BRPI0915888A2 - supressão de doenças neuroendócrinas - Google Patents

supressão de doenças neuroendócrinas Download PDF

Info

Publication number
BRPI0915888A2
BRPI0915888A2 BRPI0915888-0A BRPI0915888A BRPI0915888A2 BR PI0915888 A2 BRPI0915888 A2 BR PI0915888A2 BR PI0915888 A BRPI0915888 A BR PI0915888A BR PI0915888 A2 BRPI0915888 A2 BR PI0915888A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cys
phe
trp
lys
tyr
Prior art date
Application number
BRPI0915888-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen Johnstone
Philip Marks
Keith Foster
Original Assignee
Syntaxin Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0810785A external-priority patent/GB0810785D0/en
Priority claimed from GBGB0810782.3A external-priority patent/GB0810782D0/en
Priority claimed from GB0820884A external-priority patent/GB0820884D0/en
Priority claimed from GB0820965A external-priority patent/GB0820965D0/en
Application filed by Syntaxin Limited filed Critical Syntaxin Limited
Publication of BRPI0915888A2 publication Critical patent/BRPI0915888A2/pt
Publication of BRPI0915888E2 publication Critical patent/BRPI0915888E2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • A61K38/4886—Metalloendopeptidases (3.4.24), e.g. collagenase
    • A61K38/4893—Botulinum neurotoxin (3.4.24.69)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/06—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a lysosomal/endosomal localisation signal

