BRPI0917037A2 - ''molécula de ligação específica uso de uma molécula de ligação específica que ligue ao anx- a1 método para o tratamento da doença mediada com células t - Google Patents

Abstract

molécula de ligação específica, uso de uma molécula de ligação específica que ligue ao anx-al e método para o tratamento da doença mediada com células t a presente invenção apresenta uma molécula de ligação específica a qual liga-se à anexina-1 (anx-al) para uso no tratamento de doença mediada por célula t.

Description

MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, USO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE LIGUE AO ANX-A1 E MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA MEDIADA COM CÉLULAS T

A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de doenças mediadas por células T por meio da modulação da atividade da anexina-1.

As doenças auto-imunes são patologias crônicas incapacitantes causadas pelo mau funcionamento do sistema imunológico. Na maioria dos casos, são iniciadas por uma resposta descontrolada das células T a autoantígenos apresentados no contexto de moléculas de MHC de células apresentadoras de antígenos (APCs). Vários fatores foram descritos como envolvidos na patogênese de doenças autoimunes, incluindo os fatores ambiental, genético e viral, com uma característica abrangente: a hiperresponsividade de células T.

Glicocorticoides (GCs) são frequentemente utilizados para a terapia de uma variedade de doenças autoimunes crônicas em função da sua capacidade de bloquear simultaneamente tanto a resposta imunológica inata e adaptativa. Estudos ao longo dos últimos 10 anos ou mais realizados pelos autores da presente invenção e por outros grupos de pesquisa mostraram que alguns dos efeitos inflamatórios de GCs na resposta imunológica inata são mediados por uma proteína chamada de anexina-1 (Anx-Al). Essa proteína provou exercer um controle homeostático sobre inúmeros tipos de células, incluindo neutrófilos, macrofagos e células endoteliais. No entanto, um aspecto que sempre foi negligenciado é o papel da Anx-Al na resposta imunológica adaptativa. É surpreendente a consideração de que a Anx-Al foi proposta como um dos segundos mensageiros dos efeitos farmacológicos dos GCs.

Os autores da presente invenção mostraram

2/54 anteriormente que a Anx-Al desempenha um papel homeostático nas células T por meio da modulação da intensidade de sinalização do receptor de células T (TCR) (D ¹Acquisto et al., Blood 109: 1095-1102, 2007).

Além disso, os autores da presente invenção mostraram que os altos níveis de Anx-Al reduziram o limiar de ativação de células T e favoreceram a diferenciação em células Thl, enquanto camundongos deficientes em Anx-Al mostram uma ativação de célula T comprometida e uma maior diferenciação em células Th2 (D'Acquisto et al., Eur. J. Immunol. 37: 3.131 a 3.142, 2007).

O documento WO 2005/027965 descreve a descoberta de um mecanismo por meio do qual os neutrófilos apoptóticos distribuem sinais antiinflamatórios para células dendríticas e identificam um anticorpo que interfere nesse processo. Em particular, o documento WO 2005/027965 descreve a identificação da Anx-1 como uma molécula de sinalização que é dita como sendo expressa por neutrófilos apoptóticos para inibir a ativação e a maturação de células dendríticas. 0 documento WO 2005/027965 propõe que um anticorpo denominado de DAC5 (Detector de Células Apoptóticas N- 5) reconhece e bloqueia os efeitos antiinflamatórios da Anx-1 apresentados na superfície de neutrófilos apoptóticos mediante a fagocitose por células dendríticas. 0 documento WO 2005/027965 refere-se, portanto, à possibilidade de tratamento de várias doenças por meio do direcionamento de tais células dendríticas e da deleção das mesmas por meio da produção de uma resposta inflamatória, mas não discute um papel para a Anx-1 na ativação de células T.

O documento WO 2005/027965 reivindica que as anexinas são expressas em células que sofrem apoptose (consultar, por exemplo, a página 8, linhas 6 a 7 e 29 a 30) e que essas anexinas são apresentadas na superfície de tais

3/54 células (consultar, por exemplo, a página 6, linhas 10 a 11 e página 8, linhas 15 a 17). No entanto, dois estudos separados (Maderna et al., J Immunol., 174: 3.727 a 3.733, 2005; Scannell et al., J Immunol., 17 8: 4.595 a 4.605, 2007) mostraram que as células apoptóticas, incluindo neutrófilos, liberam a anexina-1, em vez de expressar a proteína e apresentá-la na superfície celular. Uma vez que a anexina-1 é liberada pela célula, não é possível reivindicar que o DAC5 identifica apenas as células apoptóticas que expressam a proteína na superfície, uma vez que o anticorpo também identifica a anexina-1 liberada.

Além disso, o documento WO 2005/027965 reivindica que a coincubação de neutrófilos apoptõticos que expressam a anexina-1 na sua membrana celular com células dendríticas ativadas com LPS causa a inibição da secreção de TNF-oí e a regulação ascendente dos marcadores de ativação CD83, CD86 e HLA-DR, e que a adição do DAC5 a essa cultura reverte os efeitos inibitórios da anexina-1 que expressa neutrófilos apoptóticos (página 5, linha 31 a página 6, linha 8) . Os dados dos autores da presente invenção (Huggins et al., FASEB J. 2008, em impressão) demonstram que as células dendríticas liberam Anx-1 mediante a estimulação com LPS e, portanto, o DAC5 descrito no documento WO 2005/027965 aglutina-se à Anx-1 externaiizada nos neutrófilos, bem como à anexina-1 liberada pelas células dendríticas. Além disso, os autores da presente invenção descobriram que a ausência de anexina-1 em células dendríticas causa um aumento da expressão de marcadores de maturação/ativação e da produção de citocinas inflamatórias como TNF-α e IL-Ιβ e IL-12. Por esse motivo, o anticorpo DAC5 descrito no documento WO 2005/027965 deve afetar a maturação e a ativação de células dendríticas e, portanto, a subsequente modulação da resposta imunológica.

Em apoio a isso, os autores da presente invenção

4/54 mostraram que a cocultura de células dendríticas de Anx-Al'^z com células T virgens dentro de uma reação mista de linfõcitos (MLR) mostrou uma capacidade significativamente reduzida de induzir tanto a proliferação de células T como a produção de IL-2 e IFN-γ. Portanto, os agentes bloqueadores da função de Anx-Al em células dendríticas devem reduzir a sua capacidade de estimular uma resposta imunológica mediada por células T robustas. Os anticorpos referidos no documento WO 2005/027965 não são, por essa razão, apropriados para o tratamento das doenças referidas nesse pedido de patente.

A presente invenção emprega o uso de moléculas aglutinantes específicas que se aglutinam à anexina-1 (AnxAl) no tratamento de doenças mediadas por células T.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é apresentada, portanto, uma molécula aglutinante específica que se aglutina à anexina-1 (Anx-Al) para uso no tratamento de doenças mediadas por células T.

Os autores da presente invenção mostraram anteriormente que a Anx-Al modula a intensidade de sinalização do receptor de células T (TCR) e que altos níveis de Anx-Al reduzem o limiar de ativação de células T e favorecem a diferenciação em células Thl. Os autores da presente invenção identificaram recentemente a rota da anexina, e o sinal subsequente, como um alvo para o bloqueio a fim de tratar doenças mediadas por células T. Tais doenças incluem aquelas em que há ativação anormal de células T, por exemplo, muitas doenças auto-imunes, e aquelas em que é desejável enviesar a diferenciação de células T em favor das células Thl em vez das células Th2.

A presente invenção utiliza uma molécula aglutinante específica que se aglutina à anexina-1 (Anx-Al).

As anexinas são um grupo de proteínas celulares aglutinantes ao cálcio e ao fosfolipídio e também são

5/54 conhecidas como lipocortinas. A família das anexinas tem 13 membros, incluindo a anexina Al, a anexina A2 e a anexina A5. A anexina-Al também é conhecida como anexina-1 e é denominada na presente invenção de Anx-Al. A anexina-1 (Anx-Al) é uma proteína de 3 7 kDa e foi originalmente descrita como um mediador das ações dos glicocorticoides. Ao longo dos últimos anos, as evidências mostraram que a Anx-Al desempenha um papel homeostático no sistema imunolõgico adaptativo, em particular nas células T, por meio da modulação da intensidade da sinalização do receptor de células T (TCR). A Anx-Al atua como um regulador descendente endõgeno de inflamação em células do sistema imunolõgico inato in vivo. A Figura IA é um diagrama de fitas que mostra a estrutura tridimensional da Anx-Al.

Existem oito sequências de nucleotídeos humanos que codificam a Anx-Al. De todas elas, apenas quatro são traduzidas e, portanto, há quatro isoformas de Anx-Al, designadas de ANXA1-002, ANXA1-003, ANXA1-004 e ANXAl-006. Essas sequências estão disponíveis no site da Ensembl (www.enseinbl.org) e são designadas de OTTHUMTO0000052664 (ANXA1-002), OTTHÜMTOOOO0052665 (ANXA1-003),

OTTHUMTOOOOOÔ52666 (ANXA1-004) e OTTHUMTOOOOOOS2668 (ANXA1

006) . As sequências de aminoácidos e de nucleotídeos de uma isoforma da anexina-1 humana (Anx-Al), ANXA1-003, são mostradas na Figura 2a. As sequências de aminoácidos das isoformas ANXA1-002, ANXA1-004 e ANXA1-006 são mostradas nas Figuras 2b, 2c e 2d, respectivamente. Como pode ser observado na Figura 2, as isoformas ANXA1-002, ANXA1-004 e ANXA1-006 são tanto variantes de junção curta de ANXA1-003 como variantes de ANXA1-003 com um pequeno número de mudanças de aminoácidos.

Vários estudos mostraram que o peptídeo N-terminal do Anx-Al chamado Ac.2-26 age como um substituto bioativo da

6/54 proteína inteira (consultar, por exemplo, Lim et al., Proc Natl Acad Sei EUA 95, 14.535 a 9, 1998).

A Figura 1B é uma representação esquemática dos ciclos de anexina o local desta sequencia bioativa. 0 Peptídeo Ac.2-26 é um peptídeo acetilado que tem uma sequência de resíduos de aminoácido 2-26 da sequência de aminoácido inteira de Anx-AI mostrado na Figura 2. A sequência de peptídeo Ac.2-26 é mostrada na Figura 1C e é tal como a seguir:

ch₃co-amvseflkqawfieneeqeyvqtvk

Anx-AI e seus peptídeos bioativos N-terminal derivados mediam seus efeitos biológicos através de membros da família de receptores de formil peptídeo (FPR). 0 Anx-AI exerce suas ações contra-regulatórias no extravasamento de neutrófilo e imunidade inata através de aglutinação direta e ativação de um membro desta família, receptor de formil peptídeo do tipo 1 (FPRL-1). Os autores da presente invenção descobriram anteriormente que a estimulação das células T na presença de hr Anx-AI aumenta a ativação de célula T, através da estimulação de FPRL-I (D’Acquisto et al., Blood 109: 10951102, 2007).

A presente invenção utiliza uma molécula específica de aglutinação que aglutina a Anexina-1 (Anx-AI). A Anx-AI a qual a molécula específica de aglutinação, aglutina é tipicamente Anx-AI humana, contendo a sequência de polipeptídeo mostrada na Figura 2a, ou uma variante ou fragmento da mesma, como um das isoformas de Anx-AI humana, contendo a sequência de polipeptídeo mostrada na Figura 2b, a Figura 2c ou a Figura 2d. O fragmento de Anx-AI humana a qual a molécula específica de aglutinação aglutina é tipicamente □ polipeptídeo contendo a sequência mostrada na Figura 1C. A Anx-AI a qual a molécula específica de aglutinação aglutina é tipicamente codificada pela sequência de nucleotídeo mostrada

7/54 na Figura 2a.

Tal como utilizado no presente documento, o termo variante refere-se às proteínas que têm uma sequência similar de aminoácido e/ou que tem a mesma função. Por exemplo, o termo variante abrange proteínas ou polipeptídeos que incluem uma ou mais adições de aminoácido, deleções, substituições ou similares. As substituições de aminoácido são tipicamente substituições conservativas, isto é, a substituição de um aminoácido por outro com propriedades geralmente similares, de modo que o funcionamento total provavelmente não seja seriamente afetado.

