504-044), 50 ng/mL de FGF7, 100 ng/mL de noguina (R&D Systems, Cat. n° 3344-NG), 250 nM de KAAD-ciclopamina (Calbiochem, Cat. n° 239804) e 2 mM de ácido todotransretinoico (RA) (Sigma-Aldrich, Cat. n° R2625). Na conclusão da terceira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para
120/247 análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para Pdx1, um fator de transcrição associado ao endoderma pancreático, e Cdx2, um fator de transcrição associado ao endoderma intestinal.
A etapa 4 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de três dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM suplementado com 1% de B27, 100 ng/mL de noguina, 100 ng/mL de netrina-4, 1 μΜ de DAPT (EMD Biosciences, Cat. n°565770) e 1 pM de inibidor Alk 5 (Axxora, Cat. n° ALX270-445). Na conclusão da quarta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para PDX1.
A etapa 5 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de sete dias em glicose com alto teor de DMEM com 1% de B27 e 1 pM de inibidor Alk 5. O meio em cada poço foi aspirado e substituído por uma alíquota sem uso (0,5 mL) em todos os dias. Na conclusão da quinta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para insulina e glucagon.
A etapa 6 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de sete dias em glicose com alto teor de DMEM com 1% de B27. O meio em cada poço foi aspirado e substituído por uma alíquota sem uso (0,5 mL) em dias alternados. Na conclusão da sexta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação.
Análise FACS: as células para análise FACS foram bloqueadas em uma solução a 1:5 de 0,5% de gama-globulina humana (Sigma, Cat. n°
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G-4386) em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14040-133): tampão corante BD FACS - BSA (BD, Cat. n° 554657) durante 15 minutos a 4°C. As células foram, então, coradas com anticorpos para CD9 PE (BD, Cat. n° 555372), CD99 PE (Caltag, Cat. n° MHCD9904) e CXCR4 APC (R&D Systems, Cat. n° FAB173A) durante 30 minutos a 4°C. Após uma série de lavagens em tampão corante BD FACS, as células foram coradas para viabilidade com 7-AAD (BD, Cat. n° 559925) e analisadas em um BD FACSArray. Um anticorpo de controle de isotipo IgGIK de camundongo, tanto para PE como para APC, foi usado para delimitar a porcentagem de células positivas.
Análise RT-PCR: amostras de RNA foram purificadas mediante ligação a uma membrana de sílica-gel (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) na presença de um tampão de alta salinidade contendo etanol, seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA foi adicionalmente purificado com o uso de um kit TURBO isento de DNA (Ambion, INC), e o RNA de alta qualidade foi então eluído em água. O rendimento e a pureza foram avaliados por leituras A260 e A280 em um espectrofotômetro. As cópias de CDNA foram produzidas a partir de RNA purificado com o uso de um kit de arquivo de cDNA de alta capacidade ABI (ABI, CA, EUA).
Exceto onde especificado em contrário, todos os reagentes foram obtidos junto à Applied Biosystems. As reações de PCR em tempo real foram executadas com o uso do sistema de detecção de sequência ABI PRISM® 7900. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA, EUA) foi usado com 20 ng de RNA transcrito reverso em um volume de reação total de 20 pL. Cada amostra de cDNA foi analisada em duplicata para correção quanto a erros de pipetagem. Os iniciadores e sondas TAQMAN® identificadas com FAM foram usados em concentrações de 200 nM. O nível de expressão para cada gene-alvo foi normalizado com o uso um controle endógeno de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase humana (GAPDH) anteriormente desenvolvido por Applied Biosistemas. Os conjuntos de iniciador e sonda são mencionados na tabela 12. Após uma incubação inicial a 50°C durante 2 min, seguida de 95°C durante 10 min, as amostras foram submetidas 40 vezes a ciclos em dois estágios, sendo uma etapa de
122/247 desnaturação a 95°C durante 15 s seguida de uma etapa de recozimento/extensão a 60°C durante 1 minuto. A análise de dados foi realizada com o uso do software de detecção de sequências GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Para cada conjunto de iniciador/ponta de prova, um valor Ct foi determinado como o número de ciclo no qual a intensidade de fluorescência alcançou um valor específico no meio da região exponencial de amplificação. Os níveis de expressão genética relativos foram calculados com o uso do método Ct comparativo. Brevemente, para cada amostra de cDNA, o valor Ct de controle endógeno Ct foi subtraído do gene de interesse Ct para proporcionar o valor de delta Ct (ACt). A quantidade normalizada de alvo foi calculada como 2-ACt, assumindo a amplificação em 100% de eficiência. Os dados finais foram expressos em relação a uma amostra de calibração.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens. Outros anticorpos primários usados para análise incluíram diluição a 1:100 de CDX2 de camundongo anti-humano (Invitrogen, Cat. n° 397800), diluição a 1:100
123/247 de Pdx1 de cabra anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Cat. n° SC14664), diluição a 1:200 de insulina de coelho anti-humano (Cell Signaling, Cat. n° C27C9), e diluição a 1:1500 de glucagon de camundongo antihumano (Sigma-Aldrich, Cat. n° G2654). Os anticorpos secundários usados para análise incluíram diluição a 1:400 de Alexa Fluor 647 IgG de galinha anti-camundongo (Invitrogen, Cat. n° A-21463), diluição a 1:200 de Alexa Fluor 488 IgG de jumento anti-cabra (Invitrogen, Cat. n° A11055), diluição a 1:1000 de Alexa Fluor 647 IgG de galinha anti-coelho (Invitrogen, Cat. n° A21443), e diluição a 1:1000 de Alexa Fluor 488 IgG de galinha anticamundongo (Invitrogen, Cat. n° A21200).
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
Os resultados de PCR para marcadores de diferenciação representativos são mostrados na tabela 13 para células coletadas a partir de cada etapa de diferenciação. As amostras tratadas com GDF-8 e Wnt3a, ou com GDF-8 e Composto 34 ou Composto 56, mostraram níveis de expressão similares ou, em alguns casos, otimizados para marcadores de expressão associados a diferenciação endodérmica e endócrina.
A figura 3 mostra os resultados da análise de FACS, mostrando
124/247 a expressão do marcador de endoderma definitivo, CXCR4, após a primeira etapa de diferenciação. O tratamento de células-tronco embrionárias humanas com GDF-8 e Wnt3a rendeu uma porcentagem equivalente de células positivas para CXCR4, em comparação ao tratamento com ativina A e Wnt3a. De modo similar, o tratamento de células-tronco embrionárias humanas com GDF-8 e uma molécula pequena (Composto 34 ou Composto 56) também rendeu uma porcentagem equivalente ou ligeiramente mais alta de células positivas para CXC4. A figura 4 mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína SOX17 normalizada em células-tronco embrionárias humanas, após três dias de diferenciação para endoderma definitivo. Os níveis de expressão para os grupos de tratamento usando GDF-8 com Wnt3a, ou GDF-8 com uma molécula pequena, são similares ao tratamento com ativina A e Wnt3a.
A figura 5 mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteínas Pdx1 e Cdx2 normalizada em células-tronco embrionárias humanas, após a terceira etapa de diferenciação para endoderma pancreático. Os níveis de expressão para grupos de tratamento usando GDF-8 com Wnt3a, ou GDF-8 com Wnt3a, ou GDF-8 com um composto da presente invenção, mostra níveis equivalentes de PDX1 e CDX2. Em alguns grupos de tratamento, diminuiu o número de células retidas após diferenciação, aumentando assim a razão entre as células que expressam PDX1. Foram obtidos resultados similares mostrando expressão de PDX1 normalizada equivalente em todos os grupos de tratamento após a quarta etapa de diferenciação, conforme mostrado na figura 6. Na figura 7, são mostrados níveis normalizados de proteína para insulina e glucagon, demonstrando expressão equivalente entre os grupos de tratamento com ativina A e com GDF-8.
Esses resultados coletivos demonstram que o GDF-8, em combinação com Wnt3a ou Composto 34 ou Composto 56, pode substituir a ativina A durante a diferenciação do endoderma definitivo e a subsequente diferenciação de endoderma pancreático e endócrino.
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Exemplo 13
Formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com outros membros da família de proteínas GDF
É importante determinar se o tratamento de células-tronco embrionárias humanas com outros membros da família GDF podería resultar na formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Testou-se o Wnt3a, em combinação com o Composto 34 ou o Composto 56, em células-tronco embrionárias humanas em combinação com seis diferentes fatores de crescimento GDF [GDF-3, GDF-5, GDF-8, GDF-10, GDF-11 e GDF-15], para determinara capacidade dos membros da família de proteínas GDF para diferenciar as células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Um controle paralelo de células tratadas com ativina A e Wnt3a foi mantido para propósitos de comparação.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
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Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e foram semeados sobre placas com 96 poços Packard VIEWPLATES (PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em volumes de 0,1 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por toda a duração do teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta alíquotas de 100 do meio para teste. As condições de teste foram realizadas em triplicata ao longo de um período de teste total de quatro dias, com alimentação nos dias 1 e 3, mediante aspiração e substituição do meio em cada poço com meio de teste sem uso. Vários membros da família de proteínas GDF foram obtidos para teste conforme exposto a seguir: GDF-3 (PeproTech, Cat. n° 120-22), GDF-5 (DePuy Orthopaedics, Inc., uma empresa Johnson & Johnson), GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8), GDF-10 (R&D Systems, Cat. n° 1543-BP), GDF11 (PeproTech, Cat. n° 120-11), GDF-15 (R&D Systems, Cat. n° 957GD). No primeiro dia do teste, todas os poços receberam uma alíquota (80 μΙ) de meio basal DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,5% de soro fetal bovino (Hyclone, Cat. n° SH30070.03). Foi criada uma série de cinco amostras diferentes, de controle ou experimentais para teste, a fim de avaliar a ativina A ou vários GDFs em combinação com Wnt3a ou com o Composto 34 ou o Composto 56. Essas amostras para teste foram adicionadas em alíquotas de 20 μΙ (concentradas a 5x) a poços de teste adequadamente combinadas, para produzir um volume de teste final de 100 μΙ em cada poço, nas condições de teste finais indicadas. No primeiro conjunto de amostras de controle, foram testadas as seguintes condições: 1) nenhum aditivo (isto é, nenhum fator de crescimento ou molécula pequena suplementar); 2) 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14) em combinação com 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF); 3) 20 ng/mL de Wnt3a por si só; 4) Composto 34 por si só
127/247 (2,5 μΜ) sem qualquer fator de crescimento ou molécula pequena; 5) Composto 56 por si só (2,5 μΜ) sem qualquer fator de crescimento ou molécula pequena. No segundo conjunto de amostras para teste, as seguintes condições foram testadas em combinação com 100ng/mL de GDF3: 1) nenhum aditivo (isto é, GDF-3 por si só); 2) 20 ng/mL de Wnt3a; 3) 20 ng/mL de Wnt3a com o Composto 34 (2,5 μΜ); 4) Composto 34 (2,5 μΜ); 5) Composto 56 (2,5 μΜ); e 6) 20 ng/mL de Wnt3a com o Composto 56 (2,5 μΜ). No terceiro conjunto de amostras para teste, cada uma das seis condições foi combinada com 100 ng/mL de GDF-5. No quarto conjunto de amostras para teste, cada uma das seis condições foi combinada com 100 ng/mL de GDF-8. No quinto conjunto de amostras para teste, cada uma das seis condições foi combinada com 100 ng/mL de GDF-10. No sexto conjunto de amostras para teste, cada uma das seis condições foi combinada com 100 ng/mL de GDF-11. No sétimo conjunto de amostras para teste, cada uma das seis condições foi combinada com 100 ng/mL de GDF-15. No terceiro dia de teste, todos os poços para todas as amostras para teste, receberam 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL do respectivo fator de crescimento GDF, sem Wnt3a ou Composto 34 ou Composto 56, diluído em meio DMEM:F12 suplementado com 2% de FBS.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467)
128/247 diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
A figura 8 mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína SOX17 em células-tronco embrionárias humanas, após quatro dias de diferenciação para endoderma definitivo. Em cada caso, os resultados são normalizados em relação ao tratamento do controle positivo com ativina A e Wnt3a. Na figura 8A, somente o tratamento do controle positivo rendeu uma expressão significativa de SOX17, sendo que o tratamento com Wnt3a por si só, ou qualquer dos Compostos 34 ou 56 por si sós deixou de induzir a expressão de SOX17. Na figura 8, painéis B a G, são mostrados os níveis de expressão de SOX17 normalizada para cada fator de crescimento GDF substituindo a ativina A nos respectivos tratamentos. GDF-3 (figura 8B) e GDF-5 (figura 8C) induziram uma expressão fraca de SOX17, e somente em amostras para teste nas quais estava presente um dos compostos da presente invenção. GDF10 (figura
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8D), GDF11 (figura 8E) e GDF15 (figura 8G) induziram níveis significativos de expressão de SOX17, mais do que foi observado em tratamentos com GDF3 ou 5, porém menos do que foi observado em tratamentos com ativina A e Wnt3a. Em geral, a expressão de SOX17 foi desprezível quando GDF10, GDF-11 ou GDF-15 foi combinado com Wnt3a, mas melhorou em combinação com um dos compostos da presente invenção, em particular quando combinado ao Composto 34. A figura 8D mostra os resultados para os grupos de tratamento usando GDF-8, nos quais o GDF-8 em combinação com o Composto 34 ou o Composto 56 causou uma indução robusta de SOX17, excedendo os resultados observados no controle positivo de ativina A/Wnt3a. Em alguns desse exemplos, a presença do Composto 34 ou do Composto 56, em combinação com um fator de crescimento GDF, também causou um aumento no número de células durante a diferenciação.
Esses resultados coletivos demonstram que o GDF-8 foi superior a todos os demais membros da família GDF testados, quando usado em combinação com o Composto 34 ou o Composto 56, e poderia substituir a ativina A durante a diferenciação do endoderma definitivo.
Exemplo 14
Formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com outros membros da superfamília de proteínas TGF
É importante determinar se o tratamento de células-tronco embrionárias humanas com outros membros da superfamília TGF poderia facilitar a formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. O Composto 34 e Wnt3a foram testados em células-tronco embrionárias humanas em combinação com TGFp-1, BMP2, BMP3 ou BMP4, para determinar a capacidade dos membros da superfamília TGF para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Em paralelo, duas fontes comerciais diferentes de GDF-8 foram testadas com Wnt3a quanto à sua capacidade para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marca130/247 dores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Um controle positivo usando-se ativina A com Wnt3a foi mantido para propósitos de comparação.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de célula-tronco embrionária humana foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e foram semeados sobre placas com 96 poços Packard VIEWPLATES (PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em volumes de 0,1 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por todo o teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta alíquotas de 100 do meio para teste. As condições de teste foram realizadas em triplicata ao longo de um período de teste total de três dias, com alimentação nos dias 1 e 2, mediante
131/247 aspiração e substituição do meio em cada poço com meio de teste sem uso. Vários proteínas de fator de crescimento foram obtidas para teste, conforme exposto a seguir: BMP-2 (R&D Systems, Cat. n° 355-BM); BMP-3 (R&D Systems, Cat. n° 113-BP); BMP-4 (R&D Systems, Cat. n° 314-BP); ΤΟΡβ-1 (R&D Systems, Cat. n° 240-B); GDF-8 (PeproTech, Cat. n° 120-00); GDF-8 (Shenandoah, Cat. n° 100-22); e ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14). No primeiro dia do teste, cada poço foi tratado com 80 pl de meio de crescimento [RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) contendo 2,5% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401) e 10 ng/mL de bFGF], Em alguns poços, adicionou-se 25 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF) ao meio de crescimento, para produzir uma concentração final de teste de 20 ng/mL. Em alguns poços, adicionou-se ativina A ao meio de crescimento, para produzir uma concentração final de teste de 100 ng/mL. Em alguns poços, adicionou-se 3,125 μΜ de Composto 34 ao meio de crescimento, para produzir uma concentração final de teste de 2,5 μΜ. Uma titulação de dose de fatores de crescimento adicionais (concentrada 5x, diluída em RPMI-1640) também foi adicionada aos respectivos poços de teste, para produzir um volume de teste final de 100 μΙ em cada poço, para todas as condições de tratamento. No segundo dia de teste, o Wnt3a e o Composto 34 foram omitidos do teste. Todos os poços receberam 80 μΙ de meio de crescimento [RPMI-1640 contendo 2,5% de FAF BSA e 10 ng/mL de bFGF] e 20 μΙ da respectiva diluição de fator de crescimento (concentrada 5x, diluída em RPMI-1640). Os controles comparativos para esse teste incluíam: 1) nenhum fator de crescimento adicionado; 2) Wnt3a por si só; e 3) ativina A com Wnt3a. Cada fonte comercial de GDF-8 foi testada em combinação com Wnt3a. Cada um dos fatores de crescimento BMP, bem como ΤΟΡβ-1, foi testado em combinação com Wnt3a, com o Composto 34, e com Wnt3a em combinação com o Composto 34.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à
132/247 temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
A figura 9 mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína SOX17 em células-tronco embrionárias humanas, após três dias de diferenciação para endoderma definitivo. Em cada caso, os
133/247 resultados são normalizados em relação ao tratamento do controle positivo com ativina A e Wnt3a. Os resultados na figura 9A mostram que o tratamento com o meio de crescimento por si só, ou com Wnt3a por si só, deixou de induzir a expressão de SOX17, sendo que somente a adição de ativina A causou uma expressão robusta de SOX17. Na figura 9, painéis B e C, são representados os resultados para cada uma das fontes comerciais de GDF-8, mostrando diferenças de potência entre os dois fornecedores. Embora menos potente que a ativina A, houve indução significativa da expressão de SOX17 nas células tratadas com GDF-8 em combinação com Wnt3a. Na figura 9, painéis D, E, F e G, são mostrados resultados para a diferenciação do endoderma definitivo com o uso de BMP2, BMP3, BMP4 e TGFP-1, incorporando-se uma titulação de dose para cada fator de crescimento em combinação com Wnt3a, ou o Composto 34, ou Wnt3a juntamente com o Composto 34. Embora alguns tratamentos tenham apresentado um efeito significativo sobre os números de células na conclusão do teste (por exemplo BMP2 e BMP4), a indução da expressão de SOX17 resultante de qualquer dessas combinações de fatores de crescimento e tratamentos foi fraca ou desprezível em comparação ao tratamento com Wnt3a por si só.
Exemplo 15
Estudo de faixas de dose para a formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo com uma seleção dos compostos da presente invenção
É importante conhecer as concentrações ótimas de trabalho para o Composto 181, o Composto 180, o Composto 19, o Composto 202, o Composto 40 e o Composto 34, que poderíam mediar a formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Em conjunto, foram realizadas comparações lado a lado para titulações de cada composto em combinação com ativina A ou GDF-8 no teste de endoderma definitivo. Finalmente, a duração da exposição para cada composto foi testada nos ensaios, também em combinação com ativina A ou GDF-8, adicionando o composto somente no primeiro dia do teste ou
134/247 ao longo de todos os três dias de formação de endoderma definitivo.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 10018B) e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletarse um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de célula-tronco embrionária humana foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e foram semeados sobre placas com 96 poços Packard VIEWPLATES (PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em volumes de 0,1 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por toda a duração do teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta alíquotas de 100 do meio para teste. As condições de teste foram realizadas em quadruplicata ao longo de um período de teste total de quatro dias, com alimentação diária mediante aspiração e substituição do meio em cada poço com meio de teste sem uso.
135/247
Cada poço foi tratado com 80 μΙ de meio de crescimento [RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) contendo 2,5% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401), 10 ng/mL de bFGF e fatores de crescimento adicionais (concentrados a 1,25x)J e 20 μΙ do composto de teste (concentrado a 5x e diluído em RPMI1640) para produzir um volume de teste final de 100 ul em cada poço. Os compostos para teste neste ensaio incluíam seis dos compostos da presente invenção: Composto 181, Composto 180, Composto 19, Composto 202, Composto 40 e Composto 34, bem como um inibidor GSK3i BIO comercialmente disponível (EMD Chemicals, Inc., Cat. n° 361550). No primeiro dia do teste, os poços foram tratados com vários controles ou condições experimentais. As condições de controle, com concentrações finais de teste conforme indicadas, eram conforme exposto a seguir: 1) meio de crescimento por si só; 2) somente 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF); 3) 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14); 4) 100 ng/mL de ativina A e 20 ng/mL de Wnt3a; 5) 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8); 6) 100 ng/mL GDF-8 e 20 ng/mL de Wnt3a. Os compostos para teste foram diluídos duas vezes em série, para produzir uma faixa de concentração de 78 nM a 10 μΜ no teste final. As amostras para teste experimentais combinavam cada série de diluição do composto individual com 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8, sendo ambos os conjuntos de tratamento na ausência de Wnt3a. No segundo e no terceiro dias do teste, alguns poços continuaram a ser tratados com 20 ng/mL de Wnt3a ou com o composto de teste diluído em combinação com ativina A ou GDF-8. Em outros poços, o tratamento com ativina A ou GDF-8 continuou no segundo e no terceiro dias de teste, mas removeu-se o Wnt3a ou o composto de teste diluído.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2)
136/247 durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos for determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
Resultados: os resultados da análise de alto conteúdo são mostrados para a expressão de SOX17 nas figuras 10 a 14, e o número de células resultante na conclusão do teste é mostrado nas figuras 15 a 19. Na figura 10, os resultados são mostrados para a expressão de SOX 17 resultante dos tratamentos de controle usando ativina A ou GDF-8, por si sós
137/247 ou em combinação com Wnt3a. Os tratamentos com ativina A resultaram em uma expressão de SOX17 significativamente mais alta do que a observada no tratamento com GDF-8. De modo similar, conforme visto na figura 15, o tratamento com ativina A resultou em um número mais alto de células na conclusão do teste do que o observado no tratamento com GDF-8, independentemente da presença do Wnt3a por um ou três dias durante o teste. A adição de qualquer um dentre os Compostos 181, 180, 19, 202, 40 ou 34 ao tratamento com ativina A não otimizou a expressão de SOX17 (figuras 11 a 12), nem aumentou o número de células (figuras 17 a 18), independentemente de o composto ter estado presente durante um dia no início do teste, ou durante três dias por toda a duração do teste. Entretanto, o tratamento com um dentre os Compostos 181, 180, 19, 202, 40 ou 34 em combinação com GDF-8 aprimorou significativamente a expressão de SOX17 (figuras 13 a 14), além de aumentar também o número de células no final do teste (figuras 18 a 19). Quando um dos Compostos 181, 180, 19, 202, 40 ou 34 foi usado em combinação com o GDF-8, a otimização da expressão de SOX17 e do número de células foi, em muitos casos, equivalente aos resultados observados no tratamento com ativina A. A melhor diferenciação na combinação com GDF-8 ficou evidente em um efeito de titulação de dose para muitos dos compostos, embora por vezes fosse observada toxicidade nas concentrações mais altas. Na maioria dos casos, os melhores efeitos benéficos do tratamento com o composto e o GDF-8 ficaram evidentes com somente um dia de exposição ao composto, no início do teste. Em alguns casos, a presença do composto ao longo da duração do teste não teve qualquer efeito prejudicial, ou teve um efeito ligeiramente benéfico. A partir desses resultados coletivos, foi determinada uma faixa de concentrações funcionais ótimas para cada composto em combinação com o tratamento por GDF8. Os resultados foram específicos para cada composto, geralmente na faixa de 1 a 10 μΜ, conforme testado neste ensaio.
