BRPI0915605B1 - Vacina de leishmania usando imunógeno salivar de mosca tipo borrachudo - Google Patents

Abstract

vacina de leishmania usando imunógeno salivar de mosca tipo borrachudo. a presente invenção fornece vetores que contêm e expressam in vivo ou in vitro antígenos salivares de lu. longipalpis de borrachudo que eliciam uma resposta imune em um animais ou ser humano contra a leishmania, composições de vacina compreendendo os referidos vetores e/ou polipeptídeos salivares de lu. longipalpis, métodos de vacinação contra leishmania e kits para uso com tais métodos e composições.

Description

Incorporação por Referência

Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório americano No. de Série 61/051.635, depositado no dia 8 de maio de 2008, e do pedido provisório americano No. de Série 61/101.345, depositado no dia 30 de setembro de 2008, que fazem referência ao Pedido Internacional No. PCT/US2003/034453, intitulado Lutzomyia Longipalpis Polypeptides and Methods of Use, depositado no dia 29 de outubro de 2003, o qual reivindica prioridade ao pedido provisório No. 60/422.303, depositado no dia 29 de outubro de 2002.

Todos os documentos citados ou mencionados neste documento ("documentos aqui citados"), e todos os documentos citados ou referenciados em documentos aqui citados, juntamente com quaisquer instruções, descrições, especificações de produto e encartes de produtos do fabricante para qualquer dos produtos mencionados aqui ou em qualquer documento incorporado aqui por referência, são por meio deste documento aqui incorporados por referência, podendo ser empregados na prática da invenção.

Campo da Invenção

A presente invenção se refere às formulações para combater infecções por Leishmania em animais ou seres humanos. Especificamente, a presente invenção fornece vetores que contêm e expressam in vivo ou in vitro os antigenos salivares do mosquito Lu. longipalpis, que provocam uma resposta imune em animais ou seres humanos contra a Leishmania, incluindo composições compreendendo os referidos vetores, métodos de vacinação contra a Leishmania, e kits para uso com tais métodos e composições. Antecedentes Da Invenção

A leishmaniose é uma das principais doenças parasitárias e graves que afetam seres humanos, caninos (cães, lobos, raposas, coiotes, chacais) e, em menor grau, felinos (leões, tigres, gatos domésticos, gatos selvagens, outros grandes gatos e outros felinos incluindo chitas e linces).

Subgêneros da Leishmania e Viannia são agrupados em complexos de espécies e subespécies com base em similaridades moleculares, bioquímicas e imunológicas. Existem várias formas da doença nomeadas pelas suas apresentações clinicas incluindo a leishmaniose cutânea, mucocutânea ou visceral. Cada uma destas formas de doença é causada por diferentes espécies de borrachudos encontradas em diferentes regiões do mundo. A leishmaniose cutânea dos

O agente da leishmaniose visceral é um parasita protozoário e pertence ao complexo Leishmania donovani. Este parasita está amplamente distribuída nos paises de clima temperado e subtropical do sul da Europa, África, Ásia, América do Sul e América Central (Desjeux P. et al.). Leishmania donovani infantum (L. infantum) é responsável pela doença na população canina e felina no Sul da Europa, África e Ásia. Na América do Sul e América Central, o agente é a Leishmania donovani chagasi (L. chagasi), que está intimamente relacionado com L. infantum. Em seres humanos, o agente é a Leishmania donovani donovani (L. donovani), que também está relacionado com L. infantum e L. chagasi.

Os borrachudos do gênero Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo) são os vetores primários responsáveis pela transmissão da doença. Atualmente estes são os únicos vetores conhecidos capazes de se espalhar; pulgas, carrapatos e outros artrópodes não se mostraram com o sendo vetores competentes. No entanto, raros casos de leishmaniose foram contraídos através da troca de sangue ou fluidos corporais, contato direto e pelo menos um caso de transmissão congênita. A importância dos borrachudos naturais é ainda indeterminada, mas pode estar relacionada à dose infecciosa do organismo. Ainda assim, nos últimos anos, e na ausência de vetores conhecidos, houve uma incidência enorme de leishmaniose em canis de cães de caça à raposa (Foxhound) nos Estados Unidos. Ainda não se sabe como a transmissão da doença ocorreu ou como esta doença é mantida nesses cães, porque borrachudos infectados não foram reportados nos Estados Unidos. No entanto, certas espécies de Lutzomyia (L. shannon!), encontradas ao longo do leste dos Estados Unidos e ao norte até Nova Jersey, são consideradas um vetor potencialmente competente para L. mexicana. Phlebotomus arias! (P. ariasi) e Phlebotomus perniciosus (P. perniciosus) , Phlebotomus neglectus (P. neglectus) são os vetores mais comuns no sul da Europa, África e Ásia, enquanto que Lutzomyia longipalpis (Lu. longipalpis) é o vetor mais comum na América do Sul e Central.

A leishmaniose é uma doença lentamente progressiva que pode levar até 7 anos para se tornar clinicamente aparente (McConkey SE et al;. Slappendel RJ et al.). Mesmo assim, os sinais são frequentemente inespecificos e o diagnóstico de Leishmania raramente é considerado. Os cães são mais comumente infectados com L. infantum (complexo L. donovani), que é responsável pela doença viscerotrópica nas pessoas. No entanto, até 90% de cães infectados apresentam lesões tanto cutânea quanto viscerais (Slappendel RJ et al.). Por outro lado, muitos cães parecem ser naturalmente resistentes a esse parasita e podem permanecer assintomáticos apesar da infecção conhecida (Grosjean NL et al.). Estima-se que apenas 10% dos cães que residem em áreas endêmicas de fato desenvolvem a doença clinica (Lindsay DS et al.). Esta menor incidência de doença clinica é atribuída a uma predisposição genética de certos cães a suscitar uma resposta imune mediada por células mais protetora do que a resposta humoral (Lindsay DS et al. McConkey SE et al. Slappendel RJ, et al.). Além disso, foi relatado que até 20% dos cães infectados podem suscitar uma resposta imune adequada e a recuperação espontânea de doenças clinicas (McConkey SE et al.). Nos animais que suscitam uma resposta humoral, IgGl parece correlacionar com a doença clinica, enquanto que cães assintomáticos têm maiores niveis de anticorpos IgG2 (Lindsay et al.) .

Alguns dos sinais clinicos mais frequentemente relatados da leishmaniose incluem desatenção, fadiga e intolerância ao exercido, juntamente com anorexia e perda de peso que, eventualmente, culmina como uma doença debilitante (McConkey SE et al.). Estes sinais podem ou não ser acompanhados de febre, linfadenopatia local ou generalizada (90%) e/ou hepatoesplenomegalia (Grosjean NL et al., Lindsay DS et al., McConkey SE et al., Martinez- Subiela S et al.). O envolvimento articular é também bastante comum e pode se apresentar como claudicação, com articulações inchadas ou simplesmente como uma postura rigida. Descobertas menos comuns incluem lesões oculares (<5%), diarréia crônica (30%) e unhas quebradiças deformadas e longas (20%) referidas como onicogrifose (Lindsay DS et al. Slappendel RJ et al.). As lesões cutâneas estão presentes em até 89% de cães infectados, com ou sem outros sinais de envolvimento visceral. As lesões de leishmaniose cutânea podem ocorrer em qualquer parte do corpo, mas os locais mais comuns são aqueles que estão expostos ao ambiente e são, portanto, mais suscetíveis a picadas de borrachudos. A pápula inicial rapidamente dá origem a uma úlcera. Leishmaniose visceral é invariavelmente fatal se não for tratada imediatamente. Leishmaniose visceral afeta os órgãos internos do corpo, especialmente no baço e no fígado.

Os cães são considerados o principal reservatório da Leishmaniose. A doença é caracterizada por sinais de evolução crônica ou viscero-cutâneas que ocorrem em menos de 50% dos animais infectados (Lanotte G. et al.). Ambos os cães sintomáticos e assintomáticos com anticorpos detecLáveis pode ser infecciosos (Molina, R. et al; Courtenay 0. et al.). Os gatos também podem ser portadores dos parasitas protozoários e são, deste modo, considerados reservatórios secundários potenciais.

Devido a uma série de fatores, as opções de tratamento para a leishmaniose em cães e a resposta à terapia são limitadas, na melhor das hipóteses. Por alguma razão indefinida, a leishmaniose visceral é mais difícil de tratar em cães do que nos seres humanos. Nenhuma opção de tratamento é 100% eficaz para remover a infecção parasitária e a doença clínica comumente reaparece com a cessação da terapia (Lindsay DS et al.). Em áreas endêmicas, o regime de tratamento mais comum tem sido uma combinação de alopurinol com antimonial pentavalente como meglumina antimonita ou estibogliconato de sódio (Lindsay DS et al. Slappendel RJ et al.). No entanto, nos últimos anos, este protocolo tem caído em desuso devido à crescente resistência do parasita à droga, assim como a efeitos colaterais adversos associados com estes compostos (Lindsay DS et al.). Para limitar ainda mais as opções de tratamento, Pentostam® (estibogliconato de sódio) é o único antimonial disponível nos Estados Unidos e sua distribuição é regulada pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) em Atlanta, GA (Lindsay DS et al.).

Outros protocolos têm sido tentados, mas não se mostraram mais eficazes na eliminação da infecção parasitária ou na prevenção da recaída clínica. Além disso, cada protocolo está associado com efeitos adversos potenciais. Anfotericina B se liga aos esteróis e perturba a permeabilidade da membrana celular, mas é nefrotóxica (Lindsay DS et al.). Quando administrado por via parenteral, paramomicina age sinergicamente com antimoniais causando níveis mais elevados do antimonial por períodos mais longos de tempo, mas também é nefrotóxico e atualmente não é recomendado para uso clínico (Lindsay DS et al. ) . O isetionato de pentamidina é eficaz contra a leishmaniose, mas exige pelo menos 15 injeções intramusculares e é bastante doloroso (Lindsay DS et al.). Cetoconazol, miconazol, fluconazol e itraconazol são as drogas orais que podem ser úteis na contenção da doença, mas são caras e possuem o risco de resistência às drogas no tratamento de doentes sintomaticamente. Em resumo, os diferentes regimes de tratamento para a leishmaniose em cães foram investigados, mas não são 100% eficazes; reincidências são a regra, ao invés de exceção. Finalmente, o médico veterinário se depara com o dilema de tratar os surtos sintomáticos da leishmaniose em cães com risco de desenvolvimento cepas ao fármaco deste parasita nos Estados Unidos.

A detecção em massa de cães soropositivos seguido por abate e/ou tratamento com fármaco, ou a aplicação em massa de coleiras impregnadas com deltametrina mostrou ter um impacto na redução da prevalência de leishmaniose humana e canina em áreas endêmicas do sul da Europa, África e Ásia (Maroli M. et al Mazloumi Gavgani AS et al), embora a eficácia de eliminar caninos soropositivos tem sido discutida (Dietze R. et a.; Moreira Jr. ED et al) . Estas medidas de controle são considerados inaceitáveis, caras ou não eficazes (Gradoni L. et al.).

Os modelos matemáticos usados para comparar a eficácia de diversas ferramentas para o controle de leishmaniose sugerem que uma vacina canina pode ser o método mais prático e eficaz (Dye C.). Portanto, o desenvolvimento de vacinas capazes de proteger os caninos de leishmaniose e/ou evitar a progressão da doença em animais infectados é altamente desejável para a implementação de programas de controle da leishmaniose, bem como para a comunidade veterinária (Gradoni L. et al.).

Investigações anteriores procuraram identificar os métodos de diagnóstico e tratamento de Leishmania através, por exemplo, da administração de polipeptideos antigênicos (ver, por exemplo, WO 2004/039958, que é por meio deste documento incorporado por referência em sua totalidade). No entanto, até o momento, nenhuma vacina está disponivel para o tratamento da Leishmania. Os vetores e formulações de vacinas da presente invenção preenchem esta necessidade de longa data na técnica.

A citação ou identificação de qualquer documento neste pedido aplicação não é uma admissão de que tal documento está disponivel como técnica anterior à presente invenção. Sumário da Invenção

Um objeto da presente invenção pode ser qualquer um ou todos que fornecem virus ou vetores recombinantes, assim como métodos para fazer tais virus, e fornecer composições e/ou vacinas, bem como métodos para o tratamento e profilaxia de infecção por Leishmania.

A invenção fornece um vetor recombinante, tal como um virus recombinante, por exemplo, um poxvirus recombinante, que contém e expressa, pelo menos, uma molécula de ácido nucleico exógena e, pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena pode compreender uma molécula de ácido nucleico codificando um imunógeno ou epitopo de interesse das proteínas salivares de vetores borrachudos de Lu. longipalpis.

Em particular, a presente invenção fornece um vetor recombinante, tal como um virus recombinante, por exemplo, um poxvirus recombinante, que contém e expressa pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena, e pelo menos uma molécula de ácido nucleico exógena pode compreender polipeptideos Lu longipalpis salivares e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos.Estas vacinas podem evitar a difusão e/ou a replicação do parasita em um hospedeiro.

A invenção também fornece composições imunológicas (ou imunogênicas), ou vacinas compreendendo tal vetor de expressão ou o(s) produto(s) da expressão de tal/tais vetor(es) de expressão.

A invenção ainda fornece métodos para induzir uma resposta imunológica (ou imunogênica) ou de proteção contra a Leishmania, bem como métodos para evitar ou tratar a Leishmania, compreendendo a administração do vetor de expressão ou um produto de expressão do vetor de expressão, ou uma composição compreendendo o vetor de expressão, ou uma composição compreendendo um produto de expressão do vetor de expressão.

A invenção também se refere a produtos de expressão do virus, bem como anticorpos gerados a partir dos produtos de expressão ou a expressão sua in vivo e usos para tais produtos e anticorpos, por exemplo, em aplicações de diagnóstico.

Estas e outras modalidades são reveladas ou são óbvias a partir de e englobadas pela Descrição Detalhada a seguir. Breve Descrição dos Desenhos

A seguinte descrição detalhada, dada a titulo de exemplo, e que não se destina a limitar a invenção às modalidades especificas descritas, pode ser entendida juntamente com as figuras associadas, aqui incorporados por referência, em que:

A Figura 1 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cepa do plasmídeo pVR2001 LJM17 (SEQ ID NO: 9) , em que os dois sítios de restrição BamHI estão em negrito, a sequência que codifica o peptídeo de sinal TPA é sublinhada e a sequência que codifica LJM17 está em negrito maiúsculo.

A Figura 2 mostra a sequência de ácido nucleico de uma cepa do plasmideo pVR2001 LJL143 (SEQ ID NO: 10), onde os dois sítios de restrição BamHI estão em negrito, a sequência que codifica o peptídeo de sinal tPA está sublinhada e a sequência que codifica LJL143 está em negrito maiusculo.A Figura 3 mostra um mapa do vetor doador, pALVAC C3 H6p-LJM17, com 5.737 pares de bases.

A Figura 4 ilustra o vetor de expressão canarypox vCP2390, tanto para as fitas complementares normais e reversas (SEQ ID NO: 93 e SEQ ID NO: 92) . SEQ ID NO: 93 representa a cepa do vetor vCP2390 que contém o polinucleotídeo LJM17 códon otimizado na direção que codifica o polipeptídeo LJM17 (SEQ ID NO: 5).

A Figura 5 mostra um mapa do vetor doador, pALVAC C3 H6p-LJL143, com 5.400 pares de bases.A Figura 6 ilustra o vetor de expressão canarypox VCP2389 com sua inserção codificando LJL143, e fornece a sequência de nucleotídeos de uma fita do vetor de expressão (SEQ ID NO: 94).

A Figura 7 ilustra anticorpos anti-IgG tanto paraLJM17 quanto para LJL143, absorvância medida a 405 nm, emcães vacinados e de controle, de um dia antes daadministração VI até duas semanas após a administração V5.

A Figura 8 ilustra a secreção de gama-interferon (pg/Ml) de ca~es PBMC correspondentes aos 5 grupos, duas semanas após a 5a imunização (administração V5). PBMC foram estimulados por SGH (2 pares), LJL143 (4 μg), LJM17 (4 μg), ConA (4 μg) ou não-estimulados pelo meio (med).

A Figura 9 mostra um esquema de um ensaio de morte in vitro incluindo os resultados, expressos em porcentagem de macrófagos infectados (NT: sem tratamento, LPS: lipopolissacarideo, conA: concavalina A).

A Figura 10 mostra biópsias de cães vacinados e de controle, e os sirios de picada de borrachudos, marcados com hematoxilina/eosina (H&E), Luna's, azul de toluidina e procedimentos imunoistoquimicos para CD3 e marcadores de macrófagos/monócitos (Mac).

A Figura 11 mostra a sequência de ácido nucleico de uma fita do plasmideo pNBO002 (SEQ ID NO: 19) , em que os dois sitios de restrição BamHI estão em negrito, a sequência que codifica o peptideo sinal tPA é sublinhada e a sequência que codifica LJM17 está em negrito e com letras maiusculas.

A Figura 12 mostra um mapa do vetor de plasmideo pNBO002 com sua inserção codificando LJM17, com 6.247 pares de bases.

A Figura 13 mostra a sequência de ácidos nucleicos de uma fita do plasmideo pNBO003 (SEQ ID NO: 20), em que os dois sítios de restrição BamHI estão em negrito, a sequência que codifica o peptídeo de sinal tPA é sublinhada e a sequência que codifica LJL143 está em negrito com letras maiusculas.

A Figura 14 mostra um mapa do vetor de plasmídeo pNBO003 com sua inserção codificando LJL143, com 5.899 pares de bases.

A Figura 15 mostra as sequências de proteína de LJL143 e LJM17 de L. longipalpis.A Figura 16 mostra as sequências de DNA de LJL143 e LJM17 de L. longipalpis.A Figura 17 mostra a sequência das tabelas de identidade.A Figura 18 mostra a SEQ ID NO atribuída a cada DNA e polipeptídeo.A Figura 19 é um conjunto de gráficos e imagens demonstrando a imunidade anti-saliva em cães expostos às picadas de borrachudos Lu. longipalpis. A FIG. 19A é um conjunto de gráficos que demonstram a cinética inicial de títulos de anticorpos anti-Lu. longipalpis de IgG, IgG2 e IgGl em cães expostos. A FIG. 19B é um gráfico de uma reação de hipersensibilidade tipo retardada em um cão representativo através de experimentos de exposição. A FIG. 19C é um. conjunto de imagens de uma análise histológica H/E realizadas em biópsias de punção da pele antes da exposição (E0) , 47 h depois da primeira exposição (El) , 48 h após a segunda exposição (E2) e 48 h após a terceira exposição (E3) às picadas do borrachudo. A FIG. 19D é um conjunto de imagens que caracterizam a população inflamatória em 48 horas após a terceira exposição (E3) às picadas do borrachudo com imunoistoquimica para linfócitos CD3+ T e macrófagos e cepa Luna para eosinófilos.

A Figura 20 é um conjunto de gráficos e imagens mostrando um teste de triagem de antigeno de DNAc reverso em cães.

A Figura 21 é um conjunto de gráficos e imagens que demonstram um ensaio de varredura de antigeno de proteina reverso em cães.

A Figura 22 é um conjunto de dois gráficos demonstrando a produção de interferon y de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de cães vacinados após a estimulação com proteina salivar recombinante.

A Figura 23 é um conjunto de quatro gráficos de barras demonstrando um experimento de morte in vitro para Leishmania chagasi por PBMCs a partir de cães imunizados (NT, sem tratamento, Ly, linfócitos).

Descrição Detalhada da Invenção

Observa-se que nestei descrição e particularmente nas reivindicações, termos como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e outros podem ter o significado atribuido a eles na lei de patentes americana; por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluido", "incluindo" e similares; e que termos como "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente de" têm o significado que lhes é atribuido na lei de patentes americana, por exemplo, permitem elementos não explicitamente citados, mas excluem os elementos que são encontrados no estado da técnica ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

A não ser que seja indicado ao contrário, os termos técnicos são utilizados de acordo com o uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632- 02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) . Os termos singulares "um", "uma" e "o" são tencionados a incluir "e", a não ser que o contexto claramente diga o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" é tencionada a incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. A palavra "ou" significa qualquer membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação dos membros daquela lista.

É observado que nesta descrição e nas reivindicações e/ou parágrafos em anexo, o termo "polipeptideo de Lu. longipalpis salivar", "polipeptideo Lu. longipalpis" ou "polipeptideo salivar" são usados indistintamente, o termo "polinucleotideo Lu. longipalpis", "polinucleotideo Lu. longipalpis", ou "polinucleotideo salivar" são usados indistintamente.

Os termos "polipeptideo" e "proteina" são usados indistintamente aqui para se referir aqui a um polimero de residues de aminoácidos consecutivos.