Dessa forma, os aminoácidos glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina podem ser frequentemente substituídos um pelo outro (aminoácidos que têm cadeias laterais alifáticas). Destas possíveis substituições, é preferencial que a glicina e a alanina sejam utilizadas para substituírem uma a outra (tendo em vista que estas têm cadeias laterais relativamente curtas) e que valina, leucina e isoleucina são utilizadas para substituírem umas as outras (tendo em vista que estas têm cadeias laterais alifáticas maiores que são hidrofóbicas). Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos uns pelos outros incluem: fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos que têm cadeias laterais aromáticas); lisina, arginina e histidina (aminoácidos que têm cadeias laterais básicas); aspartato e glutamato (aminoácidos que têm cadeias laterais ácidas); asparagina e glutamina (aminoácidos que têm cadeia laterais amida); e cisteína e metionina (aminoácidos que têm cadeias laterais contendo enxofre).

Utilizando os códigos de três letras e de uma letra, os aminoácidos podem ser referidos como a seguir: glicina (G ou Gli) , alanina (A ou Ala) , valina (V ou Vai) , leucina (L ou Leu), isoleucina (I ou He), prolina (P ou Pro),

8/54 fenilalanina (F ou fe) , tirosina (Y ou Tir), triptofano (W ou Trp), lisina (K ou Lis), arginina (R ou Arg), histidina (H ou His), ácido aspártico (D ou Asp), ácido glutâmico (E ou Glu), asparagina (N ou Asn), glutamina (Q ou Gin), cisteína (C ou Cis) , metionina (M ou Met) , serina (S ou Ser) e Treonina (T ou Thr) . Onde um resíduo pode ser ácido aspártico ou asparagina, os símbolos Asx ou B podem ser utilizados, Onde um resíduo pode ser ácido glutâmico ou glutamina, os símbolos GIx ou Z podem ser utilizados. As referências ao ácido aspártico incluem aspartato, e referências ao ácido glutâmico incluem glutamato, a menos que o contexto especifique de forma diferente.

Deleções ou inserções de aminoácidos também podem ser feitas relativas a sequência de aminoácido da proteína referida acima. Dessa forma, por exemplo, os aminoácidos que não têm um efeito substancial na atividade do polipeptideo, ou pelo menos, que não eliminam tal atividade, podem ser removidos. Tais deleções podem ser vantajosas, uma vez que o comprimento total e o peso molecular de um polipeptideo podem ser reduzidos enquanto retendo atividade ainda. Isto pode permitir a quantidade de polipeptideo necessária para um propósito particular de ser reduzida - por exemplo, os níveis de dosagem podem ser reduzidos.

As inserções de aminoácido relativas à sequência da proteína de fusão acima também podem ser feitas. Isto pode ser feito para alterar as propriedades de uma substância (por exemplo, para ajudar na identificação, purificação ou expressão) .

Mudanças de aminoácidos relativas à sequência mencionada acima, podem ser feitas utilizando qualquer técnica apropriada, por exemplo, através do uso de mutagênese dirigida ao sítio ou síntese de estado sólido.

Deve ser apreciado que as substituições ou

9/54 inserções de aminoácidos, dentro do escopo da presente invenção, podem ser feitas utilizando aminoácidos que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente. Se aminoácidos sintéticos ou naturais são utilizados ou não, é preferencial que apenas aminoácidos-L estejam presentes.

Um indivíduo pode usar um programa como o programa CLUSTAL para compara a sequência de aminoácidos. Este programa compara a sequência de aminoácidos e acha o alinhamento ótimo através de inserir espaços em cada sequência de acordo com o apropriado. É possível calcular a identidade ou similaridade (identidade mais conservação do tipo de aminoácido) do aminoácido para um alinhamento ótimo. Um programa como BLASTx alinhará a extensão mais longa de sequências similares e designar um valor ao ajuste. Ê, dessa forma, possível obter uma comparação em que várias regiões de similaridade são encontradas, cada uma contendo uma pontuação diferente. Ambos os tipos de análise de identidade são contemplados na presente invenção.

As variantes de proteínas e polipeptídeos descritos no presente documento devem ter a função da proteína ou polipeptídeo original. Alternativa ou adicionalmente a ter esta função da proteína ou polipeptídeo original, as variantes de proteínas e polipeptídeos descritos no presente documento, tipicamente têm, pelo menos, identidade 60% (como discutido acima) com as proteínas ou polipeptídeos descritos no presente documento, em particular uma sequência de polipeptídeos mostrada na Figura 1C ou na Figura 2. Tipicamente, as variantes para o uso na invenção têm identidade, pelo menos, 70% pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% as proteínas ou polipeptídeos descritos no presente documento, em particular a sequência de polipeptídeos mostrada na Figura 1C ou na Figura 2.

10/54

O porcentual de identidade de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucléico é determinado através de alinhar as sequências para propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na primeira sequência para o melhor alinhamento com as sequência) e para comparar os resíduos de aminoàcido ou nucleotídeos em posições correspondentes. 0 melhor alinhamento é um alinhamento de duas sequências, que resultam no maior porcentual de identidade. 0 porcentual de identidade é determinado pelo número de resíduos idênticos de aminoàcido ou nucleotídeos nas sequências sendo comparadas (isto é, identidade % = número de posições idênticas /número total de posições x 100).

Ά determinação do porcentual de identidade entre duas sequências pode ser efetuada utilizando um algoritmo matemático, conhecido pelos técnicos no assunto. Um exemplo de um algoritmo matemático para comparar duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc . Natl. Acad. Sei. Estados Unidos 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5873-5877. Os programas de NBLAST e XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 incorporaram tal algoritmo. Buscas BLAST em nucleotídeos podem ser executadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogos as moléculas de ácido nucléico da invenção. Buscas BLAST por proteína podem ser executadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoàcido homólogas para moléculas de proteína da invenção. Para obter alinhamentos abertos para propósito de comparação, BLAST abertos podem ser utilizados conforme descrito em Altschul et al. (1997) Ácidos nucléicos Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSl-Blast pode ser utilizado para realizar

11/54 uma busca repetida que detecte relações distantes entre moléculas (Id.). Quando utilizando BLAST, BLAST aberto, e programas PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados. Consultar http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989) . 0 programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de sequência de alinhamento CGC tem tal algoritmo incorporado. Outros algoritmos para a análise de sequência conhecidos no estado da técnica incluem ADVANCE e ADAM conforme descrito em Torellis e Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5; e FASTA descrito em Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8. Dentro de FASTA, ktup é uma opção de controle que define a sensibilidade e a velocidade da busca.

Em uma abordagem alternativa, as variantes podem ser proteínas de fusão, incorporando metades que tornam a purificação mais fácil, por exemplo, por etiquetar efetivamente a proteína desejada ou polipeptídio. Pode ser necessário remover a etiqueta ou isso pode ser um caso que a proteína de fusão em si retém funcionalidade suficiente para ser útil.

Uma aglutinação de moléculas específica que se aglutina ao Anx-Al conforme aqui utilizado é uma molécula que se aglutina com maior afinidade ao Anx-Al do que em outras moléculas, isto é, que se aglutine especificamente ao Anx-Al. Aglutinados de moléculas específicos que se aglutinam ao Anx-Al incluem anticorpos anti-Anx-Al e aptâmeros. Os anticorpos anti-Anx-Al para uso na presente invenção funciona por bloquear a ativação das células T e então, quando administrados, podem ser utilizados no tratamento das doenças mediadas pela célula T, que são tipicamente causadas por

12/54 ativação anormal da célula T.

Os anticorpos Anti-Anx-Al podem ser levantados, por exemplo, contra Anx-Al humano contendo a sequência de aminoácidos estabelecida na figura 2, tipicamente uma sequência de aminoácidos estabelecida na figura 2a. Altemativamente, os anticorpos anti-Anx-Al podem ser direcionados em um particular epitopo ou epitopos de Anx-Al humano contendo uma sequência de aminoácidos estabelecida na figura 2, tipicamente a sequência de aminoácidos estabelecida na figura 2a. Por exemplo, os anticorpos anti-Anx-Al podem ser direcionados contra um fragmento do N-terminal de Anx-Al, por exemplo, um fragmento do N-terminal de pelo menos 188, 100, 50 ou 25 resíduos de aminoác ido de N- Terminal da sequência de aminoácidos estabelecida na figura 2a. Tipicamente, o anticorpo anti-Anx-Al para uso na invenção é um anticorpo contra o fragmento do N-terminal de Anx-Al designado Ac2-26 e que tem a sequência mostrada na figura IC, ou centra um fragmento de pelo menos 6 aminoácidos disto. Aglutinação específica de moléculas que se aglutinam ao AnxAl então inclui anticorpos anti-Anx-Al que são anticorpos contra o Anx-Al fragmento Ac2-26 contendo a sequência mostrada na figura IC ou um fragmento de pelo menos 6 aminoácidos deste. Nesta realização, o anticorpo anti-Anx-Al é levantado contra um fragmento da sequência mostrada na figura IC que é um antigênico e capaz de estimular a produção de anticorpos que, quando administrados, podem ser utilizados no tratamento de doenças de célula mediada T, que são tipicamente causadas por ativação anormal de célula T.

Conforme declarado acima, subfragmento ativo da sequência especificada pode ser utilizada conforme definido. Subfragmentos ativos podem consistir de ou incluir um fragmento de pelo menos 6 aminoácido resíduos contínuos (um hexapeptídeo) de fragmento do N-terminal de Anx-Al designado

13/54 de Ac2-26 contendo a sequência estabelecida na figura 1C, incluindo um ou mais de:

AMVSEF

MVSEFL

VSEFLK

SEFLKQ

EFLKQA

FLKQAW

LKQAWF

KQAWFI

QAWFIE

AWF1EN

WFIENE

FIENEE

JENEEQ

ENEEQE

NEEQEY

EEQÊYV

EQEYVQ

QEYVQT

EYVQTV

YVQTVK

Subfragmentos ativos podem consistir de ou incluir um fragmento de mais de seis resíduos contínuos de aminoácido do 5 fragmento do N-terminal do Anx-Al designado como Ac2-26 contendo uma sequência estabelecida na figura 1 C, por exemplo, um fragmento de pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23 ou pelo menos 24

14/54 aminoácidos da sequência estabelecida na figura 1C.

Os anticorpos anti-Anx-Al incluem anticorpos monoclonais e policlonais. Tipicamente, o anticorpo anti-AnxAl é um anticorpo monoclonal. 0 anticorpo anti-Anx-Al pode ser um anticorpo comercialmente disponível, por exemplo, um policlonal de coelho ou um anticorpo monoclonal de camundongo. Tipicamente, o anticorpo anti-Anx-Al é humanizado, conforme descrito em detalhes abaixo.

Anticorpos monoclonais podem ser produzidos a partir de hibridomas. Esses são tipicamente formados pela fusão de células mieloma e células do baço que produzem o anticorpo desejado de maneira a formar uma linha de células imortais. A bem conhecida técnica Kohler & Milstein {Natureza 256:495-497 (1975)) ou variações subsequentes sobre esta técnica podem se utilizadas para produzir um anticorpo monoclonal para uso de acordo com a invenção.

Anticorpos Policlonais podem ser obtidos mediante a estimulação da sua produção em um hospedeiro animal apropriado (por exemplo um camundongo, rato, porquinho da índia, coelho, ovelha, bode ou macaco) por injeção de Anx-Al, ou uma variante ou fragmento deste, no animal. Se desejado, uma adjuvante pode ser administrado em conjunto com a proteína Anx-Al. Adjuvantes bem conhecidos incluem o adjuvante de Freund (completo e incompleto) e hidróxido de alumínio. Os anticorpos podem então serem purificados por virtude de sua aglutinação ao Anx-Al.

Técnicas para produzir anticorpos monoclonais e policlonais que se aglutinam a uma polipeptídio/proteína particular são agora desenvolvidas na técnica e são discutidas nos livros didáticos padrão sobre imunologia, por exemplo no Roitt et al., immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, Londres.

Adicionalmente a anticorpos inteiros, a presente

15/54 invenção inclui derivados dos mesmos que são capazes de aglutinação ao Anx-Al conforme descrito neste. Dessa maneira, a presente invenção inclui fragmentos de anticorpo e construções sintéticas. Exemplos de fragmentos de anticorpo e construções sintéticas são fornecidas por Dougall et al,, em Trends BiotechnoL, 12: 372-379 (1994).

