BRPI0916186B1

BRPI0916186B1 - vetor de plasmídeo e seu uso, vacina para febre amarela e para vírus de rna infeccioso e vírus atenuado vivo clonalmente purificado homogêneo e seu uso

Info

Publication number: BRPI0916186B1
Application number: BRPI0916186-4A
Authority: BR
Inventors: Peter M. Pushko; Igor Lukashevich
Original assignee: Medigen, Inc
Priority date: 2008-07-17
Filing date: 2009-07-17
Publication date: 2021-03-09
Also published as: WO2010008576A3; US9968672B2; HK1220720A1; US20180243404A1; ES2902787T3; US20140178430A1; BRPI0916186B8; EP2310510B1; WO2010008576A2; US20110243989A1; US10653769B2; US8691563B2; EP3992296A1; EP2977457A3; DK2310510T3; EP2977457B1; EP2310510A2; EP2310510A4; ES2544702T3; DK2977457T3

Abstract

VETOR, VÍRUS ATENUADO VIVO CLONALMENTE PURIFICADO, USO DOS DITOS VETOR E VÍRUS E VACINA PARA FEBRE AMARELA OU ENCEFALITE EQUINA VENEZUELANA. A presente invenção refere-se a vetores de iDNA e vacinas e métodos para uso dos mesmos. O iDNA gera vacinas atenuadas vivas em células eucarióticas in vitro ou in vivo para vírus de RNA patogênicos, particularmente vírus da febre amarela e vírus da encefalite equina venezuelana. Quando iDNA é injetado no recipiente de vacina, RNA de vírus atenuado vivo é gerado por transcrição in vivo nos tecidos do recipiente. Este inicia produção de vírus atenuado de progenia nos tecidos do recipiente de vacina, bem como indução de uma resposta imune efetiva que protege contra vírus não atenuado tipo selvagem.

Description

INTERESSES GOVERNAMENTAIS

[0001] Os inventores receberam material relacionado a matéria objeto deste pedido do governo dos Estados Unidos sob um acordo consoante a 15 U.S.C. § 3710a, consequentemente o governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos na matéria objeto.

CAMPO

[0002] A presente invenção refere-se a vacinas virais atenuadas e sistemas e métodos para produção e administração de tais vacinas. ANTECEDENTES

[0003] Na discussão que se segue, referência é feita a certas estruturas e/ou métodos. Contudo, as seguintes referências não devem ser construídas como uma admissão que estas estruturas e/ou métodos constituem técnica anterior. As Requerentes reservam expressamente o direito a demonstrar que tais estruturas e/ou métodos não se qualificam como técnica anterior.

[0004] Muitos vírus de RNA, incluindo vírus da Febre Amarela (YF) e vírus da Encefalite Equina Venezuelana (VEE), são patogenias humanas perigosas. O VEE é uma Patogenia de Prioridade de Categoria B e YF é uma Patogenia de Prioridade de Categoria C conforme categorizado por NIH/NIAED.

[0005] O vírus da VEE é um arbovírus de RNA de trançado simples positivo que pertence ao gênero Alphavirus da família Togaviridae. O vírus é transmitido principalmente por mosquitos, que mordem um animal infectado e, em seguida, mordem e se alimentam de outro animal ou humano. O VEE atualmente é raro nos Estados Unidos. Um epizo- ótico maior em cavalos ocorreu no Texas, mas somente cerca de 100 casos confirmados em laboratório em humanos foram documentados. Contudo, a mudança do clima pode favorecer o estabelecimento do vírus nas áreas mais quentes dos Estados Unidos. Adicionalmente, o VEE é uma arma biológica potencial e agente de bioterrorismo.

[0006] O vírus da YF é também um arbovírus de RNA de trançado simples positivo. Contudo, diferente do VEE, o vírus da YF pertence a família Flaviviridae. A doença da YF ocorre na maioria na África e América do Sul. A infecção humana começa após a deposição de partículas virais através de sldn por um mosquito infectado. A doença é frequentemente severa. Casos mais moderados podem ocorrer como um resultado de infecção prévia por outro flavivírus. Existe uma diferença entre deflagrações de doença em áreas rurais ou florestais e em áreas urbanas (Barnett, 2007). As deflagrações de doença em cidades e pessoas não nativas podem ser mais sérias devido às densidades mais altas de vetores de mosquito e densidades de população mais altas. Como 2001, a Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que o vírus da YF causa 200.000 doenças e 30.000 mortes todo ano nas populações não vacinadas. Em muitos casos, a terapia suportativa é requerida para pacientes com YF. A substituição de fluido, transfusão de derivados de sangue, e outras medidas são usadas em casos severos.

[0007] Vírus atenuados vivos foram desenvolvidos para servir como vacinas para muitos vírus de RNA tais como vírus de VEE e YF, vírus de poliomielite, influenza, sarampo, caxumba, raiva e rubéola. As vacinas de vírus atenuados vivos tradicionais compreendem os vírus de RNA atenuados vivos que são injetados no recipiente de vacina. Os vírus injetados distribuem seu genoma de RNA nas células, que resulta na produção de antígenos virais, bem como vírus atenuados de progenia nos tecidos do recipiente da vacina. Isto conduz a indução de uma resposta imune que protege contra os vírus não atenuados de contrapartes.

SUMÁRIO

[0008] Este pedido proporciona vetores compreendendo DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa e um promotor de RNA polimerase, onde o DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa é operavelmente ligado ao promotor de RNA polimerase e a molécula de RNA infecciosa codifica um vírus da Febre amarela (YF). Em certas concretizações, o vírus da YF é não patogênico. Também descritas são vacinas para Febre amarela (YF) compreendendo os vetores descritos acima, e métodos para uso das vacinas para imunizar contra um vírus da YF. Também descritos são vírus atenuados vivos purificados clonalmente homogêneos preparados de células cultivadas transfectadas com o vetor, vacinas para YF compreendendo os mesmos, e métodos para uso das vacinas para imunizar contra um vírus da YF.

[0009] Este pedido também proporciona vetores compreendendo DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa e um promotor de RNA polimerase, onde o DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa é operavelmente ligado ao promotor de RNA polimerase e a molécula de RNA infecciosa codifica um vírus da Encefalite Equina Venezuelana (VEE). Em certas concretizações, o vírus da VEE é não patogênico. Também descritas são vacinas para Encefalite Equina Venezuelana (VEE) compreendendo os vetores descritos acima, e métodos para uso das vacinas para imunizar contra um vírus da VEE. Também descritos são vírus atenuados vivos purificados clonalmente homogêneos preparados de células cultivadas transfectadas com o vetor, vacinas para VEE compreendendo o mesmo, e métodos para uso das vacinas para imunizar contra um vírus da VEE.

[00010] Este pedido também proporciona vetores compreendendo um DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa e um promotor de citomegalovírus (CMV) RNA polimerase, onde o DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa é operavelmente ligado ao promotor de CMV RNA polimerase, o promotor de CMV RNA polimerase é localizado de cerca de 12 a cerca de 18 resíduos de ácido nucleico a montante da extremidade 5' de referido DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa, e a molécula de RNA infecciosa codifica um vírus de RNA atenuado. Em certas concretizações, o vírus de RNA atenuado é um alfavírus ou um flavivírus.

