BRPI0914508B1 - ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA A PROTEÍNA PBP2a, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA - Google Patents

Abstract

anticorpos monoclonais para a proteína pbp2-a e seqüências homólogas para o tratamento de infecções e imunodiagnóstico em bactérias do filo firmicutes. a presente invenção se refere à anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar à proteína pbp2a e outras proteínas que apresentem seqüências homólogas à pbp2a, incluindo cs patógenos staphylococcus aureus resistentes a meticilina - mrsa, staphylococcus coagulase negativa, staphylococcus sciuri, enterococcus spp. e qualquer outra bactéria que venha possuir a pbp2a ou sequências homólogas a esta proteína. a invenção se refere ainda a utilização dos anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar à proteína pbp2a e outras proteínas que apresentem seqüências homólogas à pbp2a em imunodiagnóstico complementar para a detecção da resistência aos beta-lactâmicos.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais 5 capazes de reconhecer e se ligar à proteína PBP2a e outras proteínas que apresentam sequências homólogas à PBP2a, incluindo os patógenos Staphylococcus aureus resistentes & meticilina - MRSA, Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus sciuri, Enterococcus spp. e qualquer outra bactéria que venha possuir a PBP2a ou sequências homólogas a esta proteína.

A invenção se refere ainda a utilização dos anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar à proteína PBP2a e outras proteínas que apresentem sequências homólogas à PBP2a em imunodiagnóstico complementar para a detecção da resistência aos beta-lactâmicos.

Fundamentos da Invenção

As infecções causadas por Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) são uma causa de preocupação maior para os clínicos, apresentando taxas de mortalidade e morbidade superiores às infecções causadas por Staphylococci sensíveis a meticilina (1). Além disso, estas infecções acarretam um maior tempo de internação e gasto com antimicrobianos, levando a um maior custo no tratamento dos pacientes infectados por este patógeno (1).

A vancomicina tem sido o antimicrobiano de primeira escolha para o tratamento das infecções causadas por MRSA. Entretanto, o crescente isolamento de cepas MRSA em

Petição 870180168184, de 27/12/2018, pág. 9/16 comunidades nos Estados Unidos e Austrália (2, 3, 4), aliados à identificação de cepas MRSA com resistência intermediária à vancomicina no Japão, nos Estados Unidos (5) e no Brasil (6), tornam o quadro atual ainda mais grave. A descrição em 2004 de cepas MRSA totalmente resistentes à vancomicina (7) tem causado enorme preocupação na comunidade médico-científica. MRSA representa hoje um forte candidato a se tornar o temível superbug ou superbactéria - um patógeno resistente a todas as drogas disponíveis no momento.

De uma forma geral, as taxas de prevalência de MRSA (proporção de todas as infecções por S. aureus causadas por MRSA) em infecções hospitalares vem aumentando gradativamente nas últimas décadas. Em um estudo realizado por Jarvis et al., que incluiu 1268 UTIs (unidades de tratamento intensivo) em 337 hospitais dos Estados Unidos, o número de infecções por MRSA em UTIs passou de 660 para 2184 casos e a prevalência aumentou de 35% para 64,4% (8). No

Japão as taxas de prevalência das infecções hospitalares (IH) causadas por MRSA podem apresentar valores inquietantes, de 60 a 90% (9) . Em estudos realizados nos Estados Unidos, o percentual passou de 2% em 1974 para 50% em 1997 (10, 11) e em alguns hospitais dos Estados Unidos mais de 80% das IH são causadas por MRSA (12) . Na

Inglaterra, a prevalência aumentou de 1,5% para 15,2% entre 1989 a 1995 e atualmente (2004) a estimativa é de 41,5% (13) .

Além de elevadas taxas de prevalência, especialmente em hospitais de ensino e hospitais de grande porte, MRSA é considerado o principal patógeno causador de surtos epidêmicos nos hospitais brasileiros (14). Em 1986, mais de 50% das cepas de origem hospitalar de S. aureus isoladas em pacientes de hospitais universitários de São Paulo eram resistentes à meticilina e em 1993, a incidência de MRSA no Hospital Pediátrico da Escola Paulista de Medicina era de 7 9% (15) . Em um estudo realizado em hospitais de Belo

Horizonte, Resende et. al. (16), apontaram uma prevalência de 71% de MRSA.

As cepas MRSA apresentam uma proteína ligadora de penicilina de baixíssima afinidade pelos antimicróbianos da classe dos beta-lactâmicos, a PBP2a (17) . Na presença desta enzima, codificada pelo gene mecA, a bactéria consegue sintetizar o peptideoglicano, mesmo na presença de betalactâmicos. Esta enzima também pode ser encontrada em Staphylococcus coagulase negativa e em Staphylococcus sciuri - uma bactéria presente na flora normal de cães. Além da resistência aos beta-lactâmicos, as cepas MRSA hospitalares apresentam resistência à maioria das outras classes de antimicrobianos disponíveis, restando como tratamento de primeira escolha o emprego dos glicopeptídeos (vancomicina e teicoplanina).

Dois estudos empregando vacina de DNA contra a PBP2a mostraram que esta proteína é imunogênica e que a resposta imune obtida foi capaz de conferir proteção contra MRSA em ensaios realizados em modelo murino (18, 19) . Entretanto, é sabido que em infecções hospitalares grande parte dos pacientes encontra-se imunodeprimido (20). Nestes casos, uma vacina não seria capaz de gerar anticorpos protetores em tempo hábil para controlar uma infecção bacteriana.

Imunogenicidade da PBP2a.

A PBP2a é uma enzima multimodular de classe II segundo classificação de Goffin e Ghuysen (40). Esta enzima de 76 kilodaltons é composta por uma região de ligação a membrana, um domínio não-transpeptidase e o domínio transpeptidase, contendo um centro ativo de aminoácidos (STQK), responsável pelas reações de transpeptidação da bactéria (20 bis Ryfell, 1990).

Os estudos do estado da arte com a vacina de DNA contra a PBP2a, mostram resultados de redução bacteriana (quantificação renal) em animais imunizados e submetidos a desafio por infecção sistêmica foram de 3 a 4 vezes no trabalho de Ohwada et. al. e de 1000 vezes no trabalho de

Senna et. al. Os autores desses estudos usaram a sequência completa (menos a região de fixação à membrana) do gene mecA e um fragmento interno do domínio transpeptidase, respectivamente.

Porém, conforme acima mencionado, uma vacina não é capaz de gerar anticorpos protetores em tempo hábil para controlar uma infecção bacteriana. Desta forma, no caso das infecções por MRSA, a administração de anticorpos monoclonais anti-PBP2a é a terapia mais adequada para o tratamento destas infecções.

Sumário da Invenção

O objetivo principal da presente invenção é fornecer anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar à proteína PBP2a (SEQ ID NO:1) e outras proteínas que apresentem seqüências homólogas à PBP2a, incluindo os patógenos Staphylococcus aureus resistentes a meticilina MRSA, Staphylococcus coagulase negativa, Staphylococcus sciuri, Enterococcus spp. e qualquer outra bactéria que venha possuir a PBP2a ou seqüências homólogas a esta proteína.

Um outro objetivo da invenção é a utilização dos anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar à proteína PBP2a e outras proteínas que apresentem seqüências homólogas à PBP2a em imunodiagnóstico complementar para a detecção da resistência aos beta-lactâmicos.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção estão representados pelas seqüências SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO:17.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o teste imunoenzimático (ELISA) de soros de animais imunizados para a produção de anticorpos anti-PBP2a.

A Figura 2 mostra o resultado de um gel de poliacrilamida com as amostras brutas e após purificação.

A Figura 3 mostra o teste de Immunoblotting de lisados de MRSA e MSSA contra o sobrenadante contendo os anticorpos monoclonais anti-PBP2a.

A Figura 4 é uma representação dos resultados da citometria de fluxo das bactérias MRSA (CEB) e MSSA, incubadas com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e marcadas com ficoeritrina (PE).

A Figura 5 mostra o teste de proteção in vitro (CIM - j concentração inibitória mínima) conferida pelo anticorpo j monoclonal purificado anti-PBP2a e vancomicina frente a um 4 inóculo de diferentes cepas de MRSA.

A Figura 6A mostra os resultados de quantificação renal em animais tratados e não tratados com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com dose subletal da cepa CEB MRSA.