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

POLIPEPTÍDEO, ÁCIDO NUCLÉICO E USO DO REFERIDO POLIPEPTÍDEO A presente invenção refere-se a um método para supressão de doença neuroendócrina. A terapia emprega uso de uma protease não citotóxica, a qual é direcionada para uma célula tumoral neuroendócrina, preferencialmente através de um receptor de somatostatina ou cortistatina, um receptor de GHRH, um receptor de grelina, um receptor de bombesina, um receptor de urotensina, um receptor do hormônio de concentração de melanina 1; um receptor KiSS-1 ou um receptor de peptídeo de liberação de prolactina. Quando liberada deste modo, a protease é internalizada e inibe secreção da referida célula tumoral. A presente invenção também se refere a polipeptídeos e ácidos nucleicos para aplicação nos referidos métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍ- DEO, ÁCIDO NUCLÉICO E USO DO REFERIDO POLIPEPTÍDEO", A presente invenção refere-se a terapêuticos e terapias corres- pondentes para o tratamento de doenças e condições neuroendócrinas.
O sistema neuroendócrino é formado de células derivadas da crista neural embrionária, do neuroectoderma e do endoderma. Pode ser dividido em tipos celulares que formam glândulas e outros que são distribuí- dos difusamente, isto é, o sistema neuroendócrino disseminado ou difuso. O primeiro grupo inclui as células formando a pituitária, as glândulas paratiroi- desea medula adrenal. O segundo grupo inclui células na pele, pulmão, timo tiroide, pâncreas, e os tratos gastro intestinal, biliar e urogenital. Tumo- res neuroendócrinos podem surgir em todas estas localizações e podem provocar patofisiologia quer por seu tamanho físico causando pressão locali- ' zada quer por constricções sobre órgãos vizinhos, quer por secreções anor- mais de uma variedade de hormônios e outras moléculas bioativas. Estas moléculas são normalmente secretadas por células não tumorais em quanti- dades fisiologicamente apropriadas e sob firme controle fisiológico. No en- tanto, quando estas células formam tumores, as secreções podem ser ex- cessivas levando a doença.
As terapias correntes para estas doenças de hipersecreção po- dem incluir a remoção cirúrgica do tumor ou tumores, quimioterapia genérica antitumoral, terapia de interferon, radioterapia e tratamento mais específico com, por exemplo, análogos de somatostatina. A preferência por modo de tratamento inicial varia de acordo com o médico assistente e, apesar de ca- da uma destas abordagens poder ter sucesso, elas nem sempre são apro- priadas. Dependendo do tamanho e da localização do tumor a intervenção cirúrgica pode ser considerada extremamente arriscada e o tumor pode não ser completamente removido. Quimioterapia antitumoral, terapia de interfe- ron e radioterapia são algumas vezes mal toleradas pelo paciente ou podem ser contraindicadas por outras razões.
Além disso, terapias resultando em morte de células tumorais também introduzem a possibilidade de ocorrer síndrome de lise tumoral
: 2 (TLS). A síndrome de lise tumoral é uma complicação da terapia tumoral muito grave e algumas vezes com risco de vida.
Pode ser definida como uma constelação de anormalidades metabólicas resultantes de necrose tu- moral espontânea ou relacionada com o tratamento ou apoptose fulminante.
As anormalidades metabólicas observadas em pacientes com síndrome de lise tumoral incluem: hipercalemia, hiperuricemia, e hiperfosfatemia com hi- pocalcemia secundária.
A síndrome de lise tumoral também pode levar a falência renal aguda (ARF). Na maioria dos pacientes com tumores metastáticos carcinoides e endócrinos pancreáticos, o tratamento com medicamentos correntes tais como octreotida pode induzir uma rápida melhora em sintomas clínicos, tais ' como diarreia, desidratação, ataques de vermelhidão ("flushing"”), hipocale- mia, ulceração péptica, ataques hipoglicêmicos e lesões de pele necróticas ' (Kvols et al. 1986, 1987, Ruszniewski et al. 1996, Caplin et al. 1998, Kulke & Mayer 1999, Wymenga et al. 1999). No entanto, a maioria dos pacientes a- presentam dessensibilização da inibição da secreção hormonal por octreoti- da e lanreotida dentro de semanas a meses.
Estas limitações sobre as tera- pias correntes representam um problema importante.
Tumores neuroendócrinos, incluindo tumores endócrinos gastro- enteropancreáticos e adenomas da pituitária são doenças raras e heterogê- neas (tabela 1). Em consequência seu prognóstico e sobrevida de longo termo não são conhecidos de modo geral.
Independente das perspectivas de sobrevida, as secreções excessivas a partir de semelhantes tumores pode afetar notavelmente a qualidade de vida para os indivíduos afetados e deste modoo tratamento eficaz desta função aberrante é um requisito para manter a qualidade de vida dos doentes.
' 3 Tabela 1 - Incidência / prevalência de tumores neuroendócrinos importante (Estados Unidos, a menos que determinado de modo diverso) tumores carci- | São diagnosticados cerca de 5.000 tumores carcinoides noides anualmente.
De acordo com o NCI, Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos (National Cancer Institute), cerca de 74% destes tumores se originam no trato gas- tro intestinal e 25% ocorrem no trato respiratório.
Carci- noides são raros em crianças e são mais comuns em pacientes mais velhos do que a idade de 50 anos.
São duas vezes mais comuns em homens.
Tumores carci- noides do apêndice geralmente são benignos e frequen- temente ocorrem entre as idades de 20 e 40 anos. ' Insulinomas A incidência é de cerca de 4 casos por milhão por ano e a prevalência é de cerca de 4 por milhão da população - por ano Gastrinomas | A incidência de gastrinomas ocorrendo esporadicamente ou em associação com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN-1) é de 0,1 a 3 por milhão.
A prevalência de MEN-1 é de 0,2 a 2 por 100.000. MEN-1 é diagnosticada em 30 a 38% dos pacientes com gastrinomas, ao passo que é visto que 20 a 61% dos pacientes diagnosticados com MEN-1 têm gastrinomas associados com a Sín- drome de Zollinger-Ellison (ZES) Glucagonomas Glucagonoma é listado como uma "doença rara" pelo Office of Rare Diseases (ORD) dos National Institutes of Health (NIH). Prevalência = cerca de 1 em 2.720.000 pessoas nos EUA Prolactinoma Incidência: 6 a 10 por milhão por ano.
Prevalência 60 a 100 por milhão somatotrofino- | Prevalência de Acromegalia: 40 a 60 por milhão de pes- ma soas afetadas a qualquer tempo; Incidência (anual) de Acromegalia: 3 por milhão de casos anuais corticotrofinoma Incidência: 2 a 3 por milhão por ano.
Prevalência 20 a 30 por milhão
' 4 feocromocitoma | Nos países ocidentais a prevalência de feocromocitoma pode ser estimada como estando situada entre 1:6.500 a 1:2.500 com uma incidência anual nos Estados Unidos de 500 a 1.100 casos por ano [oramama OO ee Geralmente os sintomas destes tumores variam dependendo do tipo de tumor uma vez que eles secretam cada hormônio diferente causando sintomas diferentes (tabela 2). Tabela 2 - Sintomas ou doenças causados por hipersecreção de tumores neuroendócrinos Tipo tumoral Patofisiologia e sintomas (causados por hipersecreção . ao invés de pela massa tumoral) tumores carci- Uma combinação de sintomas que resultam da secre- - noides ção de hormônio ou substâncias semelhantes a hormô- nio (por exemplo, serotonina, gastrina, ACTH, histami- na) que são produzidas por alguns tumores carcinoides.
Estes sintomas incluem vermelhidão, diarreia, dor ab- dominal semelhante a cãibra, inchação da pele ou face e pescoço, respiração ofegante, ganho de peso, au- mento do pelo corporal e facial, diabetes, cefaléias, e- dema, lacrimejamento, fraqueza, hipertensão pulmonar, sintomas de falência cardíaca incluindo encurtamento da respiração Insulinomas Visão turva, diplopia, fraqueza, palpitações, confusão e comportamento bizarro.
Tende a ocorrer hipoglicemia 5 horas ou cerca de 5 horas depois de uma refeição e os sintomas associados podem ser afetados pela dieta, ingestão de etanol e exercício ViPomas Diarreia aquosa (3 a 20 litror por dia), hipocalemia, hi- pomagnesemia, hipercalcemia, acidose, vermelhidão, bexiga distendida flácida, íleo/ subíleo.
Diabetes ou in- tolerância a glicose também são comuns.
Glucagonomas | Erupção eritematosa necrolítica (frequentemente sobre a face, extremidades e áreas intertriginosas), anemia, perda de peso, tolerância à glicose prejudicada, trom- bose e diarreia.
" 5 Tipo tumoral Patofisiologia e sintomas (causados por hipersecreção ao invés de pela massa tumoral) corticotrofinoma | doença de Cushing resultante de ACTH induzindo ex- cesso de cortisol circulante somatotrofinoma Acromegalia prolactinoma oligomenorreia / amenorreia, galactorreia, secura vagi- nal, perda de libido em fêmeas; disfunção sexual (impo- tência), galactorreia e ginecomastia em machos feocromocitoma Uma ampla gama de sintomas resultantes de ações metabólicas e hemodinâmicas de catecolaminas circu- lantes.
Hipertensão sustentada ou paroxísmica é o sinal clínico mais comum encontrado em mais de 90% dos pacientes; com frequência decrescente:- cefaléia, palpi- tações, palidez, náusea, vermelhidão, perda de peso, cansaço.
Ansiedade / pânico, hipotensão ortostática, hiperglicemia Tirotrofinoma Tireotoxicose (hiperatividade da glândula tiroide), cujos sintomas incluem perda de peso ao invés de aumento do apetite, frequência cardíaca rápida, um fino tremor, aumento do nervosismo e instabilidade emocional, into- lerância ao calor, e transpiração excessiva perceptível, olhos esbugalhados, hipertrofia da glândula tiroide; em cerca de um terço dos casos, o tumor também produz excesso de hormônio do crescimento resultando em acromegalia branda As terapias correntes são altamente individualizadas uma vez que os sintomas experimentados por cada paciente são frequentemente di- ferentes e também podem estar mudando com o tempo.
Os três objetivos potenciais de tratar um paciente são (1) remover o tumor, (2) retardar ou in- terromper o crescimento do tumor ou (3) melhorar os sintomas causados por hipersecreção do tumor — todos os três podem ser buscados em combina- ção.
As terapias correntes mais comuns são descritas abaixo.
Tumores carcinoides / síndrome carcinoide Uma abordagem dupla é frequentemente usada no tratamento de síndrome carcinoide, iniciando com cirurgia para remover o tumor ou re- duzir seu tamanho, seguida por tratamento com quimioterapia ou interferons.
Um procedimento conhecido como embolização hepática pode ser usado
' 6 para controlar câncer que se disseminou a partir de um tumor carcinoide dentro do fígado; ajuda a reduzir sintomas reduzindo o suprimento sanguí- neo para o fígado e matando de fome as células tumorais.
Uma segunda abordagem envolve tratar sintomas com diferen- tes medicações: diuréticos para doença do coração, broncodilatadores para respiração ofegante, análogos de somatostatina para respiração ofegante, diarreia e vermelhidão.
Insulinomas Os sintomas de insulinomas algumas vezes podem ser tratados através de regulação da dieta (por exemplo, por ingestão de carboidrato complexo de liberação lenta e frequente; goma guar). Com insulinoma ma- 7 ligno, podem ser encontradas metástases nos linfonodos circundantes e no fígado.
Se o tumor não pode ser localizado antes ou durante cirurgia (intra- ' operativamente), pode ser removidos através de pancreatectomia distal.
Gastrinomas Em pacientes com gastrinomas, medicação antissecretora tal cómo um inibidor de bomba de prótons é usada para controlar hipersecreção de ácido gástrico.
Se um paciente não puder tomar esta medicação, é reco- mendada uma gastrectomia total.
Foi demostrado que cirurgia produz um índicede cura de 30% em 5 anos, e é recomendada em pacientes sem me- tástases hepáticas, MEN 1, ou complicações de condições médicas que po- dem limitar a expectativa de vida. (Noventa e cinco por cento dos pacientes com gastrinomas têm tumores). Pacientes com doença metastática podem se benefiar de quimioterapia ou octreotida, se a quimioterapia fracassar.
ViPomas A terapia de primeira linha para ViPomas tem por objetivo corri- gir a profunda hipocalemia, desidratação e acidose metabólica por reposição de fluidos e eletrólitos.
Tipicamente são administrados aos pacientes até 5L de fluido e 350 mEq de potássio diariamente.
O tratamento ótimo para Vl- Pomas é a remoção cirúgica do tumor primário.
Glucagonomas Cirurgia é usada para aliviar os efeitos de glucagonomas ou para
' 7 reduzir o tamanho dos tumores, embora cerca de dois terços dos pacientes não sejam curados por cirurgia mesmo depois de localização com sucesso do tumor e avaliação de doença metastática.
Atualmente, não existem fár- maçcos ativos usados para tratar glucagonoma.
Prolactinomas O tratamento medicinal é geralmente com os agonistas de do- pamina bromocriptina ou cabergolina.
Estes fármacos encolhem o tumor e retornam os níveis de prolactina ao normal em cerca de 80 por cento dos pacientes.
No entanto, o uso destes agonistas é associado com efeitos cola- terais tais como náusea e vertigem.
Cirurgia é uma opção onde terapia me- dicinal não pode ser tolerada ou se não tiver êxito em reduzir os níveis de " prolactina, restaurar a reprodução normal e a função da pituitária, e reduzir o tamanho do tumor.
No entanto, os resultados da cirurgia dependem muito do tamanho do tumor e do nível de prolactina bem como do conhecimento e da experiência do neurocirurgião.
Dependendo do tamanho do tumor e de como é removido, estudos mostram que 20 a 50 por cento recidivarão, geralmente dentro de cinco anos.
Somatotrofinomas (por exemplo, causando acromegalia) O tratamento corrente para pacientes com acromegalia inclui te- rapias cirúrgicas, por radiação, e medicinais.
O tratamento depende do ta- manho e da extensão do tumor e da necessidade de rápida cessação da função hormonal que resulta em graves sequelas clínicas.
Os tratamentos de rotina incluem cirurgia (geralmente uma abordagem transesfenoidal) com ou sem terapia de radiação no pós operatório, tratamento com bromocripti- na, tratamento com octreotida e, mais recentemente, tratamento com pegvi- somant.
As terapias descritas acima têm sucesso variável.
Corticotrofinomas Para pacientes com adenomas corticotróficos, microcirurgia transesfenoidal é o tratamento de escolha.
No entanto, os índices de remis- são reportados na maioria das séries são de cerca de 70% a 90%. Terapia com fármacos é considerada como sendo um adjunto para microcirurgia transesfenoidal em casos com um tumor residual e em casos nos quais se
' 8 espera os efeitos da terapia de radiação. São usados inibidores da esteroi- dogênese, incluindo mitotane, metirapone, cetoconazol, e aminoglutetimida. Cetoconazol é destes agentes o melhor tolerado, embora somente em cerca de 70% dos pacientes. Terapia de radiação tem sido usada em pacientes que são considerados candidatos cirúrgicos pobres e também tem sido usa- da como terapia adjuvante em pacientes com tumor ativo residual ou recor- rente.
Feocromocitoma Remoção laparoscópica de tumor é o procedimento preferencial.
No entanto, complicações durante a cirurgia precisam ser mantidas em um mínimo por tratamento médico apropriado no pré-operatório para prevenir * graves complicações induzidas por catecolamina, e potencialmente com ris- co de vida durante a cirurgia, incluindo crises hipertensivas, arritmias cardía- ' cas, edema pulmonar, e isquemia cardíaca. Regimes tradicionais incluem bloqueadores —a-adrenoceptores, —bloqueadores “combinados a/B- adrenoceptores, e bloqueadores de canais de cálcio, todos os quais podem ter efeitos indesejados tanto antes quanto depois da cirurgia.
Tirotrofinomas Cirurgia transesfenoidal é o tratamento de escolha para pacien- tes com adenomas tirotróficos. Terapia de radiação adjuvante pode ser em- pregada quando se sabe que cirurgia é não curativa mesmo se o paciente ainda for eutiroidiano apesar de ser inevitável recaída, e o efeito pleno da terapia de radiação requer meses ou anos. A terapia medicinal pode ser ne- cessária para pacientes que ainda têm sintomas de hipertiroidismo apesar decirurgiae radiação externa.
Enquanto representam condições humanas raras, mas que afe- tam a vida, os tumores neuroendócrinos continuam a impor um problema importante para o tratamento da saúde animal em uma escala global. Por conseguinte, existe a necessidade na técnica de terapêuticos e terapias al- ternativos e/ ou aprimorados que tratam um ou mais dos problemas acima.
Em todos os casos, a cirurgia pode ser de sucesso limitado bem como ter riscos inerentes para o paciente. Além disso, tratamentos com fár-
, 9 macos correntes também não são garantia de sucesso para aliviar os sinto- mas em todos os pacientes. A presente invenção resolve um ou mais dos problemas acima ou riscos associados com cirurgia ou terapias medicinais existentes, propor- cionando uma nova categoria de agente não citotóxico designado para su- primir secreções tumorais indesejáveis (por exemplo, anormalmente eleva- das) e deste modo minimizando ou revertendo a doença resultante. Em mais detalhes, um primeiro aspecto da presente invenção proporciona um polipeptídeo para aplicação na supressão de secreção / se- creções de um tumor neuroendócrino, o referido polipeptídeo compreenden- do: * a. uma protease não citotóxica, cuja protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica em uma célula tumoral neuro- ' endócrina; b. uma Porção de Direcionamento (TM) que é capaz de ligar a um Sítio de Ligação sobre uma célula tumoral neuroendócrina, cujo Sítio de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser incorporado em um endos- soma dentro da célula tumoral neuroendócrina; e c. um domínio de translocação que é capaz de translocar a pro- tease de dentro de um endossoma, através da membrana endossômica e para dentro do citosol da célula tumoral neuroendócrina.
Na aplicação, um polipeptídeo da invenção liga a uma célula tu- moral neuroendócrina. Depois disso, o componente de translocação efetua o transporte do componente de protease para dentro do citosol da célula tumo- ral. Finalmente, uma vez dentro, a protease inibe o processo de fusão exocí- tica da célula tumoral neuroendócrina. Deste modo, inativando o aparelho de fusão exocítica da célula tumoral neuroendócrina, o polipeptídeo da inven- ção inibe secreção a partir da mesma. Por conseguinte, os polipeptídeos da presente invenção suprimem / tratam uma ou mais das várias condições pa- tofisiológicas ou sintomas listados na Tabela 2 acima.
As células-alvo principais da presente invenção são células tu- morais de origem neuroendócrina que secretam um ou mais hormônios (ou
' 10 outras moléculas bioativas) levando ao desenvolvimento de uma condição patofisiológica.
A presente invenção proporciona polipeptídeos que são capazes de (e para aplicação em) supressão da secreção de hormônios e/ou outras — moléculas bioativas de tumores neuroendócrinos.
Em um aspecto relacionado da presente invenção, é proporcio- nado um método para tratar um tumor neuroendócrino em um paciente, o referido método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo da presente invenção.
Sem desejar ser limitado por qualquer teoria, os presentes in- ventores acreditam que secreção indesejável (por exemplo, níveis incomuns ' de) de moléculas fisiologicamente ativas de tumores neuroendócrinos cau- sam e mantêm condições patológicas em um paciente. Deste modo, por ini- ] bição das referidas secreções, a progressão do estado de doença pode ser interrompida e os sintomas revertidos.
Os polipeptídeos da presente invenção são particularmente ade- quados para uso no tratamento de uma série de tumores neuroendócrinos, incluindo suas metástases secretoras de hormônio, condições pré- cancerosas e sintomas das mesmas. A este respeito, 'tratamento' inclui re- dução ou eliminação de secreções excessivas a partir de semelhantes célu- las.
A título de exemplo, células-alvo de tumor neuroendócrino im- portante da presente invenção incluem: adenomas da pituitária e/ ou tumo- res neuroendócrinos gastroenteropancreáticos (GEP-NETs). Os tumores —neuroendócrinos gastroenteropancreáticos estão localizados essencialmente no estômago, intestino ou pâncreas e secretam quantidades excessivas de hormônios e outras moléculas bioativas que são normalmente secretadas em níveis menores sob regulação fisiológica. Estas secreções contribuem para os sintomas experimentados pelos pacientes. Os tumores neuroendó- crinos gastroenteropancreáticos podem ser divididos em carcinoides e subti- pos não carcinoides.
Os tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos carcinoi-
' 1 des (55% de todos os tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos) tendem a ser classificados de acordo com sua localização tecidual e inclu- em, em ordem de prevalência, os originários de células no apêndice (38%), leo (23%), reto (13%) e brônquio (11,5%).
Os tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos não car- cinoides incluem insulinomas das ilhotas pancreáticas secretando excesso de insulina (17%), tumores de tipo desconhecido (15%), gastrinomas do pâncreas ou duodeno secretando excesso de gastrina (9%), ViPomas do pâncreas, pulmão ou ganglioneuromas, secretando excesso de polipeptídeo intestinal vasoativo, e glucagonomas, tumores das ilhotas pancreáticas se- cretando excesso de glucagon.
" Os tumores da pituitária, os quais tendem a ser classificados de acordo com seu tipo de secreção ou identidade celular, incluem: prolactino- ] mas secretando prolactina (os mais comuns), somatotrofinomas (hormônio do crescimento corticotrofinomas (hormônio adrenocorticotrófico), tirotrofi- nomas (hormônio estimulante da tiroide), gonadotrofinomas (FSH, LH), e adenomas da pituitária não funcionantes.
Outros tumores secretores incluem tumores medulares da tiroi- de, tumores pulmonares de células pequenas e não pequenas, tumores de célulasde Merkel, e feocromocitomas. Os últimos podem ser fatais caso o excesso de adrenalina secretada leve a grave hipertensão. A hipersecreção referida pode tornar o indivíduo inadequado para cirurgia para remover a massa tumoral e assim pode surgir um ciclo de reforço prejudicial e é dese- jável tratamento do tumor para minimizar a secreção.
Um subgrupo particularmente preferencial de células tumorais neuroendócrinas tratado pela presente invenção é: insulinomas, gastrino- mas, ViPomas, glucagonomas, prolactinomas, somatotrofinomas, corticotro- finomas, tirotrofinomas e feocromocitomas.
Por supressão das funções secretoras de células tumorais neu- —roendócrinas (tais como o subgrupo de células tumorais acima), a presente invenção proporciona uma terapia para o tratamento de, entre outras, condi- ções tais como doença de Cushing, acromegalia, síndrome carcinoide, sín-
' 12 drome hipoglicêmica, eritema migratório necrolítico, síndrome de Zollinger- Ellison e síndrome de Verner-Morrison. Também são proporcionadas terapi- as para tratamento dos sintomas decorrentes de secreções de tumores neu- roendócrinos indesejáveis (vide a Tabela 2).
O componente 'bioativo' dos polipeptídeos da presente invenção é proporcionado por uma protease não citotóxica. Este grupo distinto de pro- teases agem por proteínas de transporte intracelular por clivagem proteolíti- ca conhecidas como proteínas SNARE (por exemplo, SNAP-25, VAMP, ou Sintaxina) — vide Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. O acrônimo SNARE deriva do termo Receptor de Anexação de NSF Solúvel, onde NSF significa Fator Sensível a N- 7 etimaleimida. Proteínas SNARE são integrais para formação de vesícula intracelular, e portanto para secreção de moléculas através de transporte de Ú vesícula de uma célula. Por conseguinte, uma vez liberada para uma célula- alvo desejada, a protease não citotóxica é capaz de inibir a secreção celular da célula-alvo.
Proteases não citotóxicas são uma classe distinta de moléculas que não mata células; ao invés, elas agem inibindo processos celulares dife- rentes da síntese de proteína. Proteases não citotóxicas são produzidas co- mo partede uma molécula de toxina maior por uma variedade de plantas, e por uma variedade de micro-organismos tais como Clostridium sp. e Neisse- ria sp.
Neurotoxinas clostridiais representam um grupo importante de moléculas de toxinas não citotóxicas, e compreendem duas cadeias de poli- peptídeos ligadas juntas por uma ligação dissulfeto. As duas cadeias são denominadas a cadeia pesada (cadeia H), a qual tem uma massa molecular de cerca de 100 kDa, e a cadeia curta (cadeia L), a qual tem uma massa molecular de cerca de 50 kDa. É a cadeia L, a qual possui uma função de protease e apresenta uma elevada especificidade de substrato para proteí- nas associadas com vesícula e/ou membrana plasmática (SNARE) envolvi- das no processo exocítico (por exemplo, sinaptobrevina, sintaxina ou SNAP- 25). Estes substratos são componentes importantes do mecanismo neuros-
' 13 secretor.
Neisseria sp., a mais importante da espécie N. gonorrhoeae, e Streptococcus sp., o mais importante da espécie S. pneumoniae, produzem moléculas de toxinas não citotóxicas funcionalmente similares. Um exemplo deumaprotease não citotóxica semelhante é protease de IgA (vide a publi- cação de Patente Internacional No. WO 99/58571, a qual é por este incorpo- rada em sua totalidade por meio de referência à mesma). Deste modo, a protease não citotóxica da presente invenção é preferencialmente uma pro- tease de neurotoxina clostridial ou uma protease de IgA. Voltando agora ao componente da Porção de Direcionamento (TM) da presente invenção, é este componente que liga o polipeptídeo da ] presente invenção a uma célula tumoral neuroendócrina.
Deste modo, uma porção de direcionamento da presente inven- ' ção liga a um receptor sobre uma célula tumoral neuroendócrina. A título de exemplo, uma porção de direcionamento da presente invenção pode ligar a um receptor selecionado entre o grupo compreendendo: um receptor de so- matostatina (SST), incluindo variantes de junção do mesmo (por exemplo, sst,, ssto, ssta, sst, e ssts); um receptor do hormônio de liberação do hormô- nio do crescimento (GHRH) — também conhecido como um receptor de GRF; um receptor de grelina; um receptor de bombesina (por exemplo, BRS-1, BRS-2, ou BRS-3); um receptor de urotensina (por exemplo, um receptor de urotensina ll); um receptor do hormônio de concentração de melanina 1; um receptor do hormônio de liberação de prolactina; um receptor do hormônio de liberação de gonadotropina (GNRHR) tal como um receptor de GRNRHR Tipo1e/ouum receptor de GNRHR Tipo 2; e/ ou um receptor KiSS-1.
Em uma modalidade, uma porção de direcionamento (TM) da presente invenção liga a um receptor de somatostatina (SST). Exemplos de porções de direcionamento de peptídeos SST adequados incluem SST de extensão total e cortistatina (CST), bem como truncações e análogos peptí- dicos dos mesmos tais como: SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC (SST-28); AGCKNFFWKTFTSC (SST-14)) QEINTERVALOPQOSARR- DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-29); QERPPLQQPP-
: 14 HRDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); QERPPPQQPP- HLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29)) DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST- 17); PCERNFFWKTFSSCK (CST-14); e PEKNFFWKTFSSCK (CST-14); D- Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052), D-Phe-Phe-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056) ou c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Cys]-NH> (BIM23268); peptídeos de octreotida, peptídeos de lanreotida, BIM23027, CYN154806, BIM23027, peptídeos de vapreotida, peptídeos de seglitida, e SOM230. Estas porções de direcionamento ligam a sst recepto- res, tais como sst,, ssto, sst;, sst, e sst; receptores, os quais estão presentes sobre células tumorais neuroendócrinas relevantes para a presente invenção — vide a Tabela 3. SST e CST têm elevada homologia estrutural, e ligam a ' todos os sst receptores conhecidos.
Tabela 3 ' Expressão de subtipos de receptores de somatostatina em tumores neuro- —endócrinos gastroenteropancreáticos (%) ssti ss? sst3ô sst4 sst5 Todos os tumores 68 86 46 93 57 Insulinoma 33 100 33 100 67 Gastrinoma 33 50 17 83 50 Glucagonoma 67 100 67 67 67 ViPoma 100 100 100 100 100 Não funcionantes 80 100 40 100 60 tumores neuroendócrinos do intestino — 80 95 65 35 75 médio Em outra modalidade, uma porção de direcionamento da presen- te invenção liga a um receptor do hormônio de liberação do hormônio do crescimento (GHRH). GHRH também é conhecido como fator de liberação do hormônio do crescimento (GRF ou GHRF) ou somatocrinina.
Peptídeos —GHRH adequados incluem peptídeo GHRH de extensão total (1-44), e trun- cações do mesmo tais como GHRH (1-27, 1-28, 1-29), GHRH (1-37), e GH- RH (1-40, 1-43)-OH, bem como análogos peptídicos tais como: BIM 28011 ou NC-9-96; [MeTyr1,Ala15,22 Nle27]--hGHRH(1-29)-NH2; MeT- yr1,Ala8,9,15,22,28 Nle27]--hGHRH(1-29)-NH2; ciclo(25-
: 15 29)[MeTyr1,Ala15,DAsp25,Nle27,0m29+ ++]-heHRH(1-29)-NH2; (D-Tyr1)- GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3)-GHRH (1-29)- NH2; (D-Ala4)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Thr7)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asn8)- GHRH (1-29)-NH2; (D-Ser9)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Tyr10)-GHRH (1-29)- i 5 NH2;(Phe4)-GHRH (1-29)-NH2; (pCI-Phe6)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyr1)- GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-D-Tyr1, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-D-Tyr1, D-Ala 2, D-Asp3)-GHRH (1-29)- NH2; (D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (His1, D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-His1, D-Ala2, N-Leu27)-GHRH (1-29)-NH2; (His1, D-Ala 2,D-Ala4, Nleu27)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)- GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; [His1, ' NLeu27]--hGHRH(1-29)-NH2; [NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2; H-Tyr-Ala-Asp- Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys- Ú Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-GlIn-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly- Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg- Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg- NH2; H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- Glin-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; H-Tyr-Ala- Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-lle-Leu-Gly-Gin-Leu-Ser-Ala-Arg- Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gin-Glu- GIn-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser- Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gin-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gin-Asp-lle-Met- Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu- NH2; His-Val-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Gln-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu- SerAla-Arglys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Leu-Asn-Arg; His-Val-Asp-Ala-lle-Phe- Thr-Gin-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-lle-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.
Em outra modalidade, uma porção de direcionamento da presen- te invenção liga a um receptor de grelina.
Exemplos de porções de direcio- —namento adequadas a este respeito incluem: peptídeos de grelina tais como grelina de extensão total (por exemplo, grelina;17) e truncações e análogos peptídicos da mesma tais como grelinaza 117, grelinas2-117, [Trp3, Arg5)-grelina
: 16 (1-5), des-Gin-Grelina, cortistatina-8, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH,, peptídeo de liberação de hormônio do crescimento (por exemplo, GHRP-6), ou hexarelina.
Em uma modalidade adicional, a porção de direcionamento liga aum receptor de bombesina (por exemplo, BRS-1, BRS-2, ou BRS-3). E- xemplos de peptídeos de bombesina adequados incluem: bombesina de ex- tensão total - um peptídeo de 14 aminoácidos isolado originalmente da pele de um sapo (pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- NH;>); e os dois homólogos conhecidos em mamíferos, a saber neuromedina B,e(GRP) tais como: GRP porcino - Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr- Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met- 7 NH2, e GRP humano - Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr- Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH.. — Refe- B rência a peptídeos de bombesina engloba homólogos dos mesmos tais co- mo neuromedina B e GRP, e inclui truncações e análogos peptídicos dos mesmos.
Em outra modalidade, uma porção de direcionamento da presen- te invenção liga a um receptor de urotensina. Porções de direcionamento adequadas a este respeito incluem peptídeos de urotensina tais como Uro- tensina-ll (U-ll), o qual é um neuropeptídeo cíclico. A região cíclica de C- terminal de U-ll é fortemente conservada através de diferentes espécies, e inclui os seis resíduos aminoácidos (-Cys Ple-Trp-Lys-Tyr-Cys-), a qual é estruturalmente similar à região central de somatostatina-14 (-Phe-Trp-Lys- Thr-). Peptídeos de urotensina da presente invenção incluem os peptídeos precursores de U-ll, tais como prepro-urotensina-ll (incluindo as duas iso- formas humanas 124 e 139 dos mesmos) bem como outras truncações tais como a forma de peptídeo maduro de onze resíduos e análogos peptídicos do mesmo.
Em uma modalidade adicional, uma porção de direcionamento da presente invenção liga a um receptor do hormônio de concentração de melanina 1. Exemplos de porções de direcionamento adequadas a este res- peito incluem: peptídeos de hormônio de concentração de melanina (MCH)
' 17 tais como MCH de extensão total, truncações e análogos dos mesmos.
Em outra modalidade, uma porção de direcionamento da presen- te invenção liga a um receptor do hormônio de liberação de prolactina. Um exemplo de uma porção de direcionamento adequada a este respeito inclui peptídeo de liberação de prolactina, truncações e análogos dos mesmos.
Em outra modalidade, uma porção de direcionamento da presen- te invenção liga a um receptor do hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH). GnRH é também conhecido como Hormônio de Liberação de Hor- mônio Luteinizante (LHRH). Exemplos de porções de direcionamento de re- ceptorde GnRH adequadas incluem: peptídeos GnRHI, peptídeos GnRHII e peptídeos GnRHIII, por exemplo o polipeptídeo precursor de GnRH de ex- " tensão total de 92 aminoácidos e truncações do mesmo tais como o deca- peptídeo: pyroGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly CONH2. i Em uma modalidade adicional, uma porção de direcionamento da presente invenção liga a um receptor KiSS-1. Exemplos de porções de direcionamento adequadas a este respeito incluem peptídeos Kisspeptina- 10, Kisspeptina-54, truncações e análogos dos mesmos.
De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição de substância, a saber um polipeptídeo compreendendo: a. uma protease não citotóxica, cuja protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica em uma célula tumoral neuro- endócrina; b. uma Porção de Direcionamento (TM) que é capaz de ligar a um Sítio de Ligação sobre uma célula tumoral neuroendócrina, cujo Sítio de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser incorporado em um endos- soma dentro da célula tumoral neuroendócrina; e c. um domínio de translocação que é capaz de translocar a pro- tease de dentro de um endossoma, através da membrana endossômica e paradentrodo citosol da célula tumoral neuroendócrina.
Todas as característicais do primeiro aspecto da presente inven- ção se aplicam igualmente ao segundo aspecto descrito acima.
] 18 Em uma modalidade preferencial do primeiro aspecto e/ ou do segundo aspecto da presente invenção, a porção de direcionamento tem uma sequência de aminoácidos de peptídeo humano. Deste modo, uma por- ção de direcionamento altamente preferencial é um peptídeo SST humano, um peptídeo CST humano ou um peptídeo GHRH humano.
Preparação de polipeptídeos Os polipeptídeos da presente invenção compreendem 3 compo- nentes principais: um 'bioativo' (isto é, uma protease não citotóxica); uma porção de direcionamento; e um domínio de translocação. A tecnologia geral associada com a preparação de semelhantes proteínas de fusão é frequen- temente referida como tecnologia de toxina redirecionada. A título de exem- ' plificação, foi consultado: a Publicação de Patente Internacional No. WO 94/21300; a Publicação de Patente Internacional No. WO 96/33273; a Publi- ] cação de Patente Internacional No. WO 98/07864; a Publicação de Patente Internacional No. WO 00/10598; a Publicação de Patente Internacional No. WO 01/21213; a Publicação de Patente Internacional No. WO 06/059093; a Publicação de Patente Internacional No. WO 00/62814; a Publicação de Pa- tente Internacional No. WO 00/04926; a Publicação de Patente Internacional No. WO 93/15766; a Publicação de Patente Internacional No. WO 00/61192; ea bPublicação de Patente Internacional No. WO 99/58571. Todas estas pu- blicações são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência às mesmas.
Em mais detalhes, o componente da porção de direcionamento da presente invenção pode ser fundido ou ao componente de protease ou ao componente de translocação da presente invenção. A referida fusão é prefe- rencialmente por meio de uma ligação covalente, por exemplo quer uma li- gação covalente direta ou através de uma molécula espaçadora / encadea- dora. O componente de protease e o componente de translocação são prefe- rencialmente encadeados juntos através de uma ligação covalente, por e- xemplo quer uma ligação covalente direta ou através de uma molécula es- paçadora / encadeadora. Moléculas espaçadoras / encadeadas adequadas são de conhecimento geral na técnica, e tipicamente compreendem uma
' 19 sequência à base de aminoácidos de entre 5 e 40, preferencialmente entre 10 e 30 resíduos aminoácidos de extensão.
Na aplicação, os polipeptídeos têm uma conformação de bi- cadeia, em que o componente de protease e o componente de translocação sãoencadeados juntos, preferencialmente através de uma ligação dissulfeto.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser preparados por técnicas de conjugação química convencional, as quais são de conheci- mento geral de uma pessoa versada.
A título de exemplo, é feita referência a Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, e a Wong, S.S. (1991), Química de conjugação e reticulação de proteína (Che- mistry of protein conjugation and cross-linking), CRC Press, Nagy ef al., " PNAS 95 p1794-99 (1998). Metodologias detalhadas adicionais para fixação de porções de direcionamento sintéticas a um polipeptídeo da presente in- Ú venção são proporcionadas, por exemplo, na Patente Européia No.
EP0257742.As publicações de conjugação mencionadas acima são incorpo- radas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência às mes- mas.
Alternativamente, os polipeptídeos podem ser preparados por preparação recombinante de uma única polipeptídeo proteína de fusão (vide, porexemplo, a Publicação de Patente Internacional No.
WO 98/07864). Esta técnica se baseia no mecanismo bacteriano in vivo pelo qual neurotoxina clostridial nativa (isto é, holotoxina) é preparada, e resulta em uma proteína de fusão tendo a seguinte disposição estrutural 'simplificada": NH>2 - [componente de protease] — [componente de translocação] —-[TM]- COOH De acordo com a Publicação de Patente Internacional No.
WO 98/07864, a porção de direcionamento é disposta em direção à extremidade de C-terminal da proteína de fusão.
A proteína de fusão é então ativada por tratamento com uma protease, a qual cliva em um sítio entre o componente de proteaseeo componente de translocação.
Uma proteína de cadeia dupla é produzida deste modo, compreendendo o componente de protease como uma cadeia única de polipeptídeo anexada de modo covalente (através de
, 20 uma ponte de dissulfeto) a outra cadeia única de polipeptídeo contendo o componente de translocação mais porção de direcionamento.
Alternativamente, de acordo com Publicação de Patente Interna- cional No.
WO 06/059093, o componente da porção de direcionamento da proteína de fusão é localizado em direção ao meio da sequência de proteína de fusão linear, entre o sítio de clivagem da protease e o componente de translocação.
Isto assegura que a porção de direcionamento seja anexada ao domínio de translocação (isto é, como ocorre com holotoxina clostridial nativa), embora neste caso os dois componentes sejam revertidos em ordem faceaface com a holotoxina nativa.
Clivagem subsequente no sítio de cliva- gem de protease expõe a porção N-terminal da porção de direcionamento, e ' proporciona a proteína de fusão do polipeptídeo bi-cadeia.
A uma ou mais sequências de clivagem de protease acima men- cionadas podem ser introduzidas (e/ ou qualquer sequência de clivagem ine- rente removida) no nível de DNA por meios convencionais, tais como por mutagênese sítio-dirigida.
Triagem para confirmar a presença de sequências de clivagem pode ser realizada manualmente ou com a assistência de pro- grama de computação (por exemplo, o programa MapDraw da DNASTAR, Inc.). Apesar de poder ser empregado qualquer sítio de clivagem de protea- se(istoé, clostridial, ou não clostridial), os seguintes são preferenciais: Enteroquinase (DDDDK)J]) Fator Xa (IEGR| / IDGR)) TEV (vírus "Etch" do tabaco) (ENLYFQJG) Trombina (LVPRIGS) PreScission (LEVLFQ GP). Sítios de clivagem de protease adicionais incluem sequências de reconhecimento que são clivadas por uma protease não citotóxica, por e- xemplo por uma neurotoxina clostridial.
Estas incluem as sequências de re- conhecimento de proteina SNARE (por exemplo, SNAP-25, sintaxina, VAMP) que são clivadas por proteases não citotóxicas tais como neurotoxi- nas clostridiais.
Exemplos particulares são proporcionados na Patente dos Estados Unidos No.
US2007/0166332, a qual é por este incorporada em sua
' 21 totalidade por meio de referência à mesma.
Também englobado pelo termo sítio de clivagem de protease é uma inteína, a qual é uma sequência autoclivante. A reação de autojunção é controlável, por exemplo, variando a concentração de agente redutor presen- te Os sítios de clivagem de 'ativação' mencionados acima também podem ser empregados como um sítio de clivagem 'destrutivo' (discutido abaixo) caso um sítio de clivagem de ativação seja incorporado em um polipeptídeo da presente invenção.
Em uma modalidade preferencial, a proteína de fusão da presen- teinvenção pode compreender uma ou mais etiquetas de purificação locali- zadas em N-terminal e/ ou C-terminal. Apesar de poder ser empregada ' qualquer etiqueta de purificação, as seguintes são preferenciais: Etiqueta de His (por exemplo, 6 x histidina), preferencialmente Ú como uma etiqueta de C-terminal e/ ou N-terminal Etiqueta de MBP (proteína de ligação de maitose), preferencial- mente como uma etiqueta de N-terminal Etiqueta de GST (glutationa-S-transferase), preferencialmente como uma etiqueta de N-terminal Etiqueta de His-MBP, preferencialmente como uma etiqueta de N-Herminal Etiqueta de GST-MBP, preferencialmente como uma etiqueta de N-terminal Etiqueta de Tioredoxina, preferencialmente como uma etiqueta de N-terminal Etiqueta de CBD (Domínio de Ligação de Quitina), preferencial- mente como uma etiqueta de N-terminal.
Uma ou mais moléculas espaçadoras / encadeadoras de peptí- deos podem ser incluídas na proteína de fusão. Por exemplo, um ligante de peptídeo pode ser empregado entre uma etiqueta de purificação e o resto da molécula da proteína de fusão.
Deste modo, um terceiro aspecto da presente invenção propor- ciona uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, DNA) codificando um
, 22 polipeptídeo conforme descrito acima (isto é, o segundo aspecto da presente invenção).
O ácido nucleico referido pode ser incluído sob a forma de um vetor, tal como um plasmídeo, o qual pode opcionalmente incluir uma ou maisde uma origem de replicação, um sítio de integração de ácido nucleico, um promotor, um terminador, e um sítio de ligação de ribossoma.
A presente invenção também inclui um método para expressar a sequência de ácido nucleico descrita acima (isto é, o terceiro aspecto da presente invenção) em uma célula hospedeira, em particular em E. coli ou através de um sistema de expressão de baculovírus.
A presente invenção também inclui um método para ativar um " polipeptídeo da presente invenção, o método referido compreendendo con- tactar o polipeptídeo com uma protease que cliva o polipeptídeo em um sítio i de reconhecimento (sítio de clivagem) localizado entre o componente de pro- tease não citotóxica e o componente de translocação, deste modo conver- tendo o polipeptídeo em um polipeptídeo bi-cadeia em que os componentes de protease não citotóxica e de translocação são ligados juntos por uma |i- gação dissulfeto. Em uma modalidade preferencial, o sítio de reconhecimen- to não é nativo para uma neurotoxina clostridial que ocorre naturalmente e/ ouparauma protease de IgA que ocorre naturalmente.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser adicionalmen- te modificados para reduzir ou prevenir efeitos colaterais indesejados asso- ciados com dispersão em áreas não alvo. De acordo com esta modalidade, o polipeptídeo compreende um sítio de clivagem destrutiva. O sítio de cliva- gem destrutiva é distinto do sítio de 'ativação' (isto é, formação bi-cadeia), e é clivável por uma segunda protease e não pela protease não citotóxica. A- lém disso, quando clivado deste modo no sítio de clivagem destrutiva pela segunda protease, o polipeptídeo tem potência reduzida (por exemplo, redu- zida capacidade de ligação à célula-alvo pretendida, atividade de transloca- çãoreduzida e/ ou atividade de protease não citotóxica reduzida). Para tota- lidade, quaisquer dos sítios de clivagem 'destrutivos' da presente invenção podem ser empregados separadamente como um sítio de 'ativação' em um
] 23 polipeptídeo da presente invenção.
Deste modo, de acordo com esta modalidade, a presente inven- ção proporciona um polipeptídeo que pode ser controlavelmente inativado e/ ou destruído em uma localização fora do sítio.
Em uma modalidade preferencial, o sítio de clivagem destrutiva é reconhecido e clivado por uma segunda protease (isto é, uma protease destrutiva) selecionada entre uma protease circulante (por exemplo, uma protease extracelular, tal como uma protease sérica ou uma protease da cascata de coagulação sanguínea), uma protease tecidual-associada (por exemplo, uma metaloprotease da matriz (MMP), tal como uma MMP de músculo), e uma protease intracelular (preferencialmente uma protease que ' está ausente da célula-alvo). Deste modo, na aplicação, caso um polipeptídeo da presente in- venção se tome dispersado longe de sua célula-alvo pretendida e/ ou seja absorvido por uma célula-não-alvo, o polipeptídeo se tornará inativado por clivagem do sítio de clivagem destrutiva (pela segunda protease).
Em uma modalidade, o sítio de clivagem destrutiva é reconheci- do e clivado por uma segunda protease que está presente dentro de um tipo celular off-site. Nesta modalidade, a célula fora do sítio e a célula-alvo são preferencialmente tipos celulares diferentes. Alternativamente (ou adicional- mente), o sítio de clivagem destrutiva é reconhecido e clivado por uma se- gunda protease que está presente em uma localização off-site (por exemplo, distal à célula-alvo). Por conseguinte, quando ocorre clivagem destrutiva ex- tracelularmente, a célula-alvo e a célula off-site podem ser ou os mesmos tipos celulares ou diferentes. A este respeito, a célula-alvo e a célula off-site podem cada possuir um receptor ao qual liga o mesmo polipeptídeo da in- venção.
O sítio de clivagem destrutiva da presente invenção proporciona inativação/ destruição do polipeptídeo quando o polipeptídeo está dentro ou em uma localização off-site. A este respeito, clivagem no sítio de clivagem destrutiva minimiza a potência do polipeptídeo (em comparação com um po- lipeptídeo idêntico carecendo do mesmo sítio de clivagem destrutiva, ou
: 24 possuindo o mesmo sítio destrutivo mas em uma forma não clivada). A título de exemplo, potência reduzida incluí: ligação reduzida (a um receptor celular de mamífero) e/ ou translocação reduzida (através da membrana endossô- mica de uma célula de mamífero na direção do citosol ), e/ ou reduzida cli- vagem de proteína SNARE.
Ao selecionar um ou mais sítios de clivagem destrutivos no con- texto da presente invenção, é preferencial que o um ou mais sítios de cliva- gem destrutivos não são substratos para quaisquer proteases que podem ser usadas separadamente para modificação pós- translacional do polipepti- deoda presente invenção como parte de seu processo de fabricação. A este respeito, as proteases não citotóxicas da presente invenção tipicamente em- ' pregam um evento de ativação de protease (através de um sítio de clivagem de protease de 'ativação' separado, o qual é estruturalmente distinto do sítio i de clivagem destrutiva da presente invenção). A finalidade do sítio de cliva- gem de ativação é clivar uma ligação de peptídeo entre a protease não cito- tóxica e os componentes de translocação ou os de ligação do polipeptídeo da presente invenção, deste modo proporcionando um polipeptídeo bi- cadeia 'ativado' em que os dois componentes referidos são encadeados jun- tos através de uma ligação di-sulfeto.
Deste modo, para ajudar a assegurar que o um ou mais sítios de clivagem destrutivos dos polipeptídeos da presente invenção não afetam de modo adverso o sítio de clivagem de 'ativação' e subsequente formação de ligação dissulfeto, os precedentes são preferencialmente introduzidos no polipeptídeo da presente invenção em uma posição de no mínimo 20, no mínimo 30, no mínimo 40, no mínimo 50, e mais preferencialmente no míni- mo 60, no mínimo 70, no mínimo 80 resíduos aminoácidos (contíguos) fora do sítio de clivagem de 'ativação'.
O um ou mais sítios de clivagem destrutivo e o sítio de clivagem de ativação são preferencialmente exógenos (isto é, manipulados / artificiais) com respeito aos componentes nativos do polipeptídeo. Em outras palavras, os sítios de clivagem referidos preferencialmente não são inerentes aos componentes nativos correspondentes do polipeptídeo. A título de exemplo,
' 25 um componente de protease ou de translocação à base de cadeia curta ou cadeia pesada de BoNT/A (respectivamente) pode ser manipulado de acor- do com a presente invenção para incluir um sítio de clivagem. O sítio de cli- vagem referido, no entanto, não estaria presente na cadeia curta ou na ca- deia pesada nativa BoNT correspondente. De modo similar, quando o com- ponente da Porção de Direcionamento do polipeptídeo é manipulado para incluir um sítio de clivagem de protease, o sítio de clivagem referido não es- taria presente na sequência nativa correspondente da Porção de Direciona- mento correspondente. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos e o sítio de clivagem de 'ativação' não ' são clivados pela mesma protease. Em uma modalidade, os dois sítios de clivagem diferem um do outro em que no mínimo um, mais preferencialmen- S te no mínimo dois, de modo particularmente preferencial no mínimo três, e o mais preferencialmente no mínimo quatro dos aminoácidos tolerados dentro das sequências de reconhecimento respectivas é/ são diferentes.
A título de exemplo, no caso de uma quimera de polipeptídeo contendo um sítio de 'ativação' do Fator Xa entre componentes clostridiais de cadeia curta e Hy, é preferencial empregar um sítio de clivagem destruti- vaqueéunm sítio diferente de um sítio de Fator Xa, o qual pode ser inserido alhures na cadeia curta e/ ou Hy e/ ou um ou mais componentes de porção de direcionamento. Neste cenário, o polipeptídeo pode ser modificado para conciliar um sítio de 'ativação' alternativo entre os componentes de cadeia curta e Hy (por exemplo, um sítio de clivagem de enteroquinase), em cujo casoum sítio de clivagem de Fator Xa separado pode ser incorporado alhu- res dentro do polipeptídeo como o sítio de clivagem destrutiva. Alternativa- mente, o sítio de 'ativação' de Fator Xa existente entre os componentes de cadeia curta e Hy pode ser retido, e um sítio de clivagem alternativo tal como um sítio de clivagem de trombina incorporado como o sítio de clivagem des- trutiva.
Ao identificar sítios adequados dentro da sequência primária de quaisquer dos componentes da presente invenção para inclusão de um ou
' 26 mais sítios de clivagem, é preferencial selecionar uma sequência primária que combina intimamente com o sítio de clivagem proposto que deve ser inserido. Ao fazer isso, mínimas alterações estruturais são introduzidas no polipeptídeo. A título de exemplo, sítios de clivagem tipicamente compreen- dem no mínimo 3 resíduos aminoácidos contíguos. Deste modo, em uma modalidade preferencial, é selecionado um sítio de clivagem que já possui (na posição ou posições corretas) no mínimo um, preferencialmente no mí- nimo dois dos resíduos aminoácidos que são requeridos de modo a introdu- zir o novo sítio de clivagem. A título de exemplo, em uma modalidade, pode ser introduzido o sítio de clivagem de Caspase 3 (DMOQD). A este respeito, é identificada uma posição de inserção preferencial que já inclui uma sequên- ' cia primária selecionada entre, por exemplo, Dio, xXMbXx, xXQx, xcxD, DMxx, DxXQx, DxD, xMQx, xMxD, xxQD, DMQx, xMQD, DxQD, e DMxD. ' De modo similar, é preferencial introduzir os sítios de clivagem dentro de regiões expostas da superfície. Dentro de regiões expostas da superfície, regiões são preferenciais regiões de loop existentes.
Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos são introduzidos em uma ou mais das seguintes posições, as quais são baseadas na sequência de aminoácidos primária de BONT/A. Enquanto as posições de inserção são identificadas (por conveniência) por meio de referência a BOoNT/A, as sequências de ami- noácidos primárias de domínios de protease alternativos e/ ou domínios de translocação podem ser prontamente alinhadas com as posições de BONT/A referidas.
Para o componente de protease, uma ou mais das posições se- guintes é preferencial: 27-31, 56-63, 73-75, 78-81, 99-105, 120-124, 137- 144, 161-165, 169-173, 187-194, 202-214, 237-241, 243-250, 300-304, 323- 335, 375-382, 391400, e 413423. A numeração acima preferencialmente inicia a partir do N-término do componente de protease da presente inven- ção.
Em uma modalidade preferencial, o um ou mais sítios de cliva- gem destrutivos estão localizados em uma posição maior do que 8 resíduos
: 27 aminoácidos, preferencialmente maior do que 10 resíduos aminoácidos, mais preferencialmente maior do que 25 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferencial maior do que 50 resíduos aminoácidos a partir do N-término do componente de protease.
De modo similar, em uma modali- dade preferencial, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos estão locali- zados em uma posição maior do que 20 resíduos aminoácidos, preferenci- almente maior do que 30 resíduos aminoácidos, mais preferencialmente maior do que 40 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferenci- al maior do que 50 resíduos aminoácidos a partir do C-término do compo- nentede protease.
Para o componente de translocação, uma ou mais das seguintes 1 posições é preferencial: 474-479, 483-495, 507-543, 557-567, 576-580, 618- 631, 643-650, 669-677, 751-767, 823-834, 845-859. A numeração acima i preferencialmente reconhece uma posição de partida de 449 para o N- término do domínio do componente de translocação da presente invenção, e uma posição de finalização de 871 para o C-término do domínio do compo- nente de translocação.
Em uma modalidade preferencial, o um ou mais sítios de cliva- gem destrutivos estão localizados em uma posição maior do que 10 resíduos aminoácidos, preferencialmente maior do que 25 resíduos aminoácidos, mais preferencialmente maior do que 40 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferencial maior do que 50 resíduos aminoácidos a partir do N-término do componente de translocação.
De modo similar, em uma modalidade preferencial, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos estão localizados em uma posição maior do que 10 resíduos aminoácidos, prefe- rencialmente maior do que 25 resíduos aminoácidos, mais preferencialmente maior do que 40 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferenci- al maior do que 50 resíduos aminoácidos a partir do C-término do compo- nente de translocação.
Em uma modalidade preferencial, o um ou mais sítios de cliva- gem destrutivos estão localizados em uma posição maior do que 10 resíduos aminoácidos, preferencialmente maior do que 25 resíduos aminoácidos,
' 28 mais preferencialmente maior do que 40 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferencial maior do que 50 resíduos aminoácidos do N- término do componente da porção de direcionamento. De modo similar, em uma modalidade preferencial, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos estão localizados em uma posição maior do que 10 resíduos aminoácidos, preferencialmente maior do que 25 resíduos aminoácidos, mais preferenci- almente maior do que 40 resíduos aminoácidos, de modo particularmente preferencial maior do que 50 resíduos aminoácidos do C-término do compo- nente da porção de direcionamento. O polipeptídeo da presente invenção pode incluir um ou mais sí- tios de clivagem de protease destrutivos (por exemplo, dois, três, quatro, ' cinco ou mais). Onde mais de um sítio de clivagem destrutiva é incluído, ca- da sítio de clivagem pode ser o mesmo ou diferente. A este respeito, o uso de mais de um sítio de clivagem destrutiva proporciona aprimorada inativa- ção off-site. De modo similar, o uso de dois ou mais sítios de clivagem des- trutivos diferentes proporciona adicional flexibilidade de design.
O um ou mais sítios de clivagem destrutivos podem ser manipu- lados dentro de quaisquer dos seguintes componente ou componentes do polipeptídeo: o componente de protease não citotóxica; o componente de translocação; a Porção de Direcionamento; ou o peptídeo espaçador (caso presente). A este respeito, o um ou mais sítios de clivagem destrutivos são escolhidos para assegurar mínimo efeito adverso sobre a potência do poli- peptídeo (por exemplo, tendo mínimo efeito sobre as regiões de direciona- mento / ligação e/ ou domínio de translocação, e/ ou sobre o domínio da pro- tease não citotóxica) enquanto assegurando que o polipeptídeo é lábil fora de seu sítio alvo / célula-alvo.
Sítios de clivagem destrutivos preferenciais (mais as segundas proteases correspondentes) são listados na Tabela imediatamente abaixo. Os sítios de clivagem listados são puramente ilustrativos e não se pretende que sejam limitantes à presente invenção.
| : VE Zz o a uu 3 3 ê o > io 3 : mm : mMinic|X je 3 o 3/3/3/3 oi o & 23 2/2/8 EE] e : Eb áldio : = Sela S falfal£a) : ê S SS88 uijui| ui ê :; ij ui uij ui j “s * ? aaa a AS jd 88/88 SsS É 2) 2/2/2) [2/2 8 8 :
E
E Oo às - ex - al Sia ' va : EN >|X| 3 > |) x + Tizinla 3 i ss ojo o o Ss
S :; j > UW| WWW : Ss 3 us >| w “leld3 |3 93/ jo = : a = = õ 5 = 2 3/> 3) - e” z É ; a 2=| |4= z io3 jozs = | << : à1& >» Di» O ' : " Se Bj E > k 8 es oE o o 8 : S81 & 7 | 8 à Hi Fiz 2R <& ala/ê o 2? eo | E SEsE OE iG&% = Secos | IS oO DIAZ < 202 ajo o > oO = on 2
E ; 3 lero oe s8s 225 Tales e 7/212/s 2 £>S 238 EERERERERER E Se = 238 RE EEBEECECERERE o o = Ho oO)= $| S/ S| 8) & ê ê é É SBTER EEEEERERERERL 3 EE S82 8a 8 E 823 & 8 jês 2823 |&218 ê e" ES |<oS 3 eu. un 3 a o