[00011] Este pedido também proporciona métodos para atenuação de um vírus de RNA, compreendendo inserir dois promotores de RNA dependentes de RNA no cDNA que codifica o vírus de RNA, pelo que o nucleocapsid e glicoproteínas são separadamente expressos de promotores independentes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00012] Figura 1. Representação esquemática de vacinas da VEE TC-83 baseadas em iDNA. (A) cDNA de comprimento total correspondente ao genoma TC-83 RNA é clonado no DNA contendo promotor de RNA polimerase dependente de DNA funcional, por exemplo, promotor de CMV. A localização de promotor de CMV, promotor 26S, poli-A, terminação de transcrição, e sequências de ribozima (opcional) são mostrados. (B) Exemplo da vacina TC-83 baseada em iDNA modificada, em que genes de TC-83 capsid e glicoproteína são expressos de promotores independentes. A localização dos promotores é mostrada. O local de partida de transcrição pode ser modificado pela variação da distância entre a extremidade 3' do promotor de CMV e a extremidade 5' da sequência de codificação de TC-83.

[00013] Figura 2. Administração da vacina de TC-83 iDNA em células in vitro ou in vivo. A injeção da vacina de TC-83 DNA sob controle de promotor de RNA polimerase dependente de DNA (vide figura 1) em células in vitro ou in vivo é mostrada. Como um resultado de administração de vacina de TC-83 iDNA, a vacina de vírus atenuado vivo TC-83 é gerada. Se administrada in vivo, a produção de vacina de TC-83 nos tecidos do paciente induz resposta imune à vacina de TC-83.

[00014] Figura 3. Representação esquemática de vacina de YF17D baseada em iDNA. cDNA de comprimento total correspondente ao genoma 17D RNA é clonado em DNA contendo promotor de RNA polimerase funcional, por exemplo, promotor de CMV. A localização de promotor de CMV, poli A, terminação de transcrição, e sequências de ribozima são mostrados.

[00015] Figura 4. Administração da vacina YF17D iDNA recombinante em células in vitro ou in vivo. Injeção da vacina 17D iDNA contendo YF17D cDNA sob controle de promotor de RNA polimerase dependente de DNA em células in vitro ou in vivo é mostrada. Como um resultado de administração de vacina 17D iDNA, a vacina de vírus atenuado vivo 17D é gerada. Se administrada in vivo aos tecidos de recipiente de vacina, a produção de vacina YF17D nos tecidos do paciente conduz a indução de resposta imune à vacina 17D.

[00016] Figura 5. Ensaio de imunofluorescência (IFA) de células de CHO transfectadas com (A) vacina VEETC-83 iDNA, Clone 13-2 (Figura 6); e (B) p3-10 DNA que expressa proteínas estruturais TC-83 (controle). Foco de células TC-83-positivas é visível no painel (A), onde o painel (B) mostra células TC-83-positivas individuais. As células são transfectadas com vacina de DNA usando reagente de transfecção Fugene 6 ou um método de transferência de gene similar. As células transfectadas são incubadas a 37°C em 5% de incubadora de CO2. Em seguida á 24 horas de incubação, as células são fixadas com acetona fria, e IFA é feita usando-se anticorpo de coelho específico para antígeno de TC-83. Em seguida, as células são incubadas usando-se anticorpo conjugado de rodamina para IgG de Coelho e observadas usando-se microscopia fluorescente.

[00017] Figura 6. Fragmento de sequência de iDNA de plasmídeo de pAA_TC83 (Clones #13-1; 13-2) contendo o TC-83 cDNA a jusante de promotor de CMV (SEQ ID NO: 1). As localizações de promotor de CMV, promotor 26 S, e local de poliA são indicadas.

[00018] Figura 7. Fragmento de sequência de iDNA de plasmídeo de pAA_TC-83_C_GP modificado (Clone #12) contendo dois promotores TC-83 26S (SEQ ID NO: 2). As localizações de promotor de CMV, promotores 26 S, e local poliA são indicadas.

[00019] Figura 8. Fragmento de sequência de iDNA de pCMV_YF17D contendo o YF17D cDNA a jusante de promotor de CMV e hepatite uma ribozima e terminação de transcrição de BGH e cassetes de poliadenilação a jusante da extremidade 3'da sequência de YF17D (SEQ ID NO: 3).

[00020] Figura 9. Otimização da distância entre a extremidade 3'do promotor de CMV e a extremidade 5'do TC-83 cDNA por ensaio de encapsidação usando vetores HA- ou N- e auxiliadores-c de DNA.

[00021] Figura 10. Transfecção de células de CHO com TC-83 iDNA #13-1 (tipo selvagem) resulta em expressão rápida de antígeno de TC- 83 em células de CHO.

[00022] Figura 11. Transfecção de células de CHO com TC-83 iDNA #12 (promotor 26S duplo) resulta em expressão retardada de antígeno de TC-83 em células de CHO.

[00023] Figura 12. Vírus TC-83 gerados de clones infecciosos in vitro são avirulentos em camundongos BALB/c. Vírus TC-83 clonados são gerados por transfecção de células de CHO usando eletroporação com clones de cDNA de vacina TC-83 infecciosos #12 e #13-1. Os vírus são inoculados em camundongos de acordo com protocolo USAMRIID padrão (Dr. Michael Parker, USAMRI1D, Ft. Detrick, MD).

[00024] Figura 13. Oligonucleotídeos sintéticos de comprimentos variados (SEQ IDNOS: 4-14, do topo para o fundo) para criar uma série de plasmídeos "capsid iDNA" em que a distância entre o promotor e o iDNA varia de 8 a 25 pares bases (vide Exemplo 8). O A capitalizado e em negrito mostra a extremidade 5' da sequência de VEE (em TC-38, o códon de partida é ATA preferivelmente do que ATG; vide os nucleotídeos ATA nas posições 704-706 em SEQ ID NO: 1).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00025] Aqui descritas estão composições para indução de uma resposta imune ou uma imunidade protetora contra vírus da Febre amarela (YF) ou vírus da Encefalite Equina Venezuelana (VEE). Em uma concretização, as composições compreendem vacinas para prevenção e/ou tratamento de doenças associadas a vírus de YF ou VEE. Também descritos são métodos de produção, uso e teste das mesmas.

[00026] Vacina TC-83 derivada de cultura de célula atenuada viva para VEE foi desenvolvida previamente. TC-83 contém atenuação de mutações (Kinney et al., 1993). A vacina TC-83 atual é totalmente licenciada para uso veterinário em cavalos e foi usada bem sucedidamente durante epizo-ótico do Texas em 1970-1971. A vacina foi também aprovada para uso em pessoas como uma Droga Nova Investigacional (IND). A vacina TC-83 proporciona proteção contra muitas cepas epizo-óticas. A vacina TC-83 foi usada como parte de programas de segurança e foi importante na proteção de indivíduos que trabalham com animais infectados e preparações de vírus. Até aqui, a vacina foi administrada a ~9.000 pessoas. Outra vacina de IND humana, C-84, foi preparada de vacina TC-83 inativada por formalina. Devido á história de uso bem sucedido como uma vacina em pessoas, a vacina TC-83 é também um vetor de vacina promissor que pode ser usado como um transportador de genes relevantes de vacina ou terapêuticos (Pushko P., Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2006/0198854, Plataformas de vetor derivadas das vacinas de alfavírus).