A Figura 6B mostra os resultados de quantificação renal em animais tratados e não tratados com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com

dose subletal da cepa	Iberian MRSA	(clone	epidêmico
europeu).
A Figura 6C mostra os	resultados de	quantificação renal
em animais tratados e	não tratados	com o	anticorpo

monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com dose subletal da cepa CA-MRSA WB7 9 (cepa comunitária brasileira).

A Figura 7A mostra a curva de sobrevivência de animais

tratados (protegidos)	e	não	tratados	(controle)	após
infecção por dose letal	de	bactérias (CEB	MRSA).
A Figura 7B mostra	a	curva	de sobrevivência de animais
tratados (protegidos)	e	não	tratados	(controle)	após
infecção por dose letal	de	bactérias (Iberian MRSA).
A Figura 7C mostra	a	curva	de sobrevivência de animais
tratados (protegidos)	e	não	tratados	(controle)	após

infecção por dose letal de bactérias (CA-MRSA WB79).

A Figura 8A mostra a quantificação bacteriana em rins de animais tratados com anticorpo monoclonal anti-PBP2a, vancomicina, associação de anticorpo+vancomicina e animais não tratados, após infecção com bactérias (CEB-MRSA).

Ά Figura 8B mostra a quantificação bacteriana em rins de animais tratados com anticorpo monoclonal anti-PBP2a.

As Figuras 9 mostram a interação entre a PBP2a recombinante (antigeno) com os anticorpos monoclonais clones 38 (Figura 9A) e clone 10 (Figura 9B).

Descrição Detalhada da Invenção.

A emergência de infecções por bactérias multiresistentes aos antimicrobianos vem apresentando um aumento alarmante. A prevalência das infecções hospitalares causadas por MRSA tem aumentando em todas as partes do mundo, inclusive no Brasil. As infecções causadas por este patógeno apresentam uma alta morbidade e acarretam um alto custo, devido ao uso intensivo de antimicrobianos e ao maior período de internação dos pacientes (24) . O tratamento baseado na quimioterapia vem dando sinais de esgotamento, com o surgimento de muito poucos fármacos realmente novos e eficazes no mercado (25) .

Neste contexto a imunoterapia passiva (re)surge como uma alternativa promissora. Apresentando uma série de características vantaj osas sobre quimioterapia convencional - entre elas a menor toxicidade, maior meia vida plasmática (o que facilita o tratamento pela redução de doses e talvez um menor custo final de tratamento) e, em especial - no caso do produto aqui apresentado - a toxicidade seletiva, preconizada por Paul Ehrlich - onde o fármaco elimina seletivamente o patógeno em questão (25a). Esta última característica é extremamente útil para se evitar a chamada pressão de seleção, exercida por antimicrobianos de largo espectro - que proporcionam o surgimento de bactérias multirresistentes (26).

Para o desenvolvimento deste produto, os inventores selecionaram a PBP2a como alvo, baseado em estudos preliminares com vacina de DNA em modelos murinos (18,19,21) e em análises imunoestruturais da molécula. A PBP2a teve sua estrutura elucidada em 2002 (29), estando depositada no PDB (Protein Data Bank) sob o código lwmr.

Diferentemente de outras abordagens, os inventores trabalharam com uma região interna da molécula, de 76 aminoácidos, que flanqueiam o centro ativo da enzima (SxxK), no domínio transpeptidase. Foram realizadas análises de identificação de epítopos na molécula e de sua apresentação aos diferentes alelos de MHC classe II (programa Tepitope), com verificação posterior da localização na molécula (programa SPDB-Viewer). Esta abordagem nos permite avaliar a facilidade de acesso dos anticorpos a estes alvos na molécula nativa.

Esta análise computacional demonstrou a presença de epitopos próximos ao centro ativo da enzima, com excelente grau de reconhecimento por alelos MHC classe II e localizados na superfície da PBP2a (dados não mostrados).

Estas previsões in silico foram confirmadas pelos testes de reconhecimento do alvo realizados (immunoblotting e citometria de fluxo) e a ligação do anticorpo a esta região da PBP2a mostrou ser capaz de conferir uma alta proteção, demonstrado pelos resultados obtidos nos testes in vitro e in vivo realizados. Os anticorpos gerados pelo fragmento de 76 aminoácidos mostraram conferir uma proteção superior aos gerados pela imunização com a PBP2a inteira, como anteriormente demonstrado pelos trabalhos de Ohwada e Senna, e confirmados pelos resultados dos inventores.

A epidemiologia das infecções causadas por MRSA mostra a presença de tipos clonais predominantes, responsáveis por surtos e epidemias em hospitais do mundo inteiro. Estes clones apresentam uma maior capacidade de colonização e virulência, quando comparados com as cepas não epidêmicas de MRSA (30) .

Como forma de validar os resultados obtidos procurou-se trabalhar com diferentes clones de MRSA - clones epidêmicos - representativos da maior parte das infecções (em especial as hospitalares) , causadas por MRSA.

A cepa CEB (clone epidêmico brasileiro), é a responsável pela maior parte das infecções causadas por MRSA em hospitais brasileiros (31), tendo também sido identificada em outros países da América do Sul (32,33), em Portugal e Tchecoslováquia (34). O clone epidêmico europeu (Iberian-MRSA) é encontrado em países europeus e nos Estados Unidos (35).

Em virtude do crescimento de casos de infecções comunitárias causadas por MRSA, foi incluído nos presentes experimentos uma destas cepas (CA-MRSA WB79) isolada no Brasil. Estas cepas apresentam características diferenciadas das encontradas em hospitais, como uma maior virulência (presença da leucocidina de Panton-Valentine) e perfil de resistência aos antimicrobianos diferente das cepas MRSA hospitalares (36). Recentemente, foi identificado um surto de infecções por CA-MRSA entre a população de homens que praticam sexo com outros homens, nos Estados Unidos (37). Podemos dizer que, a partir desta data, as infecções causadas por MRSA assumem um caráter de DST (doença sexualmente transmissível).

Os resultados de proteção conferidos pela administração do anticorpo anti-PBP2a demonstraram eficácia contra todos os diferentes clones testados, fazendo-nos acreditar em sua aplicabilidade para as infecções (comunitárias ou hospitalares) causadas por qualquer tipo de MRSA.

Algumas características importantes do produto da presente invenção precisam ser comentadas.

(i) Os resultados de proteção in vitro levam a crer que o mecanismo de ação envolvido - bloqueio de uma região próxima ao centro ativo da molécula - é suficiente para inibir o crescimento e multiplicação bacteriana. Este mecanismo, de forma similar ao dos antibióticos betalactâmicos, é tempo-dependente, necessitando que a bactéria esteja em fase de multiplicação para expor o alvo à ação da droga.

(ii) Esta característica é favorecida pelas propriedades farmacocinéticas dos anticorpos, que apresentam uma meia vida plasmática longa (38). Comparando com a terapia por antibióticos, isto significa uma administração em menor número de doses, tendo como conseqüências uma facilidade de tratamento para o paciente e talvez, um menor custo final. Estas idéias foram confirmadas na prática, no ensaio comparativo de proteção com a vancomicina (ver adiante).

(iü) significa mecanismos

A inibição do crescimento bacteriano in vitro, também que o anticorpo não necessita dos auxiliares da resposta antigeno-anticorpo tradicionais, como a opsonização e ativação de complemento. Considerando-se que grande parte das infecções hospitalares ocorre em pacientes que estão em estado de imunodepressão, esta característica do produto é extremamente importante.

(iv) Sabe-se que Staphylococcus aureus apresentam a proteína A em sua superfície. Esta molécula tem como característica ligar-se a região Fc das imunoglobulinas, impedindo a atividade opsonizante do sistema imune (38). Devido aos resultados obtidos em nossos experimentos, acreditamos que a concentração de anticorpos administrada foi capaz de saturar a proteína A existente na superfície bacteriana, não impedindo o bloqueio da PBP2a pelos anticorpos administrados.

As infecções sistêmicas causadas por MRSA têm sido tratadas com o emprego de glicopeptídeos, em especial a vancomicina. Entretanto, este fármaco apresenta uma série de efeitos colaterais, entre eles imunotoxicidade (42), ototoxicidade, nefrotoxicidade e neutropenia transitória (43) e necessitam de administração por longos períodos, apresentando um custo final por tratamento elevado.