Exemplo 16
Células expressoras de marcadores característicos da linhagem
138/247 de endoderma definitivo, que são formadas sem estar de acordo com os métodos da presente invenção, são capazes de diferenciar-se adicionalmente em células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática
Moléculas pequenas adicionais foram testadas em combinação com GDF-8 para diferenciação do endoderma definitivo. Estas incluíram um inibidor de GSK3 comercialmente disponível, bem como compostos da presente invenção. Um protocolo de diferenciação gradual foi aplicado a células tratadas com GDF-8 em combinação com várias moléculas pequenas. A eficácia da diferenciação foi determinada por expressão gênica para biomarcadores representativos do endoderma pancreático, ou de linhagens endócrinas pancreáticas. Uma amostra de controle paralela de células tratadas com ativina A e Wnt3a foi mantida para propósitos de comparação durante todo o processo de diferenciação gradual.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL™ com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de célula-tronco embrionária humana foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos
139/247 em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e folheado sobre as placas de cultura de paredes pretas com 24 poços revestidas por MATRIGEL com teor reduzido de fator de crescimento (Arctic White, Cat n° AWLS-303012) em volumes de 0,5 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por toda a duração do teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta uma alíquota (0,5 mL) de meio para teste. As condições de teste para a primeira etapa de diferenciação foram conduzidos ao longo de um período de três dias, com alimentação diária mediante aspiração e substituição do meio de cada poço com meio de teste sem uso. No primeiro dia do teste, 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n°120-14) ou 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) foram adicionados aos respectivos poços de teste nas quais cada fator de crescimento foi diluído em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com 2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (Proliant Inc., Cat n° SKU 68700) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF). No segundo dia de teste, diluiu-se 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8 em meio RPMI-1640 suplementado com 2% de FAF BSA sem Wnt3a. Em algumas amostras para teste usando GDF-8, o Wnt3a foi substituído por um composto de moléculas pequenas, adicionado somente no primeiro dia da diferenciação do endoderma definitivo. Essas moléculas pequenas incluíam o Composto 19 (2,5 μΜ no teste), o Composto 202 (2,5 pM no teste), o Composto 40 (2,5 pM no teste), ou um inibidor de GSK3 BIO disponível comercialmente (0,5 pM no teste) (EMD Chemicals, Inc., Cat. n° 361550). Na conclusão da primeira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletados para análise de citometria de fluxo, de modo a avaliar os níveis de CXCR4, um marcador de formação de endoderma definitivo. Os poços adicionais foram coletados para análise RT-PCR, de modo a medir outros marcadores de diferenciação.
140/247
Na conclusão da primeira etapa de diferenciação para endoderma definitivo, os conjuntos replicados de poços paralelos de cada grupo de tratamento foram submetidos a uma diferenciação gradual adicional. É importante notar que, após a primeira etapa de diferenciação, todas os poços passando por cultura e diferenciação subsequente receberam o mesmo tratamento. O protocolo para essa diferenciação contínua é descrito abaixo.
A etapa 2 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de dois dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de meio DMEM:F12 (Invitrogen, Cat n° 11330-032) contendo 2% de FAF BSA, 50 ng/mL de FGF7 (PeproTech, Cat. n° 100-19) e 250 nM de ciclopamina-KAAD (Calbiochem, Cat. n° 239804).
A etapa 3 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de sete dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM (Invitrogen, Cat. n° 10569) suplementada com 0,1% de Albumax (Invitrogen, Cat. n° 11020-021), 0,5x de insulina-transferrina-selênio (ITS-X, Invitrogen, Cat. n° 51500056), 50 ng/mL de FGF7, 100 ng/mL de noguina (R&D Systems, Cat. n° 3344NG), 250 nM KAAD-ciclopamina, e 2 pM ácido todo-transretinoico (RA) (Sigma-Aldrich, Cat. n° R2625). Na conclusão da terceira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para Pdx1 e Cdx2.
A etapa 4 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de três dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM suplementada com 0,1% de Albumax, 0,5x de insulina-transferrina-selênio, 100 ng/mL de noguina e 1 pM de inibidor Alk 5 (Axxora, Cat. n° ALX-270-445). Na conclusão da quarta
141/247 etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação.
Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para Pdx1.
A etapa 5 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de sete dias em glicose com alto teor de DMEM com 0,1% de Albumax, 0,5x de insulina-transferrina-selênio e 1 μΜ de inibidor Alk 5. O meio em cada poço foi aspirado e substituído por uma alíquota sem uso (0,5 mL) em todos os dias. Na conclusão da quinta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletados para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos à análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para insulina e glucagon.
Análise FACS: as células para análise FACS foram bloqueadas em uma solução a 1:5 de 0,5% de gama-globulina humana (Sigma, Cat. n° G-4386) em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14040-133): tampão corante BD FACS - BSA (BD, Cat. n° 554657) durante 15 minutos a 4°C. As células foram, então, coradas com anticorpos para CD9 PE (BD, Cat. n° 555372), CD99 PE (Caltag, Cat. n° MHCD9904) e CXCR4 APC (R&D Systems, Cat. n° FAB173A) durante 30 minutos a 4°C. Após uma série de lavagens em tampão corante BD FACS, as células foram coradas para viabilidade com 7AAD (BD, Cat. n° 559925) e analisadas em um BD FACSArray. Um anticorpo de controle de isotipo IgGIK de camundongo, tanto para PE como para APC, foi usado para delimitar a porcentagem de células positivas.
Análise RT-PCR: amostras de RNA foram purificadas mediante ligação a uma membrana de sílica-gel (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) na presença de um tampão de alta salinidade contendo etanol, seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA foi adicionalmente purificado com o uso de um kit TURBO isento de DNA (Ambion, INC), e o RNA de alta qualidade foi então eluído em água. O rendimento e a pureza foram avaliados por leituras A260 e A280 em um espectrofotômetro. As cópias de CDNA foram produzidas a partir de RNA purificado com o uso de um kit de
142/247 arquivo de cDNA de alta capacidade ABI (ABI, CA, EUA).
Exceto onde especificado em contrário, todos os reagentes foram obtidos junto à Applied Biosystems. As reações de PCR em tempo real foram executadas com o uso do sistema de detecção de sequência ABI PRISM® 7900. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA, EUA) foi usado com 20 ng de RNA transcrito reverso em um volume de reação total de 20 pL. Cada amostra de cDNA foi analisada em duplicata para correção quanto a erros de pipetagem. Os iniciadores e sondas TAQMAN® identificadas com FAM foram usados em concentrações de 200 nM. O nível de expressão para cada gene-alvo foi normalizado com o uso um controle endógeno de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase humana (GAPDH) anteriormente desenvolvido por Applied Biosistemas. Os conjuntos de iniciador e sonda são mencionados na tabela 12. Após uma incubação inicial a 50°C durante 2 min, seguida de 95°C durante 10 min, as amostras foram submetidas 40 vezes a ciclos em dois estágios, sendo uma etapa de desnaturação a 95°C durante 15 s seguida de uma etapa de recozimento/extensão a 60°C durante 1 minuto. A análise de dados foi realizada com o uso do software de detecção de sequências GENEAMP®7000 Sequence Detection System. Para cada conjunto de iniciador/ponta de prova, um valor Ct foi determinado como o número de ciclo no qual a intensidade de fluorescência alcançou um valor específico no meio da região exponencial de amplificação. Os níveis de expressão genética relativos foram calculados com o uso do método Ct comparativo. Brevemente, para cada amostra de cDNA, o valor Ct de controle endógeno Ct foi subtraído do gene de interesse Ct para proporcionar o valor de delta Ct (ACt). A quantidade normalizada de alvo foi calculada como 2-ACt, assumindo a amplificação em 100% de eficiência. Os dados finais foram expressos em relação a uma amostra de calibração.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com
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PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 pl/poço de PBS para formação de imagens. Outros anticorpos primários usados para análise incluíram diluição a 1:200 de insulina de coelho anti-humano (Cell Signaling, Cat. n° C27C9) e diluição a 1:1.500 de glucagon de camundongo anti-humano (Sigma-Aldrich, Cat. n° G2654). Os anticorpos secundários usados para análise incluíram diluição a 1:1.000 de Alexa Fluor 647 IgG de galinha anti-coelho (Invitrogen, Cat. n° A21443) e diluição a 1:1000 de Alexa Fluor 488 IgG de galinha anti-camundongo (Invitrogen, Cat. n° A21200).
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação
144/247 das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
Os resultados de PCR para marcadores de diferenciação representativos são mostrados na tabela 14 para células coletadas a partir de cada etapa de diferenciação. As amostras tratadas com GDF-8 e Wnt3a, ou com GDF-8 e uma molécula pequena, mostraram níveis de expressão similares para marcadores associados à diferenciação endodérmica e endócrina.
A figura 20, painel A mostra a análise de FACS para o marcador de endoderma definitivo, CXCR4, após a primeira etapa de diferenciação. O tratamento de células-tronco embrionárias humanas com GDF-8 e Wnt3a rendeu uma porcentagem similar de células positivas para CXCR4, em comparação ao tratamento com ativina A e Wnt3a. O tratamento de células-tronco embrionárias humanas com GDF-8 e um composto da presente invenção (Composto 19, Composto 202, Composto 40 ou inibidor GSK3 IX BIO) também rendeu uma porcentagem equivalente ou ligeiramente mais alta de células positivas para CXC4. A figura 20, painel B mostra a análise de imagens de alto conteúdo para expressão de proteína SOX17 normalizada em células-tronco embrionárias humanas, após três dias de diferenciação para endoderma definitivo. Em alguns casos, o tratamento com GDF-8 resultou em um número de células mais baixo na conclusão da primeira etapa de diferenciação. Entretanto, o tratamento com GDF-8 em combinação com Wnt3a ou com os inibidores de molécula pequena claramente induziu a expressão de SOX17, um marcador de endoderma definitivo. Em um exemplo, o tratamento com GDF-8 e o Composto 40 rendeu um número de células em cultura e uma expressão de SOX17 equivalentes ao tratamento com ativina A e Wnt3a.
A figura 20, painel C, mostra a análise de imagens de alto conteúdo para números relativos de células recuperadas de culturas tratadas por meio da etapa de diferenciação 5. Conforme observado anteriormente, ao final da etapa 1, alguns tratamentos causaram uma queda na recupe
145/247 ração celular em relação ao tratamento com ativina A e Wnt3a. Essa diminuição no número de células foi observada, especificamente, em grupos de tratamento usando GDF-8 com inibidor GSK3 BIO, e também usando GDF-8 com o Composto 19. Os grupos de tratamento com GDF-8 adicionais apresentaram recuperação celular similar à do tratamento com activin A e Wnt3a. Na figura 20, painéis D a F, são mostrados os níveis normalizados de proteína para insulina e glucagon, juntamente com sua respectiva razão em cada grupo de tratamento. Níveis similares de insulina e glucagon poderíam ser obtidos em cada um dos tratamentos com GDF-8, em relação ao tratamento com ativina A e Wnt3a, demonstrando que o GDF-8, em combinação com Wnt3a ou uma molécula pequena, pode substituir a ativina A durante a diferenciação do endoderma definitivo e a subsequente diferenciação de endoderma pancreático e endócrino.
Exemplo 17
Células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo, gue são formadas com o uso de GDF-8 e um composto da presente invenção, são capazes de diferenciar-se adicionalmente em células expressoras de marcadores característicos da linhagem endócrina pancreática
Moléculas pequenas adicionais foram testadas em combinação com GDF-8 e ativina A para diferenciação do endoderma definitivo. Estas incluíram um inibidor de GSK3 comercialmente disponível, bem como os compostos da presente invenção. Um protocolo de diferenciação gradual foi aplicado a células tratadas com GDF-8 em combinação com várias moléculas pequenas. A eficácia da diferenciação foi determinada por expressão gênica para biomarcadores representativos do endoderma pancreático e de linhagens endócrinas pancreáticas. Uma amostra de controle paralela de células tratadas com ativina A e Wnt3a foi mantida para propósitos de comparação durante todo o processo de diferenciação gradual.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferen
146/247 ciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 10018B) e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de micoplasma.
Os aglomerados celulares foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF e folheado sobre as placas de cultura de paredes pretas com 24 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Arctic White, Cat n° AWLS-303012) em volumes de 0,5 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por todo o teste.
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta uma alíquota (0,5 mL) de meio para teste. As condições de teste para a primeira etapa de diferenciação foram conduzidos ao longo de um período de três dias, com alimentação diária mediante aspiração e substituição do meio de cada poço com meio de teste sem uso. No primeiro dia do teste, 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14) ou 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) foram adicionados aos respectivos poços de teste nas quais cada fator de crescimento foi diluído em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com
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2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (MP Biomedicals, Inc; Cat # 152401). Em algumas amostras, incluiu-se também 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF). No segundo dia de teste, diluiu-se 100 ng/mL de ativina A ou 100 ng/mL de GDF-8 em meio RPMI-1640 suplementado com 2% de FAF BSA, omitindo-se o Wnt3a de todas as amostras. Em algumas amostras para teste usando GDF-8, o Wnt3a foi substituído por uma determinada concentração de composto de moléculas pequenas, adicionado somente no primeiro dia da diferenciação do endoderma definitivo. Essas moléculas pequenas incluíam: Composto 181 (1,25 μΜ no teste), Composto 180 (2,5 μΜ no teste), Composto 19 (10 μΜ no teste), Composto 202 (2,5 μΜ no teste), Composto 40 (5 μΜ no teste), Composto 34 (2,5 μΜ no teste), Composto 206 (2,5 μΜ no teste), e um inibidor GSK3 IX BIO disponível comercialmente (10 μΜ no teste) (EMD Chemicals, Inc., Cat. n° 361550). Na conclusão da primeira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletadas para análise de citometria de fluxo, de modo a avaliar os níveis de CXCR4, um marcador de formação de endoderma definitivo. Os poços adicionais foram coletadas para análise RT-PCR, de modo a medir outros marcadores de diferenciação.
Na conclusão da primeira etapa de diferenciação para endoderma definitivo, os conjuntos replicados de poços paralelos de cada grupo de tratamento foram submetidos a uma diferenciação gradual adicional. É importante notar que, após a primeira etapa de diferenciação, todos os poços passando por cultura e diferenciação subsequente receberam o mesmo tratamento. O protocolo para essa diferenciação contínua é descrito abaixo.
A etapa 2 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de dois dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de meio DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) contendo 2% de FAF BSA, 50 ng/mL de FGF7 (PeproTech, Cat. n° 100-19) e 250 nM de ciclopamina-KAAD (Calbiochem, Cat. n° 239804).
A etapa 3 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de
148/247 quatro dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM (Invitrogen, Cat. n° 10569) suplementada com 0,1% de Albumax (Invitrogen, Cat. n° 11020-021), 0,5x de insulina-transferrina-selênio (ITS-X, Invitrogen, Cat. n° 51500056), 50 ng/mL de FGF7, 100 ng/mL de noguina (R&D Systems, Cat. n° 3344-NG), 250 nM KAAD-ciclopamina, e 2 mM ácido todo-transretinoico (RA) (SigmaAldrich, Cat. n° R2625). Na conclusão da terceira etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletados para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação.
A etapa 4 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de três dias. As células foram alimentadas diariamente mediante aspiração do meio de cada poço, substituindo-se o mesmo por uma alíquota sem uso (0,5 mL) de glicose com alto teor de DMEM suplementada com 0,1% de Albumax, 0,5x de insulina-transferrina-selênio, 100 ng/mL de noguina e 1 μΜ de inibidor Alk 5 (Axxora, Cat. n° ALX-270-445). Na conclusão da quarta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletados para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação.
A etapa 5 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de sete dias em glicose com alto teor de DMEM com 0,1% de Albumax, 0,5x de insulina-transferrina-selênio e 1 μΜ de inibidor Alk 5. O meio em cada poço foi aspirado e substituído por uma alíquota sem uso (0,5 mL) em todos os dias. Na conclusão da quinta etapa de diferenciação, as células de alguns poços foram coletados para análise de RT-PCR, de modo a medir os marcadores de diferenciação. Outros poços de cultura foram submetidos a análise de imagens de alto conteúdo quanto a níveis de expressão de proteína para insulina e glucagon.
Análise FACS: as células para análise FACS foram bloqueadas em uma solução a 1:5 de 0,5% de gama-globulina humana (Sigma, Cat. n° G-4386) em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14040-133): tampão corante BD FACS - BSA (BD, Cat. n° 554657) durante 15 minutos a 4°C. As células foram, então, coradas com anticorpos para CD9 PE (BD, Cat. n° 555372), CD99 PE
149/247 (Caltag, Cat. n° MHCD9904) e CXCR4 APC (R&D Systems, Cat. n° FAB173A) durante 30 minutos a 4°C. Após uma série de lavagens em tampão corante BD FACS, as células foram coradas para viabilidade com 7AAD (BD, Cat. n° 559925) e analisadas em um BD FACSArray. Um anticorpo de controle de isotipo IgGIK de camundongo, tanto para PE como para APC, foi usado para delimitar a porcentagem de células positivas.
Análise RT-PCR: amostras de RNA foram purificadas mediante ligação a uma membrana de sílica-gel (Rneasy Mini Kit, Qiagen, CA) na presença de um tampão de alta salinidade contendo etanol, seguido de lavagem para remover os contaminantes. O RNA foi adicionalmente purificado com o uso de um kit TURBO livre de DNA (Ambion, INC), e o RNA de alta qualidade foi então eluído em água. O rendimento e a pureza foram avaliados por leituras A260 e A280 em um espectrofotômetro. As cópias de CDNA foram produzidas a partir de RNA purificado com o uso de um kit de arquivo de cDNA de alta capacidade ABI (ABI, CA, EUA).
Exceto onde especificado em contrário, todos os reagentes foram obtidos junto à Applied Biosystems. As reações de PCR em tempo real foram executadas com o uso do sistema de detecção de sequência ABI PRISM® 7900. TAQMAN® UNIVERSAL PCR MASTER MIX® (ABI, CA, EUA) foi usado com 20 ng de RNA transcrito reverso em um volume de reação total de 20 pL. Cada amostra de cDNA foi analisada em duplicata para correção quanto a erros de pipetagem. Os iniciadores e sondas TAQMAN® identificadas com FAM foram usados em concentrações de 200 nM. O nível de expressão para cada gene alvo foi normalizado com o uso um controle endógeno de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase humana (GAPDH) anteriormente desenvolvido por Applied Biosistemas. Os conjuntos de iníciador e sonda são mencionados na tabela 12. Após uma incubação inicial a 50°C durante 2 min, seguida de 95°C durante 10 min, as amostras foram submetidas 40 vezes a ciclos em dois estágios, sendo uma etapa de desnaturação a 95°C durante 15 s seguida de uma etapa de recozimento/extensão a 60°C durante 1 minuto. A análise de dados foi realizada com o uso do software de detecção de sequências GENEAMP®7000 Sequence
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Detection System. Para cada conjunto de iniciador/ponta de prova, urn valor Ct foi determinado como o número de ciclo no qual a intensidade de fluorescência alcançou um valor específico no meio da região exponencial de amplificação. Os níveis de expressão genética relativos foram calculados com o uso do método Ct comparativo. Brevemente, para cada amostra de cDNA, o valor Ct de controle endógeno Ct foi subtraído do gene de interesse Ct para proporcionar o valor de delta Ct (ACt). A quantidade normalizada de alvo foi calculada como 2-ACt, assumindo a amplificação em 100% de eficiência. Os dados finais foram expressos em relação a uma amostra de calibração.
Análise de alto conteúdo: na conclusão da cultura, as placas de teste foram lavadas uma vez com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha, e adicionado a cada poço durante duas horas, à temperatura ambiente. Após lavar três vezes com PBS, adicionou-se a cada poço o anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anti-cabra IgG, Invitrogen, Cat. n° A21467) diluído a 1:200 em PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 5 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante quinze minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens. Outros anticorpos primários usados para análise incluíram diluição a 1:100 de CDX2 de camundongo anti-humano (Invitrogen, Cat. n° 397800), diluição a 1:100 de Pdx1 de cabra anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Cat. n° SC-14664), diluição a 1:200 de insulina de coelho anti-humano (Cell Signaling, Cat. n° C27C9), e diluição a 1:1500 de glucagon de camundongo anti-humano
151/247 (Sigma-Aldrich, Cat. n° G2654). Os anticorpos secundários usados para análise incluíram diluição a 1:400 de Alexa Fluor 647 IgG de galinha anticamundongo (Invitrogen, Cat. n° A-21463), diluição a 1:200 de Alexa Fluor 488 IgG de jumento anti-cabra (Invitrogen, Cat. n° A11055), diluição a 1:1000 de Alexa Fluor 647 IgG de galinha anti-coelho (Invitrogen, Cat. n° A21443), e diluição a 1:1000 de Alexa Fluor 488 IgG de galinha anticamundongo (Invitrogen, Cat. n° A21200).
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Foram capturadas imagens de 25 campos por poço. As medições quanto à intensidade total foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de tons cinza entre 200 e 4.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo.
Resultados: os resultados para os marcadores de diferenciação representativos são mostrados na figura 21 e na tabela 15, para células coletadas a partir de cada etapa de diferenciação. Nas figuras 21A e B, os resultados da citometria de fluxo para CXCR4 são mostrados para vários tratamentos durante a primeira etapa da diferenciação do endoderma definitivo. A figura 21A mostra os efeitos sobre a expressão de CXCR4 do tratamento com vários compostos em combinação com ativina A. A figura 21B mostra os efeitos sobre o CXCR4 do tratamento com vários compostos em combinação com GDF-8. Os compostos da presente invenção em combinação com ativina A não acentuaram a expressão de CXCR4. Entre
152/247 tanto, todos os compostos da presente invenção testados neste exemplo acentuaram a expressão de CXCR4 em combinação com GDF-8.
Nas figuras 21C e 21 D, os valores de RT-PCR normalizados para vários marcadores de diferenciação, ao final da primeira etapa de diferenciação, são mostrados para tratamentos aplicados durante a primeira etapa do protocolo, usando-se os compostos selecionados da presente invenção, em combinação com ativina A (figura 21C) ou em combinação com GDF-8 (figura 21 D). Valores similares de RT-PCR normalizados foram avaliados na conclusão da etapa três do protocolo de diferenciação (figuras 21E e 21F), ao final da etapa quatro do protocolo de diferenciação (figuras 21G e 21H) e ao final da etapa 5 do protocolo de diferenciação (figuras 211 e 21J). Os tratamentos durante a etapa de diferenciação 1, que combinavam um composto da presente invenção com GDF-8, apresentaram expressão acentuada de vários marcadores endodérmicos e pancreáticos em relação ao tratamento com GDF-8 por si só (figuras 21 F, 21H e 21J). Os tratamentos combinando compostos da presente invenção com ativina A tiveram pouca ou nenhuma melhoria nos marcadores de expressão, em relação ao tratamento com ativina A por si só ou com ativina A e Wnt3a (figuras 21E, 21G e 211). A tabela 15 resume os valores de CT comparativos para marcadores genéticos adicionais ao final de cada etapa de diferenciação, comparando tratamentos durante a primeira etapa que combinavam ativina A ou GDF-8, com ou sem um composto da presente invenção. Na conclusão da quinta etapa de diferenciação, realizou-se uma análise de alto conteúdo para medir os números de células (figuras 21K e 21M) e a expressão de proteína para insulina e glucagon (figuras 21L e 21N). O tratamento com GDF-8 durante a primeira etapa de diferenciação, sozinho ou em combinação com um composto da presente invenção, resultou na expressão de insulina e glucagon na conclusão da quinta etapa de diferenciação, demonstrando que o GDF-8 foi capaz de substituir a ativina A durante a iniciação da formação de endoderma definitivo, levando subsequentemente a células hormonais pancreáticas. Coletivamente, esses dados mostram que a adição de qualquer das respectivas moléculas pequenas
153/247 teve efeitos mínimos sobre os marcadores de diferenciação para tratamentos em combinação com ativina A. Entretanto, a adição de uma molécula pequena em combinação com tratamento por GDF8 teve efeitos aprimorados significativos sobre a imediata diferenciação do endoderma definitivo, na conclusão da primeira etapa de diferenciação e também em marcadores de diferenciação a jusante, na conclusão das etapas 3, 4 e 5. Foi observada uma variabilidade dentro do painel de moléculas pequenas, talvez atribuível à concentração do composto usado no teste, e/ou de seu mecanismo de ação.
Exemplo 18
Células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo gue foram formadas com o uso de GDF-8 e um composto da presente invenção são capazes de liberar peptídeo C em seguida ao transplante para um roedor
É importante determinar se as células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático geradas in vitro por tratamento com GDF-8 e uma molécula peguena poderíam produzir células endócrinas funcionais in vivo. Foi feito um estudo de transplante in vivo, para comparar as células diferenciadas por tratamento com ativina A e Wnt3a versus tratamento com GDF-8 e compostos de molécula pequena.
Preparação de células: aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231), com passagem em média a cada quatro dias. Um meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/ml de bFGF foi usado para semeadura inicial e expansão. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de contaminação por micoplasma.
A passagem das células foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada
154/247 única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados celulares foram centrifugados a baixa velocidade em meio condicionado com MEF, para remover quantidades residuais de dispase e, então, uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 100-18B) para semeadura sobre placas com 6 poços (Nunc, Cat. n° 140685) revestidas por MATRIGEL com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231) a uma razão de 1:3, usando volumes de 2,5 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 por toda o tempo em cultura.