[00027] Devido à não existir terapia específica para YF, a vacinação é a única contramedida médica efetiva. A vacina de YF atual é uma preparação de vírus atenuado vivo produzida da cepa de vírus 17D YF (Smithburn et al., 1956). As vacinas de vírus 17D vivo foram consideradas serem seguras e efetivas (Monath, 2001). O vírus de vacina 17D YF é a fundação para ambas as linhagens 17D-204 e 17DD. A vacina 17D-204 é usada nos Estados Unidos e Austrália, onde a vacina 17DD é usada no Brasil. O sequenciamento revelou que os tipos de vacina 17D-204 e 17DD não são idênticos, que refletem acúmulo de mutações genéticas durante passagens múltiplas de sementes de vírus. Com registro de segurança em humanos, o YF17D é também um vetor promissor para o desenvolvimento de vacinas contra patogenias relacionadas a flavivírus (por exemplo, vacinas à base de YF17D quimérico contra encefalite japonesa, dengue, e vírus de West Nile (Pugachev et al, 2005), bem como contra patogenias fora do gênero flavivírus tal como malária (Tao et al., 2005) e vírus Lassa (Bredenbeek et al., 2006).

[00028] Aqui descritas estão moléculas de iDNA que expressam o genoma de RNA de vírus atenuados vivos e métodos para uso das mesmas. Em certas concretizações, quando iDNA é injetado nas células cultivadas in vitro, o RNA de vírus atenuado vivo é gerado nas células por transcrição in vivo. Isto inicia produção de vírus atenuado por progenia no meio de células cultivadas. Tal vírus atenuado vivo clonalmente puro pode ser usado para vacinação como vacina atenuada viva homogênea aperfeiçoada. Em outras concretizações, quando iDNA é injetado nas células de um recipiente de vacina, RNA de vírus atenuado vivo é gerado por transcrição in vivo nos tecidos. Isto inicia produção de vírus atenuado por progenia nos tecidos de recipiente de vacina, bem como indução de resposta imune efetiva para vírus atenuado vivo. Similarmente a qualquer DNA, o iDNA pode ser produzido em células bacteriais e representa uma molécula estável.

[00029] Em certas concretizações, as moléculas de iDNA são vetores compreendendo DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa, onde a molécula de RNA infecciosa por sua vez codifica um vírus da YF ou um vírus da VEE. O DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa pode ser operavelmente ligado a um promotor de RNA polimerase, e é geralmente modificado para codificar um vírus não patogênico (atenuado) de YF ou VEE.

[00030] Em certas concretizações, as moléculas de iDNA (DNA infeccioso) compreendem o cDNA de VEE TC-83 ou o cDNA de YF YF17D. Por exemplo, uma vacina de VEE à base de iDNA exemplar compreende uma molécula de DNA que contém a cópia de cDNA completa do genoma de RNA do vírus atenuado vivo de TC-83. Nesta molécula de iDNA, o cDNA de TC-83 é colocado a jusante de um promotor de RNA polimerase, tal como o promotor de CMV. Quando tal molécula de iDNA é introduzida em células in vitro, o RNA viral de TC- 83 é gerado nas células. O RNA de TC-83 resultante é "infeccioso" e inicia produção da vacina de vírus atenuado vivo de TC-83 nas células. Tal vacina de vírus de TC-83 pode ser coletada de células cultivadas e usadas para vacinação de acordo com as práticas atuais. Em certas concretizações, a vacina que é gerada do iDNA de TC-83 representa vírus de progenia homogêneo gerado da mesma, bem caracterizado, de DNA estável. Devido ao mesmo, iDNA clonalmente purificado é usado para a produção dos lotes de vacina, tal vacina terá em certas concretizações maior uniformidade e consistência lote a lote comparada a vacinas atuais, que podem acumular mutações durante passagens de vírus.

[00031] Alternativamente, vacina de iDNA contendo o cDNA de TC- 83 pode ser administrada ao recipiente de vacina diretamente. Tal administração de iDNA ao recipiente de vacina inicia a produção da vacina de vírus de TC-83 nos tecidos do paciente in vivo, que proporciona vacinação bem sucedida contra VEE.

[00032] Similarmente, vacinas de YF à base de iDNA podem compreender uma molécula de DNA que contém a cópia de cDNA do genoma de RNA do vírus atenuado vivo YF17D. Nesta molécula de iDNA, a cópia de YF17D cDNA pode ser colocada a jusante de um promotor de RNA polimerase, por exemplo, o promotor de citomegalovírus (CMV). Quando tal molécula de iDNA é introduzida nas células in vitro ou administrada diretamente aos tecidos de recipiente de vacina in vivo, o RNA viral 17D é gerado por transcrição do promotor de RNA polimerase. O RNA de YF17D resultante é infeccioso e inicia produção da vacina atenuada viva de YF17D. Quando injetado nos tecidos de um recipiente de vacina in vivo, tal iDNA à base de YF17D proporciona vacinação bem sucedida do paciente contra YF.

[00033] O cDNA de TC-83 ou YF17D pode ser modificado para assegurar atenuação suficiente e/ou introduzir outras características, enquanto ainda mantendo infectividade e o efeito terapêutico desejado. Em certas concretizações, o cDNA é modificado por inserção, anulação e/ou substituição de um ou mais dos nucleotídeos na sequência de cDNA de TC-83 ou YF17D. Por exemplo, o cDNA modificado pode ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% de identidade de sequência com a sequência de TC-83 ou YF17D, tal como pelo menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência.

[00034] Exemplos de cDNAs modificados incluem um DNA tendo um promotor 26S adicional no Clone 12 de iDNA TC-83 modificado (vide exemplo 3, Tabela I). Esta modificação diminui o desenvolvimento de TC-83-positivo foci, que é um sinal de atenuação adicional causada por inserção do promotor 26S adicional nesta construção (Figura 1, B). Tal atenuação adicional pode aperfeiçoar a vacina de TC-83 e reduzir efeitos adversos associados com esta vacina. Neste exemplo, um promotor 26S adicional pode ser inserido de modo que o TC-83 nucleocapsid e glicoproteínas são gerados de promotores independentes (Figura IB). Desse modo, o promotor 26S de TC-83 é duplicado, e o capsid e glicoproteínas são gerados a partir dos dois promotores 26S. Outra modificação pode ser feita para aumentar a estabilidade do iDNA em E.coli ou em células alvos, ou aumentar a estabilidade de iDNA em células de E.coli.

[00035] Adicionalmente, outros genes ou fragmentos de gene, incluindo material genético de outros alfavírus, ou de fontes não relacionadas tais como outros vírus, bactérias, micro-organismos, outros organismos, plantas, animais, ou/e humano podem ser inseridos no iDNA. Em tais casos, o iDNA de TC-83 ou YF17D modificado pode servir como um vetor para expressão de genes heterólogos in vitro ou in vivo.