Fragmentos de anticorpo incluem, por exemplo, Fab, F(ab')2 e fragmentos Fv. Fab fraemejits são discutidos em Roitt et al. [supra] . Fv fragmentos podem ser modificados para produzir uma construção sintética conhecida como uma cadeia única Fv (scFv) molécula. Isto inclui um Iigante de peptídeo covalentemente unindo as regiões da cadeia pesada variável (V_H) e da cadeia leve variável (V_L) , que contribuem para a estabilidade da molécula. O Iigante pode compreender de 1 a 20 aminoácidos, tais como, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos, 5, 10 ou 15 aminoácidos, ou outros números intermediários na faixa de 1 a 20 conforme conveniente. O Iigante de peptídeo pode ser formado de qualquer resíduo de aminoácido geralmente conveniente, como em glicina e/ou serina. Um exemplo de Iigante apropriado é Gly₄Ser. Multímeros de tais ligantes podem ser utilizados, tais como, por exemplo, um dímero, um trímero, um tetrâmero ou um pentâmero, por exemplo, (Gly₄Ser)₂, (Gly₄Ser)₃, (Gly₄Ser)₄ ou (Gly₄Ser)₅. No entanto, em outras realizações no peptídeo Iigante está presente e o domínio V_L é ligado ao domínio V_H pelo laço de peptídeos.

A molécula aglutinante específica pode ser um análogo de um fragmento variável de cadeia única (scFv). Por exemplo, o scFv pode estar ligado a outras moléculas aglutinantes específicas (por exemplo, outras scFvs, Fab fragmentos de anticorpos e IgG anticorpos quiméricos (ou seja, com estruturas humanas)), O scFv pode estar ligado a outros scFvs para formar um multímero que é uma proteína de

16/54 aglutinação multi-específica, por exemplo um dímero, um trímero ou um tetrâmero. ScFv’s bi-específicos são às vezes chamados de diacorpos, tri-específicos de triacorpos e tetraespecíficos de tetracorpos.

Um scFv pode ser preparado por qualquer técnica apropriada utilizando técnicas padrão de química ou de biologia molecular. Em uma realização da invenção, os análogos de anticorpos monoclonais podem ser preparados como scFv's de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo humano intocado (McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990); e é descrita em WO 92/01047).

Outros construtos sintéticos que podem ser utilizados incluem peptídeos determinantes da região de complementaridade (CDR). Estes são peptídeos sintéticos compreendendo determinantes de antígeno aglutinantes. A imitação de peptídeos também pode ser utilizada. Estas moléculas são geralmente anéis orgânicos restritos de forma conformacional que imitam a estrutura de um laço CDR e que incluem cadeias laterais que interagem com antígenos.

Construtos sintéticos incluem moléculas quiméricas.

Dessa maneira, anticorpos humanizados ou derivados do mesmo estão dentro do escopo dos anticorpos para uso com a presente invenção. Métodos para humanizar anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica. O anticorpo pode se humanizado ao modificar a sequência de amino ácidos do anticorpo. Um exemplo de um anticorpo humanizado é um anticorpo contendo regiões de estrutura humana, mas regiões hipervariáveis de roedores (por exemplo de murinoe). Meios de produção de anticorpos quiméricos são discutidos, por exemplo, por Morrison et al. em PNAS, 81: 6.851 a 6.855 (1984) e por Takeda et al. em Nature, 314: 452 a 454 (1985). A humanização pode ser executada, por exemplo, como descrito por Jones et al. em Nature, 321: 522 a 525 (1986); Verhoeyen

17/54 et al. em Science, 239: 1534-1536; Riechmann et al. em Nature 332: 323 a 327, 1988. Métodos de redução da imunigenicidade das moléculas aglutinantes específicas da invenção podem incluir enxertos de CDR em um molde de estrutura de anticorpo apropriada ou remodelagem de resíduos de superfície variáveis, por exemplo, por metagênese de sítio direcionado ou outras técnicas de biologia molecular comumente utilizadas (Roguska et al., Protein Eng. 9 895-904 (1996)).

Outros métodos aplicáveis incluem a identificação de potenciais epítopos de células T dentro da molécula, e a subsequente remoção destes, por exemplo, por metagênese de sítio direcionado (de-imunização). Humanização das regiões CDR ou da seqüência da estrutura ao redor pode ser feita como desejado.

Construtos sintéticos também incluem moléculas compreendendo uma porção adicional que fornece a molécula com alguma propriedade desejada além da aglutinação com antígeno. Por exemplo, a porção pode ser um rótulo (ou seja, um rótulo florescente ou radioativo). Alternativamente, pode ser um agente farmaceuticamente ativo.

A presente invenção refere-se ao uso de uma molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-AI para o tratamento de doenças mediadas por células T.

A presente invenção pode ser utilizada para o tratamento de uma ampla gama de doenças que são mediadas por células T. No presente contexto, doença mediada por células T quer dizer qualquer doença ou condição na qual as células T têm um papel na patogênese ou desenvolvimento da doença ou condição. As doenças mediadas por células T são tipicamente causadas pela ativação aberrante de células T. Neste sentido, tais doenças podem ser tratadas pela prevenção da ativação das células T ao bloquear a atividade do Anx-AI. Tipicamente, as doenças mediadas por células T tratadas na presente

18/54 invenção são doenças nas quais células Thl têm um papel.

As doenças mediadas por células T incluem, mas não estão limitadas a, doença do enxerto contra hospedeiro, rejeição do enxerto, aterosclerose, HIV e/ou AIDS, psoríase e algumas doenças auto-imunes. As doenças auto-imunes que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM), lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença de Addison, doença de Grave, esclerodermia, polimiosite, algumas formas de diabetes Mellitus (por exemplo diabetes juvenil), uveoretinite autoimune, colite ulcerosa, pênfigo vulgar, doença inflamatória intestinal e tireoidite auto-imune. A doença mediada por células T é tipicamente artrite reumatóide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico ou aterosclerose.

A doença mediada por células T é tipicamente a artrite reumatóide. Na artrite reumatóide (RA), acredita-se que as células T reconhecem e interagem com células apresentadoras de antígenos no sinovial. Uma vez ativadas, estas células produzem citocinas e moléculas efetoras; esta produção sequencial e expandida de citocinas constitui a cascata de citociná que resulta na ativação de macrófagos e a indução do processo inflamatório, culminando na degradação e reabsorção de cartilagem e ossos. Com o passar do tempo, podem ocorrer a erosão dos ossos, a destruição de cartilagem, e a perda completa da integridade das juntas. Eventualmente, múltiplos sistemas de órgãos podem ser afetados.

Em outra realização, a doença mediada por célula T é a aterosclerose. A inflamação tem um papel chave na doença de artéria coronária e outras manifestações da aterosclerose. Células imunes dominam lesões ateroscleróticas iniciais, a suas moléculas efetoras aceleram a progressão das lesões, e a ativação da inflamação pode suscitar síndrornes coronárias agudas. A imunidade adaptativa está altamente envolvida na

19/54 aterogênise uma vez que foi demonstrado que ela interage com fatores de risco metabólico para iniciar, propagar e ativar lesões na árvore arterial.

Dois modelos de camundongo com características de hipercolesterolemia e desenvolvimento rápido de, aterosclerose, o ApoE'^z‘ e o camundongo knockout para receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDLR’^Z_) são úteis no estudo da aterosclerose uma vez que eles imitam a composição celular de lesões humanas, particularmente no conteúdo de linfócitos T. O recrutamento de linfócitos é aumentado e as artérias dos camundongos propensos a aterosclerose ApoE'^z' mesmo bem antes do surgimento da patologia.

A presença de linfócitos T tem consequências funcionais, pois a sua completa ausência reduz a formação de lesões durante hipercolesterolmia moderada. CD4+ IFN- ycélulas aj udantes secretantes tipo-1 (Thl) são o tipo predominante de célula T encontrado em placas, e estas células T exercem efeitos pró-aterogênicos e desestabilizadores de placas.

Os autores da presente invenção têm descoberto agora que a Anx-Al é expressa em placas ateroscleróticas tanto humanas quanto de de murinoe e que há uma correlação entre a expressão da Anx-Al e MS em um modelo de camundongo.

Em outra realização, a doença mediada por célula T é lúpus eritematoso sistêmico (LES). Os autores da presente invenção descobriram agora que Anx-Al mRNA e proteína são expressas em níveis mais altos em células T de pacientes de LES que em células T de voluntários saudáveis.

Em relação à habilidade da Anx-Al de favorecer a diferenciação de células Thl, a presente invenção também pode ser utilizada, por exemplo, para limitar respostas celulares de proteção sem controle (Thl) contra patogênicos e para tratar infecções extracelulares (resposta Th2) ao suprimir a

20/54 diferenciação Thl e favorecendo a diferenciação Th2.

A molécula aglutinante específica que aglutina com Anx-Al é especialmente formulada para uso com um carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente. A presente invenção engloba desse modo uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula aglutinante específica que aglutina com a Anexina-1 (Anx-Al) para uso no tratamento de doença mediada por célula T. A composição farmacêutica compreende uma molécula aglutinante específica que aglutina com a Anexina-1 (Anx-Al) e um carreador farmaceuticamente aceitável, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente. Tais composições podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica da farmácia, por exemplo, ao misturar o ingrediente ativo com o carreador, excipiente, veículo, adjuvante e/ou diluente sob condições estéreis.

Carreadores, excipientes, veículos, adjuvantes e/ou diluentes apropriados são bem conhecidos no estado da técnica e incluem solução salina, tampão de fosfato-solução salina (PBS), carboximetilcelulose (CMC), metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), dextrose, liposomos, álcool polivinílico, amido de grau farmacêutico, manitol, lactose, estearato de magnésio, sacarina sádica, talco, celulose, glicose, sacarose (e outros açúcares), carbonato de magnésio, gelatina, óleo, álcool, detergentes, emulsificantes ou água (de preferência estéril). A molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al pode ser formulada como uma formulação líquida, que consiste geralmente em uma suspensão ou solução da molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al em um carreador ou carreadores líquidos aquosos ou não aquosos, por exemplo, água, etanol, glicerina, polietileno glicol (PEG) ou um óleo.

Tipicamente, quando a molécula aglutinante

21/54 específica que se aglutina a Anx-Al é um anticorpo, o anticorpo é PEGuilado, isto é, covalentemente fixado a um polietileno glicol. Tipicamente, isto tem o efeito de reduzir a imunogenicidade e aumentar a meia vida do dito anticorpo.

A molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al pode ser administrada sozinha ou conjuntamente com outro agente.

A molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al para uso na presente invenção é tipicamente administrada em um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Tal quantidade é uma quantidade eficaz para melhorar, eliminar ou evitar um ou mais sintomas da doença mediada pela célula T. De preferência, o indivíduo a ser tratado é um ser humano. No entanto, a presente invenção é igualmente aplicável à medicina humana ou veterinária. Por exemplo, a presente invenção pode encontrar uso no tratamento de animais de estimação, como cães e gatos, ou animais de trabalho, como cavalos de corrida.

A molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al pode ser administrada ao indivíduo através de qualquer meio apropriado. A molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al pode ser administrada sistemicamente, em particular, intra-articularmente, intra-arterialmente, intraperitoneaImente (i.p.), intravenosamente ou intramuscularmente. No entanto, a molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al também pode ser administrada através de outras rotas entericas ou parenteral como rotas de administração subcutânea, intradérmica, tópica (incluindo bucal, sublingual ou transdérmica), oral (incluindo bucal ou sublingual), nasal, vaginal, anal, pulmonar ou outra rota de administração apropriada.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades

22/54 distintas como cápsulas ou tabletes; como pós ou grânulos; como soluções, xaropes ou suspensões (em líquidos aquosos ou não aquosos; ou como cremes ou espumas comestíveis; ou como emulsões). Os excipientes apropriados para tabletes ou cápsulas gelatinosas duras incluem lactose, amido de milho ou derivados destes, ácido esteárico ou sais disto. Os excipientes apropriados para uso com cápsulas gelatinosas macias incluem, por exemplo, óleos vegetais, ceras, gorduras, polióis líquidos ou semi-sólidos, etc. Para a preparação de soluções e xaropes, os excipientes que podem ser utilizados incluem, por exemplo, água, polióis e açúcares. Para a preparação de suspensões, os óleos (por exemplo, óleos vegetais) podem ser utilizados para propiciar suspensões óleo em água ou água em óleo.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como adesivos distintos destinados para permanecerem em contato próximo com a epiderme do recipiente durante um período de tempo prolongado. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser distribuído a partir do adesivo através de iontoforese conforme geralmente descrito em Pharmaceutical Research, 3 (6) :318 (1986) .

As composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como pomadas, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, aspersores, aerossóis ou óleos. Para infecções do olho ou outro tecido externo, por exemplo, boca e pele, as composições são, de preferência, aplicadas como um creme ou pomada tópica. Quando formulado como uma pomada, o ingrediente ativo pode ser empregado ou com uma base de pomada miscível em água ou parafínica. Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser formulado em um creme com uma base de creme óleo em água ou uma base água em óleo. As

23/54 composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica ao olho incluem gotas para os olhos nas quais o ingrediente ativo é dissolvido ou suspenso em um carreador apropriado, especialmente um solvente aquoso. As composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica na boca incluem comprimidos, pastilhas e colutório bucal.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração retal podem ser apresentadas como supositórios ou enemas.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração nasal em que o carreador é um sólido incluem um pó não refinado que tem um tamanho de partícula, por exemplo, que se situa na faixa de 20 a 500 micra que é administrado de maneira na qual ocorre a aspiração, isto é, através de uma rápida inalação através da passagem nasal de um recipiente do pó mantido fechado até o nariz. As composições apropriadas, em que o carreador é um líquido, para administração como uma aspersão nasal ou como gotas nasais, incluem soluções aquosas ou oleosas do ingrediente ativo.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração através de inalação incluem névoas ou poeiras de partículas finas que podem ser geradas por meio de vários tipos de insufladores, nebulizadores ou aerossóis pressurizados de dosagem medida.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de aspersão.

As composições farmacêuticas adaptadas para administração parenteral incluem solução de injeção estéril aquosa ou não aquosa que pode conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que produzem a formulação substancialmente isotônica com o sangue do recipiente

24/54 planejado; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. Os excipientes que podem ser utilizados para soluções injetáveis incluem água, alcoóis, polióis, glicerina e óleos vegetais, por exemplo. As composições podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou de múltiplas doses, por exemplo, frascos e ampolas vedadas, e podem ser armazenadas em uma condição secada por congelamento (liofilizada) que exige apenas a adição de líquido estéril carreado, por exemplo água, para injeções, imediatamente antes do uso. As soluções e suspensões de injeção extemporânea podem ser preparadas a partir de tabletes, grânulos e pós estéreis.

As composições farmacêuticas podem conter agentes de preservação, agentes de solubilização, agentes de estabilização, agentes de agentes umectantes, emulsificadores, adoçantes, colorantes, odorantes, sais, tampões, agentes de revestimento ou antioxidantes. Os mesmos podem conter agentes terapeuticamente ativos em adição à molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al.

A dose da molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al a ser administrada de acordo com vários parâmetros, especialmente de acordo com a molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al utilizada; a idade, peso e condição do paciente a ser tratado; a rota de administração; e o regime requerido. Um médico estará apto a determinar a rota requerida de administração e dosagem para um paciente particular.

Esta dosagem pode ser repetida sempre que for apropriado. Se forem desenvolvidos efeitos colaterais, a quantidade e/ou frequência da dosagem pode ser reduzida, de acordo com as práticas clínicas normais.

Para a administração em mamíferos e, particularmente, seres humanos, espera-se que a dosagem

25/54 diária do agente ativo se situe na faixa entre 1 pg/kg e 10 mg/kg do peso corpóreo, e tipicamente de aproximadamente 10 pg/kg a 1 mg/kg do peso corpóreo. O médico, em qualquer caso, determinará a dosagem real que será mais apropriada para um indivíduo que será dependente de fatores incluindo idade, peso, sexo e resposta do indivíduo. As dosagens acima são exemplificadoras do caso médio. Pode haver, claro, instâncias nas quais dosagens superiores ou inferiores são merecidas, e as mesmas se encontram dentro do escopo desta invenção

Em um segundo aspecto da invenção, é apresentado o uso de uma molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al na fabricação de um medicamento para o tratamento da doença mediada pelas células T.

Em um terceiro aspecto da invenção, é apresentado um método para o tratamento da doença mediada pelas células T, o qual compreende a administração, em um indivíduo com necessidade da mesma, de uma quantidade terapêutica de uma molécula aglutinante específica que se aglutina a Anx-Al. Conforme registrado acima, o método de tratamento pode ser para um indivíduo animal humano e a invenção se estende igualmente aos métodos de tratamento para uso na medicina veterinária e/ou humana.

As características preferidas para o segundo e terceiro aspectos da invenção são tal como o primeiro aspecto com as mudanças necessárias.

A invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos e Figuras que são apresentadas para propósitos de ilustração apenas e não são destinadas a serem construídas como limitantes para a invenção. A referência é feita ao número das Figuras, em que;

A Figura IA é um diagrama de fita de estrutura de anexina-1 mostrando as quatro anexinas se repetindo e o domínio W-terminal. A Figura IB é uma representação

26/54 esquemática da repetição de anexina e a localização da sequência de bioativos, anexina-1 peptídeo Ac.2-26. A Figura 1C mostra a sequência de aminoácidos do peptídeo Ac.2-26, que é um fragmento de peptídeo acetilado N-terminal de Anx-Al.

A Figura 2a mostra (i) a seqüência de aminoácidos e (ii) a seqüência de nucleotídeos de humanos anexina-1 (AnxAl), isoforma ANXA 1-003. A Figura 2b mostra a seqüência de aminoácidos de humanos anexina-1 (Anx-Al), isoforma anxai002. A Figura 2c mostra a seqüência de aminoácidos de humanos anexina-1 (Anx-Al), isoforma AnxAl -004. A Figura 2d mostra a seqüência de aminoácidos de humanos anexina-1 (Anx-Al), isoforma ANXA 1-006.

A Figura 3 mostra o efeito de recombinante humano de anexina-1 (hrAnx-Al) na ativação de células T. O prétratamento de murino CD4 + células primárias com hrAnx-Al seguido por ativação com diferentes concentrações de antiCD3/CD28 proliferação celular aumentada (Figura 3A), IL-2 de produção (Figura 3B) e de expressão na superfície celular de CD25 e CD69 (Figuras 3C e 3D).

A Figura 4 mostra que Anx-Al endógena modula a proliferação das células T. Estimulação da Anx-Al <+/+> ou Anx-AF <7 > células T com anti-CD3, anti-CD3/CD28 ou PMA / lonomicina mostrou uma taxa de redução de incorporação de<3> H-timidina (Figuras 4A, 4B e 4C, respectivamente) e IL-2 de produção (Figura 4D) na Anx-Al células T deficiente em relação ao controle de células T não estimuladas.

A Figura 5 mostra a ativação do Ativator de Proteína-1 (AP-I), Nuclear Factor-KB (NF-KB) e Fator Nuclear de células T ativadas (NFAT), na presença ou ausência de AnxAl (Figura 5A), e um comparação entre a ativação do AP-I, NF[kappa] B e NFAT em Anx-Al <+/+> e Anx <A> células T (Figura 5B) .

A Figura 6A mostra análise FACS de expressão FPRL-I

27/54 em células T estimuladas com anti-CD3/CD28 (5,0 [mu] g/ml) para os tempos indicados. A Figura 6B mostra a localização celular da Anx-Al em células T antes (do controle) ou após estimulação com anti-CD3/CD28 (5,0 [mu] g/ml). A Figura 6C é uma representação esquemática do papel da Anx-Al / FPRL-I em células T do sistema.

A Figura 7 mostra que exógenos e endógenos Anx-Al modulam a diferenciação Thl/Th2. A Figura 7A mostra os resultados quando células T de nós linfãticos virgens foram diferenciadas in vitro em Thl (barras pretas) ou condições Th2 (barras brancas) na presença ou ausência de hr Anx-A 1 e depois reestimuladas com placa de ligação anti-CD3 para medir Thl ou produção de citosinas Th2. A Figura 7B mostra os resultados quando células T de nós linfãticos virgens da AnxAl ^+/+ ou Anx-Al'de camundongos foram diferenciadas in vitro em Thl (primeiro e segundo gráficos de coluna da esquerda) ou Th2 (terceiro e quarto gráficos de colunas da esquerda) e depois as condições reestimuladas com placa de ligação antiCD3 para medir Thl ou produção de citosinas Th2.

A Figura 8 mostra o volume da pata (Figura 8A) e classificação clínica (Figura 8B) de camundongos tratados com PBS DBA ou hrAnx-Al por 12 dias durante a fase de imunização do modelo da artrite induzida por colágeno (CIA). A Figura 8C é uma análise da expressão de Anx-Al em células CD4 + de voluntários saudáveis de controle (HC) ou artrite reumatóide (AR) . A Figura 8D mostra uma análise imuno-histoquímica da expressão de Anx-Al no tecido sinovial de pacientes com AR.

A Figura 9 mostra os efeitos do comprimento total hrAnx-Al e peptídeo N-terminal Ac 2-26 na ativação de células T.

A Figura 10 mostra a expressão da Anx-Al em placas ateroscleróticas humanas. Análise imunoistoquímica da expressão de Anx-Al com anticorpo monoclonal anti-humano Anx

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Al anticorpos IB (Figura 10A) ou com IgG não-imune (Figura 10B) em placas ateroscleróticas da carótida removidos de pacientes durante a cirurgia endarteretomia carótida. As fotografias são de um único paciente e representante de seis diferentes pacientes com condições semelhantes.

A Figura 11 mostra uma expressão da Anx-Al em placas ateroscleróticas de murino. A Figura 11 mostra uma visualização de imunofluorescência Anx-Al em ApoE“^z' de camundongos da aórtica sinusal (Figura HA e Figura HB) e da artéria braquiocefãlica (Figura 11C). Os cortes foram corados com DAPI para localizar os núcleos. Os resultados ilustrados são de uma única experiência e são representativos de três experimentos separados. Ampliação original: 200 x (Figura HA e Figura 11B), x 400 (Figura 11C).

A Figura 12 mostra a expressão da anexina-1 em Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES). 0 RT-PCR (painel superior) e análise Western Blot (painel inferior) da expressão de AnxAl em células T de pacientes saudáveis (Controle) ou com lúpus eritematoso sistêmico (LES). Os números na figura indicam o volume (pl) de cDNA ou a quantidade (pg) de proteínas obtidos a partir do mesmo número (2x10^s) de células T coletadas de pacientes saudáveis (controle) ou com Lúpus Sistêmico eritematoso sistêmico (LES).

A Figura 13 mostra a inibição da ativação do receptor de células T (TCR), medida em termos de interleucina-2 (IL-2) de produção, em células T periféricas de um doador incubados com um anticorpo monoclonal neutralizante levantado contra a recombinante humana anexina1 (anti-AnxAl mAblA).

A Figura 14 mostra a inibição da ativação do receptor de células T (TCR), medido em termos de produção de interleucina-2 (IL-2) , em células T periféricas de um doador diferente incubadas com um anticorpo monoclonal neutralizante

29/54 levantadas contra a recombinante humana anexina-1 (anti-AnxAl mAblA),

A Figura 15 mostra as seções da medula espinhal de camundongos C57BL / 6 imunizados com MOG_{3S a 55} e CFA e dos quais a medula espinhal foi removida no dia 12 (pontuação 0), dia 18 (pontuação 2) e dia 20 (pontuação 4). Os cortes foram corados com hematoxilina e eosina (Η & E, Figura 15A) ou anti-AnxAl (Figura 15B) . Para cada coloração, os painéis de direita (20X) mostram uma maior ampliação de uma área de painéis de esquerda (4X), Resultados representativos de três experimentos.

A Figura 16 mostra as seções da medula espinhal de camundongos C57BL / 6 imunizados com MOG35-55 e CFA e dos quais a medula espinhal foi removida no dia 20 (pontuação 4). Os cortes foram corados com anti-AnxAl e anti-CD3 (A) ou anti-F4/80 (B) . Os painéis da direita mostram uma sobreposição das duas colorações únicas à direita. Resultados representativos de três experimentos.

A Figura 17 mostra os resultados de um estudo em que camundongos C57BL / 6 foram imunizados com MOG_3S-s5 ^e CFA e monitorados diariamente para sinais e sintomas da EAE (A) ou o peso ganho / perdido (B) por 23 dias. Resultados são meios ± SEM (n = 10/grupo). ** P <0,01, representante de três experimentos.

A Figura 18 mostra a incorporação de ³ H -Timidina (A) e a produção de IL-2 (B) de células do de nó linfático obtidos AnxAl^+/+ e AnxAl’⁷' camundongos imunizados com MOG_{35 a S5} e CFA e sacrificados após 14 dias. As células foram estimuladas com MOG^{35 a 55} por 48 horas e pulsadas com IpCi ³HTimidina por 12 horas. Os sobrenadantes celulares foram utilizados para medir a produção de IL-2. Resultados são meios ± SEM (n = 4/grupo). * p<0,05, ** p 0,01, representante de três experimentos.

