BRPI0918265B1 - Sequência de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula transformada, polipeptídeo recombinante, preparação de proteína, alimento, alimentação, suplemento de alimento, suplemento alimentar, auxiliar dietético ou composição dietética, método de produção de um polipeptídeo recombinante e palmitase - Google Patents

Abstract

ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, SINTÉTICO OU RECOMBINANTE, CASSETE DE EXPRESSÃO, CÉLULA TRANSFORMADA, ANIMAL NÃO-HUMANO TRANSGÊNICO, PLANTA E SEMENTE TRANSGÊNICA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, HETERODÍMERO, HOMODÍMERO, POLIPEPTÍDEO IMOBILIZADO, ANTICORPO ISOLADO, HIBRIDOMA, ALIMENTO, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO RECOMBINANTE, MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO DE AUMEN-TAR A TERMOTOLERÂNCIA, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, MÉTODO PARA LAVAR UM OBJETO, MÉTODO PARA ESTEREOSSELETIVAMENTE HIDROLISAR MISTURAS RACÊMICAS, COMPOSIÇÃO, MÉTODO DE GERAR UMA VARIANTE DE UM ÁCIDO NUCLEICO CODIFICANDO UM POLIPEPTÍDEO COM A ATIVIDADE DE HIDROLASE, MÉTODO PARA PREPARAR UMA ENZIMA, LIPASE, COSMÉTICO E PRODUTO FARMACÊUTICO. A invenção refere-se a hidrolases, incluindo lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, e polinucleotídeos codificando-as, e métodos de preparação e uso destes polinucleotídeos e polipep-tídeos. A invenção também refere-se a polipeptídeos, por exemplo, enzimas, tendo uma atividade de hidrolase, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatase e métodos para preparação de óleos graxos pouco saturados ou pouco trans, tal como óleos animais ou vegetais graxos pouco saturados ou pouco trans, por exemplo, óleos de soja ou canola.

Description

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA POR MEIO DA EFS-WEB

Todo o conteúdo da seguinte submissão eletrônica da listagem de sequência por meio do servidor USPTO EFS-WEB, como autorizado e mencionado em MPEP §1730 II.B.2(a)(C), é incorporado aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos. A listagem de sequência é identificada no arquivo de texto eletronicamente depositado como segue:

CAMPO TÉCNICO

São fornecidos aqui polipeptídeos tendo atividade de hidrolase, incluindo atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, polinu- cleotídeos codificando-os, e métodos de preparação e uso destes polinu- cleotídeos e polipeptídeos. São também fornecidos aqui peptídeos e polipep- tídeos, por exemplo, enzimas, tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, e métodos para tratamento de gorduras e óleos com tais peptídeos e polipeptídeos para preparar produtos de óleo hidrolisado tal como óleos vegetais ou animais pouco saturados, por exemplo, óleos de soja ou canola, os produtos de óleo desse modo tratados e produtos compreendendo tais óleos tratados.

ANTECEDENTES

As principais aplicações industriais para hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, incluem a indústria de alimento e bebida, como agentes antiazedamento para produtos de padaria, e na produção de margarina e outras pastas com sabores de manteiga natural; em sistemas de excreção; e na indústria farmacêutica onde eles são usados como auxiliares digestivos.

Óleos e gorduras processados são um principal componente de alimentos, aditivos alimentícios e auxiliares de processamento de alimento, e são também materiais brutos renováveis importantes para a indústria química. Eles estão disponíveis em grandes quantidades de processamento de sementes oleosas de plantas como farelo de arroz, milho, colza, canola, girassol, oliva, palma ou soja. Outras fontes de óleos e gorduras valiosos incluem peixe, lixo de restaurante, e gorduras animais convertidas. Estas gorduras e óleos são uma mistura de triacilglicerídeos ou lipídeos, isto é, ácidos graxos (FA) esterificados em um andaime de glicerol. Cada óleo ou gordura contém uma ampla variedade de diferentes estruturas de lipídeo, definidas pelo conteúdo de FA e sua distribuição regioquímica no esqueleto de glice- rol. Estas propriedades dos lipídeos individuais determinam as propriedades físicas do triacilglicerídeo puro. Portanto, o conteúdo de triacilglicerídeo de uma gordura ou óleo em uma grande extensão determina as propriedades físicas, químicas e biológicas do óleo. O valor de lipídeos aumenta enormemente como uma função de sua pureza. Alta pureza pode ser obtida por cromatografia fracionária ou destilação, separando o triacilglicerídeo desejado da base mista da fonte de gordura ou óleo. Entretanto, isto é caro e as produções são frequentemente limitadas pelos baixos níveis nos quais o tri- acilglicerídeo ocorre naturalmente. Além disso, a facilidade de purificação do produto é frequentemente comprometida pela presença de muitos triacilgli- cerídeos estruturalmente e fisicamente ou quimicamente similares no óleo.

Uma alternativa para purificar triacilglicerídeos ou outros lipídeos de uma fonte natural é sintetizar os lipídeos. Os produtos de tais processos são chamados lipídeos estruturados por que eles contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida no esqueleto de gli- cerol. O valor de lipídeos também aumenta enormemente controlando o teor e distribuição de ácido graxo dentro do lipídeo. A eliminação de triglicerí- deos, gorduras ou óleos de FA indesejável, ou substituição de FA com propriedades indesejadas por ácidos graxos com propriedades químicas, físicas ou biológicas melhores ou mais desejáveis, aumenta o valor dos lipídeos. Em particular, existe uma necessidade de lipases que possam hidrolisar, por exemplo, seletivamente hidrolisem, um ácido graxo saturado (uma "satura- se"), ou aqueles que em particular, possam hidrolisar, por exemplo seletivamente hidrolisem, um ácido palmítico (uma "palmitase") ou um ácido esteárico (uma "estearatase") de um esqueleto de glicerol. Lipases, tal como satu- rases, por exemplo, palmitases e/ou estearatases podem ser usadas para realizar tal controle onde o FA sendo removido, adicionado ou substituído é ácido graxo saturado, por exemplo, ácido palmitático ou ácido esteárico.

SUMÁRIO

São fornecidos aqui polipeptídeos tendo atividade de hidrolase, incluindo atividade de lipase. Em um aspecto, são fornecidas aqui novas classes de lipases denominadas "saturases", "palmitases" e "estearatases". Também são fornecidos polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade de saturase, por exemplo, palmitase e/ou estearatase, e métodos de preparação e uso destes polinucleotídeos e polipeptídeos. Em um aspecto, são fornecidos aqui polipeptídeos, por exemplo, enzimas, tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase tendo atividade de enzima (catalítica) termoestável e/ou termo- tolerante. As atividades enzimáticas dos polipeptídeos e peptídeos como fornecidos aqui incluem (compreendem ou consistem em) uma atividade de saturase ou a atividade de lipase, incluindo hidrólise de lipídeos, reações de acidólise (por exemplo, para substituir um ácido graxo esterificado com um ácido graxo livre), reações de transesterificação (por exemplo, permuta de ácidos graxos entre triacilglicerídeos), síntese de éster, reações de alternação de éster e atividade de lipídeo acil hidrolase (LAH). Em outro aspecto, os polipeptídeos como fornecidos aqui são usados para sintetizar produtos qui- rais enantiomericamente puros.

Os polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser usados em uma variedade de contextos farmacêuticos, agrícolas e industriais, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêuticos. Adicionalmente, os polipeptí- deos como fornecidos aqui podem ser usados em processamento de alimen- to, fermento, aditivos de banho, produção de álcool, síntese de peptídeo, enantiosseletividade, preparação de couro curtido na indústria de couro, controle de resíduo e degradação de excreção animal, recuperação de prata na indústria fotográfica, tratamento médico, dessegregação de seda, degradação de biopelícula, conversão de biomassa em etanol, biodefesa, agentes antimicrobianos e desinfetantes, cuidado pessoal e cosméticos, reagentes biotécnicos, em aumento da produção de amido a partir de moagem úmida de milho, e como produtos farmacêuticos, tal como auxiliares digestivos e agentes anti-inflamatórios (antiflogísticos).

Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) e métodos para produzir óleos pouco saturados, por exemplo, óleos com um menor teor de ácido graxo saturado, incluindo óleos fracos em ácidos graxos de palmitato, estearato, miristato, laurato ou butirato e/ou ácido caprílico (ácido octanoico). Qualquer óleo vegetal, por exemplo, óleo de canola, óleo de soja, ou óleo ou gordura animal, por exemplo, sebo, pode ser tratado com uma composição, ou por um método, como fornecido aqui. Quaisquer alimentos, itens comestíveis, ou produtos de cozimento em forno, fritura ou cozimento (por exemplo, molhos, escabeches, condimentos, óleos de spray, margarinas, óleos para cozimento em forno, maionese, óleos para cozimento, óleos de salada, recheios que se pode pegar com colher e despejáveis, e similares, e produtos preparados com eles) podem compreender um óleo vegetal ou gordura animal que foi tratado com uma composição ou por um método como fornecido aqui. Óleos vegetais modificados para serem óleos saturados inferiores podem ser usados em quaisquer alimentos, itens comestíveis ou cozimento em forno ou cooking produtos, por exemplo, molhos, escabeches, condimentos, óleos de spray, margarinas, óleos para cozimento em forno, maionese, óleos para cozimento, óleos de salada, recheios que se pode pegar com colher e despejáveis e similares. Em uma modalidade, são fornecidos aqui óleos, tal como óleos vegetais, por exemplo, óleo de canola ou óleo de soja, e alimentos ou produtos de cozimento em forno ou cozimento, incluindo molhos, escabeches, condimentos, óleos de spray, margarinas, maionese, óleos para cozimento em forno, óleos para cozimento, óleos de fritura, óleos de salada, recheios que se pode pegar com colher e despejáveis, e similares, em que o óleo ou alimento, produto de cozimento em forno ou cozimento foi modificado usando uma enzima como fornecido aqui. Em um aspecto, estes óleos vegetais, por exemplo, óleo de canola, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo de linhaça, óleo de espuma de prado, óleo de oliva, óleo de palma, óleo de semente de palma, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de açafroa, óleo de sasanqua, óleo de soja, óleo de semente de girassol, resina líquida, óleo de tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou "reprodução" tradicional tal como óleos oleico elevado, linolênico inferior, ou saturado inferior (óleo de canola oleico elevado, óleo de soja linolênico inferior ou óleos de girassol esteáricos elevados), gorduras animais (sebo, banha de porco, gordura de manteiga, e gordura de frango), óleos de peixe (óleo de peixe vela, óleo de fígado de bacalhau, óleo rudimentar de laranja, óleo de sardinha, óleo de arenque, e óleo de menhaden), ou misturas de quaisquer dos acima, e alimentos ou cozimento em forno, produtos de fritura ou cozimento, compreendem óleos com um menor teor de ácido graxo saturado, incluindo óleos fracos em ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octanoico) etc., processados usando uma composição ou método como fornecido aqui.

Em um aspecto, são fornecidos aqui polipeptídeos, por exemplo, enzimas e anticorpos catalíticos, tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, incluindo atividades enzimáticas termoestáveis e termotolerantes, e atividades específicas de ácido graxo ou seletivas de ácido graxo, e atividades enzimáticas tolerantes a pH baixo e elevado, e polinucleotídeos codificando estes polipeptídeos, incluindo vetores, células hospedeiras, plantas transgênicas e animais não- humanos, e métodos para a preparação e uso destes polinucleotídeos e po- lipeptídeos.

Em outro aspecto, são fornecidos aqui ácido nucleico isolado, sintético ou recombinantes compreendendo (a) um ácido nucleico (polinucleotídeo) codificando pelo menos um polipeptídeo, em que o ácido nucleico compreende uma sequência tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou completa (100%) identidade de sequência para: (i) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23, ou (ii) o ácido nucleico de SEQ ID NO:1 tendo uma ou mais mudanças de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro ou mais ou todas as mudanças de aminoácido (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, em que o ácido nucleico de (i) ou (ii) codifica pelo menos um po- lipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase, ou codifica um polipeptídeo ou peptídeo capaz de gerar um anticorpo específico (um poli- peptídeo ou peptídeo que age como um epitopo ou imunógeno) de hidrolase (por exemplo uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou a estearatase), (b) o ácido nucleico (polinucleotídeo) de (a), em que as identidades de sequência são determinadas: (A) por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, ou (B) em uma região de pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou mais resíduos, ou o tamanho natural de um cDNA, transcrição (mRNA) ou gene, (c) o ácido nucleico (polipeptídeo) de (a) ou (b), em que, o algoritmo de comparação de sequência é um algoritmo BLAST versão 2,2,2 onde uma instalação de filtragem é fixada em blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, e todas as outras opções são estabelecidas para default, (d) um ácido nucleico (polinucleotídeo) codificando pelo menos um polipeptídeo ou peptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma esteara- tase, em que o ácido nucleico compreende uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas para o complemento do ácido nucleico de (a), (b) ou (c), em que as condições rigorosas compreendem uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65°C durante cerca de 15 minutos, (e) um ácido nucleico (polinucleotídeo) codificando pelo menos um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase, em que o polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO:2, ou fragmentos en- zimaticamente ativos da mesma, tendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, ou mais ou todas as mudanças de aminoácido (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, (f) um ácido nucleico (polinucleotídeo) codificando pelo menos um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase, em que o polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou fragmentos enzimaticamen- te ativos da mesma, (g) (A) o ácido nucleico (polinucleotídeo) de qualquer de (a) a (f) e codificando um polipeptídeo tendo pelo menos uma substituição de amino- ácido conservativa e mantendo sua atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, ou, (B) o ácido nu- cleico de (g)(A), em que o pelo menos uma substituição de aminoácido con- servativa compreende substituir um aminoácido com outro aminoácido de características semelhantes; ou, uma substituição conservativa compreende: substituição de um aminoácido alifático com outro aminoácido alifático; substituição de uma serina com uma treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico com outro resíduo acídico; substituição de um resíduo transportando um grupo amida com outro resíduo transportando um grupo amida; permuta de um resíduo básico com outro resíduo básico; ou substituição de um resíduo aromático com outro resíduo aromático, (h) o ácido nucleico (polinucleotídeo) de qualquer de (a) a (g) codificando um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase porém não tendo uma sequência sinal, (i) o ácido nucleico (polinucleotídeo) de qualquer de (a) a (h) co-dificando um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase também compreendendo uma sequência heteróloga, (j) o ácido nucleico (polinucleotídeo) de (i), em que a sequência heteróloga compreende, ou consiste em uma sequência codificando: (A) uma sequência sinal heteróloga, (B) a sequência de (A), em que a sequência sinal heteróloga é derivada de uma enzima heteróloga, ou, (C) um rótulo, um epitopo, um peptídeo de alvejamento, uma sequência clivável, uma porção detectável ou uma enzima, ou (k) uma sequência de ácido nucleico (polinucleotídeo) totalmente (completamente) complementar à sequência de qualquer de (a) a (j).

Em um aspecto, o ácido nucleico isolado, sintético ou recombi- nante codifica um polipeptídeo ou peptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, que é termoestável. Os polipeptídeos e peptídeos codificados por ácidos nuclei- cos como fornecido aqui, ou qualquer polipeptídeo ou peptídeo como forne- cido aqui, podem manter a atividade enzimática ou de ligação (por exemplo, ligação de substrato) sob condições compreendendo uma faixa de temperatura entre cerca de -100°C a cerca de -80°C, cerca de -80°C a cerca de - 40°C, cerca de -40°C a cerca de -20°C, cerca de -20°C a cerca de 0°C, cerca de 0°C a cerca de 5°C, cerca de 5°C a cerca de 15°C, cerca de 15°C a cerca de 25°C, cerca de 25°C a cerca de 37°C, cerca de 37°C a cerca de 45°C, cerca de 45°C a cerca de 55°C, cerca de 55°C a cerca de 70°C, cerca de 70°C a cerca de 75°C, cerca de 75°C a cerca de 85°C, cerca de 85°C a cerca de 90°C, cerca de 90°C a cerca de 95°C, cerca de 95°C a cerca de 100°C, cerca de 100°C a cerca de 105°C, 5 cerca de 105°C a cerca de 110°C, cerca de 110°C a cerca de 120°C, ou 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C ou mais. São fornecidos aqui os polipeptídeos termoestáveis que mantêm a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, em uma temperatura nas faixas descritas acima, em cerca de pH 3,0, cerca de pH 3,5, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,5, cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,5, cerca de pH 6,0, cerca de pH 6,5, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,5, cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,5, cerca de pH 9,0, cerca de pH 9,5, cerca de pH 10,0, cerca de pH 10,5, cerca de pH 11,0, cerca de pH 11,5, cerca de pH 12,0 ou mais.

Em um aspecto, polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser termotolerantes e podem manter a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase após exposição a uma temperatura na faixa de cerca de -100°C a cerca de -80°C, cerca de - 80°C a cerca de -40°C, cerca de -40°C a cerca de -20°C, cerca de -20°C a cerca de 0°C, cerca de 0°C a cerca de 5°C, cerca de 5°C a cerca de 15°C, cerca de 15°C a cerca de 25°C, cerca de 25°C a cerca de 37°C, cerca de 37°C a cerca de 45°C, cerca de 45°C a cerca de 55°C, cerca de 55°C a cerca de 70°C, cerca de 70°C a cerca de 75°C, cerca de 75°C a cerca de 85°C, cerca de 85°C a cerca de 90°C, cerca de 90°C a cerca de 95°C, cerca de 95°C a cerca de 100°C, cerca de 100°C a cerca de 105°C, cerca de 105°C a cerca de 110°C, cerca de 110°C a cerca de 120°C, ou 95°C, 96°C, 97°C, 98°C, 99°C, 100°C, 101°C, 102°C, 103°C, 104°C, 105°C, 106°C, 107°C, 108°C, 109°C, 110°C, 111°C, 112°C, 113°C, 114°C, 115°C ou mais.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos termotolerantes mantêm a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, após exposição a uma temperatura nas faixas descritas acima, em cerca de pH 3,0, cerca de pH 3,5, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,5, cerca de pH 5,0, cerca de pH 5,5, cerca de pH 6,0, cerca de pH 6,5, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,5, cerca de pH 8,0, cerca de pH 8,5, cerca de pH 9,0, cerca de pH 9,5, cerca de pH 10,0, cerca de pH 10,5, cerca de pH 11,0, cerca de pH 11,5, cerca de pH 12,0 ou mais.

Em uma modalidade, ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou re- combinantes compreendem uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas em um ácido nucleico como fornecido aqui, por exemplo, um ácido nucleico exemplar como fornecido aqui compreendendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23, ou uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:1 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as mudanças de resíduo (modificações de sequência para a SEQ ID NO:1) mencionadas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, ou fragmentos ou subsequências dos mesmos, e as sequências (totalmente) complementares a eles. Em um aspecto, o ácido nucleico codifica um poli- peptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. O ácido nucleico pode ser pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos de comprimento ou o tamanho natural de um gene ou transcrição compreendendo SEQ ID NO:1, e tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:1 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as mudanças de resíduo (modificações de se quência de aminoácido) para a SEQ ID NO:1 mencionadas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23; e as sequências (totalmente) complementares a eles. Em um aspecto, as condições rigorosas incluem uma etapa de lavagem compreendendo uma lavagem em 0,2X SSC em uma temperatura de cerca de 65oC durante cerca de 15 minutos.

Em uma modalidade, uma sonda de ácido nucleico, por exemplo, uma sonda para identificar um ácido nucleico codificando um polipeptí- deo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, satura- se, palmitase e/ou estearatase, compreende uma sonda compreendendo ou consistindo em pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou mais, bases consecutivas de uma sequência como fornecido aqui, ou fragmentos ou subsequên- cias dos mesmos, em que a sonda identifica o ácido nucleico por ligação ou hibridização. A sonda pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma sequência compreendendo uma sequência como fornecido aqui, ou fragmentos ou subsequências dos mesmos. A sonda pode compreender um oligonucleotí- deo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60, cerca de 30 a 70, cerca de 40 a 80, ou cerca de 60 a 100 bases consecutivas de uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui, ou uma subsequên- cia dos mesmos.

Em uma modalidade, um par de sequência iniciadora de amplificação para amplificar um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, compreende um par iniciador compreendendo ou consistindo em um par iniciador capaz de amplificar um ácido nucleico compreendendo uma sequência como fornecido aqui, ou fragmentos ou subsequên- cias dos mesmos. Um ou cada membro do par de sequência iniciadora de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 bases consecutivas da sequência.

Em uma modalidade, métodos de amplificação de um ácido nu- cleico codificando um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, compreendem a amplificação de um ácido nucleico padrão com um par de sequência iniciadora de amplificação capaz de amplificar uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui, ou fragmentos ou subsequências dos mesmos.

Em uma modalidade, cassetes de expressãso compreendem um ácido nucleico como fornecido aqui ou uma subsequência dos mesmos. Em um aspecto, o cassete de expressão pode compreender o ácido nucleico que é operavelmente ligado a um promotor. O promotor pode ser um promotor viral, bactérias no, mamífero ou de planta. Em um aspecto, o promotor de planta pode ser um promotor de batata, arroz, milho, trigo, tabaco ou cevada. O promotor pode ser um promotor constitutivo. O promotor constitutivo pode compreender CaMV35S. Em outro aspecto, o promotor pode ser um promotor induzível. Em um aspecto, o promotor pode ser um promotor específico de tecido ou um promotor ambientalmente regulado ou um progressivamente regulado. Desse modo, o promotor pode ser, por exemplo, um promotor específico da semente, um específico da folha, um específico da raiz, um específico do caule ou um induzido por excisão. Em um aspecto, o cassete de expressão pode também compreender vetor de expressão de planta ou vírus de planta.

Em uma modalidade, veículos de clonagem compreendem um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) como fornecido aqui ou um ácido nucleico como fornecido aqui. O veículo de clonagem pode ser um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fagomídeo, um cosmídeo, um fosmí- deo, um bacteriofago ou um cromossoma artificial. O vetor viral pode compreender um vetor adenovírus, um vetor retroviral ou um vetor viral adeno- associado. O veículo de clonagem pode compreender um cromossoma artificial bacteriano (BAC), um plasmídeo, um vetor derivado de bacteriofago P1 (PAC), um cromossoma artificial de levedura (YAC), ou um cromossoma artificial mamífero (MAC).

Em uma modalidade, células transformadas compreendem um ácido nucleico como fornecido aqui ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) como fornecido aqui, ou um veículo de clonagem como fornecido aqui. Em um aspecto, a célula transformada pode ser uma célula bacte- riana, uma célula mamífera, uma célula fúngica, uma célula de levedura, uma célula de inseto ou uma célula de planta. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, trigo, arroz, milho, tabaco ou cevada. A célula transformada pode ser quaisquer das células hospedeiras familiares àqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarió- ticas, tal como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células mamíferas, células de inseto, ou células de planta. Células bacteria- nas exemplares incluem quaisquer espécies dentro dos gêneros Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas e Staphylococcus, incluindo, por exemplo, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Células fúngicas exemplares incluem quaisquer espécies de Aspergillus. Células de levedura exemplares incluem quaisquer espécies de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Schwanniomyces, incluindo Pichia pastoris, Sac- charomyces cerevisiae, ou Schizosaccharomyces pombe. Células de inseto exemplares incluem quaisquer espécies de Spodoptera ou Drosophila, incluindo Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Células animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma de Bowes ou qualquer cepa de célula de camundongo ou humana.

Em uma modalidade, plantas transgênicas compreendem um ácido nucleico como fornecido aqui ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) como fornecido aqui. A planta transgênica pode ser uma planta de milho, uma planta de batata, uma planta de tomate, uma planta de trigo, uma planta de semente oleosa, uma planta de colza, uma planta de soja, uma planta de arroz, uma planta de cevada ou uma planta de tabaco.

Em uma modalidade, sementes transgênicas compreendem um ácido nucleico como fornecido aqui ou um cassete de expressão (por exemplo, um vetor) como fornecido aqui. A semente transgênica pode ser arroz, uma semente de milho, um grão de trigo, uma semente oleosa, uma colza, uma semente de soja, um grão de palma, uma semente de girassol, uma semente de sésamo, um amendoim ou uma planta de semente de tabaco.

Em uma modalidade, polipeptídeos isolados, sintéticos ou re- combinantes têm a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase, ou polipeptídeos capaz de gerar uma resposta imune específica para uma hidrolase, por exemplo, uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase (por exemplo, um epitopo); e em aspectos alternativos peptídeos e polipeptí- deos como fornecidos aqui compreendem uma sequência: (a) tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou tem 100% (completa) identidade de sequência para: (i) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, ou fragmentos enzimaticamente ativos da mesma, e tendo pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte e um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro ou mais ou todas as mudanças de resíduo de ami- noácido (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, ou (ii) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 em que o polipeptídeo ou peptídeo de (i) ou (ii) tem a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma pal- mitase e/ou uma estearatase, ou o polipeptídeo ou peptídeo é capaz de gerar um anticorpo específico (um polipeptídeo ou peptídeo que age como um epitopo ou imunógeno) de hidrolase (por exemplo uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou a estearatase), (b) o polipeptídeo ou peptídeo de (a), em que as identidades de sequência são determinadas: (A) por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por uma inspeção visual, ou (B) em uma região de pelo menos cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 ou mais resíduos de aminoácido, ou sobre o tamanho natural do poli- peptídeo ou peptídeo ou enzima, e/ou subsequências enzimaticamente ativas (fragmentos) dos mesmos, (c) o polipeptídeo ou peptídeo de (b), em que o algoritmo de comparação de sequência é um algoritmo BLAST versão 2,2,2 onde uma instalação de filtragem é fixada em blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, e todas as outras opções são estabelecidas para default; (d) uma sequência de aminoácido codificada pelo ácido nucleico fornecido aqui, em que o polipeptídeo tem (i) a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase, ou, (ii) tem atividade imunogênica em que ele é capaz de gerar um anticorpo que especificamente se liga em um polipeptídeo tendo uma sequência de (a), e/ou subsequências enzimaticamente ativas (fragmentos) dos mesmos; (e) a sequência de aminoácido de qualquer de (a) a (d), e com-preendendo pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácido constitutiva, e o polipeptídeo ou peptídeo mantém a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase; (f) a sequência de aminoácido de (e), em que a substituição conservativa compreende substituição de um aminoácido alifático com outro aminoácido alifático; substituição de uma serina com uma treonina ou vice- versa; substituição de um resíduo acídico com outro resíduo acídico; substituição de um resíduo transportando um grupo amida com outro resíduo transportando um grupo amida; permuta de um resíduo básico com outro resíduo básico; ou, substituição de um resíduo aromático com outro resíduo aromático, ou uma combinação dos mesmos, (g) a sequência de aminoácido de (f), em que o resíduo alifático compreende alanina, valina, leucina, isoleucina ou um equivalente sintético dos mesmos; o resíduo acídico compreende ácido aspártico, ácido glutâmico ou um equivalente sintético dos mesmos; o resíduo compreendendo um grupo amida compreende asparagina, glutamina ou um equivalente sintético dos mesmos; o resíduo básico compreende lisina, arginina, histidina ou um equivalente sintético dos mesmos; ou, o resíduo aromático compreende feni- lalanina, tirosina, triptofano ou um equivalente sintético dos mesmos; (h) o polipeptídeo de qualquer de (a) a (f) tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmi- tase e/ou uma estearatase porém não tendo uma sequência sinal, (i) o polipeptídeo de qualquer de (a) a (h) tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmi- tase e/ou uma estearatase também compreendendo uma sequência heteró- loga; (j) o polipeptídeo de (i), em que a sequência heteróloga compreende, ou consiste em: (A) uma sequência sinal heteróloga, (B) a sequência de (A), em que a sequência sinal heteróloga é derivada de uma enzima heteróloga, e/ou, (C) um rótulo, um epitopo, um peptídeo de alvejamento, uma sequência clivável, uma porção detectável ou uma enzima; ou (m) compreendendo uma sequência de aminoácido codificado por qualquer sequência de ácido nucleico como fornecidos aqui.

Sequências de polipeptídeo ou peptídeo exemplares como fornecidas aqui incluem SEQ ID NO:2, e subsequências dos mesmos e variantes dos mesmos, por exemplo, pelo menos cerca de 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 ou mais resíduos de comprimento, ou sobre o tamanho natural de uma enzima, todos tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as mudanças de resíduo de aminoácido (modificações de aminoácido de sequência para a SEQ ID NO:2) mencionadas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23,. Sequências de polipeptídeo ou peptídeo exemplares como fornecidas aqui incluem sequência codificada por um ácido nucleico como fornecido aqui. Sequências de polipeptídeo ou pep- tídeo exemplares como fornecidas aqui incluem polipeptídeos ou peptídeos especificamente ligados por um anticorpo como fornecido aqui. Em um aspecto, um polipeptídeo como fornecido aqui tem pelo menos uma atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou es- tearatase. Em um aspecto, a atividade é uma atividade regiosseletiva e/ou quimiosseletiva.

Em um aspecto, o polipeptídeo isolado, sintético ou recombinan- te pode compreender o polipeptídeo como fornecido aqui que não possui uma sequência sinal (peptídeo), por exemplo, não possui sua sequência sinal homóloga, e em um aspecto, compreende uma sequência sinal (peptí- deo) heteróloga. Em um aspecto, o polipeptídeo isolado, sintético ou recom- binante pode compreender o polipeptídeo como fornecido aqui compreendendo uma sequência sinal heteróloga, tal como uma sequência sinal de hidrolase ou não-hidrolase heteróloga (por exemplo, não-lipase, não- saturase ou não-palmitase). Em um aspecto, proteínas quiméricas compreendem um primeiro domínio compreendendo uma sequência sinal como fornecida aqui e pelo menos um segundo domínio. A proteína pode ser uma proteína de fusão. O segundo domínio pode compreender uma enzima. A enzima pode ser uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase) como fornecido aqui, ou, outra hidrolase.

Em um aspecto, a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) compreende uma atividade específica a cerca de 37°C na faixa de cerca de 100 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) compreende uma atividade específica de cerca de 500 a cerca de 750 unidades por miligrama de proteína. Alternativamente, a atividade de hidrolase compreende uma atividade específica a 37°C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína. Em um aspecto, a atividade de hidrolase compreende uma atividade específica a 37°C na faixa de cerca de 750 a cerca de 1000 unidades por miligrama de proteína. Em outro aspecto, a termotolerância compreende retenção de pelo menos metade da atividade específica da hi- drolase a 37°C após ser aquecida para uma temperatura elevada. Alternativamente, a termotolerância pode compreender retenção de atividade específica a 37°C na faixa de cerca de 500 a cerca de 1200 unidades por miligrama de proteína após ser aquecida para uma temperatura elevada.

Em uma modalidade, os polipeptídeos isolados, sintéticos ou re- combinantes como fornecidos aqui compreendem pelo menos um sítio de glicosilação. Em um aspecto, a glicosilação pode ser uma glicosilação N- ligada. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosilado após ser expresso em um P. pastoris ou a S. pombe ou em plantas, tal como óleo produzindo plantas, por exemplo, soja, canola, arroz, girassol, ou variantes geneticamente modificadas (GMO) destas plantas.

Em um aspecto, o polipeptídeo pode manter a atividade de hi- drolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) sob condições compreendendo cerca de pH 6,5, pH 6, pH 5,5, pH 5, pH 4,5 ou pH 4,0 ou menor. Em outro aspecto, o polipeptídeo pode manter a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) sob condições compreendendo cerca de pH 7, pH 7,5, pH 8,0, pH 8,5, pH 9, pH 9,5, pH 10, pH 10,5, pH 11, pH 11,5, pH 12,0 ou mais.

Em uma modalidade, preparações de proteína compreendem um polipeptídeo como fornecido aqui, em que a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.

Em um aspecto, heterodímeros como fornecidos aqui compreendem um polipeptídeo e um segundo domínio. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um polipeptídeo e o heterodímero pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, o segundo domínio pode ser um epitopo ou um rótulo. Em um aspecto, homodímeros como fornecidos aqui compreendem um polipeptídeo como fornecido aqui.

Em uma modalidade, polipeptídeos imobilizados como fornecidos aqui têm uma atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase), em que o polipeptídeo compreende um polipep- tídeo como fornecido aqui, um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui, ou um polipeptídeo compreendendo um polipeptídeo como fornecido aqui e um segundo domínio. Em um aspecto, um polipeptí- deo como fornecido aqui pode ser imobilizado sobre uma célula, uma vesícula, um lipossoma, uma película, uma membrana, um metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula gra- fítica, uma conta, um gel, uma placa, um cristal, um comprimido, uma pílula, uma cápsula, um pó, um aglomerado, uma superfície, uma estrutura porosa, uma disposição ou um tubo capilar, ou materiais tal como grãos, cascas secas, casca de árvore, pele, cabelo, esmalte, osso, casca de noz e materiais que derivam dos mesmos. Polinucleotídeos, polipeptídeos e enzimas como fornecidas aqui podem ser formulados em uma forma sólida tal como um pó, uma preparação liofilizada, grânulos, um comprimido, uma barra, um cristal, uma cápsula, uma pílula, um pélete, ou em uma forma líquida tal como uma solução aquosa, um aerossol, um gel, uma pasta, uma suspensão, uma emulsão aquosa/oleosa, um creme, uma cápsula, ou uma suspensão vesicular ou micelar.

Em uma modalidade, suplementos alimentares para um animal compreendem um polipeptídeo como fornecido aqui, por exemplo, um poli- peptídeo codificado pelo ácido nucleico como fornecido aqui. Em um aspecto, o polipeptídeo no suplemento alimentar pode ser glicosilado. Em uma modalidade, matrizes de liberação de enzima comestível compreendem um polipeptídeo como fornecido aqui, por exemplo, um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico como fornecido aqui. Em um aspecto, a matriz de liberação compreende um pélete. Em um aspecto, o polipeptídeo pode ser glicosi- lado. Em um aspecto, a atividade de hidrolase é termotolerante. Em outro aspecto, a atividade de hidrolase é termoestável.

Em uma modalidade, métodos de isolar ou identificar um poli- peptídeo têm a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase) compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de um anticorpo como fornecido aqui; (b) fornecimento de uma amostra compreendendo polipeptídeos; e (c) contato da amostra de etapa (b) com o anticorpo de etapa (a) sob condições em que o anticorpo pode especificamente ligar-se ao polipeptídeo, desse modo isolando ou identificando um polipeptí- deo tendo uma atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase).

Em uma modalidade, métodos de preparação de um anticorpo anti-hidrolase compreendem administrar a um animal não-humano um ácido nucleico como fornecido aqui ou um polipeptídeo como fornecido aqui ou subsequências dos mesmos em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune humoral, desse modo preparando um anticorpo anti- hidrolase. São fornecidos aqui métodos de preparação de um anticorpo anti- hidrolase compreendendo administrar a um animal não-humano um ácido nucleico como fornecido aqui ou um polipeptídeo como fornecido aqui ou subsequências dos mesmos em uma quantidade suficiente para gerar uma resposta imune.

Em uma modalidade, métodos de produção de um polipeptídeo recombinante compreendem as etapas de: (a) fornecer um ácido nucleico como fornecido aqui operavelmente ligado a um promotor; e (b) expressar o ácido nucleico de etapa (a) sob condições que permitem a expressão de po- lipeptídeo, desse modo produzindo um polipeptídeo recombinante . Em um aspecto, o método pode também compreender transformar uma célula hospedeira com o ácido nucleico de etapa (a) seguido pela expressão do ácido nucleico de etapa (a), desse modo produzindo um polipeptídeo recombinan- te em uma célula transformada.

Em uma modalidade, métodos para a identificação de um poli- peptídeo tendo uma atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) compreendem as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo como fornecido aqui; ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) fornecimento de um substrato de hidrolase; e (c) contato do polipeptídeo ou um fragmento ou variante dos mesmos de etapa (a) com o substrato de etapa (b) e detecção de um decréscimo na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação, em que um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação detecta um polipeptí- deo tendo uma atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase).

Em uma modalidade, métodos para a identificação de um substrato de hidrolase compreendem as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo como fornecido aqui; ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) fornecimento de um substrato de teste; e (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com o substrato de teste de etapa (b) e detecção de um decréscimo na quantidade de substrato ou um aumento na quantidade de produto de reação, em que um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação identifica o substrato de teste como um substrato de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase).

Em uma modalidade, métodos de determinação de se um composto de teste liga-se especificamente em um polipeptídeo, compreendem as seguintes etapas: (a) expressão de um ácido nucleico ou um vetor compreendendo o ácido nucleico sob condições permissivas para a translação do ácido nucleico para um polipeptídeo, em que o ácido nucleico compreende um ácido nucleico como fornecido aqui, ou, fornecimento de um polipep- tídeo como fornecido aqui; (b) fornecimento de um composto de teste; (c) contato do polipeptídeo com o composto de teste; e (d) determinação de se o composto de teste de etapa (b) liga-se especificamente ao polipeptídeo.

Em uma modalidade, métodos para a identificação de um modu- lador de uma atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase) compreendem as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo como fornecido aqui ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) fornecimento de um composto de teste; (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com o composto de teste de etapa (b) e medição de uma atividade da hidrolase, em que uma mudança na atividade de hidrolase medida na presença de composto de teste comparado à atividade na ausência do composto de teste fornece uma determinação de que o composto de teste modula a atividade de hidrolase. Em um aspecto, a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) pode ser medida por fornecimento de um substrato de hi- drolase e detecção de um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade de um produto de reação, ou, um aumento na quantidade do substrato ou um decréscimo na quantidade de um produto de reação. Um decréscimo na quantidade do substrato ou um aumento na quantidade do produto de reação com o composto de teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto de teste identifica o composto de teste como um ativador de atividade de hidrolase. Um aumento na quantidade do substrato ou um decréscimo na quantidade do produto de reação com o composto de teste quando comparado à quantidade de substrato ou produto de reação sem o composto de teste identifica o composto de teste como um inibidor de atividade de hidrolase.

Em uma modalidade, sistemas de computador compreendem um processador e um dispositivo de armazenagem de dados em que o referido dispositivo de armazenagem de dados tem armazenado sobre ele uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui). Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um algoritmo de comparação de sequência e um dispositivo de armazenagem de dados tendo pelo menos uma sequência de referência armazenada sobre ele. Em outro aspecto, o algoritmo de comparação de sequência compreende um programa de computador que indica polimorfismos. Em um aspecto, o sistema de computador pode também compreender um identificador que identifica um ou mais aspectos na referida sequência. Em uma modalidade, um meio interpretável por computador tem armazenado sobre ele uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui.

Em uma modalidade, métodos para identificar uma característica em uma sequência compreendem as etapas de: (a) leitura de uma sequência usando um programa de computador que identifica uma ou mais características em uma sequência, em que a sequência compreende uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui; e (b) identificação de uma ou mais características em uma sequência com o programa de computador.

Em outra modalidade, são fornecidos aqui métodos para comparar uma primeira sequência a uma segunda sequência compreendendo as etapas de: (a) leitura da primeira sequência e da segunda sequência por meio do uso de um programa de computador que compara sequências, em que a primeira sequência compreende uma sequência de polipeptídeo ou uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui; e (b) determinação de diferenças entre a primeira sequência e a segunda sequência com o programa de computador. A etapa de determinação de diferenças entre a primeira sequência e a segunda sequência pode também compreender a etapa de identificação de polimorfismos. Em um aspecto, o método pode também compreender um identificador que identifica uma ou mais características em uma sequência. Em outro aspecto, o método pode compreender a leitura da primeira sequência usando um programa de computador e identificação de uma ou mais características na sequência.

Em uma modalidade, métodos para isolar ou recuperar um ácido nucleico codificando um polipeptídeo têm a atividade de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) de uma amostra compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de um par de sequência iniciadora de amplificação para amplificar um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, em que o par iniciador é capaz de amplificar um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) isolação de um ácido nucleico da amostra ou tratamento da amostra tal que o ácido nucleico na amostra seja acessível para hibridização para o par iniciador de amplificação; e, (c) combinação do ácido nucleico de etapa (b) com o par iniciador de amplificação de etapa (a) e amplificação de ácido nucleico da amostra, desse modo isolando ou recuperando um ácido nucleico codificando um polipep- tídeo tendo a atividade de hidrolase de uma amostra. Em uma modalidade, a amostra é uma amostra ambiental, por exemplo, uma amostra de água, uma amostra líquida, uma amostra de terra, uma amostra de ar ou uma amostra biológica, por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de protozoário, uma célula de inseto, uma célula de levedura, uma célula de planta, uma célula fúngica ou uma célula mamífera. Um ou cada membro do par de sequência iniciadora de amplificação pode compreender um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos cerca de 10 a 50 ou mais bases consecutivas de uma sequência como fornecido aqui.

Em uma modalidade, método de aumentar a termotolerância ou termoestabilidade de um polipeptídeo de hidrolase compreende a glicosila- ção de um polipeptídeo de hidrolase, em que o polipeptídeo compreende pelo menos trinta aminoácidos contíguos de um polipeptídeo como fornecido aqui; ou um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui, desse modo aumentando a termotolerância ou termo- estabilidade do polipeptídeo de hidrolase. Em um aspecto, a atividade específica de hidrolase pode ser termoestável ou termotolerante em uma temperatura na faixa de maior do que cerca de 37°C a cerca de 95°C.

Em uma modalidade, métodos para superexpressar um polipep- tídeo de hidrolase recombinante (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) em uma célula compreendem expressão de um vetor compreendendo um ácido nucleico como fornecido aqui ou uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui, em que as identidades de sequência são determinadas por análise com um algoritmo de comparação de sequência ou por inspeção visual, em que a superexpressão é realizada pelo uso de um promotor de atividade elevada, um vetor dicistrônico ou pela amplificação de gene do vetor.

Em uma modalidade, composições detergentes compreendendo um polipeptídeo como fornecido aqui ou um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui compreendem a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. Em um aspecto, uma hidrolase pode ser uma hidrolase não tensoativa. Em outro aspecto, uma hidrolase pode ser uma hidrolase tensoativa.

Em uma modalidade, métodos para a lavagem de um objeto compreendem as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma composição compreendendo um polipeptídeo tendo a atividade de hidrolase, por exem- plo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, em que o poli- peptídeo compreende: um polipeptídeo como fornecido aqui ou um polipep- tídeo codificado por um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) fornecimento de um objeto; e (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) e do objeto de etapa (b) sob condições em que a composição pode lavar o objeto.

Em uma modalidade, métodos de preparação de uma planta transgênica compreendem as seguintes etapas: (a) introdução de uma sequência de ácido nucleico heteróloga em uma célula de planta, em que a sequência nucleica heteróloga compreende uma sequência de ácido nuclei- co como fornecido aqui, desse modo produzindo uma célula de planta transformada; e (b) produzindo uma planta transgênica a partir da célula transformada. Em um aspecto, a etapa (a) pode também compreender introduzir a sequência de ácido nucleico heteróloga por eletroporação ou microinjeção de protoplastos de célula de planta. Em outro aspecto, a etapa (a) pode também compreender introduzir a sequência de ácido nucleico heteróloga diretamente no tecido da planta por bombardeio de partícula de DNA. Alternativamente, a etapa (a) pode também compreender introduzir a sequência de ácido nucleico heteróloga em uma célula de planta DNA usando um hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens. Em um aspecto, a célula de planta pode ser uma célula de batata, milho, arroz, trigo, tabaco, ou cevada.

Em uma modalidade, métodos de expressar uma sequência de ácido nucleico heteróloga em uma célula de planta compreendem as seguintes etapas: (a) transformação da célula de planta com uma sequência de ácido nucleico heteróloga operavelmente ligado a um promotor, em que a sequência nucleica heteróloga compreende um ácido nucleico como fornecido aqui; (b) desenvolvimento da planta sob condições em que a sequência de ácido nucleico heteróloga é expressa na célula de planta.

Em uma modalidade, um primeiro método para síntese biocatalí- tica de um lipídeo estruturado compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) fornecimento de uma composição compreendendo um triacilglicerídeo (TAG); (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com a composição de etapa (b) sob condições em que o polipeptí- deo hidrolisa um resíduo acila na posição Sn2 do triacilglicerídeo (TAG), desse modo produzindo um 1,3-diacilglicerídeo (DAG); (d) fornecimento de um éster de R1; (e) fornecimento de uma hidrolase específica de R1, e (f) contato do 1,3-DAG de etapa (c) com o éster de R1 de etapa (d) e uma hi- drolase específica de R1 de etapa (e) sob condições em que uma hidrolase específica de R1 catalisa a esterificação da posição de Sn2, desse modo produzindo o lipídeo estruturado. Uma hidrolase como fornecida aqui pode ser uma lipase específica de Sn2. O lipídeo estruturado pode compreender uma alternativa de manteiga de cacau (CBA), uma manteiga de cacau sintética, uma manteiga de cacau natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM).

Em uma modalidade, um segundo método para síntese biocata- lítica de um lipídeo estruturado compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) fornecimento de uma composição compreendendo um triacilglicerídeo (TAG); (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com a composição de etapa (b) sob condições em que o polipeptí- deo hidrolisa um resíduo acila na posição Sn1 ou Sn3 do triacilglicerídeo (TAG), desse modo produzindo um 1,2-DAG ou 2,3-DAG; e (d) promoção da migração de acila no 1,2-DAG ou 2,3-DAG da etapa (c) sob condições cine- ticamente controladas, desse modo produzindo uma composição compreendendo um 1,3-DAG.

Este segundo método pode também compreender fornecimento de um éster de R1 e uma lipase específica de R1, e contato do 1,3-DAG de etapa (d) com o éster de R1 e a lipase específica de R1 sob condições em que a lipase específica de R1 catalisa a esterificação da posição de Sn2, desse modo produzindo um lipídeo estruturado. A hidrolase, por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase como fornecidas aqui pode ser uma enzima específica de Sn1 ou Sn3. O lipídeo estruturado pode compreender qualquer óleo vegetal, por exemplo, um óleo de soja, um óleo de canola, alternativa de manteiga de cacau (CBA), uma manteiga de cacau sintética, uma manteiga de cacau natural, 1,3-dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (SOS), 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoil- glicerol (POS) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM).

O éster de R1 pode compreender uma porção de saturação menor do que o resíduo de acila hidrolisada, em cujo caso o lipídeo estruturado desse modo produzido é uma gordura ou óleo saturado menor do que o TAG original. O éster de R1 pode compreender um ou mais dentre um ácido gra- xo de ômega-3, ácido graxo de ômega-6, um ácido graxo monoinsaturado, um ácido graxo poli-insaturado, um grupo fosfo, um éster de fitosterol, e ori- zanol. Mais especificamente o éster de R1 pode compreender uma porção selecionada do grupo consistindo em ácido alfa-linolênico, ácido eicosapen- taenoico, ácido docosaexaenoico, ácido gama-linolênico, ácido di-homo- gama-linolênico, ácido araquidônico, ácido oleico, ácido palmoleico, colina, serina, beta-sitosterol, cumestrol, dietilestilbestrol, e orizanol.

Em um aspecto deste segundo método, etapa (d) também compreende o uso de resinas de permuta de íon. As condições cineticamente controladas podem compreender condições de não equilíbrio que resultam na produção de um produto final tendo mais do que uma relação de 2:1 de 1,3-DAG para 2,3-DAG. A composição de etapa (b) pode compreender um ácido graxo fluorogênico (FA). A composição de etapa (b) pode compreender um éster de FA de umbeliferila. O produto final pode ser enantiomerica- mente puro.

Em uma modalidade, um método para a preparação de uma gordura ou óleo saturado inferior compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo (a hidrolase, por exemplo, uma lipase, satura- se, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) fornecimento de um óleo ou gordura, e (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com o óleo ou gordura de etapa (b) sob condições em que uma hidrolase pode modificar o óleo ou gordura, por exemplo, remover pelo menos um ácido graxo saturado, por exemplo, palmítico, esteárico, láurico, ácido caprílico (ácido octanoi- co) e similares. A modificação pode compreender uma hidrólise catalisada por hidrolase da gordura ou óleo. A hidrólise pode ser uma hidrólise completa ou parcial da gordura ou óleo. O óleo hidrolisado pode compreender um éster de glicerol de um ácido graxo poli-insaturado que pode substituir o ácido graxo saturado removido, ou um óleo de peixe, animal, ou vegetal. O óleo vegetal pode compreender um óleo de oliva, canola, girassol, palma, soja ou láurico ou óleo de farelo de arroz ou uma combinação dos mesmos.

Em uma modalidade, um método para a preparação de uma gordura ou óleo saturado inferior, que pode incluir ácidos graxos essenciais, compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de um polipeptídeo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) fornecimento de uma composição compreendendo um triacilglicerí- deo (TAG); (c) contato do polipeptídeo de etapa (a) com a composição de etapa (b) sob condições em que o polipeptídeo hidrolisa um resíduo acila na posição Sn1 ou Sn3 do triacilglicerídeo (TAG), desse modo produzindo um 1,2-DAG ou 2,3-DAG; e (d) promoção da migração de acila no 1,2-DAG ou 2,3-DAG da etapa (c) sob condições cineticamente controladas, desse modo produzindo um 1,3-DAG.

O método pode também compreender fornecimento de um éster de R1 e uma lipase específica de R1, e contato do 1,3-DAG de etapa (d) com o éster de R1 e a lipase específica de R1 sob condições em que a lipase específica de R1 catalisa a esterificação da posição de Sn2, desse modo produzindo um lipídeo estruturado. O éster de R1 pode compreender uma porção de saturação menor do que o resíduo de acila hidrolisada, em cujo caso o lipídeo estruturado desse modo produzido é uma gordura ou óleo saturado menor do que o TAG original. O éster de R1 pode compreender um ácido graxo de ômega-3 (alfa-linolênico, eicosapentaenoico (EPA), docosaexaenoico (DHA)), ácido graxo de ômega-6, (gamma-linolênico, di- homo-gama-linolênico (DGLA), ou araquidônico), um ácido graxo monoinsa- turado (oleico, palmoleico, e similares), grupos fosfo (colina e serina), ésteres de fitoesterol (beta-sitosterol, cumestrol, e dietilestilbestrol), e orizanol. A hidrolase, por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase como fornecidas aqui podem ser uma enzima específica de Sn1 ou Sn3. A gordura ou óleo saturado inferior pode ser preparada pela hidrólise acima descrita de qualquer óleo de alga, óleo vegetal, ou uma gordura ou óleo animal, por exemplo, óleo de Neochloris oleoabundans, óleo de Scenedes- mus dimorphus, óleo de Euglena gracilis, óleo de Phaeodactylum tricornmu- tum, óleo de Pleurochrysis carterae, óleo de Prymnesium parvum, óleo de Tetraselmis chui, óleo de Tetraselmis suecica, óleo de Isochrysis galbana, óleo de Nannochloropsis salina, óleo de Botryococcus braunii, óleo de Duna- liella tertiolecta, óleo de espécies de Nannochloris, óleo de espécies de Spi- rulina, óleo de Chlorophycease (algas verdes), e óleo de Bacilliarophy, óleo de canola, óleo de rícino, óleo de coco, óleo de coentro, óleo de milho, óleo de semente de algodão, óleo de avelã, óleo de cânhamo, óleo de linhaça, óleo de espuma de prado, óleo de oliva, óleo de palma, óleo de semente de palma, óleo de amendoim, óleo de colza, óleo de farelo de arroz, óleo de açafroa, óleo de sasanqua, óleo de soja, óleo de semente de girassol, resina líquida óleo de tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou "reprodução" tradicional tal como óleos oleicos elevados, lino- lênico inferior, ou saturado inferior (óleo de canola oleico elevado, óleo de soja linolênico inferior ou óleos de girassol esteáricos elevados); gorduras animais (sebo, banha de porco, gordura de manteiga, e gordura de frango), óleos de peixe (óleo de peixe vela, óleo de fígado de bacalhau, óleo rudimentar de laranja, óleo de sardinha, óleo de arenque, e óleo de menhaden), ou misturas de quaisquer dos acima. A gordura ou óleo saturado inferior desse modo preparado pode ser usado em alimentos ou em produtos de cozimento em forno, fritura ou cozimento compreendendo óleos ou gorduras com um teor de ácido graxo inferior, incluindo óleos fracos em ácido palmíti- co, ácido oleico, ácido láurico, ácido esteárico, ácido caprílico (ácido octa- noico) etc., processados usando uma composição ou método como fornecido aqui.

Em uma modalidade, um método para refinar um lubrificante compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma composição compreendendo uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase) como fornecida aqui; (b) fornecimento de um lubrificante; e (c) tratamento do lubrificante com uma hidrolase sob condições em que uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estea- ratase) como fornecida aqui pode hidrolisar seletivamente óleos no lubrificante, desse modo refinando-o. O lubrificante pode ser um óleo hidráulico.

Em uma modalidade, um método de tratamento de um tecido compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma composição compreendendo uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase) como fornecida aqui, em que uma hidrolase pode seletivamente hidrolisar ésteres carboxílicos; (b) fornecimento de um tecido; e (c) tratamento do tecido com uma hidrolase sob condição em que uma hidro- lase pode seletivamente hidrolisar ésteres carboxílicos, desse modo tratando o tecido. O tratamento do tecido pode compreender melhora do manuseio e encortinamento do tecido, tingimento, obtendo retardo da chama, obtendo repelência à água, obtendo brilho ótico, ou obtendo acabamento da resina. O tecido pode compreender algodão, viscose, raiom, lyocell, linho (flax), linho (linen), rami, todas as misturas dos mesmos, ou misturas dos mesmos com poliésteres, lã, poliamidas, acrílicos ou poliacrílicos. Em uma modalidade, um tecido, fio ou fibra compreendendo uma hidrolase como fornecida aqui pode ser adsorvido, absorvido ou imobilizado sobre a superfície do tecido, fio ou fibra.

Em uma modalidade, um método para remover ou reduzir a quantidade de um corante de alimento ou óleo compreende contatar uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui com o corante de alimento ou óleo sob condições em que uma hidrolase pode hidrolisar óleo ou gordura no corante. uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui pode ter uma estabilidade realçada para desnaturação por ten- soativos e para desativação por aquecimento. uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui pode ter um detergente ou uma solução de lavanderia.

Em uma modalidade, uma composição dietética compreende uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) como fornecida aqui. A composição dietética pode também compreender uma base nutricional compreendendo uma gordura. Uma hidrolase pode ser ativada por um sal de bile. A composição dietética pode também compreender uma fórmula infantil com base em leite de vaca. Uma hidrolase pode hidrolisar ácidos graxos de cadeia longa.

Em uma modalidade, um método de redução do teor de gordura em leite ou composições dietéticas com base em vegetal compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma composição compreendendo uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) como fornecida aqui; (b) fornecimento de uma composição compreendendo um leite ou um óleo vegetal, e (c) tratamento da composição de etapa (b) com uma hidrolase sob condições em que uma hidrolase pode hidrolisar o óleo ou gordura na composição. Em uma modalidade, uma dietética para um humano ou para animais não-ruminantes, compreende uma base nutricional, em que a base compreende a gordura e nenhuma ou pouca hidrolase, e uma quantidade eficaz de uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, satura- se, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui para aumentar a absorção de gordura e crescimento de humano ou animal não-ruminante.

Em uma modalidade, um método de catalisar uma reação de in- teresterificação para produzir novos triacilglicerídeos compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma composição compreendendo um poli- peptídeo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui, em que o polipeptídeo pode catalisar uma reação de interesterificação; (b) fornecimento de uma mistura de triacilglicerídeos e ácidos graxos livres; (c) tratamento da mistura de etapa (b) com o polipeptí- deo sob condições em que o polipeptídeo pode catalisar a permuta de ácidos graxos livres com os grupos acila de triacilglicerídeos, desse modo produzindo novos triacilglicerídeos enriquecidos nos ácidos graxos adicionados. O polipeptídeo pode ser uma lipase específica de Sn1,3.

Em uma modalidade, um método de interesterificação para preparar um óleo tendo um teor de ácido trans inferior e ácido graxo de cadeia intermediária inferior, compreende as seguintes etapas: (a) fornecimento de uma mistura de reação de interesterificação compreendendo um material fonte de ácido esteárico selecionado do grupo consistindo em ácido esteárico, monoésteres de ácido esteárico de alcoóis mono-hídricos de peso molecular baixo e misturas dos mesmos, (b) fornecimento de um óleo vegetal líquido; (c) fornecimento de um polipeptídeo (por exemplo, uma lipase, satu- rase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui, em que o polipeptí- deo compreende uma atividade de lipase 1,3-específica; (d) interesterifica- ção do material fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal triacilglicerídeo, (e) separação dos componentes de ácido graxo livre interesterificado de componentes de glicerídeo da mistura de interesterificação para fornecer um produto de óleo de margarina interesterificado e uma mistura de ácido graxo compreendendo ácidos graxos, monoésteres de ácido graxo ou misturas dos mesmos liberados do óleo vegetal, e (f) hidrogenação da mistura de ácido graxo. Em uma modalidade do método de interesterificação, a reação de interesterificação continua até existir equilíbrio substancial dos grupos de éster nas posições 1, 3 do componente de glicerídeo com componentes de ácido graxo de não-glicerídeo da mistura reacional.

Em uma modalidade, um método para preparar uma composição compreende 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) e 1,3-distearoil-2- monoleína (StOSt) compreendendo fornecimento de um polipeptídeo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui, em que o polipeptídeo é capaz de interesterificação catalisada por lipase 1,3-específica de 1,3-dipalmitoil-2-monoleína (POP) com ácido esteárico ou triestearina, e contato do referido polipeptídeo com uma composição compreendendo o referido POP na presença de uma fonte de estearina tal como ácido esteárico ou triestearina para preparar um produto enriquecido na 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) ou 1,3-distearoil-2-monoleína (StOSt).

Em uma modalidade, um método para melhorar ou prevenir toxicidade mediada por lipopolissacarídeo (LPS) compreende administrar a um paciente uma composição farmacêutica compreendendo uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui. Em uma modalidade, um método para destoxificar uma endotoxina compreende contato da endotoxina com uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui. Em uma modalidade, um método para desacilar uma cadeia de 2' ou 3' ácido graxo de um lipídeo A compreende contato do lipídeo A com um polipeptídeo como fornecido aqui.

Em uma modalidade, métodos para alterar a especificidade de substrato ou preferência de substrato de uma enzima lipase de origem (hi- drolase de ácido graxo) tendo uma sequência de aminoácido correspondendo à sequência de aminoácido in SEQ ID NO:2 compreendem a etapa de gerar (inserir) pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais mutações de resíduo de aminoácido na SEQ ID NO:2 como mostrado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, desse modo gerando uma nova enzima de hidrolase tendo uma sequência de aminoácido modificada e uma especificidade de substrato alterada ou preferência de substrato quando comparada à enzima lipase de origem (hidrolase de ácido graxo) SEQ ID NO:2. Em um aspecto, a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima lipase (hidrolase de ácido graxo) compreende hidrólise preferencial ou aumentada de ácido palmítico de um óleo, ou, a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima de lipase (hidrolase de ácido graxo) compreende hidrólise preferencial ou aumentada de ácido esteárico de um óleo.

Em um aspecto, a sequência de aminoácido modificado (quando comparado à SEQ ID NO:2 "origem") compreende pelo menos uma modificação de aminoácido A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; ou A225S, ou o equivalente dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos, e/ou pelo menos uma modificação de códon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG), ou o equivalente dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos, e a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima lipase (hidrolase de ácido graxo) compreende hidrólise preferencial ou aumentada de ácido palmítico de um óleo. Em um aspecto, a sequência de aminoácido modificado (quando comparado à SEQ ID NO:2 "origem") compreende I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, ou uma combinação dos mesmos, e a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima lipase (hidrolase de ácido graxo) compreende hidrólise preferencial ou aumentada de ácido esteárico de um óleo.

Em uma modalidade, métodos para preparar uma enzima tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendem hidrólise preferencial ou aumentada de ácido palmítico de um óleo, compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de uma enzima hidrolase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial de ácido palmítico de um óleo, em que a enzima hidro- lase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) tem uma sequência como fornecido aqui; e (b) preparação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais modificações de resíduo de aminoácido para a enzima hidrolase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase), em que as modificações de resíduo de aminoácido correspondem a uma sequência de mutações de aminoácido para a SEQ ID NO:2 como mostrado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, desse modo gerando uma enzima tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial ou aumentada de ácido palmítico de um óleo.

Em uma modalidade, métodos para preparar uma enzima tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendem hidrólise preferencial ou aumentada de ácido esteárico de um óleo, compre- endendo as etapas de: (a) fornecimento de uma enzima hidrolase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial de ácido esteárico de um óleo, em que a enzima hidro- lase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) tem uma sequência como fornecido aqui; e (b) preparação de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais modificações de resíduo de aminoácido para a enzima hidrolase de origem (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase), em que as modificações de resíduo de aminoácido correspondem a uma sequência de mutações de aminoácido para a SEQ ID NO:2 como mostrado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, desse modo gerando uma enzima tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial ou aumentada de ácido esteárico de um óleo.

Em uma modalidade, métodos para preparar uma enzima hidro- lase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou es- tearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendem hidrólise preferencial de um ácido graxo particular, compreendendo as etapas de (a) fornecimento de uma sequência de enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) geração (inserção) de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais mutações de resíduo de base no ácido nucleico, em que as mutações correspondem àquelas mudanças de sequência como mencionado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23; e, (c) teste da atividade da enzima recentemente gerada para uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial de um ácido graxo particular, desse modo preparando a nova enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial de um ácido graxo particular . Em um aspecto, a enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) compreende uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:2. Em um aspecto, o ácido graxo é ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico ou ácido esteárico.

Em uma modalidade, métodos para preparar uma enzima hidro- lase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou es- tearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendem hidrólise preferencial de um ácido graxo particular, e compreendem as etapas de (a) fornecimento de uma sequência de ácido nuclei- co codificando a enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui; (b) geração (inserção) de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou mais mutações de resíduo de base no ácido nucleico, em que as mutações correspondem àquelas mudanças de sequência como mencionado na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23; e, (c) expressão do ácido nucleico gerado para preparar a nova enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase), desse modo preparando uma enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, lipase, satu- rase, palmitase e/ou estearatase) tendo uma especificidade de substrato ou preferência de substrato compreendendo hidrólise preferencial de um ácido graxo particular .

Em um aspecto, a sequência codificando a enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) compreende uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:1. Em um aspecto, o ácido graxo é ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico ou ácido esteárico. Em um aspecto, a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima hidrolase de ácido graxo (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) é ácido palmítico quando comparada a uma especificidade de substrato ou preferência de substrato de ácido esteárico para uma enzima hidrolase de ácido graxo de origem (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase), ou a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova enzima hidro- lase de ácido graxo (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase) é ácido esteárico quando comparada a uma especificidade de substrato ou preferência de substrato de ácido palmítico para uma enzima hidrolase de ácido graxo de origem (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou es- tearatase) .

Em uma modalidade, lipases compreendem uma sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO:2, porém também compreendendo pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L; ou A225S, ou o equivalente dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos, e/ou pelo menos uma modificação de códon (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG), ou o equivalente dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, lipases compreendem uma sequência de aminoácido como mencionado na SEQ ID NO:2, porém também compreendendo pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q, ou uma combinação dos mesmos.

