BRPI0918453A2 - sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno - Google Patents

sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno Download PDF

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BRPI0918453A2
BRPI0918453A2 BRPI0918453A BRPI0918453A BRPI0918453A2 BR PI0918453 A2 BRPI0918453 A2 BR PI0918453A2 BR PI0918453 A BRPI0918453 A BR PI0918453A BR PI0918453 A BRPI0918453 A BR PI0918453A BR PI0918453 A2 BRPI0918453 A2 BR PI0918453A2
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isoprene
cells
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polypeptide
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BRPI0918453A
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M Peres Caroline
K Chotani Gopal
M Whited Gregory
C Mcauliffe Joseph
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Danisco Us Inc
Goodyear Tire & Rubber
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Abstract

sistemas usando cultura de células para a produção de isopreno a presente invenção caracteriza métodos para produzir isopreno a partir de células cultivadas. a invenção também fornece composições que incluem essas células cultivadas. a invenção fornece composições de iso-preno, como composições com quantidade aumentada de isopreno ou pu-reza aumentada. adicionalmente, a invenção fornece métodos para produzir isopreno ao mesmo tempo em que mantém a viabilidade celular e/ou atividade metabólica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SISTEMAS USANDO CULTURA DE CÉLULAS PARA A PRODUÇÃO DE ISOPRENO.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Estes pedidos reivindicam o benefício pelo pedido de patente provisória U.S. 61/097.163, depositado em 15 de setembro de 2008, e pedido de patente provisória U.S. 61/187.832, depositado em 17 de junho de 2009, o conteúdo de ambos está incluído por meio deste como referência em sua totalidade.
Antecedentes da Invenção
O isopreno (2-metil-1,3-butadieno) é o material de partida principal para uma variedade de polímeros sintéticos, principalmente borrachas sintéticas. O isopreno é naturalmente produzido por uma variedade de espécies de micróbios, plantas e animais. Especificamente, duas vias foram identificadas para a biossíntese isopreno: a via do mevalonato (MVA) e a via do não mevalonato (DXP) (figuras 19A e 19B). No entanto, o rendimento do isopreno originado de organismos naturais é comercialmente pouco atraente. Cerca de 800.000 toneladas por ano de c/s-poli-isopreno são produzidas a partir da polimerização do isopreno; parte de tal poli-isopreno é utilizada na indústria de pneus e borracha. O isopreno também é copolimerizado para o uso como elastômero sintético em produtos como calçados, produtos mecânicos, produtos médicos, artigos de esporte e látex.
Atualmente, a indústria de pneus e borrachas é baseada no uso de borracha natural e sintética. A borracha natural é obtida através do suco leitoso de árvores de borracha encontradas nas florestas tropicais da África. A borracha sintética é principalmente baseada em polímeros de butadieno. Para tais polímeros, o butadieno é obtido como coproduto da produção de etileno e propileno.
Enquanto o isopreno pode ser obtido pelo fracionamento de petróleo, a purificação de tal material é cara e lenta. O craqueamento de petróleo do fluxo C5 de hidrocarbonetos produz somente cerca de 15% de isopreno. Dessa forma, métodos mais econômicos para a produção de isopreno
2/291 são necessários. Especificamente, métodos para a produção de isopreno em taxas, concentrações e pureza que sejam suficientes para se adequar às exigências de um processo comercial exigente são desejáveis. São também desejáveis sistemas para a produção de isopreno a partir de materiais base econômicos.
A invenção aqui fornecida se direciona a essas necessidades, assim como fornece benefícios adicionais.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção também fornece, inter alia, composições, sistemas, células e métodos para a produção de um composto com um ou ambos das seguintes características: (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e/ou (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em uma modalidade, o composto é isopreno. Em uma modalidade, o composto é etileno. A invenção também fornece métodos para a produção de isopreno que compreendem: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que as células produzem mais de cerca de 400 nmol/gwcm/h de isopreno e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda recuperar o composto, tal como isopreno. Em uma modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de isopreno sintase. Em outra modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de IDI, uma enzima da via do MVA ou uma enzima da via do DXP. Em outra modalidade, a enzima da via do MVA é mevalonatro quinase.
São adicionalmente fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que a produtividade total cumulativa do isopreno prdoduzido pelas células em cultura é maior que cerca de 0,2 mg/l_caido/hora e a taxa de evolução de dióxido de
3/291 carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda recuperar o isopreno. Em uma modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de isopreno sintase. Em outra modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de IDI, uma enzima da via do MVA ou uma enzima da via do DXP. Em outra modalidade, a enzima da via do MVA é mevalonatro quinase.
Também são aqui fornecidos métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que a concentração de pico do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 10ng/l_caido θ θ taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/L/hora. Em algumas modalidades de quaisquer desses métodos, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10’18mmol/L/hora a cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora a 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora a 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é de cerca de 50 mmol/L/hora ou cerca de 500 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda recuperar o isopreno. Em uma modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de isopreno sintase. Em outra modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de IDI, uma enzima da via do MVA ou uma enzima da via do DXP. Em outra modalidade, a enzima da via do MVA é mevalonatro quinase.
São adicionalmente fornecidas aqui células em cultura compre
4/291 endendo um ácido nucléico codificando um polipeptídio de isopreno sintase, em que as células produzem mais de cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/L/hora. Também são aqui fornecidas células em cultura compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídio de isopreno sintase, em que a produtividade total cumulativa do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 0,2 mg/Lca|d0/hora e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10’ 18mmol/L/hora. Além disso, são aqui fornecidas células em cultura compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídio de isopreno sintase, em que a concentração de pico do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 10ng/Lcaido θ a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10‘18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades de quaisquer dessas células em cultura, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10'18mmol/l_/hora a cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora a 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora a 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é de cerca de 50 mmol/L/hora ou cerca de 500 mmol/L/hora. A invenção também fornece composição e/ou sistemas compreendendo um ou mais de quaisquer da células aqui divulgadas.
Também são aqui fornecidos métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que a concentração da fase líquida de isopreno é menor que cerca de 2 g/L e as células produzem mais que cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a cerca de 1 g/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a cerca de 200 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qualquer de cerca de 1,9 g/L, 1,8 g/L, 1,7 g/L, 1,6 g/L, 1,5 g/L, 1,4 g/L, 1,3 g/L,
5/291
1,2 g/L, ou 1,1 g/L, Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qualquer de cerca de 900 mg/L, 800 mg/L, 700 mg/L, 600 mg/L, 500 mg/L, 400 mg/L, ou 300 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qualquer de cerca del 75 mg/L, 150 mg/L, 125 mg/L, 100 mg/L, 75 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L, 20 mg/L, 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, ou 2,5 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura está entre cerca de qualquer dentre 0,1 mg/L a 200 mg/L, 1 mg/L a 200 mg/L, 1 mg/L a 150 mg/L, 1 mg/L a 100 mg/L, 1 mg/L a 50 mg/L, 1 mg/L a 25 mg/L, 1 mg/L a 20 mg/L, ou 10 mg/L a 20 mg/L, 1 mg/L a 1 g/L, 0.1 mg/L a 2 g/L, 1 g/L a 2 g/L, 10 mg/L a 1 g/L, or 100 mg/L a 1 g/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida está abaixo do limite de solubilidade de isopreno. Em algumas modalidades, a fase líquida na cultura está saturada com isopreno, e o isopreno está adicionalmente presente em uma segunda fase líquida. Em algumas modalidades, a segunda fase líquida compreende pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, ou 98% de isopreno. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda recuperar o isopreno. Em uma modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nuclèicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de isopreno sintase. Em outra modalidade, as células compreendem ainda um ou mais ácidos nuclèicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno que codifica um polipeptídio de IDI, uma enzima da via do MVA ou uma enzima da via do DXP. Em outra modalidade, a enzima da via do MVA é mevalonatro quinase.
Também são aqui fornecidos métodos para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em: (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e/ou (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto, em que é adicionado gás (como a adição de gás a um sistema como um sistema de fermen6/291 tação) em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0,01 vvm e cerca de 2 wm; e b) a produção do composto. Em uma modalidade, condições anaeróbicas são usadas, Em outra modalidade, a taxa de pulverização gasosa é 0 vvm. Em outra modalidade, a taxa de pulverização gasosa é 0 wm 5 - 0,01 vvm. Em outras modalidades, o método compreende: a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto; b) a produção do composto; e c) a recuperação do composto na fase gasosa. Em outras modalidades, o método compreende: a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto; b) a produção do composto; e c) 10 a recuperação do composto a partir da fase gasosa. Em uma modalidade, o composto produzido é etileno. Em algumas modalidades, o coeficiente da lei de Henry do composto é inferior a cerca de qualquer dentre 200 M/atm, 150 M/atm, 100 M/atm, 75 M/atm, 50 M/atm, 25 M/atm, 10 M/atm, 5 M/atm, ou 1 M/atm. Em algumas modalidades, a solubilidade em água do composto é 15 inferior a cerca de qualquer dentre 75 g/L, 50 g/L, 25 g/L, 10 g/L, 5 g/L, ou g/L. Em algumas modalidades, o composto é selecionado de um grupo que consiste em isopreno, um aldeído (por exemplo, acetaldeído), uma cetona (por exemplo, acetona, metil etil cetona ou 2-butanona), um álcool (por exemplo, metanol, etanol, 1-butanol, ou alcoóis C5 como 3-metil-3-buten-1-ol 20 ou 3-metil-2-buten-1-ol), um éster de um álcool (por exemplo, acetato de etila, ésteres de 3-metil-2-buten-1-ol, ou acetil ésteres de alcoóis C5), um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno e hidrocarbonetos C1 a C5 (por exemplo, metano, etano, etileno ou propileno). Em algumas modalidades, os hidrocarbonetos C1 a C5 são saturados, insaturados ou ramificados.
Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a C5 é um hidrocarboneto alifático insaturado (por exemplo, etileno, propeno, butileno, ou isobutileno).
Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a C5 é uma oleofina. Em modalidades particulares, o composto é isopreno. Em outras modalidades particulares, o composto é etileno. Em algumas modalidades dos métodos 30 para produzir quaisquer dos compostos descritos acima, a taxa de pulverização gasosa está entre cerca de qualquer dentre 0 vvm a 0,1 wm, 0,1 vvm a vvm, 0,2 vvm a 1 vvm, ou 0,5 wm a 1 vvm. Em algumas modalidades dos
7/291 métodos para produzir quaisquer dos compostos descritos acima, a taxa de pulverização gasosa é 0,0 wm.
Sob um aspecto, a invenção caracteriza métodos para produzir etileno, Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de etileno, em que é adicionado gás (como a adição de gás a um sistema como um sistema de fermentação) em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0,01 wm e cerca de 2 wm; e b) a produção de etileno. Em outras modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de etileno; e b) a produção de etileno; e c) a recuperação do etileno na fase gasosa. Em algumas modalidades dos métodos para produzir etileno, a taxa de pulverização gasosa está entre cerca de qualquer dentre 0 wm a 0,1 wm, 0,1 wm a 1 wm, 0,2 wm a 1 wm, ou 0,5 wm a 1 wm. Em algumas modalidades dos métodos para produzir etileno, a taxa de pulverização gasosa é 0,0 wm.
Em quaisquer das modalidades, os métodos compreendem ainda a recuperação de isopreno e/ou etileno. Em algumas modalidades, etileno é recuperado por adsorção. Em uma modalidade particular, o etileno é adsorvido em argila modificada por prata. Em outras modalidades, o etileno é recuperado por separação criogênica ou absorção/arraste.
Sob um aspecto, a invenção apresenta células em cultura que produzem isopreno. Em algumas modalidades, a invenção fornece células em cultura que produzem mais de cerca de 400 nmols de isopreno/grama de células para o peso úmido das células/hora (nmol/gwcm/h) de isopreno. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucléico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, gicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, carbono de uma fonte, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou
8/291 microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Em algumas modalidades, a invenção fornece células em cultura que convertem mais de cerca de 0,002% do carbono em um meio de cultura de células em isopreno. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucléico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, gicerol, glicerina, dihidroxiacetona, carbono de uma fonte, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Em algumas modalidades, a invenção fornece células em cultura que compreendem um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucléico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional para um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, gicerol, glicerina, dihidroxiacetona, carbono de uma fonte, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Sob um aspecto, a invenção apresenta células em cultura que
9/291 produzem um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica polipeptídio sintase capaz de produzir o composto e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, o composto produzido é etileno e o polipeptídio sintase é enzima que forma etileno (efe). Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma ou mais fontes de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Sob um aspecto, a invenção apresenta métodos para produzir isopreno, como métodos para usar quaisquer das células descritas aqui para produzir isopreno. Em algumas modalidades, o método envolve cultivar células sob condições suficientes para produzir mais que cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno. Em algumas modalidades, o método também inclui recuperar o isopreno produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui purificar o isopreno produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui polimerizar o isopreno. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucleico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e(ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, limitado a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedu
10/291 ra, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada. Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzido (como a quantidade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora por OD6oo) durante a fase estacionária é maior que ou cerca de 2 ou mais vezes a quantidade de isopreno produzido durante a fase de crescimento pela mesma quantidade de tempo. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende mais ou cerca de 9,5 % (volume) de oxigênio e a concentração de isopreno em uma fase gasosa é menor que o limite inferior de inflamabilidade ou maior que o limite superior de inflamabilidade. Em modalidades específicas, (i) a concentração de isopreno em uma fase gasosa é menor que o limite inferior de inflamabilidade ou maior que o limite superior de inflamabilidade e (ii) as células produzem mais de cerca de 400 nmol/gwcm/h de isopreno.
Em algumas modalidades, o método inclui a cultura de células sob condições suficientes para converter mais de cerca de 0,002% do carbono (mol/mol) em uma célula em meio de cultura para isopreno. Em algumas modalidades, o método também inclui a recuperação do isopreno produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui a purificação do isopreno produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui a polimerização do isopreno. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucléico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio de isopreno sintase e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, gicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, ou qualquer combinação de dois ou mais dos precedentes. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
11/291
Em algumas modalidades, isopreno é apenas produzido na fase estacionária. Em algumas modalidades, isopreno é produzido tanto na fase de crescimento quanto na fase estacionária. Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzido (como a quantidade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora por OD6qo) durante a fase estacionária é maior que ou cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, ou mais vezes a quantidade de isopreno produzido durante a fase de crescimento pela mesma quantidade de tempo.
Sob um aspecto, a invenção apresenta métodos para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L, como métodos para usar quaisquer das células aqui descritas para produzir o composto. Em algumas modalidades, o composto produzido é etileno. Em algumas modalidades, o método também inclui recuperar o composto produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui purificar o composto produzido pelas células. Em algumas modalidades, o método inclui polimerizar o composto. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nuciéico heterólogo que (i) codifica um polipeptídio sintase capaz de produzir o composto e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em uma modalidade particular, o ácido nuciéico heterólogo codifica efe. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio de cultura que inclui uma ou mais fontes de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada. Em várias modalidades, a quantidade do composto produzido (como a quantidade total do composto produzido ou a quantidade do composto produzido por litro de caldo por hora por OD6oo) durante a fase estacionária é
12/291 maior que ou cerca de 2 ou mais vezes a quantidade do composto produzido durante a fase de crescimento pela mesma quantidade de tempo. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende mais ou cerca de 9,5 % (volume) de oxigênio e a concentração do composto em uma fase gasosa é menor que o limite inferior de inflamabilidade ou maior que o limite superior de inflamabilidade.
Em algumas modalidades, o composto é apenas produzido na fase estacionária. Em algumas modalidades, o composto é produzido tanto na fase de crescimento quanto na fase estacionária. Em várias modalidades, a quantidade do composto produzido (como a quantidade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora por ODeoo) durante a fase estacionária é maior que ou cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, ou mais vezes a quantidade do composto produzido durante a fase de crescimento pela mesma quantidade de tempo.
Sob um aspecto, a invenção apresenta composições e sistemas que compreendem isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno (p/p) da fração orgânica volátil da composição é isopreno.
Em algumas modalidades, a composição compreende mais ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno em peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 em uma composição. Em algumas modalidades, a composição compreende menos ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 diferentes de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-ene-1ino, frans-pent-3-ene-1-ino, c/s-pent-3-ene-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol)) em peso quando comparado com o peso total
13/291 de todos os hidrocarbcnetos C5 em uma composição. Em algumas modalidades, a composição possui menos ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% para 1,3ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-ene-1-ino, trans-pent-3-ene-1-ino, c/s-pent-3-ene-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol) em peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 em uma composição. Em modalidades específicas, a composição possui mais de cerca de 2 mg de isopreno e possui mais que ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno em peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 em uma composição.
Em algumas modalidades, a composição possui menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ug/Lde um composto que inibe a polimerização do isopreno para qualquer composto em uma composição que iniba a polimerização do isopreno. Em modalidades específicas, a composição também possui mais de cerca de 2 mg de isopreno.
Em algumas modalidades, a composição possui um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em etanol, acetona, alcoóis prenílicos C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a composição possui mais ou cerca de 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 ug/L de etanol, acetona, álcool prenílico C5 (como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1ol), ou quaisquer dois ou mais dos precedentes. Em modalidades específicas, a composição possui mais de cerca de 2 mg de isopreno e possui um ou mais compostos selecionados a partir de grupo que consiste em etanol, acetona, alcoóis prenílicos C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
Em algumas modalidades, a composição inclui isopreno e um ou mais segundos compostos selecionados do grupo que consiste em 2heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diace
14/291 tila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1-propanol, 3metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1-butanol, 2-pentanona, 3-metil-1-butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2-butenal, acetato de butila, acetato de 3metilbutila, acetato de 3-metil-3-buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno e 2,3-cicloheptenolpiridina. Em várias modalidades, a quantidade de urn desses segundos componentes relativa à quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (isto é, o peso do componente dividido pelo peso de isopreno vezes 100) é maior que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p).
Em algumas modalidades, a composição compreende (i) a fase gasosa que compreende isopreno e (ii) células em cultura que produzem mais de cerca de 400 nmol/gwcm/h de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende um sistema fechado e a fase gasosa compreende mais ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L de isopreno quando normalizada a 1 mL de 1 OD6oo cultivada por 1 hora. Em algumas modalidades, a composição compreende um sistema aberto e a fase gasosa compreende mais ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ug/L de isopreno quando difundido em uma taxa de 1 wm. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa compreende mais ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno por peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa compreende menos ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 diferentes de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3metil-1-butino, pent-4-ene-1-ino, trans-pent-3-ene-1-ino, c/s-pent-3-ene-1ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol)) por peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da
15/291 fase gasosa possui menos ou cerca de 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% para 1,3ciclopentadieno, frans-1,3-pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-ene-1-ino, frans-pent-3-ene-1-ino, c/'s-pent-3-ene-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol) por peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil. Em modalidades específicas, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui mais de cerca de 2 mg de isopreno e possui mais ou cerca de 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno por peso quando comparado com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na fração orgânica volátil.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização do isopreno para qualquer composição da fração orgânica volátil da fase gasosa que iniba a polimerização do isopreno. Em modalidades específicas, a fração orgânica volátil da fase gasosa também possui mais de cerca de 2 mg de isopreno.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui um ou mais compostos selecionados a partir de grupo que consiste em etanol, acetona, álcool prenílico C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono. Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui mais ou cerca de 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 ug/L de etanol, acetona, álcool de premia C5 (como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou quaisquer dois ou mais dos precedentes. Em modalidades específicas, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui mais de cerca de 2 mg de isopreno e possui um ou mais compostos selecionados a partir de grupo que consiste em etanol, acetona, álcool prenílico C5 e compostos isoprenoides com 10 ou mais átomos de carbono.
Em algumas modalidades, a fração orgânica volátil da fase gasosa possui a inclusão de isopreno e um ou mais segundos compostos sele
16/291 cionados do grupo que consiste em 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeído, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1 -propanol, 3-metil-1-butanal, 3-metil-2-butanona, 1butanol, 2-pentanona, 3-metil-1 -butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno e 2,3-ciclo-heptenolpiridina. Em várias modalidades, a quantidade de um desses segundos componentes relativo à quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (isto é, o peso do componente dividido pelo peso de isopreno vezes 100) é maior que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p) em uma fração orgânica volátil da fase gasosa.
Em algumas modalidades de quaisquer das composições da invenção, pelo menos parte do isopreno está em uma fase gasosa. Em algumas modalidades, pelo menos parte do isopreno está em uma fase liquida (como um condensado). Em algumas modalidades, pelo menos parte do isopreno está em uma fase sólida. Em algumas modalidades, pelo menos parte do isopreno está adsorvido a um suporte sólido, como um suporte que inclui silica e/ou carbono ativado. Em algumas modalidades, a composição inclui etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 75 a cerca de 90% em peso de etanol, como entre cerca de 75 a cerca de 80%, cerca de 80 a cerca de 85%, ou cerca de 85 a cerca de 90% por peso de etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 4 a cerca de 15% por peso de isopreno, como entre cerca de 4 a cerca de 8%, cerca de 8 a cerca de 12%, ou cerca de 12 a cerca de 15% por peso de isopreno.
Em algumas modalidades, a invenção também inclui sistemas que incluem quaisquer das células e/ou composições descritas neste. Em algumas modalidades, o sistema inclui um reator que contém câmara que compreende células em cultura que produzem mais de cerca de 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000,
17/291
5.000, ou mais nrnol/gWCm/h de isopreno. Em algumas modalidades, o sistema não é um sistema fechado. Em algumas modalidades, pelo menos parte do isopreno é removida do sistema. Em algumas modalidades, o sistema inclui uma fase gasosa compreendendo isopreno. Em várias modalidades, a fase gasosa compreende quaisquer das composições descritas neste.
Sob um aspecto, a invenção fornece um pneu que compreende poli-isopreno. Em algumas modalidades, o poli-isopreno é produzido por (i) a polimerização de isopreno em quaisquer das composições descritas neste ou (ii) a polimerização de isopreno recuperada de quaisquer das composições descritas neste. Em algumas modalidades, o poli-isopreno compreende c/s-1,4-poli-isopreno. Sob outro aspecto, a invenção fornece métodos de produção de pneu em que a melhoria compreende o uso de qualquer um ou mais das composições, células, sistemas e/ou métodos descritos neste para a produção de isopreno para a fabricação do pneu.
Em algumas modalidades de quaisquer das composições, sistemas e métodos da invenção, uma concentração não inflamável de isopreno em uma fase gasosa é produzida. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende menos de cerca de 9,5% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, a fase gasosa compreende mais ou cerca de 9,5% (volume) de oxigênio e a concentração de isopreno em uma fase gasosa é menor que o limite de menor inflamabilidade ou maior que o limite de maior inflamabilidade. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa diferente de isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 100% (volume) de oxigênio, como entre cerca de 10% a cerca de 100% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa diferente de isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa diferente de isopreno compreende entre cerca de 1% a cerca de 50% (volume) de CO2.
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células em cultura produzem isopreno em mais que ou cerca de 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, ou mais nrnol/gWCm/h de isopreno. Em algumas modalidades de
18/291 quaisquer dos aspectos da invenção, as células em cultura convertem mais que ou cerca de 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6%, ou mais de carbono na célula em meio de cultura para isopreno. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células em cultura produzem isopreno em mais que ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, ou mais ng de isopreno/gramas de células para o peso tímido das células/h (ng/gWCm/h). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células em cultura produzem uma concentração cumulativa (quantidade total) de isopreno em mais que ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaido, em que o volume de caldo inclui o volume das células e o meio das células). Outras taxas exemplares da produção de isopreno e da quantidade total de produção de isopreno são divulgadas neste.
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de isopentenil-difosfato delta-isomerase (IDI). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem uma inserção de cópia de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptídio IDI. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de 1-desóxi-xilulose-5fosfato sintase (DXS). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem uma inserção de cópia de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptídio DXS. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem um ou mais ácidos nucleicos codificando um polipeptídio IDI e um polipeptídio DXS. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, um ácido nucléico codifica o polipeptídio de isopreno sintase,
19/291 polipeptídio IDI e polipeptídio DXS. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, um vetor codifica o polipeptídio de isopreno sintase, polipeptídio IDI e polipeptídio DXS. Em algumas modalidades, o vetor compreende um marcador seletivo, como ácidos nucleicos de resistência antibiótica.
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o ácido nucléico de isopreno sintase heterólogo e/ou o ácido nucléico de efe heterólogo é ligado de forma operacional a um promotor T7, como um promotor T7 contido em um meio ou plasmídeo de alta cópia. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o ácido nucléico de isopreno sintase heterólogo ou o ácido nucléico de efe heterólogo é ligado de forma operacional a um promotor Trc, como um promotor Trc contido em um plasmídeo de média ou alta cópia. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o ácido nucléico de isopreno sintase heterólogo ou o ácido nucléico de efe heterólogo é ligado de forma operacional a um promotor Lac, como um promotor Lac contido em plasmídeo de baixa cópia. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o ácido nucléico de isopreno sintase heterólogo ou o ácido nucléico de efe heterólogo é ligado de forma operacional a um promotor endógeno, como um promotor endógeno de serina protease alcalina. Em algumas modalidades, o ácido nucléico de isopreno sintase heterólogo ou o ácido nucléico de efe heterólogo se integra a um cromossoma das células sem um marcador seletivo.
Em algumas modalidades, um ou mais entre ácidos nucleicos da via do MVA, IDI, via do DXP, efe, ou de isopreno sintase são colocados sob controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, um ou mais entre ácidos nucleicos da via do MVA, IDI, via do DXP, efe, ou de isopreno sintase podem ser colocados sob controle do fator sigma da fase estacionária, como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais entre ácidos nucleicos da via do MVA, IDI, via do DXP, efe, ou de isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor indutível na fase estacionária, como um promotor indutível por um regulador de resposta ativo em fase estacionária.
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Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, pelo menos uma parte das células mantém o ácido nucléico de isopreno sintase ou ácido nucléico de efe heterólogo por pelo menos ou cerca de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (como a cultura contínua sem diluição). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, os ácidos nucleicos que compreendem o ácido nucléico de isopreno sintase, efe, IDI, ou DXS também compreendem um marcador seletivo, como ácidos nucleicos de resistência antibiótica.
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídeo da via do MVA (como um polipeptídeo da via do MVA de Saccharomyces cerevisiae ou Enterococcus faecalis). Em uma modalidade, o polipeptídeo da via do mVA é mevalonato quinase. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células também compreendem uma inserção de cópia de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptídeo da via do MVA (como um polipeptídeo da via do MVA de Saccharomyces cerevisiae ou Enterococcus faecalis). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células compreendem ácido nucléico de isopreno sintase, DXS e de via do MVA. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células compreendem um ácido nucléico de isopreno sintase, um ácido nucléico de DXS, um ácido nucléico de IDI e um nucléico da via do MVA (adicionalmente ao ácido nucleico de IDI).
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o polipeptídio de isopreno sintase é um polipeptídio de uma planta como Pueraria (por exemplo, Pueraria montana ou Pueraria lobata) ou Populus (por exemplo, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra, Populus trichocarpa, ou o híbrido, Populus alba x Populus tremula). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, o efe é um polipeptídio de uma bactéria como Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas syringae).
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células são células bacterianas, como células bacterianas Gram
21/291 positivas (por exemplo, células de Bacillus como células de Bacillus subtilis ou células de Streptomyces como células de Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, ou Streptomyces griseus). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células são células bacterianas Gram-negativas (por exemplo, células de Escherichia como células de Escherichia coli, Rhodopseudomonas sp. como células de Rhodopseudomonas palustris, Pseudomonas sp. como células de Pseudomonas fluorescens ou células de Pseudomonas putida, ou células de Pantoea como células de Pantoea citrea). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, as células são de fungos, células como células de fungo filamentoso (por exemplo, células de Trichoderma como células de Trichoderma reesei ou células de Aspergillus como Aspergillus oryzae e Aspergillus niger1) ou células de levedura (por exemplo, células de Yarrowia como células de Yarrowia lipolitica ou células de Saccharomyces como Saccharomyces cerevisiae).
Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, a fonte de carbono de polipeptídio microbiano inclui um ou mais polipeptídios de levedura ou bactérias. Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, a fonte de carbono de polipeptídio vegetal inclui um ou mais polipeptídios de soja, milho, canola, jatropha, palmeira, amendoim, girassol, coco, mostarda, semente de colza, semente de algodão, semente de palmeira, azeitona, açafrão, gergelim ou linhaça.
Sob um aspecto, a invenção apresenta um produto produzido por quaisquer das composições ou métodos da invenção. Deve-se entender que uma, algumas ou toda as propriedades das várias modalidades aqui descritas podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção.
Os tópicos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tomados como referência ao relatório descritivo como um todo.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é a sequência nucleotídica de um gene de isopreno
22/291 sintase de kudzu de códon otimizado para expressão em E. coli (SEQ ID N°: 1). O códon inicial ATG está em itálico, o códon final está em negrito e o sítio Pstl está sublinhado.
A figura 2 é um mapa de pTrcKudzu.
As figuras 3A-C são a sequência nucleotídica de pTrcKudzu (SEQ ID N°: 2). O RBS está sublinhado, o códon inicial da isopreno sintase de kudzu está em maiusculas e negrito e o códon final está em itálico, maiúsculas, negrito. O arcabouço de vetor é de pTrcHis2B.
A figura 4 é um mapa de pETNHisKudzu.
As figuras 5A-C são a sequência nucleotídica de pETNHisKudzu (SEQ ID N°: 5).
A figura 6 é um mapa de pCL-lac-Kudzu.
As figuras 7A-C são a sequência nucleotídica de pCL-lac-Kudzu (SEQ ID N°: 7).
A figura 8A é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 sem vetor.
A figura 8B é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 com pCL-lac-Kudzu
A figura 8C é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 com pTrcKudzu.
A figura 8D é um gráfico apresentando a produção de isopreno em células de E. coli BL21 com pETN-HisKudzu.
A figura 9A é um gráfico apresentando ao longo do tempo a OD da fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermentação de 14 litros de batelada alimentada.
A figura 9B é um gráfico apresentando produção de isopreno ao longo do tempo da fermentação de E. coli BL21/pTrcKudzu em uma fermentação de 14 litros de batelada alimentada.
A figura 10A é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Pantoea citrea. Células de controle sem isopreno sintase de kudzu recombinante. Losangos cinzas representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam a Οϋθοο23/291
A figura 10B é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Pantoea citrea expressando pCL-lac Kudzu. Losangos cinzas representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam aOD60oA figura 10C é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Pantoea citrea expressando pTrcKudzu. Losangos cinzas representam a síntese de isopreno, quadrados pretos representam a ODeooA figura 11 é um gráfico apresentando a produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase recombinante. BG3594comK é uma cepa de B. subtilis sem plasmídeo (produção de isopreno nativa). CF443-BG3594comK é uma cepa de B. subtilis com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante). IS no eixo y indica isopreno.
As figuras 12A-C são a sequência nucleotídica de pBS Kudzu #2 (SEQ ID N°: 57).
A figura 13 é a sequência nucleotídica de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID N°: 8).
A figura 14 é um mapa de pTrex3g compreendendo um gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para expressão em Yarrowia.
As figuras 15A-C são a sequência nucleotídica do vetor pSPZ1(MAP29Spb) (SEQ ID N°: 11).
A figura 16 é a sequência nucleotídica do gene de isopreno de kudzu (Pueraria montana) sintético com códon otimizado para expressão em Yarrowia (SEQ ID N°: 12).
A figura 17 é a sequência nucleotídica do gene de isopreno sintase de álamo híbrido (Populus alba x Populus tremula) sintético (SEQ ID N°: 13). O códon inicial ATG está em negrito e o códon final está sublinhado.
A figura 18A apresenta uma construção de esboço esquemático dos vetores pYLA 1, pYL1 e pYL2 (SEQ ID N°: 79, 77, 76, 75, 74 e 73).
A figura 18B apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLA(POPI) (SEQ ID N°: 72 e 73).
A figura 18C apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYU\(KZ1) (SEQ ID N°: 70 e 71).
24/291
A figura 18D apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLI(KZ1)
A figura 18E apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLI(MAP29)
A figura 18F apresenta uma construção de esboço esquemático do vetor pYLA(MAP29)
A figura 19A apresenta as vias metábolicas MVA e DXP para isopreno (com base em F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). A seguinte descrição inclui nomes alternativos para cada polipeptídio nas vias e a referência que divulga um ensaio para a medição da atividade do polipeptídio indicado (cada uma dessas referências é incorporada neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a ensaios para a atividade de polipeptídios para polipeptídios nas via do MVA e DXP). Via do mevalonate: AACT; Acetil-CoA acetiltransferase, MvaE, EC 2.3.1.9. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; Hidroximetilglutaril-CoA sintase, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensaio: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; Mevalonate quinase, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensaio: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato quinase, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensaio: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxilase, MVD1, EC 4.1.1.33. Ensaio: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; Isopentenil-difosfato deltaisomerase, IDI1, EC 5.3.3.2. Ensaio: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Via DXP: DXS; 1-Desóxi-xilulose-5-fosfato sintase, dxs, EC 2.2.1.7. Ensaio: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desóxi-D-xilulose 5-fosfato redutoisomerase, dxr, EC 2.2.1.7. Ensaio: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintase, IspD, EC 2.7.7.60. Ensaio: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-Difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase, IspE, EC 2.7.1.148. Ensaio: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-Metil-Deritritol 2,4-ciclodifosfato sintase, IspF, EC 4.6.1.12. Ensaio: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato sintase, ispG, EC 1.17.4.3. Ensaio: J. Org. Chem., 70:9168 -9174, 2005; HDR;
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-Hidróxi-2-metil-2-(E)-butenil 4-difosfato redutase, IspH, EC 1.17.1.2. Ensaio: JACS, 126:12847-12855, 2004.
A figura 19B ilustra as vias do MVA clássica e modificada. 1, acetil-CoA acetiltransferase (AACT); 2, HMG-CoA sintase (HMGS); 3, HMGCoA redutase (HMGR); 4, mevalonato quinase (MVK); 5, fosfomevalonato quinase (PMK); 6, difosfomevalonato descarboxilase (MVD ou DPMDC); 7, isopentenil difosfato isomerase (IDI); 8, fosfomevalonato descarboxilase (PMDC); 9, isopentenil fosfato quinase (IPK). A via do MVA clássica segue da reação 1 até a reação 7 através de reações 5 e 6, enquanto uma via do MVA modificada segue até as reações 8 e 9. P e PP na fórmula estrutural são fosfato e pirofosfato, respectivamente. Essa figura foi retirada de Koga e Morii, Microbiology e Mol. Biology Reviews, 71:97-120, 2007, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos ácidos nucléicos e polipeptídios da via do MVA modificada. A via do MVA modificada está presente, por exemplo, em alguns organismos de Archaea, como Methanosarcina mazei.
A figura 20 apresenta gráficos que representam os resultados da análise GC-MS de produção de isopreno por cepas de Y. lipolitica recombinante sem (esquerda) ou com (direita) um gene de isopreno sintase de kudzu. As setas indicam o tempo de eluição do padrão autêntico do isopreno.
A figura 21 é um mapa de pTrcKudzu ylDI DXS Kan.
As figuras 22A-D são a sequência nucleotídica de pTrcKudzu ylDI DXS Kan (SEQ ID N°: 20).
A figura 23A é um gráfico apresentando a produção de isopreno a partir de glicose em BL21/pTrcKudzukan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é a OD6oo e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD6oo, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam a produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23B é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzu ylDI kan. Tempo 0 é o tempo de indução
26/291 com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é Οϋθοο θ o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD600, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23C é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzu DXS kan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD6oo θ o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD6oo, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23D é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzu ylDI DXS kan. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD60o θ o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam ODeoo, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23E é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é ODSoo θ o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD6oo, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23F é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu ylDI. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD6oo e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam ODeoo, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os qua27/291 drados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23G é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pCL PtrcKudzu DXS. Tempo 0 é o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a indução; o eixo y é OD6oo e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD60o, os círculos representam a produtividade total de isopreno (pg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (pg/L/OD).
A figura 23H é um gráfico apresentando a produção de isopreno de glicose em BL21/pTrcKudzulDIDXSkan. A seta indica o tempo de indução com IPTG (400 pmol). O eixo x é o tempo após a inoculação; o eixo y é OD600 e o eixo y2 é a produtividade total de isopreno (pg/L de headspace ou produtividade específica (pg/L de headspace/OD). Os losangos representam OD600, os triângulos representam a produtividade total de isopreno (μg/L) e os quadrados representam produtividade específica de isopreno (μg/L/OD).
A figura 24 é um mapa de pTrcKKDylklS kan.
As figuras 25A-D são a sequência nucleotídica de pTrcKKDylklS kan (SEQ ID N°: 33).
A figura 26 é um mapa de pCL PtrcUpperPathway.
As figuras 27A-27D são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID N°: 46).
A figura 28 apresenta um mapa do cassete contendo a via inferior do MVA e IDI de levedura para integração no cromossoma de B. subtilis no locus nprE. nprE a montante/a jusante indica 1 kb cada de sequência do locus nprE para integração. O promotor aprE (promotor de serina protease alcalina) indica o promotor (-35, -10, +1 sítio de início da transcrição, RBS) do gene aprE. MVK1 indica o gene de mevalonato quinase de levedura. RBS-PMK indica o gene de fosfomevalonato quinase de levedura com um sítio de início RBS de Bacillus a montante. RBS-MPD indica o gene de levedura difosfomevalonato descarboxilase com um sítio de início RBS de Bacillus a montante. RBS-IDI indica o gene IDI de levedura com um sítio de início
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RBS de Bacillus a montante. Terminador indica o terminador da transcrição de serina protease alcalina de B. amyliquefaciens. SpecR indica o marcador de resistência à espectomicina. nprE repetição a montante para amp. indica uma repetição direta da região a montante utilizada para amplificação.
As figuras 29A-D são uma sequência nucleotídica do cassete contendo a via inferior do MVA e IDI de levedura para integração no cromossoma de B. subtilis no locus nprE (SEQ ID N°: 47).
Afigura 30 é um mapa de p9796-poplar.
As figuras 31A e B são uma sequência nucleotídica de p9796poplar (SEQ ID N°: 48).
A figura 32 é um mapa de pTrcPoplar.
As figuras 33A-C são uma sequência nucleotídica de pTrcPoplar (SEQ ID N°: 49).
A figura 34 é um mapa de pTrcKudzu ylDI Kan.
As figuras 35A-C são uma sequência nucleotídica de pTrcKudzu ylDI Kan (SEQ ID N°: 50).
A figura 36 é um mapa de pTrcKudzuDXS Kan.
As figuras 37A-C são uma sequência nucleotídica de pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID N°: 51).
A figura 38 é um mapa de pCL PtrcKudzu.
As figuras 39A-C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu (SEQ ID N°: 52).
A figura 40 é um mapa de pCL PtrcKudzu A3.
As figuras 41A-C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID N°: 53).
A figura 42 é um mapa de pCL PtrcKudzu ylDI.
As figuras 43A-C são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu ylDI (SEQ ID N°: 54).
A figura 44 é um mapa de pCL PtrcKudzu DXS.
As figuras 45A-D são uma sequência nucleotídica de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID N°: 55).
As figuras 46A-E apresentam gráficos que representam a produ
29/291 ção de isopreno de matérias-primas de biomassa. O painel A apresenta a produção de isopreno a partir de palhas de milho, o painel B apresenta produção de isopreno a partir de bagaços, o painel C apresenta produção de isopreno a partir de polpa de celulose de madeira macia, o painel D apresenta produção de isopreno de glicose e o painel E apresenta produção de isopreno a partir de células sem matéria-prima adicional. Os quadrados cinza representam medidas de ODeoo das culturas nos tempos indicados após a inoculação e os triângulos pretos representam a produção de isopreno nos tempos indicados após a inoculação.
A figura 47A apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno por BL21(ADE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan) em uma cultura sem adição de glicose. Os quadrados representam Οϋθοο θ os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
A figura 47B apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de açúcar invertido de matéria-prima de glicose por BL21(ADE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam OD60o e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
A figura 47C apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de matéria-prima de açúcar invertido por BL21(ADE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam OD6oo e os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
A figura 47D apresenta um gráfico que representa a produção de isopreno a partir de 1% de matéria-prima de palhas de milho de AFEX por BL21(ADE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan). Os quadrados representam ODeoo θ os triângulos representam o isopreno produzido (pg/mL).
As figuras 48A-C apresentam gráficos que demonstram o efeito do extrato de levedura de produção de isopreno. O painel A apresenta a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro de fermentadores alimentados com quantidades variadas do extrato de levedura. O painel B apresenta a evolução ao longo do tempo da concentração de isopreno dentro de fermentadores alimentados com quantidades variadas do extrato de levedura. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno pro
30/291 duzida por litro de caldo de fermentação. O painel C apresenta o efeito do extrato de levedura na produção de isopreno em E. coli cultivada em cultura de batelada alimentada.
As figuras 49A-C apresentam gráficos que demonstram a produção de isopreno a partir de um biorreator de 500 L com células de E. coli contendo um plasmídeo pTrcKudzu + ylDI + DXS. O painel A apresenta a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura. O painel B apresenta a evolução ao longo do tempo da concentração de isopreno dentro do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. O painel C apresenta a evolução ao longo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 500 L alimentado com glicose e extrato de levedura.
A figura 50 é um mapa de pJMuppervia2.
As figuras 51A-C são a sequência nucleotídica de pJMuppervia2 (SEQ ID N°: 56).
A figura 52 é um mapa de pBS Kudzu #2.
A figura 53A é um gráfico apresentando o crescimento durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante em fermentação de batelada alimentada de 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinza representam Bacillus com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
A figura 53B é um gráfico apresentando a produção de isopreno durante o tempo de fermentação de Bacillus expressando isopreno sintase de kudzu recombinante em fermentação de batelada alimentada de 14 litros. Os losangos pretos representam uma cepa controle (BG3594comK) sem isopreno sintase recombinante (produção de isopreno nativa) e os triângulos cinza representam Bacillus com pBSKudzu (produção de isopreno recombinante).
A figura 54 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica
31/291 dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 55 é a evolução ao longo do tempo de concentração de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 56 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 57 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com gicerol.
A figura 58 é a evolução ao longo do tempo de concentração de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com gicerol. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
A figura 59 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com gicerol.
As figuras 60A-60C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 150 L alimentado com glicose.
As figuras 61A-61C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 62A-62C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de ácido mevalônico e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 63A-63C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 64A-64C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 65A-65C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do bior32/291 reator de 15 L alimentado com glicose.
As figuras 66A-66C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 67A-67C são as evoluções ao longo do tempo da densidade ótica, título de isopreno e produtividade específica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 68 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série A como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico. Por exemplo, a primeira entrada na legenda da figura (isopreno em ar em 40 C) corresponde a maior curva em um gráfico.
A figura 69 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série B como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 4% de água. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 70 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série C como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 5% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 71 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série D como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 10% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 72 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série E como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 15% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 73 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série F como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 20% de CO2. A legenda da figura
33/291 lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 74 é um gráfico das temperaturas calculadas das chamas adiabáticas para a Série G como uma função da concentração do combustível para vários níveis de oxigênio com 30% de CO2. A legenda da figura lista as curvas na ordem em que aparecem em um gráfico.
A figura 75A é uma tabela da conversão do Modelo CAFT com os resultados da porcentagem do peso à porcentagem do volume para a Série A.
A figura 75B é um gráfico da inflamabilidade com os resultados a partir do Modelo CAFT para a Série A com a figura 68 plotada como porcentagem de volume.
A figura 76A é uma tabela da conversão do Modelo CAFT com os resultados da porcentagem do peso à porcentagem do volume para a Série B.
A figura 76B é um gráfico da inflamabilidade com os resultados a partir do Modelo CAFT para a Série B com a figura 69 plotada como porcentagem de volume.
A figura 77 é uma figura dos vasos de testes de inflamabilidade.