Metaloproteases da matriz (MMPs) são um grupo preferencial de proteases destrutivas no contexto da presente invenção. Dentro deste grupo, ADAM17 (EC 3.4.24.86, também conhecida como TACE), é preferencial e cliva uma variedade de proteínas da superfície celular ancoradas à membra- na,para"perder" os domínios extracelulares. Metaloproteases da matriz adi- cionais preferenciais incluem adamalisinas, serralisinas, e astacinas. Outro grupo de proteases destrutivas preferenciais é uma prote- ase do sangue de mamífero, tal como Trombina, Fator de Coagulação Vila, Fator de Coagulação IXa, Fator de Coagulação Xa, Fator de Coagulação Xla, Fator de Coagulação Xlla, Calicreína, Proteína C, e protease serina MBP-associada.
' Em uma modalidade da presente invenção, o referido sítio de clivagem destrutiva compreende uma sequência de reconhecimento tendo ] no mínimo 3 ou 4, preferencialmente 5 ou 6, mais preferencialmente 6 ou 7, ede modo particularmente preferencial no mínimo 8 resíduos aminoácidos contíguos. A este respeito, quanto mais longa (em termos de resíduos ami- noácidos contíguos) a sequência de reconhecimento, será menos provável ocorrer clivagem inespecífica do sítio destrutivo através de uma segunda protease não pretendida.
É preferencial que o sítio de clivagem destrutiva da presente in- venção seja introduzido dentro do componente de protease e/ ou a Porção de Direcionamento e/ ou dentro do componente de translocação e/ ou dentro do peptídeo espaçador. Destes quatro componentes, o componente de pro- tease é preferencial. Por conseguinte, o polipeptídeo pode ser rapidamente inativado por destruição direta dos componentes de protease não citotóxica e/ ou de ligação e/ ou de translocação.
Liberação de polipeptídeos Na aplicação, a presente invenção emprega uma composição farmacêutica, compreendendo um polipeptídeo, junto com no mínimo um componente selecionado entre um veículo, excipiente, adjuvante, propelente e/ ou sal farmaceuticamente aceitável.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser formulados para aplicação oral, parenteral, infusão contínua, implante, inalação ou apli- cação tópica. Composições adequadas para injeção podem estar sob a for- ma de soluções, suspensões ou emulsões, ou pós secos os quais são dis- solvidos ou suspendidos em um veículo adequado antes do uso.
Meios de liberação local podem incluir um aerosol, ou outro s- pray (por exemplo, um nebulizador). A este respeito, uma formulação de ae- rosol de um polipeptídeo possibilita liberação para os pulmões e/ou outras passagens nasais e/ou bronquiais ou das vias aéreas.
A via de administração preferencial é selecionada entre: sistêmi- ca (por exemplo, iv), laparoscópica e/ ou injeção localizada (por exemplo, injeção transesfenoidal diretamente dentro do tumor). ' No caso de formulações para injeção, é opcional incluir uma substância farmaceuticamente ativa para auxilitar a retenção em ou reduzir a ' remoção do polipeptídeo do sítio de administração. Um exemplo de uma substância farmaceuticamente ativa semelhante é um vasoconstritor tal co- mo adrenalina. Uma formulação semelhante confere a vantagem de aumen- tar a duração da permanência do polipeptídeo depois da administração e deste modo aumentando e/ou reforçando seu efeito.
As faixas de dosagem para administração dos polipeptídeos da presente invenção são aquelas para produzir o efeito terapêutico desejado. Será reconhecido que a faixa de dosagen requerida depende da natureza precisa do polipeptídeo ou composição, da via de administração, da nature- za da formulação, da idade do paciente, da natureza, extensão ou gravidade da condição do paciente, contraindicações, se houver, e do critério do médi- co assistente. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotinas empíricas-padrão para otimização.
Dosagens diárias adequadas (por kg de peso do paciente) estão na faixa de 0,0001 a 1 mg/kg, preferencialmente de 0,0001 a 0,5 mg/kg, mais preferencialmente de 0,002 a 0,5 mg/kg, e de modo particularmente preferencial de 0,004 a 0,5 mg/kg. A unidade de dosagem pode variar a par- tir de menos de 1 micrograma até 30 mg, mas tipicamente estará na região de 0,01 a 1 mg por dose, a qual pode ser administrada diariamente ou prefe-
rencialmente com menos frequência, tal como semanalmente ou a cada seis meses.
Um regime de dosagem particularmente preferencial se baseia em 2,5 ng de polipeptídeo como a 1X dose. A este respeito, dosagens prefe- renciais estão na faixa de 1X a 100X (isto é, 2,5 a 250 ng).
Formas de dosagens de fluido são tipicamente preparadas utili- zando o polipeptídeo e um veículo estéril livre de pirogênio. O polipeptídeo, dependendo do veículo e da concentração usados, pode ser quer dissolvido ou suspendido no veículo. Ao preparar soluções o polipeptídeo pode ser dis- —solvido no veículo, a solução sendo tornada isotônica caso necessário por adição de cloreto de sódio e esterilizada por filtração através de um filtro es- " téril usando técnicas assépticas antes de preenchimento dentro de frascos estéreis ou ampolas adequados e vedação. Alternativamente, se a estabili- Ú dade da solução for adequada, a solução dentro de seus recipientes selados pode ser esterilizada por autoclave. Vantajosamente aditivos tais como a- gentes de tamponamento, solubilizantes, estabilizantes, preservantes ou bactericidas, de suspensão ou emulsificantes e ou agentes anestésicos lo- cais podem ser dissolvidos no veículo.
Pós secos, os quais são dissolvidos ou suspendidos em um veí- culo adequado antes do uso, podem ser preparados enchendo ingredientes pré-esterilizados dentro de um recipiente estéril usando técnica asséptica em uma área estéril. Alternativamente os ingredientes podem ser dissolvidos dentro de recipientes adequados usando técnica asspticá em uma área esté- ril. O produto é em seguida secado por congelamento e os recipientes são seleados assepticamente.
Suspensões parenterais, adequadas para injeção intramuscular, subcutânea ou intradérmica, são preparadas em substancialmente a mesma maneira, exceto que os componentes estéreis são suspendidos no veículo estéril, ao invés de serem dissolvidos e esterilização não pode ser realizada por filtração. Os componentes podem ser isolados em um estado estéril ou alternativamente podem ser esterilizados depois de isolamento, por exem- plo, por irradiação gama.
i 33 Vantajosamente, um agente de suspensão, por exemplo, polivi- nilpirrolidona, é incluído na composição ou composições para facilitar a dis- tribuição uniforme dos componentes. Seção de Definições Porção de Direcionamento (TM) significa qualquer estrutura química que interage funcionalmente com um Sítio de Ligação para causar uma associação física entre o polipeptídeo da invenção e a superfície de uma célula-alvo (tipicamente uma célula de mamífero, especialmente uma célula humana). O termo porção de direcionamento engloba qualquer molé- cula (isto é, uma molécula que ocorre naturalmente, ou uma variante quimi- camente/ fisicamente modificada da mesma) que é capaz de ligação a um ' Sítio de Ligação sobre a célula-alvo, cujo Sítio de Ligação é capaz de inter- nalização (por exemplo, formação de endossoma) - também referida como endocitose mediada por receptor. A porção de direcionamento pode possuir uma função de translocação da membrana endossômica, em cujo caso componentes da porção de direcionamento e do Domínio de Translocação separados não precisam estar presentes em um agente da presente inven- ção. Do início ao fim da precedente descrição, foram descritas porções de direcionamento específicas. Referência às porções de direcionamento refe- ridas é meramente exemplar, e a presente invenção engloba todas as vari- antes e derivados das mesmas, os quais possuem uma capacidade de liga- ção básica (isto é, direcionamento) para um Sítio de Ligação sobre a célula tumoral neuroendócrina, em que o Sítio de Ligação é capaz de internaliza- ção.
A porção de direcionamento da presente invenção liga (de modo especificamente preferencial liga) à célula-alvo em questão. o termo "liga especificamente" preferencialmente significa que uma dada porção de dire- cionamento liga à célula-alvo (por exemplo, a um receptor de SST) com uma afinidade de ligação (Ka) de 10º M* ou superior, preferencialmente 107 M* ou superior, ou 10º M ou superior, ou 10º M ou superior. As porções de direcionamento da presente invenção (quando em uma forma livre, a saber quando separada de qualquer protease e/ ou componente de translocação),
preferencialmente demonstram uma afinidade de ligação (IC55) para o recep- tor alvo em questão (por exemplo, um receptor de SST) na região de 0,05 a 18 nM. A porção de direcionamento da presente invenção é preferenci- almente não aglutinina de germe de trigo (WGA).
Referência a porção de direcionamento (TM) na presente espe- cificação engloba fragmentos e variantes dos mesmos, os quais conservam a capacidade para ligar à célula-alvo em questão. A título de exemplo, uma variante pode ter no mínimo 80%, preferencialmente no mínimo 90%, mais preferencialmente no mínimo 95%, e o mais preferencialmente no mínimo 97 ou no mínimo 99% de homologia da sequência de aminoácidos com a por- ' ção de direcionamento de referência — a última é qualquer sequência de porção de direcionamento mencionada no presente requerimento. Deste ] modo, uma variante pode incluir um ou mais análogos de um aminoácido (por exemplo, um aminoácido não natural), ou uma ligação substituída. Além disso, a título de exemplo, o termo fragmento, quando usado em relação com uma porção de direcionamento, significa um peptídeo tendo no mínimo cinco, preferencialmente no mínimo dez, mais preferencialmente no mínimo vinte, e o mais preferencialmente no mínimo vinte e cinco resíduos aminoá- cidos da porção de direcionamento de referência. O termo fragmento tam- bém se refere às variantes mencionadas acima. Deste modo, a título de e- xemplo, um fragmento da presente invenção pode compreender uma se- quência de peptídeos tendo no mínimo 7, 10, 14, 17, 20, 25, 28, 29, ou 30 aminoácidos, em que a sequência de peptídeos tem no mínimo 80% de ho- —mologiade sequência em relação a uma sequência de peptídeos correspon- dente de aminoácidos (contíguos) do peptídeo de referência.
A título de exemplo, somatostatina (SST) e cortistatina (CST) têm alta homologia estrutural, e ligam a todos os receptores de SST conhe- cidos. SST de extensão total tem a sequência de aminoácidos:
MLSCRLQCALAALSIVLALGCVTINTERVALOSDPRLRQFLOKS LAAAAGKQELAKYFLAELLSEPNQTENDALEPEDLSQAAEQDEMRLELORS ANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
CST de extensão total tem a sequência de aminoácidos:
MYRHKNSWRLGLKYPPSSKEETQVPKTLISGLPGRKSSSRVG EKLOSAHKMPLSPGLLLLLLSGATATAALPLEGGPTGRDSEHMQEAAGIRK SSLLTFLAWWFEWTSQASAGPLIGEEAREVARRQEINTERVALOPQQSAR
RDRMPCRNFFWKTFSSCK Referência a estas porções de direcionamento inclui os seguin- tes fragmentos (e variantes correspondentes) das mesmas: NFFWKTF; (R ou KINFFWKTF; C(R ou KINFFWKTF; (P ou G)C(R ou KINFFWKTF; 7 NFFWKTF(S ou T); NFFWKTF(S ou TJS; NFFWKTF(S ou T)SC; (R ou KINFFWKTF(S ou T); (R ou KINFFWKTF(S ou TJS; (R ou KINFFWKTF(S ou T)SC; C(R ou KINFFWKTF(S ou T); C(R ou KINFFWKTF(S ou T)S; C(R ou KINFFWKTF(S ou T)SC; (P ou G)C(R ou KINFFWKTF(S ou T); (P ou G)C(R ou KINFFWKTF(S ou TJ)S; or (P ou G)C(R ou KINFFWKTF(S ou TJC. Com respeito às sequências acima, onde é dado um (P ou G) al- ternativo, um P é preferencial no caso de uma porção de direcionamento de CST, ao passo que um G é preferencial no caso de uma porção de direcio- namento de SST. Onde é dado um (R ou K) alternativo, um R é preferencial no caso de uma porção de direcionamento de CST, ao passo que um K é preferencial no caso de uma porção de direcionamento de SST. Onde é da- doum(SouT) alternativo, um S é preferencial no caso de uma porção de direcionamento de CST, ao passo que um T é preferencial no caso de uma porção de direcionamento de SST.
i 36 Fragmentos preferenciais compreendem no mínimo 7 ou no míi- nimo 10 resíduos aminoácidos, preferencialmente no mínimo 14 ou no míni- mo 17 resíduos aminoácidos, e mais preferencialmente no mínimo 28 ou 29 resíduos aminoácidos. A título de exemplo, sequências preferenciais inclu- em SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC (SST-28); AGCKNFFWKTFTSC (SST-14); QEINTERVALOPQQSARRDRMP- CRNFFWKTFSSCK (CST-29), QERPPLOQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); QERPPPQQPPHLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29); DRMP- CRNFFWKTFSSCK (CST-17),; PCRNFFWKTIFSSCK (CST-14); e PCKNFFWKTFSSCK (CST-14). i A porção de direcionamento pode compreender uma sequência 7 de aminoácidos mais longa, por exemplo, no mínimo 30 ou 35 resíduos ami- noácidos, ou no mínimo 40 ou 45 resíduos aminoácidos, na medida que a porção de direcionamento seja capaz de ligar a uma célula tumoral neuroen- dócrina, preferencialmente a um SST ou a um CST receptor sobre uma célu- la tumoral neuroendócrina. A este respeito, uma porção de direcionamento é preferencialmente um fragmento de extensão total SST ou CST, embora in- cluindo no mínimo a sequência de núcleo"NFFWKTF" ou uma das sequên- cias de aminoácidos primárias definidas acima.
A título de exemplo adicional, peptideos GHRH da presente in- venção incluem: YADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDILSR; YADAIFTAS- YRNVLGQLSARKLLQDILSR; YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIM; YA- DAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMS; — ADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLO- DIMSR; YADAIFTNSYRKVLGOQLSARKLLQDIMSROQQGESNQERGARARL; YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA; YADAIFTNA- YRKVLGOQLSARKLLQDIMSR; — YADAIFTNSYRKVLGQLSARKALQDIMSR; YADAIFTASYKKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYKRVLGQLSARKL- LQODIMSR; YADAIFTASYNKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYRK- VLGQLSAKKLLQDIMSR; YADAIFTASYKKVLGQLSAKKLLQDIMSR; YA- —DAIFTASYRKVLGQLSANKLLQDIMSR; —YADAIFTASYRNVLGQLSARKL- LQDIMSR; YADAIFTASYRKVLGQLSARNLLQDIMSR; YADAIFEASYRK- VLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASERKVLGQLSARKLLQDIMSR; YA-
DAIFTASYRKELGQLSARKLLQDIMSR; — YADAIFTASYRKVLGQLSARKL- LODIMSR; YADAIFTESYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTNSYRK- VLAQLSARKLLQDIM; YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIMSR; YADAIF- TASYRKVLAQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQDI- ASR; YADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQDIMSR; HVDAIFTASYRKVLAQL- SARKLLQDILNRQQAGERNQEQGA; HVDAIFTAOSYRKVLAQLSARKALOQ- DILSRQQG; HVDAIFTSSYRKVLAQLSARKLLQDILSR; HVDAIFTTSYRK- VLAQLSARKLLQDILSR; YADAIFTOSYRKVLAQLSARKALQDILNR; YA- DAIFTOSYRKVLAQLSARKALQDILSR.
É rotina para confirmar que uma porção de direcionamento liga à célula-alvo selecionada. Por exemplo, um simples experimento de desloca- ' mento radioativo pode ser empregado no qual tecido ou células representati- vas de uma célula tumoral neuroendócrina são expostos a porção de dire- cionamento marcada (por exemplo, tritiada) na presença de um excesso de porção de direcionamento não marcada. Em um experimento semelhante, as proporções relativas de ligação inespecífica e específica podem ser avalia- das, deste modo permitindo confirmação de que a porção de direcionamento liga à célula-alvo. Opcionalmente, o ensaio pode incluir um ou mais antago- nistas de ligação, e o ensaio pode compreender adicionalmente observar uma perda de ligação de porção de direcionamento. Exemplos deste tipo de experimento podem ser encontrados em Hulme, E.C. (1990), Receptor- binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, À Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.
No contexto da presente invenção, referência a uma porção de direcionamento de peptídeo (por exemplo, peptídeo de SST, peptídeo de CST, ou peptídeo de GHRH, etc) engloba análogos peptídicos das mesmas, na medida que a porção de direcionamento análoga ligue ao mesmo recep- tor que a porção de direcionamento de 'referência' correspondente. Os aná- logos referidos podem incluir resíduos sintéticos tais como: B&-Nal = R- naftilalanina; R-Pal = B —piridilalanina; hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)- homoarginina; hArg(Et>r = N N"-guanidino-(dimetil)-homoarginina; hArg(CH2CF3)) = N, N-guanidino-bis-(2,2,2 ,trifluoroetil)-homoarginina;
hArg(CH;s3, hexil) = N, N-guanidino-(metil, hexil)- homoarginina; Lys(Me) = Nº-metillisina; Lys(iPr) = Nº-isopropillisina; AmPhe = aminometilfenilalanina; AChxAla = aminociclo-hexilalanina; Abu = ácido a-aminobutírico; Tpo = 4- tiaprolina; MeLeu = N-metil-leucina; Orn = ornitina; Nle — norleucina; Nva = —norvalina; Trp(Br) = 5-bromo-triptofano; Trp(F) = 5-flúor-triptofano; Trp(NO02) = S-nitro-triptofano; Gaba = ácido v-aaminobutíic; Bmp = J mercaptopropionila; Ac = acetil; e Pen = pencilamina A título de exemplo, o aspecto do análogo peptídico acima é descrito em mais detalhes com referência a porções de direcionamento de peptídeos específicos, tais como peptídeos de SST, peptídeos de GHRH, peptídeos de bombesina, peptídeos de grelina, GnRH (peptídeos aka LH- . RH), e peptídeos de urotensina, embora o mesmo princípio se aplique a to- das as porções de direcionamento da presente invenção. ] Análogos de somatostatina, os quais podem ser usados para praticar a presente invenção, incluem, mas não estão limitados a, os descri- tos nas seguintes publicações, as quais são por este incorporadas por meio de referência: Van Binst, G. et al. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. et al. Abstract, "Conformations of Somatostatin Análogos Having Antitumor Activity", 22nd European Peptide Symposium, September 13-19,1992, Inter- laken, Suíça; PPatente dos Estados Unidos No. US 5.506.339; Patente Eu- ropéia No. EP0363589; Patente dos Estados Unidos No. US 4.904.642; Pa- tente dos Estados Unidos No. US 4.871.717; Patente dos Estados Unidos No. US 4.725.577; Patente dos Estados Unidos No. US 4.684.620; Patente dos Estados Unidos No. US 4.650.787; Patente dos Estados Unidos No. US
4.585.755; Patente dos Estados Unidos No. US 4.725.577; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.522.813; Patente dos Estados Unidos No. US
4.369.179; Patente dos Estados Unidos No. US 4.360.516; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.328.214; Patente dos Estados Unidos No. US
4.316.890; Patente dos Estados Unidos No. US 4.310.518; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.291.022; Patente dos Estados Unidos No. US
4.238.481; Patente dos Estados Unidos No. US 4.235.886; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.211.693; Patente dos Estados Unidos No. US
4.190.648; Patente dos Estados Unidos No. US 4.146.612; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.133.782; Patente dos Estados Unidos No. US
5.506.339; Patente dos Estados Unidos No. US 4.261.885; Patente dos Es- tados Unidos No. US 4.282.143; Patente dos Estados Unidos No. US
4.190.575; Patente dos Estados Unidos No. US 5.552.520; Patente Européia No. EPO0389180; Patente Européia No. EPOSO5680; Patente dos Estados Unidos No. US 4.603.120; Patente Européia No. EPO0030920; Patente dos Estados Unidos No. US 4.853.371; Publicação de Patente Internacional No. WO 90/12811; Publicação de Patente Internacional No. WO 97/01579; Pu- Dblicação de Patente Internacional No. WO 91/18016; Publicação de Patente Internacional No. WO 98/08529 e Publicação de Patente Internacional No.
' WO 98/08528; Publicação de Patente Internacional No. WO /0075186 e Pu- blicação de Patente Internacional No. WO 00/06185; Publicação de Patente Internacional No. WO 99/56769; e patente francesa No. FR 2.522.655.
Análogos preferenciais incluem: ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Phe) ou H-D-B-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-Cys-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; — H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys- NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Tyr-D-Trp- Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-NH2; H-Cys-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-NH2; H-D- Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-THr-NH2; H-Cys-Phe-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Cys-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, H-D- Phe-p-NO2-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D-RB-Nal-p-cloro-Phe- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2, H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2, H-D-Phe-Ala- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-B-Nal-NH2; H-D-R-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys- Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH2; H-D-Phe-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-B-Nal-NH2; H-D-B-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys- Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Phe- D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; — H-Gly-Pen-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-OH; H-Phe-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-0OH; H-Phe-Pen-
Phe-D-Trp-Lys-Thr-Pen-Thr-OH; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- ol; H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- CysTrp-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; Ac-D-Phe- Lys*-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Asp*-Thr-NH2 (uma ponte amida formada entre Lys* e Asp”); Ac-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Bu)-Gly-Cys- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; Ac-L-hArg (Et) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D- hArg (CH2CF3) 2-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; —Ac-D-hArg ' (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2; Ac-D-hArg ' (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NHEt; Ac-L-hArg (CH2- CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2- Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (Me)-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly- Cys-Phe-D-Trp-Lys (Me)-Thr-Cys-Thr-NHEt; Ac-hArg (CH3, hexil)-Gly-Cys- Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H-hArg (hexil2)-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys- Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- —NHEt; Ac-D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Phe-NH2; Propionil- D-hArg (Et) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys (iPr)-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-B-Nal- Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Gly-hArg (Et) 2-NH2; Ac-D-Lys (iPr)-Gly- Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; Ac-D-harg (CH2CF3) 2-D-hArg (CH2CF3) 2-Gly-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys- Thr-NH2; Ac-D-hArg (CH2CF3) 2-D-hArg (CH2CF3) 2-Giy-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Cys- Phe- NH2; Ac-D-hArg (Et) 2-D-hArg (Et) 2-Giy-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; c-Cys-Lys-Asn4-CI-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-D-Cys-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe- NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-CI-Phe-NH2; H-Bmp-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-p-Nal-NH2; H-D-B-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu- Cys-beta-Nal-NH2; H-pentaflúor-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-
NH2; Ac-D-B-Nal-Cys-pentaflúor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H-D-i- Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Nal-NH2; H-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-B-Nal-NH2; H-D-, SNal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H-D-p-CI- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; — Ac-D-p-CI-Phe-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H-D-Phe-Cys-p-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H- D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr-NH2; ciclo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr- Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-N-Me-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys- Thr-N-Me-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-L-Trp- Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp (F)-Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-Trp (F)- Lys-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-Lys- ' Thr-p-CI-Phe); ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr-D-Lys-Trp-D-Phe); ciclo (D- Ala-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Phe); ciclo (D-Ala-N-Me-D-Phe-D-Thr- ' Lys-D-Trp-D-Phe); ciclo (D-Abu-N-Me-D-Phe-D-Val-Lys-D-Trp-D-Tyr); ciclo (Pro-Tyr-D-Trp-t-4-AchxAla-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D-Trp-t4-AchxAla-Thr- Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp-t-4- AchxAla-Thr-Phe); ciclo (Pro-Tyr-D-TrpA4-Amphe-Thr-Phe); ciclo (Pro-Phe-D- Trp4-Amphe-Thr-Phe); ciclo (N-Me-Ala-Tyr-D-Trp4-Amphe-Thr-Phe); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Gaba-Gaba); ciclo (Asn-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Asn-Phe-Phe-D- Trp-Lys-Thr-Phe-NH (CH2) 4CO); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe- &gt;Ala); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-D-Glu)-OH; ciclo (Phe-Phe- D-Trp-Lys-Thr-Phe); ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly); ciclo (Phe-Phe- D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gly); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Tip (F)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp (NO2)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-Trp (Br)-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe (1)-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Tyr (But)-Gaba); ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-Pro-Cys)-OH; ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Pro- Cys)OH; ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Tpo-Cys)- OH; ciclo (Bmp-Lys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-MeLeu-Cys)-OH; ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba); ciclo (Phe-Phe-D-Trp-Lys-
Thr-Phe-D-Phe-Gaba); ciclo (Phe-Phe-D-Trp (5F)-Lys-Thr-Phe-Phe-Gaba); ciclo (Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys (Ac)-Thr-Phe-NH- (CH2) 3-CO); ciclo (Lys- Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); ciclo (Lys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Gaba); ciclo (Om-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Gaba); H-Cys-Phe-Phe-D- TrpLys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys-NH2; H- Cys-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys-NH2; H-Cys-Phe-Tyr (I)-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Cys-NH2.
Métodos para sintetizar análogos são bem documentados, con- forme ilustrado, por exemplo, pelas patentes citadas acima. Por exemplo, síntese de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2, pode ser realiza- da seguindo o protocolo estipulado no Exemplo 1 do requerimento de Paten- " te Européia No. EP 0395417A1. De modo similar, a síntese de análogos com um N-término substituído pode ser realizada, por exemplo, seguindo o proto- colo demonstrado na Publicação de Patente Internacional No. WO 88/02756, na Patente Européia No. EP 0329295, e na Patente dos Estados Unidos No. US 5.240.561.
Exemplos preferenciais de análogos lineares incluem: H-D-Phe- p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-N02-Phe-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-*Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2; H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2; e H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-beta-Nal-NH2.
Uma ou mais porções químicas, por exemplo, um derivado de açúcar, grupamentos mono ou poli-hidróxi (C2-12) alquil, mono ou poli- hidróxi (C2-12) acila, ou um derivado de piperazina, podem ser anexadas a um análogo de SST, por exemplo, ao aminoácido do N-término - vide a Pu- blicação de Patente Internacional No. WO 88/02756, a Patente Européia No. EP0329295, e a Patente dos Estados Unidos No. US 5.240.561.
Exemplos adicionais de análogos de que podem ser usados co- mouma porção de direcionamento na presente invenção incluem os seguin- tes: D-Cpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo[Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo[Cys-p-NH2-Phe-D-Trp-Lys-Val-
Cys]-Thr-NH2; N-Me-D-Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D- Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Pal-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; — Ac-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Phe-ciclo [Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal- NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-
D-Trp-Lys-Val-Cys]l-Thr-OH; ED-Phe-ciclo[Cys-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr- NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Nal-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-D-Cys]-Nal-NH2; D-Trp-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal- NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Nal-NH2; Nal-ciclo[Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys]-D-Nal-NH2; — (ACO-CH2)3-C-NH-CO-(CH2)2-CO-D-Nal-
ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]Thr-NH2; — [3-0-(2,5,6-triacetil —ascórbi- co)acetil-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-
' Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp-NH2; Phe-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Trp- NH2; 3-O-(ascórbico)-butrirl-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr- NH2; 3-O-(ácido ascórbico)Ac-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr- NH2; D-Bpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal-ciclo[Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys]--Bpa-NH2; - Tris-Suc-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys]-Thr-NH2; D-Dpa-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Nal-NH2; D-Nal- ciclo[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Dpa-NH2; — Ac-D-Nal-ciclo[Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; ciclo-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH2; NmeC-
pa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(NMeDCys-3- Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NHMe; Cpa-ciclo (DCys-NMe3-Pal-DTrp-Lys- Thr-Cys)-2-Nal-NH2; — Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal- NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa- ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-Lys-NMeThr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-
DTrp-Lys-Thr-NMeCys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr- Cys)-Nme2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(NMeDCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-Dip- NHMe; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa- ciclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Tím-ciclo (DCys-3-Pal- DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-
Thr-Cys)DTrp-NH2; Nal-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp- NH2; 3-Pal-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; NmeCpa- ciclo — (DCys-3-Pal-DTrp-Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; — Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-
DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-NMeDTrp- NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-Tyr-DTrp-NMelLys-Thr-Cys)- 2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; Nal- ciclo (DCys-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; ou 3-Pal-ciclo(DCys-3- — Pal-DTrp-NMelys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; NmeCpa-ciclo (DCys-3-Pal-DTrp- Lys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; — Cpa-ciclo(DCys-3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2- Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-3-Pal-NMeDTrp-NMelLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo (DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; ou Cpa-ciclo(DCys- 3-Pal-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-DTrp-NH2; — Cpa-ciclo — (DCys-3-Pal-DTrp- NMeLys-Thr-Cys)-2-Nal-NH2; Cpa-ciclo(DCys-Tyr-DTrp-NMeLys-Thr-Cys)-2- Nal-NH2; ácido metilpropiônico-Tyr-D-Trp- ys-Val-Cys-Thr-NH>2; ácido metil- " propiônico-Tyr-D-Trp- ys-Val-Cys-Phe-NH>; ácido metilpropiônico-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-p-CI-Phe-NH2; ácido metilpropiônico-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-B- Nal-NH2; D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; D-Phe-Phe-Tyr-D- Trp-Lys-val-Phe-Thr-NH2; — D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH>; ou D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-B-D-Nal-NH>; H>-c[Cys-Phe-Phe- D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]- NH>2, Hr-c[Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, Hz-c[Cys-Phe-Phe-D- Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>2, ou H7-c[Cys-Phe-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]- NH H7zc[Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]--NH2, Ha>-c[D-Cys-Phe-Trp- D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH,, H2-c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]- NH>z, H2-c[D-Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]--NHo, - H>c[D-Cys-Phe- Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, H2-c[D-Cys-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe- Cys]-NH2, H>c[Cys-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>2, H7>-c[D-Cys-Phe- His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>2, H>-c[D-Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Cys]|-NH>2, H>-c[Cys-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>2, ou H>-c[D-Cys- Phe-Tyr(1)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NHo, — Haz-c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, H2>-c[Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH,, Ha-c [D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, Ha-c [Cys-Asn-Phe- His-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NHo, H2-c[D-Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Thr- Phe-Cys]-NH2, H2z-cf Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2, Hz c[D-Cys-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH2z, Ha-c[Cys-Asn-Phe-Trp-
D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH., H>-c[D-Cys-Asn-Phe-Trp-D-Trp-Lys-Ser-Phe-
Cys NH», Hy-c [Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>, Hc [D- Cys-Asn-Phe-His-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>, H2-c [Cys-Asn-Phe-Tyr(1)-D- Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2, Hz-c [D-Cys-Asn-Phe-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Thr-Phe-
CysNH,» Hc [Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-rp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH,, Hc [D- Cys-Asn-Phe-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Ser-Phe-Cys]-NH>, H>c[Cys-Phe-Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe-Cys]|-NH>; Ac-D-Phe-Tyr-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-
NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; — D-Dip-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-
NalNH2; Dip-Tyr-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Nal-Tyr- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-
' D-Cys)-Val-Nal-NH2; — Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2; ciclo(D-Phe-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr); Cpa-Pal-ciclo(D-Cys- D-Trp-Lys-D-Cys)-A3c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)- AS5c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A6c-Nal-NH2; (G(z))aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; — Pal-ciclo(D-Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-ASc-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-RB-Ala- Nal-NH2; —Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Sar-Nal-NH2; Cpa-Pal- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Nal-NH2; — Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-
Lys-D-Cys)-Pro-Nal-NH2; Pro-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nie-Phe-NH2; Pro-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr-Nle-NH2; Pro-Phe-c (D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)-Thr-Phe-NH2; Cpa-Phe-c (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-NH2 ; Cpa-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Tyr-NH2; Pip-Phe-c (D-Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-NH2; Pip-Phe-c (Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Gaba-NH2; ou Pro-
Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr-NH2; Phe-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Thr- NH2; Phe-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-NH2; Ac-D-Phe-Tyr- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Thr-NH2; — Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D- Cys)-Val-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Dip- Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Abu-Nal-NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-
Lys-D-Cys)Abu-Nal-NH2; Dip-Tyr-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal- NH2; Nal-Tyr-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-Nal-NH2, Cpa-Pal-ciclo(D- Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A3c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-
i 46 Cys)-ASc-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A6c-Nal-NH2; (G(z))aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; D-Cpa-ciclo(Cys-D- Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal-NH2; Pal-ciclo (D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A5c-Nal- NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-ASc-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys- D-Trp-Lys-D-Cys)-B-Ala-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)- Sar-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Aic-Nal-NH2; Cpa-Pal- ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Gaba-Nal-NH2; — Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)-Pro-Nal-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-(A)aeg-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-A4c-Nal-NH2; Cpa-Pal-ciclo(D-Cys- D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; Pro-Phe-ciclo(Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Val-NH2; Pro-Phe-ciclo(D-Cys-D-Trp- " Lys-Cys)-Val-NH2; Pip4-NO2-Phe-ciclo(D-cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nie-NH2; (G)aeg-Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bz1)-(C)aeg-NH2; ou (C)aeg- Pal-ciclo(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr (BzI)-(G)aeg-NH2; Nal-ciclo(D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal- NH2; D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2, D-4-NO2-Phe-ciclo(D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-D4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Cys)-Nal-NH2; D-4-NO2-Phe-Pal-ciclo(D-Cys-Phe (4-O-BzI)-D-Trp-Lys- Cys)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-NH2; D-4- —NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-NH2; DA4-NO2-Phe-ciclo (D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; — DA4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; 4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr(BzI)-Tyr-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; —Pro-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal- D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Nal-NH2; Ser(Bzl)-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Thr-Tyr-NH2; — (TD)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; — (G)aeg-ciclo(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp- Lys-Cys)Thr(BzI)-Tyr-NH2; (D)aeg-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bz])- Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg- ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-
' Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Cys)-Phe(4-O0-Bz1)-Tyr-NH2; (D)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-A5c- Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Abu-Tyr-NH2; D-Cpa- ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; — (C)aeg-ciclo(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; D-Cpa-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D- Cys)Thr(Bz!)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(Pen-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bz!)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D-Cys-Trp-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (TD)aeg-c(D-Cys- Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Omn-D- Cys)Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-hLys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr- NH2; (Daeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-lamp-D-Cys)Thr(Bzl1)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D- Cys-Pal-D-Trp-Cha(4-am)-D-Cys) Thr (BzI)-Tyr-NH2; (T)>aeg-c(D-Cys-Pal-D- " Trp-Lys-D-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D- Cys)Thr(Bzl))-D-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys) Thr (Bzl)- Trp-NH2; (T) aeg-c (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Pen)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg- c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; — Ina-c(D-Cys-Phe-D-Trp- Lys-D-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-NH2; Mnf-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)- Tyr-NH2; Inp-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-thr(Bz1)-Tyr-NH2; Nua-c(D- Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Tyr(Bzl)- ThrNH2; (C)aeg-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys) Thr(Bzl)Tyr-NH2; ou (T)aeg-D-Trp-c(D-Cys-Pal-Lys-D-Cys)Thr(Bz1)-Leu-NH2; — Hca-ciclo(D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; — Ac-Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal- NH2; Ac-D-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; Ac-D-Nal-ciclo(D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; — D-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)- Nal-NH2; Nal-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-Phe-ciclo(Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; — Ac-D4-NO2-Phe- ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Nal-NH2; D-4-NO2-Phe-Pal-ciclo(D-Cys- Phe(4-O-Bz1)-D-Trp-Lys-Cys)-Tyr-NH2; DA4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Cys)Thr(Bzl)Tyr-NH2; Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bz!)- Tyr-NH2; D-4-NO2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)- NH2; D4- NO?2-Phe-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr (BzI)-Tyr-NH2; D4-NO2-
Phe-ciclo(D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; 4-NO2-Phe-ciclo(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; D-Nal-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Cys)-Thr (Bzl)-Tyr-NH2; Pro-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr- NH2; —Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Nal-NH2; —Ser(Bzl)-
ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)- Tyr-NH2; Aic-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C(z))aeg- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (A(z))aeg-ciclo(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; (TD)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-
Cys)Thr(BzI)-Tyr-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr- NH2; (G)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; (TD)aeg
' ciclo(D-Cys-4-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Cys)-Thr (BzlI)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Cys)-
Thr(Bz1)-Tyr-NH2; — (T)aeg-ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-
NH2; (Daeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (TD)aeg- ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)-Phe(4-O-Bzl)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Cys)-ASc-Tyr-NH2; — (T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cys)- Abu-Tyr-NH2; D-Cpa-ciclo(D-Cys-(T)aeg-D-Trp-Lys-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (D)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-p-Me-Phe-NH2; Ac-
(T)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(BzI)-Tyr-NH2; (T)aeg-ciclo(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Nal-NH2; D-Cpa-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D- Cys)-Nal-NH2; (A)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (C)aeg-ciclo(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg-c(D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-NH2; D-Cpa-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-
D-Cys)Thr(BzI)Tyr-NH2; (T)aeg-c(Pen-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr- NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Trp-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D- Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (T)>aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Orn- D-Cys) Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (D)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-hLys-D-Cys)Thr(Bzl)- Tyr-NH2, (D)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-lamp-D-Cys)Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (T)aeg-
c(D-Cys-Pal-D-Trp-Cha(4-am)-D-Cys)Thr(Bz1)-Tyr-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal- D-Trp-Lys-D-Cys)-Ser(Bzl)-Tyr-NH2; (T)aegc (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D- Cys)Thr (Bzl)-D-Tyr-NH2; (Daeg-c (D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bz)-
Trp-NH2; (T)aeg-c(D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-D-Pen)Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (C)aeg- c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(BzlI)-Tyr-NH2; — Ina-c(D-Cys-Phe-D-Trp- Lys-D-Cys)-Thr(Bz1)-Tyr-NH2; Mnf-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)- Tyr-NH2; Inp-c(D-Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bz!)-Tyr-NH2; Nua-c(D- Cys-Phe-D-Trp-Lys-D-Cys)-Thr(Bzl)-Tyr-NH2; (D)aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp- Lys-D-Cys)Thr(Bzl1)-Tyr-NH2; (T)>aeg-Pal-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Tyr(Bzl)- Thr-NH2; (C)aeg-Phe-c(D-Cys-D-Trp-Lys-D-Cys)Thr(Bzi)-Tyr-NH2; ou (D)aeg-D-Trp-c(D-Cys-Pal-Lys-D-Cys)Thr(Bz1)-Leu-NH2; ciclo(Trp-D-Trp- Lys-Phe(4-O-BzI)-Phe-(T)aeg); ciclo(Trp-D-Trp-Lys-Pal-Phe-(T)>aeg); * ci- clo(Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-(TN)>aeg); ou H-B-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH2 (também conhecida como lanreotida) ' ciclo(Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe), ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp- Lys-Val- Phe); D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; D-Phe-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cysbeta-Nal-NHz; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a- Aminobutírico ácido-Cys-Thr-NH>; pentaflúor-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-Thr-NH2. N-Ac-D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH>;D-beta- Nal-Cys-pentaflúor-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH7 ; D-/3-Nal-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH>; D-Phe-Cys-,3-Nal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr- NH>2; D-beta-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-aminobutírico ácido-Cys-Thr-NH>; D- p-CIPhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-aminobutírico ácido-Cys-Thr-NH>; acetil-D-p- CI-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-a-aminobutírico — ácido-Cys-Thr-NH2; — ciclo(Pro- Phe-D-Trp- Lys-Thr-Phe); ciclo(N-Me-Ala-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe); D-beta- Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH7; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- Trp-NH>2; D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol); D-p-CI-Phe-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHz; D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal; H2- beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)- (4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal- NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-
Cys-beta-Nal-NH2; (H)-(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal- D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp- LysValCys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-I-piperizinaetanossulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; - H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-O-Nal- D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Lys-Thr-NH2; —H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-beta-Nal-NH2; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal- ' NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-Phe-D- Cys-Tyr-D-Tip-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta- Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-Phe- D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2;
(H)(4-(2-hidroxietil)-1I-piperazinilacetil)-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta- Nal-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Cys-beta-Nal-NH2; — (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D- Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H(CH3CO)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-
hidroxietil)-1I-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- NH2; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4- (2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)|Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-
NH2; (H)(4(2-hidroxietil)-I-piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-
" NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4- (2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- i NH2; (H)(4(2-hidroxietil)-1I-piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-
Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr- Cys-Thr-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H(CH3CO)-
Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperazinilacetil)|Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; — H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-
Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta- Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H2-Phe-D- Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Pen-beta-Nal-NH2; H2-Phe-D-Pen-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Pen-Thr-NH2; H2-Dip-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Dip-NH2; H2-F5- Phe-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-F5-Phe-NH2; — H2-Dip-D-Cys-Pal-D-Trp-
Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-m-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-m-F- Phe-NH2 H2-o0-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-o-F-Phe-NH2; H2-p-F- Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-F-Phe-NH2; — H2-F5-Phe-D-Cys-Pal-D-
i 52 Trp-Lys-Val-Cys-F5-Phe-NH2; H2-F5-Phe-D-Cys-2-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- F5-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Dip-NH2; H2- Dip-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Dip-D-Cys-His-D-Trp- Lys-Val-Cys-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal- NH2;H2-Tip-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-D-p-F-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys- beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2- beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Nle-Cys-beta-Nal-NH2; — H2-beta-Nal-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-lle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Gly- Cys-beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Ala-Cys-beta-Nal- " NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Leu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-Bip-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-lle-Cys-Bip-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-His-D-Trp Lys-Val- Cys-p-F-Phe-NH2; H2-Npa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Tyr-NH2; H2-m-F- Phe-D-Cys-His-D-Trp-Lys-Val-Cys-m-F-Phe-NH2; H2-0-F-Phe-D-Cys-His-D- Trp-Lys-Val-Cys-o-F-Phe-NH2; — H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- Dip-NH2; H2-Cpa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Cpa-NH2; H2-Ilgl-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-lg-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- D-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-3-Il-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-CN-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-CN-Phe-NH2; H2-beta-Nal-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Dip-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Bta-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal- NH2; H2-Bpa-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Bpa-NH2; H2-Iph-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-Iph-NH2; — H2-Trp-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal- NH2; H2-p-CI-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-CI- Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-CI-Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Tle-Cys-p-CI-Phe-NH2; H2-p-CI-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Cha-Cys- p-CI-Phe-NH2; — H2-p-CI-Phe-D-Cys-Tr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-CI-Phe-NH2; H2-p-CI-Phe-D-Cys-Tyr(I)-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-CI-Phe-D- Cys-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Tle-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Tyr(1)-D- Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-F-Phe-D-Cys-Tyr(l)-D-Trp-Lys-Tle-Cys- beta-Nal-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2;
(H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; —H2-p- NO2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; — (H(CH3CO)-beta- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; H2-p-N02-Phe-D-Cys- Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl1)-Cys-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinilacetil)-p-NO2-Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-beta- Nal-NH2; — (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-NO2-Phe-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Cys-Tyr-NH2; H2-p-NO2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-NO2-Phe-D-Cys-Tyr- D-Trp-Lys-Val-Cys-P-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-
Nal-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; — H2-beta-Nal-D-Cys- Tyr(BzI)-D-Trp-Lys-Thr(BzI)-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
' piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Tyr(Bzl)- NH2; H2-D-Phe-D-Pen-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-
Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta- Nal-NH2; H2-D-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; H2-D-Phe-D- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Abu-Cys-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-beta-Nal- NH2; H2-D-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-p-F-Phe-NH2; H2-D-
Bip-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-Dip-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; H2-D-p-F-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys- beta-Nal-NH2; H2-D-p-CI-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Tle-Cys-p-CI-Phe-NH2; p-NO02-D-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Tyr(Bzl)-NH2; p-N02-D- Phe-D-Cys-Tyr(Bzl)-D-Trp-Lys-Val-Cys-Tyr(BzI)-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
— piperazinilacetil)-p-NO2-P-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr(Bzl)-Cys-Tyr(Bz])- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-p-NO2-P-Phe-D-Cys-Tyr(Bz1)-D- Trp-Lys-Val-Cys-Tyr(BzI)-NH2; (H) (S-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-beta-Nal-NH2; — (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-
NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3- fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-
* Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-fenilpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp- Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Cys-beta-Nal-NH2; — (H)(3-[2-naftil|propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- beta-Nal-NH2; — (H)(3-[2-naftil|propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-
NalNH2; (H)(3-[2-naftil|propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-beta-Nal- NH2; (H)(3-[2-naftil]propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3- [2-naftil]propionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2- naftillpropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-[2- naftillpropionil)-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2; (H)(3-Ip-
hydroxyfenil])-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3- naftil|propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; (H)(3-
' naftil|propionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; (H)(3- fenilylipropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-beta-Nal-NH2; ou (H)(3- | fenilyipropionil)-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cys-
Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)- 3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-
Cys2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(CH3CO)- beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D- Cys- Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; (H)(4-
(2-hidroxietil)-I-piperizinaetanossulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val- Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(CH3CO)- beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; — (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-
Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — (H)(4- (2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr- Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-
: 55 Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H(CH3CO)- beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; — (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys- Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; (H)(4-
(2-hidroxietil)-I-piperizinaetanossulfonil)-beta- Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr- Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H(CH3CO)Phe- D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-
2R3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil) Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-
. hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- 2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — HCH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D-
Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-
hidroxietil)-I-piperazinilaceti)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil) Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys- 2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-
Trp-Lys-Thr-Cys-2R, 3SR-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-
2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2- hidroxietil)-1-piperazinilacetil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R,3R-(2-
—hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; H2-beta-Nal-D-ys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- 2R-(2-nafti)etilamida; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-P-Trp-Lys-Vai-Cys- 2R-(2-nafti)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil) -1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-
Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)-D- Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2- naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2- naftietilamida; — (H)(CH,CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-
naftietilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2- naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2- naftietilamida; — (H)(CH,CO)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-
—naftietilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-
' piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2- naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2- nafti)etilamida; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-
naftietilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D- Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2- naftietilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-
(2-hidroxietl —-1-piperazinilacetil)|Phe-P-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2- naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossutlfonil)Phe-D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Val-Cys-2R-(2-nafti)etilamida; (H(CH3CO)Phe-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys- 2R-(2-nafti)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)|Phe-D-Cys-Pal-
D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-11- piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Val-Cys-2R-(2- nafti)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(CH3CO)Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4- (2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)|Phe-P-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-
naftijetilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys- Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-nafti)etilamida; H2-Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Cys-2R-(2-nafti)etilamida; (H(CH3CO)Phe-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-
2R-(2-nafti)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)|Phe-P-Cys-Pal- D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)Phe-D-Cys-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Cys-2R-(2- nafti)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R-(2- naftietilamida; H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R-(2-naftil)etilamida; H2-beta-Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R,3R-(2-hidroximetil)-3- hidróxi)propilamida; ou H2-Phe-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-2R,3R-(2- hidroximetil)-3-hidróxi)propilamida; — H2-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-NH2; H2-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-Phe-D-Cpa- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe- Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; ' (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)) — -beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val- Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D- Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys- Val-Phe-Thr-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys- Val-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D- Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Thr-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-I-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D- Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr- NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys- Thr-Phe-Thr-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperizinaetanossulfonil) -beta-Nal- D-Cpa-Pal-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Phe-beta-Nal-NH2; (H(CH3CO)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe- beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1-piperazinilacetil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D- Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2; (H)(4-(2-hidroxietil)-1- piperizinaetanossulfonil)-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal- NH2; H2-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2-; ou H2-beta- Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; — H2-D-beta-Nal-D-Cpa-Phe-D-
Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe- Thr-NH2; H2-D-Phe-D-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H2-D-beta-Nal- D-Cpa-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; ou H2-D-beta-Nal-D-Cpa-Tyr-D-Trp- Lys-Val-Phe-beta-Nal-NH2.
Análogos peptídicos de GHRH datam dos anos noventa, e inclu- em o 'antogonista-padrão' [Ac-Tyr', D-Arg2jhoGH-RH (1-29) Nha. A Patente dos Estados Unidos No. US 4.659.693 (a este incorporada em sua totalidade por meio de referência à mesma) revela análogos antagonistas de GH-RH os quais contêm alguns resíduos de N, N'- dialquil-ômega-guanidino alpha- amino acila na posição 2 da sequência GH-RH (1-29). As publicações que seguem são dignas de nota, todas as quais são por este incorporadas por ' meio de referência às mesmas. A Publicação de Patente Internacional No. WO 91/16923 descreve modificações de hGH-RH incluindo: substituição de Tyr1, Ala2, Asp3 ou Asn8 com seus D-isômeros; substituição de Asn8 com L- ou D-Ser, D-Arg, Asn, Thr, Glh ou D-Lys; substituição de Ser9 com Ala para reforçar a anfifiicidade da região; e substituição de Goy'S com Ala ou Aib. A Patente dos Estados Unidos No. US 5.084.555 descreve um análogo [Se-psi [CH2-NH]-TyrlºlhGH-RH (1- 29) que inclui uma ligação pseudopeptí- dica (isto é, uma ligação peptídica reduzida a uma ligação [CH2-NH]) entre os resíduos R9 e R10. A Patente dos Estados Unidos No. US 5.550.212, a Patente dos Estados Unidos No. US 5.942.489, e a Patente dos Estados Unidos No. US 6.057.422 revelam análogos de hGH-RH (1-29) NH2 produ- zidos por substituição de vários aminoácidos e acilação com ácidos aromáti- cos ou não potares no N-término de GH-RH (1-29) NH2. As propriedades inibitórias tumorais de antagonistas caracterizadas na Patente dos Estados Unidos No. US 5.942.489 e na Patente dos Estados Unidos No. US
6.057.422 foram demonstradas usando camundongos nude carregando xe- noenxertos de modelos experimentais de cânceres humanos. Exemplos es- pecíficos incluem: [PhAc-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Amp9, Tyr (Me010, A- —buis, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (PCI)6, Amp9, Abui5, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc- Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, His9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]
hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Amp9, Tyr (Me)10, Abui5, Nle27, D-Arg28, Har29JhnGH-RH(1- 29) NH2; [HOOC (CH2) 8CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Amp9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 2CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCi) 6, Amp9, Tyr (Me)1O, Abui5, Nle27, D-Arg28, Har29JhnGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCI)6, Amp9, Tyr (Me)10, His11, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]JhGH-RH(1- 29) NH2; [PhAc-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1- 29) NH2; [1-nac-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His11, A- bu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhnGH- RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D- Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu1i5, Nie27, D-Arg28 ' Har] hoH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Amp9, Tyr (Me)10, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hnGH-RH (1- 29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Cit8, Amp9, Tyr (Et)"º, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO- Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, His9, Tyr (Et010, His11, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]hGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Alpe, His9, Tyr (Et) 10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, i Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 8CO -Tyr1i, D-Arg2, Phe(pCI)6, Ala8, His9, T- yr(Et10, His11, Abui5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HO- OC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Ala8, His9, Tyr(Et)1O, His11, A- bu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D- Arg2, Phe (pCI)6, Ala8, His9, Tyr (Et)1O, His11, Abu15, His20, Nle27, D- Arg28, Har29] hnGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (p- CN6, Ala8g, Amp9, Tyr (EtJ10, His11, Abu1i5, His20, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2)1 2CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et) 10, His11, Abu15, His20, Nie27, D-Arg28, Har2lhGH-RH' (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Ala8, Amp9, T- yr(Et)10, His11, Abu15, His20, Nle27, D-Arg28, Har29)JhnGH-RH(1-29)NH2; [I-Nac-Tyr1l, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)1O, His11, Abu15, N- le27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, His9, Tyr (Et)"º, His", Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH- RH (1-
29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr, D-Arg2, Phe (pCI)6, Ala8, His9, Cit15, N- le27, D-Arg28, har29]JhGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCi)6, Ala8, His9, tyr(Et)1O, His11, His15, His20, Nle27, D-Arg28 Har29]JhGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, A- la8, His9, Tyr (ENIO, His11, Orn12, Abu15S, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 8CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Alas, His9, Tyr (Et)10, His11, Om12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] h- GH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Ala8, His9, Tyr (Et)", His", Abu", Nie 2, D-Arg2, Har29JhGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2)8CO -Tyr1i, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et) 10, His11, Abuí5, Nie27, D-Arg28, Har29] hnGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 10CO -Tyr1, D- ' Arg2 Phe (pCl) 6 Ala8, His9, Tyr(Et)1O, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28 . Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [Hca -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Ala8, His9, T- yr(Et)10, His11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1- 29) NHEt; [CH3 (CH2) SCO-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Tyr (Et)10, His11, Abu15, nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29)NHMe; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D- Arg2, Phe (pCI) 6, Alas, His9, Tyr (EtJ10, His11, Orn12, AbuiS5, His20, Orn21, Nle27 D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe CI)6, Ala8, Amp9, Tyr(Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21 Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pC!) 6, Ala8, His9, Phe (pbNO2)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [CH3(CH2)6CO -Tyr1, D-Arg2, —Phe(pCI)6, Ala8, His9, Tyr(Et)1O, His11, Om12, Abui5, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC 9CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pC!) 6, Alas, Amp9, Tyr (Et) 10, His", Orn, Abu15, His20, Orn21, Nie27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 2CO -Tyr1, D-Arg2 Phe (pCI) 6, Ala8, His9, Dip”, His", Omrn12, Abu'5, His, Orn21, Nie D-Arg28, Har29JnhnGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Phe (pDNO2)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr, D-Arg2, Phe
(pCl) 6, Alas, His9, Tyr (Et) 10, His11, Om12, Abu15, His20, Orn21, Nie27, D- Arg28, Har29] hoH-RH (1-29) NHEt; [CH3(CH2)6CO -Tyr1i, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Ala8, Amp9, Dip10, His11, Om12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, d- Arg28, Har29JhnGH-RH (1-29) NH2; [CH3(CH2)SCO -Tyri, D-Arg2, — Phe(pCI)6, Ala8, Amp9, Phe(pNO2)10, His11, Om12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Ala8, Amp9, Tyr(Et)10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, N- le27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, His9, Dip10, His11, Om12, Abu15S, His20, Orn21, Nie27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Aia8, His9, Phe (pN02)"”, His", Om'2, Abu'5, His20, Orn21, Nle27, D- ' Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2) 12CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCI)6, Ala8, Amp9, Dip10, His", Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nie27 D-Arg Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Phe (pN02) 10, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (p- CI) 6, Ala', Amp9 Dip”, His", Om12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, A- la8, Amp9, Phe (pNO2)10, His11, om12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2) 12CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Ala8, Amp9, Dip10, His11, Orn12, Abu15, his20, Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [HOOC (CH2)1 2CO -Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Alas, Amp9, Phe (pNO2)10, His", Orn12, Abu15, His20 Orn21, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NHEt; [CH3 (CH2) 4CO-Tyr1, D- Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2) 4CO-Tyr', D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hoH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abuií5, Nle27, D-Arg28 Har29JhGH-RH (1-290) NH2; [HO- OC(CH2)6CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhnGH-RH(1-29)NH2; [CH3(CH2)8CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [HOOC(CH2)BCO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCi)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2;
[CH3 (CH2)1 0CO-Tyr1, D-Arg2 Phe CI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg26, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [HOOC (CH2) O0CO-Tyr1i, D-Arg2, Phe (pClI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [CH3 (CH2) 12CO- Tyr, D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH (1- 29) NH2;[HOOC (CH2) i2CO-Tyn D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 4CO-Tyr1 D-Arg2, Phe (pCI) 6, Arg9, Abu1S, Nie27, D-Arg28, Har29JhnGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) 4CO-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu1i5, Nle27, D-Arg28, Har29]JhnGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) CO-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Arg9, —Abu15, Nle27, Har28, D-Arg29]JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (PCI) 6, Arg9, Abu'S, Nle27, Har28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 ' (CH2) 4CO-Phe0, D-Arg2, Phe (pC!) 6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29] hGH-RH (1-29) NH2; [CH3 (CH2) 14CO-D-Phe0, D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Argº, D-Arg2, Phe (pCi) 6, Arg9, Abu'5, NLe27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAc-D-Argº, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyrl, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Cite, Arg9 Abut5 Ni- e27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Cite, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr', D- —Arg2, Phe (pCl) 6, Cit8, Arg9, Abu'5, Nle27, Har28, D-Arg29]hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Cit8, Cit9, Abu15, Nle27, Har28, D- Arg29)JhGH-RH (1-29) NH2; [HOOC (CH2) i2CO-Tyn D-Arg2, Phe (pCl)6, Cit8, Cit9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI) 6, D-Ala8, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI) r3, Abu3, Arg9, Abu'5, Nle27, D- Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr, D-Arg2, Phe (pClI)6, Cito, Abu15, Nle27, Har28, D-Arg29]JhGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (PCI) 6, Arg9, Amp”, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Amp10 Abu5, Nle27, D-Arg28, Har29 —hGH-RH(1-29) NH2; PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6 Arg9, His'o, Abu'5, Nle 27, D-Arg28, Ha) heH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Cha10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr',
D-Arg2, Phe (pCI)6, Har9, Tpi10, Abu15, Nle27, D-Arg28, har29]JhGH-RH (1- 29) NH2; PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCIi)6, Har9, 2-Nal10, Abu15, Nile27, D- Arg28, Har29JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Dip10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D- Arg2, Phe(pCI)6, Har9, Phe (pbNH2)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH- RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2 Phe (pCl) zu Har9, Trptº, Abu15 Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Har9, Phe(pNO2)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29)JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc- Tyr1, D-Arg2, Phe (pCI)6, Har9, 3-Pal10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhRAc-Tyrl, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Et), A- bu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-His', D-Arg2, T- ' yr6, Har9, Bpa10, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCi) 6, Arg9, Har12, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hoH-RH (1-29) NH2; [Hca-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH (1-29) NHEt; [PhAc-TyrD- Arg2, Phe (pCl) 6 Har9, Tyr(Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hnGH-RH (1-29) NHEt; [Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCi)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29[hGH-RH(1-29) NHEt; PhAc-Tyr1, D-Arg2 Phe CI)6, Arg9, Abu15, N- le27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29 NHEt; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pC!) 6, Har9, Tyr (Me)10, Aib15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NHEt; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me) 10, Orn12, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29] hGH-RH (1- 29) NHEt; [Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Agm29]JhGH-RH (1-29); [PhAc-Tyr1, D- Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me), Abu15, Nie27, D-Arg28, Agm29]hGH- RH(1-29); Hca-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me) 10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30JhGH-RH(1- 30) NH2; [Dat-Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl)6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30]JhGH-RH (1-30) NH2; [Ipa-Tyr1, D-Arg2, Phe (pClI) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29, Har30JhGH-RH(1-30)NH2; [Hca-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu1i5, Nle27, D-Arg28, Har29, Har30] heH-RH (1-30) NHEt; [Hca-Tyr, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me10), Abu15, Nle27, D- Arg28, D-Arg29, Har30]JhGH-RH(1- 30) NH2; [Hca-Tyr', D-Arg2, Phe (pCl) 6,
a Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, D-Arg30JhGH-RH(1- 30) NH2; [Hca-Tyr', D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29, Agm30] hGH-RH (1-30); [PhAc-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29, Agm30] heH-RH (1-30); [PhAc-Tyr, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Har9, Tyr (Me)10, His11, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe(pCI)6, Har9, T- yr(Me)10, Har11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1-29) NH2 [PhAc- Tyri, D-Arg2, Phe(pCI)6, Har9, Tyr (Me)10, Amp11, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAc-Tyr1, D-Arg2, Phe (pClI)6, Har9, Tyr (Me)10, Cit", Abui5, Nle27, D-Arg28, Har2oJhnGH-RH(1-29) NH2; [PhAc- Tyr1i, D-Arg2, Phe (pCI)6, Har9, Tyr (Me), Abu15, His20, Nle, D-Arg28, : Har29]JhGH-RH(1-29) NH2; [PhAc-Tyr', D-Arg2, Phe(pCI)6, Har9, Tyr (Me)10, His", Abu1i5, His20, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH- RH (1-29) NH2; [PhAc- Tyr1, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Cit15, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH-RH(1- 29)NH2; [PhAcº, D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] hGH-RH (1-29) NH2; [IndAcO, D-Arg2, Phe(pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D- Arg28, Har29]JhGH-RH(1- 29) NH2; [PhAcº, D-Arg2, Phe pCl) r, Har9, T- yr(Me)10, Abui5, Nle27, D-Arg28, Har29JhGH- RH (1-29) NH2; [PhAcº, D- Arg2, Phe(pCI)6, Arg9, Tyr(Me) 10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH- RH (1-29) NH2; [PhAcº, His', D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]hGH-RH(1- 29) NH2; [Nacº, His', D-Arg2, Phe (pCI) 6, Arg9, Abuí5, Nie27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAcº, D-Arg2, Phe (pCl) 6 Arg9, Abu'5, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [IndAcº, D-Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAcº, D-Arg2, Phe (pCI) 6, Har9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2; [PhAcº, D-Arg2, Phe (pCl) 6, Arg9, Tyr (Me)10, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1-29) NH2 ; [PhAcº, His', D- Arg2, Phe (pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29]JhGH-RH(1-29)NH2; [Nacº, His', D-Arg2, Phe(pCI)6, Arg9, Abu15, Nle27, D-Arg28, Har29] heH-RH (1- 29) NH2;[PhACº, D-Arg?, Phe(pCI)", Ala'*, NleZ', Asp??IhnGH-RH(1-28)Agm; [buº,D-Arg?, Phe(pCI)ê *º, Abu*é, Nie? hGH-RH(1-28)Agm; [PhAcº,D-Arg?, Phe(pCI)S, Abu**, Nie JhGH-RH(1-28)Agm; [PhAcº,D-Arg?, Phe(pCI)S, Ala”,
NIle?hGH-RH(1-29)-NH2; [PhAcº, D-Arg?,Phe(pCI)S, Abu? Ala”, NIe?hGH- RH(1-29)NH>2; [PhAcº, D-Arg?, Phe(pCI)S, Abu??, Ala*”, Nle"IhGH-RH(1- 29)-NHo; — ciclo? ?[PhAcº,D-Arg?,Phe(pCI)5,Glu?,Ala*”, Nile? JhnGH-RH(1-29)- NH>; ciclo”” 2º [PhAcº,D-Arg?, Phe(pCI)º,Serº,Ala"*,Glu* 7 Nie? JhGH-RH(1- 29)-NH> ciclo? 22!?[PhAcº,D-Arg?,Phe(pCI)º,Gluº? =— ,Abu"ó Nie” JhGH- RH(1-28)Agm; ciclo? 22! 2S/PhAcº,D-Arg?,D-Asp*?, Phe(pC1),Glu8?,D- Lys”?,Ala'* Nie?hGH-RH(1-29)-NH>; ciclo? 22! ?SfPhACº,D-Arg?, Phe(pCI)º, Glu8?, pD-Lys"?, Ala”, Nle?] heH-RH(1-29)-NH2. Exemplos adicionais de análogos de GHRH são proporcionados na Publicação de Patente Interna- cional No. WO 96/032126, na Publicação de Patente Internacional No. WO 96/022782, na Publicação de Patente Internacional No. WO 96/016707, na ' Publicação de Patente Internacional No. WO 94/011397, na Publicação de : Patente Internacional No. WO 94/011396, cada uma das quais é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência às mesmas.
Exemplos de análogos de bombesina adequados para aplicação na presente invenção incluem porções de direcionamento compreendendo: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH7; (nome de código BIM-26218), D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH7? (nome de código BIM-26187); D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-p [CHNH]-Phe-NH> (nome de código BIM-26159), e D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Giy-His-Leu-p [CHNH]-Cpa-NH, (nome de código BIM-26189); éster D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-N-metil-D-Ala- His-Leu- metílico, e éster D-F,-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu- metílico.
Análogos de bombesina incluem peptídeos derivados dos peptí- deos estruturalmente relacionados, que ocorrem naturalmente, a saber, — bombesina, neuromedina B, neuromedina C, litorina, e GRP. As sequências de aminoácidos relevantes destes peptídeos que ocorrem naturalmente são: Bombesina (últimos 10 aminoácidos): Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- Met-NH>. Neuromedina B: Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH,>; Neuromedina C: Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH>z; Litorin: p- Glu-Glin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met-NH;; GRP Humano (últimos 10 amino- ácidos): Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH,.
Análogos adequados para aplicação na presente invenção inclu-
« em os descritos na Publicação de Patente dos Estados Unidos de Número Serial 502,438, arquivada em 30 de março de 1990, na Publicação de Paten- te dos Estados Unidos de No. Serial 397.169, arquivada em 21 de agosto de 1989, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial 376.555, arquivada em 7 de julho de 1989, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de Número Serial 394.727, arquivada em 16 de agosto de 1989, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial 317.941, arquivada em 2 de março de 1989, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de Número Serial 282.328, arquivada em 9 de dezembro de 1988, na Publica- çãode Patentedos Estados Unidos de No. Serial 257.998, arquivada em 14 de outubro de 1988, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. ' Serial 248.771, arquivada em 23 de setembro de 1988, na Publicação de . Patente dos Estados Unidos de No. Serial 207.759, arquivada em 16 de ju- nho de 1988, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial
204.171, arquivada em 8 de junho de 1988, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial 173.311, arquivada em 25 de março de 1988, na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial 100.571, arqui- vada em 24 de setembro de 1987; e na Publicação de Patente dos Estados Unidos de No. Serial 520.225, arquivada em 9 de maio de 1990, na Publica- çãode Patente dos Estados Unidos de No. Serial 440.039, arquivada em 21 de novembro de 1989. Todos estes requerimentos são por este incorporados por meio de referência. Análogos de bombesina também são descritos em Zachary et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 82: 7616 (1985); Heimbrook et al., "Syn- thetic Peptides: Approaches to Biological Problems", UCLA Symposium on Mol.and Cell. Biol. New Series, Vol. 86, ed. Tarn and Kaiser; Heinz-Erian et al. , Am. J. Physiol. G439 (1986); Martinez et al., J. Med. Chem. 28: 1874 (1985); Gargosky et al., Biochem. J. 247: 427 (1987); Dubreuil et al. , Drug Design and Delivery, Vol 2:49, Hanwood Academic Publishers, GB (1987); Heikkila et a/., J. Biol. Chem. 262: 16456 (1987); Caranikas et al. , J. Med. Chem. .25:1313 (1982); Saeed et al., Peptides 10: 597 (1989); Rosell et al., Trends in Pharmacological Sciences 3: 211 (1982); Lundberg et al., Proc. Nat. Aca. Sci. 80: 1120, (1983); Engberg et al., Nature 293: 222 (1984); Mi-
] 67 e zrahi ef al., Euro.
J.
Pharma. 82: 101 (1982); Leander et al., Nature 294: 467 (1981); Woll et al., Biochem.
Biophys.
Res.
Comm. 155: 359 (1988); Rivier et al., Biochem. 17: 1766 (1978); Cuttitta et al., Cancer Surveys 4: 707 (1985); Aumelas et al., Int.
J.
Peptide Res. 30: 596 (1987); todas as quais também são poreste incorporadas por meio de referência.
Os análogos podem ser preparados por meio de técnicas con- vencionais, tais como as descritas na Publicação de Patente Internacional No.
WO 92/20363 e na Patente Européia No.
EP0737691. Análogos de bombesina adicionais adequados para aplicação na presente invenção compreendem: D-Phe-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jjsi- Tac-NH2; D-Tpi-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-£si-Tac-NH2o; D-Phe-Gin-Trp- ' Ala-Val-Gly-His-Leu-£si-DMTac-NH.; Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-jBsi- Tac-NHo; D-Trp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Leu-NH2; D-Trp-GIn-Trp- Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Phe-NH;>; D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-psi-Phe-NHo; D-Trp-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Trp-NHo; D-Tpi- Gln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-psi-Leu-NH>; D-Tpi-GIn-Trp-Ala-Val-Gly- His- Leu-psi-Phe-NH2; D-Tpi-GIln-Trp-Ala-Val-Gly- His-Leu-psi-Trp-NH>; D-pGlu- Glin-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2.; D-Phe-Glin-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-psi-Tpi-NH2; D-Trp-Glin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH>.; Tpi-Gln- Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-TpicNH2; NH2CO-Tpi-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-psi-Tpi-NH? e ACY-Tpi-GIn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2 em que ACY é acetila, octanoila ou 3-hidroxi-2-naftoíla; D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly His-Leu-psi-Tpi-NH2; D-Trp-Glu(MeO)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH>; D-Trp-Glu(MeNH)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tpi-NH2; — D-Trp-His(Bz)-Trp- AlaVal GlyHis-Leu-psi-Tpi-NHz; Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly His-Leu-psi-Tpi- NH; H>D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NHo; H>-D-Nal-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Nal-Cys-Thr-NH>; H>-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Nal-Cys-Nal-NH>2; H2- D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NHo; — H>-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-D-Nal-NH2o; H>-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-D-Nal-NH.; — H>-D- —Nal-D-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H7-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val- D-Cys-Nal-NHo; H>-D-Trp-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Nal-NH2; H>-D-Nal- Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Phe-Cys-Nal-NH2; H7-D-Nal-Cys-Tyr-D-Nal-Lys-Val-Cys-
: 68 - Nal-NH>; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Nal-Cys-Thr-NH2; H>-D-Nal-Cys-Tyr- D-Trp-Orn-Val-Cys-Nal-NH2; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NHo; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys(iPr)-Thr-Cys-Nal-NH>; H2-D-Phe-Cys-Tyr-D- Trp-Lys(diEt)-Thr-Cys-Nal-NH> — H2-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Ser-Cys-Thr- NH H>D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH>; H2-D-Nal-D-Cys-Tyr-D- Trp-Lys-Thr-Cys-Nal-NH2; ou H7>D-Nal-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Nal- NH2; H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Dab-Val-Cys-Nal-NHo, H>-D-Nal-Cys-Tyr-D- Trp-Orn-Val-Cys-Nal-NH,, H2-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Val-Cys-Nal-NH>; pGlu-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2, D-Phe-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-lLeu-NH,, D-Phe-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH,, D-Cpa-Gin-Trp- Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH>, 7 D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Leu-NHo, — D-Phe-GIn-Trp-Ala-Val-D- Ala-His-Leu-Met-NH2, D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Met-NH2, pGlu- i Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Leu-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe- Leu-NH,, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Phe-Met-NH,, D-Phe-Gin-Trp- Ala-Val-D-Ala-His-Phe-Leu-NH,, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Nile- NH>2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Nle-NH>, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Phe-Nle-NH2, D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Phe-Nle-NH>, D-p- CI-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuc[CHANH]Phe-NHo, — D-Phe-Gln-Trp-Ala- Val-GlyHis-Leu-proplyamide, Ac-His-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-Leu-NH>, D- Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-CHx-Ala-Leu-NH>, ciclo-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val- Gly-His-Leu-Leu, = D-Cys-Asn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Cys-NH>s, - ciclo-His- Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met, Cys-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Cys-NH,, ciclo-D- Phe-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met, ciclo-D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu-Met,cicio-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met.
Análogos de bombesina adicionais são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional No.
WO 89/02897, na Publicação de Patente Internacional No.
WO 91/17181, na Publicação de Patente Interna- cional No.
WO 90/03980 e na Publicação de Patente Internacional No.
WO 91/02746, todas as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de pa- tente, por meio de referência às mesmas.
Exemplos de análogos de grelina adequados para aplicação
: 69 - como uma porção de direcionamento da presente invenção compreendem: Tyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH>, Tyr-DTrp-Lys-Trp-DPhe-NH,, His-DTrp-DLys- Trp-DPhe-NH,, His-DTrp-DLys-Phe-DTrp-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe- NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-l ys-NH>,, DesaminoTyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe- NH, DesaminoTyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NHo, DeaminoTyr-DTrp-Ser-Trp- DPhe-Lys-NH>, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-NH,7, His-DTrp-DTrp-Phe- Met-NH>2, Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Phe-NH>2, Glyw[CHNH]-DBNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH>, Glyy[CH2NH]-DbetaNal-DLyS-TrP-DPhe-Lys-NH,, DAla- DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH>,, His-DbetaNal-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH,, AlaHis-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH,, Alaç[CHANH]-DbetaNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH>, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH>, DAla-Dciclo-hexilAla-Ala- ' Phe-DPhe-Nle-NH>, Dciclo-hexilAla-Ala-Phe-DTrp-Lys-NH>2, DAla-DbetaAla- Thr-DThr-Lys-NH7, Dciclo-hexilAla-Ala-Trp-DPhe-NH2, DAla-DbetaNal-Ala- Ala-DAla-Lys-NHo, — DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Leu-NH,, — His-DTrp-Phe-Trp- DPhe-Lys-NH, DAla-DbetaNal-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH,, pAla-Trp-DAla- DTrp-Phe-NH>, His-Trp-DAla-DTrp-Phe-LysNH>, DLys-DEBNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH>, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH>s, Tyr-DAla-Phe-Aib-NH,, Tyr-DAla-Sar-NMePhe-NH>, ayAbu-DTrp-DTrp-Ser-NH2, ayAbu-DTrp-DTrp- Lys-NHo, ayAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH2, — aAbu-DTrp-DTrp-Orn-NH>,, — DThr- DáNal-DTrp-DPro-Arg-NH,, DAla-Ala-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH,, A- lay[CHNH]His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH7, Lys-DHis-DTrp-Phe-NH2, yA- bu-DTrp-DTrp-Orn-NH>, inip-Trp-Trp-Phe-NH>2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Leu-NH,, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Lys-NH2, Ac-DTrp-DTrp-Lys-NH2z, DLys-Tyr-DTrp-DTrp- Phe-Lys-NHo, — Ac-DbetaNal-Leu-Pro-NH,, — pAla-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH,, DVal-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NHo, “DLeu-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH», Ciclo hexilAla-DaNal-DTrp- Phe-Arg-NHz, DTp-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH>2, DAla- DBNal-DPro-Phe-Arg-NH>, Ac-DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH>, DaNal-DTrp-Phe- Arg-NH>, His-DTrp-DTrp-Lys-NH2, Ac-DpNal-DTrp-NH>, aAib-DTrp-Dciclo- hexilAla-NH2, aAib-DTrp-DAla-cicio-hexilAla-NH., DAla-Dciclo-hexilAla-Ala- —Ala-Phe-DPhe-Nle-NH>, DPhe-Ala-Phe-DPal-NH>, DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys- NH>2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH>2, Ac-DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH>, Arg- DTrp-Leu-Tyr-Trp-Pro(cícliico Arg-Pro), Ac-DBNal-PicLys-lLys-DPhe-NH2,
- 70 DPal-Phe-DTrp-Phe-Met-NHo, — DPhe-Trp-DPhe-Phe-Met-NHo, — DPal-Trp- DPhe-Phe-Met-NH7,, pAla-Pal-DTrp-DTrp-Om-NH2, ayAbu-Trp-DTrp-DTrp- Orn-NH>, BAla-Trp-DTrp-DTrp-Lys-NH72, yAbu-Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH>7, Ava- Trp-DTrp-DTrp-Orn-NH>, DLys-Tyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH>, His-DTrp-DArg- Trp-DPhe-NH7, <Glu-His-Trp-DSer-DArg-NH2, DPhe-DPhe-DTrp-Met-DLys- NH>, O0-(2-metilalill) benzofenona oxima, (R)-2-amino-3-(IH-indol-3-il)-I-(4- fenilpiperidin-1-il)propan-1-ona, N-((R)-1-((R)-1-((S)-3-(IH-indol-3-il)-1-0x0-1- (4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-ilamino)-6-amino-1-oxohexan-2-ilamino)-3- hidroxi-1-oxopropan-2-il)benzamida, — (S)-N-((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-0x0-1-(4- fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-6-acetamido-2-((S)-2-amino-3- (benzilóxi)propanamido)hexanamida, (S)-N-((R)-3-(1H-indol-3-il)-1-0x0-1-(4- - fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-2-((S)-2-acetamido-3-(benzilóxi)propanamido)- 6-amino-hexanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1-(4-(2-metoxifenil)piperidin-1- i iN)-1-oxopropan-2-il)-4-aminobutanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-i1)-1-(4-(2- metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-2-amino-2-metilpropanamida, — 3- (p-tolilcarbamoil)-2-naftoato = de metila» 3-(4(2-metoxifenil)piperidina-1- carbonil)-2-naftoato de etila, 3-(2-metoxifenilcarbamoil)-2-naftoato, (S)-2,4- diamino-N-((R)-3- (naftalen-2-ilmetóxi)-1-0x0-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2- iN)butanamida, naftaleno-2,3-di-ilbis((4-(2-metoxifenil)piperazin-1- ilmetanona), (R)-2-amino-N-(3-(benzilóxi)-1-0x0-1-(4-fenilpiperazin-1- iNpropan-2-il)-2-metilpropanamida, ou (R)-2-amino-3-(benzilóxi)-1-(4- fenilpiperazin-1-il)propan-1-ona.
Exemplos de análogos de GnRH adequados para aplicação co- mo uma porção de direcionamento na presente invenção incluem os conhe- cidos, por exemplo, da Patente Européia No.
EP171477, da Publicação de Patente Internacional No.
WO 96/033729, da Publicação de Patente Interna- cional No.
WO 92/022322, da Publicação de Patente Internacional No.
WO 92/013883, e da Publicação de Patente Internacional No.
WO 91/05563, ca- da uma das quais é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meiode referência a estas.
Exemplos específicos compreendem: (NAcD- Qal!,DPtA, DPAIº cisPzACAIa”, DPicLysº, DAIa)LHRH; NACD-
Í 71 Nal!, DpCIPhe?, DPalº,cisPzACAIa”, DNicLys",ILysº, DAIa")LHRH; (NAcCD- Nal! DpCIPhe?, DPab, Tht,PicLys”, DPicLysº,ILysº, DAIa”)LHRH; (NAcCD- Nal! ,DpCIPhe?, DPafº,PicLys”, DPicLysº, Thr”,ILysº, DAIa)LHRH; — (NapDT- hr), DpCIPhe?,DPaf,PicLys*, DPicLysº,ILysº, DAIa”)LHRH; (NAcD- —Nal,DpcIPhe? DPalº,NicLysº,DNicLysº,Thr”,ILysº, DAIa”)LHRH; (NAcCD- Nal! ,DpCIPhe?, DPal, ThrºNicLys”, DNicLysº, Thr”,!Lysº, DAIla”)LHRH; (NACDNal' ,DpCIPhe?, DPal?,PicLys”, D(PicSar)Lysº,ILysº, DAIa)LHRH"; (NACDNal DpCIPhe?,DPal?, D(PicSar)Lysº,ILysº, DAIa”)LHRH; (NAcCD- Nal! ,DpCIPhe?, DPal? PicLys”, D(SANic)Lysº,ILysº, DAIla”)LHRH; (NAcCD- Nall,DpcIPhe?,DPab,PicLys”, D(SANic)Ornº,ILysº, DAIa)LHRH; (NAcCD- Qal!, DCpa?, DPal? cisPZzACAla”, DPicLysº, NLeu”,ILysº, DAIa)LHRH; (NACD- : Nal', DCpa?, DPalº DPicLysº, DAPhe(PicSar)? ILys?, DAIaº)LHRH; NACD- : Qal!,DCpa?, DPal?,PicLys*, DPalô,ILysº, DAIa*)LHRH; (NAcCD- Nal!, DCpa?, DPal?,PicLys”, DOrn(ACyp)S,ILysº, DAIlaLHRH; N-acetil-D-beta- Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclo-pentil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH>; N- acetil-D-g-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(ciclopentil)-Phe-Lys(ciclopentil)- Pro-D-Ala-NH>; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe- (isopropil)D-Lys-Pro-D-Ala-NH;; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr- D-Lys(benzil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH;; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe- Ser-Tyr-D-Lys(Cl-benzil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH;; N-acetil-D-beta-Nal-D- Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Arg-Pro-D-Ala-NH.; — N-acetil-D-beta- Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(t-butilmetil)-Pro-D-Ala-NH>; N- acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-(4-metil-benzil)-Pro- D-Ala-NH>; N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Arg-Phe-Lys- (benzil)-Pro-D-Ala-NH;; N-acetil-D-beta-Nal-D-p-CI-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-p- NH>2-Phe-Phe-(isopropil)Lys-Pro-D-Ala-NHo; — N-acetil-D-beta-Nal-D-Phe-D- Phe-Ser-Tyr-D-Lys(heptil)-Phe-Lys-(heptil)-Pro-D-Ala-NH>; N-acetil-D-3-Nal- D-Phe-D-Phe-Ser-Tyr-D-Lys(1-butilpentil)-Phe-Lys(1-butilpentil)-Arg-Pro-D- Ala-NH>. Exemplos de análogos de urotensina adequados para aplicação como uma porção de direcionamento da presente invenção compreendem: Cpa-c [D-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys]-Val-NH2; e Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-
' 72 Cys]-Val-OH.
Os polipeptídeos da presente invenção carecem de um domínio Hc funcional de uma neurotoxina clostridial. Por conseguinte, os referidos polipeptídeos não são capazes de ligar membranas sinaptossomais de rato (através de um componente Hc clostridial) em ensaios de ligação conforme descrito em Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82. Em uma moda- lidade preferencial, os polipeptídeos preferencialmente carecem dos últimos 50 aminoácidos de C-terminal de uma holotoxina de neurotoxina clostridial. Em outra modalidade, os polipeptídeos preferencialmente carecem dos últi- mos 100, preferencialmente dos últimos 150, mais preferencialmente dos últimos 200, de modo particularmente preferencial dos últimos 250, e o mais ' preferencialmente dos últimos 300 resíduos aminoácidos de C-terminal de . uma holotoxina de neurotoxina clostridial. Alternativamente, a atividade de ligação de Hc pode ser negada / reduzida por mutagênese — a título de e- xemplo, recorrendo a BOoNT/ A por conveniência, modificação de uma ou duas mutações de resíduos aminoácidos (W1266 a L e Y1267 a F) na bolsa de ligação de gangliosídeo faz com que a região Hc perca sua função de ligação de receptor. Mutações análogas podem ser feitas para componentes peptídicos clostridiais não sorotipo A, por exemplo, um constructo à base de botulihum B com mutações (W1262 a L e Y1263 a F) ou botulihpum E (W1224 a L e Y1225 a F). Outras mutações para o sítio ativo realizam a mesma ablação de atividade de ligação de receptor de Hc, por exemplo, Y12678S em toxina botulínica tipo A e o resíduo correspondente altamente conservado nas outras neurotoxinas clostridiais. Detalhes desta e de outras mutações são descritos em Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634), a qual é por este incorporada por meio de referência à mesma.
Em outra modalidade, os polipeptídeos da presente invenção ca- recem de um domínio funcional Hc de uma neurotoxina clostridial e também carecem de qualquer porção de direcionamento funcionalmente equivalente.
Por conseguinte, os referidos polipeptídeos carecem da função de ligação natural de uma neurotoxina clostridial e não são capazes de ligar membra- nas sinaptossomais de rato (através de um componente clostridial Hc, ou
" 73 através de qualquer porção de direcionamento funcionalmente equivalente) em ensaios de ligação conforme descrito em Shone et a/. (1985) Eur. J. Bio- chem. 151, 75-82.
O peptídeo Hc de uma neurotoxina clostridial nativa compreende cerca de 400440 resíduos aminoácidos, e consiste em dois domínios fun- cionalmente distintos de cerca de 25 kDa cada, a saber a região de N- terminal (comumente referida como o peptídeo ou domínio Hcy) e a região de C-terminal (comumente referida como o peptídeo ou domínio Hcc). Este fato é confirmado pelas seguintes publicações, cada uma das quais é incor- porada aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade por meio de referência às mesmas: Umland TC (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 788-792; Her- ' reros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. Biol. Chem. 268: 15, pp. 11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. Biol. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Assoc. Abstract Papers 25:90; Swaminathan and Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. Biol. 7: 1751-1759; e Rummel A (2004) Mol. Microbiol. 51(3), 631-643. Além disso, foi bem documentado que a região de C-terminal (Hcc), a qual constitui os 160-200 resíduos aminoácidos de C-terminal, é responsável por ligação de uma neurotoxina clostridial a seus receptores celulares naturais, a saber a terminais nervosos na junção neuromuscular - este fato também é confirma- do pelas publicações acima. Deste modo, referência do início ao fim desta especificação a uma cadeia pesada ciostridial carecendo de um peptídeo (ou domínio) Hc de cadeia pesada funcional de tal modo que a cadeia pesada é incapaz de ligação a receptores da superfície celular aos quais uma neuro- toxina clostridial nativa liga significa que a cadeia pesada clostridial sim- plesmente carece de um peptídeo funcional Hcc. Em outras palavras, a regi- ão do peptídeo Hcc é ou parcialmente ou totalmente eliminada, ou modifica- da de modo diverso (por exemplo, através de tratamento químico ou proteo- lítico convencional) para inativar sua capacidade de ligação nativa para ter- minaisnervosos na junção neuromuscular. Deste modo, em uma modalidade, um peptídeo Hn clostridial da presente invenção carece de parte de uma porção peptídeo C-terminal (Hcc)
' 74 de uma neurotoxina clostridial e portanto carece da função de ligação de Hc de neurotoxina clostridial nativa. A título de exemplo, em uma modalidade, o peptídeo Hy clostridial extendido C-terminalmente carece dos 40 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 60 resíduos aminoácidos de C-terminal, oudos 80 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 100 resíduos amino- ácidos de C-terminal, ou dos 120 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 140 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 150 resíduos aminoá- cidos de C-terminal, ou dos 160 resíduos aminoácidos de C-terminal de uma cadeia pesada de neurotoxina clostridial. Em outra modalidade, o peptídeo Hu clostridial da presente invenção carece de toda a porção peptídeo C- terminal (Hcc) de uma neurotoxina clostridial e portanto carece da função de ' ligação de Hc de neurotoxina clostridial nativa. A título de exemplo, em uma : modalidade, o peptídeo Hy clostridial carece dos 165 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 170 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 175 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 180 resíduos aminoácidos de C- terminal, ou dos 185 resíduos aminoácidos de C-terminal, ou dos 190 resí- duos aminoácidos de C-terminal, ou dos 195 resíduos aminoácidos de C- terminal de uma cadeia pesada de neurotoxina clostridial. A título de exem- plo adicional, o peptídeo Ho clostridial da presente invenção carece de uma sequência de referência Hcc clostridial selecionada entre o grupo consistindo em: Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (Y1111-L1296) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (Y1098-E1291) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (Y1112-E1291) —Neurotoxina Botulínicatipo Dº - resíduos aminoácidos (Y1099-E1276) Neurotoxina Botulínica tipo E - resíduos aminoácidos (Y1086-K1252) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (Y1106-E1274) Neurotoxina Botulínica tipo G/ - resíduos aminoácidos (Y1106-E1297) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (Y1128-D1315).
As sequências de referência identificadas acima devem ser con- sideradas um guia uma vez que ligeiras variações podem ocorrer de acordo com subsorotipos.
Ú 75 A protease da presente invenção engloba todas as proteases não citotóxicas que são capazes de clivar uma ou mais proteínas do apare- lho de fusão exocítica em células eucarióticas.
A protease da presente invenção é preferencialmente uma pro- tease bacteriana (ou fragmento da mesma). Mais preferencialmente a prote- ase bacteriana é selecionada entre os gêneros Clostridium ou Neisseria / Streptococcus (por exemplo, uma protease de IgA de cadeia curta clostridial, ou uma protease de IgA neisserial preferencialmente de N. gonorrhoeae ou de S. pneumoniae). A presente invenção também engloba proteases não citotóxicas variantes (isto é, variantes de moléculas de proteases que ocorrem natural- " mente), na medida que as proteases variantes ainda demonstram a ativida- : de de protease requerida.
A título de exemplo, uma variante pode ter no mi- nimo 70%, preferencialmente no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 90%, e o mais preferencialmente no mínimo 95 ou no mínimo 98% de homologia de sequência de aminoácidos com uma sequência de protea- se de referência.
Portanto, o termo variante inclui proteases não citóticas tendo atividade de endopeptidase reforçada (ou reduzida) — menção em par- ticular aqui é feita aos Kca/Km aumentados de mutantes de BONT/A Q161A, ES4A,eKi65L vide Ahmed, S.A. (2008) Protein J.
DOI 10.1007/s10930-007- 9118-8, a qual é incorporada por meio de referência à mesma.
O termo fragmento, quando usado em relação a uma protease, tipicamente significa um peptídeo tendo no mínimo 150, preferencialmente no mínimo 200, mais preferencialmente no mínimo 250, e o mais preferencialmente no mínimo 300 resíduos aminoácidos da protease de referência.
Como com o compo- nente 'fragmento' da porção de direcionamento (discutido acima), fragmen- tos' de protease da presente invenção englobam fragmentos de proteases variantes à base de uma sequência de referência.
A protease da presente invenção preferencialmente demonstra uma atividade de serina ou de metaloprotease (por exemplo, atividade de endopeptidase). A protease é preferencialmente específica para uma proteí- na SNARE (por exemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMP, ou sintaxina).
' 76 É feita menção em particular aos domínios de protease de neu- rotoxinas, por exemplo, a domínios de protease de neurotoxinas bacterianas. Deste modo, a presente invenção engloba o uso de domínios de neurotoxi- na, os quais ocorrem na natureza, bem como versões preparadas de modo recombinante das referidas neurotoxinas que ocorrem naturalmente.
Neurotoxinas exemplares são produzidas por clostrídios, e o termo neurotoxina clostridial engloba neurotoxinas produzidas por C. tetani (TeNT), e por C. botulinum (BoNT) sorotipos A-G, bem como as neurotoxi- nas semelhantes a BoNT intimamente relacionadas produzidas por C. baratii ecC. butyricum. As abreviações mencionadas acima são usadas do início ao fim da presente especificação. Por exemplo, a nomenclatura BONT/A denota ' a fonte de neurotoxina como BoNT (sorotipo A). Nomenclatura correspon- . dente se aplica a outros sorotipos de BONT. BoNTs são as toxinas mais potentes conhecidas, com valores de dose letal mediana (LD50) para camundongos variando a partir de 0,5 até 5 ng/kg dependendo do sorotipo. BoNTs são adsorvidas no trato gastrointesti- nal, e, depois de penetrar na circulação geral, ligam à membrana pré- sináptica de terminais nervosos colinérgicos e previnem a liberação de seu neurotransmissor acetilcolina. BONT/B, BOoNT/D, BoNT/F e BoNT/G clivam sinaptobrevina/ proteina de membrana associada a vesícula (VAMP); BoNT/C, BOoNT/A e BoNT/E clivam a proteína associada- sinaptossomal de kDa (SNAP-25); e BoNT/C cliva sintaxina. BoNTs partilham uma estrutura comum, sendo proteínas bi- cadeia de -150 kDa, consistindo em uma cadeia pesada (cadeia H) de -100 25 kDa unidade modo covalente por uma única ligação dissulfeto a uma cadeia curta (cadeia L) de -50 kDa. A cadeia H consiste em dois domínios, cada um de —50 kDa. O domínio de C-terminal (Hc) é necessário para a ligação neuronal de alta afinidade, ao passo que o domínio de N-terminal (Hy) é proposto para ser envolvido em translocação de membrana. A cadeia L é uma metaloprotease zinco-dependente responsável pela clivagem da proteí- na SNARE do substrato.
O termo fragmento de cadeia L significa um componente da ca-
deia L de uma neurotoxina, cujo fragmento demonstra uma atividade de me- taloprotease e é capaz de clivar proteoliticamente uma vesícula e/ou proteí- na associada a membrana plasmática envolvida em exocitose celular.
Exemplos de sequências (de referência) de proteases adequa- dasincluem: Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (1-448) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (1-440) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (1441) Neurotoxina Botulínica tipo Dº - resíduos aminoácidos (1-445) Neurotoxina Botulínicatipo E -resíduos aminoácidos (1-422) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (1-439) - Neurotoxina Botulínica tipo G/ - resíduos aminoácidos (1-441) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (1-457) i IgA protease - resíduos aminoácidos (1-959)* * Pohiner, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458462, a qual é por este incor- porada por meio de referência à mesma.
A sequência de referência identificada acima deve ser conside- rada um guia uma vez que ligeiras variações podem ocorrer de acordo com subsorotipos. A título de exemplo, a Patente dos Estados Unidos No.
2007/0166332 (a este incorporada por meio de referência à mesma) cita se- quências clostridiais ligeiramente diferentes: Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (M1-K448) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (M1-K441) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (M1-K449) — Neurotoxina Botulínicatipo Dº - resíduos aminoácidos (M1-R445) Neurotoxina Botulínica tipo E - resíduos aminoácidos (M1-R422) Neurotoxina Botulínica tipo F. - resíduos aminoácidos (M1-K439) Neurotoxina Botulínica tipo G - resíduos aminoácidos (M1-K446) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (M1-A457) Uma variedade de fragmentos de toxina clostridial compreen- dendo a cadeia curta pode ser útil em aspectos da presente invenção com a condição de que estes fragmentos de cadeia curta podem especificamente
' 78 direcionar os componentes do núcleo do aparelho de liberação do neuro- transmissor e portanto participam da execução do mecanismo celular global por meio do qual uma toxina clostridial cliva proteoliticamente um substrato. As cadeias curtas de toxinas clostridiais têm cerca de 420 a 460 aminoáci- dosdeextensãoe compreendem um domínio enzimático. Pequisa mostrou que toda a extensão de uma cadeia curta da toxina clostridial não é neces- sária para a atividade enzimática do domínio enzimático. Como um exemplo não limitante, os oito primeiros aminoácidos da cadeia curta BONT/A não são necessários para atividade enzimática. Como outro exemplo não limitante, os oito primeiros aminoácidos da cadeia curta TeNT não são necessários para atividade enzimática. Do mesmo modo, o término carboxila da cadeia ' curta não é necessário para atividade. Como um exemplo não limitante, os . últimos 32 aminoácidos da cadeia curta BONT/A (resíduos 417-448) não são necessários para atividade enzimática. Como outro exemplo não limitante, osúltimos31 aminoácidos da cadeia curta TeNT (resíduos 427-457) não são necessários para atividade enzimática. Deste modo, aspectos desta modali- dade podem incluir cadeias curtas de toxina clostridial compreendendo um domínio enzimático tendo uma extensão de, por exemplo, no mínimo 350 aminoácidos, no mínimo 375 aminoácidos, no mínimo 400 aminoácidos, no mínimo 425 aminoácidos e no mínimo 450 aminoácidos. Outros aspectos desta modalidade podem incluir cadeias curtas de toxina clostridial compre- endendo um domínio enzimático tendo uma extensão de, por exemplo, no máximo 350 aminoácidos, no máximo 375 aminoácidos, no máximo 400 a- minoácidos, no máximo 425 aminoácidos e no máximo 450 aminoácidos.
O componente de protease não citotóxica da presente invenção preferencialmente compreende uma cadeia curta do sorotipo BoNT/A, BoNT/B ou BoNT/D (ou fragmento ou variante da mesma).
Os polipeptídeos da presente invenção, especialmente o com- ponente de protease dos mesmos, podem ser PEGuilados — isto pode ajudar a aumentar a estabilidade, por exemplo, duração da ação do componente de protease. PEGuilação é particularmente preferencial quando a protease compreende uma BoNT/A, B ou C; protease. PEGuilação preferencialmente
Ú 79 inclui a adição de PEG ao N-término do componente de protease. A título de exemplo, o N-término de uma protease pode ser extendido com um ou mais resíduos aminoácidos (por exemplo, cisteína) , os quais podem ser os mes- mos ou diferentes. Um ou mais dos referidos resíduos aminoácidos podem tersua própria molécula PEG anexada (por exemplo, anexada de modo co- valente) a estes. Um exemplo desta tecnologia é descrito na Publicação de Patente Internacional No. WO 2007/104567, a qual é incorporada em sua totalidade por meio de referência à mesma.
Um Domínio de Translocação é uma molécula que possibilita translocação de uma protease para dentro de uma célula-alvo de tal modo que uma ocorre expressão funcional da atividade de protease dentro do cito- ' sol da célula-alvo. Se qualquer molécula (por exemplo, uma proteína ou pep- . tídeo) possui a função de translocação necessária da presente invenção po- de ser confirmado por qualquer uma de uma série de ensaios convencionais. Por exemplo, Shone C. (1987) descreve um ensaio in vitro em- pregando lipossomas, os quais são estimulados com uma molécula de teste. A presença da função de translocação necessária é confirmada por libera- ção dos lipossomas de K* e/ ou NAD marcado, os quais podem ser pronta- mente monitorados [vide Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; vol. 167(1): pp.
175-180].
Um exemplo adicional é proporcionado por Blaustein R. (1987), o qual descreve uma porova in vitro simples empregando membranas bica- mada de fosfolipídeos planares. As membranas são estimuladas com uma molécula de teste e a função de translocação necessária é confirmada por um aumento na condutância através das membranas referidas [vide Blauste- in (1987) FEBS Letts; vol. 226, no. 1: pp. 115-120].
Metodologia adicional para possibilitar a avaliação de fusão de membrana e portanto identificação de Domínios de Translocação adequados para aplicação na presente invenção são proporcionadas por Methods in Enzymology Vol220 and 221, Membrane Fusion Techniques, Parts A and B, Academic Press 1993. A presente invenção também engloba domínios de translocação
Ú 80 variantes, na medida que os domínios de translocação variantes ainda de- monstram a atividade de translocação necessária.
A título de exemplo, uma variante pode ter no mínimo 70%, preferencialmente no mínimo 80%, mais preferencialmente no mínimo 90%, e o mais preferencialmente no mínimo 95% ouno mínimo 98% de homologia da sequência de aminoácidos com um domínio de translocação de referência.
O termo fragmento, quando usado em relação a um domínio de translocação, significa um peptídeo tendo no mínimo 20, preferencialmente no mínimo 40, mais preferencialmente no míi- nimo 80, e o mais preferencialmente no mínimo 100 resíduos aminoácidos dodomínio de translocação de referência.
No caso de um domínio de trans- locação clostridial, o fragmento preferencialmente tem no mínimo 100, prefe- ' rencialmente no mínimo 150, mais preferencialmente no mínimo 200, e o . mais preferencialmente no mínimo 250 resíduos aminoácidos do domínio de translocação de referência (por exemplo, domínio Hu). Como com o compo- nente 'fragmento' da porção de direcionamento (discutido acima), 'fragmen- tos' de translocação da presente invenção englobam fragmentos de domí- nios de translocação variantes com base nas sequências de referência.
O Domínio de Translocação é preferencialmente capaz de for- " mação de poros permeáveis a íons em membranas lipídicas sob condições de baixopH.
Preferencialmente se descobriu o uso de somente as porções da molécula de proteína capazes de formação de poros dentro da membra- na endossômica.
O Domínio de Translocação pode ser obtido a partir de uma fon- te de proteína microbiana, em particular a partir de uma fonte de proteína bacteriana ou viral.
Portanto, em uma modalidade, o Domínio de Transloca- ção é um domínio de translocação de uma enzima, tal como uma toxina bac- teriana ou proteína viral.
Está bem documentado que alguns domínios de moléculas de toxinas bacterianas têm a capacidade de formar os poros referidos.
Também se sabe que alguns domínios de translocação de proteínas de fusão de membrana expressadas viralmente têm a capacidade de formar os poros referidos.
Os domínios referidos podem ser empregados na presente inven-
Ú 81 ção.
O Domínio de Translocação pode ser de uma origem clostridial, tal como o domínio Hy (ou um componente funcional do mesmo). Hy signifi- ca uma porção ou fragmento da cadeia H de uma neurotoxina clostridial a- proximadamente equivalente à metade de terminal amino da cadeia H, ou o domínio correspondente a este fragmento na cadeia H intacta.
A cadeia H carece da função de ligação natural do componente Hc da cadeia H.
