BRPI0917160B1 - Método para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento - Google Patents
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Abstract
método para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento a invenção diz respeito em geral a métodos de concentrar misturas que incluam os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tais como o fator de von willebrand. os métodos convencionais de concentrar biopolímeros comunicam muitíssimos esforços de cisalhamento, que causam a degradação dos biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. os métodos aqui apresentados reduzem o esforço de cisalhamento ao mesmo tempo em que mantêm uma alta vazão de filtrado. é aqui apresentado um método para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento que inclui a circulação de uma mistura com um biopolímero sensível ao cisalhamento em um módulo de diálise de fibra oca para formar um retentato tendo uma concentração de biopolímero sensível ao cisalhamento. os módulos de diálise de fibra oca têm elevados fluxos de filtrado e baixas taxas de cisalhamento em baixas vazões. isto garante um alto rendimento do produto e perda mínima de biopolímeros sensíveis ao cisalhamento.
Description
“MÉTODO PARA CONCENTRAR BIOPOLÍMEROS SENSÍVEIS AO CISALHAMENTO”
Campo da Invenção
A invenção diz respeito em geral a métodos de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tais como o fator de von Willebrand (vWF).
Breve Descrição da Tecnologia Relacionada
Métodos conhecidos de concentrar (e diafiltrar) biopolímeros incluem a ultrafiltração (e diafiltração) de fluxo tangencial (fluxo cruzado) em placa plana e dispositivos de fibra oca. Estes dispositivos operam em vazões e pressões da transmembrana suficientemente elevados para garantir um fluxo do filtrado adequado para operação eficaz quanto ao custo. Entretanto, estas condições de operação criam taxas de elevado cisalhamento. Adicionalmente, estes dispositivos podem incluir telas para ainda aumentar o fluxo do filtrado. Estas telas também aumentam o esforço de cisalhamento comunicado aos biopolímeros. Tal esforço ao cisalhamento é particularmente indesejável quando se esteja tentando concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tais como proteínas ou partículas virais, porque os esforços podem destruir, desnaturar ou inativar o biopolímero.
Existem vários métodos conhecidos para reduzir o esforço de cisalhamento durante a concentração e/ou a diafiltração em placa plana ou dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial (fluxo cruzado). Esses métodos incluem reduzir a vazão, aumentando a área superficial da membrana, e aumentando o tamanho do corte da membrana. Entretanto, cada um destes métodos tem vários problemas. Por exemplo, reduzir a vazão também reduz o fluxo do filtrado, o que indesejavelmente aumenta o tempo de operação total, aumenta o risco de incrustação da membrana, e aumenta a extensão de tempo em que o biopolímero sensível ao cisalhamento fica exposto ao esforço de cisalhamento. O aumento da área superficial da membrana em taxas de baixo fluxo mantém o fluxo do filtrado elevado e impede-se um aumento no tempo de operação total. Entretanto, nas vazões reduzidas, o risco de incrustação da membrana aumenta. A área superficial da membrana aumentada causa mais perda do produto por causa da adsorção superficial aumentada, custos maiores para a área da membrana aumentada e consumo do tampão, e pode ter um maior volume morto do que o volume desejado do produto após a concentração. O aumento do tamanho do corte da membrana resulta em suficiente fluxo do filtrado por causa do maior tamanho de poros. Entretanto, os problemas de incrustação aumentada da membrana ou de incompatibilidade com o biopolímero sensível ao cisalhamento (isto é, o biopolímero pode passar através da membrana e ser perdido no filtrado) permanecem.
Os detergentes são usados em muitas operações de bioprocessamento para evitar a adsorção superficial e a formação de agregados das proteínas. Estas operações, entretanto, podem requerer aditivos tampões especializados para estabilizar os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento.
Para os dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial, a taxa de cisalhamento recomendado é de 2000 a 8000 s’1, e de 2500 a 4000 s'1 para carga de alimentação sensível ao cisalhamento. Ver GE Healthcare, Operating Handbook: Hollow fiber cartridges for membrane separations 8 (2004). Entretanto, os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tais como, por exemplo, o fator de von Willebrand ou as partículas virais, começam a degradar-se, a desnaturar-se, ou a expandir-se em taxas de cisalhamento acima de 2000 s'1. Portanto, existe a necessidade na técnica de métodos de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento sem comunicar altos níveis de esforço de cisalhamento.