A figura 78A é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 1: 0% de Vapor, 0 Kg/cm2 (0 psig) e 40°C.
A figura 78B é uma tabela que resume os pontos de dados da explosão e da não explosão para a Série de Testes 1.
A figura 78C é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 1 comparado com o Modelo CAFT.
A figura 79A é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 2: 4% de Vapor, 0 KG/cm2 (0 psig) e 40°C.
A figura 79B é uma tabela que resume os pontos de dados da explosão e da não explosão para a Série de Testes 2.
A figura 79C é um gráfico da curva de inflamabilidade para a Série de Testes 2 comparado com o Modelo CAFT.
As figuras 80A e 80B são uma tabela das condições experimentais detalhadas e dos resultados para a Série de Testes 1.
34/291
A figura 81 é uma tabela das condições experimentais detalhadas e dos resultados para a Série de Testes 2.
A figura 82 é um gráfico da temperatura calculada das chamas adiabáticas plotado como uma função da concentração do fluido para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 3 atmosferas de pressão.
A figura 83 é um gráfico da temperatura calculada das chamas adiabáticas plotado como uma função da concentração do fluido para várias razões de nitrogênio/oxigênio em 1 atmosfera de pressão.
A figura 84 é um gráfico da curva envelope da inflamabilidade construído com o uso de dados da figura 82 e seguindo a metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos de dados experimentais (os círculos) são de testes descritos neste que foram conduzidos em 1 pressão de sistema inicial de atmosfera.
A figura 85 é um gráfico da curva envelope da inflamabilidade construído com o uso de dados da figura 83 e seguindo a metodologia descrita no Exemplo 13. Os pontos dos dados experimentais (os círculos) são de testes descritos neste que foram conduzidos em 1 pressão de sistema inicial de atmosfera.
A figura 86A é um cromatograma GC/MS de gás de escape de fermentação.
A figura 86B é uma expansão da figura 86A para apresentar volatilidades menores presentes em gás de escape de fermentação.
A figura 87A é um cromatograma GC/MS de voláteis traços presentes em gás de escape seguido de retenção por criogenia em -78C.
A figura 87B é um cromatograma GC/MS de voláteis traços presentes em gás de escape seguido de retenção por criogenia em -196C.
A figura 87C é uma expansão da figura 87B.
A figura 87D é uma expansão da figura 87C.
As figuras 88A e 88B são cromatogramas GC/MS comparando hidrocarbonetos C5 de isopreno derivado de petróleo (figura 88A) e isopreno biologicamente produzido (figura 88B). O padrão contém três impurezas de hidrocarbonetos C5 eluindo em volta do pico principal de isopreno (figura
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88A). Em contraste, o isopreno biologicamente produzido contém quantidades de etanol e acetona (tempo de execução de 3,41 minutos) (figura 88A).
A figura 89 é um gráfico da análise de gás de escape de fermentação de uma cepa de E. coli BL21(DE3) pTrcIS expressando uma isopreno sintase de kudzu e alimentadas com glicose com 3 g/L de extrato de levedura.
A figura 90 apresenta as estruturas de várias impurezas que são estruturalmente similares ao isopreno e podem também agir como venenos de catalisador de polimerização.
A figura 91 é um mapa de pTrcHis2AUpperVia (também chamado de pTrcUpperMVA).
As figuras 92A-92C são a sequência nucleotídica de pTrcHis2AUpperVia (também chamado de pTrcUpperMVA) (SEQ ID N°: 86).
A figura 93 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 94 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 95 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 96 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
A figura 97 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 98 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com açúcar invertido.
A figura 99 é a evolução ao longo do tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 100 é a evolução ao longo do tempo do título de isopre
36/291 no dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
A figura 101 é a evolução ao longo do tempo de atividade específica de isopreno a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
Afigura 102 é um mapa de pCLPtrcUpperPathwayHGS2.
As figuras 103A-103C são a sequência nucleotídica da pCLPtrcUpperPathwayHGS2 (SEQ ID N°: 87).
A figura 104 é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 105 é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
A figura 106 é a evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
Afigura 107 é um mapa de plasmídeo MCM330.
As figuras 108A-108C são a sequência nucleotídica do plasmídeo MCM330 (SEQ ID N°: 90).
Afigura 109 é um mapa de pET24D-Kudzu.
As figuras 110A e 110B são a sequência nucleotídica de pET24D-Kudzu (SEQ ID N°: 101).
A figura 111A é a evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A figura 111B é a evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A concentração é definida como uma quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação. A figura 111C é a evolução ao longo do tempo da produtividade específica de isopreno na biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 112A é um mapa do operon da Via Inferior da Archaea
M. mazei.
As figuras 112B e 112C são a sequência do operon da Via infe
37/291 rior da Archaea M. mazei (SEQ ID N°: 102).
A figura 113A é um mapa de MCM382 - pTrcKudzuMVK(mazei).
As figuras 113B e 113C são a sequência nucleotídica de MCM382 - pTrcKudzuMVK(mazei) (SEQ ID N°: 103).
A figura 114A é um mapa de MCM376 - MVK de Lowerin pET200D da Archaea M. mazei.
As figuras 114B e 114C são a sequência nucleotídica de MCM376 - MVK de Lowerin pET200D da Archaea M. mazei (SEQ ID N°: 108).
As figuras 115A-115D demonstram que a superexpressão de MVK e isopreno quinase resulta em aumento da produção de isopreno. Isopreno e CO2 acumulados a partir de MCM401 e MCM343 durante o crescimento em glicose em biorreatores de 100mL com indução de IPTG a 100 e 200uM de produção de isopreno foram medidos por no decurso de 22 horas. A figura 115A é um gráfico do isopreno acumulado (%) de MCM343. A figura 115B é um gráfico do isopreno acumulado (%) de MCM401. A figura 115C é um gráfico do CO2 acumulado (%) de MCM 401.
A figura 116 é uma evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 117 é uma evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 118 é uma evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 119 é um gráfico da taxa de evolução de dióxido de carbono total (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 120 é um gráfico da viabilidade celular durante a produção de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. TVC/OD é a contagem viável total (unidades formadoras de colônia) em 1 mL de caldo por unidade de densidade ótica (OD550).
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A figura 121 é uma evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 122 é uma evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 123 é uma evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 124 é uma evolução ao longo do tempo de produtividade volumétrica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. A produtividade volumétrica é definida como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora.
A figura 125 é uma evolução ao longo do tempo de rendimento instantâneo dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O rendimento instantâneo é definido como a quantidade de isopreno (grama) produzido por quantidade de glicose (grama) alimentada no biorreator (p/p) durante o intervalo de tempo entre os pontos de dados.
A figura 126 é um gráfico da taxa de evolução de dióxido de carbono total (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 127 é viabilidade celular durante a produção de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. TVC/OD é a contagem viável total (unidades formadoras de colônia) em 1 ml_ de caldo por unidade de densidade ótica (OD55o).
A figura 128 é uma evolução ao longo do tempo de densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 129 é uma evolução ao longo do tempo do título de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. O título é definido como uma quantidade de isopreno produzida por litro de caldo de fermentação.
A figura 130 é uma evolução ao longo do tempo do total de isopreno produzido a partir do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
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A figura 131 é um gráfico da taxa de evolução de dióxido de carbono total (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose.
A figura 132 é um gráfico mostrando que uma diminuição transiente no fluxo de ar para o biorreator causou um pico na concentração de isopreno no gás de escape que não causou uma diminuição dramática na atividade metabólica (TCER). TCER, ou atividade metabólica, é a taxa de evolução de dióxido de carbono total.
A figura 133 é um gráfico da viabilidade celular durante a produção de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. TVC/OD é a contagem viável total (unidades formadoras de colônia) em 1 mL de caldo por unidade de densidade ótica (OD550).
A figura 134 é uma evolução ao longo do tempo da densidade ótica dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. Linhas verticais pontilhadas denotam o intervalo de tempo quando o isopreno foi introduzido no biorreator em uma taxa de 1 g/L/h.
A figura 135 é a taxa de evolução de dióxido de carbono total (TCER), ou perfil de atividade metabólica, dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. Linhas verticais pontilhadas denotam o intervalo de tempo quando o isopreno foi introduzido no biorreator em uma taxa de 1 g/L/h.
A figura 136 é a viabilidade celular durante a produção de isopreno dentro do biorreator de 15 L alimentado com glicose. TVC/OD é a contagem viável total (unidades formadoras de colônia) em 1 mL de caldo por unidade de densidade ótica (OD55o). Linhas verticais pontilhadas denotam o intervalo de tempo quando o isopreno foi introduzido no biorreator em uma taxa de 1 g/L/h.
As figuras 137A e B são a sequência do gene da isopreno sintase de pET24a de Populus alba realçado em negrito (SEQ ID N°: 109).
As figuras 137C e D são a sequência do gene da isopreno sintase de pET24a de Populus nigra realçado em negrito (SEQ ID N°: 110).
As figuras 137E e F são a sequência de pET24a de Populus
40/291 tremuloides (SEQ ID N°: 123).
A figura 137G é a sequência de aminoácidos do gene da isopreno sintase de Populus tremuloides (SEQ ID N°: 124).
As figuras 137H e I são a sequência de Populus trichocarpa pET24a: gene da isopreno sintase realçado em negrito (SEQ ID N°: 111).
As figuras 137J e K são a sequência de Populus tremula x Populus alba pET24a: gene da isopreno sintase realçado em negrito (SEQ ID N°:
112) .
A figura 137L é um mapa de MCM93 que contém a sequência codificante de IspS de kudzu em um arcabouço de pCR2.1.
As figuras 137M e N são a sequência de MCM93 (SEQ ID N°:
113) .
A figura 1370 é um mapa de pET24D-Kudzu.
As figuras 137P e Q são a sequência de pET24D-Kudzu (SEQ ID N°: 114).
A figura 138 são dados de expressão de isopreno sintase para várias espécies de álamo como medido no ensaio head space de célula inteira. O eixo Y é ug/L/OD de isopreno produzido por 0,2 mL de uma cultura induzida com IPTG.
A figura 139 é a atividade relativa de enzimas isopreno sintase de álamo como medido pelo ensaio de DMAPP. Enzimas de álamo têm atividade significativamente maior que a isopreno sintase de kudzu. O álamo [alba x tremula] teve apenas traços (<1%) de atividade e não é mostrado na plotagem.
Afigura 140 é um mapa de pDONR221:19430 - hybridHGS.
A figura 141 é a sequência nucleotídica de pDONR221:19430 hybrid HGS, a sequência da isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para levedura (SEQ ID N°: 115).
A figura 142A é um mapa de pDW14.
As figuras 142B e C são a sequência nucleotídica completa de pDW14 (SEQ ID N°: 119).
A figura 143 mostra cepas de INVSc-1 induzidas contendo
41/291 pDW14 ou pYES-DEST52. figura 143A. Um gel de bis tris de 4-12% (Novex, Invitrogen) de lisados gerados das cepas de INVSc-a induzidas com galactose e coradas com SimplyBlue SafeStain (Invitrogen). figura 143B. Análise por western blot das mesmas cepas usando o kit WesternBreeze (Invitrogen). As raias são como se segue: 1, INVSc-1 + pYES-DEST52; 2, INVSc-1 + pDW14 (isolado 1); e 3, INVSc-1 + pDW14 (isolado 2). O PM (em kDa) é indicado (usando o padrão de peso molecular SeeBlue Plus-2.
A figura 144 mostra cepas de INVSc-1 induzidas contendo pDW14 ou pYES-DEST52. figura 144A. OD6oo de cepas induzidas com galactose antes da lise. O eixo y é a ODeoo- figura 144B. Ensaio de DMAPP de headspace de isopreno sintase em cepas controle e contendo isopreno sintase. A atividade específica foi calculada como pg de HG/L/OD. As amostras são como se segue: Controle, INVSc-1 + pYES-DEST52; HGS-1, INVSc-1 + pDW14 (isolado 1); HGS-2, INVSc-1 + pDW14 (isolado 2).
A figura 145A é um mapa de isopreno sintase fluo-opt2v2 com códon otimizado.
A figura 145B é a sequência nucleotídica de isopreno sintase fluo-opt2v2 com códon otimizado (SEQ ID N°: 120).
Afigura 146Aé um mapa de pBBR1MCS5.
As figuras 146B e C são a sequência nucleotídica de pBBR1MCS5 (SEQ ID N°: 121).
A figura 147A é um mapa de pBBR5HGSOpt2_2.
As figuras 147B e C são a sequência nucleotídica de pBBR5HGSOpt2_2 (SEQ ID N°: 122).
A figura 148 é um gráfico de CER contra tempo de fermentação para a cepa MCM401, não induzida, induzida com IPTG (4 x 50 pmol) ou IPTG (2 x 100pmol).
A figura 149 mostra a concentração de glicose em soluções de cana-de-açúcar, pH ajustado ou não, como uma função do número de ciclos de autoclavagem (um ciclo = 30 min).
A figura 150 mostra curvas de crescimento (OD60o como uma função do tempo) de Pseudomonas putida F1 e Pseudomonas fluorescens
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ATCC13525 em glicose, cana-de-açúcar e açúcar de cana invertido.
A figura 151 mostra curvas de crescimento (OD6oo como uma função do tempo) de E. coli BL21(DE3), MG1655, ATCC11303 e B REL 606 em glicose, cana-de-açúcar e açúcar de cana invertido.
Afigura 152A mostra o mapa plasmidial de pCR-blunt_Pffe-efe.
As figuras 152B mostra a sequência de ácidos nucleicos de pCR-blunt_Pffe-efe (SEQ ID N°: 125).
A figura 153 mostra a produção de etileno por 5 mL de caldo de E. coli DH5a, pCRblunt-Pffh-efe na OD 0,23 incubado em um frasco headspace de 20 mL.
A figura 154 mostra a produção de etileno por 1 mL de caldo de E. coli DH5a, pCRblunt-Pffh-efe na OD 0,23 incubado em um frasco headspace de 20 mL.
A figura 155 mostra a produção de etileno por 5 mL de caldo de E. coli DH5a, pCRblunt-Pffh-efe na OD 0,45 incubado em um frasco headspace de 20 mL.
Descrição Detalhada da Invenção
A presente invenção fornece, inter alia, composições, sistemas, células e métodos para a produção de um composto com um ou ambos das seguintes características: (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e/ou (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em uma modalidade, o composto é isopreno. Em outra modalidade, o composto é etileno. A invenção caracteriza métodos para a produção de isopreno pelo cultivo de células sob condições adequadas para a produção de isopreno ao mesmo tempo em que é mantida a viabilidade celular e/ou atividade metabólica como indicado pela taxa de evolução de dióxido de carbono ou taxa de evolução de dióxido de carbono total. Taxa de evolução de dióxido de carbono (CER) e taxa de evolução de dióxido de carbono total (CER total) são termos bem-conhecidos por alguém versado na técnica da fermentação e comumente se referem ao dióxido de carbono desenvolvido pela cultura (por exemplo, mmol/L/h).
Adicionalmente, sob alguns aspectos, a invenção caracteriza
43/291 métodos para a produção de isopreno pelo cultivo de células sob condições adequadas para a produção de isopreno com isopreno concentrado na fase gasosa usando taxas de pulverização de gás reduzidas ou sem pulverização de gás. Sob alguns aspectos, a invenção também caracteriza métodos para a produção de um composto com um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e/ou baixa solubilidade em água (alta insolubilidade em água). Sob alguns aspectos, a invenção também caracteriza método para a produção de etileno.
Salvo definição em contrário, os significados de todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são aqueles comumente entendidos por alguém versado na técnica à qual esta invenção pertence. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994) e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) fornecem alguém versado na técnica com um dicionário geral de muitos dos termos utilizados nesta invenção. Deve-se entender que esta invenção não está limitada aos reagentes, protocolos e metodologia particular descritos, já que estes podem variar. Alguém versado na técnica também apreciará que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui também podem ser usados para praticar ou testar a invenção.
Para utilização aqui, salvo clara indicação em contrário, o uso dos termos um, uma e semelhantes se refere a um(a) ou mais.
Referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas àquele valor ou parâmetro por si. Por exemplo, descrição que se refere a cerca de X inclui a descrição de X. Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.
Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descrita incluem compreender, consistir e consistir essencialmente em aspectos e modalidades.
Viabilidade Celular em Título de Isopreno Alto
O isopreno é uma molécula hidrofóbica secretada por muitas plantas, animais e micróbios. Bactérias, como Bacillus, produzem isopreno
44/291 em níveis razoavelmente baixos. Embora haja alguma evidência de que plantas secretem isopreno para auxiliar a termoproteção, foi levantada a hipótese de que o isopreno pode agir antagonicamente para cianobactérias e fungos, ou como um agente antimicrobiano. Veja, por exemplo, Ladygina et al., Process Biochemistry 41:1001-1014 (2006), que foi incorporada como referência em sua totalidade, particularmente com relação à ação antagônica do isopreno. Já que os níveis de produção muito baixos que ocorrem na natureza são suficientes para serem antimicrobianos, era de grande interesse que os títulos e níveis de produtividade de isopreno necessários para a comercialização de isopreno matassem o micróbio hospedeiro.
Encontra-se métodos para produzir títulos e níveis de produtividade de isopreno para a comercialização de isopreno ao mesmo tempo que se mantinha a viabilidade celular e/ou atividade metabólica como indicado pela taxa de evolução de dióxido de carbono ou taxa de evolução de dióxido de carbono total.
São fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno, em que as células produzem mais de cerca de 400 nrnol/gWcm/h de isopreno e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10’18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades, o isopreno produzido está em qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de qualquer dentre 400 nrnol/gWCm/hora e 1 mol/gWCm/hora, 400 nmol/gwcm/hora e 1 rnmol/gWCm/hora, 400 nmol/gWCm/hora e 40 mmol/gwcm/hora, 400 nmol/gwcm/hora e 4 rnmol/gWcm/hora, 1 mmol/gwcm/hora e 1,5 mmol/gwcm/hora,
1,5 mmol/gWcm/hora e 3 mmol/gwcm/hora, 3 rnrnol/gwcm/hora e 5 mmol/gWcm/hora, 5 mrnol/gwcm/hora e 25 mmol/gwcm/hora, 25 rnmol/gwcm/hora e 100 mmol/gwcm/hora, 100 mrnol/gWcm/hora e 500 mrnol/gWcm/hora, ou 500 mmol/gwcm/hora e 1000 mrnol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é cerca de qualquer dentre 1 mrnol/gwcm/hora, 1,5 mrnol/gwcm/hora, 2 rnmol/gWcm/hora, 3 mmol/gWcm/hora, 4 rnmol/gwcm/hora, ou
45/291 mmol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono entre cerca de qualquer dentrel x 10'18 mmol/L/hora e cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou 500 mmol/L/hora.
Também são fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que as células produzem mais de cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno e a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de duas vezes. Em algumas modalidades, o isopreno produzido está em qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de qualquer dentre 400 nmol/gwcm/hora e 1 mol/gwcm/hora, 400 nrnol/gwcm/hora e 1 mrnol/gwcm/hora, 400 nmol/gWCm/hora e 40 mrnol/gwcm/hora, 400 nmol/gwcm/hora e 4 mrnol/gwcm/hora, 1 mrnol/gWcm/hora e 1,5 mmol/gWcm/hora,
1,5 mrnol/gwcm/hora e 3 mmol/gWCm/hora, 3 mmol/gWCm/hora e 5 mrnol/gwcm/hora, 5 mrnol/gwcm/hora e 25 rnmol/gWcm/hora, 25 mrnol/gWcm/hora e 100 mrnol/gwcm/hora, 100 mmol/gWcm/hora e 500 rnmol/gwcm/hora, ou 500 mrnol/gwcm/hora e 1000 mmol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é cerca de qualquer dentre 1 rnmol/gWcm/hora, 1,5 mrnol/gwcm/hora, 2 mmol/gWCm/hora, 3 mmol/gWCm/hora, 4 mmol/gWCm/hora, ou 5 mrnol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de qualquer dentre 1,75 vezes, 1,5 vezes, 1,25 vezes, 1 vez, 0,75 vezes, 0,5 vezes, ou 0,25 vezes. Em algumas modalidades, a viabiliade celular é reduzida a cerca de 2 vezes.
São adicionalmente fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas
46/291 para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno, em que a produtividade total cumulativa do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 0,2 mg/Lcaido/hora e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno está entre cerca de qualquer dentre 0,2 mg/Lcaido/hora e 5 g/LCaido/hora, 0,2 mg/Uaido/hora e 1 g/Lcaido/hora, 1 g/Lcaido/hora e 2,5 g/Lcaido/hora, 2,5 g/Lcaido/hora e 5 g/LcaidO/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x IO’18 mmol/L/hora e cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, or 500 mmol/L/hora.
São fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno, em que a produtividade total cumulativa do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 0,2 mg/Lcaido/hora e a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de duas vezes. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno está entre cerca de qualquer dentre 0,2 mg/Lcaido/hora e 5 g/Lcaido/hora, 0,2 mg/Lcaido/hora e 1 g/Lcaido/hora, 1 g/Lcaido/hora e 2,5 g/Lca|do/hora, 2,5 g/Lca|do/hora e 5 g/Lca|do/hora. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de qualquer dentre 1,75 vezes, 1,5 vezes, 1,25 vezes, 1 vez, 0,75 vezes, 0,5 vezes, ou 0,25 vezes.
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Também são fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno, em que a concentração de pico do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 10 ng/Lcaido θ a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno está entre cerca de qualquer dentre 10 ng/Lcaid0 θ 500 ng/Lca|d0, 500 ng/L^o e 1 pg/Lcaido, 1 pg/Lcaido e 5 pg/LCaido, 5 pg/Lcaido e 50 pg/Lcaido, 5 pg/Lcaido e 100 pg/Lcaido, 5 pg/Lcaido θ 250 pg/Lcaido, 250 pg/Lcaido e 500 pg/Lca|d0, 500 pg/LcaKio e 1 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido θ 50 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido e 100 mg/Uaido, 1 mg/Lcaido θ 200 mg/Lcaido, 10 ng/Lcaido e 200 mg/Lcaido, 5 pg/Lcaid0 e 100 mg/Lcaido, or 5 pg/Lcaido e 200 mg/Lcaido. Em algumas modalidades, a concentração de pico é qualquer dentre cerca de 10 ng/Lcaido, 100 ng/Lcaid0, 1 pg/Lcaido, 5 pg/Lca|d0, 1 mg/Lca|d0, 30 mg/ Lcaido, 100 mg/Lcaid0, ou 200 mg/Lcaido· Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentrel x 10'18 mmol/L/hora e cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou 500 mmol/L/hora.
Além disso, também são fornecidos aqui métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno, em que a concentração de pico do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 10 ng/Lcaido θ a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de duas vezes. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada
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Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno está entre cerca de qualquer dentrelO ng/Lca|d0 e 500 ng/Lcaldo, 500 ng/Lcaldo θ 1 PQ/Lcaldo, I Pg/Lcaldo ® 6 pg/Lcaido, 5 pg/Lcaido θ 50 pg/Lcaido. 5 Pg/Lcaldo θ 100 pg/Lcaido, 5 Pg/Lcaldo θ 250 pg/Lcaldo, 250 pg/Lcaldo e 500 pg/Lcaido, 500 pg/Lcaido θ 1 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido e 50 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido θ 100 mg/LCaido, 1 mg/Lcaido θ 200 mg/Lcaido, 10 ng/Lcaido θ 200 mg/LCaido, 5 pg/Lcaido θ 100 mg/Lcaido, ou 5 pg/Lcaido θ 200 mg/Lcaido. Em algumas modalidades, a concentração de pico é qualquer dentre cerca de 10 ng/Lceido, 100 ng/LcBido, 1 pg/Lcaido, 5 pg/Lcaido, 1 mg/Lcaido, 30 mg/ Lcaido, 100 mg/Lceido, ou 200 mg/Lcaido· Em algumas modalidades, a viabilidade celular é reduzida a menos que cerca de qualquer dentre 1,75 vezes, 1,5 vezes, 1,25 vezes, 1 vez, 0,75 vezes, 0,5 vezes, ou 0,25 vezes. Em algumas modalidades, a viabilidade celular é reduzida a cerca de duas vezes.
Também são fornecidas aqui células em cultura compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de isopreno sintase, em que as células produzem mais que 400 nmol/gWCm/hora de isopreno e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10' 18mmol/L/hora. Em algumas modalidades, o isopreno produzido está em qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de qualquer dentre 400 nrnol/gwcm/hora e 1 mol/gwcm/hora, 400 nmol/gWCm/hora e 1 mrnol/gwcm/hora, 400 nrnol/gwcm/hora e 40 mrnol/gwcm/hora, 400 nrnol/gwcm/hora e 4 mmol/gwcm/hora, 1 rnrnol/gwcm/hora e 1,5 mmol/gWCm/hora, 1,5 mmol/gWCm/hora e 3 mrnol/gwcm/hora, 3 mrnol/gWcm/hora e 5 mrnol/gWcm/hora, 5 mmol/gWCm/hora e 25 rnrnol/gwcm/hora, 25 mrnol/gWCm/hora e 100 mmol/gWCm/hora, 100 mrnol/gwcm/hora e 500 mmol/gwcm/hora, ou 500 mmol/gwcm/hora e 1000 rnrnol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é cerca de qualquer dentre 1 mmol/gwcm/hora, 1,5 mrnol/gWcm/hora, 2 rnrnol/gwcm/hora, 3 rnrnol/gwcm/hora, 4 mrnol/gWCm/hora, ou 5 mrnol/gWcm/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10’18 mmol/L/hora e cerca de 1
49/291 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou 500 mmol/L/hora.
Também são fornecidas aqui células em cultura compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de isopreno sintase, em que a produtividade total cumulativa do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 0,2 mg/Lcaido/hora e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa do isopreno está entre cerca de qualquer dentre 0,2 mg/Lcaido/hora e 5 g/L-caido/hora, 0,2 mg/Lcaido/hora e 1 g/Lcaido/hora, 1 g/Lcaido/hora e 2,5 g/LCaido/hora, 2,5 g/Lcaido/hora e 5 g/Lcaido/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10'18 mmol/L/hora e cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou 500 mmol/L/hora.
Além disso, também são fornecidos aqui células em cultura compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo de isopreno sintase, em que a concentração de pico do isopreno produzido pelas células em cultura é maior que cerca de 10 ng/Lcaido θ a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18mmol/l_/hora. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno é qualquer concen
50/291 tração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a concentração de pico do isopreno está entre cerca de qualquer dentreW ng/Lcaido e 500 ng/Lcaido, 500 ng/Lcaid0 θ 1 P9/l-caldo, 1 Pg/Lcaldo θ 5 pg/Lcaldo, 5 pg/Lcaldo θ 50 pg/Lca|do, 5 pg/Lcaldo θ 100 Pg/L-caldo, 5 pg/Lcaldo θ 250 pg/Lcaldo, 250 pg/Lcaldo θ 500 pg/Lcaldo, 500 pg/Lcaldo e 1 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaid0 e 50 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido θ 100 mg/Lcaido, 1 mg/Lcaido e 200 mg/Lcaido, 10 ng/Lcaido e 200 mg/Lcaido, 5 pg/Lcaido θ 100 mg/Lcaido, ou 5 pg/Lcaido e 200 mg/Lcaido. Em algumas modalidades, a concentração de pico é qualquer dentre cerca de 10 ng/Lcaido, 100 ng/Lcaido, 1 pg/Lcaido, 5 pg/Lcaido, 1 mg/Lcaido, 30 mg/ Lcaido, 100 mg/Lcaido, ou 200 mg/Lcaido- Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10’18 mmol/L/hora e cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora e 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora e 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora e 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora e 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é cerca de qualquer dentre 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou 500 mmol/L/hora.
Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos e células aqui descritos, a taxa de evolução de dióxido de carbono e/ou viabilidade celular de uma célula expressando um RNA e/ou proteína da via do MVA e/ou via do DXP de uma ou mais de uma cópia em duplicata e/ou heteróloga de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP é comparada a uma célula controle que não possui uma ou mais de uma cópia em duplicata e/ou heteróloga de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono e/ou viabilidade celular de uma célula expressando um RNA e/ou proteína da via do MVA e/ou via do DXP de uma ou mais de uma cópia em duplicata e/ou heteróloga de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP sob o controle de um promotor induzível, em que o promotor é induzido, é comparado a uma célula controle contendo uma ou mais de uma cópia em duplicata e/ou heteróloga de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP sob o controle de
51/291 um promotor induzível, em que o promotor não é induzido (não induzido). Em algumas modalidades, o promotor induzível é um promotor de betagalactosidase.
Isopreno
A invenção apresenta composições e métodos para a produção de isopreno em quantidades e/ou purezas aumentadas. Como utilizado neste, o termo isopreno ou 2-metil-1,3-butadieno (CAS# 78-79-5 ) se refere ao produto de hidrocarboneto C5 direto e volátil a partir da eliminação de pirofosfato de pirofosfato de 3,3-dimetilalila (DMAPP) e não envolve a ligação ou polimerização de uma ou mais moléculas de difosfato de isopentenila (IPP) para uma ou mais moléculas DMAPP.
A grande maioria do isopreno é derivada de fontes petroquímicas como uma fração impura de hidrocarboneto C5 que requer a purificação extensiva antes do material ser adequado para a polimerização. Várias impurezas são particularmente problemáticas dada a sua semelhança estrutural com o isopreno e o fato de que podem agir como venenos de catalisador de polimerização. Tais compostos incluem 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3metil-1-butino, pent-4-ene-1-ino, frans-pent-3-ene-1-ino, c/s-pent-3-ene-1ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol) (figura 90). Em outras modalidades, as impurezas podem ser 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol). Em algumas modalidades, a composição de isopreno da invenção é substancialmente livre de qualquer hidrocarboneto C5 contaminante e não saturado. Como descrito em maiores detalhes no Exemplo 10, nenhuma quantidade detectável de hidrocarbonetos C5 não saturados diferentes de isopreno (como 1,3-ciclopentadieno, frans-1,3pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3metil-1-butino, pent-4-ene-1-ino, frans-pent-3-ene-1-ino, c/s-pent-3-ene-1ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol)) foi encontra
52/291 da em composições de isopreno produzidas com o uso de métodos descritos neste. Algumas composições de isopreno produzidas com o uso de métodos descritos neste contêm etanol, acetona e álcool prenílico C5 como determinado pela Análise GC/MS. Todos esses componentes são mais facilmente removíveis a partir do vapor de isopreno que a fração isomérica dos hidrocarbonetos C5 que estão presentes em composições de isopreno derivadas de fontes petroquímicas. Assim, em algumas modalidades, as composições de isopreno da invenção necessitam de um tratamento mínimo de forma a estarem em nível de polimerização.
Sob um aspecto, composições e métodos da invenção aumentam a taxa de produção de isopreno e aumentam a quantidade total de isopreno que é produzida. Por exemplo, sistemas de cultura de células que geram 4,8 x 104 nmol/gwcm/h de isopreno foram produzidas (Tabela 1). A eficiência de tais sistemas é demonstrada pela conversão de cerca de 2,2% do carbono que as células consomem de um meio de cultura celular no isopreno. Como mostrado nos Exemplos e na Tabela 2, aproximadamente 3 g de isopreno por litro de caldo foram gerados. Caso desejado, quantidades ainda maiores de isopreno podem ser obtidas com o uso de outras condições, como as descritas neste. Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável é utilizada para a produção de isopreno. Em algumas modalidades, a produção de isopreno é separada a partir do crescimento das células. Em algumas modalidades, as concentrações de isopreno e quaisquer oxidantes são dentro dos limites não inflamáveis para reduzir ou eliminar o risco de um incêndio ocorrer durante a produção ou recuperação de isopreno. As composições e métodos da presente invenção são desejáveis porque permitem altos rendimentos de isopreno por célula, altos rendimentos de carbono, alta pureza de isopreno, alta produtividade, baixo uso de energia, pequeno custo de produção e investimentos e reações adversas mínimas. Esse processo eficiente, em larga escala e biossintético para a produção de isopreno fornece uma fonte de isopreno para borracha com base em isopreno sintético e fornece alternativas desejáveis, de baixo custo, ao uso de borracha natural.
Como discutido em maiores detalhes abaixo, a quantidade de
53/291 isopreno produzido por células pode aumentar muito através da introdução de um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, um polipeptideo de isopreno sintase vegetal) nas células. Os polipeptídios de isopreno sintase convertem difosfato de dimetilalila (DMAPP) em isopreno. Como mostrado nos Exemplos, um polipeptídio de isopreno sintase de Pueraria montana (kudzu) heterólogo foi expresso em uma variedade de células hospedeiras, como Escherichia coli, Pantoea citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia lipolitica e Thchoderma reesei. Todas estas células produziram mais isopreno que as células correspondentes sem polipeptídio heterólogo de isopreno sintase. Como ilustrado nas Tabelas 1 e 2, grandes quantidades de isopreno são produzidas com o uso de métodos descritos neste. Por exemplo, Células de B. subtilis com ácido nucléico heterólogo de isopreno sintase produziram aproximadamente 10 vezes mais isopreno em fermentador de 14 litros que as células de B. subtilis de controle correspondentes sem ácido nucléico heterólogo (Tabela 2). A produção de 300 mg de isopreno por litro de caldo (mg/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio das células quanto o volume das células) por E. coli e 30 mg/L por B. subtilis em fermentadores indica que quantidades significantes de isopreno podem ser geradas (Tabela 2). Caso desejado, o isopreno pode ser produzido em escalas ainda maiores ou outras condições descritas neste podem ser utilizadas para aumentar mais a quantidade de isopreno. Os vetores listados nas Tabelas 1 e 2 e as condições experimentais são descritos em maiores detalhes abaixo e na seção de exemplos.
Tabela 1: Rendimentos exemplares de isopreno em um recipiente agitado com o uso de culturas de células e métodos da invenção.
O ensaio para a medição da produção de isopreno é descrito no Exemplo I, parte II. Para esse ensaio, uma amostra foi removida em um ou mais momentos do recipiente agitado e cultivada por 30 minutos. A quantidade de isopreno produzido em tal amostra foi então medida. A concentração headspace e taxa específica de produção de isopreno são listadas na Tabela 1 e descritas em maiores detalhes neste.
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Cepa Produção de isopreno em frasco headspace*
Concentração de headspace (PS/Lgas) Taxa específica Pg/Lcaido/h/OD (nmol/gwcm/h)
E. coli BL21/ pTrcKudzu IS 1,40 53,2(781,2)
E. coli BL21Z pCL DXS yidi Kudzu IS 7,61 289,1 (4,25 X 103)
E. coli BL21/MCM127 com IS de kudzu e toda a via do MVA 23,0 874,1 (12,8 x 103)
E. coli BL21/ pET N-HisKudzu IS 1,49 56,6(831,1)
Pantoea citrea /pTrcKudzu IS 0,66 25,1 (368,6)
E. coli w/ Poplar IS [Miller (2001)] - 5,6 (82,2)
Bacillis licheniformis Fall US 5849970 - 4,2 (61,4)
Yarrowia lipolitica com isopreno sintase de kudzu -0,05 pg/L -2 (-30)
Trichoderma reesei com isopreno sintase de kudzu -0,05 pg/L -2 (-30)
E. coli BL21/ pTrcKKDylkIS com IS de kudzu e via inferior do MVA 85,9 3,2 x 103 (4,8 x 104)
*Normalizado a 1 mL de 1 ODeoo, cultivado por uma hora em frasco headspace selado com uma razão entre o líquido e o volume headspace de 1:19.
Tabela 2: Rendimentos exemplares de isopreno em um fermentador com o uso de culturas de células e métodos da invenção.
O ensaio para a medição da produção de isopreno é descrito no
Exemplo I, parte II. Para esse ensaio, uma amostra do gás de escape do fermentador foi tirada e analisada para uma quantidade de isopreno. O pico da concentração de headspace (que é a maior concentração de headspace durante a fermentação), título (que é a quantidade total e cumulativa de iso10 preno produzido por litro de caldo) e taxa específica do pico de produção de isopreno (que é a taxa específica mais alta durante a fermentação) são listados na Tabela 2 e descritos em maiores detalhes neste.
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Cepa Produção de isopreno em fermentadores
Pico da concentração de headspace** (Pg/Lgas) Concentração (mg/Lcaido) Taxa Específica e Pico Mg/l-caldo/h/OD (nrnol/gwcm/h)
E. co//BL21/pTrcKudzu com Kudzu IS 52 41,2 37 (543,3)
E. coli FM5/pTrcKudzu IS 3 3,5 21,4 (308,1)
E. coli BL21/ cepa tripla (DXS, yidi, IS) 285 300 240 (3,52 x 103)
E. coli FM5/ cepa tripla (DXS, yidi, IS) 50,8 29 180,8 (2,65 x 103)
E. CO//7MCM127 com IS de kudzu e toda a via do MVA 3815 3044 992,5 (1,46x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc UpperVia gi1.2 via inferior ntegrada pTrcKudzu i 2418 1640 1248 (1,83x 104)
E. CO//BL21/MCM401 com 4 x 50 μΜ de IPTG 13991 23805 3733 (5,49 x 104)
E. CO//BL21/MCM401 com 2 x 1000 μΜ de IPTG 22375 19541 5839,5 (8,59 x 104)
E. coli BL21/pCLPtrc UpperViaHGS2 pTrcKKDylklS 3500 3300 1088(1,60 x 104)
Bacillus subtilis selvagem 1,5 2,5 0,8 (11,7)
Bacillus pBS Kudzu IS 16,6 ~30 (mais de 100 h) 5 (73,4)
Bacillus Marburg 6051 [Wagner e Fali (1999)] 2,04 0,61 24,5 (359,8)
Bacillus Marburg 6051 Fall US 5849970 0,7 0,15 6,8(100)
** Normalizado a uma taxa de fluxo de gás de escape de 1 vvm (1 volume gás de escape por 1 Ι_Μ|ά0 por minuto).
Adicionalmente, a produção de isopreno por células que contêm ácidos nuclèicos heterólogos de isopreno sintase pode aumentar pelo au5 mento da quantidade de um polipeptídio 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato sintase (DXS) e/ou um polipeptídio de isopentenil difosfato isomerase (IDI) expresso pelas células. Por exemplo, um ácido nucléico DXS e/ou um ácido nucléico IDI podem ser induzidos em células. O ácido nucléico DXS pode ser
56/291 um ácido nucléico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucléico endógeno. De forma similar, o ácido nucléico IDI pode ser um ácido nucléico heterólogo ou uma cópia duplicada de um ácido nucléico endógeno. Em algumas modalidades, a quantidade de polipeptídio DXS e/ou IDI é aumentada pela substituição dos promotores DXS e/ou IDI endógenos ou regiões reguladoras por outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em maior transcrição dos ácidos nucleicos DXS e/ou IDI. Em algumas modalidades, as células contêm tanto um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, ácidos nucleicos vegetais de isopreno sintase) quanto uma cópia duplicada de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptídio de isopreno sintase.
Os polipeptídios codificados DXS e IDI são parte da via DXP para a biossíntese de isopreno (figura 19A). Os polipeptídios DXS convertem o piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato. Embora não exista a intenção de se ligar a uma teoria específica, acredita-se que o aumento da quantidade de polipeptídio DXS aumenta o fluxo de carbono através da via DXP, levando a uma maior produção de isopreno. Polipeptídios IDI catalisam a interconversão de difosfato de isopentenila (IPP) e difosfato de dimetilalila (DMAPP). Embora não exista a intenção de se ligar a uma teoria específica, acredita-se que o aumento da quantidade de polipeptídio IDI em células aumenta a quantidade (e a taxa de conversão) de IPP que é convertido em DMAPP, que, por sua vez é convertido em isopreno.
Por exemplo, a fermentação de células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisiae e DXS de E. coli foi utilizada para a produção de isopreno. Os níveis de isopreno variaram entre 50 a 300 pg/L por um período de 15 horas (Exemplo 7, parte VII).
Em algumas modalidades, a presença de ácidos nucleicos de isopreno sintase, IDI e DXS heterólogos ou extraendógenos, faz células crescerem de forma mais reprodutiva ou manterem-se viáveis por mais tempo quando comparadas com a célula correspondente com apenas um ou dois de tais ácidos nucleicos heterólogos ou extraendógenos. Por exemplo, células contendo ácidos nucleicos heterólogos de isopreno sintase IDI e
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DXS, cresceram melhor que as células com somente ácidos nucleicos heterólogos de isopreno sintase e DXS ou com apenas ácidos nucleicos heterólogos de isopreno sintase. Além disso, ácidos nucleicos heterólogos de isopreno sintase, IDI e DXS foram ligados de forma operativa com sucesso a um promotor forte em plasmídeo de alta cópia que era mantido por células de E. coli, sugerindo que grandes quantidades de tais polipeptídios podem ser expressas nas células sem causar quantidade excessiva de toxicidade às células. Embora não exista a intenção de se ligar a nenhuma teoria específica, acredita-se que a presença de ácidos nucleicos IDI e isopreno sintase heteróloga ou extraendógena pode reduzir uma quantidade de um ou mais intermediários potencialmente tóxicos que iriam de outra forma acumular somente se um ácido nucléico DXS heterólogo ou extraendógeno estivesse presente nas células.
Em algumas modalidades, a produção de isopreno por células que contêm ácidos nucleicos heterólogos de isopreno sintase é aumentada pelo aumento da quantidade de polipeptídio MVA expresso pelas células (figuras 19A e 19B). Polipeptídios exemplares de vias do MVA incluem quaisquer dos seguintes polipeptídios: polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios defosfomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídios de IDI e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) contendo uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via do MVA. Por exemplo, um ou mais ácidos nucleicos da via do MVA podem ser introduzidos nas células. Em algumas modalidades, as células contêm a via superior do MVA, que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase e HMGCoA redutase. Em algumas modalidades, as células contêm a via inferior do MVA, que inclui ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD e IDI. Em algumas modalidades, as células contêm uma via do MVA completa que inclui ácidos
58/291 nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, MVK, PMK, MVD e I Dl. Em algumas modalidades, as células contêm uma via do MVA completa que inclui ácidos nucleicos de AA-CoA tiolase, HMG-CoA sintase, HMG-CoA redutase, MVK, PMDC, IPK e IDI. Os ácidos nucleicos da via do MVA podem ser ácidos nucleicos heterólogos ou cópias duplicadas de ácidos nucleicos endógenos. Em algumas modalidades, a quantidade de um ou mais polipeptídios da via do MVA é aumentada pela substituição do promotor endógeno ou regiões reguladoras pelos ácidos nucleicos da via do MVA com outros promotores e/ou regiões reguladoras que resultam em maior transcrição dos ácidos nucleicos da via do MVA. Em algumas modalidades, as células contêm tanto um ácido nucléico heterólogo codificando um polipeptídio de isopreno sintase (por exemplo, um ácido nucléico de isopreno sintase vegetal) e uma cópia duplicada de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptídio de isopreno sintase.
Por exemplo, células de E. coli contendo um ácido nucléico codificando um polipeptídio de isopreno sintase de kudzu e ácidos nucleicos codificando polipeptídios MVK, PMK, MVD e IDI de Saccharomyces cerevisia geraram isopreno em uma taxa de 6,67 x 10-4 mol/Lca|do/OD6oo/h (vide Exemplo 8). Adicionalmente, uma fermentação de 14 litros de células E. coli com ácidos nucleicos codificando polipeptídios de AA-CoA tiolase, HMGCoA sintase e HMG-CoA redutase de Enterococcus faecalis produz 22 gramas de ácido mevalônico (um intermediário da via do MVA). Um recipiente agitado de tais células produz 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro. Esses resultados indicam que ácidos nucleicos heterólogos da via do MVA são ativos em células de E. coli que contêm ácidos nucleicos tanto para a via superior do MVA quanto para a via inferior do MVA assim como um isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 127) produz significativamente mais isopreno (874 ug/L) quando comparado com células de E. coli com ácidos nucleicos somente para a via inferior do MVA e a isopreno sintase de kudzu (cepa MCM 131) (vide Tabela 3 e Exemplo 8, parte VIII).