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A Figura 19 mostra o número total de células do baço (A) e nó linfático (B) células obtidas a partir ΑηχΑ1^+/+ e AnxAl^' camundongos imunizados com MOG_{35 a 55} e CFA e sacrificados após 14 dias. C e D mostram a análise citofluométrica de células de nó linfático com anti-CD4 FITC e anti-CD8 PE. Resultados são meios ± SEM (n = 10/grupo). ** P <0,01, representante de três experimentos.

A Figura 20 mostra níveis de (A) IFN-γ, (B) IL-2, (C) TNF-ot e (D) IL-17 nos sobrenadantes celulares de células de nódulos linfáticos obtidas de camundongos imunizados AnxAl^+/+ e AnxAl'⁷' com MOG_{35 a 55} e CFA e sacrificados após 14 dias. As células fora estimuladas com a concentração indicada de MOG_{35 a 55} por 4 dias e os sobrenadantes utilizados para ELISA de ci tos ina. Os resultados são ± SEM médias (n=4/grupo) . * p<0,05, ** p<0,01, representativo de 3 experimentos.

A Figura 21 mostra o manchamento de haematoxilineosina de seções da medula espinhal obtidas de camundongos imunizados AnxAl^+/+ (A) e AnxAT'⁷ (B) com MOG_{35 a 55} e CFA e sacrificados após 22 dias. Para cada manchamento, os painéis direitos (20X) mostram uma magnificência maior de uma área dos painéis esquerdos (4X) . As seções consecutivas foram manchadas com anti-CD3 (C) ou anti-F4/80 (D). As fotografias são representativas de três experimentos separados com resultados similares.

A Figura 22 mostra a análise FACS de células mononucleares positivas CD3 (A) e F4/80 (B) recuperadas por gradiente de Percoll de homogeneizados da medula espinhal obtidos de camundongos imunizados AnxAl^+/+ e AnxAl'^ com MOG_{3S a} 55 e CFA e sacrificados após 14 dias. Os gráficos de ponto e histogramas são de um único camundongo e representativos de 2 experimentos com n=4 camundongos. Os números nos histogramas indicam a porcentagem de células CD3* e F4/80⁺·

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Exemplos 1 a 10

Materiais e Métodos

Reagentes

O anti-CD3 de camundongo (clone 145-2C11), antiCD28 de camundongo (clone 37.51), anti-CD3 de ser humano (clone 0KT3), anti-CD28 de ser humano (clone CD28.2), antiCD69 conjugado com PE (clone H1.2F3), anti-CD25 conjugado com FITC (clone PC61.5), IL-2 murino, IL-4, IFN-γ, IL- 12, antiIL-4 (clone 11B11), e anti-IFN-γ (clone XMG1.2) foram comprados da eBioscience (Wembley, Reino Unido). O Anx-Al recombinante humano livre de endotoxina (hrAnx-Al) foi preparado conforme descrito. Em alguns experimentos, foi utilizado o hrAnx-Al desnaturado (inativo por calor a 95^QC durante cinco minutos) como controle positivo. Exceto se especificado o contrário, todos os outros reagentes eram da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EUA).

Camundongos

Os camundongos machos BALB/C, C57/BL6 e DBA/1 foram obtidos junto à Charles River Laboratories (Wilmington, MA, EUA). Os camundongos sem anexina 1 em BALB/C foram gerados em nosso laboratório e criados em condições livres de patogenia em nossas facilidades animais. Todos os camundongos utilizados nesses estudos tinham entre seis e oito semanas de idade. O trabalho animal foi realizado de acordo com as normas do Ministério do Interior no Reino Unido (Lei da Orientação na Operação de Animais e Procedimentos Científicos de 1986) e conforme as diretrizes da União Européia.

Isolamento de células de pacientes

As Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram preparadas a partir de sangue periférico utilizando centrifugação por densidade Ficoll (Ficoll-Paque Plus; Amersham Biosciences, Freiburg, Alemanha). As células CD4⁺ foram selecionadas a partir de sangue periférico

32/54 utilizando uma seleção positiva. Resumidamente, o sangue periférico foi submetido à Centrifugação Ficoll por densidade (Ficoll-Pague Plus; Amersham Biosciences). Células aderentes foram removidas das células mononucleares através da aderência ao plástico revestido por soro. As células nãoaderentes foram incubadas com anticorpo CD4 anti-humano de camundongo (RFT4), lavadas em tampão (solução salina tamponada com fosfato [PBS], 0,5% albumina de soro bovino [BSA] , 2 mM EDTA pH 7.2) e incubadas com anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado a cápsula magnética (Miltenyi Biotec, Auburn, Califórnia, EUA). As células são passadas por uma coluna magnética MACS (Miltenyi Biotec) e as células CD4⁺ foram coletadas, A pureza das células foi acessada por citometria de fluxo. A porcentagem mediana de células CD3⁺ CD4⁺ que seguem as dez depleções foi 98% (faixa, 97%-99.3%). As células restantes foram ressuspensas em tampão de lise (Ambion, Huntingdon, Reino Unido).

Cultura Celular

As células T de murino primárias foram preparadas a partir de nós de linfa por seleção negativa. Brevemente, os nós de linfas axilares, inguinais, e mesentéricos foram separados delicadamente para fazer uma suspensão de célula única e posteriormente lavados e dispostos em camadas sobre Ficoll. A camada de células brancas foi lavada duas vezes e, então, incubada com a mistura de anticorpos e as cápsulas magnéticas seguindo as instruções do fabricante (kit de isolamento negativo de célula T de camundongo; Dynal, Bromborough, Reino Unido). Em alguns experimentos, as células foram adicionalmente purificadas para obter células T virgens CD62L⁺ CD4+ através do uso do kit de isolação de célula Miltenyi Biotec T CD62L⁺ CD4+. As condições ThO foram criadas pelas células T por quatro dias em placas pré-revestidas com 96 cavidades com anti-CD3 (5 pg/ml) e anti-CD28 (5 pg/ml) em

33/54 meio RPMI completo (10% soro fetal bovino [FCS] , 2 mM Lglutamina, e 100 unidades ml'¹ gentamicina) contendo IL-2 de murino (20 U/ml). As condições Thl foram criadas com IL-12 de murino (3,4 ng/ml; eBioscience), IL-2 (20 U/ml; eBioscience), e anti-IL4 (clone 11IB11; 2 pg/ml). As condições Th2 foram criadas com IL-4 (3000 U/ml; Peprotech, Rocky Hill, NJ) , IL-2 (20 U/ml), e anti-IFN-γ (clone XMG1 .2; 2 pg/ml). As células Jurkat foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas em meio RPMI completo.

Análise citométrica de fluxo

As células T purificadas de nó de linfa foram prétratadas com recombinante humano Anx-Al por duas horas a 37°C em tubos Eppendorf e, então, estimuladas com anti-CD3 e antiCD28 fixados por placa como indicado nas Figuras. Após dezesseis horas, as células foram manchadas com anti-CD69 conjugados com PE (clone H1.2F3) e anti-CD25 conjugados com FITC (clone PC61.5), diluídas em tampão FACS (PBS contendo 1% FCS e 0,02% NaN₂) . As células intactas foram passadas através do uso de um dispersor lateral e dianteiro e foram analisadas com o programa CellQuest (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA) em um citômetro de fluxo FACScan. Para analisar a expressão FPRL-I, células T de sangue humano foram estimuladas com anti-CD3 e anti-CD28 fixados por placa por tempos diferentes e, consequentemente, manchadas com camundongo anti-humano FPRL-I (clone 6C7-3-A; 5 pg/ml), seguido por anticorpo conjugado FITC.

Teste de proliferação de célula

As células T de nó de linfa purificadas (105 células/ml) foram incubadas com um único meio ou com concentrações diferentes de hrAnx-Al por duas horas a 37°C em tubos Eppendorf. Consequentemente, as alíquotas de 200 pl de suspensão de célula foram estimuladas por anti-CD3 e antiCD28 fixados por placa durante 24 horas em placas com 96

34/54 cavidades. Após dezoito horas, as culturas foram pulsadas por oito horas com 1 pCi (3,7 x 10⁴ Bg) [³H] -timidina (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) e a radioatividade incorporada foi medida pelo contador de cintilação automatizado (Packard Instruments, Pangbourne, Reino Unido).

Ensaio de deslocamento de eletromobilidade

Os extratos nucleares colhidos de células 3 x 10^€ to 5 x 10^£ de acordo com os protocolos previamente descritos. Os extratos nucleares (de 3 pg a 5 pg) foram incubados com 1 pg (para NFAT) ou 2 pg (para NF-κΒ e AP-I) de poli (dI:dC) em 20 pl de tampão aglutinante com sondas de oligonucleotídeos de filamento duplo com marcação terminal³²? (5 x 10^s cpm) , e fracionados em um gel de poliacrilamida a 5% (razão de 29:1 de reticulação) em 0,5% TBE por duas horas e meia a 150 V. O NF-κΒ e o tampão aglutinante AP-I (lOx) continham 100 mM de Tris-HCl, (pH 7,5), 500 mM de NaCl, 10 mM de EDTA, 50% glicerol, 10 mg/ml albumina, 30 mM de GTP, 10 mM de DTT. 0 tampão aglutinante NFAT (lOx) continha 100 mM de Hepes (pH 7.9), 500 mM de KC1, 1 mM de EDTA, 1 mM de EGTA, 50% de glicerol, 5 mg/ml de albumina, 1% de Nonidet P-40, 10 mM de DTT. O NF-κΒ e as sondas de oligonucleotídeos de filamento duplo AP-I foram obtidos junto à Promega e o NFAT junto à Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Califórnia, EUA).

Análise de transferência Western

As células T de nõ de linfa foram incubadas tal como indicado nas Figuras. Após a incubação a 37°C por vários períodos de tempo, as células foram lisadas em tampão de lise gelado (1% NP-40, 20 mM de Tris pH 7.5, 150 mM de NaCl, 1 mM de MgC12, 1 mM de EGTA, 0,5 mM de PMSF, 1 pM de aprotinina, 1 pM de leupeptina, 1 pM de pepstatina, 50 mM de NaF, 10 mM de Na₄P₂O₇, e 1 mM de NaV04, 1 mM de β-glicerofosfato) . Os lisados das células foram centrifugados a 13/226 g (13.000 rpm) por cinco minutos a 4 °C e os sobrenadantes foram

35/54 coletados e submetidos a eletroforesis a poliacrilamida gel SDS-10%. Após a transferência, as membranas foram incubadas de um dia para o outro com anticorpos diluídos em solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20 (TTBS: 0,13 M de NaCl; 2.68 mM de KC1; 0,019 M de Tris-HCl; 0,001% vol./vol. Tween-20; pH 7.4) com 5% de leite desnatado em pó a 4°C.

Para os experimentos com anti-pERKl/2 e anti-Akt, o tampão de TTBS foi suplementado com NaF a 50 mM e albumina de soro bovino (5%) foi utilizada em vez de leite. Para cada condição, os equivalentes de extrato obtidos a partir do mesmo número de células foram utilizados. A imunotransferência e a visualização de proteínas por quimiluminescência intensificada (ECL; Amersham Pharmacia Biotech) foram executadas de acordo com as instruções do fabricante. Para obter frações citosólicas e de membrana, as células foram primeiramente coletadas e lavadas em PBS resfriado por gelo e, então, centrifugada brevemente por dois minutos a 300g. O pélete de célula resultante foi lisado em tampão de lise (Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5; inibidores de protease conforme listado no tampão de lise) e passadas através de uma agulha com calibre 25 pelo menos cinco vezes para assegurar a lise suficiente. A suspensão foi, então, centrifugada por dois minutos a 300 g, o sobrenadante coletado, e centrifugado novamente por 45 minutos a 800 g (4^BC)· Neste estagio, o sobrenadante (fração citosólica) foi coletado e o pellet (fração de membrana) ressuspenso em tampão de lise contendo Triton X-100 a 1% (volume/volume). Todas as frações foram mantidas em gelo por todos os experimentos.

ELISA em Citoquina

Para a análise de produção de citoquina Thl/Th2, as células Th0/Thl/Th2 (10⁶/ml) obtidas após diferenciação de quatro dias em condições de inclinação e um dia de repouso em

36/54 meio de RPMI completo, foram estimuladas com anti-CD3 ligado à placa (5 pg/ml) por oito horas em placas de 24 cavidades. Os sobrenadantes da cultura foram coletados e analisados por IFN-γ, teor de IL-2, IL-4 e IL-10 através do uso do kit ELISA de painel Thl/Th2 (eBioscience). 0 kit ELISA de IL-13 também foi adquirido junto à eBioscience.