Utilizando um modelo de infecção murino foi possível comparar um tratamento com vancomicina versus anticorpo monoclonal e a combinação das duas drogas. Os resultados obtidos indicaram que uma dose do anticorpo teve ação similar ou superior a 5 doses de vancomicina e que, a administração simultânea das duas drogas foi muito mais eficiente na eliminação da bactéria do que a administração isolada. Estes dados são extremamente importantes, pois é possível pensar em um custo menor por tratamento com o anticorpo e em uma recuperação dos pacientes em estado grave mais eficaz com a administração de vancomicina e anticorpo.

Em adição ao uso de anticorpos monoclonais anti-PBP2a para o tratamento de infecções por MRSA, a presente invenção contempla ainda, as seguintes aplicações:

(i) os resultados de reconhecimento de uma proteína com peso molecular próximo ao da PBP5 na cepa de Enterococcus sp., pelo anticorpo monoclonal anti-PBP2a, indicam que é possível ter uma resposta protetora contra este patógeno com a administração do anticorpo. A PBP5 apresenta homologia com a PBP2a, sendo classificadas com PBPs multimoduiares de classe B, com baixa afinidade por beta-lactâmicos (40). Os enterococcos são bactérias causadoras de infecções hospitalares graves, apresentam alto grau de resistência intrínseca e adquirida a antimicrobianos. As cepas resistentes à vancomicina (VRE) representam um reservatório de genes de resistência aos glicopeptídios, podendo serem transferidos a outros patógenos (41).

(ii) estes anticorpos podem ter aplicabilidade da identificação da PBP2a, por meio de testes de imunodiagnóstico. O emprego de imunotestes baseados em aglutinação de partículas de látex conjugadas ao anticorpo, por exemplo, pode dar um resultado que prevê a resistência a todos os antibióticos beta-lactâmicos em algumas horas. Nos testes de sensibilidade aos antimicrobianos convencionais 13 antibiograma - estes resultados são liberados somente após a 24 horas.

(iii) uma vez que anticorpos monoclonais têm sido empregados com sucesso em aplicações tópicas contra feridas crônicas (infliximab, ver ref. Streit et al., e WO_1999041285_A1), estes anticorpos poderão ser administrados via tópica para promover a descolonização nasal por MRSA e para o tratamento de lesões cutâneas causadas por este patógeno.

Com base nos conhecimentos e problemas encontrados no estado da arte, os presentes inventores realizaram imunizações em animais com vacina de DNA com construções correspondendo ao gene mecA (SEQ ID NO: 2) sem a região de fixação à membrana e imunizações com uma região interna do domínio transpeptidase, de 76 aminoácidos (SED ID NO: 3) compreendendo o centro ativo da enzima.

As imunizações foram realizadas nas mesmas condições, apresentadas nos trabalho de Ohwada et. al. e Senna et. al., que desenvolveram uma vacina de DNA contra a PBP2a, usando a sequência completa (menos a região de fixação à membrana) do gene mecA e um fragmento interno do domínio transpeptidase. As imunizações foram feitas com 4 doses, e os animais imunizados e um grupo controle não imunizado foram desafiados por infecção sistêmica com MRSA e determinação do número de bactérias presentes nos rins dos animais em dois períodos distintos. Os resultados obtidos mostraram que a imunização com o fragmento da transpeptidase conferiu uma redução maior do número de bactérias presentes nos rins dos animais do que nos imunizados com o gene mecA.

Assim, observamos que os anticorpos gerados contra o fragmento da transpeptidase proporcionaram uma melhor proteção nas condições empregadas (vacina de DNA em modelo murino) do que os anticorpos contra a PBP2a. O fragmento da transpeptidase abrange o centro ativo da enzima STQK (SEQ ID NO:4).

Assim, com base nos resultados encontrados, os inventores direcionaram a invenção para a produção de anticorpos monoclonais capazes de reconhecer e se ligar a proteína PBP2a e outras proteínas que apresentem sequências homólogas à proteína PBP2a, e que utilizam o fragmento da transpeptidase que abrange o centro ativo da enzima.

A invenção será agora descrita com referência aos Exemplos, os quais não devem ser considerados limitativos. MATERIAIS E MÉTODOS:

Exemplo 1

1. Bactérias:

Foram empregadas as seguintes cepas de Staphyloccus aureus resistentes a meticilina: Iberian-MRSA, COL-MRSA (cedidos pela Unité des Agents Antimicrobiens - Institut Pasteur, Dr. Patrice Courvalin), CA-MRSA WB79 e CEB-MRSA (cedidos pela Dra. Agnes Figueiredo, Instituto de Microbiologia da UFRJ) ; uma cepa de Enterococcus faecalis resistente à vancomicina e uma de Staphylococcus aureus sensível a meticilina (MSSA). Também foram utilizadas como controle, cepas de Escherichia coli BL21 DE3 (Novagen) e TOP10 (Invitrogen).

2. Animais:

Camundongos Balb/C, fêmeas, de 4 a 8 semanas de idade, obtidas junto ao CECAL-FIOCRUZ e abrigadas no LAEANde 27/12/2018, pág. 10/16

BioManguinhos, foram empregados nos ensaios de imunização e em ensaios de proteção in vivo.

3. Imunização:

Os camundongos (4 animais) receberam uma dose inicial de 100 microgramas do plasmidio pCI-Neo: fragmento do gene mecA de MRSA (18), seguido 14 dias depois de uma dose de 10 microgramas de proteína recombinante purificada, correspondente a uma região interna da PBP2a de MRSA (21), emulsificada em adjuvante de Freund completo, seguida, 14 dias depois por outra dose, emulsificada em adjuvante de Freund incompleto. Quatorze dias mais tarde o animal de melhor resposta imune (avaliada por imunoensaio enzimático ELISA), recebeu uma dose intravenosa de 10 microgramas de proteína purificada diluída em PBS (phosphate buffered saline). Três dias após a injeção I.V. o animal foi submetido à eutanásia por asfixia em CO₂ (Protocolo CEUA L0009-07 - FIOCRUZ) e o baço foi assepticamente removido para a fusão celular. O soro do animal de melhor resposta imune foi utilizado como controle positivo para os demais testes imunológicos.

4. Produção dos anticorpos monoclonais:

Os linfócitos retirados do baço foram submetidos à fusão com células de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC 1581), empregando polietilenoglicol para a fusão, sendo cultivadas em meio hipoxantina-aminopterina-timidina, a 37 °C em atmosfera de 10 % de CO₂, conforme protocolo para produção de anticorpos monoclonais em Current Protocols in Inununology (22). Os hibridomas resultantes foram avaliados após 14 dias por teste de ELISA, empregando a proteína recombinante poços foram de proteína em tampão purificada como antígeno, conforme descrito adiante. Os melhores hibridomas foram submetidos à clonagem, com seleção por ELISA dos melhores clones, sendo estes armazenados em nitrogênio líquido.

5. Imunoensaio enzimatico — ELISA:

Placas plásticas Maxisorb com 98 sensibilizadas com 500 nanogramas/poço recombinante (fragmento PBP2a) carbonato/bicarbonato e incubadas toda à noite a 4°C. No dia seguinte as placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05% de tween 20 e bloqueadas em PBS e leite desnatado 5% durante duas horas a 37°C. Foram adicionadas as amostras a serem analisadas (soro de animais imunizados diluídos 1:100 ou sobrenadantes de cultura de células) e incubadas por 2 horas a 37 °C. A placa foi novamente lavada três vezes com PBS tween 20 (0,05%) e foi adicionado o conjugado anti-IGs (anti-mouse HRP IGs SIGMA A 0412) na diluição 1:5000, seguido de incubação a 37°C por 90 minutos. Após este período a placa foi lavada três vezes com PBS tween 20 (0,05%), sendo adicionado o revelador de cor TMB peroxidase (BioRad) e incubação ao abrigo da luz durante 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de H₂SO₄ 0,5 N e a leitura foi feita a 450 nm. Foi utilizado como controle positivo um soro policlonal hiperimune diluído 1:200.