[00036] Aqui descritos estão vetores especializados para preparação de vacinas de iDNA. Contudo, será apreciado pelo versado na técnica que o iDNA aqui descrito pode ser formado usando-se qualquer vetor adequado. Em geral, um vetor é uma molécula de ácido nucleico (tipicamente DNA ou RNA) que serve para transferir uma sequência de ácido nucleico passageira (isto é, DNA ou RNA) em uma célula hospedeira. Três tipos comuns de vetores incluem plasmídeos, fagos e vírus. Em uma concretização exemplar, o vetor é um plasmídeo. As presentes vacinas de iDNA podem ser compreendidas de DNA que é produzido como um plasmídeo que pode ser introduzido em tecido de animal e neste é expresso por células de animal para produzir uma molécula de ácido ribonucleico mensageira (rnRNA) aproximadamente o tamanho do genoma de YF ou VEE, que é traduzido para produzir poliproteínas virais. As poliproteínas virais por sua vez são processadas por maquinaria celular para proporcionar um conjunto total de proteínas de YF ou VEE que são capazes de iniciar replicação do transcrito de RNA primário acima e, desse modo, iniciar o ciclo de replicação do vírus no tecido animal em que o plasmídeo de DNA acima foi introduzido.

[00037] Vetores de plasmídeo adequados e exemplares que foram usados em vacinas de DNA convencionais incluem, mas não são limitados a, pBR322 (ATCC# 31344); pUC19 (ATCC# 37254); pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad Calif. 92008; Cat. NO. V385-20); pNGVL (National Gene Vetor Laboratory, University of Michigan, Mich.); p414cyc (ATCC# 87380), p414GALS (ATCC# 87344), pBAD18 (ATCC# 87393), pBLCATS (ATCC# 77412), pBluescriptUKS, (ATCC# 87047), pBSL130 (ATCC# 87145), pCM182 (ATCC# 87656), pCMVtkLUC (ATCC# 87633), pECV25 (ATCC#77187), pGEM-7zf (ATCC# 87048), pGEX-KN (ATCC# 77332), pJC20 (ATCC# 87113, pUBllO (ATCC# 37015), pUB18 (ATCC# 37253).

[00038] O iDNA aqui descrito está também sob o controle de um promotor adequado. Para expressão eucariótica, exemplos de promotores adequados incluem o promotor anteriormente citomegalovírus ("CMV"), o promotor LTR de vírus de sarcoma de Rous ("RSV"), e o promotor de SV40.

[00039] Os seguintes descrevem métodos exemplares para produção de vetores de iDNA e vacinas:

[00040] O fragmento de cDNA correspondente ao RNA TC-83 de comprimento total é derivado por transcrição reversa e reação de cadeia de polimerase (RT-PCR) pelo uso do RNA viral TC-83 e os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de sequência de TC-83. O RNA viral TC-83 é extraído da vacina de TC-83 usando-se extração de fenol ou outros métodos. Os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de TC- 83 podem conter elementos funcionais adicionais, incluindo, mas não limitados a, locais de enzima de restrição, terminadores de transcrição, sinais de poliadenilação, ribozimas, etc.

[00041] Alternativamente, dois ou mais fragmentos de cDNA envolvendo o RNA TC-83 total são gerados usando-se RT-PCR. Então, tais fragmentos de cDNA são montados dentro de um plasmídeo simples de modo que eles compreendem o cDNA de comprimento total correspondente ao RNA TC-83 de comprimento total, conforme descrito no parágrafo anterior.

[00042] Alternativamente, o cDNA TC-83, conforme descrito nos parágrafos anteriores, é gerado pelo uso de síntese química ou uma combinação de síntese química ou/e PCR ou/e RT-PCR.

[00043] O fragmento de cDNA correspondente ao RNA de comprimento total é clonado no DNA contendo um promotor de RNA polimerase funcional, por exemplo, promotor de CMV (Figura 1A). Um exemplo de tal sequência de iDNA recombinante resultante é mostrado (Figura 6). Como um resultado de transcrição in vitro ou in vivo de tal iDNA, RNA TC-83 infeccioso funcional contendo uma ou mais mutações atenuantes é gerado. A distância entre o promotor e o cDNA TC-83 pode ser otimizada para assegurar o nível desejado de expressão de RNA. Em certas concretizações, a distância entre a GAGCTC 3'-extremidade do promotor de CMV (indicada no nucleotídeo (nt) 687 com uma seta na Figura 6), e a 5'-extremidade do cDNA TC-83 (indicada no nucleotídeo 703 com outra seta na figura 6), é 15(±3) pares bases (bp). Isto permite transcrição eficiente e produção de RNA TC-83. Para comparação, de acordo com Invitrogen, o local de partida de transcrição de CMV estaria localizado em nt 697, que é 9 nt a partir da GAGCTC 3' extremidade do promotor de CMV dentro do plasmídeo pcDNA3.1(-). Similarmente, a 3' extremidade do cDNA TC-83 pode ser seguida por ribozimas, sequências de terminação de transcrição, poli-A, bem como outros nucleotídeos e sinais para assegurar produção ótima de RNA funcionalmente ativo. Em uma concretização preferida, a distância entre a 3' extremidade de cDNA TC-82 (nt 12170, Figura 6) e o local de poli- A é 184 bp e pode variar de entre 0 a cerca de 500 bp.

[00044] Alternativamente, o TC-83 nucleocapsid e glicoproteínas são expressos de promotores independentes (Figura IB).

[00045] O iDNA de plasmídeo recombinante resultante contendo o cDNA TC-83 sob controle do promotor de RNA polimerase (Figura 1A,B) é gerado e purificado de células de E. coli. O iDNA purificado é então introduzido nas células eucarióticas cultivadas, por exemplo, em células de ovário de hamster chinês (CHO), rim de hamster recém-nato (BHK- 21), ou outras células susceptíveis (Figura 2). O DNA é administrado às células por injeção, canhão de gene, eletroporação, transfecção de lipossomo, ou outro método de transferência de gene. Nas células, o RNA TC-83 infeccioso de comprimento total é gerado por transcrição, que inicia a produção de vírus atenuado vivo TC-83 em células cultivadas e liberação de vírus TC-83 no meio (Figura 2). O vírus TC-83 é coletado a partir das culturas, formulado e usado como uma vacina de VEE de acordo com a prática atual.

[00046] Alternativamente, o iDNA recombinante contendo o cDNA TC-83 (Figura 1) é introduzido no recipiente de vacina diretamente in vivo. O iDNA é administrado nos tecidos do recipiente de vacina por injeção, eletroporação, transfecção de lipossomo, canhão de gene, ou outro método de transferência genética. Nos tecidos de recipiente de vacina, o RNA TC-83 infeccioso de comprimento total é gerado por transcrição, que inicia produção de vírus atenuado vivo TC-83 in vivo. Os antígenos de vírus TC-83 são liberados das células in vivo nos tecidos, que inicia indução de resposta imune efetiva a vacina de TC- 83.