Em algumas modalidades, pelo menos uma parte das células mantém ácido nucléico heterólogo de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do
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MVA por pelo menos cerca de 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (como uma cultura contínua sem diluição). Em algumas modalidades de quaisquer dos aspectos da invenção, os ácidos nucleicos que compreendem ácidos nucleicos heterólogos ou cópia duplicada de uma isopreno sintase endógena, DXS, IDI, e/ou via do MVA também compreendem um marcador seletivo, como um ácido nucléico de resistência ao antibiótico canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, ou de cloranfenicol.
Como indicado no Exemplo 7, parte VI, a quantidade de isopreno produzida pode ser aumentada através da adição de extrato de levedura à célula em meio de cultura. Nesse exemplo, a quantidade de isopreno produzido foi linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura no meio celular para as concentrações testadas (figura 48C). Adicionalmente, aproximadamente 0,11 grama de isopreno por litro de caldo foi produzido a partir de meio celular com extrato de levedura e glicose (Exemplo 7, parte VIII). Ambos os experimentos utilizaram células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli para a produção de isopreno. O aumento da quantidade de extrato de levedura na presença de glicose resultou em mais isopreno sendo produzido do que o aumento da quantidade de glicose na presença do extrato de levedura. Além disso, o aumento da quantidade de extrato de levedura permitiu que as células produzissem um alto nível de isopreno por uma maior quantidade de tempo e melhorou a saúde das células.
A produção de isopreno foi também demonstrada com o uso de três tipos de biomassa hidrolisada (bagaços, palhas de milho e polpa de madeira macia) como fonte de carbono (figuras 46A-C). As células de E. coli com ácidos nucleicos de isopreno sintase de kudzu, IDI de S. cerevisia e DXS de E. coli produziram tanto isopreno a partir dessas fontes de carbono de biomassa hidrolisada a partir da quantidade equivalente de glicose (por exemplo, 1% de glicose, p/v). Caso desejado, qualquer outra fonte de carbono de biomassa pode ser usada nas composições e métodos da invenção. As fontes de carbono de biomassa são desejáveis por serem mais econômi
60/291 cas que muitos meios de célula convencionais, facilitando, portanto, a produção econômica de isopreno.
Adicionalmente, o açúcar invertido apresentou funcionar como uma fonte de carbono para a geração de isopreno (figuras 47C e 96-98). Por exemplo, 2,4 g/L de isopreno foram produzidos a partir de células expressando vias de polipeptídio MVA e isopreno sintase de kudzu (Exemplo 8, parte XV). O gicerol foi utilizado também como uma fonte de carbono para a geração de 2,2 mg/L de isopreno a partir de células expressando isopreno sintase de kudzu (Exemplo 8, parte XIV).
A expressão de um ácido nucléico DXS, um ácido nucléico IDI, e/ou um ou mais entre ácidos nucléicos de via do MVA (como ácidos nucleicos codificando toda a via do MVA) além de ácidos nucléicos de isopreno sintase pode aumentar a produção de isopreno a partir de gicerol.
Em algumas modalidades, um óleo é incluído no meio celular. Por exemplo, células de B. subtilis contendo ácidos nucléicos de isopreno sintase de kudzu produzem isopreno quando cultivadas em meio celular contendo um óleo e uma fonte de glicose (Exemplo 4, parte III). Em algumas modalidades, mais de um óleo (como 2, 3, 4, 5, ou mais óleos) são incluídos no meio celular. Embora não exista a intenção de se ligar a nenhuma teoria específica, acredita-se que (i) o óleo pode aumentar a quantidade de carbono nas células que estão disponíveis para a conversão para isopreno, (ii) o óleo pode aumentar a quantidade de acetil-CoA nas células, aumentando, portanto o fluxo de carbono através da via do MVA, e/ou (ii) o óleo pode fornecer nutrientes extras para as células, o que é desejável, já que boa parte do carbono nas células é convertida para isopreno ao invés de outros produtos. Em algumas modalidades, as células que são cultivadas em meio celular contendo óleo naturalmente utilizam a via do MVA para a produção de isopreno ou são geneticamente modificadas para conter ácidos nucléicos para a via do MVA inteira. Em algumas modalidades, o óleo é parcialmente ou completamente hidrolisado antes de ser adicionado ao meio de cultura da célula para facilitar o uso do óleo pelas células hospedeiras.
Uma das maiores dificuldades da produção comercial de peque
61/291 nas moléculas como isopreno em células (por exemplo, bactérias) é o desacoplamento entre a produção da molécula e o crescimento das células. Em algumas modalidades para a produção comercialmente viável de isopreno, uma quantidade significativa de carbono a partir da matéria-prima é convertida em isopreno, ao invés de para o crescimento e a manutenção das células (eficiência do carbono). Em várias modalidades, as células convertem mais que ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, ou 8,0% do carbono no meio de cultura da célula em isopreno. Em modalidades específicas, uma parte significativa do carbono a partir da matéria-prima que é convertida em produtos a jusante é convertida em isopreno. Como descrito em maiores detalhes no Exemplo 11, as células de E. coli expressando ácidos nucleicos da via do MVA e de isopreno sintase de kudzu exibiram desacoplamento entra a produção de isopreno ou do ácido mevalônico intermediário e o crescimento, resultando na alta eficiência do carbono. Em particular, o ácido mevalônico foi formado a partir de células expressando a via superior do MVA de Enterococcus faecalis. O isopreno foi formado a partir de células expressando a via superior do MVA de Enterococcus faecalis, a via inferior do MVA Saccharomyces cerevisiae e a isopreno sintase de Pueraria montana (Kudzu). Esse desacoplamento entre a produção de isopreno ou ácido mevalônico e o crescimento foi demonstrado em quatro cepas diferentes de E. coli: BL21(LDE3), BL21(LDE3) Tuner, FM5 e MG1655. As primeiras duas cepas de E. coli são cepas B e as duas últimas são cepas K12. O desacoplamento entre a produção e o crescimento foi também demonstrado em uma variante de MG 1655 com os genes ack e pta deletados. Essa variante também demonstrou menor produção de acetato. Produção de Etileno
A invenção caracteriza métodos para a produção de etileno (CAS# 74-85-1) usando cultura de células, Em algumas modalidades, etileno se refere ao produto de hidrocarboneto C2 volátil final da conversão de 2oxoglutarato, um intermediário do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) pela enzima formadora de etileno (efe). O etileno é usado na fabricação de polí
62/291 meros como polietileno, poliéster, cloreto de polivinila e poliestireno, assim como fibras e outras substâncias químicas orgânicas.
São aqui fornecidos métodos para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto, em que é adicionado gás (como a adição de gás a um sistema como um sistema de fermentação) em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0 vvm e cerca de 2 vvm; e b) a produção do composto. Em outras modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto;
b) a produção do composto; e c) a recuperação do composto na fase gasosa. Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto; b) a produção do composto; e c) a recuperação do composto a partir da fase gasosa. Em algumas modalidades, o coeficiente da lei de Henry do composto é inferior a cerca de 200 M/atm, 150 M/atm, 100 M/atm, 75 M/atm, 50 M/atm, 25 M/atm, 10 M/atm, 5 M/atm, ou 1 M/atm. Em algumas modalidades, a solubilidade em água do composto é inferior a cerca de qualquer dentre 75 g/L, 50 g/L, 25 g/L, 10 g/L, 5 g/L, ou 1 g/L. Em algumas modalidades, o composto é selecionado de um grupo que consiste em isopreno, um aldeído (por exemplo, acetaldeído), uma cetona (por exemplo, acetona, metil etil cetona ou 2butanona), um álcool (por exemplo, metanol, etanol, 1-butanol, ou alcoóis C5 como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), um éster de um álcool (por exemplo, acetato de etila, ésteres de 3-metil-2-buten-1-ol, ou acetil ésteres de alcoóis C5), um hemiterpeno, um monoterpeno, um sesquiterpeno e hidrocarbonetos C1 a C5 (por exemplo, metano, etano, etileno, ou propileno). Em algumas modalidades, os hidrocarbonetos C1 a C5 são saturados, insaturados ou ramificados. Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a 05 é um hidrocarboneto alifático insaturado (p. ex. etileno, propeno, butileno, ou isobutileno). Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a C5 é
63/291 uma oleofina. Em modalidades particulares, o composto é isopreno. Em outras modalidades particulares, o composto é etileno. Em algumas modalidades, isopreno e etileno são coproduzidos. Em algumas modalidades dos métodos para produzir quaisquer dos compostos descritos acima, a taxa de pulverização gasosa está entre cerca de qualquer dentre 0 wm a 0,1 vvm, 0,1 wm a 1 vvm, 0,2 vvm a 1 vvm, ou 0,5 wm a 1 wm. Em algumas modalidades dos métodos para produzir quaisquer dos compostos descritos acima, a taxa de pulverização gasosa é 0,0 wm.
Sob um aspecto, a invenção caracteriza métodos para produzir etileno, Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de etileno, em que é adicionado gás (como a adição de gás a um sistema como um sistema de fermentação) em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0,01 wm e cerca de 2 wm; b) a produção de etileno. Em outras modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de etileno; e b) a produção de etileno; e c) a recuperação do etileno na fase gasosa. Em algumas modalidades dos métodos para produzir etileno, a taxa de pulverização gasosa está entre cerca de qualquer dentre 0,0 wm a 0,1 wm, 0,1 wm a 1 wm, 0,2 wm a 1 vvm, ou 0,5 wm a 1 wm. Em algumas modalidades dos métodos para produzir etileno, a taxa de pulverização gasosa é 0,0 wm.
Sob um aspecto, a invenção apresenta células em cultura que produzem um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, as células possuem um ácido nucléico heterólogo que (i) codifica polipeptídio sintase capaz de produzir o composto e (ii) é ligado de forma operacional a um promotor. Em algumas modalidades, o composto produzido é etileno e o polipeptídio sintase é enzima que forma etileno (efe). Em algumas modalidades, o promotor é a região promotora do gene ffh de E.coli, em que o promotor ffh se dirige à expressão constitutiva de efe. Em algumas modalidades, as células são culti
64/291 vadas em um meio de cultura que inclui uma ou mais fontes de carbono, como, mas não limitado a, um carboidrato, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de um carbono, óleo, gordura animal, óleo animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, gicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, fonte de carbono renovável, polipeptídio (por exemplo, uma proteína ou peptídeo vegetal ou microbiano), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura. Em algumas modalidades, as células são cultivadas sob condições de glicose limitada.
Se isopreno e etileno são coproduzidos, então eles podem ser separados durante a recuperação como descrito aqui ou por outros meios conhecidos por alguém versado na técnica. Em um aspecto da invenção, o etileno é recuperado por adsorção. Em algumas modalidades, o etileno é adsorvido em uma argila modificada por prata. Em algumas modalidades, o gás de escape da fermentação é desumidificado e passado por um filtro de argila modificada por prata a fim de remover etileno do fluxo de gás de escape, seguido pela dessorção do etileno do filtro de prata-argila usando um ciclo de oscilação de pressão. Em algumas modalidades, o gás de escape da fermentação é adicionalmente tratado antes da introdução no filtro de prata-argila pela pulverização através de uma solução de hidróxido de sódio aquoso a fim de remover dióxido de carbono. Em outro aspecto da invenção, o etileno é recuperado por separação criogênica ou dessorção/arraste. Polipeptídios e ácidos nucléicos exemplares
Vários polipeptídios e ácidos nucléicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA podem ser utilizados nas composições e métodos da invenção.
Como utilizado aqui, polipeptídios inclui polipeptídios, proteínas, peptideos, fragmentos de polipeptídios e polipeptídios de fusão. Em algumas modalidades, o polipeptídio de fusão inclui parte ou tudo de um primeiro polipeptídio (por exemplo, um polipeptídio ou fragmento cataliticamente ativo de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA) e pode opcionalmente incluir parte ou tudo de um segundo polipeptídio (por exemplo, um peptídeo que facilita a purificação ou detecção do polipeptídio de fusão,
65/291 como uma marcação His). Em algumas modalidades, o polipeptídio de fusão possui uma atividade de dois ou mais polipeptídios da via do MVA (como polipeptídios de AA-CoA tiolase e HMG-CoA redutase). Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio de ocorrência natural (como o polipeptídio codificado por um ácido nucléico de mvaE de Enterococcus faecalis) que possui uma atividade de dois ou mais polipeptídios a via do MVA.
Em várias modalidades, o polipeptídio possui pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, ou mais aminoácidos. Em algumas modalidades, o fragmento de polipeptídio contém pelo menos ou cerca de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, ou mais aminoácidos contíguos a partir de um polipeptídio completo e possui pelo menos ou cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% de uma atividade de um polipeptídio completo correspondente. Em modalidades específicas, o polipeptídio inclui um segmento ou toda a sequência de aminoácidos de qualquer polipeptídio que ocorra naturalmente de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA de. Em algumas modalidades, o polipeptídio possui uma ou mais mutações quando comparado com a sequência de polipeptídio selvagem (isto é, a sequência que ocorre na natureza), de isopreno sintase efe, DXS, IDI, ou via do MVA.
Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio isolado. Como utilizado neste, um polipeptídio isolado não é parte de uma biblioteca de polipeptídios, como a biblioteca de 2, 5, 10, 20, 50 ou mais polipeptídios diferentes e são separados por pelo menos um componente que ocorra na natureza. Um polipeptídio isolado pode ser obtido, por exemplo, por expressão de ácidos nucleicos recombinantes codificando o polipeptídio.
Em algumas modalidades, o polipeptídio é um polipeptídio heterólogo. Por polipeptídio heterólogo deve ser compreendido um polipeptídio cuja sequência de aminoácidos não é idêntica àquela de outro polipeptídio expresso de forma natural na mesma célula hospedeira. Em particular, um polipeptídio heterólogo não é idêntico a um ácido nucléico selvagem que é encontrado na mesma célula hospedeira na natureza.
Como utilizado neste, um ácido nucléico se refere a um ou dois
66/291 ou mais desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos em forma de fita simples ou dupla. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são ácidos nucleicos recombinantes. Por ácidos nucleicos recombinantes deve ser compreendido ácidos nucleicos de interesse que são livres de um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, genes) que, no genoma ocorrendo na natureza do organismo do qual os ácidos nucleicos de interesse são derivados, flanqueiam os ácidos nucleicos de interesse. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um plasmídeo de replicação autônoma ou vírus, ou no DNA genômico de um procarioto ou eucarioto, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA, um fragmento de DNA genômico, ou um fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Em várias modalidades, ácidos nucleicos são ácidos nucleicos recombinantes. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA são ligados de forma operacional a outros ácidos nucleicos codificando o todo ou uma parte de outro polipeptídio, de forma que os ácidos nucleicos recombinantes codificam um polipeptídio de fusão que inclui um polipeptídio de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA e o todo ou parte de outro polipeptídio (por exemplo, um peptídeo que facilita a purificação ou detecção do polipeptídio de fusão, como a marcação His). Em algumas modalidades, parte ou todo o ácido nucleico recombinante é quimicamente sintetizado. Deve ser compreendido que mutações, incluindo mutações de nucleotídeos únicos, podem ocorrer dentro de ácidos nucleicos como definido aqui.
Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são um ácido nucleico heterólogo. Por ácido nucleico heterólogo deve ser compreendido ácidos nucleicos cuja sequência de ácidos nucleicos não é idêntica àquela de outro ácido nucleico naturalmente encontrado na mesma célula hospedeira.
Em modalidades específicas, os ácidos nucleicos incluem um segmento de ou toda a sequência de ácidos nucleicos de qualquer ácido nucleico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou de via do MVA que ocorra
67/291 naturalmente. Em algumas modalidades, ácidos nucleicos incluem pelo menos ou cerca de 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, ou mais nucleotídeos contíguos de um ácido nucléico de isopreno sintase, ácido nucleido de efe, ácido nucléico de DXS, IDI, ou via do MVA que ocorram naturalmente. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos possuem uma ou mais mutações quando comparados com a sequência de ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA selvagem (isto é, uma sequência que ocorra na natureza). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos possuem uma ou mais mutações (por exemplo, uma mutação silenciosa) que aumentam a transcrição ou tradução de ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são uma variante degenerada de quaisquer ácidos nucleicos codificando polipeptídios de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA.
Degenerância de códons se refere à divergência no código genético que permite a variação da sequência nucleotídica sem afetar a sequência de aminoácidos de um polipeptídio codificado. Aquele versado na técnica está ciente da propensão de códon exibida por uma célula hospedeira específica no uso de códons de nucleotídeos para especificar certo aminoácido. Portanto, durante a síntese de ácidos nucleicos para expressão melhorada em célula hospedeira, é desejável em algumas modalidades a projeção de ácidos nucleicos de forma que sua frequência de uso de códon se aproxime da frequência do uso de códon preferencial da célula hospedeira.
Os números de acesso de polipeptídios e ácidos nucleicos exemplares de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do MVA são listados no Apêndice 1 (os números de acesso do Apêndice 1 e suas sequências correspondentes são neste incorporados por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito ao aminoácido e à sequência de ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do MVA de polipeptídios e ácidos nucleicos). O banco de dados Kegg também contém o aminoácido e sequência de ácidos nucleicos de vários polipeptídios e ácidos nucleicos exemplares de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou vias MVA de (vide, por e
68/291 xemplo, o site da internet genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html e as sequências destes, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito às sequências de aminoácidos e ácidos nucléicos de polipeptídios e ácidos nucléicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do MVA). Em algumas modalidades, um ou mais de polipeptídios e/ou ácidos nucléicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do MVA possuem uma sequência idêntica a uma sequência publicamente disponível em 12 de dezembro de 2007 ou 14 de setembro de 2008 como quaisquer das sequências que correspondem a quaisquer dos números de acesso no Apêndice 1 ou quaisquer das sequências presentes no banco de dados Kegg. Exemplos adicionais de polipeptídios e ácidos nucléicos de isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou via do MVA são descritos em maiores detalhes abaixo.
Exemplos de Polipeptídios de Isopreno Sintases e Ácidos Nucléicos
Como observado acima, polipeptídios de isopreno sintase convertem difosfato de dimetilalila (DMAPP) em isopreno. Exemplos de polipeptídio de isopreno sintases incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio de isopreno sintase. Métodos padrão podem ser usados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de isopreno sintase pela medida da capacidade do polipeptídio converter DMAPP no isopreno in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Em exemplos de ensaio, extratos de célula são preparados pelo cultivo de uma cepa (por exemplo, a cepa E. co//7pTrcKudzu descrita aqui) no método de recipiente agitado como descrito no Exemplo 1. Após a indução estar completa, aproximadamente 10 mL de células são peletados por centrifugação em 7000 x g por 10 minutos e resssuspensos em 5 mL de PEB sem gicerol. As células são lisadas com o uso de uma célula de Pressão Francesa com o uso de procedimentos padrão. Como alternativa, as células são tratadas com lisozima (solução de lisozima Ready-Lyse; Epicentre) após congelamento/degelo em -80°C.
A atividade de polipeptídio de isopreno sintase no extrato da cé
69/291 lula pode ser medida, por exemplo, como descrito em Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 e referências deste, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos ensaios para atividade de polipeptídio de isopreno sintase. DMAPP (Sigma) é evaporado para secar sob vapor de nitrogênio e reidratar por uma concentração de 100 mM em 100 mM de tampão de fosfato de potássio pH
8,2 e armazenado em -20 C. Para executar o ensaio, a solução de 5 μΙ_ de 1M de MgCh, 1 mM (250 pg/mL) de DMAPP, 65 μΙ_ de Tampão de extrato vegetal (PEB) (50 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 20 mM de MgCfe, 5% de gicerol e 2 mM de DTT) é adicionada a 25 μΙ_ de extrato de célula em um frasco Headspace de 20 mL com a tampa de metal rosqueada e septo de silicone coberto por teflon (Agilent Technologies) e cultivado em 37C por 15 minutos com agitação. A reação é interrompida pela adição de 200 pL de 250 mM de EDTA e quantificada por GC/MS como descrito no Exemplo 1, parte II.
Exemplos de ácidos nucleicos de isopreno sintase incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio de isopreno sintase. Exemplos de polipeptídio de isopreno sintases e ácidos nucleicos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer dos organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios mutantes e ácidos nucleicos derivados de quaisquer dos organismos fonte descritos neste.
Em algumas modalidades, o polipeptídio de isopreno sintase ou ácidos nucleicos são de família Fabaceae, como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o polipeptídio de isopreno sintase ou ácidos nucleicos são polipeptídios ou ácidos nucleicos de Pueraría montana (kudzu) (Sharkey et al., Planta Physiology 137: 700-712, 2005), Pueraría lobata, álamo (como Populus alba, Populus nigra, Populus tríchocarpa, ou Populus alba x tremula (CAC35696) Miller et al., Planta 213: 483-487, 2001) aspen (como Populus tremuloides) Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), ou Carvalho Vermelho (Quercus robur) (Zimmer et al., \NO 98/02550), que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no
70/291 que diz respeito a ácidos nucleicos de isopreno sintase e à expressão de polipeptídio de isopreno sintases. Isopreno sintases adequadas incluem, mas não são limitadas a, aquelas identificadas pelos Nos. de Acesso do Genbank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 e AY182241, que são incorporados neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito às sequências de ácidos nucleicos e polipeptídios de isopreno sintase. Em algumas modalidades, o polipeptídio ou ácido nucléico de isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucléico que ocorre naturalmente a partir de Quercus robur (isto é, o polipeptídio ou ácido nucléico de isopreno sintase é um polipeptídio ou ácido nucléico de isopreno sintase diferente do polipeptídio ou ácido nucléico que ocorre naturalmente a partir de Quercus robur). Em algumas modalidades, o ácido nucléico ou polipeptídio de isopreno sintase é polipeptídio ou ácido nucléico que ocorre naturalmente a partir de álamo. Em algumas modalidades, o ácido nucléico ou polipeptídio de isopreno sintase não é um polipeptídio ou ácido nucléico que ocorre naturalmente a partir de álamo.
Exemplos de Polipeptídios e Ácidos Nucleicos de efe
Como observado acima, polipeptídios de enzima formadora de etileno (efe) convertem 2-oxoglutarato em etileno. Exemplos de polipeptídios de efe incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio efe. Uma enzima formadora de etileno adequada inclui, mas não está limitada a, aquela identificada pelo No. de Acesso do Genbank EF175870, que é por meio deste incorporado como referência em sua totalidade, particularmente com relação às sequências de ácidos nucleicos e polipeptideos de efe. Métodos padrão (como aqueles descritos aqui) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de efe através da medição da capacidade do polipeptídio converter 2-oxoglutarato em etileno in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Exemplos de ácidos nucleicos de efe incluem ácidos nucleicos que codificam um polipeptídio, fragmento de um polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídio de fusão que possui pelo menos uma atividade de um polipeptídio efe. Exemplos de polipeptídios
71/291 e ácidos nucleicos de efe incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
Exemplos de Polipeptídios e Ácidos Nucleicos DXS
Como observado acima, polipeptídios de 1-desóxi-D-xilulose-5fosfato sintase (DXS) convertem piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1desóxi-D-xilulose-5-fosfato. Exemplos de polipeptídios DXS incluem polípeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio DXS. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio DXS através da medida da capacidade do polipeptídio converter piruvato e D-gliceraldeído-3-fosfato em 1desóxi-D-xilulose-5-fosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Exemplos de ácidos nucleicos DXS incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio DXS. Exemplos de polipeptídios DXS e ácidos nucleicos incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
Exemplos de Polipeptídios e Ácidos nucleicos IDI
Polipeptídios de isopentenil difosfato isomerase (isopentenildifosfato delta-isomerase ou IDI) catalisam a interconversão de difosfato de isopentenila (IPP) e difosfato de dimetilalila (DMAPP) (por exemplo, a conversão de IPP em DMAPP e/ou a conversão de DMAPP em IPP). Exemplos de Polipeptídio de IDI incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio IDI. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio IDI através da medida da capacidade do polipeptídio de interconverter IPP e DMAPP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo. Exemplos de Ácidos
72/291 nucleicos IDI incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio IDI. Em uma modalidade, uma fusão de difosfomevalonato descarboxilase-IDI de Coxiella burnetti é feita. Em outra modalidade, uma fusão de IDI-lsoS (isopreno sintase) é feita. Exemplos de Polipeptídio e ácidos nucleicos de IDI incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
Exemplos de Polipeptídios e Ácidos Nucleicos da Via do MVA
Exemplos de polipeptídios da via do MVA incluem polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AA-CoA tiolase), polipeptídios de 3-hidróxi-3metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase), polipeptídios de 3-hidróxi-3metilglutaril-CoA redutase (HMG-CoA redutase), polipeptídios de mevalonato quinase (MVK), polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK), polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD), polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC), polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK), polipeptídio de IDI e polipeptídios (por exemplo, polipeptídios de fusão) com atividade de dois ou mais polipeptídios da via do MVA de. Em particular, polipeptídios da via do MVA incluem polipeptídios, fragmentos de polipeptídios, peptídeos e polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via do MVA. Exemplos de ácidos nucleicos da via do MVA incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídio, fragmento de polipeptídio, peptídeo, ou polipeptídios de fusão que possuem pelo menos uma atividade de um polipeptídio da via do MVA. Exemplos de polipeptídios e ácidos nucleicos da via do MVA de incluem polipeptídios e ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente a partir de quaisquer organismos fonte descritos neste assim como polipeptídios e ácidos nucleicos mutantes derivados de quaisquer organismos fonte descritos neste.
Em particular, polipeptídios de acetil-CoA acetiltransferase (AACoA tiolase ou AACT) convertem duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados
73/291 para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de AACoA tiolase através da medida da capacidade do polipeptídio converter duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA sintase (HMG-CoA sintase ou HMGS) convertem acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3-metilglutarilCoA. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de HMG-CoA sintase através da medida da capacidade do polipeptídio converter acetoacetil-CoA em 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA in vitro, em extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA redutase (HMGCoA redutase ou HMGR) convertem 3-hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalonate. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídio de HMG-CoA redutase através da medida da capacidade do polipeptídio converter 3hidróxi-3-metilglutaril-CoA em mevalonate in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de mevalonate quinase (MVK) fosforilam mevalonate para formar mevalonato-5-fosfato. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios MVK através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonate em mevalonato-5-fosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de fosfomevalonato quinase (PMK) fosforilam mevalonato-5-fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios de PMK através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-fosfato em mevalonato-5difosfato in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de difosfomevalonato descarboxilase (MVD ou DPMDC) convertem mevalonato-5-difosfato em difosfato de isopentenila
74/291 (IPP). Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios MVD através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-difosfato em IPP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de fosfomevalonato descarboxilase (PMDC) convertem mevalonato-5-fosfato em fosfato de isopentenila (IP). Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios PMDC através da medida da capacidade do polipeptídio converter mevalonato-5-fosfato em IP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Polipeptídios de isopentenil fosfato quinase (IPK) fosforilam fosfato de isopentila (IP) para formar difosfato de isopentenila (IPP). Métodos padrão (como os descritos neste) podem ser utilizados para determinar se um polipeptídio possui atividade de polipeptídios IPK através da medida da capacidade de o polipeptídio converter IP em IPP in vitro, em um extrato de célula, ou in vivo.
Exemplos de polipeptídios e ácidos nucleicos de IDI são descritos acima.
Exemplos de Métodos para Isolar Ácidos Nucleicos
Ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA podem ser isolados com o uso de métodos padrão. Métodos para obter ácidos nucleicos desejados a partir de um organismo fonte de interesse (como um genoma bacteriano) são comuns e conhecidos na técnica de biologia molecular (vide, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas neste, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito à isolação de ácidos nucleicos de interesse). Por exemplo, se a sequência dos ácidos nucleicos for conhecida (como quaisquer dos ácidos nucleicos conhecidos descritos neste), bibliotecas genômicas adequadas podem ser criadas pela digestão de endonuclease de restrição e podem ser analisadas com sondas complementadas à sequência de ácidos nucleicos desejada. Após a sequência ser isolada, o DNA pode ser amplificado com o uso de iniciador padrão direcionado a métodos de
75/291 amplificação como a reação em cadeia da polimerase (PCR) (Patente No. U.S. 4.683.202, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a métodos PCR) para obter quantidades de DNA adequadas para a transformação com o uso de vetores apropriados.
Como alternativa, ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA (como quaisquer ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA com sequência conhecida de ácidos nucleicos) pode ser quimicamente sintetizado com o uso de métodos padrão.
Polipeptídios e ácidos nucleicos adicionais de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA de que podem ser adequados para o uso nas composições e métodos descritos neste podem ser identificados com o uso de métodos padrão. Por exemplo, bibliotecas de cosmídeos do DNA cromossômico de organismos conhecidos para a produção de isopreno naturalmente podem ser construídos em organismos como E. coli e então analisados para a produção de isopreno. Em particular, bibliotecas de cosmídeos podem ser criadas em locais onde grandes segmentos de DNA genômico (35-45 kb) são empacotados em vetores e usados para transformar hospedeiros adequados. Cosmídeos vetores são únicos em sua capacidade de acomodar grandes quantidades de DNA. Geralmente, cosmídeos vetores de pelo menos uma cópia de sequência de cos DNA que é necessária para empacotar subsequentemente circularizar o DNA heterólogo. Adicionalmente a sequência cos, esses vetores também contêm a origem de replicação como ColEI e marcadores de resistência a fármacos como ácidos nucleicos resistentes à ampicilina ou neomicina. Métodos de uso dos cosmídeos vetores para a transformação de hospedeiros bacterianos adequados são descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, que é incorporado neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a métodos de transformação.
Tipicamente para clonar cosmídeos, o DNA heterólogo é isolado com o uso de endonucleases de restrição apropriadas e ligado de forma adjacente à região cos do cosmídeo vetor com o uso de ligases apropriadas.
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Cosmídeos vetores contendo um DNA heterólogo linearizado são então reagidos com o veículo de empacotamento de DNA como bacteriófago. Durante o processo de empacotamento, os locais sítios cos são clivados e o DNA heterólogo é empacotado com a parte da cabeça da partícula viral bacteriana. Essas partículas são então usadas para transfectar células hospedeiras adequadas como E. coli. Após ser injetado na célula, o DNA heterólogo circulariza sob a influência das extremidades aderentes do cos. Dessa forma, grandes segmentos de DNA heterólogo podem ser introduzidos e expressos em células hospedeiras.
Métodos adicionais para obter ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA incluem a análise de uma biblioteca metagenômica por ensaio (como o ensaio headspace descrito neste) ou por PCR utilizando iniciadores direcionados contra os nucleotídeos codificando o comprimento de aminoácidos conservados (por exemplo, pelo menos 3 aminoácidos conservados). Aminoácidos conservados podem ser identificados por alinhamento de sequência de aminoácidos de polipeptídios conhecidos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA. Aminoácidos conservados para polipeptídios de isopreno sintase podem ser identificados com base em sequências alinhadas de polipeptídios de isopreno sintases conhecidos. Um organismo descoberto por produzir isopreno naturalmente pode ser sujeito a métodos padrão de purificação de proteína (que são bem-conhecidos na técnica) e o polipeptídio resultante purificado pode ser sequenciado com o uso de métodos padrão. Outros métodos são encontrados na literatura (vide, por exemplo, Julsing etal., Applied. Microbiol. Biotechnol. 75\ 1377-84, 2007; Comers et al., Appl Environ Microbiol. 73(19):6277-83, 2007, que são incorporadas neste por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito à identificação de ácidos nucleicos envolvidos na síntese de isopreno).
Adicionalmente, o alinhamento da sequência padrão e/ou programas de previsão da estrutura podem ser utilizados para identificar polipeptídios e ácidos nucleicos DXS, IDI, ou via do MVA com base na similaridade da sua estrutura primária e/ou secundária prevista com a de polipeptí
77/291 dios e ácidos nucléicos DXS, IDI, ou via do MVA conhecidos. Bancos de dados padrão como o banco de dados swissprot-trembl (com site em expasy.org, Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU - 1 rue Michel Servet CH-1211 Genebra 4, Suíça) também pode ser utilizado para identificar polipeptídios e ácidos nucléicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA. A estrutura secundária e/ou terciária de um polipeptídio de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA pode ser prevista com o uso de configurações padrão de programas de previsão de estruturas, como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nova Iorque, N.Y. 10032, EUA). Como alternativa, a estrutura secundária e/ou terciária real de um polipeptídio de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA pode ser determinada com o uso de métodos padrão. Ácidos nucléicos adicionais de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA também podem ser identificados por hibridização com sondas geradas a partir de ácidos nucléicos de isopreno sintase conhecidos, efe, DXS, IDI, ou via do MVA.
Exemplos de Promotores e Vetores
Qualquer ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA descrito aqui pode ser incluído em um ou mais vetores. Assim, a invenção também inclui vetores com mais um ácido nucléico codificando quaisquer polipeptídios de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA que são descritos aqui. Como utilizado aqui, um vetor deve ser compreendido como uma estrutura que é capaz de entregar e desejavelmente expressar um ou mais ácidos nucléicos de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA, cosmídeos e vetores de fago. Em algumas modalidades, o vetor contém ácidos sob o controle de uma sequência de expressão de controle.
Como utilizado aqui, uma sequência de controle de expressão deve ser compreendida como uma sequência de ácidos nucléicos que direciona a transcrição de ácidos nucléicos de interesse. Uma sequência de controle de expressão pode possuir um promotor, como um promotor constitutivo ou indutível, ou um aumentador. Um promotor indutível é um promotor
78/291 que é ativo sob regulamentação ambiental ou de desenvolvimento. A sequência de controle de expressão é ligada de forma operacional aos segmentos de ácidos nucleicos a serem transcritos.
Em algumas modalidades, o vetor contém um marcador seletivo. O termo marcador seletivo se refere a ácidos nucleicos capazes de expressão em uma célula hospedeira que permite a facilidade da seleção daquelas células hospedeiras contendo um ácido nucléico introduzido ou vetor. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, ácidos nucleicos de resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina, ampicillina, carbenicillina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina, ou cloranfenicol) e/ou ácidos nucleicos que conferem vantagem metabólica, como uma vantagem nutricional na célula hospedeira. Exemplos de marcadores nutricionais seletivos incluem os marcadores conhecidos na técnica como amdS, argB e pyr4. Marcadores úteis em sistemas de vetores para a transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Finkelstein, Capítulo 6 em Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, Chap. 6., 1992; e Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, London, 1992, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, o marcador seletivo é um ácido nucléico amdS, que codifica a enzima acetamidase, permitindo que as células transformadas cresçam em acetamida como fonte de nitrogênio. O uso de um ácido nucléico de amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito em Kelley et al., EMBO J. 4:475 - 479, 1985 e Penttila et al., Gene 61:155-164, 1987 (que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a marcadores seletivos). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, IDI, ou via do MVA se integram a um cromossoma das células sem um marcador seletivo.
Vetores adequados são aqueles que são compatíveis com a célula hospedeira utilizada. Vetores adequados podem derivar, por exemplo,
79/291 de uma bactéria, um vírus (bacteriófago T7 ou um fago derivado de M-13), um cosmídeo, uma levedura, ou uma planta. Protocolos para obtenção e utilização desses vetores são conhecidos por técnicos (ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed, Cold Spring Harbor, 1989, e incorporadas aqui por referência totalidade, especificamente relacionado ao uso de vetores).
Promotores são bem-conhecidos na técnica. Qualquer promotor que funciona na célula hospedeira pode ser utilizado para expressão de um ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA na célula hospedeira. Regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para dirigir a expressão de ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA em várias células hospedeiras são inúmeras e familiares para aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, WO 2004/033646 e referências já citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a vetores para a expressão de ácidos nucleicos de interesse). Praticamente qualquer promotor capaz de conduzir estes ácidos nucleicos é adequado para a presente invenção, mas não limitado a, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADCI, TRP1, URA3, LEU2, ENO e TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia)-, e ffh, lac, trp, APL, APR, T7, tac e trc (útil para expressão em E. coli).
Em algumas modalidades, um promotor de glicose isomerase é usado (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 7.132.527 e referências citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a sistemas promotores e plasmídeo para expressar polipeptídios de interesse). Mutantes de promotor de glicose isomerase relatados podem ser usados para variar o nível de expressão do polipeptídio codificado por um ácido nucléico ligado de forma operativa ao promotor de glicose isomerase (Patente U.S. No.7.132.527). Em várias modalidades, o promotor de glicose isomerase é contido em um plasmídeo de baixa, média ou, alta cópia (Patente U.S. No.7.132.527).
Em várias modalidades, um ácido nucléico de isopreno sintase,
80/291 efe, DXS, IDI e/ou ou via do MVA está contido em um plasmídeo de baixa cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 1 a cerca de 4 cópias por célula), plasmídeo de média cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 10 a cerca de 15 cópias por célula), ou plasmídeo de alta cópia (por exemplo, um plasmídeo que é mantido em cerca de 50 ou mais cópias por célula). Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é ligado de forma operacional ao promotor T7. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA ligado de forma operativa ao promotor T7 é contido em um plasmídeo de média ou alta cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é ligado de forma operacional ao promotor Trc. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA ligado de forma operativa ao promotor Trc é contido em um plasmídeo de média ou alta cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é ligado de forma operacional ao Promotor Lac. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA ligado de forma operativa ao promotor Lac é contido em plasmídeo de baixa cópia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é ligado de forma operacional a um promotor endógeno, como um promotor endógeno de Escherichia, Pantoea, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces, ou Trichoderma ou um promotor endógeno de serina protease alcalina, isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo ou extraendógeno de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA ligado de forma operativa ao promotor endógeno é contido em plasmídeo de alta cópia. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo replicante que não se integra em um cromossoma nas células. Em algumas modalidades, parte ou todo o vetor se integra em um cromossoma nas células.
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Em algumas modalidades, o vetor é qualquer vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica é integrado no genoma da célula e é replicado. Referência é feita ao Catálogo Central de Estoque Genético Fúngico de Cepas (FGSC, endereço eletrônico fgsc.net e referências citadas aqui, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a vetores) para uma lista dos vetores. Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são fornecidos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição., Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols em Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Suplemento 30, seção 7.7.18); van den Hondel et al. em Bennett e Lasure (Eds.) More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press pp. 396-428, 1991; e Patente U.S. No.5.874.276, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a vetores. Vetores particularmente úteis incluem pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 e pENTR/D.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é ligado de forma operacional ao promotor adequado que apresenta atividade transcricional em uma célula hospedeira fúngica. O promotor pode ser derivado de um ou mais ácidos nucleicos codificando um polipeptídio que é endógeno ou heterólogo para a célula hospedeira. Em algumas modalidades, o promotor é útil em um hospedeiro Trichoderma. Exemplos adequados não limitantes de promotores incluem cbM, cbh2, eg/1, egl2, pepA, httA, hfb2, xyn1 e amy. Em algumas modalidades, o promotor é um que é nativo da célula hospedeira. Por exemplo, em algumas modalidades quando T. reesei é o hospedeiro, o promotor é um promotor de T. reesei nativo. Em algumas modalidades, o promotor é cbh1 de T. reesei, que é um promotor induzível e foi depositado no GenBank sob o No. de acesso D86235, que é incorporado por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores. Em algumas modalidades, o promotor é um heterólogo para a célula hospedeira fúngica. Outros exemplos de promotores úteis incluem promotores dos genes de glicoamilase (glaA) de A. awamori e A. niger (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315,
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1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores); alfa amilases de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, xlrfl de T. reesei e a celobio-hidrolase 1 de T. reesei (EP 137280, que é incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a promotores).
Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui uma sequência de terminação. Regiões de controle de terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos da célula hospedeira. Em algumas modalidades, a sequência de terminação e a sequência promotora são derivadas uma vez que tenha mesma fonte. Em outra modalidade, a sequência de terminação é endógena à célula hospedeira. Uma sequência de terminador particularmente adequada é cblr\ derivada de uma cepa de Trichoderma (como T. reesei). Outros terminadores úteis incluem fungos de terminação de um A. niger ou A. awamori glicoamilase ácidos nucleicos (Nunberg et al., Mol. Cell Biol. 4:2306-2315, 1984 e Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a terminadores fúngicos). Opcionalmente, um sítio de terminação pode ser incluído. Para a expressão efetiva de polipeptídios, o DNA codificando o polipeptídio é operavelmente ligado através de códons de iniciação às regiões de controle de expressão selecionadas, de forma que a expressão que os resulte na formação do RNA mensageiro adequado.
Em algumas modalidades, o promotor, região de codificação, e terminador são todos originários do ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA a ser expresso. Em algumas modalidades, região de codificação do ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é inserida em um vetor de expressão de uso geral, de forma que ela esteja sob controle transcricional de sequências de promotor e terminador de construto de expressão. Em algumas modalidades, genes ou parte destes são inseridos a jusante do promotor forte cbtrí.
Um ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do
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MVA pode ser incorporado em um vetor, como um vetor de expressão, utilizando técnicas padronizadas (Sambrook et a!., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito à seleção adequada de sequências de DNA e à construção de vetores). Métodos usados para ligar o construto de DNA compreendendo um ácido nucléico de interesse (como um ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA), um promotor, um terminador e outras sequências e inseri-los em um vetor adequado são conhecidos na técnica. Por exemplo, enzimas de restrição podem ser usadas para clivar o ácido nucléico de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA e o vetor. Em seguida, as extremidades compatíveis do ácido nucléico clivado de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA e do vetor clivado podem ser ligadas. A adesão é geralmente feita por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existem, os ligantes oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional (ver, Sambrook et aí, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989 e Bennett e Lasure, More Gene Manipulations em Fungi, Academic Press, San Diego, pp 70-76, 1991, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a ligantes de oligonucleotídeos). Adicionalmente, vetores podem ser construídos com técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology).
Em algumas modalidades, pode ser desejável superexpressar ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA em níveis muito mais elevados do que o atualmente encontrado em células que ocorrem naturalmente. Este resultado pode ser realizado pela clonagem seletiva de ácidos nucleicos codificando os polipeptídios em plasmídeos multicópia ou colocando os ácidos nucleicos sob um promotor constitutivo ou induzível forte . Métodos para superexpressão de polipeptídios desejados são comuns e bem-conhecidos na técnica de biologia molecular e exemplos podem ser encontrados em Sambrook et aí, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989, que é incorporado aqui por refe
84/291 rência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a técnicas de clonagem.
Os seguintes recursos incluem descrições gerais suplementares, de acordo com metodologia útil de acordo com a invenção: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 e Ausubel et al., Eds. Current Protocols in Molecular Biology, 1994, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito à biologia molecular e técnicas de clonagem.
Exemplos de Organismos Fonte
Ácidos nuclèicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA (e seus polipeptídios codificados) podem ser obtidos de qualquer organismo que naturalmente contém ácidos nuclèicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA. Como observado acima, isopreno é formado naturalmente por uma variedade de organismos, como bactérias, levedura, plantas e animais. Organismos contêm uma via do MVA, Via DXP, ou ambas as via do MVA e DXP para produção de isopreno (As figuras 19A e 19B). Portanto, ácidos nuclèicos de DXS podem ser obtidos, por exemplo, a partir de quaisquer organismos que contenham a via DXP ou contêm ambas as vias do MVA e DXP. Ácidos nuclèicos de IDI e isopreno sintase podem ser obtidos, por exemplo, a partir de quaisquer organismos que contenham a via do MVA, Via DXP, ou ambas as via do MVA e DXP. Ácidos nuclèicos da via do MVA podem ser obtidos, por exemplo, a partir de quaisquer organismos que contenham a via do MVA ou contenham ambas as vias, do MVA e DXP.
Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nuclèicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA nucléica é idêntica à sequência de ácidos nuclèicos que é produzida por quaisquer dos seguintes organismos na natureza. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA de polipeptídios é idêntica à sequência de um polipeptídio que é produzido por quaisquer das seguintes organismos na natureza. Em algumas modalidades, o ácido nucléico ou polipeptídio de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou via do MVA é um ácido nucleico ou polipeptídio mutante derivado de quaisquer dos organismos descri
85/291 tos aqui. Como utilizado aqui, derivado de se refere à fonte do ácido nucleico ou polipeptídio em que uma ou mais mutações são introduzidas. Por exemplo, um polipeptídio que é derivado de um polipeptídio vegetal se refere ao polipeptídio de interesse que os resultados da introdução de uma ou mais mutações em uma sequência de um polipeptídio vegetal selvagem (isto é, uma sequência que ocorra na natureza).
Em algumas modalidades, o organismo fonte é um fungo, exemplos dos quais são espécies de Aspergillus como A. oryzae e A. niger, espécies de Saccharomyces como S. cerevisiae, espécies de Schizosaccharomyces como S. pombe e espécies de Tríchoderma como T reesei. Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma célula de fungos filamentosos. O termo fungo filamentoso se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (ver, Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York). Estes fungos são caracterizados por um micélio vegetative com uma parede celular composta por quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos são morfológica, fisiológica e geneticamente distintos de leveduras. O crescimento vegetativo de fungos filamentosos ocorre pelo alongamento de hifas e o catabolismo de carbono e obrigatoriamente aeróbico. A célula parental de fungo filamentoso pode ser uma célula de uma espécie de, mas não limitada a, Tríchoderma, (por exemplo, Tríchoderma reesei, a forma assexuada de Hypocrea jecorína, previamente classificada como T. longibrachiatum, Tríchoderma viride, Trichoderma koningii, Tríchoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 20: 46-53, 1984; ATCC No. 56765 e ATCC No. 26921); Penicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. lanuginose, ou H. grísea)-, Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A. japonicus, A. nidulans, ou A. awamorí) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 7380743, 1993 e Goedegebuur et al., Genet 41: 89-98, 2002), Fusarium sp., (por exemplo, F. roseum, F. graminum F. cerealis, F. oxysporuim, ou F. venenaturrí), Neurospora sp., (por exemplo, N. crassa), Hypocrea sp., Mucor sp., (por exemplo, M. miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (ver também, Innis
86/291 et al., Sci. 228: 21-26, 1985). O termo Trichoderma ou Trichoderma sp. ou Trichoderma spp. se refere a qualquer gênero de fungos previamente ou atualmente classificados como Trichoderma.
Em algumas modalidades, o fungo é A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum, ou F. solani. Cepas de Aspergillus são divulgadas em Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:738-743, 1993 e Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a fungos. Em modalidades específicas, o fungo é uma cepa de Trichoderma, como a cepa de T. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não limitantes incluem ATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767 e NRRL 15709, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a cepas de T. reesei. Em algumas modalidades, a cepa do hospedeiro é derivada de RL-P37. RL-P37 é divulgada em Sheir-Neiss et al., Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53, 1984, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito a cepas de T. reesei.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma levedura, como Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Pichia sp., ou Candida sp.Em algumas modalidades, a Saccharomyces sp. é Saccharomyces cerevisiae.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria, como cepas de Bacillus como B. lichenformis ou B. subtilis, cepas de Pantoea como P. citrea, cepas de Pseudomonas como P. alcaligenes, P. putida, P. syringae, ou P. fluorescens, cepas de Streptomyces como S. lividans ou S. rubiginosus, cepas de Corynebacterium sp. como Corynebacterium glutamicum, cepas de Rhodopseudomonas sp. como Rhodopseudomonas palustris, ou cepas de Escherichia como E. coli.
Como utilizado aqui, o gênero Bacillus inclui todas as espécies dentro do gênero Bacillus, conforme conhecidas por aqueles versados na técnica, incluindo, mas não limitado a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus,
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B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus e B. thuríngiensis. Reconhece-se que o gênero Bacillus continua a passar por reorganização taxonômica. Assim, pretende-se que o gênero inclua espécies que foram reclassificadas, incluindo, mas não limitando a organismos, tais como B. stearothermophilus, e que agora se chama Geobacillus stearothermophilus. A produção de endosporos resistentes à presença de oxigênio é considerada a característica definidora de gênero Bacillus, embora essa característica também se aplique aos recém-nomeados Aliciclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus e Virgibacillus.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria gram-positiva. Exemplos não límitantes incluem cepas de Streptomyces (por exemplo, S. lividans, S. coelicolor, ou S. griseus) e Bacillus. Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma bactéria gram-negativa, como E. coli, Rhodopseudomonas sp. como Rhodopseudomonas palustris ou Pseudomonas sp. como P. alcaligenes, P. putida, P. syríngae, ou P. fluorescens.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é a planta, como a planta a partir da família Fabaceae, como a subfamília Faboideae. Em algumas modalidades, o organismo fonte é kudzu, álamo (como Populus alba x tremula CAC35696), aspen (como Populus tremuloides), ou Quercus robur.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma alga, como a alga verde, alga vermelha, glaucófitas, cloraraquiniófitas, euglenídeos, cromista, ou dinoflagelados.
Em algumas modalidades, o organismo fonte é uma cianobactéria, como cianobactérias classificadas em quaisquer dos seguintes grupos com base em morfologia: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoríales, Nostocales, ou Stigonematales.
Exemplos de Células hospedeiras
Uma variedade de células hospedeiras pode ser usada para expressar polipeptídios de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA e
88/291 para a produção de isopreno nos métodos da invenção reivindicada. Exemplos de células hospedeiras incluem células de quaisquer dos organismos listados na seção anterior sob o título Exemplos de Organismos Fonte. A célula hospedeira pode ser uma célula que produz naturalmente isopreno ou etileno ou uma célula que não produze naturalmente isopreno ou etileno. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno com o uso da via DXP e ácidos nucleicos de isopreno sintase, DXS, e/ou IDI são adicionados para melhorar a produção de isopreno utilizando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno com o uso da via do MVA e uma isopreno sintase e/ou um ou mais ácidos nucleicos da via do MVA são adicionados para aumentar a produção de isopreno usando esta via. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno com o uso da via DXP e um ou mais ácidos nucleicos da via do MVA são adicionados para a produção de isopreno usando parte ou toda a via do MVA assim como a via DXP. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente isopreno usando tanto a DXP e Via do MVAs e um ou mais isopreno sintase, DXS, IDI, ou ácidos nucleicos de via do MVA são adicionados para aumentar a produção de isopreno por uma ou ambas as vias. Em algumas modalidades, a célula hospedeira produz naturalmente etileno e um ácido nucléico de efe é adicionado para acentuar a produção de etileno.
Exemplos de Métodos de Transformação
Ácidos nucleicos de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA ou vetores contendo os mesmos podem ser inseridos em uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula vegetal, uma célula fúngica, uma célula de levedura, ou uma célula bacteriana descrita aqui) utilizando técnicas padrão para expressão do polipeptídio codificado de isopreno sintase, efe, DXS, IDI, e/ou via do MVA. A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula hospedeira pode ser realizada usando técnicas de transformação como, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, lipofecção mediada ou transfecção mediada por DEAEdextrina ou transfecção usando um vírus fago recombinante), incubação com
89/291 precipitado DNA por fosfato de cálcio, bombardeio em alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA e fusão de protoplastos. Técnicas de transformação geral são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Current Protocols em Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) Capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor, 1989; e Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação). A expressão de polipeptídio heterólogo em Trichoderma é descrita na Patente U.S. No.6.022.725; Patente U.S. No. 6.268.328; Patente U.S. No. 7.262.041 ;WO 2005/001036; Harkki et al.; Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, 1991; Harkki et al., BioTechnol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594; e Nevalainen et al., The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to a expression of Both Homologous and Heterologous Genes, em Molecular Industrial Mycology, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY pp. 129 - 148, 1992, que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação e expressão). Referência é também feita a Cao et al., (Sei. 9:991-1001, 2000; EP 238023; e Yelton et al., Proceedings. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470-1474, 1984 (que são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação) para transformação de cepas de Aspergillus. Os ácidos nucleicos introduzidos podem ser integrados em DNA cromossomal ou mantidos como sequências replicantes extracromossomais.
Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para selecionar transformantes. Em um exemplo não limitante, transformantes adequados incluindo um marcador amds são usados para distinguir transformantes inadequados por sua taxa de crescimento mais rápida e formação de colônias circulares com uma superfície lisa, ao invés de contorno irregular em meio de cultura sólido contendo acetamida. Adicionalmente, em alguns casos, um ensaio adicional de estabilidade é conduzido pelo crescimento de transformantes em meio sólido não seletivo (por exemplo, um meio que não tem acetamida), pela coleta de esporos deste meio de cultura e pela deter
90/291 minação da porcentagem de esporos que, posteriormente, germinam e crescem em meio seletivo contendo acetamida.
Em algumas modalidades, células fúngicas são transformadas por um processo de formação de protoplastos e transformação dos protoplastos seguida de regeneração da parede celular de uma maneira conhecida. Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma sp. para a transformação envolve a preparação de protoplastos a partir de micélio de fungos (ver, Campbell et al., Curr. Genet. 16:53-56, 1989, queé incorporada por referência em sua totalidade, especificamente no que diz respeito aos métodos de transformação). Em algumas modalidades, os micélios são obtidos a partir de esporos vegetativos germinados. Os micélios são tratados com uma enzima que digere a parede celular, resultando em protoplastos. Os protoplastos são então protegidos pela presença de um estabilizador osmótico em meio em suspensão. Estes estabilizadores incluem o manitol, sorbitol, cloreto de potássio e sulfato de magnésio e semelhantes. Normalmente, a concentração destes estabilizadores varia entre 0,8 M e 1,2 M. É desejável usar uma solução de cerca de 1,2 M de sorbitol no meio em suspensão.
A captação de DNA na cepa hospedeira de Trichoderma sp. depende da concentração de íons cálcio. Geralmente, são usados entre cerca de 10 mM de CaCI2 e 50 mM de CaCE em uma solução de captação. Adicionalmente à captação de íons cálcio na solução, outros compostos geralmente incluídos são um sistema tamponante como tampão TE (10 mM de Tris, pH 7,4, 1 mM de EDTA) ou tampão MOPS a 10 mM, pH 6,0 (ácido morfolinopropanossulfônico) e polietileno glicol (PEG). Embora não exista uma intenção de se ligar em nenhuma teoria específica, acredita-se que o polietileno glicol aja para fundir as membranas celulares, permitindo assim que o conteúdo do meio seja distribuído no citoplasma da cepa de Trichoderma sp. e o DNA plasmidial seja transferido para o núcleo. Esta fusão frequentemente deixa várias cópias do DNA plasmidial integradas no cromossoma hospedeiro.
Normalmente uma suspensão contendo os protoplastos ou célu
91/291 las de Trichoderma sp. que foram submetidos a um tratamento de permeabilidade com uma densidade de 105 a 107/mL (tal como 2 x 106/ml_) é utilizada na transformação. Um volume de ΊΟΟμΙ desses protoplastos ou células em uma solução adequada (por exemplo, sorbitol a 1,2 M e 50 mM de CaCI2) é misturado com o DNA desejado. Em geral, uma concentração elevada de PEG é adicionada à solução de absorção. Entre 0,1 a 1 volume de PEG 4000 a 25% pode ser adicionado à suspensão de protoplastos. Em algumas modalidades, cerca de 0,25 volumes são adicionados à suspensão de protoplastos. Aditivos, tais como dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloreto de potássio, e outros também podem ser adicionados à solução de captação, e ajudam na transformação. Procedimentos similares estão disponíveis para outras células hospedeiras fúngicas (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.022.725 e 6.268.328, que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito aos métodos de transformação).
Geralmente, a mistura é então cultivada em cerca de 0°C por um período de 10 a 30 minutos. PEG adicional é depois adicionado à mistura para intensificar ainda mais a absorção da sequência de ácidos nucleicos desejada. O PEG 4000 a 25% é geralmente adicionado em volumes de 5 a 15 vezes o volume da mistura de transformação, no entanto, volumes maiores e menores podem ser adequados. O PEG 4000 a 25% é desejavelmente cerca de 10 vezes o volume da mistura de transformação. Depois que o PEG é adicionado, a mistura de transformação é, então, cultivada em temperatura ambiente ou em gelo antes da adição de uma solução de sorbitol e CaCh. A suspensão de protoplastos é então adicionada às alíquotas fundidas de um meio de crescimento. Quando o meio de crescimento inclui uma seleção de crescimento (por exemplo, acetamida ou um antibiótico), permitese o crescimento de transformantes apenas.
A transformação de células bacterianas pode ser realizada de acordo com os métodos convencionais, por exemplo, conforme descrito em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, em parti92/291 cular no que diz respeito a métodos de transformação.
Meios de Cultura de Células Exemplares
A invenção também inclui uma célula ou uma população de células em cultura que produzem isopreno ou etileno. Por células em cultura entende-se duas ou mais células em uma solução (por exemplo, um meio celular) que permite que as células sofram uma ou mais divisões celulares. Células em cultura não incluem células vegetais que fazem parte de uma planta multicelular viva contendo células que se diferenciaram em tecidos vegetais. Em várias modalidades, a cultura de células inclui pelo menos cerca de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1.000, 5.000, 10.000 ou mais células.
Qualquer fonte de carbono pode ser usada para cultivar as células hospedeiras. O termo fonte de carbono refere-se a um ou mais compostos contendo carbono, capaz de serem metabolizados por uma célula ou organismo hospedeiro. Por exemplo, o meio de cultura utilizado para cultivar as células hospedeiras pode incluir qualquer fonte de carbono adequada para manter a viabilidade ou o crescimento das células hospedeiras.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um carboidrato (tal como monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos), açúcar invertido (por exemplo, xarope de sacarose tratado enzimaticamente), glicerol, glicerina (por exemplo, um subproduto glicerina de um biodiesel ou processo de fabricação de sabão), di-hidroxiacetona, fonte de único carbono, óleo (por exemplo, um óleo vegetal ou de planta como o milho, palma ou óleo de soja), gordura animal, óleo de origem animal, ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo saturado, ácido graxo insaturado ou ácido graxo poli-insaturado), lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeo, polipeptideo (por exemplo, um peptideo ou proteína microbiana ou vegetal), fonte de carbono renovável (por exemplo, uma fonte de carbono da biomassa, como uma fonte de carbono da biomassa hidrolisado), extrato de levedura, componente de um extrato de levedura, polímero, ácido, álcool, aldeído, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol, ou qualquer combinação de dois ou mais dos supramencionados. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um produto de fotossín93/291 tese, incluindo, mas não limitado a, glicose.
Monossacarídeos exemplares incluem a glicose e a frutose, oligossacarídeos exemplares incluem lactose e sacarose, e polissacarídeos exemplares incluem amido e celulose. Carboidratos exemplares incluem os açúcares C6 (por exemplo, frutose, galactose, manose ou glicose) e açúcares C5 (por exemplo, xilose ou arabinose). Em algumas modalidades, o meio celular inclui um carboidrato, bem como uma fonte de carbono que não seja um carboidrato (por exemplo, glicerol, glicerina, di-hidroxiacetona, fonte de único carbono, óleo, óleo de origem animal, gordura animal, ácido graxo, lipídio, fosfolipídio, glicerolipídio, monoglicerídeo, diglicerídeo, triglicerídeos, fonte de carbono renovável, ou um componente de um extrato de levedura). Em algumas modalidades, o meio celular inclui um carboidrato, bem como um polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo ou proteína microbiana ou vegetal). Em algumas modalidades, o polipeptídeo microbiano é um polipeptídeo de fungos ou bactérias. Em algumas modalidades, o polipeptídeo vegetal é um polipeptídeo de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmiste, oliva, açafrão, gergelim ou semente de linhaça.
Em algumas modalidades, a concentração de carboidratos é, pelo menos, ou cerca de 5 gramas por litro de caldo (g/L, onde o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células), tal como pelo menos, ou cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração de carboidratos é de cerca de 50 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 100 e cerca de 360 g/L, entre cerca de 120 e cerca de 360 g/L, ou entre cerca de 200 e cerca de 300 g/L. Em algumas modalidades, essa concentração de carboidratos inclui o montante total de carboidrato que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das células hospedeiras.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada. Por condições de glicose limitada, entende-se que a quantidade de glicose que é adicionada é menor que ou cerca de 105% (tal como cerca de 100%) da quantidade de glicose que é consumida pelas
94/291 células. Em modalidades particulares, a quantidade de glicose que é adicionada ao meio de cultura é aproximadamente a mesma quantidade de glicose que é consumida pelas células durante um período específico de tempo. Em algumas modalidades, a taxa de crescimento celular é controlada através da limitação da quantidade de glicose adicionada, de tal forma que as células crescem a uma taxa que pode ser suportada pela quantidade de glicose no meio celular. Em algumas modalidades, a glicose não se acumula durante o tempo em que as células são cultivadas. Em várias modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada por um período maior ou cerca de 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 ou 70 horas. Em várias modalidades, as células são cultivadas em condições de glicose limitada, por um período maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% da duração total de tempo que as células são cultivadas. Embora não pretenda ficar vinculado a qualquer teoria em particular, acredita-se que as condições de glicose limitada podem permitir uma regulação mais favorável das células.
Em algumas modalidades, as células são cultivadas na presença de um excesso de glicose. Em modalidades particulares a quantidade de glicose que é adicionada é maior do que cerca de 105% (tal como cerca de ou maior que 110, 120, 150, 175, 200, 250, 300, 400, ou 500%) ou mais da quantidade de glicose que é consumida pelas células durante um período específico de tempo. Em algumas modalidades, a glicose acumula-se durante o tempo em que as células são cultivadas.
Lipídios exemplares são quaisquer substâncias que contenham um ou mais ácidos graxos que são ácidos graxos 04 e superiores, que são saturados, insaturados, ou ramificados.
Óleos exemplares são lipídios que estão líquidos à temperatura ambiente. Em algumas modalidades, os lipídios contêm um ou mais ácidos graxos C4 ou superiores (por exemplo, contêm um ou mais ácidos graxos saturados, insaturados ou ramificados com quatro ou mais carbonos). Em algumas modalidades, o óleo é obtido a partir de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmis
95/291 te, açafrão, oliva, gergelim, linhaça, células microbianas oleaginosas, sebo chinês, ou qualquer combinação de dois ou mais dos supramencionados.
Ácidos graxos exemplares incluem compostos de fórmula RCOOH, onde R é um hidrocarboneto. Ácidos graxos insaturados exemplares incluem compostos onde o R inclui pelo menos uma ligação dupla carbonocarbono. Ácidos graxos insaturados exemplares incluem, mas não estão limitados a, ácido oleico, ácido vacênico, o ácido linoleico, ácido palmitelaídico e araquidônico. Ácidos graxos poli-insaturados exemplares incluem compostos onde o R inclui uma pluralidade de ligações duplas carbonocarbono. Ácidos graxos saturados exemplares incluem compostos onde o R é um grupo alifático saturado. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui um ou mais ácidos graxos C12-C22· tais como ácidos graxos saturados C12, um ácido graxo saturado C14, um ácido graxo saturado C16, um ácido graxo saturado C18, um ácido graxo saturado C2o ou um ácido graxo saturado C22· Em uma modalidade exemplar, o ácido graxo é o ácido palmítico. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um sal de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), um derivado de um ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado), ou um sal de um derivado de ácido graxo (por exemplo, um ácido graxo insaturado). Sais apropriados incluem, mas não estão limitados a, sais de lítio, sais de potássio, sais de sódio, e assim por diante. Di- e trigliceróis são ésteres de ácidos graxos de glicerol.
Em algumas modalidades, a concentração de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeos é no mínimo, ou cerca de 1 grama por litro de caldo (g/L, onde o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células), tal como, pelo menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 g/L ou mais. Em algumas modalidades, a concentração de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo é de cerca de 10 e cerca de 400 g/L, tal como entre cerca de 25 e cerca de 300 g/L, entre cerca de 60 e cerca de 180 g/L, ou entre cerca de 75 e cerca de 150 g/L. Em algumas modalidades, a concentração inclui o montante total do lipídio, óleo,
96/291 gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui (i) um lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo e (ii) um carboidrato, como a glicose. Em algumas modalidades, a relação de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, monoglicerídeo, diglicerídeo, ou triglicerídeo para o carboidrato é de cerca de 1:1 em uma base de carbono (ou seja, um carbono no lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, diglicerídeo, monoglicerídeo ou triglicerídeo por carbono de carboidrato). Em modalidades particulares, a quantidade de lipídio, óleo, gordura, ácido graxo, diglicerídeo, monoglicerídeo ou triglicerídeo é entre cerca de 60 e 180 g/L, e a quantidade de carboidratos é de cerca de 120 e 360 g/L.
Fontes de carbono de polipeptideo microbiano exemplares incluem um ou mais polipeptídeos de fungos ou bactérias. Fontes de carbono de polipeptideo de plantas exemplares incluem um ou mais polipeptídeos de soja, milho, canola, pinhão manso, palma, amendoim, girassol, coco, mostarda, colza, algodão, palmiste, açafrão, oliva, gergelim ou semente de linhaÇa.
Fontes de carbono renováveis exemplares incluem permeado de soro de queijo, água de maceração de milho, melaço de açúcar de beterraba, malte de cevada, e os componentes de qualquer dos anteriores. Fontes de carbono renováveis também incluem glicose, hexose, pentose e xilose, presentes na biomassa, tal como milho, gramínea switchgrass, cana-deaçúcar, resíduos celulares dos processos de fermentação, e subproduto proteico da moagem de soja, milho ou trigo. Em algumas modalidades, a fonte de carbono da biomassa é um material lignocelulósico, hemicelulósico, ou celulósico, tal como, mas não limitados a, um grama, trigo, palha de trigo, bagaço de cana, bagaço de cana-de-açúcar, polpa de madeira macia, milho, sabugo ou casca de milho, grão de milho, fibra de grão de milho, palha de milho, o capim, produto de casca de arroz, ou um subproduto da moagem úmida ou seca de grãos (por exemplo, milho, sorgo, centeio, triticate, cevada, trigo e/ou bagaço de destilação). Materiais celulósicos exemplares inclu
97/291 em madeira, resíduos de polpa e papel, plantas herbáceas e polpa de fruta. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui toda ou qualquer parte da planta, como caules, grãos, raízes ou tubérculos. Em algumas modalidades, a totalidade ou parte de qualquer das seguintes plantas são usadas como fonte de carbono: milho, trigo, centeio, sorgo, triticate, arroz, milhete, cevada, mandioca, leguminosas, tais como feijão e ervilha, batata, batatadoce, banana, cana-de-açúcar, e/ou tapioca. Em algumas modalidades, a fonte de carbono é um hidrolisado de biomassa, tal como um hidrolisado de biomassa que inclui tanto xilose quanto glicose, ou que inclui tanto sacarose quanto glicose.
Em algumas modalidades, as fontes de carbono renováveis (como biomassa) são pré-tratadas antes de serem adicionadas ao meio de cultura de célula. Em algumas modalidades, o pré-tratamento inclui o prétratamento enzimático, pré-tratamento químico, ou uma combinação dos dois pré-tratamentos, enzimático e químico (ver, por exemplo, Farzaneh et al, Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005; Patente U.S. N° 6.176.176; Patente U.S. N° 6.106.888, que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades, particularmente com respeito ao pré-tratamento de fontes de carbono renováveis). Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável é parcial ou completamente hidrolisada antes de ser adicionada ao meio de cultura de células.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono renovável (tal como palha de milho) sofre pré-tratamento de explosão de fibras com amônia (AFEX) antes de ser adicionada ao meio de cultura de células (ver, por exemplo, Farzaneh et al. Bioresource Technology 96 (18): 2014-2018, 2005). Durante o pré-tratamento AFEX, uma fonte de carbono renovável é tratada com amônia anidra líquida em temperaturas moderadas (tal como cerca de 60 a cerca de 100°C), e alta pressão (como cerca de 1,72 x 106 a cerca de 2,07 x 106 Pa (250-300psi)) durante cerca de 5 minutos. Depois, a pressão é rapidamente liberada. Neste processo, efeitos físicos e químicos combinados de solubilização de lignina, hidrólise de hemicelulose, descristalização de celulose, e aumento da área de superfície permitem a conversão
98/291 enzimática quase completa de celulose e hemicelulose em açúcares fermentáveis. O pré-tratamento AFEX tem a vantagem de que quase toda a amônia pode ser recuperada e reutilizada, enquanto o restante serve como fonte de nitrogênio para micro-organismos em processos a jusante. Além disso, um fluxo de lavagem não é necessário para o pré-tratamento AFEX. Assim, a recuperação de matéria seca após o tratamento AFEX é essencialmente de 100%. AFEX é basicamente um processo dry to dry. A fonte de carbono renovável tratada é estável por longos períodos e pode ser alimentada com cargas de sólidos muito altas em hidrólise enzimática, ou processos de fermentação. A celulose e a hemicelulose são bem preservadas no processo AFEX, com pouca ou nenhuma degradação. Não há necessidade de neutralização antes da hidrólise enzimática de uma fonte de carbono renovável que sofreu pré-tratamento AFEX. A hidrólise enzimática das fontes de carbono tratadas com AFEX produz fluxo de açúcar puro para uso posterior em fermentação.
Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a, pelo menos, ou cerca de 0,1, 0,5, 1, 1,5 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ou 50% de glicose (p/v). A quantidade equivalente de glicose pode ser determinada por métodos de HPLC padronizados com glicose, como referência para medir a quantidade de glicose gerada a partir da fonte de carbono. Em algumas modalidades, a concentração da fonte de carbono (por exemplo, uma fonte de carbono renovável) é equivalente a entre cerca de 0,1% e cerca de 20% de glicose, tal como entre cerca de 0,1% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 0,5% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1% e cerca de 10% de glicose, entre cerca de 1% e cerca de 5% de glicose, ou entre cerca de 1% e cerca de 2% de glicose.
Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui extrato de levedura ou um ou mais componentes de extrato de levedura. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura é pelo menos 1 grama de extrato de levedura por litro de caldo (g/L, em que o volume de caldo inclui tanto o volume do meio celular e o volume das células), tal como, pelo
99/291 menos ou cerca de 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, ou mais g/L. Em algumas modalidades, a concentração de extrato de levedura é entre cerca de 1 e cerca de 300 g/L, tal como entre cerca de 1 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 200 g/L, entre cerca de 5 e cerca de 100 g/L, ou entre cerca de 5 e cerca de 60 g/ L. Em algumas modalidades, a concentração inclui o montante total de extrato de levedura que é adicionado antes e/ou durante o cultivo das células hospedeiras. Em algumas modalidades, a fonte de carbono inclui tanto o extrato de levedura (ou um ou mais componentes do mesmo) e outra fonte de carbono, como a glicose. Em algumas modalidades, a razão de extrato de levedura para a outra fonte de carvão é de cerca de 1:5, cerca de 1:10, ou cerca de 1:20 (p/p).
Além disso, a fonte de carbono também pode ser substrato de único carbono tais como o dióxido de carbono, ou o metanol. A produção de glicerol a partir de fontes de único carbono (por exemplo, metanol, formaldeído, ou formiato) tem sido relatada em leveduras metilotróficas (Yamada et al. Agric. Biol. Chem., 53 (2) 541-543, 1989, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono) e em bactérias (Hunter etal. Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono). Estes organismos podem assimilar compostos de único carbono, variando em estado de oxidação do metano para o formiato, e produzem glicerol. A via de assimilação de carbono pode ser através de ribulose monofosfato, através de serina, ou através de xilulose-momofosfato (Gottschalk, Bacterial Metabolism, Segunda edição, Springer-Verlag: Nova Iorque, 1986, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade, particularmente no que diz respeito às fontes de carbono). A via da ribulose monofosfato envolve a condensação de formiato com ribulose-5-fosfato para formar um açúcar de seis carbonos, que torna-se frutose e, eventualmente, o produto de três carbonos, gliceraldeído-3-fosfato. Da mesma forma, a via da serina assimila o composto de único carbono na via glicolítica através do metilenotetra-hidrofolato.
Além de substratos de um e dois carbonos, os organismos meti
100/291 lotróficos também são conhecidos por utilizar um número de outros compostos contendo carbono, como a metilamina, glicosamina e uma variedade de aminoácidos para a atividade metabólica. Por exemplo, as leveduras metilotróficas são conhecidas por utilizar o carbono da metilamina para formar trealose ou glicerol (Bellion et al, Microb. Growth Cl Compd., [Int. Symp.], 7 a ed., 415-32. Editores:Murrell et al, Editora:. Intercept, Andover, Reino Unido, 1993, que é incorporada aqui por referência, na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono). Da mesma forma, diversas espécies de Candida metabolizam o ácido oleico ou alanina (Suiter et al. Arch. Microbiol. 153 (5), 485-9, 1990, que é incorporado por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a fontes de carbono).
Em algumas modalidades, as células são cultivadas em um meio padrão contendo sais fisiológicos e nutrientes (ver, por exemplo, Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert et al. Academic Press, pp. 71-86, 1988 e Ilmen et al. Appl. Environ. Microbiol. 63:1298-1306, 1997, sendo cada uma delas incorporados aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito aos meios celulares). Meios de cultura exemplares são meios comercialmente preparados comuns, como caldo Luria Bertani (LB), caldo Sabouraud Dextrose (DP), ou caldo de meio de levedura (YM). Outros meios de crescimento definidos ou sintéticos também podem ser usados, e o meio adequado para o crescimento das células hospedeiras particulares, são conhecidos por alguém versado na técnica da ciência da microbiologia ou da fermentação.
Em adição a uma fonte de carbono adequada, o meio celular desejavelmente contém minerais adequados, sais, cofatores, tampões e outros componentes conhecidos por aqueles versados na técnica apropriada para o crescimento das culturas, ou o aumento da produção de isopreno (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas nele, e WO 96/35796 e referências citadas, sendo elas incorporadas aqui por referência, em suas totalidades, em especial no que diz respeito a condições de meios celulares e de cultura de células). Em algumas modalidades, onde um isopreno sintase, DXS, IDI, e/ou ácido nucléico da via do MVA está sob o con
101/291 trole de um promotor induzível, o agente indutor (por exemplo, açúcar, sal de metal ou antimicrobiano), é desejavelmente adicionado ao meio em uma concentração eficaz para induzir a expressão de um isopreno sintase, DXS, IDI e/ou polipeptídeo da via do MVA. Em algumas modalidades, o meio celular tem um antibiótico (como a canamicina), que corresponde ao ácido nucleico resistente ao antibiótico (tal como um ácido nucléico resistente à canamicina) em um vetor que tem um ou mais DXS, IDI, ou ácidos nucleicos da via do MVA.
Condições de Cultura de Células Exemplares
Os materiais e os métodos adequados para a manutenção e o crescimento de culturas bacterianas são bem-conhecidos no estado da técnica. Técnicas exemplares podem ser encontradas em Manual of Methods for General Bacteriology Gerhardt et al., eds, American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) ou Brock em Biotechnology: A textbook of Industrial Microbiology', segunda edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, sendo cada uma delas incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito às técnicas de cultura de células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitam a expressão de um ou mais isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou polipeptídeos da via do MVA codificados por um ácido nucléico inserido na célula hospedeira.
Condições de cultura de células padrão podem ser usadas para cultivar as células (ver, por exemplo, WO 2004/033646 e referências citadas no mesmo, sendo cada uma delas incorporadas aqui por referência em suas totalidades, em especial no que diz respeito às condições de cultura de células e de fermentação). As células são cultivadas e mantidas a uma temperatura, mistura de gases e pH adequados (tal como em cerca de 20 a cerca de 37°C, em cerca de 6% a cerca de 84% de CO2, e com um pH entre cerca de 5 a cerca de 9). Em algumas modalidades, as células são crescidas a 35°C em meio celular apropriado. Em algumas modalidades, por exemplo, as culturas são cultivadas a aproximadamente 28°C em meio apropriado, em culturas ou fermentadores com agitação, até a quantidade desejada de produ
102/291 ção de isopreno ser alcançada. Em algumas modalidades, a faixa de pH para fermentação é entre cerca de pH 5,0 a cerca de pH 9,0 (tal como cerca de pH 6,0 a cerca de pH 8,0, ou cerca de 6,5 a cerca de 7,0). As reações podem ser realizadas em condições aeróbias, anóxicas ou anaeróbias com base nos requisitos das células hospedeiras. Condições de cultura exemplares para um dado fungo filamentoso são conhecidas no estado da técnica, e podem ser encontradas na literatura científica, e/ou em fonte de fungos, tal como a American Type Culture Collection e Fungal Genetics Stock Center.
Em várias modalidades, as células são cultivadas utilizando qualquer modo conhecido de fermentação, tal como batelada, batelada alimentada ou processos contínuos. Em algumas modalidades, um método de batelada de fermentação é usado. A fermentação em batelada clássica é um sistema fechado, onde a composição do meio é definida no início da fermentação e não está sujeita às alterações artificiais durante a fermentação. Assim, no início da fermentação o meio de cultura é inoculado com as células hospedeiras desejadas e a fermentação é permitida a ocorrer sem acrescentar nada ao sistema. Normalmente, no entanto, a fermentação em batelada é batelada em relação à adição da fonte de carbono e as tentativas são muitas vezes feitas em fatores de controle, tais como pH e concentração de oxigênio. Em sistemas de batelada, as composições de metabólitos e de biomassa do sistema mudam constantemente até que o tempo de fermentação seja interrompido. Dentro de culturas em batelada, as células moderam através de uma fase lag estática para uma fase log de alto crescimento e, finalmente, para uma fase estacionária, onde a taxa de crescimento é reduzida ou interrompida. Em algumas modalidades, as células em fase log são responsáveis pela maior parte da produção de isopreno. Em algumas modalidades, as células em fase estacionária produzem isopreno. Em algumas modalidades, as células em fase log são responsáveis pela maior parte da produção de etileno. Em algumas modalidades, as células em fase estacionária produzem etileno.
Em algumas modalidades, uma variação no sistema de batelada padrão é usada, tal como o sistema de batelada alimentada. Processos de
103/291 fermentação em batelada alimentada compreendem um sistema de batelada típico, com a ressalva de que a fonte de carbono é adicionada em incrementos, como os progressos de fermentação. Sistemas de batelada alimentada são úteis quando a repressão catabólica é apta a inibir o metabolismo das células e onde é desejável ter quantidades limitadas de fonte de carbono no meio celular. Fermentações em batelada alimentada podem ser feitas com a fonte de carbono (por exemplo, glicose) em uma quantidade limitada ou em excesso. A medição da concentração real da fonte de carbono em sistemas de batelada alimentada é difícil e é, portanto, estimadas com base nas alterações dos fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido, e a pressão parcial de gases residuais como o CO2. Fermentações em batelada e batelada alimentada são comuns e bem-conhecidas no estado da técnica e exemplos podem ser encontrados em Brock, Biotechnology: A textbook of Industrial Microbiology, segunda edição (1989) Sinauer Associates, Inc., que é incorporado aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito às condições de cultura de células e de fermentação.
Em algumas modalidades, métodos de fermentação contínua são usados. A fermentação contínua é um sistema aberto onde um meio de fermentação definido é acrescentado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removido, ao mesmo tempo, para processamento. A fermentação contínua geralmente mantém as culturas com uma densidade elevada e constante, onde as células estão primariamente na fase log de crescimento.
A fermentação contínua possibilita a modulação de um fator ou qualquer número de fatores que afetam o crescimento celular ou a produção de isopreno. Por exemplo, um método mantém um nutriente limitante, tal como a fonte de carbono ou o nível de nitrogênio, a uma taxa fixa e permite que todos os outros parâmetros moderem. Em outros sistemas, uma série de fatores que afetam o crescimento podem ser alterados continuamente, enquanto a concentração de células (por exemplo, a concentração medida pela turvação do meio) é mantida constante. Sistemas contínuos esforçamse para manter as condições de crescimento no estado estacionário. Assim,
104/291 a perda de células devido ao meio que está sendo retirado, é equilibrada com a taxa de crescimento celular na fermentação. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação do produto são bem-conhecidos no estado da técnica da microbiologia industrial e uma variedade de métodos são detalhados por Brock, Biotechnology: A textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., que é incorporada aqui por referência em sua totalidade, particularmente com respeito às condições de cultura de células e de fermentação.
Em algumas modalidades, as células são imobilizadas em um substrato, como catalisadores de células inteiras, e submetidas a condições de fermentação para a produção de isopreno ou etileno.
Em algumas modalidades, garrafas de cultura líquida são colocadas em agitadores, a fim de introduzir oxigênio ao líquido e manter a uniformidade da cultura. Em algumas modalidades, uma incubadora é usada para controlar a temperatura, umidade, velocidade de agitação e/ou outras condições em que uma cultura é crescida. As incubadoras mais simples são caixas isoladas com um aquecedor regulável, geralmente vai até ~ 65°C. Incubadoras mais elaboradas também podem incluir a capacidade de diminuir a temperatura (através de refrigeração), ou a capacidade de controlar os níveis de umidade ou CO2. A maioria das incubadoras inclui um temporizador, alguns também podem ser programados para percorrer diferentes temperaturas, níveis de umidade, etc. Incubadoras podem variar em tamanho desde o tamanho de um tampo de mesa a unidades do tamanho de salas pequenas.
Se desejado, uma porção ou todo o meio celular pode ser alterado para repor os nutrientes e/ou evitar o acúmulo de subprodutos metabólicos potencialmente prejudiciais, e de células mortas. No caso de culturas em suspensão, as células podem ser separadas do meio por centrifugação ou filtragem da cultura em suspensão e, posterior ressuspensão das células em novo meio. No caso das culturas aderentes, o meio pode ser removido diretamente por sucção e substituído. Em algumas modalidades, o meio ce
105/291 lular permite pelo menos uma porção das células se dividir, pelo menos, ou cerca de 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65 ou mais divisões celulares em uma cultura contínua (tal como uma cultura contínua sem diluição).
Em algumas modalidades, um promotor constitutivo ou de indução (leaky) (como um promotor Trc) é usado e um composto (como IPTG) não é adicionado para induzir a expressão da isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou ácido (s) nucléico (s) da via do MVA operativamente ligado ao promotor. Em algumas modalidades, um composto (como IPTG) é adicionado para induzir a expressão da isopreno sintase, efe, DXS, IDI, ou ácido(s) nucleico(s) da via do MVA operativamente ligado ao promotor.
Métodos Exemplares de Desacoplamento entre a Produção de Isopreno do Crescimento Celular
Desejavelmente, o carbono da matéria-prima é convertido em isopreno ao invés de usado para o crescimento e manutenção das células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas a uma baixa para OD60o médio, então a produção de isopreno é iniciada ou aumentada. Esta estratégia permite que uma grande parte do carbono seja convertida em isopreno.
Em algumas modalidades, as células atingem uma densidade ótica de tal ordem que não se dividem mais, ou dividem-se de forma extremamente lenta, mas continuam a fazer isopreno por várias horas (tal como, cerca de 2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30 ou mais horas). Por exemplo, figuras 60A-67C mostram que as células podem continuar a produzir uma quantidade substancial de ácido mevalônico ou isopreno após as células atingirem uma densidade ótica de tal forma que não se dividem mais ou dividem-se de forma extremamente lenta. Em alguns casos, a densidade ótica a 550 nm diminui ao longo do tempo (tal como uma diminuição na densidade ótica após as células não estarem mais em uma fase de crescimento exponencial devido à lise celular), e as células continuam a produzir uma quantidade substancial de ácido mevalônico ou isopreno. Em algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos, ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25,
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30, 40, 50 ou 60 horas), e as células produzem isopreno em maior ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, ou mais nmols de isopreno/grama de células para o peso úmido das células/hora (nmol/gwcm/h) durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno esta entre cerca de 2 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 500 nmol/ gWcm/h, cerca de 150 a cerca de 500 nrnol/gWCm/h, cerca de 500 a cerca de 1.000 nrnol/gWCm/h, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gWCm/h, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 nrnol/gWCm/h, cerca de 100 a cerca de 5.000 nrnol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 300 a cerca de 1.000 nrnol/gwcm/h, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 nrnol/gwcm/h.
Em algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células produzem um título cumulativo (quantidade total) de isopreno maior ou cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, ou mais mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaido, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular) durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg/ Lcaido, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg/Lcaido, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaido, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaido, cerca de 1000 a cerca de 2.000 mg/Lcaido> ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg/Lcaid0· Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg/ Lcaido, cerca de 100 a cerca de 5.000 mg/Lcaido, cerca de 200 a cerca de 2.000 mg/ Lcaido, cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/Lca|d0, cerca de 300 a cerca de 1.000 mg/ Lcaido, ou
107/291 cerca de 400 a cerca de 1.000 mg/LcaidoEm algumas modalidades, a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%) durante um determinado período de tempo (tal como maior ou cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 horas), e as células convertem mais ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0 % do carbono no meio de cultura de células em isopreno durante este período de tempo. Em algumas modalidades, a percentagem de conversão de carbono em isopreno é entre tais como cerca de 0,002 a cerca de 4,0%, cerca de 0,002 a cerca de 3,0%, cerca de 0,002 a cerca de 2,0%, cerca de 0,002 a cerca de 1,6%, cerca de 0,002 a cerca de 0,005%, cerca de 0,005 a cerca de 0,01%, cerca de 0,01 a cerca de 0,05%, cerca de 0,05 a cerca de 0,15%, 0,15 a cerca de 0,2%, cerca de 0,2 a cerca de 0,3%, cerca de 0,3 a cerca de 0,5%, cerca de 0,5 a cerca de 0,8%, cerca de 0,8 para cerca de 1,0%, ou cerca de 1,0 a cerca de 1,6%. Em algumas modalidades, a percentagem de conversão de carbono em isopreno é entre cerca de 0,002 a cerca de 0,4%, de 0,002 a cerca de 0,16%, 0,04 a cerca de 0,16%, cerca de 0,005 a cerca de 0,3%, cerca de 0,01 a cerca de 0,3%, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,3%.
Em algumas modalidades, o isopreno é produzido apenas na fase estacionária. Em algumas modalidades, o isopreno é produzido tanto na fase de crescimento quanto na fase estacionária. Em várias modalidades, a quantidade de isopreno produzido (tal como a quantidade total de isopreno produzido ou a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo por hora, por OD6oo) durante a fase estacionária é maior ou cerca de 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou mais vezes a quantidade de isopreno produzido durante a fase de crescimento para o mesmo período de tempo. Em várias modalidades, maior ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% ou mais da quantidade total de isopreno, que é produzido (tal como a produção de isopreno durante uma fermentação por um determinado período de tempo, como 20 horas) é produzido enquanto as células estão na fase estacionária.
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Em várias modalidades, maior ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99% ou mais da quantidade total de isopreno que é produzido (tal como a produção de isopreno durante uma fermentação por um determinado período de tempo, como 20 horas) é produzido enquanto as células dividemse de forma lenta ou não se dividem, de tal forma que a densidade ótica a 550 nm das células aumenta pelo menos ou cerca de 50% (tal como pelo menos ou cerca de 40, 30, 20, 10, 5 ou 0%). Em algumas modalidades, o isopreno é produzido apenas na fase de crescimento.
Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucléicos da via do MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase são colocados sob o controle de um promotor ou fator que é mais ativo na fase estacionária do que na fase de crescimento. Por exemplo, um ou mais ácidos nucléicos da via do MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase podem ser colocados sob controle de um fator sigma de fase estacionária, tal como RpoS. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucléicos da via do MVA, IDI, DXP, ou isopreno sintase são colocados sob controle de um promotor induzível em fase estacionária, tal como um promotor induzível por um regulador de resposta ativa em fase estacionária.
Produção de Isopreno dentro de Intervalos de Operação Seguros
A produção de isopreno dentro de níveis seguros de operação de acordo com suas características de inflamabilidade simplifica o projeto e construção de instalações comerciais, melhora vastamente a capacidade de operar com segurança, e limita o potencial para a ocorrência de incêndios. Em particular, os intervalos ideais para a produção de isopreno estão dentro da zona segura, ou seja, o intervalo não inflamável de concentrações de isopreno. Em um aspecto, a invenção expõe um método para a produção de isopreno dentro do intervalo não inflamável de concentrações de isopreno (fora do envoltório de inflamabilidade do isopreno).