Geralmente, a técnica anterior não preceitua ou sugere suficientemente a uma pessoa de experiência normal na técnica um método de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento sem perda substancial do biopolímero para a precipitação de proteína, sem a incrustação da membrana e a adsorção superficial da membrana. De forma semelhante, reduzir a vazão da mistura contendo o biopolímero para por esse meio reduzir o esforço ao cisalhamento nos dispositivos, não proporciona uma alternativa eficaz porque uma certa vazão mínima é necessária para evitar a incrustação da membrana e a adsorção do precipitado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
É apresentado neste relatório descritivo um método de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento que inclua a circulação de uma mistura contendo um biopolímero sensível ao cisalhamento, tal como o fator de von Willebrand, em um módulo de diálise de fibra oca para formar um retentato que tenha uma concentração de biopolímero sensível ao cisalhamento que seja mais elevada do que aquela da mistura. O método pode ainda incluir a troca de tampões, ou diálise, com a mistura contendo um biopolímero sensível ao cisalhamento durante ou após a concentração.
As membranas dos módulos de diálise de fibra oca têm preferivelmente uma espessura de menos do que cerca de 200 micrometres, por exemplo, as membranas podem ser de cerca de 10 micrômetros a cerca de 100 micrômetros de espessura e preferivelmente são de cerca de 30 micrômetros de espessura. Nas formas de realização preferidas, as taxas de cisalhamento em parede nos módulos de diálise de fibra oca são de menos do que cerca de 2300 s'1 e, de preferência, de cerca de 50 s’1 a cerca de 1800 s’1. A pressão da transmembrana no módulo de diálise das fibras ocas preferivelmente é de cerca de 1 mm de Hg a cerca de 600 mm de Hg (cerca de 0,1 kPa a cerca de 80 kPa), e mais preferivelmente de cerca de 10 mm de Hg a cerca de 150 mm de Hg (cerca de 1 kPa a cerca de 20 kPa).
A mistura que contém o biopolímero sensível ao cisalhamento pode opcionalmente conter um tampão de solução. Se a mistura incluir um tampão de solução, o método pode ainda incluir a substituição de uma parte do tampão de solução por um tampão de diálise.
Nas formas de realização preferidas, o retentato inclui pelo menos cerca de 70 % do biopolímero sensível ao cisalhamento na mistura, preferivelmente pelo menos cerca de 80 % do biopolímero sensível ao cisalhamento na mistura, e o mais preferível pelo menos cerca de 90 % do biopolímero sensível ao cisalhamento na mistura. O retentato preferivelmente retém pelo menos cerca de 70 % da atividade do biopolímero sensível ao cisalhamento na mistura e, o mais preferível, ele retém pelo menos cerca de 80 % da atividade do biopolímero sensível ao cisalhamento na mistura.
O método apresentado provê um processo eficaz quanto ao custo para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, ao mesmo tempo em que evita a perda substancial do biopolímero para a precipitação da proteína, incrustação da membrana e aderência superficial da membrana.
Aspectos adicionais da invenção podem tomar-se evidentes àqueles versados na técnica, a partir de uma revisão da seguinte descrição detalhada, tomada em combinação com os desenhos, os exemplos e as reivindicações anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Para um mais completo entendimento da invenção, referência deve ser feita à seguinte descrição detalhada e aos desenhos anexos, nos quais:
A Figura 1 é uma vista em seção transversal de um módulo de diálise de fibra oca (não em escala);
A Figura 2 é um diagrama de fluxo do processo de um módulo de diálise de fibra oca com o tampão de diálise sendo adicionado diretamente ao retentato;
A Figura 3 é um diagrama de fluxo do processo de um módulo de diálise de fibra oca, com o tampão de diálise introduzido em contracorrente no fluxo de alimentação; e
A Figura 4 é um diagrama mostrando os dados do processo para o Experimento 2-1.