[00047] Similar ao iDNA TC-83 acima descrito, um YF17D iDNA inclui o YF17D cDNA. O YF17D cDNA de comprimento total é derivado do RNA viral de comprimento total ou montado de dois ou mais fragmentos ou sintetizado por meio químico conforme descrito acima para o TC-83. O YF17D cDNA de comprimento total é colocado sob o controle de um promotor de RNA polimerase funcional, conforme mostrado na figura 4A. Em certas concretizações, a distância entre a GAGCTC 3'-extremidade do promotor de CMV e a 5'-extremidade do cDNA TC-83 cDNA, é 15(±3) bp conforme descrito acima para TC-83. Isto permite transcrição eficiente e produção de YF 17D RNA. Ribozima, terminação de transcrição e cassetes de poli (A) são colocados conforme requerido a jusante da 3' extremidade do YF17D cDNA para assegurar transcrição e poliadenilação corretas de transcrições de YF17D RNA funcionais. Como um resultado de transcrição de YF17D iDNA in vitro ou in vivo, YF17D RNA infeccioso funcional (opcionalmente contendo uma ou mais mutações atenuantes adicionais) é gerado. Conforme visto na figura 4, a transfecção de células BHK-21 com um YF17D iDNA de comprimento total contendo YF17D cDNA sob controle do promotor de CMV resulta na transcrição de RNA infeccioso, translação, processamento pós-translacional correto de poliproteína, montagem e liberação de partículas de YF17D infecciosas.

[00048] Conforme notado acima, modificações podem ser feitas ao YF17D de comprimento total também construções de cDNA TC-83. A otimização de atenuação pode adicionalmente aperfeiçoar a vacina de YF17D iDNA e reduzir efeitos adversos incluindo doença viscerotrópica associada com vacinação de YF17D (Monath, 2007).

[00049] Em certas concretizações, os métodos aqui descritos compreendem administrar uma composição ou uma vacina de DNA compreendendo iDNA que codifica um vírus de YF ou VEE atenuado em um transportador farmacêutico aceitável a um indivíduo em necessidade desta.

[00050] A quantidade de iDNA presente nas composições ou nas vacinas de DNA aqui descritas é preferivelmente uma quantidade terapeuticamente ou farmaceuticamente efetiva. A "quantidade terapeuticamente efetiva" de iDNA é aquela quantidade necessária de modo que a sequência de nucleotídeo que codifica para o polipeptídeo de YF ou VEE realize seu papel imunológico sem causar efeitos negativos no hospedeiro ao qual a composição é administrada. A quantidade exata de plasmídeo a ser usado e a composição/vacina a ser administrada variará de acordo com fatores tais como a resistência dos promotores transcricional e translacional usados, o tipo de condição sendo tratada, o modo de administração, bem como outros ingredientes na composição. Em uma concretização, a composição ou a formulação de vacina compreende de cerca de 1 ng a cerca de 1 mg de plasmídeo.

[00051] A imunogenicidade das vacinas de DNA e composições farmacêuticas podem ser modificadas por formulação com um ou mais coadjuvantes farmaceuticamente aceitáveis ou imunoestimulantes, tais como alfa-interferon, beta-interferon, gama-interferon, fator estimulador de colônia de macrófago de granulócito ("GM-CSF"), fator estimulador de colônia de macrófago ("M-CSF"), interleucina 2 ("IL-2"), interleucina 12 ("IL-12"), e Coligonucleotídeos de pG. Para preparação de tais composições, métodos bem conhecidos na técnica podem ser usados. Em certas concretizações, o iDNA é gerado em células de E.coli como um DNA de plasmídeo, contendo motivos de CpG não-metilatados e se constitui uma molécula de imunoestimulação que ativa o sistema imune via receptores similares a toll.

[00052] Injeção subcutânea, introdução intradermal, impressão através da pele, e outros modos de administração tais como intraperitoneal, intravenoso, oral, ou distribuição por inalação são também adequados. Por exemplo, vetores contendo o iDNA podem ser introduzidos no hospedeiro desejado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, micropartículas, microcápsulas, transdução, fusão de célula, DEAE dextran, precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lipossomo, uso de um canhão de gene (bombardeio de partícula), ou um transportador de vetor de DNA (vide, por exemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu and Wu. 1988. J. Biol. Chem. 263:14621-14624).

[00053] Conforme aqui usado, o termo "tratando", "tratamento" e similares são usados aqui para significar geralmente obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado, e se referem a um processo pelo qual os sintomas de uma doença associada a YF ou VEE são completamente eliminados ou melhorados a qualquer grau clinicamente e/ou quantitativamente mensurável. O termo "prevenção" se refere a um processo pelo qual uma doença associada a YF ou VEE é obstruída e/ou retardada. As composições e vacinas aqui descritas compreendem iDNA (iDNA) capaz de produzir um vírus atenuado vivo. Em uma concretização, o vírus atenuado vivo é produzido in vivo.

[00054] Conforme aqui usado, o termo "resposta imune" inclui uma resposta de célula T, níveis de soro aumentados de anticorpos a um antígeno, a presença de anticorpos de neutralização a um antígeno (tal como um polipeptídeo de YF ou VEE), ou combinações destes. O termo "proteção" ou "imunidade protetora" inclui a capacidade dos anticorpos de soro ou resposta de célula T induzirem durante imunização para proteger (parcialmente ou totalmente) contra doença ou morte causada pelo vírus da YF ou VEE.

[00055] O "indivíduo" é um vertebrado, tal como um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, humanos, outros primatas, roedores, animais de fazenda, animais de esporte (cavalos, etc.) e animais domésticos. Em certas concretizações, o indivíduo é um humano. Em outras concretizações, os métodos encontram uso em animais experimentais (tais como espécies de macacos), em aplicação veterinária e/ou no desenvolvimento de modelos de animal para doença. Em certas concretizações, a vacina é uma vacina de VEE (tal como TC-83) e o indivíduo é um cavalo. Um "indivíduo em necessidade deste” se refere a qualquer indivíduo, paciente, ou indivíduo que pode se beneficiar dos métodos aqui descritos.

[00056] O termo dose "terapeuticamente (ou "farmaceuticamente") efetiva" ou quantidade "terapeuticamente (ou "farmaceuticamente") efetiva" significa uma dose ou quantidade que produz o efeito desejado para qual ela é administrada. A dose exata dependerá da proposta do tratamento, e será determinável por um versado na técnica que usa técnicas conhecidas.

[00057] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na Farmacopeia dos Estados Unidos ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente, em humanos.

[00058] O termo "transportador" se refere a um diluente, coadjuvante, excipiente, ou veículo com o qual o iDNA é administrado. Tais transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim, combinações destes e similares. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, glicerol monoestearato, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno glicol, água, etanol, combinações destes e similares. A composição, se desejado, pode também conter quantidades menores de agentes de umedecimento ou emulsificação, ou agentes de tamponamento de pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação sustentada, combinações destes e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes tradicionais e transportadores tais como triglicerídeos. Formulações orais podem incluir transportadores padrões tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, combinações destes, etc. Exemplos de transportadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin.