5.1. Ensaios de avidez baseados em imunoensaio enzimático

5.1.1. Ensaio de avidez com uréia (Niederhouser et al. 5.1) :

O protocolo é semelhante ao do imunoensaio (5) , com as seguintes modificações: após incubação das amostras (100 ng anticorpo monoclonal purificado clone 10 e 2,0 nanogramas do anticorpo monoclonal purificado clone 38) por duas horas a 37°C, estas foram submetidas a três lavagens com uréia 8M em PBS tween 20 (0,05%), seguida de quatro lavagens em PBS tween 20 (0,05%), tendo como controle a mesma amostra processada normalmente (sem o tratamento com uréia). Após leitura das densidades óticas das amostras, o índice de avidez foi calculado pela razão entre a leitura com uréia dividida pela leitura sem uréia, multiplicado por 100 (resultado em percentual).

5.1.2. Ensaio de avidez com tiocianato de amônio (Goldblat et al. - 5.2) protocolo é semelhante ao do imunoensaio (5) , com as seguintes modificações: após incubação das amostras (100 ng

anticorpo monoclonal purificado clone	10 e	2,0	nanogramas	do
anticorpo monoclonal purificado clone	38)	por	duas horas	a
37°C, estas foram submetidas a tratamento	com	tiocianato	de

amônio por 30 minutos a 37 °C nas seguintes concentrações: 3M; 1,5M; l,0M; 0,75M; 0,50M; 0,25M e 0,125M. Uma amostra não tratada com tiocianato de amônio foi usada como controle para cada clone.

Após leitura das densidades óticas das amostras, o índice de avidez foi calculado pela seguinte fórmula: IA (índice de avidez) = [ (log 50 - log A) x (B - A) / log B log A] + A; onde log 50 = 1, 70. A é a menor concentração de tiocianato de amônio que dá uma redução de absorvância menor que 50% e B é a maior concentração de tiocianato de amônio que dá uma redução de absorvância maior que 50%.

6. Produção e purificação dos anticorpos monoclonais:

Uma amostra do clone 10 e do clone 38 anteriormente selecionados foi crescida em meio sem soro (GIBCO VP-SFM) adicionado de 1% de BSA em frascos de 100 mL em estufa de atmosfera de CO₂ 10%. Os sobrenadantes foram submetidos a centrifugação, seguida de filtração em filtros 0,22 micrômetros purificadas em cromatografia de alta submetida à desnaturante performance (HPLC) com uma resina de proteína A MAB SelectSure (GE). Os anticorpos foram neutralizados a pH 7,0 com Tris 1M, pH 10,0, dialisados contra PBS 0,5x em água deionizada. As amostras foram submetidas a processo de liofilização, ressuspensas em água deionizada, quantificadas pelo método de Lowry e avaliadas por eletroforese gel de poliacrilamida.

7. Reconhecimento do alvo:

7.1. Reconhecimento da PBP2a in vitro - Immunoblotting:

Uma cepa MRSA (CEB) , uma cepa de Staphylococcus aureus sensível a meticilina (MSSA) uma de Enterococcus faecium vancomicina-resistente e uma cepa de Escherichia coli BL-21 DE3, foram crescidas em fase exponencial. Um mL de cada amostra foi centrifugado e lisado por agitação em pérolas de vidro em um aparelho mini-Bead Beater (Biospect Products), 3 vezes por 30 segundos. Uma alíquota de cada amostra foi eletroforese em gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE), e as proteínas foram posteriormente transferidas para uma membrana de nylon (Hybond N-BioRad). A membrana foi bloqueada sob agitação suave por duas horas em tampão PBS contendo 10% de leite desnatado e 1% de BSA (albumina sérica bovina). A membrana foi lavada três vezes em PBS tween 20 0, 05% e três vezes em

PBS. Em seguida a mesma foi colocada em incubação por duas horas, com o sobrenadante do anticorpo monoclonal anti-PBP2a diluído em PBS na proporção de 1:1. Após a incubação, a membrana foi lavada como descrito anteriormente, e foi adicionado o conjugado fosfatase alcalina (anticorpo anti IgG murino - Sigma A3688) na proporção de 1:15000 e incubado por noventa minutos. Após este período procedeu-se novamente a lavagem em PBS e foi feita a revelação com o substrato para fosfatase alcalina Western Blue (Promega).

7.2. Reconhecimento da PBP2a na superfície da bactéria Citometria de fluxo:

Uma cepa de MRSA (CEB) foi crescida em fase stat (ON) ou exponencial. As amostras foram lavadas em PBS lx e ressuspensas a uma D0₆₀o de 0,6 (~10⁸ bactérias/mL) . Estas foram centrifugadas 1 mL (10⁸ bactérias) e ressuspensas em 0,5% de BSA e uma diluição de 1:10 de soro normal (murino/humano). Em seguida, as amostras foram incubadas 30 min a 4°C, depois os concentrados (pellets) foram lavados 2 vezes em PBS e ressuspensos em 100 microlitros de PBS contendo 0,5% de BSA e uma diluição do anticorpo monoclonal anti-PBP2a na diluição 1:10.000 e incubados por 30 minutos a 4°C. Após esta etapa as amostras foram novamente lavadas como anteriormente e ressuspensas em 100 microlitros de PBS 0,5% BSA e uma diluição (1:1000) do conjugado anti IG mouse PE (ficoeritrina), sendo posteriormente incubadas no escuro por 30 min a 4°C. Em seguida, as amostras foram novamente lavadas e fixadas 15 minutos a 4°C em PBS contendo 2% de paraformaldeído. Após esta preparação as amostras foram analisadas em um citômetro de fluxo (Becton and Dickinson FACScalibur ).

8. Ensaios de proteção in vitro - determinação da concentração inibitória mínima:

As cepas de MRSA (CEB, Iberian, COL e CA) foram crescidas em fase exponencial até densidade ótica de 600 nm equivalentes a 0,5. 0 inóculo aplicado foi ajustado para conter aproximadamente 100.000 bactérias. Em tubos de ensaio ou placas de 24 cavidades, foram adicionados caldo Müller Hinton, inóculo bacteriano e concentrações crescentes do anticorpo monoclonal anti-PBP2a purificado. As placas ou os tubos foram submetidos à incubação a 37 °C por 12 horas. Após este período foi observada a presença de turvação ou não das amostras. A concentração inibitória mínima foi considerada a menor quantidade de anticorpo capaz de inibir o crescimento do inóculo bacteriano (100.000 bactérias).

9. Ensaios de proteção in vivo:

9.1: Determinação dás doses letal e DL-50 para as cepas

MRSA.

A determinação das doses letal e DL-50 foram realizadas segundo o método de Reed-Muench (23), para as cepas MRSA (CEB, Iberian, CA WB79 e COL). Grupos de camundongos Balb/C fêmeas de 8 semanas, foram inoculadas pela via intraperitonial com doses crescentes de bactérias e observados durante 7 dias. Os animais sobreviventes após este período foram submetidos à eutanásia, segundo as normas de bem estar animal estabelecidas.

9.2: Ensaios de infecção sistêmica e quantificação renal bacteriana.

rins foram em seguida

As cepas de MRSA (CEB, Iberian e CA WB7 9) foram crescidas em fase exponencial (D0₆oo~0, 6) , lavadas e ressuspendidas em PBS lx estéril a uma DC>6oo ~ 0,5, correspondente a aproximadamente 2xl0⁸ bactérias. Esta concentração foi calculada por diluição e semeadura em placas de BHI Agar contendo 10 microgramas de oxacilina/mL. Camundongos Balb/C, fêmeas de 8 semanas, receberam uma dose intraperitonial de anticorpo monoclonal anti-PBP2a purificado, de 400 microgramas, no primeiro dia. No sexto dia, os animais foram submetidos à eutanásia, os rins foram retirados assepticamente. Os homogeneizados em lmL de caldo de Luria estéril e diluídos sucessivamente em séries de 10. 100 microlitros de cada diluição foi semeada em placas de Agar BHI contendo 10 microgramas/mL de oxacilina e incubados 24 horas a 37°C, sendo feita a contagem de colônias resultantes e cálculos das diluições totais.