Embora o método apresentado para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento seja suscetível de modalidades em várias formas, são ilustradas nos desenhos (e serão daqui por diante descritas) formas de realização específicas da invenção, entendendo-se que a apresentação se destina a ser ilustrativa, e não a limitar a invenção às formas de realização específicas aqui descritas e ilustradas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção diz respeito em geral a métodos de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento de uma mistura que os contenham. Métodos conhecidos de concentrar biopolímeros devem comunicar esforço ao cisalhamento indesejavelmente elevados que devem destruir, desnaturar ou inativar os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. E aqui apresentado um método de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento que incluam o fluxo de uma mistura contendo um biopolímero sensível ao cisalhamento em um módulo de diálise de fibra oca para formar um retentato tendo uma concentração de biopolímero sensível ao cisalhamento que seja mais elevado do que aquela da mistura. O método apresentado garante um esforço de cisalhamento suficientemente baixo para evitar a destruição dos biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, ao mesmo tempo em que mantém um elevado fluxo do filtrado.
Os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento que são adequados para a concentração de acordo com o método apresentado incluem aqueles que são suscetíveis de dano, destruição e/ou perda de atividade quando expostos às forças de cisalhamento significativas (isto é, gradientes de velocidade relativamente grandes). Um exemplo de um tal biopolímero sensível ao cisalhamento é o fator de von Willebrand (vWF), o qual circula no plasma complexado com o fator VIII e auxilia na regulação da atividade de coagulação sanguínea biológica. Embora o vWF exista no plasma em uma série de formas oligométricas/poliméricas tendo pesos molecular que variam de cerca de 1.000 kDa (quilodalton) a cerca de 20.000 kDa com base nos dimeros de 520 kDa, o método apresentado não é necessariamente limitado em sua capacidade de concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento com base apenas neste faixa particular de feixe molecular.
Especificamente, o vWF é sensível às forças de cisalhamento induzidas pelo gradiente de velocidade de um meio de transporte de fluidos, em particular quando o vWF passa através ou próximo a uma membrana de filtro (isto é, quando as constrições do fluxo e as vias de fluxos circundantes na vizinhança dos poros da membrana de filtro resultam em gradientes de velocidade particularmente grandes). Por exemplo, as taxas de cisalhamento acima de 2000 s'1 (segundos inversos) leva o vWF a transformar-se de uma molécula globular para uma molécula de cadeia estendida. Esta transformação estrutural aumenta a probabilidade de aderência às superfícies do filtro e outras proteínas. Grandes multímetros de vWF são particularmente suscetíveis a esta transformação estrutural e a uma probabilidade aumentada de aderência. Durante a concentração, a aderência aumentada reduz o rendimento do produto, e a perda de grandes multímetros reduz a atividade do cofator da Ristocetina do vWF.
Os módulos de diálise de fibra oca têm elevados fluxos de filtrado e baixas taxas de cisalhamento. Estes módulos podem garantir um alto rendimento do produto e perda mínima de biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. Os módulos de diálise de fibra oca são dispositivos com fibra oca, ou membranas tubulares, abrangendo o comprimento do dispositivo, como ilustrado na Figura 1 (não em escala). Os módulos de diálise de fibra oca são conhecidos para uso na diálise sanguínea e acham-se comercialmente disponíveis, por exemplo, da Edwards Lifesciences (Saint-Prex, Suíça) e da Asahi Kasel Chemicals Corp. (Tóquio, Japão). Embora não se deseje estar ligados a qualquer teoria particular, acredita-se que os módulos operam sobre o princípio da diálise, no qual os gradientes de pressão não são os principais condutores de força para a transferência de massa. Ao invés disso, os gradientes de concentração conduzem a transferência de massa, ou a troca de tampão, através da membrana.
Na Figura 1 é mostrado um módulo 100 de diálise de fibra oca tendo uma entrada 102 de corrente de alimentação, uma saída 104 da corrente de retentato, uma saída 106 da corrente de filtrado, e uma entrada 108 da corrente opcional de tampão de diálise. O módulo 100 de diálise de fibra oca tem fibra oca 110 que abrange o módulo 100 paralelo ao fluxo de alimentação. As fibras ocas 110 são circundadas por um material de recheio 112. Os módulos de diálise de fibra oca podem ser usados isoladamente ou em série ou em paralelo, dependendo do volume da alimentação.