Exemplo 1 - Efeito de Anexina-1 recombinante humano (hrAnx-Al) na ativação da célula T

As células T de nó de linfa virgens de camundongo

foram estimuladas	com 5,0	() ,	2,5	(A) e	1,25 (A) pg/ml de
anti-CD3/CD28	na	ausência	ou	na	presença de diferentes
concentrações	de	hrAnx-Al	por	24	horas	e foram, então,
pulsadas com	3H-	timidina	para	medir a	proliferação. Os

resultados são mostrados na Figura 3A.

A Figura 3B mostra a produção de IL-2 a partir de células T de nó de linfa virgens de camundongo primárias estimuladas com anti-CD3/CD28 (1,25 pg/ml) na ausência de ou na presença de concentrações diferentes de hrAnx-Al por 24 horas.

As células T de nó de linfa virgens de camundongo foram estimuladas com anti-CD3/CD28 a uma concentração de 1,25 pg/ml (coluna esquerda), 2,5 pg/ml (coluna do meio) e 5/° pg/ml (coluna da direita), na ausência de (painéis superiores) ou na presença de (painéis inferiores) de hrAnxAl (600nM) por doze horas e, então, analisadas por expressão de CD25 e CD69 por FACS. Os resultados são mostrados na Figura 3C.

Na Figura 3D, as células T de nó de linfa virgens de camundongo foram estimuladas com a concentração indicada de anti-CD3/CD28 na presença de 150 (X) , 300 (*) e 600 (O) nM de hrAnx-Al por 12 horas e, então, analisadas por expressão de CD25 (gráfico esquerdo) e CD69 (gráfico direito) por FACS.

37/54

Em todos os experimentos, os valores são a média +erro padrão de n=3-4 de camundongo. *P<0,05; **P<0,01.

Os resultados mostram que o pré-tratamento de células primarias CD4+ virgens de camundongo com hrAnx-Al seguido por ativação com concentrações diferentes de antiCD3/CD28 aumentou a proliferação celular (Figura 3A), a produção de IL-2 (Figura 3B) e a expressão de superfície celular de CD25 e CD69 (Figuras 3C e D).

Exemplo 2 - Proliferação de Célula T de Modulados de Anx-A Endógenos

A Figura 4 mostra que: (A) anti-CD3 (5,0 pg/ml), (B) anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml) ou (C) PMA (20 ng/ml) e lonomicina (2 ng/ml) induziram a proliferação de células T deficientes de Anx-Al e do tipo selvagem, expressadas como uma porcentagem de incorporação de ³H-timidina em comparação com as células T não estimuladas de controle. Em alguns experimentos, as células também foram ativadas na presença de IL-2 reçombinante de camundongo (20 ng/ml). Os valores são a média +- erro padrão de n=4-5 tt P<0,01 vs. células Anx-Al^+/+ estimuladas com IL-2; **P<0,01 vs. células Anx-Al^+/+ estimuladas com anti-CD3, anti-CD3/CD28 ou PMA/ionomicina; §§P<0,01 vs. células Anx-Al’^z estimuladas com anti-CD3, antiCD3/CD28 ou PMA/ionomicina.

A Figura 4D mostra a produção de IL-2 a partir de células T de nó de linfa virgens estimuladas com anti-CD3, anti-CD3/CD28 (5,0 pg/ml) ou PMA (20 ng/ml) e lonomicina (2 ng/ml) por 24 horas. Os valores são média +- erro padrão de n=4-5 de camundongo. **P<0,01.

Os resultados mostram que o estímulo de células T de Anx-Al^+/+ ou Anx-Al^_/ com anti-CD3, anti-CD3/CD28 ou PMA/ionomicina mostrou uma taxa diminuída de incorporação de ³H-timidina (Figuras 4A, 4B e 40, respectivamente) e de produção de IL-2 (Figura 4D) nas células T deficientes de

38/54

Anx-Al em comparação às células T não estimuladas de controle.

Exemplo 3 - Ativação de AP-1, NF-κΒ e NFAT na presença ou ausência de Anx-Al

As investigações foram executadas sobre como o AnxAl exógeno e endógeno modula a ativação da célula T. Os três ativadores transcricionais principais de células T, a saber, Proteína Ativadora 1 (AP-1), Fator Nuclear KB (NF-KB) e Fator Nuclear de Célula T Ativadas (NFAT) foram analisados em células estimuladas na presença de hrAnx-Al.

A Figura 5A é um Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforêtica para ativação de AP-1, NF-κΒ e NFAT em células T estimuladas com anti-CD3/CD28 (1,25 pg/ml) na presença ou ausência da concentração indicada de hrAnx-Al. A Figura 5B mostra uma comparação da ativação de AP-1, NF-κΒ e NFAT em células T de Anx-Al^+Z+ e Anx^z estimuladas com antiCD3/CD28 (5,0 pg/ml).

Os resultados demonstraram a ativação aumentada de todos os três fatores de transcrição (Figura 5A) . Adversamente, as células T de Anx-Al'⁷' mostraram uma ativação diminuída destes fatores de transcrição em comparação aos seus integrantes do mesmo grupo de controle (Figura 5B).

Exemplo 4 - Externaiização de FPRL-I e Anx-Al em células T

Foi investigado se as células T expressam o receptor para Anx-Al, o Receptor de Formil Peptídeo Like-1 (FPRL-I). O manchamento de FACS de células T de Sangue Periférico (PBT) humano não estimuladas com anticorpo monoclonal anti-FPRL-1 específico não demonstrou expressão de receptor. Entretanto, o estímulo com anti-CD3/CD28 induziu a externalização de FPRL-I dentro de uma hora seguida por uma expressão em estado fixo estável sobre a superfície celular (Figura 6A) . Interessantemente, um padrão similar foi

39/54 observado para Anx-Al. Dessa forma, a análise de distribuição de Anx-Al em PBT humano demonstrou que a proteína é uniformemente distribuída entre o citosol e a membrana.

Entretanto, quando as células foram estimuladas com antiCD3/CD28, o acúmulo de Anx-Al na membrana foi observado.

A proteína é, então, exportada para o lado externo da membrana e liberada no ambiente extracelular. Consistente com este modelo, quando se imunoprecipitou Anx-Al a partir do sobrenadante de cultura de PBT humano estimulado com antiCD3/CD28, foi observada uma liberação aumentada de Anx-Al em comparação às células não estimuladas de controle (Figura 6B). Coletivamente, estas observações demonstram que a sinalização através do TCR aumenta a liberação de Anx-Al, concomitantemente com a regulação ascendente de seus receptores.

Em condições fisiológicas, O Anx-Al/FPRL-i se integra ao TCR para modular a resistência de sinalização de TCR. Entretanto, em condições patológicas, tal como em RA ou lúpus sistêmico eritematoso (dados não publicados), onde a proteína é expressada em níveis mais altos, isto poderia levar à ativação da célula T aumentada devido ao limite inferior de sinalização de TCR (Figura 6C).

Exemplo 5 - Anx-Al exógeno e endógeno modula a diferenciação de Thl/Th2

Estudos recentes postulam que a resistência da sinalização de TCR influencia o comprometimento da linhagem de célula T com as células efetoras de Thl ou Th2. Dada a sinalização aumentada ou diminuída TCR em células T tratadas com células hrAnx-Al (Figuras 3 e 5A) ou Anx-Al'⁷' (Figuras 4 e 5B) , pretende-se determinar se diferentes níveis de Anx-Al influenciariam na diferenciação de célula T em células Thl ou Th2.

As células T de nó de linfa virgens foram

40/54 diferenciadas in vitro em condições de Thl (barras pretas) ou Th2 (barras brancas) na presença ou ausência de hrAnx-Al (600 nM) e, então, re-estimuladas com anti-CD3 ligado à placa (5,0 pg/ml) por oito horas para medir a produção de citoquina de Thl ou Th2. Os resultados são mostrados na Figura 7A. Os valores são a média +- erro padrão de n=4-5 de camundongo. **P<0,01

Conforme mostrado na Figura 7A, a diferenciação de células T virgens (CD441O, CD62Lhi) era Thl (anti-CD3/CD28, IL2, IL 12 e anti-IL4) ou Th2 (anti-CD3/CD28, IL2, IL4 e anti-IFNy) condições na presença de hrAnx-Al aumentou a produção de IL2 e IFNy com uma diminuição concomitante de IL4 e liberação de IL10 mediante anti-CD3 re-níveis.

Células T de nodo linfa virgens de Anx-Al^+Z+ ou AnxAl^’ de camundongos foram diferenciadas in vitro em condições Thl (primeiro e segundo gráficos da esquerda) ou Th2 (terceiro e quarto gráficos da esquerda) e então reestimulados com anti-CD3 (5,0 pg/ml) fixado à placa por oito horas para medir a produção de citocina de Thl ou Th2. Os resultados são mostrados na Figura 7B. Os valores significam +- S. E. de n=4 a 5 camundongos. **P<0,01

Conforme mostrado na Figura 7B, descobertas semelhantes foram obtidas também com respeito a proteína endógena: análise de produção de citocina Thl/Th2 em células diferenciadas de Thl/Th2 de Anx-Al*^z+ ou Anx-Al’^z’ camundongos produziram altos níveis de IL2 e IFNy em camundongos de tipo selvagem comparado com camundongos nocaute, com perfis opostos para produção de IL4 e IL 13.

Exemplo 6 - Anx-Al e artrite reumatõide

Para provar que hrAnx-Al aumentou a ativação da célula T in vivo, uti1izou-se um modelo de camundongo de doença autoimune crônica, o modelo de artrite induzida por colágeno (CIA) em camundongos DBA. Injetou-se em camundongos

41/54 com hrAnx-Al diariamente por doze dias depois da imunização com colágeno (tempo durante o qual a diferenciação de células virgens em células efetoras Th) e depois disso a progressão da doença mediante superação do antígeno foi analisada. A Figura 8 mostra o volume da pata (Figura 8A) e classificação clínica (Figura 8B) dos camundongos tratados com PBS (100 μΐ) ou hrAnx-Al (1 pg s.c. duas vezes ao dia). A sincronização dos primeiros sintomas da doença foi obtida impulsionando-se com colágeno no dia 21, e sinais clínicos foram evidentes a partir do dia 22 (dia 1 dos primeiros sintomas das doenças). Os valores significam +- S. E. de n=6 a 8 camundongos. Grupos foram comparados utilizando o teste Mann- Whitney. *P<0,01

Conforme pode ser visto das Figuras 8 A e 8B, o tratamento de camundongos com hrAnx-Al exacerbou os sinais e sintomas de artrite comparado a camundongos tratados com veículo PBS, confirmando que altos níveis de Anx-Al influenciam a ativação e a diferenciação da célula T e que esses efeitos influenciam o desenvolvimento da doença em um modelo de camundongo de RA,

Para investigar a relevância clínica desses estudos a expressão Anx-Al foi analisada em células T periféricas CD4 + e células sinoviais CD3+ de pacientes RA. A Figura 8C mostra os resultados. Os valores medianos são indicados por linhas horizontais e valores p do teste Mann- Whitney são mostrados. *P<0,01. Conforme mostrado na Figura 8C, as células RA CD4+ expressam altos níveis de Anx-Al mRNA e proteína (dados não mostrados) em comparação com as células de voluntários de controle saudáveis (HC).

A imuno-histoquímica de fluorescência também foi executada ao utilizar anti-soro secundário etiquetado com verde e vermelho fluorescentes, tal como mostrado em cada painel da Figura 8D. Esta análise imuno-histoquímica de expressão Anx-Al no tecido sinovial de pacientes RA revelou

42/54 um alto grau de co-localização com células CD3+ ' . Portanto, considerando que células CD4 de pacientes RA expressam altos níveis de Anx-Al, pode se concluir que a expressão desregulada dessa proteína poderá contribuir para o desenvolvimento dessa doença.

Exemplo 7 - Efeitos de hrAnx-Al de comprimento total e o peptídeo de N- terminal Ac 2-26 na ativação da célula T .

Os efeitos de um peptídeo de N-terminal de hrAnx-Al (peptídeo Ac 2 a 26) e de hrAnx-Al de comprimento total na ativação da célula T foram investigados. A produção IL-2 de células T de nó de linfa virgens de camundongo foi estimulada com 0,6, 1,25 ou 2,5 pg/ml de anti-CD3/CD28 na presença ou ausência de hrAnx-Al de comprimento total (300 nM) ou o peptídeo de N-terminal derivado de Anx-Al Ac. 2 a 26 (100 μΜ) por 24 horas.