9.3: Ensaio de sobrevivência:

As cepas de MRSA foram crescidas nas mesmas condições anteriormente descritas, porém os ajustes dos inóculos foram feitos para DL-50 previamente estabelecidas. Camundongos Balb/C, fêmeas de 8 semanas, receberam intraperitonial de anticorpo monoclonal purificado, de 500 microgramas, no primeiro dia. No dia seguinte estes animais mais um grupo controle, foram infectados uma dose via intraperitonial, de cerca de 2,5 a 6,0 xlO⁸ bactérias, de acordo com a DL-50 de cada cepa. Os animais foram observados por 10 dias, sendo os sobreviventes submetidos à eutanásia.

uma dose anti-PBP2a

10. Estudo comparativo de proteção in vivo do anticorpo monoclonal anti-PBP2a e vancomicina - quantificação renal:

Ensaio 1

Quatro grupos de camundongos Balb/C, fêmeas de 8 semanas (4 animais por grupo) receberam uma dose infectante de 6,0xl0⁷ bactérias (CEB-MRSA) pela via intraperitonial. Os animais receberam doses de anticorpo monoclonal purificado (MAB), vancomicina, MAB + vancomicina e controle negativo, de acordo com os grupos abaixo:

grupo 1 : MAB 400 microgramas (primeiro dia) grupo 2 : vancomicina (150 microgramas via intramuscular de

12/12 horas) grupo 3 : vancomicina + MAB (350 microgramas) (1 dia após infecção) grupo 4 : controle

As primeiras doses de anticorpo e vancomicina foram administradas 4 horas após a administração da dose infectante. Os animais foram submetidos à eutanásia no quarto dia, os rins foram retirados assepticamente e submetidos à quantificação renal, conforme descrito anteriormente.

Ensaio II

Este ensaio foi realizado da mesma forma que o anterior, porém com uma dose infectante menor (7,0xl0⁶ bactérias), sendo que o grupo 1 foi tratado com 500 microgramas de anticorpo monoclonal purificado; o grupo 2 com vancomicina (150 microgramas via intramuscular de 12/12 horas; 5 doses); o grupo 3 com vancomicina + 500 microgramas de anticorpo monoclonal e o grupo 4 controle (animais não tratados).

11. Identificação das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal anti-PBP2a

11.1. Extração do mRNA a partir de células de hibridoma

Um centrifugado (pellet) de 10 mL de uma cultura de células do hibridoma produtor dos anticorpos monocíonais foi processado para extração do mRNA empregando o kit RNeasy

Minikit (Qiagen).

11.2. Obtenção do cDNA:

Reação de transcriptase reversa: Foi empregado o kit MMLV reverse transcriptase (Invitrogen) para a obtenção do DNA complementar, seguindo as instruções do fabricante.

11.3. Amplificação das cadeias VH e VL por reação em cadeia da polimerase (PCR)

As reações foram feitas empregando seqüências iniciadoras (Primers) abaixo.

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11.4. Seqüenciamento das cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal anti-PBP2a:

Etapas do Seqüenciamento:

I. Amplificação

Foi realizada empregando as sequências iniciadoras anteriores, definidas pelas SEQ ID NO:18 até SEQ ID NO:39.

II. Seqüenciamento:

Foi usado o aparelho ABI Prism 3100, Genetic Analyser (Hitachi).

11.5. Análise das seqüências e identificação dos CDR de cadeias leve e pesada

As seqüências de DNA obtidas foram analisadas com o auxílio do programa DNA Star, e foram traduzidas para seqüências de aminoácidos (Site ExPASy - programa Translate) para posterior análise pelos algoritmos de Kabat (24) e Chotia (25) para a identificação dos CDRs das cadeias leve e pesada.

12. Determinação das constantes de associação e dissociação dos anticorpos monoclonais (clones 10 e 38 pelo método surface plasmon resonance - SPR (Biacore).

As medições em SPR foram realizadas empregando um sensor CM-5 em um aparelho Biacore X® (BIAcore AB, Uppsala, Sweden). Os reagentes de ligação e tampões HBS-EP (lOmM hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% P20 (Tween 0, pH 7.4) foram adquiridos com a empresa GE Healthcare.

Exemplo 2

1. Obtenção dos anticorpos monoclonais murinos anti-PBP2a:

Um grupo de animais foi submetido ao protocolo de imunização conforme descrito anteriormente. O resultado avaliado por teste de ELISA encontra-se descrito na Figura

1.

Após o processo de fusão (fusão de número 90-LATAM), foi analisado por teste de ELISA o sobrenadante de 96 cavidades (hibridomas). Deste total, os cinco melhores foram selecionados, as células foram expandidas (clonagem). E novamente, os sobrenadantes resultantes analisados por ELISA. As amostras positivas foram validadas por immunoblotting contra a proteína recombinante purificada (PBP2a) , para fins de validação dos resultados obtidos por

ELISA. O resultado final encontra-se na Tabela I.

A Figura 1 revela o resultado do teste imunoenzimático (ELISA) de soros de animais imunizados para a produção de anticorpos anti-PBP2a. Cada tracejado corresponde ao soro diluído 1:100 dos animais imunizados. Em tracejado angular [ rU-L] Soro controle positivo. Primeira barra de cada tracejado: soro pré-imune; segunda barra: soro após quarta

imunização	e terceira	barra: sorc	i após a quinta	imunização.
Tabela I. 1	Clonagens da	fusão 90:	Balanço final
Hibridomas clonados	Número -total de clones	Clones positivos (ELISA)	Clones positivos (Iblotting)	Clones selecionados
77	70	2	1 (clone 38)	1
68	108	10	1 (clone 10)	1
79	91	Zero	-	-
17	101	Zero	-	-
70	48	2	zero	-

418 14 2 2

Dos clones selecionados, o clone 77-38 foi submetido ao processo de reclonagem, para verificação da estabilidade das células de secretarem os anticorpos monoclonais. Das 50 cavidades analisadas, todas apresentaram resultado positivo pelo teste de ELISA. Estes clones foram expandidos e estão estocados em nitrogênio líquido nas instalações do LATAM (Laboratório de tecnologia de anticorpos monoclonais).

2. Crescimento, produção e purificação dos anticorpos monoclonais:

O processo foi padronizado conforme descrito anteriormente. O rendimento obtido é de aproximadamente 4 miligramas de anticorpo monoclonal para cada 100 ml de sobrenadante submetido ao processo de purificação. Os resultados obtidos podem ser vistos abaixo.

Na Figura 2 podemos observar um gel· de poliacrilamida com as amostras brutas e após purificação. Essa Figura 2 mostra o gel de poliacrilamida não desnaturante com amostras de sobrenadante antes (coluna 1) e após purificação (2) em coluna de HPLC com a resina MAb SelectSure. As colunas 3 a 9 correspondem a frações obtidas da amostra purificada. A seta indica o tamanho aproximado de 150 kDa.

3. Caracterização funcional dos anticorpos monoclonais:

3.1: Reconhecimento da PBP2a in vitro - Immunoblotting

A fim de investigar a capacidade de reconhecimento do anticorpo pelo alvo no patógeno (PBP2a e seqüências afins), foi realizado o teste de immunoblotting com bactérias que apresentam a PBP2a (MRSA CEB e COL) , uma cepa de MSSA Staphylococcus aureus sensível a meticilina (não possui a PBP2a), uma cepa de Enterococcus sp. resistente à vancomicina, que possui a PBP5, uma transpeptidase de baixa afinidade por antibióticos beta-lactâmicos, homóloga à PBP2a e uma cepa de Escherichia coli, onde foi gerada a proteína recombinante, como controle negativo. Os resultados obtidos mostram que o anticorpo foi capaz de reconhecer uma proteína com peso molecular de aproximadamente 7 6 kDa nas cepas de MRSA e Enterococcus sp. , que corresponde ao tamanho da PBP2a e PBP5, respectivamente. Não foi observada reatividade do anticorpo monoclonal com proteínas de Staphylococcus aureus sensível a meticilina (PBP2a negativos) nem com a cepa de Escherichia coli. Os resultados podem ser vistos na Figura 3 (immunoblotting contra MRSA e MSSA).

Na Figura 3 é mostrado o resultado do teste de immunoblotting de lisados de MRSA e MSSA contra o sobrenadante contendo os anticorpos monocionais anti-PBP2a.

1. - marcador de peso molecular (Kaleidoscope);

2. - amostra MSSA crescida em fase exponencial;

e 4. - amostras de MRSA crescida em fase exponencial;

5. - amostra MSSA crescida em fase estacionária (overnight);

e, e 7. - amostras de MRSA crescidas em fase estacionária. A seta a esquerda indica o peso molecular da PBP2a.