Os elevados fluxos de filtrado nos módulos de diálise de fibra oca são obteníveis, porque a membrana do módulo de diálise de fibra oca é muito mais fina do que as membranas na ultrafiltração e nos dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial. Estas últimas membranas têm mais do que 200 micrometres de espessura porque estas membranas devem resistir às altas pressões da membrana, aos grandes volumes (por causa da recirculação), e aos múltiplos usos. As membranas espessas reduzem o fluxo do filtrado. Ao contrário, as membranas dos módulos de diálise de fibra oca têm menos do que cerca de 200 micrometres de espessura, preferivelmente cerca de 10 micrometres a cerca de 100 micrometres, e o mais preferível cerca de 30 micrometres de espessura. A membrana fina possibilita um fluxo do filtrado mais elevado e, portanto, a pressão da transmembrana pode ser inferior à dos outros módulos.
Tendo em vista que o módulo de diálise de fibra oca tem um elevado fluxo de filtrado, são necessárias menos passagens através do módulo de diálise de fibra oca do que o requerido nos dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial. Além disso, quando o tampão de diálise flui em fluxo de co-corrente ou de contracorrente, o número de recirculações pode ser reduzido em comparação com os processos em que o tampão de diálise é adicionado diretamente à corrente de alimentação. A eficácia dos módulos de diálise de fibra oca é de longe mais elevada do que as eficácias possíveis nos dispositivos de fibra oca de ultrafiltração e de fluxo tangential, o que requer muito mais recirculações para se obter a mesma concentração. Menos passagens em taxas de cisalhamento baixos através dos módulos de diálise de fibra oca possibilitam mais da proteína para reter sua estrutura em comparação com muitas passagens em taxas de elevado cisalhamento, como observado nos dispositivos de fibra oca de ultrafiltração ou de fluxo tangential.
As taxas de cisalhamento no módulo de diálise de fibra oca são preferivelmente abaixo de cerca de 2300 s'1. A vazão da mistura contendo biopolímero sensível ao cisalhamento pode ser ajustado ou controlado para garantir certos níveis abaixo das taxas de cisalhamento, por exemplo, abaixo de 2300 s'1, abaixo de 2000 s'1 ou abaixo de 1800 s'1. A taxa de cisalhamento é calculada pela seguinte equação:
r índice de cisalhamento = ——7-, em que Q é a vazão (ml/s), n é o número de fibras no módulo de diálise de fibra oca, e r é o raio interno de uma fibra (cm).
Ver a Tabela 1 quanto às taxas de cisalhamento nas várias vazões e o número de fibras para os módulos com um diâmetro interno de fibra de 0,2 milímetros.
Tabela 1: Taxas de Cisalhamento nas Várias Vazões quanto aos Módulos com Contagens Variáveis de Fibras
| Módulo com 4775 fibras | Módulo com 7925 fibras | Módulo com 11141 fibras | Módulo com 12547 fibras | |
| Fluxo (ml/min.) | Taxa de cisalhamento em parede (s'1) | |||
| 50 | 222 | 134 | 95 | 85 |
| 100 | 444 | 268 | 190 | 169 |
| 200 | 889 | 536 | 381 | 338 |
| 300 | 1333 | 803 | 571 | 507 |
| 400 | 1778 | 1071 | 762 | 676 |
| 500 | 2222 | 1339 | 952 | 846 |
Preferivelmente, a pressão da transmembrana no módulo de diálise de fibra oca é de cerca de 1 mm de Hg (milímetros de mercúrio) a um máximo de cerca de 600 mm de Hg [cerca de 0,1 kPa (quilopascal) a cerca de 90 kPa], e mais preferível de cerca de 10 mm de Hg a cerca de 150 mm de Hg (cerca de 1 kPa a cerca de 20 kPa). Os dispositivos de fibra oca de ultrafiltração e de fluxo tangencial podem resistir a pressões muito mais elevadas, porque eles têm membranas espessas. Estes dispositivos também requerem pressões mais elevadas para garantir eficácia e um fluxo mínimo de filtrado para operações econômicas. Por exemplo, as pressões máximas das transmembranas para os dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial situamse ao redor de 2600 mm de Hg (340 kPa a 415 kPa) em 10 °C. Na temperatura ambiente, as pressões .máximas das transmembranas são de cerca de 2300 mm de Hg a 2600 mm de Hg (310 kPa a 345 kPa). Ver GE Healthcare, Operating Handbook: Hollow fiber cartridges for membrane separations 19 (2004). Estas pressões e vazões, entretanto, provavelmente destruirão os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tal como o vWF.