Em um aspecto, a especificidade de substrato ou preferência de substrato da nova lipase compreende hidrólise preferencial ou aumentada de um ácido graxo de um óleo quando comparado à SEQ ID NO:2 "origem". Em um aspecto, o ácido graxo é ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico ou ácido esteárico.

Os detalhes de uma ou mais modalidades como são fornecidos aqui mencionados nos desenhos de acompanhamento e na descrição abaixo. Outros aspectos, objetos, e vantagens como fornecidos aqui ficarão evidentes a partir da descrição e desenhos, e das reivindicações. Todas as publicações, patentes, pedidos de patente, sequências

GenBank e depósitos ATCC, citadas aqui são pelo presente expressamente incorporados por referência para todos os propósitos.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os seguintes desenhos são ilustrativos das modalidades da invenção e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações.

A patente ou arquivo de pedido contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou publicação do pedido de patente com desenho(s) coloridos serão fornecidas pelo Escritório em solicitação e pagamento do necessário valor.

A figura 1 é um diagrama de bloco de um sistema de computador.

A figura 2 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo para comparar uma nova sequência de nucleotídeo ou proteína com uma base de dados de sequências a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova sequência e a sequência na base de dados.

A figura 3 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo em um computador para determinar se duas sequências são homólogas.

A figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo identificador para detectar a presença de um aspecto em uma sequência, como descrito em detalhe, abaixo.

A figura 5 ilustra um método exemplar como fornecido aqui com-preendendo o uso de lipases como fornecido aqui para processar um lipídeo, por exemplo, um lipídeo de um óleo de soja, para seletivamente hidrolisar um ácido palmítico para produzir um "óleo de soja palmítico reduzido".

A figura 6a ilustra os efeitos de mutações de GSSMSM de palmi- tase exemplar sobre a hidrólise de palmitato e estearato relativas à SEQ ID NO:2 origem, como descrito em detalhes no exemplo 4, abaixo. A figura 6b ilustra os efeitos de mutações de GSSM SM de estearatase exemplar sobre a hidrólise de palmitato e estearato relativa à SEQ ID NO:2 origem como descrito em detalhes no exemplo 4, abaixo.

A figura 7 mostra a SEQ ID NO:2, com as posições de mutação de palmitato e estearato particulares listadas em tipo negrito de uma fonte maior. As mutações sublinhadas (por exemplo 61A, E) são posições alterna- tivass de resíduo de aminoácido (sequências alternativas para modalidades alternativas) para melhorar a hidrólise de palmitato. As mutações em itálicos (por exemplo, 20L) são posições alternativas de resíduo de aminoácido (se-quências alternativas para modalidades alternativas) para melhorar a hidrólise de estearato. A posição 116 é uma posição alternativa de mutação de resíduo de aminoácido (uma sequência alternativa para uma modalidade alternativa) para melhorar a hidrólise de ambos palmitato e estearato.

A figura 8 mostra os dados de ensaio de óleo de soja confirmató- rios para clones selecionados da biblioteca de palmitase. Símbolos de referência semelhantes nos vários desenhos indicam elementos semelhantes.

DESCRIÇÃO DETALHADA

As modalidades alternativas compreendem polipeptídeos, incluindo lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, polinucleotídeos codificando-os, e métodos de preparação e uso destes polinucleotídeos e poli- peptídeos. Modalidades alternativas compreendem polipeptídeos, por exemplo, enzimas, tendo a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, incluindo termoestável e termo- tolerante atividade de hidrolase, e polinucleotídeos codificando estas enzimas, e preparação e uso destes polinucleotídeos e polipeptídeos. As atividades de hidrolase dos polipeptídeos e peptídeos como fornecidos aqui incluem atividade de lipase (hidrólise de lipídeos), reações de interesterifica- ção, síntese de éster, reações de alternação de éster, atividade de lipídeo acil hidrolase (LAH)) e atividade enzimática relacionada. Para os propósitos deste pedido de patente, as reações de interesterificação podem incluir reações de acidólise (envolvendo a reação de um ácido graxo e um triacilglice- rídeo), alcoólise (envolvendo a reação de um álcool e um triacilglicerídeo), glicerólise (envolvendo a reação de um glicerol e um triacilglicerídeo) e reações de transesterificação (envolvendo a reação de um éster e um triacilgli- cerídeo). Os polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser usados em uma variedade de contextos farmacêuticos, agrícolas e industriais, incluindo a fabricação de cosméticos e nutracêuticos. Em outro aspecto, os polipeptí- deos como fornecidos aqui são usados para sintetizar produtos quirais enan- tiomericamente puros.

Em certas modalidades, enzimas como fornecidas aqui podem ser catalisadores altamente seletivos. Elas podem ter a capacidade de catalisar reações com estereo-, regio-, e quimiosseletividades não possíveis em química sintética convencional. Em uma modalidade, enzimas como fornecidas aqui podem ser versáteis. Em vários aspectos, eles podem funcionar em solventes orgânicos, operar em pHs extremos (por exemplo, pHs elevados e pHs baixos), temperaturas extremas (por exemplo, temperaturas elevadas e temperaturas baixas), níveis de salinidade extremos (por exemplo, alta salinidade e baixa salinidade), e catalisar reações com compostos que são estruturalmente não relacionados com seus substratos fisiológicos naturais.

Em um aspecto, os polipeptídeos como fornecidos aqui compreendem hidrolases tendo atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estea- ratase e podem ser usados, por exemplo, na síntese biocatalítica de lipídeos estruturados (lipídeos que contêm um grupo definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida no esqueleto de glicerol), incluindo qualquer óleo vegetal, por exemplo, canola, soja, alternativas de óleos de soja, alternativas de manteiga de cacau, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), 2- monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs), tal como 1,3- dipalmitoil-2-oleoilglicerol (POP), 1,3-distearoil-2-oleoilglicerol (StOSt), 1- palmitoil-2-oleoil-3-estearoilglicerol (POSt) ou 1-oleoil-2,3-dimiristoilglicerol (OMM), ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), ácidos graxos poli- insaturados de cadeia longa, tal como ácido araquidônico, ácido docosaexa- enoico (DHA) e ácido eicosapentaenoico (EPA).

Em certa modalidade, as enzimas e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para remover, adicionar ou permutar qualquer ácido graxo de uma composição, por exemplo, preparar um óleo com um menor teor de ácido graxo saturado (por exemplo, um óleo "pouco saturado") ou um diferente teor de ácido graxo (por exemplo, convertendo um óleo compreen- dendo ácidos graxos "saturados" em um óleo compreendendo ácidos graxos "insaturados" alternativos).

Exemplos de ácidos graxos saturados que podem ser removidos, adicionados ou "redispostos" sobre um lipídeo, por exemplo, um óleo, usando uma enzima ou praticando um método como fornecido aqui incluem: Acético: CH3COOH Butírico: CH3(CH2)2COOH Caproico: CHeíCHakCOOH Caprílico: CH3(CH2)6COOH Cáprico: CH3(CH2)8COOH Undacanoico: CH3(CH2)9COOH Láurico: (ácido dodecanoico): CH3(CH2)IOCOOH Mirístico: (ácido tetradecanoico): CH3(CH2)I2COOH Pentadecanoico: CH3(CH2)nCOOH Palmítico: (ácido hexadecanoico): CH3(CH2)I4COOH Margárico: CH3(CH2)I5COOH Esteárico (ácido octadecanoico): CH3(CH2)I6COOH Araquídico (ácido eicosanoico): CH3(CH2)wCOOH Beênico: CH3(CH2)2OCOOH

Exemplos de ácidos graxos insaturados de ômega-3 que podem ser removidos, adicionados ou "redispostos" sobre um lipídeo, por exemplo, um óleo, usando uma enzima ou praticando um método como fornecidos aqui incluem: a-linolênico (ALA): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH estearaiadônico (octadecatetraenoico): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH =CH(CH2)4COOH eicosapentaenoico (EPA): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH( CH2)3COOH docosaexaenoico (DHA) CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH CH2CH=CH(CH2)2COOH

Exemplos de ácidos graxos insaturados de ômega-6 que podem ser removidos, adicionados ou "redispostos" sobre um lipídeo, por exemplo, um óleo, usando uma enzima ou por praticar um método como fornecido aqui incluem: Linoleico (ácido 9,12-octadecadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH Gama-linolênico (ácido 6,9,12-octadecatrienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4COOH Eicosadienoico (ácido 11,14-eicosadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)9COOH Di-homo-gama-linolênico (ácido 8,11,14-eicosatrienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)6COOH Araquidônico (ácido 5,8,11,14-eicosatetraenoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3CO OH Docosadienoico ( ácido 13,16-docosadienoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)11COOH Adrênico (ácido 7,10,13,16-docosatetraenoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)5CO OH Docosapentaenoico (ácido 4,7,10,13,16-docosapentaenoico): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=C H(CH2)2COOH

Exemplos de ácidos graxos ômega-9 que também podem ser removidos, adicionados ou "redispostos" sobre um lipídeo, por exemplo, um óleo, usando uma enzima ou praticando um método como fornecido aqui, incluem: Oleico (ácido 9-octadecenoico): CH3(CH2)?CH=CH(CH2)?COOH Eicosenoico (ácido 11 -eicosenoico) CH3(CH2)7CH=CH(CH2)9COOH Mead (ácido 5,8,11-eicosatrienoico): CH3(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH Êurico (ácido 13-docosenoico): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)IICOOH Nervônico (ácido 15-tetracosenoico): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)13COOH. Palmitoleico: CH3(CH2)7CH=CH(CH2)ÕCOOH

Em um aspecto, são fornecidas aqui novas classes de lipases denominadas "saturases", por exemplo, "palmitases" e "estearatases". O termo "saturase" como previamente usado na literatura descreveu uma enzima que realiza a saturação de ligações específicas em uma trilha metabólica, por exemplo, hidrogenação de uma ligação dupla (Moise, e outro, J Biol Chem, 2005, 280(30):27815-27825). Entretanto, são fornecidas aqui novas e anteriormente não descritas "saturases", em que as saturases descritas aqui hidrolisam ésteres de ácido graxo, em que os ésteres hidrolisados podem ser ésteres de ácidos graxos saturados e glicerol, umbeliferol ou outros al- coóis.

São também fornecidas aqui "palmitases" e "estearatases", ante-riormente não descritas, em que as palmitases e estearatases hidrolisam ácido palmítico e ácido esteárico, respectivamente, por exemplo, do esqueleto de glicerol. As "saturases" descritas aqui podem também ser denominadas "hidrolases saturadas". Similarmente, as "palmitases" descritas aqui podem também ser denominadas "palmitato hidrolases" e as "estearatases" descritas aqui podem também ser denominadas "estearato hidrolases".

Em outro aspecto, as saturases descritas aqui seletivamente hi- drolisam pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos ácidos graxos saturados. Em outro aspecto, as palmitases descritas aqui seletivamente hidrolisam ácidos gra- xos tal que pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos ácidos graxos hidrolisados sejam ácido palmítico. Em outro aspecto, as estearatases descritas aqui seletivamente hidrolisam ácidos graxos tal que pelo menos 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos áci dos graxos hidrolisados sejam ácido esteárico.

Em um aspecto, como ilustrado na figura 5, métodos de uso de uma enzima como fornecidos aqui podem processar um lipídeo, por exemplo, um lipídeo de uma soja ou outro óleo vegetal, para seletivamente hidro- lisar um ácido graxo saturado, por exemplo, um ácido palmítico ou esteárico, (por exemplo, de um óleo contendo estes ácidos graxos saturados) para produzir um "óleo pouco (ou menos) saturado", por exemplo, um "óleo palmí- tico reduzido", tal como um "óleo vegetal palmítico reduzido", por exemplo, um "óleo de soja palmítico reduzido". Enzimas como fornecidas aqui podem também ser usadas para seletivamente hidrolisar qualquer ácido graxo, particularmente ácidos graxos saturados, de um esqueleto de glicerol para produzir um "óleo saturado baixo (ou menor)", incluindo seletivamente hidrolisar um ácido graxo saturado, por exemplo, um ácido palmítico ou um ácido esteárico, de uma posição Sn1 ou Sn2 de um esqueleto de glicerol, além da hidrólise de uma posição Sn3 (por exemplo, hidrólise de ácido palmítico da posição Sn3 ilustrada na figura 5).

Em um aspecto, uma síntese exemplar de triglicerídeos pouco saturados, óleos ou gorduras é fornecida. Esta síntese exemplar pode usar ácidos graxos livres ou ésteres de ácido graxo, dependendo da enzima usada. Em um aspecto, as hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmita- ses e/ou estearatases, como são fornecidas aqui usadas para remover ou hidrolisar ácidos graxos saturados, tal como ácido acético, ácido butírico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido undecanoico, ácido láu- rico, ácido miristico, ácido pentadecanoico, ácido palmítico, ácido margárico, ácido esteárico, ácido aquídico, ou ácido beênico de um triglicerídeo, óleo ou gordura. Em um aspecto, os ácidos graxos removidos ou hidrolisados são substituídos por ácidos graxos com benefícios à saúde melhorados (tais como correlação reduzida com doença cardiovascular), ou propriedades químicas melhoradas (tal como estabilidade oxidativa ou reatividade) ou propriedades físicas melhoradas (tal como ponto de fusão, ou sensação na boca). Em um aspecto os ácidos graxos adicionados são ácidos graxos insaturados ômega-3, tal como ácido a-linolênico, ácido estearidônico, ácido eicosapen- taenoico (EPA), ou ácido docosaexaenoico (DHA), ou PUFAs ou ácidos gra- xos de óleo de peixe. Em um aspecto os ácidos graxos adicionados são ácidos graxos insaturados ômega-6, tal como ácido linoleico, ácido gama- linoleico, ácido eicosadienoico, ácido di-homo-gama-linoleico, ácido araqui- dônico, ácido docosadienoico, ácido adrênico, ou ácido docosapentaenoico. Em um aspecto os ácidos graxos adicionados são ácidos graxos insaturados ômega-9, tal como ácido oleico, ácido eicosaenoico, ácido mead, ácido erú- cico, ácido nervônico, ou ácido palmitoleico. Em um aspecto os ácidos gra- xos adicionados (por exemplo ômega-3, ômega-6, ou ômega-9) são adicionados por reação de ácidos graxos com os triglicerídeos, óleo ou gordura após a remoção ou hidrólise de ácidos graxos saturados pelas hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, como fornecido aqui. Em um aspecto os ácidos graxos adicionados (por exemplo, ôme- ga-3, ômega-6, ou ômega-9) são adicionados por reação de ésteres de ácido graxo, incluindo ésteres de glicerol, ou etil ou metil ésteres, com os trigli- cerídeos, óleo ou gordura após a remoção ou hidrólise de ácidos graxos saturados pelas hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, como fornecido aqui. Em um aspecto a reação para adicionar ácidos graxos (por exemplo ômega-3, ômega-6, ou ômega-9) é catalisada por uma hidrolase ou lipase, tal como uma lipase não específica (incluindo ácido graxo não-regioespecífico e não específico), ou uma lipase específica de Sn1,3, ou uma lipase específica de Sn1, ou uma lipase específica de Sn3, ou uma lipase específica de Sn2, ou uma lipase específica de ácido graxo.

Os métodos e composições (hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados na produção de nutracêuticos (por exemplo, ácidos graxos e óleos poli-insaturados), vários alimentos e aditivos alimentícios (por exemplo, emulsificantes, substitutos de gordura, margarinas e pastas), cosméticos (por exemplo, emulsificantes, cremes), produtos farmacêuticos e agentes liberadores de fármaco (por exemplo, lipossomas, comprimidos, formulações), e aditivos para alimentação animal (por exemplo, ácidos graxos poli- insaturados, tal como ácidos linoleicos).

Em um aspecto, lipases como fornecidas aqui podem agir sobre ésteres de ácido graxo fluorogênicos (FA), por exemplo, ésteres de FA de umbeliferila. Em um aspecto, perfis de especificidades de FA de lipases pre-paradas ou modificadas pelos métodos como fornecidos aqui podem ser obtidos medindo-se suas atividades relativas sobre uma série de ésteres de FA de umbeliferila, tal como ésteres de palmitato, estearato, oleato, laurato, PUFA, ou butirato.

Em um aspecto, um polipeptídeo (por exemplo, anticorpo ou enzima -, por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecido aqui para estas reações é imobilizado, por exemplo, como descrito abaixo. Em aspectos alternativos, os métodos como fornecidos aqui não requerem um solvente orgânico, podem agir com taxas de reação relativamente rápidas. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.552.317; 5.834.259.

Em certas modalidades, os métodos e composições (lipases, sa- turases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados para hidrolisar (incluindo hidrolisar seletivamente) óleos, tal como óleos de peixe, animal e óleos vegetais, e lipídeos, tal como ácidos graxos poli-insaturados. Em um aspecto, os polipeptídeos como são fornecidos aqui usados para preparar óleos pouco saturados, por exemplo, removendo (hi- drolisando) pelo menos um ácido graxo de um óleo; e a hidrólise pode ser uma hidrólise seletiva, por exemplo, apenas removendo um ácido graxo particular, tal como um ácido graxo palmítico, esteárico, ou outros saturados, ou exatamente removendo um ácido graxo de uma posição, por exemplo, Sn1, Sn2 ou Sn3. Em um aspecto, os polipeptídeos como fornecidos aqui são usados para processar ácidos graxos (tais como ácidos graxos poli- insaturados), por exemplo, ácidos graxos de óleo de peixe, por exemplo, para uso em ou como um alimento ou aditivo alimentício, ou um óleo para cozimento, fritura, cozimento em forno ou comestível. Em outra modalidade, os métodos e composições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearata- ses) como fornecidos aqui podem ser usados para seletivamente hidrolisar ésteres saturados sobre ésteres insaturados em ácidos ou alcoóis. Em outra modalidade, os métodos e composições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados para tratar látex para uma variedade de propósitos, por exemplo, para tratar látices usados em composições fixadoras de cabelo para remover odores desagradáveis. Em outra modalidade, os métodos e composições (lipases, saturases, palmita- ses e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados no tratamento de uma deficiência de lipase em um animal, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano. Em outra modalidade, os métodos e composições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados para preparar lubrificantes, tal como óleos hidráulicos. Em outra modalidade, os métodos e composições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados na preparação e uso de detergentes. Em outra modalidade, os métodos e com-posições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados em processos para para um acabamento químico de tecidos, fibras ou fios. Em um aspecto, os métodos e composições (lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui podem ser usados para obter retardo da chama em um tecido usando, por exemplo, um ácido carboxílico substituído por halogênio ou um éster do mesmo, isto é, um ácido carboxílico fluorado, clorado ou bromado ou um éster dos mesmos. Em um aspecto, são fornecidos métodos de geração de lipases de bibliotecas ambientais.

Em uma modalidade, as "hidrolases" como fornecidas aqui abrangem polipeptídeos (por exemplo, anticorpos, enzimas) e peptídeos (por exemplo, "sítios ativos") tendo qualquer atividade de hidrolase, isto é, os po- lipeptídeos como fornecidos aqui podem ter qualquer atividade de hidrolase, incluindo, por exemplo, a atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estea- ratase. Em outra modalidade, as "hidrolases" como fornecidas aqui incluem todos os polipeptídeos tendo qualquer atividade de lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase, incluindo atividade de síntese de lipídeo ou hidrólise de lipídeo, isto é, os polipeptídeos como fornecidos aqui podem ter qualquer atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. Em outra modalidade, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases como fornecidas aqui incluem enzimas ativas na bioconversão de lipídeos por meio de reações de catálise hidrólise, alcoólise, acidólise, esterificação e aminólise. Em um aspecto, hidrolases (por exemplo lipases, saturases, palmitases e/ou esteara- tases) como fornecidas aqui podem hidrolisar emulsões de lipídeo. Em um aspecto, enzimas como fornecidas aqui podem agir preferencialmente sobre ligações em Sn-1, Sn-2 e/ou Sn-3 de triacilglicerídeos para liberar um ou mais ácidos graxos do esqueleto de glicerol, por exemplo, hidrolase, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase da polipeptídeos como fornecidos aqui incluem síntese de manteiga de cacau, ácidos graxos poli- insaturados (PUFAs), 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). Em outra modalidade, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase de polipeptídeos como fornecidos aqui também compreende a produção de óleos pouco saturados, por exemplo, óleo de soja ou canola, removendo um ácido graxo, por exemplo, um ácido palmítico, oleico, láurico ou ácido esteárico. Em aspectos alternativos, enzimas como fornecidas aqui também podem hidrolisar e/ou isomeri- zar ligações em temperaturas elevadas, baixas temperaturas, pHs alcalinos e em pHs acídicos. Em um aspecto a hidrolase, por exemplo, lipase como fornecida aqui é uma saturase que catalisa reações de hidrólise, alcoólise, acidólise, esterificação e aminólise onde o ácido carboxílico ou graxo na molécula formada ou reagida é um ácido graxo saturado, tal como ácido acético, ácido butírico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico ou ácido araquídico. Em um aspecto a hidrolase, por exemplo, lipase ou saturase como fornecida aqui é uma palmitase que catalisa reações de hidrólise, alcoólise, acidólise, esterificação e aminólise onde o ácido carboxí- lico ou graxo na molécula formada ou reagida é um ácido palmítico. Em um aspecto a hidrolase, por exemplo, lipase ou saturase como fornecida aqui é uma estearatase que catalisa reações de hidrólise, alcoólise, acidólise, este- rificação e aminólise onde o ácido carboxílico ou graxo na molécula formada ou reagida é um ácido esteárico.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui enzimas compreendendo variantes de hidrolase (por exemplo, "variante de lipase", "variante saturase", "variante palmitase" ou "variante de estearatase") das enzimas como fornecido aqui; estas enzimas podem ter uma sequência de aminoáci- do que é derivada de uma sequência de aminoácido de um "precursor". O precursor pode incluir hidrolase de ocorrência natural e/ou uma hidrolase recombinante. A sequência de aminoácido da variante de hidrolase é "derivada" da sequência de aminoácido de hidrolase precursora pela substituição, deleção ou inserção de um ou mais aminoácidos da sequência de ami- noácido precursora. Tal modificação é da "sequência de DNA precursora" que codifica a sequência de aminoácido da precursora lipase em vez de manipulação da enzima hidrolase precursora de per si. Métodos adequados para tal manipulação da sequência de DNA precursora incluem métodos descritos aqui, bem como métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.

Geração e Manipulação de Ácidos Nucleicos

Em um aspecto, são fornecidos aqui ácidos nucleicos, incluindo cassetes de expressão tal como vetores de expressão, codificando os poli- peptídeos (por exemplo, hidrolases, tal como lipases saturases, palmitases e/ou estearatases, e anticorpos). Em outro aspecto, são fornecidos aqui ácidos nucleicos tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:1 e tendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as mudanças de resíduo de base descritas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23 (ou os equivalentes dos mesmos). Em uma modalidade, são fornecidos aqui ácidos nucleicos codificando polipeptídeos tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:2 e tendo pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as mudanças de resíduo de aminoácido descritas na 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23 (ou os equivalentes dos mesmos). SEQ ID NO:1 ATGCTGAAACCGCCTCCCTACGGACGCCTGCTGCGCGAACTGGCCGA- TATCCCGGCCATCGTGACGGCACCGTTCCGGGGCGCTGCGAAAA- TGGGCAAACTGGCGGATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTT- CCTGGCCGACGACAACGCCACCTCGGTGCTGCGCAAGACCTTCGATG- TCGCGGGCTTTGCCTGTTCGGGCTGGGAACGCGGCTTCAACCTCGG- CATTCGTGGCGACCTCGTGGACCGGCTGGTCGACCGGCTGCGGG- CGGTGTCGGAGGCGGCCGGTGGTCAGAAGGTGATCGTGGTCGGCTG- GAGCCTCGGCGGCCTCTATGCGCGCGAGCTGGGCCACAAGGCG- CCCGAACTGATCCGGATGGTCGTCACGCTCGGCAGTCCGTTCGCGGG- CGACCTCCACGCCAACCATGCGTGGAAGATCTACGAGGCGATCAACA- GCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGGTCGATTTCCAGATTAAG- CCGCCGGTGCGCACCATCGCGGTGTGGTCGCCGCTCGACGGGGTGG- TGGCGCCGGAGACCTCGGAAGGCTCGCCCGAGCAGTCGGACGAG- CGGCTAGAGCTGGCGGTGACCCACATGGGCTTTGCCGCATCGAAGAC- CGGGGCCGAGGCTGTGGTCCGGCTGGTCGCGGCGCGGCTCTAG SEQ ID NO:2 (codificado por SEQ ID NO:1): código de 1 letra: MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADD- NATSVLRKTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRA- VSEAAGGQKVIVVGWSLGGLYARELGHKAPELIRMVVTLGSPFAGDLHA- NHAWKIYEAINSHTVDNLPIPVDFQIKPPVRTIAVWSPLDGVVAPETSEGS- PEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAEAVVRLVAARL- código de 3 letras: Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu Ala Asp Ile Pro Ala Ile Val Thr Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe Leu Ala Asp Asp Asn Ala Thr Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val Ala Gly Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gly Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser Glu Ala Ala Gly Gly Gln Lys Val Ile Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu Ile Arg Met Val Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn His Ala Trp Lys Ile Tyr Glu Ala Ile Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Ile Lys Pro Pro Val Arg Thr Ile Ala Val Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ser Pro Glu Gln Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala Ala Arg Leu SEQ ID NO:3: ATGGCCGGCCACCAGGGCGCGCGGGGCCCCAAAGACGGTCCG- CCGGCGATGGTGATCCCGGGCTTCCTCGCCCACGACAGGCACACGA- CACGATTGCGCCGGGAACTCGCCGAGGCGGGGTTCAGGGTTCAC- CCCTGGCGGCAGGGCTGGAACATGGGAGCGCGTGCCGACACG- CTCGAGAAATTGAAGCGGGCAGTGGACCAGTGCGGTCATGACGAG- CCGATCCTGCTGGTCGGCTGGAGTCTGGGCGGGCTCTACGCGAGG- GAGGTCGCGCGCGCCGAGCCGGATCAGGTGCGGGCGGTGGTCAC- TCTTGGTTCCCCGGTGTCGGGCGACCGGCGCCGCTACACCAACGTG- TGGAAGCTGTACGAATGGGTGGCGGGTCACCCGGTGGACGACCCG- CCGATCCCCGACAAGGAGGAAAAGCCGCCGGTGCCGACCCTGG- CTTTGTGGTCGGCGGATGACGGGATCGTCGGCGCCCCGTCGGCGCG- CGGGACTCAGTTATCTCACGACAAGGCGGTCGAGATGCGAACGAG- CCACATGGGCTTTGCCATGTCGGCGAAGAGCGCACGCTTTGTTGTCG- CCGAGATCGTGAAGTTCCTGAAGAAAACCGAAGGTTCCGAGTCG- CACGATTGA SEQ ID NO:4 (codificado por SEQ ID NO:3): MAGHQGARGPKDGPPAMVIPGFLAHDRHTTRLRRELAEAGFRVHPWR- QGWNMGARADTLEKLKRAVDQCGHDEPILLVGWSLGGLYAREVARAEP- DQVRAVVTLGSPVSGDRRRYTNVWKLYEWVAGHPVDDPPIPDKEEKPPV- PTLALWSADDGIVGAPSARGTQLSHDKAVEMRTSHMGFAMSAKSAR- FVVAEIVKFLKKTEGSESHD SEQ ID NO:5: GTGAGCGAGAAAGGCGCACCCAAGGGAAGGCAGCGGCTGAAGGAGA- TCGGCGCGCTTCTGTTCCACGCGCCTCGCAGCTTGGGCCATCTGGG- CGCGCGCGGCCCCAAGGACGGTCCTCCGGTGATGGTCATCCCGGGA- TTCCTCGCGCACGACTTGCATACGACGCAGTTGCGCCGGGCGCTCG- CGAAGGCAGGCTTCCGAGTGCATCCGTGGCGGCAGGGGATGAAC- CTTGGAGCGCGCGCCGATACGCTCGAAATTCTGAAGCGCGCGGTGGA- TTCCTGCGGCTCGAGCGAGCCGATGCTGCTCGTCGGCTGGAG- CCTGGGCGGTCTCTATGCCCGGGAGATCGCGCGTGCGGAGCCGGAC- CGGGTGCGGGCGGTGGTGACGATGGGATCGCCGGTGTGGGGCGAC- CGCAGGCGCTACACCAACGTGTGGAAGCTGTACGAACGGATTGCCGG- CCATCCGGTCGACAAGCCGCCGATCCCGGACAAGAGCCAGAAGCCG- CCGGTGCCGACTCTGGCTTTGTGGTCGCAGCATGATGGCATCGTCGG- CGCGCCCTCGGCGAGAGGGACGAAGAAGACCCGCGACAAGGCGG- TCGCCATCGACACGACTCACATGGGGTTTGCCATGTCGCCCAAGA- CGACGCGCGCGGCAGTGCGTGAGATCGTGGGCTTTTTGAATGAAG- TCGAAGGCGGTTCGTCACCCCGGGCGTGA SEQ ID NO:6 (codificado por SEQ ID NO:5): MSEKGAPKGRQRLKEIGALLFHAPRSLGHLGARGPKDGPPVMVIPG- FLAHDLHTTQLRRALAKAGFRVHPWRQGMNLGARADTLEILKRAV- DSCGSSEPMLLVGWSLGGLYAREIARAEPDRVRAVVTM- GSPVWGDRRRYTNVWKLYERIAGHPVDKPPIPDKSQKPPVPTLAL- WSQHDGIVGAPSARGTKKTRDKAVAIDTTHMGFAMSPKTTRAAVREIVG- FLNEVEGGSSPRA SEQ ID NO:7: ATGAGGCTGCGCGAGGGGGGCGCGCTCGTATCGCGGGCCTATCGCG- CCTTCGGGCGCCTCGGCGAGCGCGGCCCGGCGGACGGGCCGCCG- CTGATGGTGATCCCGGGCTTCCTCGCCACCGATCGCACCAC- TTTGGGGCTGCAGCGGGCGCTGGCCAAGGGCGGCTACAAGGTGAC- CGGATGGGGCATGGGCCTCAACAGCGGCGTCACCGAAGACATAG- TCGACCGCATCGCCGCTCGGGTCGAAAGGTTTGGAGCCGGCCG- CAAAGTGATCCTCGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGACTCTACGCGCGCG- TGGTCGCGCAGGAGCGGCCGGATCTCGTCGACAAGGTGGTCACG- CTCGGCTCGCCCTTTTCGGGCGACAGGCGCCGCAACAACAATG- TCTGGCGGCTCTACGAGTTCGTC GCCGGCCATCCGGTCAACAGCCCGCCGATCGACAAGGACCCCGAGG- TGAAGCCGCCGGTGCCGACGCTCGCTATCTGGTCGCGGCGCGACGG- CATCGTCTCTCCGGCGGGCGCGCGCGGGCGGGAGGGAGAGCGCGA- CGCCGAGCTCGAGCTCGACTGCAGCCACATGGGCTTTGCGGTCAG- CGCCAGGGCTTATCCCAAGATCGTGGAGGCGGTGCGGGCGTTTCCG- GAAAACATCCGTTCGCGCTGA SEQ ID NO:8 (codificado por SEQ ID NO:7): MRLREGGALVSRAYRAFGRLGERGPADGPPLMVIPGFLATDRTTL- GLQRALAKGGYKVTGWGMGLNSGVTEDIVDRIAARVERFGAGRKVIL- VGWSLGGLYARVVAQERPDLVDKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWR- LYEFVAGHPVNSPPIDKDPEVKPPVPTLAIWSRRDGIVSPAGARGREGER- DAELELDCSHMGFAVSARAYPKIVEAVRAFPENIRSR SEQ ID NO:9: ATGAAGCCGCCGCCCGGATGGATGAAGATCCGGGAGGCGGGCTCG- CTCCTCGCGCGCTTCTACCGCGCGTTCGGCAAGCTCGAGCCGCG- CGGGCCGGCGGACGGGCCGAAGCTGATGGTGATCCCGGGTTT- CCTCGCGGGCGACAGGACGACGCTCGGGCTGCAGCGAGCGCTGG- CCGGCGGCGGCTACCGGGTCGCCGGCTGGGGGCTGGGGGTGAAC- CGCGGCGTTTCGGAGGACGTGGTCGACCGGATCGGCCAGCAAGTCG- CGCGGTTCGGGGCGGGCGAGAAGGTGATCCTGGTCGGCTGGAG- CCTTGGCGGGCTTTATGCGCGCGTGGTGGCGCAGGAGCGGCCCGAC- CTCGTCGAGAAGGTGGTGACCTTGGGCTCGCCGTTTTCGGGCGAC- CGGCGGCGCAACAACAATGTGTGGCGGCTCTATGAGTGGGTGG- CTGGGCATCCGGTGAACGATCCGCCGATCGACAAGGACCCGG- CGAAGAAGCCCCCGGTGCCGACGCTCGCGATCTGGTCGCGGCG- TGATGGGATCGTGGCGGTCGAAGGCGCGCGGGGGCGGCCGGAGGA- GCGGGATGCCGAGCTGGAGATCGATTGCAGCCACATGGGG- TTTGGGGTCAGCGGCAAGGCGTTTCCCCGAATCGTAGAGGCGG- TGAAGGGGTTCTAA SEQ ID NO:10 (codificado por SEQ ID NO:9): MKPPPGWMKIREAGSLLARFYRAFGKLEPRGPADGPKLMVIPGFLAG- DRTTLGLQRALAGGGYRVAGWGLGVNRGVSEDVVDRIGQQVARF- GAGEKVILVGWSLGGLYARVVAQERPDLVEKVVTLGSPFSGDRRRNNN- VWRLYEWVAGHPVNDPPIDKDPAKKPPVPTLAIWSRRDGIVAVEGARGR- PEERDAELEIDCSHMGFGVSGKAFPRIVEAVKGF SEQ ID NO:11: GTGTTGGTGCTGCCGGCGTTCCTCGCCAACGACCTTCCCACTTCG- CTTCTCCGCAGGACGCTGAAGGCGAACGGGTTTCGCCCGTTCGG- CTGGGCGAACGGTTTCAACTTAGGTGCACGGCCGGACACGCTCCAG- CGCCTGAGCGCACGGCTCGATGCGGTGGTTCAGGAAGCGGGCAGG- CCGGTTGCATTGATCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTATG- CCCGAGAGCTGGCGAAACGCAGGTCGGCTGAGGTGTCGGCAGTGAT- CACGCTCGGCACGCCCTTCTCGGTTGACCTCAGACGCAACAACG- CCTGGAAGCTGTACGAGCTCATCAACGATCATCCTGTCGATG- CCCCTCCCTTGGATGTTCAGGTCGACGCGAAGCCACCCGTCCGAAC- CTTCGCTTTGTGGTCGCGTCGCGACGGGATCGTAGCGCCCGCGAG- CGCGCACGGCATGGAGGGCGAGTTCGACCAGGCGATCGAGCTGCAG- TGCACGCACAACGAGATGGTCAGTGATCCGGAGG- CCCTCTCCACGATCGTTACCTTGCTGCGGGAAAATGTTGGCTCCTGA SEQ ID NO:12 (codificado por SEQ ID NO:11): MLVLPAFLANDLPTSLLRRTLKANGFRPFGWANGFNLGARPDTLQRLSAR- LDAVVQEAGRPVALIGWSLGGLYARELAKRRSAEVSAVITLGTPFSVDL- RRNNAWKLYELINDHPVDAPPLDVQVDAKPPVRTFALWSRRDGIVAPA- SAHGMEGEFDQAIELQCTHNEMVSDPEALSTIVTLLRENVGS SEQ ID NO:13: GTGAATACAGCCGACCTATTGAAGCCACCACCCGCAAGCATGACAGTT- CTCGAGGCGAGAGCGCTGCTGGACATATGCAAGATGAGCG- CCCCATTGGCGCGCTTGCTATTCAAAAAGAACTCGCCCTGGCGCAAA- CAACGGGTTCTCGTAATACCTGGCTTTGGCGCTGATGATCGCTACAC- CTGGCCGTTGCGCAATTTCGTCCAGGCACAGGGCTATGCCACGAC- TGGCTGGGGCCTGGGCACCAACAAGGCAGGTCTCAATATGCCGCAT- CAACTATCCGACGTCCACCCCAGATGGAAGCTAAAACCCAAGACG- CCGTACCGTGGTGAGGCGGGCGTACCTTACGTGATTGACCG- CTTGATCGAACGGTTTGACGAATTGGCATCGACGGATCCGCAAC- CCATCGCACTTATAGGTTGGAGTCTGGGTGGTTTCATGGCCCGTGAAG- TTGCCCGAGAGCGCCCAAACCAGGTGAGTCAGGTTATTACCCTCGG- TTCTCCTGTCATCGGAGGCCCAAAATACACCCTCGCTGCATCGGCTTT- CATCCGGCGCAAATACGATTTGGACTGGGTGGAGCAAGTGATCGCG- GAGCGGGAAGATCGCCCCATTACTGTTCCTATTACAGCAATAGTCAG- CCAGTCTGATGGCATCGTCGGATATTCAGCGGCAATCGATCACCACAG- TCCCGCTGTGCAGCATTTACATATGGATGTTGCCCATTTGGGCTTTCCT- TACAACACGAGGGTTTGGTCAGAAATCGCCAATGCGCTCAACTCTT- TAGAGGTGGAGAAGGAGCGTGTTTAG SEQ ID NO:14 (codificado por SEQ ID NO:13): MNTADLLKPPPASMTVLEARALLDICKMSAPLARLLFKKNS- PWRKQRVLVIPGFGADDRYTWPLRNFVQAQGYATTGWGLGTNKAGLNM- PHQLSDVHPRWKLKPKTPYRGEAGVPYVIDRLIERFDELASTDPQPIA- LIGWSLGGFMAREVARERPNQVSQVITLGSPVIGGPKYTLAASAFIR- RKYDLDWVEQVIAEREDRPITVPITAIVSQSDGIVGYSAAIDHHSPA- VQHLHMDVAHLGFPYNTRVWSEIANALNSLEVEKERV SEQ ID NO:15: ATGGAGCTCGCCAAGGTCACCGCCCTGATGAAGGCCACCGCCCTCGA- GATCGCGATCCTCACCGGCCACCTCGTCCTCTACCCCTCCGGGATCG- TGGCCGAGCGCCTCGCGGCCGCCCCCTCTTCACCGTCCTCCCCG- TCCGCGGGCCCGACGGGCCGACGTCCGGTCGTCCTGCTGCACGG- TTTCGTGGACAACCGCTCGGTCTTCGTCCTGCTGCGCCGTGCCCT- CACCCGGAGCGGCCGTGACTGCGTCGAGTCGCTCAACTACTCGCCG- CTCACCTGCGACCTGCGGGCCGCCGCCGAACTGCTGGGGCGCCGGG- TGGACGAGATCCGCGCCCGGACCGGACACGCCGAGGTCGACATCG- TCGGCCACAGCCTGGGCGGGCTCATCGCCCGTTATTACGTACAGCG- TCTCGGCGGTGACAGCCGGGTGCGCACCCTGGTCATGCTCGGCAC- CCCGCACTCCGGCACCACCGTGGCCCGGCTCGCCGACGCGCATCCG- CTGGTGCGGCAGATGCGGCCGGGTTCGGAGGTGCTGCGGGAGCTCG- CCGCGCCCTCGCCCGGCTGCCGTACCCGGTTCGTGAGCTTCTGGAG- CGACCTC GACCAGGTGATGGTGCCGGTGGACACGGCCTGCCTGGACCAC- CCCGACCTGCTGGTGCACAACGTCCGGGTCAGCGGGATCGGT- CATCTCGCGCTGCCGGTCCATCCCACGGTGGCGGCCGGGGTCCGG- GAGGCCCTCGACGCGAGCGGCGCGGGGGTCCCGGGGGTGCGGGAG- GAGGGGCCCGGCGCCGGCGCCGTGGCGTGA SEQ ID NO:16 (codificado por SEQ ID NO:15): MELAKVTALMKATALEIAILTGHLVLYPSGIVAERLAAAPSSPSSPSAG- PTGRRPVVLLHGFVDNRSVFVLLRRALTRSGRDCVESLNYSPLTCDL- RAAAELLGRRVDEIRARTGHAEVDIVGHSLGGLIARYYVQRLGGDSRVR- TLVMLGTPHSGTTVARLADAHPLVRQMRPGSEVLRELAAPSPGCR- TRFVSFWSDLDQVMVPVDTACLDHPDLLVHNVRVSGIGHLAL- PVHPTVAAGVREALDASGAGVPGVREEGPGAGAVA SEQ ID NO:17: GTGGCCGCCGCGGACAGCGGGACGGCGGAAGGGCAAAGGCTTCGG- CCGCCGAGCCTGTTCCTGATGCTGGCCGAGGCGAGGGGCTTG- CTCGAACTGAACTCGAGCCTGTTGTTGTCGCCGCTGTTGTTGCGGG- CGCCGAAGGGCGACGGACATCCGGTGCTGGCGCTGCCGGGCTTT- CTCGCCAGCGATCTGTCGATGGCGCCGATGCGGCGCTA- TCTGAAAGAACTCGGCTACGATGCCCATGCGTGGAACATGGGCCGCA- ATCTCGGCGGCGTCGCGTCCAAGCGCGAAGCCTTGCGCGACCTGTTG- CGGCGCATTTACAGCCAGACGGGCCGCAAGGTCAGCCTGGTCGG- CTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGCGATCTCGCTTTGCAGGCG- CCCGACATGGTGCGTTCCGTGATCACGCTCGGCAGTCCGTTTGCCAG- CGACATCAGGGCGACCAACGCCACGCGGCTCTACGAGGCGCTG- TCGGGAGAAAGGGTCGACGACAATCCGGAGTTAACAGCGGCGATCG- CCGGCGACCTGCCGGTGCCGGCGACCTCGATCTATTCCCGTACCGA- CGGTATCGTGAACTGGCACACCAGCCTGCTGCGTCCTTCCGCAACGG- CTGAAAACATCGAGGTTTACTTCGCCAGCCATATCGGGCTCGGCGT- CAACCCGGCAGCGCTGTGGGCGGTGGCCGACCGCCTGGCGCAG- CCCGAGGGGGAATTTAAGCATTTTGACCGGTCGGGTCCCTTTG- CCATTGCCTATGGCCCCCCTGAAAATGCACAATCCTGA SEQ ID NO:18 (codificado por SEQ ID NO:17): MAAADSGTAEGQRLRPPSLFLMLAEARGLLELNSSLLLSPLLLRAPKGD- GHPVLALPGFLASDLSMAPMRRYLKELGYDAHAWNMGRNL- GGVASKREALRDLLRRIYSQTGRKVSLVGWSLGGVYARDLALQAPD- MVRSVITLGSPFASDIRATNATRLYEALSGERVDDNPELTAAIAGDLPV- PATSIYSRTDGIVNWHTSLLRPSATAENIEVYFASHIGLGVNPAALWAVA- DRLAQPEGEFKHFDRSGPFAIAYGPPENAQS SEQ ID NO:19: ATGCCGGAGCGAAACGAAGCGCAGGCCCCGCCGCGTCTTCGTCCG- CCGGGGCTCGGGCTGTTCCTCGCCGAAGCGCGGGGCATTTTCGAG- CTCAACGCGAGCCTGTTGCTGTCGCCGCTTCTGTTGCGCGCGCCGCG- CGGCGACGGCCATCCGGTGCTGGCGTTGCCGGGCTTTCTTGCCAG- TGATCTATCGATGGCGCCGTTGCGCCGCTACCTCACCGAGCTCGGC- TACGACACCCACGCCTGGCGCATGGGCCGCAATGTCGGCGGCATCG- CGAAGATGCGGATCGCGCTGCTCGAGCGGCTCACGCAGATCCATG- CCGAGTGCGGCCGCAAGGTCTCGATTGTCGGCTGGAGTCTCGGCGG- CGTCTATGCGCGCGACCTCGCGTTGCAGGCGCCCGAGATGGTGCGC- TACGTCGTCACCCTCGGCAGCCCCTTCGCCAGCGACGTCCGCGCCAC- CAATGCGACGCGGCTCTATGAGGCGATGTCGGGCGAAACGGTCGG- CGACAATGTCGACCTCGTGCAGGCGATTGCCGGCGACCTGCCGGTT- CCCGTGACCTCGATCTATTCGAAGAGCGACGGCATCGTGAACTGGCG- GACCTGCCTGCTGCGCCCGTCCGCGACCGCCGAGAATATCGAGGTC- TATTTCGCGAGCCATGTCGGCATCGGCGTCAATCCGGCCGCGCTG- TGGGCGATCGCGGACCGGCTGGCCCAGCGGGAAGGCGAATTCCG- CCCCTTCGACCGGTCCGGTCCTTTTGCCATTGCCTACGCGCCCCCG- GAACAGGCACAATCGATCTGA SEQ ID NO:20 (codificado por SEQ ID NO:19): MPERNEAQAPPRLRPPGLGLFLAEARGIFELNASLLLSPLLLRAPRGD- GHPVLALPGFLASDLSMAPLRRYLTELGYDTHAWRMGRNVGGIAKMRIAL- LERLTQIHAECGRKVSIVGWSLGGVYARDLALQAPEMVRYVVTLGSPFAS- DVRATNATRLYEAMSGETVGDNVDLVQAIAGDLPVPVTSIYSKSDGI- VNWRTCLLRPSATAENIEVYFASHVGIGVNPAALWAIADRLAQREGE- FRPFDRSGPFAIAYAPPEQAQSI

São fornecidos aqui métodos para descobrir novas sequências de hidrolase usando os ácidos nucleicos como fornecidos aqui. Também são fornecidos métodos para modificar os ácidos nucleicos como fornecidos aqui por, por exemplo, as tecnologias GSSMSM e GeneReassemblySM. Os ácidos nucleicos como fornecidos aqui podem ser preparados, isolados e/ou manipulados, por exemplo, por clonagem e expressão de bibliotecas de cDNA, amplificação de mensagem ou DNA genômico por PCR, e similares. A fonte inicial de polipeptídeos e ácidos nucleicos exemplares selecionados é:

Na prática dos métodos como fornecidos aqui, genes homólogos podem ser modificados por manipulação de um ácido nucleico padrão, como descrito aqui. A matéria-objeto reivindicada pode ser praticada em conjunto com qualquer método ou protocolo ou dispositivo conhecido na técnica, que são bem descritos na literatura científica e de patente.

Técnicas Gerais

Em certas modalidades, são fornecidos aqui ácidos nucleicos in-cluindo RNA, RNAi (por exemplo, siRNA, miRNA), ácido nucleico de antis- sentido, cDNA, DNA genômico, vetores, viroses ou híbridos dos mesmos, ácidos nucleicos isolados de uma variedade de fontes, geneticamente construídos, amplificados e/ou expressos/ gerados recombinantemente. Polipep- tídeos recombinantes gerados destes ácidos nucleicos podem ser individualmente isolados ou clonados e testados quanto a uma atividade desejada (por exemplo, hidrolase, tal como, por exemplo, a atividade de lipase, satu- rase, palmitase e/ou estearatase). qualquer sistema de expressão recombi- nante pode ser usado, incluindo sistemas de expressão de célula de bactérias l, mamíferas, levedura, fúngicas, de inseto ou de planta.

Alternativamente, estes ácidos nucleicos podem ser sintetizados in vitro por técnicas de síntese química bem-conhecidas, como descrito em, por exemplo, Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19: 373 - 380; Blommers (1994) Biochemistry 33: 7886 - 7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68: 90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68: 109; Beau- cage (1981) Tetra. Lett. 22: 1859; Patente U.S. No 4.458.066.

Técnicas para a manipulação de ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, subclonagem, sondas de rotulagem (por exemplo, rotulagem de iniciador aleatória empregando-se polimerase Klenow, translação de entalhe, amplificação), sequenciamento, hibridização e similares bem como descrito na literatura de patente e científica, veja, por exemplo, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (SEGUNDA EDIÇÃO), Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HIBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y. (1993).

Outro meio útil de obter e manipular ácidos nucleicos empregados para praticar os métodos da invenção é clonar de amostrs genômicas, e, se desejado, analisar e reclonar inserções isoladas ou amplificadas de, por exemplo, clones genômicos ou clones de cDNA. Fontes de ácido nucleico empregado nos métodos da invenção incluem bibliotecas genômicas ou de cDNA em, por exemplo, cromossomas artificiais mamíferos (MACs), veja, por exemplo, as Patentes U.S. nos 5.721.118; 6.025.155; cromossomas arti- ficiais humanos, veja, por exemplo, Rosenfeld (1997) Nat. genet. 15: 333335; cromossomas artificiais de levedura (YAC); cromossomas artificiais bacterianos (BAC); cromossomas artificiais P1, veja, por exemplo, Woon (1998) Genomics 50: 306-316; vetores derivados de P1 (PACs), veja, por exemplo, Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; cosmídeos, viroses re- combinantes, fagos ou plasmídeos.

As frases "ácido nucleico" ou "sequência de ácido nucleico" podem incluir um oligonucleotídeo, nucleotídeo, polinucleotídeo, ou um fragmento de qualquer destes, DNA ou RNA (por exemplo, mRNA, rRNA, tRNA, RNAi) de origem genômica ou sintética que pode ser de filamento único ou filamento duplo e pode representar um filamento de sentido ou antissentido, um ácido nucleico de peptídeo (PNA), ou qualquer material semelhante a DNA ou semelhante a RNA, de origem natural ou sintética, incluindo, por exemplo, RNAi (RNA "de interferência" de filamento duplo), ribonucleoprote- ínas (por exemplo, iRNPs). O termo abrange ácidos nucleicos, isto é, oligo- nucleotídeos, contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais. O termo também abrange estruturas semelhantes ao ácido nucleico com esqueletos sintéticos, veja, por exemplo, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156.

Quando usado aqui, o termo "promotor" inclui todas as sequências capazes de conduzir a transcrição de uma sequência de codificação em uma célula, por exemplo, uma célula de planta. Por conseguinte, os promotores usados nos construtos como fornecido aqui incluem elementos de controle transcricional cis-atuantes e sequências reguladoras que estão envolvidas na regulação ou modulação do tempo e/ou taxa de transcrição de um gene. Por exemplo, um promotor pode ser um elemento de controle transcri- cional cis-atuante, incluindo um realçador, um promotor, um terminador de transcrição, uma origem de replicação, uma sequência de integração cro- mossômica, regiões não transladadas 5' e 3', ou uma sequência intrônica, os quais estão envolvidos na regulação transcricional. Estas sequências cis- atuantes tipicamente interagem com proteínas ou outras biomoléculas para realizarem (iniciar/ interromper, regular, modular, etc.) a transcrição. Promotores "constitutivos" são aqueles que conduzem a expressão continuamente sob condições e estados mais ambientais de desenvolvimento ou diferenciação de célula. Promotores "induzíveis" ou "reguláveis" direcionam a expressão do ácido nucleico como fornecido aqui sob a influência de condições ambientais ou condições de desenvolvimento. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas, temperatura elevada, estiagem, ou a presença de luz.

Promotores "específicos de tecido" são elementos de controle transcricional que são unicamente ativos em células ou tecidos ou órgãos particulares, por exemplo, em plantas ou animais. A regulação específica de tecido pode ser obtida por certos fatores intrínsecos que asseguram que proteínas codificando genes específicas para um dado tecido são expressas. Tais fatores são conhecidos por existirem em mamíferos e plantas de forma que permitem os tecidos específicos desenvolverem-se.

O termo "planta" inclui plantas inteiras, partes de plantas (por exemplo, folhas, caules, flores, raízes, etc.), protoplastos de plantas, sementes e células de planta e progenitura da mesma. A classe de plantas que pode ser usada no método como fornecido aqui é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas mais altas receptivas a técnicas de transformação, incluindo angioespermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), assim como gimnoespermas. Ela inclui plantas de uma variedade de níveis de ploide, incluindo estados poliploides, diploides, haploides e hemizigotos. Quando aqui usado, o termo "planta transgênica" inclui plantas ou células de planta nas quais uma sequência de ácido nucleico heteróloga foi inserida, por exemplo, os ácidos nucleicos e vários construtos recombinantes (por exemplo, cassetes de expressão) como fornecido aqui.

Em um aspecto, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo como fornecido aqui é agrupado em fase apropriada com uma sequência líder capaz de direcionar a secreção do polipeptídeo transladado ou fragmento do mesmo.

Em uma modalidade, fornecidos aqui são proteínas de fusão e ácidos nucleicos codificando-as. Um polipeptídeo como fornecido aqui pode ser fundido a um polipeptídeo ou peptídeo heterólogo, tais como peptídeos de identificação de terminal N que conferem características desejadas, tais como estabilidade aumentada ou purificação simplificada. Peptídeos e poli- peptídeos como fornecidos aqui podem também ser sintetizados e expressos como proteínas de fusão com um ou mais domínios adicionais ligados a elas para, por exemplo, produzir um peptídeo mais imunogênico, para mais facilmente isolar um peptídeo recombinantemente sintetizado, para identificar e isolar anticorpos e células B expressando anticorpo, e similares. Domínios de facilitação de detecção e purificação incluem, por exemplo, peptí- deos de quelação de metal tais como tratos de poli-histidina e módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação sobre metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação sobre a imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação de afinida- de/extensão FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). A inclusão de uma sequência ligadora clivável tal como Fator Xa ou enterocinase (Invitrogen, San Diego CA) entre um domínio de purificação e o polipeptídeo ou peptídeo compreendendo motivo para facilitar a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de ácido nucleico codificando epitopo ligado a seis resíduos de histidina seguido por uma tioredoxina e um sítio de clivagem de enterocinase (veja por exemplo, Williams (1995) Biochemistry 34: 1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12: 404 - 414). Os resíduos de histidina facilitam a deleção e purificação enquanto o sítio de clivagem de enterocinase fornece um meio de purificar o epitopo do restante da proteína de fusão. A tecnologia que pertence a vetores codificando proteínas de fusão e amplificação de proteínas de fusão são bem-descritas na literatura científica e de patente, veja, por exemplo, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12: 441-53.

Sequências de controle transcricional e translacional.

Em outra modalidade, fornecidas aqui são sequências de ácido nucleico (por exemplo, DNA, iRNA) operativamente ligadas à(s) sequên- cia(s) de controle de expressão (por exemplo, transcricional ou translacio- nal), por exemplo, promotores ou realçadores, para direcionar ou modular a expressão/síntese de RNA. A sequência de controle de expressão pode ser em um vetor de expressão. Promotores bacterianos exemplares incluem la- cI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, Pl e trp. Promotores eucarióticos exemplares incluem CMV precocemente imediato, HSV timidina cinase, SV40 precoce e tardio, LTRs de retrovírus, e metalotioneína de camundongo.

Os promotores adequados para expressar um polipeptídeo em bactérias incluem os promotores lac ou trp de E. coli, o promotor lacI, o promotor lacZ, o promotor T3, o promotor T7, o promotor gpt, o promotor PR lambda, o promotor PL lambda, promotores de enzimas glicolíticas codificando operons tais como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), e o promotor de fos- fatase de ácido. Os promotores eucarióticos incluem promotor precoce imediato CMV, o promotor de HSV timidina cinase, promotores de choque térmico, promotor SV40 precoce e tardio, LTRs de retrovírus, e o promotor de metalotioneína-I de camundongo. Outros promotores conhecidos para controlar a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou suas viroses podem também ser usados.

Promotores de Planta Específicos de Tecido

Em uma modalidade, fornecidos aqui são cassetes de expressão que podem ser expressos de uma maneira específica de tecido, por exemplo, aquela que pode expressar uma hidrolase como fornecida aqui de uma maneira específica de tecido. Em outra modalidade, fornecidas aqui são plantas ou sementes que expressam uma hidrolase como fornecida aqui de uma maneira específica de tecido. A especificidade de tecido pode ser específica de semente, específica de caule, específica de folha, específica de raiz, específica de fruta, e similares.

Em um aspecto, um promotor constitutivo tal como promotor 35S de CaMV pode ser usado para expressão em partes específicas da planta ou semente ou em toda a planta. Por exemplo, para superexpressão de uma hidrolase como fornecida aqui, um fragmento promotor de planta pode ser usado o qual direcionará a expressão de um ácido nucleico em algum ou todos os tecidos de uma planta, por exemplo, uma planta regenerada. Tais promotores "constitutivos" são ativos sob as condições mais ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação de célula. Exemplos de promotores constitutivos incluem a região de iniciação de transcrição de 35S de vírus mosaico de couve-flor (CaMV), o promotor 1'- ou 2'- derivado de T- DNA de Agrobacterium tumefaciens, e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes de planta conhecidos por aqueles versados. Tais genes incluem, por exemplo, ACT11 de Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33: 125-139); Cat3 de Arabidopsis (GenBank n° U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251: 196-203); o gene codificando a proteína veículo de estearoil-acila dessaturase de Brassica napus (Genbank n° X74782, Solo- combe (1994) Plant Physiol. 104: 1167 - 1176); GPc1 de milho (GenBank n° X15596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208: 551 - 565) o Gpc2 de milho (GenBank n° U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33: 97-112); promotores de planta descritos nas Patentes U.S. Nos. 4.962.028; 5.633.440.

Em uma modalidade, fornecidos aqui são promotores específicos de tecido ou constitutivos derivados de vírus que podem incluir, por exemplo, o promotor subgenômico tobamovírus (Kumagai (1995) Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 1679-1683; o vírus tungro bacilliform de arroz (RTBV), que replica-se apenas em células floema em plantas de arroz infectadas, com seu promotor que direciona a forte expressão de gene repórter específica de floema; promotor do vírus mosaico da veia da mandioca (CVMV), com atividade mais elevada em elementos vasculares, em células mesófilas de folha, e em extremidades de raiz (verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31: 11291139).

Alternativamente, o promotor de planta pode direcionar a expressão de ácido nucleico de expressão de hidrolase em um tecido específico, tipo órgão ou célula (isto é, promotores específicos de tecido) ou pode estar de outra maneira sob controle de modo desenvolvido ou ambiental mais preciso ou sob o controle de um promotor induzível. Exemplos de condições ambientais que podem afetar a transcrição incluem condições anae- róbicas, temperatura elevada, a presença de luz, ou vaporizadas com quími cas/hormônios. Em uma modalidade, fornecidos aqui são promotores de milho induzíveis por estiagem (Busk (1997) supra); o frio, estiagem e promotor de batata induzível por sal elevado (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33: 897 909).

Os promotores específicos de tecido podem promover a transcrição apenas dentro de uma certa estrutura de tempo de estágio de modo desenvolvido dentro daquele tecido. Veja, por exemplo, Blazquez (1998) Plant Cell 10: 791-800, caracterizando o promotor de gene Arabidopsis LEAFY . Veja também Cardon (1997) Plant J 12: 367-77, descrevendo o fator de transcrição SPL3, que reconhece um motivo de sequência conservada na região promotora do gene AP1 de identidade do meristema floral de A. thali- na; e Mandel (1995) Plant Molecular Biology, Volume 29, pp 995-1004, des-crevendo o promotor eIF4 de meristema. Os promotores específicos de tecido que são ativos em todo o ciclo de vida de um tecido particular podem ser usados. Em um aspecto, os ácidos nucleicos como fornecidos aqui são ope- ravelmente ligados a um promotor ativo primariamente apenas em células de fibra de algodão. Em um aspecto, os ácidos nucleicos como fornecidos aqui são operavelmente ligados a um promotor ativo primariamente durante os estágios de alongamento de célula de fibra de algodão, por exemplo, como descrito por Rinehart (1996) supra. Os ácidos nucleicos podem ser opera- velmente ligados ao promotor de gene Fb12A a ser preferencialmente expressos em células de fibra de algodão (Ibid). Veja também, John (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 5769-5773; John, e outro, Patentes U.S. Nos 5.608.148 e 5.602.321, descrevendo promotores específicos de fibra de algodão e métodos para a construção de plantas de algodão transgênicas. Os promotores específicos de raiz podem também ser usados para expressar os ácidos nucleicos como fornecidos aqui. Exemplos de promotores específicos de raiz incluem o promotor do gene de desidrogenase de álcool (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123: 39-60). Outros promotores que podem ser usados para expressar os ácidos nucleicos como fornecidos aqui incluem, por exemplo, promotores específicos de óvulo, específicos de embrião, específicos de endoesperma, específicos de integumento, específicos de re- vestimento de semente, ou alguma combinação dos mesmos; um promotor específico de folha (veja, por exemplo, Busk (1997) Plant J. 11: 1285 - 1295, descrevendo um promotor específico de folha em milho); o promotor ORF13 de Agrobacterium rhizogenes (que exibe elevada afinidade em raízes, veja, por exemplo, Hansen (1997) supra); um promotor específico de pólen de milho (veja, por exemplo, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161-168); um promotor de tomate ativo durante o amadurecimento do fruto, senescên- cia e abscisão de folhas e, em uma menor extensão, de folhas pode ser usado (veja, por exemplo, Blume (1997) Plant J. 12: 731 - 746); um promotor específico de pistilo do gene SK2 de batata (veja, por exemplo, Ficker (1997) Plant Mol. Biol. 35: 425 - 431); o gene Blec4 de ervilha, que é ativo em tecido epidérmico de ápices de brotos floral de alfafa transgênica tornando-a uma ferramenta útil para alvejar a expressão de genes estranhos à camada epidérmica de fibras ou brotos ativamente em desenvolvimento; o gene BEL1 específico de óvulo (veja, por exemplo, Reiser (1995) Cell 83: 735-742, GenBank n° U39944); e/ou, o promotor em Klee, Patente U.S. No 5.589.583, descrevendo uma região promotora de planta é capaz de conferir níveis elevados de transcrição em tecido meristemático e/ou rapidamente dividindo células.

Alternativamente, os promotores de planta que são induzíveis em exposição a hormônios de planta, tais como auxinas, são usados para expressar os ácidos nucleicos como fornecidos aqui. Em uma modalidade, fornecidos aqui são promotores compreendendo o fragmento de promotor E1 de elementos de resposta à auxina (AuxREs) na soja (Glycine max L.) (Liu (1997) Plant Physiol. 115: 397-407); o promotor GST6 de Arabidopsis responsivo à auxina (também responsivo ao ácido salicílico e peróxido de hidrogênio) (Chen (1996) Plant J. 10: 955 - 966); o promotor parC induzível por auxina de tabaco (Sakai (1996) 37: 906-913); um elemento de resposta à biotina de planta (Streit (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10: 933-937); e, o promotor responsivo ao ácido abscísico de hormônio de estresse (Sheen (1996) Science 274: 1900-1902).