[00059] Desse modo, conforme aqui usado, o termo "transportador farmaceuticamente aceitável" significa, mas não é limitado a, um veículo para conter o iDNA que pode ser injetado em um hospedeiro mamífero sem efeitos adversos. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados conhecidos na técnica incluem, mas não são limitados a, partículas de ouro, água estéril, salina, glicose, dextrose, ou soluções tamponadas, combinações destes e similares. Os transportadores podem incluir agentes auxiliares incluindo, mas não limitados a, diluentes, estabilizadores (isto é, açúcares e amino ácidos), conservantes, agentes de umedecimento, agentes de emulsificação, agentes de tamponamento de pH, aditivos de intensificação de viscosidade, cores, combinações destes e similares.

[00060] Conforme aqui usado, as formas singulares "o", "um", e "a" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Desse modo, por exemplo, referência à "vacina" inclui uma pluralidade de tais vacinas e referência à "dosagem" inclui referência a uma ou mais dosagens e equivalentes destas conhecidas àquele versado na técnica, e assim por diante.

[00061] As publicações aqui discutidas são providas somente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui é para ser construído como uma admissão que a presente descrição não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da descrição anterior. Adicionalmente, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datas de publicação atuais, que podem necessitar de serem independentemente confirmadas. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outras referências aqui citadas são, desse modo, incorporados por referência.

[00062] Enquanto a descrição foi descrita em detalhes com referência a certas concretizações da mesma, será aparente a um versado na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregados, sem fugir do escopo da descrição. Em adição, os seguintes exemplos são ilustrativos dos métodos aqui descritos e não devem ser considerados como limitando a descrição precedente de qualquer modo. EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação de iDNA TC-83. RNA total é extraído da vacina de TC-83 usando-se extração de fenol.

[00063] O cDNA correspondente ao RNA TC-83 de comprimento total é derivado por transcrição reversa e reação de cadeia de polimerase (RT-PCR) usando-se RNA viral TC-83 extraído e os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de sequência de TC-83.

[00064] O fragmento de cDNA correspondente ao RNA TC-83 de comprimento total é clonado no vetor de plasmídeo pASP5 contendo um promotor de CMV funcional (Figura 1 A, Figura 6), que produz o iDNA TC-83, clone 13-1 e clone 13-2. A distância entre a 3' extremidade do promotor de CMV à 5'extremidade do cDNA TC-83 é 15 bp conforme mostrado na figura 6. Após transcrição de tal iDNA TC-83 in vitro ou in vivo por maquinaria de transcrição celular, RNA TC-83 funcional infeccioso e vírus TC-83 são gerados.

[00065] O iDNA TC-83 pode ser facilmente modificado para otimizar características funcionais, por exemplo, o nível de atenuação. Por exemplo, cDNA TC-83 modificado, clone 12, é gerado por duplicação do promotor 26S e colocação do segundo promotor 26S a montante dos genes de glicoproteína TC-83 (Figura IB, Figura 7). Em tal construção, o RNA que é gerado do promotor de CMV expressa o TC-83 capsid e glicoproteínas de promotores 26S independentes. De modo a assegurar expressão das proteínas TC-83 de tal RNA TC-83 modificado, mudanças apropriadas são feitas, por exemplo, códon de ATG é introduzido no 5' terminal dos genes de glicoproteína. O RNA de comprimento total que codifica cDNA de TC-83 modificado (Clone 12) é introduzido no vetor de plasmídeo reivindicado pASP5 contendo promotor de CMV funcional (Figura IB, Figura 7). A distância entre a 3' extremidade de promotor de CMV á 5'extremidade de cDNA TC-83 modificado é 15 bp conforme mostrado na figura 7. Exemplo 2. Preparação de YF17D iDNA.

[00066] RNA total é extraído da vacina YF17D usando extração de fenol ou um método similar. Os cDNAs correspondentes ao 17D RNA de comprimento total são derivados por transcrição reversa e reação de cadeia de polimerase (RT-PCR) usando RNA viral 17D extraído e os iniciadores de oligonucleotídeo específicos de sequência 17D. Alternativamente, o YF17D cDNA de comprimento total é montado de dois ou mais plasmídeos.

[00067] O fragmento de cDNA correspondente ao RNA de comprimento total é transferido no vetor de plasmídeo reivindicado pASP5 contendo promotor de CMV funcional (Figura 3), que resulta em YF17D iDNA (Figura 8). A distância entre a 3' extremidade de promotor de CMV à 5'extremidade de YF 17D cDNA é 15 bp conforme mostrado na Figura 8 e descrito acima para as construções de TC-83. Após transcrição de YF17D iDNA em células in vitro ou in vivo, YF17D RNA infeccioso funcional e vírus YF17D são gerados. Exemplo 3. Transfecção de células de CHO com vacina TC-83 iDNA.

[00068] DNA de plasmídeo contendo TC-83 iDNA é transfectado em células de CHO usando reagente de transfecção Fugene 6 (Roche Applied Sciences). Brevemente, células de CHO são crescidas em frascos de 75 cm2, em seguida enxaguadas com salina tamponada com fosfato (PBS) e tripsinizadas. A alíquota de suspensão de célula de CHO é transferida em placas de cultura de célula de 6 poços. Em seguida, mistura de DNA de plasmídeo e reagente Fugene 6 é adicionado de acordo com as instruções do fabricante. Como DNA de plasmídeo, as seguintes construções são usadas: (1) iDNA modificado de VEE TC-83, Clone 12 (Figura IB, Figura 7); (2) iDNA de VEE TC-83, Clone 13-1 (Figura 1A, Figura 6); (3) iDNA de VEE TC-83, Clone 13-2 (Figura 1A, Figura 6); (4) Como um controle, p3-10 DNA expressando proteínas estruturais de TC-83 somente, é usado.

[00069] Como um controle adicional, células de CHO não transfectadas (5) são usadas. Os iDNAs (1) a (3) contêm o cDNA TC- 83 completo e são esperados gerar vírus de TC-83 vivos. Conforme descrito acima, o Clone 12 iDNA (1) contém promotor 26S duplicado para expressar TC-83 capsid e glicoproteínas de dois promotores 26S independentes (Figura IB). Em contraste, DNA (4) contém somente um fragmento de TC-83 correspondente aos genes estruturais de TC-83 somente e não é esperado gerar vírus de TC-83 vivos.