Assim, testes experimentais e de modelagem computacional foram utilizados para determinar os limites de inflamabilidade do isopreno (tal como isopreno na presença de O2, CO2, N2, ou qualquer combinação de dois ou mais dos gases anteriores), a fim de garantir um processo seguro. O en
109/291 voltório de inflamabilidade é caracterizado pelo limite de inflamabilidade inferior (LFL), o limite de inflamabilidade superior (UFL), a concentração de oxigênio limitante (LOG), e a temperatura limitante. Para que um sistema seja inflamável, uma quantidade mínima de combustível (tal como isopreno) deve estar na presença de uma quantidade mínima de oxidante, normalmente o oxigênio. A LFL é a quantidade mínima de isopreno que deve estar presente para sustentar a queima, enquanto o UFL é a quantidade máxima de isopreno que pode estar presente. Acima deste limite, a mistura é rica em combustível e a fração de oxigênio é muito baixa para ter uma mistura inflamável. A LOC indica a fração mínima de oxigênio que também deve estar presente para ter uma mistura inflamável. A temperatura limite é baseada no ponto de fulgor do isopreno, e é a mais baixa temperatura em que a combustão do isopreno pode se propagar. Esses limites são específicos para a concentração de isopreno, tipo e concentração de oxidantes, inertes presentes no sistema, temperatura e pressão do sistema. Composições que se enquadram dentro dos limites da curva envelope de inflamabilidade propagam combustão e requerem precauções de segurança adicionais, tanto no projeto quanto na operação dos equipamentos de processo.
As seguintes condições foram testadas através de simulação computacional, análise matemática e testes experimentais. Se desejado, outras condições (tais como outra temperatura, pressão e composições de gás permanentes) podem ser testadas usando os métodos descritos neste documento, para determinar as concentrações de LFL, UFL e de LOC.
(1) Simulação computacional e Análise matemática
Conjunto de Teste 1:
isopreno: 0% em peso -14% em peso
O2: 6% em peso - 21 % em peso
N2: 79% em peso - 94% em peso
Conjunto de Teste 2:
isopreno: 0% em peso -14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso N2: 79% em peso - 94% em peso
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Saturado com H2O
Conjunto de Teste 3: isopreno: 0% em peso -14% em peso O2: 6% em peso - 21% em peso N2: 79% em peso - 94% em peso CO2: 5% em peso - 30% em peso (2) Testes experimentais para determinação final dos limites de inflamabilidade
Conjunto de Teste 1:
isopreno: 0% em peso -14% em peso
O2: 6% em peso - 21% em peso N2: 79% em peso - 94% em peso Conjunto de Teste 2: isopreno: 0% em peso -14% em peso O2: 6% em peso - 21% em peso N2: 79% em peso - 94% em peso Saturado com H2O
O software de simulação foi usado para dar uma estimativa das características de inflamabilidade do sistema para diversas condições de teste diferentes. O CO2 não apresentou efeito significativo sobre os limites de inflamabilidade do sistema. Testes suite 1 e 2 foram confirmados por testes experimentais. Os resultados da modelagem estavam alinhados com os resultados do teste experimental. Apenas pequenas variações foram encontradas com a adição de água.
A LOC foi determinada a 9,5% de volume para uma mistura de isopreno, O2, N2, e CO2 a 40°C e 1 atmosfera. A adição de até 30% de CO2 não afetou significativamente as características de inflamabilidade da mistura de isopreno, O2, e N2. Apenas pequenas variações nas características de inflamabilidade foram mostradas entre um sistema de N2, O2e isopreno saturado hidratado e seco. A temperatura limite é de cerca de -54°C. Temperaturas abaixo de cerca de -54°C são demasiado baixas para propagar a combustão do isopreno.
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Em algumas modalidades, a LFL dos intervalos de isopreno de cerca de 1,5% em vol. a cerca de 2,0% em vol., e a UFL dos intervalos de isopreno a partir de cerca de 2,0% em vol. a cerca de 12,0% em vol., depende da quantidade de oxigênio no sistema. Em algumas modalidades, a LOC é cerca de 9,5% em vol. de oxigênio. Em algumas modalidades, a LFL de isopreno é entre cerca de 1,5% em vol. a cerca de 2,0% em vol., a UFL de isopreno é entre cerca de 2,0% em vol. a cerca de 12,0% em vol., e a LOC é cerca de 9,5% em vol. de oxigênio quando a temperatura está entre cerca de 25°C a cerca de 55°C (tal como cerca de 40°C) e a pressão está entre cerca de 1 atmosfera a 3 atmosferas.
Em algumas modalidades, o isopreno é produzido na presença de menos de cerca de 9,5% em vol. de oxigênio (ou seja, abaixo da LOC necessária para ter uma mistura inflamável de isopreno). Em algumas modalidades nas quais é produzido o isopreno na presença de maior ou cerca de 9,5% em vol. de oxigênio, a concentração de isopreno está abaixo da LFL (tal como abaixo de cerca de 1,5% em vol.). Por exemplo, a quantidade de isopreno pode ser mantida abaixo da LFL, diluindo a composição do isopreno com um gás inerte (por exemplo, adicionando, periodicamente ou continuamente, um gás inerte, como nitrogênio, para manter a composição de isopreno abaixo da LFL). Em algumas modalidades nas quais o isopreno é produzido na presença de oxigênio, maior ou cerca de 9,5% em vol., a concentração de isopreno está acima da UFL (tal como acima de cerca de 12% em vol.). Por exemplo, a quantidade de isopreno pode ser mantida acima da UFL por meio de um sistema (tal como qualquer um dos sistemas de cultura de células descritos aqui) que produz isopreno em uma concentração acima da UFL. Se desejado, um nível relativamente baixo de oxigênio pode ser usado para que a UFL também seja relativamente baixa. Neste caso, uma menor concentração de isopreno é necessária para se manter acima da UFL.
Em algumas modalidades nas quais o isopreno é produzido na presença de mais do que cerca 9,5% em volume de oxigênio, a concentração de isopreno está dentro do envelope de inflamabilidade (tal como, entre
112/291 o LFL e o UFL). Em algumas modalidades, quando a concentração de isopreno pode cair dentro do envelope de inflamabilidade, uma ou mais etapas são realizadas para reduzir a probabilidade de um incêndio ou explosão. Por exemplo, uma ou mais fontes de ignição (tais como todos os materiais que podem gerar uma faísca) podem ser evitadas. Em algumas modalidades, uma ou mais etapas são realizadas para reduzir a quantidade de tempo que a concentração de isopreno permanece dentro do envelope de inflamabilidade. Em algumas modalidades, um sensor é usado para detectar quando a concentração de isopreno está próxima ou dentro do envelope de inflamabilidade. Se desejar, a concentração de isopreno pode ser medida em um ou mais pontos do tempo durante a cultura de células, e as condições de cultura de células e/ou a quantidade de gás inerte que pode ser ajustada usando métodos padrão, se a concentração de isopreno está próxima ou dentro do envelope de inflamabilidade. Em modalidades particulares, as condições de cultura de células (tais como condições de fermentação) são ajustadas para diminuir a concentração de isopreno abaixo da concentração do LFL ou aumentar a concentração de isopreno acima da concentração do UFL. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é mantida abaixo do LFL pela diluição da composição de isopreno com um gás inerte (tal como pela adição de forma contínua ou periódica de um gás inerte para manter a composição de isopreno abaixo do LFL).
Em algumas modalidades, a quantidade de voláteis inflamáveis diferentes de isopreno (tal como um ou mais açúcares) é de pelo menos cerca de 2, 5, 10, 50, 75 ou 100 vezes menor que a quantidade de isopreno produzida. Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa diferente do gás isopreno compreende entre cerca de 0% a cerca de 100% (volume) de oxigênio, tal como entre cerca de 0% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 50%, cerca de 50% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 100% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa diferente de gás isopreno compreende entre
113/291 cerca de 0% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio, tal como entre cerca de 0% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, cerca de 40% a cerca de 50%, cerca de 50% a cerca de 60%, cerca de 60% a cerca de 70%, cerca de 70% a cerca de 80%, cerca de 80% a cerca de 90%, ou cerca de 90% a cerca de 99% (volume) de nitrogênio.
Em algumas modalidades, a porção da fase gasosa diferente do gás isopreno compreende entre cerca de 1% a cerca de 50% (volume) de CO2, tal como entre cerca de 1% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 30%, cerca de 30% a cerca de 40%, ou cerca de 40% a cerca de 50% (volume) de CO2.
Em algumas modalidades, uma composição de isopreno também contém etanol. Por exemplo, o etanol pode ser usado para destilação extrativa de isopreno, resultando em composições (como correntes de produto intermédio) que incluem tanto etanol quanto o isopreno. Desejavelmente, a quantidade de etanol está fora da curva envelope de inflamabilidade para o etanol. A LOC de etanol é de cerca de 8,7% em vol, e o LFL para o etanol é de cerca de 3,3% em vol em condições padrão, tal como cerca de 1 atmosfera e cerca de (60°F) 15,55°C (NFPA 69 Standard on Prevention Systems, edição 2008, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade, particularmente com respeito a LOC, LFL, e os valores de UFL). Em algumas modalidades, as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na presença de menos do que o LOC requerido para ter uma mistura inflamável de etanol (tal como menos de cerca de 8,7% em vol.). Em algumas modalidades em que as composições que incluem isopreno e etanol são produzidas na presença de mais do que a, ou em aproximadamente na, LOC requerida para ter uma mistura inflamável de etanol, a concentração de etanol está abaixo do LFL (tal como a menos de cerca de 3,3 % em vol.).
Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como o oxigênio) está abaixo da LOC de qualquer combustível no sistema (como isopreno ou etanol). Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como o oxigênio) é menor que a cerca de 60, 40, 30, 20, 10 ou 5% da LOC de iso
114/291 preno ou etanol. Em várias modalidades, a quantidade de oxidante (como ο oxigênio) é menor que a LOC do isopreno ou etanol, pelo menos, 2, 4, 5 ou mais pontos percentuais absolutos (% em vol). Em modalidades particulares, a quantidade de oxigênio é de pelo menos 2 pontos percentuais absolutos (% em vol) menos do que a LOC do isopreno ou etanol (tal como uma concentração de oxigênio menor que 7,5% em vol, quando a LOC do isopreno é de 9,5% em vol). Em várias modalidades, a quantidade de combustível (como isopreno ou etanol) é menor que, ou cerca de, 25, 20, 15, 10 ou 5% do LFL para esse combustível.
Produção e Recuperação de Alta Eficiência de Isopreno, um Hidrocarboneto Volátil, por Fermentação
Adicionalmente, são aqui fornecidos métodos para a produção e recuperação de alta eficiência de voláteis como isopreno usando taxas de pulverização de gás reduzidas. O uso de taxas de pulverização de gás reduzidas facilita a recuperação de isopreno e outros voláteis (como etileno) pelo aumento da concentração do volátil no gás de escape da fermentação, o que pode facilitar a recuperação a jusante do volátil a partir de gases permanentes e outras impurezas. Outra vantagem da produção e recuperação de voláteis em taxas de pulverização de gás reduzidas é que a quantidade de oxigênio presente no gás de escape é reduzida, já que uma maior porcentagem do oxigênio inicial é consumida pelas células no fermentador. Baixas concentrações de oxigênio são vantajosas já que a reação de oxigênio com isopreno para formar polímeros indesejáveis e compostos oxidados é reduzida. Além disso, o uso de taxas de pulverização de gás reduzidas maximiza a quantidade de voláteis no gás de escape, enquanto minimiza gases permanentes, em particular o oxigênio. A maximização da quantidade dos voláteis também é importante na manutenção de condições de operação seguras tendo em vista a natureza extremamente volátil do isopreno e de outros hidrocarbonetos insaturados no processo como dicutido acima.
A remoção contínua de compostos orgânicos voláteis (VOCs) do caldo de fermentação por arraste gasoso é mais eficaz para substâncias cujas propriedades físicas favoreçam a partição na fase gasosa em temperatu
115/291 ras e pressões ambiente. Em geral, um composto pode ser recuperado por arraste gasoso se ele possuir uma alta pressão de vapor em temperaturas de fermentação, combinada com baixa hidrossolubilidade. O coeficiente da lei de Henry também é usado para estimar a eficácia do arraste gasoso na remoção de compostos orgânicos de solução aquosa. Em equilíbrio, a relação entre as concentrações de um composto volátil nas fases líquida e gasosa é dada pela lei de gás de Henry (eq. 1).
P = kC (eq. 1) onde P é a pressão parcial, C a concentração aquosa e k é o coeficiente da lei de Henry. Sob condições dinâmicas, como no caso de um fermentador gás-pulverizado produzindo um composto orgânico volátil, a concentração de um volátil na fase líquida depende de vários fatores adicionais, resumidos abaixo;
i) Taxa de produção volátil (g/L/h) ii) Taxa de pulverização de gás (vvm) iii) Área de superfície da bolha (m’2) iv) Taxa de agitação
Assim, em uma taxa constante de produção volátil, taxas de pulverização de gás maiores tenderão a reduzir a concentração aquosa de estado constante do volátil. A taxa de transferência de massa volátil da fase líquida para a gasosa (ou vice-versa) é uma função da diferença entre a concentração volátil aquosa e a concentração esperada no equilíbrio, multiplicada pelo coeficiente de transferência de massa.
F = KL[C - (P/k)] (eq. 2) onde F é fluxo (mol s'1), KL a velocidade de transferência de gás (m s’1), C a concentração volátil aquosa, P é a pressão parcial e k representando o coeficiente da lei de Henry para o volátil. Quando a concentração aquosa é maior que a concentração de equilíbrio, ocorrerá efluxo de gás da fase líquida para a gasosa. A velocidade de transferência de gás, KL, também será influenciada pela área de superfície gás/líquido, que será alterada como uma função do grau de agitação do caldo de fermentação. Para um fermentador bem agitado, pode-se assumir que a maior parte das fases gasosa e líquida
116/291 está em equilíbrio e, assim, a concentração aquosa de um volátil é predominantemente uma função da pressão parcial na fase gasosa acima do líquido, de acordo com a lei de Henry (eq. 1). Deve-se entender que o valor do coeficiente de Henry varia com a temperatura e a composição da fase aquosa do sistema. Assim, a quantidade corrente de isopreno presente no caldo de fermentação aquosa em um determinado momento pode variar da quantidade teórica em um sistema ideal.
Para o isopreno em 298K, o coeficiente de Henry é 0,029 M/atm. Veja Weitz and Loser in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 7th edn., Electronic release, Wiley-VCH Verlag GMBH, Weinheim (2005); veja também Karl et al. (2003) Int. J. Mass Spec., 223-224, 383-395, que são incorporadas como referência em suas totalidades, particularmente com relação aos cálculos do coeficiente da lei de Henry. Portanto, se o gás de escape que sai do fermentador tem uma pressão parcial de isopreno de 0,01 atm (1% v/v) a 0,5 vvm, então a concentração de líquido no estado constante no caldo de fermentação será de 0,29 mM, ou cerca de 20 mg/L. Duplicando o fluxo de ar para 1 wm reduzirá pela metade a pressão parcial de isopreno acima do fermentador para 0,05% e portanto, a concentração de fase líquida será reduzida para em torno de 10 mg/L.
São aqui fornecidos métodos para produzir isopreno compreendendo: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção de isopreno; e b) a produção de isopreno,em que a concentração da fase líquida de isopreno é menor que cerca de 2 g/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a cerca de 1 g/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a cerca de 200 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qualquer de cerca de 1,9 g/L, 1,8 g/L, 1,7 g/L, 1,6 g/L, 1,5 g/L, 1,4 g/L, 1,3 g/L, 1,2 g/L, ou 1,1 g/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qualquer de cerca de 900 mg/L, 800 mg/L, 700 mg/L, 600 mg/L, 500 mg/L, 400 mg/L, ou 300 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura é inferior a qual
117/291 quer de cerca del75 mg/L, 150 mg/L, 125 mg/L, 100 mg/L, 75 mg/L, 50 mg/L, 25 mg/L, 20 mg/L, 15 mg/L, 10 mg/L, 5 mg/L, ou 2,5 mg/L. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida de isopreno na cultura está entre cerca de qualquer dentre 0,1 mg/L e 200 mg/L, 1 mg/L e 200 mg/L, 1 mg/L e 150 mg/L, 1 mg/L e 100 mg/L, 1 mg/L e 50 mg/L, 1 mg/L e 25 mg/L, 1 mg/L e 20 mg/L, ou 10 mg/L e 20 mg/L, 1 mg/L e 1 g/L, 0,1 mg/L e 2 g/L, 1 g/L e 2 g/L, 10 mg/L e 1 g/L, ou 100 mg/L e 1 g/L. Em algumas modalidades, o isopreno produzido é qualquer concentração ou quantidade divulgada na seção intitulada Produção Exemplar de Isopreno. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida está abaixo do limite de solubilidade de isopreno. Em algumas modalidades, a fase líquida na cultura está saturada com isopreno, e o isopreno está adicionalmente presente em uma segunda fase líquida. Em algumas modalidades, a segunda fase líquida compreende pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, ou 98% de isopreno.
Em algumas modalidades, as células produzem mais que cerca de 400 nmol/gwcm/hora de isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de qualquer dentre 400 nmol/gwcm/hora e 1 mol/gwcm/hora, 400 nmol/gWCm/hora e 1 mmol/gwcm/hora, 400 nmol/gwcm/hora e 40 mmol/gwcm/hora, 400 nmol/gwcm/hora e 4 mmol/gWCm/hora, 1 mmol/gwcm/hora e 1,5 mmol/gwcm/hora, 1,5 mmol/gWcm/hora e 3 mmol/gwcm/hora, 3 rnmol/gwcm/hora e 5 mmol/gWCm/hora, 5 mmol/gWCm/hora e 25 mmol/gwcm/hora, 25 mmol/gwcm/hora e 100 mrnol/gWcm/hora, 100 mmol/gwcm/hora e 500 mmol/gWCm/hora, ou 500 mmol/gWcm/hora e 1000 mmol/gwcm/hora. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é cerca de qualquer dentre 1 mmol/gwcm/hora, 1,5 rnmol/gWcm/hora, 2 mmol/gwcm/hora, 3 rnmol/gwcm/hora, 4 mmol/gWCm/hora, ou 5 mrnol/gWcm/hora.
O valor baixo para o coeficiente de Henry significa que o isopreno pode ser recuperado do caldo de fermentação por arraste gasoso em baixas taxas de pulverização, por exemplo 0,01 vvm a 2 vvm. Em algumas modalidades, a taxa de pulverização de gás está entre cerca de qualquer dentre 0 vvm e 0,01 wm, 0,01 wm e 0,1 vvm, 0,1 vvm e 1 vvm, 0,01 wm e 0,5 vvm, 0,2 wm e 1 vvm, ou 0,5 vvm e 1 vvm. Em algumas modalidades, a
118/291 taxa de pulverização de gás é cerca de qualquer dentre 0,1 wm, 0,25 wm, 0,5 wm, 0,75 wm, 1 wm, 1,25 wm, 1,5 wm, 1,75 wm, ou 2 wm. Em algumas modalidades, a pulverização de gás não é utilizada. Em algumas modalidades, baixas taxas de pulverização são mantidas em todo o decurso de execução da fermentação, durante a fase de crescimento, ou durante a fase estacionária. Em algumas modalidades, as baixas taxas de pulverização são mantidas entre cerca de qualquer dentre 1 hora e 5 horas, 5 horas e 10 horas, 10 horas e 20 horas, 20 horas e 30 horas, 30 horas e 40 horas, 40 horas e 50 horas, ou 50 horas e 60 horas. O limite inferior da pulverização de gás desejável é definido pelo ponto em que a fase aquosa se torna saturada com isopreno e uma fase orgânica líquida é formada. Isto pode ocorrer apenas abaixo do ponto de ebulição do isopreno (34,1 °C a 1 atm), acima do qual uma fase de isopreno líquido nunca se formará. Em temperaturas abaixo do ponto de ebulição do isopreno, a formação de uma fase líquida é determinada pela solubilidade aquosa do isopreno, que é de aproximadamente 650 mg/L a 25°C. Embora seja altamente desejável evitar a formação de uma fase de isopreno líquido, não é absolutamente necessário, contanto que as células possam tolerar a presença de isopreno líquido sem efeitos tóxicos.
Em algumas modalidades, o oxigênio, CO2, e isopreno são quaisquer das quantidades ou concentrações discutidas na seção intitulada Produção de Isopreno com Intervalos de Operação Seguros. Em algumas modalidades, o oxigênio é consumido pelas células enquanto mantém metabolismo completamente aeróbico. Em algumas modalidades, um excesso de oxigênio é usado a fim de satisfazer às demandas de oxigênio das células. Intervalos desejáveis de oxigênio no gás de escape são inferiores a 20%, ou inferiores a 15% ou inferiores a 10% (v/v). Níveis de oxigênio abaixo da concentração limite de oxigênio necessários para a combustão do isopreno (9,5% v/v a 1 atm) são particularmente desejáveis. Em algumas modalidades, o ar enriquecido por oxigênio é utilizado com a finalidade de permitir taxas de remoção de gás enquanto satisfaz a demanda de oxigênio celular. Em algumas modalidades, a parte da fase gasosa da remoção de gás com
119/291 preende entre cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20%, ou cerca de 20% a cerca de 30% (volume) de oxigênio. Em algumas modalidades, fermentações de isopreno são realizadas sob alta pressão a fim de minimizar a quantidade de oxigênio em excesso necessária para manter os níveis de oxigênio dissolvido necessários na fase líquida.
Em algumas modalidades, a redução da taxa de remoção de gás ao logo do fermentador é vantajosa para um processo de produção de isopreno integrado em que tais condições enriquecem os níveis de isopreno no gás de escape até cerca de 30.000 ug/L (cerca de 1% v/v) sem afetar adversamente a fisiologia das células.
Em algumas modalidades, as taxas de pulverização de gás reduzidas não afetam adversamente significativamente a fisiologia das células. Em algumas modalidades,a taxa de evolução de dióxido de carbono das células em cultura com taxas de pulverização de gás reduzidas está entre cerca de qualquer dentre 1 x 10’18mmol/L/hora a cerca de 1 mol/L/hora, 1 mmol/L/hora a 1 mol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, 25 mmol/L/hora a 75 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora a 750 mmol/L/hora, ou 450 mmol/L/hora a 550 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a taxa de evolução de dióxido de carbono é de cerca de 50 mmol/L/hora, 100 mmol/L/hora, 150 mmol/L/hora, 200 mmol/L/hora, 250 mmol/L/hora, 300 mmol/L/hora, 350 mmol/L/hora, 400 mmol/L/hora, 450 mmol/L/hora, ou cerca de 500 mmol/L/hora. Em algumas modalidades, a viabilidade celular com taxas de pulverização de gás reduzidas é reduzida a menos que cerca de qualquer dentre 1,75 vezes, 1,5 vezes, 1,25 vezes, 1 vez, 0,75 vezes, 0,5 vezes, ou 0,25 vezes. Em algumas modalidades, a viabiliade celular é reduzida a cerca de 2 vezes. Em algumas modalidades, a viabilidade celular com taxas de pulverização de gás reduzidas de uma célula expressando um RNA e/ou proteína da via do MVA e/ou via do DXP de uma ou mais cópias heterólogas e/ou em duplicata de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP é comparada com a de uma célula controle que não possui uma ou mais cópias heterólogas e/ou em duplicata de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP com taxas de pulverização de gás reduzidas. Em algumas moda
120/291 lidades, a viabilidade celular com taxas de pulverização de gás reduzidas de uma célula expressando um RNA e/ou proteína da via do MVA e/ou via do DXP de uma ou mais cópias heterólogas e/ou em duplicata de um ácido nucleico da via do MVA e/ou via do DXP sob o controle de um promotor induzível, em que o promotor está induzido, é comparada com a de uma célula controle contendo uma ou mais cópias heterólogas e/ou em duplicata de um ácido nucléico da via do MVA e/ou via do DXP sob o controle de um promotor induzível, em que o promotor não está induzido (não induzido) com taxas de pulverização de gás reduzidas. Em algumas modalidades, o promotor induzível é um promotor de beta-galactosidase.
Em algumas modalidades, a fermentação de um organismo hospedeiro geneticamente modificado que converte pelo menos 5% do carbono total consumido pelo organismo em um hidrocarboneto volátil, insaturado. Em algumas modalidades, a produção de um hidrocarboneto insaturado nessa taxa como para estar presente no gás de escape da fermentação em um nível de pelo menos cerca de 100 ug/L, 500 ug/L, 1000 ug/L, 2. 500 ug/L, 5.000 ug/L, 7.500 ug/L, ou 10.000 ug/L.
Em algumas modalidades, o hidrocarboneto insaturado é recuperado do fluxo de gás de escape de forma a estar adequado a altas taxas de produção, que correspondem à concentração no gás de escape de pelo menos cerca de qualquer dentreWO ug/L, 500 ug/L, 1000 ug/L, 2. 500 ug/L, 5.000 ug/L, 7.500 ug/L, ou 10.000 ug/L. Em algumas modalidades, a extração e recuperação contínuas de um hidrocarboneto insaturado a partir do gás de escape da fermentação em particular em baixas taxas de remoção de gás tal que o gás de escape resultante é enriquecido com o componente volátil de interesse. Em algumas modalidades, a recuperação do hidrocarboneto volátil por métodos que dependem de concentrações elevadas do volátil. Por exemplo, a captura eficiente do isopreno no gás de escape da fermentação através do uso de tecnologias de compressão/condensação ou destilação extrativa. Também é contemplado o uso de cartuchos de carbono ativado além de adsorventes de sílica-gel, dessorção e concentração de isopreno a partir de cartuchos de carbono e/ou construção e fermentação de
121/291 organismos hospedeiros como cepas de E. coli que podem converter cerca de 5% ou mais do substrato de glicose em isopreno e resulta em concentrações de gás de escape maiores que cerca de 15.000 ug/L de isopreno. Métodos de recuperação incluem quaisquer dos métodos descritos aqui.
Também são aqui fornecidos métodos para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L. Em algumas modalidades, o método compreende: a) a cultura de células sob condições adequadas para a produção do composto, em que é adicionado gás (como a adição de gás a um sistema como um sistema de fermentação) em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0,01 wm e cerca de 2 wm; e b) a produção do composto. Em uma modalidade, a taxa de pulverização gasosa é 0 wm. Em outra modalidade, a taxa de pulverização gasosa é 0 wm - 0,01 wm.
Em algumas modalidades, a quantidade do composto que se divide na massa celular não está incluída nos valores de solubilidade da fase líquida. Em algumas modalidades, a concentração da fase líquida está abaixo da solubilidade limite do composto.
Em algumas modalidades, os compostos podem ser continuamente recuperados do caldo de fermentação por arraste gasoso em taxas de pulverização de gás baixas, em particular aqueles compostos com coeficientes da lei de Henry de cerca de qualquer inferior a 250 M/atm, 200 M/atm, 150 M/atm, 100 M/atm, 75 M/atm, 50 M/atm, 25 M/atm, 10 M/atm, 5 M/atm, ou 1 M/atm. Exemplos incluem aldeídos tais como acetaldeído a 15 M/atm), cetonas como acetona (30 M/atm), metil etil cetona (100 M/atm), ou 2butanona (20 M/atm), ou alcoóis incluindo metanol (220 M/atm), etanol (200 M/atm), 1-butanol (120 m/atm) ou alcoóis C5 incluindo 3-metil-3-buten-1-ol, e 3-metil-2-buten-1-ol (50-100 M/atm). Ésteres de alcoóis geralmente têm constantes de Henry menores que os respectivos alcoóis, por exemplo, acetato de etila (6-9 M/atm) ou os acetil ésteres de alcoóis C5 (<5 M/atm). Compostos com coeficientes da lei de Henry inferiores a 1 M/atm são particular
122/291 mente desejáveis. Exemplos incluem hemiterpenos, monoterpenos ou sesquiterpenos, além de outros hidrocarbonetos como hidrocarbonetos C1 a C5 (por exemplo, metano, etano, etileno ou propileno). Em algumas modalidades, os hidrocarbonetos como hidrocarbonetos C1 a C5 são saturados, insaturados ou ramificados. Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a C5 é um hidrocarboneto alifático insaturado (por exemplo, etileno, propileno, butileno ou isobutileno). Em algumas modalidades, o hidrocarboneto C1 a C5 é uma oleofina.
Em geral, há uma correlação entre o coeficiente da lei de Henry e hidrossolubilidade em que compostos com coeficientes muito baixos são escassamente solúveis em água (consideravelmente insolúveis em água). Embora voláteis com solubilidades infinitas em água (por exemplo, acetona ou etanol) possam ser removidos por arraste gasoso, limites de solubilidade desejáveis são inferiores a cerca de qualquer dentre 100 g/L, 75 g/L, 50 g/L, 25 g/L, 10 g/L, 5 g/L, ou 1 g/L.
Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos para produzir quaisquer dos compostos aqui descritos, a taxa de pulverização de gás está entre cerca de qualquer dentre 0 vvm e 0,01 wm, 0,01 wm e 0,1 vvm, 0,1 vvm e 1 vvm, 0,2 vvm e 1 vvm, ou 0,5 wm e 1 vvm. Em algumas modalidades, a taxa de pulverização de gás é cerca de qualquer dentre 0,1 vvm, 0,25 wm, 0,5 vvm, 0,75 wm, 1 wm, 1,25 wm, 1,5 wm, 1,75 vvm, ou 2 vvm. Em algumas modalidades, as baixas taxas de pulverização são mantidas em todo o decurso de execução da fermentação, durante a fase de crescimento, ou durante a fase estacionária. Em algumas modalidades, as baixas taxas de pulverização são mantidas entre cerca de qualquer dentre 1 hora e 5 horas, 5 horas e 10 horas, 10 horas e 20 horas, 20 horas e 30 horas, 30 horas e 40 horas, 40 horas e 50 horas, ou 50 horas e 60 horas.
Quaisquer dos sistemas descritos aqui podem ser usados nos métodos para produzir um composto aqui descrito. O método padrão poderia ser usado para purificar tal como aqueles descritos na seção intitulada Exemplos de Métodos de Purificação Separados podem ser realizados após a recuperação, por exemplo, por técnicas de destilação ou adsorção
123/291 seletiva.
Produção Exemplar de Isopreno
Em algumas modalidades, as células são cultivadas em meio de cultura sob condições que permitem a produção de isopreno pelas células. Por produtividade absoluta de pico quer-se dizer a quantidade máxima absoluta de isopreno no gás de escape (pfí-gas) durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de produtividade absoluta de pico quer-se dizer o ponto de tempo durante uma execução de fermentação quando a quantidade absoluta do isopreno no gás de escape é máxima durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de produtividade absoluta de pico. Em algumas modalidades, a produtividade absoluta de pico para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
Por produtividade específica de pico quer-se dizer a quantidade máxima de isopreno produzida por células durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de produtividade específica de pico quer-se dizer o ponto de tempo durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular), quando a quantidade de isopreno produzida por célula está em um máximo. A produtividade específica é determinada pela divisão da produtividade total pela quantidade de células, como determinado pela densidade ótica em 600nm (OD600). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de produtividade específica de pico. Em algumas modalidades, a produtividade específica de pico para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno por células divulgadas aqui.
Por concentração de pico quer-se dizer a quantidade máxima
124/291 de isopreno produzida durante a cultura das células por um determinado período de tempo (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Por ponto de tempo de concentração de pico querse dizer o ponto de tempo durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular), quando a quantidade de isopreno produzido por célula está em um máximo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno é medida no ponto de tempo de concentração de pico. Em algumas modalidades, a concentração de pico para as células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
Por produtividade cumulativa total quer-se dizer a quantidade total, cumulativa de isopreno produzida durante a cultura das células por um período de tempo particular (por exemplo, a cultura de células durante uma execução de fermentação particular). Em algumas modalidades, a quantidade total, cumulativa de isopreno é medida. Em algumas modalidades, a produtividade total cumulativa nas células é sobre qualquer uma das quantidades de isopreno divulgadas aqui.
Por resposta relativa do detector quer-se dizer a razão entre a resposta do detector (como a área de GC/MS) para um composto (tal como isopreno) e a resposta do detector (tal como a área de GC/MS) de um ou mais compostos (como todos os hidrocarbonetos C5). A resposta do detector pode ser medida como descrito aqui, como pela análise de GC/MS realizada com o sistema Agilent 6890 GC/MS equipado com uma coluna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 pm; 0,25 pm de espessura de filme). Se desejado, a resposta relativa do detector pode ser convertida para uma percentagem de peso usando fatores de resposta para cada um dos compostos. Este fator de resposta é uma medida da quantidade de sinal que é gerado para um composto especial (ou seja, a sensibilidade do detector é para um composto particular). Este fator de resposta pode ser usado como um fator de correção para converter a resposta do detector para uma percentagem de peso quando o detector tem sensibilidades diferentes para os compostos que estão sendo comparados. Alternativamente, a percentagem de peso
125/291 pode ser aproximada ao assumir que os fatores de resposta são os mesmos para os compostos que estão sendo comparados. Assim, a percentagem de peso pode ser considerada como sendo aproximadamente a mesma que a da resposta relativa do detector.
Em algumas modalidades, as células em cultura produzem isopreno em quantidades maiores que, ou de cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, ou mais nmol do isopreno/grama de células para o peso úmido das células/hora (nmol/gwcm/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, cerca de 150 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, cerca de 500 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 300 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h.
A quantidade de unidades de isopreno em nmol/gwcm/h pode ser medida conforme divulgado na Patente US No. 5.849.970, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade, particularmente no que diz respeito à medição da produção de isopreno. Por exemplo, dois mL de headspace (por exemplo, headspace de uma cultura como a 2 mL da cultura cultivadas em frascos fechados a 32°C com agitação de 200 rpm, por aproximadamente 3 horas) são analisados para isopreno usando um sistema de cromatografia gasosa padrão, tais como um sistema operado isotermicamente (85°C) com uma coluna n-octano/porasil C (Alltech Associates, Inc., Deerfield, Illinois) e acoplados a urn detector de gás de redução de óxido de mercúrio RGD2 (Trace Analytical, Menlo Park, CA) (ver, por exemplo, Greenberg et al., Atmos. Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol 97:1588-1591 de 1991, sendo cada urn deles aqui incorporado por referên
X *
126/291 cia em sua totalidade, em particular, com relação a medição da produção de isopreno). As unidades de área de crornatografia gasosa são convertidas em nmol de isopreno por meio de uma curva de calibração de concentração padrão de isopreno. Em algumas modalidades, o valor para gramas de células por peso úmido das células é calculado pela obtenção do valor de A6oo para uma amostra da cultura de células e, em seguida, o valor A6oo é convertido para gramas de células com base em uma curva de calibração de peso úmido para as culturas de células com um valor A6oo conhecido. Em algumas modalidades, os gramas de células são estimados assumindo-se que um litro de caldo (incluindo o meio celular e células) com um valor de A6Oo de 1 tem um peso úmido de célula de 1 grama. O valor também é dividido pelo número de horas que a cultura foi incubada, tal como três horas.
Em algumas modalidades, as células em cultura produzem isopreno em quantidades maiores que, ou de cerca de 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 100.000, ou mais de ng de isopreno/g de células para o peso úmido das células/h (nmol/gwcm/h). Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, tal como entre cerca de 2 a cerca de 100 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 500 nmol/gwcm/h, cerca de 500 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 1.000 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 100 a cerca de 5.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 2.000 nmol/gwcm/h, cerca de 200 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, cerca de 300 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 nmol/gwcm/h. A quantidade de isopreno em nmol/gwcm/h pode ser calculada pela multiplicação do valor pela produção de isopreno nas unidades de nmol/gwcm/h discutidas acima de 68,1 (como descrito na Equação 5 abaixo).
Em algumas modalidades, as células em cultura produzem uma titulação cumulativa (total) de isopreno maior que, ou cerca de, 1,10, 25, 50,
127/291 <100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, ou mais de MG de isopreno/L de caldo (mg/Lcaldo, em que o volume de caldo inclui o volume das células e do meio celular). Em algumas modalidades, a quan5 tidade de isopreno está entre cerca de 2 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, tai como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg/Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 500 mg/Lcaldo, cerca de 500 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, cerca de 1000 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo, ou cerca de 2.000 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno está entre cerca de 20 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, cerca de 100 a cerca de 5.000 mg/Lcaldo, cerca de 200 a cerca de 2.000 mg/Lcaldo, cerca de 200 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, cerca de 300 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo, ou cerca de 400 a cerca de 1.000 mg/Lcaldo.
A produtividade específica de isopreno em mg de isopreno/L de headspace do frasco agitado ou culturas semelhantes pode ser medida tomando uma amostra de 1 ml da cultura de células em um valor de OD60o de aproximadamente 1,0, colocando-a em um frasco de 20 ml, incubando por 30 minutos e, em seguida medindo a quantidade de isopreno no headspace (como descrito, por exemplo, no exemplo 1, parte II). Se o valor da OD60o 20 não for 1,0, então a medida pode ser normalizada para um valor de OD600
1,0 pela divisão do valor da Οϋθοο- O valor do mg de isopreno/L de headspace pode ser convertido para mg/Lcaldo/h/OD6oo de cultura de caldo pela multiplicação por um fator de 38. O valor em unidades de mg/Lcaldo/h/OD6oo pode ser multiplicado pelo número de horas e o valor de OD600 para obter a 25 titulação cumulativa em unidades de mg de isopreno/L de caldo.
A taxa de produção de isopreno instantânea em mg/Lcaido/h em um fermentador pode ser medida tomando uma amostra do fermentador de gases de exaustão, analisando a mesma para a quantidade de isopreno (em unidades tais como mg de isopreno por Lgas), como descrito, por exemplo, 30 no exemplo 1, parte II e multiplicando este valor pela taxa que o gás de escape é passado para cada litro de caldo (por exemplo, em 1 wm (volume de ar/volume de caldo/minuto), isto é, de 60 Lgas por hora). Assim, um nível de
128/291 gases de gás de escape de 1 mg/Lgas corresponde a uma taxa de produção instantânea de 60 mg/Lcaldo/h em fluxo de ar de 1 wm. Se desejar, o valor das unidades de mg/Lcaido/h pode ser dividido pelo valor OD6oo para obter a taxa específica em unidades de mg/Lcaid0/h/OD. O valor médio de mg de isopreno/Lgás pode ser convertido para a produtividade total do produto (gramas de isopreno por litro de caldo de fermentação, mg/Lcaldo) pela multiplicação desta concentração média de isopreno do gás de escape pela quantidade total de gás de escape injetado por litro de caldo de fermentação durante a fermentação. Assim, uma concentração média de isopreno de gás de escape de 0,5 mg/Lcaido/h durante 10 horas a 1 vvm corresponde a uma concentração total do produto de 300 mg de isopreno Lcaido·
Em algumas modalidades, as células em cultura convertem mais que, ou cerca de, 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% de carbono no meio de cultura de células em isopreno. Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono em isopreno está entre cerca de 0,002 a cerca de 4,0%, cerca de 0,002 a cerca de 3,0%, cerca de 0,002 a cerca de 2,0%, cerca de 0,002 a cerca de 1,6%, cerca de 0,002 a cerca de 0,005%, cerca de 0,005 a cerca de 0,01%, cerca de 0,01 a cerca de 0,05%, cerca de 0,05 a cerca de 0,15%, 0,15 a cerca de 0,2%, cerca de 0,2 a cerca de 0,3%, cerca de 0,3 a cerca de 0,5%, cerca de 0,5 a cerca de 0,8%, cerca de 0,8 a cerca de 1,0%, ou cerca de 1,0 a cerca de 1,6%. Em algumas modalidades, a conversão percentual de carbono em isopreno está entre cerca de 0,002 a cerca de 0,4%, de 0,002 a cerca de 0,16%, 0,04 a cerca de 0,16%, cerca de 0,005 a cerca de 0,3%, cerca de 0,01 a cerca de 0,3%, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,3%.
A conversão percentual de carbono em isopreno (também referida como % do rendimento do carbono) pode ser medida pela divisão dos rnols de carbono no isopreno produzidos por mois de carbono na fonte de carbono (tal como os mois de carbono no lote e glicose alimentada e extrato de levedura). Este número é multiplicado por 100% para dar um valor percentual (conforme indicado na Equação 1).
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Equação 1 % de rendimento de carbono = (mols de carbono no isopreno produzido)/(mols de carbono na fonte de carbono) * 100
Para este cálculo, pode-se assumir que o extrato de levedura contém 50% p/p de carbono. Como um exemplo, para os 500 litros descritos no Exemplo 7, parte VIII, a conversão percentual de carbono em isopreno pode ser calculada como mostrado na Equação 2.
Equação 2 % de rendimento de carbono = (39,1 g de isopreno * 1/68,1mol/g * 5C/mol)/[(181.221 g de glicose * 1/180 mol/g * 6C/mol) + (17.780 g de extrato de levedura * 0,5/12 mol/g)] * 100 = 0,042%
Para as duas fermentações de 500 litros descritas aqui (Exemplo 7, partes VII e VIII), a conversão percentual de carbono em isopreno está entre 0,04-0,06%. Um rendimento de 0,11-0,16% de carbono foi alcançado usando sistemas de 14 litros, conforme descrito neste documento. O exemplo 11, parte V descreve a conversão de 1,53% de carbono para isopreno usando os métodos descritos neste documento.
Um técnico no assunto pode facilmente converter a taxa de produção de isopreno ou a quantidade de isopreno produzido em outras unidades. As equações exemplares estão listadas abaixo para a interconversão entre as unidades.
Unidades para a Taxa de produção de isopreno (total e específica) Equação 3 g de isopreno/Lcaido/h = 14,7 isopreno mmol de isopreno/Lcaido/h (taxa volumétrica total)
Equação 4 nmol de isopreno/gwcm/h = 1 nmol de isopreno/Uaido/h/ODeoo (Esta conversão pressupõe que um litro de caldo com um valor de OD600 de 1 tem um peso úmido de célula de 1 grama).
Equação 5 nmol de isopreno/gwcm/h = 68,1 ng de isopreno/gwcm/h (dado o peso molecular de isopreno)
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Equação 6 nmol de isopreno /Lgás O2/h = 90 nmol de isopreno/Lcaido/h (a uma taxa de fluxo de O2 de 90 L/h por L de caldo de cultura)
Equação 7 ug de isopreno/Lgas de isopreno em gás de escape = 60 ug de isopreno/Lcaido/h, com uma taxa de fluxo de 60 Lgas por Lcaido (1 vvm) Unidades para titulação (total e específica)
Equação 8 nmol de isopreno/mg de proteína celular = 150 nmol de isopreno/Lcaido/ODeoo (Esta conversão pressupõe que um litro de caldo com um valor de OD6oo de 1 tem uma proteína celular total de aproximadamente 150 mg) (produtividade específica)
Equação 9 g de isopreno/Lcaido = 14,7 mmol de isopreno/Lcaido (titulação total)
Se desejado, a Equação 10 pode ser usada para converter qualquer uma das unidades que incluem o peso úmido das células para as unidades correspondentes, que incluem o peso seco das células.
Equação 10
Peso seco de células = (peso úmido das células)/3,3
Se desejado, a Equação 11 pode ser usada para conversão entre unidades de ppm e ug/L. Em particular, ppm significa partes por milhão definido em termos de ug/g (p/p). As concentrações de gases também podem ser expressas em uma base volumétrica usando ppmv (partes por milhão por volume), definida em termos de uL/L (v/v). A conversão de ug/L para ppm (por exemplo, ug de analito por g de gás) pode ser realizada pela determinação da massa por L de gás de escape (ou seja, a densidade do gás). Por exemplo, um litro de ar em condições normais de temperatura e pressão (CNTP; 101,3 kPa (1 bar) e 0°C (273,15K)) tem uma densidade de aproximadamente 1,29 g/L. Assim, uma concentração de 1 ppm (ug/g) é igual a 1,29 ug/L na CNTP (equação 11). A conversão de ppm (ug/g) ug/L é uma função tanto da pressão, temperatura como da composição global do
131/291 gas de escape.