Os ácidos nucleicos como fornecidos aqui podem também ser operavelmente ligados a promotores de planta que são induzíveis em exposição a reagentes químicos que podem ser aplicados à planta, tais como herbicidas ou antibióticos. Por exemplo, o promotor In2-2 de milho, ativado por protetores herbicidas de benzenossulfonamida, pode ser usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); aplicação de diferentes protetores herbicidas induz padrões de expressão de gene distintos, incluindo a expressão na raiz, hydathodes, e o meristema do ápice do broto. As se-quências de codificação podem ser sob o controle de, por exemplo, um promotor induzível por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas contendo o gene de arginina descarboxilase de Avena sativa L (aveia) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473); ou um elemento res- ponsivo ao ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324). Usando- se promotores quimicamente (hormônio- ou pesticida)- induzidos, isto é, promotor responsivo a uma química que pode ser aplicada à planta transgê- nica no campo, a expressão de um polipeptídeo como fornecido aqui pode ser induzida em um estágio particular de desenvolvimento da planta. Em certas modalidades, fornecidas aqui são plantas transgênicas contendo um gene induzível codificando para polipeptídeos como fornecidos aqui cuja faixa hospedeira é limitada a espécies de planta-alvo, tal como milho, arroz, cevada, trigo, batata ou outras culturas, induzíveis em qualquer estágio de desenvolvimento da colheita.

Promotores de planta específicos de tecido podem direcionar a expressão de sequências operavelmente ligadas em tecidos exceto o tecido- alvo. Desse modo, um promotor específico de tecido é aquele que direciona a expressão preferencialmente no tipo de célula ou tecido-alvo, porém pode também induzir a alguma expressão em outros tecidos também.

Os ácidos nucleicos como fornecidos aqui podem também ser operavelmente ligados a promotores de planta que são induzíveis em exposição a reagentes químicos. Estes reagentes incluem, por exemplo, herbicidas, auxinas sintéticas ou antibióticos que podem ser aplicados, por exemplo, vaporizados, sobre plantas transgênicas. A expressão induzível dos ácidos nucleicos de produção de hidrolase como fornecida aqui permitirão o agricultor selecionar plantas com a relação amido:açúcar ideal. O desenvolvimento de partes de planta pode desse modo ser controlado.

Em uma modalidade, fornecidos aqui são meios para facilitar a colheita de plantas e partes de planta. Por exemplo, em várias modalidades, o promotor In2-2 de milho, ativado por protetores herbicidas de benzenosul- fonamida, é usado (De Veylder (1997) Plant Cell Physiol. 38: 568-577); aplicação de diferentes protetores herbicidas induz padrões distintos de expressão de gene, incluindo a expressão na raiz, hydathodes, e o meristema do ápice do broto. As sequências de codificação como fornecidas aqui estão também sob o controle de um promotor induzível por tetraciclina, por exemplo, como descrito com plantas de tabaco transgênicas contendo o gene de arginina descarboxilase de Avena sativa L (aveia) (Masgrau (1997) Plant J. 11: 465-473), ou, um elemento responsivo de ácido salicílico (Stange (1997) Plant J. 11: 1315-1324).

Se a expressão de polipeptídeo apropriada é desejada, uma região de poliadenilação na extremidade 3' da região de codificação deveria ser incluída. A região de poliadenilação pode ser derivada do gene natural, de uma variedade de outros genes de planta ou de genes no T-DNA Agrobacteriano.

Vetores de expressão e veículos de clonagem

Em uma modalidade, fornecidos aqui são vetores de expressão, cassetes de expressão e veículos de clonagem compreendendo ácidos nu- cleicos, por exemplo, sequências codificando as hidrolases e anticorpos. Os vetores de expressão e veículos de clonagem como fornecidos aqui podem compreender partículas virais, baculovírus, fago, plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, fosmídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomas artificiais bac- terianos, DNA viral (por exemplo, vaccínia, adenovírus, vírus da varíola de ave, pseudorraivas e derivados de SV40), cromossomas artificiais com base em P1, plasmídeos de levedura, cromossomas artificiais de levedura, e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros específicos de interesse (tal como bacilo, Aspergillus e levedura). Os vetores como fornecidos aqui podem incluir as sequências de DNA cromossômicas, não cromossômi- cas e sintéticas. Grandes números de vetores adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica, e estão comercialmente disponíveis. Os vetores exemplares incluem: bacterianos: vetores pQE (Qiagen), plasmídeos pBLUESCRIPTTM, vetores pNH, (vetores lambda-ZAP (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T (Pharmacia); Eucarióticos: pXT1, pSG5 (Strata- gene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro plamídeo ou outro vetor pode ser usado contanto que eles sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro. Os vetores de baixo número de cópia ou número elevado de cópia podem ser usados.

Em uma modalidade, um "cassete de expressão" como fornecido aqui compreende uma sequência de nucleotídeo a qual é capaz de produzir a expressão de um gene estrutural (isto é, uma sequência de codificação de proteína, tal como uma hidrolase como fornecida aqui) em um hospedeiro compatível com tais sequências. Cassetes de expressão incluem pelo menos um promotor operavelmente ligado com a sequência de codificação de polipeptídeo; e, opcionalmente, com outras sequências, por exemplo, sinais de terminação de transcrição. Fatores adicionais necessários ou úteis na execução de expressão podem também ser usados, por exemplo, realçadores. "Operavelmente ligado" quando usado aqui refere-se à ligação de um promotor a montante de uma sequência de DNA tal que o promotor media a transcrição da sequência de DNA. Desse modo, cassetes de expressão também incluem plasmídeos, vetores de expressão, vírus recombi- nante, qualquer forma de vetor de "DNA nu", e similares. Um "vetor" compreende um ácido nucleico que pode infectar, transfectar, transduzir transitoriamente ou permanentemente uma célula. Deve ser reconhecido que um vetor pode ser um ácido nucleico nu, ou um ácido nucleico complexado com proteína ou lipídeo. O vetor opcionalmente compreende proteínas e/ou ácidos nucleicos virais ou bacterianos, e/ou membranas (por exemplo, uma membrana de célula, um envelope de lipídeo viral, etc.). Vetores incluem, mas não estão limitados a réplicons (por exemplo, réplicons de RNA, bacte- riófagos) a cujos fragmentos de DNA podem ser ligados e tornados replicados. Vetores por conseguinte incluem, mas não estão limitados a RNA, DNA ou RNA circular ou linear autorreplicante autônomo (por exemplo, plasmí- deos, viroses, e similares, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.217.879), e incluem ambos os plasmídeos de expressão e não expressão. Onde uma cultura de células ou micro-organismo recombinante é descrito como hospedando um "vetor de expressão" isto inclui igualmente DNA circular e linear extracromossômico e DNA que foi incorporado no(s) cromossoma(s) do hospedeiro. Onde um vetor está sendo mantido por uma célula hospedeira, o vetor pode ser estavelmente replicado pelas células durante a mitose como uma estrutura autônoma, ou ser incorporado no genoma do hospedeiro.

O vetor de expressão pode compreender um promotor, um sítio de ligação de ribossoma para iniciação de translação e um terminador de transcrição. O vetor pode também incluir sequências apropriadas para amplificação da expressão. Os vetores de expressão de mamífero podem compreender uma origem de replicação, quaisquer sítios de ligação de ribosso- ma necessários, um sítio de poliadenilação, doador de união e sítios acepto- res, sequências de terminação transcricionais, e sequências não transcritas de flanqueamento 5'. Em alguns aspectos, as sequências de DNA derivadas dos sítios de poliadenilação e união SV40 podem ser usadas para fornecer os elementos genéticos não transcritos requeridos.

Em um aspecto, os vetores de expressão contêm um ou mais genes marcadores selecionáveis para permitir a seleção de células hospedeiras contendo o vetor. Tais marcadores selecionáveis incluem genes codificando di-hidrofolato redutase ou genes conferindo resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, genes conferindo resistência à tetraciclina ou ampicilina em E. coli, e o gene de TRP1 de S. cerevisiae. As regiões promotoras podem ser selecionadas de qualquer gene desejado usando-se vetores de cloranfenicol transferase (CAT) ou outros vetores com marcadores selecionáveis.

Os vetores para expressão do polipeptídeo ou fragmento do mesmo em células eucarióticas podem também conter realçadores para aumentar os níveis de expressão. Os realçadores são elementos cis-atuantes de DNA, usualmente de cerca de 10 a cerca de 300 bp de comprimento que atuam sobre um promotor para aumentar sua transcrição. Exemplos incluem o realçador SV40 sobre o lado posterior da origem de replicação de 100 a 270 pares de base, o realçador de promotor precoce de citomegalovírus, o realçador de polioma sobre o lado posterior da origem de replicação, e os realçadores de adenovírus.

A sequência de DNA pode ser inserida em um vetor por uma va-riedade de procedimentos. Em geral, a sequência de DNA é ligada à posição desejada no vetor seguindo digestão da inserção e do vetor com endonucleases de restrição apropriadas. Alternativamente, as extremidades cegas igualmente em inserções e o vetor podem ser ligados. Uma variedade de técnicas de clonagem é descrita em Ausubel e Sambrook. Tais procedimentos e outros são supostos estarem dentro do escopo daqueles versados na técnica.

O vetor pode ser na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, ou um fago. Outros vetores incluem sequências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas, derivados de SV40; plasmídeos bacteria- nos, DNA de fago, baculovírus, palsmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago, DNA viral tais como vaccí- nia, adenovírus, vírus da varíola de ave e pseudorraivas. Uma variedade de vetores de expressão e clonagem para uso com hospedeiros eucarióticos e procarióticos é descrita por Sambrook.

Vetores bacterianos particulares que podem ser usados incluem plasmídeos comercialmente disponíveis compreendendo elementos genéticos do vetor de clonagem bem conhecido pBR322 (ATCC 37017), pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), GEM1TM (Promega Biotec, Madison, WI, USA) pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pD10, psiX174 pBlues- cript II KSTM, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, DR540, pRIT5 (Pharmacia), pKK232-8 e pCM7. Vetores eucarióticos particulares incluem pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Strata- gene) pSVK3, pBPV, pMSG, e pSVL (Pharmacia). Entretanto, qualquer outro vetor pode ser usado contanto que ele seja replicável e viável à célula hospedeira.

Os ácidos nucleicos como fornecidos aqui podem ser expressos em cassetes de expressão, vetores ou vírus e transitoriamente ou estavel- mente expressos em sementes e células de planta. Um sistema de expressão exemplarmente transitório usa sistemas de expressão epissomais, por exemplo, RNA viral do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) gerado no núcleo por transcrição de um minicromossoma epissômico contendo DNA superes- piralado, veja, por exemplo, Covey (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1633-1637. Alternativamente, as sequências de codificação, isto é, todos ou subfragmentos de sequências como fornecidos aqui podem ser inseridos em um genoma de célula hospedeira de planta tornando-se uma parte integral do DNA cromossômico hospedeiro. Transcrições antissentido ou sentido podem ser expressas desta maneira. Um vetor compreendendo as sequências (por exemplo, promotores ou regiões de codificação) dos ácidos nuclei- cos como fornecidos aqui pode compreender um gene marcador que confere um fenótipo selecionável sobre uma célula de planta ou semente. Por exemplo, o marcador pode codificar resistência ao biocida, particularmente resistência ao antibiótico, tal como resistência à canamicina, G418, bleomicina, higromicina, ou resistência ao herbicida, tal como resistência ao clorossulfu- rona ou Basta.

Vetores de expressão capazes de expressar ácidos nucleicos e proteínas em plantas são bem-conhecidos na técnica, e podem incluir, por exemplo, vetores de Agrobacterium spp., vírus da batata X (veja, por exemplo, Angell (1997) EMBO J. 16:3675-3684), vírus mosaico do tabaco (veja, por exemplo, Casper (1996) Gene 173:69 - 73), vírus de atrofiamento da fo-lhagem do tomate (veja, por exemplo, Hillman (1989) Virology 169:42-50), vírus etch do tabaco (veja, por exemplo, Dolja (1997) Virology 234: 243-252), vírus mosaico golden do feijão (veja, por exemplo, Morinaga (1993) Microbiol Immunol. 37:471-476), vírus mosaico da couve-flor (veja, por exemplo, Cec- chini (1997) Mol. Plant Microbe Interact. 10:1094-1101), elemento transferível de Ac/Ds do milho (veja, por exemplo, Rubin (1997) Mol. Cell. Biol. 17:6294-6302; Kunze (1996) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:161-194), e o elemento transferível mutador-supressor de milho (Spm) (veja, por exem- plo, Schlappi (1996) Plant Mol. Biol. 32:717 - 725); e derivados dos mesmos.

Em um aspecto, o vetor de expressão pode ter dois sistemas de replicação para permitir ser mantido em dois organismos, por exemplo, em células de mamífero, levedura, fúngicas ou inseto para expressão e em um hospedeiro procariótico para clonagem e amplificação. Além disso, para integrar os vetores de expressão, o vetor de expressão pode conter pelo menos uma sequência homóloga ao genoma de célula hospedeira. Ele pode conter duas sequências homólogas que flanqueiam a construção de expressão. O vetor de integração pode ser direcionado a um local específico na célula hospedeira selecionando-se a sequência homóloga apropriada para inclusão no vetor. As construções para integrar os vetores são bem- conhecidas na técnica.

Os vetores de expressão como fornecidos aqui podem também incluir um gene marcador selecionável para permitir a seleção das cepas bacterianas que foram transformadas, por exemplo, genes que tornam as bactérias resistentes aos fármacos tais como ampicilina, cloranfenicol, eri- tromicina, canamicina, neomicina e tetraciclina. Marcadores selecionáveis podem também incluir genes biossintéticos, tais como aqueles nas séries de reação biossintéticas de histidina, triptofano e leucina.

Células hospedeiras e células transformadas

Em uma modalidade, fornecidad aqui são células transformadas compreendendo uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, uma sequência codificando uma hidrolase ou um anticorpo, ou um vetor como fornecido aqui. A célula hospedeira pode ser quaisquer das células hospedeiras familiares àqueles versados na técnica, incluindo células procarióticas, células eucarióticas, tais como células bacterianas, células fúngicas, células de levedura, células de mamíferos, células de inseto, ou células de planta.

Enzimas como fornecidas aqui podem ser expressas em qualquer célula hospedeira, por exemplo, qualquer célula bacteriana, qualquer célula de levedura, qualquer Saccharomyces ou Schizosaccharomyces spp., qualquer Pichia spp., por exemplo, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisi- ae ou Schizosaccharomyces pombe. Células bacterianas exemplares inclu- em qualquer Streptomyces ou Bacillus spp., por exemplo, E. coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium ou qualquer espécie dentro dos gêneros Bacillus, Streptomyces e Staphylococcus. Células de inseto exemplares incluem Drosophila S2 e Spodoptera Sf9. Cé-lulas animais exemplares incluem CHO, COS ou melanoma de Bowes, ou ou qualquer linhagem celular humana e de camundongo. A seleção de um hos-pedeiro apropriado está dentro das capacidades daqueles versados na técnica. As técnicas para transformar uma ampla variedade de espécies de planta mais importantes são bem-conhecidas e descritas na bibliografia técnica e científica. Veja, por exemplo, Weising (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Patente U.S. No. 5.750.870.

O vetor pode ser introduzido nas células hospedeiras usando qualquer dentre uma variedade de técnicas, incluindo transformação, trans- fecção, transdução, infecção viral, pistolas de gene, ou transferência de gene mediada por Ti. Métodos particulares incluem transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-Dextrana, lipofecção ou eletropora- ção (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986)). Onde apropriado, as células hospedeiras construídas podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados quando apropriados para ativar os promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes como fornecidos aqui. Seguindo a transformação de uma cepa hospedeira adequada e crescimento da cepa hospedeira em uma densidade de célula apropriada, o promotor selecionado pode ser induzido por meios apropriados (por exemplo, mudança de temperatura ou indução química) e as células podem ser cultivadas durante um período adicional para permiti- las produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento deste.

Em um aspecto, os ácidos nucleicos ou vetores como fornecidos aqui são introduzidos nas células para avaliação, desse modo, os ácidos nucleicos entram nas células de uma maneira adequada para expressão subsequente do ácido nucleico. O método de introdução é largamente imposto pelo tipo de célula alvejada. Métodos exemplares incluem precipitação de CaPO4, fusão de lipossoma, lipofecção (por exemplo, LIPOFECTINTM), eletroporação, infecção viral, etc. Os ácidos nucleicos candidatos podem estavelmente integrar no genoma da célula hospedeira (por exemplo, com introdução retroviral) ou podem existir transitoriamente ou estavelmente no citoplasma (isto é, através do uso de plasmídeos tradicionais, utilizando se-quências reguladoras padrão, marcadores de seleção, etc.). Modalidades alternativas compreendem vetores retrovirais capazes de transfeccionar tais alvos (por exemplo, células mamíferas, humanas) porque, por exemplo, muitas avaliações farmaceuticamente importantes requerem alvos de célula de mamífero modelo ou humano.

As células podem ser colhidas por centrifugação, rompidas por meios químicos ou físicos, e o extrato bruto resultante é mantido para outra purificação. As células microbianas empregadas para expressão de proteínas podem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo cicla- gem de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico, ou uso de agentes de lise de célula. Tais métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. O polipeptídeo expresso ou fragmento do mesmo pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de célula re- combinantes por métodos incluindo precipitação de etanol ou sulfato de amônio, extração de ácido, cromatografia de permuta de cátion ou ânion, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cro- matografia por afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lecitina. Etapas de reduplicação de proteína podem ser usadas, quando necessário, na conclusão da configuração do polipeptídeo. Se desejado, cro- matografia líquida de alto desempenho (HPLC) pode ser usada para etapas de purificação finais.

Vários sistemas de cultura de célula de mamífero podem também ser usados para expressar a proteína recombinante. Exemplos de sistemas de expressão de mamífero incluem as linhagens de COS-7 de fi- broblastos de rim de macaco e outras linhagens de célula capazes de expressar proteínas de um vetor compatível, tais como as linhagens de célula C127, 3T3, CHO, HeLa e BHK.

As construções em células hospedeiras podem ser usadas de uma maneira convencional para produzir o produto de gene codificado pela sequência recombinante. Dependendo do hospedeiro usado em um procedimento de produção recombinante, os polipeptídeos produzidos por células hospedeiras contendo o vetor podem ser glicosilados ou podem ser não gli- cosilados. Os polipeptídeos como fornecidos aqui podem ou não podem também incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial.

Os sistemas de translação livres de célula podem também ser usados para produzir um polipeptídeo como fornecido aqui. Os sistemas de translação livres de célula podem usar mRNAs transcritos a partir de uma construção de DNA compreendendo um promotor operavelmente ligado em um ácido nucleico codificando o polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Em alguns aspectos, a construção de DNA pode ser linearizada antes de conduzir uma reação de transcrição in vitro. O mRNA transcrito é então incubado com um extrato de translação livre de célula apropriado, tal como um extrato de reticulócito de coelho, para produzir o polipeptídeo desejado ou fragmento do mesmo.

Os vetores de expressão podem conter um ou mais genes marcadores selecionáveis para fornecer uma característica fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas tais como di-hidrofolato reductase ou resistência à neomicina para cultura de célula eucariótica, ou tal como resistência à ampicilina ou tetraciclina em E. coli.

Amplificação de Ácidos Nucleicos

Em outra modalidade, fornecidos aqui são ácidos nucleicos codi-ficando os polipeptídeos, ou ácidos nucleicos modificados, podem ser repro-duzidos por, por exemplo, amplificação. Em uma modalidade, fornecidos aqui são pares de iniciador de amplificação para amplificar os ácidos nuclei- cos codificando uma hidrolase, por exemplo, uma lipase, palmitase e/ou es- tearatase, onde os pares de iniciador são capazes de amplificar sequências de ácido nucleico como fornecido aqui. Alguém de experiência na técnica pode projetar os pares de sequência de iniciador de amplificação para qualquer parte de ou o tamanho natural destas sequências.

As reações de amplificação podem também ser usadas para quantificar a quantidade de ácido nucleico em uma amostra (tal como a quantidade de mensagem em uma amostra de célula), rotular o ácido nuclei- co (por exemplo, aplicá-lo em uma disposição ou uma mancha), detectar o ácido nucleico, ou quantificar a quantidade de um ácido nucleico específico em uma amostra. Em um aspecto como fornecido aqui, a mensagem isolada de uma célula ou uma biblioteca de cDNA é amplificada. O técnico versado pode selecionar e projetar os iniciadores de amplificação de oligonucleotídeo adequados. Os métodos de amplificação são também bem-conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, reação em cadeia de polimerase, PCR (veja, por exemplo, PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) e PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reação em cadeia de ligase (LCR) (veja, por exemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241:1077; Barringer (1990) Gene 89:117); amplificação de transcrição (veja, por exemplo, Kwoh (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173); e, replicação de sequência autossustentada (veja, por exemplo, Guatelli (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874); amplificação de Q Beta replicase (veja, por exemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477 - 1491), ensaio de amplificação de Q-beta replicase automatizada (veja, por exemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) e outras técnicas mediadas por RNA polime- rase (por exemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); veja também Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; Patentes U.S. Nos. 4.683.195 e 4.683.202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

Em uma modalidade, fornecidos aqui são pares iniciadores de amplificação compreendendo sequências como fornecido aqui, por exemplo, onde o par iniciador compreende um primeiro membro tendo uma sequência como mencionado em torno do primeiro (o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou mais resíduos de um ácido nucleico como fornecido aqui, e um segundo membro tendo uma sequência como mencionado em torno do primei- ro (o 5') 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 ou mais resíduos do filamento complementar do primeiro membro.

Determinação do grau de identidade de sequência

Em uma modalidade, fornecidos aqui são ácidos nucleicos tendo pelo menos ácido nucleico, ou identidade de sequência completa (100%) para um ácido nucleico como fornecido aqui, por exemplo, um ácido nicleico exemplar como fornecido aqui (por exemplo, tendo uma sequência como mencionado em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23, ou SEQ ID NO:1 modificada para codificar uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (várias) ou todas as variações de base descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23, ou o equivalente da mesma); e polipeptídeos tendo pelo menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%) para um polipeptídeo como fornecido aqui, por exemplo, um polipeptídeo exemplar tendo uma sequência como mencionado em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:2 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (várias) ou todas as variações de base descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23, ou o equivalente da mesma. Em aspectos alternativos, a identidade de sequência pode estar sobre uma região de pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais resíduos sucessivos, ou o tamanho natural do ácido nu- cleico ou polipeptídeo. A extensão da identidade de sequência (homologia) pode ser determinada usando qualquer programa de computação e parâme- tros associados, incluindo aqueles descritos aqui, tal como BLAST 2.2.2. ou FASTA versão 3.0t78, com os parâmetros básicos. Como usados aqui, os termos "computador", "programa de computação" e "processador" são usados em seus contextos gerais mais amplos e incorporam todos os tais dispositivos, como descrito em detalhes, abaixo.

A tabela abaixo descreve características selecionadas de ácidos nucleicos exemplares e polipeptídeos como fornecidos aqui, incluindo com-paração de identidade de sequência das sequências exemplares para publicar a base de dados para identificar a atividade das enzimas como fornecido aqui por análise de homologia (identidade de sequência). Todas as sequências descritas na tabela (todas as sequências exemplares como fornecido aqui) foram submetidas a uma pesquisa BLAST (como descrito em detalhes, abaixo) contra dois conjuntos de base de dados. O primeiro conjunto de base de dados está disponível por NCBI (National Center for Biotechnology Information). Todos os resultados das pesquisas contra estas bases de dados são encontrados nas colunas intituladas "Descrição de NR", "Código de Acesso de NR", "Evalor de NR" ou "Organismo de NR". "NR" refere-se à base de dados de nucleotídeo Não redundante mantida por NCBI. Esta base de dados é um compósito de GenBank, atualizações de GenBank, e atualizações de EMBL. As entradas na coluna "Descrição de NR" refere-se à linha de definição em qualquer determinado registro de NCBI, que inclui uma descrição da sequência, tal como o organismo de fonte, nome de gene/nome de proteína, ou alguma descrição da função da sequência - desse modo identificando uma atividade das enzimas exemplares listadas como fornecido aqui por análise de homologia (sequência de identidade). As entradas na coluna "Código Acesso de NR" refere-se ao identificador único dado para um registro de sequência. As entradas na coluna "Evalor de NR" refere-se ao valor Esperado (Evalor) que representa a probabilidade que um escore de alinhamento tão bom quanto aquele encontrado entre a sequência dúvida (as se-quências como fornecido aqui) e uma sequência de base de dados seria en-contrada no mesmo número de comparações entre sequências randomiza- das como foi feito na pesquisa BLAST presente. As entradas na coluna "Or- ganismo de NR" refere-se ao organismo de fonte da sequência identificada como choque BLAST mais próximo (homologia de sequência). O segundo conjunto de base de dados é coletivamente conhecido como a base de dados de GENESEQTM, que está disponível por Thomson Derwent (Philadelphia, PA). Todos os resultados de pesquisas contra esta base de dados são encontrados nas colunas intituladas " Descrição de Proteína de GENESE- QTM", "Código de Acesso de Proteína de GENESEQTM", "Evalor de Proteína de GENESEQTM", "Descrição de DNA de GENESEQTM", " Código de Acesso de DNA de GENESEQTM" ou "Evalor de DNA de GENESEQTM". A informação encontrada nestas colunas é comparável à informação encontrada nas colunas de NR descritas acima, a não ser que tenha sido derivada de pesquisas BLAST em comparação com a base de dados de GENESEQTM em vez da base de dados de NCBI. As colunas "Comprimento de DNA Dúvida" e "Comprimento de Proteína Dúvida" referem-se ao número de nucleotídeos ou ao número de aminoácidos, respectivamente, na sequência como fornecida aqui que foi procurada ou interrogada em comparação com a base de dados NCBI ou GENESEQTM. As colunas "Comprimento de DNA de GE- NESEQTM ou NR" e " Comprimento de Proteína GENESEQTM ou NR" referem-se ao número de nucleotídeos ou ao número de aminoácidos, respectivamente, na sequência da combinação de topo da pesquisa BLAST. Os resultados fornecidos nestas colunas são da pesquisa que retornou o Evalor inferior, ou da base de dados de NCBI ou da base de dados de Geneseq. As colunas "GENESEQTM/% de ID de Proteína de NR" e "GENESEQTM/% de ID de DNA de NR" referem-se ao percentual de identidade de sequência entre a sequência como fornecida aqui e a sequência da combinação de BLAST de topo. Os resultados fornecidos nestas colunas são da pesquisa que retornou o Evalor inferior, ou da base de dados de NCBI ou da base de dados de GENESEQTM.

Sequências homólogas também incluem sequências de RNA, em que as uridinas substituem as timinas nas sequências de ácido nucleico. As sequências homólogas podem ser obtidas usando quaisquer dentre os procedimentos descritos aqui ou podem resultar da correção de um erro de sequência. Será apreciado que as sequências de ácido nucleico aqui menci-onadas, podem ser representadas no formato de caractere simples tradicional (Veja, por exemplo, Stryer, Lubert. Biochemistry, 3a Ed.,W. H Freeman & Co., Nova Iorque.) ou qualquer outro formato que registra a identidade dos nucleotídeos em uma sequência.

Vários programas de comparação de sequência aqui identificados e conhecidos por alguém de experiência na técnica podem ser usados para comparação de sequências. Identidades de sequência de ácido nuclei- co e/ou proteína (homologias) podem ser avaliadas usando qualquer dentre uma variedade de algoritmos de comparação de sequência e programas conhecidos na técnica. Tais algoritmos e programas incluem, porém não são limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA e CLUSTALW (Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444 - 2448, 1988; Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215(3):403 - 410, 1990; Thompson e outros, Nucleic Acids Res. 22(2):4673 - 4680, 1994; Higgins e outros, Methods Enzymol. 266:383 - 402, 1996; Altschul e outros, J. Mol. Biol. 215(3):403 - 410, 1990; Altschul e outros, Nature Genetics 3:266 - 272, 1993).

Homologia ou identidade pode ser medida usando software de análise de sequência (por exemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tal software compara sequências similares designando-se graus de homologia em várias deleções, substituições e outras modificações. Os termos "homologia" e "identidade" no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeo ou ácidos nuclei- cos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências, que são as mesmas ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos, que são os mesmos quando comparados e alinhados quanto à correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou região designada, como avaliada usando qualquer número de algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência pode agir como uma sequência de referência (por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico exemplar como aqui fornecido), em que as sequências teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, sequências de referência e teste são registradas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. Parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência em seguida calcula as identidades de sequência percentuais para as sequências teste relativas à sequência de referência, baseada nos parâmetros de programa.

Uma "janela de comparação", quando usada aqui, inclui referência a um segmento de qualquer um do número de resíduos contíguos. Por exemplo, em aspectos alternativos como aqui fornecidos, resíduos contíguos que variam em qualquer momento de 20 ao tamanho natural de uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo exemplar, são comparados a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências são idealmente alinhadas. Se a sequência de referência tem a identidade de sequência requisito para uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo exemplar, por exemplo, em aspectos alternativos, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou sequência de identidade completa (100%) para uma sequência de ácido nu- cleico ou polipeptídeo exemplar como aqui fornecido, cuja sequência está dentro do escopo como aqui fornecido. Em modalidades alternativas, subse- quências que variam de cerca de 20 a 600, cerca de 50 a 200, e cerca de 100 a 150 são comparadas a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas depois que as duas sequências estiverem ideal- mente alinhadas.

Métodos de alinhamento de sequência para comparação, são bem-conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Walterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. 48: 443, 1970, pela pesquisa para o método de similaridade de Person & Lipman, Proc. Na- t'l, Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Winconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por alinhamento manual e inspeção visual. Outros algoritmos para determinar a homologia ou identidade incluem, por exemplo, além de um programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool no National Center for Biological Information), ALIGN, AMAS (Analysis of Multiply Aligned Sequences), AMPS (Protein Multiple Sequence Alignment), ASSET (Aligned Segment Statistical Evaluation Tool), BANDS, BESTSCOR, BIOSCAN (Biological Sequence Comparative Analysis Node), BLIMPS (BLocks IMProved Searcher), FASTA, Intervals & Points, BMB, CLUSTAL V, CLUSTAL W, CONSENSUS, LCONSENSUS, WCONSENSUS, algoritmo de SmithWaterman, DARWIN, algoritmo de Las Vegas, FNAT (Forced Nucleotide Alignment Toll), Framealign, Framesearch, DYNAMIC, FILTER, FSAP (Fris- tensky Sequence Analysis Package), GAP (Global Alignment Program), GENAL, GIBBS, GenQuest, ISSC (Sensitive Sequence Comparison), LALIGN (Local Sequence Alignment), LCP (Local Content Program), MACAW (Multiple Alignment Construction & Analysis Workbench), MAP (Multiple Alignment Program), MBLKP, MBLKN, PIMA (Pattern-Induced Multisequence Alignment), SAGA (Sequence Alignment by Genetic Algorithm) e WHAT-IF. Tais programas de alinhamento também podem ser usados para avaliar bases de dados de genoma para identificar as sequências de polinu- cleotídeos tendo sequências substancialmente idênticas. Várias bases de dados de genoma estão disponíveis, por exemplo, uma porção substancial do genoma humano está disponível como parte do Projeto de Sequencia- mento de Genoma Humano (Gibbs, 1995). Vários genomas foram sequenci- ados, por exemplo, M. genitalium (Fraser e outro, 1995), M. jannaschii (Bult e outro, 1996), H. influenzae (Fleishmann e outro, 1995), E. coli (Blattner e outro, 1997) e levedura (S. cerevisiae) (Mewes e outro, 1997) e D. melano- gaster (Adams e outro, 2000). Progresso significante também foi feito no se- quenciamento dos genomas de organismos modelo, tal como camundongo, C. elegans e Arabadopsis sp. Bases de dados contendo informação genômi- ca anotadas com alguma informação funcional são mantidas por organização diferente, e são acessíveis por meio da internet.

Algoritmos BLAST, BLAST 2.0 e BLAST 2.2.2 também são usados. Eles são descritos, por exemplo, em Altschul (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Software para realizar análises de BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificar os pares de sequência de classificação elevada (HSPs) identificando-se palavras curtas de comprimento W na sequência dúvida, que compara ou satisfaz algum escore limiar de valor positivo T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como o limiar de escore de palavra adjacente (Altschul (1990), supra). Estes choques de palavra adjacente inicial agem como sementes para iniciar as pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo-as. Os choques de palavra são prolongados em ambas as direções ao longo de cada sequência, visto que o escore de alinhamento cumulativo pode ser aumentado. Escores cumulativos são calculados, usando, para sequências de nu- cleotídeo, os parâmetros M (escore de recompensa para um par de resíduos de adaptação; sempre > 0). Para sequências de aminoácido, uma matriz de classificação é usada para calcular o escore cumulativo. A extensão dos choques de palavras em cada direção é detida quando: o escore de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor máximo obtido; o escore cumulativo parte de zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa; ou o final de cada sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determi- nam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como padrões, um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos. Para sequências de aminoácido, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra de 3 e expectativas (E) de 10 e os alinhamentos de matriz de classificação BLOSUM62 (B) (veja Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (veja, por exemplo, Karlin & Altschul (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873). Uma medida da similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de soma menor (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma comparação entre duas sequências de aminoácido ou nucleotídeo ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência, se a probabilidade de soma menor em uma comparação do ácido nucleico teste ao ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,2, ou alternativamente, menor do que cerca de 0,01 ou alternativamente, menor do que cerca de 0,001.

Em um aspecto, as homologias de sequência de ácido nucleico e proteína são avaliadas usando a Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"). Por exemplo, cinco programas BLAST específicos podem ser usados para realizar a seguinte tarefa: (1) BLASTP e BLAST3 comparam uma sequência dúvida de aminoácido contra uma base de dados de sequência de proteína; (2) BLASTN compara uma sequência dúvida de nucleo- tídeo contra uma base de dados de sequência de nucleotídeo; (3) BLASTX compara os produtos de translação conceptual de seis estruturas de uma sequência de nucleotídeo dúvida (ambos os filamentos) contra uma base de dados de sequência de proteína; (4) TBLASTN compara uma sequência de proteína dúvida contra uma base de dados de sequência de nucleotídeo transladada em todas as seis estruturas de leitura (ambos os filamentos); e (5) TBLASTX compara as translações de seis estruturas de uma sequência dúvida de nucleotídeo contra as translações de seis estruturas de uma base de dados de sequência de nucleotídeo.

Em um aspecto, os programas BLAST identificam sequências homólogas identificando-se segmentos similares, que são referidos aqui como "pares de segmentos de classificação elevada," entre uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido dúvida e uma sequência teste que é alternativamente obtida de uma base de dados de sequência de ácido nucleico ou proteína. Pares de segmento de classificação elevada são alternativamente identificados (isto é, alinhados) por meio de uma matriz de classificação, muitos dos quais são conhecidos na técnica. Em um aspecto, a matriz de classificação usada é a matriz BLOSUM62 (Gonnet e outro, Science 256: 1443 - 1455, 1992; Henikoff e Henikoff, Proteins 17:46 - 61, 1993). Em um aspecto, as matrizes PAM ou PAM250 também podem ser usadas (veja, por exemplo, Schwartz e Dayhoff, eds., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).

Em um aspecto, para determinar se um ácido nucleico tem a identidade de sequência requerida para estar dentro do escopo como aqui fornecido, os programas NCBI BLAST 2.2.2 são usados, opções básicas para blastp. Há cerca de 38 opções de parâmetro no programa BLAST 2.2.2. Neste aspecto exemplar como aqui fornecido, todos os valores básicos são usados a não ser que o parâmetro de filtragem básico (isto é, todos os parâmetros fixados em básico exceto a filtragem que é fixada em OFF); em seu lugar um parâmetro "-F F" é usado, que incapacita a filtragem. O uso de filtragem básica frequentemente resulta em violações de Karlin-Altschul devido ao comprimento curto da sequência.

Os valores básicos usados neste aspecto exemplar como aqui fornecido, incluem: "Filtro para baixa complexidade: ON Tamanho de Palavra: 3 Matriz: Blosum62 Custos de abertura: Existência:11 Extensão:1"

Outros parâmetros básicos são: filtro para baixa complexidade OFF, tamanho de palavra de 3 para proteína, matriz BLOSUM62, penalidade de existência de abertura de -11 e uma penalidade de extensão de abertura de -1. Em um aspecto, a opção "-W" padroniza em 0. Isto significa que, se não ajustar, o tamanho de palavra padroniza-se em 3 para proteínas e 11 para nucleotídeos.

Sistemas de computador e produtos de programa de computação

Para determinar e identificar as identidades de sequência, homo- logias estruturais, motivos e similares in silico, a sequência como aqui fornecida pode ser armazenada, recuperada e manipulada em qualquer meio, que pode ser lido e acessado por um computador. Em certas modalidades, são aqui fornecidos computadores, sistemas de computador, meios legíveis por computador, produtos de programa de computador e similares, contendo nestes (compreendendo) sequências de polipeptídeo e ácido nucleico como aqui fornecido, registradas ou armazenadas neles. Quando usado aqui, as palavras "registrado" e "armazenado" referem-se a um processo para armazenar informação em um meio de computador. Um técnico versado pode facilmente adotar quaisquer métodos conhecidos para registrar informação em um meio legível de computador para gerar fabricações compreendendo uma ou mais sequências de polipeptídeo e/ou ácido nucleico como aqui fornecido.

Outro aspecto como aqui fornecido é um meio legível de computador tendo registrado nesse, pelo menos uma sequência de ácido nucleico e/ou polipeptídeo como aqui fornecido. Meios legíveis de computador incluem meios magneticamente legíveis, meios opticamente legíveis, meios eletronicamente legíveis e meios magnéticos / ópticos. Por exemplo, os meios legíveis de computador podem ser um disco rígido, um disco flexível, uma fita magnética, CD-ROM, Disco Versátil Digital (DVD), Memória de Acesso Aleatório (RAM) ou Memória Exclusiva de Leitura (ROM), bem como outros tipos de outros meios conhecidos por aqueles versados na técnica.

Os aspectos como aqui fornecidos, incluem sistemas (por exemplo, sistemas com base na internet), particularmente sistemas de computador, que armazenam e manipulam as sequências e informação de sequência descritas aqui. Um exemplo de um sistema de computador 100 é ilustrado na forma de digrama de bloco na figura 1. Quando usado aqui, "um sistema de computador" refere-se aos componentes de hardware, componentes de software e componentes de armazenagem de dados usados para analisar uma sequência de nucleotídeo ou polipeptídeo como aqui fornecido. O sistema de computador 100 pode incluir um processador para processar, acessar e manipular os dados da sequência. O processador 105 pode ser qualquer tipo bem-conhecido da unidade de processamento central, tal como, por exemplo, o Pentium III da Intel Corporation, ou processador similar de Sun, Motorola, Compaq, AMD ou International Business Machines. O sistema de computador 100 é um sistema de propósito geral, que compreende o processador 105 e um ou mais componentes de armazenagem de dados internos 110 para armazenar dados, e um ou mais dispositivos de correção de dados para corrigir os dados armazenados nos componentes de armazenagem de dados. Um técnico versado pode facilmente apreciar que qualquer um dos sistemas de computador atualmente disponíveis é adequado.

Em um aspecto, o sistema de computador 100 inclui um processador 105 conectado em um barramento que é conectado em uma memória principal 115 (alternativamente implementada como RAM) e um ou mais dispositivos de armazenagem de dados internos 110, tais como uma unidade rígida e/ou outros meios legíveis de computador tendo dados registrados nesses. O sistema de computador 100 também pode incluir um ou mais dispositivos de correção de dados 118 para ler os dados armazenados nos dispositivos de armazenagem de dados internos 110. O dispositivo de correção de dados 118 pode representar, por exemplo, uma unidade de disco flexível, uma unidade de disco compacto, uma unidade de fita magnética ou um modem capaz de uma conexão em um sistema de armazenagem de dados remotos (por exemplo, por meio da internet), etc. Em algumas modalidades, o dispositivo de armazenagem de dados interno 110 é um meio legível de computador removível tal como um disco flexível, um disco compacto, uma fita magnética, etc. contendo lógica de controle e/ou dados registrados nesse. O sistema de computador 100 pode vantajosamente incluir ou ser programado por software apropriado para ler a lógica de controle e/ou os dados do componente de armazenagem de dados logo que inseridos no dispositivo de correção de dados. O sistema de computador 100 inclui uma exibição 120, que é usada para exibir a produção para um usuário de computador. Deve também ser notado que, o sistema de computador 100 pode ser ligado a outros sistemas de computador 125a-c em uma rede ou rede de área ampla para fornecer o acesso centralizado ao sistema de computador 100. O software para acessar e processar as sequências de nucleotídeo ou amino- ácido como aqui fornecido, pode residir em uma memória principal 115 durante a execução. Em alguns aspectos, o sistema de computador 100 também pode compreender um algoritmo de comparação de sequência, para comparar uma sequência de ácido nucleico como aqui fornecido. O algoritmo e sequência(s) podem ser armazenado(s) em um meio legível de computador. Um "algoritmo de comparação de sequência" refere-se a um ou mais programas, que são implementados (localmente ou remotamente) no sistema de computador 100, para comparar uma sequência de nucleotídeo com outras sequências de nucleotídeo e/ou compostos armazenados dentro de um meio de armazenagem de dados. Por exemplo, o algoritmo de comparação de sequência pode comparar as sequências de nucleotídeo como aqui fornecido, armazenadas em um meio legível de computador em sequências de referência armazenadas em um meio legível de computador para identificar homologias ou motivos estruturais.

Os parâmetros usados com os algoritmos acima podem ser adaptados dependendo do comprimento de sequência e grau de homologia estudado. Em alguns aspectos, os parâmetros podem ser os parâmetros básicos usados pelos algoritmos na ausência de instruções do usuário. A figura 2 é um diagrama de fluxo que ilustra um aspecto de um processo 200 para comparar uma nova sequência de proteína ou nucleotídeo com uma base de dados de sequências, a fim de determinar os níveis de homologia entre a nova sequência e as sequências na base de dados. A base de dados de sequências pode ser uma base de dados privada armazenada dentro do sistema de computador 100, ou uma base de dados pública tal como GENBANK, que está disponível através da Internet. O processo 200 começa em um estado de origem 201 e em seguida desloca para um estado 202, em que a nova sequência a ser comparada é armazenada em uma memória em um sistema de computador 100. Como discutido anteriormente, a memória pode ser qualquer tipo de memória, incluindo RAM ou um dispositivo de armazenagem interna. O processo 200 em seguida desloca para um estado 204, em que a base de dados de sequência é aberta para análise e comparação. O processo 200 em seguida desloca-se para um estado 206, em que a primeira sequência armazenada na base de dados é lida em uma memória no computador. Uma comparação é em seguida realizada em um estado 210 para determinar se a primeira sequência é igual à segunda sequência. É importante notar que esta etapa não está limitada a realizar uma comparação exata entre a nova sequência e a primeira sequência na base de dados. Métodos bem-conhecidos são conhecidos por aqueles de experiência na técnica, para comparar duas sequências de proteína ou nucleotídeo, ainda que elas não sejam idênticas. Por exemplo, os intervalos podem ser introduzidos em uma sequência a fim de aumentar o nível de homologia entre as duas sequências testadas. Os parâmetros que controlam se as aberturas ou outras características são introduzidas em uma sequência durante a comparação, são normalmente registrados pelo uso do sistema de computador. Lo go que uma comparação das duas sequências foi realizada no estado 210, uma determinação é feita em um estado de decisão 210, se as duas sequências forem iguais. Certamente, o termo "mesmas" não está limitado às sequências que são absolutamente idênticas. As sequências que estão dentro dos parâmetros de homologia registrados pelo usuário, serão marcadas como "mesmas" no processo 200. Se uma determinação é feita, que as duas sequências sejam as mesmas, o processo 200 desloca para um estado 214, em que o nome da sequência da base de dados é exibido ao usuário. Este estado notifica ao usuário que a sequência com o nome exibido preenche os constrangimentos de homologia que foram registrados. Logo que o nome da sequência armazenada é exibido ao usuário, o processo 200 desloca para um estado de decisão 218, em que uma determinação é feita se mais sequências existem na base de dados. Se mais nenhuma sequência existe na base de dados, então o processo 200 termina em um estado final 220. Entretanto, se existem mais sequências na base de dados, então o processo 200 desloca para um estado 224, em que um indicador é deslocado para a próxima sequência na base de dados, de modo que possa ser comparada à nova sequência. Desta maneira, a nova sequência é alinhada e comparada com cada sequência na base de dados. Deve ser notado que se uma determinação foi feita no estado de decisão 212, em que as sequências não foram homólogas, então o processo 200 deslocaria imediatamente para o estado de decisão 218 a fim de determinar se quaisquer outras sequências estariam disponíveis na base de dados para comparação. Consequentemente, um aspecto como aqui fornecido, é um sistema de computador compreendendo um processador, um dispositivo de armazenagem de dados tendo armazenado nisso uma sequência de ácido nucleico como aqui fornecido, e um comparador de sequência para conduzir a comparação. O comparador de sequência pode indicar um nível de homologia entre as sequências comparadas ou identificar motivos estruturais, ou pode identificar motivos estruturais em sequências que são comparadas àqueles códigos de ácido nuclei- co e códigos de polipeptídeo. A figura 3 é um diagrama de fluxo que ilustra uma modalidade de um processo 250 em um computador para determinar se duas sequências são homólogas. O processo 250 começa em um estado de origem 252 e em seguida desloca para um estado 254, em que uma primeira sequência a ser comparada é armazenada em uma memória. A segunda sequência a ser comparada é então armazenada em uma memória em um estado 256. O processo 250 em seguida move-se para um estado 260, em que o primeiro caractere na primeira sequência é lido e em seguida para um estado 262, em que o primeiro caractere da segunda sequência é lido. Deve ser entendido que se a sequência é uma sequência de nucleotí- deo, então o caractere normalmente seria A, T, C, G ou U. Se a sequência é uma sequência de proteína, então pode ser um código de aminoácido de letra única a fim de que as primeira e segunda sequências possam ser facilmente comparadas. Uma determinação é então feita em um estado de decisão 264, se os dois caracteres forem os mesmos. Se eles forem os mesmos, então o processo 250 desloca para o estado 268, em que os próximos caracteres nas primeira e segunda sequências são lidos. Uma determinação é então feita se os próximos caracteres forem os mesmos. Se eles forem, então o processo 250 continua nesta alça até que os dois caracteres não sejam os mesmos. Se uma determinação é feita, que os próximos dois caracteres são iguais, o processo 250 desloca para um estado de decisão 274 para determinar se existem mais quaisquer caracteres ou sequência a ler. Se não existem mais quaisquer caracteres a ler, então o processo 250 desloca-se para um estado 276 onde o nível de homologia entre as primeira e segunda sequências é exibido ao usuário. O nível de homologia é determinado calculando-se a proporção de caracteres entre as sequências que foram as mesmas do número total de sequências na primeira sequência. Desse modo, se cada caractere em uma primeira sequência de 100 nucleotídeos alinhada com cada caractere em uma segunda sequência, o nível de homologia seria 100%.

Alternativamente, o programa de computador pode comparar uma sequência de referência a uma sequência como fornecido aqui para determinar se a sequência difere-se em uma ou mais posições. O programa pode registrar o comprimento e identidade de nucleotídeos inseridos, deleta- dos ou substituídos com respeito à sequência de referência ou uma sequência como fornecido aqui. O programa de computador pode ser um programa que determina se uma sequência de referência contém um polimorfismo de nucleotídeo simples (SNP) com respeito a uma sequência como fornecido aqui, ou, se uma sequência como fornecido aqui compreende um SNP de uma sequência conhecida. Desse modo, em alguns aspectos, o programa de computador é um programa que identifica SNPs. O método pode ser implementado pelos sistemas de computador descritos anteriormente e o método ilustrado na figura 3. O método pode ser realizado lendo-se uma se- quência como fornecido aqui e as sequências de referência através do uso do programa de computador e identificando-se diferenças com o programa de computador.

Em outros aspectos, o sistema com base no computador compreende um identificador para identificar aspectos dentro de um ácido nu- cleico ou polipeptídeo como fornecido aqui. Um "identificador" refere-se a um ou mais programas que identificam certas características dentro de uma sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um identificador pode compreender um programa que identifica uma estrutura de leitura aberta (ORF) em um ácido nucleico. A figura 4 é um diagrama de fluxo ilustrando um aspecto de um processo identificador 300 para detectar a presença de uma característica em uma sequência. O processo 300 começa em um estado de origem 302 e em seguida desloca-se para um estado 304 onde uma primeira sequência que deve ser checada quanto às características é armazenada em uma memória 115 no sistema de computador 100. O processo 300 em seguida desloca-se para um estado 306 onde uma base de dados de características de sequência é aberta. Uma tal base de dados incluiria uma lista de cada atributo da característica junto do nome característico. Por exemplo, um nome característico pode ser "Códon de Iniciação" e o atributo seria "ATG". Outro exemplo seria o nome característico "Caixa TAATAA" e o atributo de característica seria "TAATAA". Um exemplo de uma tal base de dados é produzido pela University of Winconsin Genetics Computer Group. Alternativamente, as características podem ser motivos de polipeptídeo estruturais tais como alfa hélices, beta lâminas, ou motivos de polipeptídeo funci-onais tais como sítios ativos enzimáticos, motivos de hélice-giro-hélice ou outros motivos conhecidos por aqueles versados na técnica. Logo que a base de dados de características é aberta no estado 306, o processo 300 desloca-se para um estado 308 onde a primeira característica é lida a partir da base de dados. Uma comparação do atributo da primeira característica com a primeira sequência é então feita em um estado 310. Uma determinação é então feita em um estado de decisão 316 se o atributo da característica foi encontrado na primeira sequência. Se o atributo foi encontrado, então o pro- cesso 300 desloca-se para um estado 318 onde o nome da característica encontrada é exibido ao usuário. O processo 300 em seguida desloca-se para um estado de decisão 320 onde uma determinação é feita se as características de movimento existem na base de dados. Se não existem mais características, então o processo 300 termina em um estado final 324. Entretanto, se existem mais características na base de dados, então o processo 300 lê a próxima característica da sequência em um estado 326 e alças traseiras ao estado 310 onde o atributo do próximo aspecto é comparado contra a primeira sequência. Se o atributo da característica não é encontrado na primeira sequência no estado de decisão 316, o processo 300 desloca-se diretamente ao estado de decisão 320 a fim de determinar se quaisquer mais aspectos existem na base de dados. Desse modo, em um aspecto, um programa de computador que identifica estruturas de leitura aberta (ORFs).

Uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo como fornecida aqui pode ser armazenada e manipulada em uma variedade de programas de processador de dados em uma variedade de formatos. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser armazenada como texto em um arquivo de processamento de palavra, tal como MICROSOFTWORDTM ou WORDPERFECTTM ou como um arquivo ASCII em uma variedade de programas de base de dados familiares àqueles de experiência na técnica, tal como DB2, SYBASE, ou ORACLETM. Além disso, muitos programas de computador e bases de dados podem ser usados como algoritmos de comparação de sequência, identificadores, ou fontes de sequências de nucleotí- deo de referência ou sequências de polipeptídeo a serem comparadas em uma sequência de ácido nucleico como fornecida aqui. Os programas e base de dados podem compreender: MACPATTERN™ (EMBL), DISCOVERYBASE™ (Molecular Applications Group), GENEMINE™ (Molecular Applications Group), LOOK™ (Molecular Applications Group), MACLOOK™ (Molecular Applications Group), BLAST and BLAST2 (NCBI), BLASTN and BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403, 1990), FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988), FASTDB™ (Brutlag et al. Comp. App. Biosci. 6:237-245, 1990), CATALYST™ (Molecular Simulations Inc.), CATALYST™/SHAPE™ (Molecular Simulations Inc.), CERI- US2.DBACCESS™ (Molecular Simulations Inc.), HYPOGEN™ (Molecular Simulations Inc.), Insight II, (Molecular Simulations Inc.), DISCOVER™ (Molecular Simulations Inc.), CHARMm™ (Molecular Simulations Inc.), FELIX™ (Molecular Simulations Inc.), DELPHI™s (Molecular Simulations Inc.), QUANTEMM™, (Molecular Simulations Inc.), HOMOLOGY™ (Molecular Simulations Inc.), MODELER™ (Molecular Simulations Inc.), ISIS™ (Molecular Simulations Inc.), Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ (Molecular Simulations Inc.), WEBLAB™ Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.), GENE EXPLORER™ (Molecular Simulations Inc.), SEQFOLD™ (Molecular Simulations Inc.), a base de dados de MDL Available Chemicals Directory, a base de dados de MDL Drug Data Report, a base de dados de Comprehensive Medicinal Chemistry, a base de dados de Derwent's World Drug Index, a base de dados de BioByteMasterFile, a base de dados de Genbank, e a base de dados de Genseqn. Muitos outros programas e base de dados seriam evidentes por aqueles de experiência na técnica apresentaram a descrição presente.

Motivos que podem ser detectados usando os programas anteriores incluem sequências codificando zíperes de leucina, motivos de hélice- giro-hélice, sítios de glicosilação, sítios de ubiquitinação, alfa hélices e beta lâminas, sequências de sinal codificando os peptídeos de sinal que direcionam a secreção das proteínas codificadas, sequências implicadas no regulamento de transcrição tais como homeocaixas “homeoboxes”, distensões acídicas, sítios ativos enzimáticos, sítios de ligação de substrato e sítios de clivagem enzimáticos.

Hibridização de ácidos nucleicos

Em certas modalidades, fornecidos aqui são ácidos nucleicos isolados, sintéticos ou recombinantes que hibridizam sob condições rigorosas para ácido nucleico fornecido aqui, por exemplo, uma sequência exemplar fornecida aqui, por exemplo, uma sequência como mencionada em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 ou SEQ ID NO:23, ou SEQ ID NO:1 modificada para codificar uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (várias) ou todas as variações de base descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23, ou o equivalente da mesma, e subsequências e sequências complementares das mesmas, ou um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo como fornecido aqui. As condições rigorosas podem ser condições altamente rigorosas, condições rigorosas médias e/ou condições rigorosas baixas, incluindo as condições de severidade reduzida e alta descritas aqui. "Hibridização" refere-se ao processo pelo qual um filamento de ácido nucleico liga-se com um filamento complementar através de empare- lhamento de base. As reações de hibridização podem ser sensíveis e seletivas a fim de que uma sequência particular de interesse possa ser identificada mesmo em amostras nas quais ela está presente em baixas concentrações. As condições rigorosas podem ser definidas, por exemplo, pelas concentrações de sal ou formamida nas soluções de pré-hibridização e hibridi- zação, ou pela temperatura de hibridização, e são bem-conhecidas na técnica. Por exemplo, a rigorosidade pode ser aumentada reduzindo-se a concentração de sal, aumentando-se a concentração de formamida, ou elevando-se a temperatura de hibridização, alternando-se o tempo de hibridização, como descrito em detalhes abaixo. Em aspectos alternativos, os ácidos nu- cleicos como fornecidos aqui são definidos por sua capacidade de hibridizar sob várias condições de rigorosidade (por exemplo, elevada, média ou baixa), como aqui mencionado.

Em modalidades alternativas, ácidos nucleicos como fornecidos aqui como definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições rigorosas podem estar entre cerca de cinco resíduos e o tamanho natural de ácido nucleico como fornecido aqui; por exemplo, eles podem ser 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou mais, resíduos no comprimento. Ácidos nucleicos mais curtos do que o tamanho natural são também incluídos. Estes ácidos nucleicos podem ser úteis como, por exemplo, sondas de hibridização, sondas de rotulagem, sondas de oligonu- cleotídeo de PCR, iRNA, antissentido ou sequências codificando peptídeos de ligação de anticorpo (epitopos), motivos, sítios ativos e similares.

Em um aspecto, os ácidos nucleicos como fornecidos que são definidos por sua capacidade de hibridizar sob alta severidade compreendendo condições de cerca de formamida a 50% em cerca de 37oC a 42oC. Em um aspecto, ácidos nucleicos como fornecidos aqui são definidos por sua capacidade de hibridizar sob severidade reduzida compreendendo condições em cerca de 35% a 25% de formamida em cerca de 30oC a 35oC.

Alternativamente, os ácidos nucleicos como fornecidos aqui são definidos por sua capacidade de hibridizar sob alta severidade compreendendo condições em 42oC em formamida a 50%, 5X SSPE, SDS a 0,3%, e um ácido nucleico de bloqueio de sequência repetitiva, tal como cot-1 ou DNA de esperma de salmão (por exemplo, 200 n/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e cisalhado). Em um aspecto, os ácidos nucleicos como fornecidos aqui são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de severidade reduzida compreendendo formamida a 35% em uma temperatura reduzida de 35oC.

Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X SSC, SDS a 0,5% a 50°C. Estas condições devem ser consideradas condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização anterior é conduzida em formamida a 30%. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização anterior é conduzida em formamida a 10%.

A faixa de temperatura correspondente ao nível particular de ri-gorosidade pode ser também estreitada calculando-se a relação de purina para pirimidina do ácido nucleico de interesse e ajustando-se a temperatura adequadamente. Ácidos nucleicos como fornecidos aqui também são definidos por sua capacidade de hibridizar sob condições de severidade alta, média e baixa como mencionadas em Ausubel e Sambrook. Variações nas faixas anteriores e condições são bem-conhecidas na técnica. As condições de hibridização são discutidas também, abaixo.

O procedimento anterior pode ser modificado para identificar ácidos nucleicos tendo níveis decrescentes de homologia para a sequência da sonda. Por exemplo, para obter ácidos nucleicos de homologia decrescente à sonda detectável, condições menos rigorosas podem ser usadas. Por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em aumentos de 5oC de 68oC a 42oC em um tampão de hibridização tendo uma concentração de Na+ de aproximadamente 1M. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2X de SSC, SDS a 0,5% na temperatura de hibridização. Estas condições são consideradas condições "moderadas" acima de 50oC e condições "baixas" abaixo de 50oC. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização anterior é conduzida em 55oC. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização anterior é conduzida em 45oC.

Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6X de SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42oC. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em 5% de aumentos de 50% a 0% para identificar clones tendo níveis decrescentes de homologia para a sonda. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X de SSC, SDS a 0,5% em 50oC. Estas condições são consideradas condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização anterior é conduzida em formamida a 30%. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa severidade" é quando a hibridização anterior é conduzida em formamida a 10%.

Entretanto, a seleção de um formato de hibridização não é crítica - é a severidade das condições de lavagem que menciona as condições que determinam se um ácido nucleico está dentro do escopo como fornecido aqui. As condições de lavagem usadas para identificar ácidos nucleicos dentro do escopo como fornecido aqui incluem, por exemplo: uma concentração de sal de cerca de 0,02 molar em pH 7 e uma temperatura de pelo menos cerca de 50oC ou cerca de 55oC a cerca de 60oC; ou, uma concentração de sal de cerca de NaCl a 0,15 M em 72oC durante cerca de 15 minutos; ou, uma concentração de sal de cerca de 0,2X de SSC em uma temperatura de pelo menos cerca de 50oC ou cerca de 55oC a cerca de 60oC durante cerca de 15 a cerca de 20 minutos; ou, o complexo de hibridização é lavado duas vezes com uma solução com uma concentração de sal de cerca de 2X de SSC contendo SDS a 0,1% em temperatura ambiente durante 15 minutos e em seguida lavado duas vezes por 0,1X de SSC contendo SDS a 0,1% em 68oC durante 15 minutos; ou, condições equivalentes. Veja, Sambrook, Tijs- sen e Ausubel para uma descrição de tampão de SSC e condições equivalentes. Estes métodos podem ser usados para isolar ácidos nucleicos como fornecidos aqui.

Sondas de oligonucleotídeos e métodos para usá-las

Em certas modalidades, são fornecidas aqui sondas de ácido nucleico para identificar ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo com a atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. Em um aspecto, a sonda compreende pelo menos 10 bases consecutivas de um ácido nucleico como fornecido aqui. Alternativamente, uma sonda como fornecido aqui pode ser pelo menos cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais, ou cerca de 10 a 50, cerca de 20 a 60 cerca de 30 a 70, bases consecutivas de uma sequência como mencionado em um ácido nucleico como fornecido aqui. As sondas identificam um ácido nu- cleico por ligação e/ou hibridização. As sondas podem ser usadas em disposições como fornecido aqui, ver discussão abaixo, incluindo, por exemplo, disposições capilares. As sondas como fornecido aqui podem também ser usadas para isolar outros ácidos nucleicos ou polipeptídeos.

As sondas como fornecido aqui podem ser usadas para determinar se uma amostra biológica, tal como uma amostra de terra, contém um organismo tendo uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui (por exemplo, um ácido nucleico codificando hidrolase) ou um organismo do qual o ácido nucleico foi obtido. Em tais procedimentos, uma amostra biológica potencialmente abrigando o organismo do qual o ácido nucleico foi isolado é obtida e ácidos nucleicos são obtidos da amostra. Os ácidos nucleicos são contatados com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar a quaisquer sequências complementares presentes na amostra. Onde necessário, condições que permitem a sonda especificamente hibridizar às sequências complementares podem ser determinadas colocando-se a sonda em contato com sequências complementares de amostras conhecidas conter a sequência complementar, bem como controlar sequências que não contêm a sequência complementar. Condições de hibridização, tais como a concentração de sal do tampão de hibridização, a concentração de formamida do tampão de hibridização, ou a temperatura de hibridização, podem ser variadas para identificar condições que permitem a sonda hibridi- zar especificamente a ácidos nucleicos complementares (ver discussão sobre condições de hibridização específicas).

Se a amostra conter o organismo do qual o ácido nucleico foi isolado, hibridização específica da sonda será então detectada. Hibridização pode ser detectada rotulando-se a sonda com um agente detectável tal como um isótopo radioativo, um pigmento fluorescente ou uma enzima capaz de catalisar a formação de um produto detectável. Muitos métodos para usar as sondas rotuladas para detectar a presença de ácidos nucleicos complementares em uma amostra são familiares para aqueles versados na técnica. Estes incluem Southern Blots, Northern Blots, procedimentos de hibridização de colônia, e manchas de ponto. Protocolos para cada destes procedimentos são fornecidos em Ausubel e Sambrook.

Alternativamente, mais do que uma sonda (pelo menos uma da qual é capaz de especificamente hibridizar a quaisquer sequências complementares que estão presentes na amostra de ácido nucleico), pode ser usada em uma reação de amplificação para determinar se a amostra contém um organismo contendo uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui (por exemplo, um organismo do qual o ácido nucleico foi isolado). Em um aspecto, as sondas compreendem oligonucleotídeos. Em um aspecto, a rea- ção de amplificação pode compreender uma reação PCR. Protocolos de PCR são descritos em Ausubel e Sambrook (ver discussão sobre reações de amplificação). Em tais procedimentos, os ácidos nucleicos na amostra são contatados com as sondas, a reação de amplificação é realizada, e qualquer produto de amplificação resultante é detectado. O produto de amplificação pode ser detectado realizando-se eletroforese em gel nos produtos de reação e manchando o gel com um intercalador tal como brometo de etídio. Alternativamente, uma ou mais das sondas podem ser rotuladas com um isótopo radioativo e a presença de um produto de amplificação radioativo pode ser detectada por autorradiografia após eletroforese em gel.

Sondas derivadas de sequências perto das extremidades 3' ou 5' da sequência de ácido nucleico como fornecido aqui podem também ser usadas em procedimentos de caminhada de cromossomo para identificar clones contendo, por exemplo, sequências genômicas adicionais. Tais métodos permitem o isolamento de genes que codificam proteínas adicionais de interesse do organismo hospedeiro.