O termo "ácidos nucleicos", "nucleotideo" e "polinucleotideo" se refere ao RNA ou DNA e seus derivados, como os que contêm estruturas modificadas. Deve-se perceber que a invenção fornece polinucleotideos compreendendo sequências complementares às aqui descritas. Polinucleotideos de acordo com a presente invenção podem ser preparados de diversas formas (por exemplo, por síntese química, por clonagem de genes, etc.) e podem assumir diversas formas (por exemplo, lineares ou ramificadas, de fita simples ou dupla, ou um híbrido do mesmo, iniciadores, sondas, etc.).

O termo "gene" é amplamente utilizado para se referir a qualquer segmento de polinucleotideo associado a uma função biológica. Deste modo, os genes ou polinucleotideos incluem introns e éxons como na sequência do genoma, ou apenas as sequências de codificação como em DNAcs, como uma estrutura de leitura aberta (ORF), a partir do códon de partida (códon metionina) e terminando com um sinal de término (códon de parada). Genes e polinucleotideos podem também incluir as regiões que regulam suas expressões, como a iniciação da transcrição, tradução e terminação da transcrição. Deste modo, também estão incluídos os promotores e regiões de ligação a ribossomo (em geral, esses elementos regulatórios ficam aproximadamente entre 60 e 250 nucleotídeos à montante do códon de iniciação da sequência de codificação ou gene; Doree SM et al;. Pandher K et al;. Chung et JY al), terminadores de transcrição (em geral o terminador está localizado em aproximadamente 50 nucleotídeos à jusante do códon de parada da sequência de codificação ou gene; Ward CK et al). Gene ou polinucleotideo também se referem a um fragmento de ácido nucleico que expressa RNAm ou RNA funcional, ou codifica uma proteina especifica, e que inclui sequências regulatórias.

O termo "polipeptideo imunogênico" ou "fragmento imunogênico" como aqui utilizado refere-se a um polipeptideo ou um fragmento de um polipeptideo que compreende uma porção alelo-especifica, um epitopo ou outra sequência tal que o polipeptideo ou fragmento irá se ligar a uma molécula de MHC e induzir uma resposta de linfócito T citotóxico ("CTL"), e/ou uma resposta das células B (por exemplo, produção de anticorpos), e/ou resposta de linfócitos T-auxiliadores, e/ou uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) contra o antigeno do qual o polipeptideo imunogênico ou fragmento imunogênico é derivado. Uma resposta DTH é uma reação imunológica em que a ativação do macrófago dependente de célula Tea inflamação causam lesão tecidual. A reação de DTH para a injeção subcutânea do antigeno é frequentemente utilizada como um ensaio de imunidade mediada por células.

Por definição, um epitopo é um determinante antigênico que é imunologicamente ativo, no sentido de que, quando administrados a um hospedeiro, é capaz de evocar uma resposta imune do tipo humoral (células B) e/ou de tipo celular (células T). Estes são grupos quimicos particulares ou sequências peptidicas em uma molécula que são antigênicos. Um anticorpo se liga especificamente a um epitopo antigênico em particular em um polipeptideo. Exemplos específicos, não limitativos de um epitopo incluem uma sequência de tetra a pentapeptídeo em um polipeptideo, uma sequência de tri a pentaglicosideo em um polissacarideo. No animal, a maior parte dos antigenos vai apresentar alguns ou mesmo muitos determinantes antigênicos simultaneamente. Tal polipeptideo pode ser também qualificado como um polipeptideo imunogênico e o epitopo pode ser identificado conforme descrito adicionalmente. Um componente biológico "isolado" (como um ácido nucleico ou proteina ou organela) refere-se a um componente que foi substancialmente separados ou removido por purificação de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente, por exemplo, outros DNAs e RNAs cromossômicos e extra-cromossômicos, proteínas e organelas. Os ácidos nucleicos e proteínas que têm sido "isolados" incluem ácidos nucleicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrões. O termo também engloba ácidos nucleicos e proteínas preparadas por tecnologia recombinante, assim como por síntese química.

O termo "purificado", conforme usado na presente invenção, não necessita de pureza absoluta, mas sim, destina-se como um termo relativo. Assim, por exemplo, uma preparação de polipeptideo purificada é aquela em que o polipeptideo é mais enriquecido do que o polipeptideo no seu ambiente natural. Uma preparação de polipeptideo é substancialmente purificada de modo que o polipeptideo representa diversas modalidades, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou pelo menos 98% do conteúdo total de polipeptídeos da preparação. O mesmo se aplica aos polinucleotideos. Os polipeptídeos aqui revelados podem ser purificados por qualquer dos meios conhecidos na técnica.

Um polinucleotideo recombinante é aquele que tem uma sequência que não é natural ou tem uma sequência que é feito por uma combinação artificial de dois segmentos separados de outra forma da sequência. Esta combinação artificial é frequentemente realizada por síntese química ou, mais comumente, por meio da manipulação artificial dos segmentos isolados de ácidos nucleicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Em uma modalidade, um polinucleotideo recombinante codifica uma proteína de fusão.

Em um aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos da espécie de borrachudo Lu. longipalpis. Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptideo que tem uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 , 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87, e uma variante ou fragmento da mesma.

Além disso, homólogos de polipeptideos de espécies de borrachudos Lu. longipalpis são tencionadas a estarem dentro do escopo da presente invenção. Como usado aqui, o termo "homólogos" inclui ortólogos, análogos e parálogos. O termo "análogos" refere-se a dois polinucleotideos ou polipeptideos que têm a mesma ou semelhante função, mas que evoluiram separadamente em organismos independentes. O termo "ortólogos" refere-se a dois polipeptideos ou polinucleotideos de diferentes espécies, mas que evoluiram a partir de um gene ancestral comum por especiação.

Normalmente, ortólogos codificam polipeptideos tendo funções iguais ou semelhantes. 0 termo "parálogos" refere- se a dois polipeptideos ou polinucleotideos que são relacionados pela duplicação dentro de um genoma. Parálogos geralmente têm funções diferentes, mas essas funções podem ser relacionadas. Análogos, ortólogos e parálogos de um polipeptideo salivar tipo selvagem podem diferir do polipeptideo salivar tipo selvagem por modificações pós- traducionais, por diferenças na sequência de aminoácidos, ou por ambos. Em particular, os homólogos da invenção irão exibir em geral pelo menos 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade sequencial, com toda ou parte da sequência de polipeptideo ou polinucleotideo salivar tipo selvagem, e irá apresentar uma função semelhante.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polipeptideo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com umpolipeptideo que tem uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29,31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece fragmentos e variantes de polipeptideos de L. longipalpis acima identificados (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31 , 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81 , 83, 85 ou 87) que podem ser facilmente preparados por uma pessoa versada na técnica usando técnicas de biologia molecular bem conhecidas.As variantes são polipeptideos homólogos que têm uma sequência de aminoácidos de pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com a sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87.

As variantes incluem variantes alélicas. O termo "variante alélica" refere-se a um polinucleotideo ou um polipeptideo contendo polimorfismos que levam a alterações nas sequências de aminoácidos de uma proteina e que existem em uma população natural (por exemplo, uma espécie de virus ou variedade). Tais variações naturais alélicas podem tipicamente resultam em 1 a 5% de variância em um polinucleotideo ou um polipeptideo. Variantes alélicas podem ser identificadas pelo sequenciamento da sequência de ácido nucleico de interesse em um número de espécies diferentes, que podem ser facilmente realizados por meio de sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético do gene naquelas espécies. Quaisquer e todas as variações de ácido nucleico e polimorfismos resultantes de aminoácidos ou variações que são o resultado de variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do gene se interesse, são tencionados a estarem dentro do escopo da invenção.

Uma variante é qualquer polipeptideo secretado da saliva de Lu. longipalpis, capaz de induzir em animais, como cães, vacinados com este polipeptideo uma resposta imune baseada em células especificas caracterizada pela secreção de interferon gama (IFN-gama) com a estimulação por compostos de extratos da glândula salivar de Lu. longipalpis. Tal secreção de IFN-gama pode ser demonstrada através de metodologia in vitro (isto é, imunoensaio Quantikine® de R&D Systems Inc. (número de catálogo #CAIF00); Djoba Siawaya JF et al.).

Conforme aqui utilizado, o termo "derivado" ou "variante" refere-se a um polipeptideo, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptideo, que tem uma ou mais variações de aminoácidos conservativas ou outras modificações menores, de modo que (1) o polipeptideo correspondente tem função substancialmente equivalente em comparação com o polipeptideo tipo selvagem ou (2) um anticorpo suscitado contra o polipeptideo é imunorreativo com o polipeptideo tipo selvagem. Essas variantes ou derivados incluem polipeptídeos tendo modificações menores das sequências de aminoácidos primárias de polipeptideo Lu. longipalpis que podem resultar em peptídeos que têm atividade substancialmente equivalente em comparação com o polipeptideo correlativo inalterado. Tais alterações podem ser deliberadas, como por mutagênese direcionada a sitio ou podem ser espontâneas. 0 termo "variante" ainda contempla eliminações, adições e substituições à sequência, contanto que as funções de polipeptideos produzam uma resposta imunológica como aqui definido.

O termo "variação conservadora" denota a substituição de um residue de aminoácido por outro residue biologicamente semelhante, ou a substituição de um nucleotideo em uma sequência de ácido nucleico tal que o residuo de aminoácido codificado não muda ou é outro residuo biologicamente similar. Sob este aspecto, substituições particularmente preferidas serão geralmente de natureza conservativas, isto é, aquelas substituições que ocorrem dentro de uma familia de aminoácidos. Por exemplo, os aminoácidos são geralmente divididos em quatro familias: (1) ácidos - aspartato e glutamato, (2) básicos - lisina, arginina, histidina, (3) não-polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano, metionina; e (4) polares sem carga - glicina tirosina, asparagina, glutamina, cistina, treonina, serina. Fenilalanina, triptofano e tirosina são às vezes classificados como aminoácidos aromáticos. Exemplos de variações conservadoras incluem a substituição de um residuo hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro residuo hidrofóbico, ou a substituição de um residuo polar por outro residuo polar, como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ácido, ou glutamina por asparagina, e assim por diante; ou uma substituição conservativa semelhante do aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado que não vai ter um grande efeito sobre a atividade biológica. Proteinas tendo substancialmente a mesma sequência de aminoácidos como a molécula de referência, mas que possui substituições de aminoácidos menores que não afetam substancialmente a imunogenicidade da proteina estão, portanto, na definição do polipeptideo de referência. Todos os polipeptideos produzidos por essas modificações são incluidos neste documento. O termo "variação conservadora" também inclui o uso de um aminoácido substituído no lugar de um aminoácido de origem não-substituido, desde que anticorpos suscitados para o polipeptideo substituído também imunorreagem com o polipeptideo não-substituido.

Um fragmento imunogênico de polipeptideo Lu. longipalpis inclui pelo menos 8, 10, 15 ou 20 aminoácidos consecutivos, pelo menos 21 aminoácidos, pelo menos 23 aminoácidos, pelo menos 25 aminoácidos ou pelo menos 30 aminoácidos de um polipeptideo L. longipalpis tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87, ou suas variantes. Em outra modalidade, um fragmento de polipeptideo Lu. longipalpis inclui um epitopo antigênico especifico encontrado em um polipeptideo Lu. longipalpis de comprimento total.

Procedimentos para determinar fragmentos de polipeptídeos e epítopos, tais como geração de bibliotecas de peptídeos sobrepostos (Hemmer B. et al.), Pepscan (Geysen H. M. et al, 1984; Geysen HM et al, 1985; Van der Zee R. et al.; Geysen HM) e algoritmos (De Groot A. et al;. Hoop T. et al, .. Parker K. et al) , podem ser usados na prática da invenção, sem experimentação indevida. Geralmente, os anticorpos se ligam especificamente a um epitopo antigênico particular. Exemplos específicos não- limitativos incluem uma sequência de tetra ou pentapeptídeo em um polipeptideo, uma sequência de tri ou pentaglicosídeo em um polissacarídeo. Em animais, a maioria dos antígenos estará presente várias ou até mesmo em muitos determinantes antigênicos simultaneamente. De preferência, em que o epitopo é um fragmento de proteína de uma molécula maior ele vai ter substancialmente a mesma atividade imunológica que a proteína total.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo codificando um polipeptideo do borrachudo Lu. longipalpis, tal como um polinucleotideo codificando um polipeptideo tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo codificando um polipeptideo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97% , 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, ou uma variante conservativa, uma variante alélica, um homólogo ou um fragmento imunogênico compreendendo pelo menos oito ou pelo menos dez aminoácidos consecutivos de um destes polipeptideos, ou uma combinação destes polipeptideos.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo de ter uma sequência de nucleotídeos conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ou 91, ou uma variante da mesma. Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um polinucleotideo que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial a um polinucleotideo que tem uma sequência conforme estabelecido nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ou 91, ou uma variante da mesma.

Estes polinucleotideos podem incluir sequências de DNA, DNAc, RNA que codificam um polipeptideo de Lu. longipalpis. Entende-se que todos os polinucleotideos codificando um polipeptideo Lu. longipalpis também estão incluidos aqui, contanto que eles codifiquem um polipeptideo com atividade reconhecida, como a ligação a um anticorpo que reconhece o polipeptideo, a indução de uma resposta imune ao polipeptideo, ou um efeito na sobrevivência de Leishmania, quando administrado a um individuo exposto ao parasita ou que sofre uma diminuição de um sinal ou sintoma de infecção por Leishmania.

Os polinucleotideos da descrição incluem sequências que são degeneradas como resultado do código genético, por exemplo, uso e códon otimizado para um hospedeiro especifico. Como aqui usado, "otimizado" refere-se a um polinucleotideo que é geneticamente modificado para aumentar a sua expressão em uma determinada espécie. Para fornecer polinucleotideos otimizados de codificação para polipeptídeos salivares, a sequência de DNA do gene da proteina salivar pode ser modificada para 1) compreender códons preferenciais por genes altamente expressos em uma espécie particular, 2) compreender um conteúdo de A + T ou G + C na composição de base de nucleotídeo com aquelas substancialmente encontradas nas referidas espécies; 3) formar uma sequência de iniciação das referidas espécies; ou 4) eliminar as sequências que causam desestabilização, poliadenilação inadequada, degradação e terminação do RNA, ou aquela de formam grampos de estrutura secundária ou sitios de união de RNA. A expressão aumentada da proteina salivar nas referidas espécies pode ser obtida utilizando a frequência de distribuição de uso de códon em eucariotos e procariotos, ou em uma determinada espécie. O termo "frequência de uso de códons preferidos" refere-se à preferência exibida por uma célula hospedeira especifica no uso de códons de nucleotídeos para especificar um determinado aminoácido. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais são especificados por mais de um códon. Portanto, todas as sequências de nucleotídeos degenerados são incluídas na descrição, desde que a sequência de aminoácidos do polipeptideo salivar de Lu. longipalpis funcionalmente inalterada.

A identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos pode ser estabelecida pela matriz blosum 62 e blast em pares do NCBI (National Center for Biotechnology Information) usando os parâmetros padrões (ver, por exemplo, o algoritmo BLAST ou BLASTX disponivel no servidor de "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, Maryland, EUA), assim como em Altschul et al; e, portanto, este documento fala de usar o algoritmo ou a matriz BLAST ou BLASTX e BLOSUM62 matriz pelo termo "blasts").

A identidade de sequência entre as duas sequências de nucleotídeos também pode ser determinada usando o programa "Align" de Myers e Miller, ("Optimal Alignment in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 1988) e disponivel no NCBI, bem como o mesmo ou outros programas disponíveis via Internet em sitios dela como o sitio do NCBI.

Alternativa ou adicionalmente, o termo "identidade", por exemplo, com relação a uma sequência de nucleotideo ou de aminoácidos, pode indicar uma medida quantitativa da homologia entre duas sequências. A homologia de sequência porcentual pode ser calculada como:(Nref - Ndif) *100/Nref, onde Ndif é o número total de residuos não-idênticos nas duas sequências quando alinhadas e onde Nref é o número de resíduos em uma das sequências. Deste modo, a sequência de DNA AGTCAGTC terá uma identidade de sequência de 7 5% com a sequência AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2) .

Alternativa ou adicionalmente, "identidade" em relação às sequências pode se referir ao número de posições com os nucleotídeos ou aminoácidos idênticos, dividido pelo número de nucleotídeos ou aminoácidos na menor das duas sequências em que o alinhamento das duas sequências pode ser determinado em acordo com o algoritmo de Wilbur e Lipman (Lipman e Wilbur), por exemplo, usando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma penalidade de intervalo de 4, e análise assistida por computador e interpretação dos dados da sequência incluindo o alinhamento pode ser convenientemente realizado utilizando programas comercialmente disponíveis (por exemplo, Pacote Intelligenetics™, Intelligenetics Inc. CA). Quando sequências de RNA são consideradas semelhantes, ou têm um grau de identidade de sequência ou de homologia com sequências de DNA, timidina (T) na sequência do DNA é considerado igual a uracila (U) na sequência de RNA. Assim, sequências de RNA estão dentro do escopo da invenção e podem ser derivadas de sequências de DNA, por timidina (T) na sequência de DNA a ser considerada igual à uracila (U) em sequências de RNA.

A semelhança de sequência ou a identidade de sequência de duas sequências de aminoácidos, ou a identidade de sequência entre duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o pacote de softwares Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).

Vantajosamente, a identidade de sequência ou homologia, como a identidade de sequência de aminoácidos ou homologia pode ser determinada usando o programa Blastp (Altschul et al.) e disponível no NCBI, bem como o mesmo ou outros programas disponíveis na Internet nos respectivos sítio ali, como o sítio NCBI.

Os documentos a seguir fornecem algoritmos para comparar a identidade familiar ou a homologia de sequências e, adicionalmente ou alternativamente, com relação ao precedente, os ensinamentos dessas referências podem ser usados para determinar a homologia ou identidade porcentual: Needleman SB e Wunsch CD; Smith TF e Waterman MS; Smith TF, Waterman MS e Sadler JR; Feng DF e Dolittle RF; Higgins DG e Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ; e, Devereux J, Haeberlie P e Smithies O. E, sem experimentação demasiada, a pessoa versada na técnica pode consultar muitos outros programas ou referências para a determinação de homologia porcentual.

Os polinucleotideos Lu. longipalpis podem incluir um DNA recombinante, que está incorporado em um vetor, em um plasmideo de replicação autonômica ou virus, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula em separado (por exemplo, um DNAc) independente de outras sequências.

Vetores recombinantes revelados neste documento podem incluir um polinucleotideo codificando um polipeptideo, uma variante do mesmo ou um fragmento do mesmo. Vetores recombinantes podem incluir plasmídeos e vetores virais e podem ser usados para a expressão in vitro ou in vivo expressão, vetores recombinantes podem incluir ainda um peptideo de sinal. Peptideos de sinal são cadeias peptidicas curtas (3-60 aminoácidos de comprimento) que direcionam o transporte pós-traducional de uma proteína (que é sintetizada no citosol) a certas organelas como o núcleo, matriz mitocondrial, retículo endoplasmático, cloroplasto, apoplasto e peroxissomos. Tipicamente, os polipeptideos Lu. longipalpis salivares naturais, como as proteínas LJM17 e LJL143 podem ser traduzidas como precursores, com uma sequência de peptideo de sinal N- terminal e um domínio de proteína "madura". 0 peptideo sinal pode ser clivado rapidamente na tradução. A sequência de sinal pode ser a sequência natural da proteína salivar ou um peptideo sinal de uma proteína secretada, por exemplo, da proteína ativadora de plasminogênio tecidual (tPA), em especial a tPA humana (S. Friezner Degen et al.; R. Rickies et al.; D. Berg. et al.), ou o peptídeo sinal do fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF1), em particular o IGF1 equino (K. Otte et al.), o IGF1 canino (P. Delafontaine et al.), o IGF1 felino (WO03/022886), o IGF1 bovino (S. Lien et al.), o IGF1 suíno (M. Muller et al.), o IGF1 de galinha (Y. Kaj imoto et al.), o IGF1 de peru (número de acesso GenBank AF074980). O peptídeo sinal de IGF1 pode ser natural ou otimizado, o qual pode ser obtido através da remoção de sítios de união crípticos e/ou através da adaptação do uso de códons. Na tradução, o polipeptideo não-processado pode ser clivado em um sítio de clivagem para levar ao polipeptideo maduro. O sítio de clivagem pode ser previsto pelo método de Von Heijne (1986).