3.2: Reconhecimento da PBP2a na superfície da bactéria Citometria de fluxo

O objetivo do teste de citometria de fluxo é o de validar a capacidade de reconhecimento do alvo na bactéria em sua forma nativa, pelo anticorpo monoclonal. Nos testes anteriores (immunobloting) , observamos o reconhecimento do alvo nas proteínas submetidas a um processo de desnaturação, que ocorre durante a separação protéica por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. Novamente, analisamos uma cepa controle negativo (MSSA, PBP2a negativa) e uma cepa MRSA (CEB), crescidas em fase exponencial e estacionária. Os resultados obtidos mostram que o anticorpo é capaz de reconhecer o alvo na superfície bacteriana em ambas as condições. A presença de proteína A na superfície de

Staphylococci não foi capaz de inibir a ligação do anticorpo com a PBP2a. Os resultados obtidos podem ser vistos na

Figura 4.

A Figura 4 mostra os resultados da citometria de fluxo das bactérias MRSA (CEB) e MSSA, incubadas com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e marcadas com ficoeritrina (PE). Em (1), bactérias MSSA; em (2), MRSA crescida em fase estacionária, em (3), MRSA crescida em fase exponencial. As populações de MRSA apresentam um deslocamento para a direita, correspondendo a um aumento de células marcadas pelo conjugado fluorescente.

4. Avaliação da proteção conferida pelo anticorpo monoclonal anti-PBP2a:

4.1. Testes de proteção in vitroz

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) .

Estes ensaios têm por finalidade avaliar a capacidade do anticorpo ligar-se diretamente ao alvo em um sistema fechado. No caso de anticorpos monoclonais com finalidade terapêutica, resultados positivos são de extrema importância, pois significam que o anticorpo é capaz de reconhecer o alvo e bloquear o crescimento bacteriano sem o auxílio do sistema imune do hospedeiro, como os mecanismos

A de ativação de complemento e opsonização, resultantes da ação conjunta sistema imune inato e adaptativo do hospedeiro. Foram avaliadas as cepas MRSA CEB, COL e Iberian, onde se observaram valores semelhantes de CIM (aproximadamente 500 microgramas) nas condições avaliadas. Estes dados indicam que independente do background genético de diferentes cepas de MRSA, as doses de anticorpo necessárias para bloquear o crescimento são as mesmas. Estes resultados podem ser vistos na Figura 5.

A Figura 5 mostra o teste de proteção in vitro (CIM concentração inibitória mínima) conferida pelo anticorpo monoclonal purificado anti-PBP2a e vancomicina frente a um inóculo de 10⁵ células de diferentes cepas de MRSA. A ausência de turvação indica que não houve crescimento bacteriano nas condições analisadas.

IA: MRSA CEB (clone epidêmico brasileiro) + 250 μg de anticorpo;

2A:	MRSA CEB + 500	pg de anticorpo;
3A:	MRSA CEB + 750	μρ de anticorpo;
4À	e 6A: controles	negativos da cepa MRSA CEB.
1B:	MRSA COL + 250	μρ de anticorpo;
2B:	MRSA COL + 500	μg de anticorpo;
3B:	MRSA COL + 750	μg de anticorpo;
4B	e 6B: controles	negativos da cepa MRSA COL.

1C: Iberian MRSA (clone epidêmico europeu anticorpo;

CEE) + 250 gg de

2C:	MRSA	CEE	+	500
3C:	MRSA	CEE	+	750
4C	e 6C:	controles

gg de anticorpo;

ng;

negativos da cepa MRSA CEE.

ID:	MRSA	CEB	+	150	μς	vancomicina,
2D:	MRSA	CEB	+	300	μς	vancomicina,
3D:	MRSA	CEB	+	•500	μς	de vancomicina,
4D:	MRSA	CEB	+	750	μς	de vancomicina;
5D	e 6D:	controles	negativos .

4.2. Testes de proteção ia vivo:

4.2.1. Determinação das doses letais e subletais para as cepas MRSA CEB, Iberian, CA-WB79 e COL:

Estes ensaios foram necessários para que fosse avaliada a proteção in vivo nos dois modelos empregados - o de quantificação renal por dose subletal e o teste de sobrevivência após infecção sistêmica com um inóculo maior de bactérias - capaz de levar a morte cerca de 50% dos animais (DL-50). A via escolhida foi a intraperitonial, devido à facilidade de administração e ausência de perdas. Para condução do ensaio foi efetuada uma adaptação do método de Reed-Muench, com dois animais por condição (dose bacteriana infectante em concentrações crescentes), para a determinação das DL-50 e de doses subletais e foram testadas três doses diferentes, uma vez que possuíamos conhecimento prévio das doses letais médias para Staphylococcus aureus. A cepa MRSA COL, primeiro clone de MRSA a ter seu genoma seqüenciado, é utilizada como cepa de referência para estudos sobre este patógeno. Entretanto, a mesma mostrou-se pouco virulenta, necessitando de doses infectantes elevadas em relação aos demais clones de MRSA para causar infecção nos animais. Em virtude disso a mesma não foi utilizada nos ensaios de proteção.

4.2.2. Ensaios de proteção renal após infecção sistêmica com dose subletal

Estes ensaios, empregando um modelo de quantificação renal após infecção, permitem avaliar a capacidade do anticorpo em reduzir a presença de bactérias em órgãos vitais (rins) após uma infecção sistêmica. Em três ensaios independentes, com cepas MRSA virulentas e de diferentes backgrounds genéticos, foi alcançada uma redução superior a 3 logs (1000 vezes). Nestes ensaios, os animais receberam uma dose prévia de 500 microgramas de anticorpo. No ensaio com a cepa CA-MRSA, foi avaliada a proteção conferida por uma dose inferior (250 microgramas) de anticorpo, onde também foi observada redução bacteriana, porém inferior à obtida com a dose de 500 microgramas. Os resultados podem ser vistos nas Figuras 6A, 6B e 6C.

A Figura 6A mostra os resultados de quantificação renal em animais tratados e não tratados com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com dose subletal da cepa CEB MRSA. Em listrado horizontal: log da concentração de bactérias isoladas dos rins de cada animal não tratado. Em quadriculado: log da quantidade de bactérias isoladas dos rins de cada animal tratado com o anticorpo. Quantificação bacteriana: controles: Cl: 2000 bactérias; C2: 29.000 bactérias; C3: 220.000 bactérias; C4: 52.000 bactérias (média de 75.750 bactérias). Animais tratados (protegidos): Pl: 20 bactérias; P2, P3 e P4: 10 bactérias (média de 12,5 bactérias). Redução da quantidade de bactérias recuperadas de animais tratados em relação aos não tratados: 6060 vezes.

A Figura 6B mostra os resultados de quantificação renal em animais tratados e não tratados com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com dose subletal da cepa Iberian MRSA (clone epidêmico europeu). Em listrado horizontal: log da concentração de bactérias isoladas dos rins de cada animal não tratado. Em quadriculado grande: log da quantidade de bactérias isoladas dos rins de cada animal tratado com o anticorpo. As barras em quadriculado pequeno indicam as respectivas médias obtidas. Quantificação bacteriana: controles: Cl: 210.000 bactérias; C2: 44.000 bactérias; C3: 300.000 bactérias; C4:

290.000 bactérias (média de 211.000 bactérias). Animais tratados (protegidos): Pl: 80 bactérias; P2: 200 bactérias,

P3: 10 bactérias e P4: 60 bactérias (média de 87,5 bactérias). Redução da quantidade de bactérias recuperadas de animais tratados em relação aos não tratados: 2420 vezes.