Em um aspecto, sequências de ácido nucleico como são fornecidas aqui usaram as sondas para identificar e isolar ácidos nucleicos relacionados. Em alguns aspectos, os ácido nucleicos relacionados desse modo identificados podem ser cDNAs ou DNAs genômicos de organismos exceto o organismo do qual o ácido nucleico como fornecido aqui foi primeiro isolado. Em tais procedimentos, uma amostra de ácido nucleico é contatada com a sonda sob condições que permitem a sonda especificamente hibridizar às sequências relacionadas. Hibridização da sonda para ácidos nucleicos do organismo relacionado é então detectada usando qualquer um dos métodos descritos acima.

Em reações de hibridização de ácido nucleico, as condições usadas para alcançar um nível particular de rigorosidade variarão, dependendo da natureza dos ácidos nucleicos a serem hibridizados, por exemplo, o tamanho, grau de complementaridade, composição de sequência de nu- cleotídeo (por exemplo, conteúdo de GC v. AT), e tipo de ácido nucleico (por exemplo, RNA v. DNA) das regiões de hibridização dos ácidos nucleicos po- dem ser consideradas na seleção de condições de hibridização. Uma consi-deração adicional é se um dos ácidos nucleicos é imobilizado, por exemplo, sobre um filtro. Hibridização pode ser realizada sob condições de baixa rigorosidade, moderada rigorosidade ou elevada rigorosidade. Como um exemplo de hibridização de ácido nucleico, uma membrana de polímero contendo ácidos nucleicos desnaturados imobilizados é primeiro pré-hibridizada durante 30 minutos a 45°C em uma solução consistindo em 0,9 M de NaCl, 50 mM de NaH2PO4, pH 7,0, 5,0 mM de Na2EDTA, SDS a 0,5%, 10X Denhardt's, e 0,5 mg/ml de ácido polirriboadenílico. Aproximadamente 2 X 107 cpm (atividade específica de 4-9 X 108 cpm/ug) de sonda de oligonucleotídeo de extremidade rotulada 32P são então adicionados à solução. Após 12-16 horas de incubação, a membrana é lavada durante 30 minutos em temperatura ambiente (RT) em 1X SET (150 mM de NaCl, 20 mM de cloridrato Tris, pH 7,8, 1 mM de Na2EDTA) contendo SDS a 0,5%, seguido por uma lavagem de 30 minutos em 1X SET fresco a Tm-10°C para uma sonda de oligonucle- otídeo. A membrana é então exposta ao filme autorradiográfico para detecção de sinais de hibridização.

Variando-se a rigorosidade das condições de hibridização usadas para identificar ácidos nucleicos, tais como cDNAs ou DNAs genômicos, que hibridizam à sonda detectável, ácidos nucleicos tendo diferentes níveis de homologia à sonda podem ser identificados e isolados. A rigorosidade pode ser variada conduzindo-se a hibridização em temperaturas variantes abaixo das temperaturas de fusão das sondas. A temperatura de fusão, Tm, é a temperatura (sob resistência iônica definida e pH) na qual 50% da sequência-alvo hibridizam a uma sonda perfeitamente complementar. Condições muito rigorosas são selecionadas ser iguais a ou cerca de 5°C menor do que a Tm para uma sonda particular. A temperatura de fusão da sonda pode ser calculada usando as seguintes fórmulas exemplares. para sondas entre 14 e 70 nucleotídeos em tamanho, a temperatura de fusão (Tm) é calculada usando a fórmula: Tm=81,5+16,6(log [Na+])+0,41(fração G+C)- (600/N) onde N é o tamanho da sonda. Se a hibridização for realizada em uma solução contendo formamida, a temperatura de fusão pode ser calcula- da usando a equação: Tm=81,5+16,6(log [Na+])+0,41(fração G+C)-(0,63% de formamida)-(600/N) onde N é o tamanho da sonda. Pré-hibridização pode ser realizada em 6X SSC, 5X reagente de Denhardt, SDS a 0,5%, 100 μg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado ou 6X SSC, 5X reagente de Denhardt, SDS a 0,5%, 100 μg de DNA de esperma de salmão fragmentado desnaturado, 50% de formamida. Fórmulas para SSC e Denhardt e outras soluções são listadas, por exemplo, em Sambrook.

Em um aspecto, hibridização é conduzida adicionando-se a sonda detectável às soluções de pré-hibridização listadas acima. Onde a sonda compreende DNA de filamento duplo, ele é desnaturado antes da adição à solução de hibridização. O filtro é contatado com a solução de hibridização durante um período de tempo suficiente para permitir a sonda hibridizar a cDNAs ou DNAs genômicos contendo sequências complementares a eles ou homólogas a eles. Para sondas acima de 200 nucleotídeos de comprimento, a hibridização pode ser realizada a 15-25°C abaixo da Tm. Para sondas mais curtas, tais como sondas de oligonucleotídeo, a hibridização pode ser conduzida a 5-10°C abaixo da Tm. Em um aspecto, hibridizações em 6X SSC são conduzidas em aproximadamente 68°C. Em um aspecto, hibridiza- ções em 50% de formamida contendo soluções são conduzidas em aproximadamente 42°C. Todas as hibridizações precedentes seriam consideradas estar sob condições de elevada rigorosidade.

Em um aspecto, após a hibridização, o filtro é lavado para remover qualquer sonda detectável não especificamente ligada. A rigorosidade usada para lavar os filtros pode também ser variada dependendo da natureza dos ácidos nucleicos a serem hibridizados, o tamanho dos ácidos nuclei- cos a serem hibridizados, o grau de complementaridade, a composição de sequência de nucleotídeo (por exemplo, conteúdo de GC v. AT), e o tipo de ácido nucleico (por exemplo, RNA v. DNA). Exemplos de lavagens de condição de rigorosidade progressivamente maior são como a seguir: 2X SSC, SDS a 0,1% em temperatura ambiente durante 15 minutos (baixa rigorosidade); 0,1X SSC, SDS a 0,5% em temperatura ambiente durante 30 minutos a 1 hora (moderada rigorosidade); 0,1X SSC, SDS a 0,5% durante 15 a 30 minutos entre a temperatura de hibridização e 68°C (elevada rigorosidade); e 0,15 M de NaCl durante 15 minutos a 72°C (muito elevada rigorosidade). Uma lavagem de baixa rigorosidade final pode ser conduzida em 0,1X SSC em temperatura ambiente. Os exemplos acima são meramente ilustrativos de um grupo de condições que podem ser usadas para lavar filtros. Alguém versado na técnica saberia que existem numerosas receitas para diferentes lavagens de rigorosidade.

Ácidos nucleicos que se hibridizaram à sonda podem ser identificados por autorradiografia ou outras técnicas convencionais. O procedimento acima pode ser modificado para identificar ácidos nucleicos tendo níveis decrescentes de homologia à sequência da sonda, por exemplo, para obter ácidos nucleicos de homologia decrescente à sonda detectável, condições menos rigorosas podem ser usadas, por exemplo, a temperatura de hibridização pode ser diminuída em incrementos de 5°C de 68°C para 42°C em um tampão de hibridização tendo uma concentração de Na+ de aproximadamente 1 M. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com 2X SSC, SDS a 0,5% na temperatura de hibridização. Estas condições são consideradas ser condições "moderadas" acima de 50°C e condições "baixas" abaixo de 50°C. Um exemplo de condições "moderadas" de hibridização é quando a hibridização acima é conduzida a 55°C. Um exemplo de condições de hibridização de "baixa rigorosidade" é quando a hibridização acima é conduzida a 45°C.

Alternativamente, a hibridização pode ser realizada em tampões, tal como 6X SSC, contendo formamida em uma temperatura de 42°C. Neste caso, a concentração de formamida no tampão de hibridização pode ser reduzida em incrementos de 5% de 50% para 0% para identificar clones tendo níveis decrescentes de homologia à sonda. Após a hibridização, o filtro pode ser lavado com 6X SSC, SDS a 0,5% a 50°C. Estas condições são consideradas ser condições "moderadas" acima de 25% de formamida e condições "baixas" abaixo de 25% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização "moderadas" é quando a hibridização acima é conduzida em 30% de formamida. Um exemplo específico de condições de hibridização de "baixa rigorosidade" é quando a hibridização acima é conduzida em 10% de formamida.

Estas sondas e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para isolar, ou identificar (por exemplo, usando uma disposição), ácidos nucleicos tendo uma sequência com pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, de identidade de se quência para uma sequência de ácido nucleico como fornecido aqui com-preendendo pelo menos cerca de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, ou mais bases consecutivas dos mesmos, e as sequências complementares a eles. Homologia pode ser medida usando um algoritmo de alinhamento, como descrito aqui, por exemplo, os polinucleotídeos homólogos podem ter uma sequência de codificação que é uma variante alélica de ocorrência natural de uma das sequências de codificação descritas aqui. Tais variantes alélicas podem ter uma substituição, deleção ou adição de um ou mais nucleotídeos quando comparadas em um ácido nucleico como fornecido aqui.

Adicionalmente, as sondas e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para isolar, ou identificar (por exemplo, usando uma disposição), ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos tendo pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência (homologia) em um polipeptídeo como fornecido aqui compreendendo pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, ou 150 ou mais aminoácidos consecutivos dos mesmos como determinado usando um algoritmo de alinhamento de sequência, por exemplo, tal como o algoritmo FASTA versão 3.0t78 com os parâmetros default, ou um programa BLAST 2.2.2 com fixações exemplares como apresentado aqui.

Inibição de Expressão de Hidrolases

Em certas modalidades, são fornecidos aqui ácidos nucleicos complementares a (por exemplo, sequências antissentido a) as sequências de ácido nucleico como fornecido aqui, por exemplo, sequências codificando hidrolase. Sequências antissentido são capazes de inibir o transporte, junção ou transcrição de genes codificando hidrolase. A inibição pode ser executada através do alvejamento de DNA genômico ou RNA mensageiro. A inibição pode ser executada usando DNA, por exemplo, uma ribozima inibitória, ou um RNA, por exemplo, um iRNA de filamento duplo, compreendendo uma sequência como fornecido aqui. A transcrição ou função de ácido nucleico alvejado pode ser inibida, por exemplo, por hibridização e/ou clivagem. São fornecidos aqui grupos de inibidores compreendendo oligonucleotídeos capazes de ligar-se a gene de hidrolase e/ou mensagem, em qualquer caso prevenindo ou inibindo a produção ou função de hidrolase. A associação pode ser através de hibridização de sequência específica. Outra classe útil de inibidores inclui oligonucleotídeos que causam inativação ou clivagem de mensagem de hidrolase. O oligonucleotídeo pode ter atividade de enzima que causa tal clivagem, tais como ribozimas. O oligonucleotídeo pode ser quimicamente modificado ou conjugado a uma enzima ou composição capaz de clivar o ácido nucleico complementar. Alguém pode avaliar um pool de muitos diferentes tais oligonucleotídeos quanto àqueles com a atividade desejada.

Oligonucleotídeos Antissentido

Em certas modalidades, são fornecidos aqui oligonucleotídeos antissentido capazes de ligar-se à mensagem de hidrolase que pode inibir a atividade de hidrolase por alvejamento de mRNA ou DNA genômico. Estratégias para planejar oligonucleotídeos antissentido são bem descritas na literatura de patente e científica, e o técnico versado pode planejar tais oli- gonucleotídeos de hidrolase usando os novos reagentes como fornecido aqui, por exemplo, protocolos de caminhada de gene/mapeamento de RNA para avaliar quanto a oligonucleotídeos antissentido eficazes são bem- conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Ho (2000) Methods Enzymol. 314:168-183, descrevendo um ensaio de mapeamento de RNA, que é baseado em técnicas moleculares padrão para fornecer um método fácil e seguro para seleção de sequência antissentido potente. Ver também Smith (2000) Eur. J. Pharm. Sci. 11:191-198.

Em um aspecto, ácidos nucleicos de ocorrência natural recombi- nantemente gerados, ou, isolados são usados como oligonucleotídeos antis- sentido. Os oligonucleotídeos antissentido podem ser de qualquer tamanho; por exemplo, em aspectos alternativos, os oligonucleotídeos antissentido são entre cerca de 5 a 100, cerca de 10 a 80, cerca de 15 a 60, cerca de 18 a 40. Os oligonucleotídeos antissentido podem ser RNA ou DNA de filamento único ou filamento duplo. O tamanho ideal pode ser determinado por avaliação de rotina. Os oligonucleotídeos antissentido podem estar presentes em qualquer concentração. A concentração ideal pode ser determinada por avaliação de rotina. Uma ampla variedade de análogos de ácido nucleico e nucleotídeo não de ocorrência natural sintéticos são conhecidos os quais podem dirigir-se a este problema potencial, por exemplo, ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs) contendo esqueletos não iônicos, tais como unidades de N- (2-aminoetil) glicina podem ser usados. Oligonucleotídeos antissentido tendo ligações de fosforotioato podem também ser usados, como descrito em WO 97/03211; WO 96/39154; Mata (1997) Toxicol Appl Pharmacol 144:189-197; Antisense Therapeutics, ed. Agrawal (Human Press, Totowa, N.J., 1996). São fornecidos aqui oligonucleotídeos antissentido tendo análogos de esqueleto de DNA sintéticos, que também podem incluir ácidos nucleicos de fosforo-ditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno(metilimino), 3'-N-carbamato, e morfolino carbamato, como descrito acima.

Metodologia química combinatorial pode ser usada para criar vastos números de oligonucleotídeos que podem ser rapidamente avaliados quanto a oligonucleotídeos específicos que têm afinidades de ligação apropriadas e especificidades com respeito a qualquer alvo, tal como as sequências de hidrolase de sentido e antissentido como fornecido aqui (ver, por exemplo, Gold (1995) J. of Biol. Chem. 270:13581-13584).

Ribozimas Inibitórias

Em certas modalidades, são fornecidas aqui ribozimas capazes de ligar-se à mensagem de hidrolase que pode inibir a atividade de hidrolase por alvejamento de mRNA. Estratégias para planejar ribozimas e selecionar a sequência antissentido específica de hidrolase para alvejamento são bem- descritas na literatura de patente e científica, e o técnico versado pode planejar tais ribozimas usando os novos reagentes como fornecido aqui. Ribo- zimas agem por ligação a um RNA-alvo através da porção de ligação de RNA-alvo de uma ribozima que está agarrada em proximidade íntima a uma porção enzimática do RNA que cliva o RNA-alvo. Desse modo, a ribozima reconhece e liga-se a um RNA-alvo através de pareamento de base complementar, e uma vez ligada ao sítio correto, age enzimaticamente para clivar e inativar o RNA-alvo. Clivagem de um RNA-alvo de uma tal maneira destruirá sua capacidade de síntese direta de uma proteína codificada se a clivagem ocorrer na sequência de codificação. Após a ribozima ter ligado e clivado seu RNA-alvo, ela é tipicamente liberada daquele RNA e desse modo pode ligar e clivar novos alvos repetidamente.

Em algumas circunstâncias, a natureza enzimática de uma ribo- zima pode ser vantajosa sobre outras tecnologias, tal como tecnologia antis- sentido (onde uma molécula de ácido nucleico simplesmente liga-se em um alvo de ácido nucleico para bloquear sua transcrição, translação ou associação com outra molécula) quando a concentração eficaz de ribozima necessária para executar um tratamento terapêutico pode ser menor do que aquela de um oligonucleotídeo antissentido. Esta vantagem potencial reflete a capacidade da ribozima agir enzimaticamente. Desse modo, uma única molécula de ribozima é capaz de clivar muitas moléculas de RNA-alvo. Além disso, uma ribozima é tipicamente um inibidor altamente específico, com a especificidade de inibição dependendo não apenas do mecanismo de ligação de pareamento de base, porém também do mecanismo pelo qual a molécula inibe a expressão do RNA ao qual ela se liga. Isto é, a inibição é causada por clivagem do RNA-alvo e desse modo a especificidade é definida como a razão da taxa de clivagem do RNA alvejado sobre a taxa de clivagem de RNA não alvejado. Este mecanismo de clivagem é dependente de fatores adicionais àqueles envolvidos em pareamento de base. Desse modo, a especificidade de ação de uma ribozima pode ser maior do que aquela de ligação de oligonucleotídeo antissentido ao mesmo sítio de RNA.

A molécula de RNA de ribozima enzimática pode ser formada em um motivo de cabeça de martelo, porém pode também ser formada no motivo de um grampo de cabelo, vírus de hepatite delta, íntron de grupo I ou RNA semelhante a RNase P (em associação com uma sequência guia de RNA). Exemplos de tais motivos de cabeça de martelo são descritos por Rossi (1992) Aids Research and Human Retroviruses 8:183; motivos de grampo de cabelo por Hampel (1989) Biochemistry 28:4929, e Hampel (1990) Nuc. Acids Res. 18:299; o motivo de vírus de hepatite delta por Perrotta (1992) Biochemistry 31:16; o motivo de RNaseP por Guerrier-Takada (1983) Cell 35:849; e o intron de grupo I por Cech (Patente U.S. N° 4.987.071). A recitação destes motivos específicos não é pretendida ser limi- tante; aqueles versados na técnica reconhecerão que uma molécula de RNA enzimática como fornecida aqui pode ter um sítio de ligação de substrato específico complementar a uma ou mais das regiões de RNA de gene-alvo, e tem sequência de nucleotídeo dentro de ou circunjacente àquele sítio de ligação de substrato que concede uma atividade de clivagem de RNA à molécula.

Interferência de RNA (RNAi)

Em certas modalidades, são fornecidas aqui moléculas inibitórias de RNA, assim chamadas moléculas de "RNAi", compreendendo uma sequência de hidrolase como fornecido aqui. A molécula de RNAi pode compreender uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), por exemplo, siRNA e/ou miRNA. O RNAi pode inibir a expressão de um gene ou transcrição de hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou este- aratase). Em um aspecto, a molécula de RNAi, por exemplo, siRNA e/ou miRNA, é cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 ou mais nucleotídeos dúplex em tamanho. Ao mes- mo tempo que a invenção não é limitada por qualquer mecanismo de ação particular, o RNAi pode entrar em uma célula e causar a degradação de um RNA de filamento único (ssRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a RNA de filamento duplo (dsRNA), mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado interferência de RNA (RNAi). Um mecanismo básico possível atrás do RNAi é a quebra de um RNA de filamento duplo (dsRNA) pareando uma sequência de gene específica em pedaços pequenos chamados RNA de interferência pequeno, que disparam a degradação de mRNA que pareia sua sequência.

Em um aspecto, os RNAi's, como são fornecidos aqui, são usados em produtos terapêuticos de silenciamento de gene, ver, por exemplo, Shuey (2002) Drug Discov. Today 7:1040-1046. Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para seletivamente degrar RNA usando os RNAi's. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de RNAi como fornecidas aqui podem ser usadas para gerar uma mutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Métodos para preparar e usar moléculas de RNAi para seletivamente degradar RNA são bem-conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 6.506.559; 6.511.824; 6.515.109; 6.489.127.

Modificação de Ácidos Nucleicos

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos de gerar variantes da ácidos nucleicos, por exemplo, aquelas codificando uma hidro- lase ou um anticorpo como fornecido aqui. Estes métodos podem ser repetidos ou usados em várias combinações para gerar hidrolases ou anticorpos tendo uma atividade alterada ou diferente ou uma estabilidade alterada ou diferente daquela de uma hidrolase ou anticorpo codificado pelo ácido nu- cleico padrão. Estes métodos também podem ser repetidos ou usados em várias combinações, por exemplo, para gerar variações em expressão de gene / mensagem, translação de mensagem ou estabilidade de mensagem. Em outro aspecto, a composição genética de uma célula é alterada por, por exemplo, modificação de um gene homólogo ex vivo, seguido por sua rein- serção na célula.

O termo "variante" pode incluir polinucleotídeos ou polipeptídeos como fornecidos aqui modificados em um ou mais pares de base, códons, íntrons, éxons, ou resíduos de aminoácido (respectivamente) todavia ainda mantém a atividade biológica de uma hidrolase como fornecido aqui. Variantes podem ser produzidas por qualquer número de recursos incluídos os métodos tais como, por exemplo, PCR propenso ao erro, embaralhamento, mu- tagênese direcionada a oligonucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagêne- se por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagênese por cassete, mutagê- nese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagê- nese específica do sítio, GeneReassembly, GSSMSM e qualquer combinação dos mesmos. Técnicas para produzir hidrolases variantes tendo atividade em um pH ou temperatura, por exemplo, que é diferente de uma hidrolase de tipo selvagem, são incluídas aqui.

Um ácido nucleico como fornecido aqui pode ser alterado por qualquer método, por exemplo, métodos randomizados ou estocásticos, ou, métodos não-estocásticos, ou "evolução direcionada," veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.361.974. Métodos para mutação randomizada de genes são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.830.696. Por exemplo, mutágenos podem ser usados para mutar randomi- zadamente um gene. Mutágenos incluem, por exemplo, irradiação de luz ultravioleta ou gama, ou um mutágeno químico, por exemplo, mitomicina, ácido nitroso, psoraléns fotoativados, sozinhos ou em combinação, para induzir rompimentos de DNA tratáveis para reparar por recombinação. Outros mutágenos químicos incluem, por exemplo, bissulfito de sódio, ácido nitroso, hidroxilamina, hidrazina ou ácido fórmico. Outros mutágenos são análogos de precursores nucleotídeos, por exemplo, nitrosoguanidina, 5-bromouracila, 2-aminopurina, ou acridina. Estes agentes podem ser adicionados a uma reação de PCR em lugar do precursor nucleotídeo desse modo mutando a sequência. Agentes de intercalação tal como proflavina, acriflavina, quinacri- na e similares podem também ser usados.

Qualquer técnica em biologia molecular pode ser usada, por exemplo, mutagênese de PCR randomizada, veja, por exemplo, Rice (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5467-5471; ou, mutagênese múltipla combinatorial por cassete, veja, por exemplo, Crameri (1995) Biotechniques 18:194196. Alternativamente, ácidos nucleicos, por exemplo, genes, podem ser reagrupados após fragmentação randomizada ou "estocástica", veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.291.242; 6.287.862; 6.287.861; 5.955.358; 5.830.721; 5.824.514; 5.811.238; 5.605.793. Em aspectos alternativos, modificações, adições ou deleções são introduzidas por PCR propenso ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada a oligonucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagênese por PCR sexual, mutagênese in vivo, mutagêne- se por cassete, mutagênese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica do sítio, Gene Site Saturation Mutage- nesisSM (GSSMSM), reagrupamento de ligação sintética (SLR ou GeneReassembly), recombinação, recombinação de sequência recursiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese dúplex aberta, mutagênese de reparo de pareamento errôneo de ponto, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de deleção, mutagênese de seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação multimérica de ácido nuclei- co quimérico, e/ou uma combinação destes e outros métodos.

As seguintes publicações descrevem uma variedade de métodos e/ou procedimentos de recombinação recursivos que podem ser incorporados nos métodos como fornecido aqui: Stemmer (1999) "Molecular breeding of viruses for targeting and other clinical properties" Tumor Targeting 4:1-4; Ness (1999) Nature Biotechnology 17:893-896; Chang (1999) "Evolution of a cytokine using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:793-797; Minshull (1999) "Protein evolution by molecular breeding" Current Opinion in Chemical Biology 3:284-290; Christians (1999) "Directed evolution of thymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA family shuffling" Nature Biotechnology 17:259-264; Crameri (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature 391:288-291; Crameri (1997) "Molecular evolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling," Nature Biotechnology 15:436-438; Zhang (1997) "Directed evolution of an effective fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Patten e outros (1997) "Applications of DNA shuffling to Pharmaceuticals and Vaccines" Current Opinion in Biotechnology 8:724-733; Crameri e outros (1996) "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling" Nature Medicine 2:100-103; Gates e outros (1996) "Affinity selective isolation of ligands from peptide libraries through display on a lac repressor 'headpiece dimer'" Journal of molecular Biology 255:373-386; Stemmer (1996) "Sexual PCR and Assembly PCR" In: The Encyclopedia of Molecular Biology. VCH Publishers, Nova Iorque. pp.447-457; Crameri and Stemmer (1995) "Combinatorial multiple cassette mutagenesis creates all the permutations of mutant and wildtype cassettes" BioTechniques 18:194-195; Stemmer e outros (1995) "Single-step assembly of a gene and entire plasmid form large numbers of oligodeoxyribonucleotides" Gene, 164:49-53; Stemmer (1995) "The Evolution of Molecular Computation" Science 270: 1510; Stemmer (1995) "Searching Sequence Space" Bio/Technology 13:549-553; Stemmer (1994) "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling" Nature 370:389-391; e Stemmer (1994) "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1074710751.

Métodos mutacionais de gerar diversidade incluem, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio (Ling e outros (1997) "Approaches to DNA mutagenesis: an overview" Anal Biochem. 254(2): 157-178; Dale e outros (1996) "Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the fosforothio- ate method" Methods Mol. Biol. 57:369-374; Smith (1985) "In vitro mutagenesis" Ann. Rev. Genet. 19:423-462; Botstein & Shortle (1985) "Strategies and applications of in vitro mutagenesis" Science 229:1193-1201; Carter (1986) "Site-directed mutagenesis" Biochem. J. 237:1-7; e Kunkel (1987) "The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis" in nucleic acids & molecular biology (Eckstein, F. e Lilley, D. M. J. eds., Springer Verlag, Berlin)); Muta- gêneses usando uracila contendo padrões (Kunkel (1985) "Rapid e efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel e outros (1987) "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection" Methods in Enzymol. 154, 367382; e Bass e outros (1988) "Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities" Science 242:240-245); mutagênese direcionada a oligonucle- otídeo (Methods in Enzymol. 100: 468-500 (1983); Methods in Enzymol. 154: 329-350 (1987); Zoller & Smith (1982) "Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic acids Res. 10:64876500; Zoller & Smith (1983) "Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors" Methods in Enzymol. 100:468-500; e Zoller & Smith (1987) "Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template" Methods in Enzymol. 154:329-350); Mutagêneses de DNA modificado por fosforotioato (Taylor e outros (1985) "The use of fosforothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764; Taylor e outros (1985) "The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using fosforothioate-modified DNA" Nucl. Acids Res. 13: 8765-8787 (1985); Nakamaye (1986) "Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by fosforothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 14: 96799698; Sayers e outros (1988) "Y-T Exonucleases in fosforothioate-based oli- gonucleotide-directed mutagenesis" Nucl. Acids Res. 16:791-802; e Sayers e outros (1988) "Strand specific cleavage of fosforothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide" Nucl. Acids Res. 16: 803-814); Mutagêneses usando DNA dúplex fechado (Kramer e outros (1984) "The gapped duplex DNA approach to oligonucleo- tide-directed mutation construction" Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer & Fritz (1987) Methods in Enzymol. "Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA" 154:350-367; Kramer e outros (1988) "Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations" Nucl. Acids Res. 16: 7207; e Fritz e outros (1988) "Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro" Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999).

Protocolos adicionais usados nos métodos como fornecido aqui incluem reparo de pareamento errôneo de ponto (Kramer (1984) "Point Mismatch Repair" Cell 38:879-887), Mutagêneses usando cepas hospedeiras deficientes de reparo (Carter e outros (1985) "Improved oligonucleotide site- directed mutagenesis using M13 vectors" Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443; e Carter (1987) "Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors" Methods in Enzymol. 154: 382-403), Mutagêneses de deleção (Eghtedarzadeh (1986) "Use of oligonucleotides to generate large deletions" Nucl. Acids Res. 14: 5115), restriction-selection and restriction-selection and restriction-purification (Wells e outros (1986) "Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin" Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423), mutagenesis by total gene synthesis (Nambiar e outros (1984) "Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein" Science 223: 1299-1301; Sakamar e Khorana (1988) "Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin)" Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372; Wells e outros (1985) "Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites" Gene 34:315-323; e Grundstrom e outros (1985) "Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene synthesis" Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316), double-strand break repair (Mandecki (1986); Arnold (1993) "Protein engineering for unusual environments" Current Opinion in Biotechnology 4:450-455. "Oli- gonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis" Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:7177-7181). Detalhes adicionais em muitos dos métodos acima podem ser encontrados em Methods in Enzymology Volume 154, que também descreve controles úteis para problemas de transferência de inquietação com vários métodos de mutagêneses.

Protocolos adicionais usados nos métodos como fornecidos aqui incluem aqueles descritos na Patente U.S. No. 5.605.793 a Stemmer (25 de fevereiro de 1997), "Methods for In Vitro Recombination;" Patente U.S. No. 5.811.238 a Stemmer e outros (22 de setembro de 1998) "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" Patente U.S. No. 5.830.721 a Stemmer e outros (3 de novembro de 1998), "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" Patente U.S. No. 5.834.252 a Stemmer, e outros (10 de novembro de 1998) "End-Complementary Polymerase Reaction;" Patente U.S. No. 5.837.458 a Minshull, e outros (17 de novembro de 1998), "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 95/22625, Stem- mer e Crameri, "Mutagenesis by Random Fragmentation and Reassembly;" WO 96/33207 por Stemmer e Lipschutz "End Complementary Polymerase Chain Reaction;" WO 97/20078 por Stemmer e Crameri "Methods for Generating Polynucleotides having Desired Characteristics by Iterative Selection and Recombination;" WO 97/35966 por Minshull e Stemmer, "Methods and Compositions for Cellular and Metabolic Engineering;" WO 99/41402 por Punnonen e outros "Targeting of Genetic Vaccine Vectors;" WO 99/41383 por Punnonen e outros "Antigen Library Immunization;" WO 99/41369 por Punnonen e outros "Genetic Vaccine Vector Engineering;" WO 99/41368 por Punnonen e outros "Optimization of Immunomodulatory Properties of Genetic Vaccines;" EP 752008 por Stemmer e Crameri, "DNA Mutagenesis by Random Fragmentation e Reassembly;" EP 0932670 por Stemmer "Evolving Cellular DNA Uptake by Recursive Sequence Recombination;" WO 99/23107 por Stemmer e outros, "Modification of Virus Tropism and Host Range by Viral Genome Shuffling;" WO 99/21979 por Apt e outros, "Human Papillomavirus Vectors;" WO 98/31837 por del Cardayre e outros "Evolution of Whole Cells and Organisms by Recursive Sequence Recombination;" WO 98/27230 por Patten e Stemmer, "Methods and Compositions for Polypeptide Engineering;" WO 98/27230 por Stemmer e outros, "Methods for Optimization of Gene Therapy by Recursive Sequence Shuffling and Selection," WO 00/00632, "Methods for Generating Highly Diverse Libraries," WO 00/09679, "Methods for Obtaining in Vitro Recombined Polynucleotide Sequence Banks and Resulting Sequences," WO 98/42832 por Arnold e outros, "Recombination of Polinucleotide Sequences Using Random or Defined Primers," WO 99/29902 por Arnold e outros, "Method for Creating Polynucleotide and Polypeptide Sequences," WO 98/41653 por Vind, "An in Vitro method for Construction of a DNA Library," WO 98/41622 por Borchert e outros, "Method for Constructing a Library Using DNA Shuffling," e WO 98/42727 por Pati e Zarling, "Sequence Alterations using Homologous Recombination."

Protocolos que podem ser usados (fornecendo detalhes considerando vários métodos de geração de diversidade) são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. número de série (USSN) 09/407.800, "SHUFFLING OF CODON ALTERED GENES" por Patten e outros depositado em 28 de setembro de 1999; "EVOLUTION OF WHOLE CELLS AND ORGANISMS BY RECURSIVE SEQUENCE RECOMBINATION" por del Cardayre e outros, Patente U.S. No. 6.379.964; "OLIGONUCLEOTIDE MEDIATED NUCLEIC ACID RECOMBINATION" por Crameri e outros, Patentes U.S. Nos. 6.319.714; 6.368.861; 6.376.246; 6.423.542; 6.426.224 e PCT/US00/01203; "USE OF CODON-VARIED OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS FOR SYNTHETIC SHUFFLING" por Welch e outros, Patente U.S. No. 6.436.675; "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov e outros, depositado em 18 de janeiro de 2000, (PCT/US00/01202) e, por exemplo, "METHODS FOR MAKING CHARACTER STRINGS, POLYNUCLEOTIDES & POLYPEPTIDES HAVING DESIRED CHARACTERISTICS" por Selifonov e outros, depositado em 18 de julho de 2000 (U.S. Ser. No. 09/618.579); "METHODS OF POPULATING DATA STRUCTURES FOR USE IN EVOLUTIONARY SIMULATIONS" por Selifonov e Stemmer, depositado em 18 de janeiro de 2000 (PCT/US00/01138); e "SINGLE-STRANDED NUCLEIC ACID TEMPLATE- MEDIATED RECOMBINATION AND NUCLEIC ACID FRAGMENT ISOLATION" por Affholter, depositado em 6 de setembro de 2000 (U.S. Ser. No. 09/656.549); e Patentes U.S. Nos. 6.177.263; 6.153.410.

Métodos não estocásticos, ou "evolução direcionada," que incluem, por exemplo, gene site saturation mutagenesisSM (GSSMSM), reagrupa- mento de ligação sintética (SLR ou GeneReassembly), ou uma combinação dos mesmos são usados para modificar os ácidos nucleicos como fornecido aqui para gerar hidrolases com propriedades novas ou alteradas (por exemplo, atividade sob condições altamente acídicas ou alcalinas, altas temperaturas, e similares). Polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos modificados podem ser avaliados quanto a uma atividade antes de testar para atividade proteolítica ou outra. Qualquer protocolo ou modalidade de teste pode ser usado, por exemplo, usando uma plataforma de disposição capilar. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.361.974; 6.280.926; 5.939.250.

Mutagênese de saturação, ou, tecnologia GSSMSM

Em um aspecto como fornecido aqui, modificação de gene não- estocástico, um "processo de evolução direcionada," é usada para gerar hi- drolases e anticorpos com propriedades novas ou alteradas. Variações deste método foram denominadas "mutagênese de saturação de sítio de gene," "mutagênese de saturação de sítio," "mutagênese de saturação" ou simplesmente "GssMsM." Isto pode ser usado em combinação com outros processos de mutagenização. Em um aspecto, são fornecidos aqui métodos para preparar enzimas e anticorpos usando tecnologia GssMsM, por exemplo, como descrito aqui e também nas Patentes U.s. Nos. 6.171.820; 6.579.258; 6.238.884.

Em um aspecto, a tecnologia GssMsM compreende fornecer um polinucleotídeo padrão e uma pluralidade de oligonucleotídeos, em que cada oligonucleotídeo compreende uma sequência homóloga ao polinucleotídeo padrão, desse modo alvejando uma sequência específica do polinucleotídeo padrão, e uma sequência que é uma variante do gene homólogo; gerando polinucleotídeos de descendência compreendendo variações de sequência não-estocásticas replicando o polinucleotídeo padrão com os oligonucleotí- deos, desse modo gerando polinucleotídeos compreendendo variações de sequência de gene homólogas.

Em um aspecto, iniciadores de códon contendo uma sequência de N,N,G/T degenerada são usados para introduzir mutações de ponto em um polinucleotídeo, a fim de gerar um grupo de polipeptídeos de descendência em que uma faixa total de substituições de aminoácido simples é representada em cada posição de aminoácido, por exemplo, um resíduo de aminoácido em um sítio ativo de enzima ou sítio de ligação de ligante alvejado a ser modificado. Estes oligonucleotídeos podem compreender uma primeira sequência homóloga contígua, uma sequência de N,N,G/T degenerada, e, opcionalmente, uma segunda sequência homóloga. Os produtos trans- lacionais de descendência a jusante do uso de tais oligonucleotídeos incluem todas as possíveis mudanças de aminoácido em cada sítio de aminoáci- do ao longo do polipeptídeo, por que a degeneração da sequência de N,N,G/T inclui códons para todos os 20 aminoácidos. Em um aspecto, um tal oligonucleotídeo degenerado (compreendido de, por exemplo, um cassete de N,N,G/T degenerado) é usado para submeter cada códon original em um padrão de polinucleotídeo origem a uma faixa total de substituições de có- don. Em outro aspecto, pelo menos dois cassetes degenerados são usados - no mesmo oligonucleotídeo ou não, para submeter pelo menos dois có- dons originais em um padrão de polinucleotídeo origem a uma faixa total de substituições de códon, por exemplo, mais do que uma sequência de N,N,G/T pode estar contida em um oligonucleotídeo para introduzir mutações de aminoácido em mais do que um sítio. Esta pluralidade de sequências N,N,G/T pode ser diretamente contígua, ou separada por uma ou mais sequência(s) de nucleotídeo adicional(is). Em outro aspecto, oligonucleotí- deos úteis para introduzir adições e deleções podem ser usados sozinhos ou em combinação com os códons contendo uma sequência N,N,G/T, para introduzir qualquer combinação ou permutação de adições, deleções, e/ou substituições de aminoácido.

Em um aspecto, mutagênese simultânea de duas ou mais posições de aminoácido contíguas é feita usando um oligonucleotídeo que contém tripletos de N,N,G/T contíguos, isto é, uma sequência de (N,N,G/T)n degenerada. Em outro aspecto, cassetes degenerados tendo menos degeneração do que a sequência de N,N,G/T são usados. Por exemplo, pode ser desejável em alguns casos usar (por exemplo em um oligonucleotídeo) uma sequência de tripleto degenerada compreendida de apenas um N, onde referido N pode estar na primeira, segunda ou terceira posição do tripleto. Quaisquer outras bases incluindo quaisquer combinações e permutações das mesmas podem ser usadas nas duas posições restantes do tripleto. Alternativamente, pode ser desejável em alguns casos usar (por exemplo em um oligo) uma sequência de tripleto de N,N,N degenerada.

Em um aspecto, o uso de tripletos degenerados (por exemplo, tripletos de N,N,G/T) provê geração sistemática e fácil de uma faixa total de possíveis aminoácidos naturais (para um total de 20 aminoácidos) em cada e toda posição de aminoácido em um polipeptídeo (em aspectos alternativos, os métodos também incluem geração de menos do que todas as possíveis substituições por resíduo de aminoácido, ou códon, posição), por exemplo, para um polipeptídeo de 100 aminoácidos, 2000 espécies distintas (isto é 20 possíveis aminoácidos por posição X 100 posições de aminoácido) podem ser geradas. Embora o uso de um oligonucleotídeo ou grupo de oligo- nucleotídeos contendo um tripleto de N,N,G/T degenerado, 32 sequências individuais podem codificar para todos os 20 possíveis aminoácidos naturais. Desse modo, em um vaso reacional em que uma sequência de polinucleotí- deo de origem é submetida à mutagênese de saturação usando pelo menos um tal oligonucleotídeo, existem 32 polinucleotídeos de descendência distintos gerados codificando 20 polipeptídeos distintos. Ao contrário, o uso de um não-oligonucleotídeo degenerado em mutagênese direcionada ao sítio induz a apenas um produto de polipeptídeo de descendência por vaso reacional. Não-oligonucleotídeos degenerados podem opcionalmente ser usados em combinação com iniciadores degenerados descritos; por exemplo, não- oligonucleotídeo degenerado pode ser usado para gerar mutações de ponto específicas em um polinucleotídeo de trabalho. Isto fornece um método para gerar mutações de ponto silenciosas específicas, mutações de ponto induzindo a correspondentes mudanças de aminoácido, e mutações de ponto que causam uma geração de códons de interrupção e uma correspondente expressão de fragmentos de polipeptídeo.

Em um aspecto, cada vaso reacional de mutagênese de saturação contém polinucleotídeos codificando pelo menos 20 moléculas de poli- peptídeos de descendência (por exemplo, hidrolase, por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) tal que todos os 20 aminoácidos naturais são representados em uma posição específica de aminoácido correspondendo à posição de códon mutagenizada no polinucleotídeo de origem (outros aspectos usam menos do que todas as 20 combinações naturais). As 32 vezes de polipeptídeos de descendência degenerados geradas de cada vaso reacional de mutagênese de saturação podem ser submetidas à amplificação clonal (por exemplo clonadas em um hospedeiro adequado, por exemplo, hospedeiro E. coli, usando, por exemplo, um vetor de expressão) e submetidas à avaliação de expressão. Quando um polipeptídeo de descendência individual é identificado por avaliação para mostrar uma mudança em propriedade favorável (quando comparado ao polipeptídeo de origem, tal como seletividade aumentada para hidrólise de ésteres de palmitato versus hidrólise de ésteres de oleato), pode ser sequenciado para identificar a substituição de aminoácido correspondentemente favorável contida aqui.

Em um aspecto, em mutagenização cada e toda posição de aminoácido em um polipeptídeo de origem usando mutagênese de saturação como descrito aqui, mudanças de aminoácido favoráveis podem ser identificadas em mais do que uma posição de aminoácido. Uma ou mais novas moléculas de descendência podem ser geradas que contêm uma combinação de todas ou parte destas substituições de aminoácidos favoráveis, por exemplo, se 2 mudanças de aminoácido favoráveis específcas são identificadas em cada das 3 posições de aminoácido em um polipeptídeo, as permutações incluem 3 possibilidades em cada posição (nenhuma mudança do aminoácido original, e cada das duas mudanças favoráveis) e 3 posições. Desse modo, existem 3 x 3 x 3 ou 27 possibilidades totais, incluindo 7 que foram anteriormente examinadas - 6 mutações de ponto simples (isto é 2 em cada das três posições) e nenhuma mudança em qualquer posição.

Em outro aspecto, mutagênese de saturação por sítio pode ser usada junto com outros métodos estocásticos ou não-estocásticos para vari- ar a sequência, por exemplo, reagrupamento de ligação sintética (veja abaixo), embaralhamento, quimerização, recombinação e outros processos de mutagenização e agentes de mutagenização. São fornecidos aqui processos de mutagenização, incluindo mutagênese de saturação, usados de uma maneira iterativa.

Reagrupamento de ligação sintética (SLR)

Em um aspecto são fornecidos aqui sistemas de modificação de gene não estocásticos denominados "remontagem de ligação sintética," ou simplesmente "SLR,", também conhecido como tecnologia "GeneReassembly", um "processo de evolução direta," para gerar polipeptídeos, por exemplo, enzimas (tais como hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmita- ses e/ou estearatases) ou anticorpos como fornecido aqui, com propriedades novas ou alteradas. SLR é um método de ligação de fragmentos de oligonu- cleotídeo entre si não-estocasticamente. Este método difere de embaralhamento de oligonucleotídeo estocático em que os blocos de construção de ácido nucleico não são embaralhados, concatenados ou quimerizados ran- domizadamente, porém de preferência são agrupados não- estocasticamente. Veja, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 6.773.900, 6.740.506, 6.713.282, 6.635.449, 6.605.449, 6.537.776.

Em um aspecto, SLR compreende as seguintes etapas: (a) for-necimento de um polinucleotídeo padrão, em que o polinucleotídeo padrão compreende sequência codificando um gene homólogo; (b) fornecimento de uma pluralidade de polinucleotídeos de bloco de construção, em que os poli- nucleotídeos de bloco de construção são designados para remontagem de cruzamento com o polinucleotídeo padrão em uma sequência predeterminada, e um polinucleotídeo de bloco de construção compreende uma sequência que é um variante do gene homólogo e uma sequência homóloga ao po- linucleotídeo padrão flanqueando a sequência variante; (c) combinação de um polinucleotídeo de bloco de construção com a polinucleotídeo padrão tal que o polinucleotídeo de bloco de construção reagrupe por cruzamento com o polinucleotídeo padrão para gerar polinucleotídeos compreendendo variações de sequência de gene homólogos.

SLR não depende da presença de níveis elevados de homologia entre polinucleotídeos a serem redispostos. Desse modo, este método pode ser usado para não-estocasticamente gerar bibliotecas (ou grupos) de moléculas de descendência compreendidas de mais de 10100 diferentes quimeras. SLR pode ser usado para gerar bibliotecas compreendidas de mais de 101000 diferentes quimeras de descendência. Em um aspecto são fornecidos aqui métodos de produção não-estocásticos de um grupo de moléculas de ácido nucleico quiméricas finalizadas tendo uma ordem de montagem total que é escolhida por planejamento. Este método inclui as etapas de gerar por planejamento uma pluralidade de blocos de construção de ácido nucleico específico tendo terminações ligáveis mutuamente compatíveis úteis, e montagens destes blocos de construção de ácido nucleico, tal que uma ordem de montagem total designada seja obtida.

As terminações ligáveis mutuamente compatíveis de um bloco de construção de ácido nucleico a ser montado são consideradas ser "úteis" para este tipo de montagem ordenada se eles permitirem os blocos de construção serem acoplados em ordens predeterminadas. Desse modo, a ordem de montagem total em que o bloco de construção de ácido nucleico pode ser acoplado é especificada pelo planejamento das terminações ligáveis. Se mais que uma etapa de montagem deve ser usada, então a ordem de montagem total em que o bloco de construção de ácido nucleico pode ser acoplado é também especificada pela ordem sequencial da(s) etapa(s) de mon- tagem(ens). Em um aspecto, as peças de construção aneladas são tratadas com uma enzima, tal como uma ligase (por exemplo, T4 DNA ligase), para obter ligação covalente das peças de construção.

Em um aspecto, o planejamento de blocos de construção de oli- gonucleotídeo é obtido analisando um grupo de padrões de sequência de ácido nucleico progenitora que serve como uma base para produzir um grupo de descendência de polinucleotídeos quiméricos finalizados. Estes padrões de oligonucleotídeo de origem desse modo servem como uma fonte de informação de sequência que ajuda no planejamento do bloco de construção de ácido nucleico que deve ser mutagenizado, por exemplo, quimeri- zado ou embaralhado. Em um aspecto deste método, as sequências de uma pluralidade de padrões de ácido nucleico de origem são alinhadas a fim de selecionar um ou mais pontos de demarcação. Os pontos de demarcação podem ser localizados em uma área de homologia, e são compreendidos de um ou mais nucleotídeos. Estes pontos de demarcação são alternativamente compartilhados por pelo menos dois dos padrões progenitores. Os pontos de demarcação podem desse modo ser usados para delinear os limites de blocos de construção de oligonucleotídeo a serem gerados a fim de redispor os polinucleotídeos de origem. Os pontos de demarcação identificados e selecionados nas moléculas progenitoras servem como pontos de quimerização potencial na montagem das moléculas de descendência quiméricas finais. Um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia (compreendida de pelo menos uma base de nucleotídeo homologa) compartilhada por pelo menos duas sequências de polinucleotídeo de origem. Alternativamente, um ponto de demarcação pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos metade das sequências de polinucleotídeo de origem, ou, pode ser uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos dois terços das sequências de polinucleotídeo de origem. Em modalidades alternativas, um ponto de demarcação útil é uma área de homologia que é compartilhada por pelo menos três quartos das sequências de polinucleotídeo de origem, ou, podem ser compartilhadas por quase todas as sequências de polinucleotídeo de origem. Em um aspecto, um ponto de demarcação é uma área de homologia que é compartilhada por todas as sequências de polinu- cleotídeo de origem.

Em um aspecto, um processo de remontagem de ligação é realizado exaustivamente a fim de gerar uma biblioteca exaustiva de polinucleo- tídeos quiméricos de descendência. Em outras palavras, todas as combinações ordenadas possíveis do bloco de construção de ácido nucleico são representadas no grupo de moléculas de ácido nucleico quiméricas finalizadas. Ao mesmo tempo, em outro aspecto, a ordem de montagem (isto é, a ordem de montagem de cada bloco de construção na sequência de 5' a 3 de cada ácido nucleico quimérico finalizado) em cada combinação é por plane- jamento (ou não-estocásticos) como descrito acima. São fornecidos aqui métodos não-estocásticos que reduzem a possibilidade de produtos colaterais indesejáveis.

Em outro aspecto, o método de remontagem de ligação é realizado sistematicamente, por exemplo, o método é realizado a fim de gerar uma biblioteca compartimentalizada sistematicamente de moléculas de descendência, com compartimentos que podem ser avaliados sistematicamente, por exemplo, um a um. São fornecidos aqui métodos compreendendo uso seletivo e judicioso de blocos de construção de ácido nucleico específico, acoplado com o uso seletivo e judicioso de reações de montagem de etapas sequenciais, um projeto pode ser obtido onde grupos específicos de produtos de descendência são feitos em cada dos diversos dados de reação. Isto permite um exame sistemático e procedimento de avaliação serem realizados. Desse modo, estes métodos permitem um número potencialmente muito grande de moléculas de descendência ser examinado sistematicamente em grupos menores. Por causa de sua capacidade de realizar quimerização de uma maneira que é altamente flexível, todavia exaustiva e sistemática também, particularmente quando existe um baixo nível de homologia entre as moléculas progenitoras, estes métodos provêm uma geração de uma bi-blioteca (ou grupo) compreendida de um grande número de moléculas de descendência. Por causa da natureza não-estocástica do presente método de remontagem de ligação, as moléculas de descendência geradas podem compreender uma biblioteca de moléculas de ácido nucleico quiméricas fina-lizadas tendo uma ordem de montagem total que é escolhida por planejamento. Os métodos de mutagênese de saturação e evolução direcionada otimizada também podem ser usados para gerar diferentes espécieis moleculares de descendência.

Em um aspecto, os métodos inclusos fornecem liberdade de escolha e controle considerando a seleção de pontos de demarcação, o tamanho e número dos blocos de construção de ácido nucleico, e o tamanho e projeto dos acoplamentos. O requisito de homologia intermolecular pode ser altamente relaxado. De fato, pontos de demarcação podem ainda ser esco- lhidos em áreas de pouca ou nenhuma homologia intermolecular. Por exemplo, por causa da oscilação do códon, isto é, a degeneração de códons, substituições de nucleotídeo podem ser introduzidas em blocos de construção de ácido nucleico sem alterar o aminoácido originalmente codificado no padrão de progenitor correspondente. Alternativamente, um códon pode ser alterado tal que a codificação para um aminoácido original seja alterada. Em um aspecto, substituições podem ser introduzidas no bloco de construção de ácido nucleico a fim de aumentar a incidência de pontos de demarcação homólogos intermoleculares e desse modo permitir um número aumentado de acoplamentos ser obtido entre os blocos de construção, o que por sua vez permite um número maior de moléculas quiméricas de descendência ser gerado.

Em outro aspecto, a natureza sintética da etapa em que os blocos de construção são gerados permite o planejamento e introdução de nu- cleotídeos (por exemplo, um ou mais nucleotídeos, que podem ser, por exemplo, códons ou íntrons ou sequências regulatórias) que podem posteriormente ser opcionalmente removidos em um processo in vitro (por exemplo, por mutagênese) ou em um processo in vivo (por exemplo, utilizando a capacidade de união de gene de um organismo hospedeiro). É apreciado que em muitos casos a introdução destes nucleotídeos possam também ser desejáveis por muitas outras razões além do benefício potencial de criar um ponto de demarcação útil.

Em um aspecto, um bloco de construção de ácido nucleico é usado para introduzir um íntron. Desse modo, íntrons funcionais são introduzidos em um gene feito pelo homem fabricado de acordo com os métodos descritos aqui. Os íntron(s) artificialmente introduzidos podem ser funcionais em células hospedeiras para união de gene muito de modo que íntrons de ocorrência natural apresentem funcionalidade em união de gene.

Sistema de Evolução Direcionada Otimizada

Em certas modalidades, são fornecidos aqui sistemas de modificação de gene não estocásticos denominados "sistema de evolução direcionada otimizada" para gerar hidrolases e anticorpos com propriedades novas ou alteradas. Evolução direcionada otimizada é direcionada ao uso de ciclos repetidos de reclassificação redutiva, recombinação e seleção que provêm uma evolução molecular direcionada de ácidos nucleicos através de recom- binação. Evolução direcionada otimizada permite a geração de uma grande população de sequências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significantemente enriquecida para sequências que têm um número prede-terminado de eventos de cruzamento.

Um evento de cruzamento é um ponto em uma sequência quimérica onde uma mudança em sequência ocorre a partir de uma variante de origem para outra variante de origem. Tal ponto é normalmente na junção de onde oligonucleotídeos de duas origens são ligados entre si para formar uma única sequência. Este método permite cálculo das concentrações corretas de sequências de oligonucleotídeo de modo que a população quimérica de sequências seja enriquecida para um número escolhido de eventos de cru-zamento. Isto fornece mais controle sobre escolha de variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos de cruzamento.

Além disso, este método fornece um método conveniente para explorar uma quantidade estraordinária do espaço variante da proteína possível em comparação a outro sistema. Anteriormente, se gerado, por exemplo, 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, seria extremamente dificil testar tal número elevado de variantes quiméricas para uma atividade particular. Além disso, uma porção significante da população de descendência tem um número muito elevado de eventos de cruzamento que resultou em proteínas que foram menos prováveis de ter níveis aumentados de uma atividade particular. Usando estes métodos, uma população de moléculas quiméricas pode ser enriquecida para aquelas variantes que têm um número particular de eventos de cruzamento. Desse modo, embora alguém ainda possa gerar 1013 moléculas quiméricas durante uma reação, cada das moléculas escolhidas para outra análise mais provável tem, por exemplo, apenas três eventos de cruzamento. Por que a população de descendência resultante pode ser confirmada ter um número predeterminado de eventos de cruzamento, os limites sobre a variedade funcional entre as moléculas quiméri- cas são reduzidos. Isto fornece um número mais controlável de variáveis quando calculando que oligonucleotídeo dos polinucleotídeos de origem originais pode ser responsável por afetar uma caracteristica particular.

Um método para criar uma sequência de polinucleotídeo de des-cendência quimérica é para criar oligonucleotídeos correspondentes para fragmentos ou porções de cada sequência de origem. Em modalidades al-ternativas, cada oligonucleotídeo inclui uma única região de sobreposição de modo que a mistura dos oligonucleotídeos entre si resulte em uma nova variante que tenha cada fragmento de oligonucleotídeo agrupado na ordem correta. Alternativamente protocolos para a prática destes métodos como fornecidos aqui podem ser encontrados nas Patentes U.S. N°s. 6.773.900, 6.740.506, 6.713.282, 6.635.449, 6.605.449, 6.537.776, 6.361.974.

O número de oligonucleotídeos gerado para cada variante de origem transporta uma ligação com o número total de cruzamentos resultantes na molécula quimérica que é finalmente criada, por exemplo, três variantes de sequência de nucleotídeo de origem podem ser fornecidas para sofrer uma reação de ligação a fim de encontrar uma variante quimérica tendo, por exemplo, maior atividade em alta temperatura. Como um exemplo, um grupo de 50 sequências de oligonucleotídeo pode ser gerado correspondendo a cada porção de cada variante de origem. Consequentemente, durante o processo de remontagem de ligação pode existir até 50 eventos de cruzamento dentro de cada sequência quimérica. A probabilidade que cada dos polinu- cleotídeos quiméricos gerados conterá oligonucleotídeos de cada variante de origem em ordem alternada é muito baixa. Se cada fragmento de oligo- nucleotídeo está presente na reação de ligação na mesma quantidade molar é provável que em algumas posições oligonucleotídeos do mesmo polinu- cleotídeo de origem serão ligados em seguida a um outro e desse modo não resulta em um evento de cruzamento. Se a concentração de cada oligonu- cleotídeo de cada origem é mantida constante durante qualquer etapa de ligação neste exemplo, existe uma chance de 1/3 (assumindo 3 origens) que um oligonucleotídeo da mesma variante de origem ligue-se dentro da sequência quimérica e não produza cruzamento.

Consequentemente, uma função de densidade de probalidade (PDF) pode ser determinada para predizer a população de eventos de cruzamento que são prováveis ocorrerem durante cada etapa na reação de ligação devido a um grupo de números de variante de origem, um número de oligonucleotídeos correspondendo a cada variante, e uma concentração de cada variante durante cada etapa na reação de ligação. As estatísticas e matemáticas atrás da determinação do PDF são descritas abaixo. Utilizando estes métodos, alguém pode calcular tal função de densidade de probalidade, e desse modo enriquecer a população quimérica de descendência para um número predeterminado de eventos de cruzamento resultando de uma reação de ligação particular. Além disso, um número-alvo de eventos de cruzamento pode ser predeterminado, e o sistema então programado para calcular a quantidade de partida de cada oligonucleotídeo de origem durante cada etapa na reação de ligação para resultar em uma função de densidade de probalidade que se centre no número predeterminado de eventos de cruzamento. Estes métodos são direcionados ao uso de ciclos repetidos de re- classificação redutiva, recombinação e seleção que permite a evolução molecular direcionada de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo através de recombinação. Este sistema permite a geração de uma grande população de sequências quiméricas evoluídas, em que a população gerada é significantemente enriquecida para sequências que têm um número predeterminado de eventos de cruzamento. Um evento de cruzamento é um ponto em uma sequência quimérica onde uma mudança em sequência ocorre a partir de uma variante de origem para outra variante de origem. Tal ponto é normalmente na junção de onde oligonucleotídeos de duas origens são ligados entre si para formar uma única sequência. O método permite o cálculo das concentrações corretas de sequências de oligonucleotídeo de modo que a população quimérica de sequências é enriquecida para um número escolhido de eventos de cruzamento. Isto fornece mais controle sobre escolha de variantes quiméricas tendo um número predeterminado de eventos de cruzamento.

Determinação de Eventos de Cruzamento

Aspectos como fornecidos aqui incluem um sistema e software que recebem um cruzamento desejado da função de densidade de probalidade (PDF), do número de genes de origem a serem reagrupados, e do número de fragmentos na remontagem como consumo. A saída deste programa é um "PDF fragmento" que pode ser usado para determinar uma receita para produzir genes reagrupados, e o PDF de cruzamento estimado destes genes. O processamento descrito aqui é alternativamente realizado em MATLAB™ (The Mathworks, Natick, Massachusetts) uma liguagem de programação e ambiente de desenvolvimento para computação técnica.

Processos Iterativos

Em certas modalidades, são fornecidos aqui processos que podem ser repetidos iterativamente. Por exemplo um ácido nucleico (ou, o ácido nucleico) responsável por uma hidrolase alterada ou fenótipo de anticorpo é identificado, reisolado, novamente modificado, retestado para atividade. Este processo pode ser repetido iterativamente até um fenótipo desejado ser construído, por exemplo, uma trilha anabólica ou catabólica bioquímica inteira pode ser construída em uma célula, incluindo atividade proteolítica.

Similarmente, se for determinado que um oligonucleotídeo particular não tem nenhum efeito de modo algum sobre a característica desejada (por exemplo, um novo fenótipo de hidrolase), pode ser removido como uma variável sintetizando oligonucleotídeos de origem maiores que incluem a sequência a ser removida. Uma vez que a incorporação de uma sequência dentro de uma sequência maior previne quaisquer eventos de cruzamento, não mais existirá qualquer variação desta sequência nos polinucleotídeos de descendência. Esta prática iterativa de determinar que oligonucleotídeos estão mais relacionados com a característica desejada, e que são não relacionados, permite exploração mais eficiente de todas as possíveis variantes de proteína que podem fornecer a característica ou atividade particular.

Embaralhamento In vivo

O embaralhamento In vivo de molécules é usado em métodos como fornecidos aqui que fornecem variantes de polipeptídeos como fornecido aqui, por exemplo, anticorpos, hidrolases, e similares. O embaralha- mento In vivo pode ser realizado utilizando a propriedade natural de células para recombinar multímeros. Enquanto a recombinação in vivo forneceu a maior rotina natural para diversidade molecular, a recombinação genética permanence um processo relativamente complexo que envolve 1) o reco-nhecimento de homologias; 2) clivagem de filamento, invasão de filamento, e etapas metabólicas induzindo a produção de quiasma recombinante; e finalmente 3) a resolução de quiasma em moléculas recombinadas discretas. A formação da quiasma requer o reconhecimento de sequências homólogas.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para produzir um polinucleotídeo hibrído de pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo. Em outras modalidades, são fornecidos aqui métodos usados para produzir um polinucleotídeo hibrído introduzindo pelo menos um primeiro polinucleotídeo e um segundo polinucleotídeo que compartilham pelo menos uma região de sequência de homologia parcial em uma célula hospedeira adequada. As regiões de sequência de homologia parcial promovem processos que resultam em reorganização de sequência produzindo um polinucleotídeo híbrído. Em um aspecto, o termo "polinucleo- tídeo hibrído" abrange qualquer sequência de nucleotídeo que resulte de um método como fornecido aqui, e em uma modalidade contém sequência de pelo menos duas polissequências de nucleotídeos originais. Tal polinucleotí- deo hibrído pode resultar de eventos de recombinação intermolecular que promovem integração de sequência entre moléculas de DNA. Além disso, tais polinucleotídeos hibrídos podem resultar de processos de reclassifica- ção redutiva intramolecular que utiliza sequências repetidas para alterar a sequência de nucleotídeo dentro de uma molécula de DNA.

Produção de variante de sequência

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos de preparar variantes de sequência do ácido nucleico e sequências de hidrolase e anticorpo como fornecidos aqui ou isolar hidrolases usando os ácidos nuclei- cos e polipeptídeos como fornecidos aqui. Em certas modalidades, são fornecidas aqui variantes de um gene de hidrolase como fornecido aqui, que podem ser alteradas por qualquer método, incluindo, por exemplo, métodos randomizados ou estocásticos, ou, métodos não-estocásticos, ou "evolução direta,", como descritos acima.

São fornecidos aqui métodos de geração de uma variante de um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de um ácido nucleico padrão compreendendo um ácido nucleico como fornecido aqui; e (b) modificação, dele- ção ou adição de um ou mais nucleotídeos na sequência padrão, ou uma combinação dos mesmos, para gerar uma variante do ácido nucleico padrão. Em um aspecto, o método pode também compreender expressar o ácido nucleico variante para gerar uma variante de hidrolase, por exemplo, um po- lipeptídeo de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. As modificações, adições ou deleções pode ser introduzidas por um método compreendendo PCR propensa ao erro, embaralhamento, mutagênese direcionada a oligo- nucleotídeo, PCR por agrupamento, mutagênese por PCR sexual, mutagê- nese in vivo, mutagênese por cassete, mutagênese de conjunto recursivo, mutagênese de conjunto exponencial, mutagênese específica do sítio, Gene Site Saturation MutagêneseM (GSSMSM), reagrupamento de ligação sintética (SLR ou GeneReassembly) ou uma combinação dos mesmos. Em outro aspecto, as modificações, adições ou deleções são introduzidas por um método compreendendo recombinação, recombinação de sequência recursiva, mutagênese de DNA modificado por fosfotioato, mutagênese padrão contendo uracila, mutagênese dúplex aberta, mutagênese de reparo de parea- mento errôneo de ponto, mutagênese de cepa hospedeira deficiente de reparo, mutagênese química, mutagênese radiogênica, mutagênese de dele- ção, mutagênese de seleção de restrição, mutagênese por purificação de restrição, síntese de gene artificial, mutagênese de conjunto, criação de mul- tímero de ácido nucleico quimérico e uma combinação dos mesmos.

