ES2544702T3 - Vacunas en forma de ADNi y métodos para utilizarlas - Google Patents

Abstract

Un vector plasmídico que contiene: (a) un promotor de la ARN polimerasa, ligado operablemente a un ADN que codifica una molécula de ARN infeccioso; y (b) una cola de poli-A en dirección 3' respecto a dicho ADN donde: (i) la molécula de ARN codifica un virus de la fiebre amarilla (YF) atenuado; y (ii) el promotor de la ARN polimerasa es adecuado para la expresión en células de mamífero.

Description

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05-08-2015

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Vacuna en forma de ADNi* Mortalidad de las células BHK tras la transfección con ADN in vitro** Título de YF17D, mediante ensayo en placas***

*** Ensayo realizado en medio recogido a partir de las células transfectadas 5 días después de la transfección.

Ejemplo 5. (Ejemplo de referencia) Infección de células CHO con virus TC-83 obtenidos a partir de células transfectadas con ADNi. Con el fin de confirmar que se generan virus TC-83 vivos en las células transfectadas con ADN plasmídico que contienen el ADNc de TC-83 completo, se recolecta el medio a partir de células transfectadas (remítase al ejemplo 3) y se utiliza para infectar células CHO frescas. Se infectan células CHO frescas en portaobjetos con 8 pocillos con medio diluido 100 veces recolectado a partir de las células transfectadas, y se detecta la expresión de antígenos de TC-83 mediante IFA 24 h después de la infección (Tabla III). Los resultados indican que el medio procedente de las células transfectadas con vacunas con TC-83 basadas en que ADNi contienen virus TC-83 infecciosos vivos.

Tabla III. Infección de células CHO frescas con medio recogido a partir de las células CHO transfectadas con ADNi que contiene el ADNc completo de la vacuna TC-83 en dirección 8’ respecto al promtor CMV*

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Transfección con vacuna en forma de ADN % de células positivas para el antígeno de TC-83, por IFA

1.

ADNi modificado de TC-83 contra VEE, clon 12 100

2.

ADNi de TC-83 contra VEE, clon 13-1 80

3.

ADNi de TC-83 contra VEE, clon 13-2 100

4.

ADN p3-10 que expresa únicamente proteínas estructurales de TC-83 (control) 0

5.

Células CHO no transfectadas (control) 0

* Se diluye 100 veces el medio recogido a partir de las células transfectadas 5 días después de la transfección (Tabla I), a continuación se utilizan 100 mcL para infectar células CHO frescas en portaobjetos con 8 pocillos durante 1 h a 37°C, 5% de CO2. A continuación, se añaden 300 mcL de medio completo y se prolonga la incubación 24 h. ** IFA 24 h después de la infección, utilizando antisuero para proteínas estructurales de TC-83.

Ejemplo 6. (Ejemplo de referencia) Vacunación de ratones con la vacuna en forma de ADNi de TC-83.

Se inyecta una dosis de cada vacuna en forma de ADNi de TC-83 (clones 12, 13-1, 13-2, tal y como se indica en la Tabla I) comprendida entre 1 ng y 1 mg por vía intramuscular, subcutánea e intradérmica a ratones de laboratorio (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster exógamos, u otra cepa susceptible). Se aíslan las vacunas en forma de ADNi de TC-83 a partir de E. coli en forma de ADN plasmídico utilizando el método de aislamiento de ADN Endo-free de Promega. En 30 días, los animales reciben una segunda dosis idéntica del seno retroorbital en los días 0, 30 y 60. Se determina la respuesta inmunitaria mediante métodos inmunológicos estándar incluida la determinación de anticuerpos séricos contra los antígenos de TC-83 en el suero de animales vacunados mediante ELISA. Se detectan anticuerpos séricos contra los antígenos de TC-83 lo que sugiere una vacunación con éxito con la vacuna en forma de ADNi de TC-83.

Ejemplo 7. Vacunación de ratones con la vacuna en forma de ADNi de YF17D.

Se inyecta una dosis de cada vacuna en forma de ADNi de 17D (remítase a la secuencia de ADN en la Figura 7) comprendida entre 1 ng y 1 mg por vía intramuscular, subcutánea e intradérmica a ratones de laboratorio (BALB/c, C57BL/6, Swiss Webster exógamos u otra cepa susceptible). Se aísla la vacuna en forma de ADNi de 17D a partir de E. coli en forma de ADN plasmídico utilizando el método de aislamiento de ADN Endo-free de Promega. En 30 días, los animales reciben una segunda dosis idéntica de la vacuna en forma de ADNi de 17D. Se toman muestras séricas del seno retroorbital de animales anestesiados en los días 0, 30 y 60. Se determina la respuesta inmunitaria mediante métodos inmunológicos estándar que incluyen la determinación de anticuerpos séricos contra los antígenos de YF 17D en el suero de animales vacunados mediante ELISA. Se detectan anticuerpos séricos contra los antígenos de YF lo que sugiere una vacunación con éxito con la vacuna en forma de ADNi de YF17D.

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Claims (1)

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