Um plasmideo pode incluir uma unidade de transcrição do DNA, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que lhe permite replicar em uma célula hospedeira, como uma origem de replicação (procarióticos ou eucarióticos). Um plasmideo também pode incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Formas circulares e lineares forma dos plasmídeos são englobadas na presente invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão in vivo compreendendo uma sequência de polinucleotideo, que contém e expressa in vivo em um hospedeiro os polipeptídeos Lu. longipalpis salivares e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos.0 vetor de expressão in vivo pode incluir qualquer unidade de transcrição contendo um polinucleotideo ou um gene de interesse e aqueles elementos essenciais para a sua expressão in vivo. Estes vetores de expressão podem ser plasmídeos ou vetores virais recombinantes. Para a expressão in vivo, o promotor pode ser de origem virai ou de origem celular. Em uma modalidade, o promotor pode ser o promotor inicial de citomegalovírus (CMV) (promotor CMV- IE) , o promotor inicial ou tardio do vírus SV40 ou o promotor LTR do vírus sarcoma de Rous, um promotor de um gene do citoesqueleto, tal como o promotor desmina (Kwissa M. et al.), ou o promotor de actina (Miyazaki J. et al. ) . Quando vários genes estão presentes no mesmo plasmídeo, eles podem ser fornecidos na mesma unidade de transcrição ou em unidades diferentes.

Conforme usado aqui, o termo "plasmídeo" pode incluir qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e os elementos necessários para a sua expressão in vivo em uma célula ou células do hospedeiro ou alvo desejado e, neste sentido, é observado que um plasmídeo circular superenovelado ou não- enovelado, assim como uma forma linear, é tencionado a estar dentro do escopo da invenção. Os plasmideos também podem compreender outros elementos reguladores da transcrição como, por exemplo, sequências estabilizadoras tipo intron. Em várias modalidades, os plasmideos podem incluir o primeiro intron do CMV-IE (WO 89/01036), o intron II do gene da beta-globina de coelho (van Ooyen et al.), a sequência sinal da proteina codificada pelo tecido ativador de plasminogênio (tPA;. Montgomery et al), e/ou um sinal de poliadenilação (polyA), em particular o polyA do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (US 5.122.458) ou o polyA do gene da beta-globina de coelho ou do virus SV40.

Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição de vacina compreendendo:a) um vetor de expressão in vivo, onde o vetor compreende um polinucleotideo codificando um ou mais polipeptideos selecionado do grupo que consiste de um polipeptideo salivar Lu. longipalpis, uma variante ou fragmento do polipeptideo Lu. longipalpis, e uma mistura dos mesmos, e b) um veiculo, diluente ou excipiente veterinariamente ou farmaceuticamente aceitável.

Em outro aspecto, a presente invenção diz respeito a uma composição de vacina compreendendo: a) um primeiro vetor de expressão in vivo, em que o vetor compreende um polinucleotideo codificando um ou mais polipeptideos selecionados do grupo que consiste de um polipeptideo Lu. longipalpis salivar, uma variante ou fragmento do polipeptideo Lu. longipalpis salivar, e uma mistura dos mesmos; b) um segundo vetor de expressão in vivo, onde o vetor compreende um polinucleotideo codificando um ou mais polipeptideos selecionados do grupo que consiste de um polipeptideo Lu. longipalpis salivar, uma variante ou fragmento do polipeptideo de Lu. longipalpis salivar e uma mistura dos mesmos e, c) veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.0 termo "composição da vacina" ou "vacina" compreende qualquer composição, uma vez ela tenha sido injetada em um hospedeiro, inclusive caninos, felinos e humanos, que protege o hospedeiro da leishmaniose cutânea e/ou leishmaniose visceral, e/ou que possa prevenir a implantação do parasita e/ou que possa impedir a progressão da doença em indivíduos infectados e/ou que possa limitar a difusão de parasitas em fuga aos órgãos internos, e/ou que possam evitar ou limitar a absorção do parasita por um borrachudo durante uma refeição de sangue em um cão vacinado. Isto pode ser feito mediante a vacinação de acordo com a presente invenção por meio da indução de secreção de citocina, notavelmente a secreção de IFN-gama (como exemplo de um método da secreção de IFN-gama, o imunoensaio Quantikine® de R&D Systems Inc. (número de catálogo #CAIF00) poderia ser utilizado (Djoba Siawaya JF et al.)).

Os veiculos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis de uso são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, por E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para a distribuição farmacêutica dos polipeptídeos, plasmideos, vetores virais aqui revelados. Em geral, a natureza do veiculo ou excipiente vai depender do modo particular de administração a ser empregado. Por exemplo, as formulações parenterais, normalmente, compreendem os liquidos injetáveis que incluem liquidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis como água, salina fisiológico, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou semelhantes como um veiculo. Para composições sólidas (por exemplo, pastilhas liofilizadas, formas de pó, pilula, comprimido ou cápsula), veiculos ou excipientes sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêutico de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de veiculos ou excipientes biologicamente neutros, composições imunogênicas a serem administradas podem conter pequenas quantidades de substâncias adjuvantes não-tóxicas, como agentes umidificantes ou emulsificantes, conservantes e agentes tamponantes de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

As vacinas de acordo com a presente invenção podem incluir vetores codificando qualquer polinucleotideo de acordo com a presente invenção, conforme descrito acima.

Múltiplas inserções podem ser feitas no mesmo vetor usando sitios de inserção diferentes ou usando o mesmo sitio de inserção. Quando o mesmo sitio de inserção é usado, cada inserção de polinucleotideo, que pode ser qualquer polinucleotideo da presente invenção acima mencionado, pode ser inseridos sob o controlo do mesmo e/ou diferentes promotores. A inserção pode ser feita cauda-a- cauda, cabeça-a-cabeça, cauda-a-cabeça ou cabeça-a-cauda. Elementos IRES (Sitio de Entrada de Ribossomo Interno, consultar EP 0803573) também pode ser usado para separar e para expressar inserções múltiplas operavelmente ligadas ao mesmo e/ou diferentes promotores.

Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo acima mencionado. 0 vetor de expressão pode ser um vetor de expressão in vivo, ou em um vetor de expressão in vitro.

De modo mais geral, a presente invenção engloba vetores de expressão in vivo, incluindo qualquer plasmideo (EP-A2-1001025; Chaudhuri P.) contendo e expressando in vivo em um hospedeiro o polinucleotideo ou gene do polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, variante do mesmo ou fragmento do mesmo e elementos necessários para a sua expressão in vivo.

Em um exemplo especifico não-limitativo, o plasmideo pVR1020 ou pVR1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al.; Hartikka J. et al.), pVR2001-TOPA (ou pVR2001-TOPG) (Oliveira F. et al.) ou pABUO (US 6, 852,705) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma sequência de polinucleotideos. O plasmideo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a sequência sinal tPA humana. O pVR1020 é uma estrutura de plasmideo disponível junto a Vical, Inc., (São Diego, CA), que foi previamente usado, ver, por exemplo, Patentes Americanas Nos. 6.451.769 e 7.078.507. Conforme descrito em Oliveira et al., plasmideo PVR2001-TOPO (ou pVR2001-TOPA) é pVR1020 modificado pela adição de topoisomerases flanqueando o sitio de clonagem e contendo codificação para e expressando um peptideo sinal de secreção, por exemplo, o peptideo sinal ativador de plasminogênio tecidual (tPA), que aumenta a probabilidade de produzir uma proteina secretada, (ver Figura 1 em Oliveira F. et al.).

Cada plasmideo pode compreender ou conter ou consistir essencialmente do polinucleotideo de acordo com a presente invenção, operavelmente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor, onde o promotor pode estar vantajosamente adjacente ao polinucleotideo para o qual a expressão é desejada. Em geral, é vantajoso utilizar um promotor forte que seja funcional em células eucarióticas. Um exemplo de um promotor útil ser o promotor do citomegalovirus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou murina, ou pode, opcionalmente, ter outra origem como a de rato ou porquinho-da-india. 0 promotor CMV-IE pode compreender a parte promotora efetiva, que pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Referência pode ser feita à EP 260 148, EP 323 597, US 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, bem como WO 87/03905. O promotor CMV-IE pode ser vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al.) ou CMV- IE de murino. Em termos mais gerais, o promotor pode ter uma origem virai ou uma origem celular. Um forte promotor virai diferente de CMV-IE que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor inicial/tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do virus do sarcoma de Rous. Um promotor celular forte que pode ser utilizados de forma útil na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como o promotor desmina (Kwissa M. et al.), ou o promotor de actina (Miyazaki J. et al.). Sub fragmentos funcionais desses promotores, isto é, as porções desses promotores que mantêm atividade do promotor adequada, estão incluídos na presente invenção, por exemplo, promotores CMV-IE truncados de acordo com WO 98/00166 ou US 6.156.567, e podem ser usados na prática da invenção. 0 promotor útil na prática da invenção consequentemente pode incluir derivados e/ou subfragmentos de um promotor de comprimento total que mantém a atividade promotora adequada e, portanto, funciona como um promotor, e que pode vantajosamente ter atividade promotora que é substancialmente semelhante àquela do promotor real ou de comprimento total do qual o derivado ou sub-fragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores CMV-IE truncados da US 6.156.567, em comparação com a atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Assim, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender ou consistir essencialmente de ou consistir da porção promotora do promotor de comprimento total e/ou a porção promotora do promotor de comprimento total, bem como derivados e/ou sub fragmentos seus.

Vantajosamente, os plasmídeos compreendem ou consistem essencialmente de outros elementos de controle de expressão. É especialmente vantajoso incorporar sequências de estabilização, por exemplo, sequências de intron(s), por exemplo, o primeiro intron do hCMV-IE (WO 89/01036), o intron II do gene da β-globina de coelho (van Ooyen et al.). Também para o sinal de poliadenilação (polyA) para os plasmideos e vetores virais diferentes de poxvirus, uso pode ser feito do sinal de poly (A) do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver US 5.122.458), ou o sinal poly (A) sinal do gene da β-globina de coelho ou o sinal poly(A) do virus SV40.

Em uma modalidade da presente invenção, o vetor do plasmideo é pVR2001 compreendendo o polinucleotideo LJM17, como descrito no exemplo 1 deste documento.

Em outra modalidade da presente invenção, o vetor do plasmideo é pVR2001 compreendendo o polinucleotideo LJL143, conforme descrito no exemplo 2 da presente invenção.

Em outra modalidade da presente invenção, o vetor do plasmideo é pNBO002, conforme descrito no exemplo 9 da presente invenção.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, o vetor do plasmideo é pNBO003, conforme descrito no exemplo 10 da presente invenção.

De modo mais geral, a presente invenção compreende vetores de expressão in vivo, incluindo qualquer vetor virai recombinante contendo um polinucleotideo ou gene codificando um ou mais imunógenos de Lu. longipalpis salivares e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, incluindo quaisquer elementos necessários para a sua expressão in vivo.

Os referidos vetores virais recombinantes poderiam ser selecionados, por exemplo, a partir do poxvirus, principalmente os virus avipox, tais como os virus fowlpox ou os virus canarypox. Em uma modalidade, o virus fowlpox é TROVAC (ver WO 96/40241). Em outra modalidade, o vetor canarypox é ALVAC. O uso destes vetores virais recombinantes e a inserção dos polinucleotideos ou genes de interesse são plenamente descritos em US 5.174.993; US 5.505.941 e US 5.766.599 para fowlpox, e na US 5.756.103 para canarypox. Mais do que um sitio de inserção dentro do genoma virai poderia ser usado para a inserção de múltiplos genes de interesse.

Em uma modalidade, o vetor virai é um adenovirus, como um adenovirus humano (HAV) ou um adenovirus canino (CAV).

Em outra modalidade, o vetor virai é um adenovirus humanos, especificamente um adenovirus do sorotipo 5, tornado incompetente para replicação por uma eliminação na região El do genoma viral, especialmente aproximadamente a partir do nucleotideo 459 até aproximadamente ao nucleotideo 3510 por referência à sequência do hAd5 revelada em GenBank sob o número de acesso M73260 e na publicação referenciada Chroboczek et al, 1992. 0 adenovirus eliminado é propagado em El-expressando células 293 (Graham et al., 1977) ou PER, especialmente PER.C6 (Falloux et al., 1998). O adenovirus humano pode ser adicionalmente ou alternativamente excluído na região E3, especialmente a partir aproximadamente do nucleotideo 28.592 até aproximadamente o nucleotideo 30.470. A eliminação na região El pode ser feita em combinação com uma eliminação na região E3 (ver, por exemplo, Shriver et al;. Graham et al; . Ilan et al; Patente Americana No. 6.133.028 e 6.692.956; Tripathy et al.; Tapnell; Danthinne et al;. Berkner; Berkner et al;. Chavier et al). Os sítios de inserção podem ser os locais El e/ou E3 (região) , eventualmente após uma eliminação parcial ou total das regiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o vetor de expressão é um adenovirus, o polinucleotideo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, como um promotor forte, vantajosamente um promotor do gene inicial imediato do citomegalovírus (promotor CMV-IE), especialmente a região intensificadora/promotora aproximadamente do nucleotídeo - 734 até aproximadamente o nucleotídeo +7 em Boshart et al., ou a região intensificadora/promotora do vetor pCI de Promega Corp. 0 promotor CMV-IE é vantajosamente de origem murina ou humana. O promotor do fator de alongamento la também pode ser usado. Um promotor músculo específico também pode ser usado (Li et al.). Promotores fortes também são discutidos em relação aos vetores do plasmideo. Em uma modalidade, uma sequência de união pode estar localizada à jusante da região intensificadora/promotora. Por exemplo, o intron 1 isolado do gene CMV-IE (Stenberg et al.), o íntron do isolado do gene da β-globina de coelho ou ser humano, especialmente o íntron 2 do gene da β-globina, o íntron isolado do gene da imunoglobulina, uma sequência de união do gene inicial SV40 ou a sequência do íntron quimérica isolada a partir do vetor PCI de Promega Corp. Uma sequência poly(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino, especialmente aproximadamente a partir do nucleotídeo 2339 até aproximadamente o nucleotídeo 2550 em GenBank sob o número de acesso BOVGHRH, um gene da β-globina de coelho ou um sinal de poliadenilação do gene tardio SV40.

Em outra modalidade, o vetor virai é um adenovirus canino, especialmente um CAV-2 (ver, por exemplo, Fischer et al; Patentes Americanas Nos. 5.529.780 e 5.688.920; WO 95/14102). Para CAV, os sitios de inserção podem estar na região E3 e/ou na região localizada entre a região E4 e na região ITR direita (ver Patentes Americanas Nos. 6.090.393 e 6.156.567). Em uma modalidade, a inserção está sob o controle de um promotor, como um promotor do gene inicial imediato do citomegalovirus (promotor CMV-IE) ou um promotor já descrito para um vetor de adenovirus humano. Uma seguência poly(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene da β-globina de coelho.

Em outra modalidade, o vetor virai é um herpesvirus, como um herpesvirus canino (CHV) ou um herpesvirus felino (FHV). Para CHV, os sitios de inserção podem estar no gene da timidina quinase, em ORF3, ou em UL43 ORF (ver US 6.159.477). Em uma modalidade, o polinucleotideo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor CMV-IE (murino ou humano). Uma sequência poly(A) e uma sequência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene da β-globina de coelho.

Para vetores recombinantes à base de um vetor poxvirus, um virus vaccinia ou um virus vaccinia atenuado (por exemplo, MVA, uma cepa Ankara modificada obtidas depois de mais de 570 passagens da cepa da vacina Ancara em fibroblastos de embrião de galinha; ver Stickl & Hochstein- Mintzel ; Sutter et al; disponíveis como ATCC VR-1508, ou NYVAC, ver US 5.494.807 e a Patente Americana No. 5.494.807, que discute a construção de NYVAC, bem como variações de NYVAC com ORFs adicionais eliminadas do genoma do virus vaccinia cepa Copenhagen, bem como a inserção de moléculas de ácido nucleico codificadoras heterólogas em sitios deste recombinantes, e também o uso de promotores emparelhados; ver também WO 96/40241), um virus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, , fowlpox, dovepox, pigeonpox, quailpox, ALVAC ou TROVAC; ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.505.941, 5.494.807) pode ser usado. Vírus canarypox atenuados são descritos em US 5.756.103 (ALVAC) e WO 01/05934. Vírus canarypox atenuados são descritos em US 5.766.599 que pertence ao TROVAC da cepa fowlpox atenuada. Referência é feita ao canarypox disponível de ATCC sob número de acesso VR-111. Várias cepas de vacinação do vírus fowlpox também são disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE comercializada por Intervet. Para obter informações sobre o método usado para gerar recombinantes do mesmo e como administrar seus recombinantes, o profissional versado pode consultar os documentos citados aqui e WO 90/12882, por exemplo, como para o vírus vaccinia, menção é feita às Patentes Americanas Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 e 5.762.938, inter alia; para fowlpox, menção é feita das Patentes Americanas Nos. 5.174.993, 5.505.941 e 5.766.599, inter alia: para canarypox, se faz menção da Patente Americana No. 5.756.10, inter alia. Quando o vetor de expressão é um vírus vaccinia, o sítio ou sítios de inserção para o polinucleotideo ou polinucleotideos a serem expressos estão vantajosamente no gene ou sítio de inserção da timidina quinase (TK), no gene ou sítio de inserção da hemaglutinina (HA), a região codificando o corpo de inclusão do tipo A (ATI); ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencentes ao vírus vaccinia. No caso de canarypox, vantajosamente o sítio ou sítios de inserção são ORF(s) C3, C5 e/ou C6; ver também os documentos aqui citados, especialmente aquelas pertencentes ao vírus canarypox. No caso de fowlpox, vantajosamente o sítio ou sítios de inserção são ORFs F7 e/ou F8, ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencentes ao virus fowlpox. 0 sitio ou sitios de inserção para o virus MVA estão vantajosamente como em várias publicações, incluindo Carroll MW et al;. Stittelaar KJ et al; . Sutter G. et al; E, sob este aspecto, também é verificado que o genoma MVA completo é descrito em Antoine G., Virology, que permite que a pessoa versada use outros sitios de inserção ou outros promotores.

Vantajosamente, o polinucleotideo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor poxvirus especifico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 kDa (Cochran et al.), o promotor I3L de vaccinia (Riviere et al.), o promotor de vaccinia HA (Shida), o promotor ATI de cowpox (Funahashi et al.), o promotor de vaccinia Hβ (Taylor J. et al;. Guo P. et al J.;. Perkus M. et al.), inter alia.

Em uma modalidade adicional, o vetor viral recombinante é o virus canarypox ALVAC recombinante vCP2390-SEQ ID NO: 6, expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis, tal como descrito no exemplo 3.

Em uma modalidade adicional, o vetor virai recombinante é o virus canarypox ALVAC recombinante vCP2390, expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis, tal como descrito no exemplo 11.

Em uma modalidade adicional, o vetor virai recombinante é o virus canarypox ALVAC recombinante VCP2389-SEQ ID NO: 2, expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. longipalpis, conforme descrito no exemplo 4.

Em uma modalidade adicional, o vetor virai recombinante é o virus canarypox ALVAC recombinante vCP2389, expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. longipalpis, conforme descrito no exemplo 12.

Em uma modalidade adicional, o vetor virai recombinante é o virus MVA recombinante MVA-LJM17, expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis, conforme descrito no exemplo 5.

Em uma modalidade adicional, o vetor virai recombinante é o virus MVA recombinante MVA-LJL143, expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. longipalpis, conforme descrito no exemplo 6.

Qualquer um dos polinucleotideos divulgados aqui pode ser expresso in vitro por transferência de DNA ou vetores de expressão em uma célula hospedeira apropriada. A célula hospedeira pode ser procariótica ou eucariótica. O termo "célula hospedeira" também inclui qualquer progenia da referida célula hospedeira. Métodos de transferência estável, significando que o polinucleotideo estrangeiro é continuamente mantido na célula hospedeira, são conhecidos na técnica. Células hospedeiras podem incluir bactérias (por exemplo, Escherichia coli), leveduras, células de insetos e células de vertebrados. Métodos de expressão de sequências de DNA em células eucarióticas são bem conhecidos na técnica. Como um método para a expressão in vitro, vetores recombinantes de Baculovirus (por exemplo, virus da poliedrose nuclear de Autographa California (AcNPV)) pode ser usado com os ácidos nucleicos aqui revelados. Por exemplo, os promotores da poliedrina podem ser utilizados com células de inseto (por exemplo, células de Spodoptera frugiperda, como células Sf9 disponíveis em ATCC sob o número de acesso CRL 1711, ou células Sf21) (ver, por exemplo, Smith et al;. Pennock et al.; Vialard et al.; Verne A.; O'Reilly et al.; Kidd I. M. & Emery V.C.; EP 0370573, EP 0265785; US 4.745.051). Para a expressão, o Pacote Starter BaculoGold (# Cat 21001K) de PharMingen (Becton Dickinson) pode ser utilizado. Como um método para a expressão in vitro, E. coli recombinante pode ser usada com um vetor. Por exemplo, ao clonar em sistemas bacterianos, promotores induzíveis, como o promotor de arabinose, pL de lambda bacteriófago, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac), e semelhantes podem ser utilizados. A transformação de uma célula hospedeira com o convencionais bem conhecidas pelas pessoas versadas na técnica. Quando o host é procariótico, como em E. coli, as células competentes que são capazes de captar DNA podem ser preparadas a partir de células colhidas após a fase de crescimento exponencial, e subsequentemente tratadas pelo método CaC12 através de procedimentos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, MgC12 ou RbCl podem ser usados.