Diferenciação celular, o processo de diferenciação foi iniciado três dias depois de as células serem semeadas sobre placas com 6 poços revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento. Um protocolo em quatro etapas foi usado para diferenciação in vitro de célulastronco embrionárias humanas H1 em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático. A etapa 1 foi conduzida ao longo de três dias para gerar células de endoderma definitivo. No primeiro dia da etapa 1, a diferenciação foi iniciada mediante a aspiração do meio de cultura gasto, seguida da adição de um volume igual de meio basal RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com 2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (Proliant Biologicals, Cat. n° SKU 68700) e 8 ng/mL de bFGF. Em um grupo de tratamento, as células foram expostas a 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14) com 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF). Em um segundo grupo de tratamento, as células foram expostas a 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) com 2,5 μΜ de Composto 40. Em um terceiro grupo de tratamento, as células foram expostas a 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) com 2,5 μΜ de Composto 202. No segundo e no terceiro dias da etapa 1 de diferenciação, as células em todos os grupos de tratamento foram alimentadas com RPMI-1640 contendo 2%
155/247 de FAF BSA, 8 ng/mL de bFGF e ou 100 ng/mL de ativina A (grupo de tratamento 1), ou 100 ng/mL de GDF-8 (grupos de tratamento 2 e 3), sem a adição de Wnt3a ou um composto da presente invenção. Ao final do terceiro dia de cultura, um poço de cada grupo de tratamento foi coletado para análise de FACS.
A etapa 2 do protocolo de diferenciação foi conduzida ao longo de três dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente com DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 2% de FAF BSA e 50 ng/mL de FGF7 (PeproTech, Cat. n° 100-19).
A etapa 3 do protocolo de diferenciação foi conduzida ao longo de quatro dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente com glicose com alto teor de DMEM (Invitrogen, Cat. n°10569) suplementado com 1% de B27 (Invitrogen, Cat. n° 17504044), 50 ng/mL de FGF7, 100 ng/mL de noguina (R&D Systems, Cat. n° 3344-NG), 250 nM de KAAD-ciclopamina (Calbiochem, Cat. n° 239804) e 2 μΜ de ácido todo-transretinoico (RA) (Sigma-Aldrich, Cat. n° R2625).
A etapa 4 do protocolo de diferenciação foi conduzida ao longo de três dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente, durante os primeiros dois dias, com glicose com alto teor de DMEM suplementado com 1% de B27, 100 ng/mL de noguina e 1 μΜ de inibidor ALK5 (Axxora, Cat. n° ALX-270-445). No terceiro dia, as células foram coletadas do substrato mediante o uso de uma ponta de 20 μΙ (Rainin, Cat. n° RT-L10F) e um raspador de células (Corning, Cat. n° 3008) e, então, transferidas para um tubo de 50 mL. As células foram deixadas sedimentar por gravidade, e o sobrenadante foi aspirado sem perturbar o pélete de células. As células foram ressuspensas em glicose com alto teor de DMEM suplementado com 1% de B27, 100 ng/mL de noguina e 1 mM de inibidor ALK5 e, então, cultivadas de um dia para o outro em microplacas de seis poços com fixação ultrabaixa Costar (Corning Inc., Cat. n° 3471). No dia seguinte, as células na cultura em suspensão foram coletadas e contadas. Alíquotas de 10x106 células/camundongo foram usadas para transplante. Alíquotas de 0,5 x 106 células foram coletadas para análise por RT-PCR.
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A figura 22 mostra os resultados da citometria de fluxo para células de endoderma definitivo geradas ao final da etapa 1 para cada um dos respectivos grupos de tratamento. O tratamento com ativina A e Wnt3a, ou o tratamento com GDF-8 e um composto da presente invenção, resultou em células que expressam níveis similares de CXCR4 (mais que 85%) ao final da etapa 1, sugerindo que uma população equivalente de células de endoderma definitivo foi derivada de cada grupo de tratamento.
Os resultados da análise de RT-PCR para células de cada grupo de tratamento na conclusão da etapa 4 do protocolo de diferenciação são mostrados na figura 22, painel B. As células diferenciadas em endoderma pancreático (PE) com o uso de ativina A e Wnt3a, ou com o uso de GDF-8 e o Composto 40, ou com o uso de GDF-8 e o Composto 202, expressaram níveis equivalentes de marcadores para PE: CDX2, MAFA, NGN3, NKX6.1, PDX1 e Ptf1 alfa. Esses resultados sugerem que o protocolo de diferenciação usando GDF-8 e uma molécula pequena foi igualmente eficaz na criação de uma população de células precursoras de endoderma pancreático.
Transplante, para camundongos, de células-tronco embrionárias humanas tratadas de acordo com os métodos da presente invenção: camundongos SCID beges machos (C.B-lgh-Vo/GbmsTac-Prkdc^-Lyst139 N7) com cinco a seis semanas de idade foram adquiridos junto à Taconic Farms. Os camundongos foram acomodados em gaiolas microisoladoras com livre acesso a alimento e água esterilizados. Em preparação para a cirurgia, os camundongos foram identificados por etiquetas na orelha, seu peso corporal foi medido, e sua glicose sanguínea foi determinada com o uso de um glicosímetro manual (LifeScan, One Touch). No dia da cirurgia, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de isoflurano e oxigênio, e o sítio cirúrgico foi raspado com aparadores próprios para pequenos animais. No pré-operatório, os camundongos receberam uma dose subcutânea de 0,1 mg.kg de Buprenex. O sítio cirúrgico foi preparado com sucessivas lavagens de 70% de álcool isopropílico, 10% de povidonaiodeto e 70% de álcool isopropílico, e uma incisão lateral esquerda foi feita através das camadas de pele e músculo. O rim esquerdo foi externalizado e
157/247 mantido úmido com cloreto de sódio a 0,9%. Um cateter I.V. de 24G x %” foi usado para penetrar a cápsula renal, e a agulha foi removida. O cateter foi, então, avançado sob a cápsula renal até o pólo distal do rim. Durante a preparação pré-operatória dos camundongos, as células para transplante foram centrifugadas em um tubo de 1,5 mL para microfuga, e a maior parte do sobrenadante foi removida, deixando uma quantidade suficiente de meio para coletar o pélete de células. As células foram coletadas em uma ponta de pipeta Rainin Pos-D para deslocamento positivo, e a pipeta foi invertida para deixar as células decantarem por gravidade. O excesso de meio foi dispensado, deixando uma preparação de células pronta para transplante. Para o transplante, a ponta de pipeta Pos-D foi colocada firmemente na parte central do cateter, e as células foram dispensadas da pipeta através do cateter sob a cápsula renal, para aplicação ao pólo distal do rim. O lúmen do cateter foi purgado com um pequeno volume de meio de cultura, para transportar quaisquer células restantes, e o cateter foi removido. A cápsula renal foi selada com um cautério de baixa temperatura, e o rim foi retornado a sua posição anatômica original. O músculo foi fechado por suturas contínuas com o uso de suturas 5-0 VICRYL, e a pele foi fechada com grampos cirúrgicos. O camundongo foi removido da anestesia e deixado recuperar-se totalmente. No pós-operatório, os camundongos receberam uma dose subcutânea de 1,0 mg.kg de Metacam.
Em seguida ao transplante, os camundongos foram pesados uma vez por semana, e a glicose sanguínea foi medida duas vezes por semana. Em vários intervalos em seguida ao transplante, os camundongos receberam doses de 3 g/kg de glicose IP e, 60 minutos após a injeção de glicose, foi coletado sangue via sinus retro-orbital e colocado em tubos para microfuga contendo uma pequena quantidade de heparina. O sangue foi centrifugado, e o plasma foi colocado em um segundo tubo de microfuga, e congelado em gelo seco para armazenamento a -80°C, até que fosse realizado o teste de peptideo C humano. Os níveis de peptideo C humano foram determinados com o uso do kit para diagnóstico Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA, de acordo com as instruções do
158/247 fabricante.
Os resultados do teste ELISA para peptídeo C humano são mostrados na figura 23 para camundongos transplantados com células obtidas de cada um dos respectivos grupos de tratamento. Nenhum peptídeo C humano circulante foi detectado quatro semanas após o transplante, para qualquer dos camundongos que receberam células de qualquer dos grupos de tratamento. Oito semanas após o transplante, peptídeo C detectável foi encontrado em um dentre dois camundongos que receberam células tratadas com ativina A e Wnt3a, um dentre três camundongos que receberam células tratadas com GDF-8 e Composto 40, e duas dentre três camundongos que receberam células tratadas com GDF-8 e Composto 202. Esses resultados sugerem que uma população equivalente de células precursoras endócrinas poderia ser derivada do protocolo de diferenciação com GDF-8 e uma molécula pequena, e que as células adicionalmente maturaram in vivo para uma célula secretora de insulina e responsiva a glicose.
Exemplo 19
Células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo que foram formadas com o uso de GDF-8 são capazes de liberar peptídeo C em seguida ao transplante para um roedor
É importante demonstrar que as células diferenciadas com GDF8 na ausência de ativina A poderíam, também, ser adicionalmente diferenciadas para uma população de células endócrinas capaz de secretar peptídeo C humano em um modelo de transplante de roedor in vivo.
Preparação de células: aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231), com passagem em média a cada quatro dias. Um meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/ml de bFGF foi usado para semeadura inicial e expansão. Todas as linhagens de células ES humanas foram mantidas em números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao cariótipo normal e à ausência de contaminação por micoplasma.
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A passagem das células foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados celulares foram centrifugados a baixa velocidade em meio condicionado com MEF, para remover quantidades residuais de dispase e, então, uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 100-18B) para semeadura sobre placas com 6 poços (Nunc, Cat. n° 140685) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231) a uma razão de 1:3, usando volumes de 2,5 mL/poço. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. As placas foram mantidas a 37°C, com 5% de CO2 durante toda a cultura.
Diferenciação celular, o processo de diferenciação foi iniciado três dias depois de as células serem semeadas em placas com 6 poços. Um protocolo em quatro etapas foi usado para diferenciação in vitro de célulastronco embrionárias humanas H1 em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático. A etapa 1 foi conduzida ao longo de três dias, para gerar células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. No primeiro dia da etapa 1, a diferenciação foi iniciada mediante a aspiração do meio de cultura gasto, seguida da adição de um volume igual de meio basal RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com 2% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA) (Proliant Biologicals, Cat. n° SKU 68700) e 8 ng/mL de bFGF. Em um grupo de tratamento, conjuntos de células em duplicata foram tratados com 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF). Em um segundo grupo de tratamento, conjuntos de células em duplicata foram tratados com 100 ng/mL de GDF-8 e 2,5 mM do Composto 40. No segundo e no terceiro dias da primeira etapa de diferenciação, as células em todos os
160/247 grupos de tratamento foram alimentadas com RPMI-1640 contendo 2% de
FAF BSA, 8 ng/mL de bFGF e 100 ng/mL de GDF-8, porém sem a adição de
Wnt3a ou do Composto 40. Ao final do terceiro dia de cultura, um poço de cada grupo de tratamento foi coletado para análise de FACS.
A etapa 2 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de três dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente com DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 2% de FAF BSA e 50 ng/mL de FGF7 (PeproTech, Cat. n° 100-19).
A etapa 3 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de quatro dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente com glicose com alto teor de DMEM (Invitrogen, Cat. n° 10569) suplementado com 1% de B27 (Invitrogen, Cat. n° 17504-044), 50 ng/mL de FGF7, 100 ng/mL de noguina (R&D Systems, Cat. n° 3344-NG), 250 nM de KA-AD-ciclopamina (Calbiochem, Cat. n° 239804) e 2 μΜ de ácido todotrans-retinoico (RA) (Sigma-Aldrich, Cat. n° R2625).
A etapa 4 do protocolo de diferenciação foi realizada ao longo de três dias. As células de todos os grupos de tratamento foram alimentadas diariamente com glicose com alto teor de DMEM suplementada com 1% de B27, 100 ng/mL de noguina e 1 μΜ de inibidor ALK5 (Axxora, Cat. n° ALX270-445), e 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) durante os primeiros dois dias. No terceiro dia da etapa 4, as células foram coletadas das placas com 6 poços usando-se uma ponta de 20 μΙ (Rainin, Cat. n° RTL10F) e um raspador de células (Corning, Cat. n° 3008), sendo então transferidas para um tubo de 50 mL. As células foram deixadas sedimentar por gravidade, e o sobrenadante foi aspirado sem perturbar o pélete de células. As células foram ressuspensas em glicose com alto teor de DMEM suplementado com 1% de B27, 100 ng/mL de noguina e 1 mM de inibidor ALK5 e, então, cultivadas de um dia para o outro em microplacas de seis poços com fixação ultrabaixa Costar (Corning Inc., Cat. n° 3471). No dia seguinte, as células na cultura em suspensão foram coletadas e contadas. Alíquotas de 10 x 106 células/camundongo foram usadas para transplante. Alíquotas de 0,5 x 106 células foram coletadas para análise por RT-RCR.
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A figura 24A mostra os resultados da citometria de fluxo para células de endoderma definitivo geradas ao final da etapa 1 para cada um dos respectivos grupos de tratamento. Os resultados para tratamento com GDF-8 e Wnt3a, ou tratamento com GDF-8 e Composto 40, expressaram níveis similares de CXCR4 ao final da etapa 1, sugerindo que uma população celular de endoderma definitivo equivalente e robusta resultou de cada grupo de tratamento. Conjuntos de tratamento em duplicata apresentaram forte concordância. Os resultados antes do transplante para análise de RTPCR na conclusão da etapa 4 do protocolo de diferenciação são mostrados na figura 24B. As células diferenciadas para endoderma pancreático (PE) com o uso de GDF-8 e Wnt3a, ou GDF-8 e Composto 40, expressaram níveis equivalentes de marcadores característicos da linhagem de endoderma pancreático, como: CDX2, MafA, Ngn3, NKX6.1, Pdx-1 e Ptf1A. Esses resultados demonstram que o protocolo de diferenciação usando GDF-8 e Wnt3a, ou GDF-8 e um composto da presente invenção, foi igualmente eficaz na criação de uma população de células precursoras de endoderma pancreático. O protocolo de diferenciação foi conduzido em dois conjuntos de tratamento independentes porém idênticos. Os resultados dos conjuntos de tratamento em duplicata apresentaram forte concordância, conforme mostrado por análise de RT-PCR.
Transplante, para camundongos, de células-tronco embrionárias humanas: camundongos SCID beges machos (C.B-/gri-1b/GbmsTacPrkdc^-Lys?9 N7) com cinco a seis semanas de idade foram adquiridos junto à Taconic Farms. Os camundongos foram acomodados em gaiolas microisoladoras com livre acesso a alimento e água esterilizados. Em preparação para a cirurgia, os camundongos foram identificados por etiquetas na orelha, seu peso corporal foi medido, e sua glicose sanguínea foi determinada com o uso de um glicosímetro manual (LifeScan, One Touch). No dia da cirurgia, os camundongos foram anestesiados com uma mistura de isoflurano e oxigênio, e o sítio cirúrgico foi raspado com aparadores próprios para pequenos animais. No pré -operatório, os camundongos receberam uma dose subcutânea de 0,1 mg.kg de Buprenex. O sítio cirúrgico foi
162/247 preparado com sucessivas lavagens de 70% de álcool isopropílico, 10% de povidona-iodeto e 70% de álcool isopropílico, e uma incisão lateral esquerda foi feita através das camadas de pele e músculo. O rim esquerdo foi externalizado e mantido úmido com cloreto de sódio a 0,9%. Um cateter I.V. de 24G x %” foi usado para penetrar a cápsula renal, e a agulha foi removida. O cateter foi, então, avançado sob a cápsula renal até o pólo distal do rim. Durante a preparação pré-operatória dos camundongos, as células para transplante foram centrifugadas em um tubo de 1,5 mL para microfuga, e a maior parte do sobrenadante foi removida, deixando uma quantidade suficiente de meio para coletar o pélete de células. As células foram coletadas em uma ponta de pipeta Rainin Pos-D para deslocamento positivo, e a pipeta foi invertida para deixar as células decantarem por gravidade. O excesso de meio foi dispensado, deixando uma preparação de células pronta para o transplante. Para o transplante, a ponta de pipeta PosD foi colocada firmemente na parte central do cateter, e as células foram dispensadas da pipeta através do cateter sob a cápsula renal, para aplicação ao pólo distai do rim. O lúmen do cateter foi purgado com um pequeno volume de meio de cultura, para transportar quaisquer células restantes, e o cateter foi removido. A cápsula renal foi selada com um cautério de baixa temperatura, e o rim foi retornado a sua posição anatômica original. O músculo foi fechado por suturas contínuas com o uso de 5-0 VICRYL, e a pele foi fechada com grampos cirúrgicos. O camundongo foi removido da anestesia e deixado recuperar-se totalmente. No pósoperatório, os camundongos receberam uma dose subcutânea de 1,0 mg.kg de Metacam.
Em seguida ao transplante, os camundongos foram pesados uma vez por semana, e a glicose sanguínea foi medida duas vezes por semana. Em vários intervalos em seguida ao transplante, os camundongos receberam doses de 3 g/kg de glicose IP e, 60 minutos após a injeção de glicose, foi coletado sangue via sinus retro-orbital e colocado em tubos para microfuga contendo uma pequena quantidade de heparina. O sangue foi centrifugado, e o plasma foi colocado em um segundo tubo de microfuga, e
163/247 congelado em gelo seco para armazenamento a -80°C, até que fosse realizado o teste de peptídeo C humano. Os níveis de peptídeo C humano foram determinados com o uso do kit para diagnóstico Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA, de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados do teste ELISA para peptídeo C humano são mostrados nas figuras 29C e D para camundongos transplantados com células obtidas de cada um dos respectivos grupos de tratamento. Níveis similares de peptídeo C humano eram detectáveis 8 semanas após o transplante, para cada categoria de tratamento, indicando que uma população equivalente de células endócrinas precursoras podería ser derivada do protocolo de diferenciação com o uso de GDF-8 e Wnt3a, ou de GDF-8 e um composto da presente invenção.
Exemplo 20
Avaliação do potencial dos inibidores de CDK, GSK3 e TRK para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
Um subconjunto de 14 moléculas pequenas proprietárias, conhecidas por terem especificidade para rotas de sinalização de CDK, GSK3 e/ou TRK, foram avaliadas quanto a seu potencial para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo.
Semeadura para teste das células: em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico para cultura de tecidos revestido por Matrigel® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), usandose volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se para, então,
164/247 recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e teste: a triagem foi realizada usando-se os compostos descritos na tabela 16. Além disso, o Composto 34 foi incluído como um controle positivo, conforme demonstrado nos exemplos anteriores. Os compostos foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenados a -80°C. Os compostos da biblioteca foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. As condições de teste foram realizadas em triplicata, com alimentação em dias alternados ao longo de um período de teste de quatro dias. O teste foi iniciado mediante aspiração do meio de cultura de cada poço, seguido de três lavagens em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190) para remover quantidades residuais de fatores de crescimento. No primeiro dia do teste, os volumes de teste de 200 μΙ por poço foram adicionados a cada poço usando-se meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,5% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03) e 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) mais 2,5 mM de composto. Um conjunto paralelo de amostras para teste foi tratado de maneira idêntica, porém omitindo-se o GDF-8 do meio. No terceiro dia do teste, os volumes de teste de 100 μΙ por poço foram adicionados a cada poço usando-se meio base DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS mais 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8). O GDF-8 foi omitido das amostras para teste que não foram tratadas com GDF-8 no primeiro dia do teste. As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com FCS e 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14) durante todo o teste de quatro dias, juntamente com adição de Wnt3a (20 ng/mL) nos dias 1 e 2. As amostras de controle negativo conti165/247 nham meio base DMEM:F12 suplementado com FCS.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anticabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, corados somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calcula
166/247 dos para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total de proteína SOX17 foi relatada como intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula multiplicada pela área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de cinza entre 200 e 3.500. Coletou-se a média de dados das poços em triplicata. A porcentagem de poços tratados em relação ao controle positivo foi calculada.
Os resultados para essa triagem são mostrados na tabela 17. Nenhuma das moléculas pequenas induziu uma expressão de SOX17 significativa na ausência de GDF-8 durante o processo de diferenciação em quatro dias. O Composto 34 serviu como um controle experimental, e induziu uma expressão de SOX17 significativa na presença de GDF-8, equivalente aos níveis observados com o controle positivo usando ativina A e Wnt3a. Os demais compostos da presente invenção testados neste exemplo apresentaram uma faixa de atividades com indução entre fraca e moderada para expressão de SOX17. Deve-se observar que a atividade de diferenciação nesse subconjunto de compostos foi observada em associação com a seletividade para todas as três rotas sinalizadoras enzimáticas, tornando difícil determinar conclusivamente um mecanismo de ação claro.
Exemplo 21
Triagem quanto a análogos dos compostos da presente invenção que são capazes de mediar a formação de células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo
Com base nas estruturas dos compostos da presente invenção, conduziu-se uma busca por análogos e 118 análogos foram encontrados. A triagem inicial determinou que alguns análogos eram capazes de induzir diferenciação do endoderma definitivo na ausência de ativina A, em combinação com outros fatores de crescimento. É importante determinar se esses análogos também poderíam induzir a diferenciação do endoderma definitivo em combinação apenas com GDF-8.
Semeadura para teste das células: em resumo, aglomerados de células-tronco embrionárias humanas H1 foram cultivados sobre plástico
167/247 para cultura de tecidos revestido por Matrigel® com teor reduzido de fator de crescimento (Invitrogen, Cat. n° 356231). As células foram passadas usando-se tratamento com colagenase (Invitrogen, Cat. n° 17104-019) e raspagem delicada, foram lavadas para remover quantidades residuais de enzima, e folheadas com dispersão uniforme a uma razão de 1:1 (área superficial) sobre placas pretas com 96 poços (Packard ViewPlates, PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), usando-se volumes de 100 μΙ/poço. As células foram deixadas unir-se para, então, recuperar a proliferação na fase log ao longo de um período de 1 a 3 dias, com alimentação diária de meio condicionado com MEF suplementado com 8 ng/mL de bFGF (R&D Systems, Cat. n° 233-FB). As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
Preparação de compostos e teste: a triagem foi realizada usando-se uma biblioteca de compostos análogos. Os compostos dessa biblioteca foram disponibilizados sob a forma de estoques de 5 mM no formato de placa com 96 poços, solubilizados em 100% de DMSO (Sigma, Cat. n° D2650) e armazenados a -80°C. Os compostos da biblioteca foram adicionalmente diluídos até uma concentração intermediária de 0,2 mM em 50 mM de HEPES (Invitrogen, Cat. n° 15630-080) e 20% de DMSO, e armazenados a 4°C. As condições de teste foram realizadas em triplicata, com alimentação em dias alternados ao longo de um período de teste de quatro dias. Os testes foram iniciados mediante aspiração do meio de cultura de cada poço, seguido de três lavagens em PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190) para remover quantidades residuais de fatores de crescimento. No primeiro dia do teste, os volumes de teste de 200 μΙ por poço foram adicionados a cada poço usando-se meio base DMEM:F12 (Invitrogen, Cat. n° 11330-032) suplementado com 0,5% de FCS (HyClone, Cat. n° SH30070.03) e 200 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) mais 2,5 μΜ de composto. No terceiro dia do teste, os volumes de teste de 100 μΙ por poço foram adicionados a cada poço usando-se meio base DMEM:F12 suplementado com 2% de FCS mais 200 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8).
168/247
As amostras de controle positivo continham o mesmo meio base suplementado com FCS e 100 ng/mL de ativina A humana recombinante (PeproTech, Cat. n° 120-14) durante todo o teste de quatro dias, juntamente com Wnt3a (20 ng/mL) nos dias 1 e 2. As amostras de controle negativo continham meio base DMEM:F12 suplementado com FCS, adicionando-se Wnt3a nos dias 1 e 2, mas omitindo-se o tratamento com ativina A.