Equação 11 ppm (ug/g) é igual a 1,29 ug/L em condições normais de temperatura e pressão (CNTP; 101,3 kPa (1 bar) e 0°C (273,15K)).
A conversão de ug/L para ppmv (por exemplo, um uL do analito por L de gás) pode ser realizada usando a Lei do Gás Universal (equação 12). Por exemplo, uma concentração de gás de escape de 1000 ug/Lgás corresponde a 14,7 umol/Lgás. A constante universal dos gases é 0,082057 L.atm K-1mol-1, então usando a equação 12, o volume ocupado por 14,7 umol de HG na CNTP é igual a 0,329 mL. Portanto, a concentração de 1000 ug/L de HG é igual a 329 ppmv ou 0,0329% (v/v) na CNTP.
Equação 12
PV = nRT, em que P é a pressão, V é o volume, n mois de gás, R é a constante universal dos gases e T é a temperatura em Kelvin.
A quantidade de impurezas em composições de isopreno é normalmente medida aqui em peso por volume (p/v) com base em unidades como ug/L. Se desejado, as medidas em unidades de ug/L podem ser convertidas em unidades de mg/m3 através da equação 13.
Equação 13 ug/L = 1 mg/m3
Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula que compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase produz uma quantidade de isopreno que é de pelo menos ou cerca de, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzido a partir de uma célula correspondente crescida essencialmente sob as mesmas condições, sem o ácido nucléico heterólogo que codifica o polipeptídeo do isopreno sintase.
Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula que compreende um ácido nucléico heterólogo que codifica um polipeptídeo de isopreno sintase e um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo de DXS, IDI, e/ou via do MVA produzem uma quanti
132/291 dade de isopreno que é pelo menos, ou cerca de 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 150 vezes, 200 vezes, 400 vezes, ou maior que a quantidade de isopreno produzido a partir de uma célula cultivada correspondente sob as mesmas condições, sem os ácidos nucleicos heterólogos.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende mais que, ou cerca de, 99,90, 99,92, 99,94, 99,96, 99,98, ou 100% de isopreno, em peso, em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos 05 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta relativa de detector maior que, ou de cerca de, 99,90, 99,91, 99,92, 99,93, 99,94, 99,95, 99,96, 99,97, 99,98, 99,99, ou 100% de isopreno em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 99,90 a cerca de 99,92, cerca de 99,92 a cerca de 99,94, cerca de 99,94 a cerca de 99,96, cerca de 99,96 a cerca de 99,98, cerca de 99,98 a 100% de isopreno em peso em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno (tal como 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, c/s-1,3pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, pent-4eno-1-ino, trans-pent-3-eno-1-ino, c/s-pent-3-eno-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol)), em peso, em relação ao peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta do detector de menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% de hidrocarbonetos C5 além de isopreno em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição tem uma resposta relativa do detector de menos que, ou cerca de, 0,12, 0,10, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02, 0,01, 0,005,
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0,001, 0,0005, 0,0001, 0,00005, ou 0,00001% para 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, cis-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, frans-pent-3~eno-1-ino, c/s-pent3-eno-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol) em comparação com a resposta do detector para todos os hidrocarbonetos C5 na composição. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,02 a 0,04%, cerca de 0,04 a cerca de 0,06%, cerca de 0,06 a 0,08%, cerca de 0,08 a 0,10%, ou cerca de 0,10 a cerca de 0,12% de hidrocarbonetos C5 diferentes de isopreno (tal como, 1,3-ciclopentadieno, trans-1,3-pentadieno, cis-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1-pentino, 2pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, frans-pent-3-eno-1-ino, c/s-pent3-eno-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol), em peso, em comparação com o peso total de todos os hidrocarbonetos C5 na composição.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que iniba a polimerização de isopreno . Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, tal como cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,01 a cerca de 5, cerca de 0,01 a cerca de 1, cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 ug/L de um composto que inibe a polimerização de isopreno para qualquer composto na composição que iniba a polimerização de isopreno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ug/L de um hidrocarboneto diferente de isopreno (como 1,3ciclopentadieno, (rans-1,3-pentadieno, c/s-1,3-pentadieno, 1,4-pentadieno, 1pentino, 2-pentino, 3-metil-1-butino, pent-4-eno-1-ino, frans-pent-3-eno-1-ino, c/s-pent-3-eno-1-ino, 3-hexen-1-ol, acetato de 3-hexen-1-ila, limoneno, geraniol (trans-3,7-dimetil-2,6-octadien-1-ol) e citronelol (3,7-dimetil-6-octen-1-ol).
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Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0,005 a cerca de 50, como cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,01 a cerca de 5, cerca de 0,01 a cerca de 1, cerca de 0,01 a cerca de 0,5, ou cerca de 0,01 a cerca de 0,005 ug/L de um hidrocarboneto diferente de isopreno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ug/L de uma proteína ou ácido graxo (estando essa proteína ou ácido graxo naturalmente associado com borracha natural).
Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 10, 5, 1, 0,8, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de alfa acetilenos, piperilenos, acetonitrilo, ou 1,3-ciclopentadieno. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de enxofre ou alenos. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 30, 20, 15, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de todos acetilenos (tais como pentino-1, butino-2, 2MB1-3ino, e 1-pentino-4ino). Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende menos ou cerca de 2000, 1000, 500, 200, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, ou 0,005 ppm de dímeros de isopreno, tais como dímeros cíclicos do isopreno (por exemplo, compostos derivados C10 cíclicos da dimerização de duas unidades de isopreno).
Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui etanol, acetona, um álcool de prenila C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3metil-2-buten-1-ol), ou por dois ou mais dos elementos anteriores. Em modalidades específicas, a composição de isopreno compreende maior que ou cerca de 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80, 100, ou 120 ug/L de etanol, acetona, a C5 álcool de prenila (tal como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol), ou por dois ou mais dos elementos anteriores. Em algumas modalidades, a composição de isopreno compreende entre cerca de 0.005 a cerca de 120, tal como cerca de 0.01 a cerca de 80, cerca de 0.01 a cerca de 60, cerca de 0.01 a cerca de 40, cerca de 0.01 a cerca de 30, cerca de 0.01 a cerca de 20, cerca de 0.01 a cerca de 10, cerca de 0.1 a
135/291 cerca de 80, cerca de 0.1 a cerca de 60, cerca de 0.1 a cerca de 40, cerca de 5 a cerca de 80, cerca de 5 a cerca de 60, ou cerca de 5 a cerca de 40 ug/L de etanol, acetona, a C5 álcool de prenila, ou por dois ou mais dos elementos anteriores.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais dos seguintes componentes: 2-heptanona, 6-metil-5-hepten-2-ona, 2,4,5-trimetilpiridina, 2,3,5-trimetilpirazina, citronelal, acetaldeido, metanotiol, acetato de metila, 1-propanol, diacetila, 2-butanona, 2-metil-3-buten-2-ol, acetato de etila, 2-metil-1 -propanol, 3-metil-1 -butanal, 3-metil-2-butanona, 1butanol, 2-pentanona, 3-metil-1 -butanol, isobutirato de etila, 3-metil-2butenal, acetato de butila, acetato de 3-metilbutila, acetato de 3-metil-3buten-1-ila, acetato de 3-metil-2-buten-1-ila, (E)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, (Z)-3,7-dimetil-1,3,6-octatrieno, 2,3-cicloheptenolpiridina, ou um polímero isopreno linear (tal como um dímero isopreno linear ou um trimero de isopreno linear derivado da polimerização de múltiplas unidades de isopreno). Em diversas modalidades, a quantidade de um destes componentes relativo à quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (ou seja, peso dos componentes dividido pelo peso do isopreno multiplicado por 100) é maior do que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110% (p/p). Em algumas modalidades, a resposta do detector relativo ao segundo composto em comparação com a resposta do detector de isopreno é maior do que ou cerca de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou 110%. Em diversas modalidades, a quantidade de um destes componentes relativo à quantidade de isopreno em unidades de porcentagem por peso (ou seja, peso dos componentes dividido pelo peso do isopreno multiplicado por 100) está entre cerca de 0,01 a cerca de 105% (p/p), tal como cerca de 0,01 a cerca de 90, cerca de 0,01 a cerca de 80, cerca de 0,01 a cerca de 50, cerca de 0,01 a cerca de 20, cerca de 0,01 a cerca de 10, cerca de 0,02 a cerca de 50, cerca de 0,05 a cerca de 50, cerca de 0,1 a cerca de 50, ou 0,1 a cerca de 20% (p/p).
Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui um ou mais dos seguintes: um álcool, um aldeído, ou uma cetona (tais como
136/291 quaisquer alcoóis, aldeídos, ou cetonas, descritos neste documento). Em algumas modalidades, a composição de isopreno inclui (i) um álcool e um aldeído, (ii) um álcool e uma cetona, (iii) um aldeído e uma cetona, ou (iv) um álcool, um aldeído, e uma cetona.
Em algumas modalidades, a composição de isopreno contém um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1butanol, 3-metil-1 -propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1butanol, ou indol. Em algumas modalidades, a composição de isopreno contem 1 ppm ou mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2butanona, 2-metil-1 -butanol, ou indol. Em algumas modalidades, a concentração de mais de um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2-metil-1 -butanol, ou indol, está entre cerca de 1 a cerca de 10,000 ppm em uma composição de isopreno (como gás de escape antes que este seja purificado). Em algumas modalidades, a composição de isopreno (como gás de escape após este ter sido submetido a uma ou mais etapas de purificação) inclui um ou mais dos seguintes: metanol, acetaldeído, etanol, metanotiol, 1-butanol, 3-metil-1-propanol, acetona, ácido acético, 2-butanona, 2metil-1-butanol, ou indol, a uma concentração entre cerca de 1 a cerca de 100 ppm, tal como cerca de 1 a cerca de 10 ppm, cerca de 10 a cerca de 20 ppm, cerca de 20 a cerca de 30 ppm, cerca de 30 a cerca de 40 ppm, cerca de 40 a cerca de 50 ppm, cerca de 50 a cerca de 60 ppm, cerca de 60 a cerca de 70 ppm, cerca de 70 a cerca de 80 ppm, cerca de 80 a cerca de 90 ppm, ou cerca de 90 a cerca de 100 ppm. Compostos orgânicos voláteis de culturas de células (tais como compostos orgânicos voláteis no headspace das culturas de células) podem ser analisados usando métodos padronizados tais como estes descritos neste documento ou outros métodos padronizados, tais como espectrometria de massa de reação de transferência de prótons (ver, por exemplo, Bunge et al., Applied e Environmental Microbiology, 74(7):2179-2186, 2008 que é aqui incorporado por referência em sua totalidade, relativo particularmente à análise de compostos orgânicos volá137/291 teis).
Em algumas modalidades, a composição compreende mais que cerca de 2 mg de isopreno, tal como maior que ou cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, ou 1000 mg de isopreno. Em algumas modalidades, a composição compreende maior que ou cerca de 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g de isopreno. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição está entre cerca de 2 a cerca de 5,000 mg, como entre cerca de 2 a cerca de 100 mg, cerca de 100 a cerca de 500 mg, cerca de 500 a cerca de 1,000 mg, cerca de 1,000 a cerca de 2,000 mg, ou cerca de 2,000 a cerca de 5,000 mg. Em algumas modalidades, a quantidade de isopreno na composição está entre cerca de 20 a cerca de 5,000 mg, cerca de 100 a cerca de 5,000 mg, cerca de 200 a cerca de 2,000 mg, cerca de 200 a cerca de 1,000 mg, cerca de 300 a cerca de 1,000 mg, ou cerca de 400 a cerca de 1,000 mg. Em algumas modalidades, maior que ou cerca de 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, ou 95% por peso da fração orgânica volátil da composição é isopreno.
Em algumas modalidades, a composição inclui etanol. Em algumas modalidades, a composição inclui entre cerca de 75 a cerca de 90% por peso de etanol, tal como entre cerca de 75 a cerca de 80%, cerca de 80 a cerca de 85%, ou cerca de 85 a cerca de 90% por peso de etanol. Em algumas modalidades nas quais a composição inclui etanol, a composição também inclui entre cerca de 4 a cerca de 15% por peso de isopreno, tal como entre cerca de 4 a cerca de 8%, cerca de 8 a cerca de 12%, ou cerca de 12 a cerca de 15% por peso de isopreno.
Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ou mais ácidos nucleicos heterólogos que codificam um polipeptídeo de isopreno sintase, polipeptídeo DXS, polipeptídeo IDI, e/ou polipeptídeo da via do MVA produz uma quantidade de um composto isoprenoide (tal como um composto com 10 ou mais átomos de carbono que é formado a partir da reação de uma ou mais moléculas de IPP com as moléculas de um ou mais DMAPP) que é maior do que ou cerca de 2-vezes, 3vezes, 5-vezes, 10-vezes, 25-vezes, 50-vezes, 100-vezes, 150-vezes, 200
138/291 vezes, 400-vezes, ou maior que a quantidade do composto isoprenoide produzido a partir de uma célula correspondente cultivada sob as mesmas condições, sem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos. Em algumas modalidades abrangidas pela invenção, uma célula compreendendo um ou mais ácidos nucleicos heterólogos codificando um polipeptídeo de isopreno sintase, polipeptídeo DXS, polipeptídeo IDI, e/ou polipeptídeo da via do MVA produz uma quantidade de um álcool prenílico C5 (tal como 3-metil-3-buten-1-ol ou 3-metil-2-buten-1-ol) que é maior do que ou cerca de 2-vezes, 3-vezes, 5vezes, 10-vezes, 25-vezes, 50-vezes, 100-vezes, 150-vezes, 200-vezes, 400-vezes, ou maior que a quantidade de álcool prenílico C5 produzido a partir da célula correspondente cultivada sob essencialmente as mesmas condições, sem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos.
Métodos de Purificação de Isopreno Exemplares
Em algumas modalidades, quaisquer dos métodos descritos neste documento incluem ainda a recuperação do composto. Em algumas modalidades, quaisquer dos métodos descritos neste documento incluem ainda a recuperação de isopreno. Embora os exemplos de métodos de purificação abaixo se refiram ao isopreno, qualquer composto aqui divulgado pode ser purificado pelos métodos discutidos abaixo.
O isopreno produzido a partir das composições e métodos da invenção pode ser recuperado usando técnicas padronizadas, como a arraste gasoso, a separação de membrana reforçada, fracionamento, adsorção/dessorção, pervaporação, dessorção térmica ou a vácuo de isopreno a partir de uma fase sólida, ou na extração de isopreno imobilizado ou absorvido a uma fase sólida, com um solvente (ver, por exemplo, Patentes US NoS 4.703.007 e 4.570.029, que são, cada uma, incorporadas por referência em suas totalidades, particularmente com relação à recuperação de isopreno e métodos de purificação). Em modalidades específicas, destilação extrativa com um álcool (como etanol, metanol, propanol, ou uma combinação dos mesmos) é usada para recuperar o isopreno. Em algumas modalidades, a recuperação de isopreno envolve o isolamento de isopreno na forma líquida (como uma solução pura de isopreno ou uma solução de isopreno em um
139/291 solvente). Remoção gasosa envolve a remoção de vapor de isopreno a partir da fermentação do fluxo de gás de escape de forma contínua. Essa operação pode ser alcançada de diversas maneiras, incluindo, mas não limitado a, adsorção para uma fase sólida, a partição em uma fase líquida, ou condensação direta (como condensação devido à exposição a uma bobina de condensação ou não a um aumento da pressão). Em algumas modalidades, enriquecimento de membrana de uma corrente de vapor de isopreno diluído acima do ponto de orvalho do vapor resultante da condensação de isopreno líquido. Em algumas modalidades, o isopreno é comprimido e condensado.
A recuperação de isopreno pode envolver uma etapa ou várias etapas. Em algumas modalidades, a remoção de vapor de isopreno a partir da fermentação de efluentes gasosos e a conversão de isopreno de uma fase líquida são realizadas simultaneamente. Por exemplo, isopreno pode ser diretamente condensado do fluxo de gás de escape para formar um líquido. Em algumas modalidades, a remoção de vapor de isopreno a partir da fermentação de efluentes gasosos e a conversão de isopreno para uma fase líquida, são realizadas sequencialmente. Por exemplo, isopreno pode ser adsorvido por uma fase sólida e, em seguida, extraído da fase sólida, com um solvente.
Em algumas modalidades, quaisquer dos métodos descritos neste documento incluem ainda purificação do isopreno. Por exemplo, o isopreno produzido a partir das composições e métodos da invenção pode ser purificado por técnicas convencionais. Purificação se refere a um processo através do qual isopreno é separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é obtido como um líquido substancialmente puro. Exemplos de métodos de purificação incluem: (i) destilação de uma solução em um extrator líquido e (ii) cromatografia. Como usado aqui, isopreno purificado significa isopreno que foi separado de um ou mais componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em algumas modalidades, o isopreno é de, pelo menos, cerca de 20%, por peso, livre de outros componentes que estão presentes quando o isopreno é produzido. Em diversas modalidades, o iso
140/291 preno é de, pelo menos, ou cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, ou 99%, por peso, puro. Pureza pode ser analisada por qualquer método apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, análise HPLC, ou análise de GC-MS.
Em algumas modalidades, pelo menos uma parte da fase gasosa remanescente após uma ou mais etapas de recuperação para a remoção de isopreno é reciclada através da introdução da fase gasosa em um sistema de cultura celular (como um fermentador) para a produção de isopreno.
Em algumas modalidades, quaisquer dos métodos descritos neste documento incluem ainda polimerização do isopreno. Por exemplo, os métodos padrão podem ser usados para polimerizar o isopreno purificado para formar cis-poli-isopreno ou outros produtos de fluxo para baixo, usando métodos padrão. Assim, a invenção também apresenta um pneu compreendendo poli-isopreno, como cis-1,4-poli-isopreno e/ou trans-1,4-poli-isopreno feito a partir de qualquer uma das composições de isoprenos divulgadas neste documento.
Exemplos
Os exemplos, os quais se destinam a ser puramente exemplares da invenção e não devem ser considerados para limitar a invenção de forma alguma, também descrevem e detalham os aspectos e modalidades da invenção discutido acima. Salvo indicação em contrário, a temperatura está em graus centígrados e pressão é ou está próxima à atmosférica. Os exemplos anteriores e descrição detalhada são oferecidos a título de ilustração e não por meio de limitação. Todas as publicações, pedidos de patentes e patentes citadas neste relatório descritivo estão aqui incorporados por referência, como se cada publicação individual, pedido ou pedidos de patente fossem especificamente e individualmente indicada para ser incorporados por referência. Em particular, todas as publicações citadas neste documento são expressamente aqui incorporadas por referência com o objetivo de descrever e divulgar composições e metodologias que possam ser utilizadas em conexão com a invenção. Embora a invenção anterior esteja descrita em detalhes por meio de ilustração e exemplo, para fins de clareza de entendí
141/291 mento, será prontamente aparente para aqueles com habilidade comum na récnica, à luz dos ensinamentos da presente invenção que determinadas alterações e modificações podem ser feitas, sem se afastar do espírito ou o alcance das reivindicações anexado.
Exemplo 1: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
I. Construção de vetores para expressão de isopreno sintase de kudzu em E. coli
A sequência da proteína para o gene da isopreno sintase de kudzu (Pueraria montana) (IspS) foi obtida a partir do GenBank (AAQ84170). Um gene de isopreno sintase kudzu, otimizado para uso do códon em E. coli, foi comprado de DNA2.0 (SEQ ID N°:1). O gene da isopreno sintase foi removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição BspLUI ll/Psfl, gel purificado, e ligado em pTrcHis2B (Invitrogen) que tinham sido digeridos com NcoVPstt. O construto foi projetado de tal forma que o códon no gene da isopreno sintase 5' para o sítio de Pstl. Como resultado, quando o construto foi expresso o marcador His não está ligado à proteína de isopreno sintase. O plasmídeo resultante, pTrcKudzu, foi verificado por sequenciamento (figuras 2 e 3).
O gene da isopreno sintase também foi clonado em pET16b (Novagen). Neste caso, o gene da isopreno sintase é inserido em pET16b de tal forma que a proteína de isopreno sintase recombinante continha o marcador His N-terminal. O gene da isopreno sintase foi amplificado a partir de pTrcKudzu por PCR usando o conjunto de iniciadores pET-His-Kudzu-2F: 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID N°: 3) e pET-His-Kudzu-R: 5'-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAG CTG (SEQ ID N°: 4). Estes iniciadores adicionaram um sítio de Λ/del na extremidade 5' e um sítio de Ban?H1 na extremidade 3' do gene respectivamente. O pTrcKudzu plasmídeo, acima descrito, foi utilizado como DNA molde, a polimerase Herculase (Stratagene) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante e os iniciadores foram adicionados a uma concentração de 10 pMols. A PCR foi realizada em um volume total de 25 μΙ. O produ
142/291 to da PCR foi digerido com NdeVBamW e clonado em pET16b digerido com as mesmas enzimas. A mistura de ligação foi transformada em E. coli Top10 (Invitrogen) e o clone correto selecionado por sequenciamento. O plasmídeo resultante, em que o gene isopreno sintase de kudzu foi expresso a partir do promotor T7, foi designado pETNHisKudzu (figuras 4 e 5).
O gene de isopreno sintase de kudzu também foi clonado no plasmídeo de baixo número de cópias pCL1920. Os iniciadores foram usados para amplificar o gene da isopreno sintase de kudzu de pTrcKudzu descrito acima. O iniciador anterior adiciona um sítio de /7/ndlll e uma RBS consenso E. coli para uma extremidade 5'. O sítio de clonagem Pstl já está presente em pTrcKudzu apenas 3' do códon de parada para que o iniciador reverso seja construído de tal forma que o produto da PCR final inclua o sítio de Pstl. As sequências dos iniciadores são: Hindlll-RBS-Kudzu F: 5-CATAT GAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID N°: 6) e BamH1 -Kudzu R: 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAG CTG (SEQ ID N°: 4). O produto de PCR é amplificado com a polimerase Herculase com iniciadores a uma concentração de 10 pmol e com 1 ng de DNA molde (pTrcKudzu). O protocolo de amplificação inclui 30 ciclos (95°C por 1 minuto, 60°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos). O produto é digerido com Hindlll e Pstl e ligado em pCL1920 que também foi digerido com Hindlll e Pstl. A mistura de ligação é transformada em E. coli Top10. Vários transformantes são verificados pelo sequenciamento. O plasmídeo resultante é designado PCL-lac-Kudzu (figuras 6 e 7).
II. Determinação de produção de isopreno
Para as culturas em frasco agitado, um mL de uma cultura é transferido de frascos agitados para frascos de headspace CTC de 20 mL ( frasco Agilent cat# 5188 2753; cap cat# 5188 2759). A tampa é rosqueada firmemente, e os frascos incubados à temperatura equivalente com agitação a 250 rpm. Após 30 minutos, os frascos são retirados da incubadora e analisados conforme descrito abaixo (ver Tabela 1 para alguns valores experimentais obtidos neste ensaio).
Nos casos em que a produção de isopreno no fermentador é
143/291 determinada, as amostras são tomadas a partir do gás de escape do fermentador e analisadas diretamente, como descrito abaixo (ver Tabela 2 para alguns valores experimentais obtidos neste ensaio).
A análise é realizada utilizando um sistema Agilent 6890 GC/MS em interface com um amostrador automático CTC Analytics (Switzerland) CombiPAL operando no modo headspace. Uma coluna CG Agilent HP-5 MS GC/MS (30 mx 0,25 mm; 0,25 espessura de filme) é usada para a separação dos analitos. O amostrador é configurado para injetar 500 pl_ de gás no headspace. O método GC/MS utiliza o hélio como gás de arraste a uma vazão de 1 ml/min. A porta de injeção é realizada a 250°C, com uma razão de separação de 50:1. A temperatura do forno é mantida a 37°C para a duração de 2 minutos da análise. O detector seletivo de massas Agilent 5793N é executado no monitoramento de íons simples (modo SIM) em m/z 67. O detector é desligado 1,4-1,7 minutos para permitir a eluição de gases de efeito permanente. Sob estas condições, observa-se que o isopreno (2-metil1,3-butadieno) é eluído em 1,78 minutos. A tabela de calibração é utilizada para quantificar a quantidade absoluta de isopreno e é encontrada para ser linear a partir de 1 pg/L a 2000 pg/L. O limite de detecção é estimado em 50 a 100 ng/L usando este método
III. Produção de isopreno em frascos de agitação contendo células de E. coli expressando isopreno sintase recombinante
Os vetores descritos acima são introduzidos em E. coli cepa BL21 (Novagen) para produzir cepas BL21/ptrcKudzu, BL21/pCL-lac-Kudzu e BL21/pETHisKudzu. As cepas são distribuídas para o isolamento em LA (ágar Luria) carbenicilina + (50 mg/ml) e incubadas durante a noite a 37°C. Colônias individuais são inoculadas em frascos aletados de 250 ml agitados contendo 20 ml de caldo Luria Bertani (LB) e carbenicilina (100 mcg/ml). As culturas são cultivadas durante a noite a 20°C com agitação de 200 rpm. A OD60o das culturas durante a noite é medida e as culturas são diluídas em frascos aletados de 250 ml agitados contendo 30 ml de MagicMedia (Invitrogen) + carbenicilina (100 mcg/ml) para uma OD6oo ~ 0,05. A cultura é incubada a 30°C com agitação de 200 rpm. Quando a OD600 ~ 0,5-0,8, 400 mM
144/291 de IPTG são adicionados e as células são incubadas por mais 6 horas a 30°C com agitação de 200 rpm. As 0, 2, 4 e 6 horas após a indução com IPTG, 1 ml de alíquotas das culturas é coletado, a OD6oo é determinada e a quantidade de isopreno produzido é medida conforme é descrito acima. Os resultados são mostrados na figura 8.
IV. Produção de Isopreno a partir de BL21/ptrcKudzu em fermentação de 14 litros
A produção em larga escala de isopreno de E. coli recombinante contendo o gene de isopreno sintase de kudzu é determinada a partir de uma cultura em batelada alimentada. A receita para os meios de fermentação (TM2) por litro de meio de fermentação é a seguinte: K2HPO4 13,6 g, KH2PO4 13,6 g, MgSO4 * 7H2O 2 g, ácido cítrico mono-hidratado 2 g, citrato de amônia férrico 0,3 g, (NH4)2SO4 3,2 g, extrato de levedura 5 g, Solução de Metal Traço Modificada 1000X 1ml. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diF^O. O pH é ajustado para 6,8 com hidróxido de potássio (KOH) e q.s. para volume. O produto final é esterilizado por filtração com filtro 0,22 μ (somente, não esterilizado em autoclave).A receita para Solução de Metal Traço Modificada 1000X é como se segue: ácido cítrico * H2O 40 g, MnSO4 * H2O 30 g, NaCl 10 g, FeSO4 * 7H2O 1 g, CoCI2 * 6H2O 1 g, ZnSO4 * 7H2O 1 g, CuSO4 * 5H2O 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMoO4 * 2H2O 100 mg. Cada componente é dissolvido um de cada vez em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então q.s. para volume e esterilizado com filtro de 0,22 μ.
Este experimento é realizado em biorreator de 14 L para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose na fermentação desejada, pH 6,7 e temperatura de 34°C. O inóculo de E. coli estirpe BL21/ptrcKudzu tirado de um frasco congelado é preparado em meio de peptona de soja-extrato de levedura-e glicose. Após o crescimento inóculo para OD550 = 0,6, dois frascos de 600 ml foram centrifugados, o conteúdo ressuspenso em 70 ml de sobrenadante para transferir o pélete celular (70 ml de material OD 3,1) para o biorreator. Por várias vezes após a inoculação, as amostras são retiradas e a quantidade de isopreno produzido é determinada como descrito acima. Os resultados são mostrados na figura 9.
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Exemplo 2: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de álamo recombinante
A sequência da proteína para a isopreno sintase de álamo (Populus alba x Populus tremula) (Schnitzler, JP, et al. (2005) Planta 222:777786) é obtida a partir do GenBank (CAC35696). Um gene com códon otimizado para E. coli, é comprado de DNA2.0 (p9796-álamo, figuras 30 e 31). O gene da isopreno sintase é removido do plasmídeo fornecido por digestão com endonuclease de restrição BspLU11l/Pstl, purificado em gel e ligado em pTrcHis2B que havia sido digerido com Ncol/Pstl. O construto é clonado tal que o códon de parada em que a inserção é antes do sítio Pstl, que resulta em um construto em que o marcador His não estiver ligado à proteína isopreno sintase. O plasmídeo resultante pTrcPoplar (figuras 32 e 33), é verificado por sequenciamento.
Exemplo 2B: Demonstração de atividade de isopreno sintase a partir de várias isopreno sintases de populus
As seguintes isopreno sintases foram examinadas: Populus alba (Número de acesso BAD98243; figuras 137A e B; SEQ ID N°: 109), Populus nigra (Número de acesso CAL69918; figuras 137C e D; SEQ ID N°: 110), Populus tremuloides (Número de acesso AAQ16588; figura 137 E, F, e G; SEQ ID N°: 123), Populus trichocarpa (Número de acesso ACD70404; figuras 137H e I; SEQ ID N°: 111), Populus alba x Populus tremula (Número de acesso CAJ29303; figuras 137J e K; SEQ ID N°: 112), e MCM112-Kudzu.
pET24Kudzu (ambém referido como MCM112) foi construído como se segue: o gene de isopreno sintase de kudzu foi subclonado no vetor pET24d (Novagen) do vetor pCR2.1 (Invitrogen). O gene de IspS de kudzu foi amplificado a partir do DNA molde de pTrcKudzu usando os iniciadores MCM50 5-GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAAAACATGTG TGCGACCTCTTC TCAATTTACT (SEQ ID N°: 31); e MCM53 5'-CGGTCGA CGGATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID N°: 32). Reações de PCR são executadas usando Taq DNA Polimerase (Invitrogen) e o produto de PCR resultante é clonado no vetor de clonagem pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) e transformado em células quimicamente competentes de E. coli
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Top10 (Invitrogen). Transformantes são plaqueados em L ágar contendo carbenicilina (50 pg/mL) e incubados durante a noite a 37°C. Culturas de 5 mL de Caldo Luria contendo carbenicilina a 50 pg/ml foram inoculadas com um só transformante e cultivadas durante a noite a 37°C. Cinco colônias são tríadas pelo inserto correto por sequenciamento de DNA plasmidial isolado de 1 mL de cultura líquida (Caldo Luria) e purificado usando o kit de minipreparação QIAprep Spin (Qiagen). O plasmídeo resultante, designado MCM93, contém a sequência codificante de IspS de kudzu em um arcabouço de pCR2.1 (figura 137L). A sequência de MCM93 (SEQ ID N°: 113) é mostrada nas figuras 137M e N.
A sequência codificante de kudzu foi removida por digestão com endonuclease de restrição com Pci\ e 8amH1 (Roche) e purificada em gel usando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). O DNA do vetor pET24d foi digerido com Λ/col e fíamHI (Roche), tratado com fosfatase alcalina de camarão (Roche) e purificado usando o kit QIAprep Spin Mini-prep (Qiagen). O fragmento de IspS de kudzu foi ligado ao pET24d digerido com NcoVBamW usando o kit Rapid DNA Ligation (Roche) em um proporção de 5:1 de fragmento para vetor em um volume total de 20 pL. Uma parte de uma mistura de ligação (5 pL) foi transformada em células quimicamente competentes de E. coli Top 10 e plaqueada em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). O transformante correto foi confirmado por sequenciamento e transformado em células BL21 (ADE3)pLysS quimicamente competentes (Novagen). Uma única colônia foi selecionada após o crescimento durante a noite a 37°C em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). Um mapa do plasmídeo resultante designado como pET24D-Kudzu é mostrado na figura 1370. A sequência de pET24D-Kudzu (SEQ ID N°: 114) é mostrada nas figuras 137P e Q.
Genes de isopreno sintase otimizados para Escherichia coli clonados no vetor de expressão pET24a (Novagen) foram adquiridos da DNA2.0 (Menlo Park, CA) para Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra e Populus trichocarpa. Os genes foram sintetizados com a sequência peptídica de endereçamento ao cloroplasto removida, resultando na expressão de proteínas maduras.
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O construto para a isopreno sintase de kudzu foi usado como controle neste exemplo. Os plasmídeos foram transformados no hospedeiro de expressão de E. coli BL21(DE3)pLysS e transformantes foram cultivados em 0,6ml_ de meio TM3. A receita do meio TM3 é como se segue: K2HPO4 (13,6 g/L) KH2PO4 (13,6 g/L), MgSO4 * 7H2O (2 g/L) ácido cítrico monohidratado (2 g/L) citrato de amônio férrico (0,3 g/L) (NH4)2SO4 (3,2 g/L) extrato de levedura (0,2 g/L) 1 mL de solução de Elementos Traços WOOx, pH ajustado a 6,8 com hidróxido de amônio qs até o volume com Dl H2O estéril e esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns. A receita para a solução de Elementos Traços 1000x é como se segue: ácidos cítricos * H2O (40 g/L), MnSO4 * H2O (30 g/L), NaCI (10 g/L), FeSO4 * 7 H2O (1 g/L), CoCI2 * 6 H2O (1 g/L), ZnSO4 * 7 H2O (1 g/L), CuSO4 * 5 H2O (100 mg/L), H3BO3 (100 mg/L), NaMoQ4 * 2 H2O (100 mg/L). Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH ajustado a 3,0 com HCI/NaOH, q.s. até o volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 microns.
As culturas foram induzidas com 400uM de IPTG e o cultivo foi continuado até OD6oo de cerca de 5. Alíquotas de cultura foram transferidas para uma placa de vidro de poços profundos e os poços foram selados com selante de placa de alumínio. A placa foi incubada a 25°C por 30 minutos com agitação a 450 rpm. As reações foram inativadas por calor pela elevação da temperatura a 70°C por 5 minutos. O headspace de célula inteira foi medido pelo método GCMS como descrito no Exemplo 1, Parte II.
Valores de Km foram obtidos de culturas cultivadas de modo similar, mas as células foram coletadas e lisadas por um protocolo de lisozima e congelamento/descongelamento. Um volume de 400 pL de cultura foi transferido para uma placa de 96 poços nova (Perkin Elmer, N° do catálogo 6008290) e células foram coletadas por centrifugação em uma centrífuga Beckman Coulter Allegra 6R a 2500 x g. O sedimentado foi ressuspendido em 200 mL de tampão hipotônico (5 mM de MgCL2, 5 mM de Tris HCI, 5 mM de DTT pH 8,0) e a placa foi congelada a -80°C por um tempo mínimo de 60 minutos. O lisado celular foi preparado pelo descongelamento da placa e adição de 32 mL de tampão de ensaio DMAPP de isopreno sintase (57 mM
148/291 de Tris HCI, 19 mM de MgCI2, 74 mg/mL de DNase I (Sigma N° do catálogo DN-25), 2,63x105 U/mL de solução de lisozima ReadyLyse (Epicentre N° do catálogo R1802M), e 5 mg/mL de BSA grau biologia molecular. A placa foi incubada com agitação a 25°C por 30 minutos e em seguida colocada em gelo. DMAPP e o lisado foram adicionados na concentração desejada em um bloco de vidro de poço profundo selado para o ensaio head space de célula inteira descrito acima. As reações prosseguiram por 1 hora e em seguida terminadas pela etapa de aquecimento descrita acima e a atividade head space foi medida também como descrito.
Em uma abordagem alternativa, a atividade das enzimas foi medida de células cultivadas em 25mL de volume e induzida de modo similar ao descrito acima. Células foram coletadas por centrifugação e os sedimentados foram lisados por prensagem francesa em tampão que consistia em 50% de glicerol misturado 1:1 com 20 mM de Tris/HCI pH 7,4, 20 mM de MgCI2, 200 mM de KCI, 1 mM de DTT. Um volume de lisado de 25 uL foi avaliado pela atividade de isopreno sintase em frascos de tampa rosqueada de 2 mL contendo 75 uL de tampão de ensaio (66,6 mM deTris/HCI pH 8, 6,66 mM de DMAPP, 43 mM, MgCI2). A reação foi incubada por 15 minutos a 30°C e foi interrompida pela adição de 100uL de EDTA a 250 mM através do septo do frasco. O isopreno foi medido por GC/MS como descrito no Exemplo 1, Parte II.
Todos os métodos para determinação de atividade mostraram que a enzima de álamo derivada dos álamos de linhagem pura era várias vezes maior que a de Populus [Alba x tremula]. As figuras 138 e 139 mostraram esses resultados para o ensaio head space de célula inteira e para o ensaio de DMAPP, respectivamente,e surpreendentemente indica que enzimas de P. nigra, P. tremuloides, P. trichocarpa e P. Alba, todas, tiveram atividade significativamente maior que a do híbrido[R alba x P.tremula].
O ensaio DMAPP foi realizado como se sege: um volume de 400 pL de cultura foi transferido para uma placa de 96 poços nova (Perkin Elmer, No. do catálogo 6008290) e células foram coletadas por centrifugação em uma centrífuga Beckman Coulter Allegra 6R a 2500 x g. O sedimentado foi
149/291 ressuspendido em 200 mL de tampão hipotônico (5 mM de MgCL2, 5 mM de Tris HCI, 5 mM de DTT pH 8,0) e a placa foi congelada a -80°C por urn tempo mínimo de 60 minutos. O lisado celular foi preparado pelo descongelamento da placa e adição de 32 mL de tampão de ensaio DMAPP de isopreno sintase (57 mM de Tris HCI, 19 mM de MgCI2, 74 mg/mL de DNase I (Sigma N° do catálogo DN-25), 2,63x105 U/mL de solução de lisozima ReadyLyse (Epicentre N° do catálogo R1802M), e 5 mg/mL de BSA grau biologia molecular. A placa foi incubada com agitação a 25°C por 30 minutos e em seguida colocada em gelo. Para a produção de isopreno uma alíquota de 80mL de lisado foi transferida para uma placa de vidro de 96 poços profundos (Zinsser N° do catálogo 3600600) e 20 mL de uma solução 10 mM de DMAPP em 100 mM de KHPO4, pH 8,2 (Cayman Chemical N° do catálogo. 63180) foram adicionados. A placa foi selada com selante de placa de alumínio (Beckman Coulter Catalog N° 538619) e incubada com agitação a 30°C por 60 minutos. As reações enzimáticas foram terminadas pelo aquecimento do bloco de vidro (70°C por 5 minutos). O head space celular de cada poço foi analisado quantitativamente como descrito no Exemplo I, Parte II.
Notavelmente P. alba, P.tremuloides, P. tríchocarpa tiveram atividade maior que a isopreno sintase de kudzu, A enzima de P. Alba foi expressa com a maior atividade de todas as enzimas testadas. As maiores atividades observadas com o lisado celular comparadas com o ensaio de head space celular provavelmente foram devidas a limitações em DMAPP, o substrato para essas enzimas, distribuído pela via do desóxi-xilulose 5-fosfato (DXP) endógena da célula.
Parâmetros cinéticos de Km foram medidos como sendo cerca de 2 a 3 mM para todas as enzimas para as quais o valor foi determinado. Exemplo 3: Produção de isopreno em Pantoea citrea expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
Os plasmídeos pTrcKudzu e pCL-lac Kudzu descritos no Exemplo 1 são eletroporados em P.citrea (Pat. EUA N° 7241587). Transformantes são selecionados em LA contendo carbenicilina (200 mcg/ml) ou espectino
150/291 micina (50 mg/ml), respectivamente. Produção de isopreno de agitador e determinação da quantidade de isopreno produzidos são realizadas, conforme descrito no Exemplo 1 para cepas de E. coli expressando isopreno sintase recombinante de kudzu. Os resultados são mostrados na figura 10.
Exemplo 4: Produção de isopreno em Bacillus subtilis expressando isopreno sintase de kudzu recombinante
I. Construção de um plasmídeo replicante de B. subtilis para a expressão de isopreno sintase de kudzu
O gene da isopreno sintase de kudzu é expresso em cepa de Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK (BG3594comK) usando um plasmídeo replicante (pBS19 com um cassete de resistência a cloranfenicol) sob controle do promotor aprE. O gene da isopreno sintase, o promoter aprE e o terminador de transcrição são amplificados separadamente e fundidos usando PCR. O construto é então clonado em pBS19 e transformado em B. subtilis.
a) Amplificação do promoter aprE
O promotor aprE é amplificado a partir do DNA cromossômico de Bacillus subtilis usando os seguintes iniciadores:
CF 797 (+) Iniciar promotor aprE Mfel
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID N°: 58)
CF 07-43 (-) Fundir promotor aprE ao Kudzu ispS
5'-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID N°: 59)
b) Amplificação do gene da isopreno sintase
O gene da isopreno sintase de kudzu é amplificado a partir de plasmídeo pTrcKudzu (SEQ ID N°: 2). O gene é códon otimizado para E. coli e sintetizado pelo DNA 2.0. Os seguintes iniciadores são usados:
CF 07-42 (+) Fundir o promotor aprE ao gene sintase de isopreno kudzu (GTG iniciar códon)
5-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCA AT (SEQ ID N°: 60)
151/291
CF 07-45 (-) Fundir a extremidade 3' do gene sintase de isopreno kudzu ao terminador
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID N°: 61)
c) Amplificação de transcrição de terminador
O terminador da serina protease alcalina de Bacillus amyliquefaciens é amplificado a partir de um plasmídeo previamente sequenciado pJHPms382 usando os seguintes iniciadores:
CF 07-44 (+) Fundir a extremidade 3' do gene sintase de isopreno kudzu ao terminador
5'-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID N°: 62)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens (BamHI) 5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
O fragmento kudzu é fundido ao fragmento terminador usando PCR com os seguintes iniciadores
CF 07-42 (+) Fundir promotor aprE ao gene de isopreno sintase de kudzu (GTG códon inicial)
5'-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCA
AT (SEQ ID N°: 61)
CF 07-46 (-) Final de B. amyliquefaciens terminador (BamHI)
5'-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
O fragmento kudzu é fundido ao fragmento promotor usando PCR com os seguintes iniciadores:
CF 797 (+) Iniciar promotor aprE Mfel
5'-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID N°: 64)
CF 07-46 (-) Final do B. amyliquefaciens terminador (BamHI)
5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID N°: 63)
152/291
O fragmento de PCR de fusão é purificado usando um kit Qiagen e digerido com as enzimas de restrição BamHI e Mfel. Este fragmento de DNA digerido é purificado com gel, usando um kit Qiagen e ligado a um vetor conhecido como pBS19, que foi digerido com EcoRI e BamHI e gel purificado.
A mistura de ligação é transformada em células de E. coli Top 10 e colônias são selecionadas em placas de LA+50 de carbenicilina. Um total de seis colônias é escolhido e cultivado durante a noite em LB+ 50 de carbenicilina e, em seguida, os plasmídeos são isolados, usando um kit Qiagen. Os plasmídeos são digeridos com EcoRI e BamHI para verificar se insere e três dos plasmídeos corretos são enviados para sequenciamento com os seguintes iniciadores.
CF 149 (+) EcoRI inicial de promotor aprE 5'-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 65) CF 847 (+) Sequência em pXX 049 (final do promotor aprE) 5-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG (SEQ ID N°: 66)
CF 07-45 (-) Fundir a extremidade 3' de sintase de isopreno kudzu ao terminador
5'-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID N°: 61)
CF 07-48 (+) Sequenciar iniciador para isopreno sintase de kudzu 5'-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID N°: 67) CF 07-49 (+) Sequenciar em isopreno sintase de kudzu 5'-GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID N°: 68) O plasmídio designado PBS Kudzu # 2 (figuras 52 e 12) está correto pelo sequenciamento e é transformado em BG 3594 comK, uma cepa hospedeira de Bacillus subtilis. A seleção é feita em placas de LA + 5 de cloranfenicol. Um transformante é escolhido e atinge as colônias únicas em LA + 5 de cloranfenicol, cultivadas em LB + 5 de cloranfenicol até que ele atinja um OD60q de 1,5. Ele é armazenado congelado em um frasco a -80 °C na presença de glicerol. A cepa resultante é designada CF 443.