[00070] Uma alíquota (0,3 ml) de células de CHO transfectadas de placas de 6 poços é semeada em lâminas de câmara de 8 poços. As células de CHO transfectadas são incubadas a 37°C em 5% de CO2. A mortalidade da célula é determinada em placas de 6 poços diariamente por microscopia visual. Ensaio de imunofluorescência (IFA) é realizado a 24 horas pós-transfecção usando lâminas de câmara de 8 poços com antissoro que reconhecem os antígenos de TC-83, de acordo com o método descrito em Pushlco et al. (1997). Os resultados são mostrados na tabela I. As células transfectadas com iDNAs (1) a (3) morrem dentro de 5 dias pós-transfecção, pelo que as células de CHO com transfecções de controle (4) e (5) permanecem vivas. Também, foci de células expressando antígenos de TC-83 são detectados por IFA a 24 horas pós-transfecção nas células transfectadas com DNAs (2) e (3), indicando, desse modo, a presença de vírus de TC-83 vivos (Figura 5). O resultado indica que introdução de vacinas de TC-83 à base de iDNA em células cultivadas resultadas na produção de vírus de TC-83 vivos. Tabela I. Transfecção de células de CHO com o iDNA de vacina de TC-83

* DNA transfectado em células de CHO é feito em placas de 6 poços usando-se reagente de transfecção de Fugene 6 (Roche Applied Sciences) 2 * Observado no dia 5 após transfecção. 3 ** IFA, ensaio de imunofluorescência pelo uso de antissoro para proteínas estruturais de TC-83. Exemplo 4. Transfecção de células de BHK-12 com vacina de YF17D iDNA.

[00071] Brevemente, DNA de plasmídeo contendo YF17D iDNA é transfectado em células cultivadas (CHO, BHK-21, ou linhas de célula similares) e ensaiado usando-se métodos padrões conforme descrito no Exemplo 3. Os resultados são mostrados na tabela II. Ensaio de placa é usado para determinar a titulação de vírus de YF17D vivos gerados em células transfectadas com iDNA de plasmídeo. Estes resultados indicam que introdução de vacina de 17D à base de iDNA em células cultivadas resulta em síntese de RNA específico de vírus e na produção de vírus de YF17D vivos (Tabela II). Tabela II. Transfecção de células de BHK-21 com DNA de plasmídeo contendo YF17D iDNA

* DNA transfectado em células de BHK é feito em placas de 6 poços usando-se reagente de transfecção Fugene 6 (Roche Applied Sciences) 2 * Observado no dia 5 após transfecção 3 ** Ensaio realizado em meio coletado de células transfectadas 5 dias pós transfecção. Exemplo 5. Infecção de células de CHO com vírus de TC-83 derivados de células transfectadas de iDNA.

[00072] De modo a confirmar que vírus de TC-83 vivos é gerado nas células transfectadas com DNA de plasmídeo contendo o cDNA de TC- 83 completo, o meio é coletado de células transfectadas (vide exemplo 3) e usado para infectar células de CHO frescas. As células de CHO frescas são infectadas em lâminas de câmara de 8 poços com meio diluído 100 vezes coletado de células transfectadas, e expressão de antígenos de TC-83 é detectadas por IFA a 24 horas pós-infecção (Tabela III). Os resultados indicam que meio de células transfectadas com vacinas de TC-83 à base de iDNA contém vírus de TC-83 infeccioso vivo. Tabela III. Infecção de células de CHO frescas com meio coletado de células de CHO transfectadas com iDNA contendo cDNA de comprimento total de vacina de TC-83 a jusante do promotor de CMV*

* Meio coletado de células transfectadas 5 dias pós- transfecção (Tabela I) é diluído 100 vezes, em seguida 100 mcL são usados para infectar células de CHO frescas em lâminas de câmara de 8 poços por 1 hora a 37°C, 5% de CO2. Em seguida, 300 mcL de meio completo é adicionado e incubação é continuada por 24 horas. ** IFA 24 horas pós-infecção pelo uso de antissoro para proteínas estruturais de TC-83. Exemplo 6. Vacinação de camundongos com vacina de iDNA de TC-83.

[00073] Camundongos experimentais (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster fora de procriação, ou outra cepa susceptível) são injetados intramuscularmente, subcutaneamente, e intradermalmente com uma dose de cada vacina de iDNA de TC-83 (Clones 12, 13-1, 13-2, conforme indicado na tabela I) variando de 1 ng a 1 mg. As vacinas de iDNA de TC-83 são isoladas de E.coli como DNA de plasmídeo pelo uso de método de isolamento de DNA Promega Endo-free. Em 30 dias, os animais receberam uma segunda dose idêntica da vacina de iDNA de TC-83. Amostras de soro de animais anestesiados são tomadas de poços retro-orbitais nos dias 0, 30, e 60. A resposta imune é determinada por métodos imunológicos padrões incluindo determinação de anticorpo de soro para antígenos de TC-83 no soro de animais vacinados por ELISA. O anticorpo de soro para antígenos de TC-83 é detectado sugerindo vacinação bem sucedida com vacina de iDNA de TC-83. Exemplo 7. Vacinação de camundongos com vacina de YF17D iDNA.

[00074] Camundongos experimentais (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster fora de procriação, ou outra cepa susceptível) são injetados intramuscularmente, subcutaneamente e intradermalmente com uma dose de cada vacina de 17D iDNA (vide sequência de DNA na Figura 7) variando de 1 ng a 1 mg. A vacina de 17D iDNA é isolada de E.coli como DNA de plasmídeo pelo uso de método de isolamento de DNA Promega Endo-free. Nos 30 dias, os animais receberam uma segunda dose idêntica da vacina de 17D iDNA. As amostras de soro de animais anestesiados são tomadas de poços retro-orbitais nos dias 0, 30, e 60. A resposta imune é determinada por métodos imunológicos padrões incluindo determinação de anticorpo de soro para antígenos de YF 17D no soro de animais vacinados por ELISA. O anticorpo de soro para antígenos de YF é detectado sugerindo vacinação bem sucedida com vacina de YF17D iDNA. Exemplo 8. Otimização de Distância Entre a 3' extremidade de Promotor de CMV e a 5' Extremidade de sDNA por Ensaio de Encapsidação Usando Vetores HA ou N e os DNA e-Auxiliadores.

[00075] Para a função bem sucedida do iDNA, é importante alcançar transcrição eficiente do RNA de TC-83 funcional de comprimento total a partir do plasmídeo de iDNA. Portanto, é importante otimizar transcrição incluindo a distância entre a extremidade do promotor e o início do cDNA, de modo a maximizar a eficácia de síntese de RNA funcional. Nós construímos um "iDNA pequeno" que codifica somente o gene capsid de vírus de TC-83 incluindo regiões regulatórias. Todos os outros genes de TC-83 são anulados de tal "capsid iDNA". Em seguida, nós inserimos oligonucleotídeos sintéticos de comprimentos variados (vide figura 13) entre o promotor de CMV e o "capsid iDNA" usando local de SacI no 3' terminal do promotor de CMV. Desse modo, uma série de plasmídeos "capsid iDNA" é produzida em que a distância entre o promotor e o iDNA varia de 8 a 25 pares bases. Cada construção de capsid iDNA é transfectada por eletroporação em células de CHO junto com (1) RNA GP-auxiliador e (2) vetor HA de RNA. O RNA GP- auxiliador codifica as glicoproteínas de TC-83, pelo que o vetor HA de RNA codifica o gene HA de influenza. Nas células de CHO cotransfectadas, o TC-83 capsid e proteínas GP encapsidam o vetor HA em partículas de ciclo simples. Por titulação de tais partículas usando ensaio de imunofluorescência (IFA) e antissoro de HA, a titulação das partículas é detectada. Neste sistema, o nível de expressão de capsid do "capsid iDNA" é um fator de limitação de taxa e afeta a titulação das partículas.