A este respeito, a função Hc pode ser removida por eliminação da sequência de aminoácidos Hc (quer no nível de síntese de DNA, ou no nível pós-síntese portratamento com nuclease ou protease). Alternativamente, a função de Hc pode ser inativada por tratamento química ou biológica.
Deste modo, a ca-
' deia H é incapaz de ligação ao Sítio de Ligação sobre uma célula-alvo à qual . neurotoxina clostridial nativa (isto é, holotoxina) liga.
Exemplos de Domínios de Translocação (de referência) adequa-
dos incluem:
Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (449-871) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (441-858) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (442-866) Neurotoxina Botulínica tipo Dº - resíduos aminoácidos (446-862)
— Neurotoxina Botulínicatipo E -resíduos aminoácidos (423-845) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (440-864) Neurotoxina Botulínica tipo G — - resíduos aminoácidos (442-863) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (458-879)
A sequência de referência identificada acima deve ser conside-
rada um guia uma vez que ligeiras variações podem ocorrer de acordo com subsorotipos.
A título de exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 2007/0166332 (a este incorporada por meio de referência à mesma) cita se- quências clostridiais ligeiramente diferentes:
Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (A449-K871)
—Neurotoxina Botulínicatipo B -resíduos aminoácidos (A442-S858) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (T450-N866) Neurotoxina Botulínica tipo Dº - resíduos aminoácidos (D446-N862)
' 82 Neurotoxina Botulínica tipo E - resíduos aminoácidos (K423-K845) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (A440-K864) Neurotoxina Botulínica tipo G - resíduos aminoácidos (S447-S863) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (S458-V879) No contexto da presente invenção, uma variedade de regiões Hy de toxina Clostridial compreendendo um domínio de translocação podem ser úteis para em aspectos da presente invenção com a condição de que estes fragmentos ativos podem facilitar a liberação de uma protease não citotóxica (por exemplo, uma cadeia L clostridial) a partir de vesículas intracelulares para dentro do citoplasma da célula-alvo e portanto participam da execução do mecanismo celular global por meio do qual uma toxina clostridial cliva - proteoliticamente um substrato. As regiões Hy das cadeia longacadeias lon- gas de toxinas Clostridiais têm cerca de 410 a 430 aminoácidos de extensão e compreendem um domínio de translocação. Pequisa mostrou que toda a extensãode uma região Hy de uma cadeia pesada de toxina Clostridial não é necessária para a atividade de translocação do domínio de translocação. Deste modo, aspectos desta modalidade podem incluir regiões Hy de toxina clostridial compreendendo um domínio de translocação tendo uma extensão de, por exemplo, no mínimo 350 aminoácidos, no mínimo 375 aminoácidos, —nomínimo 400 aminoácidos e no mínimo 425 aminoácidos. Outros aspectos desta modalidade podem incluir regiões Hy de toxina clostridial compreen- dendo domínio de translocação tendo uma extensão de, por exemplo, no máximo 350 aminoácidos, no máximo 375 aminoácidos, no máximo 400 a- minoácidos e no máximo 425 aminoácidos.
Para detalhes adicionais sobre a base genética da produção de toxina em Clostridium botulinum e C. tetani, foi consultado Henderson et al (1997) em The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press.
O termo Hyn engloba porções Hy de neurotoxinas que ocorrem naturalmente, e porções Hy modificadas tendo sequências de aminoácidos que não ocorrem na natureza e/ ou resíduos aminoácidos sintéticos, contan- to que as porções Hy modificadas ainda demonstrem a função de transloca-
Ú 83 ção mencionada acima.
Alternativamente, o Domínio de Translocação pode ser de uma origem não clostridial.
Exemplos de origens de Domínios de Translocação (de referência) não clostridiais incluem, mas não estão restritos a, o domínio detranslocação da toxina diftérica [0'Keefe et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1992) 89, 6202-6206; Silverman et a/., J.
Biol.
Chem. (1993) 269, 22524 22532; e London, E. (1992) Biochem.
Biophys.
Acta., 1112, pp.25-51]), o do- mínio de translocação de exotoxina de Pseudomonas tipo A [Prior et al.
Bio- chemistry (1992) 31, 3555-3559], os domínios de translocação da toxina do anthrax[Blanke et al.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA (1996) 93, 8437-8442], uma variedade de peptídeos fusogênicos ou hidrofóbicos de função de transloca- ' ção [Plank et al.
J.
Biol.
Chem. (1994) 269, 12918-12924; e Wagner et al : (1992) PNAS, 89, pp.7934-7938], e peptídeos anfifílicos [Murata et a/ (1992) Biochem., 31, pp. 1986-1992]. O Domínio de Translocação pode espelhar o Domínio de Translocação presente em uma proteína que ocorre naturalmen- te, ou pode incluir variações de aminoácidos na medida que as variações não destruam a capacidade de translocação do Domínio de Translocação.
Exemplos particulares de Domínios de Translocação (de refe- rência) virais adequados para aplicação na presente invenção incluem al- guns domínios de transloção de proteínas de fusão de membrana expressa- das viralmente.
Por exemplo, Wagner et al. (1992) e Murata et al. (1992) descrem a função de translocação (isto é, fusão de membrana e vesicula- ção) de uma série de peptídeos fusogênicos e anfifílicos derivados da região de N-terminal de hemaglutinina do vírus da influenza.
Outras proteínas de fusãode membrana expressadas viralmente conhecidos tendo a atividade de translocação desejada são um domínio de translocação de um peptídeo fusogênico do Semliki Forest Virus (SFV), um domínio de translocação da glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular (VSV), um domínio de trans- locação da proteína F de SER vírus e um domínio de translocação da glico- proteínado envelope do Foamy virus.
Proteínas Aspike viralmente codifica- das têm aplicação particular no contexto da presente invenção, por exemplo, a proteina E1 de SFV e a proteína G da proteína G de VSV.
: 84 Aplicação dos Domínios de Translocação (de referência) listados na Tabela (abaixo) inclui uso de variantes de sequências dos mesmos.
Uma variante pode compreender uma ou mais substituições de ácidos nucleicos conservativas e/ ou eliminações ou inserções de ácidos nucleicos, com a condição de que a variante possui a função de translocação necessária.
Uma variante também pode compreender uma ou mais substituições de a- minoácidoss e/ ou eliminações ou inserções de aminoácidos, na medida que a variante possui a função de translocação necessária.
Fonte do Domínio | Resíduos aminoáci- Referências de Translocação dos Toxina diftérica 194-380 Silverman et a/., 1994, J.
Biol.
Chem. 269, 22524-22532 7 London E., 1992, Biochem.
Biophys.
Acta., 1113, 25-51 Domínio |l de e- 405-613 Prior ef a/., 1992, Biochemistry xotoxina de 31, 3555-3559 pseudomonas Kihara & Pastan, 1994, Bioconj Chem. 5, 532-538 Hemaglutinina do | GLFGAIAGFIENG- Plank et a/., 1994, J.
Biol. vírus da Influenza | WEGMIDGWYG, e Chem. 269, 12918-12924 Variantes dos mes- Wagner et al., 1992, PNAS, mos 89, 7934-7938 Murata ef a/., 1992, Biochemis- try 31, 1986-1992 Proteína fusogê- | Domínio de translo- | Kielian ef a/., 1996, J Cell Biol. nica do Semliki cação 134(4), 863-872 Forest vírus Glicoproteína G 118-139 Yao et al., 2003, Virology do vírus da Esto- 310(2), 319-332 matite Vesicular Proteína F do Domínio de translo- | Seth et a/., 2003, J Virol 77(11) vírus SER cação 6520-6527 Glicoproteína do | Domínio de translo- | Picard-Maureau et a/., 2003, J envelope do Fo- cação Virol. 77(8), 4722-4730 amy virus Os polipeptídeos da presente invenção podem compreender a-
' 85 dicionalmente um domínio facilitador de translocação. O referido domínio facilita a liberação da protease não citotóxica para dentro do citosol da célu- la-alvo e são descritos, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional No. WO 08/008803 e na Publicação de Patente Internacional No. WO 08/008805, cada uma das quais é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência às mesmas.
A título de exemplo, domínios facilitadores de translocação ade- quados incluem um domínio de peptídeo fusogênico de vírus envelopado, por exemplo, domínios de peptídeos fusogênicos adequados incluem domí- niode peptídeo fusogênico do vírus da influenza (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do vírus da influenza A de 23 aminoácidos), domínio de ' peptídeo fusogênico do alfavírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogê- : nico do Semliki Forest vírus de 26 aminoácidos), domínio de peptídeo fuso- gênico do vesiculovírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do vírusda estomatite vesicular de 21 aminoácidos), domínio de peptídeo fuso- gênico do respirovírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do Sendai vírus de 25 aminoácidos), domínio de peptídeo fusogênico do morbi- liivírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do vírus da cinomose canina de 25 aminoácidos), domínio de peptídeo fusogênico do avulavírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do vírus da doença de New- castle de 25 aminoácidos), domínio de peptídeo fusogênico do henipavírus (por exemplo, domínio de peptídeo fusogênico do Hendra vírus de 25 ami- noácidos), domínio de peptídeo fusogênico do metapneumovírus (por exem- plo, domínio de peptídeo fusogênico do metapneumovírus Humano de 25 aminoácidos) ou domínio de peptídeo fusogênico do spumavírus tal como domínio de peptídeo fusogênico do foamy virus simiesco; ou fragmentos ou variantes dos mesmos.
A título de exemplo adicional, um domínio facilitador de translo- cação pode compreender um domínio Hc de toxina Clostridial ou um frag- mento ou variante do mesmo. Em mais detalhes, um domínio facilitador de translocação Hoy de toxina Clostridial pode ter uma extensão de no mínimo 200 aminoácidos, no mínimo 225 aminoácidos, no mínimo 250 aminoácidos,
í 86 no mínimo 275 aminoácidos.
A este respeito, um domínio facilitador de translocação Hen de toxina Clostridial preferencialmente tem uma extensão de no máximo 200 aminoácidos, no máximo 225 aminoácidos, no máximo 250 aminoácidos, ou no máximo 275 aminoácidos.
Exemplos (de referência) específicos incluem: Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (872-1110) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (859-1097) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (8667-1111) Neurotoxina Botulínica tipo Dº - resíduos aminoácidos (863-1098)
Neurotoxina Botulínicatipo E -resíduos aminoácidos (846-1085) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (865-1105)
- Neurotoxina Botulínica tipo G - resíduos aminoácidos (864-1105) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (880-1127) ' As posições de sequências acima podem variar um pouco de acordo com sorotipo/ subtipo, e exemplos adicionais de domínios Hcy de toxina Clostridial (de referência) adequados incluem:
Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (874-1110) Neurotoxina Botulínica tipo B - resíduos aminoácidos (861-1097) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (869-1111)
— Neurotoxina Botulínicatipo Dº - resíduos aminoácidos (865-1098) Neurotoxina Botulínica tipo E - resíduos aminoácidos (848-1085) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (867-1105) Neurotoxina Botulínica tipo G - resíduos aminoácidos (866-1105) Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (882-1127)
Qualquer um dos domínios de facilitação descritos acima pode ser combinado com quaisquer dos peptídeos dos domínios de translocação previamente descritos que são adequados para aplicação na presente in- venção.
Deste modo, a título de exemplo, um domínio de facilitação não clostridial pode ser combinado com peptídeo do domínio de translocação não clostridial ou com peptídeo do domínio de translocação clostridial.
Alter- nativamente, um domínio facilitador de translocação Hcw de toxina Clostridial pode ser combinado com um peptídeo do domínio de translocação não clos-
' 87 tridal.
Alternativamente, um domínio facilitador How de toxina Clostridial pode ser combinado ou com um peptídeo do domínio de translocação clostridial, cujos exemplos incluem: Neurotoxina Botulínica tipo A - resíduos aminoácidos (449-1110)
Neurotoxina Botulínicatipo B -resíduos aminoácidos (442-1097) Neurotoxina Botulínica tipo Cº - resíduos aminoácidos (450-1111) Neurotoxina Botulínica tipo Dº - resíduos aminoácidos (446-1098) Neurotoxina Botulínica tipo E - resíduos aminoácidos (423-1085) Neurotoxina Botulínica tipo F - resíduos aminoácidos (440-1105)
Neurotoxina Botulínica tipo G -resíduos aminoácidos (447-1105)
Neurotoxina Tetânica - resíduos aminoácidos (458-1127)
' Homologia de sequência:
. Qualquer um de uma variedade de métodos de alinhamento de sequência pode ser usado para determinar a percentagem de identidade, incluindo, sem limitação, métodos globais, métodos locais e métodos híbri- dos, tais como, por exemplo, métodos de aproximação de segmentos.
Pro- tocolos para determinar a percentagem de identidade são procedimentos de rotina dentro do âmbito de uma pessoa versada na técnica.
Métodos globais alinham sequências do início ao fim da molécula e determinm o melhor ali- —nhamento adicionando escores de pares de resíduos individuais e impondo penalidades de intervalo.
Métodos não limitantes incluem, por exemplo, CLUSTAL W, vide, por exemplo, Julie D.
Thompson et al., CLUSTAL W: Im- proving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position - Specific Intervalo Penalties and Weight Ma- trix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); e refinamento iterativo, vide, por exemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accu- racy of Multiple Protein.
Sequence Alignments by Ilterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J.
Mol.
Biol. 823- 838 (1996). Métodos locais alinham sequências por identificação de um ou mais motivos conservados partilhados por todas as sequências de entrada.
Métodos não limitante incluem, por exemplo, Match-box, vide, por exemplo, Eric Depiereux and Emest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Al-
' 88 gorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); amostragem de Gibbs, vide, por exemplo, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Stra- tegy for Multiple Alignment, 262 (5131 ) Science 208-214 (1993); Align-M, vide, por exemplo, Ivo Van Walle et a/., Align-M - A New Algorithm for Muiti- ple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9): Bioinformatics: 1428- 1435 (2004). Deste modo, a percentagem da identidade de sequência é de- terminada por métodos convencionais. Vide, por exemplo, Altschul ef al., Buil. Math. Bio. 48: 603-16, 1986 e Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-19, 1992. Em resumo, duas sequências de aminoácidos ' são alinhadas para otimizar os escores de alinhamento usando uma penali- . dade de abertura de intervalo de 10, uma penalidade de extensão de interva- lo de 1, e a matriz de classificação "blosum 62" de Henikoff e Henikoff (ibid.) conforme mostrado abaixo (aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra de rotina). Escores de alinhamento para determinação da identidade de se- quência
ARNDCQEGHILKMFPSTWYV A4 R-15 N-206 D-2-216 CcC0-3-3-39 Q-1100-35 E-1002425 G0-20-1-3-2-26 H-201-1-300-28 1-1-3-3-3-1-3-34-34 L-1-2-34-1-2-34-324 K-120-1-311-2-1-3-25 M-1-1-2-3-10-2-3-212-15
Í 89 F-2-3-3-3-2-3-3-3-100-306 P1-2-2-1-3-1-1-2-2-3-3-1-247 S1-110-1000-1-2-20-1-2-14 TO-10-1-1-1-1-2-2-1-1-1-1-2-115 W-3-3-4-4-2-2-3-2-2-3-2-3-114-3-211 Y-2-2-2-3-2-1-2-32-1-1-2-13-3-2-227 VO0-3-3-3-1-2-2-3-331-21-1-2-20-3-14 A percentagem de identidade é em seguida calculada como: Número total de combinações idênticas x 100 [extensão da sequência mais longa mais o número de intervalos introduzidos dentro da sequência ' mais longa de modo a alinhar as duas sequências] . Polipeptídeos substancialmente homólogos são caracterizados como tendo uma ou mais substituições, eliminações ou adições de aminoá- cidos.
Estas alterações são preferencialmente de uma natureza menor, isto é, substituições de aminoácidos conservadoras (vide abaixo) e outras substi- tuições que não afetam significativamente o dobramento ou a atividade do polipeptídeo; pequenas eliminações, tipicamente de um a cerca de 30 ami- noácidos; e pequenas extensões de terminal amino ou carboxila, tais como um resíduo metionina de terminal amino, um pequeno peptídeo ligante de até cerca de 20 a 25 resíduos, ou uma etiqueta de afinidade.
Substituições de aminoácidos conservadoras Básicas: arginina lisina histidina Acidíferas: ácido glutâmico ácido aspártico Polares: glutamina asparagina Hidrofóbicas: leucina isoleucina valina r 90 Aromáticas: —* fenilalanina triptofano tirosina Pequenas: glicina alanina serina treonina metionina Além dos 20 aminoácidos de rotina, aminoácidos de não de roti- na(tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, iso- valina e a -metil serina) podem ser substituídos por resíduos aminoácidos - dos polipeptídeos da presente invenção.
Um número limitado de aminoáci- . dos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos aminoácidos de polipeptídeos clostridiais.
Os polipeptídeos da presente in- venção também podem compreender resíduos aminoácidos que não ocor- rem naturalmente.
Aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, sem limi- tação, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis4-hidroxiprolina, trans4- hidroxi-prolinay N-metilglicinay allo-treoninay metil-treoninay hidroxi- etilcisteína, hidroxietilhomo-cisteína, nitro-glutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenil-alanina, 4- azafenil-alanina, e 4-fluorofenilalanina.
Vários métodos são conhecidos na técnica para incorporação de resíduos aminoácidos que não ocorrem natu- ralmente em proteínas.
Por exemplo, pode ser empregado um sistema in vitro em que mutações não senso são suprimidas usando tRNAs supresso- res quimicamente aminoacilados.
Métodos para sintetizar aminoácidos e aminoacilar tRNA são conhecidos na técnica.
Transcripção e translação de plasmídeos contendo mutações não senso são realizadas em um sistema livrede células compreendendo um extrato de E. coli S30 e enzimas e ou- tros reagentes disponíveis comercialmente.
Proteínas são purificadas por cromatografia.
Vide, por exemplo, Robertson et al., J.
Am.
Chem.
Soc. 113:
S 91 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; e Chung et a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). Em um segundo método, é realizada translação em oócitos de Xenopus por microinjeção de MRNA mutado e tRNAs supressores quimi- camente aminoacilados (Turcatti et a/., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). Dentro de um terceiro método, células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que deve ser substituído (por exemplo, fenilalani- na) e na presença do um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmen- te desejados (por exemplo, 2-azafenilalaninay 3-azafenilalanina, 4- azafenilalanina, ou 4-fluorofenilalanina). O aminoácido que não ocorre natu- ralmente é incorporado no polipeptídeo ao invés de seu complemento natu- : ral. Vide, Koide et a/., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Resíduos aminoácidos . que ocorrem naturalmente podem ser convertidos em espécies que não o- correm naturalmente por modificação química in vitro. Modificação química pode ser combinada com mutagênese sítiodirigida para expandir adicional- mente a faixa de substituições (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoá- cidos que não são codificados pelo código genético, aminoácidos que não ocorrem naturalmente, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos aminoácidos de polipeptídeos da presente invenção. Aminoácidos essenciais nos polipeptídeos da presente invenção podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técni- ca, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de triagem de alani- —na(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Sítios de interação biológica também podem ser determinados por análise física da estrutura, conforme determinado por técnicas tais como ressonância magnética nucle- ar, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em combinação com mutação de aminoácidos de sítios de contato putativos. Vide, por exemplo, de Vos ef al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wiodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. As identitdads de aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a
Ú 92 partir da análise de homologias com componentes relacionados (por exem- plo, os componentes de translocação ou de protease) dos polipeptídeos da presente invenção.
Múltiplas substituições de aminoácido podem ser feitas e testa- das usando métodos conhecidos de mutagênese e triagem, tais como os revelados por Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-7, 1988) ou Bo- wie and Sauer (Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 86: 2152-6, 1989). Em resumo, estes autores revelam métodos para randomizar simultaneamente duas ou mais posições em um polipeptídeo, selecionando para polipeptídeo funcio- nal, eem seguida sequenciando os polipeptídeos mutagenizados para de- terminar o espectro de substituições possíveis em cada posição.
Outros mé- ' todos que podem ser usados incluem display de fago (por exemplo, Lowman . et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et a/., Patente dos Estados Uni- dos No. 5.223.409; Huse, publicação WIPO de Patente Internacional No.
WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et a/., Ge- ne 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988). Agora segue uma breve descrição das figuras, as quais ilustram aspectos e/ ou modalidades da presente invenção.
Figura 1 - Purificação da proteína de fusão LHWD-CT-CST28 Usando a metodologia resumida no Exemplo 5, uma proteína de fusão LHyWD-CT-CST28 foi purificada a partir de células de E. coli BL21 (DE3). Em resumo, os produtos solúveis obtidos depois de disrupção celular foram aplicados a uma coluna de captura por afinidade carregada com ní- quel.
As proteínas ligadas foram eluídas com 200 mM de imidazol, tratadas com enteroquinase para ativar a proteína de fusão e em seguida reaplicadas a uma segunda coluna de captura por afinidade carregada com níquel.
A- mostras do procedimento de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE.
Alameda 1: Primeiro eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel, Alameda 2: Segundo eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel sob condições não redutoras, Alameda 3: Segundo eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel sob condições redutoras, Alameda 4: Mar- cadores da massa molecular (kKDa).
Í 93 Figura 2 - Purificação da proteína de fusão LHWA-CT-SST14 Usando a metodologia resumida no Exemplo 6, uma proteína de fusão LHWA-CT-SST14 foi purificada a partir de células de E. coli BL21 (DE3). Em resumo, os produtos solúveis obtidos depois de disrupção celular foram aplicados a uma coluna de captura por afinidade carregada com ní- quel. As proteínas ligadas foram eluídas com 200 mM de imidazol, tratadas com Fator Xa para ativar a proteína de fusão e em seguida reaplicadas a uma segunda coluna de captura por afinidade carregada com níquel. Amos- tras do procedimento de purificação foram avaliadas por SDS-PAGE. Ala- meda 1: Primeiro eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel, Alameda 2: Marcadores da massa molecular (kDa), Alamedas 3 e 4: Segun- ' do eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel sob condições . não redutoras, Alamedas 5 e 6: Segundo eluente da coluna de Sepharose de quelação de níquel sob condições redutoras.
Figura 3 - Atividade de SST-LHNWA em células endócrinas culti- vadas (AtT20) A figura 3a mostra inibição da secreção de ACTH by SST-LHnN/A, e a figura 3b mostra clivagem correspondente de SNAP-25 por SST-LHy/A.
Figura 4 - Atividade de SST-LHNWD em células endócrinas culti- vadas(GH3) A figura 4 mostra o efeito da liberação do hormônio do cresci- mento por células GH3. Maiores dosagens de administração de SST-LHnW/D resultam em uma maior inibição da liberação do hormônio do crescimento.
Figura 5 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 deratoinvivo A figura 5 mostra os efeitos da administração i.v. de CP-GHRH- LHD (SXN101000) sobre os níveis de IGF-1 de rato 5 dias depois de trata- mento em comparação com um controle de somente veículo.
Figura 6 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 deratoinvivo A figura 6 mostra os efeitos da administração i.v. de CP-GHRH- LHD (SXN101000) sobre os níveis de IGF-1 de rato no dia, 1 a 8 dias depois
' 94 de tratamento em comparação com um controle de somente veículo. Devido ao bloqueio da cânula nos dias 9 e 10 deve ser considerado um número n muito pequeno. Figura 7 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis do hor- —môniodo crescimento de rato in vivo A figura 7b mostra os efeitos da administração i.v. de CP-GHRH- LHD (SXN101000) sobre os níveis do hormônio do crescimento de rato no dia, 5 dias depois de tratamento em comparação com um controle apenas com veículo (figura 7a) e infusão de octreotida (figura 7c).
SEQ ID NOS 1 Sequência de DNA de LHN/A ' 2. Sequência de DNA de LHy/B . 3. Sequência de DNA de LHNW/C
4. Sequência de DNA de LHNW/D
5. Sequência de DNA do ligante CP-EN-GS15-SST28 hu- mano
6. Sequência de DNA do ligante CT-GS20-CST28 humano
7. Sequência de proteína da fusão CP-CST14-GS20-LHD
8. Sequência de proteína da fusão CP-CST14-GS30-LHD
9. Sequência de proteína da fusão CP-CST28-GS20-LHD
10. Sequência de proteína da fusão CP-CST28-GS30-LHD
11. Sequência de proteína da fusão CP-SST14-GS20-LHD
12. Sequência de proteína da fusão CP-SST14-GS30-LHD
13. Sequência de proteína da fusão CP-SST28-GS20-LHD
14. Sequência de proteína da fusão CP-SST28-GS30-LHD
15. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS20-LHD
16. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS30-LHD
17. Sequência de DNA da fusão CT-CST28-GS20-LHD
18. Sequência de proteína da fusão CT-CST28-GS20-LHD
19. Sequência de proteína da fusão CT-CST28-GS30-LHD
20. Sequência de proteina da fusão CT-SST14-GS15- L(HFxa)HD
: 95
21. Sequência de proteína da fusão CT-SST14-GS30-LHD
22. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS20-LHD
23. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS30-LHD
24. Sequência de proteína da fusão CT-SST14-GS35-LHC
25. Sequência de DNA da fusão CP-GS15-SST28-LHA
26. Sequência de proteína da fusão CP-GS15-SST28-LHA
27. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS15-LHB
28. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS20-LHC
29. Sequência de proteína da fusão CT-CST17-GS25-LHC
30. Sequência de proteína da fusão CT-CST29-GS15-LHA
31. Sequência de proteína da fusão CT-CST29-GS30-LHB ' 32. Sequência de DNA de IgA-Hytet . 33. Sequência de proteína da fusão CT-GHRP-LHC
34. Sequência de proteína da fusão CT-GHRH-LHD
35. Sequência de proteína da fusão CT-GHRP-LHD
36. Sequência de proteína da fusão CT-grelina-LHA
37. Sequência de proteína da fusão IgA-Hytet-CT-SST14
38. Sequência de proteína da fusão IgA-Hytet-CT-GHRP
39. Sequência de proteína da fusão CT-grelina S3W-LHA
40. Sequência de proteína da fusão CT-GRP-LHD
41. Sequência de proteína da fusão CT-GRP-LHB
42. Sequência de proteína da fusão CP-QGHRH29-LHD
43. Sequência de proteína da fusão CP-QGGHRH-LHA
44. Sequência de proteína da fusão CP-QGHRH-LHC
45. Sequência de proteína da fusão CP-qQGHRH-LHD
46. Sequência de proteína da fusão CP-QGGHRH-LHD N10- PL5
47. Sequência de proteína da fusão CP-9&GGHRH-LHD N10- HX12
48. Sequência de proteína da fusão CP-UTS-LHA
49. Sequência de proteína de LHNWA
50. Sequência de proteína de LHy/B
Ú 96
51. Sequência de proteína de LHNWC
52. Sequência de proteína de LHN/D
53. Sequência de proteína de IgA-Hytet BA. Peptídeo Octreotida sintetizado
55. Peptídeo agonista de GHRH sintetizado
56. Peptídeo antagonista de GHRH sintetizado
57. Sequência de proteína da fusão CP-MCH-LHD
58. Sequência de proteína da fusão CT-KISS-LHD
59. Sequência de proteína da fusão CT-PrRP-LHA
60. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-27-
LHD ' | 61. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-28- . LHD
62. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-29-
LHD
63. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-44-
LHD
64. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-40-
LHD
65. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala9-
LHD 66 Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala22-
LHD
67. Sequência de proteina da fusão CcP- HS GHRH Ala8 Lys11 1-29-LHD
68. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys11 Argi2 1-29-LHD
69. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn11 1-29-LHD
70. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys20 1-29-LHD
71. Sequência de proteína da fusão CP-
' 97 HS GHRH Ala8 Lys11 Lys20 1-29-LHD
72. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn20 1-29-LHD
73. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asni2 1-29-LHD
74. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn21 1-29-LHD
75. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Glu 7 1-29-LHD
76. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Glu 10 1-29LHD - 77. Sequência de proteína da fusão CP- . HS GHRH Ala8 Glu 13 1-29-LHD
78. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala8-
LHD
79. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Glu8 1- 29-LHD
80. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Alai5 1-27-LHD : 81. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala15-
LHD
82. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Ala15 1-29-LHD
83. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 9 15 22 27-LHD
84. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 9 15 22-LHD
85. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH HVOAL 1-32-LHD
86. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH HVSAL 1-29-LHD
87. Sequência de proteína da fusão CP-
] 98 HS GHRH HVTAL 1-29-LHD
88. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH QALN-
LHD
89. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH QAL-
LHD
90. Sequência de proteína da fusão CP-RhGHRH29 N8A M27L-LHD
91. Sequência de proteína da fusão CP-hGHRH29 N8A K12N M27L-LHD
92. Sequência de proteína da fusão N-terminal-kGHRH29 N8A M27L-LHD
93. Sequência de proteína da fusão GRNRH-C humana . 94. Sequência de proteína da fusão GnRH -D GS 20 huma- na
SUMÁRIO DE EXEMPLOS Exemplo 1 - Preparação de um constructo de estrutura principal
LHA Exemplo 2 - Construção de LHA-CP-SST28 Exemplo 3 - Expressão e purificação de uma proteína de fusão LHA-CP-SST28 Exemplo 4 - Construção de LHD-CT-CST28 Exemplo 5 - Expressão e purificação de uma proteína de fusão LHD-CT-CST28 Exemplo 6 - Conjugação química de LHN/A a porção de direcio- namentode SST (SSTTM) Exemplo 7 - Atividade de SST-LHA em células endócrinas culti- vadas (AtT20) Exemplo 8 - Atividade de SST-LHD em células neuroendócrinas cultivadas (GH3) Exemplo 9 - Método para aliviar sintomas acromegálicos por re- dução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária
Í 99 Exemplo 10 - Método para normalizar dedos hirsutos inchados por redução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária Exemplo 11 - Método para melhorar as consequências de res- surgimento de adenoma da pituitária secretor de hormônio do crescimento Exemplo 12 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina Exemplo 13 - Método para tratar doença de Cushing em pacien- tes intolerantes a análogos de somatostatina Exemplo 14 - Método para reverter impotência sexual feminina por tratamento de prolactinoma Exemplo 15 - Método para produzir perda de peso por tratamen- 2 to de insulinoma Exemplo 16 - Método para tratar glucagonoma Exemplo 17 - Método para tratar diarreia e vermelhidão causa- dos por ViPoma Exemplo 18 - Método para tratar gastrinoma Exemplo 19 - Método para tratar tireotoxicose causada por tiro- trofinoma Exemplo 20 - Método para tratar dilatação dos tecidos moles re- corrente causada por acromegalia Exemplo 21 - Método para tratar hirsutismo facial excessivo cau- sado por doença de Cushing Exemplo 22 - Método para tratar galactorreia masculina causada porprolactinoma Exemplo 23 - Método para tratar múltiplos sintomas causados por insulinoma Exemplo 24 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina Exemplo 25 - Método para tratar doença de Cushing em pacien- tes intolerantes a análogos de somatostatina Exemplo 26 - Método para reverter impotência sexual feminina
' 100 por tratamento de prolactinoma Exemplo 27 - Método para tratar doença de Cushing Exemplo 28 - Método para tratar gastrinoma Exemplo 29 - Método para aliviar sintomas acromegálicos por redução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária Exemplo 30 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina Exemplo 31 - Método para tratar acromegalia 2 10 Exemplo 32 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 de rato in vivo Exemplo 33 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de » IGF-1 de rato in vivo Exemplo 34 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis do hormônio do crescimento de rato in vivo SEQ IDs 1 Sequência de DNA de LHN/A ggatceATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAAC
GGTGTTGACATTGCTTACATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGC — CGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTTATCCCGGAACG TGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGA AGCGAAACAGGTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACC GATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGTGTTACTAAACTGTTCGAGC GTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCG CGGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATCGATACCGAACTGAAAGTA ATCGACACTAACTGCATCAACGTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTT CCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGATATCATCCA GTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAAC GGCTACGGTTCCACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCTTCG GTTTTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAACCCACTGCTGGGCGCTG GTAAATTCGCAACTGATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACTGATTCA TGCAGGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTT
" 101
CAAAGTTAACACCAACGCGTATTACGAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGC TTCGAAGAACTGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATCGACT CTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGAT ATCGCATCCACCCTGAACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACTGCTT CTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAATACCTGCTCAGCGAA GACACCTCCGGCAAATTCTCTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTTTA CAAAATGCTGACTGAAATTTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTITA AAGTTCTGAACCGCAAAACCTATCTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAA AATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTATCTACGATGGTTTCAACC
TGCGTAACACCAACCTGGCTGCTAATTTTASRCGGCCAGAACACGGAAAT : CAACAACATGAACTTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGT : 7 TTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCT
Y GACGATGACGATAAAAACAAAGCGCTGAACCTGCAGTGTATCAAGGTTA ACAACTGGGATTTATTCTTCAGCCCGAGTGAAGACAACTTCACCAACGA CCTGAACAAAGGTGAAGAAATCACCTCAGATACTAACATCGAAGCAGCC GAAGAAAACATCTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTGACCTTTA ATTTCGACAACGAGCCGGAAAACATTTCTATCGAAAACCTGAGCTCTGA TATCATCGGCCAGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAACGTTTCCCAAAC GGTAAAAAGTACGAGCTGGACAAATATACCATGTTCCACTACCTGCGCG — CGCAGGAATTTGAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGT TAACGAAGCTCTGCTCAACCCGTCCCGTGTATACACCTTCTTCTCTAGC GACTACGTGAAAAAGGTCAACAAAGCGACTGAAGCTGCAATGTTCTTGG GTTGGGTTGAACAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCCGAAGT ATCTACTACCGACAAAATTGCGGATATCACTATCATCATCCCGTACATCG GTCCGGCTCTGAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGACTTCGTTGG CGCACTGATCTTCTCCEGGTGCGGTGATCCTGCTGGAGTTCATCCCGGA AATCGCCATCCCGGTACTGGGCACCTTTGCTCTGGTTTCTTACATTGCA AACAAGGTTCTGACTGTACAAACCATCGACAACGCGCTGAGCAAACGTA ACGAAAAATGGGATGAAGTTTACAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGC — TAAGGTTAATACTCAGATCGACCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCA CTGGAAAACCAGGCGGAAGCTACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACA ACCAGTACACCGAGGAAGAAAAAAACAACATCAACTTCAACATCGACGA
' 102
TCTGTCCTCTAMACTGAACGAATCCATCAACAAAGCTATGATCAACATCA ACAAGTTCCTGAACCAGTGCTCTGTAAGCTATCTGATGAACTCCATGAT CCCGTACGGTGTTAAACGTCTGGAGGACTTCGATGCGTCTCTGAAAGAC GCCCTGCTGAAATACATTTACGACAACCGTGGCACTCTGATCGGTCAGG
TTGATCGTCTGAAGGACAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATCCC TTTTCAGCTCAGTAAATATGTCGATAACCAACGCCTTTTGTCCACTtaataa gott
2. Sequência de DNA de LHy/B
GGATCCATGCCGGTTACCATCAACAACTTCAACTACAACGACCCGATCG ACAACAACAACATCATTATGATGGAACCGCCGTTCGCACGTGGTACCGG ' ACGTTACTACAAGGCTTTTAAGATCACCGACCGTATCTGGATCATCCCG ' : GAACGTTACACCTTCGGTTACAAACCTGAGGACTTCAACAAGAGTAGCG / GGATTTTCAATCGTGACGTCTGCGAGTACTATGATCCAGATTATCTGAAT ACCAACGATAAGAAGAACATATTCCTTCAGACTATGATTAAACTCTTCAA CCGTATCAMAAGCAAACCGCTCGGTGAAAAACTCCTCGAAATGATTATC AACGGTATCCCGTACCTCGGTGACCGTCGTGTCCCGCTTGAAGAGTTC AACACCAACATCGCAAGCGTCACCGTCAACAAACTCATCAGCAACCCAG GTGAAGTCGAACGTAAAAAAGGTATCTTCGCAAACCTCATCATCTTCGG TCCGGGTCCGGTCCTCAACGAAAACGAAACCATCGACATCGGTATCCA —GAACCACTTCGCAAGCCGTGAAGGTTTCGGTGGTATCATGCAGATGAAA TTCTGCCCGGAATACGTCAGTGTCTTCAACAACGTCCAGGAAAACAAAG GTGCAAGCATCTTCAACCGTCGTGGTTACTTCAGCGACCCGGCACTCAT CCTCATGCATGAACTCATCCACGTCCTCCACGGTCTCTACGGTATCAAA GTTGACGACCTCCCGATCGTCCCGAACGAGAAGAAATTCTTCATGCAGA GCACCGACGCAATCCAGGCTGAGGAACTCTACACCTTCGGTGGCCAAG ACCCAAGTATCATAACCCCGTCCACCGACAAAAGCATCTACGACAAAGT CCTCCAGAACTTCAGGGGTATCGTGGACAGACTCAACAAAGTCCTCGTC TGCATCAGCGACCCGAACATCAATATCAACATATACAAGAACAAGTTCAA AGACAAGTACAAATTCGTCGAGGACAGCGAAGGCAAATACAGCATCGA —“CGTAGAAAGTTTCGACAAGCTCTACAAAAGCCTCATGTTCGGTTTCACC GAAACCAACATCGCCGAGAACTACAAGATCAAGACAAGGGCAAGTTACT TCAGCGACAGCCTCCCGCCTGTCAAAATCAAGAACCTCTTAGACAACGA
| 103
GATTTACACAATTGAAGAGGGCTTCAACATCAGTGACAAAGACATGGAG AAGGAATACAGAGGTCAGAACAAGGCTATCAACAAACAGGCATACGAG GAGATCAGCAAAGAACACCTCGCAGTCTACAAGATCCAGATGTGCGTC GACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCTGACGATGACGATAAAAACA — AAGCGCTGAACCTGCAGTGCATCGACGTTGACAACGAAGACCTGTTCTT CATCGCTGACAAAAACAGCTTCAGTGACGACCTGAGCAAAAACGAACGT ATCGAATACAACACCCAGAGCAACTACATCGAAAACGACTTCCCGATCA ACGAACTGATCCTGGACACCGACCTGATAAGTAAAATCGAACTGCCGAG CGAAAACACCGAAAGTCTGACCGACTTCAACGTTGACGTTCCGGTTTAC
GAAAAACAGCCGGCTATCAAGAAAATCTTCACCGACGAAAACACCATCT ' TCCAGTACCTGTACAGCCAGACCTTCCCGCTGGACATCCGTGACATCAG i ' TCTGACCAGCAGTTTCGACGACGCTCTGCTGTTCAGCAACAAAGTTTAC ” AGTTTCTTCAGCATGGACTACATCAAAACCGCTAACAAAGTTGTTGAAGC
AGGGCTGTTCGCTGGTTGGGTTAAACAGATCGTTAACGACTTCGTTATC GAAGCTAACAAAAGCAACACTATGGACAAAATCGCTGACATCAGTCTGA TCGTTCCGTACATCGGTCTGGCTCTGAACGTTGGTAACGAAACCGCTAA AGGTAACTTTGAAAACGCTTTCGAGATCGCTGGTGCAAGCATCCTGCTG GAGTTCATCCCGGAACTGCTGATCCCGGTTGTTGGTGCTTTCCTGCTGG AAAGTTACATCGACAACAAAAACAAGATCATCAAAACCATCGACAACGCT — CTGACCAAACGTAACGAAAAATGGAGTGATATGTACGGTCTGATCGTTG CTCAGTGGCTGAGCACCGTCAACACCCAGTTCTACACCATCAAAGAAGG TATGTACAAAGCTCTGAACTACCAGGCTCAGGCTCTGGAAGAGATCATC AAATACCGTTACAACATCTACAGTGAGAAGGAAAAGAGTAACATCAACAT CGACTTCAACGACATCAACAGCAAACTGAACGAAGGTATCAACCAGGCT ATCGACAACATCAACAACTTCATCAACGGTTGCAGTGTTAGCTACCTGAT GAAGAAGATGATCCCGCTGGCTGTTGAAAAACTGCTGGACTTCGACAAC ACCCTGAAAAAGAACCTGCTGAACTACATCGACGAAAACAAGCTGTACC TGATCGGTAGTGCTGAATACGAAAAAAGTAAAGTGAACAAATACCTGAA
GACCATCATGCCGTTCGACCTGAGTATCTACACCAACGACACCATCCTG —ATCGAAATGTTCAACAAATACAACTCTtaataagctt
3. Sequência de DNA de LHNW/C ggattceATGCCGATCACCATCAACAACTTCAACTACAGCGATCCGGTGGAT
- 104 .
AACAAAAACATCCTGTACCTGGATACCCATCTGAATACCCTGGCGAACG AACCGGAAAAAGCGTTTCGTATCACCGGCAACATTTGGGTTATTCCGGA TCGTTTTAGCCGTAACAGCAACCCGAATCTGAATAAACCGCCGCGTGTT ACCAGCCCGAAAAGCGGTTATTACGATCCGAACTATCTGAGCACCGATA — GCGATAAAGATACCTTCCTGAAAGAAATCATCAAACTGTTCAAACGCATC AACAGCCGTGAAATTGGCGAAGAACTGATCTATCGCCTGAGCACCGATA TTCCGTTTCCGGGCAACAACAACACCCCGATCAACACCTTTGATTTCGA TGTGGATTTCAACAGCGTTGATGTTAAAACCCGCCAGGGTAACAATTGG GTGAAAACCGGCAGCATTAACCCGAGCGTGATTATTACCGGTCCGCGC
GAAAACATTATTGATCCGGAAACCAGCACCTTTAAACTGACCAACAACA ' CCTTTGCGGCGCAGGAAGGTTTTGGCGCGCTGAGCATTATTAGCATTAG ' - CCCGCGCTTTATGCTGACCTATAGCAACGCGACCAACGATGTTGGTGAA 7 GGCCGTTTCAGCAAAAGCGAATTTTGCATGGACCCGATCCTGATCCTGA
TGCATGAACTGAACCATGCGATGCATAACCTGTATGGCATCGCGATTCC GAACGATCAGACCATTAGCAGCGTGACCAGCAACATCTTITTACAGCCAG TACAACGTGAAACTGGAATATGCGGAAATCTATGCGTTTGGCGGTCCGA CCATTGATCTGATTCCGAAAAGCGCGCGCAAATACTTCGAAGAAAAAGC GCTGGATTACTATCGCAGCATTGCGAAACGTCTGAACAGCATTACCACC GCGAATCCGAGCAGCTTCAACAAATATATCGGCGAATATAAACAGAAAC TGATCCGCAAATATCGCTTTGTGGTGGAAAGCAGCGGCGAAGTTACCGT TAACCGCAATAAATTCGTGGAACTGTACAACGAACTGACCCAGATCTTC ACCGAATTTAACTATGCGAAAATCTATAACGTGCAGAACCGTAAAATCTA CCTGAGCAACGTGTATACCCCGGTGACCGCGAATATTCTGGATGATAAC GTGTACGATATCCAGAACGGCTTTAACATCCCGAAAAGCAACCTGAACG TTCTGTTTATGGGCCAGAACCTGAGCCGTAATCCGGCGCTGCGTAAAGT GAACCCGGAAAACATGCTGTACCTGTTCACCAAATTTTGCGTCGACGCG ATTGATGGTCGTAGCCTGTACAACAAAACCCTGCAGTGTCGTGAACTGC TGGTGAAAAACACCGATCTGCCGTTTATTGGCGATATCAGCGATGTGAA AACCGATATCTTCCTGCGCAAAGATATCAACGAAGAAACCGAAGTGATC —TACTACCCGGATAACGTGAGCGTTGATCAGGTGATCCTGAGCAAAAACA CCAGCGAACATGGTCAGCTGGATCTGCTGTATCCGAGCATTGATAGCG AAAGCGAAATTCTGCCGGGCGAAAACCAGGTGTTTTACGATAACCGTAC
- 105
CCAGAACGTGGATTACCTGAACAGCTATTACTACCTGGAAAGCCAGAAA CTGAGCGATAACGTGGAAGATTTTACCTTTACCCGCAGCATTGAAGAAG CGCTGGATAACAGCGCGAAAGTTTACACCTATTTTCCGACCCTGGCGAA CAAAGTTAATGCGGGTGTTCAGGGCGGTCTGTTTCTGATGTGGGCGAA CGATGTGGTGGAAGATTTCACCACCAACATCCTGCGTAAAGATACCCTG GATAAAATCAGCGATGTTAGCGCGATTATTCCGTATATTGGTCCGGCGC TGAACATTAGCAATAGCGTGCGTCGTGGCAATTTTACCGAAGCGTTTGC GGTTACCGGTGTGACCATTCTGCTGGAAGCGTTTCCGGAATTTACCATT CCGGCGCTGGGTGCGTTTGTGATCTATAGCAAAGTGCAGGAACGCAAC GAAATCATCAAAACCATCGATAACTGCCTGGAACAGCGTATTAAACGCT ' GGAAAGATAGCTATGAATGGATGATGGGCACCTGGCTGAGCCGTATTAT : CACCCAGTTCAACAACATCAGCTACCAGATGTACGATAGCCTGAACTAT . CAGGCGGGTGCGATTAAAGCGAAAATCGATCTGGAATACAAAAAATACA GCGGCAGCGATAAAGAAAACATCAAAAGCCAGGTTGAAAACCTGAAAAA CAGCCTGGATGTGAAAATTAGCGAAGCGATGAATAACATCAACAAATTC ATCCGCGAATGCAGCGTGACCTACCTGTTCAAAAACATGCTGCCGAAAG TGATCGATGAACTGAACGAATTTGATCGCAACACCAAAGCGAAACTGAT CAACCTGATCGATAGCCACAACATTATTCTGGTGGGCGAAGTGGATAAA CTGAAAGCGAAAGTTAACAACAGCTTCCAGAACACCATCCCGTTTAACA
TCTTCAGCTATACCAACAACAGCCTGCTGAAAGATATCATCAACGAATAC TTCAATtaataagctt
4. Sequência de DNA de LHyWD ggatteATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAAAT
GACAACGATATTCTGTACCTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACCAC ACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGGGTCATTCCAGAAC GCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCGAC GTCCAAATATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACGAA CAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATCATTAAACTGTTTAAGCGTATTAAT GAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGTTCCC CGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTTTACCCG TCATACGACAAACATCGCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGGAAA GTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTITTGGTCCGCTGCCAAA
' 106
CATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCGAAT CCGAGTTTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCCCGG AATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTCACCAGCAACCAGAGCTCAGCAGTA TTAGGAAAGTCAATTTTTTGCATGGACCCGGTTATTGCACTGATGCACG —AACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAGTGA CAAACGTATTCGTCCCCAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGATGGG CCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCEGGAGGCCTGGACGTA GAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCATTG GGCCATTATAAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAACGAT TCCATCTTCEGTGGATCTCGAATATTGATAAATATAAGAAAATTTTTAGCG ' AGAAATATAATTTTGATAAAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAACATTG - ACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAAGTT ' GTGTATAGTTCCCAATACAACGTTAAGAATCGTACCCATTACTTCTCTCG TCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGACGATAATATTTACACTA TTCGTGACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTTCAATATTGAAAATTCA GGCCAGAACATTGAACGCAACCCGGCCTTGCAGAAACTGTCGAGTGAA TCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAAGTCTGCGTCGACAAAAGCGAAGAGA AGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTGCAGT GTATTAAAGTGAAAAACAATCGGCTGCCTTATGTAGCAGATAAAGATAG —CATTAGTCAGGAGATTTTCGAAAATAAAATTATCACTGACGAAACCAATG TTCAGAATTATTCAGATAAATTITTCACTGGACGAAAGCATCTTAGATGGC CAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGTGA ATATGGAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTITTATGATGA CATTACGAAATATGTGGACTACCTTAATTCTTATTACTATTTGGAAAGCC AGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGCGTGGA AGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCTG GCGGAAAAAGTAAATAAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTGG GCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATTATGAAAAAGGATA CCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCCT —GCGTTAAATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCCT TTGCTACCGCGGGCETCEGCGTTCCTCOTGGAGGGCTTTCCTGAATTTAC TATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATTITACTCTTCCATCCAGGAGCGT
. 107
GAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAAC GCTGGAAAGATTCTTATCAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCAT CACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTATGATAGTCTGTCGT ACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTAC TCTGGTAGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAAGA ATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAAGCTATGAATAACATTAACAAATTC ATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGTTCAAGAATATGCTGCCAAAAG TTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTATC AACCTCATCGACTCCCACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCGTC
TGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACGATGCCGTTTAATATT * TTTTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGATATCATCAATGAATATTTC ' : AATtaataagctt . 5. Sequência de DNA do ligante CP-EN-GS15-SST28 hu- mano
CATATGGGATCCGGTTTAAACGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTA AATCTGACGATGACGATAAAAGCGCCAATTCAAATCCTGCAATGGCGCC ACGCGAACGCAAAGCTGGTTGCAAAAACTTCTTCTGGAAAACCTTCACC TCTTGCGCGCTAGCGGGCEGTEGCGGTAGCGGCGGTEGCGGTAGECG GCGGTGGCGETAGCGCACTAGTGCTGCAGCTAGAATAATGAAAGCTT
6. Sequência de DNA do ligante CT-GS20-CST28 humano
GGATCCGTCGACCTGCAGGGTCTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCEG TGGCGGTAGCGGCGGTEGCGETAGCGGCGGTEGCGGTAGCGCACTA GTGCAGGAAAGACCTCCATTACAACAACCTCCACATCGCGATAAGAAAC CATGTAAGAATTTCTTTTGGAAAACATTTAGCAGTTGCAAATGATAAAAG CTT
7. Sequência de proteína da fusão CP-CST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITOQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP —LPNILDYTASLTLAGAQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK
] 108
YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGONIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKPCKNFFWKTFSSCKALAGGGGSG GGGSGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVONYS DKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYL NSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQOAG LFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQ AFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKD SY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK
ENIKSOQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFD ' LRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIIN " EYFN 7 8. Sequência de proteína da fusão CP-CST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPOQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKPCKNFFWKTFSSCKALAGGGGSG GGGSGGEGESGEGESGEGESALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENK IITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVF YDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLA EKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENC LEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDL EYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML —PKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFS YTNNSLLKDIINEYFN
9. Sequência de proteína da fusão CP-CST28-GS20-LHD
' 109
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFOMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKQERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWK TFSSCKALAGGGGSGGGGSCGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEI ] FENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPG ' BR EEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFL . PSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPA LNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKT IENCLEQORVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIK AKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLF KNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPF NIFSYTNNSLLKDIINEYFN
10. Sequência de proteína da fusão CP-CST28-GS30-LHD —TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKQERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWK TFSSCKALAGGGGSGGGGSCGGGESCGEGSCGGGSALVLQCIKVKNNRL —PYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLL PNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVE EALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDK
* 110
ISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFT FYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQM YDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNIN KFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAK — VNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
11. Sequência de proteína da fusão CP-SST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPONKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP
LPNILDYTASLTLOGAQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL í GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ - FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK 7 YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR
THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSG GGGSGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVONYS DKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYL NSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAG LFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQ —AFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKD SYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDK ENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFD LRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIIN EYFN
12. Sequência de proteína da fusão CP-SST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGAQQAQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL —GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKAGCKNFFWKTFTSCALAGGGGSG GGGSCSSESCSSESGEGESALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENK ITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVF YDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLA EKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIG NSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENC LEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDL EYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFS
Í YTNNSLLKDIINEYFN ' . 13. Sequência de proteína da fusão CP-SST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGAQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWK TFTSCALAGGGGSGGGGSCGGGGSALVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
14. Sequência de proteína da fusão CP-SST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGAQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWK TFTSCALAGGGGSGCGGGSCSGGGSGGGESGGEGGSALALQCIKVKNNRLP YVADKDSISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLP ' NVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE . ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKI " SDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTF YSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMY DSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINK FIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKV NESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
15. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONY SDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN — KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE
REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY í 113
QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSCGGGGSGGGGSALVPCKNF FWKTFSSCK
16. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ : FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK - YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQOYNVKNR : THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY —QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGESGCEGESGGGGSEG GGSALVPCKNFFWKTFSSCK
17. Sequência de DNA da fusão CT-CST28-GS20-LHD
GGATCCATGACGTGGCCAGTTAAGGATTTCAACTACTCAGATCCTGTAA ATGACAACGATATTCTGTACCTTCGCATTCCACAAAATAAACTGATCACC ACACCAGTCAAAGCATTCATGATTACTCAAAACATTTGGGTCATTCCAGA ACGCTTTTCTAGTGACACAAATCCGAGTTTATCTAAACCTCCGCGTCCG ACGTCCAAATATCAGAGCTATTACGATCCCTCATATCTCAGTACGGACG — AACAAAAAGATACTTTCCTTAAAGGTATCATTAAACTGTTTAAGCGTATTA ATGAGCGCGATATCGGGAAAAAGTTGATTAATTATCTTGTTGTGGGTTC CCCGTTCATGGGCGATAGCTCTACCCCCGAAGACACTTTTGATTITTACC
" 114
CGTCATACGACAAACATCGCGGTAGAGAAGTTTGAGAACGGATCGTGG AAAGTCACAAACATCATTACACCTAGCGTCTTAATTTITTIGGTCCGCTGCC AAACATCTTAGATTATACAGCCAGCCTGACTTTGCAGGGGCAACAGTCG AATCCGAGTTTCGAAGGTTTTGGTACCCTGAGCATTCTGAAAGTTGCCC — CGGAATTTCTGCTCACTTTTTCAGATGTCACCAGCAACCAGAGCTCAGC AGTATTAGGAAAGTCAATTITTITTGCATGGACCCGGTTATTGCACTGATGC ACGAACTGACGCACTCTCTGCATCAACTGTATGGGATCAACATCCCCAG TGACAAACGTATTCGTCCCCAGGTGTCTGAAGGATTTTTCTCACAGGAT GGGCCGAACGTCCAGTTCGAAGAGTTGTATACTTTCGGAGGCCTGGAC GTAGAGATCATTCCCCAGATTGAGCGCAGTCAGCTGCGTGAGAAGGCA : TTGGGCCATTATAAGGATATTGCAAAACGCCTGAATAACATTAACAAAAC - GATTCCATCTTCGTGGATCTCGAATATTGATAAATATAAGAAAATTITITTAG ' CGAGAAATATAATTTTGATAAMAGATAATACAGGTAACTTTGTGGTTAACA TTGACAAATTCAACTCCCTTTACAGTGATTTGACGAATGTAATGAGCGAA GTTGTGTATAGTTCCCAATACAACGTTAAGAATCGTACCCATTACTTCTC TCGTCACTACCTGCCGGTTTTCGCGAACATCCTTGACGATAATATTTACA CTATTCGTGACGGCTTTAACTTGACCAACAAGGGCTTCAATATTGAAAAT TCAGGCCAGAACATTGAACGCAACCCGGCCTTGCAGAAACTGTCGAGT GAATCCGTGGTTGACCTGTTTACCAAAGTCTGCGTCGACAAAAGCGAAG AGAAGCTGTACGATGACGATGACAAAGATCGTTGGGGATCGTCCCTGC AGTGTATTAAAGTGAAAAACAATCGGCTGCCTTATGTAGCAGATAAAGAT AGCATTAGTCAGGAGATTTTCGAAAATAAAATTATCACTGACGAAACCAA TGTTCAGAATTATTCAGATAAATTTTCACTGGACGAAAGCATCTTAGATG GCCAAGTTCCGATTAACCCGGAAATTGTTGATCCGTTACTGCCGAACGT GAATATGGAACCGTTAAACCTCCCTGGCGAAGAGATCGTATTITTATGAT GACATTACGAAATATGTGGACTACCTTAATTCTTATTACTATTTGGAAAG CCAGAAACTGTCCAATAACGTGGAAAACATTACTCTGACCACAAGCGTG GAAGAGGCTTTAGGCTACTCAAATAAGATTTATACCTTCCTCCCGTCGCOT GGCGGAAAAAGTAAATAAAGGTGTGCAGGCTGGTCTGTTCCTCAACTG —GGCGAATGAAGTTGTCGAAGACTTTACCACGAATATTATGAAAAAGGAT ACCCTGGATAAAATCTCCGACGTCTCGGTTATTATCCCATATATTGGCCC TGCGTTAAATATCGGTAATAGTGCGCTGCGGGGGAATTTTAACCAGGCC
' 115
TTTGCTACCGCGGGCGTCGCGTTCCTCCTGGAGGGCTTTCCTGAATTTA CTATCCCGGCGCTCGGTGTTTTTACATITTTACTCTTCCATCCAGGAGCG TGAGAAAATTATCAAAACCATCGAAAACTGCCTGGAGCAGCGGGTGAAA CGCTGGAAAGATTCTTATCAATGGATGGTGTCAAACTGGTTATCTCGCA TCACGACCCAATTCAACCATATTAATTACCAGATGTATGATAGTCTGTCG TACCAAGCTGACGCCATTAAAGCCAAAATTGATCTGGAATATAAAAAGTA CTCTGGTAGCGATAAGGAGAACATCAAAAGCCAGGTGGAGAACCTTAA GAATAGTCTGGATGTGAAAATCTCTGAAGCTATGAATAACATTAACAAAT TCATTCGTGAATGTTCGGTGACGTACCTGTTCAAGAATATGCTGCCAAA AGTTATTGATGAACTGAATAAATTTGATCTGCGTACCAAAACCGAACTTA : Ú TCAACCTCATCGACTCCCACAACATTATCCTTGTGGGCGAAGTGGATCG . TCTGAAGGCCAAAGTAAACGAGAGCTTTGAAAATACGATGCCGTTTAAT ' ATTTTITTCATATACCAATAACTCCTTGCTGAAAGATATCATCAATGAATAT TTCAATCTAGAAGGCGGTGGCGGTAGCGGCEGTEGCGGTAGCGGCGG TGGCGGTAGCGCACTAGTGCAGGAAAGACCTCCATTACAACAACCTCC
ACATCGCGATAAGAAACCATGTAAGAATTTCTITTTGGAAAACATTTAGCA GTTGCAAAtaataagctt
18. Sequência de proteína da fusão CT-CST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITONIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGOQNIERNPALQOKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONY SDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN — KIYTFLPSLAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY
- 116
QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGCGGGESGGGGSALVQERPP LQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK
19. Sequência de proteína da fusão CT-CST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCEMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK : YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR . THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY —QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSCGGESGCEGESGEGESEG GGSALVQERPPLQOQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK
20. Sequência de proteina da fusão CT-SST14-GS15- L(EFxa)HD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL —GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSIDGRNVQF EELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYIDGRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQ EIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLP
GEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYT — FLPSLAEKVYNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIG PALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKI|
KTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADA IKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYL FKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMP FNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSCGGGGSALVAGCKNFFWKT
SÍ FTSC - 21. Sequência de proteína da fusão CT-SST14-GS30-LHD ' TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII — PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC
SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGESGGGGSGEGG6SCSG —GGSALVAGCKNFFWKTFTSC
22. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS20-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
- 118
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN ' KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII : PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE ' REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTIYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVSANSN PAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
23. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS30-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYOSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN — KNTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQORVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY
Í 119
QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSCGEGSGGEGGESGSGEGSEG GGSALVSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC
24. Sequência de proteína da fusão CT-SST14-GS35-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY : Ú AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE - YKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI ' YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR KDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV FYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGCEGESCSCSESCSGSGESGGGESGGGGESS GGGSALVAGCKNFFWKTFTSC
25. Sequência de DNA da fusão CP-SST28-GS15-LHA —ggatceEATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTCAACTATAAAGACCCAGTTAAC
GGTGTTGACATTGCTTACATCAAAATCCCGAACGCTGGCCAGATGCAGC CGGTAAAGGCATTCAAAATCCACAACAAAATCTGGGTTATCCCGGAACG TGATACCTTTACTAACCCGGAAGAAGGTGACCTGAACCCGCCACCGGA AGCGAAACAGGTGCCGGTATCTTACTATGACTCCACCTACCTGTCTACC —GATAACGAAAAGGACAACTACCTGAAAGGTGTTACTAAACTGTTCGAGC GTATTTACTCCACCGACCTGGGCCGTATGCTGCTGACTAGCATCGTTCG CGGTATCCCGTTCTGGGGCGGTTCTACCATCEGATACCGAACTGAAAGTA ATCGACACTAACTGCATCAACGTTATTCAGCCGGACGGTTCCTATCGTT CCGAAGAACTGAACCTGGTGATCATCGGCCCGTCTGCTGATATCATCCA GTTCGAGTGTCTGAGCTTTGGTCACGAAGTTCTGAACCTCACCCGTAAC GGCTACGGTTCCACTCAGTACATCCGTTTCTCTCCGGACTTCACCOTTCG GTTITTGAAGAATCCCTGGAAGTAGACACGAACCCACTGCTGGGCGCTG GTAAATTCGCAACTGATCCTGCGGTTACCCTGGCTCACGAACTGATTCA TGCAGGCCACCGCCTGTACGGTATCGCCATCAATCCGAACCGTGTCTT CAAAGTTAACACCAACGCGTATTACGAGATGTCCGGTCTGGAAGTTAGC TTCGAAGAACTGCGTACTTTTGGCGGTCACGACGCTAAATTCATCGACT CTCTGCAAGAAAACGAGTTCCGTCTGTACTACTATAACAAGTTCAAAGAT : ' ATCGCATCCACCCTGAACAAAGCGAAATCCATCGTGGGTACCACTGCTT R CTCTCCAGTACATGAAGAACGTTTTTAAAGAAAAATACCTGCTCAGCGAA : GACACCTCCGGCAAATTCTCTGTAGACAAGTTGAAATTCGATAAACTTTA CAAAATGCTGACTGAAATITTACACCGAAGACAACTTCGTTAAGTTCTITA AAGTTCTGAACCGCAAAACCTATCTGAACTTCGACAAGGCAGTATTCAA AATCAACATCGTGCCGAAAGTTAACTACACTATCTACGATGGTTTCAACC TGCGTAACACCAACCTGGCTGCTAATTTTAACGGCCAGAACACGGAAAT CAACAACATGAACTTCACAAAACTGAAAAACTTCACTGGTCTGTTCGAGT TTTACAAGCTGCTGTGCGTCGACGGCATCATTACCTCCAAAACTAAATCT GACGATGACGATAAAAGCGCCAATTCAAATCCTGCAATGGCGCCACGC GAACGCAAAGCTGGATGCAAAAACTTCTTTTGGAAGACATTTACTAGTTG TGCGCTAGCGGGCEGTEGCGGTAGCGGCGGTEGGCGGTAGCGGCGGT GGCGGTAGCGCACTAGTGCTGCAGTGTATCAAGGTTAACAACTGGGAT TTATTCTTCAGCCCGAGTGAAGACAACTTCACCAACGACCTGAACAAAG GTGAAGAAATCACCTCAGATACTAACATCGAAGCAGCCGAAGAAAACAT CTCGCTGGACCTGATCCAGCAGTACTACCTGACCTTTAATTTCGACAAC GAGCCGGAAAACATTTCTATOEGAAAACCTGAGCTCTGATATCATCGGCC AGCTGGAACTGATGCCGAACATCGAACGTTTCCCAAACGGTAAAAAGTA CGAGCTGGACAAATATACCATGTTCCACTACCTGCGCGCGCAGGAATTT —GAACACGGCAAATCCCGTATCGCACTGACTAACTCCGTTAACGAAGCTC TGCTCAACCCGTCCCGTGTATACACCTTCTTCTCTAGCGACTACGTGAA AAAGGTCAACAAAGCGACTGAAGCTGCAATGTTCTTGGGTTGGGTTGAA CAGCTTGTTTATGATTTTACCGACGAGACGTCCGAAGTATCTACTACCG ACAAAATTGCGGATATCACTATCATCATCCCGTACATCGGTCCGGCTCT GAACATTGGCAACATGCTGTACAAAGACGACTTCGTTGGCGCACTGATC TTCTCCGGTGCGGTGATCCTGCTGGAGTTCATCCCGGAAATCGCCATC CCGGTACTGGGCACCTTTGCTCTGGTTTCTTACATTGCAAACAAGGTTC TGACTGTACAAACCATCGACAACGCGCTGAGCAAACGTAACGAAAAATG GGATGAAGTTTACAAATATATCGTGACCAACTGGCTGGCTAAGGTTAAT ACTCAGATCGACCTCATCCGCAAAAAAATGAAAGAAGCACTGGAAAACC AGGCGGAAGCTACCAAGGCAATCATTAACTACCAGTACAACCAGTACAC
CGAGGAAGAAAAAAACAACATCAACTTCAACATCGACGATCTGTCCTCT : : AAACTGAACGAATCCATCAACAAAGCTATGATCAACATCAACAAGTTCCT . GAACCAGTGCTCTGTAAGCTATCTGATGAACTCCATGATCCCGTACGGT í GTTAAACGTCTGGAGGACTTCGATGCGTCTCTGAAAGACGCCCTGCTGA
AATACATTTACGACAACCGTGGCACTCTGATCGGTCAGGTTGATCGTCT
GAAGGACAAAGTGAACAATACCTTATCGACCGACATCCCTTTTCAGCTC AGTAAATATGTCGATAACCAACGCCTTITTGTCCACTtaataagctt
26. Sequência de proteína da fusão CP-SST28-GS15-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY — LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKSANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKT FTSCALAGGGGSCGGGGSGGGGSALVLQCIKVYNNWDLFFSPSEDNFTNDL NKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLEL MPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSR WTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIP YIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLT VOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEAT
? 122
KAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLM NSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIP FQLSKYVDNORLLST
27. Sequência de proteína da fusão CT-SST28-GS15-LHB — PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYK
PEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKL LEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGP GPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIF NRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMOSTDAIQAEE
LYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNK . " FKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFS | . DSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEH í LAVYKIQMCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDD
LSKNERIEYNTOSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVY EKQPAIKKIFTDENTIFOYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSM DYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALN VGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVWVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNA LTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYR YNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAV —EKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTND TILIEMENKYNSLEGGGGSGGGGSCGGGGSALDSANSNPAMAPRERKAGC KNFFWKTFTSC
28. Sequência de proteína da fusão CT-CST14-GS20-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN — PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE YKOKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR
. 123
KDINEETEVIY YPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV FYDNRTOQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVQOGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFOQNTIPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGCGGESGCGGGSGGGGSALVAGCKNFFWK TFTSC
29. Sequência de proteína da fusão CT-CST17-GS25-LHC . 7 PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN
R PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR M LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE YKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR —KDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV FYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVQOGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSA!I!/PYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPENIFSY TNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGESGCEGESGGGGSGGGGSALVDRMP CRNFFWKTFSSCK
30. Sequência de proteína da fusão CT-CST29-GS15-LHA —EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN
PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA
- 124
DIIQFECLSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY —LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNF TNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIG QLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI TINPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIAN . KVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQ ' AEATKAIINYQOYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSV ' SYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTL STDIPFQLSKYVDNORLLSTLEGGGGSCGGGSGGGGSALVQEINTERVAL OPOOSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK
31. Sequência de proteína da fusão CT-CST29-GS30-LHB
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYK PEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKL LEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGP —"GPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIF NRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMOQSTDAIQAEE LYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNK FKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFS DSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEH LAVYKIQMCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDD LSKNERIEYNTOSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVY EKQPAIKKIFTDENTIFOYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSM DYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALN VGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVYVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNA — LTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYR YNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAV EKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTND
] 125
TILIEMFENKYNSLEGGGGSGCGGESGCSSGESCSGSGSGGGESCGEGGSALDQ EINTERVALOPQAOSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK
32. Sequência de DNA de IgA-Hytet ggatteATGGAGTCCAATCAGCCGGAAAAAAATGGAACCGCGACTAAACC
CGAGAATTCGGGGAACACTACGTCGGAAAACGGCCAGACGGAACCTGA GAAGAAACTGGAACTACGAAATGTGTCCGATATCGAGCTATACTCTCAA ACCAATGGAACCTATAGGCAGCATGTTTCATTGGACGGAATCCCAGAAA ATACGGATACATATTTCGTCAAAGTGAAGTCTAGCGCATTCAAGGATGTA TATATCCCCGTTGCGAGTATTACAGAAGAGAAGCGGAACGGTCAAAGC GTTTATAAGATTACAGCAAAGGCCGAAAAGTTACAACAGGAGTTAGAAA : Ú ACAAATACGTTGACAATTTCACTTTTTATCTCGATAAAAAGGCTAAAGAG - GAAAACACGAACTTCACGTCATTTAGTAATCTGGTCAAAGCCATAAATCA : AAATCCATCTGGTACATACCATCTCGCGGCAAGTCTAAACGCGAATGAA GTAGAACTTGGCCCGGACGAGCGTTCATACATTAAGGATACCTTTACTG GCAGACTCATAGGGGAAAAAGACGGTAAGAACTATGCTATATACAATTT GAAAAAGCCTTTATTTGAGAACCTGTCGGGCGCCACCGTCGAGAAATTG TCCCTTAMAAACGTAGCTATAAGCGGAAAGAATGACATCGGTAGTCTTG
CAAACGAGGCTACTAACGGGACAAAGATTAAACAAGTGCACGTAGATGG Gtgtgtcgacggcatcattacctecaaaactaaatctgacgatgacgataaaaacaaagegetgaacet gcagtgcattaaaataaagaatgaggatttgacattcategcagaaaaaaatagctteagegaagagec gitccaagatgagatagtaagctacaacaccaagaacaagccgcttaattttaattactcgttagataaaat catagttgactacaacctticaatcegaagatcacgttaccgaatgacagaacaactcctgtoeacaaaagga attccctatgcacctgagtataagtcaaatgcegegtraacaatagagattcataatatagatgacaacac catctatcaatatctgtacgctcagaaaagtccaacaactcttcagegtataacaatgaccaatagtgtega tgacgcattgataaatictaccaagatatactcttatttoccgagegteatctecaaagttaatecaaggtacte aaggcattctatttttgcaatgggtecgagacatcatagatgacttcactaatgagtegtcteagaaaaceac gattgataaaatatcagatgtttecaccategtceectacatcggacctacgcttaacattataaageaggg gtatgaggggaattttateggagcgttagaaactacgggggtigtactattacttgaatacataccagagata acattgccegttatageggeceteagtategcagaatcaagtacacaaaaagaaaagataatcaaaaca atcgacaactticctagaaaagaggtacgaaaaatggatagaggtttataaactegtgaaagegaaatagt taggcactgattaatacgcagttccaaaagagatcctatcaaatgtatagatcactagagtaccaggtggat gccataaagaaaattatcegactatgaatataaaatatattcaggtccagataaggagcagatagctgatga r 126 aataaacaatitaaaaaacaaacttgaagagaaggcegaataaggccatgatcaatatcaatatititatac gagaatcttcacgatcttttttggtaaatcagatgattaacgaagecaaaaagcagcetacttgagttegacac acagtccaaaaacatactaatgcaatatatcaaagcaaactcaaaattcattagaattactgagctgaag aaactggaatccaaaataaataaagtattctetacccegatecegttetettactetaaaaaccttgactacta ggtagataacgaagaagatatigacgtictagagtaataagectt
33. Sequência de proteína da fusão CT-GHRP-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF . ' SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY . AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE ' YKOKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR KDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV FYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVOGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN — CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSCGGGEGSALVGSSFLSPEHORVQAQAR KESKKPPAKLQPR
34. Sequência de proteína da fusão CT-GHRH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL —GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KNTFLPSLAEKVYNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF
ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVYADAI . ' FTNSYRKVLGOQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA - 35. Sequência de proteína da fusão CT-GHRP-LHD : TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII — PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSCGGGGSGGGGSALVEGSSFL SPEHORVOQRKESKKPPAKLQPR
36. Sequência de proteína da fusão CT-grelina-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN
. 128
PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIY TEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNF TNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIG
QLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN . ' PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI . TUIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIAN í KVLTVOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQ
AEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSV SYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTL STDIPFQLSKYVDNQRLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGSSFLSPEHQ RVQQRKESKKPPAKLQOPR
37. Sequência de proteína da fusão IgA-Hyutet-CT-SST14
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTY —RQHVSLDGIPENTDTYFVKVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAE KLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNLVKAINQNPSGTYHLAA SLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATV EKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKAQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDK NKALNLQCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKII VDYNLOSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQ KSPTTLORITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIID DFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLE YIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTV NTQFQOKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLE —EKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANS KFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVLEGGGGSGG GGSGGGGSALVAGCKNFFWKTFTSC
7. 129
38. Sequência de proteína da fusão IgA-Hyhtet-CT-GHRP
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTY RQHVSLDGIPENTDTYFVKVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGQSVYKITAKAE KLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNLVKAINQNPSGTYHLAA —SLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATV EKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDK NKALNLQCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKII VDYNLOSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQ KSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIID
DFTNESSOQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKOGYEGNFIGALETTGVVLLLE . Í YIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTV . NTQFOKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLE 7 EKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANS
KFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVLEGGGGSGG GGSGGGGSALVGSSFLSPEHQORVAQRKESKKPPAKLQPR
39. Sequência de proteína da fusão CT-grelina S3W-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA —DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQOYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNF TNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIG QLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI TUIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIAN — KVLTVOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQ AEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSV SYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTL STDIPFQLSKYVDNORLLSTLEIYALVGSWFLSPEHQRVAQQRKESKKPPAKL QPR
40. Sequência de proteína da fusão CT-GRP-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR " THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS . SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD : SISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF —ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGEGGGSALVGNHW AVGHLM
41. Sequência de proteína da fusão CT-GRP-LHB
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYK PEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQOTMIKLFNRIKSKPLGEKL LEMINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGP GPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVOQENKGASIF NRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMOQSTDAIQAEE LYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLONFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNK FKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFS —DSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEH LAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDL SKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVY
: 131
EKQPAIKKIFTDENTIFOQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSM DYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDAIADISLIVPYIGLALN VGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVYVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNA LTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYR — YNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAV EKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTND TILIEMFENKYNSLEGGGGSGGGGSGGGGSALVGNHWAVGHLM
42. Sequência de proteína da fusão CP-qGHRH29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN ” YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP . LPNILDYTASLTLOGQAQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTOSYRKVLAQLSARK LLQDILNRAEAAAKEAAAKALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDET NVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDIT KYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNK GVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALR GNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRV KRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKY SGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDE LNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSL LKDIINEYFN
43. Sequência de proteína da fusão CP-QGHRH-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG —RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA
GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE í 132
LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSLIEGRHVDAIFTASYRKVLAQLSARKLLOQDIL NROQOGERNQEQGALAGGGGESCGGGGSGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSP SEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENL SSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSV NEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVST TDKIADITINIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFAL VSYIANKVLTVOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKE " ALENQAEATKAIINYQOYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFL . NQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK : VNNTLSTDIPFOQLSKYVDNORLLST
44. Sequência de proteína da fusão CP-YGGHRH-LHC
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY —AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE YKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRHVDAIFTASYRKVLAQLSARKLLQDILNRQAGER NQEQGALAGGGGSGGGGSGGGGSALVLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKT DIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPG
ENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVY TYFPTLANKVNAGVOGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPY!|
GPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEI IKTIDNCLEQRIKRWKDSY EWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGA! —KAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYL FKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIP
FNIFSYTNNSLLKDIINEYFN c 133
45. Sequência de proteína da fusão CP-GGHRH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQOSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGAQAQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTOSYRKVLAQLSARKLLQ " DILNRQQGERNQEQGAALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLP . YVADKDSISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLP : NVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEE ALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKI SDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTF YSSIQEREKIIKTIENCLEQORVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMY DSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINK FIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKV NESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
46. Sequência de proteína da fusão CP-QGGHRH-LHD N10- PL5
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGAQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS —SESVVDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTOSYRKVLAQLSARK LLQDILNRQQGERNQEQINTERVALOAPAPLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQ EIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLP
: 134
GEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYT FLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIG PALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKII KTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADA IKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYL FKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMP FNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
47. Sequência de proteína da fusão CP-QGHRH-LHD N10- HX12
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT O NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN . YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP : LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQOYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDNNNNNNNNNNDDDDKHVDAIFTOSYRKVLAQLSARK LLQDILNRQQGERNQEQGAEAAAKEAAAKALQCIKVKNNRLPYVADKDSIS —QEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNL
PGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIY TFLPSLAEKVNKGVQOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPY|
GPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQERE KIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQA DAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSV TYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFEN TMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
48. Sequência de proteína da fusão CP-UTS-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN —PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGOQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGGGGSADDDDKNDDPPISIDLTFHLLRNMIEMARIENER EQAGLNRKYLDEVALAGGGGSGGGGSCGGGGSALVLQCIKVNNWDLFFSP SEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENL SSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSV NEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVST
TDKIADITIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFAL o VSYIANKVLTVOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKE . ALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFL
Í NQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDK VNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLST
49. Sequência de proteína de LHNVA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVNNWDLFFSPSEDNF TNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIG QLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI TIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVYLGTFALVSYIAN KVLTVOTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQ —AEATKAIINYOYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSV SYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTL STDIPFQLSKYVDNQRLLST
50. Sequência de proteína de LHNW/B
PVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYK PEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLOTMIKLFNRIKSKPLGEKL LEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGP —GPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIF NRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMOQSTDAIQAEE LYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNK FKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFS DSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEH LAVYKIQMCVDEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIDVDNEDLFFIADKNSFSDDL SJ SKNERIEYNTOSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVY R EKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSM : DYIKTANKVVEAGLFAGWVKOQIVNDFVIEANKSNTMDAIADISLIVPYIGLALN VGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVYVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNA LTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYR YNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAV EKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEY EKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTND TILIEMFNKYNS
51. Sequência de proteína de LHNWC — PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKE!IIKLFKRINSREIGEELIYR
LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE YKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGOQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR KDINEETEVIYYPDNVSVDOQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV —FYDNRTONVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVOQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALN
ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN í 137
CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSY TNNSLLKDIINEYFN
52. Sequência de proteína de LHNWD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ” FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK . YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR ' THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY —QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
53. Sequência de proteína de IgA-Hytet
ESNQPEKNGTATKPENSGNTTSENGQTEPEKKLELRNVSDIELYSQTNGTY RQOHVSLDGIPENTDTYFVKVKSSAFKDVYIPVASITEEKRNGOSVYKITAKAE KLQQELENKYVDNFTFYLDKKAKEENTNFTSFSNLVKAINQNPSGTYHLAA SLNANEVELGPDERSYIKDTFTGRLIGEKDGKNYAIYNLKKPLFENLSGATV EKLSLKNVAISGKNDIGSLANEATNGTKIKQVHVDGCVDGIITSKTKSDDDDK NKALNLQCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKII — VDYNLOSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQ KSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVYNQGAQGILFLQWVRDIID
DFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLE í 138
YIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVY NTQFOKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLE EKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTOSKNILMQYIKANS KFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDV
54. Peptídeo Octreotida sintetizado Cys-Dphe-Cys-Phe-Dtrp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol
55. Peptídeo agonista de GHRH sintetizado HIS-ALA-ASP-ALA-ILE-PHE-THR-ASN-SER-TYR-ARG-LYS-VAL-LEU- GLY-GLN-LEU-SER-ALA-ARG-LYS-LEU-LEU-GLN-ASP-ILE-NLE-SER- ARG-CYS ” 56. Peptídeo antagonista de GHRH sintetizado - PhAc-Tyr-D-Arg-Asp-Ala-lle-Phe(4-CI)-Thr-Ala-Har-Tyr(Me)-His-Lys-Val-Leu- ' Abu-Gln-Leu-Ser-Ala-His-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Nle-D-Arg-Har-CYS
57. Sequência de proteína de CP-MCH-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITOQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKDFDMLRCMLGRVYRPCWOQVALAK RLVLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILD GQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKL SNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVE DFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLE GFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWL SRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKN —SLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDS HNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
58. Sequência de proteína de CT-KISS-LHD c 139 .
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFOCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQOYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP ” LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN . KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII ' PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE REKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGCGGGSGGGGSALVYNWN SFGLRFG
59. Sequência de proteína de CT-Pr>RP-LHA
EFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTN PEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLG RMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSA DIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTOQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGA GKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEE LRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMK NVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTY LNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNF TGLFEFYKLLCVDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQCIKVYNNWDLFFSPSEDNF TNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIG —QLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLN PSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADI
TUIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIAN z 140 º
KVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTOQIDLIRKKMKEALENQ AEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSV SYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTL STDIPFQLSKYVDNORLLSTLEGGGGSGGGGSGGGGSALVTPDINPAWYA SRGIRPVGRFG
60. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-27-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP SJ LPNILDYTASLTLOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL . GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGOQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQ DIMALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIV FYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSL —AEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
61. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-28-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL
GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ z 141 0
FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQ DIMSALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFE NKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEI VFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPS LAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN
CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI "” DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN - MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI ' FSYTNNSLLKDIINEYFN ' 62. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 1-29-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI —ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN
: 142 e
IFSYTNNSLLKDIINEYFN
63. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 144-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK
YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR o THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS . SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQ " DIMSRQQGESNQERGARARLALAGGGGSGGGESGGGGSALALQCIKVKN
NRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVD PLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTT SVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDT LDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALG VFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHIN YQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAM — NNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDR LKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
64. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH 140-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPOQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYOQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGAQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK —YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQ
: 143 É“
DIMSROQGESNQERGALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPY VADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPN VNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEA LGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKIS DVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFY SSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMY DSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINK FIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKV NESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
65. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala9- o LHD - TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT 7 NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNAYRKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
66. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala22-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
, 144 +
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ — FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQOKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLGQLSARKALQ DIMSRALAGGGGSCGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE . EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP . SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL : NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
67. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys11 1-29-LHD “TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPOQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYKKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF —ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL
+
B NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
68. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys11 Argi2 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP o LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL . GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK
YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYKRVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP — SLAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
69. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn11 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ
+ " FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK
YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYNKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA " KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK . NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN : IFSYTNNSLLKDIINEYFN
70. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys20 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQOKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLGQLSAKKLLQ : DIMSRALAGGGGSCGGGGSCGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI —“ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN
7 IFSYTNNSLLKDIINEYFN
71. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Lys11 Lys20 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR ” THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS . SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYKKVLGQLSAKKLLQD ' IMSRALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFE NKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEI VFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPS LAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
72. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn20 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQOSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLGQLSANKLLQ ? ' DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL —NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
73. Sequência de proteína da fusão CP- ” HS GHRH Ala8 Asn12 1-29-LHD . TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT ' NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGAQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFOCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
74. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Asn21 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT " NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLGQLSARNLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITIDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE CÍ EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP - SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL ' NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
75. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Glu 7 1-29-LHD —TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPONKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFEASYRKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF —ENKITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP
SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL í NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI
ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
76. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Glu 10 1-29LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP Í LPNILDYTASLTLOGAQQAQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL : GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASERKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP —SLAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
77. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Glu 13 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ " FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKELGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGEGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA ” KIDLEYKKYSGSDKEN!IKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK - NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN ' IFSYTNNSLLKDIINEYFN
78. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala8-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGOQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL —GKSIFOCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI —ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN ' IFSYTNNSLLKDIINEYFN
79. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Giu8 1- 29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT — NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQOYNVKNR C THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGOQNIERNPALQOKLS . SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTESYRKVLGQLSARKLLQ ] DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK —NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
80. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala1i5 1-27-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPONKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALOKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQ " DIMALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFEN KIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIV FYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSL AEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
81. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH Ala15-
CÍ LHD . TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT ' NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGAQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQ DIMSRALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
82. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 Ala15 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
7 NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ —FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGOQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLAQLSARKLLQD IMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFE NKITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEI " VFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPS . LAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI ' GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
83. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 9 15 22 27-LHD —TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQ DIASRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF —ENKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL , NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
84. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH Ala8 9 15 22-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP " LPNILDYTASLTLAOGAQQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL . GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQ DIMSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP —SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSY QWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVYGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
85. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH HVOAL 1-32-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITOQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ ' FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGONIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTASYRKVLAQLSARKALQ DILSROQGALAGGGGSCGGGGESGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSIS QEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNL
PGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIY TFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPY|
GPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQERE KIIKTIENCLEQORVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQA " DAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSV . TYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFEN , TMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFN
86. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH HVSAL 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPOQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQAQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL —GKSIFOCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTSSYRKVLAQLSARKLLQ DILSRALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI —ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN " IFSYTNNSLLKDIINEYFN
87. Sequência de proteína da fusão CP- HS GHRH HVTAL 1-29-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT — NPSLSKPPRPTSKYOQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR O THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS - SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKHVDAIFTTSYRKVLAQLSARKLLQD ' ILSRALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFE NKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEI VFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPS LAEKVNKGVOAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNI GNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIEN CLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKI DLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKN MLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNI FSYTNNSLLKDIINEYFN
88. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH QALN-
LHD TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPOQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK — YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLAQLSARKALQ
7 DILNRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF
ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL —NIGNSALRGNFNOAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN IFSYTNNSLLKDIINEYFN
89. Sequência de proteína da fusão CP-HS GHRH QAL- "” LHD . TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT ' NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLAGQQASNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHOQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEINIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSDDDDKYADAIFTASYRKVLAQLSARKALQ DILSRALAGGGGSGGGGSCGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIF ENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGE EIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLP SLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPAL NIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTI ENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKA KIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFK NMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFN
IFSYTNNSLLKDIINEYFN 9o. Sequência de proteína da fusão CP-hGHRH29 N8A M27L -LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT
7 NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN
YLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSIEGRYADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDIL SR ALAGGGGSGGGGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIIT DETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYD . DITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEK " VNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNS ALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLE ORVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLE YKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLP KVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYT NNSLLKDIINEYFN
91. Sequência de proteína da fusão CP-hGHRH29 N8A K12NM27L-LHD
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP LPNILDYTASLTLOGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDGIITSKTKSIEGR — YADAIFTASYRNVLGQLSARKLLOQ- DILSR ALAGGGGSGGGEGSGGGGSALALQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIIT DETNVOQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYD ' DITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEK VNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNS ALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLE QRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLE YKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLP KVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYT NNSLLKDIINEYFN
92. Sequência de proteína da fusão N-terminal-kGHRH29 N8A M27L -LHD
HVDAIFTASYRKVLAQLSARKLLQDILNRNNNNNNNNNNTWPVKDFNYSDP ] VNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSK . YQOSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDS ' STPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTL QGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVLGKSIFCMDPVIA LMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDV EIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFD KDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVF ANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVC VDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITD —ETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDD ITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKV NKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSA LRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQ RVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYK KYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVI DELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNN
SLLKDIINEYFN SEQID93 —proteínade fusão GnRH-C
PITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSN — PNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDTFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYR LSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGP RENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRF ' SKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEY AEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGE YKQOKLIRKYRFVWVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVONRKI YLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGOQNLSRNPALRKVNP ENMLYLFTKFCVDAIDGRSLYNKTLQCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLR KDINEETEVIY YPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQV FYDNRTOQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPT LANKVNAGVOGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALN ISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDN
CLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKID o LEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNML . PKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSY ' TNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGGGGSGGGGSALVMKPIQKLLAGLILLTW
CVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVKEVGQLAETQRFECTTH
QPRSPLRDLKGALESLIEEETGQKKI SEQID94 fusão GNRH-D
TWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDT NPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLIN YLVWGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGP —LPNILDYTASLTLAGAQOSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNOSSAVL GKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQ FEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDK YKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNR THYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLS SESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKD SISQEIFENKIITDETNVONYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEP LNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSN KIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVII PYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQE —REKIIKTIENCLEORVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSY QADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIREC SVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESF ' ENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEGGGGSGCGEGSGCCGGESGGEGGSAL VMKPIQKLLAGLILLTWCVEGCSSQHWSYGLRPGGKRDAENLIDSFQEIVK
EVGQLAETQRFECTTHQPRSPLRDLKGALESLIEEETGQKKI Exemplo 1 - Preparação de um constructo de estrutura principal 5º LHVA O procedimento que segue cria um clone para aplicação como uma estrutura principal de expressão para expressão de proteína de multi- domínio. Este exemplo se baseia na preparação de um clone à base do so- rotipo A (SEQ ID 1), embora os procedimentos e métodos sejam igualmente aplicáveis a todos os sorotipos LHy tais como sorotipo B (SEQ ID 2), soroti- - po C (SEQ ID 3) e sorotipo D (SEQ ID 4) e outras proteases e domínios de . translocação ou tais como IgA e Hy Tetânica usando a sequência publicada ' apropriada para síntese (SEQ ID 32). Preparação de vetores de clonagem e de expressão pCR 4 (Invitrogen) é o vetor de clonagem de rotina de escolha escolhido devido à falta de sequências de restrição dentro do vetor e sítios de primers de sequenciamento adjacentes para fácil confirmação de cons- tructo. O vetor de expressão se baseia no vetor de expressão pET (Nova- gen) o qual foi modificado para conter o sítio de clonagem múltipla Ndel- BamHIl-Sall-Pstl-Xbal-Hindlll para inserção de constructo, um fragmento do vetor de expressão foi removido para criar um plasmídeo não mobilizável, uma variedade de diferentes etiquetas de fusão foram inseridas para aumen- tar as opções de purificação e um sítio Xbal existente na estrutura principal do vetor foi removido para simplificar a subclonagem. Preparação de LC/A A sequência de DNA é designada por retro translação da se- quência de aminoácidos LC/A (obtida a partir de fontes de bancos de dados livremente disponíveis tais como GenBank (número de acesso P10845) u- sando uma de uma variedade de ferramentas de softwares de translação reversa (por exemplo Backtranslation tool v2.0 (Entelechon)). As sequências de reconhecimento BamHl/Sall são incorporadas nas extremidades 5' e 3' respectivamente da sequência mantendo o frame de leitura correto. A se-
" quência de DNA é triada (usando software tal como SeqBuilder, DONASTAR Inc.) para sequências de clivagem enzimática de restrição incorporadas du- rante a retro translação. Quaisquer sequências de clivagem que são consi- deradas comuns para aquelas requeridas pelo sistema de clonagem são removidas pela Backtranslation tool da sequência codificante proposta asse- gurando que seja mantido uso de codons de E. coli comum. O uso de co- dons de E. coli é avaliado por meio de referência a programas de softwares tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), e a % do teor de GC e taxa de uso de codons avaliada por meio de referência a tabelas de uso de —codons publicadas (por exemplo, GenBank Release 143, de 13 de setembro " de 2004). Esta sequência de DNA otimizada contendo o frame de leitura a- . berta LC/A (ORF) é em seguida sintetizada comercialmente (por exemplo, ' por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCRA4.
Preparação de inserto HWA A sequência de DNA é designada por retro translação da HyA sequência de aminoácidos (obtida a partir de fontes de bancos de dados livremente disponíveis tais como GenBank (número de acesso P10845) u- sando uma de uma variedade de ferramentas de softwares de translação reversa (por exemplo Back translation tool v2.0 (Entelechon)). Uma sequên- cia de restrição Pstl adicionada ao N-término e Xbal-codon de interrupção- Hindlll ao C-término assegurando que seja mantido o frame de leitura corre- to. A sequência de DNA é triada (usando software tal como SeqBuilder, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem enzimática de restrição incor- poradas durante a retro translação. Quaisquer sequências que são conside- radas comuns para aquelas requeridas pelo sistema de clonagem são remo- vidas pela Backtranslation tool da sequência codificante proposta assegu- rando que seja mantido uso de codons de E. coli comum. O uso de codons de E. coli é avaliado por meio de referência a programas de softwares tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), e a % do teor de GC e taxa de uso de codons avaliada por meio de referência a tabelas de uso de codons publicadas (por exemplo, GenBank Release 143, de 13 de setembro
' de 2004). Esta sequência de DNA otimizada é em seguida sintetizada co- mercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4. Preparação do interdomínio (ligante LC-Hy) O ligante LC-Hy pode ser designado a partir do primeiro princí- pio, usando a informação de sequência existente para o ligante como o mo- delo. Por exemplo, o ligante do sorotipo A (definido neste caso como a regi- ão do polipeptídeo interdomínio que existe entre as cisteínas da ponte de dissulfeto entre LC e Hy) tem a sequência VRGIIPFKTKSLDEGYNKALNDL.
Esta informação de sequência está livremente disponível a partir de fontes CÍ de bancos de dados disponíveis tais como GenBank (número de acesso . P10845). Para produção de um sítio de clivagem de protease específico, a , sequência de reconhecimento nativa para Fator Xa pode ser usada na se- quência modificada VDGIITSKTKSLIEGR ou uma sequência de reconheci- mento de enteroquinase é inserida dentro do loop de ativação para gerar a sequência VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLO. Usando uma de uma variedade de ferramentas de softwares de translação reversa (por exemplo Backtrans- lation tool v2.0 (Entelechon), a sequência de DNA codificando a região do ligante é determinada. Sequências enzimáticas de restrição BamHlI/Sall e PstilXbal/codon de interrupção/Hindlll são incorporadas em sua extremida- de, nos frames de leitura corretos. A sequência de DNA é triada (usando software tal como Seqbuilder, DNASTAR Inc.) para sequências de clivagem enzimática de restrição incorporadas durante a retro translação. Quaisquer sequências que são consideradas comuns para aquelas requeridas pelo sis- tema de clonagem são removidas pela Backtranslation tool da sequência codificante proposta assegurando que seja mantido uso de codons de E. coli comum. O uso de codons de E. coli é avaliado por meio de referência a pro- gramas de softwares tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), e a % do teor de GC e taxa de uso de codons avaliada por meio de referên- ciaatabelasde uso de codons publicadas (por exemplo, GenBank Release 143, de 13 de setembro de 2004). Esta sequência de DNA otimizada é em seguida sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart
7 ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4.
Montagem e confirmação do clone da estrutura principal Devido ao tamanho pequeno, o ligante de ativação deve ser transferido usando um processo de duas etapas. O vetor ligante pCRÁA é clivadocom enzimas de restrição de combinação BamHI + Sal e o vetor li- gante clivado em seguida serve como o receptor para DNA de LC clivado pelas enzimas de restrição BamHI + Sail. Uma vez que o DNA codificando LC é inserido a montante do DNA ligante, todo o fragmento de DNA ligante de LC pode ser em seguida isolado e transferido para o vetor de expressão depETMCS.O LC-ligante é cortado do vetor de clonagem de pCR 4 usan- - do enzimas de restrição BamHI/Pstl. O vetor de expressão pET é digerido : com as mesmas enzimas mas também é tratado com fosfatase antártica ' como uma precaução extra para prevenir re-circularização. O LC-ligante e a estrutura principal do vetor pET são purificados por gel e o inserto purificado a estrutura principal do vetor são ligados juntos usando T4 DNA ligase. O produto é transformado com células TOP10 as quais são em seguida triadas para LC-ligante usando digestão por restrição por BamHI/Pstl. O processo é em seguida repetido para a inserção de Hy dentro do sítios de restrição Ps- ti/Hindlll do constructo pET-LC-ligante.
Triagem com enzimas de restrição é suficiente para assegurar que a estrutura principal final esteja correta uma vez que todos os compo- nentes já são confirmados e sequenciados durante a síntese. No entanto, durante a subclonagem de alguns componentes dentro do estrutura princi- pal, onde fragmentos de tamanhos similares estão sendo removidos e inse- ridos, é necessário o sequenciamento de uma pequena região para confir- mar a correta inserção.
Exemplo 2 - Construção de LHNWAA-CP-GS15-SST28 O procedimento que segue cria um clone para aplicação como um constructo de expressão para expressão de fusão multidomínio onde a porção de direcionamento (TM) é apresentada centralmente entre a protease e o domínio de translocação. Este exemplo se baseia na preparação da fu- são LHNW/A-CP-GS15-SST28 (SEQ ID 25), embora os procedimentos e mé-
: todos sejam igualmente aplicáveis para criar outras fusões de protease, do- mínio de translocação e porção de direcionamento, onde a porção de dire- cionamento é N-terminal ao domínio de translocação.
Neste exemplo, um espaçador de glicina-serina de 15 aminoácidos flanqueante (G,S)3 é mani-
— pulado dentro da sequência de interdomínio para assegurar acessibilidade do ligante a seu receptor, mas outros espaçadores são aplicáveis.
Preparação de inserto espaçador- SST28 humano
A região do ligante do polipeptídeo interdomínio LC-Hy existe entre as cisteíinas da ponte de dissulfeto entre LC e Hy.
Para inserção de um sítio de clivagem de protease, espaçador e uma região da porção de direcio-
" namento (TM) dentro do loop de ativação, uma de uma variedade de ferra- . mentas de softwares de translação reversa (por exemplo Backtranslation tool! " v2.0 (Entelechon) são usados para determinar a sequência de DNA codifi- cando a região do ligante.
Para apresentação central de uma sequência
SST28 no N-término do domínio Hy, uma sequência de DNA é designada para as regiões do espaçador GS e da porção de direcionamento (TM) pos- sibilitando incorporação dentro do clone da estrutura principal (SEQ ID 1). A sequência de DNA pode ser arranjada como BamHlI-Sa/l-espaçador-sítio de ativação de protease-SST28-espaçador-Pstl-Xbal-codon de interrupção-
Hindlll (SEQID 5). Uma vez que o DNA da porção de direcionamento é de- signado, o DNA adicional requerido para codificar o espaçador preferencial é criado in sílico.
É importante assegurar que o frame de leitura correto seja mantido para o espaçador, SST28 e sequências de restrição e que a se-
quência Xbal não seja precedida pelas bases TC, as quais resultariam em
DAM metilação.
A sequência de DNA é triada para sequência de restrição incorporada e quaisquer sítios adicionais são removidos manualmente da sequência remanescente assegurando que seja mantido uso de codons de
E. coli comum.
O uso de codons de E. coli é avaliado por meio de referência a programas de softwares tais como Graphical Codon Usage Analyser (Ge-
neart),ea'%do teor de GC e taxa de uso de codons avaliada por meio de referência a tabelas de uso de codons publicadas (por exemplo, GenBank Release 143, de 13 de setembro de 2004). Esta sequência de DNA otimiza-
7 da é em seguida sintetizada comercialmente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é proporcionada no vetor pCR 4. Montagem e confirmação do clone da estrutura principal De modo a criar um constructo LC-espaçador-sítio de ativação- SST28-espaçador-Hy (SEQ ID 25) usando o constructo de estrutura principal (SEQ ID 1) e o vetor pCR 4-espaçador-sítio de ativação-porção de direcio- namento-espaçador recém sintetizado codificando a porção de direciona- mento SST28 (SEQ ID 5), pode ser usado um método de uma ou duas eta- pas; tipicamente o método de duas etapas é usado quando o DNA da porção dedirecionamento tem menos de 100 pares de bases.
Usando o método de - uma etapa a região do ligante SST28 pode ser inserida diretamente dentro . do constructo de estrutura principal cortando o vetor pCR 4- espaçador-sítio : de ativação-porção de direcionamento-espaçador com enzimas de restrição Sall e Pstl e inserindo a porção de direcionamento codificando fragmento de DNA dentro de um constructo de estrutura principal pET cortado de modo similar.
Usando o método de duas etapas o domínio LC é excisado do clone da estrutura principal usando enzimas de restrição BamHI e Sal e ligado dentro de vetor pCR 4- espaçador-sítio de ativação-porção de direcionamen- to-espaçador digerido de modo similar.
Isto cria um ORF LC-espaçador-sítio de ativação-SST28-espaçador em pCR 4 que pode ser excisado do vetor usando as enzimas de restrição BamHI e Psfl para subsequente ligação dentro do constructo de expressão pET de modo similar.