A transformação também pode ser realizada através de eletroporação. Quando o hospedeiro é um eucarioto, tais métodos de transdução de DNA como coprecipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais, como microinjeção, eletroporação, inserção de um plasmideo incorporados em lipossomas, ou vetores virais podem ser usados.Células eucarióticas também podem ser co-transformadas com sequências de polinucleotideos L. longipalpis, e uma segunda molécula de DNA estrangeira codificando um fenótipo selecionável, como o gene da timidina quinase de herpes simplex. Outro método é o uso de um vetor virai eucariótico (ver acima) , tal como um herpes virus ou adenovirus (por exemplo, adenovirus canino 2), para transitoriamente transduzir células eucarióticas e expressar a proteina (Gluzman EA). Além disso, um agente de transfecção pode ser utilizado, como dioleoil-fosfatidil-etnolamina (DOPE).

O isolamento e purificação de polipeptideo recombinante expresso podem ser efetuado por meios convencionais, incluindo cromatografia preparativa (por exemplo, por exclusão de tamanho, troca iônica, afinidade), a precipitação seletiva e ultra-filtração. Exemplos das técnicas do estado da arte que pode ser usadas, mas não estão limitadas, podem ser encontrados em "Protein Purification Applications", Segunda Edição, Editado por Simon Roe e disponivel em Oxford University Press. Tal polipeptideo recombinantemente expresso é parte da presente invenção. Os métodos para a produção de qualquer polipeptideo de acordo com a presente invenção, conforme descrito acima, também são englobados, em particular o uso de um vetor de expressão recombinante compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e de uma célula hospedeira.

As vacinas contendo vetores virais recombinantes de acordo com a invenção podem ser liofilizadas, vantajosamente com um estabilizador. A liofilização pode ser feita de acordo com procedimentos de liofilização padrões bem conhecidos. Os estabilizadores farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis podem ser carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacarose, glicose, dextrano, trealose), glutamato de sódio (Tsvetkov T et al; Israeli E et al), proteínas como peptona, albumina, lactoalbumina ou caseína, proteina contendo agentes tais como leite desnatado (Mills C. K. et al.; Wolff E et al. ) e tampões (por exemplo, tampão fosfato, tampão de fosfato de metal alcalino). Um adjuvante pode ser usado para solubilizar as preparações liofilizadas.

Qualquer composição de vacina, de acordo com a invenção, pode vantajosamente também conter um ou mais adj uvantes.

As vacinas à base de plasmideo podem ser formuladas com lipídeos catiônicos, vantajosamente com DMRIE (N-(2- hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1- propanamônio; WO96/34109), e vantajosamente em associação com um lipídeo neutro, por exemplo, DOPE (dioleoil- fosfatidil-etanolamina; Behr J. P.), a fim de formar DMRIE- DOPE. Em uma modalidade, a mistura é feita extemporaneamente, e antes de sua administração, é vantajoso esperar cerca de 10 min até cerca de 60 minutos, por exemplo, cerca de 30 min, para a complexação apropriada da mistura. Quando DOPE é utilizada, a proporção em peso de DMRIE/DOPE pode ser de 95/5 a 5/95, e é vantajosamente 1/1. A proporção em peso de plasmídeo/DMRIE ou DMRIE-adjuvante DOPE é, por exemplo, de 50/1 a 1/10, de 10/1 a 1/5 ou de

Opcionalmente, uma citocina pode ser adicionada à composição, especialmente GM-CSF ou citocinas induzindo Thl (por exemplo, IL12). Estas citocinas podem ser adicionadas à composição como um plasmideo que codifica a proteina de citocina. Em uma modalidade, as citocinas são de origem canina, por exemplo, GM-CSF canina cuja sequência gênica foi depositada no banco de dados GenBank (número de acesso S49738). Esta sequência pode ser usada para criar o referido plasmideo em uma maneira similar ao que foi feito em WO 00/77210.

A vacina à base de vetor virai recombinante pode ser combinada com fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanina; US 6.017.537) e/ou adjuvante Carbomer (Phameuropa Vol. 8, No. 2, junho de 1996.). As pessoas versadas na técnica podem se referir também à US 2.909.462, que descreve tais polimeros acrílicos reticulados com um composto poliidroxilado tendo pelo menos 3 grupos hidroxila, vantajosamente não mais do que 8, os átomos de hidrogênio de pelo menos três hidroxilas sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados radicais com pelo menos 2 átomos de carbono. Por exemplo, os radicais são aqueles contendo de 2 a 4 átomos de carbono, por exemplo, grupos vinil, alil e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem por si só conter outros substituintes, tais como metil. Os produtos vendidos com o nome de Carbopol® (BF Goodrich, Ohio, EUA) são apropriados. Os produtos são reticulados com alil sacarose ou com alil pentaeritritol. Dentre estes, podem ser vantajosamente mencionados Carbopol® 974P, 934P e 971P.

Entre os copolimeros de anidrido maleico e derivados alquenila, os copolimeros EMA® (Monsanto), que são copolimeros de anidrido maleico e etileno, lineares ou reticulados, por exemplo, reticulados com éter divinílico, são vantajosos. Pode ser feita referência a J. Fields et al.

Os polimeros de ácido acrilico ou metacrilico e os copolimeros EMA® são formados, por exemplo, de unidades básicas da seguinte fórmula, na qual:- RI e R2, que são idênticos ou diferentes, representam H ou CH3- x = 0 ou 1, de preferência x = 1- y = 1 ou 2, com x + y = 2Para os copolimeros EMA®, x = 0 e y = 2. Para os carbômeros, x = y = 1.

A dissolução desses polimeros em água leva a uma solução ácida, que é neutralizada, vantajosamente até pH fisiológico, a fim de fornecer a solução adjuvante em que a vacina em si é incorporada. Os grupos carboxila do polimero estão, deste modo, parcialmente na forma COO-.

Em uma modalidade, uma solução de adjuvante, especialmente de carbômero (Pharmeuropa, vol. 8, N °2, junho de 1996), é preparada em água destilada, vantajosamente na presença de cloreto de sódio, sendo a solução obtida em um pH ácido. Esta solução estoque é diluida pela adição a ela da quantidade desejada (para a obtenção da concentração final desejada), ou uma parte substancial sua, de água carregada com NaCl, vantajosamente salina fisiológica (NaCl 9 g/L) , tudo de uma só vez, em várias porções com neutralização concomitante ou subsequente (pH 7,3 a 7,4), vantajosamente com NaOH. Esta solução em pH fisiológico é utilizada para misturar com a vacina, que pode ser especialmente armazenada na forma liofilizada, liquida ou congelada.

A concentração de polimero na composição final da vacina pode ser de 0,01% a 2% p/v, de 0,06 a 1% p/v, ou de 0,1 a 0,6% p/v.

A sub-unidade da vacina pode ser combinada com adjuvantes, como emulsões óleo em água, água-em-óleo-em- água à base de óleo mineral e/ou óleo vegetal e tensoativos não-iônicos, tais como copolimeros em bloco, Tween®, Span®. Estas emulsões são notoriamente aquelas descritas na página 147 de "Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 1995 ou emulsões TS, notoriamente a emulsão TS6, e emulsões LF, notoriamente emulsão LF2 (para ambas as emulsões TS e LF, ver WO 04/024027). Outros adjuvantes adequados são, por exemplo, vitamina E, saponinas, e Carbopol® (Noveon; ver WO 99/51269; WO 99/44633), hidróxido de aluminio ou fosfato de aluminio ("Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, 1995), adjuvantes biológicos (isto é, C4b, notoriamente C4b murino (Ogata R. T. et al.), ou C4b equino, GM-CSF, notoriamente GM-CSF equino (US 6.645.740)), toxinas (isto é, toxinas de cólera CTA ou CTB, toxinas termolábeis de Escherichia coli LTA ou LTB (Olsen C W et al;. Fingerut E et al.; Zurbriggen R et al. Peppoloni S et al.'l, e CpG (isto é, CpG #2395 (ver Jurk M et al.)r CpG #2142 (ver SEQ. ID. NO: 890 em EP 1.221.955)) .

A vacina também pode conter ou compreender um ou mais antigenos de Leishmania, por exemplo, a proteina de membrana de cinetoplastídeo 11 (KMP11).

Antígenos de Leishmania KMP11 são derivados, por exemplo, de L. infantum ou L. chagasi. KMP11 é uma proteina de membrana de superfície altamente conservada presente em todos os membros da família Kinetoplastidae, e é diferencialmente expresso tanto em formas amastigotas quanto promastigotas de Leishmania (Jardim A. et al;. Jardim A. et al; . Berberich C. et al. ). A sequência de ácidos nucleicos do gene e a sequência de aminoácidos da proteína KMP11 de Leishmania são disponíveis em bases de dados públicas, notoriamente L. infantum no banco de dados GenBank, sob os números de adesão X95627 e X95626. A sequência de ácido nucleico de L. donovani também está disponível a partir do banco de dados GenBank, notoriamente sob o número de acesso S77039.0 estado da técnica considerando KMP11, vetores expressando KMP11 e vacinas são mais bem resumidos no pedido de patente WO 08/064181. Uma vacina à base de plasmideo compreendendo pVR1020 KMP11 é descrita no exemplo 1 e a vacina de base do vetor do vírus canarypox compreendendo vCP2350 está descrita no exemplo 3. WO 08/064181 também dá informações considerando adjuvantes, formulação, dose e via de administração.

Polipeptídeos KMP11 e variantes ou fragmentos dos mesmos podem ser produzidos, isolados e purificados da mesma forma estabelecida para a expressão in vitro de polipeptideos salivares de borrachudos.

Em uma modalidade, a vacina compreende polipeptideos salivares de Lu. longipalpis e/ ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo um polinucleotideo codificando os polipeptideos e/ou variantes de Lu. longipalpis ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo KMP11 codificando o polipeptideo KMP11 e/ou fragmentos ou variantes dos mesmos de Leishmania. Em um exemplo especifico, não-limitativo desta modalidade, o polipeptideo salivar de Lu. longipalpis inclui um polipeptideo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87. Em outro exemplo especifico não-limitativo desta modalidade, o polinucleotideo codifica um polipeptideo salivar de Lu. longipalpis que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo com uma sequência conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 , 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87. Em ainda outro exemplo não-limitativo especifico, o polinucleotideo tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, 96%, 97%, 98 % ou 99% a um polinucleotideo com uma sequência conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 2, 4, 6, 8, 12,.14, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ou 91.

Em uma modalidade particular, a vacina compreende polipeptideos LJM17 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo codificando o polipeptideo LJM17 de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo KMP11 codificando o polipeptideo KMP11 e/ou fragmentos ou variantes dos mesmos de Leishmania. Por exemplo, os vetores da para LJM17 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJM17, pNB0002, vCP2390, VCP2390-SEQ ID NO: 6 e MVA-LJM17. Os vetores para KMP11 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR1020 KMP11 e vCP2350. Em uma modalidade, a vacina compreende plasmideos pVR2001 LJM17 e pVR1020 KMP11. Em outra modalidade, a vacina compreende vetores vCP2390 e vCP2350. Em ainda outra modalidade, a vacina compreende os plasmideos pNBO002 e pVR1020 KMP11. Em ainda outra modalidade, a vacina compreende VCP2390-SEQ ID NO: 6 e VCP2350.

Em outra modalidade particular, a vacina compreende polipeptídeos LJL143 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo codificando o polipeptideo LJL143 de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo codificando polipeptídeos KMP11 de Leishmania e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos. Por exemplo, os vetores para LJL143 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJL143, pNBG003, VCP2389, vCP2389-SEQ ID NO: 2 e MVA-LJL143. Os vetores para KMP11 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR1020 KMP11 e VCP2350. Em uma modalidade, a vacina compreende plasmideos pVR2001 LJL143 e pVR1020 KMP11. Em outra modalidade, a vacina compreende vetores VCP2389 e VCP2350. Em ainda outra modalidade, a vacina compreende os plasmideos pNBO003 e pVR1020 KMP11. Em ainda outra modalidade, a vacina compreende vetores VCP2389-SEQ ID NO: 2 e vCP2350.

Em outra modalidade particular, a vacina compreende polipeptideos LJL143 salivares de Lu. longipalpis, variantes suas, fragmentos seus e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo codificando o polipeptideo LJL143 de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou polipeptideos LJM17 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo LJM17 codificando o polipeptideo LJM17 de Lu. Longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou polipeptideos KMP11 de Leishmania e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo ou gene KMP11. Por exemplo, os vetores para LJL143 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJL143, pNBO003, VCP2389, VCP2389-SEQ ID NO: 2 e MVA-LJL143. Os vetores para LJM17 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJM17, pNBO002, VCP2390, VCP2390-SEQ ID NO: 6 e MVA-LJM17. Os vetores para KMP11 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR1020 KMP11 e VCP2350. Em uma modalidade, a vacina compreende os plasmideos pVR2001 LJL143, pVR2001 LJM17 e pVR1020 KMP11. Em outra modalidade, a vacina compreende os vetores vCP2389, vCP2390 e vCP2350. Em ainda pNB0003, pNBO002 e pVR1020 KMP11. Em outra modalidade, a vacina compreende os vetores VCP2389-SEQ ID NO: 2, vCP2390- SEQ ID NO: 6 e vCP2350.

A vacina também pode estar associada com pelo menos um antigeno de Leishmania, por exemplo, Leishmania inativada.

Em uma modalidade particular, a cepa de Leishmania pode ser Leishmania infantum, e/ou Leishmania braziliensis. Em uma modalidade preferida, a cepa de Leishmania pode ser Leishmania braziliensis.

Essas cepas de Leishmania podem ser inativadas por métodos quimicos ou fisicos. Os métodos quimicos são notavelmente BPL formaldeido. Os métodos fisicos podem ser notavelmente ultra-som. Um método para inativar Leishmania para uso em uma vacina é descrito em R. Cordeiro Giunchetti et al., Vaccine, 2007. As formas promastigotas são cultivadas em meio NNN/LIT por 6 a 14 dias, porém mais preferivelmente 10 dia, até a diferenciação entre a forma prociclica promastigota na forma metaciclica promastigota ser conseguida com base na observação microscópica. A cultura pode então ser colhida por centrifugação (2000xg, 20 minutos, 4 °C).

Quando aplicável, o sobrenadante é descartado e a biomassa é lavada três vezes em tampão salina. Seja a cultura for clarificada ou não, a suspensão de promastigotos (isto é, a cultura bruta ou promastigoto ressuspenso em tampão de solução salina após centrifugação) é subsequentemente rompida por tratamento com ultra-som com uma potência de 10 a 375W, mas de preferência mais de 40W, por 1 minuto, a 0 °C. O volume de lote para este tratamento está entre 5 e 150 mL, preferivelmente 30 mL. Após o tratamento, o lisado pode ser armazenado a -80 ° C.

A formulação da vacina pode ser preparada a partir do concentrado de proteina que é obtido após a lise celular. A quantidade de proteina lisada que pode ser usada para a vacinação de um cachorro é de cerca de 50 mg a cerca de 2000 mg, de preferência de cerca de 50 mg a cerca de 600 mg. A concentração de proteina é determinada de acordo com o método de Lowry.

A vacina de Leishmania inativada pode ser combinada com adjuvantes, como os descritos anteriormente para as vacinas de sub-unidade.

Em uma modalidade, a vacina compreende polipeptídeos salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores que compreendem o polinucleotideo salivar de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou Leishmania inativada. Em um exemplo específico, não-limitante desta modalidade, o polipeptideo salivar de Lu. longipalpis inclui um polipeptideo tendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com um polipeptideo tendo uma sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87. Em outro exemplo não-limitante especifico desta modalidade, o polinucleotideo codifica uma polipeptideo salivar de Lu. longipalpis que tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade sequencial com um polipeptideo com uma sequência conforme estabelecida nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 , 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87. Em ainda outro exemplo não-limitante especifica, o polinucleotideo tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, 96%, 97%, 98 % ou 99% com um polinucleotideo tendo uma sequência conforme estabelecida nas SEQ IDs NOs: 2, 4, 6, 8, 12, 14, 16, 18,21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48,50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78,80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 ou 91.

Em uma modalidade particular, a vacina compreende polipeptídeos LJM17 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo LJM17 e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou Leishmania inativada. Por exemplo, os vetores para LJM17 podem ser selecionados dentre os grupos consistindo de pVR2001 LJM17, pNBO002, VCP2390, VCP2390-SEQ ID NO: 6 e MVA-LJM17, e podem ser combinados com Leishmania inativada selecionada do grupo consistindo Leishmania infantum e/ou Leishmania braziliensis inativadas por ultra-som. Por exemplo, em uma modalidade, a vacina compreende o vetor VCP2390 e Leishmania braziliensis inativada por ultra-som. Em outra modalidade, a vacina compreende o vetor vCP2390-SEQ ID NO: 6 Leishmania braziliensis inativada por ultra-som.

Em outra modalidade particular, a vacina compreende polipeptídeos LJL143 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo LJL143 e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou Leishmania inativada. Por exemplo, os vetores para LJL143 podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJL143, pNBO003, VCP2389, VCP2389-SEQ ID NO: 2 e MVA-LJL143. A Leishmania inativada pode ser selecionada do grupo consistindo de Leishmania infantum e/ou Leishmania braziliensis inativada por ultra- som. Por exemplo, em uma modalidade, a vacina compreende o vetor vCP2389 e Leishmania braziliensis inativada por ultra-som. Em outra modalidade, a vacina compreende o vetor vCP2389-SEQ ID NO: 2 e Leishmania braziliensis inativada por ultra-som.

Em outra modalidade particular, a vacina compreende polipeptideos LJL143 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo LJL143 e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou polipeptideos LJM17 salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou vetores compreendendo o polinucleotideo LJM17 e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, e/ou Leishmania inativada. Por exemplo, os vetores poderiam ser selecionados de LJL143 do grupo consistindo de pVR2001 LJL143, pNBO003, vCP2389, VCP2389-SEQ ID NO: 2 e MVA- LJL143. Para LJM17, os vetores podem ser selecionados do grupo consistindo de pVR2001 LJM17, pNBO002, VCP2390, VCP2390-SEQ ID NO: 6 e MVA-LJM17. A Leishmania inativada pode ser selecionada do grupo consistindo de Leishmania infantum e/ou Leishmania braziliensis inativada por ultra- som. Em uma modalidade, a vacina compreende vetores vCP2389 e vCP2390 e Leishmania braziliensis inativada por ultra- som. Em outra modalidade, a vacina compreende vetores VCP2389-SEQ ID NO: 2 e vCP2390-SEQ ID NO: 6 e Leishmania braziliensis inativada por ultra-som.

Outro aspecto da presente invenção se refere aos métodos de vacinação de um hospedeiro contra Leishmania usando as composições de vacina aqui reveladas.

O hospedeiro pode ser qualquer um ou todos dentre seres humanos, felinos (por exemplo, gatos domesticados, gatos pequenos, gatos grandes e gatos selvagens) e caninos (por exemplo, cães, cadelas, cachorrinhos, raposas, chacais e lobos). Em uma modalidade, o hospedeiro é um canino.

As vias de administração podem ser, por exemplo, por via intramuscular (IM) ou intradérmica (ID) ou transdérmica (TD) ou subcutânea (SC) . Os meios de administração podem ser, por exemplo, com uma seringa com uma agulha, ou um aparelho livre de agulhas, ou uma seringa com uma agulha acoplada ao tratamento de eletrotansferência (ET), ou aparelho sem agulha acoplado ao tratamento ET.

Outro aspecto da invenção refere-se a utilização de uma vacina à base de plasmideo de acordo com a presente invenção para a administração à Leishmania, um hospedeiro, em que esta administração é acoplada ao tratamento ET. A administração de uma vacina baseada em plasmideo é vantajosamente intramuscular. Os meios de administração são, por exemplo, uma seringa e uma agulha. Uma ou várias injeções podem ser administradas sucessivamente. No caso de várias injeções, elas podem ser realizadas com de 2 a 6 semanas de intervalo, por exemplo, cerca de 3 semanas de intervalo. Em uma modalidade, um reforço semi-anual ou um reforço anual é ainda administrado.