As membranas dos módulos de diálise de fibra oca podem ser produzidas de vários materiais que tendam a resistir à aderência dos biopolímeros. Tipicamente, as membranas muito hidrofílicas, ou membranas de baixa ligação de proteína, são preferidas. Os materiais preferidos têm uma adsorção de proteínas de menos do que 1 g/m2 (grama por metro quadrado). Alguns materiais adequados incluem, por exemplo, os derivados de celulose (por exemplo, a celulose modificada ou regenerada) e as membranas sintéticas (por exemplo, polissulfona, polietersulfona, fluoreto de polivinilideno, poliacrilonitrila, poliimida, poliamida cerâmica e alifática). Materiais de membrana preferidos incluem a polissulfona, a polietersulfona e a celulose modificada. Por exemplo, a adsorção de proteína típica é de 0,5 g/m para a polietersulfona e de 0,1 g/m para a celulose regenerada.
Os módulos de diálise de fibra oca podem operar de vários modos, incluindo concentração, concentração e diafiltração, e concentração e diálise. Na concentração, com referência continuada à Figura 1, uma corrente de alimentação flui para a entrada 102 através das fibras ocas 110 para formar um retentato que saia do módulo 100 através da saída 104. Pequenas moléculas da mistura contendo os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento passam através da membrana das fibras ocas 110 para o material de recheio 100, e são removidas do módulo 100 através da saída 106 como filtrado. Os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento viajam ao longo das fibras ocas 110 para formar o retentato.
A mistura contendo os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento pode incluir um tampão de solução. Por exemplo, um tampão de solução para os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tal como o vWF, pode ser um tampão de HEPES de 20 mM (milimolares) e um tampão de NaCl de 150 mM, com um pH de 7,4 na temperatura ambiente. O HEPES, ou o ácido 4-(2hidroxietil)-l-piperazinaetano-sulfônico, é um agente de tamponamento químico orgânico zuiteriônico. O tampão de solução pode passar através da membrana das fibras ocas 110 para o material de recheio e sair do módulo de diálise de fibra oca como filtrado.
O retentato incluirá os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. O retentato pode opcionalmente incluir um tampão de diálise. Por exemplo, um tampão de diálise para os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, tal como o vWF, pode ser um citrato de 20 mM e um tampão de glicina de 15 mM, com um pH de 7,3 na temperatura ambiente. Na diafiltração, o tampão de diálise pode ser adicionado diretamente ao retentato durante ou após a concentração, como ilustrado na Figura 2. A Figura 2 é um diagrama de fluxo do processo de um módulo de diálise de fibra oca com o tampão de diálise sendo adicionado diretamente ao retentato. O retentato opcionalmente pode retomar à alimentação se passagens múltiplas através do módulo de diálise de fibra oca forem desejadas, conforme mostrado pela linha tracejada.
Na diálise, o tampão de diálise pode escoar através do material de recheio 112 durante ou após a concentração, conforme ilustrado na Figura 1, ou no fluxo de co-corrente ou no fluxo de contracorrente, deslocando o tampão de solução. A Figura 3 é um diagrama de fluxo do processo de um módulo de diálise de fibra oca com o tampão de diálise introduzido em contracorrente com o fluxo de alimentação. O fluxo de co-corrente (não mostrado) pode ser alcançado pela ligação do filtrado com as correntes do tampão de diálise. O retentato pode opcionalmente ser retomado à alimentação se múltiplas passagens através do módulo de diálise de fibra oca forem necessárias como mostrado pela linha tracejada.
Como ilustrado na Figura 1, o tampão de diálise entra no módulo 100 através da entrada 108 e faz o contato com as superfícies externas da membrana das fibras ocas 110 no fluxo em contracorrente, e desloca uma parte do tampão de solução. Especificamente, na Figura 1, uma corrente de alimentação contendo um tampão de solução e um biopolímero sensível ao cisalhamento entra em um módulo 100 através da entrada 102. Um tampão de diálise entra no módulo através da entrada 108, e flui através de um material de recheio 100 no fluxo em contracorrente. Nas fibras ocas 110, uma parte do tempão de solução e uma parte do tampão de diálise passam através da membrana. O tampão de solução é removido como filtrado, e o tampão de diálise e os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento formam um retentato que sai do módulo 100 através da saída 104. Altemativamente, o tampão de diálise e as correntes do filtrado podem ser ligados para desenvolver o tampão de diálise no fluxo de co-corrente com a corrente de alimentação (não mostrada).