O constructo final contém o LC-espaçador-sítio de ativação-SST28-espaçador-Hy DNA (SEQ ID 25) o qual resultará em uma proteína de fusão contendo a sequência ilus- tradanaSEQ|D26. Exemplo 3 - Expressão e purificação de uma proteína de fusão LHNWA-CP-SST28 Este exemplo se baseia na preparação de uma proteína LHNWA que incorpora um polipeptídeo da porção de direcionamento SST28 dentro daregião do ligante interdomínio (SEQ ID 26), onde o ORF do vetor de ex- pressão pET também codifica uma etiqueta de purificação de histidina.
Estes procedimentos e métodos são igualmente aplicáveis às outras proteínas de
- fusão tais como as mostradas nas SEQ ID 7-14, 42-48, 57, 60-91. Onde a- propriado, a enzima de ativação deve ser selecionada para ser compatível com o sítio de ativação de protease dentro de cada sequência Expressão de LHWA-CP-SST28 A expressão da proteina LHN/A-CP-SST28 é obtida usando o seguinte protocolo.
Inocular 100 ml! de TB modificada contendo 0,2 % de glucosamina e 30 ug/ml de canamicina em um frasco de 250 ml com uma única colônia da cepa de expressão LHA-CP-SST28. Cultivar a cultura a 37ºC, 225 rpm por 16 horas.
Inocular 1 L de TB modificada contendo 0,2 % de glucosamina e 30 pg/ml de canamicina em um frasco de 2 L com 10 ml SÍ de cultura de um dia para o outro.
Cultivar as culturas a 37ºC até um ODgoo . nm de de cerca de 0,5 ser atingido em cujo ponto reduzir a temperatura até , 16ºC.
Depois de 1 hora induzir as culturas com 1 mM de G e cultivar a 16ºC por um adicional de 16 horas.
Purificação da proteína LHWA-CP-SST28 Descongelar tubo de falcon contendo 35 m! de HEPES a 50 mM pH 7,2, 200 mM de NaCl e aproximadamente 10 g de pasta de células de E. coli BL21 (DE3). Homogenizar a pasta de células (138 Kpa(20 psi)) assegu- rando que a amostra permaneça fria.
Centrifugar as células lisadas a 18 000 rpm,4ºC por 30 minutos.
Carregar o sobrenadante sobre uma coluna que- lante carregada com 0,1 M de NISOA4 (é suficiente coluna de 20 a 30 ml) e- quilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Usando uma etapa de gradiente de 10, 40 e 100 mM de imidazol, lavar a proteína ligada não específica e eluir a proteína de fusão com 200 mM de imidazol.
A prote- ínade fusão eluída é dialisada contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 MM de NaCl a 4ºC de um dia para o outro e o OD>39 nm é medido para es- tabelecer a concentração de proteína.
Adicionar 3,2 ul de enteroquinase (New England Biolabs) por mg de proteína de fusão e incubar estático de um dia para o outro a 25ºC.
Carregar sobre uma coluna quelante carregada com 0,1M de NiSO4 (é suficiente coluna de 20 a 30 ml) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Lavar coluna até linha basal com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Usando uma etapa de gradiente de
. 10, 40 e 100 mM de imidazol, lavar a proteína ligada não específica e eluir a proteína de fusão com 200 mM de imidazol.
Dialisar a proteína de fusão elu- ída contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2 150 mM de NaCl a 4ºC de um dia para o outro e concentrar a fusão até cerca de 2 mg/ml, aliquotar a a- mostrae congelar a -20ºC.
Testar a proteína purificada usando OD>285, BCA e análise da pureza.
Exemplo 4 - Construção de LHNW/D-CT-GS20-CST28 O procedimento que segue cria um clone para aplicação como um constructo de expressão para expressão de fusão multidomínio onde a porção de direcionamento (TM) é apresentada C-terminalmente ao domínio Í de translocação.
Este exemplo se baseia na preparação da fusão LHNWD-CT- . GS20-CST28 (SEQ ID 17), embora os procedimentos e métodos sejam i- ' gualmente aplicáveis para criar outras fusões de protease, domínio de trans- locação e porção de direcionamento, onde a porção de direcionamento de CHerminal ao domínio de translocação.
Neste exemplo, um espaçador de glicina-serina de 20 aminoácidos flanqueante é manipulado dentro da se- quência de interdomínio para assegurar acessibilidade do ligante a seu re- ceptor, mas outros espaçadores são aplicáveis.
Preparação de espaçador- inserto CST28 humano Para apresentação de uma sequência CST28 no C-término do domínio Hy, uma sequência de DNA é designada para flanquear as regiões do espaçador e da porção de direcionamento (TM) possibilitando incorpora- ção dentro do clone da estrutura principal (SEQ ID 4). A sequência de DNA pode ser arranjada como BamHl-Sa/l-Pstl-Xbal-espaçador-CST28-codon de interrupção-Hindlll (SEQ ID 6). A sequência de DNA pode ser designada usando uma de uma variedade de ferramentas de softwares de translação reversa (por exemplo, EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.), ou Backtranslation tool v2.0 (Entelechon)). Uma vez que o DNA da porção de direcionamento é designado, o DNA adicional requerido para codi- ficaro espaçador preferencial é criado in sílico.
É importante assegurar que o frame de leitura correto seja mantido para o espaçador, CST28 e sequên- cias de restrição e que a sequência Xbal não seja precedida pelas bases
' TC, as quais resultaram em DAM metilação. A sequência de DNA é triada para sequências de restrição incorporadas e quaisquer sequências adicio- nais são removidas manualmente da sequência remanescente assegurando que seja mantido uso de codons de E. coli comum. O uso de codons de E. colié avaliado por meio de referência a programas de softwares tais como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), e a % do teor de GC e taxa de uso de codons avaliada por meio de referência a tabelas de uso de codons publicadas (por exemplo, GenBank Release 143, de 13 de setembro de 2004). Esta sequência de DNA otimizada é em seguida sintetizada comerci- almente (por exemplo, por Entelechon, Geneart ou Sigma-Genosys) e é pro- Í porcionada no vetor pCR 4.
. Montagem e confirmação do clone da estrutura principal , De modo a criar um construct LHNW/D-GS20-CST28 (SEQ ID 17) usando o constructo de estrutura principal (SEQ ID 4) e o vetor pCR 4 espaçador-porção de direcionamento recém sintetizado codificando a porção de direcionamento CST28 (SEQ ID 6), pode ser usado um método de uma ou duas etapas; tipicamente o método de duas etapas é usado quando o DNA da porção de direcionamento tem menos de 100 pares de bases. U- sando o método de uma etapa o CST28 pode ser inserido diretamente den- trodo constructo de estrutura principal cortando o vetor pCR 4-espaçador- porção de direcionamento com enzimas de restrição Xbal e Hindlll e inserin- do a porção de direcionamento codificando fragmento de DNA em um cons- tructo de estrutura principal pET cortado de modo similar. Usando o método de duas etapas o domínio LHy é excisado do clone da estrutura principal usando enzimas de restrição BamHI e Xbal e ligado em vetor pCR 4- espaçador-CST28 digerido de modo similar. Isto cria um ORF LHy- espaçador-CST28 em pCR 4 que pode ser excisado do vetor usando enzi- mas de restrição BamHI e Hindlll para ligação subsequente dentro do cons- tructo de expressão pET clivado de modo similar. O constructo final contém o LCHigante-Hyespaçador-CST28 DNA (SEQ ID 17) o qual resultará em uma proteína de fusão contendo a sequência ilustrada na SEQ ID 18. Exemplo 5 - Expressão e purificação de uma proteína de fusão
' LHND-CT-CST28 Este exemplo se baseia na preparação de uma proteína LHy/D que incorpora um polipeptídeo de porção de direcionamento CST28 no tér- mino carboxila do domínio Hy (SEQ ID 18), onde o ORF do vetor de expres- são pET também codifica uma etiqueta de purificação de histidina.
Estes procedimentos e métodos são igualmente aplicáveis a sequências de proteí- nas de fusão tais como as mostradas nas SEQs ID 15, 16, 18-24, 27-31, 33- 41, 58-59, e 93-94. Onde apropriado, a enzima de ativação deve ser sele- cionada para ser compatível com o sítio de ativação de protease dentro de cada sequência.
SÍ Expressão de LHWD-CT-CST28 . Expressão da proteína LHNWD-CT-CST28 é obtida usando o se- " guinte protocolo.
Inocular 100 ml! de TB modificada contendo 0,2 % de glu- cosamina e 30 pg/ml de canamicina em um frasco de 250 ml com uma única colôniada cepa de expressão LHWD-CT-CST28. Cultivar a cultura a 37ºC, 225 rpm por 16 horas.
Inocular 1 L de TB modificada contendo 0,2 % de glu- cosamina e 30 ug/ml de canamíicina em um frasco de 2 L com 10 ml de cul- tura de um dia para o outro.
Cultivar as culturas a 37ºC até um ODsoo nm de de cerca de 0,5 ser atingido em cujo ponto reduzir a temperatura até 16ºC.
Depois de 1 hora induzir as culturas com 1 mM de G e cultivar a 16ºC por um adicional de 16 horas.
Purificação da proteína LHWD-CT-CST28 Descongelar tubo de falcon contendo 35 ml de HEPES a 50 mM pH 7,2, 200 mM de NaCl e aproximadamente 10 g de pasta de células de E. coliBL21(DE3). Homogenizar a pasta de células (20psi) assegurando que a amostra permaneça fria.
Centrifugar as células lisadas a 18 000 rpm, 4ºC por 30 minutos.
Carregar o sobrenadante sobre uma coluna quelante carre- gada com 0,1 M de NISO4 (é suficiente coluna de 20 a 30 ml) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl.
Usando uma etapa de gra- dientede 10,40 e 100 mM de imidazol, lavar a proteína ligada não específi- ca e eluir a proteína de fusão com 200 mM de imidazol.
A proteína de fusão eluída é dialisada contra 5 L de 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCI
] a 4ºC de um dia para o outro e o OD>255 nm é medido para estabelecer a concentração de proteína. Adicionar 3,2 ul de enteroquinase (New England Biolabs) por mg de proteína de fusão e incubar estático de um dia para o outro a 25ºC. Carregar sobre uma coluna quelante carregada com 0,1 M de NISO4(é suficiente coluna de 20 a 30 ml) equilibrada com 50 mM de HEPES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Lavar coluna até linha basal com 50 mM de HE- PES pH 7,2, 200 mM de NaCl. Usando uma etapa de gradiente de 10,40 e 100 mM de imidazol, lavar a proteína ligada não específica e eluir a proteína de fusão com 200 mM de imidazol. Dialisar a proteína de fusão eluída contra 5Lde50mM de HEPES pH 7,2 150 mM de NaCl a 4ºC de um dia para o e outro e concentrar a fusão até cerca de 2 mg/ml, aliquotar a amostra e con- . gelar a -20ºC. Testar a proteína purificada usando OD>go, BCA e análise da ' pureza. As figuras 1 e 2 demonstram purificação de proteínas de fusão con- forme analisado por SDS-PAGE. Exemplo 6 - Conjugação química de LHN/A a porção de direcio- namento de SST (SST TM) O procedimento que segue cria uma molécula quimicamente conjugada contendo a sequência de aminoácidos LHN/A (SEQ ID 49), prepa- rada a partir da SEQ ID 1 usando o método de produção resumido no exem- plo3,e um peptídeo SST Octreotida o qual foi sintetizado quimicamente (SEQ ID 54). No entanto, os procedimentos e métodos são igualmente apli- cáveis para a conjugação de outros peptídeos tais como SEQ ID 55 e SEQ ID 56 a outras proteínas de protease/domínio de translocação tais como a- quelas contendo as sequências de aminoácidos SEQ ID 50, 51, 52 e 53.
A proteína LHNy/A foi permutada com tampão de 50 mM de He- pes 150 mM de sal em PBSE (100 mM de 14,2 g de NAP2HPOA4, 100 mM de 5,85 g de NaCl, 1 MM de EDTANa> pH 7,5 com 1 M de HCI) usando a colu- na Bio-rad de PD10. Isto foi feito lavando um volume de coluna de PBSE através da coluna de PD10, a proteína foi em seguida adicionada à coluna até não saírem mais gotas na extremidade da coluna de PD10. 8 mls de PBSE foi em seguida adicionado e são coletadas frações de 0,5 ml. As fra- ções coletadas são as medidas usando a leitura Azgo e as frações contendo
. proteína são reunidas.
Uma concentração de 1,55 mg/ml de LHy/A foi obtida da etapa de permuta de tampão e esta foi usada para estabelecer as seguin- tes reações: [| az — q QT" As amostras foram deixadas para correr em temperatura ambi- ente por3 horas antes de serem passadas para baixo em outra coluna de PD10 para permuta de tampão em PBSE e as frações contendo proteína s foram reunidas.
Uma concentração final de 25 mM de DTT foi em seguida adicionada a proteína derivada e em seguida as amostras foram deixadas CC em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida foram tomadas as leituras Ago & Az43 para realizar a proporção da interação SPDP:LHWA e a reação que resultou em uma provisão de derivatização de entre 1 e 3 foi u- sada para a conjugação do peptídeo.
O reagente SPDP liga às aminas pri- márias da LHNy/A através de um éster de N-hidroxissuccinimida (NHS), dei- xando a porção reativa a sulfidril para formar uma ligação dissulfeto ao gru- pamento SH livre sobre a cisteína livre sobre o peptídeo sintetizado.
Neste case a sequência de peptídeos é Octreotida a qual foi sintetizada com uma cisteína livre sobre o N-término (SEQ ID 91). A LHNWA derivada por SPDP foi misturada com um excesso de 4 vezes do ligante de Octreotida e a reação foi em seguida deixada em temperatura ambiente por 90 minutos enquanto correndo.
O excesso de octreotida foi em seguida removido usando também uma coluna de PD10 deixando molécula conjugada de LHny/A-Octreotida.
Exemplo 7 - Atividade de SST-LHNW/A em células endócrinas cul- tivadas (AtT20) A linhagem celular de tumor de pituitária de rato AtT20 é um e- xemplo de uma linhagem celular de origem endócrina.
Portanto representa uma linhagem celular modelo para a investigação de efeitos de inibição-de- liberação dos agentes.
As células AtT20 possuem receptores superficiais que possibili- tam a ligação, e internalização de SST-LHNWA.
Em contraste, as células
. AtT20 carecem de receptores adequados para neurotoxinas clostridiais e portanto não são suscetíveis a neurotoxinas botulínicas (BoNTs). A figura 3 (a) ilustra a inibição da liberação de ACTH por células AtT20 depois de incubação prévia com SST-LHN/A.
É evidente que se ob- servainibição dose-dependente, indicando que SST-LHnN/A pode inibir a libe- ração de ACTH partir de um modelo de células endócrinas.
Foi demonstrado que a inibição da liberação de ACTH se correlaciona com clivagem da prote- ína SNARE SNAP?25 (figura 3 (a) e (b)) Deste modo, a inibição da liberação de mensageiro químico é devida a um efeito mediado por endopeptidase
—clostridial de clivagem da proteina SNARE.
SJ Materiais e Métodos
: Kits de imunoensaio enzimático de ACTH foram obtidos da Ba- ' chem Research Inc., CA, EUA.
Reagentes de Western blotting foram obtidos da Invitrogen e da Sigma.
Células AtT20 foram semeadas sobre lâminas de 12 cavidades e cultivadas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 4 mM de Glutamax.
Depois de 1 dia SST-LHN/A foi aplicado por 72 horas e em seguida as células foram lavadas para remover SST-LHNW/A não ligado.
À secreção de ACTH foi estimulada elevando a concentração de potássio ex- tracelular (60 mM de KCI) e cálcio (5 MM de CaClz) por 30 min.
O meio foi colhidodas células e armazenado a -20ºC até ser avaliado para teor de AC- TH usando o Kit de imunoensaio e seguindo as instruções do fabricante.
As células foram solubilizadas em 1x LDS eletroforese tampão de amostra redu- tor, aquecidas por 10 minutos a 90ºC e em seguida armazenadas a -20ºc até serem usadas para Western blotting.
A secreção estimulada foi calculada subtraindo a liberação basal da liberação total sob condições de estimula- ção.
As amostras celulares solubilizadas foram separadas por SDS-PAGE e transferidas para membrana de nitrocelulose.
Proteólise de SNAP-25, um componente crucial do processo neurosecretor e o substrato para a ativida- de de endopeptidase zinco-dependente de BOoNT/A, foi em seguida detecta- da sondando com um anticorpo que reconhece tanto formas intactas quanto clivadas de SNAP-25. Foi obtida quantificação da proteólise por análise de imagem usando um sistema de estudo por imagens de Synoptics Syngene
" GeneGnome e o sofiware GeneTools.
Exemplo 8 - Atividade de SST-LHn/D em células neuroendócri- nas cultivadas (GH3) A linhagem de células de pituitária de rato GH3 é um exemplo de uma linhagem celular de origem neuroendócrina. Portanto representa uma linhagem celular modelo para a investigação de efeitos de inibição-da- liberação dos agentes.
As células GH3 possuem receptores superficiais que possibili- tam a ligação, e internalização de SST-LHn/D. Em contraste, as células GH3 carecem de receptores adequados para neurotoxinas clostridiais e portanto SJ não são suscetíveis a neurotoxinas botulínicas (BoNTs). . A figura 4 ilustra a inibição da liberação de hormônio do cresci- ' mento (GH) por células GH3 depois de incubação prévia com SST-LHN/D É evidente que se observa inibição dose-dependente, indicando que SST- LHn/D pode inibir a liberação de GH a partir de um modelo de células neuro- endócrinas.
A comparação dos efeitos de inibição observados com conjuga- do e a LHN/D não direcionada demonstra a contribuição da porção de dire- cionamento (TM) para eficiente inibição da liberação do transmissor.
Materiais e Métodos Kits de imunoensaio enzimático de GH foram obtidos da Millipo- re, MA, EUA. Células GH3 foram cultivadas sobre lâminas de 24 cavidades em mistura de nutriente F-10 (Ham) suplementada com 15 % de Soro de Cavalo, 2,5 % de FBS, 2 mM de L-Glutamina. As células foram tratadas com SST-LHNWD ou LHy/D por 72 horas e em seguida as células foram lavadas para remover SST-LHn/D não ligado. A secreção foi estimulada expondo as células a 10 uM de acetato de tetradecanoil forbol (TPA, PMA) durante 30 min. O meio foi colhido das células e armazenado a -20ºC até ser avaliado para teor de GH usando o kit de imunoensaio e seguindo as instruções do fabricante. A secreção estimulada foi calculada subtraindo a liberação basal da liberação total sob condições de estimulação.
Exemplo 9 - Método para aliviar sintomas acromegálicos por re-
7 dução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária Um homem de 35 anos de idade membro de um time regional de badminton é submetido a uma radiografia espinhal devido a dor na região inferior das costas. O médico observa crescimento ósseo anormal e, na a- namnese, o homem relata incidentes cada vez mais frequentes de apnéia do sono e também pele progressivamente oleosa. O médico recomenda medição dos níveis de IGF-1 circulantes e estes são considerados elevados. Testes subsequentes também mostram níveis circulantes de GH acima do normal de modo que é realizada uma var- É redura cranial por MRI. Esta mostra um tumor da pituitária de 9 mm de diã- . metro. O paciente é tratado com uma proteína de fusão de porção de dire- , cionamento de peptídeo de cortistatina ou de somatostatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31) por injeção i.v..
Em intervalos de 1 semana os níveis circulantes de IGF-1 são medidos e é visto que estão menores na primeira medição e reduzem de modo estável até 15% acima do normal durante as seis semanas seguintes. O nível de GH circulante é considerado normal neste momento. Uma dose adicional da medicação com medições a cada duas semanas do IGF-1 mos- tra que este hormônio estabilizou na extremidade superior do normal. Em seis semanas depois do segundo tratamento uma varredura cranial por MRI revela encolhimento do tumour até 6 mm. A terapia é continuada em uma dosagem reduzida em intervalos de dois meses com níveis de IGF-1 e de GH medidos na sétima semana. Estes são ambos estáveis na faixa normal e a apnéia do sono e a pele oleosa estão agora ausentes. Uma radiografia espinhal em uma ano depois do primeiro tratamento não apresenta aumento do tamanho ósseo a partir da observação original.
Exemplo 10 - Método para normalizar dedos hirsutos e inchados por redução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária Uma funcionária de confeitaria de 50 anos de idade do sexo fe- minino tem dificuldade crescente para remover sua aliança e eventualmente
. visita seu médico.
O médico também observa que os dedos da paciente têm mais pelo do que o esperado e, no questionamento, a paciente admite que ambas estas condições surgiram gradualmente.
Testes clínicos subsequen- tes revelam um nível maior do que a média de GH circulante que não se al- teradepois de uma bebida de alto teor de glicose.
Suspeita-se de uma con- dição acromegálica e uma varredura cranial por tomografia computadorizada confirma a presença de um pequeno tumor da pituitária.
Cirurgia é considerada inadequada de modo que a paciente é tratada com uma injeção i.v. de uma proteína de fusão de porção de direcio- —namento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ JS ID 7-16, 18-24, 26-31). Dentro de quatro semanas o teste de tolerância a . glicose mostra uma reação nos níveis de GH e nos níveis de IGF-1 próxima ' ao normal.
O tratamento continua em intervalos de seis semanas e por volta do final da décima oitava semana a paciente consegue remover seu anel facimente eo hirsutismo desapareceu.
Exemplo 11 - Método para melhorar as consequências de res- surgimento de adenoma da pituitária secretor de hormônio do crescimento Um mergulhador de 52 anos de idade do sexo masculino se a- presenta com sintomas acromegálicos progressivamente perceptíveis, inclu- indodilatação de tecidos moles e aumento das extremidades.
Testes meticu- losos confirmam a presença de um adenoma da pituitária de 12 mm.
Análo- gos de somatostatina são mal tolerados pelo paciente de modo que o tumor é ressecado e testes regulares durante 2 anos mostram que os níveis circu- lantes de GH e de IGF-1 estão na faixa superior do normal e não é adminis- trada medicação adicional.
Dezoito meses depois, ao se apresentar com hiperidrose e hipertensão moderada, observa-se que os níveis de GH e de IGF-1 estão acima do normal e uma varredura por tomografia computadori- zada revela recrescimento do adenoma da pituitária.
Repetir a ressecção é considerado indesejável.
O homem é tratado por administração i.v. de uma proteína de fusão de porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou de cor- tistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Um curso de radioterapia
7 também é administrado e depois de quatro semanas a hiperidrose e a hiper tensão estão quase normais assim como os níveis de GH e de IGF-1. Duran- te os próximos três anos os sintomas não recidivam e não há recrescimento do tumor em cinco anos pós tratamento.
Exemplo 12 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina Depois de seis anos de controle com êxito dos níveis circulantes de GH e de IGF-1 por análogos de somatostatina, uma leitora de tarot de feira acromegálica de 60 anos de idade relata óbvia pele progressivamente oleosae também odor corporal proeminente em consequência de hiperidro- - se.
Ela é considerada intolerante a glicose e tem elevados circulantes níveis - de IGF-1 e o aumento da dosagem de SSA não controla estes.
Ú Ela é tratada por injeção localizada de uma proteína de fusão de porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (porexemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Dentro de 14 dias a paciente rela- ta uma redução significativa na transpiração.
Durante o mês seguinte sua pele oleosa retorna ao normal e por esta ocasião seus níveis de GH e de IGF-1 estão ambos dentro da faixa normal.
Esta situação permanece duran- te os próximos cinco anos.
Exemplo 13 - Método para tratar doença de Cushing em pacien- tes intolerantes a análogos de somatostatina Uma estudante madura do sexo feminino de 30 anos de idade visita seu clínico geral para solicitar tratamento para ansiedade e depressão.
O médico observa que a mulher tem uma face arredondada com aumento da —gorduraem torno do pescoço e também braços e pernas mais finos do que o normal.
Na anamnese ela confirma um ciclo menstrual irregular.
Um nível urinário de cortisol livre de 24 horas de 150 ug é medido sugerindo síndrome de Cushing.
Varredura abdominal por MRI mostra que não há tumores adre- nais presentes mas varredura cranial por MRI revela um pequeno tumor da pituitária.
O paciente é considerado inadequado para intervenção cirúrgica de modo que é tratado com uma proteína de fusão de porção de direciona-
' mento peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7- 16, 18-24, 26-31). Exemplo 14 - Método para reverter impotência sexual feminina por tratamento de prolactinoma Uma mulher de 36 anos de idade visita seu médico, preocupada a respeito de sua recente expressão de leite pelas mamas, apesar de seu teste negativo de gravidez.
O exame também indica secura vaginal e ela confirma que perdeu sua libido.
Os resultados dos testes clínicos são em grande parte normais com a notável exceção de moderada hiperprolactine- mia.
Uma varredura cranial por MRI indica um adenoma da pituitária, consis- í tente com os elevados níveis de prolactina. . Ela é tratada por administração oral com uma preparação de : uma proteína de fusão de porção de direcionamento de peptídeo de soma- tostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Depois deoitodias ela não expressa mais leite nas mamas e seus níveis de umida- de vaginal melhoraram significativamente.
Depois de sete semanas a secura começa a retornar mas é quase imediatamente revertida por um segundo tratamento.
Os tratamentos continuam em visitas a cada seis semanas à clínica de saúde sexual onde a mulher relata um retorno à atividade sexual normal.
Exemplo 15 - Método para produzir perda de peso por tratamen- to de insulinoma Uma mulher de 64 anos de idade com um índice de massa cor- poral (BMI) de 39 foi diagnosticada com insulinoma inoperável.
Ela deseja obter uma redução sustentada do apetite e peso para lhe possibilitar manter um interesse ativo em aeróbica de modo que é tratada por uma injeção sis- têmica de uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direciona- mento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Dentro de 10 a 14 dias depois do tratamento seu ganho de peso se estabilizou e por volta de 30 dias ocorreu perda de peso.
A paci- ente mantém uma perda de peso significativa contanto que a medicação continue como uma série de injeções por 24 semanas.
' Exemplo 16 - Método para tratar glucagonoma Uma mulher de 63 anos de idade visita seu médico em um esta- do angustiado, tendo tido erupções desenvolvidas sobre suas nádegas, em torno de sua virilha e sobre suas pernas inferiores. Testes de sangue mos- tram que ela está anêmica e diabética. Ela também tem episódios diarreicos frequentes. O médico suspeita da presença de glucagonoma e uma varredu- ra por tomografia computadorizada confirma a existência de um tumor na cauda do pâncreas.
A paciente é tratada com uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou de cortista- Í tina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Depois de 4 semanas os epi- . sódios diarreicos cederam e as erupções clarearam significativamente. Sua ' contagem de células vermelhas também retornou quase ao normal. O trata- mento é repetido em intervalos de seis semanas e os sintomas parmanecem emgrande parte sob controle.
Exemplo 17 - Método para tratar diarreia e vermelhidão causa- dos por ViPoma Um homem de 49 anos de idade sofre de diarreia secretora as- sociada com vermelhidão crônico. Testes clínicos indicam acidose metabóli- ca,e uma varredura abdominal por tomografia computadorizada revela um tumor — quase certamente um ViPoma — próximo ao pâncreas.
Cirurgia não está disponível para o paciente de modo que ele é tratado com uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcio- namento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ 1D7-16,18-24, 26-31). Dentro de 3 semanas o vermelhidão parou e a diar- reia se tornou menos frequente. Por volta de sete semanas depois do trata- mento todos os sintomas desapareceram e permanecem ausentes contanto que a terapia seja repetida em intervalos de aproximadamente 8 semanas.
Exemplo 18 - Método para tratar gastrinoma Um homem de 47 anos de idade sofre de grave ulceração pépti- ca que causa dor abdominal debilitante. Ele também experimenta episódios diarreicos inexplicados e eventualmente é diagnostado com gastrinoma in-
' trapancreático por testes de sangue e estudo abdominal por ultrassom.
Ele é tratado por injeção intratumoral de uma medicação consis- tindo em uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direciona- mento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16,18-24,26-31), ou fusão compreendendo uma porção de direcionamen- to de peptídeo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Dentro de uma semana os sintomas gástricos dolorosos começam a melhorar. A hipergastrinemia cedeu e os episódios diarreicos reduziram em gravidade e frequência. Este estado é característico por 7 semanas mas os níveis sanguíneos de gastrina começam a aumentar depois disso. A terapia é repetida em intervalos de 7 - semanas e isto mantém a gastrina sanguínea em níveis normais e outros . sintomas não recidivam. : Exemplo 19 - Método para tratar tireotoxicose causada por tiro- trofinoma Um membro feminino da tripulação de bordo de uma companhia aérea de 39 anos de idade visita seu médico queixando-se de transpiração excessiva, ligada com nervosismo previamente desconhecido, que começou a afetar sua capacidade para realizar seu trabalho. Durante a consulta é evi- dente um fino tremor e o doutor suspeita de tireotoxicose. A mulher é enca- —minhada a um endocrinologista que realiza uma série de testes de sangue. As principais anormalidades detectadas são níveis elevados de tiroxina mas também níveis elevados de TSH (tirotrofina), indicativo de um tirotrofinoma. Uma varredura por MRI da cabeça confirma a presença de um tumor da pi- tuitária.
A mulher é tratada com uma medicação consistindo em uma proteína de fusão compreendendo porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Tanto a transpiração quanto o nervosismo declinam durante as duas sema- nas seguintes. Testes de sangue de seguimento a cada duas semanas mos- tram que tanto os níveis de tiroxina quanto de tirotrofina baixaram e eles a- tingem níveis normais por volta de seis semanas. A paciente é capaz de re- assumir a plena atividade de trabalho.
. Exemplo 20 - Método para tratar dilatação dos tecidos moles re- corrente causada por acromegalia Uma mulher de 72 anos de idade, já tendo sofrido cirurgia tran- sesfenoidal para remover uma macroadenoma da pituitária, apresenta reci- divade sintomas acromegálicos (essencialmente dilatação dos dedos e lin- gua e cansaço e letargia crescentes). Varredura cranial por MRI revela a presença de um microadenoma da pituitária putativo e testes sanguíneos ubsequentes confirmam elevados níveis circulantes de GH e de IGF-1. Cirurgia é considerada incompatível com as condições médicas pré-existentes de modo que ela é tratada com uma medicação consistindo - em uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento . de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, : 18-24, 26-31). Depois de uma semana ela relata se sentir mais ativa de mo- do geral e que a dilatação de seus dedos e língua reduziu perceptivelmente.
Por volta de três semanas os sintomas recorrentes reverteram completa- mente e exame endocrinológico confirma uma normalização dos níveis de GH e de IGF-1. Ela é monitorada mensalmente e são administrados trata- mentos repetidos em intervalos de 10 semanas.
Este regime de dosagem mantém os níveis hormonais dentro da faixa normal e previne a recidiva dos sintomas.
Exemplo 21 - Método para tratar hirsutismo facial excessivo cau- sado por Doença de Cushing Uma consultora de beleza de 27 anos de idade começa a de- senvolver perceptível crescimento de pelos faciais.
Isto não é tratado ade- quadamente por métodos de remoção capilar de rotina e lhe está causando graves problemas psicológicos (ansiedade, depressão) em relação tanto a seu trabalho quanto a sua vida pessoal.
Seu médico suspeita de síndrome de Cushing de modo que ela é encaminhada a um endocrinologista.
Testes de sangue e de urina apresentam elevados níveis de cortisol e níveis ACTH, eum teste de estimulação de CRH se comprova positivo, confirmando a probabilidade de um tumor da pituitária secretor de ACTH.
Varreduras por tomografia computadorizada de adrenal e da pituitária confirmam a presença
, de um tumor da pituitária mas não anormalidade adrenal.
Depois de discussões com outros médicos a paciente opta por intervenção medicinal e é tratada com uma medicação consistindo em uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptí- deode somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31), ou fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptí- deo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Dentro de dez dias a mulher está começando a se sentir mais positiva e por volta do tempo de duas semanas ela precisa usar clareamento capilar ou cremes depilatórios com muito me- norfrequência. os sintomas começam a reaparecer em torno de dez a doze - semanas de modo que é administrado um segundo tratamento. Ocorre um . padrão similar de remissão dos sintomas, reaparecimento gradual e trata- | mento. Durante o terceiro tratamento, a paciente opta por remoção cirúrgica do tumor da pituitária. Monitoração de seguimento pelos dois anos seguintes não apresenta recidiva de sintomas ou tumor.
Exemplo 22 - Método para tratar galactorreia masculina causada por prolactinoma Um jogador de rugby de 40 anos de idade do sexo masculino tem estado preocupado há algum tempo acerca do aumento do tamanho das mamas além do que é esperado do treinamento. Ele se torna altamente es- tressado quando uma gota de leite aparece na mama esquerda. Seu médico imediatamente suspeita da existência de um prolactinoma da pituitária e o encaminha a um radiologista e a um endocrinologista. Testes de sangue mostram hiperprolactinemia mas função tiroidiana normal. Uma varredura cranial por MRI mostra que está presente um tumor da pituitária.
Na ausência de qualquer efeito de massa tumoral o homem é tratado com uma medicação consistindo em uma proteína de fusão compre- endendo uma porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31). Depois de somente quatro diasa expressão do leite cessou e depois de seis semanas houve uma redução mensurável em tecido de mama não muscular. Durante este período os níveis sanguíneos de prolactina foram medidos de quinze em
, quinze dias e retornaram ao normal por volta da medição da quarta semana.
O tratamento é repetido em intervalos de 12 semanas, durante cujo tempo não há recorrência de sintomas e não há indicação de crescimento tumoral.
Cirurgia ou outro tratamento de redução do tumor é considerado desneces- sário enquanto estas condições são características.
Exemplo 23 - Método para tratar múltiplos sintomas causados por insulinoma Um homem de 51 anos de idade é diagnosticado com insulino- ma depois de se apresentar ao mécido com uma variedade de condições ocorrendo recentemente incluindo visão turva, palpitações, fraqueza, amné- - sia e, desmaiou em duas ocasiões em três meses.
O diagnóstico é confir- - mado por testes endocrinológicos e radiográficos. i Ele é tratado com uma medicação consistindo em uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de somatostatina ou de cortistatina (por exemplo, SEQ ID 7-16, 18-24, 26-31), ou fusão compreendendo um uma porção de direcionamento de peptídeo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Dentro de uma semana seus níveis de visão e de energia retornaram quase ao normal e continuam a melhorar du- rante a quinzena seguinte.
Em quatro semanas ele não está mais hipoglicê- micoe neste ponto é realizada enucleação laparoscópica de um tumor da cabeça do pâncreas.
Monitoração subsequente do paciente não registra re- torno dos sintomas ou da massa tumoral e o paciente permanece saudável depois de três anos.
Exemplo 24 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina Depois de 3 anos de controle com êxito de GH e IGF-1 circulan- tes por análogos de somatostatina, uma funcionária de escritório acromegá- lica de 54 anos de idade relata óbvia pele progressivamente oleosa e tam- bém odor corporal proeminente em consequência de hiperidrose.
É visto que elaé intolerante a glicose e tem níveis circulantes elevados de IGF-1 e o aumento da dosagem de SSA não controla estes.
Ela é tratada por injeção intravenosa de uma proteína de fusão
Í compreendendo um hormônio do crescimento liberando porção de direcio- namento de peptídeo hormonal (por exemplo, SEQ ID 34, 42-47, 60-92). Dentro de 14 dias a paciente relata uma significativa redução na transpira- ção.
Durante o mês seguinte sua pele oleosa retorna ao normal e nesta oca- siãoseus níveis de GH e de IGF-1 estão ambos dentro da faixa normal.
Esta situação permanece durante os próximos cinco anos.
Exemplo 25 - Método para tratar doença de Cushing em pacien- tes intolerantes a análogos de somatostatina Uma recepcionista de 37 anos de idade do sexo feminino visita seu clínico geral para solicitar tratamento para ansiedade e depressão.
O 7 médico observa que a mulher tem uma face arredondada com aumento de « gordura em torno do pescoço e também braços e pernas mais finos do que o ' normal.
Na anamnese ela confirma um ciclo menstrual irregular.
Um nível urinário de cortisol livre de 24 horas de 150 ug é medido sugerindo síndrome de Cushing.
Varredura abdominal por MRI mostra que não há tumores adre- nais presentes mas varredura cranial por MRI revela um pequeno tumor da pituitária.
A paciente é considerada inadequada para intervenção cirúrgica de modo que é tratada com uma injeção intravenosa de proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de urotensina (por exemplo, SEQ ID 48). Exemplo 26 - Método para reverter impotência sexual feminina por tratamento de prolactinoma Uma mulher de 28 anos de idade visita seu médico, preocupada arespeito de sua recente expressão de leite nas mamas, apesar de seu tes- te negativo de gravidez.
O exame também indica secura vaginal e ela con- firma que perdeu sua libido.
Os resultados dos testes clínicos são bastante normais com a notável exceção de moderada hiperprolactinemia.
Uma var- redura cranial por MRI indica um adenoma da pituitária, consistente com os níveiselevados de prolactina.
Ela é tratada por uma injeção intravenosa de uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de grelina
' (GHRP) (por exemplo, SEQ ID 33, 35, 38), ou fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Depois de quatro dias ela não expressa mais leite nas mamas e seus níveis de umidade vaginal melhoraram significativamente.
Depois de treze sema- nasa secura começa a retornar mas é quase imediatamente revertida por um segundo tratamento.
Os tratamentos continuam em visitas a cada doze semanas à clínica de saúde sexual onde a mulher relata um retorno à ativi- dade sexual normal.
Exemplo 27 - Método para tratar doença de Cushing Uma datilógrafa do sexo feminindo de 30 anos de idade visita 7 seu clínico geral para solicitar tratamento para ansiedade e depressão.
O . médico observa que a mulher tem uma face arredondada com aumento de ' gordura em torno do pescoço e também braços e pernas mais finos do que o normal.
Na anamnese ela confirma um ciclo menstrual irregular.
Um nível urinário de cortisol livre de 24 horas de 200 ug é medido sugerindo síndrome de Cushing.
Varredura abdominal por MRI mostra que não há tumores adre- nais presentes mas varredura cranial por MRI revela um pequeno tumor da pituitária.
A paciente é considerada inadequada para intervenção cirúrgica de modo que é tratada com uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de bombesina (GRP) (por exemplo, SEQ ID 40-41), ou fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Exemplo 28 - Método para tratar gastrinoma Um homem de 63 anos de idade sofre de grave ulceração pépti- ca que causa dor abdominal debilitante.
Ele também experimenta episódios diarreicos inexplicados e eventualmente é diagnosticado com gastrinoma intrapancreático por testes de sangue e estudo de ultrassom abdominal.
Ele é tratado por injeção intratumoral de uma medicação consis- tindoem uma proteína de fusão compreendendo um análogo da porção de direcionamento de peptídeo de cortistatina ou somatostatina (octreotida — SEQ ID 54), o qual tenha sido quimicamente conjugado à proteína de trans-
" locação de protease (por exemplo, SEQ ID 49-53). Dentro de uma semana os sintomas gástricos dolorosos começam a melhorar.
A hipergastrinemia cedeu e os episódios diarreicos reduziram em gravidade e frequência.
Este estado é característico por 8 semanas mas os níveis sanguíneos de gastrina começam a aumentar depois disso.
A terapia é repetida em intervalos de 8 semanas e isto mantém a gastrina sanguínea em níveis normais e outros sintomas não reaparecem.
Exemplo 29 - Método para aliviar sintomas acromegálicos por redução dos níveis elevados de GH e de IGF-1 resultantes de adenoma da pituitária 7 Uma mulher de 50 anos de idade relata a seu clínico geral inci- . dentes progressivos de apnéia do sono e também pele progressivamente oleosa e o clínico geral observa crescimento ósseo anormal.
O clínico geral recomenda a medição do IGF-1 circulante e estes são considerados elevados.
Testes subsequentes também mostram níveis circulantes de GH acima do normal de modo que é realizada uma varredura cranial por MRI.
Esta mostra um tumor da pituitária de 5 mm de diâmetro.
À paciente é tratada com uma proteína de fusão MCH (por exemplo, SEQ ID 57) por injeção |.v.. Em intervalos de 1 semana os níveis circulantes de IGF-1 são medidos e é visto que estão menores na primeira medição e reduzem de modo estável até 5% acima do normal durante as oito semanas seguintes.
O nível de GH circulante é considerado normal neste momento.
Uma dose adi- cional da medicação com medições quinzenais de IGF-1 mostra que este hormônio estabilizou na extremidade superior do normal.
Em seis semanas depois do segundo tratamento uma varredura cranial por MRI revela enco- lhimento do tumor para 3 mm.
A terapia é continuada em uma dosagem re- duzida em intervalos de dois meses com níveis de IGF-1 e de GH medidos na sétima semana.
Estes estão ambos estáveis na faixa normal e a apnéia dosonoea pele oleosa estão agora ausentes.
Exemplo 30 - Método para tratar pacientes acromegálicos resis- tentes a análogos de somatostatina
7 Depois de 1 ano de controle com êxito de GH e IGF-1 circulante por análogos de somatostatina, um motorista de perfuratriz acromegálico de 40 anos de idade relata óbvia pele progressivamente oleosa e também odor corporal proeminente em consequência de hiperidrose.
Descobre-se que ele é intolerante a glicose e tem níveis circulantes elevados de IGF-1 e o au- mento da dosagem de SSA não controla estes.
Ele é tratado por injeção intravenosa de uma proteína de fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo de ligação KISS1R (por exemplo, SEQ ID 58), ou fusão compreendendo uma porção de direcionamento de peptídeo GnRH (por exemplo, SEQ ID 93-94). Dentro de 7 14 dias o paciente relata uma significativa redução na transpiração.
Durante . o mês seguinte sua pele oleosa retorna ao normal e neste momento seus i níveis de GH e de IGF-1 estão ambos dentro da faixa normal.
Esta situação permanece durante os próximos cinco anos.
Exemplo 31 - Método para tratar acromegalia Uma paciente relata a seu clínico geral que ela não cabe mais em seus sapatos tamanho 8, um tamanho que ela usou durante os últimos 25 anos, e que sua aliança não caberia mais.
Depois de excluir obesidade, o clínico geral suspeita que isto pode ser o resultado de um distúrbio da pitui- tária, o clínico geral encaminha a paciente para testes os quais confirmam níveis de IGF-1 e de GH significativamente elevados.
Uma MRI cranial con- firma a presença de um adenoma de pituitária.
Ela é tratada por injeção intravenosa de uma proteína de fusão compreendendo um receptor do hormônio de liberação de prolactina ligando porção de direcionamento de peptídeo (por exemplo, SEQ ID 59). Durante os meses seguintes os níveis de GH e de IGF-1 retornam ao normal e isto é mantido por uma injeção trimestral da proteína de fusão.
Exemplo 32 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 de rato in vivo Objetivos Avaliar o impacto de administração i.v. de fusão CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 em ratos cinco dias depois de tratamento em com-
7 paração com controle tratado apenas com veículo.
Materiais e Métodos Animais: ratos Sprague-Dawley adultos machos mantidos sob condições de alojamento de rotina com com luzes ligadas às 05:00 horas (14 horas de luz:10 horas de escuridão), comida e água disponíveis à vontade e habituados às condições de alojamento por no mínimo 1 semana antes da cirurgia.
Cirurgia: no dia 1 do estudo os ratos (200 a 250 g) serão aneste- siados com uma combinação de Hypnorm (0,32 mg/kg de citrato de fentanila e10 mg/kg de fluanisona, i.m.) e diazepam (2,6 mg/kg i.p.). A veia jugular - direita é exposta e uma cânula de politeno de ponta silástica (i.d. 0,50 mm, . o.d. 0,93 mm) (Portex, Reino Unido) é inserida dentro do vaso até se situar Ú próxima à entrada do átrio direito.
As cânulas serão preenchidas com solu- ção salina isotônica heparinizada (10 Ul/ml). A extremidade livre das cânulas serão exteriorizadas através de uma incisão no couro cabeludo e em segui- da passadas através de uma mola protetora ancorada ao crânio usando dois parafusos de aço inoxidável e acrílico dental autocurador.
Depois da recupe- ração os animais são alojados dentro de gaiolas individuais dentro do ambi- ente de amostragem de sangue automatizada.
A extremidade da mola prote- toraé fixadaa uma conexão mecânica que possibilita ao animal máxima |li- berdade de movimento.
As cânulas são jateadas diariamente com solução salina heparinizada para manter a desobstrução.
Tratamento: Às 09:00 no dia 2 do estudo os ratos receberão uma injeção i.v. de CP-GHRH-LHD ou controle de somente veículo.
Amostragem: o sistema de amostragem de sangue automatiza- da (ABS) foi previamente descrito (Clark et al., 1986; Windle et al., 1997). Três a quatro dias depois da cirurgia a cânula da veia jugular de cada animal será conectada ao sistema de amostragem de sangue automatizada.
Às 07:00 no dia 6 a amostragem se iniciará.
As amostras de sangue serão cole- tadasem intervalos de 10 minutos usando o sistema automatizado por um período de 24 horas.
Um total de 144 amostras de sangue serão coletadas para que cada contenha não mais de 38 ul de sangue total.
' Resultados Os níveis de IGF-1 foram medidos usando um Kkit ELISA de IGF-
1. A figura 5 ilustra uma redução estatisticamente significativa nos níveis de IGF-1 nos ratos tratados com fusão em comparação com o controle de so- mente veículo com um valor P de teste-t = 0,0416 depois de somente cinco dias. Exemplo 33 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis de IGF-1 de rato in vivo Objetivos: Este estudo é designado para investigar o curso de tempo da a- 7 tividade para fusão CP-GHRH-LHD identificando o retardo de tempo entre a - administração e o efeito inicial do composto nos níveis de IGF-1. ' Materiais e Métodos: Animais: ratos Sprague-Dawley adultos machos mantidos sob condições de alojamento de rotina com com luzes ligadas às 05:00 horas (14 horas de luz:10 horas de escuridão), comida e água disponíveis à vontade e habituados às condições de alojamento por no mínimo 1 semana antes da cirurgia. Cirurgia: no dia 1 do estudo os ratos (260-280g) serão anestesi- —ados com uma combinação de Hypnorm e diazepam. A veia jugular direita é em seguida exposta e uma cânula de politeno de ponta silástica (i.d. 0,50 mm, o.d. 0,93 mm) (Portex, Reino Unido) é inserida dentro do vaso até se situar próxima à entrada da direita. As cânulas serão preenchidas com solu- ção salina isotônica heparinizada (10 Ul/ml). A extremidade livre das cânulas serão exteriorizadas através de uma incisão no couro cabeludo e passadas através de uma mola ancorada ao crânio usando parafusos de aço inoxidá- vel e cimento dental. Depois da recuperação os animais serão alojados den- tro de gaiolas individuais no ambiente sistema de amostragem de sangue automatizada. A mola será fixada a uma conexão que possibilita ao animal máxima liberdade de movimento. As cânulas serão jateadas diariamente com solução salina heparinizada para manter a desobstrução. Tratamento: às 10:00h no dia 5 do estudo os ratos receberão
7 uma injeção i.v. da CP-GHRH-LHD ou veículo (solução salina estéril). Amostragem de sangue: depois de jatear as cânulas será colhi- da uma única amostra de sangue manual (100 ul) de cada rato às 09:30h.
As amostras serão colhidas do dia 5 ao dia 18 do experimento (ou até as cânulas serem bloqueadas). Plasma das amostras de sangue será armaze- nado a -20C para análise posterior do teor de IGF-1 por kit ELISA.
Resultados A figura 6 ilustra uma redução estatisticamente significativa nos níveis de IGF-1 nos ratos tratados com fusão em comparação com o contro- lede somente veículo a partir do quarto dia depois do tratamento. - Exemplo 34 - Atividade de CP-GHRH-LHD sobre os níveis do . hormônio do crescimento de rato in vivo ] Objetivos Avaliar o impacto de administração i.v. de fusão CP-GHRH-LHD sobre os níveis do hormônio do crescimento em ratos cinco dias depois de tratamento em comparação com controles tratados com veículo somente e de infusão de Octreotida.
Materiais e Métodos Animais: ratos Sprague-Dawley adultos machos mantidos sob condições de alojamento de rotina com com luzes ligadas às 05:00 horas (14 horas de luz:10 horas de escuridão), comida e água disponíveis à vontade e habituados às condições de alojamento por no mínimo 1 semana antes da cirurgia.
Cirurgia: no dia 1 do estudo os ratos (200 a 250 g) serão aneste- siados com uma combinação de Hypnorm (0,32 mg/kg de fentanil citrato e 10 mg/kg de fluanisona, i.m.) e diazepam (2,6 mg/kg i.p.). A veia jugular di- reita é exposta e uma cânula de politeno de ponta silástica (i.d. 0,50 mm, o.d. 0,93 mm) (Portex, Reino Unido) é inserida dentro do vaso até se situar próxima à entrada do átrio direito.
As cânulas serão preenchidas com solu- çãosalinaisotônica heparinizada (10 Ul/ml). A extremidade livre das cânulas serão exteriorizadas através de uma incisão no couro cabeludo e em segui- da passadas através de uma mola protetora ancorada ao crânio usando dois
- parafusos de aço inoxidável e acrílico dental auto curador.
Depois da recu- peração os animais são alojados dentro de gaiolas individuais dentro do am- biente de amostragem de sangue automatizada.
A extremidade da mola pro- tetora é fixada a uma conexão mecânica que possibilita ao animal máxima lierdade de movimento.
As cânulas são jateadas diariamente com solução salina heparinizada para manter a desobstrução.
Tratamento: às 09:00 no dia 2 do estudo os ratos receberão uma injeção i.v. do composto ativo de Syntaxin ou veículo.
Uma infusão de 12 horas de somatostatina (ou um análogo) se iniciará 6 horas depois do início da amostragem (administrada através de uma das linhas de cânulas duplas) - e continuará por 12 horas somente. [Este timing da infusão deve ser um ex- . celente controle do ensaio de GH uma vez que deve-se ver secreção na |li- Í nha basal em seguida completa inibição e em seguida rápida recuperação / rebote] Amostragem: o sistema de amostragem de sangue automatiza- da (ABS) foi previamente descrito (Clark et al., 1986; Windle et a/., 1997). Três a quatro dias depois da cirurgia a cânula da veia jugular de cada animal será conectada ao sistema de amostragem de sangue automatizada.
Às 07:00 no dia 6 a amostragem se iniciará.
As amostras de sangue serão cole- tadas em intervalos de 10 minutos usando o sistema automatizado por um período de 24 horas.
Um total de 144 amostras de sangue serão coletadas para cada conterá não mais de 38 ul de sangue total.
Resultados Os níveis do hormônio do crescimento foram medidos usando um ensaio de RIA.
A figura 7a ilustra os animais tratados com veículo os quais apresentam liberação de hormônio do crescimento pulsátil típica, a figura 7b ilustra a completa ablação da liberação de hormônio do crescimen- to pulsátil depois do tratamento com quimera GHRH-LHD e a figura 7c mos- tra o bloqueio da liberação de hormônio do crescimento pulsátil e subse- quenterecuperação quando a infusão de Octreotida é interrompida.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Polipeptídeo para o uso na supressão de secreção de uma célula tumoral neuroendócrina compreendendo: a. uma protease não citotóxica, cuja protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica em uma célula tumoral neuro- endócrina, em que a protease não citotóxica compreende uma endopeptida- se de neurotoxina clostridial ou uma protease de IgA; b. uma Porção de Direcionamento (TM) de peptídeo ou análogo da mesma que liga a um Sítio de Ligação sobre uma célula tumoral neuro- —endócrina, cujo Sítio de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser in- corporado em um endossoma dentro da célula tumoral neuroendócrina, em que a TM de peptídeo compreende um peptídeo hormônio de liberação do ' hormônio do crescimento (GHRH); um peptídeo de somatostatina, um peptí- - deo de cortistatina; um peptídeo de grelina; um peptídeo de bombesina; um peptídeo de urotensina; um peptídeo do hormônio de concentração de mela- nina 1; um peptídeo KISS-1; um peptídeo do hormônio de liberação de go- nadotropina (GnNnRH); e/ou um peptídeo de liberação de prolactina; e c. um domínio de translocação de neurotoxina clostridial que transloca a protease de dentro do endossoma, através da membrana endos- sômicae para dentro do citosol da referida célula tumoral neuroendócrina; em que o polipetídeo carece do domínio de ligação Hc. nativo de uma neurotoxina clostridial e não está apto a ligar aos terminais nervosos na junção neuromuscular.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, em que a célu- la tumoral neuroendócrina é selecionada a partir do grupo compreendendo células derivadas de ou contribuindo para: tumores da pituitária; tumores neuroendócrinos gastroenteropancreáticos não carcinoides; tumores carci- noides; e feocromocitomas.
3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a célula tumoral neuroendócrina é selecionada a partir do grupo compreen- dendo células derivadas de ou contribuindo para somatotrofinomas, insuli- nomas, gastrinomas, ViPomas, glucagonomas, prolactinomas, corticotrofi-
. 2 nomas, tirotrofinomas e feocromocitomas.
4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações
1.a3, em que o TM se liga a um receptor selecionado a partir do grupo com- preendendo: um receptor do hormônio de liberação do hormônio do cresci- mento(GHRH); um receptor de somatostatina (SST), um receptor de cortis- tatina (CST); um receptor de grelina; um receptor de bombesina; um recep- tor de urotensina; um receptor do hormônio de concentração de melanina 1; um receptor KiSS-1; um receptor do hormônio de liberação de gonadotropina (GnRH); e/ou um receptor de peptídeo de liberação de prolactina.
5. Polipeptídeo compreendendo: a. uma protease não citotóxica, cuja protease é capaz de clivar uma proteína do aparelho de fusão exocítica em uma célula tumoral neuro- endócrina; - b. uma Porção de Direcionamento (TM) que se liga a um Sítio de Ligação sobre uma célula tumoral neuroendócrina, cujo Sítio de Ligação é capaz de sofrer endocitose para ser incorporado em um endossoma dentro da célula tumoral neuroendócrina; e c. um domínio de translocação que transloca a protease de den- tro do endossoma, através da membrana endossômica e para dentro do ci- tosolda referida célula tumoral neuroendócrina em que o polipetídeo carece do domínio de ligação H.. nativo de uma neurotoxina clostridial e não está apto a se ligar aos terminais nervosos na junção neuromuscular; e em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoá- cidostendo no mínimo 90 a 92%, ou no mínimo 95 a 97%, ou no mínimo 98 a 99% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 57, 58, 59. 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81,82,83,84,85,86,87,88, 89, 90, 91, 92, 93 ou 94.
6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, em que a célu- la tumoral neuroendócrina é selecionada entre o grupo consistindo em célu-
.: 3 las derivadas de ou contribuindo para: tumores da pituitária, tumores neuro- endócrinos gastroenteropancreáticos não carcinoides; tumores carcinoides; feocromocitomas, insulinomas, gastrinomas, ViPomas, glucagonomas, pro- lactinomas, somatotrofinomas, corticotrofinomas, tirotrofinomas e feocromo- citomas.
7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a porção de direcionamento liga a um receptor selecionado entre o grupo compreendendo: um receptor do hormônio de liberação do hormônio do crescimento (GHRH); um receptor de somatostatina (SST), um receptor de cortistatina (CST); um receptor de grelina; um receptor de bombesina (por exemplo, BRS-1, BRS-2, ou BRS-3); um receptor de urotensina (por exem- plo, um receptor de urotensina 1I); um receptor do hormônio de concentração Á de melanina 1; um receptor KiSS-1; um receptor do hormônio de liberação 5 de gonadotropina (GNRH); e/ou um receptor de peptídeo de liberação de prolactina.
8. Ácido nucléico codificando um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7.
9. Método para tratar acromegalia em um paciente compreen- dendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou um ácido nu- cleico, como definido na reivindicação 8.
10. Polipetídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8 para uso em um método, como definido na reivindicação 9, para tratar acromegalia.
U7 FIG. 1 100 50
FIG. 2 1 2 3 4 5 6 — — — 100 — E 2 leal ú—. — —. do -—— 50 — - -—- e - La
FIG. 3a Secreção de ACTH e clivagem de SNAP25 a partir de células AtT20-D16vF2 tratadas com SST-LHnA 140 120 100 80 = 60 40 —e- Secreção de ACTH como % não tratada 7 % de SNAP25 não clivado o 01 1 10 100 1000 [SST-LHnA] nM FIG. 3b InM 10nM 100nM oOnM SST/A SST/A SST/A SST/A* - Le PO E NONO TI o =
( FIG. 4 Efeito de SST/LHnD sobre a liberação de GH por células GH3 o - & 1.40 o . 2 120 , E 3 1.00 S' 080 3 we 0.60 cs x S 0.40 B8 020 £ 0.00 F SST/D100 LHNDI00 SST/DIO LHNDIO Controle Tratamento i FIG. 5 E 400 v 3017 HEGESSCCCCSA | nrorodooroooo - ue eee een - O sc — «eee ECAAAAAARAAAAS = eceereseneeerateeeevaren] 3 200 etenentaadaaataatadaata o POSSAS É — RetafeeateraralatarAa SC ERRAR Fossa ta] -. penaorara a aeee ca ata naao = 107 sssssaAASA ia S essa = inealanaaareaaa 8 SAAE — eaaaeaaaaaadadaaa Ss pescada tenra adeneneaaa 8 o. aaa a nara aa ara aara ATA aa mm aaa Nasa IN IN nr VEÍCULO SXN101000 Tratamento d FIG. 6 120 m VEÍCULO vw 110 4 SXN101000 ret E 100 . o - E 290 REA o DT 80 Fedek 2 x EO A E 7 o = o
E go so 2x õ 30 20 o NOT OO > o SO A SS
ST IS IS SE IS SE IT IV QN SE
= 17 £ = E | Da: 8 À i À o | : | [ SC 7 d a | || n 1 go f | : ! há || À h H [1 i dx IA ANAL A Nf, Ja E Wi À E Be Ik NU Na JUV + A RRAEELRA 14d PIER. falaria pet MA Mt * lado FARA PENTA: E Ao, DARIA FIG. 7a =. ATE ASS ASSES Hora do relógio - º 200 — 1 £ o 15
E Q 125 o = É 100 o & 75 x O so ” | | À) AA Ô A ea OA rala DARIA Li Dbstes A ASR AA na ade rs SP AS RARA NARA SD EEN FIG. 7b
AMRS AARRA AISNE Hora do relógio 175
E o
E
Ê = | 7s | à | 2 5 À Â õ | Ih | jo 257 VA) ; À e o Bo ALA era Pts ionoaeiTaÇ oO ANA o FIG. 7c
SRU AA ASS A SORES Hnra dao relágiio
BRC10915888A 2008-06-12 2009-06-11 polipetídeo, seu método de ativação, sequência de ácido nucléico codificando o mesmo e seu uso BRPI0915888E2 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0810785A GB0810785D0 (en) 2008-06-12 2008-06-12 Suppression of neuroendocrine diseases
GB0810785.6 2008-06-12
GB0810782.3 2008-06-12
GBGB0810782.3A GB0810782D0 (en) 2008-06-12 2008-06-12 Suppression of cancers
GB0820884.5 2008-11-14
GB0820884A GB0820884D0 (en) 2008-11-14 2008-11-14 Suppression of neuroendocrine diseases
GB0820965A GB0820965D0 (en) 2008-11-17 2008-11-17 Suppression of cancers
GB0820965.2 2008-11-17
PCT/GB2009/050665 WO2009150469A2 (en) 2008-06-12 2009-06-11 Suppression of neuroendocrine diseases