A Figura 6C mostra os resultados de quantificação renal em animais tratados e não tratados com o anticorpo monoclonal anti-PBP2a e submetidos à infecção sistêmica com dose subletal da cepa CA-MRSA WB79 (cepa comunitária brasileira). As cinco primeiras barras (em xx, tracejado hrizontal e quadriculado grande): log da concentração de bactérias isoladas dos rins de cada animal não tratado. A primeira barra (em xx): estimativa em relação a um animal morto antes da eutanásia. As barras 6, 7, 8 e 9 (em tracejado horizontal e quadriculado): log da quantidade de bactérias isoladas dos rins de animais tratados com 250 gg de anticorpo monoclonal anti-PBP2a. As barras 10, 11, 12 e (em triângulo): log da quantidade de bactérias isoladas dos rins de cada animal tratado com 500 pg do anticorpo. As barras quadriculadas (5^a, 9^a e 13^a barras) indicam as respectivas médias obtidas. Quantificação bacteriana: controles: Cl: 650.000 bactérias; C2: 26.000 bactérias; C3:

17.000 bactérias; C4: 500.000 bactérias (estimativa do animal morto) (média de 231.000 bactérias). Animais tratados com 250 qg de anticorpo: Pl: zero; P2: 5.400 bactérias, P3: 830 bactérias e P4: 10 bactérias (média de 1.560 bactérias). Animais tratados com 500 gg de anticorpo: Pl: 80; P2: zero; P3: 210; P4: 80 bactérias (média 92,5) Redução da quantidade de bactérias recuperadas de animais tratados em relação aos não tratados com 250 μ9 de anticorpo: 149 vezes. Com 500 μ9:

2.497 vezes.

4.2.3. Ensaios de sobrevivência

Neste tipo de ensaio, avaliamos a proteção conferida pelo anticorpo aos animais após uma infecção com uma carga bacteriana capaz de matar 50% dos animais (DL-50) ou mais. Foi avaliada a proteção contra as três cepas empregadas no ensaio de quantificação renal. Nos três ensaios independentes foi observada uma redução significativa no (i) tempo de sobrevida e (ii) na própria sobrevida dos animais sob tratamento com os anticorpos monoclonais anti-MRSA.

No ensaio com a cepa MRSA-CEB, 70% dos animais sob tratamento sobreviveram à infecção, contra apenas 10% do grupo controle (não-tratados) . No ensaio com a cepa MRSAIberian, os resultados obtidos foram semelhantes, com 60% de proteção em animais sob tratamento e 100% de morte no grupo controle. No ensaio com a cepa CA-MRSA foi observado uma proteção de 100% contra 70% nos animais controle. Estes resultados podem ser vistos nas Figuras 7a, 7b e 7c.

A Figura 7A mostra a curva de sobrevivência de animais tratados (protegidos) e não tratados (controle) após infecção por dose de 2,3xl0⁸ bactérias (CEB MRSA) administradas pela via intraperitonial (DL-50).

A Figura 7B mostra a curva de sobrevivência de animais tratados (protegidos) e não tratados (controle) após infecção por dose de 4,2xl0⁸ bactérias (Iberian MRSA) administradas pela via intraperitonial (~DL-50).

A Figura 7C mostra a curva de sobrevivência de animais tratados (protegidos) e não tratados (controle) após infecção por dose de Ι,ΙχΙΟ⁹ bactérias (CA-MRSA WB79) administradas pela via intraperitonial (~DL-50).

4.2.4. Estudo comparativo entre a proteção conferida pelo anticorpo monoclonal versus vancomicina.

Em virtude de a vancomicina ser o antimicrobiano de primeira escolha para o tratamento de infecções graves por MRSA, foi realizado um estudo comparativo de proteção em um modelo diferente dos anteriores. Neste estudo, os animais foram infectados e somente após quatro horas de infecção, começou-se a administração do antimicrobiano ou dos anticorpos monoclonais. O estudo foi realizado com três grupos distintos, um tratado com vancomicina, outro com anticorpos monoclonais e um terceiro com a administração simultânea do antimicrobiano + anticorpos. As doses de vancomicina foram ajustadas e administradas de forma semelhante aos casos de infecções em humanos (500 mg de 12 em 12 horas).

Os resultados obtidos indicaram que houve uma redução em torno de 15 vezes da quantidade de bactérias presentes nos rins dos animais tratados com antimicrobiano ou anticorpos, três dias após a infecção. Entretanto, no grupo que recebeu tratamento com antimicrobiano e anticorpos foi observada uma redução de 4.617 vezes.

Com base nestes resultados, podemos concluir que a proteção conferida por uma dose de anticorpo correspondeu a cinco doses de vancomicina e que a administração simultânea de vancomicina e dos anticorpos foi muito eficaz na redução da carga bacteriana observada nos rins dos animais infectados. Este estudo foi repetido com uma dose infectante um pouco menor para podermos observar melhor a ação protetora dos anticorpos monoclonais anti-MRSA de forma isolada e em associação com a vancomicina. (Ver figuras 8).

Após a realização do segundo ensaio com uma dose infectante menor, os resultados obtidos confirmaram os resultados iniciais. A proteção conferida pelo tratamento com anticorpo monoclonal levou a uma redução de 89 vezes, que foi superior a proteção obtida pelo tratamento com 5 doses de vancomicina (redução de 35 vezes). Entretanto, o resultado mais significativo de redução foi vista no grupo tratado com anticorpo+ vancomicina, levando a uma redução de 450 vezes.

A Figura 8A mostra a quantificação bacteriana em rins de animais tratados com anticorpo monoclonal anti-PBP2a, vancomicina, associação de anticorpo+vancomicina e animais não tratados, após infecção com 6,0xl0⁷ bactérias (CEBMRSA). O início do tratamento ocorreu 4 horas após infecção.

Vancomicina administrada de 12/12 horas (5 doses). As barras 1, 2, 3, 4 e 5 (tracejado): log da concentração de bactérias recuperadas dos animais não tratados (controles). Cl: 7.000.000; C2: 295.000; C3: 380.000; C4: 3.200.000 (média: 2.718.750 bactérias). As barras 6, 7, 8, 9 e 10 (quadriculado): log da concentração de bactérias recuperadas de animais tratados com 400 gg de anticorpo monoclonal antiPBP2a. Pl: 4.200; P2: 310.000; P3: 330.000; P4: 90.000 (média 183.550 bactérias). As barras 11, 12, 13, 14 e 15 (bolas): animais tratados com vancomicina. Pl: 110.000, P2: 58.000, P3: 500.000, P4: 21.000 (média 172.250 bactérias). As barras 16, 17, 18, 19 e 20 (triângulo) : log da concentração de bactérias recuperadas de animais tratados com anticorpo (300 μς) + vancomicina. Pl: 1.100, P2: 700, P3: 450, P4: 90 (média 585 bactérias).

A Figura 8B mostra a quantificação bacteriana em rins de animais tratados com anticorpo monoclonal anti-PBP2a (barras 7 a 12), vancomicina (barras 13 a 18), associação de anticorpo+vancomicina (19 a 24) ) e animais não tratados (barras 1 a 6) , após infecção com 7,0xl0⁶ bactérias (CEBMRSA). Início do tratamento 4 horas após infecção. Vancomicina administrada de 12/12 horas (5 doses). As barras 1 a 6: log da concentração de bactérias recuperadas dos animais não tratados (controles). Cl: 6.000; C2: 1.000; C3: 500; C4: 118.000 e C5: 1.000 (média: 25.220 bactérias) . As barras 7 a 12: log da concentração de bactérias recuperadas de animais tratados com 500 gg de anticorpo monoclonal antiPBP2a. MB1: 450; MB2: 200; MB3: 100; MB4: 20; MB5: zero (média 284 bactérias). As barras 13 a 18: animais tratados com vancomicina. VC1: 100, VC2: 700, VC3: zero, VC4: zero;

VC5: 2800 (média 720 bactérias). As barras 19 a 24: log da concentração de bactérias recuperadas de animais tratados com anticorpo (500 gg) + vancomicina. MBV1: 130, MBV2: 20,

MBV3: 10, MBV4: 80; MBV5: 20 (média 56 bactérias).

5. Ensaios de avidez.

Resultados dos testes de avidez dos anticorpos monoclonais clones 10 e 38:

Avidez protocolo uréia:

clone 10: 1,03/1,46 (leitura DOs com tratamento/sem tratamento) = 70,5% clone 38: 1,00/1,21= 82,6%

Avidez protocolo tiocianato de amônio:

Clone 10: (DOs):

Controle: 1,12

Amostras tratadas tiocianato:

2M=0,046; l,5M=0,047; 1M=O,1O7; 0,75M=0,483; 0,5M=0,602;

0,375M=0,684 índice de avidez: 2,47

Clone 38 (DOs):

Controle: 1,22

Amostras tratadas com tiocianato:

2M=0,056; l,5M=0,062; 1M=O,129; 0,75M=0,648; 0,5M=0,758;

0,375M=0,793 índice de avidez: 4,40

Observa-se que em ambos os ensaios os índices de avidez do clone 38 foram superiores aos do clone 10. Além disso, verifica-se que para atingir uma DO próxima a 1,0, segundo os dois protocolos, foi necessário empregar 50 vezes mais anticorpo do clone 10 do que do clone 38.