Concluiu-se que o peptídeo de N-terminal Ac.2 a 26 retém a maior parte da atividade biológica da proteína de comprimento total, isto é, produção de IL-2 aumentada (Figura 9) e proliferação da célula T (dados não mostrados).

Exemplo 8 - Anx-Al e aterosclerose

Para investigar se Anx-Al está expresso em placas ateroscleróticas de ser humano, seções de placas ateroscleróticas carótidas removidas de pacientes durante a cirurgia de endarterectomia de carótida foram tingidas com um anticorpo monoclonal (mAblB) de camundongo anti-AnX-Al de ser humano. A produção desse anticorpo está descrita em Pepinsky et al. FEBS Letters 261: 247 a 252, 1990, Resumidamente, os camundongos BALB/c foram imunizados com uma injeção intraperitoneal de anexina-1 (chamado de lipocortin-1 em Pepinsky et al.), em adjuvante de Freund completo. Os animais foram inoculados nos dias 14 e 28 com anexina-1 em adjuvante de Freund incompleto. Depois de seis semanas, foram feitos

43/54 sangramentos de testes e ensaiados para anticorpos que bloquearam atividade de anexina-1. Células do baço de camundongos cuj o anti-soro exibiu at ividade anti-anexina foram fundidas com células SP3 x Ag8 para a produção de hibridoma. Sobrenadantes de cultura de hibridoma foram ensaiados para anticorpos que poderiam precipitar anexina-1 radiorotulada, e hibridomas que produzem anticorpos que precipitaram mais de 50% das contagens de entrada foram subclonados por diluição limitante. As linhagens mais promissoras cresceram como aseite em camundongos pristanopreparados e os anticorpos monoclonals foram purificados por afinidade em sefarose de proteína A, utilizando a ligação Pierce e sistemas de tampão de eluição.

Conforme mostrado na Figura 10, uma coloração clara e compacta para Anx-Al poderia ser observada dentro da plaqueta confirmando que a infiltração inflamatória dentro desses tecidos expressa altos níveis de Anx-Al.

Uma análise semelhante também foi conduzida em camundongos ApoE'^z~. Localização de Anx-Al no seio aórtico e na artéria braquiocefálica (BCA) de camundongos com dez meses de idade ApoE'^ foi desempenhada por microscopia confocal para determinar a expressão e distribuição espacial de AnxAl. No tecido arterial não aterosclerótico careceu de Anx-Al imunorreativo (dados não mostrados). Em contrapartida, a placa aterosclerótica tanto do seio aórtico quanto do BCA mancha fortemente para Anx-Al (Figura 11).

Uma leve imunor reat ividade para Anx-Al foi detectada na proximidade da capa fibrosa tanto no seio aórtico (Figura 11 A) quanto no BCA (Figura 11B) e na proximidade do núcleo necrótico da placa no seio aórtico (Figura 11B). Esses resultados demonstraram que Anx-Al é expresso tanto em placas ateroscleróticas de ser humano quanto de murinos e sugerem que a expressão do mesmo poderia

44/54 influenciar potencialmente a estabilidade da placa.

Exemplo 9 - Anx-Al e lúpus eritematoso sistêmico (SLE)

Estudos clínicos sobre as funções biológicas de Anexina-1 associaram a presença de auto-anticorpos contra essa proteína com o desenvolvimento de doenças auto-imunes que incluem lúpus eritematoso sistêmico (SLE), artrite reumatóide e doença inflamatória intestinal. Ã luz dessas conclusões há uma hipótese que a geração desses autoanticorpos poderá se dar devido a uma expressão descontrolada de Anexina-1 nesses pacientes. Para verificar essa hipótese, o nível de expressão de Anexina-1 em células T coletadas de voluntários saudáveis e pacientes SLE foi analisado. Anexina1 mRNA e proteína foram expressos em um nível muito mais marcante nas células T SLE (Figura 12). Dessa maneira, esses resultados apóiam a hipótese de que a expressão de Anexina-1 aumentada nas células T SLE e, portanto, em Células T de pacientes com outras patologias auto-imunes, pode ser responsável pelos níveis aumentados de citocinas de Thl descritos nessas patologias, desse modo representando um fator de risco para o desenvolvimento de doenças auto-imunes.

Exemplo 10 - Inibição da ativação de célula T por anticorpos anti-Anx-Al

Células T sanguíneas periféricas de humanos purificadas foram incubadas com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (5 pg/ml) para ativar o receptor de Célula T (TCR): isto ocorreu conforme demonstrado na Figura 13 pela produção notável de interleucina-2 (IL-2), uma citocina central para a ativação e diferenciação da Célula T.

Células foram então encubadas com diferentes concentrações (1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 micrograma/ml) de um anticorpo de camundongo neutralizante monoclonal aumentado contra anexina 1 (mAblA) recombinante humano. A produção

45/54 desse anticorpo é descrita em Pepinsky et al., FEES Letters 261: 247 a 252, 1990 e no Exemplo 8.

O tratamento com mAblA produziu uma inibição dependente de concentração de produção de IL-2 (Figura 13) e a proliferação de células (dados não mostrados). igG foi utilizado como um controle em concentrações de 1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 micrograma/ml e não teve eficácia em toda as concentrações. Os resultados mostraram que o bloqueio de efeitos de anexina-1 pareceu ser mais efetivo em concentrações mais baixas do anticorpo monoclonal mAb IA específico.

Em todos os casos, os dados significam +- SE de medições triplicadas. *P<0,01.

Células T de sangue periférico humano purificado de um doador diferente foram então incubadas com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 em diferentes concentrações (1 pg/ml) para ativar o receptor de Célula T (TCR) . Novamente, isto ocorreu como demonstrado na Figura 14 pela produção de interleucina-2 (IL-2), mas a um nível mais baixo devido a baixa concentração de anticorpos anti-CD3 e antiCD28 utilizados.

Novamente, as células foram então incubadas com diferentes concentrações (1,0, 0,1, 0,01 e 0,001 micrograma/ml) do anticorpo monoclonal de camundongo neutralisante aumentado contra anexina 1 (mAb IA) recombinante humana. O tratamento com mAb IA produziu uma inibição dependente de concentração de produção de IL-2 (Figura 14). IgG foi utilizado como um controle a uma concentração de 1,0 micrograma/ml e não teve eficácia. Novamente, os resultados mostraram que os efeitos do bloqueio de anexina-1 pareceu mais efetivo em baixas concentrações do anticorpo monoclonal mAb IA específico, exceto com uma concentração de 1,0 micrograma/ml de mAblA.

46/54

Em todos os casos, os dados significam +- SE de medições triplicadas. *P<0,01.

Esses experimentos demonstraram que a anexina 1 endógena promove a ativação de Células T na presença de um estímulo específico. Em adição, o bloqueio da trajetória do anexina 1 atenuou a ativação das Células T em até 50%. O fato de que a inibição alcançou um máximo em torno de 50% sugere que a imunidade normal e doméstica não seria afetada pelo tratamento de doenças mediadas por célula T utilizando uma molécula que se liga especificamente a Anx-Al, conforme reivindicado.

Exemplo 11 - Anx-Al e esclerose múltipla (MS)

Materiais e Métodos

Reagentes

O peptídeo de glicoproteína oligodendroglial de mielina (MOG)_{33 a 55} (MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK) foi sintetizado e purificado por Cambridge Research Biochemicals (Billingham, Reino Unido). Adjuvante de Freund completo que contem Mycobacterium tuberculosis H37a foi adquirido junto à Difco, ao passo que a toxina Bordetella pertussis foi adquirida junto ã Sigma-Aldrich Co (Poole, Reino Unido). A menos que esteja especificado em contrário, todos os outros reagentes procederam da Sigma-Aldrich Co.

Camundongos

Camundongos nulos machos AnxAl foram tal como previamente descrito (Harmon et al., Faseb J, 17: 253 a 255, 2003; Roviezzo et al. , J. Physiol Pharmacol 53: 541 a 553, 2002) (nove a onze semanas de idade) e foram retrocruzados em um fundo C57BL/6 para >10 gerações e criados nas instalações de tratamento de animais B&K (Hull, Reino Unido). Camundongos com controle de idade e pareados por sexo C57BL/6 foram utilizados como controle para todos os experimentos. Os animais foram mantidos sob condições padrão e mantidos em um

47/54 ciclo de 12 horas/12 horas de luz/escuridão a 22 +-1’C de acordo com as regulamentações United Kingdon Home Office (Lei sobre Animais publicada em 1986) e das diretivas da União Européia.

Indução de EAE

Camundongos foram imunizados subcutaneamente no dia 0 com 300 μΐ de emulsão que consiste em 300 pg de MOG _{35 a} 55 no PBS combinado com um volume igual de CFA que contem 300 pg M. tuberculosis H37Ra morto por calor. A emulsão foi injetada em ambos os flancos e seguida de uma injeção intraperitoneal de toxina B. pertussis (500 ng/100 pl) em 100 pl de salina nos dias 0 e 2. Os camundongos foram observados diariamente quanto a sinais de EAE e perda de peso. A gravidade da doença foi classificada em uma escala de 6 pontos: 0 = sem doença; 1 « cauda flácida parcial; 2 = cauda completamente flácida; 3 = hipotonia de membro posterior; 4 = paralisia de membro posterior parcial; 5 = paralisia de membro posterior completa ; 6 = animal morto ou moribundo.

Ensaio de proliferação de célula

Células de nó linfático (células de 10⁵ /200 pl) obtidas de camundongos imunizados com MOG ₃₃ » _S5 por catorze dias foram estimuladas com MOG 33 a 55 (50 a 100 pg/200 pl) por 48 horas em placas de 96 compartimentos. Durante as últimas doze horas, culturas foram pulsadas com 1 pCi de [³H] timidina (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido) e a radioatividade incorporada foi medida por um contador de cintilação automatizado (Packard instrument Company, Inc., Illinois, Estados Unidos da América).

Citocina ELISA

Células de nó linfático (células de 10⁶/ml) obtidas de camundongos imunizados com MOG_{33 a 55} por catorze dias foram estimuladas com MOG_{33 a} 55 (100 pg/ml) por quatro dias.

Sobrenadantes de células foram coletados e analisados para

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IFN-γ, IL-2, IL-17A e teor de TNF-ot utilizando kits ELISA (eBioscience, Dorset, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante .

Isal ação de célula inflamatória da espinha dorsal

Camundongos foram mortos utilizando CO₂. As espinhas dorsais foram expelidas da coluna espinhal com PBS por pressão hidroestãtica utilizando uma seringa presa a uma agulha de calibre 21. Os tecidos foram cortados em pequenos pedaços e passados através de um coador celular (70 nm,- BD Falcon) utilizando o êmbolo de uma seringa de 1 ml esterilizada. A suspensão de célula única foi centrifugada por dez minutos a 390 xg, resuspensa em 20 ml de PBS que contém 30% de Percoll (Sigma) e revestida em 10 ml de PBS contendo 70% de Percoll, Depois da centrifugação a 390 xg por vinte minutos, as células mononucleares foram removidas da interfase, lavadas, e ressuspensas no tampão FACS (PBS contendo 1% de FCS e 0,02% NaN₂) para análise adicional.

Citometria de fluxo

Amostras de células de tecidos da espinha dorsal purificados com Percoll ou nó linfático purificados com Ficoll foram ressuspensas no tampão FACS contendo CD16/CD32 FcylIR anticorpo de bloqueio (clone 93; eBioscience) por trinta minutos a 4°C. Depois disso, as suspensões de célula foram rotuladas cora anti-CD3o conjugado por FITC (1 : 100; clone 145 2C11) ou anti-F4/80 (1 :100; clone EMT) enquanto células de nó linfático foram manchadas com anti-CD4-FITC (1 : 5 0 0 ; clone L3 T4) e ant i-CD8 (1 :1000,- cl one Ly - 2) por trintaO minutos a 4°C, previamente a análise por FACS calibur utilizando software CellQuest (Becton Dickinson). Pelo menos 10* células foram analisadas por amostra, e determinação de populações positiva e negativa foi desempenhada com base na mancha atingida com isotipos igG irrelevantes.