Na placa plana e nos dispositivos de ultrafiltração de fibra oca de fluxo tangencial, a diálise não é realizada pela troca de tampões através da membrana. Ao invés disso, após a concentração, o tampão de diálise é adicionado ao retentato e concentrado novamente. Isto é realizado muitas vezes para se obter suficiente troca de tampões. Ao contrário, os módulos de diálise de fibra oca podem operar em concentração e na modalidade de diálise simultaneamente, reduzindo o número de passagens através do módulo.
Os tampões preferivelmente são compatíveis com os biopolímeros. Os tampões geralmente variarão com base nas exigências específicas para biopolímeros específicos. Quanto à maioria das proteínas terapêuticas, por exemplo, os tampões preferivelmente têm um pH de cerca de 4 a cerca de 9 na temperatura ambiente. Os tampões fora desta faixa de pH podem causar desnaturação da proteína. Entretanto, algumas proteínas (por exemplo, a pepsina) funcionam melhor nos ambientes ácidos, por exemplo, em um pH de cerca de 1 a cerca de 2. Além disso, os tampões preferivelmente não devem conter compostos redutores ou caotrópicos que devem destruir o biopolímero. Os agentes redutores são apenas prejudiciais para as proteínas ou os peptídeos que incluam ligações de dissulfeto. A maior parte das proteínas terapêuticas incluem ligações de dissulfeto, e os agentes redutores podem destruir estas ligações. Os componentes redutores incluem, por exemplo, beta-mercaptoetanol, mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris(2carboxietil)-fosfina. Os componentes caotrópicos incluem, por exemplo, uréia, cloreto de guanidínio, tiocianato de guanidina e tiocianato de potássio.
Após a concentração, o retentato preferivelmente inclui pelo menos cerca de 70 % do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80 % e, ainda mais preferível, pelo menos cerca de 90 % do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura. Após a concentração, o biopolímero sensível ao cisalhamento presente no retentato de preferência retém pelo menos cerca de 70 % da atividade presente na mistura, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % da atividade presente na mistura.
O método apresentado evita o uso de detergentes para reduzir a adsorção superficial e a formação de agregados e o desenvolvimento de aditivos tampões especializados para estabilizar os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. O uso de detergentes é problemático porque, acima das concentrações críticas, eles podem formar micelas de elevado peso molecular que se comportem como proteínas e possam ser concentradas junto com os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento. Portanto, a concentração final do detergente deve ser difícil de controlar.
Exemplos
Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar a invenção, mas não se pretende com eles limitar o seu escopo. O Exemplo 1 descreve quatro experimentos realizados com um módulo de diálise de fibra oca com uma área superficial de membrana de 3000 cm2. O Exemplo 2 descreve duas experimentos realizados com um módulo de diálise de fibra oca com uma área superficial de membrana de 7000 cm . A área superficial de membrana é a área da superfície de membrana interna em uma fibra oca multiplicada pelo número de fibras ocas no módulo. Estas experimentos foram realizados com o tampão de diálise fluindo em fluxo de contracorrente, como ilustrado na Figura 2. Exemplo 1
Quatro experimentos foram realizados com vWF como o biopolímero sensível ao cisalhamento com um módulo de diálise de fibra oca. O módulo de diálise de fibra oca tinha uma área superficial de membrana de 3000 cm , uma membrana de espessura de 30 micrômetros, um comprimento de fibra de 100 milímetros, e um diâmetro interno de fibra de 200 micrômetros. O material da membrana era de polietersulfona. As concentrações das correntes de alimentação eram de 0,7 grama de proteína de vWF por litro (g de vWF/litro), 0,56 g de vWF/litro, 0,39 g de vWF/litro e 0,27 g de vWF/litro. As concentrações dos retentatos, após a concentração, foram de 2,52 g de vWF/litro, 4,59 g de vWF/litro, 2,23 g de vWF/litro e 1,26 g de vWF/litro, respectivamente. Os experimentos levaram aproximadamente 2 a 4 horas até a conclusão.
O tampão de solução, na corrente de alimentação, foi um
HEPES de 20 mM (milimolar) e um tampão de NaCl de 150 mM, com um pH de 7,4 na temperatura ambiente. O tampão de diálise foi um tampão de citrato a 20 mM e de glicina a 15 mM, com um pH de 7,3 na temperatura ambiente. A concentração do HEPES foi reduzida de mais do que 15 mM na alimentação a menos do que 1 mM no retentato.