Para vacinas à base de plasmideo, vias vantajosas de administração podem ser ID ou IM. Esta administração pode ser através do uso de uma seringa com uma agulha ou com um aparelho sem agulha como Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, EUA) ou Vetjet™ (Merial) ou Vitajet™ (Bioject Inc.), ver US 2006/0034867. A dosagem pode ser de 50 mg a 500 mg por plasmideo. Quando DMRIE-DOPE é adicionado, 100 mg por plasmideo podem ser utilizados. Quando GM-CSF canino ou outras citocinas são usadas, o plasmideo que codifica esta proteina pode estar presente em uma dosagem de cerca de 200 μg a cerca de 500 μg e pode ser vantajosamente 200 μg. 0 volume de doses pode variar entre 0,01 mL e 0,5 mL, por exemplo, 0,25 mL. A administração pode ser fornecida com múltiplos pontos de injeção.

Alternativamente, as vacinas à base de plasmideo podem ser administradas por via IM acoplada ao tratamento de eletrotransferência (ET) . 0 tratamento ET pode ser realizado utilizando um aparelho para eletrotransferir e as especificações do fabricante (ou seja, Sphergen G250 generator (Sphergen SARL, Evry Genopole, França); Sistema de eletroporação de DNA MedPulser® (Innovio Biomedical Corporation, São Diego, Califórnia, EUA)) . Em uma modalidade, o aparelho para eletrotransferência tem um campo unipolar. A intensidade do campo pode ser de cerca de 50 até cerca de 250 V/cm, de cerca de 50 a cerca de 200 V/cm, ou de cerca de 50 a cerca de 175 V/cm. A duração do pulso pode ser de cerca de 1 a 50 msec, ou de cerca de 15 a 25 msec. A frequência pode ser de cerca de 1 a 50 Hz, ou de cerca de 5 a cerca de 15 Hz. 0 intervalo interpulso pode ser de cerca de 1 a 1000 mseg, ou de cerca de 1 a cerca de 200 ms. O número de pulsos pode ser 1 a 20, ou de 5 a 10. A intensidade intra tecidual pode ser vantajosamente de até cerca de 2 A. A distância entre os eletrodos pode ser de cerca de 0,2 a cerca de 1 cm, ou de cerca de 0,2 a cerca de 0,5 cm.Para as vacinas à base de vetor viral, as vias de administração podem ser vantajosamente SC ou IM ou TD ou ID. Esta administração pode ser feita por uma seringa com uma agulha ou com um aparelho sem agulha como Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, EUA) ou Vetjet™ (Merial) ou Vitajet™ (Bioject Inc.). A dosagem pode ser de cerca de 103 UFP até cerca de 109 UFP por vetores poxvirus recombinantes. Quando o vetor é um virus canarypox, a dose pode ser, por exemplo, de cerca de 105 UFP até cerca de 109 UFP, ou de cerca de 106 UFP até cerca de 108 UFP. O volume de doses pode ser de cerca de 0,01 mL a 0,2 mL, e é vantajosamente 0,1 mL. Administração pode compreender múltiplos pontos de injeção.

Para a via IM, o volume da vacina fornecido pode ser de 0,2 a 2 ml, em especial de cerca de 0,5 a 1 mL. As mesmas dosagens são utilizadas para qualquer um dos vetores da presente invenção.

No caso das vacinas de sub-unidade, a via de administração pode ser vantajosamente via SC ou IM ou TD ou ID. Esta administração pode ser feita por uma seringa com uma agulha ou com um aparelho isento de agulha como Dermojet ou Biojector (Bioject, Oregon, EUA) ou Vetjet™ (Merial) ou Vitajet™ (Bioject Inc.). A dosagem pode ser de cerca de 50 a cerca de 500 μg, em particular de cerca de 50 a cerca de 150 μg, e mais particularmente de cerca de 50 a cerca de 100 μg. 0 volume da vacina de sub-unidade fornecido é 0,2 a 2 mL, em particular de cerca de 0,5 a 1 mL.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma estratégia de vacina, que é baseada em um regime de administração inicial de reforço, onde a administração inicial e a(s) administração/administrações de reforço utiliza(m) uma composição compreendendo um excipiente, diluente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, e um vetor de expressão in vivo compreendendo uma sequência de polinucleotideos, que contém e expressa o polipeptideo e/ou variantes salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos.

A presente invenção refere-se ao uso de vetores de expressão in vivo em um regime de administração inicial-de reforço, compreendendo uma administração inicial de uma vacina compreendendo um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma sequência de polinucleotideos para expressão, in vivo, de polipeptídeos salivares de Lu. longipalpis e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, seguido por uma administração de reforço de uma vacina compreendendo um veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, um vetor de expressão in vivo contendo uma sequência de polinucleotideos para expressar, in vivo, polipeptídeos Lu. longipalpis de borrachudo e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos, conforme descrito acima, para proteger uma hospedeiro da leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença em hospedeiros infectados.

Um regime inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial e pelo menos uma administração de reforço usando pelo menos um polipeptideo comum e/ou variantes ou fragmentos dos mesmos. A vacina usada na administração inicial pode ser de natureza diferente daquelas usadas como uma vacina de reforço posterior. A administração inicial pode compreender uma ou mais administrações. Da mesma forma, a administração de reforço pode compreender uma ou mais administrações.As vias de administração, doses e volumes são conforme divulgado anteriormente aqui.

As administrações inicial de reforço podem ser vantajosamente realizadas com 2 a 6 semanas de intervalo, por exemplo, cerca de 3 semanas de intervalo. De acordo com uma modalidade, um reforço semi-anual ou um reforço anual, vantajosamente com a vacina à base de vetor virai, também está previsto. Os animais são vantajosamente de pelo menos 6 a 8 semanas de idade na época da primeira administração.

Em uma modalidade particular, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmídeo de acordo com a presente invenção e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor viral recombinante de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade particular, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor virai recombinante de acordo com a presente invenção, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de sub- unidade de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade particular, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor virai recombinante de acordo com a presente invenção e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideos de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um método de vacinação de um indivíduo suscetível à Leishmania compreendendo um regime de administração inicial de reforço em que o dito regime compreende uma administração inicial de uma vacina que compreende, em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável contendo um polinucleotideo para expressar, in vivo, um polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, uma variante ou fragmento do polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, ou uma mistura dos mesmos, seguido por uma administração de reforço de uma vacina que compreende, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, um vetor viral recombinante compreendendo urn polinucleotideo para expressar, in vivo, o(s) mesmo(s) polipeptideo(s) salivar(eS) de Lu. longipalpis (s) , variantes da mesma, fragmentos seus, para proteger o individuo de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença no individuo infectado.

Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método de vacinação de um individuo suscetível à Leishmania compreendendo uma administração inicial de reforço em que o referido regime compreende uma administração inicial de uma vacina que compreende, em um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, um vetor virai recombinante compreendendo um polinucleotideo para expressar, in vivo, um polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, uma variante ou fragmento do polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, ou uma mistura dos mesmos, seguido por uma administração de reforço de uma vacina que compreende, em um veiculo ou excipiente farmaceuticamente o veterinariamente aceitável, um plasmídeo contendo um polinucleotideo para expressar, in vivo, o(s) mesmo(s) polipeptideo(s) salivar(es) de Lu. longipalpis, variante(s) do(s) mesmo(s), fragmento(s) do(s) mesmo(s) para proteger o individuo de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença no indivíduo infectado.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção refere- se a um método de vacinação de um indivíduo suscetível à Leishmania compreendendo um regime de administração inicial-de reforço em que o referido regime compreende uma administração inicial de uma vacina, que compreende, em um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, um vetor virai recombinante compreendendo um polinucleotideo para expressar, in vivo, um polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, uma variante ou fragmento do polipeptideo salivar de Lu. longipalpis, ou uma mistura dos mesmos, seguida por uma administração de reforço de uma vacina que compreende, em um veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, o(s) mesmo(s) polipeptideo(s) salivar(es) de Lu. longipalpis variante(s) do mesmo, fragmento(s) do mesmo para proteger o indivíduo de leishmaniose e/ou prevenir a progressão da doença no indivíduo infectado.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJM17 ou pNBO002, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina baseada no vetor vCP2390 ou vCP2390-SEQ ID NO: 6.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 ou pNBO003, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina baseada no vetor vCP2389 ou vCP2389-SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 e LJM17 pVR2001, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor vCP2389 e vCP2390.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pNBO003 e pNBO002, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor VCP2389-SEQ ID NO: 2 e VCP2390-SEQ ID NO: 6.

Em ainda outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo de pVR2001LJM17 ou pNBO002, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor MVA-LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 ou pNBO003, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor MVA-LJL143.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 e pVR2001 LJM17, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de vetor MVA-LJL143 e MVA-LJM17.

Em ainda outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de plasmideo pNBO003 e pNBO002, e pelo menos uma administração de reforço da administração de uma vacina à base de vetor MVA-LJL143 e MVA-LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor VCP2390 ou VCP2390-SEQ ID NO: 6, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de subunidade polipeptidica LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor VCP2389 ou vCP2389-SEQ ID NO: 2, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de subunidade de polipeptideo LJL143.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor vCP2389 ou vCP2389-SEQ ID NO: 2 e vCP2390 ou vCP2390-SEQ ID NO: 6, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de subunidade de polipeptideo LJL143 e polipeptideo LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA-LJM17, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de subunidade de polipeptideo LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA-LJL143, e pelo menos uma administração de reforço de vacina de subunidade polipeptidica LJL143.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA LJL143 e MVA-LJM17, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina de subunidade de polipeptideo LJL143 e de polipeptideo LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor VCP2390 ou VCP2390-SEQ ID NO: 6, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base do plasmídeo pVR2001 LJM17 ou pNBO002.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor vCP2389 ou VCP2389-SEQ ID NO: 2, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 ou pNB0003.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor VCP2389 ou VCP2390, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 e pVR2001 LJM17.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor vCP2389-SEQ ID NO: 2 e vCP2390-SEQ ID NO: 6, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideo pNBO003 e pNBO002.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA-LJM17, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJM17 ou pNBO002.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial-de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA-LJL143, e pelo menos uma administração de reforço de uma vacina à base de plasmideo pVR2001 LJL143 ou pNBO003.

Em outra modalidade, o regime de administração inicial de reforço compreende pelo menos uma administração inicial de uma vacina à base de vetor MVA LJL143 e pelo menos uma administração de reforço de vacina à base de plasmideo pNBO003 e pNBG002.

Outro aspecto da presente invenção se refere a um kit de vacinação inicial de reforço de acordo com a presente invenção. O kit pode compreender, pelo menos, dois frascos: um primeiro frasco contendo uma vacina para a vacinação inicial de acordo com a presente invenção, e um segundo frasco contendo uma vacina a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção. O kit pode conter vantajosamente o primeiro ou segundo frascos adicionais para as vacinações iniciais adicionais ou as vacinações de reforço adicionais.

Em uma modalidade, o kit pode incluir dois frascos, um contendo uma vacina à base de plasmideo, para a vacinação inicial de acordo com a presente invenção, o outro frasco contendo uma vacina à base de vetor virai recombinante para a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade, o kit pode compreender dois frascos, um contendo uma vacina à base de vetor virai recombinante de acordo com a presente invenção, o outro frasco contendo uma vacina de sub-unidade para a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção.

Em outra modalidade, o kit pode compreender dois frascos, um contendo uma vacina à base de vetor virai recombinante para a vacinação inicial de acordo com a presente invenção, o outro frasco contendo uma vacina à base de plasmideo para a vacinação de reforço de acordo com a presente invenção.

É aqui revelado que as pessoas que experimentam uma conversão de resposta DTH anti-Leishmania também têm um aumento de anticorpos contra as proteinas salivares de Lu. longipalpis. Deste modo, a presença ou ausência de anticorpos para as proteinas salivares de Lu. longipalpis pode ser usada para determinar se um individuo tem uma infecção por Leishmania.

Um método é divulgado aqui para diagnosticar infecção com Leishmania, detectando a presença de anticorpos que se ligam especificamente a um ou mais polipeptideos tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87, ou um polipeptideo tendo pelo menos 80%, pelo menos, 90%, pelo menos, 95% ou, pelo menos 99% de homologia com um destes polipeptideos, uma variante conservadora, um homólogo ou um fragmento imunogênico de um destes polipeptideos. O método pode utilizar um único polipeptideo de Lu. longipalpis ou uma combinação destes polipeptideos. Em certos exemplos, o método de diagnóstico detecta anticorpos que se ligam especificamente a pelo menos 3, 6 ou 10 destes polipeptideos, ou fragmentos imunogênicos destes.

Em uma modalidade, uma ou mais polipeptideos Lu. longipalpis podem ser ligados a um substrato sólido. Por exemplo, o polipeptideo Lu. longipalpis tendo uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87 pode ser ligado ao substrato. Um ou mais destes polipeptideos podem ser ligados ao substrato, por exemplo, pelo menos, 3, 6 ou 10 destes polipeptideos, ou um fragmento imunogênico seu. Em um exemplo, um ou mais polipeptideos tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17, 25, 33, 39, 47 ou 77 pode ser ligado ao substrato. Em outro exemplo, um ou mais polipeptideos Lu. longipalpis tendo uma sequência conforme estabelecido nas SEQ IDs NOs: 1, 3, 5, 7, 11, 13, 15, 17 ou 57 pode ser ligado ao substrato. Em um exemplo especifico, não limitante, pelo menos seis polipeptideos Lu. longipalpis estão ligados a um substrato sólido, onde cada um dos polipeptídeos compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 1 (ou 3, ou 11, ou 13), SEQ ID NO: 5 (ou 7, ou 15 ou 17), SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 73 ou SEQ ID NO: 77, ou um fragmento imunogênico seu. Em outro exemplo específico não limitante, pelo menos três polipeptídeos Lu. longipalpis estão vinculados a um substrato sólido, em que cada um dos polipeptídeos compreende uma sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 (ou 3, ou 11, ou 13), SEQ ID NO: 5 (ou 7, ou 15 , ou 17), ou SEQ ID NO: 57, ou um fragmento imunogênico do mesmo.

Em uma modalidade, dois ou mais (por exemplo, pelo menos, 3, 6 ou 10) polipeptídeos Lu. longipalpis (ou fragmentos imunogênicos seus) são aplicados a um substrato sólido, por exemplo, como uma série de "pontos", como em um ensaio de dot blot. Em outra modalidade, dois ou mais polipeptídeos Lu. longipalpis são aplicados ao substrato, como em um arranjo linear. Em uma outra modalidade, polipeptídeos Lu. longipalpis são aplicados a uma membrana em uma arranjo bidimensional. Desta forma, a presença de anticorpos a mais de um polipeptideo Lu. longipalpis é avaliada. Cada polipeptideo Lu. longipalpis pode ser aplicado diretamente à superfície de uma membrana em um único local ou em uma combinação de locais.

O substrato sólido pode ser uma esfera de poliestireno, uma membrana, um chip ou uma placa. Um substrato de plástico ou de vidro pode ser utilizado. Em outras modalidades, é utilizada uma membrana que é composta de materiais porosos, tais como náilon, nitrocelulose, acetato de celulose, fibras de vidro e outros polimeros porosos. A superfície de um suporte sólido pode ser ativada por processos químicos que causam a ligação covalente do polipeptideo ao suporte. No entanto, qualquer outro método adequado pode ser utilizado para imobilizar um polipeptideo a um suporte sólido, incluindo, sem limitação, as interações iônicas, interações hidrofóbicas, interações covalentes e semelhantes. Uma vez que o polipeptideo é aplicado ao substrato, o substrato pode entrar em contato com uma substância, como uma solução contendo proteína, a qual satura não-especificamente os sítios de ligação nela. Exemplos específicos não-limitativos de uma solução contendo proteína incluem uma solução à base de leite em pó ou albumina de soro, tal como albumina de soro bovino.

Uma amostra (por exemplo, soro, sangue, plasma, urina, sêmen, saliva, escarro, fluido lacrimal, fluido linfático) é então adicionado ao substrato e a amostra e o substrato combinados são incubados por um tempo suficiente para permitir a ligação específica. A ligação de anticorpos específicos aos polipeptideos Lu. longipalpis aqui revelados é então detectada utilizando quaisquer meios conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, um anticorpo secundário marcado é usado para detectar os anticorpos que se ligam especificamente aos polipeptideos de Lu. longipalpis. O marcador pode ser um radiomarcado (por exemplo, 125I), um marcador enzimático (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano silvestre) ou um marcador fluorescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína). Sistemas de detecção para esses marcadores são conhecidos por uma pessoa versada na técnica. A ligação do espécime, ou um componente do espécime ao polipeptideo Lu. longipalpis, como indicado pela presença do marcador, indica infecção por Leishmania.

Em outra modalidade, o espécime é adsorvido em um substrato sólido que contém sítios de ligação para polipeptideos, como moléculas de anticorpos. Em uma modalidade, o substrato sólido é uma esfera de poliestireno, um chip, uma membrana ou uma placa. O substrato é posteriormente contatado com uma substância, tal como uma solução contendo proteína, que não satura especificamente os sítios de ligação nela. O substrato é a seguir lavado com um tampão. Uma solução de um ou mais polipeptideos de Lu. longipalpis é então adicionada ao espécime ligado, vinculado. Em uma modalidade, o polipeptideo de Lu. longipalpis é diretamente marcado. A marcação do polipeptideo de Lu. longipalpis pode ser provocada pelo uso de qualquer marcador, como pela incorporação de um isótopo ou grupo radioativo, ou por acoplamento deste componente a uma enzima, um corante, por exemplo, uma porção cromofórica ou um grupo fluorescente. As enzimas de uso são aquelas que podem ser determinadas por colorimetria, espectrofotometria ou fluorimetria. Exemplos não-limitativos de enzimas para uso na presente invenção incluem enzimas do grupo das oxidorredutases, como catalase, peroxidase, glicose oxidase, beta-glicuronidase, beta-D-glicosidase, beta-D-galactosidase urease e galactose oxidase. Após o polipeptideo de Lu. longipalpis marcado ser incubado com o substrato sólido, qualquer polipeptideo de Lu. longipalpis marcado não-ligado é removido por lavagem. Polipeptideo de Lu. longipalpis marcado ligado é então detectado por um ensaio adequado. A ligação do polipeptideo de Lu longipalpis marcado a um espécime, ou a um componente do espécime é indicativo de infecção com Leishmania.

Em geral, as etapas de incubação utilizadas na realização dos procedimentos podem ser realizadas de forma conhecida, como por incubação em temperaturas entre cerca de 4 °C e 25 °C, por cerca de 30 minutos até cerca de 48 horas. As lavagens podem ser incluídas com uma solução aquosa tal como um tampão, em que o tampão é de cerca de pH de 6 a cerca de pH 8, como pelo uso de uma solução salina isotônica de um pH de cerca de 7.

Ensaios de ligação competitivos também são de uso na detecção de infecção com Leishmania. Um técnico versado no assunto, dados os polipeptideos de Lu. longipalpis aqui revelados, será prontamente capaz de esboçar ensaios adicionais, tais como ensaios de ligação competitiva, de uso na detecção de infecção por Leishmania.

Em outra modalidade, os polipeptideos Lu. longipalpis aqui revelados podem ser incluídos em um kit de teste de diagnóstico. Por exemplo, um kit de teste de diagnóstico para detectar a infecção por Leishmania inclui um substrato sólido tendo nele aplicado um ou mais polipeptideos Lu. longipalpis aqui revelados. Em outras modalidades, o kit inclui instruções escritas e/ou um recipiente incluindo uma quantidade específica de anticorpos marcados para imunoglobulinas, tais como IgG ou IgM, ou anticorpos secundários rotulados que se ligam aos anticorpos de uma espécie de interesse. Por exemplo, anticorpos marcados podem ser fornecidos que detectam especificamente imunoglobulinas de cachorro ou seres humanos. Os anticorpos marcados podem ser marcados por fluorescência, marcado com enzima ou radiomarcados. Anticorpos marcados usados nos kits de teste acima descritos podem ser empacotados em qualquer solução ou forma liofilizada adequada para a reconstituição.

Em outra modalidade, o kit de teste inclui uma quantidade especifica de um ou mais polipeptídeos de Lu. longipalpis aqui descritos em um recipiente, e instruções por escrito. Em um exemplo, o polipeptideo de Lu. longipalpis é diretamente marcado. Em outro exemplo, um ou mais polipeptídeos de Lu. longipalpis é não-marcado. Se o polipeptideo de Lu. longipalpis é não-marcado, um recipiente também pode ser incluido com um reagente de detecção, que se liga especificamente ao polipeptideo de Lu. longipalpis, tal como um anticorpo monoclonal marcado. O kit também pode incluir opcionalmente um substrato sólido para a ligação do espécime.