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BRPI0915888A2 true BRPI0915888A2 (pt) 2020-06-30
BRPI0915888E2 BRPI0915888E2 (pt) 2020-09-01

Family

ID=41417177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRC10915888A BRPI0915888E2 (pt) 2008-06-12 2009-06-11 polipetídeo, seu método de ativação, sequência de ácido nucléico codificando o mesmo e seu uso

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20110171191A1 (pt)
EP (3) EP2310028B1 (pt)
JP (2) JP5728380B2 (pt)
KR (1) KR101642363B1 (pt)
CN (2) CN104328100B (pt)
AU (1) AU2009259033B2 (pt)
BR (1) BRPI0915888E2 (pt)
CA (1) CA2727082C (pt)
ES (2) ES2614990T3 (pt)
IL (1) IL209855A (pt)
WO (1) WO2009150469A2 (pt)
ZA (1) ZA201008536B (pt)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008232709C1 (en) 2007-03-28 2015-01-15 President And Fellows Of Harvard College Stitched polypeptides
US10466245B2 (en) 2008-02-20 2019-11-05 The Secretary Of State For Health Covalently linked thermostable kinase for decontamination process validation
GB0803068D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Health Prot Agency Cross-linked biological indicator
CA2727082C (en) * 2008-06-12 2019-02-26 Syntaxin Limited Fusion proteins for use in suppression of acromegaly
GB0820970D0 (en) * 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
KR20170058446A (ko) 2010-08-13 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티도미메틱 거대고리
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins
AR088392A1 (es) 2011-10-18 2014-05-28 Aileron Therapeutics Inc Macrociclos peptidomimeticos
HK1205454A1 (en) 2012-02-15 2015-12-18 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
CA2862038C (en) 2012-02-15 2021-05-25 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles
BR112015009470A2 (pt) 2012-11-01 2019-12-17 Aileron Therapeutics Inc aminoácidos dissubstituídos e seus métodos de preparação e uso
EP3194618B1 (en) 2014-09-15 2021-04-21 Clifton Life Sciences LLC Compositions, methods and kits for diagnosis of a gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasm
WO2016049359A1 (en) 2014-09-24 2016-03-31 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
WO2016061583A1 (en) * 2014-10-17 2016-04-21 University Of Virginia Patent Foundation Compositions and methods for treating pituitary tumors
US10253067B2 (en) 2015-03-20 2019-04-09 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
TW201814045A (zh) 2016-09-16 2018-04-16 英商艾普森生物製藥有限公司 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
WO2018060351A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Ipsen Biopharm Limited Hybrid neurotoxins
EP3312290A1 (en) 2016-10-18 2018-04-25 Ipsen Biopharm Limited Cellular vamp cleavage assay
EP3375871A1 (en) * 2017-03-13 2018-09-19 SIT Biotech GmbH Selective cell death-inducing enzyme system
JOP20190276B1 (ar) * 2017-05-31 2024-04-18 Napo Pharmaceuticals Inc طرق وتركيبات لعلاج إسهال الحمض الصفراوي، والإسهال المرتبط باستئصال الأمعاء الدقيقة أو إزالة المرارة، ومتلازمة الأمعاء القصيرة
UA128185C2 (uk) 2018-01-29 2024-05-01 Іпсен Біофарм Лімітед Ботулінічний нейротоксин, який розщеплює ненейронний snare
GB201900621D0 (en) 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
CN110801512B (zh) * 2019-11-15 2023-07-18 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 一种用于促进哲罗鲑性腺成熟的多肽及其应用
CN111388651B (zh) * 2020-05-09 2022-05-03 山东大学齐鲁医院 Cst-14在制备骨质疏松症治疗药物中的应用
CN113257370B (zh) * 2021-05-12 2022-09-02 中国医学科学院北京协和医院 基于临床病理基本信息和vista检测的pnet复发风险预测模型
WO2025155896A1 (en) * 2024-01-19 2025-07-24 Sling Therapeutics, Inc. Use of inhibitors of insulin-like growth factor receptor-1 for growth hormone igf-secreting neoplasias

Family Cites Families (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4291022A (en) 1975-03-11 1981-09-22 Sandoz Ltd. Organic compounds
US4133782A (en) 1976-06-07 1979-01-09 The Salk Institute For Biological Studies Somatostatin analogs with dissociated biological activities
US4190575A (en) 1977-12-27 1980-02-26 American Home Products Corporation Polypeptides related to somatostatin
IT1105131B (it) 1977-06-08 1985-10-28 Merck & Co Inc Peptidi analoghi della somatostatina dotati di piu' lunga e maggiore attivita' biologica e relativo procedimento di protezione
US4211693A (en) 1977-09-20 1980-07-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides with para-substituted phenylalanine
LU78191A1 (de) 1977-09-28 1979-05-25 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von neuen cyclopeptiden
JPS5819669B2 (ja) 1978-10-28 1983-04-19 白井松新薬株式会社 新規生理活性ペプチド化合物及びその製造法
US4190648A (en) 1979-03-13 1980-02-26 Merck & Co., Inc. Peptides having somatostatin activity
US4316890A (en) 1979-03-16 1982-02-23 Ciba-Geigy Corporation Peptides and processes for the manufacture thereof
US4328214A (en) 1979-07-04 1982-05-04 Ciba-Geigy Corporation Cyclopeptides and pharmaceutical preparations thereof and also processes for their manufacture
US4310518A (en) 1979-10-31 1982-01-12 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4235886A (en) 1979-10-31 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4369179A (en) 1979-12-14 1983-01-18 Ciba-Geigy Corporation Acylpeptides
US4282143A (en) 1980-06-13 1981-08-04 American Home Products Corporation Octapeptides lowering growth hormone
US4360516A (en) 1981-04-13 1982-11-23 Merck & Co., Inc. Modified D-retro cyclic hexapeptide somatostatin analogs
ATE14226T1 (de) 1981-12-24 1985-07-15 Ciba Geigy Ag Cyclische octapeptide und pharmazeutische praeparate davon, sowie verfahren zur herstellung derselben und ihre anwendung.
FR2522655B1 (fr) 1982-03-05 1987-03-06 Sanofi Sa Analogues de la somatostatine possedant une liaison du type hydrazide et medicaments en contenant
US4522813A (en) 1983-10-27 1985-06-11 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4659693A (en) 1984-04-30 1987-04-21 Syntex (U.S.A.) Inc. N,N'-dialkyl substituted guanidino amino acyl residue substituted GRF-analog peptides
US4632979A (en) 1984-06-18 1986-12-30 Tulane Educational Fund Therapeutic LHRH analogs
US4684620A (en) 1984-09-04 1987-08-04 Gibson-Stephens Neuropharmaceuticals, Inc. Cyclic polypeptides having mu-receptor specificity
US5003011A (en) 1985-04-09 1991-03-26 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic decapeptides
US4725577A (en) 1985-04-25 1988-02-16 Administrators Of The Tulane Educational Fund Biologically active lysine containing octapeptides
US4650787A (en) 1985-04-25 1987-03-17 Schally Andrew Victor Biologically active octapeptides
US4585755A (en) 1985-04-29 1986-04-29 Merck & Co., Inc. Cyclic and bridged cyclic somatostatin analogs useful as local anti-inflammatory agents
US4904642A (en) 1985-09-12 1990-02-27 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic somatostatin analogs
US4853371A (en) 1986-06-17 1989-08-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic somatostatin analogs
US4803261A (en) 1986-06-27 1989-02-07 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide
NL194729C (nl) 1986-10-13 2003-01-07 Novartis Ag Werkwijze voor de bereiding van peptidealcoholen via vaste fase.
US4871717A (en) 1987-01-07 1989-10-03 Administrators Of The Tulane Educational Fund Peptides
JP2795449B2 (ja) 1987-09-24 1998-09-10 ジ・アドミニストレーターズ・オブ・ザ・ツーレイン・エデュケイショナル・ファンド 治療用ペプチド
US5084555A (en) 1989-08-21 1992-01-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund An octapeptide bombesin analog
JPH03502328A (ja) 1988-02-01 1991-05-30 ジ・アップジョン・カンパニー 極性末端基類を有するレニン抑制ペプチド類
ZA895838B (en) 1988-08-18 1991-03-27 Syntex Inc Pharmaceutical compounds
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE68928667T2 (de) 1988-10-14 1998-10-01 Univ Tulane Peptide als arzneimittel
US5171835A (en) 1988-10-21 1992-12-15 The Administrators Of The Tulane Educational Fund LHRH antagonists
CA2012115C (en) 1989-03-15 2001-07-03 Biomeasure, Inc. Iodinated somatostatins
JP2882679B2 (ja) 1989-04-26 1999-04-12 ジ・アドミニストレーターズ・オブ・ザ・ツーレイン・エデュケイショナル・ファンド 線状ソマトスタチン類似体
ES2091907T3 (es) 1989-12-08 1996-11-16 Univ Tulane Analogos octapeptidos de somatostina con una threonina en la sexta posicion.
DK0450461T3 (da) 1990-04-06 1995-10-23 Univ Tulane LHRH-analoger
EP0527914A4 (en) 1990-05-04 1993-08-11 The Administrators Of The Tulane University Educational Fund Novel synthetic grf analogs
EP0531342A1 (en) 1990-05-09 1993-03-17 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Cyclized and linear therapeutic peptides
IT1240643B (it) 1990-05-11 1993-12-17 Mediolanum Farmaceutici Spa Peptidi biologicamente attivi contenenti in catena 2-alchiltriptofano
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
HU207104B (en) 1991-01-25 1993-03-01 Biosignal Kutato Fejlesztoe Kf Process for producing new somatostatin analogs inhibiting tumour growth and pharmaceutical compositions comprising such compounds
US6083915A (en) 1991-05-10 2000-07-04 Biomeasure, Inc. Method for treating liver cancer
US5240561A (en) 1992-02-10 1993-08-31 Industrial Progress, Inc. Acid-to-alkaline papermaking process
AU3658093A (en) 1992-02-10 1993-09-03 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
US5656727A (en) 1992-09-15 1997-08-12 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Antagonists of LHRH
WO1994011397A1 (en) 1992-11-13 1994-05-26 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Ghrh agonists
AU5668894A (en) 1992-11-13 1994-06-08 The Administrators Of The Tulane Eductional Fund Ghrh agonists
GB9305735D0 (en) * 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
EP0788509B1 (en) 1993-08-09 2003-05-28 Societe De Conseils De Recherches Et D'applications Scientifiques S.A.S. Therapeutic peptide derivatives
US5550212A (en) 1993-12-17 1996-08-27 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity
AUPM985694A0 (en) 1994-12-02 1995-01-05 Farmer, Mostyn Golf training aid
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
ATE170873T1 (de) 1995-03-13 1998-09-15 Biomeasure Inc Bombesin-analogen
CA2218173A1 (en) 1995-04-14 1996-10-17 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Analogs of growth hormone-releasing factor
GB9508204D0 (en) * 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
MY147327A (en) 1995-06-29 2012-11-30 Novartis Ag Somatostatin peptides
US5942489A (en) 1996-05-03 1999-08-24 The Administrators Of The Tulane Educational Fund HGH-RH(1-29)NH2 analogues having antagonistic activity
GB9617671D0 (en) * 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
AU3215597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Biomeasure Incorporated Method of inhibiting fibrosis with a somatostatin agonist
US5968903A (en) 1998-05-07 1999-10-19 Biomeasure, Incorporated Inhibition of H. pylori proliferation
DK1084146T3 (da) 1998-05-13 2003-02-03 Biotecon Ges Fuer Biotechnologische Entwicklung & Consulting Mbh Hybridprotein til inhibering af degranuleringen af mastocyter og anvendelse deraf
ES2205849T3 (es) 1998-07-22 2004-05-01 Osprey Pharmaceuticals Limited Conjugados para tratar alteraciones inflamatorias y asociadas con daños tisulares.
JP2002521456A (ja) 1998-07-30 2002-07-16 ソシエテ・ドゥ・コンセイユ・ドゥ・ルシェルシュ・エ・ダプリカーション・シャンティフィック・エス・ア・エス ソマトスタチン類似体の使用法
US20040071736A1 (en) * 1998-08-25 2004-04-15 Health Protection Agency Methods and compounds for the treatment of mucus hypersecretion
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US6057422A (en) 1998-11-25 2000-05-02 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Antagonistic analogs of GH-RH inhibiting IGF-I and -II
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
US6358697B2 (en) 1999-04-21 2002-03-19 Children's Hospital Medical Center Intracellular pharmaceutical targeting
CZ20014297A3 (cs) 1999-06-04 2002-06-12 Societe De Conseils De Recherches Et D´Application Sloučenina, způsob vyvolání účinku agonisty receptoru pro neuromedin B a receptoru pro somatostain, farmaceutický prostředek a způsob léčení
HK1046020B (en) * 1999-08-25 2007-05-11 Allergan, Inc. Activatable recombinant neurotoxins
US20080032931A1 (en) * 1999-08-25 2008-02-07 Steward Lance E Activatable clostridial toxins
US20030180289A1 (en) * 1999-09-23 2003-09-25 Foster Keith Alan Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US7838008B2 (en) * 1999-12-07 2010-11-23 Allergan, Inc. Methods for treating diverse cancers
US6831059B2 (en) * 2000-10-20 2004-12-14 Allergan, Inc. Compositions and methods for treating gonadotrophin related illnesses
US6827931B1 (en) * 2000-10-20 2004-12-07 Allergan, Inc. Method for treating endocrine disorders
EP1599213A4 (en) * 2003-02-24 2009-07-15 Ira Sanders CELL MEMBRANE TRANSLOCATION OF SNARE R GUL S INHIBITORS, ASSOCIATED COMPOSITIONS AND PATHOLOGY TREATMENT PROCESSES
TW200517400A (en) * 2003-08-05 2005-06-01 Univ Tulane Antagonistic analogs of GH-RH (2003)
US7514088B2 (en) * 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
EP1982997B1 (en) * 2004-09-01 2012-08-08 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
PL1830872T3 (pl) * 2004-12-01 2011-09-30 Sec Dep For Health Białka fuzyjne
GB0426397D0 (en) * 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
GB0426394D0 (en) * 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
US8399400B2 (en) * 2004-12-01 2013-03-19 Syntaxin, Ltd. Fusion proteins
EP1871789B1 (en) * 2005-03-15 2013-11-06 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
ES2369558T3 (es) 2005-09-19 2011-12-01 Allergan, Inc. Toxinas clostridiales y toxinas clostridiales activables.
EP1834962A1 (de) 2006-03-15 2007-09-19 Biotecon Therapeutics GmbH PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin
AU2007272515B2 (en) * 2006-07-11 2013-09-26 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells
JP2009543558A (ja) 2006-07-11 2009-12-10 アラーガン、インコーポレイテッド 増強した転位置能力および増強したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素
CA2727082C (en) * 2008-06-12 2019-02-26 Syntaxin Limited Fusion proteins for use in suppression of acromegaly
JP5799397B2 (ja) * 2008-06-12 2015-10-28 イプセン・バイオイノベーション・リミテッドＩｐｓｅｎ Ｂｉｏｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 癌の抑制
US10057187B1 (en) 2015-05-27 2018-08-21 Amazon Technologies, Inc. Dynamic resource creation to connect client resources in a distributed system

Also Published As

Publication number Publication date
EP3590956A1 (en) 2020-01-08
AU2009259033A1 (en) 2009-12-17
CN102112145B (zh) 2014-07-30
KR101642363B1 (ko) 2016-07-25
WO2009150469A3 (en) 2010-07-15
EP2310028B1 (en) 2016-11-16
JP2014195454A (ja) 2014-10-16
AU2009259033B2 (en) 2013-11-07
EP2719392A1 (en) 2014-04-16
BRPI0915888E2 (pt) 2020-09-01
ZA201008536B (en) 2012-05-30
US20110171191A1 (en) 2011-07-14
CN102112145A (zh) 2011-06-29
JP5891258B2 (ja) 2016-03-22
CA2727082A1 (en) 2009-12-17
EP2719392B1 (en) 2019-07-24
ES2614990T3 (es) 2017-06-02
JP5728380B2 (ja) 2015-06-03
JP2011522560A (ja) 2011-08-04
CN104328100A (zh) 2015-02-04
CA2727082C (en) 2019-02-26
IL209855A0 (en) 2011-02-28
EP2310028A2 (en) 2011-04-20
IL209855A (en) 2013-09-30
ES2750651T3 (es) 2020-03-26
CN104328100B (zh) 2019-08-23
WO2009150469A2 (en) 2009-12-17
KR20110038017A (ko) 2011-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2750651T3 (es) Proteínas de fusión para uso en el tratamiento de acromegalia
US8796216B2 (en) Suppression of neuroendocrine diseases
JP5799397B2 (ja) 癌の抑制
ES2436816T3 (es) Proteínas de fusión no citotóxicas que comprenden muteínas de EGF
JP2012500018A5 (pt)
JP2016509997A (ja) 骨粗鬆症を抑制するための治療
AU2014200449B2 (en) Suppression of neuroendocrine diseases
HK40020225A (en) Suppression of neuroendocrine diseases
HK1154512B (en) Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
HK1154512A (en) Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
HK1190946B (en) Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
HK1190946A (en) Fusion proteins for use in the treatment of acromegaly
HK40007205A (en) Fusion proteins for use in the treatemnt of cancer
HK1152659A (en) Fusion proteins for use in the treatment of cancer
HK1152659B (en) Fusion proteins for use in the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: IPSEN BIOINNOVATION LIMITED (GB)

B03A Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette]

Free format text: ADDITIONAL INVENTOR'S CERTIFICATE:

B11A Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing

Free format text: ADDITIONAL INVENTOR'S CERTIFICATE:

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: IPSEN BIOINNOVATION LIMITED (GB)

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.

B11Y Definitive dismissal - extension of time limit for request of examination expired [chapter 11.1.1 patent gazette]

Free format text: ADDITIONAL INVENTOR'S CERTIFICATE:

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2599 DE 27-10-2020 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.

B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]