Análise de alto conteúdo: na conclusão de quatro dias de cultura, as placas de teste foram lavadas duas vezes com PBS (Invitrogen, Cat. n° 14190), fixadas com 4% de paraformaldeído (Alexis Biochemical, Cat. n° ALX-350-011) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, então, lavadas três vezes com PBS e permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 (Sigma, Cat. n° T8760-2) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células foram lavadas novamente três vezes com PBS e bloqueadas com 4% de soro de galinha (Invitrogen, Cat. n° 16110082) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. O anticorpo primário (cabra anti-humano SOX17, R&D Systems, Cat. n° AF1924) foi diluído a 1:100 e 4% de soro de galinha e adicionado a cada poço durante uma hora, à temperatura ambiente. O anticorpo secundário conjugado Alexa Fluor 488 (galinha anticabra IgG, sondas moleculares, Cat. n° AZ1467) foi diluído a 1:200 em PBS e adicionado a cada poço de amostra, após lavagem por três vezes com PBS. Para contracorar os núcleos, adicionou-se 4 pg/mL de Hoechst 33342 (Invitrogen, Cat. n° H3570) durante dez minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas uma vez com PBS e deixadas em 100 μΙ/poço de PBS para formação de imagens.
A captura de imagens foi realizada com o uso de um equipamento de análise celular IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare), usando o filtro dicroico 51008bs para células coradas com Hoechst 33342 e Alexa Fluor 488. Os tempos de exposição foram otimizados a partir de poços com controle positivo e de poços com controle negativo não tratado, coradas somente com anticorpo secundário. Foram capturadas imagens de 15 campos por poço, para compensar por qualquer perda celular ocorrida durante o bioensaio e os procedimentos de coloração subsequentes. As medições
169/247 quanto ao número total de células e à intensidade total de SOX17 foram obtidas a partir de cada poço com o uso do software IN Cell Developer
Toolbox 1.7 (GE Healthcare). A segmentação para os núcleos foi determinada com base em níveis de escala de tons de cinza (linha de base na faixa de 100 a 300) e tamanho nuclear. Médias e desvios-padrão foram calculados para cada réplica de conjunto de dados. A expressão total da proteína SOX17 foi relatada como a intensidade total ou intensidade integrada, definida como a fluorescência total da célula vezes a área da célula. O fundo foi eliminado com base no critério de aceitação das faixas de escala de cinza 10 entre 200 e 3.500. Os dados de intensidade total foram normalizados mediante a divisão das intensidades totais para cada poço pela intensidade total média para o controle positivo. Dados normalizados foram calculados para médias e desvios-padrão de cada conjunto de réplicas.
Os resultados da triagem são mostrados na tabela 18, a partir 15 de quatro placas de teste neste único experimento. Os compostos são classificados em relação à expressão de SOX17 como uma porcentagem do tratamento do controle positivo com ativina A e Wnt3a. Esse teste identificou uma lista de 12 novos acertos de análogo, conforme mostrado na tabela 19.
Exemplo 22
Células-tronco embrionárias humanas cultivadas em microportadores podem ser diferenciadas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo de acordo com os métodos da presente invenção
Para os propósitos de diferenciação e produção de grandes números de células endócrinas sob condições escalonáveis, foi importante mostrar gue as células-tronco embrionárias humanas podiam ser cultivadas e diferenciadas para endoderme definitiva sobre microesferas portadoras com o uso dos métodos da presente invenção.
Preparação de células para teste e diferenciação: células H1 p49C3 foram rotineiramente cultivadas sobre microesferas Cytodex3 (GE
Healthcare Life Sciences, NJ, EUA) em um 125 mL frasco de agitação, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US n° 61/116.447.
170/247
Após sete dias, as células e as microesferas foram transferidas para uma placa com 6 poços (Vendor; Cat # XXX) a uma razão de 30 cm2 de área superficial da microesfera por poço, e a placa foi colocada em uma plataforma de agitação. As células sobre as microesferas no poço para tratamento do controle positivo (designada AA/Wnt3a) foram diferenciadas com adição de 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF) durante dois dias, seguido de 100 ng/mL de ativina A e 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 100-18B) durante um dia em RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 22400) com 2% de BSA isento de ácido graxo (MP Biomedicals, Inc, Cat. n° 152401), usando volumes de 2 mL/poço. O Composto 34, a uma concentração final de 2,5 μΜ, foi adicionado a uma poço de tratamento para controle negativo (designada CMP por si só) em RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço) durante três dias, na ausência de qualquer outro tratamento por fator de crescimento. Um terceiro poço de tratamento (designada CMP+8) recebeu o Composto 34 a 2,5 μΜ mais 50 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) em RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço) durante três dias. Um quarto poço de tratamento (designada CMP+8+D) recebeu o Composto 34 a 2,5 μΜ com 50 ng/mL de GDF-8 e 50 ng/mL de PDGF-D me RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço) durante três dias. Um quinto poço de tratamento (designada CMP+8+D+V) recebeu o Composto 34 a 2,5 μΜ com 50 ng/mL de GDF-8, 50 ng/mL de PDGF-D e 50 ng/mL de VEGF em RPMI1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço) durante três dias. Um sexto poço de tratamento (designada CMP+8+D+V+M) recebeu o Composto 34 a 2,5 μΜ com 50 ng/mL de GDF-8, 50 ng/mL de PDGF-D, 50 ng/mL de VEGF e 20 ng/mL de Muscimol em RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço) durante três dias. Todos os meios e tratamentos foram trocados diariamente.
Na conclusão do tratamento e do cultivo, as células foram coletadas das microesferas, de acordo com os métodos descritos no pedido de patente US n° 61/116.447. As células coletadas foram contadas e analisa171/247 das por citometria de fluxo, de acordo com os métodos acima descritos.
Os resultados são mostrados na figura 25. Conforme mostrado no painel A, números similares de células foram recuperados para todos os grupos de tratamento passando por diferenciação. Conforme mostrado no painel B, as células tratadas somente com o Composto 34 não se diferenciaram em células positivas para CXCR4. O tratamento do controle positivo, adicionando ativina A e Wnt3a durante a diferenciação, induziu a expressão de CXCR4 em 68% da população celular resultante. O Composto 34, adicionado com as várias combinações de fator de crescimento, induziu a expressão de CXCR4 em 50% da células, em média. Deve-se notar que níveis equivalentes de expressão de CXCR4 foram observados durante o tratamento com o Composto 34 em combinação com um único fator de crescimento, GDF-8, ou em combinação com múltiplos fatores de crescimento que incluíam GDF-8. Isso prova que o Composto 34, em combinação com pelo menos GDF-8, pode substituir a ativina A e o Wnt3a para promover a diferenciação do endoderma definitivo. Esse exemplo mostra, também, que o procedimento para tratamento é eficaz para células cultivadas e diferenciadas sobre microesferas portadoras.
Exemplo 23
Os compostos da presente invenção, juntamente com GDF-8, acentuam a proliferação celular
Um exemplo anterior mostrou que o GDF-8 é capaz de substituir a ativina A para diferenciar células-tronco embrionárias humanas em células expressoras de marcadores característicos da linhagem de endoderma definitivo. Foi importante conhecer as potências relativas do GDF-8 e da ativina A em relação à formação de endoderma definitivo. Um teste de resposta à dosagem foi conduzido com o uso de concentrações equivalentes de cada fator de crescimento, para comparar os resultados durante a diferenciação das células-tronco embrionárias humanas.
Os compostos da presente invenção usados em combinação com GDF-8 durante a diferenciação do endoderma definitivo foram avaliados quanto a sua capacidade para induzir a proliferação celular. Os resultados
172/247 foram comparados ao tratamento com ativina A ou GDF-8 por si sós.
Preparação de células para teste: culturas de estoque de células-tronco embrionárias humanas (linhagem de células-tronco embrionárias humanas H1) foram mantidas em um estado pluripotente não diferenciado sobre placas revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento (BD Biosciences, Cat. n° 356231), em meio condicionado com MEF e com passagem, em média, a cada quatro dias. A passagem foi realizada mediante a exposição das culturas celulares a uma solução de 1 mg/mL de dispase (Invitrogen, Cat. n° 17105-041) durante 5 a 7 minutos a 37°C, seguida de enxágue da camada única com meio de cultura condicionado com MEF e raspagem delicada para recuperar os aglomerados celulares. Os aglomerados foram centrifugados a baixa velocidade para coletar-se um pélete de células e para remover quantidades residuais de dispase. Os aglomerados celulares foram divididos a uma razão de 1:3 ou 1:4 para cultura de manutenção de rotina, ou a uma razão de 1:1 para teste imediato. Todas as linhagens de células-tronco embrionárias de ser humano foram mantidas com números de passagem menores que 50, e foram rotineiramente avaliadas quanto ao fenótipo cariotípico normal e quanto à ausência de contaminação por micoplasma.
Os aglomerados celulares usados no teste foram uniformemente ressuspensos em meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/mL de bFGF, e foram semeados sobre placas com 96 poços Packard VIEWPLATES (PerkinElmer, Cat. n° 6005182) revestidas por MATRIGEL® com teor reduzido de fator de crescimento, em volumes de 100 μΙ/poço. Um meio condicionado com MEF e suplementado com 8 ng/ml de bFGF foi usado para semeadura inicial e expansão. A alimentação diária foi conduzida aspirando-se o meio de cultura gasto de cada poço, e substituindo o mesmo por um volume igual de meio sem uso. Um conjunto de poços de fundo em cada placa de teste não foi semeado com células, mas foi tratado durante todo o teste com condições de meio basal. As placas foram mantidas a 37°C, 5% de CO2, em uma caixa umidificada por toda a duração do ensaio.
173/247
Teste: o teste foi iniciado mediante a aspiração do meio de cultura de cada poço, adicionando-se de volta uma alíquota final de 100 pl do meio para teste. As condições de teste foram realizadas em triplicata ao longo de um período de teste total de três dias, com alimentação diária 5 mediante aspiração e substituição do meio em cada poço com meio de teste sem uso. Testes idênticos foram preparados simultaneamente em paralelo, para avaliação ao final de 24, 48 e 72 horas.
No primeiro dia do teste, todos os poços contendo células receberam uma alíquota (80 μΙ) de meio RPMI-1640 (Invitrogen, Cat. n° 10 22400) suplementado com 2,5% de fração V de albumina bovina isenta de ácido graxo (FAF BSA, 2% no teste final) (Proliant Inc., Cat. n° SKU 68700). Várias amostras para controle e para teste foram criadas a uma concentração de 5x para serem adicionadas a poços adequados (20 μΙ por poço). As condições de controle incluíam o seguinte, com concentrações 15 finais de fator de crescimento conforme indicado: 1) meio basal com 2% de FAF BSA; 2) 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n°120-14) com 8 ng/mL de bFGF (PeproTech, Cat. n° 100-18B); 3) 100 ng/mL de ativina A com 8 ng/mL de bFGF e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324WN/CF); 4) 100 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) com 8 20 ng/mL de bFGF; 5) GDF-8 com 8 ng/mL de bFGF e 20 ng/mL de Wnt3a. As células em um conjunto adicional de poços de controle foram tratadas com meio condicionado com MEF durante todo o teste. Em algumas amostras de controle usando GDF-8, o Wnt3a foi substituído por um composto da presente invenção. Para as amostras para teste experimentais, os oito 25 diferentes compostos foram diluídos duas vezes em série, para criar três diferentes concentrações de dose, então combinadas com 100 ng/mL de GDF-8 e 8 ng/mL de bFGF. Essas moléculas pequenas incluíam os compostos proprietários Composto 181, Composto 180, Composto 19, Composto 202, Composto 40, Composto 34 e Composto 56, e um inibidor 30 GSK3 BIO disponível comercialmente (EMD Chemicals, Inc., Cat. n° 361550). No segundo e no terceiro dias de teste, todos os poços para amostras de controle e experimentais foram aspirados e alimentados novamente
174/247 usando-se condições de tratamento idênticas, exceto pelo fato de que o Wnt3a foi removido de alguns poços de controle.
Teste de MTS: na conclusão de 24, 48 ou 72 horas de cultura, um conjunto de placas de teste foi submetido a um teste de MTS (Promega, Cat. n° G3581), seguindo-se as instruções do fabricante. Em resumo, adicionou-se 20 pl de MTS a cada poço, e as placas de teste foram incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante quatro horas, antes de serem tomadas as leituras de OD490. As medidas estatísticas foram calculadas menos o plano de fundo (isto é, poços de tratamento sem células), para determinar os valores médios para cada conjunto em triplicata, em adição a um erropadrão da média.
O teste de MTS é uma medida de atividade metabólica celular na redução enzimática de um composto de tetrazólio para um produto de formazano. Em um único ponto no tempo, o teste de MTS pode ser usado como um indicador comparativo da viabilidade celular. Os testes de MTS avaliados em paralelo e a pontos sequenciais no tempo, podem agregar informações adicionais referentes a aumentos na atividade metabólica celular que, por sua vez, podem ser correlacionados com a proliferação celular para cada condição de tratamento. A figura 26, painel A mostra as leituras de OD490 para todos os tratamentos de controle ao longo do período de teste de três dias. As células tratadas com meio condicionado mostraram pouca alteração em OD490 ao longo de três dias, indicando que os números de células nesse grupo de tratamento permaneceram estáticos. Em contraste, as células cultivadas em meio basal sem fatores de crescimento (nenhum tratamento), mostraram um declínio constante em OD490, correlacionado com uma perda no número de células ao longo do tempo. Os tratamentos com ativina A durante o processo de diferenciação, com e sem Wnt3a, mostraram aumentos incrementais em OD490, indicando expansão significativa da população celular ao longo do tempo. O tratamento com GDF-8 na ausência de Wnt3a resultou em uma diminuição de OD490, em relação ao tratamento com ativina A, sendo isso perceptível no primeiro dia e mantido ao longo dos três dias de cultivo. A adição de Wnt3a ao grupo de
175/247 tratamento com GDF-8 resultou em recuperação e aumento de OD490 pelo terceiro dia de cultivo.
Da figura 26, painel B, até a figura 26, painel I, são mostrados os resultados do teste MTS para tratamento com um inibidor de molécula pequena em combinação com GDF-8. As leituras de OD490 referentes aos tratamentos com um composto da presente invenção e GDF-8 apresentaram resultados equivalentes a, ou melhores que, aqueles do tratamento com ativina A. Em todos os casos, uma concentração ótima de cada molécula pequena combinada com GDF-8 resultou em leituras de OD490 otimizadas ao longo dos três dias de teste em relação ao tratamento com GDF-8 por si só. Isso sugere que os compostos da presente invenção são importantes para induzir a proliferação e a expansão de uma população celular durante a diferenciação do endoderma definitivo.
Exemplo 24
Células-tronco embrionárias humanas cultivadas em microportadores podem ser diferenciadas em células proqenitoras endócrinas de acordo com os métodos da presente invenção
Para os propósitos de diferenciação e produção de grandes números de células endócrinas sob condições industriais, foi importante mostrar que as células-tronco embrionárias humanas podiam ser cultivadas e diferenciadas para células progenitoras endócrinas sobre microesferas portadoras, com o uso de um protocolo sem ativina A.
Preparação de células para teste e diferenciação: células H1 p45 foram cultivadas sobre microesferas Cytodex3 (GE Healthcare, Cat. n° 170485-01) em uma placa de fixação ultrabaixa com 6 poços (Costar, Cat. n° 3471) colocada sobre uma plataforma de agitação com cerca de 1 rotação a cada 10 segundos (Vari Mix, Thermo Scientific, Cat. n° M79735). Um meio condicionado em MEF foi trocado diariamente durante seis dias. Então, o meio foi alterado para os tratamentos apresentados a seguir, para iniciar a diferenciação de endoderma. As células sobre as microesferas no poço para tratamento do controle positivo (designada AA+Wnt) foram diferenciadas com adição de 100 ng/mL de ativina A (PeproTech, Cat. n° 120-14), 8 ng/mL
176/247 de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 100-18B) e 20 ng/mL de Wnt3a (R&D Systems, Cat. n° 1324-WN/CF) durante um dia, seguido de 100 ng/mL de ativina A e 8 ng/mL de bFGF (PeproTech Inc., Cat. n° 100-18B) durante dois dias em RPMI-1640 (Invitrogen, Cat n° 22400) com 2% de BSA isento de ácido graxo (Proliant Biomedicals, Inc, SKU n° 68700), usando volumes de 2 mL/poço. Um segundo poço de tratamento (designada GDF-8+MCX) recebeu o Composto 202 a 2,5 μΜ mais 200 ng/mL de GDF-8 (R&D Systems, Cat. n° 788-G8) e 8 ng/mL de bFGF durante um dia, seguido de dois dias com 200 ng/mL de GDF-8 e 8 ng/mL de bFGF em meio RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço). Um terceiro poço de tratamento (designada GDF-8+Wnt) recebeu 200 ng/mL de GDF-8 com 20 ng/mL de Wnt3a e 8 ng/mL de bFGF durante um dia, seguido de dois dias com 200 ng/mL de GDF-8 e 8 ng/mL de bFGF em meio RPMI-1640 com 2% de BSA isento de ácido graxo (2 mL/poço). Todos os meios e tratamentos foram trocados diariamente.
Na conclusão do tratamento e do cultivo, as células foram coletadas e contadas para se determinar a recuperação celular e para submetêlas a citometria de fluxo. Observou-se altos teores de CXCR4 e CD99 em seguida a todos os três regimes de tratamento (figura 27A). O número de células variou entre amostras (figura 27B). Um menor número de células foi observado em amostras tratadas com GDF-8 e nos grupos de endoderma definitivo e quarto estágio, em comparação a outros grupos de tratamento. Isso sugere que os compostos da presente invenção podem aumentar a proliferação das células durante a diferenciação.
Ao final do estágio 3, os genes para endoderma PDX1, HNF4 alfa e CDX2 são expressos nas células (figuras 27C e 27D). O tratamento das células com GDF-8 e um composto na presente invenção durante o primeiro estágio de diferenciação resultou em uma melhor expressão de Pdx1, em comparação ao tratamento de diferenciação para controle. Ao final do estágio 4, os genes para endoderma estavam adicionalmente regulados para cima (figuras 27E e 27F). Esses resultados concluem que o GDF-8 mais o Composto 202 podem substituir a ativina A e o Wnt3a para diferen
177/247 ciação do endoderma definitivo, resultando na formação de endoderma pancreático.
As publicações citadas ao longo deste documento estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade. Embora os vários 5 aspectos da invenção tenham sido ilustrados acima, por meio de referência a exemplos e modalidades preferenciais, deve-se compreender que o escopo da invenção é definido não pela supracitada descrição, mas pelas reivindicações apresentadas a seguir, adequadamente interpretadas sob os princípios da legislação de patentes.