O processo e kit de teste acima descritos para detecção de anticorpos para os polipeptídeos de Lu. longipalpis aqui revelados podem ser utilizados em diversas aplicações incluindo, mas não limitado, à detecção de infecção por Leishmania em um indivíduo utilizando os métodos aqui revelados. Os testes e kits aqui revelados podem ser usados para detectar a eficácia de um tratamento terapêutico em um indivíduo. Em ainda outra modalidade, os testes e kits aqui revelados também podem ser usados para avaliar uma infecção primária por Leishmania ou para prever a recuperação da infecção por Leishmania, tomando um fluido corporal de um individuo infectado, por exemplo, em vários momentos após a infecção, e aplicando os procedimentos de detecção acima descritos.

A presente invenção irá agora ser adicionalmente descrita por meio dos seguintes exemplos não limitantes.EXEMPLOS

Sem elaboração adicional, acredita-se que um técnico versado no assunto pode, usando as descrições anteriores, praticar a presente invenção em toda a sua extensão. Os seguintes exemplos detalhados devem ser interpretados como sendo meramente ilustrativos, e não como limitações da revelação anterior de forma alguma. Técnicos versados no assunto irão reconhecer de imediato variações dos procedimentos, tanto como aos reagentes como com as condições técnicas reacionais.

A construção de inserções de DNA, os plasmideos e vetores virais recombinantes foram realizados utilizando as técnicas de biologia molecular padrões descritas por J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

Todos os fragmentos de restrição utilizados para a presente invenção foram isolados usando o kit "Geneclean" (BIO 101 Inc., La Jolla, Califórnia).EXEMPLO 1: Construção do plasmídeo pVR2001 LJM17 expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis

O polinucleotideo codificando o polipeptideo LJM17 de Lu. longipalpis é sintetizado e tem a sequência descrita em SEQ ID NO: 8, que contém a cauda poly(A). O fragmento LJM17 é amplificado por PCR e clonado no sítio de clonagem TOPO do plasmídeo doador pVR2001-TQPA (também referido como pVR2001-TOPO).

O plasmídeo resultante, pVR2001 LJM17, portanto, contém e expressa uma nucleotideo codificando um promotor capaz de direcionar a expressão em uma célula de mamífero, um peptideo líder para facilitar a secreção/liberação de uma sequência de proteína procariótica de uma célula de mamífero, LJM17, topoisomerases flanqueando o DNA que codifica LJM17, assim como uma sequência de terminação.

A sequência de ácido nucléico de uma fita do plasmídeo pVR2001 LJM17 é descrita na SEQ ID NO: 9 e na Figura 1, onde os sítios BamHI estão nas posições [4-9] e [5051- 5056] , a sequência de nucleotídeos codificando o peptideo de sinal tPA estando na posição [4976-5062] e a sequência de nucleotídeos codificando LJM17 está na posição [5063- 6247]. EXEMPLO 2: Construção do plasmideo pVR2001 LJL143 expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. longipalpis

O polinucleotideo codificando o polipeptideo LJL143 de Lu. longipalpis é sintetizado e tem a sequência descrita em SEQ ID NO: 4, que contém a cauda poly (A) . O fragmento LJL143 é amplificado por PCR e clonado no sitio de clonagem TOPO do plasmideo pVR2001-TOPA, conforme descrito no exemplo 1, para gerar o plasmideo pVR2001 LJL143.

A sequência de ácido nucléico de uma fita do plasmideo pVR2001 LJL143 é descrita na SEQ ID NO: 10 e na Figura 2, onde os sitios BamHI estão nas posições [4-9] e [5051- 5056], a sequência de nucleotídeos codificando o peptideo de sinal tPA está na posição [4976-5062] e a sequência de nucleotídeos codificando LJL143 está na posição [5063- 5899] .EXEMPLO 3: Construção de um vetor do vírus canarypox ALVAC expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis.

Para uma discussão e exemplos do plasmideo pALVAC, e o locus C3, ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.756.103, 5.833.975 e 6.780.407. A sequência do promotor H6 do virus vaccinia foi descrita anteriormente (ver, por exemplo, Taylor et al;. Taylor et al; Guo et al).

O polinucleotideo codificando o polipeptideo LJM17 de Lu. longipalpis é sintetizado e tem a sequência descrita na SEQ ID NO: 6. Este polinucleotideo é então ligado ao plasmideo doador pALVAC H6p C3 resultando em pALVAC C3 H6p- LJM17 contendo 5.737 pares de bases (Figura 3).

Para gerar VCP2390-SEQ ID NO: 6, o plasmideo pALVAC C3 H6p-LJM17 é linearizado com a enzima de restrição NotI. Os fragmentos linearizados foram individualmente transfectados em células CEF primárias infectadas por ALVAC usando o método de precipitação de fosfato de cálcio (ver Panicali et al; Piccini et al) . Após 24h, as células transfectadas são coletadas, submetidas ao ultra-som e utilizadas para a testagem de virus recombinante.

Placas recombinantes são examinadas com base no método de hibridização de elevação da placa usando uma sonda especifica para LJM17 de Lu. longipalpis, que é marcada com peroxidase de rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham # Cat RPN-3001). Após três ciclos sequenciais de purificação de placa, os recombinantes são gerados pela confirmação da hibridização como 100% positiva para a inserção LJM17 de Lu. longipalpis e 100% negativa para a ORF C3.

Uma única placa é selecionada do terceiro ciclo de purificação de placa e foi expandida para obter PI (60 mm), P2 (frascos T75), e os estoques P3 (garrafas cilíndricas) para amplificar vCP2390-SEQ ID NO: 6. O fluido de cultura de células infectada a partir de garrafas cilíndricas é colhido e concentrado para produzir estoque de vírus.

O constructo é sequenciado para confirmar as sequências da inserção de Lutzomyia longipalpis LJM17 e as ramificações esquerda e direita de C3 ao redor da inserção LJM17 de Lutzomyia longipalpis em VCP2390-SEQ ID NO: 6.

EXEMPLO 4: Construção de um vetor do vírus canarypox ALVAC expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. Longipalpis.

O polinucleotideo codificando o polipeptideo LJL143 de Lu. longipalpis é sintetizado e tem a sequência descrita em SEQ ID NO: 2. Essa sequência é então ligada a um plasmídeo doador pALVAC C3 H6p. O plasmídeo resultante, pALVAC C3 H6p-LJL143, compreende 5.400 pares de bases (Figura 5), e é sequenciado para confirmar a sequência de ácido nucléico (SEQ ID NO: 2) do gene LJL143.

Para gerar VCP2389-SEQ ID NO: 2, o plasmídeo pALVAC C3 H6p-LJL143 é linearizado com a enzima de restrição NotI. Os fragmentos linearizados são individualmente transfectados em células CEF primárias infectadas com ALVAC usando o método de precipitação de fosfato de cálcio (ver Panicali et al; Piccini et al). Após 24h, as células transfectadas são colhidas, submetidas ao ultra-som e utilizadas para a varredura de virus recombinante.

Placas de recombinação são varridas com base no método de hibridização da placa levantada usando uma sonda LJL-143 especifica de Lu. longipalpis que é marcada com peroxidase de rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham # Cat RPN-3001). Após três rodadas sequenciais de purificação de placa, os recombinantes são gerados pela confirmação da hibridação como 100% positivos para a inserção LJL143 de T,u. longipalpis e 100% negativos para a ORF C3.

Uma única placa é selecionada a partir da terceira rodada de purificação de placa e expandida para obter os estoques PI (60 mm), P2 (frascos T75) , P3 (garrafas cilindricas) para amplificar vCP2389-SEQ ID NO: 2. O fluido de cultura de células infectadas das garrafas cilindricas são colhidos e concentrados para produzir estoque de virus.

O constructo é sequenciado para confirmar as sequências da inserção de Lutzomyia longipalpis LJL143 e as ramificações da esquerda e da direita de C3 em torno da inserção de LJL143 de Lutzomyia longipalpis na VCP2389-SEQ ID NO: 2.EXEMPLO 5: Construção de um vetor MVA expressando o polipeptideo LJM17 salivar de .to, longipalpis^

MVA é uma cepa modificada Ankara obtidas depois de mais de 570 passagens da cepa da vacina Ankara em fibroblastos de embrião de galinha (ver Stickl & Hochstein- Mintzel; Sutter et al) disponíveis como ATCC VR-1508. Sua adaptação a essas células causou a excisão de 6 regiões que não são essenciais para o seu desenvolvimento e seu ciclo infeccioso em esse tipo de células (desaparecimento de cerca de 15% do genoma viral; Meyer et al) . Material genético exógeno pode ser inserido em qualquer uma destas regiões de excisão. No contexto da presente invenção, o material genético estrangeiro é inserido nas excisões II e III, que são localizadas usando os fragmentos de restrição HindIII N e A, respectivamente (Altenburger et al.).

A manipulação do virus recombinante MVA expressando LJM17 é realizada como descrito anteriormente em Staib C. et al., com exceção de que o fragmento de DNA de 723 pares de bases que contém a ORF gfp é substituída pelo fragmento de DNA de 1.239 pares de bases codificando o antigeno LJM17 (SEQ ID NO: 6), gerando MVA-LJM17.EXEMPLO 6: Construção de um vetor MVA expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. longipalpis

A construção do virus MVA recombinante expressando LJL143 é realizada como descrito anteriormente em Sfaib C. de bases contendo a ORF gfp é substituído pelo fragmento de DNA com 906 pares de base codificando o antígeno LJL143 (SEQ ID NO: 2), gerando MVA-LJL143.EXEMPLO 7: Expressão de proteína salivar de Lu. longipalpis in vitro

Plasmideos de expressão com antígenos salivares de Lu. longipalpis marcados com His codificados pelo DNAc derivado dos plasmideos pVR2001 LJM17 (ver exemplo 1) e pVR2001 LJL143 (ver exemplo 2) são construídos e transfectados em células HEK-293F. Os sobrenadantes coletados em 72 horas são analisados por cromatografia I-IPLC utilizando a coluna Nickel e gradiente de imidazol. As frações de HPLC positivas para a proteína recombinante salivar com a porção 6x His nos seus C-terminais são testadas com soros policlonais de camundongos previamente imunizados com os plasmideos de DNAc correspondentes originais. As proteínas recombinantes são testadas por SDS-PAGE e Western blotting, aliquotadas em PBS e armazenadas a -70 °C.

A vacina de sub-unidade compreendendo LJM17 é aqui referida como rLJM17. A vacina é preparada por combinação de 100 μg de proteína recombinante purificada LJM17 com 300 μg do adjuvante CpG jl-2142 em 20% de Emulsigen® (.Uaborat.órios MVP) (para CpG -II-21 42, ver SEO ID NO: 890 em

A vacina de sub-unidade compreendendo LJL143 é referida aqui como rLJL143. A vacina é preparada por combinação de 100 μg de proteina recombinante purificada LJL143 com 300 μg do adjuvante CpG #2142 em 20% de Emulsigen®.

EXEMPLO 8: Vacinação de cães contra a leishmaniose cães (beagles fêmeas de 1-2 anos) são divididos aleatoriamente em 5 grupos de 5 cães cada. Todos os cães dos grupos 1 a 4 são vacinados no DO (VI) pela via intradérmica (ID) na auricula da orelha usando uma seringa e uma agulha, com 500 μg de plasmideo pVR2001 LJM17 purificado (exemplo 1) expressando LJM17 (grupos 1 e 2) ou plasmideo pVR2001 LJL143 (exemplo 2) expressando LJL143 (grupos 3 e 4).

Os cães do grupo 1 e grupo 3 são reforçado em D14 (V2) e D28 (V3), com 500 μg dos mesmos plasmideos usados para VI pela via transdérmica (TD) na parte interna superior de ambas as patas traseiras com o dispositivo de distribuição sem agulha VetJet™ (Merial). Os cães do grupo 1 e do grupo 3 foram ainda reforçados no D42 (V4) com 500 μg dos mesmos plasmideos mesmo por via intramuscular acoplado a eletroporação (ET/TM.) no lado externo de ambas as coxas com o di spositivo e t.e< o<iia Spherqen (parâmetros: 8HV, TI - 20, T2 = 80, N = 10) .

Os cães dos grupos 2 e 4 são reforçados no D14 (V2) e D28 (V3), com 500 μg dos mesmos plasmideos utilizados para VI por via IM acoplado a eletroporação (ET/IM) , como descrito acima. Os cachorro dos grupos 2 e 4 são adicionalmente reforçados no D42 (V4), por via ID naauricula da orelha, tal como descrito acima, com vacinas de subunidade (ver exemplo 7) rLJM17 (grupo 2) ou rLJL143 (grupo 4), respectivamente.

Todos os cães dos grupos 1 e 2 recebem um reforço da vacina final D192 (V5) pela via IM no quadriceps esquerdo, com 108 UFP do virus recombinante canarypox VCP2390 (exemplo 3) expressando LJM17. Todos os cachorros dos grupos 3 e 4 recebem um reforço da vacina final em D192 (V5) pela via IM no quadriceps esquerdo, com 108 UFP do virus recombinante canarypox vCP2389 (exemplo 4) expressando LJL143.

Os cães do grupo 5 são vacinados com 500 μg do plasmideo purificado parental pVR2001 que não expressa o antigeno em DO por ID, D14 por TD, D28 por TD e D42 por ET/IM e recebem um reforço final D192 por via IM, com 108 UFP de um virus canarypox controle recombinante (Purevax™)- EXEMPLO 9: Construção do plasmideo pNBOOOZ expressando o pol:’.pepfci.d.eo LJM17 salivar de Lu. loxictípsl-pís

A sequência de ácidos nucléicos codificando o polipeptideo Lu. longipalpis LJM17 foi sintetizada e tem a sequência descrita em SEQ ID NO: 18 que contém a cauda poly(A). O fragmento LJM17 foi amplificado por PCR e clonado no sitio de clonagem TOPO do plasmídeo doador pVR2001-TOPA, como descrito no exemplo 1, para gerar o plasmídeo pNBO002.

A sequência de ácido nucléico de uma cepa do plasmídeo pNBO002 é descrita na SEQ ID NO: 19 e na Figura 11, onde os sítios BamHI estão em posições [1819-1824] e [3019-3024], a sequência de nucleotídeos codificando o peptideo sinal tPA está na posição [1744-1830] e a sequência de nucleotídeos codificando LJM17 está na posição [1831-3015] . 0 mapa do plasmídeo pNBO002 é mostrado na Figura 12.pNBG002 é análogo ao pVR2001 LJM17. Neste caso, este constructo e o constructo do exemplo 1 são identificáveis pela sequência de ácido nucléico de suas inserções, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

Exemplo 10: Construção do plasmídeo pNBO003 expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. Longipalpis1\ sequência de ácidos nucléicos codificando LJL143 de Lu. longipalpis foi sintetizada e tem a sequência descrita em SEQ TD NO; Oi, que contém a cauda po.l y (A) - O f ragmen l: o ir T, 1 q g. foi arnQ.i OioooOr o'C i’O'.: <- dorado io<:> rm o> c. do clonagem TOPO do plasmideo pVR2001 TOPA, conforme descrito no exemplo 1, para gerar o plasmideo pNBO003.

A sequência de ácido nucléico de uma cepa do plasmideo pNBO003 é descrita na SEQ ID NO: 20 e na Figura 13, onde os sitios BamHI estão nas posições [1819-1824] e [2671-2676], a sequência de nucleotideos codificando o peptideo sinal tPA está na posição [1744-1830] e a sequência de nucleotideos codificando LJL143 está na posição [1831- 2667]. O mapa do plasmideo pNBO003 é mostrado na Figura 14.pNBG003 é análogo ao pVR2001 LJL143. Neste caso, este constructo e o construct© do exemplo 2 são identificáveis pela sequência de ácido nucléico de suas inserções, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Exemplo 11: Construção de um vetor do virus canarypox ALVAC expressando o polipeptideo LJM17 salivar de Lu. longipalpis

Para a discussão e os exemplos do plasmideo pALVAC e do locus C3 ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.756.103; 5.833.975 e 6.780.407. A sequência do promotor H6 do virus vaccinia foi descrita anteriormente (ver, por exemplo, Taylor et al;. Taylor et al;.. Guo et al).

A sequência de ácidos nucléicos codificando o polipeptideo LJM17 de Lu. longipalpis foi sintetizada e tem a sequência descrita em SEO ID NO: 6. Esta sequêncici foi :/odorr~otinümada para a mimarão em mamíferos pela Genes rf GmbH (Regensburg, Alemanha), resultando na sequência descrita na SEQ ID NO: 91, que codifica o polipeptidio LJM15 (SEQ ID NO: 5) .

Esta sequência códon-otimizada foi então ligada ao plasmideo doador pALVAC H6p C3 para gerar pALVAC C3 H6p- LJM17 contendo 5.737 pares de bases (Figura 3). O plasmideo resultante, pALVAC C3 H6p-LJM17, foi sequenciado e confirmado como contendo a sequência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO: 91) do gene LJM17.

Para gerar VCP2390, o plasmideo pALVAC C3 H6p-LJM17 foi linearizado com a enzima de restrição Notl. Os fragmentos linearizados foram individualmente transfectados em células CEF primárias infectadas com ALVAC usando o método de precipitação de fosfato de cálcio descrito anteriormente (Panicali et al; Piccini et al) . Após 24h, as células transfectadas foram colhidas, submetidas ao ultra- som e utilizadas para a varredura do virus recombinante.

Placas recombinantes foram selecionadas com base no método de hibridização de elevação da placa usando uma sonda LJM17-especifica sintética de Lu. longipalpis que foi marcada com peroxidase de rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham Cat l|P%PN-3001) . Após três rodadas sequ^nr'i ais de purificação de placa. os ooconib.i u a ntes 7o i . nn ? i_ . । dos e 11 I; 1 rniades-; pçi' 5.1 b r i d, j ç,; 1 < •, como 100% positivos para a inserção LJM17 sintética e 100% negativos para a ORF C3.

Uma lâmina única foi selecionada a partir da terceira rodada de purificação de placa e expandiu-se para obter os estoques PI (60 mm), P2 (frascos T75), P3 (garrafas cilíndricas) para amplificar VCP2390. O fluido de cultura de células infectadas a partir de garrafas cilíndricas foi colhido e concentrado para produzir estoque virai.

O constructo foi sequenciado para confirmar as sequências da inserção LJM17 códon-otimizada e as ramificações esquerda e direita C3 em torno da inserção LJM17 códon-otimizada em vCP2390.

O vetor vCP2390 é ilustrado na Figura 4. As sequências de ácido nucléico para ambas as fitas de vCP2390 são descritas na Figura 4.

Exemplo 12: Construção de um vetor do vírus canarypox ALVAC expressando o polipeptideo LJL143 salivar de Lu. 1 ongipalpi s

A sequência de ácidos nucléicos codificando LJL143 de Lu. longipalpis foi sintetizada e tem a sequência descrita em SEQ ID NO: 2. Esta sequência foi códon-otimizada para a expressão de mamíferos pela Geneart GmbH (Regensburg,. Alemanha), resultando na sequência descrita em SEQ ID NO: '2, que codifica o proi.mio EJE! 4 '• (SEQ ff.) NQ: ,!q .

Esta sequência códon-otimizada foi então ligada ao plasmideo doador pALVAC C3 H6p resultando em pALVAC C3 H6p- LJL143 contendo 5.400 pares de bases (Figura 5), que foi sequenciado e confirmado como contendo a sequência de ácidos nucléicos (SEQ ID NO: 22) do o gene LJL143.

Para gerar vCP2389, o plasmideo pALVAC C3 H6p- plasmideo LJL143 foi linearizado com a enzima de restrição NotI. Os fragmentos linearizados foram individualmente transfectados em células CEE primárias infectadas com ALVAC usando o método de precipitação de fosfato de cálcio (ver Panicali et al; Piccini et al) . Após 24h, as células transfectadas foram colhidas, submetidas ao ultra-som e utilizadas para a varredura de virus recombinante.

Placas recombinantes foram varridas com base no método de hibridização de elevação de placa usando uma sonda LJL143 especifica sintética de Lu. longipalpis que foi marcado com peroxidase de rábano silvestre de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham Cat # RPN-3001). Após as três rodadas sequenciais de purificação de placa, os recombinantes foram gerados e confirmados por hibridação como 100% positivo parei a inserção LJL143 sintética e 100% negativo para a C3 ORF.

Uma placa única foi selccioriad<3 a partir da terceira estoques Pl (60 mm), P2 (frascos T75), P3 (garrafas cilíndricas) para amplificar vCP2389. O fluido de cultura de células infectadas a partir das garrafas cilíndricas oi colhido e concentrado para produzir estoque de vírus.