Tabela 2: Dados para os Experimentos 1-1, 1-2, 1-3 E 1-4
| Experimento 1-1 | Experimento 1-2 | Experimento 1-3 | Experimento 1-4 | |
| Volume da alimentação (1) | 1,4 | 1,94 | 2,36 | 4,85 |
| Volume do retentato (ml) | 330 | 235 | 410 | 1057 |
| Volume total do filtrado (1) | 15,3 | 10 | 12,86 | 12 |
| Volume do tampão de diálise (1) | 14,2 | 8,3 | 10,9 | 8,2 |
| Fluxo de alimentação (ml/min) | 50 a 100 | 50 a 200 | 200 | 200 |
| TMP 9 (mm de Hg) | -6 a 28 | 0a60 | -1 a 75 | n/a |
| Tempo do processo (min) | 152 | 123 | 143 | 207 |
| Rendimento de proteína do vWF | 84,8 | 69 | 80,7 | 74,1 |
| Rendimento da atividade do cofator da Ristocetina do vWF(%) | 80 | 74,9 | 105,8 | 733,4 |
Exemplo 2
Dois experimentos foram realizados com vWF como o biopolímero sensível ao cisalhamento com um módulo de diálise de fibra oca. O módulo de diálise de fibra oca tinha uma área superficial de membrana de 7000 cm , uma membrana de espessura de 30 micrômetros, um comprimento de fibra de 100 milímetros, e um diâmetro interno de fibra de 200 micrômetros. O material da membrana era de polietersulfona. Os experimentos foram realizados em uma vazão de alimentação de 300 ml/minuto com uma taxa de redução de volume inicial de 2 litros/hora e uma taxa de diálise de 5 litros/hora. A taxa de cisalhamento comunicado pela vazão de alimentação foi de aproximadamente 571 s’1. As concentrações das correntes de alimentação foram de cerca de 0,18 g de vWF/litro e de cerca de 0,22 g de vWF/litro. As concentrações do retentato foram de cerca de 0,88 g de vWF/litro e de cerca de 0,95 g de vWF/litro, respectivamente.
O tampão de solução, na corrente de alimentação, foi um tampão de HEPES a 20 mM e NaCl a 150 mM, com um pH de 7,4 na temperatura ambiente. O tampão de diálise foi um tampão de sal livre de citrato a 20 mM e glicina a 15 mM, com um pH de 7,3 na temperatura ambiente. A concentração do HEPES foi reduzida de mais do que 15 mM na alimentação a menos do que 1 mM no retentato.
Tabela 3: Dados dos Experimentos 2-1 e 2-2
| Experimento 2-1 | Experimento 2-2 | |
| Volume da alimentação (1) | 10,5 | 12,7 |
| Proteína total vWF na alimentação (g) | 1,9 | 2,8 |
| Vazão da alimentação (ml/min) | 300 | 300 |
| TMP (mm de Hg) | 8al31 | -4 a 116 |
| Taxa de redução do volume (ml/hora) | 2000 | 2000 |
| Taxa de diálise (ml/h) | 5000 | 4000 |
| Tempo total (h) | 8,9 | 6,3 |
| Rendimento de proteína do vWF (%) | 108,5 | 79,6 |
| Atividade - Rendimento do cofator da Ristocetina do vWF (%) | 97,6 | 77,7 |
A Figura 4 é uma representação gráfica do Experimento 2-1 com dados quanto à pressão da transmembrana, a pressão antes do filtro, a taxa de redução do volume, e o volume total do filtrado.
Exemplo Comparativo
Nove experimentos foram desenvolvidos nos dispositivos de fibra oca de fluxo tangential, com uma membrana de 300 kDa, comercialmente disponível da GE Healthcare (Buckinghamshire, Reino Unido). O diâmetro interno do dispositivo de fibra oca de fluxo tangential foi de 0,5 mm. Seis dos experimentos foram realizados nos dispositivos de fibra oca de fluxo tangential com uma área superficial da membrana de 140 cm , e três foram realizadas com uma área superficial da membrana de 650 cm. O processo de concentração incluiu uma etapa de ultrafiltração e uma etapa de diafiltração. A taxa de cisalhamento recomendado para a carga de alimentação sensível ao cisalhamento foi de 2000 a 4000 s’1, porém estes taxas de cisalhamento foram muito elevados para o biopolímero sensível ao cisalhamento testado, o vWF. Portanto, os experimentos foram desenvolvidos em vazões mais baixos do que recomendados para reduzir o esforço de cisalhamento comunicado aos biopolímeros. Após a ultrafiltração, o rendimento de proteína médio do vWF foi de 50,7 %, e o rendimento do cofator de Ristocetina do vWF foi de 59,0 %. Após o processo final de diafiltração, o rendimento de proteína médio do vWF foi de 48,3 % e o rendimento do cofator de Ristocetina do vWF foi de 53,8 %.