Tabela 1
Placa n° Composto n° Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
placa 5 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7159 67,42 8.12E+06 2,51
placa 5 Ativina A / Wnt3a 10619 100,00 3.23E+08 100,00
placa 5 Composto 58 4848 45,66 -1.60E+06 -0,49
placa 5 Composto 59 20 0,19 -4.62E+06 -1,43
placa 5 Composto 60 3348 31,52 -2.33E+05 -0,07
placa 5 Composto 61 2931 27,60 -3.05E+06 -0,94
placa 5 Composto 62 7171 67,53 -2.04E+06 -0,63
placa 5 Composto 3 14211 133,82 -2.34E+06 -0,73
placa 6 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 3264 32,97 2.52E+06 0,80
placa 6 Ativina A / Wnt3a 9902 100,00 3.14E+08 100,00
placa 6 Composto 63 1917 19,36 4.75E+05 0,15
placa 6 Composto 26 5434 54,88 -6.33E+05 -0,20
placa 6 Composto 27 6288 63,50 -1.13E+06 -0,36
placa 6 Composto 28 4121 41,62 -1.89E+06 -0,60
178/247
placa 6 Composto 39 5164 52,15 -1.66E+06 -0,53
placa 6 Composto 30 4726 47,73 -1.23E+06 -0,39
placa 7 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 9545 47,57 -4.87E+06 -0,99
placa 7 Ativina A / Wnt3a 20064 100,00 4.92E+08 100,00
placa 7 Composto 31 7230 36,03 -3.45E+06 -0,70
placa 7 Composto 32 14655 73,04 -3.03E+06 -0,62
placa 7 Composto 33 13891 69,23 -8,11 E+06 -1,65
placa 7 Composto 34 11674 58,18 -2.24E+06 -0,46
placa 7 Composto 35 15379 76,65 -7.30E+06 -1,48
placa 7 Composto 36 8356 41,65 -4.57E+06 -0,93
placa 8 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 6868 36,97 -2,31 E+06 -0,52
placa 8 Ativina A / Wnt3a 18575 100,00 4.47E+08 100,00
placa 8 Composto 37 9048 48,71 -3,51 E+06 -0,79
placa 8 Composto 38 11361 61,16 -4,31 E+06 -0,96
placa 8 Composto 39 7054 37,98 -3.83E+06 -0,86
placa 8 Composto 40 8104 43,63 -4.59E+06 -1,03
placa 1 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 2972 27,98 1.64E+07 19,74
placa 1 Ativina A / Wnt3a 3126 29,44 8.33E+07 100,00
placa 1 Composto 64 2201 20,72 1,71 E+07 20,52
placa 1 Composto 65 3030 28,53 2.83E+07 33,95
placa 1 Composto 66 1990 18,74 2.36E+07 28,30
placa 1 Composto 67 2074 19,53 2.63E+07 31,55
placa 1 Composto 68 1432 13,48 1.03E+07 12,39
placa 1 Composto 69 2593 24,42 2.62E+07 31,43
placa 1 Composto 70 2236 21,05 2.59E+07 31,11
placa 1 Composto 71 2996 28,22 3.07E+07 36,92
placa 1 Composto 72 2179 20,52 1,21E+07 14,50
placa 1 Composto 73 2817 26,53 2.93E+07 35,25
179/247
placa 1 Composto 74 2853 26,86 2.25E+07 27,01
placa 1 Composto 75 1689 15,91 1,42E+07 17,05
placa 1 Composto 76 2324 21,89 1.48E+07 17,81
placa 1 Composto 77 2306 21,71 2.04E+07 24,55
placa 1 Composto 78 3298 31,06 2.58E+07 31,00
placa 1 Composto 79 2855 26,88 2.79E+07 33,47
placa 1 Composto 80 3603 33,93 3.22E+07 38,62
placa 1 Composto 81 2263 21,31 1.07E+07 12,91
placa 1 Composto 82 1210 11,39 1.36E+07 16,33
placa 1 Composto 83 1805 17,00 1.82E+07 21,87
placa 1 Composto 84 2024 19,06 2.48E+07 29,80
placa 1 Composto 85 2840 26,74 3.45E+07 41,44
placa 1 Composto 86 1447 13,63 8,43E+06 10,13
placa 1 Composto 87 5336 50,25 4.20E+07 50,38
placa 2 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 4033 35,50 2.14E+07 21,70
placa 2 Ativina A / Wnt3a 4292 37,78 9.86E+07 100,00
placa 2 Composto 88 3416 30,06 4.17E+07 42,28
placa 2 Composto 89 4751 41,82 2.11E+07 21,40
placa 2 Composto 90 4542 39,98 3.03E+07 30,70
placa 2 Composto 91 1401 12,33 1.29E+06 1,31
placa 2 Composto 92 4210 37,06 2.95E+07 29,90
placa 2 Composto 93 4157 36,59 2.29E+07 23,26
placa 2 Composto 94 4046 35,61 2.85E+07 28,91
placa 2 Composto 95 8368 73,66 4.02E+07 40,72
placa 2 Composto 96 3695 32,53 2.92E+07 29,57
placa 2 Composto 97 3437 30,26 2,41 E+07 24,44
placa 2 Composto 98 4178 36,77 3.75E+07 38,07
placa 2 Composto 99 3739 32,91 2.10E+07 21,29
placa 2 Composto 100 2275 20,02 1.27E+07 12,86
placa 2 Composto 101 3496 30,77 2.98E+07 30,17
180/247
placa 2 Composto 102 4874 42,90 2.10E+07 21,32
placa 2 Composto 103 4228 37,22 2.69E+07 27,32
placa 2 Composto 104 6115 53,82 4.93E+07 49,99
placa 2 Composto 105 6484 57,07 5.03E+07 50,95
placa 2 Composto 106 4211 37,06 3.94E+07 40,00
placa 2 Composto 107 2853 25,11 1.78E+07 18,04
placa 2 Composto 108 3779 33,27 2.39E+07 24,26
placa 2 Composto 108 2869 25,26 2.04E+07 20,71
placa 2 Composto 110 4398 38,71 2.53E+07 25,65
placa 3 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 2589 91,17 1.17E+07 5,89
placa 3 Ativina A / Wnt3a 6933 244,13 1.98E+08 100,00
placa 3 Composto 111 6816 240,04 5.33E+07 26,90
placa 3 Composto 112 5357 188,66 3.52E+07 17,74
placa 3 Composto 113 6002 211,37 8.55E+07 43,11
placa 3 Composto 114 3308 116,49 3.85E+07 19,44
placa 3 Composto 115 5007 176,31 3.96E+07 19,95
placa 3 Composto 116 3802 133,89 3J2E+07 15,75
placa 3 Composto 117 6521 229,64 4.16E+07 20,97
placa 3 Composto 118 6128 215,81 5.53E+07 27,91
placa 3 Composto 119 4184 147,35 3,41 E+07 17,21
placa 3 Composto 120 2489 87,66 2.87E+07 14,49
placa 3 Composto 121 4985 175,54 3.94E+07 19,87
placa 3 Composto 25 4151 146,17 4.03E+07 20,32
placa 3 Composto 122 6407 225,61 4.15E+07 20,95
placa 3 Composto 123 4465 157,24 5.35E+07 26,99
placa 3 Composto 124 4417 155,53 4.67E+07 23,55
placa 3 Composto 125 6367 224,23 5.73E+07 28,93
placa 3 Composto 126 6157 216,82 7.47E+07 37,70
placa 3 Composto 127 5593 196,97 5,61 E+07 28,28
placa 3 Composto 128 4160 146,50 4,91 E+07 24,77
181/247
placa 3 Composto 129 3778 133,03 3.54E+07 17,88
placa 3 Composto 130 4357 153,43 4.15E+07 20,92
placa 3 Composto 131 6135 216,05 4.28E+07 21,61
placa 3 Composto 132 4421 155,69 4.58E+07 23,12
placa 3 Composto 133 7069 248,94 6.52E+07 32,88
placa 4 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 3274 86,62 1.25E+07 12,79
placa 4 Ativina A / Wnt3a 4158 110,03 9.79E+07 100,00
placa 4 Composto 134 5277 139,62 3.43E+07 35,04
placa 4 Composto 64 5657 149,67 3.38E+07 34,48
placa 4 Composto 135 2790 73,83 1.63E+07 16,63
placa 4 Composto 34 4774 126,33 4.35E+07 44,47
placa 4 Composto 136 4881 129,16 3.20E+07 32,73
placa 4 Composto 137 1740 46,05 9.16E+06 9,35
placa 4 Composto 30 6367 168,46 4.22E+07 43,13
placa 4 Composto 37 5377 142,27 2.85E+07 29,14
placa 4 Composto 138 7722 204,32 3.07E+07 31,37
placa 4 Composto 139 3574 94,56 1.30E+07 13,32
placa 4 Composto 140 3893 103,00 1.12E+07 11,46
placa 4 Composto 39 6114 161,77 3.45E+07 35,22
placa 4 Composto 141 4310 114,04 1.61E+07 16,48
placa 4 Composto 142 5091 134,71 3.74E+07 38,22
placa 4 Composto 35 6601 174,65 8.50E+07 86,77
placa 4 Composto 143 3582 94,79 2.17E+07 22,14
placa 4 Composto 144 6787 179,57 5.45E+07 55,69
placa 4 Composto 145 3752 99,29 2.23E+07 22,81
placa 4 Composto 146 2554 67,59 1.83E+07 18,71
placa 4 Composto 112 3289 87,03 1.48E+07 15,11
placa 4 Composto 113 3819 101,06 2.34E+07 23,93
placa 4 Composto 114 1259 33,32 1.34E+07 13,67
placa 4 Composto 22 5517 145,98 7.09E+07 72,39
182/247
placa 4 Composto 150 5104 135,04 3.34E+07 34,11
placa 5 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7159 116,70 8.12E+06 2,51
placa 5 Ativina A / Wnt3a 10619 173,09 3.23E+08 100,00
placa 5 Composto 151 2785 45,39 -1.03E+06 -0,32
placa 5 Composto 152 4693 76,50 -3.08E+06 -0,95
placa 5 Composto 153 9718 158,40 -1.20E+06 -0,37
placa 5 Composto 154 3479 56,70 -1.97E+06 -0,61
placa 5 Composto 155 9343 152,28 -3,45E+06 -1,07
placa 5 Composto 156 3813 62,16 -2.58E+05 -0,08
placa 6 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 3264 68,37 2.52E+06 0,80
placa 6 Ativina A / Wnt3a 9902 207,40 3.14E+08 100,00
placa 6 Composto 157 2480 51,94 -1.22E+06 -0,39
placa 6 Composto 158 5271 110,41 -1.30E+06 -0,41
placa 6 Composto 159 6478 135,68 -1.84E+06 -0,59
placa 6 Composto 160 4212 88,21 1.30E+05 0,04
placa 6 Composto 161 2439 51,09 -9.20E+05 -0,29
placa 6 Composto 162 1260 26,39 -1.35E+06 -0,43
placa 7 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 9545 156,12 -4.87E+06 -0,99
placa 7 Ativina A / Wnt3a 20064 328,17 4.92E+08 100,00
placa 7 Composto 163 16557 270,81 -7,31 E+06 -1,49
placa 7 Composto 164 16472 269,42 -7.37E+06 -1,50
placa 7 Composto 165 3015 49,32 -7.34E+06 -1,49
placa 7 Composto 166 13845 226,45 -7.98E+06 -1,62
placa 7 Composto 167 10325 168,87 -7.35E+06 -1,49
placa 7 Composto 168 14139 231,26 -6.49E+06 -1,32
placa 7 Composto 169 4468 73,08 -6.38E+06 -1,30
placa 8 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 6868 179,83 -2,31 E+06 -0,52
183/247
placa 8 Ativina A / Wnt3a 18575 486,35 4.47E+08 100,00
placa 8 Composto 170 13140 344,04 -4.13E+06 -0,93
placa 8 Composto 171 10894 285,22 -2,61 E+06 -0,58
placa 8 Composto 172 3416 89,44 -4.72E+06 -1,06
placa 8 Composto 173 8815 230,81 -4.25E+06 -0,95
placa 8 Composto 174 11760 307,91 -3.33E+06 -0,75
placa 8 Composto 175 5 0,13 -4,91 E+06 -1,10
placa 8 Composto 176 10139 265,47 -4.73E+06 -1,06
placa 8 Composto 177 9994 261,68 -2.95E+06 -0,66
placa 8 Composto 178 8998 235,58 -3.74E+06 -0,84
placa 5 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7159 67,42 8,12E+06 2,51
placa 5 Ativina A / Wnt3a 10619 100,00 3.23E+08 100,00
placa 5 Composto 21 4719 44,44 -1.96E+06 -0,61
placa 5 Composto 22 2036 19,18 -1.79E+06 -0,55
placa 5 Composto 23 2563 24,13 -1.56E+06 -0,48
placa 5 Composto 24 4470 42,09 -7.05E+05 -0,22
placa 5 Composto 24 6085 57,30 -3.08E+06 -0,95
placa 5 Composto 26 7276 68,52 -2.38E+06 -0,74
placa 5 Composto 27 4588 43,20 -5.63E+05 -0,17
placa 5 Composto 28 2682 25,26 -1.37E+06 -0,43
placa 5 Composto 29 5778 54,41 -1.94E+06 -0,60
placa 5 Composto 30 620 5,84 -5.05E+06 -1,56
placa 5 Composto 31 3419 32,19 -1.42E+06 -0,44
placa 6 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 3264 69,07 2.52E+06 0,80
placa 6 Ativina A / Wnt3a 9902 209,51 3.14E+08 100,00
placa 6 Composto 32 2142 45,32 -1.33E+06 -0,42
placa 6 Composto 33 5564 117,73 -8.63E+05 -0,27
placa 6 Composto 34 5927 125,41 -2,01 E+06 -0,64
placa 6 Composto 35 10068 213,01 -2.15E+06 -0,68
184/247
placa 6 Composto 36 5170 109,39 -1.22E+06 -0,39
placa 6 Composto 37 3098 65,55 1,91 E+06 0,61
placa 6 Composto 38 1537 32,52 4.48E+04 0,01
placa 6 Composto 39 3650 77,23 -2,01 E+06 -0,64
placa 6 Composto 40 5817 123,07 4,91 E+05 0,16
placa 6 Composto 64 4359 92,23 -1.07E+05 -0,03
placa 6 Composto 30 4035 85,38 2.09E+06 0,66
placa 6 Composto 65 3279 69,37 -5.63E+05 -0,18
placa 6 Composto 67 2698 57,08 -1.95E+06 -0,62
placa 7 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 9545 321,22 -4.87E+06 -0,99
placa 7 Ativina A / Wnt3a 20064 675,20 4.92E+08 100,00
placa 7 Composto 68 10894 366,62 -5.15E+06 -1,05
placa 7 Composto 69 9734 327,58 -3.97E+06 -0,81
placa 7 Composto 70 16736 563,21 -6,51 E+06 -1,32
placa 7 Composto 71 17999 605,71 -7.38E+06 -1,50
placa 7 Composto 72 7309 245,96 -6,47E+06 -1,32
placa 7 Composto 73 8888 299,10 -3.03E+06 -0,62
placa 7 Composto 74 11496 386,85 -2.67E+06 -0,54
placa 7 COMPOSTO 75 9739 327,74 -7.75E+06 -1,57
placa 7 Composto 76 14439 485,89 -4.19E+06 -0,85
placa 7 Composto 77 12331 414,95 -6.03E+06 -1,22
placa 7 Composto 78 9702 326,49 -6.57E+06 -1,33
placa 7 Composto 79 8535 287,22 -6.92E+06 -1,41
placa 8 nenhuma ativina A (com Wnt3a) 6868 295,49 -2,31 E+06 -0,52
placa 8 Ativina A / Wnt3a 18575 799,17 4.47E+08 100,00
placa 8 Composto 80 13939 599,68 -4.23E+06 -0,95
placa 8 Composto 81 10466 450,29 -4,91 E+06 -1,10
placa 8 Composto 82 10323 444,14 -4.90E+06 -1,10
placa 8 Composto 83 14619 628,95 1.48E+06 0,33
185/247
placa 8 Composto 84 14105 606,84 -4.44E+06 -0,99
placa 8 Composto 85 12172 523,66 -3.48E+06 -0,78
placa 8 Composto 86 7218 310,54 -4.22E+06 -0,94
placa 8 Composto 87 5383 231,58 -4.07E+06 -0,91
placa 8 Composto 88 10419 448,27 -4.27E+06 -0,96
placa 8 Composto 89 11780 506,83 -3.94E+06 -0,88
placa 8 Composto 90 7002 301,25 -1.54E+06 -0,35
placa 8 Composto 91 6224 267,78 -4.53E+06 -1,01
Tabela 2
Composto n° Número de célula Intensidade de Sox17
% de controles positivos % de controles positivos
Composto 17 133,8 -0,7
Composto 95 195,0 40,7
Composto 138 185,7 31,4
Composto 87 170,7 50,4
Composto 144 163,2 55,7
Composto 35 158,7 86,8
Composto 30 153,1 43,1
Composto 105 151,0 51,0
Composto 39 147,0 35,2
Composto 104 142,5 50,0
Composto 29 136,0 34,5
Composto 22 132,7 72,4
Composto 37 129,3 29,1
Composto 134 126,9 35,0
Composto 150 122,7 34,1
Composto 142 122,4 38,2
Composto 136 117,4 32,7
Composto 80 115,2 38,6
Composto 34 114,8 44,5
Composto 102 113,5 21,3
ΛΒΒΓΪΑΤ
Composto 89 110,7 21,4
Composto 105 105,8 30,7
Composto 78 105,5 31,0
Composto 141 103,6 16,5
Composto 110 102,5 25,7
Composto 133 102,0 32,9
Tabela 3
Composto n° tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
Nenhum nenhuma ativina A, com Wnt3a 23253 124,16 1.97E+07 10,59
Nenhum Ativina A / Wnt3a 18728 100,00 1.86E+08 100,00
Composto 17 nenhuma AA (com Wnt3a) 21445 114,51 3.43E+07 18,48
Nenhum nenhuma ativina A, com Wnt3a 23253 124,16 1.97E+07 10,59
Nenhum Ativina A / Wnt3a 18728 100,00 1.86E+08 100,00
Composto 22 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 18336 97,91 3.72E+07 20,05
Composto 34 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 18891 100,87 3.26E+07 17,55
Composto 29 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 20221 107,97 2.83E+07 15,27
Composto 39 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 17095 91,28 2.82E+07 15,19
Composto 37 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 15605 83,32 2.67E+07 14,37
Composto 35 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 23823 127,20 2.54E+07 13,69
187/247
Composto 80 nenhuma AA (com Wnt3a) EGF+FGF4 19864 106,07 2.33E+07 12,54
Composto 141 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17719 94,61 2.24E+07 12,04
Composto 30 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 18063 96,45 2.18E+07 11,73
Composto 150 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 16833 89,88 2.16E+07 11,63
Composto 144 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17100 91,31 2.04E+07 11,01
Composto 104 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17863 95,38 1.89E+07 10,19
Composto 142 nenhuma AAfcom Wnt3a) EGF+FGF4 18955 101,21 1.84E+07 9,90
Composto 110 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17534 93,62 1.76E+07 9,45
Composto 78 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17703 94,52 1.71E+07 9,23
Composto 133 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 16521 88,22 1.67E+07 8,97
Composto 87 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 16495 88,07 1,55E+07 8,33
188/247
Composto 95 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 16900 90,24 1.43E+07 7,72
Composto 136 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 19167 102,34 7,91 E+06 4,26
Composto 105 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 15217 81,25 7.45E+06 4,01
Composto 134 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 17208 91,88 7.40E+06 3,99
Composto 138 nenhuma AAfcom Wnt3a) EGF+FGF4 16695 89,14 6.65E+06 3,58
Composto 89 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 14652 78,24 3.89E+06 2,10
Composto 90 nenhuma AAfcom Wnt3a) EGF+FGF4 15903 84,92 3.53E+06 1,90
Composto 102 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 12943 69,11 2.85E+05 0,15
Nenhum nenhuma ativina A, com Wnt3a 23253 124,16 1.97E+07 10,59
Nenhum Ativina A / Wnt3a 18728 100,00 1.86E+08 100,00
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 18294 97,68 1,99E+07 10,70
189/247
Tabela 3B
Composto n° Número de célula Intensidade de Sox17
% de controles positivos % de controles positivos
Composto 22 97,91 20,05
Composto 34 100,87 17,55
Composto 29 107,97 15,27
Composto 39 91,28 15,19
Composto 37 83,32 14,37
Composto 35 127,20 13,69
Tabela 4
Composto n° tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidad e total média % de controles positivos
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7107 67,96 -1.27E+07 -7,94
Nenhum Ativina A / Wnt3a 10459 100,00 1.60E+08 100,00
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF 6942 73,43 1.27E+06 0,74
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 5738 60,69 3.14E+06 1,83
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PD GF-AB 4453 47,10 9.30E+05 0,54
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PD GF- AB+Muscimol 10391 109,91 8.92E+06 5,20
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+PDGF- A+VEGF 5728 60,59 2.14E+06 1,24
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF4+PDGF- A+VEGF 13198 139,59 1.29E+07 7,54
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PD GF-A+VEGF 10480 110,85 8.97E+06 5,23
190/247
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PD GF- A+Muscimol 13649 144,37 1.45E+07 8,43
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 3117 34,86 -1,41 E+06 -0,72
Nenhum Ativina A / Wnt3a 8942 100,00 1.95E+08 100,00
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF 19334 216,23 6.62E+07 33,86
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-AB 16662 186,34 4.95E+07 25,33
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-A 16885 188,84 4.48E+07 22,94
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) VEGF 18263 204,25 3,51 E+07 17,98
Composto 35 nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF4 4410 49,32 3.33E+07 17,04
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) Muscimol 18867 211,00 2,61 E+07 13,35
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-C 16642 186,12 1,85E+07 9,46
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-D 17618 197,03 1.84E+07 9,41
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-B 14168 158,46 1.52E+07 7,76
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) PD98059 18877 211,11 1.30E+07 6,64
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP1 18849 210,81 1.29E+07 6,59
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) LY294002 18374 205,49 1.03E+07 5,28
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP4 16748 187,31 8.97E+06 4,59
191/247
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP2 16218 181,38 8.89E+06 4,55
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP7 20111 224,91 8.05E+06 4,12
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) U0124 16539 184,97 7.54E+06 3,86
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP6 17838 199,50 7.32E+06 3,75
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) BMP2/7 12042 134,67 7.08E+06 3,62
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) bicuculina 19312 215,98 1.95E+06 1,00
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) U0126 19961 223,24 -5.75E+05 -0,29
Composto 35 nenhuma AA(com Wnt3a) bu ti rato 14238 159,24 -1.85E+06 -0,94
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 6049 45,2 -1.31E+07 -5,2
Nenhum Ativina A/Wnt3a 13392 100,0 2.50E+08 100,0
Composto 20 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 9434 70,4 1,48E+08 59,1
Composto 17 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 7988 59,6 1.13E+08 45,0
192/247
Composto 16 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 8303 62,0 9.20E+07 36,7
Composto 13 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 7045 52,6 7.22E+07 28,8
Composto 19 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 7799 58,2 6.82E+07 27,2
Composto 92 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 5886 44,0 5.63E+07 22,5
Composto 93 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 5463 40,8 4.38E+07 17,5
Composto 94 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 5100 38,1 4.18E+07 16,7
193/247
Composto 95 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 4510 33,7 3.32E+07 13,3
Composto 96 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 4570 34,1 3.09E+07 12,3
Composto 97 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 4561 34,1 2.15E+07 8,6
Composto 98 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3176 23,7 9.86E+06 3,9
Composto 99 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 1209 9,0 -1.56E+07 -6,2
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 15494 98,0 -1,25E+07 -4,4
Nenhum Ativina A/Wnt3a 15807 100,0 2.86E+08 100,0
194/247
Composto 18 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 8742 55,3 1.01E+08 35,4
Composto 14 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 8464 53,5 8.33E+07 29,1
Composto 15 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 7234 45,8 7.95E+07 27,8
Composto 100 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 6805 43,0 5.88E+07 20,6
Composto 101 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 5668 35,9 5.34E+07 18,7
Composto 102 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 6195 39,2 5.29E+07 18,5
195/247
Composto 103 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 7545 47,7 5.13E+07 18,0
Composto 104 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 4757 30,1 4.58E+07 16,0
Composto 105 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 6285 39,8 4.29E+07 15,0
Composto 106 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 5622 35,6 2.86E+07 10,0
Composto 107 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3951 25,0 1.72E+07 6,0
Composto 108 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3226 20,4 1.58E+07 5,5
196/247
Composto 109 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3473 22,0 1.46E+07 5,1
Composto 110 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3703 23,4 1.32E+07 4,6
Composto 111 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2918 18,5 1.22E+07 4,3
Composto 112 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2975 18,8 1.04E+07 3,6
Composto 113 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2910 18,4 9.18E+06 3,2
Composto 114 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2734 17,3 6.13E+06 2,1
197/247
Composto 115 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2169 13,7 3.77E+06 1,3
Composto 116 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3107 19,7 3.52E+06 1,2
Composto 117 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3343 21,1 5.35E+05 0,2
Composto 118 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 3034 19,2 2.37E+05 0,1
Composto 119 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2263 14,3 -1.66E+06 -0,6
Composto 120 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 1771 11,2 -5.57E+06 -2,0
198/247
Composto 121 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 1136 7,2 -1.79E+07 -6,3
Composto 122 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 2021 12,8 -2.09E+07 -7,3
Tabela 5
Composto n° tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7107 67,96 -1.27E+07 -7,94
Nenhum Ativina A / Wnt3a 10459 100,00 1.60E+08 100,00
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF 6942 73,43 1.27E+06 0,74
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4 5738 60,69 3.14E+06 1,83
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PDG F-AB 4453 47,10 9.30E+05 0,54
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 10391 109,91 8.92E+06 5,20
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+PDGFA+VEGF 5728 60,59 2.14E+06 1,24
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF4+PDGF- A+VEGF 13198 139,59 1.29E+07 7,54
Composto 17 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 10480 110,85 8.97E+06 5,23
199/247
Composto 17 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 13649 144,37 1.45E+07 8,43
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 7107 67,96 -1.27E+07 -7,94
Nenhum Ativina AZ Wnt3a 10459 100,00 1.60Ε+Ό8 100,00
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF 23887 228,40 -1.01E+07 -6,32
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4 21268 203,36 1.36E+06 0,85
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB 17611 168,39 1.28E+07 8,03
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 17949 171,62 1.54E+06 0,96
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+PDGF- A+VEGF 23242 222,23 1.23E+07 7,72
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com FGF4+PDGF- A+VEGF 16068 153,63 3.92E+07 24,57
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 16132 154,25 9.11E+07 57,04
Composto 35 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 15457 147,80 6.89E+07 43,15
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF 1971 18,84 -1.44E+07 -9,00
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4 7436 71,10 -4.35E+06 -2,72
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB 6535 62,48 -7.52E+06 -4,71
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 1376 13,15 -1.42E+07 -8,91
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+PDGF- A+VEGF 8880 84,91 -8.53E+06 -5,34
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AA(com FGF4+PDGF- A+VEGF 8146 77,89 -4.82E+06 -3,02
200/247
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 8858 84,70 -7.15E+06 -4,48
Composto 29 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 10071 96,30 2.95E+06 1,85
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF 7966 76,17 -1.19E+07 -7,42
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4 6932 66,28 -4.62E+06 -2,89
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-AB 7473 71,46 -2,61 E+06 -1,63
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 7914 75,67 -1.91E+06 -1,20
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+PDGF- A+VEGF 12956 123,88 -1.25E+07 -7,82
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom FGF4+PDGF- A+VEGF 6731 64,36 -1.10E+07 -6,89
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 8778 83,93 1.39E+05 0,09
Composto 37 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 5821 55,66 -1,22E+07 -7,64
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF 13062 124,89 2.78E+07 17,39
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4 13133 125,58 1.23E+08 76,85
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-AB 12532 119,83 1.09E+08 68,41
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 15811 151,18 6.90Ε+Ό6 4,32
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom EGF+PDGF- A+VEGF 11801 112,84 4.04E+06 2,53
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AAfcom FGF4+PDGF- A+VEGF 15262 145,93 1.15E+07 7,18
201/247
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 12901 123,36 5,01 E+07 31,35
Composto 34 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 12208 116,72 5.56E+07 34,83
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 10224 108,14 7.36E+05 0,43
Nenhum Ativina A / Wnt3a 9455 100,00 1.72E+08 100,00
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF 11615 122,85 1.49E+05 0,09
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4 10456 110,59 5.11E+06 2,98
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB 9972 105,47 1.62E+06 0,94
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 10540 111,48 2.22E+06 1,29
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+PDGF- A+VEGF 17050 180,34 4.84E+06 2,82
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com FGF4+PDGF- A+VEGF 8856 93,67 7,01 E+05 0,41
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 7973 84,33 5.30E+06 3,09
Composto 39 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 9103 96,28 7.32E+05 0,43
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF 14105 149,19 1.75E+06 1,02
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4 12971 137,19 1.04E+07 6,05
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB 16580 175,36 8.60E+06 5,01
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-AB+Muscimol 14676 155,23 5,61 E+06 3,27
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+PDGF- A+VEGF 20372 215,48 4.99E+06 2,91
202/247
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com FGF4+PDGF- A+VEGF 12277 129,85 4.90E+06 2,86
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+VEGF 12522 132,44 7.88E+06 4,59
Composto 22 nenhuma Wnt3a) AA(com EGF+FGF4+PDG F-A+Muscimol 11610 122,80 1.33E+07 7,77
Tabela 6
Composto n° tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