II. Produção de isopreno em frascos de agitação contendo células de B. subtilis expressando isopreno sintase recombinante
153/291
Culturas de um dia para o outro são inoculadas com uma única colônia da CF 443 a partir de uma LA + cloranfenicol (Cm, 25 mcg/ml). As culturas são cultivadas em LB + Cm a 37°C com agitação de 200 rpm. Essas culturas de um dia para o outro (1 mL) são utilizadas para inocular 250 ml em frascos agitados contendo 25 ml de meio Grants II e cloranfenicol, na concentração final de 25 pg/ml. Receita para Meio Grants II é 10 g de peptona de soja, 3 ml de 1M de Κ2ΗΡΟ4, 75 g de glicose, 3,6 g de ureia, 100 ml de MOPS 10X, q.s. para 1 L com H2O, pH 7,2; 10X MOPS receita era 83,72 g MOPS, 7,17 g de tricina, 12 g de péletes de KOH, 10 ml de solução 0,276M K2SO4, 10 ml de solução 0.528M MgCI2, 29,22 g de NaCI, 100 ml de micronutrientes 100X, q.s. para 1 L com H2O; e receita de 100X micronutrientes é 1,47 g CaCI2*2H2O, 0,4 g FeSO4*7H20, 0,1 g MnSO4*H20, 0,1 g ZnSO4*H2O, 0,05 g CuCI2*2H2O, 0,1 g CoCI2*6H2O, 0,1 g Na2MoO4*2H2O, q.s. para 1 L com H2O. Frascos de agitação são incubados a 37°C e as amostras são colhidas em 18, 24 e 44 horas. Às 18 horas o headspace da CF443 e da cepa controle são amostrados. Isso representa 18 horas de acúmulo de isopreno. A quantidade de isopreno é determinada por cromatografia gasosa, conforme descrito no Exemplo 1. A produção de isopreno é reforçada significativamente pela expressão de isopreno sintase recombinante (figura 11).
III. Produção de isopreno por CF443 em fermentação de 14 L
A produção em larga escala de isopreno de B. subtilis recombinante contendo o gene de isopreno sintase de kudzu em um plasmídeo de replicação é determinada a partir de uma cultura em batelada alimentada. A cepa de Bacillus CF 443, expressando um gene de isopreno sintase de kudzu ou cepa controle que não expressa um gene de isopreno sintase de kudzu são cultivadas por fermentação em batelada alimentada convencionais em um meio nutriente contendo farelo de soja (Cargill), de sódio e fosfato de potássio, sulfato de magnésio e uma solução de ácido cítrico, cloreto férrico e cloreto de manganês. Antes da fermentação, a mídia é macerada por 90 minutos, utilizando uma mistura de enzimas, incluindo celulases, pectinases e hemicelulases (ver, WO95/04134). Fermentações 14-L são alimentadas
154/291 com 60% peso/peso de glicose (dextrose DE99 Cargill, ADM verdes Versadex Danisco ou açúcar invertido) e 99% em peso/peso do óleo (óleo de soja Família Ocidental, onde o peso de 99%/peso é a concentração do petróleo antes que ele foi adicionado ao meio de cultura celular). Alimentação é iniciada quando a glicose no lote não é detectável. A taxa de alimentação é elevada durante várias horas e é ajustada para adicionar o óleo em uma base de carbono equivalente. O pH é controlado em 6,8-7,4 usando 28% peso/volume de hidróxido de amônio. Em caso de formação de espuma, antiespumante é adicionado à mídia. A temperatura de fermentação controlada a 37°C e a cultura de fermentação é agitada a 750 rpm. Vários outros parâmetros tais como pH, OD%, o fluxo de ar e pressão são monitorados durante todo o processo. A DO% é mantida acima de 20. As amostras são colhidas ao longo do tempo de 36 horas e analisadas para o crescimento de células (OD550) e produção de isopreno. Os resultados desses experimentos são apresentados nas figuras 53A e 53B.
IV. Integração de isopreno sintase de kudzu (ispS) em B. subtilis.
O gene de isopreno sintase de kudzu é clonado em um plasmídeo de integração (pJH101-cmpR) sob o controle do promotor aprE. Sob as condições testadas, nenhum isopreno é detectado.
Exemplo 5: Produção de isopreno em Trichoderma
I. Construção de vetores para expressão da isopreno sintase de kudzu em Trichoderma reesei
O gene IS de kudzu com códon otimizado para Yarrowia lipolytica é sintetizado pelo DNA 2.0 (SEQ ID N°: 8) (figura 13). Este plasmídio, serve como molde para a seguinte reação de PCR: 1 pl de molde de plasmídeo (20 ng/ul), 1 μΙ de Iniciador EL-945 (10 uM) 5-GCTTATGGATCCTCTA GACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ ID N°: 9), 1 μΙ de Iniciador EL965 (10uM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID N°: 10), 1 μΙ de dNTP (10mM), 5 μΙ 10x PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerase Buffer, 1 μΙ de PfuUltra II Fusion HS DNA Polimerase, 40 μΙ de água em um volume total de reação de 50 ul. O iniciador direto contém 4 nucleotídeos adicionais na extremidade 5' que não correspondem ao gene de isopreno
155/291 sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, mas são necessários para a clonagem no vetor pENTR/D-TOPO. O iniciador reverso contém 21 nucleotídeos adicionais na extremidade 5' que não correspondem ao gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, mas são inseridos para clonagem de outros arcabouços de vetores. Usando o MJ Research PTC-200 Termociclador, a reação de PCR é realizada da seguinte forma: 95°C por 2 minutos (primeiro ciclo só), 95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos (Repita o procedimento para 27 ciclos), 72°C por 1 minuto após o último ciclo. O produto da PCR é analisado em um E-gel 1,2% para confirmar a amplificação bem-sucedida do gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica.
O produto de PCR é então clonado usando o seguinte protocolo do fabricante para o kit de clonagem TOPO pENTR/D-TOPO: 1 ml de reação de PCR, 1 ml de solução salina, 1 ml de vetor TOPO pENTR/D TOPO e 3 μΙ de água em uma reação com total de volume de 6μΙ_. A reação é incubada em temperatura ambiente por 5 minutos. Um microlitro de reação TOPO é transformado em células quimicamente competentes de E. coli TOP10. Os transformantes são selecionados em placas LA + 50 mg/mL de canamicina. Várias colônias são escolhidas e cada uma é inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB + 50 mg de canamicina/ml e as culturas cultivadas durante a noite a 37°C com agitação de 200 rpm. Plasmídeos são isolados dos tubos de cultura durante a noite usando QIAprep Spin Miniprep Kit, seguindo o protocolo do fabricante. Vários são os plasmídeos sequenciados para verificar se a sequência de DNA está correta.
Um único plasmídeo pENTR/D-TOPO codificando um gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica é usado para clonagem Gateway em um vetor pTrex3g feito sob medida. Construção de pTrex3g é descrita no WO 2005/001036 A2. A reação é realizada seguindo o protocolo do fabricante para o kit LR Gateway Clonase II Enzima Mix (Invitrogen): 1 ml de vetor doador pENTR/D-TOPO de gene de isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica, 1 ml do vetor de destino pTrex3g, 6 μΙ de tampão TE, PH 8,0 em um volume total de reação de 8
156/291 μΙ. A reação é incubada em temperatura ambiente por uma hora e, em seguida, 1 ml de solução de proteinase K é adicionado e a incubação prosseguiu a 37°C por 10 minutos. Em seguida, 1 ml de reação é transformado em células quimicamente competentes de E. coli ΤΘΡ10. Os transformantes são selecionados em placas /LA + 50 mg ml carbenicilina. Várias colônias são escolhidas e cada uma é inoculada em um tubo de 5 ml contendo LB + 50 pig carbenicilina/ml e as culturas são cultivadas durante a noite a 37°C com agitação de 200 rpm. Plasmídeos são isolados dos tubos de cultura durante a noite usando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Inc.), seguindo o protocolo do fabricante. Vários são os plasmídeos sequenciados para verificar se a sequência de DNA foi correta.
Transformação biobalística de plasmídeo pTrex3g com isopreno sintase de kudzu com códon otimizado para Y. lipolytica (figura 14) em um quad exclui cepa de Trichoderma reesei é realizada através do sistema de distribuição de partícula PDS-1000/HE de biobalística (ver WO 2005/001036 A2). Isolamento de transformantes estáveis e avaliação de frasco de agitação são realizados usando o protocolo enumerado no Exemplo 11 da publicação de patentes WO 2005/001036 A2.
II. Produção de isopreno em cepas recombinantes de T. reesei
Um mL de 15 e 36 horas culturas antigas dos transformantes isopreno sintase descritos acima são transferidos para frascos de cabeça no espaço. Os frascos são lacrados e incubados por 5 horas a 30 °C. O gás headspace é medido e isopreno é identificado pelo método descrito no Exemplo 1. Dois dos transformantes mostram traços de isopreno. A quantidade de isopreno pode ser aumentada por uma incubação de 14 horas. As duas amostras positivas mostram isopreno em níveis de cerca de 0,5 mg/L para a incubação de 14 horas. O controle não transformado não apresenta níveis detectáveis de isopreno. Este experimento mostra que T. reesei é capaz de produzir isopreno a partir de precursor endógeno quando fornecido com uma isopreno sintase exógena.
Exemplo 6: Produção de isopreno em Yarrowia
I. Construção de vetores para expressão de isopreno sintase de kudzu em
157/291
Yarrowia lipolytica.
O ponto de partida para a construção de vetores para a expressão do gene da isopreno sintase de kudzu enn Yarrowia lipolytica é o vetor pSPZ1 (MAP29Spb). A sequência completa desse vetor (SEQ ID N°:11) é mostrada na figura 15.
Os fragmentos a seguir são amplificados por PCR usando DNA cromossômico de uma cepa de Y. lipolytica GICC 120285 como molde: uma forma sem promotor do gene URA3, um fragmento do gene do RNA ribossomal 18S, um terminador de transcrição do gene XPR2 de Y. lipolytica e dois fragmentos de DNA contendo os promotores de genes e XPR2 e ICL1. Os seguintes iniciadores de PCR são utilizados:
ICL1 3
5'-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATC TGCAGGTGAC (SEQ ID N°: 69)
ICL1 5
5-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID N°: 70) XPR3
5'-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID N°: 71)
XPR5
5'-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID N°:
72)
XPRT3
5'-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID N°: 73)
XPRT5
5'-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACG
G (SEQ ID N°: 74)
Y18S3
5'-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID N°: 75)
Y18S 5
158/291
5'-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID N°: 76)
YURA3
S'-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID N°: 77)
YURA 50
5'-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID N°: 78)
YURA 51
5'-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID N°: 79)
Para amplificação por PCR, a polimerase PfuUltrall (Stratagene), tampão fornecido pelo fornecedor e dNTPs, 2,5 mM de iniciadores e o DNA molde indicado são utilizados de acordo com as instruções do fabricante. A amplificação é feita através do seguinte ciclo: 95°C por 1 min; 34x (95°C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 3 min) e 10 min a 72°C seguidos de 4°C de incubação.
Moléculas sintéticas de DNA codificando o gene da isopreno sintase de kudzu, com códon otimizado para a expressão em Yarrowia, são obtidas a partir do DNA 2.0 (figura 16; SEQ ID N°:12). Detalhe completo do esquema de construção dos plasmídeos pYLA(KZ1) e pYLI(KZ1) carregando o gene da isopreno sintase de kudzu sob o controle dos promotores XPR2 e ICL1, respectivamente, é apresentado na figura 18. Plasmídeos de controle no qual um gene do fator de acoplamento (MAP29) é inserido no lugar de um gene da isopreno sintase são igualmente construídos (figuras 18E e 18F).
Um procedimento de clonagem semelhante pode ser usado para expressar um gene de isopreno sintase de Alamo (Populus alba x Populus tremula. A sequência do isopreno de Álamo é descrita em Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487 e mostrada na figura 17 (SEQ ID N°:13). Um esquema de construção para a geração dos plasmídeos pYLA (POP1) e pYLI(POP1) contendo o gene de isopreno sintase de Álamo sob o controle
159/291 dos promotores,XPR2 e ICL1 respectivamente, é apresentado nas figuras 18Ae B.
II. Produção de isopreno por cepas recombinantes de Y. lipolytica.
Os vetores pYLA(KZ1), pYLI(KZ1), pYLA(MAP29) e pYLI (MAP29) são digeridos com Sacll e usados para transformar a cepa Y. lipolytica CLIB 122 por um procedimento de acetato de lítio padrão/polietileno glicol de uridina prototrofica. Resumidamente, as células de levedura cultivadas em YEPD (1% de extrato de levedura, peptona a 2%, 2% de glicose) durante a noite, são coletadas por centrifugação (4000 rpm, 10 min), lavadas uma vez com água estéril e suspensas em acetato de lítio a 0,1 M, pH 6,0. Alíquotas de duzentos pl da suspensão de células são misturadas com uma solução de DNA plasmidial linearizado (10-20 mg), incubadas por 10 minutos em temperatura ambiente e misturadas com 1 ml de 50% de PEG 4000 no mesmo tampão. As suspensões são adicionalmente incubadas por uma hora à temperatura ambiente, seguido por um choque térmico de 2 minutos a 42°C. As células são então semeadas em placas de SC his leu (0,67% de base nitrogenada de levedura, 2% de glicose, 100 mg/L de leucina e histidina). Transformantes aparecem após 3-4 dias de incubação a 30°C.
Três isolados a partir da transformação PYLA (KZ1), três isolados a partir da transformação (KZ1) Pyli, dois isolados do (MAP29) PYLA transformação e dois isolados do Pyli (MAP29) transformação são cultivados por 24 horas em meio YEP7 (1% de extrato de levedura, peptona 2%, pH 7,0) a 30°C com agitação. Células de 10 ml de cultura são coletadas por centrifugação, ressuspendidas em 3 ml de YEP7 fresco e colocadas em frascos de 15 ml com tampa de rosca. Os frascos são incubados durante a noite em temperatura ambiente, com suave (60 rpm) agitação. O conteúdo de isopreno no headspace dos frascos é analisado por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa, como descrito no Exemplo 1. Todos os transformantes obtidos com PYLA (KZ1) e Pyli (KZ1) produziram facilmente uma quantidade detectável de isopreno (0,5 mg/L para 1 mg/L, figura 20). Nenhum isopreno é detectado no headspace das amostras de controle portadoras do gene da fitase, em vez de um gene de isopreno sintase
160/291
Exemplo 7: Produção de isopreno em E. coli expressando isopreno sintase de kudzu e idi, ou dxs, ou idi e dxs
I. Construção de vetores codificando isopreno sintase de kudzu e idi, ou dxs, ou idie dxs para a produção de isopreno em E. coli
i) Construção de pTrcKudzuKan
O gene bla de pTrcKudzu (descrito no Exemplo 1) é substituído com o gene que confere resistência à canamicina. Para remover o gene bla, pTrcKudzu é digerido com BspHI, tratado com Fosfatase Alcalina de Camarão (SAP), aquecido a 65°C, em seguida, tem as extremidades preenchidas por fragmento Klenow e dNTPs. O fragmento de 5 kbp grande é purificado a partir de um gel de agarose e ligado ao gene kanR que tem sido amplificado de PCR-Blunt-ll-TOPO utilizando os iniciadoresMCM22 5'- GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID N°: 14) e MCM23 5'- GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID N°: 15), digerido com Hind\\\ e Pvu\, e finalmente preenchido. Um transformante carregando um plasmídeo que confere resistência à canamicina (pTrcKudzuKan) é selecionado em LA contendo canamicina 50 pg/ml.
ii) Construção de pTrcKudzu ylDI Kan
O TrcKudzuKan é digerido com Pstl, tratado com a SAP, aquecido e gel purificado. Ele é ligado a um produto de PCR codificando idi de S. cerevisiae com um RBS sintético. Os iniciadores para PCR Nsil-YIDI 1 F 5'CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID N°: 16) e Pstl-YIDI 1 R 5'- CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID N°: 17); e o molde são DNA genômico de S. cerevisiae. O produto da PCR é digerido com Nsil e Pstl e gel purificado antes da ligação. A mistura de ligação é transformada em células TQP10 quimicamente competentes e selecionada em LA contendo 50 mg/ml de canamicina. Transformantes vários são isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado ylDI pTrcKudzu (kan) (figuras 34 e 35).
iii) Construção de pTrcKudzu DXS Kan
Plasmídeo pTrcKudzuKan é digerido com Pstl, tratado com a SAP, aquecido e gel purificado. Ele é ligado a um produto da PCR de codifi
161/291 cação de E. coli dxs com um RBS sintético. Os iniciadores para PCR MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAA ACATGAGTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID N°: 18) e MCM14 5'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID N°: 19); e do modelo são a E. coli DNA genômico. O produto da PCR é digerido com Nsil e Pstl e gel purificado antes da ligação. A reação de transformação resultante é transformada em células TQP10 e selecionada em l_A com 50 mg de canamicina/ml. Transformantes vários são isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado pTrcKudzu-DXS (kan) (figuras 36 e 37).
iv) Construção de pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan)
O TrcKudzu-ylDI(kan) é digerido com Psti, tratado com a SAP, aquecido e gel purificado. Ele é ligado a um produto PCR de codificação de E. coli dxs com um RBS sintético, (iniciadores MCM13 5-GATCATGCATT CGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID N°: 18) e MCM14 5'- CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTG AT (SEQ ID N°: 19); modelo de células TOP10) que foram digeridos com Nsil e Pstl e gel purificado. O plasmídeo final é chamado pTrcKudzu-ylDIdxs (kan) (figuras 21 e 22).
v) Construção de pCL PtrcKudzu
Um fragmento de DNA contendo o promotor, o gene estrutural e de terminação de Exemplo 1 acima é digerido de pTrcKudzu usando SSPI e gel purificado. É ligado ao pCL1920 que foi digerido com Pvull, tratado com SAP e morta por calor. A mistura resultante da ligadura foi transformada em células TQP10 e selecionada em LA, contendo 50 mcg de espectinomicina/ml. Vários clones estão isolados e sequenciados e dois são selecionados. PtrcKudzu PCL e PCL PtrcKudzu (A3) têm a inserir em orientações opostas (figuras 38-41).
vi) Construção de pCL PtrcKudzu ylDI
O Nsi\-Pst\ digerido, gel purificado, IDI PCR amplicon do (ii) acima mencionado são ligados dentro do pCL PtrcKudzu que tem sido digerido com Pstl, tratado com SAP, e aquecido. A mistura de ligadura é transformada em células TQP10 e selecionada em LA contendo 50 pg/ml de especti
162/291 nomicina. Diversos clones são isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado pCL PtrcKudzu ylDI (figuras 42 e 43).
vii) Construção de pCL PtrcKudzu DXS
O Nsil-Pstl digerido, gel purificado, DXS PCR amplicon a partir de (iii) acima são ligados em pCL PtrcKudzu (A3), que foi digerido com Pstl, tratados com a SAP, e aquecidos . A mistura de ligadura é transformada em células TOP 10 e selecionada em LA, contendo 50 mcg/ ml de espectinomicina . Diversos clones são isolados e sequenciados e o plasmídeo resultante é chamado PCL PtrcKudzu DXS (figuras 44 e 45)
II. Medição de isopreno em headspace de culturas expressando sintase de isopreno kudzu, idi, e/ou dxsem diferentes números de cópias
Culturas de E. coli BL21 (ADE3) previamente transformadas com plasmídeos pTrcKudzu(kan) (A), pTrcKudzu-ylDI kan (B), pTrcKudzu-DXS kan (C), pTrcKudzu-ylDI-DXS kan (D) são crescidas em LB canamicina a 50 pg/mL. Culturas de pCL PtrcKudzu (E), pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-ylDI (F) e pCL PtrcKudzu-DXS (G) são cultivadas em LB espectinomicina a 50 mcg/mL. As culturas são induzidas com 400 mM de IPTG em tempo de 0 (OD600 aproximadamente 0,5) e as amostras colhidas para mensuração headspace de isopreno (ver Exemplo 1). Os resultados são mostrados nas figuras 23A-23G.
Plasmídeo pTrcKudzu-ylDI-dxs (kan) foi introduzido em E. coli estirpe BL21 pela transformação. A tensão resultante BL21/pTrc Kudzu IDI DXS é cultivada durante a noite em LB contendo canamicina (50 mg/ml) a 20°C e utilizada para inocular frascos agitados de TM3 (13,6 g de K2PO4, 13,6 g de KH2PO4, 2,0 g de MgSO4*7H2O), 2,0 g de ácido cítrico monohidratado, 0,3 g de citrato de amônia férrico, 3,2 g de (NH4)2SO4, 0,2 g de extrato de levedura, 1,0 ml de 1000x Solução para Traço Metal Modificada, ajustada ao pH 6,8 e q.s. para H2O, e esterilizada por filtração) contendo glicose a 1%. Frascos são incubados a 30°C até uma OD600 de 0,8 ser atingida, e então induzida com 400 mM de IPTG. As amostras são colhidas em vários momentos após a indução e a quantidade de isopreno no headspace é medida conforme é descrito no Exemplo 1. Os resultados são mos163/291 trados na figura 23H.
III. Produção de isopreno a partir de biomassa em E. co///pTrcKudzu ylDI DXS
A cepa BL21 pTrcKudzulDIDXS é testada para a capacidade de geração de isopreno a partir de três tipos de biomassa, o bagaço, a palha de milho e polpa de madeira macia com a glicose como controle. Hidrolisados de biomassa são preparados por hidrólise enzimática (Brown, L e Torget, R., 1996, NREL padrão de ensaio método Lap-009 'Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass”) e utilizados na diluição com base em equivalentes de glicose. Neste exemplo, equivalentes de glicose é igual a 1% de glicose. Uma única colônia de uma placa de células recém-transformada de BL21 (DE3) pTrcKudzu ylDI DXS (kan) é usada para inocular 5 ml de LB mais canamicina (50 mg/ml). A cultura é incubada durante a noite a 25°C com agitação. No dia seguinte, a cultura de noite é diluída para uma OD6oo de 0,05 em 25 ml de TM3 + 0,2% de YE + 1 % de matéria-prima. A matériaprima é o milho Stover bagaço, ou celulose de fibra longa. A glicose é usada como um controle positivo e nenhuma glicose é usada como controle negativo. As culturas são incubadas a 30°C com agitação a 180 rpm. A cultura é monitorada para OD600 e quando atinge uma OD6oo de ~ 0,8, as culturas são analisadas nas 1o e 3 horas para a produção de isopreno, conforme descrito no Exemplo 1. Culturas não são induzidas. Todas as culturas com adição de matéria-prima produziram isoprenos equivalentes aos do controle da glicose positivo. Os experimentos são feitos em duplicada e são mostrados na figura 46.
IV. Produção de isopreno a partir de açúcar invertido em E. colil pTrcKudzulDIDXS
Uma única colônia de uma placa de células recém-transformadas de BL21(ADE3)/pTrcKudzu ylDI DXS (can) é usada para inocular 5 mL de LB + canamicina (50 pg/mL). A cultura é incubada durante a noite a 25°C com agitação. No dia seguinte, a cultura crescida durante a noite é diluída a uma ODeoo de 0,05 em 25 mL de TM3 + 0,2% de YE + 1% de matéria-prima. Matéria-prima é glicose, glicose invertida ou palha de milho. A matéria-prima
164/291 de açúcar invertido (Danisco Invert Sugar) é preparada pelo tratamento enzimático de xarope de sacarose. A palha de milho AFEX é preparada como descrito abaixo (Parte V). As células são cultivadas a 30°C e a primeira amostra é medida quando as culturas atingem uma OD6oo ~ 0,8-1,0 (0 hora). As culturas são analisadas pelo crescimento como medido pela OD6oo θ pela produção de isopreno como no Exemplo 1 nas horas 0, 1 e 3. Resultados são mostrados na figura 47.
V. Preparação de hidrolisado de palha de milho pré-tratada por AFEX
A palha de milho pré-tratada por AFEX é obtida no Instituto de Biotecnologia de Michigan. As condições de pré-tratamento são de 60% de umidade, carga de amônia 1:1 e 90°C por 30 minutos, em seguida, secagem ao ar. O teor de umidade na palha de milho pré-tratada por AFEX é de 21,27%. Os teores de glucana e xilana na palha de milho pré-tratada por AFEX são de 31,7% e 19,1% (base seca), respectivamente. O processo de sacarificação é o seguinte: 20 g de palha de milho pré-tratada por AFEX são adicionados em um frasco de 500 mL com 5 mL de tampão citrato de sódio a 1M pH 4,8, 2,25 mL de Accellerase 1000, 0,1 mL de Grindamyl H121 (produto de xilanase da Danisco de Aspergillus niger para a indústria de panificação) e 72,65 mL de água Dl. O frasco é colocado em um agitador orbital e incubado a 50°C por 96 horas. Uma amostra é retirada do agitador e analisada por HPLC. O hidrolisado continha 38,5 g/L de glicose, 21,8 g/L de xilose e 10,3 g/L de oligômeros de glicose e/ou xilose.
VI. O efeito de extrato de levedura na produção de isopreno no crescimento de E. coli em cultura de batelada alimentada
A fermentação é realizada na escala de 14L como previamente descrito para células de E. coli contendo o plasmídeo pTrcKudzu ylDI DXSdescrito acima. O extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada) é alimentado em taxa exponencial. A quantidade total de extrato de levedura distribuído ao fermentador varia entre 70-830 g durante a fermentação de 40 horas. A densidade ótica do caldo fermentative é medida em um comprimento de onda de 550 nm. A densidade ótica final nos fermentadores é proporcional à quantidade de extrato de levedura adicionado (figura 48A).
165/291
O nível de isopreno no gás de escape do fermentador é determinado conforme descrito anteriormente. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação (figura 48B). A quantidade de isopreno produzida é linearmente proporcional à quantidade de extrato de levedura alimentada (figura 48C).
VII. Produção de isopreno em fermentação de 500L de pTrcKudzu DXS ylDI
Uma fermentação de 500 litros de células de E. coli com ácidos nucleicos de DXS de E. coli, IDI de S. cerevisiae e isopreno sintase de kudze (E. coli BL21(ADE3) pTrc Kudzu dxs yidi) é usada para produzir isopreno. Os níveis de isopreno variaram de 50 a 300 pg/L em um período de 15 horas. Com base nas concentrações médias de isopreno, o fluxo médio através do dispositivo e o grau de avanço de isopreno, a quantidade de isopreno coletado é calculada em cerca de 17 g.
VIII. Produção de isopreno em fermentação de 500 L de E. coli cultivada em cultura em batelada alimentada
Receita do Meio (por litro de meio de fermentação): 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura, 1 mL de Solução de Metal Traço Modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com gás de amônia (NH3) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibiótico são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2* 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMo04* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em H2O Dl, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterelizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 500L com células de E. coli contendo 0 plasmídeo pTrcKudzu ylDI DXS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose e extrato de levedura na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação deseja
166/291 dos. Um inóculo de cepa de E. coli tirada de um frasco congelado é preparado em meio peptona de soja-extrato de levedura-glicose. Após o inóculo ser cultivado a OD 0,15, medida a 550 nm, 20 mL são usados para inocular um biorreator contendo 2,5 L de meio peptona de soja-extrato de leveduraglicose. O biorreator de 2,5 L é cultivado a 30°C até a OD 1,0 e 2,0 L são transferidos para o biorreator de 500 L.
Extrato de levedura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canada) e glicose são adicionados em taxas exponenciais. A quantidade total de glicose e extrato de levedura distribuída ao biorreator durante a fermentação de 50 horas é de 181,2 kg e 17,6 kg, respectivamente. A densidade ótica no biorreator ao longo do tempo é apresentada na figura 49A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme descrito anteriormente. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação (figura 49B). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 50 horas é de 55,1 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 49C.
Exemplo 8: Produção de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato recombinante e de isopreno sintase de kudzu
I. Clonagem da via inferior do MVA
A estratégia para clonagem da via inferior do mevalonato é como se segue. Quatro genes da via de biossíntese do mevalonato; genes de mevalonato quinase (MVK), fosfomevalonato quinase (PMK), difosfomevalonato descarboxilase (MVD) e difosfato de isopentenil isomerase são amplificados por PCR a partir do DNA cromossômico de S. cerevisiae e clonados individualmente no plasmídeo pCR Bluntll TOPO (Invitrogen). Em alguns casos, o gene idi é amplificado a partir do DNA cromossômico de E. coli. Os iniciadores são desenhados tal que um RBS consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID N°: 80) ou AAGGAGG (SEQ ID N°: 81)) seja inserido na extremidade 5', 8 bp a montante do códon de início e um sítio Pst\ seja adicionado na extremidade 3'. Os genes são em seguida clonados um por um no vetor pTrcHis2B até que a via inteira seja montada.
O DNA cromossômico deS. cerevisiae S288C é obtido na ATCC
167/291 (ATCC 204508D). O gene de MVK é amplificado a partir do cromossoma de
S. cerevisiae usando os iniciadores MVKF (5-AGGAGGTAAAAAAACATGT CATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID N°: 21) e MVK-Pst1-R (5-ATGG CTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID N°: 22) usando PfuTurbo de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR do tamanho correto (1370 bp) é identificado por eletroforese através de um E-gel de 1,2% (Invitrogen) e clonado em pZeroBLUNT TOPO. O plasmídeo resultante é designado pMVK1. O plasmídeo pMVK1 é digerido com as endonucleases de restrição Saci e 7aq1 e o fragmento é purificado do gel e ligado no pTrcHis2B digerido com Saci e BstBI. O plasmídeo resultante é nomeado pTrcMVKI.
O segundo gene na via de biossíntese do mevalonato, PMK, é amplificado por PCR usando os iniciadores: Pstl-PMK1 R (5'-GAATTCGCC CTTCTGCAGCTACC, SEQ ID N°: 23) e BsiHKA I-PMK1 F (5'-CGACTGGT GCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID N°: 24). A reação de PCR é realizada usando a Pfu Turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de tamanho correto (1387 bp) é digerido com Pstl e Bs/HKI e ligado no pTrcMVKI digerido com Pstl. O plasmídeo resultante é nomeado pTrcKK. Os genes de MVD e idi são clonados da mesma maneira. A PCR é executada usando os pares de iniciadores PstlMVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID N°: 25) e NsilMVD 1 F (5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID N°: 26) para amplificar o gene de MVD e Pstl-YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGAC GCGTTGTTATAGC, SEQ ID N°: 27) e Nsil-YIDI 1 F (5-CATCAATGCATC GCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID N°: 28) para amplificar o gene de ylDI. Em alguns casos, o gene da IPP isomerase, idi de E. coli é utilizado. Para amplificar idi a partir do DNA cromossômico de E. coli, o seguinte conjunto de iniciadores é utilizado: Pstl-CIDI 1 R (5-GTGTGATGGA TATCTGCAGAATTCG, SEQ ID N°: 29) eNsil-CIDI 1 F (5-CATCAATGCATC GCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID N°: 30). O DNA molde é DNA cromossômico isolado por métodos padrão a partir de E. coli FM5 (WO 96/35796 e WO 2004/033646, que são aqui incorporados, cada um, como
168/291 referência em suas totalidades, particularmente em relação ao isolamento de ácidos nucleicos). Os plasmídeos finais são nomeados pKKDIy para a construção que codifica o gene idi de levedura ou pKKDIc para a construção que codifica o gene idi de E. coli. Os plasmídeos são transformados em hospedeiros de E. coli BL21 para análise subsequente. Em alguns casos, a isopreno sintase de kudzu é clonada em pKKDIy produzindo o plasmídeo pKKDIylS.
A via inferior do MVA também é clonada em pTrc contendo um marcador de resistência ao antibiótico canamicina. O plasmídeo pTrcKKDIy é digerido com as endonucleases de restrição Apa\ e Psfí, o fragmento de 5930 bp é separado em um E-gel de agarose a 1,2% e purificado usando o kit Gel Purification da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKudzuKan, descrito no Exemplo 7, é digerido com as endonucleases de restrição Apal e Pstt, e o fragmento de 3338 bp contendo o vetor é purificado a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. O fragmento de vetor de 3338 bp e o fragmento da via inferior do MVA de 5930 bp são ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche. A mistura de ligação é transformada em células de E. coli TOP10 e transformantes foram cultivados a 37°C durante a noite com seleção em LA contendo canamicina (50 pg/mL). Os transformantes são verificados por digestão com enzima de restrição e um é congelado como estoque. O plasmídeo é designado pTrcKanKKDIy.
II. Clonagem de um gene de isopreno sintase de kudzu em pTrcKanKKDIy
O gene de isopreno sintase de kudzu é amplificado por PCR a partir de pTrcKudzu, descrito no Exemplo 1, usando os iniciadores MCM50 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTCGACCT CTTCTCAATTTACT (SEQ ID N°: 31) e MCM53 5'- CGGTCGACGGATCC CTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID N°: 32). O fragmento de PCR resultante é clonado em pCR2.1 e transformado em E. coli TOP10. Este fragmento contém a sequência codificante da isopreno sintase de kudzu e uma região a montante contendo um RBS de E. coli. Transformantes são incubados durante a noite a 37° C com seleção em LA contendo carbenicili
169/291 na (50 pg/mL). A correta inserção do fragmento é verificada por sequenciamento e esta cepa é designada como MCM93.
O plasmídeo da cepa MCM93 é digerido com as endonucleases de restrição Λ/s/l e Pst\ para liberar um inserto de 1724 bp contendo o RBS e a isopreno sintase de kudzu. O fragmento de 1724 bp é separado em um Egel de agarose a 1,2% e purificado usando o kit Gel Purification da Qiagen de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo pTrcKanKKDIy é digerido com a endonuclease de restrição Pst\, tratado com SAP por 30 minutos a 37°C e purificado usando o kit de purificação de produto de PCR da Qiagen. O plasmídeo e o fragmento de DNA codificando a isopreno sintase de kudzu são ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche. A mistura de ligação é transformada em células de E. coli TOP10 e transformantes são cultivados durante a noite a 37°C com seleção em LA contendo canamicina a 50 pg/mL. O transformante correto é verificado por digestão de restrição e o plasmídeo é designado pTrcKKDylkISKan (figuras 24 e 25). Este plasmídeo é transformado em células BL21(ÀDE3) (Invitrogen).
III. Produção de isopreno a partir de mevalonato em E. coli expressando a via inferior recombinante do mevalonato e isopreno sintase de kudzu.
A cepa BL21/pTrcKKDylklSKan é cultivada em meio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) ajustado a pH 7,1 e suplementado com 0,5% de glicose e 0,5% de ácido mevalônico. Uma cultura controle também é estabelecida usando condições idênticas, mas sem a adição de 0,5% de ácido mevalônico. A cultura é iniciada a partir de uma cultura semeada durante a noite com um inóculo de 1% e induzida com 500 pM de IPTG quando a cultura atingisse uma OD6oo de 0,3 a 0,5. As culturas são cultivadas a 30°C com agitação a 250 rpm. A produção de isopreno é analisada 3 horas após a indução com o ensaio headspace descrito no Exemplo 1. A produção máxima de isopreno é 6,67 x 10-4 mol/Lcaido/OD6oo/h onde Lcaido θ o volume do caldo e inclui tanto o volume do meio celular como o volume das células. A cultura controle não suplementada com ácido mevalônico não produz isopreno mensurável.
170/291
IV. Clonagem da via superior do MVA
A via biossintética superior do mevalonato, compreendendo dois genes que codificam três atividades enzimáticas, é clonada a partir de Enterococcus faecalis. O gene mvaE codifica uma proteína com as atividades enzimáticas tanto de acetil-CoA acetiltransferase como de 3-hidróxi-3metilglutaril-CoA (HMG-CoA) redutase, as primeira e terceira proteínas da via e o gene mvaS codifica a segunda enzima da via, HMG-CoA sintase. O gene mvaE é amplificado a partir do DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um sítio de ligação ribossomal de E. coli e um espaçador na frente usando os seguintes iniciadores:
CF 07-60 (+) Início de mvaE w/ RBS + códon de início ATG Saci
5' - GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACA GTAGTTATTATTG (SEQ ID N°: 34)
CF 07-62 (-) Fundir mvaE a mvaS com RBS no meio
5' - TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTA TTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID N°: 35)
O gene mvaS é amplificado a partir do DNA genômico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) com um RBS e espaçador de E. coli na frente usando os seguintes iniciadores:
CF 07-61 (+) Fundir mvaE a mvaS com RBS no meio
5' - GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATT GGGATTGATAAA (SEQ ID N°: 36)
CF 07-102 (-) Final do gene mvaS Bgl\\
5' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 37)
Os fragmentos de PCR são fusionados, com a PCR usando os seguintes iniciadores:
CF 07-60 (+) Início de mvaE w/ RBS + códon de início ATG Saci 5'-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTAT TG (SEQ ID N°: 34)
CF 07-102 (-) Final do gene mvaS BglW
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5'-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 37)
O fragmento de fusão de PCR é purificado usando um kit Qiagen e digerido com as enzimas de restrição Sacl e Sg/ll. Este fragmento de DNA 5 digerido é purificado do gel usando um kit Qiagen e ligado no vetor disponível comercialmente pTrcHis2A, que foi digerido com Saci e BglW e purificado do gel.
A mistura de ligação é transformada em células E. coli Top 10 e colônias são selecionadas em placas de LA+50 pg/mL de carbenicilina. Um 10 total de seis colônias é escolhido e cultivado durante a noite em LB+50 μg/mL de carbenicilina e plasmídeos são isolados usando um kit Qiagen. Os plasmídeos são digeridos com Saci e BglW para checar os insertos e um plasmídeo correto é sequenciaco com os seguintes iniciadores:
CF 07-58 (+) Início do gene mvaE
5' - ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID N°: 38)
CF 07-59 (-) Final do gene mvaE
5' - ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID N°: 39)
CF 07-82 (+) Início do gene mvaS
5' - ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID N°: 40)
CF 07-83 (-) Final do gene mvaS
5' - TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 41)
CF 07-86 (+) Sequência em mvaE
5' - GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID N°: 42)
CF 07-87 (+) Sequência em mvaE
5' - TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID N°: 43)
CF 07-88 (+) Sequência em mvaE
5' - GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID N°: 44)
CF 07-89 (+)Sequência mvaS
5' - GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID N°: 45)
O plasmídeo chamado pTrcHis2AUpperPathway#1 está correto pelo sequenciamento e é transformado na epa BL21 de E. coli disponível
172/291 comercialmente. A seleção é feita em LA+ 50 pg/mL de carbenicilina. Dois transformantes são escolhidos e cultivados em LB+ 50 pg/mL de carbenicilina até que eles atinjam uma OD6oo de 1,5. Ambas as cepas são congeladas em um recipiente a -80°C na presença de glicerol. Cepas são designadas como CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway#1 em BL21, isolado #1 e CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway#1 em BL21, isolado #2. Descobriu-se que ambos os clones são se comportam identicamente quandos analisados.
V. Clonagem da Via Superior do MVA em pCL1920
O plasmídeo pTrcHis2AUpperPathway é digerido com a endonuclease de restrição Sspl para liberar um fragmento contendo pTrc-mvaEmvaS-(His tag)-terminator. Neste fragmento, a cauda de His não é traduzida. Este fragmento de 4,5 kbp de extremidades cegas é purificado a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. Um fragmento de 4,2 kbp defosforilado, com extremidades cegas de pCL1920 é preparado por digestão do vetor com a endonuclease de restrição PvM, tratamento com SAP e purificação do gel a partir de um E-gel de 1,2% usando o kit Gel Purification da Qiagen. Os dois fragmentos são ligados usando o Kit Quick Ligation da Roche e transformados em células químicamente competentes TOP10. Transformantes são selecionados em LA contendo espectinomicina (50 pg/mL). Uma colônia correta é identificada pela triagem pela presença do inserto por PCR. O plasmídeo é designado pCL PtrcUpperPathway (figuras 26 e 27A-27D).
VI. Cepas Expressando as Vias Superior e Inferior do Mevalonato Combinadas
Para obter uma cepa com via do mevalonato completa mais isopreno sintase de kudzu, plasmídeos pTrcKKDylkISkan e pCLpTrcUpperPathway são ambos transformados em células competentes BL21(ÀDE3) (Invitrogen) e transformantes são selecionados em LA contendo canamicina (50 pg/mL) e espectinomicina (50 pg/mL). Os transformantes são checados por prep. de plasmídeo para garantir que ambos os plasmídeos estejam retidos no hospedeiro. A cepa é designada MCM127.
VII. Produção de ácido mevalônico a partir de glicose em E. colil pUpperpa
173/291 thway
Colônias isoladas de BL21/pTrcHis2A-n?vaE/mvaS ou FM5/p pTrcHis2A-mvaE/a7vaS são inoculadas em LB + carbenicilina (100 pg/mL) e são cultivadas durante a noite a 37°C com agitação a 200 rpm. Essas culturas são diluídas em 50 mL de meio em frascos aletados de 250 mL para uma OD6oo de 0,1. O meio é TM3 + 1 ou 2% de glicose + carbenicilina (100 ug/mL) ou TM3 + 1% de glicose + óleo de soja hidrolisado + carbenicilina (100 ug/mL) ou TM3 + biomassa (painço (switchgrass), palha de milho ou bagaço preparado). Culturas são cultivadas a 30°C com agitação a 200 rpm por aproximadamente 2-3 horas até uma OD6oo de 0,4 ser atingida. Neste momento a expressão da construção mvaE mvaS é induzida pela adição de IPTG (400 μΜ). Culturas são incubadas por 20 ou 40 horas adicionais com amostras sendo tomadas em intervalos de 2 horas a 6 horas após a indução e em seguida em 24, 36 e 48 horas conforme necessário. A amostragem é feita pela remoção de 1 mL de cultura, medição da OD6oo, sedimentação das células em uma Microfuge, remoção do sobrenadante e análise do mesmo para ácido mevalônico.
Uma fermentação de 14 litros de células de E coli com ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos de HMG-CoA redutase, HMG-CoA sintase e AA-CoA tiolase de Enterococcus faecalis produz 22 gramas de ácido mevalônico com meio TM3 e 2% de glicose como o meio celular. Um frasco em agitação dessas células produz 2-4 gramas de ácido mevalônico por litro com meio LB e 1% de glicose como o meio de cultura de células. A produção de ácido mevalônico nessas cepas indica que a via do MVA era funcional em E coli.
VIII. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo as vias superior e inferior do MVA mais isopreno sintase de kudzu.