Em um aspecto, o método pode ser repetido iterativamente até uma hidrolase, por exemplo, uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase tendo uma atividade alterada ou diferente ou uma estabilidade alterada ou diferente daquela de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico padrão ser produzida. Em um aspecto, a variante hidrolase, por exemplo, polipeptídeo de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase é ter- motolerante, e mantém alguma atividade após ser exposta a uma temperatura elevada. Em outro aspecto, a variante hidrolase, por exemplo, polipeptí- deo de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase tem glicosilação aumentada quando comparado à hidrolase, por exemplo, lipase, saturase, palmi- tase e/ou estearatase codificada por um ácido nucleico padrão. Alternativamente, a variante hidrolase, por exemplo, polipeptídeo de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase tem hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase sob uma temperatura elevada, em que a hidrolase, por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase codificada pelo ácido nucleico padrão não é ativa sob a temperatura elevada. Em um aspecto, o método pode ser repetido iterativamente até a hidrolase, por exemplo, sequência de codificação de uma lipase, uma saturase, uma palmi- tase e/ou uma estearatase tendo um uso de códon alterado daquele do ácido nucleico padrão ser produzida. Em outro aspecto, o método pode ser repetido iterativamente até um gene de hidrolase, por exemplo, uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou um gene de estearatase, tendo níveis maiores ou menores de expressão de mensagem ou estabilidade daquele do ácido nucleico padrão ser produzido. Em outro aspecto, formulação do produto de hidrolase final, por exemplo, produto de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase, possibilita um aumento ou modulação da performace da hidrolase, por exemplo, lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase no produto.

As variantes isoladas podem ser de ocorrência natural. As variantes podem também ser criadas in vitro. As variantes podem ser criadas usando técnicas de engenharia genética tal como mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese química randomizada, procedimentos de deleção de exonuclease III, e técnicas de clonagem padrão. Alternativamente, tais variantes, fragmentos, análogos, ou derivados podem ser criados usando sínteses químicas ou procedimentos de modificação. Outros métodos de preparar variantes são também familiares àqueles versados na técnica. Estes incluem procedimentos em que as sequências de ácido nucleico obtidas de isolados naturais são modificadas para gerar ácidos nucleicos que codificam polipep- tídeos tendo características que realçam seu valor em aplicações industriais e laboratoriais. Em tais procedimentos, um grande número de sequências variantes tendo uma ou mais diferenças de nucleotídeo com resposta à sequência obtida do isolado natural é gerado e caracterizado. Estas diferenças de nucleotídeo podem resultar em mudanças de aminoácido com respeito aos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos dos isolados naturais.

Por exemplo, variantes podem ser criadas usando PCR propensa a erro. Em PCR propensa a erro, PCR é realizada sob condições onde a fidelidade da reprodução da DNA polimerase é baixa, tal que uma alta taxa de mutações de ponto é obtida ao longo de todo comprimento do produto PCR. PCR propensa a erro é descrita, por exemplo, em Leung, D.W., e outros, Technique, 1:11-15, 1989) e Caldwell, R. C. & Joyce G.F., PCR Method Applic., 2:28-33, 1992. Em síntese, em tais procedimentos, os ácidos nuclei- cos a serem mutagenizados são misturados com iniciadores de PCR, tampão de reação, MgCl2, MnCl2, Taq polimerase e uma concentração apropriada de dNTPs para obter uma alta taxa de mutação de ponto ao longo de todo comprimento do produto PCR. Por exemplo, a reação pode ser realizada usando 20 fmols de ácido nucleico a serem mutagenizados, 30 pmols de cada iniciador de PCR, um tampão de reação compreendendo 50 mM de KCl, 10 mM de Tris HCl (pH 8,3) e 0,01% de gelatina, MgCl2 a 7 mM, MnCl2 a 0,5 mM, 5 unidades de Taq polimerase, dGTP a 0,2 mM, dATP a 0,2 mM, dCTP a 1 mM, e dTTP a 1 mM. PCR pode ser realizada para 30 ciclos de 94°C durante 1 min, 45°C durante 1 min, e 72°C durante 1 min. Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados como apropriado. Os ácidos nucleicos mutagenizados são clonados em um vetor apropriado e as atividades dos polipeptídeos codificados pelos ácidos nucleicos mutage- nizados são avaliadas.

As variantes podem também ser criadas usando mutagênese di-recionada a oligonucleotídeo para gerar mutações específicas de sítio em qualquer DNA clonado de interesse. Mutagênese de oligonucleotídeo é des- crita, por exemplo, em Reidhaar-Olson (1988) Science 241:53-57. Em síntese, em tais procedimentos uma pluralidade de oligonucleotídeos de filamento duplo transportando uma ou mais mutações a serem introduzidas no DNA clonado são sintetizadas e inseridas no DNA clonado a serem mutageniza- dos. Clones contendo o DNA mutagenizado são recuperados e as atividades dos polipeptídeos que eles codificam são estimadas.

Outro método para gerar variantes é PCR de montagem. PCR de montagem envolve a montagem de um produto de PCR de uma mistura de pequenos fragmentos de DNA. Um grande número de diferentes reações de PCR ocorre em paralelo no mesmo frasconete, com os produtos de uma reação preparando os produtos de outra reação. PCR de montagem é descrita em, por exemplo, Patente U.S. N°. 5.965.408.

Ainda outro método de gerar variantes é mutagênese por PCR sexual. Em mutagênese por PCR sexual, recombinação homóloga forçada ocorre entre moléculas de DNA de diferentes, porém altamente relacionadas, sequências de DNA in vitro, como um resultado de fragmentação ran- domizada da molécula de DNA com base em homologia de sequência, seguida pela fixação do cruzamento por extensão de iniciador em uma reação de PCR. Mutagênese por PCR sexual é descrita, por exemplo, em Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751. Em síntese, em tais procedimentos uma pluralidade de ácidos nucleicos a serem recombinados é digerida com DNase para gerar fragmentos tendo um tamanho médio de 50200 nucleotídeos. Fragmentos de tamanho médio desejados são purificados e ressuspensos em uma mistura de PCR. PCR é conduzida sob condições que facilitam recombinação entre os fragmentos de ácido nucleico. Por exemplo, PCR pode ser realizada ressuspendendo os fragmentos purificados em uma concentração de 10-30 ng/l em uma solução de 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 a 2,2 mM, KCL a 50 mM, Tris HCl a 10 mM, pH 9,0, e 0,1% de Triton X-100. 2,5 unidades de Taq polimerase por 100:1 de mistura reaci- onal são adicionadas e PCR é realizada usando o seguinte esquema: 94°C durante 60 segundos, 94°C durante 30 segundos, 50-55°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos (30-45 vezes) e 72°C durante 5 minutos.

Entretanto, será apreciado que estes parâmetros podem ser variados como apropriado. Em alguns aspectos, oligonucleotídeos podem ser incluídos nas reações de PCR. Em outros aspectos, o fragmento de Klenow de DNA poli- merase I pode ser usado em uma primeira série de reações de PCR e Taq polimerase pode ser usada em uma série subsequente de reações de PCR. Sequências recombinantes são isoladas e as atividades dos polipeptídeos que elas codificam são estimadas.

Variantes podem também ser criadas por mutagênese in vivo. Em alguns aspectos, mutações randomizadas em uma sequência de interesse são geradas por propagação de uma sequência de interesse em uma cepa de bactérias, tal como uma cepa de E. coli, que transporta mutações em uma ou mais das trilhas de reparo de DNA. Tais cepas "mutadoras" têm uma maior taxa de mutação randomizada do que aquela de uma origem tipo selvagem. A propagação do DNA em uma destas cepas eventualmente gerará mutações randomizadas dentro do DNA. Cepas mutadoras adequadas para uso para mutagênese in vivo são descritas, por exemplo, em publicação de PCT N° WO 91/16427.

As variantes podem também ser geradas usando mutagênese de cassete. Em mutagênese de cassete uma pequena região de uma molécula de DNA de filamento duplo é substituída com um "cassete" de oligonu- cleotídeo sintético que difere da sequência nativa. O oligonucleotídeo frequentemente contém sequência nativa completamente e/ou parcialmente randomizada.

Mutagênese de conjunto recursivo pode também ser usada para gerar variantes. Mutagênese de conjunto recursivo é um algoritmo para engenharia de proteína (mutagênese de proteína) desenvolvido para produzir diversas populações de mutantes fenoticamente relacionados cujos os membros diferem em sequência de aminoácido. Este método usa um mecanismo de feedback para controlar ciclos sucessivos de mutagênese de cassete combinatorial. Mutagênese de conjunto recursivo é descrita, por exemplo, em Arkin (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815.

Em alguns aspectos, as variantes são criadas usando mutagê- nese de conjunto exponencial. Mutagênese de conjunto exponencial é um processo para gerar bibliotecas combinatoriais com uma elevada porcentagem de mutantes únicos e funcionais, em que pequenos grupos de resíduos são randomizados em paralelo para identificar, em cada posição alterada, aminoácidos que induzem a proteínas funcionais. Mutagênese de conjunto exponencial é descrita, por exemplo, em Delegrave (1993) Biotechnology Res. 11:1548-1552. Mutagênese randomizada e direcionada ao sítio são descritas, por exemplo, em Arnold (1993) Current Opinion in Biotechnology 4:450-455.

Em alguns aspectos, as variantes são criadas usando procedimentos de embaralhamento em que porções de uma pluralidade de ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos distintos são fundidas entre si para crier sequências de ácido nucleico quiméricas que codificam polipeptídeos quiméricos como descritos em, por exemplo, Patentes U.S. N°s. 5.965.408, 5.939.250.

São fornecidas aqui variantes de polipeptídeos compreendendo sequências em que um ou mais dos resíduos de aminoácido (por exemplo, de um polipeptídeo exemplar, por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:2 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (diversas) ou todas as variações de aminoácido descritas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, ou o equivalente dos mesmos) são substituídas com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (por exemplo, um resíduo de aminoácido conservado) e tal resíduo de aminoáci- do substituído pode ou não ser aquele codificado pelo código genético. Substituições conservativas são aquelas que substituem um determinado aminoácido em um polipeptídeo por outro aminoácido de características semelhantes. Desse modo, polipeptídeos aqui incluem aqueles com substituições conservativas de sequências, por exemplo, as sequências exemplares como fornecidas aqui (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:2 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (diversas) ou todas as variações de aminoácido descritas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23, ou o equivalente dos mesmos), incluindo porém não limitadas às seguintes substituições: substituições de um aminoácido alifáti- co tal como alanina, valina, leucina e isoleucina com outro aminoácido alifá- tico; substituição de uma serina com uma treonina ou vice-versa; substituição de um resíduo acídico tal como ácido aspártico e ácido glutâmico com outro resíduo acídico; substituição de um resíduo transportando um grupo amida, tal como asparagina e glutamina, com outro resíduo transportando um grupo amida; permuta de um resíduo básico tal como lisina e arginina com outro resíduo básico; e substituição de um resíduo aromático tal como fenilalanina, tirosina, ou triptofano com outro resíduo aromático. Outras variantes são aquelas em que um ou mais dos resíduos de aminoácido dos poli- peptídeos como fornecidos aqui incluem um grupo substituinte.

Outras variantes dentro do escopo como são fornecidas aqui, aquelas em que o polipeptídeo está associado com outro composto, tal como um composto para aumentar a meia-vida do polipeptídeo, por exemplo, polietileno glicol. Variantes adicionais dentro do escopo como são fornecidas aqui, aquelas em que os aminoácidos adicionais são fundidos ao polipeptí- deo, tal como uma sequência líder, uma sequência secretória, uma sequência de proproteína ou uma sequência que facilita a purificação, enriquecimento, ou estabilização do polipeptídeo. Em alguns aspectos, as variantes, fragmentos, derivados e análogos dos polipeptídeos como fornecidos aqui retêm a mesma função ou atividade biológica dos polipeptídeos exemplares, por exemplo, a atividade proteolítica, como descrita aqui. Em outros aspectos, uma variante, fragmento, derivado, ou análogo inclui uma proproteína, tal que a variante, fragmento, derivado, ou análogo possa ser ativado por clivagem da porção de proproteína para produzir um polipeptídeo ativo.

Otimização de códons para obter níveis elevados de expressão de proteína em células hospedeiras

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para modi- ficar ácidos nucleicos codificando hidrolase para modificar o uso de códon. Em uma modalidade, são fornecidos aqui métodos para modificar códons em um ácido nucleico codificando uma hidrolase para aumentar ou diminuir sua expressão em uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula bacteri- ana, de inseto, de mamífero, de levedura ou de planta. Também são fornecidos aqui ácidos nucleicos codificando uma hidrolase modificada para aumentar sua expressão em uma célula hospedeira, hidrolase desse modo modificada, e métodos das preparações da hidrolases modificadas. O método compreende identificar um códon "não preferido" ou um "menos preferido" em ácido nucleico codificando hidrolase e substituindo um ou mais dentre estes códons não-preferidos ou menos preferidos com um "códon preferido" codificando o mesmo aminoácido como o códon substituído e pelo menos um códon não-preferido ou menos preferido no ácido nucleico foi substituído por um códon preferido codificando o mesmo aminoácido. Um códon preferido é um códon super-representado em sequências de codificação em genes na célula hospedeira e um códon não-preferido ou menos preferido é um códon sub-representado em sequência de codificaçãos em genes na célula hospedeira.

Células hospedeiras para expressar os ácidos nucleicos, cassetes de expressão e vetores como fornecidos aqui incluem bactérias, levedura, fungos, células de planta, células de inseto e células mamíferas. Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para otimizar o uso de códon em todas estas células, ácidos nucleicos alterados por códon e polipeptídeos feitos pelos ácidos nucleicos alterados por códon. Células hospedeiras exemplares incluem bactérias gram negativas, tal como Escherichia coli e Pseudomonas fluorescens; bactérias gram positivas, tal como Lactobacillus gasseri, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris, Bacillus subtilis. Células hospedeiras exemplares também incluem organismos eucarióticos, por exemplo, várias leveduras, tal como Saccharomyces sp., incluindo Saccha- romyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, e Kluyve- romyces lactis, Hansenula polimorpha, Aspergillus niger, e células e cepas celulares mamíferas e células e cepas celulares de inseto. Outras células hospedeiras exemplares incluem células bacterianas, tal como E. coli, Strep- tomyces, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium e várias espécieis dentro dos gêneros Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, células fúngicas, tal como Aspergillus, levedura tal como quaisquer espécies de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces, incluindo Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, ou Schizosaccha- romyces pombe, células de inseto tal como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, células de animais tal como CHO, COS ou melanoma de Bowes e adenovi- roses. A seleção de um hospedeiro apropriado inclui-se nas capacidades daqueles versados na técnica. Em certas modalidades, são fornecidos aqui ácidos nucleicos e polipeptídeos optimizados para expressão nestes organismos e espécies.

Por exemplo, os códons de um ácido nucleico codificando uma hidrolase isolada de uma célula de bactéria são modificados tal que o ácido nucleico seja idealmente expresso em uma célula de bactéria diferente das bactérias das quais uma hidrolase foi derivada, a levedura, a fungos, uma célula de planta, uma célula de inseto ou uma célula mamífera. Métodos para otimizar códons são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Patente U.S. N° 5.795.737; Baca (2000) Int. J. Parasitol. 30:113-118; Hale (1998) Protein Expr. Purif. 12:185-188; Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253. Veja também Narum (2001) Infect. Immun. 69:7250-7253, descrevendo a otimização de códons em sistema de camundongos; Out- chkourov (2002) Protein Expr. Purif. 24:18-24, descrevendo otimização de códons em levedura; Feng (2000) Biochemistry 39:15399-15409, descrevendo otimização de códons em E. coli; Humphreys (2000) Protein Expr. Purif. 20:252-264, descrevendo otimização do uso de códon que afeta a secreção em E. coli.

Animais transgênicos não-humanos

Em certas modalidades, são fornecidos aqui animais transgêni- cos não-humanos compreendendo um ácido nucleico, um polipeptídeo (por exemplo, uma hidrolase ou um anticorpo como fornecido aqui), um cassete de expressão, um vetor, uma célula transfectada ou transformada como for- necido aqui. Os animais transgênicos não-humanos podem ser, por exemplo, cabras, coelhos, ovelhas, porcos, vacas, ratos e camundongos, compreendendo os ácidos nucleicos como fornecidos aqui. Estes animais podem ser usados, por exemplo, como modelos in vivo para estudar a atividade de hidrolase, ou, como modelos para avaliar quanto aos agentes que mudam a atividade de hidrolase in vivo. As sequências de codificação para um poli- peptídeo a ser expresso nos animais transgênicos não-humanos podem ser designadas para serem constitutivas, ou, sob o controle de fatores regulató- rios transcricionais específicos do tecido, específicos do desenvolvimento ou induzíveis. Animais transgênicos não-humanos podem ser designados e gerados usando qualquer método conhecido na técnica; veja, por exemplo, Patentes U.S. N°s 6.211.428, 6.187.992, 6.156.952, 6.118.044, 6.111.166, 6.107.541, 5.959.171, 5.922.854, 5.892.070, 5.880.327, 5.891.698, 5.639.940, 5.573.933, 5.387.742, 5.087.571, descrevendo a preparação e uso de células transformadas e ovos e camundongos transgênicos, ratos, coelhos, ovelhas, porcos e vacas. Veja também, por exemplo, Pollock (1999) J. Immunol. Methods 231:147-157, descrevendo a produção de proteínas recombinantes no leite de animais de leiteria transgênicos; Baguisi (1999) Nat. Biotechnol. 17:456-461, demonstrando a produção de cabras transgêni- cas. Patente U.S. N° 6.211.428, descreve a preparação e uso de mamíferos não-humanos transgênicos que expressam em seus cérebros uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de DNA. A Patente U.S. N°. 5.387.742, descreve a injeção de sequências de DNA recombinante clonado ou sintético em ovos de camundongos fertilizados, implantando os ovos injetados em fêmeas pseudográvidas, e desenvolvendo camundongos transgênicos a termo, em que as células expressam proteínas relacionadas com a patologia de doença de Alzheimer. A Patente U.S. N° 6.187.992, descreve a preparação e uso de um camundongo transgênico cujo genoma compreende um rompimento do gene codificando proteína precursora ami- loide (APP). "Animais de nocaute" também podem ser usados para praticar os métodos como fornecidos aqui. Por exemplo, em um aspecto, os animais modificados ou transgênicos como fornecidos aqui compreendem um "animal de nocaute," por exemplo, um "camundongo de nocaute," construído não para expressar um gene endógeno, que é substituído com um gene expressando uma hidrolase, ou, uma proteína de fusão compreendendo uma hidrolase como fornecida aqui. Como notado acima, nocautes funcionais também podem ser gerados usando sequências antissentido como fornecido aqui, por exemplo, moléculas de RNAi de filamento duplo.

Sementes e Plantas Transgênicas

Em certas modalidades, são fornecidas aqui, sementes e plantas transgênicas compreendendo um ácido nucleico, um polipeptídeo (por exemplo, uma hidrolase ou um anticorpo como fornecido aqui), um vetor ou cassete de expressão ou uma célula transformada ou transfectada como fornecido aqui. A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Em uma modalidade, são fornecidos aqui, métodos de preparar e usar estas sementes e plantas transgênicas. A planta transgênica ou célula de planta expressando um polipeptídeo como fornecido aqui, pode ser construída de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.309.872.

Construções de expressão e ácidos nucleicos como fornecido aqui, podem ser introduzidas em uma célula de planta por quaisquer meios. Por exemplo, as construções de expressão e ácidos nucleicos podem ser introduzidas no genoma de um hospedeiro de planta desejado, ou, as construções de expressão ou ácidos nucleicos podem ser epissomas. A introdução no genoma de uma planta desejada pode ser tal que a produção de hi- drolase de hospedeiro seja regulada por elementos de controle translacional ou transcricional endógenos. Em um aspecto, são fornecidos aqui, "plantas de nocaute", onde a inserção de sequência de gene por, por exemplo, re- combinação homóloga, tem rompido a expressão do gene endógeno. Meios de gerar plantas de "nocaute" são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Strepp (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4368 - 4373; Miao (1995) Plant J 7:359 - 365. Veja a discussão sobre plantas transgênicas, abaixo.

Os ácidos nucleicos como fornecido aqui, podem ser usados para conferir as características desejadas especialmente em qualquer planta, por exemplo, em plantas de produção de sementes oleosas, incluindo, farelo de arroz, semente de colza (canola), girassol, azeitona, palma ou soja, e similares, ou em glicose ou plantas de produção de amido, tais como milho, batata, trigo, arroz, cevada e similares. Ácidos nucleicos como fornecidos aqui podem ser usados para manipular as séries de reação metabólicas de uma planta, a fim de otimizar ou alterar a expressão de hospedeiro de uma hidrolase ou um substrato ou produto de uma hidrolase, por exemplo, um óleo, um lipídeo, tal como, mono-, di- ou triacilglicerídeo e similares. Eles podem mudar as relações de lipídeos, conversão de lipídeos e renovação em uma planta. Isto pode facilitar o processo inicial em uma planta. Alternativamente, hidrolases como fornecido aqui, podem ser usadas na produção de uma planta transgênica, para produzir um composto não naturalmente produzido por essa planta. Isto pode diminuir os custos de produção ou criar um novo produto.

Em um aspecto, a primeira etapa na produção de uma planta transgênica envolve preparar uma construção de expressão para expressão em uma célula de planta. Estas técnicas são bem-conhecidas na técnica. Elas podem incluir a seleção e clonagem de um promotor, uma sequência de codificação para facilitar a ligação eficiente de ribossomas em mRNA e seleção das sequências terminadoras de gene apropriadas. Um promotor constitutivo exemplar é CaMV35S, do vírus mosaico da couve-flor, que geralmente resulta em um grau elevado de expressão em plantas. Outros promotores são mais específicos e respondem aos estímulos no ambiente externo ou interno de planta. Um promotor induzível a luz exemplar, é o promotor do gene cab, codificando a proteína de ligação a/b de clorofila principal.

Em um aspecto, o ácido nucleico é modificado para obter a expressão maior em uma célula de planta. Por exemplo, uma sequência como fornecido aqui é provável de ter uma porcentagem mais alta de pares de nu- cleotídeo A-T comparada àquela vista em uma planta, uma parte da qual prefere pares de nucleotídeo G-C. Portanto, os nucleotídeos A-T na sequên- cia de codificação podem ser substituídos com nucleotídeos G-C sem signi- ficantemente mudar a sequência de aminoácido para realçar a produção do produto de gene em células de planta.

O gene marcador selecionável pode ser adicionado á construção de gene, a fim de identificar tecidos ou células de planta que tenham bem- sucedidamente integrado o transgene. Isto pode ser necessário porque, obter a incorporação e expressão de genes em células de planta é um evento raro, ocorrendo justamente em alguns percentuais das células ou tecidos alvejados. Genes marcadores selecionáveis codificam proteínas que fornecem resistência aos agentes que são normalmente tóxicos às plantas, tais como antibióticos ou herbicidas. Apenas as células de planta que têm integrado o gene marcador selecionável sobreviverão quando desenvolvidas em um meio contendo o herbicida ou antibiótico apropriado. Como para outros genes inseridos, genes marcadores também requerem sequências de terminação e promotor para a própria função.

Em um aspecto, preparar sementes ou plantas transgênicas compreende incorporar sequências como fornecido aqui e, opcionalmente, genes marcadores em uma construção de expressão-alvo (por exemplo, um plasmídeo, um fago), junto do posicionamento do promotor e das sequências terminadoras. Isto pode envolver transferir o gene modificado na planta através de um método adequado. Por exemplo, uma construção pode ser introduzida diretamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como, eletroporação e microinjeção de protoplastos de célula de planta, ou as construções podem ser introduzidas diretamente em tecido de planta usando métodos balísticos, tal como bombardeio de partícula de DNA. Por exemplo, veja, por exemplo, Christou (1997) Plant Mol. Biol. 35: 195 - 203; Pawlowski (1996) Mol. Biotechnol. 6: 17 - 30; Kelin (1987) Nature 327: 70 - 73; Takumi (1997) Genes Genet. Syst. 72: 63 - 69, discutindo o uso de bombardeio de partícula para introduzir transgenes em trigo; e Adam (1997) supra, para uso de bombardeio de partícula para introduzir YACs em células de planta. Por exemplo, Rinehart (1997) supra, usou bombardeio de partícula para gerar plantas de algodão transgênicas. Mecanismos para acelerar partículas são descritos na Patente U.S. No. 5.015.580; e, BioRad comercialmente disponível (Biolistics) instrumento de aceleração de partícula PDS- 2000; veja também, John, Patente U.S. No. 5.608.148; e Ellis, Patente U.S. No. 5.681.730, que descreve a transformação mediada por partícula de gim- nospermas .

Em um aspecto, os protoplastos podem ser imobilizados e injetados com um ácido nucleico, por exemplo, uma construção de expressão. Embora a regeneração da planta dos protoplastos não seja fácil com cereais, a regeneração da planta é possível em legumes usando embriogênese somática de calo derivado de protoplasto. Os tecidos organizados podem ser transformados com DNA nu usando técnica de pistola de gene, onde o DNA é revestido em microprojéteis de tungstênio, disparo 1/100o o tamanho das células, que transmitem a profundidade do DNA em células e organelas. O tecido transformado é então induzido para regenerar, usualmente por em- briogênese somática. Esta técnica foi bem-sucedida em várias espécies de cereal, incluindo milho e arroz.

Ácidos nucleicos, por exemplo, construções de expressão, também podem ser introduzidos em células de planta usando vírus recombinan- tes. As células de planta podem ser transformadas usando vetores virais, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus mosaico do tabaco (Rouwendal (1997) Plant Mol. Biol. 33:989 - 999), veja Porta (1996) "Use of viral replicons for the expression of genes in plants," Mol. Biotechnol. 5:209 - 221.

Alternativamente, os ácidos nucleicos, por exemplo, uma construção de expressão, podem ser combinados com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidos em um vetor hospedeiro de Agrobacte-rium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens conduzirão a inserção da construção e marcador adjacente no DNA de célula de planta, quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas por Agrobacterium tumefaciens, incluindo o desarmamento e uso de vetores binários, são bem descritas na literatura científica. Veja, por exemplo, Horsh (1984) Science 233:496 - 498; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803 (1983); Gene Transfer to Plants, Potrykus, ed. (Springer-Verlag, Berlin 1995). O DNA em uma célula de A. tumefaciens está contido no cromossoma bacteriano bem como em outra estrutura conhecida como um plasmídeo Ti (indução de tumor). O plasmídeo Ti contém uma extensão de DNA denominada T-DNA (~20 kb longo) que é transferida á célula de planta no processo de infecção e uma série de genes vir (virulência) que conduzem o processo de infecção. A. tu- mefaciens pode apenas infectar uma planta através de ferimentos: quando um caule ou raiz de planta é ferido, ela produz certos sinais químicos, em resposta aos quais, os genes vir de A. tumefaciens tornam ativados e conduzem uma série de eventos necessários para a transferência de T-DNA do plasmídeo Ti para o cromossoma da planta. O T-DNA então entra na célula da planta através do ferimento. Uma especulação é que o T-DNA espera até que o DNA da planta esteja sendo replicado ou transcrito, em seguida se insere no DNA da planta exposta. A fim de usar A. tumefaciens como um vetor de transgene, a seção de indução de tumor de T-DNA tem de ser re-movida, enquanto mantendo as regiões da margem do T-DNA e os genes vir. O transgene é então inserido entre as regiões da margem do T-DNA, em que é transferido para a célula da planta e torna-se integrado nos cromossomas da planta.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui, métodos para a transformação de plantas monocotiledôneas usando os ácidos nucleicos como fornecido aqui, incluindo cereais importantes, veja, Hiei (1997) Plant Mol. Biol. 35:205 - 218. Veja também, por exemplo, Horsch, Science (1984) 233:496; Fraley (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803; Thykjaer (1997) supra; Park (1996) Plant Mol. Biol. 32:1135 - 1148, discutindo a integração de T-DNA em DNA genômico. Veja também D'Halluin, Patente U.S. No. 5.712.135, descrevendo um processo para a integração estável de um DNA compreendendo um gene que é funcional em uma célula de um cereal, ou outra planta monocotiledônea.

Em um aspecto, a terceira etapa pode envolver a seleção e re-generação de plantas ilesas capazes de transmitir o gene-alvo incorporado para a próxima geração. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente contando com um marcador de herbicida e/ou biocida que foi introduzido juntamente com as sequências de nucleotídeo desejadas. A regeneração da planta de protoplastos cultivados é descrita em Evans e outros, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124 - 176, MacMillilan Publishing Company, Nova Iorque, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21- 73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida do calo da planta, explantes, órgãos, ou partes destes. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467 - 486. Para obter as plantas ilesas dos tecidos transgênicos tais como embriões imaturos, elas podem ser desenvolvidas sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecido. Logo que as plantas ilesas são geradas e produzem semente, a avaliação da descendência começa.

Depois que o cassete de expressão é estavelmente incorporado em plantas transgênicas, ele pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Quaisquer dentre várias técnicas de reprodução padrão podem ser usadas, dependendo das espécies a serem cruzadas. Logo que a expressão transgênica dos ácidos nucleicos como fornecido aqui induz às mudanças fenotípicas, plantas compreendendo os ácidos nucleicos recom- binantes como fornecido aqui, podem ser sexualmente cruzadas com uma segunda planta para obter um produto final. Desse modo, a semente como fornecido aqui, pode ser derivada de um cruzamento entre duas plantas transgênicas como fornecido aqui, ou um cruzamento entre uma planta como fornecido aqui e outra planta. Os efeitos desejados (por exemplo, expressão dos polipeptídeos como fornecido aqui para produzir uma planta com teor de óleo ou lipídeo alterado, aumentado ou diminuído) podem ser realçados quando ambas as plantas parentais expressam os polipeptídeos como fornecido aqui. Os efeitos desejados podem ser passados para gerações de planta futuras por meio de propagação padrão.

Os ácidos nucleicos e polipeptídeos como fornecido aqui são expressos em ou inseridos em qualquer planta ou semente. Plantas trans- gênicas como fornecido aqui, podem ser dicotiledôneas ou monocotiledô- neas. Exemplos de plantas transgênicas monocot como fornecido aqui são gramas, tais como grama de campina (grama azul, Poa), grama de forragem tais como festuca, lolium, grama branda, tal como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (cereal). Exemplos de plantas transgênicas dicot como fornecido aqui são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e feijão-soja, e plantas cruciferous (família Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thalia- na. Desse modo, as sementes e plantas transgênicas como fornecido aqui incluem uma ampla faixa de plantas, incluindo, porém não limitadas às espécies do gênero Anacardium, Arachis, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hor- deum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Ma- lus,Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea, Oryza, Panieum, Panni- setum,Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Rici- nus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna e Zea.

Em modalidades alternatives, os ácidos nucleicos como fornecido aqui são expressos em plantas que contêm células de fibra, incluindo, por exemplo, algodão, árvore de algodão de seda (Kapok, Ceiba pentandra), salgueiro do deserto, arbusto de creosoto, flor de inverno, balsa, ramie, ke- naf, cânhamo, roselle, juta, abaca de sisal e linho. Em modalidades alternatives, as plantas transgênicas como fornecido aqui podem ser membros do gênero Gossypium, incluindo membros de quaisquer espécies Gossypium, tais como G. arboreum, G. herbaceum, G. barbadense e G. hirsutum.

Em certas modalidades, as plantas transgênicas aqui, podem ser usadas para produzir grandes quantidades dos polipeptídeos (por exemplo, anticorpos, hidrolase) como fornecido aqui. Por exemplo, veja Palmgren (1997) Trends Genet. 13:348; Chong (1997) Transgenic Res. 6:289 - 296 (produzindo beta-caseína de proteína de leite humano em plantas de batata transgênicas usando um promotor de manopina sintase (mas 1',2') bidirecional, induzível por auxina com métodos de transformação de disco de folha mediados por Agrobacterium tumefaciens).

Usando procedimentos conhecidos, alguém de experiência na técnica pode avaliar plantas como fornecido aqui, detectando-se o aumento ou diminuição de mRNA de transgene ou proteína em plantas transgênicas. Meios para detecção e quantificação de mRNAs ou proteínas são bem- conhecidos na técnica.

São fornecidos aqui, ácidos graxos ou derivados de ácido graxo de plantas transgênicas como fornecido aqui, por exemplo, plantas oleaginosas transgênicas. Em um aspecto, plantas oleaginosas transgênicas que compreendem pelo menos uma hidrolase como fornecido aqui, são produzidas. Em um aspecto, a planta transgênica compreende um gene de hidro- lase operavelmente ligado a um promotor, permitindo uma expressão do gene em compartimentos celulares, extracelulares ou de tecido diferentes daqueles nos quais os lipídeos de planta acumulam-se, ou permitindo a indução exógena da hidrolase. Em um aspecto, sementes e/ou frutas contendo os lipídeos das plantas são coletadas, as sementes e/ou frutas são esmagadas (se necessário depois da hidrolase (por exemplo, lipase, saturase, pal- mitase e/ou estearatase) tratamento por indução de gene) para trazer em contato os lipídeos ou hidrolases como fornecido aqui, contidos nas sementes e/ou frutas. A mistura pode ser permitida incubar para permitir a hidrólise enzimática dos lipídeos do material de solo por ação catalítica da lipase, como aqui fornecida, contida no material esmagado. Em um aspecto, os ácidos graxos formados pela hidrólise são extraídos e/ou convertidos para obter os derivados de ácido graxo desejados.

Este processo de hidrólise enzimática como fornecido aqui, usa condições operacionais moderadas e pode ser em pequena escala e usar instalações econômicas. Neste aspecto, a planta como fornecida aqui, é induzida para produzir uma hidrolase para transformação de lipídeos de plan ta. Usando esta estratégia, para a enzima é impedida de entrar em contato com lipídeos de planta armazenados, para evitar qualquer risco de hidrólise prematura ("autodegradação da planta") antes de colher. As unidades de esmagamento e incubação podem ser em pequena escala e leves; muitas são conhecidas na indústria agrícola e podem ser realizadas nos locais, em que as plantas são colhidas.

Em um aspecto, as plantas transgênicas como fornecido aqui são produzidas por transformação de plantas oleaginosas naturais. As plantas geneticamente transformadas como fornecido aqui são em seguida reproduzidas sexualmente para produzir sementes transgênicas como fornecido aqui. Estas sementes podem ser usadas para obter progênie de planta transgênica.

Em um aspecto, o gene de hidrolase é operavelmente ligado a um promotor induzível para impedir qualquer contato prematuro de hidrolase e lipídeo de planta. Este promotor pode direcionar a expressão do gene em compartimentos diferentes daqueles, em que os lipídeos acumulam-se ou o promotor pode iniciar a expressão da hidrolase em um momento desejado por uma indução exógena.

Polipeptídeos e peptídeos

Em certas modalidades, fornecidos aqui são polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes tendo uma identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 50% de identidade de sequência) para SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, or SEQ ID NO:20 or SEQ ID NO:2 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (várias) ou todas as variações de ácido nucleico descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23, ou o equivalente da mesma). Em certas modalidades, fornecidos aqui são ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos tendo uma sequência como mencionada em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:2 tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (várias) ou todas as variações de aminoácidos descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23, ou o equivalente da mesma.

A identidade de sequência pode estar sobre o tamanho natural do polipeptídeo, ou, a identidade pode estar em cima de uma região de pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 ou mais resíduos. Os polipeptídeos como fornecidos aqui também podem ser mais curtos que o tamanho natural dos polipeptí- deos exemplares. Em um aspecto fornecido aqui estão os polipeptídeos compreendendo apenas uma subsequência de uma sequência como fornecida aqui, subsequências exemplares podem ser cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, ou mais resíduos. Em aspectos alternativos, polipeptídeos (peptídeos, fragmentos) podem variar no tamanho entre cerca de 5 e o tamanho natural de um polipeptídeo, por exemplo, uma enzima como fornecida aqui; tamanhos exemplares sendo cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, ou mais resíduos, por exemplo, resíduos contíguos de uma hidrolase exem-plar como fornecida aqui. Peptídeos como fornecidos aqui podem ser úteis como, por exemplo, sonda de rotulagem, antígenos, toleragens, motivos, sítios ativos de hidrolase.

Polipeptídeos como fornecidos aqui também incluem anticorpos capazes de ligar-se a uma hidrolase como fornecida aqui.

Polipeptídeos como fornecidos aqui também incluem sequências de aminoácido que são "substancialmente idênticas" às sequências fornecidas aqui, incluindo sequências que são diferentes de uma sequência de referência por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoáci- do conservadoras ou não conservadoras, particularmente quando uma tal substituição ocorre em um sítio que não é o sítio ativo das moléculas, e contanto que o polipeptídeo essencialmente mantenha suas propriedades funcionais. Uma substituição de aminoácido conservadora, por exemplo, substitui um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácido hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina, ou metionina, por outra, ou substituição de um aminoácido polar por outra, tal como substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutami- na por asparagina). Um ou mais aminoácidos podem ser deletados, por exemplo, de uma hidrolase, resultando na modificação da estrutura do poli- peptídeo, sem significantemente alterar sua atividade biológica. Por exemplo, aminoácidos de terminal amino ou carboxila que não são requeridos para atividade de hidrolase podem ser removidos. "Aminoácido" ou "sequência de aminoácido" pode incluir uma sequência de oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo, ou proteína, ou a um fragmento, porção, ou subunidade de qualquer destas, e a moléculas de ocorrência natural ou sintéticas.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" podem incluir aminoácidos unidos a um ao outro por ligações de peptídeo ou ligações de peptídeo modificado, isto é, isósteres de peptídeo e podem conter aminoácidos modificados exceto os 20 aminoácidos codificados por gene. O termo "polipeptídeo" também inclui fragmentos de peptídeo e polipeptídeo, motivos e similares. O termo também inclui polipeptídeos glicosilados. Os peptídeos e polipeptídeos como fornecido aqui também incluem todas as formas "miméticas" e "pepti- domiméticas", como descrito em maiores detalhes, abaixo.

Os polipeptídeos como fornecidos aqui incluem hidrolases em uma forma ativa e inativa. Por exemplo, os polipeptídeos como fornecidos aqui incluem proproteínas antes da "maturação" ou processamento das sequências prepro, por exemplo, por uma enzima de processamento de pro- proteína, tal como uma proproteína convertase para gerar uma proteína madura "ativa". Os polipeptídios como fornecidos aqui incluem hidrolases inativas por outras razões, por exemplo, antes da "ativação" por um evento de processamento pós-translacional, por exemplo, uma ação de endo- ou exopeptidase ou proteinase, um evento de fosforilação, uma amidação, uma glicosilação ou uma sulfação, um evento de dimerização, e similares. Os métodos para identificação das sequências de domínio "prepro" e sequên- cias de sinal são bem-conhecidos na técnica, veja, por exemplo, Van de Ven (1993) Crit. Rev. Oncog. 4(2): 115-136. Por exemplo, para identificar uma sequência prepro, a proteína é purificada a partir do espaço extracelular e a sequência de proteína N-terminal é determinada e comparada com a forma não processada.

Os polipeptídeos como fornecidos aqui incluem todas as formas ativas, incluindo subsequências ativas, por exemplo, domínios catalíticos ou sítios ativos, de uma enzima como fornecidos aqui. Em certas modalidades, fornecidos aqui são domínios catalíticos ou sítios ativos como mencionados abaixo. Em outras modalidades, fornecidos aqui são peptídeos ou polipeptí- deos compreendendo ou consistindo em um domínio de sítio ativo como predito por uso de uma base de dados tal como Pfam (que é uma coleta grande de alinhamentos de sequência múltiplos e modelos Markov ocultos abrangendo muitas famílias de proteína comuns, The Pfam protein families databases, A. Bateman, E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller, S.R. Eddy, S. Griffiths-Jones, K.L. Howe, M. Marshall, e E.L.L. Sonnhammer, Nucleic Acids Research, 30(1):276-280, 2002) ou equivalente.

Em certas modalidades, fornecidos aqui são polipeptídeos com ou sem uma sequência de sinal e/ou uma sequência prepro. Em uma modalidade, fornecidos aqui são polipeptídeos com sequências de sinal heteroló- gas e/ou sequências prepro. A sequência prepro (incluindo uma sequência como fornecida aqui usada como um domínio de prepro heterólogo) pode estar localizada na extremidade de amino terminal ou de carbóxi terminal da proteína. Em outra modalidade, fornecidas aqui são sequências de sinal isoladas, sintéticas ou recombinantes, sequências prepro e domínios catalíticos (por exemplo, "sítios ativos") compreendendo ou consistindo em sequências como fornecidas aqui. A sequência de sinal, domínios de prepro e/ou domínio catalítico como fornecido aqui podem fazer parte de uma proteína de fusão, por exemplo, como um domínio heterólogo em uma proteína quimérica. Em certas modalidades, fornecidos aqui são ácidos nucleicos codificando estes domínios catalíticos (CDs), domínios de prepro e sequências de sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma sequência compreenden- do/consistindo em resíduos de terminal amino de um polipeptídeo como fornecido aqui). Em certas modalidades, fornecidas aqui são sequências de sinal compreendendo um peptídeo compreendendo/consistindo em uma sequência como mencionada em resíduos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44, 1 a 45, 1 a 46, 1 a 47, 1 a 48, 1 a 49 ou 1 a 50, de um polipeptídeo como fornecido aqui.

Os polipeptídeos e peptídeos como fornecidos aqui podem ser isolados de fontes naturais, podem ser sintéticos, ou podem ser polipeptí- deos recombinantemente gerados. Os peptídeos e proteínas podem ser re- combinantemente expressos in vitro ou in vivo. Os peptídeos e polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser feitos e isolados usando qualquer método conhecido na técnica. O polipeptídeo e peptídeos como fornecidos aqui podem também ser sintetizados, totalmente ou em parte, usando métodos químicos bem-conhecidos na técnica. Observe, por exemplo, Carthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, P.A. Por exemplo, a síntese de peptídeo pode ser realizada usando várias técnicas de fase sólida (observe, por exemplo, Roberge (1995) Science 269-202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13) e a síntese automática pode ser obtida, por exemplo, usando o Sintetizador de Peptídeo ABI 431A (Perkin Elmer) de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.

Os peptídeos e polipeptídeos como fornecidos aqui podem também ser glicosilados. A glicosilação pode ser adicionada pós- translacionalmente ou quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, onde o último incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à sequência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na sequência de codificação de ácido nucleico. A glicosilação pode ser O-ligada ou N-ligada.

Proteínas ou polipeptídeos "recombinantes" referem-se a poli- peptídeos ou proteínas produzidas por técnicas de DNA recombinantes; isto é, produzidas de células transformadas por uma construção de DNA exógena codificando o polipeptídeo ou proteína desejada. Proteína, polipeptídeos ou ácidos nucleicos "sintéticos" (inclundo oligonucleotídeos) como fornecidos aqui incluem aqueles preparados por qualquer síntese química, por exemplo, como descrito abaixo. "Fragmentos" como usados aqui são uma porção de uma proteína de ocorrência natural que pode existir em pelo menos duas conformações diferentes. Fragmentos podem ter a mesma ou substancialmente a mesma sequência de aminoácido como a proteína de ocorrência natural. "Fragmentos enzimaticamente ativos" como usados aqui são uma porção de uma sequência de aminoácido (codificando uma proteína) que mantém pelo menos uma atividade funcional da proteína a qual está relacionado. "Substancialmente a mesma" significa que uma sequência de aminoácido é grandemente, porém não totalmente, a mesma, porém mantém pelo menos uma atividade funcional da sequência à qual ela está relacionada. Em geral duas sequências de aminoácido são "substancialmente as mesmas" ou "substancialmente homólogas" se elas são pelo menos em torno de 85% idênticas. Os fragmentos que têm diferentes estruturas tridimensionais como a proteína de ocorrência natural são também incluídos. Um exemplo disto, é uma molécula "pró-forma", tal como uma proproteína de baixa atividade que pode ser modificada por clivagem para produzir uma enzima madura com atividade signifi- cantemente maior,

Os peptídeos e polipeptídeos como fornecidos aqui, como definidos acima, incluem todas as formas "miméticas" e "peptidomiméticas". Os termos "mimético" e "peptidomimético" referem-se a um composto químico sintético o qual tem substancialmente as mesmas características estruturais e/ou funcionais dos polipeptídeos fornecidos aqui. O mimético pode ser composto completamente de análogos sintéticos, não naturais de aminoáci- dos, ou, ser uma molécula quimérica de aminoácidos de peptídeo parcialmente naturais e análogos parcialmente não naturais de aminoácidos. O mimético também pode incorporar qualquer quantidade de substituições conservadoras de aminoácido natural, contanto que tais substituições também não alterem substancialmente a estrutura e/ou atividade do mimético. Como com polipeptídeos como fornecidos aqui que são variantes conservadoras, experimentação rotineira determinará se um mimético está dentro do escopo como fornecido aqui, isto é, que sua estrutura e/ou função não é alterada substancialmente. Desse modo, em um aspecto, uma composição mimética está dentro do escopo como fornecido aqui se houver uma atividade de hidrolase.

Composições miméticas de polipeptídeo como fornecidas aqui podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais. Em aspecto alternativo, composições miméticas como fornecidas aqui incluem um ou todos os seguintes três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo diferentes das ligações de união de amida natural ("ligação de peptídeo"); b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural; ou c) resíduos que induzem a imitação estrutural secundária, isto é, para induzir ou estabilizar uma estrutura secundária, por exemplo, uma volta beta, volta gama, folha beta, conformação de volta helicoidal, e similares. Por exemplo, um polipeptídeo como fornecido aqui pode ser caracterizado como um mimético quando todos ou alguns de seus resíduos são unidos por meios químicos exceto as uniões de peptídeo naturais. Resíduos peptidomiméticos individuais podem ser unidos por ligações de peptídeo, outras ligações químicas ou meios de acoplamento, tal como, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissucinimida, maleimidas bifunci- onais, N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) ou N,N'-di-isopropilcarbodiimida (DIC). Os grupos de ligação que podem ser uma alternativa para as ligações de união de amida tradicional ("união de peptídeo") incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, -C(=O)-CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-O), tioéter (CH2S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida, ou éster (veja, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide Backbone Modifications," MArcell Dekekr, NY).

Um polipeptídeo como fornecido aqui pode também ser caracterizado como um mimético contendo todos ou alguns resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácidos de ocorrência natural. Os resíduos não naturais são bem descritos na literatura da patente e científica; algumas composições não naturais exemplares úteis como miméticos de resíduos de aminoácidos naturais e normas são descritas abaixo. Os miméticos de ami- noácidos aromáticos podem ser gerados substituindo-se por, por exemplo, D- ou L-nafilalanina; D- ou L-fenilglicina; D- ou L-2-tienilalanina; D- ou L-1, - 2, -3 ou 4-pireneilalanina; D- ou L-3 tieneilalanina; D- ou L-(2-piridinil)- alanina; D- ou L-(3-piridinil)-alanina; D- ou L-(2-pirazinil)-alanina), D- ou L-(4- isopropil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)-fenilglicina; D-(trifluorometil)- fenilalanina; D-p-fluoro-fenilalanina; D- ou L-p-bifenilfenilalanina; D- ou L-p- metóxi-bifenilfenilalanina; D- ou L-2-indol(alquil)alanina; e D- ou L- alquilaininas, onde a alquila pode ser metila, etila, propila, hexila, butila, pentila, isopropila, iso-butila, sec-isotila, iso-pentila substituídas ou não substituídas, ou um aminoácido não-ácido. Os grupos aromáticos de aminoácido não natural incluem, por exemplo, anéis aromáticos de tiazolila, tiofenila, pi- razolila, benzimidazolila, naftila, furanila, pirrolila, e piridila.

Os miméticos de aminoácidos ácidos podem ser gerados substituindo-se por, por exemplo, aminoácidos não carboxilados ao mesmo tempo em que mantendo uma carga negativa; (fosfono)alanina; treonina sulfatada. Os grupos laterais de carboxila (por exemplo, aspartila ou glutamila) podem também ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R'- N-C-N-R') tal como, por exemplo, 1-ciclo-hexil-3(2-morfolinil-(4-etil) carbodii- mida ou 1-etil-3(4-azonia-4,4-dimetolpentil)carbodiimida. Aspartila ou gluta- mila podem também ser convertidas para resíduos de asparaginila e gluta- minila pela reação com íons de amônio. Os miméticos de aminoácidos básicos podem ser gerados por substituição com, por exemplo, (além da lisina e arginina) a ornitina, citrulina, ou ácido (guanidino)-acético, ou ácido (guanidi- no)alquil-acético de aminoácidos, onde alquila é definida acima. O derivado de nitrila (por exemplo, contendo a porção de CN no lugar de COOH) pode ser substituido por asparagina ou glutamina. Os resíduos de asparaginila e glutaminila podem ser desaminados pelos resíduos de aspartila ou glutamila correspondentes. Os miméticos de resíduo de arginina podem ser gerados reagindo-se a arginila com, por exemplo, um ou mais reagentes convencionais, incluindo, por exemplo, fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclo- hexanodiona, ou ninidrina, alternativamente sob condições alcalinas. Os mi- méticos de resíduo de tirosina podem ser gerados reagindo-se a tirosila com, por exemplo, compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. O N- acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar as espécies de O-acetil tirosila e derivados de 3-nitro, respectivamente. Os miméticos de resíduo de cisteína podem ser gerados reagindo-se os resíduos de cisteinila com, por exemplo, alfa-haloacetatos tal como ácido 2-cloroacéticos ou cloro- acetamidas e aminas correspondentes; para produzir derivados de carboxi- metila ou carboxiamidometila. Os miméticos de resíduo de cisteína podem também ser gerados reagindo-se os resíduos de cisteinila com, por exemplo, bromo-trifluoroacetona, ácido alfa-bromo-beta-(5-imidozoil)propiônico; fosfato de cloroacetila, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridila; dissulfe- to de metil 2-piridila; p-cloromercuribenzoato; 2-cloromercuri-4-nitrofenol; ou, cloro-7-nitrobenzo-oxa-1,3-diazol. Os miméticos de lisina podem ser gerados (e resíduos de amino terminal podem ser alterados) reagindo-se a lisinila com, por exemplo, succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico. A lisina e outros miméticos de resíduo contendo alfa-amino podem também ser gerados pela reação com imidoésteres, tal como picolinimidato de metila, fosfato piridoxal, piridoxal, cloroboroidreto, ácido trinitro-benzenossulfônico, O-metilisoureia, 2,4,pentanodiona, e reações catalisadas por transamidase com glioxilato. Os miméticos de metionina podem ser gerados pela reação com, por exemplo, sulfóxido de metionina. Os miméticos de prolina incluem, por exemplo, ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, prolina de 3- ou 4-hidróxi, desidroprolina, 3- ou 4-metilprolina, ou 3,3-dimetilprolina. Os mimé- ticos de resíduo de histidina podem ser gerados reagindo-se histidila com, por exemplo, brometo de para-bromofenacila ou dietilprocarbonato. Outros miméticos incluem, por exemplo, aqueles gerados por hidroxilação de prolina e lisina; fosforilação dos grupos de hidroxila de resíduos de serila ou treonila; metilação dos grupos de alfa-amino de lisina, arginina e histidina; a acetila- ção da amina N-terminal; metilação de resíduos de amida da cadeia principal ou substituição com aminoácidos de N-metila; ou amidação de grupos de carboxila C-terminal.

Um resíduo, por exemplo, um aminoácido, de um polipeptídeo como fornecido aqui pode também ser substituído por um aminoácido (ou resíduo peptidomimético) da quilaridade oposta. Desse modo, qualquer ami- noácido de ocorrência natural na L-configuração (que pode também ser referida como R ou S, dependendo da estrutura da entidade química) pode ser substituído com o aminoácido do mesmo tipo estrutural químico ou um pep- tidomimético, porém da quilaridade oposta, referido como o D-aminoácido, porém também pode ser referido como a forma S- ou R-.

Em certas modalidades, fornecidos aqui são métodos para modificar os polipeptídeos como fornecidos aqui por processos naturais, tal como processamento pós-translacional (por exemplo, fosforilação, acilação, etc), ou por técnicas de modificação química, e os polipeptídeos modificados resultantes. As modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptí- deo, incluindo o esqueleto de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e o amino ou carboxila terminal. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em graus variantes em vários sítios em um determinado polipeptídeo. Também um determinado polipeptídeo pode ter muitos tipos de modificações. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção de heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de um fosfatidilinositol, ciclização de reticulação, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, ga- ma-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, io- dação, metilação, miristoliação, oxidação, pegilação, processamento proteo- lítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfação, e adição mediada por transferência de RNA de aminoácidos em proteína tal como arginilação. Observe, por exemplo, Creighton, T.E., Proteins - Struture and Molecular Properties 2a Edição, W.H. Freeman and Company New York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pp. 1-12 (1983).

Os métodos de síntese de peptídeo químicos de fase sólida também podem ser empregados para sintetizar o polipeptídeo ou fragmentos dos mesmos. Tal método é conhecido na técnica desde o início de 1960 (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154, 1963) (Veja também Stewart, J.M. e Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a Edição, Pierce Chemical Co., Rockford, III, pp,11-12) e foi recentemente empregado em kits de síntese e esboço de peptídeo de laboratório comercialmente disponível (Cambridge Research Biochemical). Tais kits de laboratório comercialmente disponíveis têm geralmente utilizado os ensinamentos de H.M. Gey- sen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3998 (1984) e fornecem a subsistência da sintetização de peptídeos nas pontas de uma multidão de "bastões" e "pinos" todos os quais estão conectados a uma única placa. Quando um tal sistema é utilizado, uma placa de bastões ou pinos é invertida e inserida em uma segunda placa de poços ou reservatórios correspondentes, os quais contêm soluções para a ligação ou ancoramento de um aminoácido apropriado às pontas de pinos ou bastões. Repetindo-se uma tal etapa do processo, isto é, invertendo e inserindo as pontas de bastão e pinos em so-luções apropriadas, os aminoácidos são formados em peptídeos desejados. Além disso, vários sistemas de síntese de peptídeo FMOC disponíveis estão disponíveis. Por exemplo, a montagem de um polipeptídeo ou fragmento pode ser realizada em um suporte sólido empregando um sintetizador de peptídeo automatizado, Inc., Model 431ATM, Applied Biosystems. Tal equipamento fornece fácil acesso aos peptídeos como aqui fornecido, por síntese direta ou por síntese de uma série de fragmentos que podem ser acoplados empregando outras técnicas conhecidas.

Enzimas

Em certas modalidades, são fornecidas aqui, hidrolases, por exemplo lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, por exemplo, proteínas que compreendem pelo menos cerca de 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais, ou identidade de sequência completa (100%), para um polipeptide exemplar como fornecido aqui (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, ou SEQ ID NO:20 ou SEQ ID NO:2 tendo um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais (vários) ou todas as variações de aminoácido descritas na Tabela 3, Tabela 4, Tabela 9, Tabela 10, Tabela 11, Tabela 16 ou Tabela 23 ou o equivalente dos mesmos, anticorpos que os ligam, e métodos para prepará-los e usá-los. Os polipeptides como fornecidos aqui, podem ter alguma atividade de hidrolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase. Em aspectos alternativos, uma atividade de uma enzima como fornecido aqui compreende hidrólise ou síntese de lipídeos ou óleos. As hidrolases como fornecidas aqui, podem modificar óleos por hidrólise, acidólise, alcoólise, glicerólise, esterificação, transesterificação e/ou interes- terificação, incluindo reações de "migração forçada".

Em aspectos alternativos, as hidrolases como fornecidas aqui, podem ter novas atividades ou modificadas quando comparado a hidrolases exemplares ou às atividades aqui descritas. São fornecidas aqui, hidrolases com e sem sequências de sinal e as sequências de sinal propriamente ditas. São fornecidas aqui, hidrolases imobilizadas, anticorpos anti-hidrolase e fragmentos dos mesmos. São fornecidas aqui, proteínas para inibir a atividade de hidrolase, por exemplo, anticorpos que ligam-se ao sítio ativo de hidro- lase. São fornecidos aqui, homodímeros e heterocomplexos, por exemplo, proteínas de fusão, heterodímeros, etc., compreendendo as hidrolases como fornecidas aqui. São fornecidas aqui, hidrolases que têm atividade em uma ampla faixa de pH's e temperaturas altas e baixas (por exemplo, condições aquosas ácidas ou básicas).

Em um aspecto, uma ou mais hidrolases (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidas aqui, são usadas para a síntese biocatalítica de lipídeos estruturados, isto é, lipídeos que contêm um conjunto definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida no esqueleto de glicerol, inclusive alternativas de manteiga de cacau, ácidos graxo poli-insaturados (PUFAs), 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), 2- monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs).

São fornecidos aqui, métodos de enzimas geradoras que têm Kcat/Km alterado (mais alto ou mais baixo). Em um aspecto, mutagênese dirigida ao sítio é usada para criar enzimas de hidrolase adicionais com especificidades de substrato alternativas. Por exemplo, isto pode ser feito redesenhando a região de ligação do substrato ou o sítio ativo da enzima. Em um aspecto, hidrolases como fornecidas aqui, são mais estáveis em altas temperaturas, como 80°C a 85°C a 90°C a 95°C, quando comparadas às hidro- lases de organismos convencionais ou moderados.

Várias proteínas como fornecidas aqui, têm uma atividade de hi- drolase, por exemplo, atividade de lipase, saturase, palmitase e/ou esteara- tase, sob várias condições. São fornecidos aqui, métodos de preparar hidro- lases com estabilidades e eficiência catalítica com respeito à temperatura, agentes de oxidação e condições de pH. Estes métodos podem usar, por exemplo, as técnicas de mutagênese dirigida ao sítio e/ou mutagênese ran- domizada. Em um aspecto, a evolução dirigida pode ser usada para produzir hidrolases com estabilidade e especificidades alternativas.

As proteínas como fornecidas aqui, são usadas em métodos que podem identificar moduladores de hidrolase, por exemplo, ativadores ou ini-bidores. Resumidamente, as amostras teste (por exemplo, compostos, tais como membros de peptídeo ou bibliotecas combinatoriais, caldos, extratos, e similares) são adicionadas aos ensaios de hidrolase para determinar sua capacidade de modular, por exemplo, inibir ou ativar a divisão de substrato. Estes inibidores podem ser usados na indústria e pesquisados para reduzir ou prevenir a isomerização indesejada. Moduladores constatados usando os métodos como fornecidos aqui, podem ser usados para alterar (por exemplo, diminuir ou aumentar) o espectro de atividade de uma hidrolase.

Em um aspecto, são fornecidos aqui, métodos de descoberta de hidrolases usando os ácidos nucleicos, polipeptídeos e anticorpos como aqui fornecidos. Em um aspecto, as bibliotecas de lâmbda fago são avaliadas quanto à descoberta com base na expressão de hidrolase. São fornecidas aqui, bibliotecas de lambda fago para uso na avaliação para permitir a detecção de clones tóxicos; acesso melhorado ao substrato; necessidade reduzida de construção de um hospedeiro, desvio do potencial para qualquer influência resultante da excisão da massa da biblioteca; e, desenvolvimento mais rápido em baixas densidades de clone. A avaliação das bibliotecas de lambda fago pode ser na fase líquida ou na fase sólida. São fornecidos aqui, métodos para avaliação na fase líquida. Isto determina uma flexibilidade maior nas condições de ensaio; flexibilidade do substrato adicional; maior sensibilidade quanto aos clones fracos; e facilidade de automatização durante a avaliação da fase sólida.

Em outras modalidades, são fornecidos aqui, métodos de avaliação usando as proteínas e ácidos nucleicos como fornecidos aqui, que envolvem automatização robótica. Isto permite a execução de milhares de reações biocatalíticas e ensaios de avaliação em um curto período de tempo, por exemplo, por dia, bem como a garantia de um nível elevado de exatidão e reprodutibilidade (observe a discussão das disposições, abaixo). Como um resultado, uma biblioteca de compostos derivados pode ser produzida em uma questão de semanas.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui, enzimas de hidro- lase que são hidrolases de ocorrência não natural que têm uma atividade de hidrolase diferente, estabilidade, especificidade de substrato, perfil de pH e/ou desempenho característico quando comparado à hidrolase de ocorrência não natural. Estas hidrolases têm uma sequência de aminoácido não encontrada na natureza. Elas podem ser derivadas por substituição de uma pluralidade de resíduos de aminoácido de uma hidrolase precursora com aminoácidos diferentes. A hidrolase precursora pode ser uma hidrolase de ocorrência natural ou uma hidrolase recombinante. Em um aspecto, as vari- antes de hidrolase abrangem a substituição de quaisquer dos L-aminoácidos de ocorrência natural nas posições de resíduo de aminoácido designadas.

Sequências de sinal de hidrolase, domínios catalíticos e prepro

Em certas modalidades, são fornecidas aqui, sequências de sinal (por exemplo, peptídeos de sinal (SPs)), domínios prepro e domínios catalíticos (CDs). Os SPs, domínios prepro e/ou CDs como fornecidos aqui, podem ser peptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes ou podem fazer parte de uma proteína de fusão, por exemplo, como um domínio heterólogo em uma proteína quimérica. Em certas modalidades, são fornecidos aqui, ácidos nucleicos codificando esses domínios catalíticos (CDs), domínios prepro e sequências de sinal (SPs, por exemplo, um peptídeo tendo uma sequência compreendendo/consistindo em resíduos de amino terminal de um polipeptídeo como fornecido aqui). Em certas modalidades, são fornecidas aqui, sequências de sinal compreendendo um peptídeo compreenden- do/consistindo em uma sequência apresentada nos resíduos 1 a 12, 1 a 13, 1 a 14, 1 a 15, 1 a 16, 1 a 17, 1 a 18, 1 a 19, 1 a 20, 1 a 21, 1 a 22, 1 a 23, 1 a 24, 1 a 25, 1 a 26, 1 a 27, 1 a 28, 1 a 28, 1 a 30, 1 a 31, 1 a 32, 1 a 33, 1 a 34, 1 a 35, 1 a 36, 1 a 37, 1 a 38, 1 a 39, 1 a 40, 1 a 41, 1 a 42, 1 a 43, 1 a 44 (ou um peptídeo mais longo) de um polipeptídeo como fornecido aqui. Em uma modalidade, são fornecidas aqui, sequências de sinal recombinantes compreendendo/consistindo em uma sequência de sinal como fornecido aqui, derivada de outra enzima como fornecida aqui, ou outro tipo de enzima ou polipeptídeo.