Nenhum nenhuma ativina A (com Wnt3a) 477 6,64 7.4E+04 0,09
Nenhum Ativina A1 Wnt3a 7185 100,00 8.0E+07 100,00
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum 4611 64,18 1.4E+07 17,21
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF 6145 85,53 1,5E+07 19,18
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF4 5323 74,09 2.7E+07 33,75
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-D 5017 69,84 1.5E+07 18,76
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-A 4175 58,11 1.1E+07 13,43
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) VEGF 4713 65,60 1,0E+07 12,49
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) GDF8 6354 88,44 7.1E+07 88,59
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Muscimol 7286 101,41 3.1E+07 38,38
203/247
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-D+VEGF 5030 70,01 1.2E+07 14,58
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) VEGF+Muscimol 776 10,81 1,3E+06 1,56
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF-D+Muscimol 3490 48,57 6.5E+06 8,02
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) GDF8+PDGF-D 6889 95,88 5.8E+07 72,59
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) PDGF- D+Muscimol+VEGF 2133 29,68 2.7E+06 3,32
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) GDF8+PDGF- D+VEGF 5585 77,74 6.6E+07 81,75
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) GDF8+VEGF+Musci mol 6083 84,67 5.6E+07 69,62
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) GDF8+PDGF- D+VEGF+Muscimol 9455 131,60 9.6E+07 119,24
Composto 34 nenhuma A-A, nenhum Wnt3a EGF+FGF4+PDGF- A+VEGF+PDGF- D+Muscimol+GDF8 4757 66,21 3.9E+07 48,77
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) EGF+FGF4+PDGF- A+VEGF+PDGF- D+Muscimol+GDF8 6028 83,90 7.0E+07 87,44
204/247
Tabela 7
Número de célula Expressão de Sox17
Piaca Tratamento Composto n° Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
1 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 6049 45,2 -1.31E+07 -5,2
1 Ativina A/Wnt3a Nenhum 13392 100,0 2.50E+08 100,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 18 13037 97,3 1.63E+O8 65,2
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 14 9344 69,8 1.23E+08 49,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 15 8448 63,1 8.64E+07 34,5
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 16 5498 41,1 6.56E+O7 26,2
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 64 5063 37,8 5.88E+07 23,5
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 65 4788 35,8 4.57E+07 18,2
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 66 8129 60,7 3.53E+07 14,1
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 67 6791 50,7 3.18E+07 12,7
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 68 3456 25,8 2.30E+07 9,2
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 69 3995 29,8 1.69E+07 6,8
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 70 474 3,5 -1.80E+07 -7,2
2 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15494 98,0 -1.25E+07 -4,4
205/247
2 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15807 100,0 2.86E+08 100,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 19 8425 53,3 1.19E+08 41,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 13 9123 57,7 1.13E+08 39,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 71 6048 38,3 5,51 E+07 19,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 72 6060 38,3 5.46E+07 19,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 73 5545 35,1 3.99E+07 14,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 74 10898 68,9 3,91 E+07 13,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 75 4117 26,0 3,01 E+07 10,5
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 76 3825 24,2 2.74E+O7 9,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 77 5928 37,5 2.44E+07 8,5
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 78 3303 20,9 2.03E+07 7,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 79 4767 30,2 1.85E+07 6,5
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 80 2194 13,9 1.22E+07 4,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 81 2920 18,5 9.16E+05 0,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 82 1819 11,5 -1.05E+07 -3,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 83 2153 13,6 -1.19E+07 -4,2
206/247
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 84 58 0,4 -2.94E+07 -10,3
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 85 57 0,4 -3.03E+07 -10,6
1 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 6049 45,2 -1.31E+07 -5,2
1 Ativina A/Wnt3a Nenhum 13392 100,0 2.50E+08 100,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 20 9434 70,4 1.48E+08 59,1
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 17 7988 59,6 1.13E+O8 45,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 16 8303 62,0 9.20E+07 36,7
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 13 7045 52,6 7.22E+07 28,8
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 19 7799 58,2 6.82E+07 27,2
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 92 5886 44,0 5.63E+07 22,5
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 93 5463 40,8 4.38Ε+Ό7 17,5
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 94 5100 38,1 4.18E+07 16,7
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 95 4510 33,7 3.32E+07 13,3
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 96 4570 34,1 3.Ο9Ε+Ό7 12,3
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 97 4561 34,1 2.15E+07 8,6
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 98 3176 23,7 9.86E+O6 3,9
207/247
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 99 1209 9,0 -1.56E+07 -6,2
2 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15494 98,0 -1.25E+07 -4,4
2 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15807 100,0 2.86E+08 100,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 18 8742 55,3 1.01E+08 35,4
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 14 8464 53,5 8.33E+O7 29,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 15 7234 45,8 7.95E+07 27,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 100 6805 43,0 5.88E+07 20,6
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 101 5668 35,9 5.34E+07 18,7
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 102 6195 39,2 5.29E+07 18,5
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 103 7545 47,7 5.13E+07 18,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 104 4757 30,1 4.58E+07 16,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 105 6285 39,8 4.29E+07 15,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 106 5622 35,6 2.86E+O7 10,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 107 3951 25,0 1.72E+07 6,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 108 3226 20,4 1.58E+07 5,5
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 109 3473 22,0 1.46E+07 5,1
208/247
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 110 3703 23,4 1.32E+07 4,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 111 2918 18,5 1.22E+07 4,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 112 2975 18,8 1.04E+07 3,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 113 2910 18,4 9.18E+06 3,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 114 2734 17,3 6.13E+O6 2,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 115 2169 13,7 3.77E+06 1,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 116 3107 19,7 3.52E+06 1,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 117 3343 21,1 5.35E+05 0,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 118 3034 19,2 2.37E+05 0,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 119 2263 14,3 -1.66E+06 -0,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 120 1771 11,2 -5.57E+06 -2,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 121 1136 7,2 -1.79E+07 -6,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 122 2021 12,8 -2.09E+07 -7,3
1 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 6049 45,2 -1.31E+07 -5,2
1 Ativina A/Wnt3a Nenhum 13392 100,0 2.50E+08 100,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 19 15878 118,6 2.67E+08 106,5
209/247
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 24 12714 94,9 2.46E+08 98,2
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 23 12165 90,8 2.15E+08 86,0
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 21 12640 94,4 1.65E+08 65,9
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 13 11491 85,8 1.61E+08 64,3
1 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 30 11396 85,1 1.34E+08 53,4
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 36 7964 59,5 9.47E+07 37,8
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 32 8066 60,2 9.29E+07 37,1
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 26 7415 55,4 8.30E+07 33,1
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 17 6994 52,2 7.76E+07 31,0
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 31 6957 51,9 6.59E+07 26,3
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 179 3573 26,7 2.43E+07 9,7
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 180 922 6,9 -2.20E+07 -8,8
1 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 181 8 0,1 -2.68E+07 -10,7
2 nenhuma ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15494 98,0 -1.25E+07 -4,4
2 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15807 100,0 2.86E+08 100,0
2 EGF, FGF, PDGF-A VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 18 21102 133,5 4.18E+08 146,3
210/247
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 15 15373 97,3 3.74E+08 130,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 14 9008 57,0 2.62E+08 91,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 38 9650 61,0 2.46E+08 86,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 35 10461 66,2 1.59E+08 55,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 16 9064 57,3 1.48E+08 51,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 34 8907 56,3 9.99E+07 35,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 20 7346 46,5 8.90E+07 31,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 27 8044 50,9 8,81 E+07 30,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 28 7591 48,0 8.77E+07 30,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 40 4049 25,6 8.23E+07 28,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 33 7485 47,4 8.10E+07 28,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 25 6571 41,6 7.60E+07 26,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 182 7631 48,3 6.74E+07 23,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 183 6777 42,9 5.93E+07 20,8
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 184 5475 34,6 5.44E+07 19,0
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 185 4093 25,9 4.92E+07 17,2
211/247
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 186 5274 33,4 4.63E+O7 16,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 187 5342 33,8 4.02E+07 14,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 188 5533 35,0 3.98E+07 13,9
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 189 5928 37,5 3.96E+07 13,9
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 190 4822 30,5 3.90E+07 13,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 191 4249 26,9 3,81 E+07 13,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 192 5616 35,5 3.54E+07 12,4
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 193 4158 26,3 3.23E+07 11,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 194 3470 22,0 2.96E+07 10,4
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 195 3800 24,0 2.95E+07 10,3
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 196 4619 29,2 2.78E+07 9,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 197 4011 25,4 2.45E+07 8,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 198 4367 27,6 1.92E+07 6,7
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 199 3162 20,0 1.20E+07 4,2
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 200 2087 13,2 4.43E+06 1,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 201 1568 9,9 -6.17E+06 -2,2
212/247
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 202 5213 33,0 -1,41 E+07 -4,9
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 203 7 0,0 -3.04E+07 -10,6
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 204 11 0,1 -3.18E+07 -11,1
2 EGF, FGF, PDGF-A, VEGF, PDGF-D, muscimol, GDF8 Composto 205 10 0,1 -3.20E+07 -11,2
Tabela 8
Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio % de controles Intensidade % de controles
Composto n° de células positivos TOTAL MÉDIA positivos
Composto 18 21102 133,5 4.18E+08 146,3
Composto 15 15373 97,3 3.74E+08 130,8
Composto 19 15878 118,6 2.67E+08 106,5
Composto 24 12714 94,9 2.46E+08 98,2
Composto 14 9008 57,0 2.62E+08 91,6
Composto 38 9650 61,0 2.46E+O8 86,2
Composto 23 12165 90,8 2.15E+08 86,0
Composto 21 12640 94,4 1.65E+08 65,9
Composto 13 11491 85,8 1.61E+08 64,3
Composto 35 10461 66,2 1.59E+08 55,7
Composto 30 11396 85,1 1.34E+08 53,4
Composto 16 9064 57,3 1.48E+08 51,8
Composto 36 7964 59,5 9.47E+07 37,8
Composto 32 8066 60,2 9.29E+07 37,1
Composto 34 8907 56,3 9.99E+07 35,0
Composto 26 7415 55,4 8.30E+07 33,1
Composto 20 7346 46,5 8.90E+07 31,2
Composto 17 6994 52,2 7.76E+07 31,0
Composto 27 8044 50,9 8,81 E+07 30,8
213/247
Composto 28 7591 48,0 8.77E+07 30,7
Composto 40 4049 25,6 8.23E+07 28,8
Composto 33 7485 47,4 8.10E+07 28,3
Composto 25 6571 41,6 7.60E+07 26,6
Composto 31 6957 51,9 6.59E+07 26,3
Composto 20 9434 70,4 1.48E+08 59,1
Composto 17 7988 59,6 1.13E+08 45,0
Composto 16 8303 62,0 9.20E+07 36,7
Composto 18 8742 55,3 1.01E+08 35,4
Composto 14 8464 53,5 8.33E+07 29,1
Composto 13 7045 52,6 7.22E+07 28,8
Composto 15 7234 45,8 7.95E+07 27,8
Composto 19 7799 58,2 6.82E+07 27,2
Tabela 9
tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Placa n° Ativina A Composto n° Fatores de crescimento Número total médio de células % de controles positivos Intensidade TOTAL MÉDIA % de controles positivos
1 Nenhum Nenhum Nenhum 9164 149,46 -5,91 E+06 -5,17
1 10 ng/mL de A-A Nenhum Nenhum 6132 100,00 1.52E+06 1,33
1 100 ng/mL de A-A Nenhum Nenhum 9658 157,51 1.14E+08 100,00
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 8556 139,53 8.78E+07 76,82
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 7657 124,87 4.70E+07 41,09
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+FGF4+PDGF 8100 132,10 4.42E+07 38,65
214/247
A+Muscimol+Wnt 3a
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wrrt3a 7975 130,06 3.43E+07 30,03
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+FGF4+Wnt3a 9800 159,83 4.59E+O7 40,13
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 FGF4+Wnt3a 6490 105,84 4.28E+07 37,43
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 EGF+Wnt3a 5001 81,55 2.80E+07 24,45
1 10 ng/mL de A-A Composto 22 wnt3a 4543 74,09 3.05E+07 26,65
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 2522 41,14 -4.86E+06 -4,25
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 3479 56,74 -3.96E+06 -3,46
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+FGF4+PDGF A+Muscimol+Wnt 3a 3820 62,29 -1.67E+06 -1,46
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wnt3a 3263 53,21 -4.56E+06 -3,99
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+FGF4+Wnt3a 2704 44,10 -4.17E+06 -3,65
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 FGF4+Wnt3a 284 4,64 -7.54E+06 -6,59
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 EGF+Wnt3a 155 2,53 -7.82E+06 -6,84
1 10 ng/mL de A-A Composto 35 wnt3a 173 2,83 -7,61 E+06 -6,66
215/247
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 2737 44,63 2,41 E+07 21,10
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 2283 37,23 5.59E+06 4,88
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+FGF4+PDGF A+Muscim ol+Wnt 3a 4676 76,26 2,41 E+07 21,11
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wnt3a 3964 64,65 2.27E+07 19,89
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+FGF4+Wnt3a 1736 28,31 1.98E+06 1,73
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 FGF4+Wnt3a 2139 34,89 6.98E+06 6,10
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 EGF+Wnt3a 365 5,96 -4.86E+06 -4,25
1 10 ng/mL de A-A Composto 29 wnt3a 2090 34,09 4.89E+06 4,28
2 Nenhum Nenhum Nenhum 9325 121,89 -3.35E+06 -3,01
2 10 ng/mL de A-A Nenhum Nenhum 5177 67,67 3.89E+06 3,49
2 100 ng/mL de A-A Nenhum Nenhum 7650 100,00 1.11E+08 100,00
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 18362 240,02 3.45E+08 309,74
2 10 ng/mL de AA Composto 34 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 15574 203,58 2.59E+O8 232,70
216/247
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 EGF+FGF4+PDGF A+Muscimol+Wnt 3a 17890 233,85 2.88E+O8 258,30
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wnt3a 17875 233,65 2.68E+08 241,07
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 EGF+FGF4+Wnt3a 14158 185,07 2.40E+08 215,35
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 FGF4+Wnt3a 13323 174,15 2.19E+O8 196,86
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 EGF+Wnt3a 14527 189,89 2.28E+08 204,84
2 10 ng/mL de A-A Composto 34 wnt3a 3589 46,91 7.02E+07 63,08
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 5738 75,00 2.14E+O7 19,24
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 2531 33,08 2.82E+06 2,53
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+FGF4+PDGF A+Muscimol+Wnt 3a 2879 37,64 3,61 E+06 3,24
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wnt3a 2989 39,07 -1.78E+04 -0,02
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+FGF4+Wnt3a 734 9,59 -3.93E+06 -3,53
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 FGF4+Wnt3a 521 6,81 -4.46E+06 -4,01
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 EGF+Wnt3a 211 2,75 -4.54E+06 -4,08
217/247
2 10 ng/mL de A-A Composto 39 wnt3a 518 6,78 -2.37E+06 -2,13
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+FGF4+PDGF -A+VEGF+PDGFD+Muscimol+GDF 8+Wnt3a 5711 74,65 1.21E+07 10,82
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+FGF4+PDGF -AB+VEGF+Wnt3a 4767 62,31 -5.16E+05 -0,46
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+FGF4+PDGF A+Muscimol+Wnt 3a 4540 59,34 9.23E+05 0,83
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+FGF4+PDGF -AB+Wnt3a 4223 55,20 -6.15E+05 -0,55
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+FGF4+Wnt3a 3501 45,77 5.60E+05 0,50
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 FGF4+Wnt3a 3930 51,37 -1.88E+06 -1,69
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 EGF+Wnt3a 1431 18,70 -2.75E+06 -2,47
2 10 ng/mL de A-A Composto 37 wnt3a 791 10,34 -2.99E+06 -2,68
Tabela 10
Composto n° tratamentos Número de célula Expressão de Sox17
Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
Nenhum Nenhuma ativina A (com Wnt3a) 4273 33,70 4.75E+07 17,49
Nenhum Ativina A (com Wnt3a) 12676 100,00 2.72E+08 100,00
218/247
Composto 34 Nenhuma AA(sem Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 13317 105,06 2,01 E+08 74,08
Composto 34 Nenhuma AAfsem Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 14189 111,93 2,01 E+08 73,90
Composto 34 Nenhuma AA(sem Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 12616 99,52 1.80E+08 66,21
Composto 34 Nenhuma AA(sem Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 8269 65,23 1.13E+08 41,73
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum Nenhum 11711 92,38 1.65E+08 60,68
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum EGF (25 ng/mL) 16052 126,63 2.14E+08 78,82
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum EGF (50 ng/mL) 13593 107,23 1.94E+08 71,52
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum EGF (100 ng/mL) 13170 103,90 1.93E+08 71,04
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (25 ng/mL) Nenhum 18433 145,41 2.49E+08 91,72
Composto 34 nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (25 ng/mL) EGF (25 ng/mL) 18841 148,63 2.60E+08 95,72
219/247
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (25 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 16232 128,05 2.30E+08 84,79
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (25 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 9309 73,44 1.39E+08 51,00
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (50 ng/mL) Nenhum 12757 100,64 1.66E+08 61,10
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (25 ng/mL) 17720 139,79 2,31 E+08 85,01
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 16331 128,83 2.26E+08 83,11
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 16336 128,87 2.32E+08 85,24
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (100 ng/mL) Nenhum 19853 156,61 2.59E+08 95,45
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (25 ng/mL) 19880 156,83 2.59E+08 95,47
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 18166 143,30 2.35E+08 86,30
Composto 34 nenhuma AA(com Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 11241 88,68 1,55E+08 57,10
220/247
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) Nenhum EGF (50 ng/mL) 5558 43,85 5,01 E+07 18,44
Nenhum nenhuma AA(com Wnt3a) Nenhum EGF (100 ng/mL) 6818 53,79 6.42E+07 23,62
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (50 ng/mL) Nenhum 8494 67,01 6.62E+07 24,35
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 10138 79,98 7.30E+07 26,87
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (50 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 10219 80,62 7.75E+07 28,51
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (100 ng/mL) Nenhum 9944 78,45 6.68E+07 24,59
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (50 ng/mL) 11046 87,14 8.17E+07 30,07
Nenhum nenhuma AAfcom Wnt3a) FGF (100 ng/mL) EGF (100 ng/mL) 7695 60,71 6.87E+07 25,28
Tabela 11
Intensidade de SOX17 normalizada
Ativina A GDF8
ng/mL Média SD Média SD
1600 100,00 9,20 100,00 9,00
800 100,00 6,60 84,90 6,30
221/247
400 100,00 3,30 72,20 7,50
200 100,00 1,90 51,30 5,30
100 90,70 8,70 32,70 5,10
50 85,20 4,70 17,60 4,80
25 73,10 2,80 5,10 3,60
12,50 50,90 6,20 0,90 0,80
6,25 18,40 4,80 0,70 1,40
3,13 3,00 1,90 0,10 0,20
1,56 0,10 0,00 0,00 0,20
0,00 0,00 0,20 0,30 0,30
Tabela 12
nome do marcador n° de catálogo *
AFP Hs00173490 m1
CD99 Hs00365982 m1
CD9 Hs00233521 m1
CDH1 Hs00170423 m1
CDH2 Hs00169953 m1
CDX2 Hs00230919 m1
CER1 Hs00193796 m1
CXCR4 Hs00237052 m1
FGF17 Hs00182599 m1
FGF4 Hs00173564 m1
FOXA2 Hs00232764 m1
GAPDH Hs99999905 m1
GATA4 HS00171403 m1
GATA6 Hs00232018 m1
GSC Hs00418279 m1
HLXB9 Hs00232128 m1
KIT Hs00174029 m1
MIXL1 HS00430824 g1
222/247
NANOG HS02387400 g1
OTX2 Hs00222238 ml
POU5F1 HS00742896 s1
SOX17 Hs00751752 s1
SOX7 HS00846731 s1
T Hs00610080 ml
ALB Hs00609411 ml
AMY2A HS00420710 q1
ARX Hs00292465 ml
CDX2 Hs00230919 ml
GAPDH Hs99999905 ml
GCG Hs00174967 ml
HNF4A Hs00230853 ml
INS Hs00355773 ml
ISL1 Hs00158126 ml
MAFA Hs01651425 s1
MAFB Hs00534343 s1
NEUROD1 Hs00159598 ml
NEUROG3 Hs00360700 g1
NKX2-2 Hs00159616 ml
NKX2-5 Hs00231763 ml
NKX6-1 HS00232355 ml
PAX4 Hs00173014 ml
PAX6 Hs00240871 ml
PDX1 Hs00236830 ml
PECAM1 Hs00169777 ml
POU3F4 HS00264887 s1
PTF1A Hs00603586 g1
SST HS00356144 ml
ZIC1 Hs00602749 ml
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Tabela 13 Etapa de diferenciação 1 Tratamento CG 1 co S2 c Q Q 3DF8/ Composto 34 s £ s § o g Q Q Etapa de diferenciação 3 Tratamento Us c 1 co 1 Q fO s f Q. E o O g Q a 3DF8/ Composto 56
224/247
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Z ID 40 ’’T in co CD_ CN m É Z IO 03' CM 03 03' CM CO_ ro 3
É Z CN CD s m CM co to CM CN co' CM g Z CN 40* CM (D ID' CN co 4D* CM CO cd' CM
o 2 a Z_ CO o>_ ΓΜ co CM O> CM ID ID CM O O a: Q LU Z CO 4D CN co CO CN ro CN CO CD CO CO
NEDR0D1 CO cm 40 co’ CM CD S CN CM s 2 a z CD- CO- (M
MAF B CD co’ cm CN cm CD CM OS CN CM co' CM CO* CM CM 03 (M
£ m CN co CO_ 03 OS CM VIAFA CO CO V- CO CO- CN co
Zj co CO co' ΓΜ co CM CN CM s CD cb CM co' CM co CM CD-
co z in o’ CM o' CM CN CN CM CD co' CD Z 4D co CD co CD~ r—
z I CD o’ cm CN CM CM CO- CM z X CM CN CM CN CM CN co' CM
CD o co m σ> 03 σ> CO- CM <D_ o o o CN co' CN co' CO- CO co
g o S CN CN CM co CN CM CD CN CM § Cl CO CN CM co' CM co' CM co_ s
g co co' CM IO CM CO CN CM g CN CN (M S to CM
CN 1 < CM CM CM CM £! C0_ CM 4D co' CM 03 CM 03 CM
3 <r CO co CO σ> OS CD CO co' CQ —1 <r m co 03 CD o CM <M
X Q ã co co os co' 03 co CO CO* X Q Q_ ã (O co' CO 03 _ 03 03* n O .CM
Etapa de diferenciação 4 rratamento\CTs c I co $2 c | Q Q 3 o ω a E o O S3 Q Q 3DF8/ Composto 56 Etapa de diferenciação 5 Tratamento Us rc co I 3DF8/Wnt3a 3DF8/ Composto 34 3DF8/ Composto 56
225/247
7alores de CT g co 3' CM 34,5 CD 3 (0 a> JO co
fc co CM cm cm cm CM cm' CM CM
É n co 33,9 CM ID* m
o n CO cm’ m ID m cn co CM co
! LU n CO. co cm 32,9 CO co
§ n_ CM σ> CM ID oo CM CD CM cn. CM
1 CD co CM oo. CM co CM CM.
CD o' m o' m o' CO CD CM
i z -- co co 30,5 33,1 o' CO
É Z <n o' co 32,3 CO. CO co m
â Z CN 29,6 CD CM CM σ> CM 28,1
0 § Q LU Z co o m m ID 3 co 3‘
Q O CC Q LU Z CM in CD CM co CM
LL m cm co co rxi co σ> id ΓΜ
Í $ <0 35,2 34,8 34,7
Zj co cd CM CM co CM. CO co CM 25,7
co z 20,5 19,3 o’ CM CD a>
z X ΓΜ CO s Si Si
0 o 0 cn co co
§ O id CM id CM CO CM σ> id CM
& <r CD. CM co co CM CM co CM
CM 1 < o' o' CO. CD o’ m
co -J <r CO. S m co CM CO. S ID CM
3APDH o' CM o' CM 21,3 CM. CM
Etapa de diferenciação 6 ξ c Φ E 3 E l- s c co co tz | Q 0 3 £ g § o & Q 0 s o to g E o O g5 Q Q
Etapa de diferenciação 1 Valor de Ct t CO $ CN 3 co' co CD CN CO CM CO
SOX7 co CO 33,3 33,7 CO co 32,6
X o W r- CM co CM co CN CO CN CO CN CM CN CN
POU5F 1 CO cm CO CO 30,8 31,3 33,3
CM g CO CN 00. CN 21,8 21,9
NANOG ID. S| OS Si co CN CO. Si CO CM co CM
MIXL1 CD CM co OO CN OO CN oo CM CO_ _
X. CM co CM ID id CN 24,2 24,3 24,8
HLXB9 23,4 CO. CO CN 23,1 Si CM
O co 0 CD. CM CO co CN CO- CM 21,9 22,3 CO CM
GATA6 cm CM CO CO* CN CN CM ID CN CM co cm CM CO CM
GATA4 23,8 ID Si 24,2 23,6 23,4
FOXA2 s id CN 24,2 24,2 3
0 00 CO 3 ID —s 34,4 36,5
FGF1 7 19,8 CN 20,1 o CM 20,3
CXCR4 cm CM CO co CN. CO CM 22,3 22,2
CER 1 ID 19,5 co 18,8 18,8
CDX2 O o s CO o
CDH cn o’ CN co. CM co CM o' CM 00 o’ CM
CDH1 co CN CO. Si CO. Si CO. Si 25,9
8 o Q CN. Si ID. Si Si Si ID co’ CM
CD9 x— Si 23,8 23,7 COCO CM 24,5
Q. £ co id co 3 3 34,8 o
Q o CN o CN CD 19,8 19,8
Tratamento CU co CU £2 c i ll Q Ω GDF8/GSK3 inh BIO CD O to g E o O Sj LL. O 0 s CM O to O Q. E o Q co Q 0 GDF8/ Composto 40
226/247
Valor de Ct
o NJ CO o' co T“ CO co co 34,6 35,5 Etapa de diferenciação 4____________________Valor de Ct_____________________________________________________________________________________________________________________________ o N CD CXÍ CO CD S ID S
ω ω (N CN co 31,3 32,4 32,4 32,4 SST CO id' CN CN 25,6
.ο 30,8 30,7 30,6 o CO 32,4 31,5 Ê< co CN co CN tD co CN
P0U3F 4 CD co CXI g to σ>~ CN σ>' CN 30,2 30,2 POU3F 4 CN CN _
PECAM CO co CXI 32,2 32,2 co 30,9 31,5 PECAM CN σί CN 31,2 30,7
PDX1 CN CN CO co' CN 23,2 σ> CN CN 23,7 23,2 PDX1 CO CN CN co CN 23,2
PAX6 35,2 co 32,9 CO co CO 36,2 CO PAX6 CN CO_ CN CN
PAX Í4 CD cxi CN σ> CN 28,7 28,3 σ> CN CD CN PAX 4 CD ID CXI 26,2 CD CN
NKX6-1 28,3 cd CN 28,8 27,8 3 29,5 ΝΚΧ6-1 CD ID' CN CO in CN 26,1
NKX2-5 34,1 37,8 LD co 37,6 o 37,2 ΝΚΧ2-5 CT> co co 35,4 35,4
NKX2-2 27,3 27,9 CD CN 27,5 CO CN 27,8 CN 8 z 24,2 CÍ s
NEUR 0G3 CXI IO CXI 26,4 26,2 25,9 cxi 26,2 NEUR OG3 co co CN 24,2 cxi
NEURO b, co ID CXI CN CN CO CD CN CD cd' CN 27,2 27,2 NEURO D1 23,7 COs §L
MAFB cxi cxi CD_ & CO CN 27,8 27,9 m i 24,9 24,9 25,4
MAFA 3 s 34,7 3' 34,2 34,5 Í 32,4 33,1 ID CN CO
Σ3 ω 29,4 cd CN 29,3 8 31,6 CO Zj ω 25,2 25,7 25,7
INS CXI σ> cxi σ> CN 28,8 28,5 30,3 o co INS CD_ CN o> CN CN CN
z X < 21,8 co CN CN 22,6 22,5 CN CN 22,5 z X < CD_ CN σ> .s O>_ 5.