Após o sequenciamento, os resultados mostraram que a sequência da inserção LJL143 sintética e as ramificações esquerda e direita C3 em torno da inserção LJL143 sintética em vCP2389 estavam corretas.O vetor vCP2389 é ilustrado na Figura 6.Exemplo 13: Expressão de proteína salivar de Lu. longipalpis in vitro

Plasmideos de expressão com antígenos salivares de Lu. longipalpis marcados com His codificados pelo DNAc derivado de plasmideos pNBO002 (ver exemplo 9) e pNBO003 (ver exemplo 10) foram construídos e transfectados em células HEK-293F. Os sobrenadantes coletados em 72 h foram analisados por cromatografia HPLC utilizando coluna Nickel e gradiente de imidazol. As frações de HPLC positivas para a proteína recombinante salivar com porção 6x His em seus C-terminais foram testadas com soros policlonais de camundongos previamente imunizados com os plasmideos de DNAc correspondentes originais. As proteínas recombinantes foram testadas por SDS-PAGE e Western blottingr aliquotadas eiii PBS e armazeroidas a -70 °C.

A vacina de sub-unidade compreendendo LJM17 é aqui referida como rLJM17. A vacina é preparada por combinação de 100 μg de proteina recombinante purificada LJM17 com 300 μg do adjuvante CpG #2142 em 20% de Emulsigen® (laboratórios MVP) (para CpG #2142, ver SEQ ID NO: 890 em EP1.221.955).

A vacina de sub-unidade compreendendo LJL143 é referida aqui como rLJL143. A vacina é preparada por combinação de 100 μg de proteina recombinante purificada LJL143 com 300 μg do adjuvante CpG #2142 em 20% de Emulsigen®.

Exemplo 14: Vacinação de cães contra a leishmaniosecães (beagles fêmeas de 1-2 anos) são divididos aleatoriamente em 5 grupos de 5 cães cada. Todos os cães dos grupos 1 a 4 são vacinados no DO (VI) pela via intradérmica (ID) na auricula da orelha usando uma seringa e uma agulha, com 500 μg de plasmideo pNBC002 purificado (exemplo 9) expressando o antigeno LJM17 (grupos 1 e 2) ou plasmideo pNBO003 (exemplo 10) expressando o antigeno LJL143 (grupos 3 e 4), respectivamente.

Os cães do grupo 1 e grupo 3 são reforçados em D14 (V2) e D28 (V3), com 500 μg dos mesmos plasmideos usados para VI via I r.jimdénnica (TD) na parte interna superior de ambas as patas traseiras com o dispositivo de distribuição sem agulha VetJet™ (Merial). Os cães do grupo 1 e do grupo 3 foram ainda reforçados no D42 (V4) com 500 μg dos mesmos plasmideos pela mesma via intramuscular acoplada com eletroporação (ET/IM) no lado externo de ambas as coxas com o dispositivo e tecnologia Sphergen (parâmetros: 88V, TI = 20, T2 = 80, N = 10).

Os cachorros dos grupos 2 e 4 foram reforçados no D14 (V2) e D28 (V3) , com 500 μg dos mesmos plasmideos utilizados para VI por via IM acoplada à eletroporação (ET/IM), como descrito acima. Os cachorros dos grupos 2 e 4 foram adicionalmente reforçados no D42 (V4), por via ID na auricula da orelha, tal como descrito acima, com vacinas de subunidade (ver exemplo 13) rLJM17 (grupo 2) ou rLJL143 (grupo 4), respectivamente.

Todos os cães dos grupos 1 e 2 receberam um reforço da vacina final D192 (V5) pela via IM no quadriceps esquerdo, com 108 UFP do virus recombinante canarypox VCP2390 (exemplo 11, com SEQ ID NO: 21 como inserção) expressando LJM17. Todos os cachorros dos grupos 3 e 4 receberam um reforço da vacina final em Dl 92 (V5) pela via IM no quadriceps esquerdo, com IO8 UFP de um vírus recombinante Ccinai.ypux vC!?2 38 9 (exemplo 12, com SEQ ID NO: 22 como

Os cachorros do grupo 5 foram vacinados com 500 μg do plasmídeo purificado parental pVR2001 que não expressa o antígeno em DO por ID, D14 por TD, D28 por TD e D42 por ET/IM e receberam um reforço final em D192 por via IM, com 108 UFP de um vírus canarypox controle recombinante (Purevax™).

A imunidade humoral significativa e específica para LJM17 e LJL143 foi evidenciada por ELISA em cães vacinados (ver a Figura 7). As placas de 96 poços (Maxisorp™, Nunc) foram revestidas durante a noite a 4 °C com proteína rLJM17 (2 μg/mL) ou rLJL143 (2 μg/mL) . O soro de cachorro foi sucessivamente adicionado às placas em triplicate, em uma diluição de 1/50 com IgG anti-cachorro de coelho AffiniPure conjugada com fosfatase alcalina (Jackson ImmunoResearch) em 1/5000 e p-nitrofenilfosfato (Sigma). A absorbância foi medida a 405 nm usando Spectramax Plus (Molecular Devices).Títulos de anticorpos significativos persistiram até 6 meses após a administração V4. 0 reforço vCP (V5) lembrou as respostas de anticorpos específicas em cães vacinados de forma eficiente. Respostas anamnésticas após VCP estabeleceram a expressão de LJL143 e LJM17 de vCP2389 e VCP2390 respectivamente, e a capacidade dos vetores i: o forca rem as corpos r ,> ç i.moiros hiimorais in vivo-OÚfR' de 'OC>u ioioido. duos ;; < ou a i ri a a UCCS u rd o içr V5 foram estimuladas por 2 pares de homogenato de glândula salivar (SGH), LJL143 (4 μg) e LJM17 (4 μg) , ou por ConA (4 μg) . PBMCs que não foram estimulados pelo meio (med) serviram como controles. A produção de IFN-gama foi avaliada através da medição dos níveis de secreção de IFN- gama no meio em 72 horas (Quantikine ELISA; R & D Systems).

Os resultados estão mostrados na Figura 8. A adição de proteínas LJM17 ou LJL143 recombinantes purificadas causou o aumento da secreção de IFN-gama de PBMCs de cães vacinados com LJM17 ou LJL143 vacinados. Nenhum aumento da secreção de IFN-gama foi evidenciado quando PBMCs estavam na presença de meio de controle (med).

A adição de ConA ou SGH aos PBMCs de cães vacinados com LJM17 ou LJL143 também causou um aumento da secreção de IFN-gama. Notavelmente, o antigeno LJM17 causou respostas de INF-gama muito fortes em animais do grupo 2 (1800pg/mL), e também causou uma forte resposta nos animais do grupo 1 (200 pg/mL). 0 antigeno LJL143 também causou respostas muito fortes de INF-gama em animais dos grupos 3 e 4, com mais de 2000 pg/mL, que foram comparáveis aos resultados observados quando PBMCs foram estimuladas por ConA.Duels semanas apos a adminrs tração VI», 1'BMCs 1 oram i. no 'I ados ,j polir do doi.:.; o.ies cμio 1i a v i ,i w sido v-n.' j n Co; com LJM17 e LJL143. Os linfócitos de células T autólogos (5 x 106 células) foram estimulados com qualquer dose de 25 μg de LJM17 recombinante, 25 μg de LJL143 recombinante, ou 4 μg de ConA. As células foram então incubadas na presença de macrófagos infectados por amastigotas de Leishmania chagasi (infectados na proporção 5:1). Lipopolissacarideos (LPS) e células T não-estimuladas (NT, sem tratamento) serviram como controles. As células foram avaliadas quanto à eficiência de morte que foi medida por uma redução significativa na porcentagem de macrófagos infectados (Figura 9).

Linfócitos estimulados com LJM17 recombinante ou LJL143 recombinante foram tão citotóxico aos macrófagos quanto os linfócitos que foram estimulados pelo mitógeno ConA não-especifico.

Cães vacinados com LJL143 LJM17 e de controle foram ajustados com um dispositivo de colar de velcro. O dispositivo de colar de velcro foi preparado pela disposição de vinte fêmeas não-infectadas de seis dias de idade de Lu. longipalpis em um dispositivo de 10 mm de espessura Plexiglas que continha um parafuso fixado e uma malha de náilon em um de seus lados, de modo que os borrachudos eram capazes de sondar através das nialhas O dispositivo foi mantido a 25 ° C antes da exposição para limitar a condensação e foi, então, firmemente preso a um colar de velcro por 10 minutos na barriga raspada de cães vacinados com LJL143 e LJM17 e de controle. Os cães não foram restringidos durante todo o tempo de exposição. Biópsias de punção de pele de 4 mm ou 6 mm (Acuderm) foram retiradas da barriga dos cães anestesiados 48 horas após a picada dos borrachudos.

As biópsias foram armazenadas em formaldeido tamponado neutro (10% de formalina) e então foram processados rotineiramente para marcação com hematoxilina/eosina (H&E), Luna's, azul de toludina e procedimentos imunohistoquimicos para CD3 e marcadores de macrófagos/monócitos (Mac). Figura 10 fornece os resultados imunohistoquimicos dos sitios de picada de borrachudo. A infiltração imune celular especifica (manchas escuras nas imagens) é observada em cães vacinados, enquanto que nenhuma infiltração foi observada nos animais de controle.

EXEMPLO 15: Vacinação de cães com proteínas salivares LJL143 e LJM17 produz uma resposta imune protetora que matou amastigotas de Leishmania chagasi in vitro.

Neste estudo, proteínas sali vares de Lii. J.ong.ipa l.pi s taririi tostadas para determinar ss cias SOTITI i munocjo ni ca s çm foram identificadas que podem produzir uma resposta imune celular protetora e matar Leishmania infantum em um ensaio in vitro.

Para identificar esses componentes salivares, um ensaio de varredura de antigeno reverso à base de DNA foi desenvolvido. Esta varredura identificou dois antigenos indutores de DTH fortes das 35 proteinas mais abundantes nas glândulas salivares de Lu. longipalpis. Estes dados foram adicionalmente validados com proteinas recombinantes, resultando na confirmação do potencial de indução de DTH para as proteinas salivares LJM17 (SEQ ID NO: 5) e LJL143 (SEQ ID NO: 1) de Lu. longipalpis. Além disso, as células mononucleares do sangue periférico de cães vacinados com LJL143 e LJM17 produziram interferon (IFN)-y após estimulação com as proteinas recombinantes salivares e, mais importante, a estimulação dessas células com as proteinas recombinantes resultou na morte de Leishmania infantum in vitro. Estas moléculas representam, portanto, fortes candidatas a serem usadas como uma vacina para controlar Leishmania infantum em cães.

Material e Métodos

Cães: fêmeas beagles de 1-2 anos de idade (Marshall Farms) foram aloiadas no biotério' do NIIl, Bethesda, EUA, S ÇO i. I .1. n d o <ã.S ÍJl 1 '' !. À ISO'S do Coill J 1.0 d(-' Ol.l .Í Cado o 11 > !i"O Animais. Eles foram bem alimentados animais sob constante exame por problemas de saúde por um veterinário e tinham recebido todas as vacinas de rotina. Nenhum tratamento ectoparasitico foi administrados durante os últimos quatro meses antes dos experimentos de exposição ao borrachudo.

Borrachudos: Lutzomyia longipalpis, cepa Jacobina, foram criados utilizando como alimento larval uma mistura de fezes de coelho fermentadas e ração de coelho. Aos borrachudos adultos foram oferecidos um cotonete de swab contendo sacarose a 20%, mas foram privados de açúcar nas 24 horas antes dos experimentos de exposição. Algumas fêmeas foram utilizadas para a dissecação de glândulas salivares em 4-7 dias após a emergência e homogenatos da glândula salivar (SGH) foram preparados como descrito acima.

Exposição a picadas de borrachudos: Lu. longipalpis fêmeas de seis dias de idade, foram colocadas em um dispositivo Plexiglas de 10 mm de espessura. O dispositivo continha um parafuso fixado e uma malha de náilon em um de seus lados para sondar o borrachudo com ele. O dispositivo foi mantido a 25 °C antes dei exposição até o limite de condensação e estava firmemente unido com um colar Velcro no pescoço raspado de cães por 20 mintitos - Os cães foram J I. V t. L 'è L ; J 0? •' j. i'i.i ' o i’.i ! ç' I • ã ri 1.5 I P r I n.d ' J.C Z í i_ OJ ct < p

Varredura Antigeno Reversa (RAS): Cães pré-expostos a picadas de borrachudos foram anestesiados e injetados por via intradérmica com plasmideos de DNA ou proteínas recombinantes. Os sitios de injeção foram separados uns dos outros por 15 mm. Para plasmideos de DNA, as moléculas foram codificadas e agrupadas de forma aleatória para cada cão antes da injeção na barriga. O código foi quebrado apenas após medições de induração e eritema serem concluídas. Para o DNA-RAS, 38 amostras foram injetadas em um volume total de 40 uL de solução, incluindo PBS, um par de SGH de Lu. longipalpis diluído em PBS e 20 μg de vetores controle e os 35 plasmideos de DNA recombinantes, diluídos em PBS, codificando proteínas salivares individuais de Lu. longipalpis. Para proteína-RAS, 5 amostras foram injetadas em duplicata (40 μL) , incluindo a PBS, 1 par de SGH de Lu. longipalpis diluído em PBS, e 3 proteínas recombinantes salivares de Lu. longipalpis (300 ng). A medida dos diâmetros de induração e eritema foi efetuada 48 horas após a injeção intradérmica das amostras.

Histologia e PCR em tempo real em biópsias de punção da pele: Biópsias de punções de 4 mm ou 6 mm da pele (Acuderm) foram retiradas do pescoço ou barriga de cães arostosiados o divididas cm duas metades iguais. Uma metade loi a jjii.-i asnacfi ar ! inalei -i cio i.ainpoiiado mui co (lítà do formalina), em seguida, processados rotineiramente para coloração com hematoxilina/eosina, Luna's, azul detoluidina e procedimentos de imunoistoquimica para CD3 e marcadores de macrófago/monócito. A outra metade,armazenada em RNAlater (Sigma), foi usada para extração deRNA (Agencourt® RNAdvance™ Tissue, Beckman Coulter). RNAs foram transcritos reversamente (transcritor da sintese deDNAc da primeira fita, Roche) e utilizados para PCR em tempo real usando o LightCycler 480 (Roche), conjunto de 10iniciadores (concentração final de 0,2 μM) e sondas duplamente marcadas FAM/TAMRA até um total de 15 μl por reação em triplicatas. Os iniciadores e as sondas para IL4, IL12, TGF-β, IFN-y e GAPDH caninos foram descritosanteriormente (Breathnach et al.). As condições de15amplificação, aquisição, e análise da curva de fusão e curva padrão foram realizadas como descrito anteriormente (Breathnach et al.). Os niveis de expressão do gene interessado foram normalizados com os niveis endógenos GAPDH para controlar a quantidade de RNA. 20

DNAc recombinante: A partir de uma biblioteca de DNAc (ver' acima) , as 35 moléculas mais abundantes das glândulas salivares de r,n. iongí r>a..lp.in foram selecionadas e seus ' ,'ÇÍA c c 1I o o a d < ’ s rri at. rv 131 Sí> í. -TUFO ne.l as I; «-‘''li i ca.s 1?

MEgaprep de Plasmídeo sem endotoxina GenElute™ (Sigma), limpos com água ultrapura usando Centricon® Plus-20 (Millipore) e eluidos em PBS. O controle de qualidade dos 35 plasmideos purificados incluiu medidas de endotoxina, análise de perfil de restrição e sequenciamento. Os plasmideos de DNA salivares purificados foram esterilmente filtrados e armazenados a -70 °C.

Proteínas recombinantes: plasmideos de expressão contendo antigenos salivares de Lu. longipalpis marcados com His codificando DNAc derivado dos plasmideos DNA de saliva de origem parental foram construídos como descrito (Oliveira et al.) e transfectados em células HEK-293F. Os sobrenadantes coletados em 72 h foram submetidos à cromatografia de HPLC usando coluna Nickel e gradiente de imidazol. Frações de HPLC positivas para a proteína recombinante salivar com porção de 6x motivo em seus C- terminais foram testadas com soros policlonais de camundongos previamente imunizados com plasmideos de DNAc correspondentes originais. As proteínas recombinantes foram testadas por SDS-PAGE e Western blotting, aliquotadas em PBS e armazenadas a -70 °C.

Vírus canarypox recombinante: Dois vírus canarypox derivados cLo vetores ALVAC expressando respectivamente os JV-J v>'V-> r-3 LJLJ 7 v ’ >' ‘)) V| TCI'MJ.’7 ‘ '’"f'' V--: °0 ’ LV-JO qorirL-s usando métodos padrões e validados por sequenciamento do

DNA viral, RT-PCR em RNAm de células infectadas e Western Blot de sobrenadantes das células infectadas. Vacina contra anti-disposição de furão PurevaxTM (Merial) foi utilizada como controle de injeções de virus canarypox.

Vacinação de cães com vacinas salivares: 25 cães foram divididos aleatoriamente em 5 grupos de 5 cães cada. Todos os cães dos grupos 1 a 4 são vacinados no DO (VI) pela via intradérmica (1D) na auricula da orelha usando uma seringa e uma agulha, com 500 μg de plasmideo purificado expressando os antigenos LJM17 (grupos 1 e 2) ou LJL143 (grupos 3 e 4), respectivamente. Os cães do grupo 1 e grupo 3 foram reforçados em D14 (V2) e D28 (V3) , com 500 μg dos mesmos plasmideos usados para VI pela via transdérmica (TD) na parte interna superior de ambas as patas traseiras com o dispositivo de distribuição sem agulha VetJet™ (Merial). Os cães do grupo 1 e do grupo 3 foram ainda reforçados no D42 (V4) com 500 μg dos mesmos plasmideos pela via intramuscular (IM) acoplada com eletroporação no lado externo de ambas as coxas com o dispositivo e tecnologia Sphergen (parâmetros: 88V, TI = 20, T2 = 80, N = 10) . Os cachorros dos grupos 2 e 4 foram reforçados no D14 (V2) e D2 8 (V3) , com 500 ltq cios mesmos plasmideos utilizados para

VI por via IM acoplada à eletroporação, como descrito acima. Os cachorros dos grupos 2 e 4 foram adicionalmente reforçados no D42 (V4), com 100 μg da proteina recombinante LJM17 (rLJM17) (grupo 2) ou LJL143 (rLJL143) (grupo 4), em associação com 300 μg de CpG ODN em 20% de Emulsigen® (MVP Laboratories) pela via ID na auricula da orelha, conforme descrito acima. Todos os cães dos grupos 1 a 2 receberam um reforço da vacina final D192 (V5) pela via IM no quadriceps esquerdo, com 108 UFP do virus recombinante canarypox vCP2390 e vCP2389 expressando respectivamente os antigenos LJM17 (grupos 1 e 2) ou LJL143 (grupos 3 e 4).

Os cachorros do grupo 5 foram vacinados com em D0, D14, D28 e D42 com 500 μg do plasmideo purificado parental VR2001 que não expressa antigeno e receberam um reforço final em D192 por via IM com 108 UFP de um virus canarypox controle recombinante (Purevax™).

ELISA: Placas de 96 poços (Maxisorp™, Nunc) foram revestidas durante a noite a 4 °C, com SGH de Lu. longipalpis (5 pares/mL), proteina rLJM17 (2 μg/mL) ou rLJL143 (2 μg/mL). Soro de cachorro em triplicata, em diluição de 1/50, IgG anti-cachorro de coelho AffiniPure con j uqada com 1: os ,t at ase • t .1.. ca 1 i na (J a c kson Immi.i noResea r chi) em 1/5000 e p n i tToimn i 'I fosfato (S.i qma ) 1 <? । am sucessivamente adicionados às placas. Absorbância a 405 nm foi medida usando Spectramax Plus (Molecular Devices). A produção de IFN-y nos sobrenadantes de células foi medida após 72 h (Quantikine ELISA; R&D Systems) após estimulação com SGH (pares 1 ou 2), ConA (4 μg) , rLJM17 (2 ou 10 μg) ou rLJL143 (2 ou 10 μg).

Atividade anti-leishmania: Macrófagos derivados de monócitos de canino foram preparados como o uso dos métodos padronizados. As células autólogas T (5 x 106 células) foram retiradas da cultura, após uma semana, estimuladas com SGH de Lu. longipalpis (2 pares), ConA (4 μg) , rLJM17 (25 μg) ou rLJL143 (25 μg) , e colocadas de volta na presença de macrófagos infectados por L. infantum infectados na proporção de 5:1. A atividade anti-leishmania foi avaliada por mudanças nas porcentagens de células infectadas e o número de amastigotas por macrófago, após o exame microscópico das preparações marcadas com Giemsa.