As sequências de sinal de hidrolase (SPs), CDs e/ou sequências de prepro como fornecidas aqui, podem ser peptídeos isolados, ou, sequências unidas à outra hidrolase ou um polipeptídeo de não hidrolase, por exemplo, como uma proteína de fusão (quimérica). Em certas modalidades, são fornecidos aqui polipeptídeos compreendendo sequências de sinal de hidrolase como aqui fornecido. Em um aspecto, os polipeptídeos compreendendo sequências de sinal de hidrolase SPs, CDs e/ou prepro, como aqui fornecido, compreendem sequências heterólogas a hidrolases como aqui fornecido (por exemplo, uma proteína de fusão compreendendo um SP, CD e/ou prepro, como aqui fornecido, e sequências de outra proteína hidrolase ou não hidrolase). São fornecidas aqui, hidrolases como fornecidas aqui, com sequências SPs, CDs e/ou prepro heterólogas, por exemplo, as sequências com uma sequência de sinal de levedura. Uma hidrolase como fornecida aqui, pode compreender um SP e/ou prepro heteróloga em um vetor, por exemplo, um vetor de série pPIC (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Em um aspecto, as sequências SPs, CDs e/ou prepro como fornecido aqui, são identificadas após a identificação de novos polipeptídeos de hidrolase. As séries de reação pelas quais as proteínas são classificadas e transportadas para sua própria localização celular são muitas vezes referidas como séries de reação de alvejamento de proteína. Um dos elementos mais importantes em todos esses sistemas alvejantes, é uma sequência curta de aminoácido no amino terminal de um polipeptídeo recentemente sintetizado chamada de sequência de sinal. Esta sequência de sinal direciona uma proteína para sua localização apropriada na célula e é removida durante o transporte ou quando a proteína alcança seu destino final. A maioria das proteínas secretadas, membrana ou lisossomais têm uma sequência de sinal de amino terminal que as marca para a translocação no lúmen do retículo endoplasmático. As sequências de sinal podem variar no comprimento de 13 a 45 resíduos de aminoácido. Vários métodos de reconhecimento de sequências de sinal são conhecidos por aqueles de experiência na técnica. Por exemplo, em um aspecto, novos peptídeos de sinal de hidrolase são identificados por um método referido como Sinal P. O Sinal P utiliza uma estrutura neural combinada que reconhece ambos peptídeos de sinal e seus sítios de clivagem. (Nielsen, e outros, "Identidication of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and preciption of their cleavage sites." Protein Engineering, volume 10, no 1, p. 1-6 (1997))

Deveria ser entendido que em alguns aspectos as hidrolases como aqui fornecido, podem não ter sequências SPs e/ou prepro, e/ou domínios catalíticos (CDs). Em um aspecto, são fornecidos aqui polipeptídeos (por exemplo, hidrolases) necessitando de parte ou toda uma SP, um CD e/ou um domínio prepro. Em outro aspecto, são fornecidos aqui, ácidos nu- cleicos que codificam uma sequência de sinal (SP), um CD e/ou prepro de uma hidrolase operavelmente ligada a uma sequência de ácido nucleico de uma hidrolase diferente ou, opcionalmente, uma sequência de sinal (SPs) e/ou domínio prepro de uma proteína de não hidrolase pode ser desejado.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui, polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes compreendendo sequências de sinal (SPs), domínio prepro e/ou domínios catalíticos (CDs) como aqui fornecidos, e sequências heterólogas. As sequências heterólogas são sequências não naturalmente associadas (por exemplo, a uma hidrolase) com uma SP, domínio prepro e/ou CD. A sequência a qual a SP, domínio prepro e/ou CD não estão naturalmente associados, pode estar na extremidade amino terminal da SP, domínio prepro e/ou CD, extremidade carbóxi terminal e/ou em ambas extremidades da SP e/ou CD. Em certas modalidades, são fornecidos aqui, polipeptídeos isolados, sintéticos ou recombinantes compreendendo (ou consistindo em) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) como aqui fornecido com a condição de que não esteja associado com qualquer sequência a qual seja naturalmente associado (por exemplo, sequência de hidrolase). São fornecidos aqui, ácidos nucleicos isolados ou recombinantes codificando esses polipeptídeos. Desse modo, em um aspecto, o ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante como fornecido aqui, compreende codificar a sequência para uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) como fornecido aqui, e uma sequência heteróloga (isto é, uma sequência não naturalmente associada com uma sequência de sinal (SP), domínio prepro e/ou domínio catalítico (CD) como fornecido aqui). A sequência heteróloga pode estar na extremidade 3' terminal, extremidade 5' terminal, e/ou em ambas extremidades da sequência de codificação de SP, domínio prepro e/ou CD.

Em certas modalidades, é fornecida aqui, fusão de subsequên- cias N-terminal ou C-terminal de enzimas como fornecida aqui, (por exemplo, sequências de signal, sequências prepro) com outros polipeptídeos, proteínas ativas ou fragmentos de proteína. A produção de uma enzima como fornecido aqui (por exemplo, a hidrolase, por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) também pode ser realizada expressando-se a enzima como uma proteína de fusão inativa, que é ativada depois por um evento de clivagem proteolítica (usando uma atividade de protease endógena ou exógena, por exemplo, tripsina) que resulta na separação do par de proteína de fusão e da enzima madura, por exemplo, hidrolase como fornecido aqui. Em um aspecto, a proteína de fusão como fornecida aqui, é expressa de uma construção de nucleotídeo híbrido, que codifica uma única estrutura de leitura aberta que contém os seguintes elementos: a sequência de nucleotídeo para a proteína de fusão, uma sequência lgadora (definida como uma sequência de nucleotídeo que codifica uma sequência de amino- ácido flexível, que une dois domínios de proteína menos flexíveis), sítio de reconhecimento de clivagem de protease, e a sequência de enzima madura (por exemplo, qualquer enzima como fornecida aqui, por exemplo, uma hi- drolase). Em aspectos alternativos, a proteína de fusão pode compreender uma sequência de pectato liase, uma sequência de xilanase, uma sequência de ácido fosfatídico fosfatase, ou outra sequência, por exemplo, a sequência que mostrou previamente ser superexpressada em um sistema hospedeiro de interesse. Qualquer sistema hospedeiro pode ser usado (veja a discussão, acima), por exemplo, E. coli ou Pichia pastoris. A disposição das sequências de nucleotídeo na construção de nucleotídeo quimérica pode ser determinada com base nos níveis de expressão de proteína alcançados com cada construção de fusão. Procedendo da extremidade 5' da construção de nucleotídeo para a extremidade 3' principal do construto, em um aspecto, as sequências de nucleotídeo são agrupadas como segue: sequência de si- nal/proteína de fusão/sequência ligadora/sítio de reconhecimento de clivagem de protease/enzima madura (por exemplo, qualquer enzima como fornecida aqui, por exemplo, uma hidrolase) ou sequência de sinal/sequência pro/enzima madura/sequência ligadora/proteína de fusão. A expressão de enzima (por exemplo, qualquer enzima como fornecida aqui, por exemplo, uma hidrolase) como uma proteína de fusão inativa, pode melhorar a ex-pressão global da sequência da enzima, pode reduzir qualquer toxicidade potencial associada com a superprodução de enzima ativa e/ou pode aumentar a vida de prateleira da enzima antes do uso, porque a enzima seria inativa até a proteína de fusão por exemplo pectato liase ser separada da enzima, por exemplo, hidrolase como fornecida aqui.

Em uma modalidade, são fornecidas aqui, formulações específicas para a ativação de uma hidrolase como fornecida aqui, expressa como uma proteína de fusão. Em um aspecto, a ativação da atividade de hidrolase inicialmente expressa como uma proteína de fusão inativa é realizada usando uma atividade proteolítica ou potencialmente uma atividade proteolítica em combinação com uma peptidase amino-terminal ou carboxil-terminal (a peptidase pode ser uma enzima como fornecida aqui, ou, outra enzima). Este evento de ativação pode ser realizado de uma variedade de modos, e em uma variedade de pontos no processo de fabricação/armazenagem antes da aplicação em desengomador de óleo. Processos exemplares como fornecidos aqui incluem: clivagem por uma atividade endógena expressa pela fabricação de hospedeiro na secreção da construção de fusão nos meios de fermentação; clivagem por uma atividade de protease endógena, que é ativada ou entra em contato com a construção de fusão intracelularmente expressa na ruptura das células hospedeiras; passagem da construção de fusão bruta ou purificada em uma coluna de atividade de protease imobilizada para realizar a clivagem e ativação de enzima (por exemplo, hidrolase como fornecida aqui, por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) antes da formulação de enzima; tratamento da construção de fusão bruta ou purificada com uma fonte solúvel de atividade proteolítica; ativação de uma hidrolase (por exemplo, uma hidrolase como fornecida aqui) na refinaria de óleo usando uma fonte solúvel ou insolúvel de atividade proteolítica imediatamente antes do uso no processo; e/ou, ativação da atividade de hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase como fornecida aqui) por circulação contínua da formulação de construção de fusão através da coluna de atividade de protease imobilizada em temperatura reduzida (por exemplo, qualquer entre cloreto de 4°C e 20°C). Este evento de ativação pode ser realizado antes da liberação ao sítio de uso ou pode ocor- rer no local na refinaria de óleo.

Glicosilação

Os peptídeos e polipeptídeos como fornecidos aqui (por exemplo, hidrolases, anticorpos) podem também pode ser glicosilados, por exemplo, em um aspecto, compreendendo pelo menos um sítio de glicosilação, por exemplo, glicosilação ligada a N ou ligada a O. Em um aspecto, o poli- peptídeo pode ser glicosilado depois de ser expresso em um P. pastoris ou um S. pombe. A glicosilação pode ser adicionada pós-translacionalmente quimicamente ou por mecanismos biossintéticos celulares, em que o último incorpora o uso de motivos de glicosilação conhecidos, que podem ser nativos à sequência ou podem ser adicionados como um peptídeo ou adicionados na sequência de codificação de ácido nucleico.

Hidrolases híbridas e bibliotecas de peptídeo

Em certas modalidades, fornecidas aqui são hidrolases híbridas (por exemplo, proteínas sintéticas), proteínas de fusão, incluindo bibliotecas de peptídeo, compreendendo as sequências como fornecidas aqui. As bibliotecas de peptídeos como fornecidas aqui podem ser usadas para isolar os moduladores de peptídeo (por exemplo, ativadores ou inibidores) dos alvos. As bibliotecas de peptídeo como fornecidas aqui podem ser usadas para identificar os pares de ligação formal dos alvos, tais como ligantes, por exemplo, citocinas, hormônios e similares.

Em um aspecto, as proteínas de fusão como fornecidas aqui (por exemplo, a porção de peptídeo) são conformacionalmente estabilizadas (relativas aos peptídeos lineares) para permitir uma maior afinidade de aglutinação para os alvos. Em outro aspecto, fornecidas aqui são fusões de hi- drolases como fornecidas aqui e outros peptídeos, incluindo peptídeos ran- domizados e conhecidos. Eles podem ser fundidos de uma tal maneira que a estrutura da enzima ou anticorpo (por exemplo, hidrolases) não seja signifi- cantemente perturbada e o peptídeo seja metabolicamente ou estruturalmente conformacionalmente estabilizado. Isto permite a criação de uma biblioteca de peptídeo que é facilmente monitorada igualmente para sua presença nas células e sua quantidade.

As variantes da sequência de aminoácido como fornecidas aqui podem ser caracterizadas por uma natureza predeterminada da variação, uma característica que os estabelece à parte de uma forma de ocorrência natural, por exemplo, uma variação de interespécies ou alélica de uma sequência de hidrolase. Em um aspecto, as variantes como fornecidas aqui exibem a mesma atividade biológica qualitativa como os análogos de ocorrência natural. Alternativamente, as variantes podem ser selecionadas para ter características modificadas. Em um aspecto, ao mesmo tempo em que o sítio ou região para a introdução de uma variação de sequência de aminoá- cido é predeterminado, a mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, a fim de otimizar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, a mutagênse randomizada pode ser conduzida na região ou códon-alvo e as variantes de hidrolase expressas avaliadas quanto à combinação ideal da atividade desejada. As técnicas para fazer as mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA tendo uma sequência conhecida são bem-conhecidas, como discutido aqui, por exemplo, a mutagê- nese do iniciador M13 e mutagênese de PCR. A avaliação dos mutantes pode ser feita usando ensaios de atividades proteolíticas. Em aspectos alternativos, as substituições de aminoácido podem ser resíduos únicos; as inserções podem estar na ordem de cerca de 1 a 20 aminoácidos, embora inser-ções consideravelmente maiores possam ser feitas. As deleções podem variar de cerca de 1 a cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70 resíduos ou mais. Para obter um derivado final com as propriedades ideais, as substituições, dele- ções, inserções ou qualquer combinação das mesmas podem ser usadas. Geralmente essas alterações são feitas em alguns aminoácidos para minimizar a alteração da molécula. Entretanto, as maiores alterações podem ser toleradas em certas circunstâncias.

Em certas modalidades, fornecidas aqui são as hidrolases onde a estrutura do esqueleto do polipeptídeo, a estrutura secundária ou terciária, por exemplo, uma estrutura de beta-folha ou alfa-helicoidal, foi modificada. Em um aspecto, a carga ou hidrofobicidade foi modificada. Em um aspecto, o tamanho de uma cadeia lateral foi modificado. As alterações substanciais na função ou identidade imunológica são feitas selecionando-se as substituições que são menos conservadoras. Por exemplo, as substituições podem ser feitas as quais mais significantemente afetam: a estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área da alteração, por exemplo uma estrutura de beta- folha ou alfa-helicoidal; um sítio hidrofóbico ou carga da molécula, que pode estar em um sítio ativo; ou uma cadeia lateral. Em outras modalidades, fornecidas aqui são proteínas compreendendo as substituições de sequência como fornecidas aqui, por exemplo, onde (a) um resíduo hidrofílico, por exemplo, serila ou treonila, é substituído por (ou pelo) um resíduo hidrofóbi- co, por exemplo, leucila, isoleucila, fenilalanila, valila ou alanila; (b) uma cis- teína ou prolina é substituída por (ou pelo) qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositiva, por exemplo, lisila, arginila, ou histidila, é substituído por ou (pelo) um resíduo eletronegativo, por exemplo, glutamila ou aspartila; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído por (ou pelo) um não tendo uma cadeia lateral, por exemplo glicina. As variantes podem exibir a mesma atividade biológica qualitativa (isto é, atividade de hidrolase) embora as variantes possam ser selecionadas para modificar as características das hidro- lases quando necessário.

Em um aspecto, as hidrolases como fornecidas aqui compreendem rótulos de purificação ou epitopos, sequências de sinal ou outras sequências de fusão, etc. Em um aspecto, as hidrolases como fornecidas aqui podem ser fundidas por um peptídeo randomizado para formar um peptídeo de fusão. Por "fundido" ou "operavelmente ligado" aqui é entendido que o peptídeo randomizado e a hidrolase estão ligados juntos, de uma tal maneira para minimizar o rompimento da estabilidade da estrutura da hidrolase, por exemplo, mantendo a atividade da hidrolase. O polipeptídeo de fusão (ou polinucleotídeo de fusão codificando o polipeptídeo de fusão) pode também compreender outros componentes bem como, incluindo múltiplos peptídeos em múltiplas alças.

Em um aspecto, os peptídeos (por exemplo, subsequências de hidrolase) e ácidos nucleicos os codificando são randomizados, ou totalmen- te randomizados ou eles são influenciados em sua randomização, por exemplo, na frequência de nucleotídeo/resíduo geralmente ou por posição. "Randomizado" significa que cada ácido nucleico e peptídeo consistem em nucleotídeos e aminoácidos essencialmente randomizados, respectivamente. Em um aspecto, os ácidos nucleicos que dão origem aos peptídeos podem ser quimicamente sintetizados, e desse modo podem incorporar qualquer nucleotídeo em qualquer posição. Desse modo, quando os ácidos nu- cleicos são expressos para formar peptídeos, qualquer resíduo de aminoáci- do pode ser incorporado em qualquer posição. O processo sintético pode ser projetado para gerar os ácidos nucleicos randomizados, para permitir a formação de todas ou a maioria das possíveis combinações sobre o comprimento do ácido nucleico, desse modo formando uma biblioteca de ácidos nucleicos randomizados. A biblioteca pode fornecer uma população suficientemente estruturalmente diversa de produtos de expressão randomizados para afetar uma faixa probabilisticamente suficiente de respostas celulares para fornecer uma ou mais células exibindo uma resposta desejada. Fornecidas aqui são bibliotecas de interação grande o suficiente para que pelo menos um de seus membros tenha uma estrutura que determine a afinidade com alguma molécula, proteína, ou outro fator.

Metodologias de Avaliação e Dispositivos de Monitoramento "On-Line"

Na prática dos métodos como fornecidos aqui, uma variedade de mecanismos e metodologias pode ser usada em conjunto com os polipeptí- deos e ácidos nucleicos como fornecidos aqui, por exemplo, para avaliar os polipeptídeos quanto à atividade de hidrolase (por exemplo, avaliação de fármaco potencial), para anticorpos que ligam-se a um polipeptídeo como fornecido aqui, para ácidos nucleicos que hibridizam para um ácido nucleico como fornecido aqui, para avaliar quanto às células expressando um poli- peptídeo como fornecido aqui e similares. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.337.187.

Disposições Capilares

Disposições capilares, tal como a GIGAMATRIXTM, Diversa Cor- poration, San Diego, CA, podem ser usadas nos métodos como fornecidos aqui. Os ácidos nucleicos ou polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser imobilizados ou aplicados a uma disposição, incluindo disposições capilares. As disposições podem ser usadas para avaliar ou monitorar as bibliotecas das composições (por exemplo, pequenas moléculas, anticorpos, ácidos nu- cleicos, etc.) quanto à sua capacidade de ligar-se ou modular a atividade de um ácido nucleico ou um polipeptídeo como fornecido aqui. Disposições capilares fornecem outro de sistema para manter e avaliar amostras. Por exemplo, um aparelho de avaliação de amostra pode incluir uma pluralidade de capilares formados em uma disposição de capilares adjacentes, em que cada capilar compreende pelo menos uma parede que define um lúmen para manter uma amostra. O aparelho também pode incluir material intersticial disposto entre os capilares adjacentes na disposição, e um ou mais indícios de referência formados dentro do material intersticial. Um capilar para avaliar uma amostra, em que o capilar é adaptado para ser ligado em uma disposição de capilares, pode incluir uma primeira parede definindo um lúmen para manter a amostra, e uma segunda parede formada de um material de filtragem, para filtrar energia de excitação fornecida ao lúmen para estimular a amostra.

Um polipeptídeo ou ácido nucleico, por exemplo, um ligante ou um substrato, pode ser introduzido em um primeiro componente em pelo menos uma porção de um capilar de uma disposição de capilar. Cada capilar da disposição capilar pode compreender pelo menos uma parede que define um lúmen para manter o primeiro componente. Uma bolha de ar pode ser introduzida no capilar atrás do primeiro componente. Um segundo componente pode ser introduzido no capilar, em que o segundo componente é separado do primeiro componente pela bolha de ar. Uma amostra de interesse pode ser introduzida como um primeiro líquido rotulado com uma partícula detectável em um capilar de disposição capilar, em que cada capilar da disposição capilar compreende pelo menos uma parede que define um lúmen para manter o primeiro líquido e a partícula detectável, e em que a pelo menos uma parede é revestida com um material de ligação para ligar a partícu- la detectável a pelo menos uma parede. O método pode também incluir a remoção do primeiro líquido do tubo capilar, em que a partícula detectável ligada é mantida dentro do capilar, e introdução de um segundo líquido no tubo capilar.

A disposição capilar pode incluir uma pluralidade de capilares individuais compreendendo pelo menos uma parede externa definindo um lúmen pelo menos. A parede externa do vaso capilar pode ser uma ou mais paredes fundidas juntamente. Semelhantemente, a parede pode definir um lúmen que é cilíndrico, quadrado, hexagonal ou qualquer outra forma geométrica contanto que as paredes formem um lúmen para a retenção de um líquido ou amostra. Os capilares da disposição capilar podem ser mantidos juntos em proximidade imediata para formar uma estrutura planar. Os capilares podem ser ligados juntos, sendo fundidos (por exemplo, onde os capilares são feitos de vidro), colados, ligados ou presos lado a lado. A disposição capilar pode ser formada de qualquer número de capilares individuais, por exemplo, uma faixa de 100 a 4.000.000 capilares. Uma disposição capilar pode formar uma placa de microtítulo tendo cerca de 100.000 ou mais capilares individuais ligados juntamente.

Disposições, ou "Biochips"

Os ácidos nucleicos ou polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser imobilizados ou aplicados a uma disposição. As disposições podem ser usadas para avaliar ou monitorar as bibliotecas das composições (por exemplo, pequenas moléculas, anticorpos, ácidos nucleicos, etc.) quanto à sua capacidade de ligar ou modular a atividade de um ácido nucleico ou um polipeptídeo como fornecido aqui. Por exemplo, em um aspecto como fornecido aqui, um parâmetro monitorado é a expressão da transcrição de um gene de hidrolase. Uma ou mais, ou, todas as transcrições de uma célula podem ser medidas por hibridização de uma amostra compreendendo as transcrições da célula, ou, ácidos nucleicos representativos de ou complementares para as transcrições de uma célula, por hibridização para ácidos nucleicos imobilizados em uma disposição, ou "biochip". Usando-se uma "disposição" de ácidos nucleicos em um microchip, algumas ou todas as transcrições de uma célula podem ser simultaneamente quantificadas. Alter-nativamente, as disposições compreendendo o ácido nucleico genômico podem também ser usadas para determinar o genótipo de uma cepa recentemente construída feita pelos métodos como fornecidos aqui. As "disposições do polipeptídeo" podem também ser usadas para simultaneamente quantificar uma pluralidade de proteínas. A presente invenção pode ser praticada com qualquer "disposição" conhecida, também referida como uma "micro- disposição" ou "disposição de ácido nucleico" ou "disposição de polipeptí- deo" ou "disposição de anticorpo" ou "biochip", ou variação dos mesmos. As disposições são genericamente uma pluralidade de "pontos" ou "elementos- alvo", cada elemento-alvo compreendendo uma quantidade definida de uma ou mais moléculas biológicas, por exemplo, oligonucleotídeos, imobilizados sobre uma área definida de uma superfície de substrato para a ligação específica a uma molécula da amostra, por exemplo, transcrições de mRNA.

As "disposições" ou "microdisposições" ou "biochips" ou "chips" como fornecidos aqui podem compreender uma pluralidade de elementos- alvo, cada elemento-alvo compreendendo uma quantidade definida de um ou mais polipeptídeos (incluindo anticorpos) ou ácidos nucleicos imobilizados sobre uma área definida de uma superfície de substrato.

Em um aspecto, as hidrolases são usadas como formas imobilizadas. Qualquer método de imobilização pode ser usado, por exemplo, imobilização em um suporte inerte tal como dietilaminoetil-celulose, vidro poroso, quitina ou células. Células que expressam hidrolases como fornecidas aqui podem ser imobilizadas por reticulação, por exemplo com glutaraldeído a uma superfície de substrato.

Na prática dos métodos como fornecidos aqui, qualquer método e/ou disposição conhecido de fazer e usar disposições pode ser incorporado no todo ou em parte, ou variações dos mesmos, como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.277.628; 6.277.489; 6.261.776; 6.258.606; 6.054.270; 6.048.695; 6.045.996; 6.022.963; 6.013.440; 5.965.452; 5.959.098; 5.856.174; 5.830.645; 5.770.456; 5.632.957; 5.556.752; 5.143.854; 5.807.522; 5.800.992; 5.744.305; 5.700.637; 5.556.752; 5.434.049; veja também, por exemplo, WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958; veja também, por exemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21:2532. Veja também pedidos de patente U.S. publicados Nos. 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448; 20010012537; 20010008765.

Anticorpos e métodos de blindagem com base em Anticorpo

Em certas modalidades, fornecidos aqui são anticorpos isolados, sintéticos e recombinantes que especificamente ligam-se a uma hidrolase como fornecida aqui. Esses anticorpos podem ser usados para isolar, identificar ou quantificar as hidrolases como fornecidas aqui ou polipeptídeos relacionados. Esses anticorpos podem ser usados para isolar outros polipeptí- deos como fornecidos aqui ou outras hidrolases relacionadas. "Anticorpos" como fornecidos aqui podem compreender peptí- deo(s) ou polipeptídeo(s) derivado(s) de, modelado(s) após ou substancialmente codificado(s) por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglo- bulina, ou fragmentos dos mesmos, capaz(es) de especificamente ligar(em) um antígeno ou epitopo, veja, por exemplo, Fundamental Immunology, Terceira Edição, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994) J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. O termo anticorpo inclui porções de ligação de antígeno, isto é, "sítios de ligação de antígeno", (por exemplo, fragmentos, subsequências, regiões de determinação de complementaridade (CDRs)) que mantêm a capacidade de ligar antígeno, incluindo (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de uma única ramificação de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward e outros, (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada. Anticorpos de cadeia única são também incluídos por referência no termo "anticorpo". Fornecidos aqui são anticorpos, incluindo sítios de ligação de antígeno e anticorpos de cadeia simples que especificamente ligam-se a uma hidrolase fornecida aqui. Na prática dos métodos como fornecidos aqui, os polipeptídeos tendo uma atividade de hidrolase também podem ser usados.

Os anticorpos podem ser usados em colunas de imunoprecipita- ção, manchamento, colunas de imunoafinidade, e similares. Se desejado, as sequências de ácido nucleico codificando para antígenos específicos podem ser geradas por imunização seguida por isolamento do polipeptídeo ou ácido nucleico, amplificação ou clonagem e imobilização do polipeptídeo em uma disposição como fornecida aqui. Alternativamente, os métodos como fornecidos aqui podem ser usados para modificar a estrutura de um anticorpo produzido por uma célula a ser modificada, por exemplo, uma afinidade de anticorpo pode ser aumentada ou diminuída. Além disso, a capacidade de preparar ou modificar os anticorpos pode ser um fenótipo construído em uma célula pelos métodos como fornecidos aqui.

Os métodos de imunização, produção e isolamento de anticorpos (policlonal e monoclonal) são conhecidos por aqueles de experiência na técnica e descritos na literatura de patente e científica, observe, por exemplo, Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/ Greene, NY (1991); Sites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7a edição) Lange Medical Publications, Los Altos, CA ("Sites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2a edição) Academic Press, Nova York, NY (1986); Kohler (1975) Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nova York. Os anticorpos também podem ser gerados in vitro, por exemplo, utilizando bibliotecas de exibição de fago expressando sítio de ligação de anticorpo recombinante, além dos métodos in vivo tradicionais utilizando animais. Veja, por exemplo, Hoogenboom (1997) Trends Biotechnol. 15:62-70; Katz (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45.

Os polipeptídeos ou peptídeos podem ser usados para gerar an-ticorpos, que ligam-se especificamente aos polipeptídeos como fornecidos aqui. Os anticorpos resultantes podem ser usados em procedimentos de cromatografia de imunoafinidade para isolar ou purificar o polipeptídeo ou determinar se o polipeptídeo está presente em uma amostra biológica. Em tais procedimentos, uma preparação de proteína, tal como um extrato, ou uma amostra biológica é contatada com um anticorpo capaz de especificamente ligar a um dos polipeptídeos como fornecidos aqui.

Nos procedimentos de imunoafinidade, o anticorpo é ligado a um suporte sólido, tal como uma conta ou outra matriz de coluna. A preparação da proteína é colocada em contato com o anticorpo sob condições nas quais o anticorpo especificamente liga-se a um dos polipeptídeos como fornecidos aqui. Após uma lavagem para remover as proteínas não especificamente ligadas, os polipeptídeos especificamente ligados são eluídos.

A capacidade das proteínas em uma amostra biológica de ligar- se ao anticorpo pode ser usando qualquer de uma variedade de procedimentos familiares àqueles versados na técnica. Por exemplo, a ligação pode ser determinada rotulando-se o anticorpo com um rótulo detectável tal como um agente fluorescente, um rótulo enzimático, ou um radioisótipo. Alternativamente, a ligação do anticorpo à amostra pode ser detectada usando um anticorpo secundário tendo um tal rótulo detectável neste. Os ensaios particulares incluem ensaios ELISA, ensaios sanduíche, radioimunoensaios e Western Blots.

Os anticorpos policlonais gerados contra os polipeptídeos como fornecidos aqui podem ser obtidos por injeção direta dos polipeptídeos em um animal ou administrando-se os polipeptídeos a um animal não-humano. O anticorpo desse modo obtido, então se ligará ao polipeptídeo propriamente dito. Desse modo, até uma sequência codificando somente um fragmento do polieptídeo pode ser usada para gerar anticorpos que podem ligar-se ao polipeptídeo nativo total. Tais anticorpos podem em seguida ser usados para isolar o polipeptídeo de células expressando aqueles polipeptídeos.

Para a preparação de anticorpos monoclonais, qualquer técnica que forneça os anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhagem celular pode ser usada. Os exemplos incluem a técnica de hibridoma, a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana e a técnica de EBV-hibridoma (Cole, e outros, 1985, em Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Veja, Patente U.S. No 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples para os polipeptídeos como fornecidos aqui. Alternativamente, os camundongos transgênicos podem ser usados para expressar os anticorpos humanizados para esses polipeptídeos ou fragmentos dos mesmos.

Os anticorpos gerados contra os polipeptídeos como fornecidos aqui (incluindo anticorpos anti-idiotipo) podem ser usados na avaliação de polipeptídeos similares de outros organismos e amostras. Em tais técnicas, os polipeptídeos do organismo são contatados com o anticorpo e esses poli- peptídeos que especificamente ligam o anticorpo são detectados. Qualquer dos procedimentos descritos acima pode ser usado para detectar a ligação de anticorpo.

Hidrolases imobilizadas

Em um aspecto, uma hidrolase como fornecida aqui, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases, é usada como formas imobilizadas, por exemplo, para processar lipídeos, na síntese estruturada de lipídios, para digerir proteínas e similares. As lipases imobilizadas como fornecidas aqui podem ser usadas, por exemplo, para hidrólise de triacilgli- cerídeos, diacilglicerídeos ou ésteres ou para a esterificação ou transesterifi- cação de ácidos graxos, diacilglicerídeos ou triacilglicerídeos, ou na interes- terificação de gorduras. Em um aspecto, a lipase é específica para esterifi- cação de ácidos graxo com álcool, 1,3-específico ou específico para a hidrólise de glicerídeos parciais, ésteres ou triacilglicerídeos. Lipases imobilizadas como fornecidas aqui podem ser usadas em um leito empacotado para tran- sesterificação contínuo de gorduras livres solventes. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.818.695; 5.569.594.

Qualquer método de imobilização ou forma de suporte pode ser usado, por exemplo, disposições, contas, suportes capilares e similares, como descrito acima. Em um aspecto, a imobilização de hidrolase pode acontecer em um suporte inerte tal como dietilaminoetil-celulose, vidro poroso, quitina ou células. Células que expressam uma hidrolase como fornecida aqui podem ser imobilizadas por reticulação, por exemplo com glutaraldeído a uma superfície de substrato. As hidrolases imobilizadas como fornecidas aqui podem ser preparadas contendo hidrolase ligada a um suporte hidrofó- bico particulado poroso, seco, com um tensoativo, tal como um éster de ácido graxo de sorbitano de polioxietileno ou um éster de ácido graxo de poligli- cerol. O suporte pode ser um polímero olefínico alifático, tal como um polieti- leno ou um polipropileno, um homo ou copolímero de estireno ou uma mistura do mesmo ou um suporte inorgânico pré-tratado. Estes suportes podem ser selecionados de polímeros olefínicos alifáticos, polímeros de oxidação, misturas destes polímeros ou suportes inorgânicos pré-tratados para tornar estes suportes hidrofóbicos. Este pré-tratamento pode compreender a silani- zação com um composto de silício orgânico. O material inorgânico pode ser uma sílica, uma alumina, um vidro ou uma cerâmica. Suportes podem ser feitos de poliestireno, copolímeros de estireno, polietileno, polipropileno ou de copolímeros derivados de (met)acrilatos. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.773.266.

As enzimas de hidrolase, fragmentos das mesmas e ácidos nu- cleicos que codificam as enzimas e fragmentos podem ser afixados a um suporte sólido. Este é frequentemente econômico e eficiente no uso das hi- drolases em processos industriais. Por exemplo, um consórcio ou coquetel de enzimas de hidrolase (ou fragmentos ativos das mesmas), que é usado em uma reação química específica, pode ser ligado a um suporte sólido e molhado em um tonel de processo. A reação enzimática pode acontecer. Em seguida, o suporte sólido pode ser retirado do tonel, junto com as enzimas afixadas nele, para uso repetido. Em uma modalidade como fornecido aqui, um ácido nucleico isolado como fornecido aqui é afixado a um suporte sólido. Em outra modalidade como fornecido aqui, o suporte sólido é seleciona- do a partir do grupo de um gel, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo e qualquer combinação dos mesmos.

Por exemplo, suportes sólidos fornecidos aqui incluem géis. Alguns exemplos de géis incluem SEPHAROSETM (GE Healthcare, Piscataway, NJ), gelatina, glutaraldeído, glutaraldeído tratado com quitosana, albu- mina-glutaraldeído, quitosana-xantana, gel toyopearl (gel de polímero), algi- nato, alginato-polilisina, carragenina, agarose, glioxil agarose, agarose mag-nética, dextrana-agarose, poli(carbamoil sulfonato) hydrogel, hidrogel de BSA-PEG, álcool polivinílico fosforilado (PVA), monoaminoetil-N-aminoetila (MANA), amino, ou qualquer combinação dos mesmos.

Outros suportes sólidos fornecidos aqui compreendem resinas ou polímeros. Alguns exemplos de resinas ou polímeros incluem celulose, acrilamida, náilon, raiom, poliéster, resina de permuta de ânion, AMBERLI- TETM XAD-7, AMBERLITETM XAD-8, AMBERLITETM IRA-94, AMBERLITETM IRC-50 (Rohm e Haas, Philadelphia, PA), polivinila, poliacrílico, polimetacri- lato, ou qualquer combinação dos mesmos.

Outro tipo de suporte sólido fornecido aqui compreende cerâmica. Alguns exemplos incluem cerâmica não porosa, cerâmica porosa, SiO2, Al2O3. Outro tipo de suporte sólido útil na presente invenção é o vidro. Alguns exemplos incluem vidro não poroso, vidro poroso, vidro de aminopropi- la ou qualquer combinação dos mesmos. Outro tipo de suporte sólido que pode ser usado é um microeletrodo. Um exemplo é uma magnetita revestida por polietilenoimina. Partículas grafíticas podem ser usadas como um suporte sólido.

Outro tipo de suporte sólido fornecido aqui compreende produtos de terra diatomácea e silicatos. Alguns exemplos incluem CELITE®, KENI- TE®, DIACTIV®, PRIMISIL®, DIAFIL® diatomitas e MICRO-CEL®, CAL- FLO®, SILASORBTM, e CELKATE® (World Minerals Inc., Santa Barbara, CA) cálcio sintético e silicatos de magnésio.

Outro exemplo de um suporte sólido é ou compreende uma célula, tal como uma hemácia.

Kits

Em certas modalidades, fornecidos aqui são kits compreendendo as composições, por exemplo, ácidos nucleicos, cassetes de expressão, vetores, células, sementes transgênicas ou plantas ou parte de plantas, poli- peptídeos (por exemplo, hidrolase) e/ou anticorpos como fornecidos aqui. O kit também pode conter um material instrucional ensinando as metodologias e uso industrial como fornecido aqui, como descrito aqui.

Aplicações Industriais e Médicas

As hidrolases (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) fornecidas aqui têm muitos usos industriais e aplicações médicas, e alguns usos exemplares e composições são descritos abaixo. Os processos como fornecidos aqui compreendem converter um fosfolipídeo não hidratável a uma forma hidratável, desengomação de óleo, processamento de alimento, processamento de óleos (por exemplo, preparação de um óleo saturado inferior) de plantas, peixe, algas e similares, para nomear apenas algumas aplicações.

Processamento de alimentos e alimentações

Em certas modalidades, fornecidos aqui são processos de preparação de queijo usando hidrolases (por exemplo, lipases, saturases, pal- mitases e/ou estearatases) como fornecidas aqui. Em outras modalidades, fornecidos aqui são queijos que compreendem hidrolases. Em um aspecto, as enzimas como fornecidas aqui (por exemplo, lipases, saturases, palmita- ses e/ou estearatases ou uma combinação dos mesmos) são usadas para processar queijos para realce de sabor, para aumentar a produção e/ou para "estabilizar" queijos, por exemplo, reduzindo-se a tendência para "óleo-off," ou, em um aspecto, as enzimas como fornecidas aqui são usadas para produzir queijo do leite de queijo. Estes processos como fornecidos aqui podem incorporar qualquer método ou protocolo, por exemplo, como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.551.635, e 6.399.121, WO 03/070013, WO 00/054601. Por exemplo, em um aspecto, hidrolases (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidas aqui são usadas para estabilizar a emulsão de gordura em leite ou composições compreendendo leite, por exemplo, creme, e são usadas para estabilizar composições de leite, por exemplo para a fabricação de cremes ou líquidos de creme. Em uma modalidade, fornecidos aqui são processos por aumentar o sabor de um queijo usando pelo menos uma enzima como fornecida aqui, o processo compreendendo a incubação de uma proteína, uma gordura e uma protease e uma lipase (por exemplo, como fornecido aqui) em um meio aquoso sob condições que produzem um sabor de queijo realçado (por exemplo, amargor reduzido), por exemplo, como descrito em WO 99/66805. Em um aspecto, lipases como fornecidas aqui são usadas para realçar o sabor em um queijo (por exemplo, uma coalhada) misturando-se com água, uma protease, a uma fosfolipase em uma temperatura elevada, por exemplo, entre cerca de 75oC a 95oC, como descrito, por exemplo, em Patente U.S. No. 4.752.483. Em um aspecto, as lipases como fornecidas aqui são usadas para acelerar o envelhecimento do queijo adicionando-se uma enzima como fornecida aqui a um queijo (por exemplo, um leite de queijo) antes de adicionar um coagulante ao leite, ou, adicionar uma enzima (por exemplo, uma lipase) como fornecida aqui a uma coalhada com sal antes de prensar, por exemplo, como descrito, por exemplo, em Patente U.S. No. 4.707.364. Em um aspecto, uma lipase como fornecida aqui é usada para degradar um tria- cilglicerídeo na gordura de leite para liberar ácidos graxos livres, resultando no realce de sabor. Uma enzima como fornecida aqui também pode ser usada em quaisquer destes processos como fornecidos aqui, veja, por exemplo, Brindisi (2001) J. of Food Sci. 66:1100-1107.

Síntese estruturada e processamento de óleos

Em certas modalidades, fornecidos aqui são métodos para a síntese estruturada de óleos, lipídeos e similares usando hidrolases (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidas aqui. Os métodos como fornecidos aqui compreendem uma síntese biocatalítica de lipídeos estruturados, isto é, lipídeos que contêm um conjunto definido de ácidos graxos distribuídos de uma maneira definida em um esqueleto, por exemplo, um esqueleto de glicerol. Produtos gerados usando as hidrolases e praticando os métodos como fornecidos aqui incluem óleos saturados inferiores, por exemplo, óleos de vegetais (por exemplo, soja, óleo de colza), animais, plantas, peixe, algas que foram processados ou tratados com um polipeptídeo como fornecido aqui; e alimentos, alimentações, suplementos, farmacêuticos e similares iguais compreendendo óleos saturados feitos por prática dos métodos e/ou composições (por exemplo, enzimas) como fornecidos aqui. Produtos gerados usando as hidrolases e a prática dos métodos como fornecidos aqui também incluem alternativas de manteiga de cacau, lipídeos contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), lipídeos contendo ácidos graxos essenciais, lipídeos contendo ácidos graxos monoinsaturados, lipídeos contendo fosfocolina e fosfosserina, lipídios contendo fitosteróis, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerí- deos (TAGs).

Os métodos como fornecidos aqui possibilitam a síntese de lipídeos ou ácidos graxos com definidas regiosseletividades e estereosseletivi- dades. São fornecidos aqui óleos, lipídeos e similares, e óleos que podem ser usados em alimentos e alimentações e materiais de cozimento (por exemplo, óleos para cozimento, óleos de fritura, óleos para cozimento em forno, molhos, escabeches, condimentos, óleos de spray, margarinas, maionese, recheios que se pode pegar com colher e despejáveis, alternativas de manteiga de cacau, e similares) que foram processados ou tratados com polipeptídeos ou peptídeos (por exemplo, hidrolases, tal como lipases, satu- rases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidos aqui. Em certas modalidades, são fornecidos aqui produtos farmacêuticos, nutracêuticos e cosméticos compreendendo polipeptídeos (por exemplo, hidrolases, tal como lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases; ou peptídeos ou antibodies) como fornecidos aqui.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para processar (modificar) óleos, lipídeos e similares usando hidrolases como fornecidas aqui. Os métodos que podem ser usados para processar óleos de plantas, animais, micro-organismos. Os métodos como fornecidos aqui podem ser usados na síntese de óleos estruturados similares àqueles encontrados em plantas, animais, e micro-organismos. Lipídeos e óleos podem ser processados para terem uma característica desejada. Lipídeos e óleos que podem ser processados pelos métodos como fornecidos aqui (usando as hidrolases como fornecidas aqui) incluem alternativas de manteiga de cacau, lipídeos contendo ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), lipídeos contendo ácidos graxos essenciais, lipídeos contendo ácidos graxos monoinsaturados, lipídeos contendo fosfocolina e fosfosserina, lipídeos contendo fitoesteróis, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerí- deos (TAGs). Em um aspecto, os óleos e gorduras processados e sintéticos como fornecidos aqui (por exemplo, alternativas de manteiga de cacau e óleos vegetais) podem ser usados em uma variedade de aplicações, por exemplo, na produção de alimentos (por exemplo, confeitarias, pastelarias) e na formulação de produtos farmacêuticos, nutracêuticos e cosméticos. São fornecidos aqui métodos de processamento de gorduras e óleos, por exemplo, sementes oleosas, de plantas, incluindo, por exemplo, canola, rícino, coco, coentro, milho, semente de algodão, avelã, semente de cânhamo, linhaça, espuma de prado, oliva, óleo de palma, semente de palma, amendoim, colza, farelo de arroz, açafroa, sasanqua, soja, girassol, tall, tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou reprodução tradicional tal como óleos oleico elevado, linolênico inferior, ou saturado inferior (canola oleico elevado, soja linolênico, ou girassol esteárico elevado) ou misturas de quaisquer dos acima usando uma hidrolase como fornecida aqui.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos de pro-cessamento de óleos de animais, por exemplo, peixe (peixe vela, fígado de bacalhau, laranja áspera, sardinha, arenque, menhaden, e similares), mamíferos (porco, boi, e similares) e ave comestível (frango, e similares), usando as hidrolases como fornecidas aqui. Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para uma síntese estruturada de óleos similar àqueles encontrados em animais, por exemplo, peixe, ave comestível, e mamíferos e micro-organismos, usando as hidrolases como fornecidas aqui. Em um aspecto, estes óleos sintéticos ou processados são usados como aditivos alimentares, alimentos, como ingredientes em formulações farmacêuticas, nutra- cêuticos ou em cosméticos. Por exemplo, em um aspecto as hidrolases como são fornecidas aqui usadas para hidrolisar ácidos graxos longe de óleos de peixe de modo que os ácidos graxos possam ser recuperados e usados como um aditivo de alimentação. Em um aspecto, as hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para processar óleo de excreção de restaurante e gorduras animais convertidas.

Em outras modalidades, são fornecidos aqui métodos de pro-cessamento de gorduras e óleos, por exemplo, de óleos algais, incluindo, por exemplo, óleo de Neochloris oleoabundans, óleo de Scenedesmus di- morphus, óleo de Euglena gracilis, óleo de Phaeodactylum tricornutum, óleo de Pleurochrysis carterae, óleo de Prymnesium parvum, óleo de Tetraselmis chui, óleo de Tetraselmis suecica, óleo de Isochrysis galbana, óleo Nan- nochloropsis salina, óleo de Botryococcus braunii, óleo de Dunaliella terti- olecta, óleo de Nannochloris species, óleo de Spirulina species, óleo de Chlorophycease (algas verdes), e óleo de Bacilliarophy ou misturas de quaisquer das referidas gorduras e óleos.

Em um aspecto, as hidrolases como fornecidas aqui são biocata- lisadores versáteis em síntese orgânica, por exemplo, na síntese estruturada de óleos, lipídeos e similares. Enzimas como fornecidas aqui (incluindo hi- drolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) podem admitir uma ampla faixa de substratos, incluindo alcoóis secundários e terciários, por exemplo, de um produto natural tal como alfa-terpineol, linalool e similares. Em alguns aspectos, as hidrolases como fornecidas aqui têm boa a excelente enantioespecificidade (por exemplo, estereoespecifici- dade).

Em certas modalidades, fornecido aqui é um processo de conversão de óleo (por exemplo, óleos vegetais, manteigas de cacau, e similares) compreendendo pelo menos uma enzima (por exemplo, uma lipase, sa- turase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui. Em um aspecto, um processo de conversão de óleo compreende uma hidrólise controlada e acilação, por exemplo, uma acilação de glicerol, que pode resultar em alta pureza para uma ampla faixa de produtos. Em um aspecto, hidrolases (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecidas aqui são usadas para produzir óleos de diacilglicerol e óleos nutricionais estruturados. Em certas modalidades, são fornecidos aqui processos para a esterificação de propileno glicol usando uma enzima como fornecida aqui, por exemplo, uma lipase regio- e/ou quimiosseletiva para esterificação mo- nossubstituída na posição Sn-1. São fornecidos aqui processos para uma síntese estruturada de óleos com perfis de ácido graxo saturado ou insatu- rado alvejado usando uma enzima como fornecida aqui, por exemplo, uma lipase regio- e/ou quimiosseletiva para a remoção de um ácido graxo saturado, ou, para uma adição alvejada de um ácido graxo a um esqueleto de gli- cerol.

Em um aspecto, os métodos como fornecidos aqui também compreendem processos para uma remoção seletiva de ácidos graxos (por exemplo, ácidos graxos indesejáveis) de óleos, por exemplo, separando ácidos graxos saturados e/ou insaturados de óleos, usando uma hidrolase (por exemplo, uma lipase, saturase, palmitase e/ou estearatase) como fornecida aqui. O processo como fornecido aqui pode separar ácidos graxos saturados e/ou insaturados de qualquer óleo, por exemplo, um óleo de soja. A enzima pode ser quimiosseletiva e/ou enantiosseletiva. Em um aspecto, estes processos geram gorduras e óleos de alta estabilidade, por exemplo, óleos para fritura "saudáveis". Este processo exemplar como fornecido aqui pode ser usado para gerar óleos com menos enxofre, por exemplo, usando um processo compreendendo remoção de enxofre de óleo bruto. As enzimas como fornecidas aqui podem também ser usadas em processos de interesterifica- ção por estes e outros propósitos.

Em um aspecto, uma enzima como fornecida aqui é usada para gerar um óleo de gordura "não-trans". Em um aspecto, um óleo "não-trans" é gerado de um óleo parcialmente hidrogenado para produzir um óleo apenas cis. A enzima pode ser quimiosseletiva e/ou enantiosseletiva.

Em outra modalidade, são fornecidos aqui processos para modificar manteigas de cacau usando uma enzima como fornecida aqui. Cerca de 80% de manteigas de cacau compreendem POP, SOS e POS triacilglice- rídeos (P é ácido graxo palmítico, O é ácido graxo oleico, S é ácido graxo esteárico). A estrutura de ácido graxo saturada-insaturada-saturada de manteigas de cacau confere seus pontos de fusão característicos, por exemplo, em chocolates. Em um aspecto, os processos sintéticos estruturados e diretos como são fornecidos aqui usados em manteigas de cacau para reduzir variações da manteiga de cacau ou para produzir manteigas de cacau sintéticas ("alternativas de manteiga de cacau"). Em um aspecto, a hidrolase (por exemplo, lipase ou esterase) quimiosseletiva e/ou enantiosseletiva (por exemplo, uma regiosseletiva) como fornecida aqui é usada para preparar uma alternativa de manteiga de cacau, por exemplo, um substituto de manteiga de cacau e/ou um equivalente de manteiga de cacau. São fornecidas aqui alternativas de manteiga de cacau, incluindo substitutos de manteiga de cacau, substitutos de manteiga de cacau e equivalentes de manteiga de cacau e seus intermediários de fabricação compreendendo uma enzima como fornecida aqui. Um processo como fornecido aqui (usando uma enzima como fornecida aqui) para preparar alternativas de manteiga de cacau podem compreender misturar um óleo vegetal, por exemplo, um óleo de palma, com shea ou equivalente, illipe ou equivalente e sal, esterinas ou equivalente, e tratando os óleos combinados com os polipeptídeos como fornecidos aqui. Em um aspecto, o processo como fornecido aqui compreende o uso de inte- resterificação. O processo como fornecido aqui pode gerar formas composi- cionais ou cristalinas que imitam manteiga de cacau "natural".

Em certas modalidades, são fornecidos aqui processos (usando uma enzima como fornecida aqui) para produzir um diacilglicerol (DAG), por exemplo, 1, 3 diacilglicerol, usando um óleo vegetal, por exemplo, um óleo de baixo custo. A enzima pode ser quimiosseletiva e/ou enantiosseletiva. O processo como fornecido aqui pode resultar em uma composição compreendendo DAG tendo boa estabilidade, vida de prateleira longa e desempenho de temperatura elevada.

As enzimas (hidrolases, por exemplo, lipases, saturases palmi- tases e /ou estearatases) como fornecidas aqui e métodos como fornecidos aqui podem também ser usados no tratamento enzimático de óleos cosmetí- veis, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. no. 6.025.171. Neste método exemplar, enzimas como são fornecidas aqui imobilizadas por preparação de uma emulsão contendo uma fase hidrofóbica contínua, tal como um óleo de triacilglicerídeo, e uma fase aquosa dispersa contendo uma enzima anfifílica, tal como lipase como fornecida aqui, e material portador que é parcialmente dissolvido e parcialmente não dissolvido na fase aquosa, e removendo água da fase aquosa até a fase transformar-se em partículas portadoras revestidas de enzima sólida. A parte não dissolvida do material portador pode ser um material que é insolúvel em água e óleo, ou um material solúvel em água em forma não dissolvida por que a fase aquosa já está saturada com o material solúvel em água. A fase aquosa pode ser formada com um líquido de fermentação de lipase bruta contendo resíduos de fermentação e biomassa que pode servir como materiais portadores. A lipase imobilizada é útil para redisposição de éster e desacidificação em óleo. Após uma reação, a enzima imobilizada pode ser regenerada para uma subsequente reação adicionando-se água para obter dissolução parcial do portador, e com a enzima resultante e fase aquosa contendo o portador dispersa em uma fase hidrofóbica evaporando água para novamente formar as partículas portadoras revestidas por enzima.

As enzimas (por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases) como fornecidas aqui e métodos como fornecidos aqui podem também ser usados para preparar óleos transesterificados, como descrito, por exemplo, na Patente U.S. no. 5.288.619. São fornecidos aqui métodos para transesterificação enzimática para preparar um óleo margarina tendo ambos conteúdo de ácido baixo trans e quanto ácido graxo de cadeia intermediária baixo. O método inclui as etapas de fornecimento de uma mistura reacional de transesterificação contendo um material fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, transesterificando o material fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal usando uma lipase 1-, 3-posicionalmente específica, e então finalmente hidrogenando a mistura de ácido graxo para fornecer um material fonte de ácido esteárico reciclado para uma reação de reciclo com o óleo vegetal. São fornecidos aqui métodos contracorrente para preparar um óleo transesterificado. O método inclui as etapas de fornecimento de uma zona de reação de transesterificação contendo uma lipase 1-, 3-posicionalmente específica, introduzindo um óleo vegetal na zona de tran- sesterificação, introduzindo um material fonte de ácido esteárico, conduzindo um gás supercrítico ou fluido de contracorrente de gás liquefeito subcrítico, realizando uma reação de transesterificação da corrente de triacilglicerídeo com o ácido esteárico ou monoéster de ácido esteárico em uma zona de reação, removendo uma corrente de óleo de margarina de triacilglicerídeo transesterificado, removendo uma fase fluida de contracorrente, hidrogenan- do o ácido esteárico transesterificado ou monoéster de ácido esteárico para fornecer um material fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado, e introduzindo o material fonte de ácido esteárico de reciclo hidrogenado em uma zona de reação.

Em um aspecto, para permitir a enzima como fornecida aqui agir, ambas as fases, a fase de óleo e a fase aquosa que contém a enzima, devem ser intimamente misturadas. Pode não ser suficiente simplesmente agitá-las. Boa dispersão da enzima no óleo é auxiliada se ela for dissolvida em uma pequena quantidade de água, por exemplo, 0,5 - 5 % em peso (relativo ao óleo), e emulsificada no óleo nesta forma, para formar gotículas menores do que 10 micrômetros de diâmetro (média de peso). As gotículas podem ser menores do que 1 micrômetro. Agitação turbulenta pode ser feita com velocidades radiais acima de 100 cm/sec. O óleo também pode ser circulado no reator usando uma bomba rotatória externa. A fase aquosa contendo a enzima pode também ser finamente dividida por meio de ação ul- trassônica. Um aparelho de dispersão pode ser usado.

Em um aspecto, uma reação enzimática como fornecida aqui ocorre na superfície de limite entre a fase de óleo e da fase aquosa. É o objetivo de todas estas medidas para misturar para criar a maior superfície possível para uma fase aquosa que contém a enzima. A adição de tensoati- vos aumenta a microdispersão da fase aquosa. Em alguns casos, portanto, tensoativos com valores HLB acima de 9, tal como sulfato de Na-dodecila, são adicionados à solução de enzima, como descrito, por exemplo, em EP-A 0 513 709. Um método eficaz similar para melhorar a emulsificação é a adição de lisolecitina. As quantidades adicionadas podem situar-se na faixa de 0,001% a 1%, com referência ao óleo. A temperatura durante o tratamento da enzima não é crítica. Temperaturas entre 20oC e 80oC podem ser usadas, porém a última pode apenas ser aplicada durante um curto tempo. Neste aspecto, a lipase como fornecida aqui tendo uma boa temperatura e/ou baixa tolerância de pH é usada. As temperaturas de aplicação entre 30oC e 50oC são ideais. O perído de tratamento depende da temperatura e pode ser mantido menor com uma temperatura crescente. Tempos de 0,1 a 10 horas, ou, 1 a 5 horas são geralmente suficientes. A reação ocorre em um reator, que pode ser dividido em estágios. Portanto, operação contínua é possível, juntamente com operação de batelada. A reação pode ser realizada em diferentes estágios de temperatura. Por exemplo, a incubação pode ocorrer durante 3 horas a 40oC, em seguida durante 1 hora a 60oC. Se a reação prossegue em estágios, esta também abre-se para a possibilidade de ajuste de diferentes valores de pH nos estágios individuais. Por exemplo, no primeiro estágio o pH da solução pode ser ajustado para 7, por exemplo, e em um segundo estágio a 2,5, adicionando-se ácido cítrico ou outros ácidos adequados. Em pelo menos um estágio, entretanto, o pH da solução de enzima deve ser abaixo de 4, ou, abaixo de 3. Se o pH foi subsequentemente ajus-tado abaixo deste nível, uma deterioração do efeito pode ser encontrada. Portanto, o ácido cítrico pode ser adicionado à solução de enzima antes da última ser misturada no óleo.

As enzimas (hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmi- tases e/ou estearatases) como fornecidas aqui e métodos como fornecidos aqui podem também ser usados para preparar óleos, como descrito, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. No. 11/567.318, incorporado aqui por referência em sua totalidade. São fornecidos aqui processos contínuos para tratamento enzimático de lipídeos. O método refere-se a um processo e aparelho para uma interesterificação enzimática contínua de composições contendo lipídeo usando uma pluralidade de reatores de leito fixos, em que o fluxo da composição contendo lipídeo através do aparelho pode permanecer substancialmente constante mesmo quando a atividade enzimática de um leito fixo diminui em tempo prolongado, e mesmo quando um leito fixo é desligado tal como para reparo, substituição, ou reabastecimento.

Em uma modalidade, fornecido aqui é um método de hidrolisar um óleo ou gordura reagindo o óleo ou gordura com uma enzima palmitase. Em uma modalidade, a hidrólise conduzida na presença de um emulsificador tendo HLB maior do que 12. Em uma modalidade, a enzima palmitase é codificada por uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1 e tendo i) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 95 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 9, ii) mudança de nucleotídeos (ou o equivalente dos mesmos) codificando os resíduos de aminoácido nas posições 85 e 172 (ou o equivalente dos mesmos) como mencionado na tabela 15, iii) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 83 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 16, e iv) as seguintes mutações silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, e 188ACG. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico é uma sequência de SEQ ID NO:1 e tendo i) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 95 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 9, ii) mudança de nucleotídeos (ou o equivalente dos mesmos) codificando os resíduos de aminoácido nas posições 85 e 172 (ou o equivalente dos mesmos) como mencionado na tabela 15, iii) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 83 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 16, e iv) as seguintes mutações silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, e 188ACG. Em uma modalidade, a enzima palmitase é hit de tolerância térmica 29 como descrito na tabela 9, e tendo i) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 95 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 9, ii) mudança de nucleotídeos (ou o equivalente dos mesmos) codificando os resíduos de aminoácido nas posições 85 e 172 (ou o equivalente dos mesmos) como mencionado na tabela 15, iii) uma mudança de nucleotídeo (ou o equivalente do mesmo) codificando o resíduo de aminoácido na posição 83 (ou o equivalente do mesmo) como mencionado na tabela 16, e iv) as seguintes mutações silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, e 188ACG. Em uma modalidade, a enzima palmitase usada nos métodos fornecidos aqui é enzima 29 SM com as seguintes mutações silenciosas 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, e 188ACG como descrito no exemplo 12.

Em certas modalidades, o emulsificador tem HLB maior do que 12, 14, 16, ou 18. Em certas modalidades, o emulsificador é selecionado de oleato de sódio, oleato de potássio, linoleato de sódio, linoleato de potássio, linolenato de sódio, linolenato de potássio, laureato de sódio, laureato de potássio, estearato de sódio, estearato de potássio, palmitato de sódio, pal- mitato de potássio, oleato de palma de sódio, oleato de palma de potássio ou uma combinação dos mesmos. Em certas modalidades, a mistura reacio- nal compreende cerca de 1 a 20% de água baseado no peso total dos reagentes. Em uma modalidade, a mistura reacional compreende cerca de 1, 3, 5, 7, 10, 15, 17 ou 20% de água baseado no peso total dos reagentes.

Em certas modalidades, o óleo ou gordura é misturado com o emulsificador antes da adição da enzima palmitase. Em certas modalidades, a mistura de óleo/gordura e emulsificador é homogeneizada antes e/ou após adição da enzima palmitase para garantir emulsão uniforme.

Em certas modalidades, a reação é conduzida em cerca de 20 a 70 oC. Em certas modalidades, a reação é conduzida em cerca de 20, 30, 40, 50, 60 ou 70 oC. Em certas modalidades, a enzima palmitase fornecida aqui reduz o conteúdo de palmitato do óleo/gordura a cerca de 5% ou menos. Em certas modalidades, a enzima palmitase fornecida aqui reduz o conteúdo de palmitato do óleo/gordura a cerca de 5, 4, 3, 2, 1% ou menos. Em certas modalidades, a redução desejada em conteúdo de palmitato ocorre em cerca de ou menos que cerca de 48 h, 24 h, 20h, 16h, 12h, 10h, 5h ou 3h. Em certas modalidades, o método também compreende um pré- tratamento ou o óleo/gordura para remover a goma e fase aquosa e para reduzir ácidos graxos livres. Quaisquer métodos de pré-tratamento imaginados adequados por alguém versado na técnica podem ser usados. Em certas modalidades, o método também compreende adição de uma base (adição cáustica) para formar sabões.

Em certas modalidades, o óleo usado na reação é óleo refinado ou óleo bruto. Em uma modalidade, a reação também compreende adição de um fosfolipídeo. Qualquer fosfolipídeo imaginado adequado por alguém versado na técnica pode ser usado nas reações. Em uma modalidade, o fos- folipídeo é lecitina. Em uma modalidade, o óleo usado nas reações fornecido aqui é um óleo refinado e a reação compreende adição de um fosfolipídeo.

Nutracêuticos

Em um aspecto, as composições e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para preparar nutracêuticos por processamento ou sintetizar lipídeos e óleos usando as enzimas como fornecidas aqui, por exemplo, hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estea- ratases como fornecidas aqui. Em um aspecto, os lipídeos ou óleos processados ou sintetizados incluem ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs), dia- cilglicerídeos, por exemplo, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), monoacilglicerí- deos, por exemplo, 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e triacilglicerídeos (TAGs). Em um aspecto, os nutracêuticos são feitos processando diacilglice- rídeos, por exemplo, 1,3-diacil glicerídeos (DAGs), monoacilglicerídeos, por exemplo, 2-monoacilglicerídeos (MAGs) e/ou triacilglicerídeos (TAGs) de fontes de planta (por exemplo, semente oleosa) ou de fontes de animal (por exemplo, óleo de peixe). Em certas modalidades, são fornecidos aqui nutra- cêuticos (por exemplo, composições dietéticas) compreendendo polipeptí- deos (por exemplo, enzimas, peptídeos, anticorpos) como fornecidos aqui.

Em um aspecto, as composições e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para fortificar composições dietéticas, especialmente produtos baseados em leite de vaca, por exemplo, fórmulas infantis com base em leite de vaca, com hidrolases ativadas por sal de bile. As composições preparadas pelos métodos e composições como fornecidos aqui podem ser usadas para alimentar recém-nascidos e crianças prematuras, incluindo ad-ministração de uma hidrolase ativada por sal de bile como fornecida aqui para aumentar digestão de gordura e portanto taxa de crescimento. Em certas modalidades, são fornecidos aqui composições e métodos para tratar indivíduos com produção de enzima pancreática inadequada por administração de hidrolase ativada por sal de bile em conjunção com ingestão de gorduras; veja também descrição, abaixo.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições dietéticas compreendendo uma hidrolase, por exemplo, hidrolase ativada por sal de bile como fornecido aqui. Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições dietéticas compreendendo uma base nutricional compreendendo a gordura e uma quantidade eficaz de hidrolase ativada por sal de bile como fornecido aqui. Em uma modalidade, são fornecidas aqui fórmulas infantis com base em leite de vaca compreendendo uma hidrolase, por exemplo, hidrolase ativada por sal de bile como fornecido aqui. Em um aspecto, uma hidrolase como fornecida aqui é ativa na digestão de ácidos graxos de cadeia longa, por exemplo, C12 a C22, que compõem uma porcentagem muito elevada de maioria de leites, por exemplo, 99% de leite de mama humana. Veja, por exemplo,Patente U.S. no. 5.000.975.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições dietéticas compreendendo um óleo de gordura vegetal e uma hidrolase como fornecida aqui. Em outras modalidades, são fornecidos aqui métodos de processar produtos baseados em leite e/ou composições compreendendo óleo vegetal para preparar composições dietéticas. Em um aspecto, as composições processadas compreendem um óleo de ácido láurico, um óleo de ácido oleico, um óleo de ácido palmítico e/ou um óleo de ácido linoleico. Em um aspecto, um óleo de farelo de arroz, óleo oleico de girasol e/ou óleo de canola podem ser usados como óleos de ácidos oleicos. Em um aspecto, gorduras e óleos, por exemplo, semente oleosas, de plantas, incluindo, por exemplo, canola, rícino, coco, coentro, milho, caroço de algodão, avelã, semente de cânhamo, linhaça, espuma de prado, oliva, óleo de palma, semente de palma, amendoim, colza, farelo de arroz, açafroa, sasanqua, soja, girassol, tall, tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido gra- xo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou reprodução tradicional tal como oleico elevado, linolênico baixo, ou óleos saturados baixos (canola oleica elevada, soja de linolênico baixo, ou girasol esteárico elevado), misturas de quaisquer dos acima para uso nos nutracêu- ticos e composições dietéticas são processadas ou preparadas usando uma hidrolase como fornecida aqui. Veja, por exemplo, Patente U.S. no. 4.944.944.