0 o 0 34,1 34,2 32,8 33,1 cd 3 37,6 0 0 0 CN 22,6 22,3
§ o 23,3 σ> co CN 23,6 3 CN 23,8 § 0 co CN co CN 23,3
I co CXI σϊ CN σ>' CN σ> CN CD σ> CN 29,6 i CD_ s 25,3 CO id ÇN
CN 1 < ID cd CN 30,4 30,3 30,2 T“ CO 30,5 CN 1 < co co CN ID co CN 28,7
3 id CN 26,5 25,2 26,1 26,7 25,8 ? CO- CN CO. CN CN
GAPD H σ>. 18,5 18,5 co' co 18,6 Q L 18,9 18,3 σ>
Tratamento <§ CO $2 c | s GDF8/GSK3 inh BIO GDF8/Composto 19 CN CN I ε o o «5 Q Q GDF8/ Composto 40 Tratamento CD 1 GDF8/Wnt3a GDF8/GSK3 inh BIO
227/247
cõ tf> co t}4,4 Etapa de diferenciação 5 Valor de Ct ZIC1 34,1 25,6 26,3 28,8 33,8 34,8
tf) to' CM 26,1 CO co CM SST Rl 22,7 CO CM 22,9 22,6 22,3
CO aõ CM CO co CM 28,4 E <r to_ CM 29,1 28,7 28,2 26,4
CM tO_ CM 27,6 POU3F 4 co CM 28,9 28,1 28,2 29,1 29,2
eo 30,2 1 PECAM _ 29,2 29,2 29,8 29,9 29,9
23,1 23,4 (23,1 PDX1 22,6 23,6 23,6 23,4 23,4 23,4
CO CM co_ CM co CM PAX6 5. 25,6 25,6 25,6 25,8 26,4
to' CM 25,8 σ> tO~ CM PAX 4 26,4 27,2 27,3 26,8 27,2 27,3
tf)' CM CO CM CD tf) CM ΝΚΧ6-1 tf> CM CO to CM tf) CM tf) CM CO Cl ID CM
σ> tf)' CO 35,7 37,3 NKX2-5 CO CO co co O 34,6 o CO 3
24,6 24,5 24,6 ΝΚΧ2-2 (N 24,2 s CM 23,2 23,5
σ> co CM CM 24,2 NEUR OG3 CM CO co' CM 28,4 28,6 28,2 co CM
CD co' CM 24,2 NEURO D1 CM 22,6 22,9 CO cm CM CO Rí tf) cm' Cl
id CM IO tf) CM co to CM m 1 CO_ 8 σ> CO Cl 23,8 23,8 CO CO CM 23,9
s 33,3 33,5 MAFA 33,7 32,6 33,5 33,2 cm Q. CM J
25,6 25,5 CO CM Zj ω 23,4 s 23,8 23,2 23,9
CM CM CO cm CM INS 16,9 CD l< 16,8 17,1
22,2 22.1 CO R| HNF4 o>_ 5. 22,3 22,4 22,6 22,2 22,2
5 cm CM co Rl GCG 16,2 CM_ CM_ r- co 16,9
to co’ CM 23,6 h,7 CDX2 CD co CM CO co' Cl CM S 24,2 σ> co CM CM_ §L
CM tf) CM tf) CM 25,5 1 co’ CM 23,8 S 23,4 co CM 23,7
O) co' CM 29,2 29,4 CM 1 < CO co Cl co Cl o> Cl CO co CM σ> CM CD CM
CM CD o CM ▼— CM CD _ 19,5 19,9 19,2 O CM o Cl 19,5
18,9 σ> 19,2 GAPD H σ> co σ> σ> 19,2 19,6
σ> o Io a E o O 5δ u_ Q Ω. GDF8/ Composto 202 o o I <3 & Q Ç2. Tratamento δ GDF8A/Vnt3a_______ GDF8/GSK3 inh BIO σ> ο ü) a E Ο Ο cõ LL Q £ CM O CM O 1» a 1 Si Q 2 GDF8/ Composto 40
228/247
Η U a. ο £ •8 g O H tf á 33,8 32,7 29,6 m to co 32,8 tf) co co 34,6 CD CM CO
δ w CO CM CO 31,2 33,0 32,0 33,0 32,1 m cm co cm co 32,4 29,8
δ ω r- CD CN CM_ CM CM cm CM CM 22,3 22,6 co cm CM co CM 23,3 25,2
POU5F 1 CM CM CO CD cõ 32,8 32,1 32,1 32,7 33,6 co s 33,2 29,5
0TX2 tf) tf 19,9 CO cm ÇM 20,3 22,9 22,5 22,0 co CM ÇM O tf 24,3
8 z 2 s 22,7 24,8 co CM 3 24,5 23,8 24,9 23,9 25,0
Sd s O) CO CM CM CO CM 27,9 m σ> CM & 28,0 tf) co CM CD CM CD O CO
ΚΓΤ tf σ> cm CM OÍ CD tf CD tf 23,9 I 22,9 co CM co CM tf) CM
HLXB9 CO 3 (O co CM m tf) CM 24,8 o co CM CM tf) CM tf) tf) CM CM tf) CM 3 CO tf) CM
O w O cm CM CO cm CM 00 o CM 22,5 CO S co S O) o CM CM cm CM CD cm CM CM 3
<: δ <o 22,9 21,8 22,9 22,6 22,7 23,0 22,5 CM CO CM tf 24,8
GATA4 I___________________________________________________________________________ 25,0 23,1 s 23,1 25,1 24,5 24,6 O tf) CM cq 3 27,5
F0XA2 tf) CM 22,9 25,6 24,0 25,6 25,7 25,5 25,8 3 25,9
FGF4 34,0 33,4 35,1 34,0 32,8 36,0 35,1 36,0 36,2 34,9
fe 20,7 co 20,1 18,9 20,5 20,4 20,2 σ> o ÇM o CM 22,1
2 O X o o CM o cm ÇM O —tf 22,0 17,7 22,0 cm CM 22,2 19,6 CD 3
te LU O T- 18,3 17,1 18,2 CM CD 18,3 r-_ 18,5 18,3 o CM
o 36,0 O o σ> m' co 35,2 O o O o o o tf) tf) Q O o O o ’í
r Q O 21,8 20,9 20,7 CM 20,8 CM 20,4 21,9 CM 22,3
CDH 1 26,1 s O CD Ç1 25,9 26,3 25,9 25,8 cm CM 25,5 25,2
6 600 24,0 22,0 23,3 21,6 24,9 I 23,7 _________________________________________________________________________! 23,6 23,7 23,7 25,9
CD9 CM m CM tf) co CM tf) 3 23,6 s tf) CM CD 3 tf) CM CD 3 tf) tf) Cl
CL £ CO cm <o O o o o 34,2 35,4 O tf O tf O tf) CO o o ’’T 40,0
Q È^ 194 18,2 20,1 co 20,1 co o CM 19,9 20,2 19,8 21,6
Tabela 15 Etapa 1 Tratamento CO ! cõ I 8 E O O 1 AA+Composto 180 O) i 8 E O O í AA+Composto 202 O 8 § o â AA+GSK3 inhib BIO AA+Composto 206 GDF8
229/247
32,6 31,9 32,3 CO o' CN 32,5 CN co CD X CO co’ co
m χ· 32,8 CO CN CO CN <O 32,0 CN CO 33,7 co CN CO
ο in CN 23,7 CN S CD CN CN CO X CO CN CO CO' CN S
x— cõ CO s CN co' g> . CO_ CO 30,0 CD S CO X
24,4 23,3 23,0 & 21,5 22,2 21,8 22,2
CO s in CN CO cd' CN co CN 25,1 s CO ni X
30,5 28,1 28,3 28,5 CN 28,5 29,3 29,7
m CN CO co £N 25,8 CD CN CN 25,9 in CN o in CN in CN
25,0 24,3 24,2 24,0 23,1 23,4 a 23,8
23,8 23,6 23,6 22,1 23,5 23,4 22,7 23,6
a 23,9 23,9 CO CN CN 22,5 22,6 —S o —X
27,3 25,4 25,2 O in CN —S CN s 24,5 24,9
25,7 25,2 25,0 24,2 23,6 24,9 a 25,3
34,8 36,3 36,6 33,2 34,3 35,4 34,8 34,5
22,0 tn S CN 20,4 19,9 20,5 20,1 20,3
CD CO CN 23,0 X co CN S 22,4 23,3 o CO CN
cn o o' CN 19,9 18,0 18,5 18,2 17,7 CO
o o’ Ν’ o o' X 40,0 35,8 33,8 33,4 29,9
CD CN CN 22,4 22,1 20,7 o' 20,5 20,0 o CM
in CN m in CN 26,9 24,6 co —Si 24,7 24,3 23,2
25,8 23,6 24,0 23,7 20,2 22,6 21,8 22,5
o in CN in CN CD m CN 23,9 22,1 o co CN CO CN X
40,0 40,0 40,0 o o' 30,6 40,0 30,1 o o' Ν'
21,2 20,7 20,9 19,6 18,5 o' 19,6 σ>
CO $2 E co Q <2 GDF8+Compostol 81 GDF8+Composto 180 GDF8+Compostol 9 GDF8+Composto 202 GDF8+Composto 40 GDF8+GSK3 inhib BIO GDF8+Composto 206
230/247
Valores de RT-PCR CT δ Ν 34,8 o o’ 34,8 34,4 o o’ 40,0 in” Q O) X o o’ s cd' £1 CM co £1
SST L CM CO’ co 32,8 34,6 34,7 o o’ 34,2 35,3 35,2 31,9 29,5 CM
iPTF1 34,6 o o’ 36,0 40,0 o o o' 35,6 40,0 35,0 34,2 34,0
POU3F 30,5 30,7 30,8 31,3 40,0 31,9 31,3 32,4 31,2 30,8 29,8
PECA Μ 31,0 30,9 30,0 28,9 o o’ 29,7 30,3 31,0 29,7 30,0 32,2
PDX1 L. 23,3 23,8 25,0 26,3 40,0 CM 24,8 26,1 23,9 25,5 23,1
ΡΑΧ6 o o’ 38,1 40,0 36,2 o CD s o o’ o o’ g co_ S co in CM
ΡΑΧ4 co 31,9 33,3 35,3 40,0 32,0 32,9 34,9 31,5 32,4 31,5
ΝΚΧ6-1 32,2 σ> s 35,8 35,3 40,0 33,9 34,4 40,0 35,0 o in' co 32,9
ΝΚΧ2- 5 CD 3 o o’ 33,9 32,5 o o’ CD 8 33,6 32,6 CO cm CO 34,4 o o
ΝΚΧ2- 2 29,3 29,0 30,3 I CO o o' m CT> CM 30,3 31,8 CO σ> CM 30,3 29,1
NEUROG 3_______ o co CM co CM 29,0 30,3 o o’ 28,5 29,1 o_ δ CD co* CM CD CM IO CM
NEMOD1 o’ CO 30,4 CO 32,6 40,0 30,0 30,8 o 3 £ CO o' £9. 30,1
MAFB i____________________________________________________________________________________________ CM CM 28,5 28,6 34,9 28,2 co' CM co δ CO δ 27,2 26,1
MAFA 36,4 33,9 34,6 34,3 40,0 35,1 34,1 34,9 34,4 33,6 I 30,5
L ω 29,3 28,8 30,4 29,4 o o 29,8 29,7 30,2 co CM 28,5 26,3
INS 34,8 ko 40,0 o o o o' 35,1 o o’ _ o o’ o o’ o o’ 40,0
z I < 22,4 22,4 22,3 1O _ co CD cm' CM 22,3 in CM in _ CD co £1 22,4
O 0 0 34,7 40,0 35,1 o ? CO 3 o o o’ 35,7 40,0 35,1
g o σ> o co' CM 22,3 22,5 o —s m Rí CM CM' n 22,0 23,8 23,1
32,0 33,0 34,2 33,3 40,0 33,0 34,9 34,6 co' co 35,3 33,8
1 <r 30,6 30,2 30,1 30,0 o 30,7 o’ co o’ co co o’ co 30,4 29,5
m 26,9 CO CM o co CM 25,5 o o’ 26,2 25,8 24,9 o CM 28,7 27,0
GAPD H 18,5 co 18,6 18,8 34,1 18,5 18,5 18,5 18,3 18,0 17,4
CO CO Q 43 UI Tratamento AA CO CO Έ 1 AA+Composto 181 AA+Composto 180 σ> g g 1 AA+Composto 202 o 1 g E o Q + $ AA+GSK3 inhib BIO AA+Composto 206 GDF8 (0 £2 co O _____<2.
231/247
34,5 o 3 10 CO CO o 3 o o 40,0 30,3
CN <o 34,4 3' 30,9 33,7 33,6 29,2
33,9 CD 3 40,0 31,6 36,3 34,8 ! 33,0
10 ο CO CO 8 31,6 _ 30,2 30,5 30,0 30,8
29,4 31,6 29,4 30,1 29,2 30,4 32,7
23,5 23,7 25,0 23,0 23,2 24,0 23,3
10 co 40,0 35,0 31,8 o o 35,1 CN
30,5 31,2 34,4 30,4 31,5 30,6 31,3
32,5 32,6 35,2 30,5 32,9 33,9 32,3
10' co 35,4 134,4 35,7 35,3 34,6 40,0
o co' CN 29,0 32,2 28,4 28,8 27,9 29,3
O CN 10- CN io_ cõ CN CO δ 26,8 £5
CD 00 CN 30,0 i______________________________________________________________________________________________________________________________________________ CO co co CD cd CN o'oe 29,2 29,9
CO CN CN CO* CN CD CN 27,5 27,6 T~ CN
35,5 35,9 10 3 CN 3 34,3 35,3 35,1
co co CN 29,5 CD CN 10 co CN I I 29,1 29,9 27,9
34,5 40,0 O o CD 3 o o 34,5 40,0
CN CN & CN 8 CD RÍ 22,4 5 22,9
O O CD 3 o o o 35,1 34,7 40,0
co CN 22,8 1 o CN CN co co CN o co ÇN CN CN _ 23,8
cOcõ 32,4 co CO CO CN CO 32,5 31,5 33,5
30,2 CD 8 σ> CN 8 8 30,3 30,2
CO- CN CO CN σ> CN CO CN CN 24,9 27,6
CO co CO co co co CO co co 18,2
GDF8+Compostol 81 GDF8+Composto 180 Õ (0 o CL E o o + co Q 0 CD GDF8+Composto 202 GDF8+Composto 40 __________ GDF8+GSK3 inhib BIO ________ GDF8+Composto 206
232/247
b a. o Q. έ 0) D ω £ o £ 5 32,5 32,4 31,2 31,2 35,1 32,7 CN CO 32,9
SST CO. s O) ID CN ID in CN 27,1 24,0 25,6 CN CN CD co CN
<0 O) CN CO o co 32,6 29,5 31,2 33,7 CO σ> CN
POU3F 4 m <0 CN CN CN in CN 28,5 CN ID co CN ID o CO <0 (D CN
PECA M 29,8 30,4 27,9 26,7 29,6 30,3 29,6 29,7
PDX1 23,7 Si 24,0 24,0 24,3 ID CN 26,5 23,6
ΡΑΧ6 t— CN CD_ CN o to CN 28,9 CT> co CN CN CD CN 30,0 26,3
PAX4 in CN co' CN CO to CN CN CO to CN CN O) CM ID in CN
NKX6- 1 CN tf) CM CO CN 28,9 CN CO CN 32,9 CN &
NKX2- 5 31,9 31,8 30,9 29,4 32,1 CN CM co 31,5 31,9
NKX2- I? 24,0 S CD S 25,0 25,0 26,2 23,8
NEUROG 3 co co' CN s tD S 25,8 s CO 10 CN S co co CM
NEUROD 1 co CN s CN S 25,5 24,0 S 26,3 23,3
MAFB U> co CN s s 24,6 23,9 S in CM m co CN
MAFA I______________________________________________________________________________________________ 30,6 5“ CO 31,6 S' CO 31,5 33,0 30,4
ω 25,1 24,5 26,1 24,4 25,3 26,5 24,0
INS <0 co’ CN CN 10 CN 24,6 26,7 CN CN 23,5 26,3 22,8
z T < CN CN o CN 20,6 O CN CO CN CN CN
o 0 o 22,8 25,1 ID S 25,4 CO_ CN CN CN CN CN in CM CM CN
CDX2 23,7 22,1 21,6 CO co CN CD R| CN CN CD CN CN
< 23,9 24,6 o s 26,3 24,0 s 26,7 23,3
1 < CD co’ CN 29,3 CN 27,3 (Mostra de ARN insuficiente) cd CN σΓ CN 29,2 co CN
co < 22,4 in co ÇN O s 21,0 20,7 CD o’ CN CD 20,9
0 0. <5 X 19,0 19,5 18,0 19,4 19,2 19,2 19,0 18,8
to Q 5 Lil Tratamento <0 CO •c J o to a E o Q £ g 5 a E o O t o $ 5 AA+Composto 19 AA+Composto 202 AA+Composto 40 AA+GSK3 inhib BIO AA+Composto 206
233I2A7
CO CN CM 29,0 cd cõ 33,4 CO 34,1 32,6 32,7 28,9
O CD CM Si CN Si CO co CM 27,9 8 CN CM 23,4 24,0
O O m s co co’ CM 30,7 32,6 cd CM 28,4 29,5
CD CM CN ID CN σ> co . CM 29,2 cd' CN 26,4 27,8 26,9
CD CM co CO CD CN !30,6 I I_____________________________________________________________________________________________________ 30,2 ID σ> CM 29,3 30,0 31,4
ID cd CM CO co’ CN CO a 23,8 25,1 O co CM 23,4 24,2 23,5
cd_ CM CO CO’ CM o_ CN 28,3 30,0 26,5 26,1 27,0 27,2
CO co’ CM 24,2 26,0 28,2 24,8 24,8 26,1 25,5
31,2 O co CN 25,7 CN 30,2 25,9 26,6 27,9 26,3
CO cn co 33,3 32,1 ID co CO 34,0 33,4 33,2 33,3 35,3
o cd CM o ID CN CM co CM Si 25,6 23,4 23,7 24,2 24,0
28,7 24,0 co CN co CN 26,4 22,2 £ 23,8 23,0
29,2 ID CM 22,9 i______________________________________________________________________________________________________________________________________________ 24,3 26,2 22,9 23,2 23,8 23,7
s* 25,1 23,0 S’ 25,5 ID co’ _ 23,3 24,0 24,2
co cm co 32,7 30,6 CO 32,6 30,3 30,2 31,0 30,9
co CN ID CM CO co’ CM Si co io CM 24,3 23,8 24,6 24,9
30,9 ID m' CN cm’ CM 24,5 CN 5 c\i 21,5 21,8 CN CM
CO co CN 23,0 21,4 ID a 22,1 co CN CN 22,0 CN 22,3
CO CN 24,6 id' CM 26,7 CO 21,0 21,5 22,6
CO s Si co CN 23,9 22,9 24,5 CD CO* CN 23,0 24,0
29.8 id' CM tD co CM Si ID ID~ CM CO CN co CN 24,3 Si
σ> CN O σ> CN co CN 29,3 co CM o co CN O CD CM 29,1 28,9
m IO CM co s CO a 24,0 22,6 o CN CN CN σ> 21,6
O co 19,0 o co 19,5 σ> O σΓ O cd cd' ▼*- 18,9
GDF8 CO CO c ? co u. D Q GDF8+Compostol 81 GDF8+Compostol 80 GDF8+Composto 19 GDF8+Composto 202 GDF8+Composto 40 GDF8+GSK3 inhib BIO GDF8+Composto 206
234/247
_________________________________________Valores de RT-PCR CT_______________________________________________________ 6 N 34,4 32,5 31,2 CO 8 O s 32,8 σ>_ cõ o cm co cm ¢0 22,5
SST 19,6 σ> 18,8 co co' CM aí σ>~ 19,5 cd CM
PTF1 A CO CM 27,5 28,0 co Cl CÍ CO o ci 28,1 29,7 27,5 29,5
POU3F 4 CO oo CM 28,8 28,8 o σ> Cl CM CO CM CM σ> CM 29,2 29,9 28,7 27,8
PECA M 30,1 29,6 27,5 co Cl in cõ ÇM 28,1 CO co CM 29,0 cn cm
PDX1 CM co Cl 23,3 co Cl Cl co Cl o CM 23,6 23,2 CO co CM 23,3 25,6
PAX6 q ci (θ' Cl cq ci <O cm CD CO CM ci cm CD s CM CD co CM
PAX4 <o_ CM co CM co CD Cl CM_ CM IO co σ> co CM cm CM CM σί CM
NKX6- 1 25,5 CD Cl co Cl m cd CM 00 to CM 25,8 co Cl LO CM cd to CM CD cd CM
NKX2- 5 34,1 CO —s 32,2 CM 8 8’ σ> σ> CM σ> cm co CO co CO. 35,8 CO
NKX2- 2 23,7 23,4 23,3 OO co Cl O co CM 23,7 23,5 24,2 CD co .CM 25,9
NEUROG 3 oo’ Cl O co CM a> co d m σΓ Cl CM_ cõ CD CO CM o σ> CM *o σ> CM 28,0 30,1
NEUROD 1 00 R| 21,6 21,5 cm CM CM 21,9 21,6 22,1 CM 24,2
m í CM CÍ CM O cT CM CM cT <M- CD CM CM ci CD RÍ ^· cm CM 22,8 RÍ co' CM
MAFA 31,8 31,6 31,4 σ> co O cm CO CO co 31,5 31,8 CO 31,8
Zj ω 22,4 22,3 22,1 26,2 & 22,5 22,8 22,5 co_ s
INS σ> CD tO 26,9 15,0 14,7 to cq 17,7
HNF4A 21,3 20,9 20,9 o CM 24,2 21,3 CM 20,5 21,3 22,9
Ο 0 0 14,1 o_ CO σ> 27,0 CT> CD to 14,4 co
i Q 23,4 23,1 22,9 σ> Rí 25,4 23,4 O co CM CD RÍ co' CM s
22,0 21,9 22,0 5 28,2 22,6 22,3 23,0 CM RÍ 25,2
27,6 Cl 27,6 CD CM 28,6 o co - CM σ>_ cn o CO CM cn CM CM co CM
03 Cl o cm o o’ CL CO co OO 00 23,6 19,2 18,9 r— 19,5 20,5
o JL x 18,3 18,0 18,0 O oo σ>_ 18,6 18,3 18,3 18,2 17,4
to co Q s LU Tratamento s c ! AA+Com posto 181 AA+Composto 180 AA+Composto 19 AA+Composto 202 § a E o J AA+GSK3 inhib BIO AA+Composto 206 GDF8
235/247
22,8 31,9 31,5 31,9 30,9 32,0 32,4 σ> co CN
ID 5. 19,5 18,8 20,5 20,8 20,4 19,3 co o CN
30,7 27,3 27,3 31,0 CN CN ID CO* CN o co CN
28,1 CO co CN 28,7 o Q ID O) CN 28,9 o' CO CO co* CN
29,8 27,5 29,6 29,0 O CD CN 27,3 co CN 03 CN
25,6 23,0 22,9 24,2 23,2 σ> 8 o Si O_ <N
26,5 CN 23,8 25,2 25,2 ▼— CO s ID CN
CO σ> _ CO CD Π co Cl 27,3 CN 26,6 27,3 lD_ CN
27,0 25,0 25,1 28,6 24,8 25,0 26,7 25,9
31,9 33,8 o o 33,9 co ÍÕ 33,2 o •D co ID 3
CD iD~ Cl co Cl 23,2 COs co co Cl 23,2 CN s s
30,2 i CN 27,9 31,2 27,8 27,3 28,2 28,5
24,0 CN 21,2 22,6 ______________________________________________________________________________________________________________________________________________i 22,3 21,5 22,1 22,8
ID CO Cl CO CN Cl 22,1 23,2 23,3 22,5 22,6 I______________________________________________________________________________________________ σ> cn CN
31,9 31,5 CO 32,2 32,8 31,5 32,6 !32,1