Picadas de borrachudos Lutzomyia longipalpis induzem uma forte resposta de hipersensibilidade tipo retardado em cães

Em modelos de roedores, a imunidade celular, caracterizada por uma resposta de hipersensibilidade do tipo Tbl tardia. (DTH) as proteinas salivares do borrachuda, ii 1. Cvj O O o cl i 1 L i II cl i. c> d O . L O I. I 11 ü1 í II J O S O CU I. c.l I l - <;.l O v .1.. S C .1 cl 1 - bl cl O há informações relativas à presença e natureza de imunidade celular à saliva de borrachudos em cães, os reservatórios principais da leishmaniose visceral causada por Leishmania infantum (chagasi) na Europa e América Latina. Assim, a cinética inicial da imunidade anti-saliva em cães após a exposição a picadas de Lutzomyia longipalpis, vetor da Leishmania infantum chagasi na América Latina, foi investigada. Sete dos nove beagles apresentaram anticorpos anti-saliva específicos uma semana após a terceira exposição às picadas (FIG. 19A). Não considerando um único cão, esses animais apresentaram uma forte resposta de anticorpos IgG2 na ausência de IgGl (FIG. 19A) . Um cão apresentou uma resposta de anticorpo IgG2/IgGl misturada. Para investigar se os cães expostos a picadas de borrachudos desenvolveram uma resposta DTH, a enduração da pele no local da picada até 96 horas após cada exposição foi medida. Após a segunda exposição às picadas de borrachudo, uma pequena enduração foi observada nos 7 cães que produziram níveis significativos de anticorpos IgG de Lu. longipalpis (FIG. 19B) . Isto foi caracterizado por um eritema local, inchaço e, eventualmente, espessamento da pele. A intensidade e a duração do enduração observada foi s i. ( ÍI! I i .i < vi L -j v,-i(uia) I • ' ui.,! iv> r . ii ióa a I;ç\r<<i r.> oxposicao < J11 r and<>enduração não foi observada após a primeira exposição em animais ingênuos (FIG. 19B) . As análises histológicas do sitio de enduração mostraram inflamação minima caracterizada por linfócitos perivasculares espalhados e neutrófilos raro na derme superficial 48 horas após a primeiro e segunda exposição (FIG. 19C). Um aumento dramático no infiltrado celular foi observado 48 horas após a terceira exposição. Esta foi caracterizada por um espessamento proeminente da epiderme e a presença de infiltrados multifocais de células inflamatórias, consistindo de linfócitos, macrófagos e eosinófilos (FIG. 19D). Com base no tempo de reação, bem como na natureza do infiltrado, concluiu-se que a saliva de borrachudos induz a uma reação de hipersensibilidade tardia na pele de cães após exposições repetidas.Proteinas salivares de Lutzomyia longipalpis que induzem DTH em cães

Moléculas salivares de Lu. longipalpis, que são responsáveis pela geração de uma resposta DTH em cães foram investigadas. Transcrições que codificam as 35 proteínas mais abundantes secretadas das glândulas salivares da espécie foram identificadas acima. A identificação dos Candida tos caprjz. dec induzir uma resposta imune celular de como cães, é proibitivo em termos de custo e espaço. Parasuperar este obstáculo, uma abordagem de varredura de antigeno reversa foi desenvolvida que consistiu em expor quantidade minima de cães (cinco) às picadas do borrachudo e injetando cada animal com até 38 amostras (35 plasmideos de DNA codificando as proteinas salivares e três controles) (FIG. 20A) . Dos 35 plasmideos de DNA injetado, somente 4 (LJM17, LJM11, LJL143 e LJL138) induziram um eritema significativo em mais de 3 cães, 48 horas após o desafio (FTG. 20B) e apenas 2 plasmideos de DNA (LJL143 e LJM17) produziram um forte endurecimento em 3 cães, 48 horas após o desafio (FIG. 20B) . A maioria dos plasmideos injetado não produziu um eritema ou endurecimento significativo (FIG. 20B) e a injeção de PBS e controle de vetor vazia induziu eritema minimo no local da injeção em comparação com LJM17 e LJL143 (FIG. 20C). A especificidade e reatividade de plasmideos de DNA injetados é mostrada na FIG. 20D. Com base nesses resultados, LJM17 e LJL143 foram escolhidos para análise adicional. LJL143 e LJM17 induziram a produção de citocinas indicativas de um ambiente Thl no sitio da injeção, incluindo IL-12 e IFN-y (FIG. 20E) . Os cortes histológicos realizadas 48 horas após o desafio mostraram que IP.TL.14 3 L.JM17 recrutam linfócitos c macrófagos no <ti IJI -j cçfí ómllcaTivo de rrspom a ct'' hipersensibilidade do tipo clássica tardia (DTH) (Fig. 20F) . Para validar a especificidade desta abordagem, LJL143, LJM17 e LJM111 solúveis altamente purificadas, dentre diversas outras proteínas recombinantes salivares, foram preparadas (FIG. 21A) . Proteínas recombinantes LJL143 e LJM17 reproduziram a resposta DTH observada após a injeção de seus respectivos plasmideos de DNA (FIG. 21B e 21C) , incluindo o recrutamento de linfócitos e macrófagos para o local da injeção (FIG. 21D).CclcS Xliiillii∑cidOS CO∑ii LJL143 θ L3vil7 pXOdU∑Oiil específicos para proteínas recombinantes da saliva.Cães (5 por grupo) foram imunizados com plasmideos deDNA que codificam LJL143, LJM17 ou plasmideo de DNA controle, um reforço primáro com as respectivas proteínas recombinantes salivares e uma imunização final com o vírus canarypox expressando respectivas as proteínas salivares (Tabela 1) . PBMCs de cães imunizados foram estimulados com até 4 ug de sua respectiva proteína recombinante, ConA e 1 par de homogeneizado de glândula salivar (SGH). Cães vacinados com LJL143 produziram níveis significativos de IFN-y cinco semanas após a quarta vacinação e antes da injeção com canarypox (FIG. 22A). De modo mais importante, a proteina n a t i ,v, > Í.„J [j a 3 presente em 1 par de homogene i ...lo ri,-- (•"! i ti ri 11 ! r> ::. » j j pr ; r ! ; rvp "M • ; r i inro rz T-tirr : f ;o semelhante em cães vacinados com LJL143 (FIG. 22A) . Cães vacinados com LJM17 produziram niveis mais baixos consideráveis de IFN-y em comparação com cães vacinados LJL143 (FIG. 22A). Um perfil similar foi observada duas 5semanas após a vacinação com canarypox, onde PBMCs de cães vacinados com LJL143 produziram duas vezes maior IFN-y em relação ao seu estado pré-pox (FIG. 22B).

Vacinação com LJL143 e I.JM17 gera uma resposta imuneprotetora, que mata amastigotas de Leishmania chagasi ia

Macrófagos infectados dos PBMCs de dois cães vacinados com LJM17 e LJL143 eficientemente mataram amastigotas de Leishmania chagasi após a adição de linfócitos autólogos estimulados com proteinas recombinantes LJM17 e LJL143 respectivamente (Fig. 23). A eficiência da morte foi medida por uma redução significativa na porcentagem de macrófagos infectados (FIG. 23A) , bem como do número de amastigotas por macrófagos (Fig. 23B). Este efeito de morte foi comparável àquele observado com a adição de mitógeno ConA não-especifico (Fig. 23).EXEMPLO 16: Produção de uma Resposta Imune em Cães

Doze cães de cerca de três anos com a imunidadenatural contra a leishmaniose são injetados através da via intradérmica (ID) na parte de trás após raspar os pelos, com 100 μg de cada plasmideo individual suspenso em 100 μL de PBS. Cada plasmideo é injetado em um ponto diferente. Os pontos são separados por pelo menos 3 cm para evitar a interferência entre as respostas DTH. O controle negativo (100 μl de tampão) é também inoculados por via ID.

A resposta DTH é avaliada 72 horas após a injeção, medindo o maior diâmetro dai área de tumefação da pele. Os resultados são expressos como o valor médio da rsrea de e uiim ,ÍSJ ç,--i o j.jç í o > >'ii<; o;-.; ea:s ve corno uma poπ:feBta<jeπi oo cees tumefação de diâmetro igual ou superior a 4 mm em 72 horas após a injeção.

Em um segundo estudo, 10 cães ingênuos de 4 a 6 meses de idade são imunizados pela injeção ID em 10 pontos (100 μL por ponto) na orelha direita com uma reunião dos plasmideos que codificam o polipeptideo Lu. longipalpis, 100 μd para cada um suspenso em 1000 μL de PBS. No dia 21, os cães são injetados em 10 pontos (100 μL por ponto) na orelha esquerda e em 10 pontos (100 μL por ponto) na barriga com um conjunto de plasmideos, 100 μg para cada um suspenso em 2000 μL de PBS. Todos os cães são desafiados no dia 35, pela inoculação por via ID na parte de trás (após a remoção dos pelos), com 100 μg de cada plasmídeo individual suspenso em 100 μL de PBS. Cada plasmídeo é injetado em um ponto diferente. Os pontos são separados por pelo menos 3 cm para evitar interferência. Como controle negativo, 100 μl de tampão são inoculados por via intradérmica. A resposta DTH é avaliada 72 horas após o desafio, através da medição do diâmetro maior da área de tumefação da pele. Os resultados são expressos como o valor médio da área de tumefação para todos os cães e como uma porcentagem de cães com uma resposta DTH 'positive). Uinã DTH positiva é um d i.ànie i: ru da are i rir r mimo raça< > a.rior oil iqual a -d mi I ímet i or 2 0em 72 horas após a injecção.

Os resultados deste estudo mostram que os plasmideos podem induzir uma imunidade celular em cães após a injeção, a imunidade celular revelada por uma resposta DTH. A variação do nivel de resposta DTH pode ser pela variação da expressão da inserção.

Será evidente que os detalhes precisos dos métodos descritos podem ser alterados ou modificados, sem se afastar do espirito da revelação descrita. Nósreivindicamos todas as tais modificações e variações que se enquadram no escopo e no espirito das reivindicações abaixo. Referências1. Adler e Theodor, Ann. Trap. Med. Parasitai. 20:109, 1926.2. Altenburger et al., 1989, Arch. Virol. 105, 15-27;3. Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215. 403-410;4. Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25, 3389-3402;5. Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396;6. Bairoch, Nucleic Acids Res. 19 (Suppl.):2241,1991;7. Barral et al.r Am J Trop Med Hyg 62:740-5, 200;8. Behr J. B.. Biocorríuqate Chemistry, 1994: 5: 382-389;9. Berber! ch C. V; L . , Bi.ochim. Biophys - Acta, 1998, 10. Boshart M. et al., Cell, 1985, 41, 521-530 ;11. Boshart M. et al., Cen 41:521-530, 1985 ;12. Breathnach et al., Vet Dermatol 2006, 17:313-21;13. Carroll M. W. et al., Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394 ;14. Charlab et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:15155- 60, 1999;15. Chaudhuri P Res. Vet. Sci. 2001, 70(3), 255-6 ;16. Chung J Y et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296 ;17. Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35;18. D. Berg, et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296;19. De Groot A. et al., Nature Biotechnology, 1999, 17, 533-561;20. Desjeux P., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2001, 95: 239-43;21. Devereux J, Haeberlie P and Smithies 0, "A comprehensive set of sequence analysis program for the VAX," Nucl. Acids Res., 12: 387-395 (1984);22. Dietze R. et al., Clin. Infect. Dis., 1997, 25: 1240-2;23. Djoba Siawayri JF et al., PT.oS ONE, 2008, 3(7), 24. Doree S M et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6) :1983-9;25. Dye C., Am. J. Trop. Med. Hyg., 1996, 55: 125-30;26. Feng DF and Dolittle RF, "Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees," J. of Molec. Evol., 25:351-360 (1987);27. Fingerut E et al., Vaccine, 2005, 23(38): 4685-4 696;28. Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47;29. Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1984, 81 (13), 3998-4002;30. Geysen H. M. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,1985, 82 (1), 178-182;31. Geysen H. M. , Southeast Asian J. Trop. Med.Public Health, 1990, 21 (4), 523-533;32. Gradoni L. et al., Vaccine, 2005, 23: 5245-51;33. Gros jean NL et al., Lindsay DS et al., McConkeySE et al., Martinez-Subiela S, Tecles F, Eckersall PD, Cerón JJ: Serum concentrations of acute phase proteins in dogs with leishmaniasis. Vet Rec 150:241-244, 2002;34. Grosjean NL, Vrable RA, Murphy AJ, Mansfield LS:So re,?p re v ,3 Jo r; ce ot a nt i bod rc s against Le i shman.i. a spp among 2003;35. Guo P. et al. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198;36. Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7,1205-1217;37. Hemer B. et al., Immunology Today, 1998, 19 (4),163-168;38. Henikoff et al., Bioinformatics 15:471, 1999;39. Higgins DG e Sharp PM, "Fast and sensitivemultiple sequence alignment on a microcomputer," CABIOS, 5: 151-153 (1989);40. Hoop T. et al., Mol. Immunol. 1983, 20(4), 483-4 89;41. Immonogenicity of a killed Leishmania vaccinewith Saponin adjuvant in dogs", R. Cordeiro Giunchetti et al., Vaccine, 2007, 25: 7674-7686;42. Israeli E et al., Cryobiology 1993, 30(5): 519-23;43. J. Fields et al., Nature, 186: 778-780, 4 June19 60;44. J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970);45. J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 .1 i 647. Jardim A. et al., Biochem. J., 1995, 305: 315-2048. Jeanmougin et al., Trends Biochem. Sci. 23:403,199849. Jurk M et al., Immunobiology 2004, 209(1-2): 141- 15450. K. Otte et al. Gen. Comp. Endocrinol. 1996,102(1), 11-1551. Kidd I. M. & Emery V.C., "The use ofbaculoviruses as expression; vectors," Applied Biochemistry and Biotechnology 42:37-159, 199352. Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-234453. Lanotte G. et al., Ann. Parasitol. Hum. Comp.,1979, 54: 277-9554. Lindsay DS, Zajac AM, Barr SC: Leishmaniasis inAmerican Foxhounds: An Emerging Zoonosis? Compend Cont Educ Pract Vet 24:304-312, 200255. Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-9756. Muller M. et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18(2),36457. Maniatis et al., Molecular Cloning: a LaboratoryManuel. Cold Spring Harbor Laboratory, 198258. - Mar-a I i M. e' > I , Med. Vet. . Eirlomol . , 2001. 15: 59. Martinez-Subiela S, Tecles F, Eckersall PD, Ceron JJ: Serum concentrations of acute phase proteins in dogs with leishmaniasis. Vet Rec 150:241-244, 200260. Mazloumi Gavgani A.S. et al., Lancet, 2002, 360:374-961. McConkey SE, López A, Shaw D, Calder J:Leishmanial polyarthritis in a dog. Canine Vet J 43:607- 609, 200262. Melanby, Nature. 158, 554-555.13, 194663. Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 72, 1031-103864. Mills C K et al., Cryobiology 1988, 25(2): 148-5265. Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269-27766. Molina R. et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. , 1994, 88: 491-3; Courtenay 0. et al., J. Infect. Dis., 2002, 186: 1314-2067. Montgomery et al., Cell. Mol. Biol. 43:285-292,199768. Moreira Jr. E.D. et al., Vet. Parasitol., 2004,122: 245-5269. Nielsen et al., Protein Eng. 10:1, 199770. Ogata R T et al., J. Biol. Chem. 1989, 264(28):16565-16572Ol J. VQ i. , I !•'. . Vd' i. i ié (200b) 24 : .3 74—9(1'72. Olsen 7' W ,>! , V.re . BO7r I Rlj) i : Vi.'i'i 115673. Optimal Alignments in Linear Space", CABIOS 4, 11-17, 198874. O'Reilly et al., "Baculovirus expression vectors, A laboratory manual," New York Oxford, Oxford University Press, 199475. P. Delafontaine et al. Gene 1993, 130, 305-30676. Pandher K et al., Infect. Imm. 1998, 66(12):5613-977. Panicali et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 1982,79: 4927-493178. Parker K. et al., Immunol. Res. 1995, 14(1), 34- 5779. Piccini et al., Methods Enzymol., 1987, 153: 545- 56380. Pasleau et al., Gene 38:227-232, 198581. Pennock et al., Mol. Cell Biol. 4: 399- 406, 199482. Peppoloni S et al., Expert Rev Vaccines, 2003,2 (2) : 285-29383. Perkus M. et al., J. Virol., 1989, 63, 3829-383684. Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 199685. Pharmaceutical Biotechnology, 1995, volume 6, edited by Michael !•’. Powell and Mark J. Newm.-m, Plenum 86. Piccini et al., Methods Enzymol., 1987, 153: 545- 56387. Ribeiro et al., Insect Biochem. 19:409-412, 198988. Rickies R. et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-156989. Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-343490. S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972-698591. S. Lien et al. Mamm. Genome 2000, 11(10), 877-88292. Shida, Virology, 1986, 150, 451-45793. Slappendel RJ, Ferrer L. em: Greene CE:Infectious Diseases of the Dog and Cat. WB Saunders Co, Philadelphia, 1998, pp. 450-45894. Smith et al., Mol. Cell Biol. 3:2156-2165, 198395. Smith TF and Waterman MS, "Comparison of Biosequences," Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)96. Smith TF, Waterman MS e Sadler JR, "Statistical characterization of nucleic acid sequence functional domains," Nucleic Acids Res., 11:2205-2220 (1983)97. Soares et al., J. Immunol. 160:1811-6, 199898. Stalb C. et a 1 . , Biot.echn.iques, 2000, 28(6) :1.137 JT, 1144-6, 1.146 1971, 113, 1149-1153100. Stittelaar K. J. et al., J. Virol., 2000, 74 (9),4236-4243;101. Sutter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,1992, 89, 10847-10851102. Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032- 1040103. Taylor et al. Vaccine. 6: 497-503, 1988a104. Taylor et al. Vaccine. 6: 504-508, 1988b105. Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508106. Thompson JD, Higgins DG e Gibson TJ, "ClusterW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighing, positions-specific gap penalties and weight matrix choice," Nucleic Acid Res., 22:4673-480, 1994;107. Titus and Ribeiro, Parasitol Today 6:157-159, 1990;108. Tsvetkov T et al., Cryobiology 1983, 20(3): 318-23;109. Vaccine Design, The subunit and adjuvant approach", Pharmaceutical Biotechnology, vol. 6, editado per Michael F. Powell and Mark J. Newman, 1995, Plenum I..'j.es New loj.k;110. '. v n J. ci J L Lie L * :L Í ,:.i . , e. .We r/co- Lda; >LL "Lr, LIHIJ ; 111. Van der Zee R. et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19 (1), 43-47;112. van Ooyen et al., Science, 1979, 206, 337-344;113. Verne A., Virology- 167:56 71, 1988;5 114. Vialard et al., J. Virol. 64:37-50, 1990;115. VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91-97;116. Von Heijne (1986), Nucleic Acid Research, 14; 4683-4691;10 117. Ward C K et al., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36118. Wilbur e Lipman, 1983 PNAS USA 80:726119. Wolff E et al., Cryobiology 1990, 27(5): 569-75120. Y. Kajimoto et al. Mol. Endocrinol. 1989, 3(12), 15 1907-1913121. Zurbriggen R et al., Expert Rev Vaccines, 2003, 2(2) : 295-304.

Claims (7)

1. Composição de vacina para uso no tratamento ou prevenção de infecção por Leishmania em um hospedeiro caracterizada pelo fato da referida vacina compreender:a) um polipeptídeo de Lu. longipalpis salivar; eb) um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável,em que o polipeptídeo de Lu. longipalpis compreende uma sequência de aminoácidos que possui a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, 3, 11 ou 13.

2. Composição de vacina para uso no tratamento ou prevenção de infecção por Leishmania em um hospedeiro caracterizada pelo fato da referida vacina compreender:a) um primeiro vetor de expressão, em que o primeiro vetor compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptideo Lu. longipalpis salivar;b) um segundo vetor de expressão, em que o segundo vetor compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Lu. longipalpis salivar; ec) um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável, em quei) o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que possui a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 1, 3, 11 ou 13; ouii) o polinucleotídeo possui a sequência conforme estabelecida na SEQ ID NO: 2, 4, 12, 14, 22 ou 89.

3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de polinucleotídeo é códon-otimizada para o hospedeiro, de forma que a sequência de aminoácidos do polipeptideo Lu. Longipalpis codificado pela sequência de polinucleotídeo é funcionalmente inalterada.

4. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo vetor de expressão é um vetor ALVAC compreendendo a SEQ ID NO: 22.

5. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo vetor de expressão é um vetor vCP2389 compreendendo a SEQ ID NO: 94.

6. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro e/ou o segundo vetor de expressão é um vetor viral ou plasmidial.

7. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de o hospedeiro é um humano, canino ou felino.

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