Em um aspecto, as enzimas como são fornecidas aqui em uma forma que é estável para armazenar na fórmula e/ou o estômago, porém ativa quando a formulação atinge a porção do trato gastrointestinal onde a fórmula normalmente seria digerida. Formulações (por exemplo, microcápsu- las) para liberação no intestino são bem-conhecidas na técnica, por exemplo, polímeros biodegradáveis tais como polilactídeo e poliglicolídeo, como descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 4.767.628, 4.897.268, 4.925.673, 5.902.617.

Confeitarias, manteiga de cacau (cocoa) e alimentos

Em um aspecto, as composições e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para preparar e processar manteigas duras, tal como manteiga de cacau (manteiga de cocoa). Em outro aspecto, são fornecidos aqui confeitarias, manteiga de cacau e alimentos compreendendo polipeptí- deos (por exemplo, enzimas, peptídeos, anticorpos) como fornecidos aqui.

As composições e métodos como fornecidos aqui podem ser usados para preparar alternativas de manteiga de cacau por técnicas sintéticas "estruturadas" usando as enzimas, por exemplo, hidrolases, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou estearatases como fornecidas aqui. Por exemplo, em um aspecto, os métodos como fornecidos aqui processam ou sintetizam triacilglicerídeos, diacilglicerídeos e/ou monoacilglicerídeos para uso como, por exemplo, alternativas de manteiga de cacau. Em um aspecto, os métodos como fornecidos aqui geram uma manteiga dura com uma "região plástica" definida para manter suficiente dureza abaixo ou em temperatura ambiente. Em um aspecto, os lipídeos processados ou sintetizados são designados para terem uma "região plástica" muito estreita, por exemplo, em um aspecto, onde rapidamente derrete em cerca de temperatura corporal. Manteiga de cacau natural começa a amaciar em aproximadamente 30oC a 32oC, e derrete completamente em aproximadamente 36oC. Manteiga de cacau natural pode conter 70 % em peso ou mais de três glice- róis de 1,3-dissaturado-2-oleoíla, que são glicerol de 1,3-dipalmitoil-2-oleoila (POP), glicerol de 1-palmitoil-2-oleoil-3-estearoíla (POSt) e glicerol de 1,3- distearoil-2-oleoíla (StOSt). Estes três gliceróis mostram um comportamento de fusão similar entre si e são responsáveis por propriedades de fusão da manteiga de cacau, exibindo uma região plástica muito estreita. Em certas modalidades, são fornecidas aqui manteigas de cacau sintéticas ou manteigas de cacau processadas (sintetizadas ou processadas usando uma hidro- lase como fornecida aqui, todas as possíveis composições são referidas como alternativas de manteiga de cacau) com variação de porcentagens de glicerol de 1,3-dipalmitoil-2-oleoíla (POP), glicerol de 1-palmitoil-2-oleoíla (POSt) e glicerol de 1,3-distearoil-2-oleoíla (StOSt), dependendo das propriedades desejadas da manteiga de cacau sintética, e, manteigas de cacau sintéticas com mais ou menos do que 70 % em peso dos três gliceróis de 1,3-dissaturado-2-oleoíla. As manteigas de cacau sintéticas como fornecidas aqui podem parcialmente ou completamente substituir manteigas de cacau não processadas ou naturais e podem manter ou melhorar propriedades de manteiga dura essenciais.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui manteigas de cacau sintéticas ou manteigas de cacau processadas (sintetizadas ou processadas usando uma hidrolase como fornecida aqui) com propriedades desejadas para uso em confeitaria, padaria e produtos farmacêuticos. Em outras modalidades, são fornecidos aqui confeitarias, padaria e produtos farmacêuticos, e similares, compreendendo uma hidrolase como fornecida aqui. Em um aspecto, os métodos como fornecidos aqui preparam ou processam um lipídeo (uma gordura) de uma confecção (por exemplo, um chocolate) ou a ser usado em uma confecção. Em um aspecto, um lipídeo é preparado ou proces- sado tal que o chocolate mostra menos impressão digital do que o chocolate preparado de manteiga de cacau natural, ao mesmo tempo que ainda tendo características de fusão súbitas na boca. Em um aspecto, um lipídeo é preparado ou processado tal que uma confecção (por exemplo, chocolate) pode ser preparada em uma temperatura ambiente comparativamente elevada, ou, ser preparada usando uma água de resfriamento em uma temperatura comparativamente elevada. Em um aspecto, o lipídeo é preparado ou processado tal que uma confecção (por exemplo, chocolate) pode ser armazenada sob condições relativamente mais quentes, por exemplo, condições tropicais ou semitropicais ou em construções centralmente aquecidas. Em um aspecto, os lipídeos são preparados ou processados tal que uma confecção (por exemplo, chocolate) terão um conteúdo de lipídeo (gordura) de composição e qualidade consistentes. As enzimas como fornecidas aqui podem ser usadas para fornecer uma composição substituta para manteiga de cacau que pode melhorar significantemente sua estabilidade térmica e subs- tutuí-la em uma ampla faixa de aplicações.

Produção de margarina e manteigas para bolo

Em certas modalidades, são fornecidas aqui gorduras sintéticas ou processadas, por exemplo, margarina e manteiga para bolo, sintetizadas ou processadas usando uma hidrolase como fornecida aqui. Em outras modalidades, são fornecidas aqui gorduras sintéticas ou processadas, por exemplo, margarina e manteiga para bolo, compreendendo polipeptídeos (por exemplo, enzimas, peptídeos, anticorpos) como fornecidos aqui.

Em uma modalidade, são fornecidas aqui gorduras processadas compreendendo um óleo vegetal, tal como canola, rícino, coco, coentro, milho, caroço de algodão, avelã, semente de cânhamo, linhaça, espuma de prado, oliva, óleo de palma, semente de palma, amendoim, colza, farelo de arroz, açafroa, sasanqua, sésamo, soja, girassol, tall, tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou "reprodução" tradicional tais como óleos tipo oleico elevado, linolênico baixo, ou óleos saturados baixos (canola oleica elevada, soja de linolênico baixo, ou girasol esteárico ele- vado) sintetizados ou processados usando uma hidrolase como fornecida aqui. As gorduras sintéticas ou processadas, por exemplo, margarina e manteiga para bolo, são designadas ter uma "plasticidade" desejada. Muitos dos produtos de gordura plástica, tal como margarina e manteiga para bolo, são produzidos de matérias-primas duras e óleos líquidos como materiais brutos. Por exemplo, óleos líquidos tal como canola, rícino, coco, coentro, milho, caroço de algodão, avelã, semente de cânhamo, linhaça, espuma de prado, oliva, óleo de palma, semente de palma, amendoim, colza, farelo de arroz, açafroa, sasanqua, sésamo, soja, girassol, tall, tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido graxo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou "reprodução" tradicional tais como oleico elevado, linolênico baixo, ou óleos saturados baixos (canola oleica elevada, soja de linolênico baixo, ou girasol esteárico elevado), são misturados com seus óleos endurecidos (matérias-primas duras), e a mistura é ajustada para ter uma consistência apropriada (plasticidade). Os produtos de gordura plástica tal como margarina e manteiga para bolo desse modo produzidos tendem a causar a formação de cristalinos relativamente ásperos por que as gorduras e óleos usados como os materiais brutos são compostos de ácidos graxos tendo quase o mesmo comprimento de cadeia de carbono. Em outras palavras, eles têm uma composição unificada elevadamente de ácidos graxos. Por este motivo, a plasticidade destes produtos pode ser mantida em um grau apropriado somente em uma faixa de temperatura estreita, a fim de que os óleos líquidos contidos aqui tenham uma tendência a exsudar. São fornecidos aqui métodos de preparar ou processar gorduras designadas tal que elas tenham uma composição variada (e definida) de ácidos graxos. O óleo resultante, por exemplo, margarina ou manteiga para bolo, pode ter uma faixa mais ampla de plasticidade.

Em um aspecto, os métodos e composições como fornecidos aqui, são usados para preparar ou processar óleos vegetais, tais como canola, rícino, coco, coentro, milho, caroço de algodão, avelã, semente de cânhamo, linhaça, espuma de prado, oliva, óleo de palma, semente de palma, amendoim, colza, farelo de arroz, açafroa, sasanqua, sésamo, soja, girassol, tall, tsubaki, variedades de óleos "naturais" tendo composições de ácido gra- xo alteradas por meio de Organismos Geneticamente Modificados (GMO) ou "reprodução" tradicional tais como óleos tipo oleico elevado, linolênico baixo, ou óleos saturados baixos (canola oleica elevada, soja de linolênico baixo, ou girasol esteárico elevado) usando as hidrolases como fornecido aqui, incluindo interesterificação e transesterificação enzimática, veja, por exemplo, Patente U.S. no. 5.288.619 e Pedido de Patente U.S. No.de Série 11/567.318. Os métodos e composições como fornecidos aqui podem ser usados no lugar de interesterificação randomizada como descrito em, por exemplo, Patente U.S. No. 3.949.105. Em um aspecto, os métodos e composições como fornecidos aqui, são usados em transesterificação enzimática para preparar um óleo, por exemplo, um óleo de margarina, tendo teor tanto de ácido trans baixo quanto de ácido graxo de cadeia intermediária baixo.

Em um aspecto, a estrutura simétrica de um óleo, por exemplo, um óleo tipo palma ou láurico é modificada, por exemplo, em uma estrutura randomizada. Desse modo, os métodos como fornecidos aqui podem ser usados para modificar as propriedades de produtos de gordura plástica. Em um aspecto, a modificação de óleos pelos métodos como fornecido aqui pode ser designada para prevenir ou retardar gradualmente o endurecimento do óleo com o tempo, particularmente quando os produtos estão sendo armazenados.

Em um aspecto, os métodos e composições como fornecidos aqui em uma mistura reacional de transesterificação compreendendo um material de fonte de ácido esteárico e um óleo vegetal líquido comestível, transesterificando o material de fonte de ácido esteárico e o óleo vegetal usando uma lipase específica de posição 1-,3 como fornecido aqui, e em seguida hidrogenando a mistura de ácido graxo para fornecer um material de fonte de ácido esteárico de reciclo para uma reação recíclica com o óleo vegetal. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.288.619.

Em um aspecto, uma reação de interesterificação é conduzida com uma lipase como fornecida aqui. Em um aspecto, uma lipase como fornecida aqui tem seletividade para posições 1- e 3 de triacilglicerídeo para retardar ou inibir um aumento na quantidade de triacilglicerídeos trissatura- dos no óleo. Nesta reação como fornecido aqui, deficiências de interesterifi- cação randomizada convencional e a dificuldade de interesterificação com uma lipase não específica podem ser superadas por que a interesterificação é conduzida por uma enzima como fornecida aqui tendo especificidade para posições 1- e 3 de triacilglicerídeos. Em um aspecto, a exsudação de óleos líquidos contidos nos produtos é retardada ou prevenida com um aumento de temperatura na reação para inibir um aumento no ponto de fusão causado por um aumento na quantidade de triacilglicerídeos trissaturados. Isto controla o problema de endurecimento de produtos durante armazenagem por longo tempo.

Composições farmacêuticas e tratamento de deficiências de hi- drolase

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos e composições (enzimas como fornecidas aqui, por exemplo, esterases, acilases, lipases, fosfolipases ou proteases como fornecidas aqui) que podem ser usados no tratamento de uma deficiência de hidrolase em um animal, por exemplo, um mamífero, tal como um ser humano. Por exemplo, em um aspecto, os métodos e composições como fornecidos aqui, são usados para tratar embaralhamento de pacientes de uma deficiência de uma lipase pan- creática. Em um aspecto, uma lipase é administrada oralmente. Uma enzima como fornecido aqui pode ser liberada no lugar de ou com uma preparação de enzima de pâncreas de porco.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições far-macêuticas compreendendo polipeptídeos (por exemplo, enzimas, peptí- deos, anticorpos) como fornecidos aqui. Estas composições farmacêuticas podem ser na forma de comprimidos, pílulas, géis, cápsulas, hidrogéis, sprays, pós, aerossóis, implantes, lipossomos, cremes, unguentos, líquidos, uma microsfera, uma partícula de núcleo multiparticulado, uma emulsão, uma suspensão, nanoestruturas e similares. As composições farmacêuticas compreendendo polipeptídeos (por exemplo, enzimas, peptídeos, anticorpos) como fornecidos aqui podem ser administradas em qualquer forma, por exemplo, oralmente, intradermicamente, intraperitoneamente, por I.V., topicamente e similares. Em um aspecto, as composições farmacêuticas como fornecidas aqui, são formuladas para liberação tópica, sublíngual, oral, intravenosa, subcutânea, intramuscular, transdérmica, intra-arterial, intraarticular, ou intradérmica.

Em um aspecto, as composições como fornecidas aqui, usadas para estes tratamentos são ativas sob condições acídicas. Em um aspecto, as composições como fornecidas aqui, são administradas oralmente em formulações (por exemplo, comprimidos, pílulas, géis, cápsulas, hidrogeis, sprays, pós, aerossóis) que passam através das regiões de ácido do estômago e descarregam a enzima somente no ambiente relativamente alcalino do jejuno. Em um aspecto, uma hidrolase como fornecida aqui é formulada com um veículo tal como derivados de lactose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, celulose ou gelatina ou qualquer outro tal excipiente. Um lubrificante tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio ou cera de polietileno glicol também pode ser adicionado. Uma solução de açúcar concentrada, que pode conter aditivos tal como talco, dióxido de titânio, gelatina ou goma arábica, pode ser adicionada como um revestimento. Cápsulas macias ou duras podem ser usadas para encapsular uma hidrolase como um líquido ou como uma preparação sólida. Veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.691.181; 5.858.755.

Detergentes

Em certas modalidades, fornecidos aqui são métodos e composições (enzimas, por exemplo, lipases, saturases, palmitases e/ou esteara- tases como fornecidas aqui) que podem ser usados na preparação e uso de detergentes. Uma hidrolase como fornecida aqui pode ser adicionada a, por exemplo, ser misturada com, qualquer composição, sólido ou líquido detergente conhecido, com ou sem mudar a composição de uma composição detergente. Por exemplo, uma hidrolase como fornecida aqui pode ser adicionada a qualquer sabão, por exemplo, sulfatos alifáticos tal como sulfatos de alquila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada, sulfatos de amido, sulfatos de éter de alquila ou alquenila tendo um grupo alquila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno são adicionados, sulfonatos alifáticos tal como sulfonatos de alquila, sulfonatos de amida, sulfossuccinatos de dialqui- la, sulfonatos de alfa-olefinas, de olefinas tipo vinilideno e de olefinas internas, sulfonatos aromáticos tal como alquilbenzenossulfonatos de cadeia linear ou ramificada, amidas ou carbonatos de éter de alquila ou alquenila tendo um grupo alquila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido propileno e óxido de butileno são adicionados, ou amidas, ésteres ou sais de ácido alfa-sulfo-graxo, tensoati- vos tipo aminoácido, tensoativos de fosfato tal como fosfatos acídicos de alquila ou alquenila, e fosfatos de alquila ou alquenila, tensoativos anfotéri- cos tipo ácido sulfônico, tensoativos anfotéricos tipo betaína, alcoóis ou éteres de alquila ou alquenila tendo um grupo alquila ou alquenila de cadeia linear ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno são adicionados, éteres de polióxi-etilenoalquil fenila tendo um grupo alquila de cadeia linear ou ramificada ao qual um ou mais dentre óxido de etileno, óxido de propileno e óxido de butileno são adicionados, adutos de óxido de alcanolamidas ou alquileno de ácido graxo superior dos mesmos, ésteres de ácido graxo de sacarose, monoésteres de glicerol de ácido graxo, óxidos de alquil- ou alquenil-amina, tensoativos ca- tiônicos tipo sal de tetra-alquil-amônio, ou uma combinação dos mesmos. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.827.718.

Em algumas modalidades, são fornecidas aqui composições de-tergentes compreendendo um ou mais polipeptídeos (hidrolases) como fornecidos aqui. Formas tensoativas e/ou não tensoativas podem ser usadas. Em um aspecto, a quantidade de hidrolase total, tensoativa e/ou não- tensoativa, pode ser de cerca de 0,0001% a cerca de 1,0%, ou de cerca de 0,0002% a cerca de 0,5%, em peso, de uma composição detergente. Em um aspecto, de uma composição detergente, uma hidrolase tensoativa é de cerca de 5% a cerca de 67% e uma hidrolase não tensoativa é de cerca de 33% a cerca de 95% da atividade total de hidrolase na mistura enzimática. Em um aspecto, o pH ideal da mistura enzimática total é entre cerca de 5 a cerca de 10,5.

Em um aspecto, as composições detergentes como fornecidas aqui incluem hidrolases alcalinas como fornecidas aqui que funcionam em valores de pH alcalino, visto que o pH de uma solução de lavagem pode estar em uma faixa de pH alcalino sob condições de lavagem ordinárias. Veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.454.971.

Os polipeptídeos como fornecidos aqui (enzimas como fornecidas aqui) podem ser usados em qualquer composição detergente, que são bem conhecidas na técnica, veja, por exemplo, Patentes U.S.Nos. 5.069.810; 6.322.595; 6.313.081. Por exemplo, em um aspecto, uma composição detergente de lavanderia é fornecida. Isto pode compreender 0,8 ppm a 80 ppm de uma lipase como fornecida aqui.

Qualquer método de preparação usando composições detergentes pode ser usado com enzimas como fornecidas aqui, veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.413.928; 6.399.561; 6.365.561; 6.380.147. As composições detergentes podem estar em uma ou duas partes de composição aquosa, uma composição líquida não-aquosa, um sólido de fusão, uma forma granular, uma forma particulada, um comprimido prensado, uma forma de gel, um pó, um gel, um hidrogel, um lipossoma, um aerossol, uma pasta e/ou uma forma de suspensão. As hidrolases como fornecidas aqui podem também ser usadas como um produto aditivo de detergente em uma forma sólida ou líquida. Tais produtos aditivos são destinados a suplementar ou reforçar o empenho de composições detergentes convencionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos capazes de remover sujeiras de alimento de modo geral, películas de resíduo alimentar e outras composições alimentares menores usando estas composições detergentes. Hidrolases como fornecidas aqui podem facilitar a remoção de manchas por meio de hidrólise de lipídeos catalítica, gorduras ou óleos. Hi- drolases como fornecidas aqui podem ser usadas em detergentes de lavagem de louça e em detergentes de lavanderia têxtil.

O teor de enzima ativa real depende do método de fabricação de uma composição detergente e não é crítico, assumindo que a composição detergente tem a desejada atividade enzimática. Em um aspecto, a quantidade de hidrolases presentes na composição final varia de cerca de 0,001 mg a 0,5 mg por grama de uma composição detergente. A enzima particular escolhida para uso no processo e produtos fornecidos aqui dependem das condições de utilidade final, incluindo a forma de produto física, uso de pH, temperatura de uso, e tipos de sujeira a serem degradadas ou alteradas. A enzima pode ser escolhida para fornecer atividade e estabilidade ideais para qualquer determinado grupo de condições de utilidade. Em um aspecto, as hidrolases são fornecidas aqui ativas nas faixas de pH de cerca de 4 a cerca de 12 e na faixa de temperatura de cerca de 20oC a cerca de 95oC. Os detergentes como fornecidos aqui podem compreender tensoativos catiônicos, não iônicos semipolares ou zwiteriônicos; ou, misturas dos mesmos.

Em uma modalidade, enzimas como fornecidas aqui podem ser formuladas em detergentes em pó e líquidos tendo pH entre 4,0 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (alternativamente 0,1% a 0,5%) em peso. Estas composições detergentes podem também incluir outras enzimas tal como proteases, celulases, lipases ou endoglicosidases, endo-beta.-1,4- glucanases, beta-glucanases, endo-beta-1,3(4)-glucanases, cutinases, peroxidases, laccases, amilases, glucoamilases, pectinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, ligninases, pululanases, arabinanases, hemicelulases, mannanases, xiloglucanases, xilanases, pectin acetil esterases, ramnogalac- turonan acetil esterases, poligalacturonases, ramnogalacturonases, galacta- nases, pectin liases, pectin metilesterases, celobioidrolases e/ou transglutaminases. Estas composições detergentes podem também incluir construtores e estabilizantes.

A adição de hidrolases como fornecidas aqui a composições de limpeza convencionais não cria qualquer limitação de uso especial. Em outras palavras, qualquer temperatura e pH adequado para um detergente é também adequada para as composições como fornecidas aqui contanto que a enzima seja ativa em ou tolerante do pH e/ou a temperatura do uso pretendido. Além disso, as hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas em uma composição de limpeza sem detergentes, novamente ou sozinha ou em combinação com construtores e estabilizantes.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui composições de limpeza incluindo composições detergentes para limpeza de superfícies duras, composições detergentes para limpeza de tecidos, composições de lavagem de louça, composições de limpeza oral, composições de limpeza de dentadura, e soluções de limpeza de lentes de contato.

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para a lavagem de um objeto compreendendo contatar o objeto com um polipeptídeo como fornecido aqui sob condições suficientes para a lavagem. Uma hidro- lase como fornecida aqui pode ser incluída como um aditivo detergente. A composição detergente como fornecida aqui pode, por exemplo, ser formulada como uma composição detergente de lavanderia manual ou em máquina compreendendo um polipeptídeo como fornecido aqui. Um aditivo de lavanderia adequado para o pré-tratamento de tecidos manchados pode pode compreender um polipeptídeo como fornecido aqui. Uma composição ama- ciante de tecido pode compreender uma hidrolase como fornecida aqui. Alternativamente, uma hidrolase como fornecida aqui pode ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfície dura doméstica gerais. Em aspectos alternativos, aditivos detergentes e composições detergentes como fornecidos aqui podem compreender uma ou mais outras enzimas tal como uma protease, uma lipase, uma cuti- nase, outra protease, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lactase, e/ou uma peroxidase (veja também, acima). As propriedades da(s) enzima(s) como fornecidas aqui são escolhidas serem compatíveis com o detergente selecionado (isto é, pH-ideal, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.) e as enzima(s) estão presentes em quantidades eficazes. Em um aspecto, enzimas como fornecidas aqui, são usadas para remover materiais malcheirosos de tecidos. Várias composições detergentes e métodos para prepará-las, que podem ser usados são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.333.301; 6.329.333; 6.326.341; 6.297.038, 6.309.871, 6.204.232, 6.197.070, 5.856.164.

Quando formuladas como composições adequadas para uso em um método de lavagem em máquina de lavanderia, as hidrolases como fornecidas aqui podem compreender tanto um tensoativo e um composto construtor. Elas podem adicionalmente compreender um ou mis componentes detergentes, por exemplo, compostos poliméricos orgânicos, agentes de branqueamento, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes de sabão de cal, suspensão para terra e agentes antirredeposi- ção e inibidores de corrosão. Composições de lavanderia como fornecidas aqui podem também conter agentes de amaciamento, como componentes detergentes adicionais. Composições contendo hidrolases como fornecidas aqui podem fornecer limpeza de tecido, remoção de mancha, manutenção da brancura, amaciamento, aparência da cor, inibição de transferência de pigmento e sanitização quando formulada como composições detergentes de lavanderia.

A densidade das composições detergentes de lavanderia como fornecidas aqui pode variar de cerca de 200 a 1500 g/litro, ou, cerca de 400 a 1200 g/litro, ou, cerca de 500 a 950 g/litro, ou, 600 a 800 g/litro, de composição; isto pode ser medido em cerca de 20oC.

A forma "compacta" de composições detergentes de lavanderia como fornecidas aqui é melhor refletida pela densidade e, em termos de composição, pela quantidade de sal de carga inorgânica. Os sais de carga inorgânica são ingredientes convencionais de composições detergentes em forma de pó. Em composições detergentes convencionais, os sais de carga estão presentes em quantidades substanciais, tipicamente 17% a 35% em peso da composição total. Em um aspecto das composições compactas, o sal de carga está presente em quantidades não excedendo a 15% da composição total, ou, não excedendo 10%, ou, não excedendo 5% em peso da composição. Os sais de carga inorgânicos podem ser selecionados dos sais de metal de álcali e alcalinoterrosos de sulfatos e cloretos, por exemplo, sulfato de sódio.

As composições detergentes líquidas como fornecidas aqui podem também ser em uma "forma concentrada." Em um aspecto, as composições detergentes líquidas podem conter uma menor quantidade de água, em comparação com os detergentes líquidos convencionais. Em aspectos alternativos, o teor de água do detergente líquido concentrado é menor do que 40%, ou, menos do que 30%, ou, menos do que 20% em peso da composição detergente. Os compostos detergentes como fornecidos aqui podem compreender formulações como descritas em WO 97/01629.

As hidrolases como fornecidas aqui podem ser úteis na formulação de várias composições de limpeza. Diversos compostos conhecidos são tensoativos adequados, incluindo detergentes não-iônicos, aniônicos, catiô- nicos, ou zwiteriônicos, por exemplo, como descrito nas Patentes U.S.Nos. 4.404.128, 4.261.868, 5.204.015. Além disso, enzimas como fornecidas aqui podem ser usadas, por exemplo, em aplicações de sabão em barra ou líquido, formulações de cuidados com a louça, soluções ou produtos de limpeza de lentes de contato, hidrólise de peptídeo, tratamento de lixo, aplicações têxteis, como enzimas de clivagem de fusão em produção de proteína, e similares. As hidrolases como fornecidas aqui podem fornecer desempenho realçado em uma composição detergente quando comparada à outra protease detergente, isto é, o grupo de enzima pode aumentar a limpeza de certas manchas sensíveis à enzima tal como vidro ou sangue, como determinado por avaliação usual após um ciclo de lavagem padrão. As hidrolases como fornecidas aqui podem ser formuladas em detergentes em pó e líquidos conhecidos e detergentes líquidos tendo pH entre 6,5 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (por exemplo, cerca de 0,1% a 0,5%) em peso. Estas composições de limpeza detergentes podem também incluir outras enzimas tal como outras esterases conhecidas, fosfolipases, proteases, amilases, celulases, lipases ou endoglicosidases, bem como construtores e estabilizantes.

Tratamento de alimentos e processamento de alimento

As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para separação de componentes de materiais de célula de planta. Por exemplo, hi- drolases como fornecidas aqui podem ser usadas na separação de material rico em proteína (por exemplo, células de planta) em componentes, por exemplo, sacarose de beterraba açucareira ou amido ou açúcares de batata, polpa ou frações de casca. Em um aspecto, hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para separar colheitas ricas em proteína ou ricas em óleo em frações de proteína e óleo e frações de casca valiosas. O processo de separação pode ser realizado pelo uso de métodos conhecidos na técnica.

As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas na preparação de sucos de fruta ou vegetais, xaropes, extratos e similares para aumentar a produção. As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas no ratamento enzimático (por exemplo, hidrólise de proteínas) de vários materiais derivados de parede de célula de planta ou materiais de excreção, por exemplo, de produção de vinho ou suco, ou resíduos agrícolas tal como cascas de vegetal, cascas de feijão, polpa de beterraba açucareira, polpa de oliva, polpa de batata, e similares. As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para modificar a consistência e aparecimento de frutos ou vegetais processados. As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para tratar material de planta para facilitar o processamento de material de planta, incluindo alimentos, facilitar a purificação ou extração de componentes de planta. As hidrolases como fornecidas aqui podem ser usadas para melhorar o valor da alimentação, diminuir a capacidade de ligação com a água, melhorar a degradabilidade em plantas de água de excreção e/ou melhorar a conversão do material de planta para ensilagem, e similares.

Alimentações animais e aditivos para alimento ou alimentação

Em certas modalidades, são fornecidos aqui métodos para tratar alimentações e alimentos animais e aditivos de alimento ou alimentação usando hidrolases como fornecidas aqui, animais incluindo mamíferos (por exemplo, seres humanos), pássaros, peixe e similares. Em outras modalidades, são fornecidos alimentações animais, alimentos, suplementos para alimentação e alimento, e aditivos compreendendo hidrolases como fornecidas aqui.

Em certas modalidades, são fornecidas aqui hidrolases para uso na modificação de alimentação animal ou um alimento, por exemplo, para processar o alimento ou alimentação in vitro (modificando componentes da alimentação ou alimento) ou in vivo. Em outro aspecto, uma hidrolase como fornecida aqui pode ser fornecida expressando as enzimas diretamente em colheitas de alimentação transgênica (como, por exemplo, plantas transgêni- cas, sementes e similares), tal como milho, soja, colza, lupin e similares. Em um aspecto, são fornecidas aqui plantas transgênicas, partes de planta e células de planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo como fornecido aqui. Em um aspecto, o ácido nuclei- co é expresso de modo que uma hidrolase como fornecida aqui, é produzida em quantidades recuperáveis. uma hidrolase pode ser recuperada de qualquer planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou alimentação, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade, melhorando o valor nutricional, palatabilida- de, e propriedades reológicas ou para destruir um fator antinutritivo.

Interesterificação

Em um aspecto, os métodos e composições fornecidos aqui podem ser usados para modificar as propriedades de misturas de triacilglicerí- deo, e, em um aspecto, sua consistência. Em um aspecto, uma enzima como fornecida aqui pode ser usada na presença de um catalisador tal como metal de sódio ou metóxido de sódio para promover a migração de acila entre moléculas de glicerídeo tal que os produtos consistam em misturas de glicerídeo em que os resíduos de acila graxos sejam randomizadamente distribuídos entre as moléculas de glicerídeo.

Em um aspecto, as enzimas como fornecidas aqui podem ser usadas para produzir produtos de interesterificação sob condições de reação em que a hidrólise de gordura é minimizada de modo que a interesterificação catalisada por lipase torne a reação dominante. Estas condições podem incluir, por exemplo, restringir a quantidade de água no sistema.

Em um aspecto, enzimas como fornecidas aqui podem ser usadas para catalisar as reações de interesterificação usando misturas de tria- cilglicerídeos e ácidos graxos livres, como descrito, por exemplo, na EP 0 093 602 B2. Nestes casos, o ácido graxo livre pode ser permutado com grupos acila dos triacilglicerídeos para produzir novos triacilglicerídeos enriquecidos no ácido graxo adicionado. Em um aspecto, lipases 1,3-específicas como fornecidas aqui podem ser usadas para confinar a reação às posições 1 e 3 dos glicerídeos, o que permite obter uma mistura de triacilglicerídeos não obteníveis por interesterificação química ou reação com uma lipase não específica. Em um aspecto, lipases não específicas são usadas para atingir resultados similares à interesterificação química.

A capacidade de produzir novas misturas de triacilglicerídeo usando lipases posicionalmente específicas como fornecidas aqui é útil para a indústria de óleos e gorduras por que algumas destas misturas têm propriedades valiosas. Um exemplo é a interesterificação catalisada por lipase 1,3- específica de 1,3-dipalmitoil-2-monoleína (POP), que é o maior triacilglicerí- deo da fração mediana de óleo de palma, com ácido esteárico ou triestearina para fornecer produtos enriquecidos na 1-palmitoil-3-estearoil-2-monoleína (POSt) e 1,3-distearoil-2-monoleína (StOSt) valiosos. POSt e StOSt são os importantes componentes de manteiga de cacau. Desse modo, um aspecto como fornecido aqui fornece uma reação de interesterificação para produzir equivalentes de manteiga de cacau de materiais de partida econômicos.

Em um aspecto, fornecidos aqui são métodos de produção de um substituto de gordura dura usando as lipases 1,3-específicas como fornecidas aqui. Em um aspecto, um substituto de gordura dura compreende uma mistura de palma de fração mediana e StOSt, POSt ou StOSt/POSt de pelo menos 85% de pureza.

A invenção será também descrita com referência aos seguintes exemplos; entretanto, deve ser entendido que a invenção não está limitada a tais exemplos.

EXEMPLOS Exemplo 1: Ensaios de lipase-saturase exemplares

Os seguintes exemplos descrevem ensaios para avaliar quanto a uma hidrolase, por exemplo, atividade de uma lipase, uma saturase, uma palmitase e/ou uma estearatase. Em um aspecto, estes ensaios exemplares podem ser usados como avaliações de rotina para determinar se um poli- peptídeo inclui-se dentro do escopo como fornecido aqui. Tais ensaios incluem o uso de compostos indicadores de pH para detectar a clivagem de ácidos graxos de triacilglicerídeos, métodos espectrofotométricos, HPLC, GC, MS, TLC e outros. Jaeger (1994) FEMS Microbiol. Rev. 15:29-63; Ader (1997) Methods Enzymol. 286:351-386; Vorderwülbecke (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:631-639; Renard (1987) Lopids 22: 539- 541.

Avaliação quanto à Atividade de Lipase/Esterase

As colônias são colhidas com palitos estéreis e usadas para in-dividualmente inocular cada um dos poços de placas de microtítulo de 96 poços. Os poços continham 250 μL de meios de LB com 100 μg/mL de am- picilina, 80 μg/mL de meticilina, e 10% v/v de glicerol (LB Amp/Meth, glycerol). As células foram desenvolvidas durante a noite a 37°C sem agitação. Cada poço desse modo continha uma cultura de estoque de células de E. coli cada das quais continha um pBLUESCRIPT™ com uma única inserção de DNA.

As placas de 96 poços foram usadas para multiplamente inocular uma única placa (a "placa condensada") contendo em cada poço 200 μL de LB Amp/Meth, glycerol. Esta etapa foi realizada usando a High Density Replicating Tool (HDRT) de uma BIOMEK™ (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA) com um branqueador a 1%, água, isopropanol, ciclo de esterilização secado por ar entre cada inoculação. Cada poço da placa condensada desse modo continha 10 a 12 diferentes clones de pBLUESCRIPT™ de cada placa de biblioteca fonte. A placa condensada foi cultivada durante 16 horas a 37° C, e em seguida usada para inocular duas placas filhas de mi- crotítulo de 96 poços brancas (Polifiltronics, Inc., Rockland MA) contendo em cada poço 250 μL de LB Amp/Meth (nenhum glicerol). A placa condensada original foi colocada em armazenagem a -80°C. As duas placas filhas condensadas foram inocubadas a 37°C durante 18 horas.

A esterase de cadeia curta "solução de estoque de substrato de 600 μM" foi preparada como segue: 25 mg de cada dos seguintes compos- tos foram dissolvidos no volume apropriado de DMSO para produzir uma solução a 25,2 mM. Os compostos usados foram proprionoato de 4- metilumbeliferila, butirato de 4-metilumbeliferila, e heptanoato de 4- metilumbeliferila. Duzentos e cinquenta microlitos de cada solução de DMSO foram adicionados a aproximadamente 9 mL de 50 mM, pH 7,5, tampão de HEPES que continha 0,6% de Triton X-100 e 0,6 mg por mL de dodecil mal- tosida (Anatrace, Maumee, OH). O volume foi levado para 10,5 mL com o tampão de HEPES acima mencionado para produzir uma suspensão ligeiramente turva.

A "solução de substrato de 600 μM de cadeia longa" foi preparada como segue: 25 mg de cada dos seguintes compostos foram dissolvidos em DMSO para 25,2 mM como acima. Os compostos usados foram elaidato de 4-metilumbeliferila, palmitato de 4-metilumbeliferila, oleato de 4- metilumbeliferila, e estearato 4-metilumbeliferila. Todos requereram breve aquecimento em um banho a 70° C para obter a dissolução. Duzentos e cinquenta microlitros de cada solução de DMSO foram adicionados ao tampão de HEPES e diluídos para 10,5 mL como acima. Todos os sete derivados de umbeliferila foram obtidos de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).

Cinquenta μL de "600 μM de solução de estoque substrato", da esterase de cadeia longa ou esterase de cadeia curta' foram adicionados a cada dos poços de uma placa condensada branca usando o BIOMEK™ para produzir uma concentração final de substrato de cerca de 100 μM. Os valores de fluorescência foram registrados (excitação = 326 nm, emissão = 450 nm) em um fluorômetro de leitura de placa imediatamente após a adição de substrato. A placa foi incubada a 70°C durante 60 minutos no caso dos substratos de cadeia longa, e 30 minutos em RT no caso dos substratos de cadeia curta. Os valores de fluorescência foram registrados novamente. Os valores de fluorescência inicial e final foram comparados para determinar se um clone ativo estava presente.

Para isolar o clone individual que transportou a atividade, as placas foram descongeladas e as placas individuais usadas para singularmente inocular uma nova placa contendo LB Amp/Meth. Como acima, a placa foi incubada a 37°C para cultivar as células, 50 μL de 600 μM de solução de estoque de substrato e solução de estoque foram adicionados usando o BI- OMEK™ e a fluorescência foi determinada. Logo que o poço ativo da placa fonte foi identificado, as células deste poço ativo foram estriadas sobre ágar com LB/Amp/Meth e cultivadas durante a noite a 37° C para obter colônias simples. Oito colônias simples foram colhidas com um palito estéril e usadas para individualmente inocular os poços de uma placa de microtítulo de 96 poços. Os poços continham 250 μL de LB Amp/Meth. As células foram cultivadas durante a noite a 37°C sem agitação. Uma alíquota de 200 μL foi r e- movida de cada poço e ensaiada com os substratos de cadeia longa ou curta apropriados, como acima. O clone mais ativo foi identificado e os restantes 50 μL de cultura foram usados para estriar uma placa de ágar com LB/Amp/Meth. Oito colônias individuais foram colhidas, cultivadas e ensaiadas, como acima mencionado. O clone mais ativo foi usado para inocular 3 mL de culturas de LB/Amp/Meth, que foram cultivadas durante a noite. O DNA de plasmídeo foi isolado das culturas e utilizado para sequenciamento.

Exemplo 2: Protocolos Exemplares para Determinação por LCMS de Perfil de Ácido Graxo Liberado Resultante da Hidrólise Enzimática de Óleo Vegetal

O seguinte exemplo descreve métodos exemplares (protocolos) para conduzir hidrólise enzimática de óleo vegetal, tal como óleo de soja (usado neste exemplo), (incluindo preparação de enzima) usando, por exemplo, enzimas como fornecidas aqui. Este exemplo também descreve métodos exemplares (protocolos) para detectar e quantificar os ácidos gra- xos liberados do óleo. O método é descrito usando uma lipase SEQ ID NO:2, porém é aplicável a outras enzimas, incluindo as enzimas como fornecidas aqui, por exemplo, as enzimas exemplares tendo uma sequência como mencionado na SEQ ID NO:2 e tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as modificações de resíduo de aminoácido descritas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23. Expressão de Proteína em Placa de 96 Poços Profundos: 1. Cultivar clones de lipase de E. coli durante a noite a 30°C em 1 mL de meio de TB contendo carbenicilina (100 μg/mL) em placas de 96 poços profundos com localização de registro e identidade de clones. 2. Inocular as placas de 96 poços profundos frescos contendo meio de TB (1 mL; 100 μg/mL carbenicilina) com as culturas líquidas (10 μL/poço). 3. Incubar a cultura durante a noite a 30°C ao mesmo tempo que agitando a 200 rpm. 4. Induzir a expressão de proteína por transferência de 500 μL de cada durante a noite em culturas em placa de 96 poços frescos contendo o meio de TB (500 μL/poço; 100 μg/mL carbenicilina) e tetraciclina anidra (200 ng/mL). 5. Incubar a 30°C durante 2 horas com agitação a 200 rpm 6. Colher as células por centrifugação de cada placa durante 10 minutos a 3000 x g. Remover o sobrenadante. Os péletes celulares podem ser usados imediatamente para ensaios de óleo ou armazenados a -20°C durante o último uso. Reação de Hidrólide de Óleo Enzimático: 1. Adicionar 100 μL de B-PER™ (Pierce Chemical, Rockford, IL) a cada pélete celular. Se os péletes são armazenados a -20°C, deixar descongelar durante 10 minutos em temperatura ambiente antes da adição de B-PER™. 2. Adicionar 400 μL de óleo de soja a cada poço de placa de 96 poços profundos. 3. Adicionar diversas contas (vidro 710-1180 μm) por poço. Selar as placas com CAPMATS™ (Whatman, Florham Park, NJ). 4. As células são lisadas e uma emulsão de óleo/enzima/tampão é gerada usando um moinho misturador (Retsch Inc., Newtown, PA). Colocar um par de placas seladas no Moinho Misturador e agitar durante 30 segundos em uma frequência de 30 ciclos/segundo. 5. Substituir os selos CAPMATS™ com um selo permeável ao gás. 6. Incubar as placas durante 2 horas a 37°C ao mesmo tempo que agitando a 200 rpm. Extração de Ácido Graxo: 1. Adicionar 1 mL de solvente de extração (CHCl3:MeOH:4N HCl (2:1:0,075)) a cada poço da placa de 96 poços profundos. 2. Pipetar a mistura para cima e para baixo diversas vezes até parecer homogênea. 3. Cobrir as placas com um selo de folha fina de metal de alumínio. 4. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 x g. Cortar o selo aberto usando uma gilete. 5. Penetrar a ponta da pipeta através da fase superior e transferir 5 μL de fase inferior para uma nova placa de 96 poços profundos contendo 995 μL/po^o de MeOH (isto é, uma diluição de 1/200 da fase inferior). Tomar cuidado para não contaminar-se com a fase superior. Armazenar misturas de extração separadas a 4°C. 6. Transferir 150 μL da diluição de 1/200 de todas as amostras para uma placa de 96 poços de poliestireno. 7. Prevenir a evaporação, selar por aquecimento as placas. As-segurar-se de que o selo não contacte MeOH visto que isto prevenirá a adesão apropriada. 8. Analisar as amostras por LC/MS. ANÁLISE DE LC/MS: 1. Amostras submetidas em formato de placa de 96 poços são injetadas por meio de um autoamostrador HTCPAL™ (LEAP Technologies, Carrboro, NC) em uma mistura isocrática de H2O/MeCN (10/90, v/v) e ácido fórmico a 0,1%, liberada por bombas LC-10ADVP™ (Shimadzu, Kyoto, Japan) a 1,2 mL/min. 2. Separação é obtida com uma coluna SYNERGI MAX-RP™ (Phenomenex, Sutter Creek CA) 150 x 2,00 mm e detecção. A quantificação é completada com um espectrômetro de massa API 4000™ triple-quad (Applied Biosystems, Foster, CA) usando ionização por eletrospray (ESI) e mo- nitoração de íon múltiplo para massas 277, 279, 281, 255, 283 no modo de íon negativo. 3. O controle da instrumentação e geração de dados são realizados com o software ANALYST 1.3™ (Applied Biosystems, Foster, CA). 4. LC/MS calibrada para cada ácido graxo na faixa de 0,5 a 50 μg usando amostras padrões (Sigma). Esta faixa ajusta-se melhor a uma curva padrão de regressão quadrática que é usada para calcular a quantidade de cada ácido graxo liberado nas amostras de enzima.

Exemplo 3: Protocolos Exemplares para Avaliação de HTP de Bibliotecas de Evolução de Lipase quanto à Seletividade Aumentada para Hidrólise de Ésteres de Palmitato ou Estearato versus Ésteres de Oleato

O seguinte exemplo descreve métodos exemplares (protocolos) para avaliação de produtividade elevada (HTP) de "bibliotecas de evolução" de lipase quanto à seletividade aumentada para hidrólise de ésteres de pal- mitato ou estearato versus ésteres de oleato. Este método exemplar (proto- colo/avaliação de HTP) descreve bibliotecas de evolução de lipase de avaliação derivadas de SEQ ID NO:2, porém é aplicável a outras enzimas, incluindo as enzimas como fornecidas aqui, por exemplo, as enzimas exemplares tendo uma sequência como mencionada na SEQ ID NO:2 e tendo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze ou mais ou todas as modificações de resíduo de aminoácido descritas na tabela 3, tabela 4, tabela 9, tabela 10, tabela 11, tabela 16 ou tabela 23; e este método exemplar (protocolo) é aplicável a outros tipos de biblioteca.

Estas avaliações HTP exemplares são conduzidas utilizando dois substratos fluorogênicos: ésteres de metilumbeliferila de palmitato ou estearato versus o éster de metilumbeliferila de oleato. Fluxo de Avaliação de HTP: 1. Clones de biblioteca são dispostos em placas de microtítulo e ensaiados em uma avaliação de HTP primária. 2. Clones identificados como tendo seletividade melhorada são designados como hits primários. 3. Hits primários são redispostos em placas de microtítulo, e en- saiados em uma avaliação de HTP secundária. 4. Clones confirmados como tendo seletividade melhorada são designados como hits secundários. 5. Hits secundários são sequenciados para identificar mutações de sequência presentes e ensaiados sobre óleo (ver protocolo separado). Protocolo de Ensaio de HTP: 1. Rotular com Barcode as placas de ensaio de 384 poços pretas; placas de cultivo de 384 poços de rótulo barcode e carregar 30 μL/poço de meio LB (100 μg/mL de carbenicilina). 2. Colher os clones com pintool ou cereja em placas de cultivo e cultivar durante a noite a 30°C em uma incubadora umidificada. 3. Induzir expressão de lipase por adição de 30 μL/poço de meio LB (100 μg/mL de carbenicilina) contendo 4 μg/ml de tetraciclina anidra e incubar 2 horas a 30°C. 4. Lisar as células por adição de 20 μl/poço de B-PER™ (Pierce Chemical, Rockford, IL); manter em temperatura ambiente até serem colocadas no robô. 5. Conduzir o ensaio de atividade de lipase no robô (ver abaixo). 6. Clones identificados como tendo seletividade aumentada para ésteres MeUMB de palmitato ou estearato sobre éster MeUMB de oleato são designados como hits. 7. Colher os clones com cereja de hit em placas de 96 poços profundos contendo meio LB (1 mL/poço; 100 μg/mL de carbenicilina) e cultivar durante a noite a 30°C. 8. Para hits primários, redispor em placas de 384 poços e repetir as etapas 1-8 na avaliação secundária; designar clones de hit como hits secundários. 9. Para hits secundários, após a etapa 8 submeter ao sequenci- amento. Protocolo de Exemplo de Avaliação de HTP Automatizada 1. Damasco: Misturar e transferir uma alíquota (10 μL) de células lisadas de "Placa de Cultivo" (ver as etapas 1-4 acima) a cada de duas placas de ensaio separadas (1 & 2). 2. MULTIDROP™ (Thermo Electron Corporation, Milford, MA): Adicionar 70 μL de substrato 1 (UMB-16:0) à placa de ensaio 1; adicionar 70 μL de substrato 2 (UMB-18:1) à placa de ensaio 2 3. Incubar as placas de ensaio durante 20 minutos a 37°C. 4. Ler em fluorímetro: Excitação 360 nm e Emissão 465 nm.

Clones de hit secundários determinados ter sequências únicas são dispostos e cultivados em placas de 96 poços e ensaiados sobre óleo de soja (ver abaixo). Estruturas de Substratos Fluorogênicos Usados na Avaliação de HTP

Exemplo 4: Evolução Exemplar para Hidrólise Melhorada de Ésteres de Palmitato ou Estearato Usando Tecnologia GSSMSM

O seguinte exemplo descreve e resume os resultados de protocolos de avaliação e "evolução de enzima" exemplares que identificaram enzimas exemplares como fornecidas aqui, por exemplo, enzimas tendo uma sequência como mencionada na SEQ ID NO:2, porém também tendo uma modificação de resíduo como mencionada na tabela 3 ou tabela 4; ou enzimas codificadas por um ácido nucleico tendo uma sequência como mencionada na SEQ ID NO:1, porém também tendo uma modificação de resíduo como mencionada na tabela 3 ou tabela 4. Em um aspecto, um ensaio de avaliação exemplar para identificar estas enzimas exemplares como fornecidas aqui usou óleo de soja como um substrato, e os ácidos graxos liberados (hidrolisados) do óleo de soja foram caracterizados, por exemplo, como ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico ou ácido esteárico.

Óleo de soja tem a seguinte distribuição de ácido graxo: Linolê- nico = 8%; Linoleico = 53%; Oleico = 23%; Palmítico = 12%; Esteárico = 4%. Desse modo, se a porcentagem de ácido palmítico liberado (hidrolisado) de óleo de soja por uma enzima exemplar como fornecida aqui for maior do que 12%, então aquela enzima tem uma preferência para hidrolisar (liberar) ácido palmítico.

Avaliação de Palmitase: fazer uma "Biblioteca de Palmitase"

Uma biblioteca de palmitase de variantes de SEQ ID NO:2 foi feita por tecnologia GSSMSM (número de patente 6.171.820). Mutações de ponto foram introduzidas usando oligonucleotídeos degenerados, em uma posição de aminoácido de uma só vez, de modo que cada códon original seja substituído com cada dos 20 aminoácidos naturalmente codificados. As variantes mutadas foram transformadas no hospedeiro de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, USA) para expressão e avaliação. A biblioteca foi construída em um vetor de expressão pASK-5, que foi modificado do vetor pASK- IBA (IBA GmbH, Alemanha). Para fazer pASK-5, o ligador de clonagem original foi substituído com novos sítios de clonagem, especificamente, a sequência de XbaI para HindIII de pASK-IBA foi substituída com a seguinte sequência: RBS ArgSerHisHisHisHisHisHis TCTAGATAACGAGGGCAAAACCATGGGAGGATCCAGATCT- CATCACCATCACCATCACTAAGCTT (SEQ ID NO:21) XbaI NcoI BamHI BglII HindIII

A expressão das variantes de GSSMSM foi induzida com anidro- tetraciclina após as densidades de célula hospedeira ideais serem alcançadas.

Enzimas tendo sequências de aminoácido geradas por tecnologia GSSMSM foram avaliadas por um protocolo de avaliação de alta produtividade (HTP), por exemplo, o protocolo descrito no exemplo 3, que determinou que ácido graxo foi preferencialmente hidrolisado de uma gordura - óleo de soja neste ensaio. O objetivo do projeto de evolução foi melhorar a seletividade de palmitato da sequência de origem, SEQ ID NO:2, sobre óleo. O ensaio compreendeu contato da nova/ enzima modificada de sequência com óleo de soja, que compreende vários ácidos graxos, incluindo ácido linolêni- co, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico e ácido esteárico (ver % de distribuição, listada acima) e medição da quantidade de cada ácido graxo hidrolisado por cada enzima modificada. Uma "biblioteca" de sequências foi identificada que permitiu uma enzima preferencialmente hidrolisar um ácido palmítico (ou um ácido esteárico, ver abaixo), do óleo de soja (a desse modo chamada "Biblioteca de Palmitato"): • Avaliações primária e secundária foram conduzidas usando uma avaliação de HTP por exemplo, o método descrito no exemplo 3; • Sequenciamento de hits secundários identificou mutações de aminoácido que resultaram na seletividade melhorada para hidrólise de pal- mitato versus oleato na avaliação de HTP comparada com, por exemplo a sequência de origem, SEQ ID NO:2. • Para cada variante de códon codificando para uma mutação de aminoácido, um clone foi colhido com cereja e disposto em placas de 96 poços para ensaio sobre óleo; • A partir dos ensaios de óleo a seletividade das enzimas mutan- tes para palmitato ou estearato ou outros ácidos graxos foi obtida (Tabela 3) • O hit de ponta produziu palmitato como 59% de ácidos graxos liberados (FAs) versus (vs) 43% para SEQ ID NO:2 no mesmo ensaio; isto corresponde a um aumento em fator de seletividade de 3,6 a 4,9; • Diversos clones também mostraram aumento em seletividade de estearato. • tabela 1, abaixo, resume as mutações de GSSMSM (ver acima) selecionadas para inclusão na "biblioteca de palmitato" a serem combinadas por tecnologia GeneReassemblySM (ver Exemplo 5). Em um ensaio exemplar, catorze (14) mutações de aminoácido únicas foram identificadas como produzindo o maior aumento em hidrólise de palmitato em ensaios de óleo (ver também as tabelas 1, 3 e 4, abaixo). Os resíduos são rotulados de acordo com a ordem que eles ocorrem na SEQ ID NO:2 de origem (ver figura 7), entre os resíduos que produzem aumento significante em hidrólise de palmitato ou estearato em ensaios de óleo. O "AA original" em SEQ ID NO:2 e mutações benéficas ("Novos Aminoácidos"), isto é, sequências exemplares como fornecidas aqui, são fornecidos. Em um aspecto, as mutações únicas a arginina (R) nas posições de resíduo 163 e 164 podem ser incluídas alternadamente de modo que esta biblioteca exemplar incluirá clones com as sequências 163V-164D (SEQ ID NO:2), 163R-164D, e 163V-164R, porém não a sequência 163R-164R. Tabela 1

A figura 6a ilustra os efeitos de mutações de GSSMSM de palmi- tase exemplares sobre a hidrólise de palmitato e estearato relativa a SEQ ID NO:2 de origem. Para cada das catorze (14) mutações de aminoácido únicas selecionadas para inclusão na biblioteca GeneReassemblySM de palmitase a mudança de porcentagem em palmitato e estearato liberados, relativa a SEQ ID NO:2 de origem, é representada por meio de um gráfico. Muitas destas mutações produziram aumento significante em hidrólise de palmitato, acompanhado por aumento pequeno a significante em hidrólise de estearato. Entretanto, diversas mutações causam leves diminuições em hidrólise de este- arato. Asteriscos denotam mutações identificadas como conduzindo seletividade tipo saturase aumentada.

Avaliação de Estearato: fazer uma "Biblioteca de Estearato (Es- tearatase)"

Uma biblioteca de estearatase de variantes de SEQ ID NO:2 foi feita por tecnologia GSSMSM (número de patente 6.171.820). Mutações de ponto foram introduzidas usando oligonucleotídeos degenerados, uma posição de aminoácido de uma só vez, de modo que cada códon original possa ser substituído com cada dos 20 aminoácidos naturalmente codificados. As variantes mutadas foram transformadas no hospedeiro de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, USA) para expressão e avaliação. A biblioteca foi construída em vetor de expressão pASK-5 (como descrito acima). A expressão da variante de GSSMSM foi induzida com anidrotetraciclina após as densidades de célula hospedeira ideais serem alcançadas.

Enzimas tendo sequências de aminoácido geradas por tecnologia GSSMSM foram avaliadas por um protocolo de avaliação de alta produtividade (HTP), por exemplo, o protocolo descrito no exemplo 3, que determinou que ácido graxo foi preferencialmente hidrolisado de uma gordura - óleo de soja neste ensaio. O ensaio compreendeu contato da nova/ enzima modificada de sequência com óleo de soja, que compreende vários ácidos gra- xos, incluindo ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico e ácido esteárico (ver % de distribuição, listada acima) e medição da quantidade de cada ácido graxo hidrolisado por cada enzima modificada. Uma "biblioteca" de sequências foi identificada que permitiu uma enzima preferencialmente hidrolisar um ácido esteárico (ou um ácido palmítico, ver acima), do óleo de soja (a desse modo chamada "Biblioteca de Estearato"): • Avaliações primária e secundária foram conduzidas usando uma avaliação de HTP por exemplo, o método descrito no exemplo 3; • Sequenciamento de hits secundários identificou mutações de aminoácido que resultaram na seletividade melhorada para hidrólise de es- tearato versus oleato na avaliação de HTP comparada com, por exemplo a sequência de origem, SEQ ID NO:2. • Para cada variante de códon codificando para uma mutação de aminoácido, um clone foi colhido com cereja e disposto em placas de 96 po- ços para ensaio sobre óleo. • Ensaios de óleo de hits secundários sequenciados produziram a seletividade das enzimas mutantes para palmitato ou estearato ou outros ácidos graxos (Tabela 3). • O hit de ponta produziu estearato como 22% de FAs liberado versus 9% para a SEQ ID NO:2 no mesmo ensaio; isto corresponde a um aumento em fator de seletividade de 2,3 a 5,5; • Diversos clones também mostraram aumento em seletividade de palmitato.

A tabela 2, abaixo, resume as mutações de GSSMSM (ver acima) selecionadas para inclusão na "biblioteca de estearatase" a serem combinadas por tecnologia GeneReassemblySM. Em um ensaio exemplar, vinte e duas (22) mutações de aminoácido únicas foram identificadas como produzindo o maior aumento em hidrólise de estearato em ensaios de óleo (ver também as tabelas 2, 3 e 4, abaixo). Os resíduos são rotulados de acordo com a ordem que eles ocorrem na SEQ ID NO:2 de "origem", entre os resíduos que produzem aumento significante em hidrólise de palmitato ou estea- rato em ensaios de óleo. O "Aminoácido Original" em SEQ ID NO:2 e mutações benéficas ("Novos Aminoácidos"), isto é, sequências exemplares como fornecidas aqui, são fornecidos. Em um aspecto, a mutação única a alanina (A) na posição de resíduo 223 é incluída como uma mutação fixa de modo que cada clone nesta biblioteca exemplar contenha esta mutação. Tabela 2

A figura 6b (ver também acima) ilustra os efeitos de doze (12) das vinte e duas (22) mutações de GSSMSM de estearatase de chumbo em hidrólise de palmitato e estearato relativa à SEQ ID NO:2 de origem. Para cada das doze (12) mutações de aminoácido únicas fornecidas na figura 6b e selecionadas para inclusão na biblioteca GeneReassemblySM de esteara- tase a mudança de porcentagem em palmitato e estearato liberados, relativa à SEQ ID NO:2 de origem, é representada por meio de um gráfico. A maioria destas mutações produziu aumento significante em hidrólise de estearato, porém diminuições leves a significantes em hidrólise de palmitato. Asteriscos denotam mutações identificadas como conduzindo seletividade tipo saturase aumentada isto é, aumento em seletividade para hidrólise de palmitato e es- tearato versus hidrólise de ácidos graxos insaturados no óleo, por exemplo, oleato, linoleato e Linolenato. Sumário • Avaliação da biblioteca "GSSMSM" (ver acima onde tecnologia GSSMSM é descrita em detalhes) baseada na SEQ ID NO:2 de origem produziu clones únicos mutantes de aminoácido com melhoras significantes em seletividade de palmitato e estearato, e em seletividade saturada isto é, sele-tividade para hidrólise de palmitato e estearato (por exemplo, hidrólise seletiva de palmitato e/ou estearato de óleo de soja); • Clones foram descobertos com melhoras significantes em sele-tividade de estearato (hidrólise seletiva de ácido esteárico sobre outros ácidos graxos); • Mutantes de GSSMSM com seletividade de palmitato aumentada (hidrólise seletiva de ácido palmítico sobre outros ácidos graxos) relativa à enzima de SEQ ID NO:2 foram descobertos.

A Tabela 3 e a tabela 4, abaixo, descrevem (também sumariam) as sequências das enzimas hidrolase exemplares como fornecidas aqui, por exemplo, a enzima exemplar tendo uma sequência como mencionada na SEQ ID NO:2 e tendo pelo menos uma (uma, diversas ou todas) as mudanças de resíduo de aminoácido descritas ns tabelas. A tabela 3 e tabela 4 também sumariam os dados de atividade quanto às enzimas exemplares selecionadas; os dados incluindo o pareamento de enzimas exemplares particulares com sua atividade de hidrolase positiva compreendendo a catálise de hidrólise de (liberação de) um palmitato ou um ácido graxo de estearato de óleo de soja, como identificado por um protocolo de avaliação de produtividade elevada (HTP), como descrito acima.

Na tabela 3 e tabela 4, o termo "Aminoácido Original" indica o resíduo de aminoácido alvejado (indicado sob "Resíduo de aminoácido") na enzima de "origem" SEQ ID NO:2 ("alvejada" para mudança); e o termo "Novos Aminoácidos" indica o resíduo de aminoácido recentemente designado (que substituiu o correspondente resíduo "alvejado" na "sequência velha") na enzima exemplar (nova) como fornecida aqui. Listando o "Novo Aminoácido" residente sob a coluna "estearato" versus o "palmitato" que indica qual das duas avaliações de ácido graxo de alta produtividade (HTP) (isto é, liberação de ácido palmítico em uma avaliação, e liberação de ácido esteárico na outra avaliação, veja o Exemplo 3) foi usada para detectar (identificar) uma enzima particular com a variação de resíduo indicada (nova sequência de enzima, "Novo Aminoácido" residente).

Por exemplo, na primeira série na tabela 3, no resíduo 7 de ami- noácido, a tirosina (ou "Y") da enzima de "origem" SEQ ID NO:2 é substituída por um resíduo de arginina (ou "R") aminoácido, e esta nova enzima (Y7R) tem atividade que difere daquela da enzima de origem (veja a tabela 3); por exemplo, o "Dados do Óleo" sumaria a preferência de substrato (ácido graxo) da nova enzima (por exemplo, a enzima Y7R) listando os ácidos graxos liberados (hidrolisados) gerados quando a enzima foi exposta ao (contatada com) óleo de soja (ensaios descritos acima), observando que o óleo de soja de substrato tem diversos grupos constituintes de ácido graxo hidrolisável possível, incluindo ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico.

Por exemplo, na primeira série, para uma enzima Y7R, 8,3% dos ácidos graxos liberados (do óleo de soja reagido) foram ácido linolênico, 22,1% dos ácidos graxos liberados foram ácido linoleico; 19,7% dos ácidos graxos liberados foram ácido oleico; 41,5% dos ácidos graxos liberados fo-ram ácido palmítico; 8,4% dos ácidos graxos liberados foram ácido esteárico (estes quatro números adicionam até 100%).

A coluna P + S adiciona ambos os pontos de dados P e S para sumariar o quanto dos ácidos graxos totais liberados foi ácido palmítico e ácido esteárico (41,5% mais 8,4% = 49,9% dos ácidos graxos hidrolisados foram ácido palmítico e ácido esteárico, ou "P + S"). TABELA 3 TABELA 3 (continuação)

A tabela 4 é um sumário, ou outra compilação, de dados mostra- dos na tabela 3 (acima), por exemplo, o termo "posição" indicou a posição de resíduo de aminoácido na SEQ ID NO:2; o termo "Aminoácido original", como na tabela 3, indicou o resíduo "origem" inalterado, enquanto o termo "Novo Aminoácido." como na tabela 3, indicou o resídio de aminoácido alterado (novo) naquela posição. Os termos "WT_P" e "WT_S" indicam a preferência de substrato (liberação de ácido graxo) da enzima de "origem", por exemplo, SEQ ID NO:2 para um substrato particular (ácido graxo) indicando a quantidade de ácido graxo liberado (hidrolisado) do óleo de soja (como na tabela 3), onde "P" é ácido palmítico, e "S" é ácido esteárico.

As colunas "palmitato" e "estearato" indicam a quantidade de ácido palmítico e ácido esteárico liberada (por hidrólise enzimática) do óleo de soja, que compreende ácido linolênico, ácido linoleico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido esteárico, como descrito acima. "P + S" mostra as quantidades combinadas de ácidos graxos hidrolisados que foram ácido palmítico e ácido esteárico, ou "P + S". Os termos "delta_P" e "delta_S" indicam a mudança na preferência de uma enzima exemplar como fornecida aqui (por exemplo, D61A da primeira série) para hidrolisar ácido palmítico e ácido esteárico, respectivamente, quando comparado à correspondente atividade de SEQ ID NO:2. O termo "delta P+S" indica o total ou mudança somada em preferência de uma enzima exemplar como fornecida aqui (por exemplo D61A da primeira série) para hidrolisar ácido palmítico e ácido esteárico quando comparado à atividade correspondente de SEQ ID NO:2.