Histologia

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Tecidos da espinha dorsal foram dissecados e fixados em 4% de formalina tamponada neutra por 48 horas e então encubados com solução descalcificante contendo EDTA (0,ImM no PBS) por catorze dias previamente â inclusão em parafina. Avaliação histolõgica foi desempenhada em seções de inclusão de parafina com coleta de amostras em vários pontos de tempo dependendo da gravidade da doença. Seções de espinha dorsal (5 pm) foram desparafinizadas com xileno e manchados com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliar a inflamação. A mancha para AnxAl foi desempenhada em seções congeladas utilizando anti-AnxAl (diluição 1:500; Zymed, Invitrogen) e anticorpo de coelho anti-Ig de cavalo conj ugado com peroxidase HRP (diluição 1 :500; Dako). Mancha dupla para AnxAl e CD3 ou F4/80 foi conduzida conforme descrito previamente utilizando anti-CD3 de FITC-conjugado (1 :100; clone 145 2C11) ou anti-F4/80 (1 :100; clone BMT) . Seções também foram contracoradas com hematoxilina. Em todos os casos, um mínimo 2 3 seções por animal foram avaliadas. Imagens digitais de contraste de fase foram tomadas utilizando o pacote de software de análise de imagem Image Pro.

Análise Estatística

O software prism (GraphPad software) foi utilizado para executar todos os testes. Avaliações estatísticas de freqüência de célula, proliferação e produção de citocina foram desempenhadas utilizando testes t de estudante ímpar, de duas caudas. ANOVA foram aplicados para analisar a classificação clínica ΞΑΕ. Um valor p de <0,05 foi considerado por ser relevante estatisticamente. Valores p menores que 0,05 foram considerados significativos. Dados são apresentados como meio +- S.E.M de n amostras por grupo.

Resultados

Expressão de AnxAl correlaciona-se com a gravidade

50/54 de encefalomielite autoimune experimental (EAE)

A correlação entre níveis AnxAl no teor da espinha dorsal e extensão de células mononucleares de infiltração no CNS foram avaliados em um modelo de camundongo de MS induzido por imunização com MOG_{35 a E5}, EAE. MOG_{35 a} 55 EAE induzido é um modelo para dimielinação autoimune de CNS e tem sido amplamente utilizado para investigar mecanismos patogênicos responsáveis pelo desenvolvimento de MS. Para esse fim, espinhas dorsais e cérebros de camundongos do tipo selvagem imunizados com peptideo MOG_{35 a E5} em diferentes estágios das doenças isto é no dia 12 (pontuação 0), dia 18 (pontuação 2) e dia 20 (pontuação 4) foram coletados e a imuno-histoquímica para AnxAl foi desempenhada lado a lado com hematoxilina e mancha de eosina.

Conforme mostrado na Figura 15, tecidos da espinha dorsal coletados durante a fase de indução de camundongos sem sinais de doença mostraram uma mancha fraca para AnxAl (pontuação 0, Fig. 15A e B, respectivamente). Contudo, com os primeiros sintomas de sinais clínicos e o aparecimento de infiltrações inflamatórias na CNS, manchas descontínuas de imunocoloração de AnxAl foram observadas em torno de toda a meninge (pontuação 2, Figuras 15A e B, respectivamente). Ã medida que a doença progrediu, um aumento no número de manchas de infiltração celular positiva de AnxAl foi observado (pontuação 4, Figuras ISA e B, respectivamente), sugerindo que a infiltração de células inflamatórias que expressam altos níveis de AnxAl é correlato com a gravidade da doença.

Para identificar fontes celulares de imunorreatividade de AnxAl na espinha dorsal, coloração de dupla imunofluorescência das seções foi desempenhada com anti -AnxAl e mesmo anti-CD3 (marcador para Células T) ou antiF4/80 (marcador para macrofagos). Um grande número de Células

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T infiltradas e macrofagos foi detectado nas seções de espinha dorsal de camundongos no pico de EAE (Figuras 16A e B, painéis do meio, respectivamente). Contudo, a coloração AnxAl nas mesmas seções mostrou uma co-localização parcial tanto das Células T quanto dos macrofagos sem preferência particular por um ou outro tipo de célula (Figuras 16A e B, painéis da direita, respectivamente).

Camundongos AnxAl⁷' desenvolvem um EAE enfraquecido

Uma vez que a expressão AnxAl foi regulada para mais no pico de EAE, o papel dessa proteína no desenvolvimento de EAE foi investigado. Camundongos AnxAl ⁺⁷⁺ e AnxAl'⁷' foram imunizados s.c. com peptídeo MOG_{35 a ss} no CFA no dia 0, e então injetou-se i.v. toxina B. pertussis em ambos os dias 0 e 2. Ambos os camundongos AnxAl^+/+ e AnxAl'⁷' começaram a desenvolver EAE do dia 12 depois da imunização, alcançando o pico da doença em torno do dia 20. Contudo, camundongos AnxAl'⁷' tiveram níveis reduzidos da doença comparado ao AnxAl⁺⁷⁺ (Figura 17A) . Interessante, isto foi evidente e significativo somente no estágio posterior da doença, isto é do dia 18 a 23 e daí por diante.

Estudos em modelos de animais de EAE demonstraram que a fase aguda da doença coincide com perda de peso, provavelmente devido a anorexia e absorção de líquidos deficiente. A medição de peso de camundongos imunizados correlacionou-se com a gravidade da pontuação clínica e mostrou uma perda de peso reduzida - do dia 18 em diante nos camundongos AnxAl'⁷' comparado aos controles AnxAl ⁺⁷⁺ (Figura 17B). Comparação adicional de desenvolvimento de EAE em camundongos AnxAl ⁺⁷⁺ e AnxAl'⁷' mostraram uma diminuição tanto na taxa de mortalidade quanto na pontuação máxima da doença, sem diferenças na taxa de incidência ou sintomas da doença (Tabela 1).

Tabela 1 : Parâmetros clínicos de EAE Induzidos po

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MOG35 a 55- em n=10/grupo)	camundongos AnxAl +z+ e	AnxAl '7' (média +- SEM,
Camundongos	Incidência3	Mortalidade	Dia do sintoma (meio+SEM)	Pontuação Max. (meio+SEM)
AnxAl+7 + AnxAl'7'	100% (10/10) 100% (10/10)	33,3% (3/10) 0% (0/10)	16,4±2,3 15,9±1,3	5,7±0,2 4,3+0,1**

**p<0,01,	representativo de 3 experimentos §	EAE
pontuação clínica igual ou maior que	1.
Resposta	de lembrança In	vi tro para	MOG35 a ss	em
camundongos AnxAl'/'
Células	T representam	um papel	chave	no
desenvolvimento de	EAE e células	T AnxAl'7'	possuem	uma

capacidade enfraquecida de responder a estímulo antiCD3/CD28. Ã luz dessas descobertas, foi investigado se o desenvolvimento diminuído de EAE em camundongos AnxAl'^z_ foi associado com uma resposta mais baixa ao estímulo de antígeno. Células de nó linfático de camundongos AnxAl ^+z+ e AnxAl'⁷' , coletadas catorze dias depois da imunização, foram estimuladas in vitro com MOG35 a 55. Células de nó linfático AnxAl'⁷* mostraram uma taxa diminuída de proliferação e produziram níveis mais baixos de IL-2 quando estimuladas com MOG35 a bs comparado a camundongos do tipo selvagem (Figura 18A e B, respectivamente). Resultados similares foram obtidos com esplenocitos (dados não mostrados).

Esses resultados na proliferação de células foram espelhados no número de células recuperadas dos nós linfáticos de drenagem e do baço dos camundongos imunizados. A contagem total de células mononucleares de nó linfático e do baço purificadas com Ficoll dos mesmos animais, revelaram uma diminuição significativa em camundongos AnxAl*⁷' comparado a controles (Figura 19A e B, respectivamente), com mudanças não mensuráveis nas porcentagens de células positivas CD4 ou

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CD8 (Figura 19C e D, respectivamente).

Respostas de citocina Thl7 e Thl específica de MOG_{35 e} 55 reduzida em camundongos AnxAl'

Estudos que usam células de nó linfático de drenagem a partir de camundongos C57/BL6 imunizados por MOG_{35 a} 55 mostraram mudanças significativas na produção de citocina Thl e Th 17. A análise da produção de citocina de células de nó linfático AnxAl'^z' mediante estímulo com MOG_{35 a} ss por 96 h mostrou uma produção diminuída de citocinas Thl IFN-γ, IL-2, e TNF-oí comparado a células de tipo selvagem (Figura 20 A a C). De modo semelhante, medição de produto de assinatura Thl7 IL- 17, revelou níveis diminuídos dessa citocina em AnxAl'^z' comparado ao tipo selvagem (Figura 20D).

Infiltração da Célula T no sistema nervoso de camundongos AnxAl-/~ durante EAR,

Os sinais reduzidos de EAE em camundongos AnxAl'^z' do dia 18 em diante, foi um estímulo para que se investigasse se podería haver um correlato neuropatológico. As espinhas dorsais de camundongos AnxAl ^+z+ e AnxAl'^z' tratados, coletadas no dia 18 ou 22, foram analisadas quanto a evidência histológica de inflamação. Concluiu-se que houve números reduzidos de infiltrações de célula imune detectadas em camundongos AnxAl'^z‘ comparado com animais AnxAl^+z+. (Figura 21 A e B) .

Os sinais histológicos reduzidos de inflamação em camundongos AnxAl‘^z‘ foram associados com um número reduzido de CD3 e células positivas F4/80 que infiltram a CNS (Figura 21C e D, respectivamente). Essas análises qualitativas foram confirmadas por medições de porcentagens FACS de CD3 e leucócitos positivos F4/80 isolados dos tecidos da espinha dorsal do dia 18. Consistente com os resultados imunohistoquímicos, camundongos AnxAl'⁷' tiveram aproximadamente 60 e 80% menos Células T e macrófagos, respectivamente,

54/54 comparado com camundongos AnxAl^+/+ (Figura 22A e B, respectivamente).

Os resultados mostram que há uma acumulação marcante de células de expressão Anexina-1 na espinha dorsal 5 de camundongos no pico da doença. Há, portanto, uma correlação entre a expressão Anexina-1 e o desenvolvimento de EAE.

Em adição, os resultados mostram que camundongos deficientes de Anexina-1 desenvolvem EAE menos severa.

Ablação da expressão de Anexina-1 portanto limita o desenvolvimento de EAE, um modelo de camundongo para MS.

Claims (2)

1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, caracterizada por se ligar a Anexin-1 (Anx-Al) para o uso no tratamento de doença mediada com células T.

5 2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que a dita molécula de ligação específica é um anticorpo anti-Anx-Al.

3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada em que o dito anticorpo 10 anti-Anx-Al é um anticorpo monoclonal ou um fragmento do mesmo.

4 . MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada em que o anticorpo monoclonal é humanizado. ₌ ..... - — _ » - - - ₁₅ 5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada em que o dito anticorpo anti-Anx-Al é __ um , anticorpo contra um fragmento de N-terminal de Anx-Al que tem a seqüência mostrada na figura 2a.

20 6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada em que o dito anticorpo anti-Anx-Al é um anticorpo contra o fragmento Ac.2-26 de AnxAl que tem a seqüência mostrada na figura 1C ou um fragmento de pelo menos seis aminoácidos do mesmo.

25 7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada em que a dita doença mediada com células T é selecionada do grupo que consiste em doença de enxerto-versus-hospedeiro, rejeição a enxerto, aterosclerose, HIV, AIDS, psoríase, e doenças 3 0 auto imune s.

8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada em que a doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatóide (AR),

2/2 esclerose múltipla (EM) , lupus eritematoso sistêmico (LES) , mal de Addison, mal de Grave, escleroderma, polimiosite, diabetes mellitus, uveoretinite autoimune, colite ulcerativa, pemphigus vulgaris, doença intestinal inflamatória e tireoidite autoimune.

9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada em que a dita doença autoimune é selecionada do grupo que consiste em artrite reumatóide (AR), esclerose múltipla (EM) e lupus eritematoso sistêmico (LES).

10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada em que a dita doença mediada com células T é selecionada do grupo que consiste em aterosclerose, HIV, AIDS e psoríase. . .

11. USO DE UMA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ESPECÍFICA QUE LIGUE AO ANX-A1, caracterizado por servir na manufatura de um medicamento para o tratamento de doença mediada com.células T.

12 . MÉTODO PARA O TRATAMENTO DA DOENÇA MEDIADA COM CÉLULAS T, caracterizado por compreender a administraçao de uma quantidade terapêutica de uma molécula de ligação específica que se liga a Anx-Al a um indivíduo com necessidade da mesma.