[00076] Foi verificado que a distância ótima entre o 3'-terminal do promotor de CMV e a 5' extremidade do cDNA capsid de TC-83 é 15 pares bases entre o local de SacI (a extremidade de promotor de CMV) e o início de cDNA (Figura 9). Nós verificamos que esta distância ótima proporcionou expressão de antígeno de capisid funcional em um nível máximo. Contudo, outras construções de capsid iDNA com distâncias de 12 a 18 bp também proporcionam nível detectável de expressão e altas titulações de partículas. Os dados são confirmados em vários experimentos usando titulação de vetor HA. Nós também confirmamos estes resultados de otimização quando nós usamos quantificação do vetor N que expressa gene de nucleoproteína ao invés de gene HA. Exemplo 9. Vírus de TC-83 Gerados de Clones Infecciosos In vitro são Avirulentos em Camundongos BALB/c.

[00077] Os vírus de TC-83 são gerados por transfecção de células de CHO com vacina de cDNA de TC-83 infecciosa (iDNA), clones #12 e #13-1. A expressão de antígenos de TC-83 é mostrada por IFA a 24 horas pós transfecção em células transfectadas com qualquer iDNA (#12 e #13-1). Os vírus são coletados de culturas de célula de CHO a 96 horas pós transfecção, após e o efeito citopático (CPE) é aparente. A titulação de cada vírus é determinada por ensaio de placa padrão em monocamadas de célula Vero. Os vírus gerados de iDNA #13-1 tem a titulação de 7x107 PFU/ml, pelo que os vírus gerados de iDNA #12 não mostram as placas, sugerindo formação mais lenta de placas e possivelmente, nível mais alto de atenuação. Em seguida, 105 unidades de formação de placa (PFU) de vírus #13-1 são inoculadas em camundongos BALB/c intramuscularmente de acordo com o protocolo padrão. O vírus gerado de iDNA #12 não é usado para inoculação de animais, porque a titulação da placa não pode ser determinada. Como um controle, o vírus de VEE tipo selvagem (cepa Trinidad) é inoculado nos animais.

[00078] No grupo de VEE de controle, 10 de 10 animais morrem em seguida à inoculação, demonstrando a natureza virulenta do vírus de controle (Figura 12). Em contraste, o vírus gerado de iDNA (#13-1) é avirulento em camundongos, visto que os camundongos não mostram sinais de doença. Este resultado confirma que iDNA contém mutações atenuadas derivadas de vacina de TC-83 e que estas mutações atenuantes não revertem ao fenótipo virulento tipo selvagem durante produção de vírus de iDNA. REFERÊNCIAS Bamett ED.Yellow fever: epidemiology and prevention. Clin Infect Dis. 2007 Mar 15;44(6):850-6. Epub 2007 Feb 1. Review. Bredenbeek PJ, Molenkamp R, Spaan WJ, Deubel V, Marianneau P, Salvato MS, Moshkoff D, Zapata J, Tikhonov I, Patterson J, Carrion R, Ticer A, Brasky K, Lukashevich IS. A recombinant Yellow Fever 17D vaccine expressing Lassa virus glycoproteins. Virology. 2006 Feb 20;345(2):299-304. Kinney RM, Chang GJ, Tsuchiya KR, Sneider JM, Roehrig JT, Woodward TM, Trent DW. Attenuation of Venezuelan equine encephalitis virus strain TC-83 is encoded by the 5'-noncoding region and the E2 envelope glycoprotein. J Virol. 1993;67(3): 1269-77. MonathTP. Yellow fever: an update.Lancet Infect Dis. 2001 Aug;l(l):ll-20. Monath TP. Dengue and yellow fever—challenges for the development and use of vaccines.N Engl J Med. 2007 Nov 29;357(22):2222-5. Pugachev KV, Guirakhoo F, Monath TP. New developments in flavivirus vaccines with special attention to yellow fever.Curr Opin Infect Dis. 2005 Oct;18(5):387-94. Pushlco P, Parker M, Ludwig GV, Davis NL, Johnston RE, Smith JF. Replicon-helper systems from attenuated Venezuelan equine encephalitis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology 1997;239(2):389-401. Smithburn KC, Durieux C, Koerber R, et al. Yellow fever vaccination. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1956. OMS monograph series no. 30, Tao D, Barba-Spaeth G, Rai U, Nussenzweig V, Rice CM, Nussenzweig RS.Yellow fever 17D as a vaccine vector for microbial CTL epitopes: protection in a rodent malaria model. J Exp Med. 2005 Jan 17;201 (2): 201-9.

Claims

1. Vetor de plasmídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um promotor de RNA polimerase, operacionalmente ligado a um DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa; e (b) uma cauda poli-A a jusante do referido DNA, em que (i) a molécula de RNA codifica um vírus atenuado da febre amarela (YF); e (j) ) o promotor da RNA polimerase é adequado para expressão em células de mamíferos.

2. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido DNA que codifica a referida molécula de RNA compreende um cDNA de YF17D (nucleotídeos 703 a 11564 da Figura 8) ou uma sequência de polinucleotídeos de YF17D de comprimento total de uma vacina de YF17D.

3. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o promotor é um promotor de citomegalovírus (CMV).

4. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido promotor de CMV está localizado de cerca de 12 a cerca de 18 resíduos de ácido nucleico a montante da extremidade 5' de referido DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa.

5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referido promotor de CMV está localizado 15 resíduos de ácido nucleico a montante da extremidade 5' de referido DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que referido vetor compreende um vetor pASP5.

7. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida cauda poli-A está localizada de cerca de 0 a cerca de 500 resíduos de ácido nucleico a jusante da extremidade 3' de referido DNA que codifica uma molécula de RNA infecciosa.

8. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o DNA que codifica a molécula de RNA infecciosa compreende ainda um elemento funcional adicional operacionalmente ligado ao DNA que codifica as glicoproteínas do vírus atenuado e em que o elemento funcional permite a transcrição das glicoproteínas.

9. Vacina para YF, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva do vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Vírus atenuado vivo clonalmente purificado homogêneo, caracterizado pelo fato de que compreende: a molécula de RNA infecciosa codificada pelo DNA, como definido na reivindicação 1, e dois promotores de RNA polimerase dependentes de RNA, os dois promotores de RNA polimerase dependentes de RNA são operacionalmente ligados a uma ou mais porções de um capsídeo e uma glicoproteína da molécula de RNA infecciosa, em que a molécula de RNA infecciosa codifica um vírus da Febre Amarela (YF).

12. Vacina para vírus de RNA infeccioso, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus atenuado vivo clonalmente purificado homogêneo, como definido na reivindicação 11.

13. Uso de um vetor, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma vacina para imunização de um mamífero contra um vírus da YF.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido mamífero é um ser humano ou um cavalo.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido mamífero é um ser humano.

16. Uso de um vírus, como definido na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma vacina para imunização de um mamífero contra um vírus da YF.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido mamífero é um ser humano ou um cavalo.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido mamífero é um ser humano.