A seção "mutações de palmitato" resume as enzimas exemplares como fornecidas aqui tendo uma preferência de atividade (hidrólise de ácido graxo) para liberar ácido palmítico versus outros ácidos graxos. A seção "mutações de estearato" resume a enzima exemplar como fornecida aqui tendo uma preferência de atividade para liberar ácido esteárico versus outros ácidos graxos (de óleo de soja, ensaio descrito acima). TABELA 4

Exemplo 5: Evolução Exemplar para Hidrólise Melhorada de Palmitato Usando Tecnologia GeneReassemblySM

Quatorze (14) mutações de aminoácido identificadas da avalia- 5 ção GSSMSM que abrange sete (7) posições de aminoácido foram combinadas pela tecnologia GeneReassemblySM (Patente U.S. número 6.605.449). As sequências de ácido nucleico de tamanho natural geradas a partir da fase de GeneReassemblyforam clonadas em um vetor de expressão pASK-5 (veja a descrição acima) para expressão em hospedeiro de HMS175 (Novagen, USA). A expressão de variantes de GeneReassembly foi induzida com ani- drotetraciclina após as densidades de célula hospedeira ideal serem atingidas.

As 14 mutações que produziram o maior aumento em hidrólise de palmitato, identificadas na tabela 2, foram selecionadas para inclusão em uma biblioteca de GeneReassembly de palmitase gerada por métodos descritos acima. Os clones iniciais foram avaliados sobre palmitato de umbelife- rila quanto à atividade produzindo cerca de 145 clones únicos de sequência, que foram ensaiados quanto à atividade sobre óleo de soja, como descrito acima.

A figura 8 mostra dados de avaliação primária e secundária para ensaios de óleo sobre os clones selecionados da biblioteca de palmitase. Os clones que produziram palmitato em mais do que 70% de Fas hidrolisados no ensaio primário (sob as condições de taxa inicial padrão do método de ensaio) foram selecionados para serem reensaiados em óleo de soja. Para cada ensaio de óleo de soja, os FAs extraídos foram diluídos 50 vezes e 100 vezes para análise por LCMS ou GC. Onde mutações não alvejadas adicionais foram encontradas, isto é também indicado. As relações de hidrólise de FA detectadas e as quantidades de cada FA detectadas são apresentadas. Na figura, "elevados" e "baixos" indicam valores que estavam fora da faixa da curva de calibração. As séries são classificadas na ordem de percentagem de palmitato liberado no segundo ensaio, e em seguida pelo palmitato total liberado. Numerosos clones mostraram seletividade de palmitato signifi- cantemente aumentada (até 100%), em comparação com uma SEQ ID NO:2 de origem (61,2%).

Os hits palmitase de topo 25 selecionados com base no ensaio secundário descrito acima foram subclonados em Pseudomonas systems (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050130160 e Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050186666). A sequência de ácido nucleico codificando a enzima ou polipeptídeo foi inserida ou no vetor pMYC (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050130160) ou no vetor pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20080058262) e em seguida introduzida no hospedeiro de Pseudomonas fluorescens por eletroporação. As células transformadas foram selecionadas ou por desenvolvimento em meio mínimo para uma construção de pDOW1169 ou em meios ricos mais tetraciclina para uma construção pMYC. A expressão da enzima ou polipeptídeo foi induzida com IPTG após densidades de célula hospedeira ideais serem obtidas.

A tabela 5 mostra dados de ensaios sobre o óleo de soja, conduzidos em duplicata, dos hits de topo 25 expressos nos sistemas Pseudo-monas systems. Os 4 hits construídos no vetor pDOW1169 são listados em tipografia em negrito sublinhada, todos os outros hits foram construídos no vetor pMYC. A enzima foi adicionada a 5 g de óleo bruto resultando em teor de água final de 20%. A mistura foi em seguida homogeneizada com uma sonda de 7 mm e incubada durante 40 horas a 25°C com agitação com barra agitadora. As alíquotas foram removidas e analisadas quanto ao FA convertendo FA em FAME e quantificando FAME por GC como descrito no exemplo 8. As enzimas 25 foram carregadas nos 5 g de óleo de soja com base em unidades iguais de atividade de UMB-palmitato. Nestas reações palmita- to em óleo foi significantemente reduzido de 11% em óleo não tratado para 5% ou menos em óleos tratados com enzima indicando uma preferência aumentada para hidrólise de palmitato em comparação com a SEQ ID NO:2 da enzima de origem. Tabela 5 ND (Não Determinado)

A tabela 6 abaixo mostra dados para uma termoestabilidade dos hits de palmitase de topo 25 selecionados com base no ensaio secundário descrito acima. Estes dados foram obtidos usando os hits expressos no hos-pedeiro de E. coli HMS174. Os clones foram dispostos em placas de 96 po- ços e incubados durante 10 minutos em temperatura ambiente (RT), 45, 50 ou 55°C, em seguida ensaiados em RT em MeUMB-palmitato. A percentagem de atividade residual é determinada dividindo-se a atividade após incubação em cada temperatura pela atividade após a incubação em RT. São também para cada palmitase as mutações presentes, e exemplos de seleti- vidade e atividade de palmitato em óleo de soja. SEQ ID NO:2 manteve aproximadamente 15% de atividade após a incubação durante 10 minutos a 50°C, porém não teve nenhuma atividade após a incubação a 55°C. Tabela 6

Exemplo 6: Produção de Laboratório para Avaliação de Enzimas Palmitase, estearatase ou Saturase Candidatas

Enzimas e polipeptídeos exemplares como fornecidos aqui fo-ram expressos no sistema Pseudomonas (Dow Global Technologies Inc.,

Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050130160). O ácido nucleico codificando a enzima ou polipeptídeo é inserido no vetor pMYC (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050130160) e foi em seguida introduzido no hospedeiro de Pseudomonas fluorescens auxotrófico por eletroporação. As células transformadas foram selecionadas por crescimento em meio mínimo. A expressão da enzima ou polipeptídeo foi induzida com IPTG após as densidades de célula hospedeira ideal serem obtidas.

O seguinte procedimento deve ser usado para avaliar a capaci- dade de uma enzima ou outro polipeptídeo como fornecido aqui hidrolisar uma amostra de óleo. A enzima palmitase é adicionada a 1 kg de óleo bruto resultando em teor de água final de 20%. A mistura é em seguida homogeneizada com um misturador aéreo e incubada em temperatura ambiente com mistura constante usando um misturador de pá. As alíquotas (0,5 mL) foram removidas a 0h, 21h, 43h, 65h, e 72h e tratadas para análise FAME conversion & GC analysis como descrito no exemplo 8.

O procedimento acima foi usado com a SEQ ID NO:2, a amostra de óleo foi um óleo de soja bruto. Após 72 horas amostras tanto de óleo não tratado quanto óleo tratado com enzima produziram os resultados mostrados na tabela 7. Tabela 7

Os resultados mostram um signifiante decréscimo na quantidade de ácido palmítico (C16:0), um tal decréscimo sendo considerado desejável. Exemplo 7: Avaliação de Lipases, Saturase ou Palmitases com Homologia de Sequência para a SEQ ID NO:2 de Polipeptídeo Exemplar

Diversas sequências de lipase homólogas foram subclonadas no vetor pMAL-c2x (New England Biolabs, USA) pelo método de xi-clonagem (Genlantis, USA). As construções contendo SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, ou SEQ ID NO:16 foram transformadas no hospedeiro de Escherichia coli ArcticExpress RP (Stratagene, USA) para expressão. A expressão das lipases está sob o controle de um promotor que é induzido com IPTG após as densidades de célula hospedeira ideais serem obtidas. As enzimas recombinantes foram testadas em óleo de soja quanto à seletividade de FA (Tabela 8). As lipases compreendendo SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:14, ou SEQ ID NO:16 foram expressas e clivadas do rótulo de fusão MBP usando condições padrões. Uma única colônia foi inoculada em meio de LB contendo 20 μg/ml de gentamicina e agitada a 200 rpm durante a noite a 30°C. Esta cultura durante a noite foi inoculada em meio de LB fresco contendo 20 μg/ml de gentamicina em uma leitura OD600 de 0,05. Esta cultura foi agitda a 200 rpm e 30°C até uma leitura OD600 de 0,5 ser obtida. As culturas foram transferidas para 12°C agitando a 200 rpm e dei-xadas equilibrar para a temperatura inferior antes da indução de expressão de lipase pela adição de 0,5 mM de IPTG, seguido por outro crescimento durante 24 horas. As células foram coletadas por centrifugação, suspensas em tampão Tris pH 8, contendo NaCl, CaCl2, DNaseI, e lisozima, e em se-guida lisadas por sonicação. Os lisados celulares foram clarificados por cen-trifugação. As enzimas foram clivadas de MBP por incubação da fusão li- pase-MBP com FactorXa durante 6 horas em temperatura ambiente, seguido por mais 18 horas a 12°C. Os lisados clarificados com enzimas recombinan- tes ativas intactas todos mostraram preferências fortes e similares para hi- drólise de palmitato sobre outro FA quando ensaiado em óleo de soja (Tabela 8). Tabela 8

Exemplo 8: Método para Conversão de ácidos graxos livres ou triglicerídeos em ésteres de metila de ácido graxo (FAME) e quantificação de FAME por Cromatografia de Gás.

Ácidos graxos liberados de lipídeos, triglicerídeos, gorduras ou óleos pela ação de lipases, por exemplo, saturases, palmitases e/ou esteara- tases podem ser quantificados diretamente por LCMS usando o método descrito no exemplo 2. Alternativamente estes ácidos graxos hidrolisados podem ser convertidos em ésteres de metila de ácido graxo (FAME) usando metanólise catalisada por ácido, e em seguida quantificados por Cromato- grafia de Gás (GC). Neste exemplo: • O óleo após a reação com lipases, por exemplo, saturases, palmitases e/ou estearatases é tratado pela adição de 1 mL de solvente de extração (CHCl3:MeOH:4N HCl (2:1:0,075)) por 0,5 mL de volume de reação. • Uma alíquota de 45 μL de óleo extraído é transferida para den-tro de um frasconete de tampa de rosca de 4 mL. A cada frasconete uma pequena barra agitadora é adicionada, seguido por 2 mL de hexano e 400 μL 20% (v/v) de MeOH em HCl. • Os frasconetes são então selados e aquecidos com agitação durante 15 minutos. Os frasconetes são então removidos de aquecimento e deixados resfriar antes de adicionar 800 μL de H2O. • A mistura é então vortexada e a amostra (500 μL) da camada de hexano de topo contendo FAMES é transferida para um frasconete auto- amostrador para a GC. A cada amostra 500 μL de 0,5 mg/mL C15:0 FAME são adicionados como um padrão interno.

O FAME sintetizado usando este método é então analisado por Cromatografia de Gás usando os seguintes parâmetros operacionais: • O equipamento é um Hewlett Packard 6890 Série GC com au- toamostrador • A coluna usada é uma Coluna Supelco SP-2380 Fused Silica Capillary 30 m x 0,25 mm e 0,2 μm de espessura de película • O injetor e detector são fixados a 260°C; fluxo de gás portador de Hélio é fixado a 0,6mL/min; o forno é fixado em uma temperatura inicial de 150°C. • As amostras (1 mL) são injetadas com uma divisão de 10:1 de injeção. O método GC usado tem : • Rampa 1: 4C/min durante 10 min = 190°C • Rampa 2: 15C/min durante 4 min = 250°C • Retenção: 250°C durante 2 min FA de triglicerídeo pode também ser analisado por conversão em FAME, mesmo na presença de ácidos graxos hidrolisados. Usando o método acima e o método abaixo em combinação, pode este ser usado para determinar a seletividade de ácido graxo de uma lipase, por exemplo, satu- rase, palmitase, e/ou estearatase, e o efeito da enzima sobre o óleo. O mé-todo para análise de FA ligado ao glicerol (ou outros alcoóis) utiliza metanó- lise catalisada na base: • O óleo após reação com lipases, por exemplo, saturases, pal- mitases e/ou estearatases é tratado por adição de 1 mL de extração de sol-vente (CHCl3:MeOH:4N HCl (2:1:0,075)) por 0,5 mL de volume de reação. • Uma alíquota de 45 μL de óleo extraído é transferida em um tubo micrófugo. Os 500 μL de heptano são adicionados seguidos por 50 μL de KOH metanólico a 2 N. • A mistura é vortexada vigorosamente durante 30 segundos, em seguida centrifugada. • Uma alíquota (50 μL) da camada de heptano de topo contendo FAME é transferida para um frasconete autoamostrador e combinada com 450 μL de hexano contendo o padrão interno C15:0. • Análise de FAME por GC é como delineada acima.

Exemplo 9: Evolução Exemplar para Tolerância Térmica de Palmitase usando a Tecnologia GSSMSM

A palmitase exemplar da invenção que incluiu as mutações D61E, R72K, e V163R de SEQ ID NO:2 (Enzima 17, tabela 5, acima) foi es-colhida como o mutante de seletividade de chumbo dos ciclos anteriores de evolução (Exemplos 4 e 5, acima). Outra evolução para melhorar a tolerância térmica da enzima seletiva de chumbo (SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R) foi conduzida usando a tecnologia GSSM (veja, por exemplo,Patente U.S. No. 6.171.820). Em síntese, a evolução de GSSM foi realizada por introdução de mutações de ponto usando oligonucleotídeos degenerados, uma posição de aminoácido em um tempo, de modo que cada códon original possa ser substituído com cada dos 20 aminoácidos natural-mente codificados. A biblioteca foi construída no vetor pDOW-Kan, analisado por gel de agarose, DPNI tratado e então transformado em células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram desenvolvidas, colhidas e se- quenciadas. Colônias foram agrupadas e o DNA foi preparado usando o kit Qiagen mini-prep (Catálogo # 27106, Qiagen, Valencia, CA). Células competentes de Pseudomonas fluorescens foram então transformadas com o DNA. O hospedeiro de Pseudomonas fluorescens foi obtido de Dow Global Technologies Inc. (Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050130160, Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050186666 e Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20060110747). O vetor pDOW-Kan foi construído adicionando-se um marcador de resistência de canamicina a pDOW1169 (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20080058262). As células foram desenvolvidas em meio mínimo M9 (Dow Global Technologies Inc., Pedido de Publicação de Patente U.S. No. 20050186666) suplementado com uracila e canamicina. Todos os exemplos que seguem que descrevem o uso do vetor pDOW-kan, Pseudomonas fluo- rescens, e meios de M9, referem-se ao mesmo vetor pDOW-kan, Pseudo-monas fluorescens, e meios M9 descritos acima.

A biblioteca de GSSM foi analisada em formato de 384 poços. Avaliações de HTP primárias e secundárias foram realizadas usando UMB- Palmitato (como descrito acima no exemplo 3). A fim de identificar mutações que mantêm a atividade enquanto a enzima está em uma temperatura ele-vada, o ensaio foi conduzido incubando o substrato fluorogênico com o lisa- do de célula total a 54°C durante 30 minutos, precedido por uma incubação de 30 minutos do lisado de célula total com tampão durante 30 minutos a 54°C para garantir que a enzima atingiu a 54°C antes da carga de substrato. A fluorescência de cada mutante foi medida (veja a coluna 2, tabela 9) e qualquer mutante com uma leitura de fluorescência de mais do que 2 desvi- os padrões acima do controle foram determinados serem um "hit' - isto é, um mutante com tolerância térmica suficientemente aumentada. 117 hits com mudanças de aminoácido únicas foram identificados a partir da avaliação de UMB-Palmitato (veja a tabela 9, abaixo). As mudanças de aminoáci- 5 do nos 117 hits de mutação única ocorreram em 50 resíduos; 22% da proteína mostraram mudanças de aminoácido. Os 117 hits foram também avaliados quanto ao desempenho sobre o óleo bruto em ensaios de 5 g padrões (veja o exemplo 5) a 25°C e 45°C. Os resultados são mostrados na tabela 10, abaixo. Tabela 9: Tabela 10

Uma mudança de códon em um determinado resíduo que não resulta em uma mudança de aminoácido é referida como uma mutação silenciosa. Mutações silenciosas são obtidas como hits devido à expressão aumentada com relação à enzima de origem, e foram observados 37 sítios na avaliação de GSSM (Tabela 11, abaixo). Tabela 11

Exemplo 10: Evolução exemplar para Tolerância Térmica Melho-rada de Palmitase usando a Tecnologia TMCASM

As mutações de realização de topo identifiadas durante a evolu-ção de GSSM (Exemplo 9, acima) foram avaliadas em ensaios de óleo pri- 5 mário e secundário para inclusão em evolução de TMCA. Ensaios de 5g de óleo bruto foram conduzidos, como descrito no exemplo 5, porém em 10% do teor de água, com os 117 hits únicos a 25°C e 45°C. O perfil de óleo foi avaliado seguindo 24 e 48 horas de reação. Os hits primários foram submetidos a ensaios de óleo secundário a 25°C, 45°C e 55°C. As alíquotas foram removidas a 3, 24, e 48 horas para avaliar os perfis de óleo. Os executores de topo são listados na tabela 12 abaixo com o palmitato permanecendo no óleo listado como um percentual dos ácidos graxos ligados totais. Para avaliar o impacto de um refinamento cáustico intermediário, os ensaios a 45°C foram cáusticos refinados pela adição de 11% de NaOH (estimado para 7% de FFA) e aquecidos com agitação contínua a 60°C. Enzima fresca foi adici-onada ao óleo refinado em 20% de teor de água, homogeneizada e a reação do óleo prosseguiu com agitação durante mais 24 horas a 45°C. O teor de palmitato final em amostras refinadas cáusticas é mostrado na última coluna, "CR 24H".

Dos executores de topo mostrados na tabela 12, 15 mutantes (mostrados em itálicos em negrito na tabela 12) foram selecionados por combinação usando a tecnologia TMCA. A biblioteca de TMCA foi construída como descrito na Publicação PCT número WO 2009/018449 e como também abaixo descrito. Esta biblioteca compreendeu 9216 variantes únicas. Tabela 12:

Tailored Multi-Site Combinatorial Assembly (TMCA) technology, TMCA technology (veja Publicação PCT No. WO 09/018449), compreende um método para produzir uma pluralidade de polinucleotídeos de descendência tendo diferentes combinações de várias mutações em múltiplos sítios. O método pode ser realizado, em parte, por uma combinação de pelo menos uma ou mais das seguintes etapas:

Obtendo informação de sequência de um polinucleotídeo ("primeiro" ou "padrão"). Por exemplo, a primeira ou padrão sequência pode ser um tipo selvagem (por exemplo SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R) ou uma sequência mutada. Uma informação de sequência pode ser do polinucleotídeo completo (por exemplo, um gene ou uma estrutura de leitura aberta) ou de regiões parciais de interesse, tal como uma sequência codificando um sítio para ligação, especificidade de ligação, catálise, ou especificidade de substrato.

Identificação de três ou mais mutações de interesse ao longo da primeira ou padrão sequência de polinucleotídeo. Por exemplo, mutações podem ser em 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 20 ou mais posições dentro da primeira ou padrão sequência. As posições podem ser predeterminadas por posição absoluta ou pelo contexto de resíduos ou homologia circundantes. Por exemplo, para TMCA de polipeptídeos de palmitase, as mudanças de ami- noácido termotolorante de topo que resultaram em desempenho de enzima melhorado foram incluídas como mutações de interesse. As sequências flanqueando as posições de mutação sobre qualquer dos lados podem ser conhecidas. Cada posição de mutação pode conter duas ou mais mutações, tal como para diferentes aminoácidos. Tais mutações podem ser identificadas pelo uso de Gene Site Saturation MutagenesisSM (GSSMSM) technology, como descrito aqui e, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 6.171.820; 6.562.594; e 6.764.835.

Fornecimento de iniciadores (por exemplo, oligonucleotídeos sin-téticos) compreendendo as mutações de interesse. Em uma modalidade, um iniciador é fornecido para cada mutação de interesse. Desse modo, um primeiro ou padrão polinucleotídeo tendo 3 mutações de interesse pode usar 3 iniciadores naquela posição. O iniciador também pode ser fornecido como um lago de iniciadores contendo uma posição degenerada, de modo que a mutação de interesse seja a faixa de qualquer nucleotídeo ou aminoácido de ocorrência natural, ou um subgrupo daquela faixa, por exemplo, um lago de iniciadores pode ser fornecido que favorece mutações para resíduos de ami- noácido alifático.

Os iniciadores podem ser preparados como iniciadores dianteiros ou reversos, ou os iniciadores podem podem ser preparados como pelo menos um iniciador dianteiro e pelo menos um iniciador reverso. Quando mutações são posicionadas próximas entre si, pode ser conveniente usar iniciadores que contêm mutações para mais do que uma posição ou diferentes combinações de mutações em múltiplas posições.

Fornecimento de um polinucleotídeo contendo a sequência padrão. O primeiro ou padrão polinucleotídeo pode ser circular, ou pode ser superespiralado, tal como um plasmídeo ou vetor para clonagem, sequenci- amento ou expressão. O polinucleotídeo pode ser de filamento único ("ssD- NA"), ou pode ser de filamento duplo ("dsDNA"). Por exemplo, o método TCMA submete o padrão de dsDNA superespiralado ("sc") a uma etapa de aquecimento a 95oC durante 1 min (veja Levy, Nucleic Acid Res., 28(12):e57(i-vii) (2000)).

Adição dos iniciadores ao polinucleotídeo padrão em uma mistura reacional. Os iniciadores e os polinucleotídeo padrão são combinados sob condições que permitem os iniciadores anelarem-se ao polinucleotídeo padrão. Em uma modalidade do protocolo de TMCA, os iniciadores são adicionados ao polinucleotídeo em uma única mistura reacional, porém podem ser adicionados em múltiplas reações.

Realização de uma reação(s) de extensão de polimerase. Os produtos de extensão (por exemplo, como um "polinucleotídeo estendido modificado" ou "descendência") podem ser amplificados por métodos convencionais. Os produtos podem ser analisados quanto ao comprimento, sequência, propriedades de ácido nucleico desejadas, ou expressos como po- lipeptídeos. Outros métodos de análise incluem hibridização in situ, avalia- ção de sequência ou avaliação de expressão. A análise pode incluir um ou mais ciclos de avaliação e seleção de uma propriedade desejada.

Os produtos podem também ser transformados em uma célula ou outro sistema de expressão, tal como um sistema livre de célula. O sistema livre de célula pode conter enzimas relacionadas à replicação de DNA, reparo, recombinação, transcrição, ou para translação. Hospedeiros exemplares incluem células bacterianas, de levedura, de planta e de animal e cepas celulares, e incluem E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pichia pastoris e Aspergillus niger. Por exemplo, cepas XL1-Blue ou Stb12 de E. coli podem ser usadas como hospedeiros.

O método da invenção pode ser usado com o mesmo ou diferentes iniciadores sob diferentes condições de reação para promover produtos tendo diferentes combinações ou números de mutações.

Realizando o método exemplar descrito acima, este protocolo também fornece um ou mais polinucleotídeos produzidos por este método de evolução de TMCA, que então podem ser avaliados ou selecionados quanto à propriedade desejada. Um ou mais dos polinucleotídeos de descendência podem ser expressos como polipeptídeos, e opcionalmente analisados ou selecionados para uma propriedade desejada. Desse modo, esta modalidade do protocolo de evolução de TMCA fornece polinucleotídeos e os polipep- tídeos codificados, bem como biblioteas de tais polinucleotídeos codificando tais polipeptídeos. Esta modalidade do protocolo de evolução de TMCA também provê avaliação das bibliotecas por avaliação ou seleção da biblioteca para obter um ou mais polinucleotídeos codificando um ou mais polipeptí- deos tendo a atividade desejada.

Outra modalidade do protocolo de evolução de TMCA descrito na Publicação PCT No. WO 2009/018449 compreende um método de produção de uma pluralidade de polinucleotídeos modificados. Tais métodos geralmente incluem (a) adição de pelo menos três iniciadores a um polinu- cleotídeo padrão de filamento duplo em uma única mistura reacional, em que os pelo menos três iniciadores não são de sobreposição, e em que cada de pelo menos três iniciadores compreendem pelo menos uma mutação dife- rente dos outros iniciadores, em que pelo menos um iniciador é um iniciador dianteiro que pode anelar-se a um filamento negativo do padrão e pelo menos um iniciador seja um iniciador reverso que pode anelar-se a um filamento positivo do padrão, e (b) submissão da mistura reacional a uma reação de extensão de polimerase para produzir uma pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos dos pelo menos três iniciadores.

Outra modalidade do protocolo de evolução de TMCA descrito na Publicação PCT No. WO 2009/018449 compreende um método em que uma célula é transformada com a pluralidade de produtos estendidos que não foram tratados com uma ligase. Em outra modalidade da invenção, a pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos é recuperada da célula. Em outra modalidade, a pluralidade recuperada de polinucleotídeos modificados estendidos é analisada, por exemplo, expressando pelo menos um de pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos e analisando o polipeptídeo expresso deles. Em outra modalidade, uma pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos compreendendo as mutações de interesse é selecionada.

Em outra modalidade do protocolo de evolução de TMCA, informação de sequência considerando o polinucleotídeo padrão é obtida, e três ou mais mutações de interesse ao longo do polinucleotídeo padrão podem ser identificadas. Em outra modalidade, produtos obtidos pela extensão de polimerase podem ser analisados antes de transformar uma pluralidade de produtos modificados estendidos em uma célula.

Em uma modalidade do protocolo de evolução de TMCA, produtos obtidos pela extensão de polimerase são tratados com uma enzima, por exemplo, uma enzima de restrição, tal como uma enzima de restrição de DpnI, desse modo destruindo a sequência de polinucleotídeo padrão. Os produtos tratados podem ser transformados em uma célula, por exemplo, uma célula de E.coli.

Em uma modalidade do protocolo de evolução de TMCA, pelo menos dois, ou pelo menos três, ou pelo menos quatro, ou pelo menos cinco, ou pelo menos seis, ou pelo menos sete, ou pelo menos oito, ou pelo menos nove, ou pelo menos dez, ou pelo menos onze, ou pelo menos doze, ou mais iniciadores podem ser usados. Em uma modalidade, cada iniciador compreende uma única mutação de ponto. Em outra modalidade, dois iniciadores dianteiros ou dois reversos compreendem uma mudança diferente na mesma posição no polinucleotídeo padrão. Em outra modalidade, pelo menos um iniciador compreende pelo menos duas mudanças em diferentes posições no polinucleotídeo padrão. Todavia, em outra modalidade, pelo menos um iniciador compreende pelo menos duas mudanças em diferentes posições e pelo menos dois iniciadores dianteiros ou dois reversos compreendem uma diferente mudança na mesma posição no polinucleotídeo padrão.

Em uma modalidade do protocolo de evolução de TMCA, os ini-ciadores dianterios são agrupados em um grupo dianteiro e os iniciadores reversos são agrupados em um grupo reverso, e os iniciadores no grupo dianteiro e os iniciadores no grupo reverso, independente um do outro, são normalizados para serem concentração igual no grupo correspondente independente de posições no polinucleotídeo padrão, e em que após a normalização uma quantidade igual dos iniciadores dianteiro e reverso é adicionada à reação. Neste método de normalização, uma combinação de algumas posições pode ser influenciada. A influência pode ser devido a, por exemplo, uma concentração iniciadora relativamente baixa em uma posição contendo um único iniciador comparado a uma posição contendo múltiplos iniciadores. "Influência posicional" refere-se aos polinucleotídeos resultantes que mostram uma forte preferência para uma incorporação de iniciadores em uma única posição relativa a outras posições dentro de seu grupo de iniciador dianteiro ou reverso. Isto resulta em uma combinação de polinucleotídeos modificados que pode ter uma percentagem elevada de mutações dentro de uma única posição iniciadora, porém uma baixa percentagem de mutações em outra posição dentro de seu grupo de iniciador dianteiro ou reverso. Esta influência é desfavorável quando o objetivo da TMCA é gerar polinucleotí- deos de descendência compreendendo todas as possíveis combinações de mudanças para o padrão. A influência pode ser corrigida, por exemplo, por normalização dos iniciadores como um lago em cada posição a ser igual.

Em uma modalidade do protocolo de evolução de TMCA, a nor-malização de iniciador é realizada organizando-se os iniciadores em múltiplos grupos, dependendo de sua loalização sobre o polinucleotídeo padrão, em que os iniciadores que abrangem a mesma região selecionada no padrão, estão em um grupo; normalizando os iniciadores agrupados dentro de cada grupo a ser concentração igual; reunindo os iniciadores dianteiros dentro de um grupo em um grupo dianteiro e normalizando a concentração entre cada grupo dos iniciadores dianteiros a ser igual; reunindo os iniciadores reversos dentro de um grupo em um grupo reverso e normalizando concentração entre cada grupo dos iniciadores reversos a serem iguais; e adicionando uma quantidade igual dos iniciadores dianteiro e reverso na reação. Nenhuma influência foi observada para combinações de posição.

Em uma modalidade do protocolo de evolução de TMCA, um grupo de iniciadores degenerados, cada qual compreendendo uma posição degenerada, é fornecido, em que a mutação de interesse é uma faixa de diferentes nucleotídeos na posição degenerada. Em outra modalidade, um grupo de iniciadores degenerados é fornecido compreendendo pelo menos um códon degenerado correspondendo a pelo menos um códon do polinu- cleotídeo padrão e pelo menos uma sequência adjacente que é homóloga a uma sequência adjacente ao códon da sequência de polinucleotídeo padrão. Em outra modalidade, o códon degenerado é N,N,N e codifica quaisquer de 20 aminoácidos de ocorrência natural. Em outra modalidade, o códon degenerado codifica menos do que 20 aminoácidos de ocorrência natural.

Outra modalidade do protocolo de evolução de TMCA descrito na Publicação PCT No. WO 2009/018449 compreende um método de produção de uma pluralidade de polinucleotídeos modificados compreendendo as mutações de interesse. Tais métodos geralmente incluem (a) adição de pelo menos dois iniciadores a um polinucleotídeo padrão de filamento duplo em uma única mistura reacional, em que o pelo menos dois iniciadores não estão em sobreposição, e em que cada de pelo menos dois iniciadores compreendem pelo menos uma mutação diferente do(s) outro(s) iniciador(es), em que pelo menos um iniciador é um iniciador dianteiro que pode anelar-se a um filamento negativo do padrão e pelo menos um iniciador é um iniciador reverso que pode anelar-se a um filamento positivo do padrão, (b) submissão da mistura reacional a uma reação de extensão de polimerase para produzir uma pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos dos pelo menos dois iniciadores, (c) tratamento de uma pluralidade de polinucleotí- deos modificados estendidos com uma enzima, desse modo destruindo o polinucleotídeo padrão, (d) transformação dos polinucleotídeos modificados estendidos tratados que não foram tratados com uma ligase em uma célula, (e) recuperação de uma pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos da célula, e (f) seleção de uma pluralidade de polinucleotídeos modificados estendidos compreendendo as mutações de interesse.

Neste exemplo, as 15 mutações selecionadas para inclusão na biblioteca de TMCA tolerante térmico são mostradas na tabela 13, abaixo. Seis padrões de DNA foram usados: SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R (origem), origem com mutação de E95K, origem com mutação de P162G, origem com mutação de P162K, origem com mutação de E95K & P162G, e origem com mutações de E95K & P162K. Os plasmídeos da origem com mutação de E95K, origem com mutação de P162G, origem com mutação de P162K foram passados através de células competentes de E. coli XL1Blue para metilar o DNA. Seis evoluções de TMCA separadas foram realizadas, uma para cada dos seis padrões em combinação com os oligos listados na tabela 14 abaixo. Tabela 13: Tabela 14:

Membros da biblioteca foram amplificados no vetor pDOW-kan, analisados por gel de agarose, e tratados por DPNI. As amostras foram então transformadas em células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram colhidas, desenvolvidas e sequenciadas. Os resultados do sequenci- amento indicaram que a mutação E116L e as mutações nos aminoácidos 144, 149 e 150 foram sub-representadas em comparação ao máximo teórico. Portanto, outra biblioteca de TMCA foi criada usando uma mistura normalizada de todos os padrões. As reações de TMCA foram repetidas usando todos os oligos listados na tabela 14, exceto aqueles para mutações de E116I e E116N. A quantidade de iniciadores usados para a mutação E116L e para a região 4 (aminoácidos 144, 149 & 150) foi duplicada. As amostras foram amplificadas no vetor pDOW-kan, analisadas por gel de agarose, e tratadas com DPNI. O DNA de amostra foi transformado em células compe-tentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram colhidas, desenvolvidas e se- quenciadas. A incorporação de mutações nos aminoácidos 144, 149, e 150 foi melhorada, porém o E116L foi ainda sub-representado em comparação ao máximo teórico. O DNA de ambas as bibliotecas foi transformado em células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram agrupadas e o DNA foi preparado usando o kit Qiagen mini-prep. O DNA foi então usado para transformar células competentes Pseudomonas fluorescens. As células foram desenvolvidas em meios LB suplementados com uracila (750 μg/ml) e canamicina (50 μg/ml). Um número suficiente de colônias foi obtido para su- peramostrar a biblioteca em 10 vezes. A biblioteca foi superamostrada em dez vezes para dar razão uma sub-representação de E116L.

A biblioteca de TMCA termotolerante resultante foi desenvolvida em meios mínimos de M9 suplementados com uracila (750 μg/ml) e canami- cina (50 μg/ml) e foi analisada usando a avaliação de HTP descrita no exemplo 3, acima. A biblioteca foi incubada a 60°C durante 30 minutos antes e após a adição de UMB-Palmitato. As placas de 384 poços foram então lidas com excitação a 365 nm e emissão a 460 nm. Cada placa foi rapidamente resfriada por centrifugação e o espectrofotômetro foi preaquecido para minimizar artefatos em leituras. Os valores de fluorescências através de cada placa de 384 poços são mostrados. Os hits foram identificados como aqueles tendo desvios padrões >2 acima do controle positivo (mutação única de E116L). Uma avaliação de HTP secundária ensaiou hits de HTP primários em duas temperaturas 60°C e 63°C. Os hits secundários foram identificados como desvios padrões >4 acima do controle positivo médio na placa de 63°C e mantendo >50% de atividade entre 60°C e 63°C. 318 hits de HTP secundários únicos de sequência foram identificados. Estes hits contêm entre 2 e 9 mutações. Ensaios de óleo bruto de 5 g padrões (como descritos no exemplo 5) foram conduzidos com lisados clarificados dos 318 hits. Dos hits de HTP secundários, aqueles que reduziram palmitato mais eficientemente nas temperaturas elevadas (45°C ou 60°C) do que a 25°C no ensaio de óleo, foram escolhidos como "hits de óleo" de tolerância térmica. 57 hits de óleo de tolerância térmica primária foram identificados e caracterizados por ensaios de óleo adicionais (veja as tabelas 15 e 16, abaixo). Além disso, ensaios de óleo de 5 g foram realizados e 9 hits de óleo foram identificados que tiveram perfis de desempenho de temperatura preferidos em adição a níveis de atividade total variáveis (veja a tabela 17, abaixo). Tabela 15: • Hits de tolerância térmica 29, 40, 41 e 74 também contêm mu- tações adicionais (veja mutações adicionais listadas na tabela 16, abaixo). Tabela 16: Mutações adicionais também contidas nos hits de tolerância térmica 29, 40, 41 e 74. Tabela 17:

Exemplo 11: Evolução Exemplar para Expressão Realçada de Palmitase usando a Tecnologia TMCASM

As 37 mutações silenciosas individuais identificadas durante a avaliação de GSSM (veja a tabela 11, Exemplo 9, acima) foram avaliadas quanto à expressão (veja a tabela 18, abaixo). 50 mL de culturas foram ex-pressos em meios M9, suplementados com uracilA e canamicina, em frascos de 250 mL. Os hits foram desenvolvidos a 30°C durante 16 a 20 horas antes e após a indução com 0,3 mM de IPTG. As células foram peletizadas por centrifugação e lisadas com B-PER™ (Catálogo número 78248, Pierce Pro- tein Research Products, Rockford, IL). Uma porção do lisado inteiro foi cen-trifugada para clarificar. Tanto o lisado celular total quanto os lisados clarifi-cados foram ensaiados quanto à concentração de proteína total usando o Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo# 500-0006) com base no método Bradford, e quanto à atividade sobre o substrato fluorogêni- co UMB-Palmitato, e por SDS-PAGE. Os valores foram normalizados com o valor de origem estabelecido para 100%. 16 hits foram identificados demonstrando atividade aumentada sobre a origem). Tabela 18:

As mutações silenciosas individuais de topo 11 (Tabela 19, abai-xo) foram combinadas usando a tecnologia TMCA, como descrito na Publi-cação PCT Número WO 2009/018449 e também descritas abaixo). Tabela 19:

Para a evolução de TMCA, quatro padrões de DNA foram usa- dos: (1) Palmitase "Origem A" (SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R), (2) Palmitase "Origem B" (Origem A com mutações adicionais (GGC)45(GGA) e (CTG)117(CTT)), (3) Palmitase "Origem C" (Origem A com mutação adicional (GGC)45(GGA)), e (4) "Origem D" (Origem A com mutação adicional (CTG)117(CTT)). Nota: Mutações são listadas para fornecer o códon original, seguido pelo número de posição do aminoácido modificado, seguido pelo novo códon. Por exemplo, (GGC)45(GGA) indica que o códon para um aminoácido na posição 45 de SEQ ID NO:2 foi mudado de (GGC) para (GGA).

Um primeiro ciclo de reações de TMCA foi completado com cada dos quatro padrões de DNA e os iniciadores para as regiões 1 e 4 (veja a tabela 20, abaixo; região 1: aminoácido 35; região 4: aminoácidos 183 e 188), desse modo criando quatro sub-bibliotecas. Os produtos de sub- biblioteca foram purificados usando o kit Qiagen PCR clean-up. Cada sub- biblioteca, contendo uma mistura de produtos purificados e, portanto, contendo múltiplos padrões, foi então usada em uma segunda reação de TMCA simples por sub-biblioteca com iniciadores para regiões 2 e 3 (veja a tabela 21, abaixo; região 2: aminoácidos 102 e 108; região 3: aminoácidos 124, 126, 128 e 133). Tabela 20: Tabela 21:

As amostras foram amplificadas no vetor pDOW-kan, analisadas quanto por gel de agarose, DPNI tratado e em seguida transformadas em células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram desenvolvidas, colhidas e sequenciadas. As colônias foram agrupadas e o DNA foi prepara- do para cada sub-biblioteca usando o kit Qiagen mini-prep (Catálogo # 27106, Qiagen, Valencia, CA). Células competentes de Pseudomonas fluo- rescens foram então transformadas com o DNA. As células foram desenvolvidas em meios LB suplementados com uracila (750 μg/ml) e canamicina (50 μg/ml). Um número suficiente de colônias foi obtido para uma superamostra- gem de sete vezes da biblioteca (pelo menos 14.000 colônias).

A biblioteca foi disposta, desenvolvida em meios mínimos de M9 suplementado com uracila (750 μg/ml) e canamicina (50 μg/ml) e ensaiada com 400 μM de palmitato de 4-metilumbeliferila em HEPES a 80 mM em pH7,5. As amostras foram incubadas durante 30 minutos a 54°C antes e após a adição do substraato. A fluorescência foi lida a Ex360nm & Em465nm. 46 amostras de mutação silenciosa produziram sequências únicas (veja a tabela 22, abaixo). A leitura de fluorescência para cada das amostras de mu-tação silenciosa é também listada na tabela 22, primeira coluna "Atividade de UMB". As amostras de mutação silenciosa 2, 7, 9, 10, 13, 16, 23, 25, 40, e 44 tiveram mudanças de aminoácido (AA) além das mutações silenciosas (veja a tabela 23, abaixo). Tabela 22: Tabela 22 (continuação): Tabela 23:

As 46 únicas amostras de mutação silenciosa foram desenvolvi- das em frascos de agitação de 250 mL. Os lisados clarificados foram quanti-ficados usando o Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) com base no método Bradford e em seguida normalizados para a expressão de proteína total. A expressão foi analisada por SDS-PAGE.

A origem (SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R), controle negativo, e hits de mutação silenciosa de topo 4 foram expressos em escala de 1L. Cada amostra foi lisada por microfluidizante ou na presença de BPER detergente. A concentração de proteína foi quantificada quanto aos lisados brutos e clarificados usando o Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo# 500-0006) com base no método Bradford. Cada série do gel de SDS-PAGE foi então carregada com proteína total igual. Os níveis de palmitase similares foram observados sob todas as condições de solubilidade e lise testadas. Os hits de mutação silenciosa 26, 34, 35 e 37 (Tabelas 22 e 23, acima) mostraram uma maior percentagem de expressão da palmitase, quando comparado à origem (SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R). Hit de mutação silenciosa 35 teve a maior percentagem de expressão de palmitase. O hit de mutação silenciosa teve as seguintes sete mutações silenciosas quando comparado à origem: (GCG)35(GCT), (GTG)102(GTT), (AGC)108(AGT), (CTG)117(CTT), (CGG)126(AGG), (AGT)133(TCT), e (ACC)188(ACG).

Exemplo 12: Evolução Exemplar para Expressão Realçada de Palmitases Tolerantes Térmicas

Para avaliar a expressão dos 9 candidatos de palmitases tole-rantes térmicas de chumbo (Exemplo 10, Tabelas 15, 16, e 17), as 7 mutações silenciosas de topo (Exemplo 11) foram incorporadas em cada chumbo tolerante térmico como descrito abaixo. O resultado foi que cada chumbo tolerante térmico (Hits de tolerância térmica 29, 40, 41, 74, 81, 202, 204, 238, e 244) teve as seguintes mutações silenciosass incorporadas (35GCT, 102GTT, 108AGT, 117CTT, 126AGG, 133TCT, 188ACG) em cada um com as mutações silenciosas incorporadas, cada chumbo tolerante térmico foi renomeado adicionando-se "SM" à terminação do número de hit tolerante térmico, por exemplo, hit tolerante térmico 29 com as mutações silenciosas incorporadas foi renomeado "29 SM". Igualmente, hit 40 tornou-se "40 SM", o hit 41 tornou-se "41 SM", hit 74 tornou-se "74 SM", hit 81 tornou-se "81 SM", hit 202 tornou-se "202 SM", hit 204 tornou-se "204 SM", hit 238 tornou- se "238 SM", e hit 244 tornou-se "244 SM".

A fim de incorporar as 7 mutações silenciosas de topo nos chumbos tolerantes terminais 9, tecnologia TMCA como descrito na Publica-ção PCT Número WO 2009/018449 e como também descrito abaixo foi usada.

Para o primeiro ciclo de evolução de TMCA, os chumbos toleran tes térmicos de topo 9 e o hit de expressão de chumbo (hit de mutação si-lenciosa #35) foram passados através de células competentes de E. coli XL1Blue a fim de melhorar o DNA. O hit de mutação silenciosa #35 foi usado como o padrão de DNA. Os oligos listados na tabela 24 abaixo foram usados para incorporar combinações de mutações no padrão de DNA. Tabela 24:

As amostras foram amplificadas no vetor pDOW-kan, analisadas quanto ao gel de agarose, e tratadas com DPNI. As amostras foram trans-formadas em células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram co- lhidas, desenvolvidas e sequenciadas. O sequenciamento identificou diver-sas combinações de mutações. Entretanto, algumas combinações foram sub-representadas. Portanto, algumas das novas construções do primeiro ciclo de evolução de TMCA foram selecionadas para uso como padrões para o ciclo seguinte de evolução de TMCA. Os padrões usados são listados na tabela 25 abaixo. Tabela 25:

As combinações de padrões e oligos usados no segundo ciclo de evolução de TMCA são listadas na tabela 26 abaixo. Uma reação de TMCA separada foi conduzida para cada série na tabela 26, criando uma biblioteca individual para cada série. Por exemplo, um ciclo consistiu no pa-drão F8 e iniciadores 2For e 7 Rev. Um segundo ciclo consistiu no padrão F8 e iniciadores 2For e 6 Rev. Observe, diversos dos mesmos iniciadores foram usados como no primeiro ciclo. Dois iniciadores adicionais foram or- denados para um segundo ciclo de PCR. Estes oligos foram denominados 116LF e 162F. O oligo 116LF tem a sequência reversa e complementar de oligo 4-Alt2-RevJC. O oligo 162F tem a sequência reversa e complementar de 5-RevJC. Tabela 26:

As amostras foram amplificadas no vetor pDOW-kan, analisadas quanto ao gel de agarose, e tratadas com DPNI. As amostras foram trans-formadas em Células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram colhidas, desenvolvidas e sequenciadas. O sequenciamento identificou sufi- ciente representação de 7 das 9 construções desejadas. Entretanto, quando as outras duas construções foram sub-representadas, um ciclo adicional de evolução de TMCA foi requerido para obter as induções tolerantes térmicas restantes em combinação com as sete mutações silenciosas. Duas novas construções foram usadas como padrões para um terceiro ciclo de evolução de TMCA. Estes padrões são listados na tabela 27 abaixo. As combinações de padrões e oligos usados no terceiro ciclo são listadas na tabela 28 abaixo. Uma reação de TMCA separada foi conduzida para cada série na tabela 28, criando uma biblioteca individual para cada série. Por exemplo, um ciclo consistiu no padrão F3 e iniciadores 162F e 7 Rev. O segundo ciclo consistiu no padrão B5 e iniciadores 162F e 6 Rev. Tabela 27: Tabela 28:

As amostras foram amplificadas no vetor pDOW-kan, analisadas quanto ao gel de agarose, e tratadas com DPNI. As amostras foram trans-formadas em Células competentes de E. coli XL1Blue. As colônias foram colhidas, desenvolvidas e sequenciadas. Suficiente representação das duas construções restantes foi obtida. DNA para todas as construções de E. coli XL1Blue desejadas foi preparado e transformado em células competentes de Pseudomonas fluorescenss. As células foram desenvolvidas em meio de LB suplementado com uracila (750 μg/ml) e canamicina (50 μg/ml). As amostras foram confirmadas por sequenciamento.

Para avaliação, a biblioteca foi desenvolvida em meios mínimos de M9 suplementados com uracila (750 μg/ml) e canamicina (50 μg/ml). Os ensaios de óleo padrão foram realizados carregando-se lisados clarificados a 10% de teor de água usanto tampão de fosfato em ensaios de óleo bruto nos níveis de atividade de UMB-Palmitato listados na coluna esquerda da tabela 29. Os ensaios de óleo foram carregados, homogeneizados e subse-quentemente continuamente misturados como para as reações padrões, a 25°C, 45°C, e 60°C. Alíquotas de 50 μL de 11% de NaOH foram adicionadas em 3 e 20 horas para cada reação de óleo, em seguida homogeneizadas. As alíquotas foram removidas a 20, 44, e 68 horas e submetidas à extração de metanol de clorofórmio padrão e metanólise total, seguido por análise GC de FAME (como descrito no exemplo 8, acima). O palmitato restante no óleo é listado para cada alíquota na tabela 29. O Hit tolerante térmico de mutação silenciosa 29 SM reduziu o palmitato dramaticamente em todo curso do tem-po a 25°C (Tabela 29). Tabela 29:

Exemplo 13: Sal de potássio de ácido oleico como emulsificante possibiliza a enzima gerar o óleo de palmitato a 1%

As amostras de óleo foram incubadas com 10% de potássio- oleato para avaliar o impacto deste emulsificante sobre as reações de óleo com a palmitase. Lisados clarificados de Hit 29SM ou controle negativo foram carregados em ensaios de 5% de teor de água em óleo pré-tratado (A e B) e óleo bruto (C). O pré-tratamento foi realizado por tratamento, aquecimento, centrifugação da enzima e em seguida filtrando o óleo para remover a goma e a fase aquosa e para reduzir os ácidos graxos livres, como descrito no exemplo 14, para gerar um óleo de palmitato <5% livre de goma. O óleo foi homogeneizado antes e após a adição da enzima para garantir emulsões uniformes. 0,5 g de sal de potássio de ácido oleico comercialmente obtido foi pesado em 5 g de óleo, misturado a 60°C para solubilizar, e em seguida homogeneizado. A adição de cáustico para neutralização de FFA a 1% foi feita às reações listadas "cáustico". Os ensaios de óleo foram carregados com enzima, re-homogeneizados e subsequentemente continuamente misturados como para reações padrão. As alíquotas foram removidas a 3, 24, 48, 72, e 120 horas. As alíquotas foram submetidas à extração de metanol de clorofórmio e metanólise total, seguida por análise por GC de FAME (como descrito no exemplo 8, acima). O palmitato restante no óleo é listado para cada alíquota na tabela 30 abaixo. Os óleos pré-tratados foram bem- sucedidamente impulsionados para um nível de palmitato a 1%. Tabela 30:

Exemplo 14: 2 kg de óleo com centrifugação intermediária e emulsificação de oleato obtêm óleo de palmitato a 1%

O impacto combinado de polipeptídeo, uma etapa de filtração in-termediária, e adição de oleato de potássio para atingir óleo de palmitato a 1% foi avaliado em escala de bancada. 2 kg de óleo bruto foram reagidos com 29 SM em 5% de teor de água. A reação de óleo foi homogeneizada durante 1 minuto com um IKA em velocidade 6 atingindo uma temperatura de 25°C. Um misturador aéreo foi equipado com a pá misturadora de tinta e misturada a reação de óleo a 390 rpm. Seguindo 1 hora de reação, a velocidade de mistura foi acelerada a 530 rpm. A temperatura de reação foi monitorada e flutuada de 21°C a 29°C com aquecimento intermitente de um bloco de aquecimento. As amostras foram removidas para seguir as mudanças em perfil de óleo. Seguindo 28 horas, a reação de óleo foi aquecida para 66°C e centrifugada em um girotestador. A fração de óleo foi resfriada para temperatura ambiente durante a noite com mistura com pá, em seguida gelada com um banho de gelo para menos do que 10°C. Terra diatomácea foi adicionada e os TAGS e DAGS foram separados dos ácidos graxos livres por filtração através de um funil Buchner gelado com papel Whatman. 1 kg deste óleo de palmitato reduzido foi usado para iniciar as reações com oleato de potássio como um emulsificante. 100 g de oleato de potássio foram adicionados ao óleo. As reações foram aquecidas para 60°C com agitação para garantir a solubilidade. O óleo foi gelado para 23°C, em seguida 50 ml de enzima foram adicionados para obter 5% de teor de água.

Este óleo foi homogeneizado antes e após adição de enzima 29 SM para garantir emulsões uniformes. Alíquotas foram removidas a 6, 21, 24, 28, após a filtração, após a adição de oleato, em início de novo ensaio e 3, 20, e 22 horas dentro do segundo ensaio. As alíquotas foram submetidas à extração de metanol de clorofórmio padrão e total metanólise, seguida por GC análise de FAME (como descrito no exemplo 8, acima). Os ácidos graxos restantes ligados no óleo são listados para cada alíquota na tabela 31, abaixo. Hit 29 SM foi capaz de impulsionar os níveis de palmitato para 1% no óleo. Tabela 31:

Exemplo 15: Centrifugação Dupla e Filtração produz óleo de bai xo palmitato

A capacidade de separar o oleato de potássio seguindo reações de óleo foi demonstrada abaixo. 2 kg de óleo bruto foram reagidos com 29 SM em 5% de teor de água. A reação de óleo foi homogeneizada durante 1 minuto com um IKA em velocidade 6 atingindo uma temperatura de 25°C. Um misturador aéreo foi equipado com uma pá misturadora de tinta e misturou a reação de óleo a 390 rpm. Seguindo 1 hora de reação, a velocidade de mistura foi acelerada para 530 rpm. A temperatura de reação foi monitorada e flutuada de 21°C a 29°C com aquecimento intermitente de um bloco de aquecimento. As amostras foram removidas para seguir mudanças em perfil de óleo. Seguindo 28 horas, a reação de óleo foi aquecida para 80°C e cen-trifugada em um girotestador. A fração de óleo foi resfriada para a temperatura ambiente durante a noite com mistura com pá, em seguida gelada com um banho de gelo para menos do que 10°C. Terra diatomácea foi adicionada e os TAGS e DAGS foram separados dos ácidos graxos livres por filtração através de um funil Buchner gelado com papel Whatman. 1 kg deste óleo tratado foi usado para iniciar as reações com oleato de potássio como um emulsificante. 50 g de oleato de potássio foram adicionados para obter 5%. Isto foi misturado e homogeneizado. 50 ml de enzima foram carregados para obter 5% de teor de água e homogeneizados durante 1 minuto a 6 no IKA alcançando 26,6°C. Esta reação de óleo foi misturada com uma pá misturadora de tinta equipada com um misturador aéreo a 400 rpm. Aquecimento de bloco de calor intermitente foi utilizado. Alíquotas foram removidas a 3, 20, 24, e a 8, 28, e 48 horas seguindo o início do segundo ensaio. As alíquotas foram submetidas à extração de metanol de clorofórmio padrão e metanólise total, seguida por GC análise de FAME (como descrito no exemplo 8, acima). Ácidos graxos restantes ligados no óleo são listados para cada alíquota na tabela 32, abaixo. 29 SM impulsionou os níveis de palmitato para 1,5%. Este óleo foi aquecido para 85°C e centrifugado removendo os resíduos de proteína. A fração de óleo foi gelada para 6°C com mistura com pá, terra diatomácea foi adicionada e o material foi separado sobre um funil Buchner. A filtração foi continuada a 25°C. Tabela 32:

Exemplo 16: Otimização de Códon

Versões otimizadas por códon para expressão em Pseudomo- nas fluorescens do hit de mutação silenciosa tolerante térmica de chumbo 29 SM (Exemplo 12) foram designadas por dois diferentes métodos. A primeira versão otimizada por códon substituiu todos os códons no hit 29SM com aqueles preferidos por Pseudomonas fluorescens, incluindo as 7 mutações silenciosas melhores incorporadas (Exemplo 12). Esta versão foi denominada 29SM-Pf (SEQ ID NO:22). O uso de códon preferido para Pseudomonas fluorescens foi determinado por revisão da Base de Dados de Uso de Códon disponível online no website Kazusa DNA Research Institute (2-6-7 Kazusa- kamatari, Kisarazu, Chiba 292-0818 JAPÃO, 2009 recuperado da Internet <URL:http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html>). Em particular, os padrões de uso de códon para o Pseudomonas fluorescens PfO-1 (2009 recuperado da Internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=205922>) e Pseudomonas fluorescens Pf-5 (2009 recuperado da Internet <URL: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi- bin/showcodon.cgi?species=220664>) foram usados na designação da sequência otimizada por códon, SEQ ID NO:22.

A segunda versão otimizada por códon também substituiu todos os códons no hit 29SM com aqueles preferidos por Pseudomonas fluores- cens, exceto mantidas as 7 mutações silenciosas de chumbo (Exemplo 11). Esta versão foi denominada 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO:23). 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO:23) é o candidato de topo sobre 29SM-Pf (SEQ ID NO:22). SEQ ID NO:22: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGA- TATCCCGGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAA- TGGGCAAACTGGCAGATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTT- CCTGGCGGACGACAACGCGACCAGCGTGCTGCGGAAGACCTT- CGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTGGGAAAAGGGCTTCAAC- CTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCGACCGCCTGCG- CGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTAATCGTGGTCGG- CTGGTCCCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGTTGGGCCACAAGG- CCCCCGAACTGATCCGTATGGTCGTCACGCTCGGCTCCCCGTTCG- CCGGCGACCTCCACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCAT- CAACTCCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGA- TTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGCCGTGTGGAGCCCGCTCGA- CGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAGCCCCGAGCAGAG- CGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTTGCGGC- TAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCG- CCTCTGA SEQ ID NO:23: ATGCTCAAGCCCCCACCTTACGGCCGTCTGCTCCGCGAACTGGCTGA- TATCCCGGCGATCGTGACTGCTCCGTTCCGCGGCGCAGCCAAAA- TGGGCAAACTGGCTGATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTT- CCTGGCGGACGACAACGCGACCAGCGTGCTGCGGAAGACCTT- CGAGGTCGCCGGCTTTGCGTGCAGCGGCTGGGAAAAGGGCTTCAAC- CTCGGCATTCGTGGCGACCTCATGGACTACCTGGTCGACCGCCTGCG- CGCCGTGAGCGAGGCCGCGGGGGGGCAGAAGGTTATCGTGGTCGG- CTGGAGTCTCGGCGGCCTCTACGCCCGGGAGCTTGGCCACAAGG- CCCCCGAACTGATCAGGATGGTCGTCACGCTCGGCTCTCCGTTCG- CCGGCGACCTCCACGCGAACCATGCCTGGAAGATCTACGAGGCCAT- CAACTCCCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGCGCGATTTCCAGA- TTAAGCCGCCGGTGCATACCATCGCCGTGTGGAGCCCGCTCGA- CGGGGTGGTGGCCCCGGAGACGAGCGAAGGCAGCCCCGAGCAGAG- CGACGAGCGCTTGGAGCTGGCCGTGACCCACATGGGCTTTGCGGC- TAGCAAGACCGGGGCGGAGGCAGTGGTCCGCCTGGTCGCCGCCCG- CCTCTGA

As sequências de ambas as versões otimizadas por códon do gene foram enviadas para DNA 2.0 Incorporated (Menlo Park, CA) para síntese de DNA. Os genes foram sintetizados no vetor pJ201 com um sítio de restrição de Spel e Xhol sobre qualquer lado do gene. Quando os genes sintetizados foram liberados, os plasmídeos foram cortados com enzimas de restrição. O DNA de vetor pDOW-Kan foi também cortado com as mesmas enzimas de restrição e em seguida tratado com fosfatase alcalina intestinal de bezerro (New England Biolabs, Produto #M0290L). Todas as amostras foram purificadas por gel e extraídas usando o kit de extração de gel QIA- quick (Qiagen, Produto #28706). O vetor e inserções foram então ligados usando o Roche Rapid Ligation kit (Roche, Produto # 11635379001). Os produtos de ligação foram então transformados em células competentes de E.coli XL1Blue. As colônias foram colhidas, desenvolvidas e o DNA foi preparado usando o Qiagen mini-prep kit. As amostras de DNA foram confirmadas pela sequência e o DNA foi então usado para transformar Pseudomonas fluorescens. 29SM-Pf (SEQ ID NO:22), 29SM-Pf+SM (SEQ ID NO:23), 29SM, a origem (SEQ ID NO:2 com mutações D61E, R72K, e V163R) e o controle de hospedeiro/vetor foram então desenvolvidos e induzidos em frascos agi-tados de 250 mL. A concentração de proteína nos lisados clarificados foi quantificada usando o Bio-Rad Proteína Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, catálogo # 500-0006) com base no método Bradford e em seguida normalizada para a expressão de proteína total. A expressão foi analisada por SDS- PAGE, com cada série do gel de SDS-PAGE carregado com proteína total igual. 29SM-Pf e 29SM-Pf+SM teve uma percentagem maior de proteína palmitase expressa quando comparada a 29SM e a origem. 29SM-Pf+SM teve uma percentagem ligeiramente maior de expressão de palmitase do que 29SM-Pf. A melhora em expressão portanto foi ligeiramente mais pro-nunciada na presença de mutações silenciosas.

Diversas modalidades, como fornecidas aqui foram descritas. Não obstante será entendido que várias modificações podem ser feitas sem afastar-se do espírito e escopo como fornecido aqui. Consequentemente outras modalidades incluem-se no escopo das seguintes reivindicações.

Claims (13)

1. Sequência de ácido nucleico recombinante caracterizada por ser a SEQ ID NO: 1, a qual possui pelo menos uma alteração de nucleotídeo que resulta em uma modificação de resíduo de aminoácido de D61A ou D61E em comparação com a SEQ ID NO: 2.

2. Sequência de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por possuir ainda uma ou mais alterações de nucleotídeos que resulta em uma ou mais modificações de resíduo de ami- noácidos de R72E, R72K, E116A, E116Q, E116R, E116T, E116V, S133A, I151G, I151A, V163R ou D164R em comparação com a SEQ ID NO: 2.

3. Cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem caracte-rizado por compreender um ácido nucléico como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Veículo de clonagem, de acordo com a reivindicação 3, carac-terizado por compreender um vetor viral, um plasmídeo, um fago, um fago- mídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago ou um cromossoma artificial.

5. Célula bacteriana, fúngica ou de levedura transformada ca-racterizada por compreender a sequência de ácido nucleico recombinante, como definida na reivindicação 1 ou 2, ou o cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, como definido na reivindicação 3 ou 4, em que a célula bacteriana é uma espécie de Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas ou Staphylococcus, a célula fúngica é uma espécie de Aspergillus e a célula de levedura é uma espécie de Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Schwanniomyces.

6. Polipeptídeo recombinante caracterizado por compreender: (a) a SEQ ID NO: 2, ou seus fragmentos enzimaticamente ati-vos, e possuir pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido de D61A ou D61E, em que o polipeptídeo tem uma atividade de hidrolase com-preendendo atividade de palmitase, (b) o polipeptídeo de (a), tendo uma atividade de hidrolase com-preendendo atividade de palmitase, mas sem uma sequência de sinal.

7. Polipeptídeo recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por compreender ainda uma ou mais das alterações de resí-duos de aminoácidos de R72E, R72K, E116A, E116Q, E116R, E116T, E116V, S133A, I151G, I151A, V163R ou D164R.

8. Preparação de proteína caracterizada por compreender um polipeptídeo, como definido na reivindicação 6 ou 7, em que a preparação de proteína compreende um líquido, um sólido ou um gel.

9. Polipeptídeo imobilizado caracterizado por compreender uma sequência, como definida na reivindicação 6, em que o polipeptídeo é imobilizado em uma célula, um metal, uma resina, um polímero, uma cerâmica, um vidro, um microeletrodo, uma partícula grafítica, uma conta, um gel, uma placa, uma disposição ou um tubo capilar.

10. Alimento, alimentação, suplemento de alimento, suplemento alimentar, auxiliar dietético ou composição dietética caracterizado por com-preender o polipeptídeo recombinante como definido na reivindicação 6 ou 7.

11. Método de produção de um polipeptídeo recombinante ca-racterizado por compreender as etapas de: (a) fornecer uma sequência de ácido nucleico operavelmente ligada a um promotor, em que a sequência de ácido nucleico compreende uma sequência como definida na reivindicação 1; em que o método também compreende transformar uma célula hospedeira com a sequência de ácido nucleico da etapa (a) seguido pela expressão da sequência de ácido nucleico de etapa (a), desse modo produ-zindo o polipeptídeo recombinante em uma célula transformada, em que a célula transformada é uma célula como definida na reivindicação 5.

12. Palmitase caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 2, porém também compreen-dendo a) modificação de resíduo de aminoácido D61E, R72K e V163R; b) modificação de resíduo de aminoácido D61E, R72K e V163R e pelo menos uma modificação de resíduo de aminoácido A48C, R85Y, E95K, E116I, E116L, E116N, A144I, E149H, A150I, P162G, P162K, R172H, R172L ou A225S.

13. Palmitase, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a especificidade ou preferência de substrato da nova lipase compreende hidrólise preferencial ou aumentada de um ácido graxo em comparação com a SEQ ID NO: 2, em que o ácido graxo é ácido palmítico.