CN CN m a CN tf 23,2 ID co Cl CO Rl 23,1 CO co CN
id_ x— 00 14,4 15,6 15,8 CO 15,5 16,0
22,9 21,2 20,9 21,2 21,9 x— CN CO o' CN S'
IO_ CN 16,2 id CO 15,2 16,0
24,3 23,4 22,9 23,0 24,0 23,0 22,8 o Si
-----------------------------------------------------------------------1 24,8 22,4 22,2 23,4 23,1 22,3 23,2 co’ CN
CM co' CN CO_ CN co_ CN CO CN CO co CN 27,9 27,6 27,9
20,6 σΓ 18,0 18,5 19,6 co o o CN
co 18,0 18,0 18,3 co co CO' y— 18,0
co co Έ § co Q 0 GDF8+Compostol 81 GDF8+Compostol 80 GDF8+Composto 19 GDF8+Composto 202 GDF8+Composto 40 GDF8+GSK3 inhib BIO GDF8+Composto 206
236/247
Tabela 16
Composto n° Seletividade primária
Composto 6 Seletivo para GSK
Composto 7 Seletivo para GSK
Composto 8 Seletivo para GSK
Composto 9 Seletivo para CDK
Composto 57 Seletivo para Trk
Composto 41 Seletivo para GSK
Composto 42 Seletivo para CDK
Composto 10 Seletivo para CDK
Composto 34 controle positivo
Composto 11 Seletivo para CDK
Composto 43 Seletivo para Trk
Composto 44 Seletivo para GSK
Composto 12 Seletivo para CDK
Composto 45 Seletivo para Trk
Tabela 17
Número de célula Expressão de Sox17
Placa Tratame nto Composto n° Seletividade do composto Número total médio de células % de controles positivos Intensidade total média % de controles positivos
1 nenhum a Ativina A Nenhum N/D 9809 67,8 -4.0E+05 -0,2
1 Ativina A/Wnt3a Nenhum N/D 14476 100,0 2.3E+08 100,0
1 Nenhum GDF8 Composto 11 Seletivo para CDK 565 3,9 -1.1E+06 -0,5
1 Nenhum GDF8 Composto 44 Seletivo para GSK 14 0,1 -1.1E+06 -0,5
1 Nenhum Composto 43 Seletivo para Trk 8610 59,5 -2.1E+05 -0,1
237/247
GDF8
1 Nenhum GDF8 Composto 42 Seletivo para CDK 8700 60,1 -2.4E+05 -0,1
1 Nenhum GDF8 Composto 57 Seletivo para Trk 1222 8,4 -7.1E+05 -0,3
1 Nenhum GDF8 Composto 10 Seletivo para CDK 7011 48,4 -6.6E+05 -0,3
1 Nenhum GDF8 Composto 41 Seletivo para GSK 9995 69,0 5.9E+04 0,0
1 Nenhum GDF8 Composto 7 Seletivo para CDK 3 0,0 -1.4E+06 -0,6
1 Nenhum GDF8 Composto 45 Seletivo para Trk 8857 61,2 -4.5E+05 -0,2
1 Nenhum GDF8 Composto 6 Seletivo para GSK 14827 102,4 -1,8E+05 -0,1
1 Nenhum GDF8 Composto 9 Seletivo para CDK 7156 49,4 -4.2E+04 0,0
1 Nenhum GDF8 Composto 12 Seletivo para GSK 13124 90,7 -2.3E+05 -0,1
1 Nenhum GDF8 Composto 8 Seletivo para GSK 13235 91,4 3,8E+05 0,2
1 GDF8 Composto 34 controle positivo 13926 96,2 2.6E+08 111,8
1 GDF8 Composto 45 Seletivo para Trk 9540 65,9 1.1E+08 47,9
1 GDF8 Composto 7 Seletivo para GSK 5296 36,6 7.0E+07 30,4
1 GDF8 Composto 10 Seletivo para CDK 4627 32,0 6.6E+07 28,6
1 GDF8 Composto 6 Seletivo para GSK 5118 35,4 5.8E+07 25,2
1 GDF8 Composto 43 Seletivo para Trk 6682 46,2 5.4E+07 23,4
1 GDF8 Composto 42 Seletivo para CDK 5686 39,3 4.9E+07 21,2
1 GDF8 Composto 8 Seletivo para GSK 5018 34,7 4.7E+07 20,4
1 GDF8 Composto 9 Seletivo para CDK 4816 33,3 4.5E+07 19,4
1 GDF8 Composto 41 Seletivo para GSK 4455 30,8 3.4E+07 14,8
1 GDF8 N/D N/D 2856 19,7 2.2E+07 9,4
238/247
1 GDF8 Composto 57 Seletivo para Trk 2110 14,6 1,1 E+07 4,8
1 GDF8 Composto 11 Seletivo para CDK 210 1,4 -4.9E+05 -0,2
1 GDF8 Composto 44 Seletivo para GSK 226 1,6 -9.5E+05 -0,4
1 GDF8 Composto 12 Seletivo para CDK 31 0,2 -1.3E+06 -0,6
Tabela 18
Número de célula Expressão de Sox17
Placa Tratame nto Composto N° Número total médio de células SD % de CV % de controles positivos Intensida de total média SD % de CV % de controles positivos
1 nenhum a ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15489 0 0,00 103,2 3.75E+07 O.00E+ 00 0,00 10,9
1 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15007 1991 13,27 100,0 3.45E+08 7.16E+ 07 20,75 100,0
1 GDF8 Composto 206 20568 1683 8,18 137,1 5.19E+08 4,41 E+ 07 8,51 150,3
1 GDF8 Composto 207 19224 1091 5,68 128,1 2.54E+08 5.69E+ 07 22,41 73,6
1 GDF8 Composto 19 12569 1524 12,13 83,8 2.40E+08 6.34E+ 07 26,44 69,5
1 GDF8 Composto 23 8758 474 5,41 58,4 1.16E+08 9.07E+ 06 7,80 33,7
1 GDF8 Composto 170 6460 2305 35,68 43,0 9.44E+07 6.98E+ 07 73,93 27,4
1 GDF8 Composto 208 4848 1225 25,27 32,3 2.26E+07 2.15E+ 07 94,96 23,6
1 GDF8 Composto 209 4831 1243 25,74 32,2 3.97Ê+07 1.61E+ 07 40,56 11,5
1 GDF8 Composto 4338 1520 35,04 28,9 3.63E+07 3.27E+ 90,14 10,5
239/247
32 07
1 GDF8 Composto 30 4679 435 9,29 31,2 3.47E+07 1.04E+ 07 30,03 10,1
1 GDF8 Composto 223 3704 1077 29,08 24,7 3.45E+07 2.74E+ 07 79,43 10,0
1 GDF8 Composto 2 4538 632 13,93 30,2 2.95E+07 2,81 E+ 06 9,50 8,6
1 GDF8 Composto 210 2645 817 30,88 17,6 2.90E+07 2.45E+ 07 84,73 8,4
1 GDF8 Composto 24 5012 1263 25,21 33,4 2.64E+07 1.66E+ 07 62,95 7,7
1 GDF8 Composto 211 5165 796 15,41 34,4 2,61 E+07 5.02E+ 06 19,23 7,6
1 GDF8 Composto 212 5476 1445 26,39 36,5 2.54E+07 1,18E+ 07 46,53 7,4
1 GDF8 Composto 224 5188 761 14,67 34,6 2.46E+07 8.26E+ 06 33,56 7,1
1 GDF8 Composto 225 4431 1149 25,92 29,5 2.45E+07 2.65E+ 07 108,19 7,1
1 GDF8 Composto 13 3123 1508 48,27 20,8 2.44E+07 2.30E+ 07 94,13 7,1
1 GDF8 Composto 213 1261 1028 81,49 8,4 2.07E+07 1,97E+ 07 95,03 6,0
1 GDF8 Composto 52 4932 386 7,82 32,9 1.99E+07 6.90E+ 06 34,67 5,8
1 GDF8 Composto 214 3345 335 10,01 22,3 1.93E+07 1.39E+ 07 72,18 5,6
1 GDF8 Composto 51 4289 940 21,91 28,6 1,70E+07 1.10E+ 07 64,86 4,9
1 GDF8 Composto 26 4896 545 11,14 32,6 1.65E+07 5.93E+ 06 36,02 4,8
1 GDF8 Composto 3617 577 15,94 24,1 1.59E+07 4.96E+ 31,21 4,6
240/247
226 06
1 GDF8 Composto 215 4326 165 3,81 28,8 1.45E+07 2.69E+ 06 18,53 4,2
1 GDF8 Composto 31 3619 1011 27,92 24,1 1.36E+07 4.63E+ 06 34,15 3,9
1 GDF8 Composto 216 3364 629 18,70 22,4 8.75E+06 2.30E+ 06 26,32 2,5
1 GDF8 Composto 217 2859 544 19,03 19,1 8.75E+06 1.94E+ 06 22,16 2,5
1 GDF8 Composto 218 1327 118 8,92 8,8 6.44E+06 9.70E+ 05 15,05 1,9
1 GDF8 Composto 219 368 168 45,67 2,5 1.79E+06 1,29E+ 06 72,17 0,5
2 nenhum a ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15778 0 0,00 103,2 2.24E+07 O.OOE+ 00 0,00 6,7
2 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15290 1119 7,32 100,0 3.37E+08 2.84E+ 07 8,44 100,0
2 GDF8 Composto 202 20177 987 4,89 132,0 4.85E+08 1.94E+ 07 4,00 144,0
2 GDF8 Composto 227 2911 4619 158,6 9 19,0 3.89E+07 6.69E+ 07 172,00 11,5
2 GDF8 Composto 15 4383 1775 40,49 28,7 3.57E+07 3.57E+ 07 100,03 10,6
2 GDF8 Composto 228 4043 1253 30,98 26,4 3.10E+07 2.53E+ 07 81,62 9,2
2 GDF8 Composto 229 3451 892 25,85 22,6 1.80E+07 1,46E+ 07 81,07 5,4
2 GDF8 Composto 4 3163 805 25,44 20,7 1.58E+07 3.54E+ 06 22,32 4,7
2 GDF8 Composto 2791 1453 52,05 18,3 1.40E+07 9.00E+ 64,28 4,2
241/247
220 06
2 GDF8 Composto 5 3137 1172 37,34 20,5 1.30E+07 7.52E+ 06 57,85 3,9
2 GDF8 Composto 230 2624 248 9,46 17,2 1.24E+07 1,55E+ 07 124,73 3,7
2 GDF8 Composto 231 4773 2651 55,55 31,2 1.22E+07 6,51 E+ 06 53,37 3,6
2 GDF8 Composto 232 3273 1290 39,41 21,4 1.18E+07 1.51E+ 07 127,98 3,5
2 GDF8 Composto 221 1950 361 18,52 12,8 1.18E+07 1.54E+ 07 131,11 3,5
2 GDF8 Composto 233 3041 180 5,93 19,9 1.12E+07 1.09E+ 07 97,44 3,3
2 GDF8 Composto 147 3434 1199 34,91 22,5 1.12E+07 9.80E+ 06 87,75 3,3
2 GDF8 Composto 234 2835 623 21,98 18,5 9.47E+06 5.67E+ 06 59,84 2,8
2 GDF8 Composto 235 3391 2269 66,91 22,2 9.10E+06 6,51 E+ 06 71,52 2,7
2 GDF8 Composto 236 2868 561 19,57 18,8 6.73E+06 6.32E+ 06 93,82 2,0
2 GDF8 Composto 33 2362 511 21,66 15,4 6.60E+06 2.45E+ 06 37,20 2,0
2 GDF8 Composto 1 3213 166 5,16 21,0 6.48E+06 3.09E+ 06 47,67 1,9
2 GDF8 Composto 53 2783 441 15,86 18,2 6.36E+06 2.89E+ 06 45,36 1,9
2 GDF8 Composto 237 2973 292 9,83 19,4 6.02E+06 3.00E+ 06 49,79 1,8
2 GDF8 Composto 238 2739 485 17,70 17,9 5.97E+06 6,10E+ 06 102,07 1,8
2 GDF8 Composto 3156 667 21,15 20,6 5.60E+06 2.42E+ 43,24 1,7
242/247
239 06
2 GDF8 Composto 240 3002 287 9,55 19,6 4.68E+06 3.13E+ 06 66,80 1,4
2 GDF8 Composto 200 2308 209 9,04 15,1 4.39E+06 1.88E+ 06 42,83 1,3
2 GDF8 Composto 222 1776 719 40,47 11,6 3.33E+06 2.52E+ 06 75,78 1,0
2 GDF8 Composto 241 2949 446 15,14 19,3 3.29E+06 1.55E+ 06 47,03 1,0
2 GDF8 Composto 242 385 184 47,83 2,5 1.08E+06 8.85E+ 05 81,61 0,3
2 GDF8 Composto 243 249 55 22,21 1,6 2.53E+05 3.07E+ 05 121,25 0,1
2 GDF8 Composto 204 250 21 8,38 1,6 1.36E+05 2.27E+ 04 16,66 0,0
3 nenhum a ativina A (com Wnt3a) Nenhum 15796 0 0,00 99,6 2.82E+07 O.OOE+ 00 0,00 8,0
3 Ativina A/Wnt3a Nenhum 15867 785 4,95 100,0 3.54E+08 2.40E+ 07 6,77 100,0
3 GDF8 Composto 34 6974 3723 53,38 44,0 2.07E+08 9,51 E+ 07 45,85 58,6
3 GDF8 Composto 185 10892 1552 14,24 68,6 1.53E+08 4.08E+ 07 26,72 43,1
3 GDF8 Composto 35 7746 1873 24,17 48,8 1.35E+08 4.86E+ 07 36,08 38,0
3 GDF8 Composto 22 6727 1927 28,64 42,4 1.06E+08 5.04E+ 07 47,73 29,8
3 GDF8 Composto 34 4889 1152 23,57 30,8 4,31 E+07 2,11E+ 07 48,95 12,2
3 GDF8 Composto 4173 1758 42,14 26,3 3.94E+07 2.24E+ 56,78 11,1
243/247
184 07
3 GDF8 Composto 223 4234 1604 37,88 26,7 3.55E+07 2.51E+ 07 70,56 10,0
3 GDF8 Composto 37 4187 338 8,06 26,4 3.11E+07 1,56E+ 07 50,18 8,8
3 GDF8 Composto 244 4479 1229 27,43 28,2 2.73E+07 1.52E+ 07 55,71 7,7
3 GDF8 Composto 245 4725 99 2,09 29,8 2.59E+07 1.03E+ 07 39,90 7,3
3 GDF8 Composto 246 3820 1091 28,57 24,1 2.30E+07 2.69E+ 07 117,08 6,5
3 GDF8 Composto 247 3730 966 25,90 23,5 2.14E+07 1.04E+ 07 48,63 6,1
3 GDF8 Composto 248 3875 445 11,48 24,4 2.13E+07 9.45E+ 06 44,45 6,0
3 GDF8 Composto 25 3879 658 16,95 24,4 1.76E+07 1.21E+ 07 69,04 5,0
3 GDF8 Composto 195 3703 405 10,94 23,3 1.61E+07 3.27E+ 06 20,34 4,5
3 GDF8 Composto 227 2904 397 13,68 18,3 1.43E+07 1,35E+ 07 94,25 4,0
3 GDF8 Composto 183 3306 969 29,32 20,8 1.35E+07 1.14E+ 07 84,25 3,8
3 GDF8 Composto 187 2768 1426 51,51 17,4 1.35E+07 9.02E+ 06 66,67 3,8
3 GDF8 Composto 201 3213 1114 34,66 20,3 1.35E+07 1.69E+ 07 125,02 3,8
3 GDF8 Composto 197 3268 211 6,46 20,6 1.30E+07 5.25E+ 06 40,51 3,7
3 GDF8 Composto 249 3840 348 9,06 24,2 1.29E+07 6,79E+ 06 52,72 3,6
3 GDF8 Composto 2404 213 8,86 15,1 1.12E+07 4.95E+ 44,30 3,2
244/247
141 06
3 GDF8 Composto 194 3177 354 11,14 20,0 9.75E+06 2,11E+ 06 21,63 2,8
3 GDF8 Composto 250 3683 420 11,40 23,2 9.14E+06 4.78E+ 06 52,32 2,6
3 GDF8 Composto 251 3021 668 22,10 19,0 8,41 E+06 4.59E+ 06 54,60 2,4
3 GDF8 Composto 20 2793 205 7,35 17,6 6.77E+06 1.86E+ 06 27,45 1.9
3 GDF8 Composto 252 2580 135 5,24 16,3 6.20E+06 2,31 E+ 05 3,72 1.8
3 GDF8 Composto 253 2485 820 32,98 15,7 5.83E+06 1.47E+ 06 25,20 1.6
3 GDF8 Composto 202 2095 518 24,71 13,2 5.75E+06 2.62E+ 06 45,66 1.6
3 GDF8 Composto 21 371 294 79,19 2,3 2.36E+06 3.07E+ 06 129,78 0,7
4 nenhum a ativina A (com Wnt3a) Nenhum 16629 0 0,00 119,3 2.42E+07 O.OOE+ 00 0,00 7,8
4 Ativina A/Wnt3a Nenhum 13945 1535 11,01 100,0 3.09E+08 4.77E+ 07 15,46 100,0
4 GDF8 Composto 34 7416 6482 87,41 53,2 2.10E+08 1.82E+ 08 86,70 68,0
4 GDF8 Composto 240 11283 2023 17,93 80,9 1.61E+08 4,41 E+ 07 27,34 52,2
4 GDF8 Composto 28 5236 1787 34,12 37,5 4.03E+07 3.08E+ 07 76,36 13,1
4 GDF8 Composto 198 3985 2674 67,10 28,6 3.89E+07 5.55E+ 07 142,91 12,6
4 GDF8 Composto 4861 1501 30,87 34,9 3.03E+07 1,98E+ 65,37 9,8
245/247
196 07
4 GDF8 Composto 18 1921 1759 91,56 13,8 2.94E+07 3.65E+ 07 123,90 9,5
4 GDF8 Composto 186 3486 425 12,19 25,0 2.34E+07 1.42E+ 07 60,78 7,6
4 GDF8 Composto 254 3960 1521 38,42 28,4 2,31 E+07 2.27E+ 07 98,10 7,5
4 GDF8 Composto 168 3460 324 9,36 24,8 2.28E+07 7.13E+ 06 31,23 7,4
4 GDF8 Composto 190 3402 1318 38,74 24,4 1.87E+07 1.58E+ 07 84,61 6,1
4 GDF8 Composto 255 4006 1625 40,57 28,7 1.52E+07 1.05E+ 07 68,91 4,9
4 GDF8 Composto 50 2666 743 27,86 19,1 1.48E+07 8.30E+ 06 56,15 4,8
4 GDF8 Composto 27 3721 721 19,37 26,7 1.19E+07 9.69E+ 06 81,29 3,9
4 GDF8 Composto 256 2922 1275 43,64 21,0 9,41 E+06 8.65E+ 06 92,01 3,0
4 GDF8 Composto 257 3182 705 22,14 22,8 8.06E+06 4.49E+ 06 55,75 2,6
4 GDF8 Composto 258 2731 472 17,29 19,6 7.89E+06 7.24E+ 06 91,70 2,6
4 GDF8 Composto 189 2350 1625 69,16 16,9 7.72E+06 5.36E+ 06 69,41 2,5
4 GDF8 Composto 259 2195 955 43,49 15,7 6.92E+06 2.58E+ 06 37,29 2,2
4 GDF8 Composto 260 2468 741 30,04 17,7 6.64E+06 3.33E+ 06 50,18 2,2
4 GDF8 Composto 261 2965 456 15,38 21,3 6.23E+06 2.10E+ 06 33,61 2,0
4 GDF8 Composto 2377 572 24,08 17,0 6.17E+06 2.76E+ 44,65 2,0
246/247
192 06
4 GDF8 Composto 262 2894 399 13,78 20,8 5.75E+06 3.00E+ 06 52,20 1,9
4 GDF8 Composto 188 3005 759 25,26 21,6 5.02E+06 3.97E+ 06 79,06 1,6
4 GDF8 Composto 263 2129 230 10,79 15,3 4.77E+06 1.14E+ 06 23,93 1,5
4 GDF8 Composto 264 2630 342 13,00 18,9 4.28E+06 2.17E+ 06 50,73 1,4
4 GDF8 Composto 265 2636 1372 52,04 18,9 4.27E+06 1.15E+ 06 26,86 1,4
4 GDF8 Composto 14 274 14 5,02 2,0 1.56E+05 9,51 E+ 04 60,91 0,1
4 GDF8 Composto 205 241 3 1,20 1,7 1.36E+05 6.83E+ 04 50,42 0,0
4 GDF8 Composto 266 271 7 2,67 1,9 1.18E+05 3.34E+ 04 28,43 0,0
4 GDF8 Composto 203 253 4 1,49 1,8 1.09E+05 3.49E+ 04 32,09 0,0
Tabela 19
Expressão de Sox17
Composto n° % de controles positivos
Composto 181 150,3
Composto 202 144,0
Composto 180 73,6
Composto 19 69,5
Composto 34 68,0
Composto 40 52,2
Composto 185 43,1
Composto 185 38,0
247/247
Composto 35 33,7
Composto 23 29,8
Composto 22 27,4
Composto 17 23,6
1/1

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para diferenciar células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores característicos da linhagem do endoderma definitivo que compreende tratar as células-tronco pluripotentes com um
    5 meio desprovido de activina A, e contendo um composto selecionado do grupo consistindo em: EGF, FGF4, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, VEGF, GDF-8, muscimol, PD98059, LY294002, U0124, U0126, e butirato de sódio, durante um período de tempo suficiente para a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células que expressam marcadores caracte10 rísticos da linhagem do endoderma definitivo.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a activina A ausente também contém pelo menos um outro composto selecionado do grupo consistindo em: uma anilina-piridinotriazina e uma anilina-piridinotriazina cíclica.
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