Estes rendimentos ficaram bem abaixo daqueles obtidos com os módulos de diálise de fibra oca. Além disso, as vazões mais baixas necessários para reduzir as taxas de cisalhamento nos dispositivos de fibra oca de fluxo tangencial aumentaram o tempo do processo a um nível proibitivo. Sem compensar quanto ao baixo fluxo de filtrado resultante associado com as baixas vazões, o tempo de processo não é economicamente exequível. Os métodos de aumentar o fluxo do filtrado, tais como de aumentar TMP ou a área superficial da membrana, resultam em perdas dos biopolímeros sensíveis ao cisalhamento para a precipitação de proteína ou a adsorção superficial.
Os exemplos precedentes demonstram um método eficaz para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, o qual alcança elevados rendimentos mediante a redução dos esforços de cisalhamento e retenção de um fluxo de filtrado suficientemente elevado. Este método assegura que a mistura que contenha os biopolímeros sensíveis ao cisalhamento é concentrada sem perder quantidades significativas do biopolímero para a transformação estrutural, a precipitação de proteína, a incrustação da membrana, e/ou a adsorção superficial da membrana.
A descrição acima é fornecida para clareza de entendimento apenas, e nenhuma limitação desnecessária deve ser dela entendida, uma vez que as modificações dentro do escopo da invenção podem ser evidentes àqueles que possuam habilidade normal na técnica.
Claims (12)
- REIVINDICAÇÕES1. Método para concentrar biopolímeros sensíveis ao cisalhamento, caracterizado pelo fato de que compreende escoar uma mistura compreendendo um biopolímero sensível ao cisalhamento e uma solução tampão dentro de um módulo de diálise de fibra oca para formar um retentato, o dito retentato tendo uma concentração de biopolímero sensível ao cisalhamento que seja maior do que aquela da mistura, e um filtrado, em que uma pressão transmembrana entre a mistura e o filtrado é de 1 mmHg a 150 mmHg, em que uma espessura da membrana do módulo de diálise de fibra oca é menor que 200 micrômetros, em que uma taxa de cisalhamento em parede no módulo é menor que 2300 s-1, em que o biopolímero sensível ao cisalhamento no retentato retém uma atividade de pelo menos 70% da atividade do biopolímero sensível presente na mistura, e em que o biopolímero sensível ao cisalhamento é o fator von Willebrand.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espessura de uma membrana do módulo de diálise de fibra oca é de 10 micrômetros a 100 micrômetros.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a espessura de uma membrana do módulo de diálise de fibra oca é de 30 micrômetros.
- 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma taxa de cisalhamento em parede no módulo de diálise de fibra oca é de 50 s-1 a 1800 s-1.
- 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peloPetição 870190095627, de 24/09/2019, pág. 8/9 fato de que uma membrana do módulo de diálise de fibra oca compreende um material que tem adsorção de proteína abaixo de 1 grama por metro quadrado.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma membrana do módulo de diálise de fibra oca compreende um material selecionado do grupo que consiste em polissulfona, polietersulfona, fluoreto de polivinilideno, poliimida, cerâmica, celulose modificada, poliamida alifática, e poliacrilonitrila.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma membrana do módulo de diálise de fibra oca compreende um material selecionado do grupo que consiste em polissulfona, polietersulfona e celulose modificada.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente deslocar uma parte do tampão de solução com um tampão de diálise.
- 9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o retentato compreende pelo menos 70 % do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o retentato compreende pelo menos 80 % do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura.
- 11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o retentato compreende pelo menos 90 % do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura.
- 12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o biopolímero sensível ao cisalhamento presente no retentato retém uma atividade de pelo menos 80 % da atividade do biopolímero sensível ao cisalhamento presente na mistura.
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