6. Determinação das constantes de associação e dissociação dos anticorpos monocíonais (clones 10 e 38 pelo método Surface Plasmon Resonance - SPR (BIAcore).

Os resultados obtidos pelo método SPR confirmaram os resultados preliminares de avidez dos anticorpos, onde o clone 38 mostrou novamente resultados superiores aos do clone 10. De acordo com os dados vistos na Tabela II, observamos que o clone 38 apresenta uma afinidade 450 vezes maior que a do clone 10.

Esta afinidade deve-se principalmente a sua maior taxa de associação, que é cerca de 100 vezes maior que a do clone

10. Devido à altíssima afinidade do clone 38, suas medidas apresentam parâmetros próximos ao limiar de detecção do equipamento. Contudo, devido ao cuidado no planejamento e execução dos experimentos, obtivemos um ajuste excelente para os dados experimentais utilizando o modelo de Langmuir, o que indica que os dados obtidos são confiáveis.

A Figura 9 mostra a interação entre a PBP2a recombinante (antígeno) com os anticorpos monocíonais clones 38 (Figura 9A) e clone 10 (Figura 9B). As curvas de tracejado esfumaçado representam os dados de SPR nas concentrações de acordo com a legenda à direita. Todas as amostras foram analisadas em duplicata e o modelo teórico de Langmuir 1:1 para cada curva está mostrado em preto sob cada curva. No eixo vertical estão representadas as unidades de resposta e na linha horizontal o tempo em segundos. As linhas mais próximas ao eixo horizontal representam a linha de base de cada amostra (controle negativo).

Tabela II

Constantes de dissociação e de interação entre o antígeno (PBP2a) e os anticorpos monoclonais clones 10 e 38.

	ka (M-1s-1)	ka (s’1)	KD (nM)
Clone 10	4.42xl03 ± 5,7	1.16xl04 ± 5.63xl0'7	26.2
Clone 38	5.45xl05 ± 384	3.13xl0-5 ± 2.11xl0_1°	5.7xl0-2

7. Identificação das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das cadeias leve e pesada do anticorpo monoclonal anti-PBP2a

Após o processo de extração do mRNA de células do hibridoma do clone produtor dos anticorpos utilizados (clone 38), procedeu-se à obtenção do cDNA e com este material foram realizadas as reações de PCR para os diferentes alelos de cadeias leve e pesada. Os materiais obtidos foram submetidos a seqüenciamento empregando as mesmas seqüências iniciadoras (definidas pelas SEQ ID NO:18 até SEQ ID NO:39) utilizadas nas reações de PCR. Foram identificados em três seqüenciamentos distintos, a cadeia leve 391 e a cadeia pesada 310. Aplicando os algoritmos de Kabat e Chotia, chegamos à identificação dos CDRs das cadeias leve e pesada, que são objeto das reivindicações em anexo.

A seguir apresentamos as seqüências dos CDRs das cadeias leve e pesada.

SEQ ID NO:6 - aminoácidos da cadeia leve do CDR 1.

RSSQSIGHSNGNTYLE

SEQ ID NO:7 - aminoácidos da cadeia leve do CDR 2.

KVSNRFS

SEQ ID NO:8 - aminoácidos da cadeia leve do CDR 3

FQGSYVPLT

SEQ ID NO:9 - DNA da cadeia leve do CDR 1.

cgcagcagccagagcattggccatagcaacggcaacacctatctggaa

SEQ ID NO:10 - DNA da cadeia leve do CDR 2.

aaagtgagcaaccgctttagc

SEQ ID NO:11 - DNA da cadeia leve do CDR 3.

tttcagggcagctatgtgccgctgacc

SEQ ID NO:12 - aminoácidos da cadeia pesada do CDR 1.

GFSITSSSSCWH

SEQ ID NO:13 - aminoácidos da cadeia pesada do CDR 2.

RICYEGSISYSPSLKS

SEQ ID NO:14 - aminoácidos da cadeia pesada do CDR 3.

ENHDWFFDV

SEQ ID NO:15 - DNA da cadeia pesada do CDR 1.

ggctttagcattaccagcagcagcagctgctggcat

SEQ ID NO:16 - DNA da cadeia pesada do CDR 2.

cgcatttgctatgaaggcagcattagctatagcccgagcctgaaaagc

SEQ ID NO:17 - DNA da cadeia pesada do CDR 3.

gaaaaccatgattggttttttgatgtg

Portanto, a presente invenção aqui descrita anticorpos monoclonais anti-PBP2a, capazes de se ligar especificamente a PBP2a e seqüências homólogas, tem aplicabilidade em infecções causadas por bactérias que apresentem esta proteína ou similares (MRSA, MRSE e Enterococcus spp. e qualquer outro patógeno que venha a possuir uma proteína homóloga à PBP2a).

É importante enfatizar que uma vez que estas infecções são um problema de abrangência mundial e os ensaios foram realizados contra os principais clones epidêmicos de MRSA conhecidos, o produto da presente invenção possui aplicabilidade em qualquer lugar em que exista infecções por este patógeno.

A seguir são relacionados os documentos pertencentes ao estado da arte de conhecimento dos inventores e citados no presente relatório descritivo.

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Claims (6)

1. reivindicações

   1. Anticorpo monoclonal isolado que se liga à proteína PBP2a de bactérias resistentes à meticilina (MRSA) caracterizado pelo fato de que compreende na região de cadeia variável leve uma região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 6, uma região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 7 e uma região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 8, na região de cadeia variável pesada uma região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 12, uma região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 13 e uma região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 14.
2. 2. Anticorpo monoclonal isolado de acordo com a reivindicação 1, caraterizado pelo fato de que na região de cadeia variável leve a região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 6 é codificada pela SEQ ID NO: 9 ou suas sequências degeneradas, a região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 7 é codificada pela SEQ ID NO: 10 ou suas sequências degeneradas, a região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 8 é codificada pela SEQ ID NO: 11 ou suas sequências degeneradas; na região de cadeia variável pesada a CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 12 é codificada pela SEQ ID NO: 15 ou suas sequências degeneradas, a região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 13 é codificada pela SEQ ID NO: 16 ou suas sequências degeneradas, a região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID de 27/12/2018, pág. 11/16

   NO: 14 é codificada pela SEQ ID NO: 17 ou suas sequências degeneradas.
3. 3. Anticorpo monoclonal isolado que se liga à proteína PBP5 de Enterococcus spp. caracterizado pelo fato de que compreende uma região de cadeia variável compreendendo na região de cadeia variável leve uma região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 6, uma região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 7 e uma região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 8, na região de cadeia variável pesada uma região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 12, uma região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 13 e uma região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 14.
4. 4. Anticorpo monoclonal isolado de acordo com a reivindicação 3, caraterizado pelo fato de que compreende na região de cadeia variável leve a região CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 6 é codificada pela SEQ ID NO: 9 ou suas sequências degeneradas, a região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 7 é codificada pela SEQ ID NO: 10 ou suas sequências degeneradas, a região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID NO: 8 é codificada pela SEQ ID NO: 11 ou suas sequências degeneradas; na região de cadeia variável pesada a CDR1 consistindo da sequência SEQ ID NO: 12 é codificada pela SEQ ID NO: 15 ou suas sequências degeneradas, a região CDR2 consistindo da sequência SEQ ID NO: 13 é codificada pela SEQ ID NO: 16 ou suas sequências degeneradas, a região CDR3 consistindo da sequência SEQ ID de 27/12/2018, pág. 12/16

   NO: 14 é codificada pela SEQ ID NO: 17 ou suas sequências degeneradas.
5. 5. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de uma infecção por bactérias possuidoras da PBP2a

   5 ou proteínas homólogas a esta, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade do anticorpo monoclonal isolado conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4 e um veículo farmacêutico, carreador ou excipiente.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a 10 reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a bactéria é do filo Firmicutes.