As seguintes cepas são criadas por transformação em várias combinações de plasmídeos contendo o gene da isopreno sintase de kudzu e da via superior e inferior do MVA, como descrito acima e os plasmídeos contendo os genes idi, dxs, dxr e de isopreno sintase descritos no Exemplo 7. As células hospedeiras usadas são BL21 (ÀDE3) quimicamente competen
174/291 tes e as transformações são feitas por métodos padrão. Transformantes são selecionados em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL) ou canamicina mais espectinomicina (ambas em uma concentração de 50 pg/mL). Placas foram cultivadas a 37°C. As cepas resultantes são designadas como se segue:
Cultivadas em canamicina mais espectinomicina (50 pg/mL cada)
MCM127 - pCL Upper MVA + pTrcKKDylklS (kan) em BL21(ADE3)
MCM131 - pCL1920 + pTrcKKDylklS (kan) em BL21(ADE3) MCM125 - pCL Upper MVA + pTrcHis2B (kan) em BL21(ADE3) Cultivadas em canamicina (50 pg/mL)
MCM64 - pTrcKudzu ylDI DXS (kan) em BL21(ADE3)
MCM50 - pTrcKudzu (kan) em BL21(ADE3)
MCM123 - pTrcKudzu ylDI DXS DXR (kan) em BL21(ADE3)
As cepas acima são inoculadas a partir de estoques congelados para LA + antibiótico apropriado e cultivadas durante a noite a 37°C. Uma única colônia de cada placa é usada para inocular frascos de agitação (25 mL de LB + o antibiótico apropriado). Os frascos são incubados a 22°C durante a noite com agitação a 200 rpm. Na manhã seguinte os frascos são transferidos para uma incubadora a 37°C e cultivados por 4,5 horas adicionais com agitação a 200 rpm. As culturas de 25 mL são centrifugadas para sedimentar as células e estas são ressuspendidas em 5 mL de LB + o antibiótico apropriado. As culturas são em seguida diluídas em 25 mL de LB+1% de glicose + o antibiótico apropriado para uma OD6oo de 0,1. São preparados dois frascos para cada cepa, um para indução com IPTG (800 μΜ), o segundo não é induzido. As culturas são incubadas a 37°C com agitação a 250 rpm. Um grupo das culturas é induzido após 1,50 horas (imediatamente após o tempo 1 de amostragem). Em cada tempo de amostragem, a Οϋθοο é medida e a quantidade de isopreno determinada conforme descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Tabela 3. A quantidade de isopreno feito é apresentada como a quantidade do pico de produção para a cepa particular.
175/291
Tabela 3. Produção de isopreno em cepas de E. coli
Cepa Isopreno (pg/litro/OD/h)
MCM50 23,8
MCM64 289
MCM125 ND
MCM131 Traço
MCM127 874
ND: não detectado
Traço: pico presente, mas não integrável.
IX. Análise de ácido mevalônico
A mevalonolactona (1,0 g, 7,7 mmols) (CAS# 503-48-0) é fornecida pela Sigma-Aldrich (Wl, USA) como um xarope que é dissolvido em água (7,7 mL) e e é tratada com hidróxido de potássio (7,7 mmols) a fim de gerar o sal de potássio do ácido mevalônico. A conversão em ácido mevalônico é confirmada por análise de 1H RMN. Amostras para análise de HPLC são preparadas pela centrifugação a 14.000 rpm por 5 minutos para remover células, seguida pela adição de uma alíquota de 300 pL de sobrenadante a 900 pL de H2O. Em seguida, é adicionado ácido perclórico (36 pL de uma solução a 70%) seguido pela mistura e resfriamento em gelo por 5 minutos. As amostras são em seguida centrifugadas novamente (14.000 rpm por 5 min) e o sobrenadante transferido para HPLC. Padrões de ácido mevalônico (20, 10, 5, 1 e 0,5 g/L) são preparados da mesma maneira. A análise de ácido mevalônico (volume de injeção de 20 uL) é realizada por HPLC usando uma coluna BioRad Aminex 87-H+ (300 mm por 7,0 mm) eluída com 5 mM de ácido sulfúrico a 0,6 mL/min com detecção do índice de retração (IR). Sob estas condições, o ácido mevalônico é eluído na forma de lactona em
18,5 minutos.
X. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo a via superior do MVA mais isopreno sintase de kudzu
Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato e isopreno sintase de kudzu é usada para produzir isopreno em células em cultura de batelada alimentada. Este expe
176/291 rimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 2,2 g/L de isopreno.
Receita do meio (por litro de meio de fermentação): O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: a solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2* 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoQ4* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperPathway (figura 26) e pTrcKKDylklS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de isopreno a partir da glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de peptona de sojaextrato de levedura-glicose. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, quando medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 54 horas é de 3,7 kg. A
177/291 indução é feita pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG é levada a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atinge um valor de 10. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 190. A concentração de IPTG é elevada a 100 uM em 38 horas de fermentação. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 54. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um volume final de 2,2 g/L (figura 55). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 54 horas é de 15,9 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 56.
XI. Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonate e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L
Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptideos da via do mevalonate e isopreno sintase de kudzu é usada para produzir isopreno em células em cultura de batelada alimentada. Este experimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 3,0 g/L de isopreno.
Receita do meio (por litro de meio de fermentação): O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: a solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4* H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4* 7H2O, 1 g de CoCI2* 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4* 2H2O. Os componentes são dissol
178/291 vidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc 5 KKDylklS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é esfriado em uma placa de I_B ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser culti10 vado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose 15 distribuída ao biorreator durante a fermentação de 59 horas é de 2,2 kg. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atinge um valor de 10. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 190. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 93. O 20 nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 3,0 g/L (figura 94). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 59 horas é de 22,8 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na FIGURA 95. O rendimento molar do car25 bono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 2,2%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose é de 1,0%.
XII. Fermentação de isopreno em E. co/z expressando genes da via do mevalonato e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L
Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptideos da via do mevalonato, isopreno sintase de Pueraria lobata e isopreno sintase de kudzu é usada para produzir isopreno em células em cultu
179/291 ra de batelada alimentada. Este experimento demonstra que células em cultivo sob condições de limitação de glicose resultam na produção de 3,3 g/L de isopreno.
i) Construção de pCLPtrcUpperPathwayHGS2
O gene que codifica a isopreno sintase de Pueraría lobata é amplificado por PCR usando os iniciadores Nsil-RBS-HGS F (CTTGATGCATCCTGCATTCGCCCTTAGGAGG, SEQ ID N°: 88) e pTrcR (CCAGGCAAATTCTGl I I IATCAG, SEQ ID N°: 89), e pTrcKKDylklS como o molde. O produto de PCR assim obtido é digerido por restrição com Λ/s/l e Psfl e purificado em gel. O plasmídeo pCL PtrcUpperPathway é digerido por restrição com Pstl e defosforilado usando a fosfatase alcalina rAPid (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.
Esses fragmentos de DNA são ligados e a reação de ligação é transformada em células quimicamente competentes de E. coli Top10 (Invitrogen), plaqueadas em L ágar contendo espectinomicina (50 pg/ml) e incubadas durante a noite a 37°C. O DNA plasmidial é preparado a partir de 6 clones usando o kit de minipreparação Qiaquick Spin. O DNA plasmidial é digerido com as enzimas de restrição EcoRV e Mlu\ para identificar um clone em que o inserto tenha a orientação certa (ou seja, o gene orientado da mesma forma que o promotor pTrc).
O plasmídeo correto resultante é designado pCLPtrcUpperPathwayHGS2. Este plasmídeo é avaliado usando o ensaio headspace aqui descrito e descobriu-se que produz isopreno em E. coli Top10, validando assim a funcionalidade do gene. O plasmídeo é transformado em BL21(ADE3) contendo pTrcKKDylklS para produzir a cepa BL21/ pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDylklS. Esta cepa tem uma cópia extra da isopreno sintase comparada com a cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS (Exemplo 8, parte XI). Esta cepa também tem maiores expressão e atividade de HMGS comparada com a cepa BL21/pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS usada no Exemplo 8, parte XI.
ii) Fermentação de isopreno em E. coli expressando pCLPtrcUpperPathwayHGS2-pTrcKKDylklS e cultivada em cultura de batelada alimentada na es
180/291 cala de 15 L
Receita do meio (por litro de meio de fermentação): O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: a solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4* H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4* 7H2O, 1 g de CoCI2* 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCLPtrcUpperPathwayHGS2 e pTrc KKDylklS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 58 horas é de 2,1 kg. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 25
181/291 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atinge um valor de 9. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 170. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 104. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 3,3 g/L (figura 105). A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 58 horas é de 24,5 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 106. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 2,5%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose é de 1,2%. A análise mostra que a atividade da isopreno sintase é aumentada aproximadamente 3-4 vezes comparada com BL21 expressando os plasmídeos CL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS (dados não mostrados).
XIII. Integração cromossômica da via inferior do mevalonato em E. coli.
Um operon sintético contendo mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e a IPP isomerase é integrado ao cromossoma de E. coli. Se desejado, a expressão pode ser alterada pela integração de diferentes promotores 5' do operon.
A Tabela 9 lista os iniciadores usados para este experimento. Tabela 9. Iniciadores
MCM78 attTn7 up rev para a construção de integração gcatgctcgagcggccgc I 1 I lAATCAAACATCCTGCCAACTC (SEQ ID N°: 91)
MCM79 attTn7 down rev para a construção de integração) gatcg aagggcg atcgT GT CACAGT CTG G CGAAACCG (SEQ ID N°: 92)
MCM88 attTn7 up forw para a construção de integração ctgaattctgcagatatcTGi i i i iCCACTCTTCGTTCACTTT (SEQ ID N°: 93)
MCM89 attTn7 down forw para a construção de integração tctagagggcccAAGAAAAATGCCCCGCTTACG (SEQ ID N°: 94)
MCM104 promotor Gl 1.2 - MVK Gatcgcggccgcgcccttgacgatgcacatcctgagcaaataattcaaccacaattgtgagcggataacacaaggaggaacagctatgtcattaccgttcttaacttc (SEQ ID N°: 95)
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MCM105 terminador aspA - ylDI Gatcgggccccaagaaaaaaggcacgcatctgacgtgccttttttatttgtaacgcgttgttatagcattcta (SEQ ID N°: 96)
MCM120 forw de attTn7: homologia com attTn7, homologia com marcador GB aaagtagccgaagatgacggtttgtccatggagttggcaggatgtttgattaaagcAATTAACCCTCACTAAAGGGCGG (SEQ ID N°: 97)
MCM127 Rev complement de 1.2 Gl: homologia com marcador GB (extralongo), promotor, RBS, ATG AGAGTGTTCACCAAAAATAATAACCTTT CCCGGT GCAgaagttaagaacggtaagacatagctgtttcctccttgtgttaccgctcacaattagtggttgaattattgctcaggatgtggcatcgtcaagggTAATACGACTCACTATAGGGCTCG (SEQ ID N°: 98)
i) Construção de vetor-alvo
O sítio attTn7 é selecionado para integração. Regiões de homologia a montante (attTn7 up) (iniciadores MCM78 e MCM79) e a jusante (attTn7 down) (iniciadores MCM88 e MCM89) são amplificadas por PCR a partir de células MG1655. Uma reação de 50 uL com 1uL de iniciadores a 10uM, 3uL de ddH2O, 45uL de Platinum PCR Supermix High Fidelity da Invitrogen e uma colônia raspada de MG1655 é desnaturada por 2:00 a 94°C, submetida a 25 ciclos (2:00 a 94°C, 0:30 a 50 °C e 1:00 a 68°C), extensão por 7:00 a 72°C e resfriada a 4°C. Este DNA resultante é clonado em pCR2.1 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, resultando nos plasmídeos MCM278 (attTn7 up) e MCM252 (attTn7 down). O fragmento de 832bp digerido com Apa\-Pvu\ purificado em gel a partir de MCM252 é clonado no plasmídeo pR6K digerido com Apa\-Pvu\ e purificado em gel, criando o plasmídeo MCM276. O fragmento de 825bp digerido com Pstt-Nott e purificado em gel a partir de MCM278 é clonado em MCM276 digerido com Pst\-Not\ e purificado em gel, criando o plasmídeo MCM281.
ii) Clonagem da via inferior e promotor
Os genes MVK-PMK-MVD-IDI são amplificados a partir de pTrcKKDylklS com os iniciadores MCM104 e MCM105 usando o sistema de PCR Expand Long PCR da Roche de acordo com as instruções do fabricante.Este produto é digerido com Nott e Apal e clonado em MCM281, que tinha
183/291 sido digerido com Notl e Apal e purificado em gel. Os iniciadores MCM120 e MCM127 são usados para amplificar o cassete CMR a partir do DNA molde FRT-gb2-Cm-FRT da GeneBridges usando Pfu Ultra II da Stratagene.Um programa de PCR com desnaturação a 95°C por 4:00, 5 ciclos de 95°C por 0:20, 55°C por 0:20, 72°C por 2:00, 25 ciclos de 95°C por 0:20, 58°C por 0:20, 72°C por 2:00, 72°C por 10:00, e em seguida o resfriamento a 4°C é usado com quatro reações de PCR de 50uL contendo 1uL de molde a ~10ng/uL, 1uL de cada iniciador, 1,25 uL de dNTPs 10mM, 5uL de tampão 10x, 1uL de enzima e 39,75uL de ddH20. Reações são combinadas, purificadas em uma coluna de purificação de PCR da Qiagen e usadas na eletroporação de células Pir1 lavadas em água contendo o plasmídeo MCM296. A eletroporação é efetuada em cuvetas de 2mM a 2,5V e 200 ohms. As reações de eletroporação são recuperadas em LB por 3h a 30°C. O transformante MCM330 é selecionado em LA com CMP5, Kan50 (figuras 107 e 108A-108C).
iii) Integração em cromossoma de E. coli
O DNA de minipreparação (kit Qiaquick Spin) de MCM330 é digerido com SnaBI e usado na eletroporação de BL21(DE3) (Novagen) ou MG1655 contendo o plasmídeo pRedET Carb da GeneBridges. Células são cultivadas a 30°C até ~OD1, em seguida induzidas com 0,4% de Larabinose a 37°C por 1,5 horas. Essas células são lavadas três vezes em ddH2O a 4°C antes da eletroporação com 2uL de DNA. Integrações são selecionadas em L ágar contendo cloranfenicol (5 ug/mL) e subsequentemente foi confirmado que elas não cresciam em L ágar + canamicina (50 ug/mL). A integração de MCM331 em BL21 e a integração de MCM333 em MG1655 são congeladas.
iv) Construção de pET24D-Kudzu que codifica a isopreno sintase de kudzu
O gene da isopreno sintase de kudzu é subclonado no vetor pET24d (Novagen) a partir do vetor pCR2.1 (Invitrogen). Em particular, o gene da isopreno sintase de kudzu é amplificado a partir do DNA molde pTrcKudzu usando os iniciadores MCM50 5-GATCATGCAT TCGCCCTTAG GAGGTAAAAA AACATGTGTG CGACCTCTTC TCAATTTACT (SEQ ID N°:
184/291
99) e MCM53 5'-CGGTCGACGG ATCCCTGCAG TTAGACATAC ATCAGCTG (SEQ ID N°: 100). Reações de PCR são executadas usando Taq DNA Polimerase (Invitrogen) e o produto de PCR resultante é clonado no vetor de clonagem pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen) e transformado em células quimicamente competentes de E. coli Top10 (Invitrogen). Transformantes são plaqueados em L ágar contendo carbenicilina (50 pg/mL) e incubados durante a noite a 37°C. Culturas de 5 mL de caldo Luria contendo carbenicilina a 50 pg/ml são inoculadas com um só transformante e cultivadas durante a noite a 37°C. Cinco colônias são triadas pelo inserto correto por sequenciamento de DNA plasmidial isolado de 1 mL de cultura líquida (Caldo Luria) e purificado usando o kit de minipreparação QIAprep Spin (Qiagen). Ο plasmídeo resultante, designado MCM93, contém a sequência codificante de isopreno sintase de kudzu em um arcabouço de pCR2.1.
A sequência codificante de kudzu é removida por digestão de endonuclease de restrição com Pci\ e SamH1 (Roche) e purificada em gel usando o kit QIAquick Gel Extraction (Qiagen). O DNA do vetor pET24d é digerido com Nco\ e Ba/nHI (Roche), tratado com fosfatase alcalina de camarão (Roche) e purificado usando o kit QIAprep Spin Mini-prep (Qiagen). O fragmento de isopreno sintase de kudzu é ligado ao pET24d NcoMBamHI digerido usando o kit Rapid DNA Ligation (Roche) em uma proporção de 5:1 de fragmento para vetor em um volume total de 20 pL. Uma parte de uma mistura de ligação (5 pL) é transformada em células quimicamente competentes de E. coli Top 10 e plaqueada em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). O transformante correto é confirmado por sequenciamento e transformado em células BL21(ADE3)pLysS quimicamente competentes (Novagen). Uma única colônia é selecionada após o crescimento durante a noite a 37°C em L ágar contendo canamicina (50 pg/mL). Um mapa do plasmídeo resultante designado como pET24D-Kudzu é mostrado na figura 109. A sequência de pET24D-Kudzu (SEQ ID N°: 101) é mostrada nas figuras 110A e 110B. A atividade de isopreno sintase é confirmada usando um ensaio headspace.
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v) Cepas de produção
As cepas MCM331 e MCM333 foram cotransformadas com os plasmídeos pCLPtrcupperpathway e pTrcKudzu ou pETKudzu, resultando nas cepas mostradas na Tabela 10.
Tabela 10. Cepas de Produção
Origem Inferior Integrada Plasmídeo de MVA Superior Plasmídeo de isopreno sintase Cepa de Produção
BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpper Pathway pTrcKudzu MCM343
BL21(DE3) MCM331 pCLPtrcUpper Pathway pET24DKudzu MCM335
MG1655 MCM333 pCLPtrcUpper Pathway pTrcKudzu MCM345
vi) Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L.
Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de Κ2ΗΡΟ4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
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A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo a via inferior do MVA integrada gi1.2 descrita acima e os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrcKudzu. Este experimento é realizado para monitorar a formação de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é esfriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 57 horas é de 3,9 kg. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 100 uM quando a taxa de evolução de dióxido de carbono atinge100 mmol/L/h. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 111A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 1,6 g/L (figura 111B). A produtividade específica de isopreno ao longo da fermentação é apresentada na figura 111C e picos em
1,2 mg/OD/h. A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 57 horas é de 16,2 g. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 0,9%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose é de 0,4%. XIV. Produção de isopreno em E. coli BL21 contendo a isopreno sintase de kudzu usando glicerol como fonte de carbono
Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando isopreno sintase de kudzu é usada para produzir isopreno em células alimentadas com glicerol em cultura de batelada alimentada. Este experimento demonstra que células em cultivo na presença de glicerol (sem glicose) resultam na produção de 2,2 g/L de isopreno.
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Receita do meio (por litro de meio de fermentação): O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Glicerol, 5,1 g, 0,1 g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X: O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2* 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4* 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo o plasmídeo pTrcKudzu. Este experimento é realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicerol na temperatura de 35°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LA ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de peptona de soja-extrato de levedura-glicose e cultivada a 35°C. Após 0 inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 600 mL são usados para inocular um biorreator de 7,5 L.
O glicerol é adicionado em taxa exponencial até que as células atinjam uma densidade ótica a 550 nm (OD55o) de 153.A quantidade total de glicerol distribuído ao biorreator durante a fermentação de 36 horas é de 1,7 kg. Fora a glicose no inóculo, nenhuma glicose é adicionada ao biorreator. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 20 uM quando a OD550 atinge um valor de 50. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 57. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de iso
188/291 preno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 2,2 g/L (figura 58). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 54 horas é de 20,9 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 59.
XV. Fermentação de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonate e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L usando açúcar invertido como fonte de carbono
Uma fermentação na escala de 15 L de E. coli expressando polipeptídeos da via do mevalonato e isopreno sintase de kudzu é usada para produzir isopreno em células alimentadas com açúcar invertido em cultura de batelada alimentada. Este experimento demonstra que células em cultivo na presença de açúcar invertido resultam na produção de 2,4 g/L de isopreno. Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de açúcar invertido, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume esterilizado por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21(DE3) contendo os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de iso
189/291 preno a partir de açúcar invertido na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
O açúcar invertido é adicionado em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de açúcar invertido é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de açúcar invertido distribuída ao biorreator durante a fermentação de 44 horas é de 2,4 kg. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD55o) atinge um valor de 9. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 200. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 96. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 2,4 g/L (figura 97). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 44 horas é de 18,4 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 98. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 1,7%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose é de 0,8%.
Exemplo 9: Construção da via superior e inferior do MVA para integração em Bacillus subtilis
I. Construção da via Superior do MVA em Bacillus subtilis
A via superior de Enterococcus faecalis é integrada em B. subtilis sob o controle do promotor aprE. A via superior consiste em dois genes; mvaE, que codifica AACT e HMGR, e mvaS, que codifica HMGS. Os dois genes são fusionados a um códon de parada no meio deles, um sítio RBS na frente de mvaS e estão sob o controle do promotor aprE. Um terminador está situado após o gene mvaE. O marcador de resistência a cloranfenicol é
190/291 clonado após o gene mvaE e a construção é integrada no locus aprE por dupla permutação usando regiões flanqueadoras homólogas.
Quatro fragmentos de DNA são amplificados por PCR tal que eles contenham profusões que permitirão que eles sejam fusionados por uma reação de PCR. Amplificações por PCR são executadas usando Herculase polimerase de acordo com as instruções do fabricante.
1. PaprE
CF 07-134 (+) Início de promotor aprE Pstl
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82)
CF 07-94 (-) Fusiona PaprE a mvaE
5'- CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTT
AA (SEQ ID N°: 83)
Molde: DNA cromossômico de Bacillus subtilis
2. mvaE
CF 07-93 (+) fusiona mvaE ao promotor aprE (códon de início GTG)
5'- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTA TTG (SEQ ID N°: 84)
CF 07-62 (-) Fusiona mvaE a mvaS com RBS no meio
5'- TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATT GTTTTCTTAAATC (SEQ ID N°: 35)
Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis (da ATCC)
3. mvaS
CF 07-61 (+) Fusiona mvaE a mvaS com RBS no meio
5'- GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATT GGGATTGATAAA (SEQ ID N°: 36)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'- CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAA CGGT (SEQ ID N°: 85)
Molde: DNA cromossômico de Enterococcus faecalis
4. Terminador de serina protease alcalina de B. amyliquefaciens
CF 07-123 (+) Fusiona o final do mvaS ao terminador
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5'- ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGG
CCCCG (SEQ ID N°: 86)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens BamHI
5’- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID
N°: 63)
Molde: DNA cromossômico de Bacillus amyliquefaciens
Reações de Fusão por PCR
5. Fusionar mvaE a mvaS
CF 07-93 (+) fusiona mvaE ao promotor aprE (códon de início GTG)
5- TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTA
TTG (SEQ ID N°: 84)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5’CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 85)
Molde: #2 e 3 acima
6. Fusionar mvaE-mvaS ao promotor aprE
CF 07-134 (+) Início do promotor aprE Pstl
5’- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82)
CF 07-124 (-) Fusiona o final do mvaS ao terminador
5'CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 85)
Molde #1 e #4 acima
7. Fusiona PaprE-mvaE-mvaS ao terminador
CF 07-134 (+) Início de aprE promotor Pstl
5'- GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82)
CF 07-46 (-) Final do terminador de B. amyliquefaciens BamHI
5'- GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID
N°: 63)
Molde: #4 e #6
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O produto é digerido com endonucleases de restrição Pstl/BamHI e ligado a pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vetors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, p. 615-624. In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch, e R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, DC) que é digerido com PstVBamHl. A ligação é transformada em células quimicamente competentes de E.coli TOP 10 e transformantes são selecionados em LA contendo carbenicilina (50 pg/mL). O plasmídeo correto é identificado por sequenciamento e é designado pJMUpperpathway2 (figuras 50 e 51). O DNA plasmidial purificado é transformado em Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK e transformantes são selecionados em L ágar contendo cloranfenicol (5 pg/mL). Uma colônia correta é selecionada e é plaqueada sequencialmente em L ágar contendo cloranfenicol a 10, 15 e 25 pg/mL para amplificar o número de cópias do cassete contendo a via superior.
A cepa resultante é testada pela produção de ácido mevalônico pelo crescimento em LB contendo 1 % de glicose e 1 %. Culturas são analisadas por GC para a produção de ácido mevalônico. Esta cepa é usada subsequentemente como um hospedeiro para a integração da via inferior do mevalonato.
Os seguintes iniciadores são usados para sequenciar as várias construções acima.
Iniciadores de sequenciamento:
CF 07-134 (+) Início de promotor aprE Pstl õ-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID N°: 82) CF 07-58 (+) Início de gene mvaE 5'-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID N°: 38) CF 07-59 (-) Final do gene mvaE 5'-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID N°: 39)
CF 07-82 (+) Início de gene mvaS
5'-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID N°: 40)
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CF 07-83 (-) Final do gene mvaS
5-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID N°: 41)
CF 07-86 (+) Sequência em mvaE 5'GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID N°: 42) CF 07-87 (+) Sequência em mvaE 5'-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID N°: 43) CF 07-88 (+) Sequência em mvaE 5'-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID N°: 44) CF 07-89 (+) Sequência mvaS 5'-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID N°: 45) Transformantes são selecionados em LA contendo cloranfenicol em uma concentração de 5 pg/mL. Confirmou-se que uma colônia tinha a integração correta por sequenciamento e esta é plaqueada em LA contendo concentrações crescentes de cloranfenicol no decorrer de sete dias, até um nível final de 25 pg/mL. Isto resulta na amplificação do cassete contendo os genes de interesse. A cepa resultante é designada CF 455: pJMupperpathway#1 X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (amplificada para crescer em LA contendo cloranfenicol a 25 pg/mL).
II. Construção de uma via inferior do MVA em Bacillus subtilis
A via inferior do MVA, consistindo nos genes mvk1, pmk, mpd e idi combinados em um cassete consistindo em regiões de DNA flanqueadoras da região nprE do cromossoma de B. subtilis (sítio de integração), no promotor aprE, e no marcador de resistência à espectinomicina (veja as figuras 28 e 29). Este cassete é sintetizado por DNA2.0 e é integrado ao cromossoma de B. subtilis contendo a via superior do MVA integrada no locus aprE. O gene da isopreno sintase de kudzu é expresso a partir do plasmídeo que se replica descrito no Exemplo 4 e é transformado na cepa tanto com a via superior como a inferior integradas.
Exemplo 10: Composições exemplares de isopreno e métodos para fazê-las I. Análise Composicional de gás de escape da fermentação contendo isopreno
Uma fermentação na escala de 14 L é realizada com uma cepa
194/291 de E. coli BL21(DE3) recombinante contendo dois plasmídeos (pCL upperMev; pTrcKKDylklS que codifica a via completa do mevalonato para a biossintese de precursor isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu. O gás de escape da fermentação do tanque de 14 L é coletado em recipientes de headspace de 20 mL aproximadamente no momento do pico de produtividade de isopreno (27,9 horas transcorridas do tempo de fermentação, EFT) e analisado por headspace GC/MS pelos componentes voláteis.
A análise headspace é realizada com um sistema Agilent 6890 GC/MS equipado com uma coluna Agilent HP-5MS GC/MS (30 m x 250 pm; 0.25 pm de espessura de filme). Um injetor automático combiPAL é usado para amostragem de alíquotas de 500 uL a partir de recipientes headspace de 20 mL. O método de GC/MS utiliza hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção é mantida a 250°C com uma relação de divisão de 50:1. A temperatura do forno é mantida a 37°C para um período de 2 minutos iniciais, seguido por um aumento até 237°C em uma velocidade de 25°C/min para um tempo de método total de 10 minutos. O detector seletivo de massas Agilent 5793N faz varreduras de m/z 29 a m/z 300. O limite de detecção deste sistema é de aproximadamente 0,1 ug/Lgas ou aproximadamente 0,1 ppm. Se desejado, pode ser utilizado equipamento mais sensível com um limite de detecção menor.
O gás de escape consiste em 99,925 % (v/v) de gases permanentes (N2, CO2 e O2), aproximadamente 0,075% de (2-metil-1,3-butadieno) isopreno (-750 ppmv, 2100 pg/L) e quantidades menores (<50 ppmv) de etanol, acetona, e dois alcoóis C5 prenílicos. A quantidade de vapor de água não é determinada, mas é estimada como sendo igual à pressão de vapor em equilíbrio a 0°C. A composição da fração orgânica volátil é determinada por integração da área sob os picos no cromatograma de GC/MS (figuras 86A e 86B) e é listada na Tabela 6. As curvas de calibração para padrões de etanol e acetona permitiram a conversão de área GC área em concentração de fase gasosa em unidade de ug/L usando métodos padrão.
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Tabela 6. Composição de componentes orgânicos voláteis no gás de escape de fermentação.
O gás de escape é analisado no tempo de 27,9 horas de uma fermentação usando uma cepa E. coli BL21(DE3) expressando uma via do mevalonato heteróloga, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu.
Composto RT (min) GC área Área % Cone. (ug/L)
Etanol 1,669 239005 0,84 62 +/- 6
Acetona 1,703 288352 1,02 42 +/- 4
(2-metil-1,3butadieno) Isopreno 1,829 27764544 97,81 2000 +/- 200
3-metil-3-buten-1 -ol 3,493 35060 0,12 <10
3-metil-2-buten-1-ol 4,116 58153 0,20 <10
II. Medição de traços de compostos orgânicos voláteis (VOCs) coproduzidos com isopreno durante a fermentação de uma cepa de E. coli recombinante
Uma fermentação na escala de 14 L é realizada com uma cepa de E. coli BL21(DE3) recombinante contendo dois plasmídeos (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) que codifica a via completa do mevalonato para a biossíntese de precursor isoprenoide, uma isoprenil pirofosfato isomerase de levedura e uma isopreno sintase de kudzu.
O gás de escape da fermentação é passado por recipientes headspace resfriados a fim de concentrar e identificar traços de componentes orgânicos voláteis. O gás de escape desta fermentação é amostrado em uma taxa de 1 L/min por 10 minutos através de um recipiente headspace de 20 mL empacotado com lã de quartzo (2g) e resfriado a -78°C com gelo seco. O recipiente é tampado novamente com uma tampa de recipiente nova e analisado por headspace GC/MS para VOCs capturados usando as condições descritas no Exemplo 10, parte I. As proporções de compostos observadas nas figuras 87A-87D são uma combinação de nível global no gás de escape de fermentação, a pressão de vapor relativa a -78°C, e a resposta do detector do espectrômetro de massas. Por exemplo, o nível baixo de isopreno em relação aos volá
196/291 teis oxigenados (por exemplo, acetona e etanol) é uma função da alta volatilidade deste material tal que ele não se acumula no recipiente headspace a 78°C.
A presença de muitos desses compostos é única para composi5 ções de isopreno derivadas de fontes biológicas. Os resultados são representados nas figuras 87A-87D e resumidos nas Tabelas 7A e 7B.
Tabela 7A: Voláteis traços presentes em gás de escape produzido por E. coli BL2KDE3) (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) após criocaptura a -78°C.
Composto RT (min) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
Acetaldeído 1,542 4019861 4,841 40,14
Etanol 1,634 10553620 12,708 105,39
Acetona 1,727 7236323 8,714 72,26
2-metil-1,3-butadieno 1,777 10013714 12,058 100,00
1-propanol 1,987 163574 0,197 1,63
Diacetila 2,156 221078 0,266 2,21
2-metil-3-buten-2-ol 2,316 902735 1,087 9,01
2-metil-1 -propanol 2,451 446387 0,538 4,46
3-metil-1-butanal 2,7 165162 0,199 1,65
1-butanol 2,791 231738 0,279 2,31
3-metil-3-buten-1 -ol 3,514 14851860 17,884 148,32
3-metil-1-butanol 3,557 8458483 10,185 84,47
3-metil-2-buten-1 -ol 4,042 18201341 21,917 181,76
3-metil-2-butenal 4,153 1837273 2,212 18,35
Acetato de 3-metilbutila 5,197 196136 0,236 1,96
Acetato de 3-metil-3-buten- 1-ila 5,284 652132 0,785 6,51
2-heptanona 5,348 67224 0,081 0,67
2,5-dimetilpirazina 5,591 58029 0,070 0,58
Acetato de 3-metil-2-buten- 1-ila 5,676 1686507 2,031 16,84
6-metil-5-hepten-2-ona 6,307 101797 0,123 1,02
2,4,5-trimetilpiridina 6,39 68477 0,082 0,68
197/291
Composto RT (min) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
2,3,5-trimetilpirazina 6,485 30420 0,037 0,30
(E)-3,7-dimetil-1,3,6- octatrieno 6,766 848928 1,022 8,48
(Z)-3,7-dimetil-1,3,6octatrieno 6,864 448810 0,540 4,48
Butirato de 3-metil-2-buten- 1-ila_ 7,294 105356 0,127 1,05
Citronellal 7,756 208092 0,251 2,08
2,3-ciclo-heptenolpiridina 8,98 1119947 1,349 11,18
1 Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto listado.
2 % de área é a área do pico expressa como uma % relativa à área total do pico de todos os compostos.
3 Proporção em % é a área do pico expressa como uma % relativa à área do pico de 2-metil-1,3-butadieno.
Tabela 7B. Voláteis traços presentes em gás de escape produzido por E. coli BL2KDE3) (pCL upperMev; pTrcKKDylklS) após criocaptura a -196°C.
Composto RT (min) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
Acetaldeído 1,54 1655710 0,276 0,33
Metanotiol 1,584 173620 0,029 0,03
Etanol 1,631 10259680 1,707 2,03
Acetona 1,722 73089100 12,164 14,43
2-metil-1,3-butadieno 1,771 506349429 84,269 100,00
acetato de metiia 1,852 320112 0,053 0,06
1-propanol 1,983 156752 0,026 0,03
Diacetila 2,148 67635 0,011 0,01
2-butanona 2,216 254364 0,042 0,05
2-metil-3-buten-2-ol 2,312 684708 0,114 0,14
acetato de etila 2,345 2226391 0,371 0,44
2-metil-1-propanol 2,451 187719 0,031 0,04
3-metil-1-butanal 2,696 115723 0,019 0,02
198/291
Composto RT (min) Área GC1 % de área2 Proporção em %3
3-metil-2-butanona 2,751 116861 0,019 0,02
1-butanol 2,792 54555 0,009 0,01
2-pentanona 3,034 66520 0,011 0,01
3-metil-3-buten-1 -ol 3,516 1123520 0,187 0,22
3-metil-1 -butanol 3,561 572836 0,095 0,11
isobutirato de etila 3,861 142056 0,024 0,03
3-metil-2-buten-1 -ol 4,048 302558 0,050 0,06
3-metil-2-butenal 4,152 585690 0,097 0,12
acetato de butila 4,502 29665 0,005 0,01
acetato de 3- metilbutila 5,194 271797 0,045 0,05
Acetato de 3-metil-3buten-1-ila 5,281 705366 0,117 0,14
Acetato de 3-metil-2buten-1-ila 5,675 815186 0,136 0,16
(E)-3,7-dimetil-1,3,6- octatrieno 6,766 207061 0,034 0,04
(Z)-3,7-dimetil-1,3,6- octatrieno 6,863 94294 0,016 0,02
2,3-cicloheptenolpiridina 8,983 135104 0,022 0,03
1 Área GC é a área não corrigida sob o pico correspondente ao composto listado.
2 % de área é a área do pico expressa como uma % relativa à área total do pico de todos os compostos.
3 Proporção em % é a área do pico expressa como uma % relativa à área do pico 5 de 2-metil-1,3-butadieno.
III. Ausência de isômeros de hidrocarbonetos C5 em isopreno derivado de fermentação.
A criocaptura do isopreno presente no gás de escape da fermentação é realizada usando um recipiente headspace de 2 ml_ resfriado em 10 nitrogênio líquido. O gás de escape (1 L/min) é passado por um recipiente de 20 ml_ contendo pelotas de hidróxido de sódio a fim de minimizar o acúmulo de CO2 sólido e em gelo no recipiente de 2 ml_ (-196°C). Aproximadamente 10L de gás de escape são passados pelo recipiente, após o que são aquecí199/291 dos até -78°C com ventilação, seguido pelo fechamento, de novo, com uma tampa de recipiente nova e análise por GC/MS.
A análise por GC/MS headspace é realizada com um sistema Agilent 6890 GC/MS usando uma seringa hermética a gás delOOuL no modo headspace. Uma coluna Zebron ZB-624 GC/MS (30 m x 250 pm; espessura de filme de 1,40 pm) é usada para separação de analitos. O injetor automático GC é equipado com uma seringa hermética a gás de 100 uL e a altura da agulha é ajustada para permitir a injeção de uma amostra headspace de 50 uL de um recipiente GC de 2 mL. O método GC/MS utiliza hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção é mantida a 200°C com uma relação de divisão de 20:1. A temperatura do forno é mantida a 37°C para os 5 minutos de duração da análise. O detector seletivo de massas Agilent 5793N é executado no modo de monitoramento de íon único em m/z 55, 66, 67 e 70. Sob essas condições, observa-se que o isopreno é eluído em 2,966 minutos (figura 88B). Um padrão de isopreno derivado de petróleo (Sigma-Aldrich) também é analisado usando este método e descobriu-se que contém isômeros de hid roca rbonetos C5 adicionais, que são eluídos pouco antes ou depois do pico principal e são quantificados com base na área GC corrigida (figura 88A).
Tabela 8A: Análise GC/MS de isopreno derivado de petróleo
Composto RT (min) Área GC % de área de hidrocarbonetos C5 totais
2-metil-1-buteno 2,689 18,2 x 103 0,017%
(Z)-2-penteno 2,835 10,6x 104 0,101%
Isopreno 2,966 10,4x107 99,869%
1,3-ciclopentadieno (CPD) 3,297 12,8 x 103 0,012%
Tabela 8B: Análise GC/MS de isopreno derivado de fermentação (% de hidrocarbonetos C5 totais)
Composto RT (min) Área GC corrigida % de hidrocarbonetos C5 totais
Isopreno 2,966 8,1 x 107 100%
200/291
Em um experimento separado, uma mistura padrão de hidrocarbonetos C5 é analisada para determinar se a resposta do detector é a mesma para cada um dos compostos. Os compostos são 2-metil-1-buteno, 2metil-1,3-butadieno, (E)-2-penteno, (Z)-2-penteno e (E)-1,3-pentadieno. Neste caso, a análise é realizada em uma coluna Agilent DB-Petro (100 m x 0,25 mm, 0,50 um espessura de filme) mantida a 50°C por 15 minutos. O método GC/MS utiliza hélio como o gás de arraste em um fluxo de 1 mL/min. A porta de injeção é mantida a 200°C com uma relação de divisão de 50:1. O detector seletivo de massas Agilent 5793N é executado no modo de varredura completa de m/z 19 a m/z 250. Sob essas condições, uma concentração de 100 ug/L de cada padrão produz a mesma resposta de detector dentro do erro experimental.
IV. Composições compreendendo isopreno adsorvido a uma fase sólida.
O isopreno produzido biologicamente é adsorvido ao carbono ativado resultando em uma fase sólida contendo 50 a 99,9% de carbono, 0,1% a 50% de isopreno, 0,01% a 5% de água, e quantidades menores (<0,1%) de outros componentes orgânicos voláteis.
O gás de escape de fermentação é lançado através de uma serpentina de condensação de cobre mantida a 0°C, seguido por um filtro de dessecação de silica granulada a fim de remover vapor d'água. O gás de escape desumidificado é em seguida lançado através de filtros contendo carbono (Koby Jr, Koby Filters, MA) até o ponto em que o surgimento de isopreno foi detectado no filtro de escape por GC/MS. A quantidade de isopreno adsorvido ao cartucho pode ser determinada indiretamente pelo cálculo da concentração no gás de escape, a vazão geral e o surgimento porcentual no decorrer do período de coleta. Senão, o isopreno adsorvido pode ser recuperado a partir dos filtros por dessorção térmica, a vácuo ou mediada por solvente.
V. Coleta e análise de isopreno condensado.
O gás de escape de fermentação é desumidificado e o CO2 removido por filtração através de um adsorvente adequado (por exemplo, ascarite). O fluxo de gás de escape resultante é em seguida lançado através
201/291 de um condensador resfriado por nitrogênio líquido a fim de condensar os VOCs no fluxo. A vasilha de coleta contém t-butil catecol para inibir o condensado de isopreno resultante. O condensado é analisado por GC/MS e RMN a fim de determinar a pureza usando métodos padrão, tal como aqueles aqui descritos.
VI. Produção de alcoóis prenílicos por fermentação
A análise de gás de escape de uma cepa de E. coli BL21(DE3) expressando uma isopreno sintase de kudzu revela a presença tanto de isopreno como de 3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol). Os níveis dos dois compostos no gás de escape da fermentação no decorrer da fermentação são mostrados na figura 89 conforme determinado por headspace GC/MS. Os níveis de isoprenol (3-metil-3-buten-1-ol, 3-MBA) alcançados são quase 10 ug/LgáS de escape neste experimento. Experimentos adicionais produzem níveis de aproximadamente 20 ug/LgáS de escape no gás de escape de fermentação.
Exemplo 11:0 desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno em E. coli expressando genes da via do mevalonato e fermentada em uma cultura de batelada alimentada
Este Exemplo 11 ilustra o desacoplamento do crescimento celular a partir de ácido mevalônico e produção de isopreno.
I. Condições de Fermentação
Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hid ratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O,
202/291 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida q.s. até o volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada com células de E. coli contendo os plasmídeos pTrcHis2AUpperPathway (também chamado pTrcUpperMVA, figuras 91 e 92A-92C) (carbenicilina a 50 pg/mL) ou o pCL PtrcUpperMVA (também chamado pCL PtrcUpperPathway (figura 26)) (espectinomicina a 50 pg/mL). Para experimentos em que isopreno é produzido, as células de E. coli também contêm o plasmídeo pTrc KKDylklS (canamicina a 50 pg/mL). Estes experimentos são realizados para monitorar a formação de ácido mevalônico ou isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. co//tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LA ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, quando medida a 550 nm, ele é usado para inocular o biorreator.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração do ácido mevalônico no caldo de fermentação é determinada pela aplicação de amostras tratadas com ácido perclórico (Sigma-Aldrich # 244252) (incubadas com 0,3 M a 4°C por 5 minutos) em uma coluna de HPLC de ácidos orgânicos (BioRad # 125-0140). A concentração é determinada pela comparação do tamanho do pico do ácido mevalônico do caldo com uma curva de calibração gerada a partir de mevalonolacetona (Sigma-Aldrich # M4667) tratada com ácido perclórico para formar D,L-mevalonato. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno é definido como a quantidade de isopreno produzido por litro de caldo de fermentação.
203/291
II. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli BL2KDE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de 150 L
Células BL21(DE3) que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 45 mL de meio triptona-extrato de levedura e incubadas a 30°C com agitação a 170 rpm por 5 horas. Esta solução é transferida para um biorreator de 5 L com meio triptona-extrato de levedura e as células são cultivadas a 30°C e 27,5 rpm até a cultura atingir uma OD550 de 1,0. Os 5 L de inóculo são semeados em um biorreator de 150 L contendo 45 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 1,1 mM quando a OD55o atinge um valor de 10. O perfil da OD55o no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 60A. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de ácido mevalônico aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 61,3 g/L (figura 60B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 60C e a comparação com a figura 60A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 52,5 horas é de 4,0 kg para 14,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de ácido mevalônico durante a fermentação é de 34,2%.
III. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli BL2KDE3) expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de15 L
Células BL21(DE3) que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 1,0 mM quando a OD550 atinge um valor de 10. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 61 A. O título de ácido mevalônico aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 53,9 g/L (figura 61B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 61C e a comparação com a figura 61A ilustra o desacoplamento entre
204/291 crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 46,6 horas é de 491 g para 2,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de ácido mevalônico durante a fermentação é de 28,8%.
IV. Produção de ácido mevalônico em células de E. coli FM5 expressando o plasmídeo pTrcUpperMVA em uma escala de15 L
Células FM5 que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD55o de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 1,0 mM quando a OD550 atinge um valor de 30. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 62A. O título de ácido mevalônico aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 23,7 g/L (figura 62B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 62C e a comparação com a figura 62A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de ácido mevalônico. A quantidade total de ácido mevalônico produzida durante a fermentação de 51,2 horas é de 140 g para 1,1 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de ácido mevalônico durante a fermentação é de 15,2%.
V. Produção de isopreno em células de E. coli BL2KDE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de15 L
Células BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 25 μΜ quando a OD550 atinge um valor de 10. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 190. A concentração de IPTG é elevada a 100 uM em 38 horas de fermentação. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 63A. O título de isopreno aumenta ao longo da fermenta
205/291 ção até um valor final de caldo de 2,2 g/L (figura 63B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 63C e a comparação com a figura 63A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 54,4 horas é de 15,9 g para 2,3 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 1,53%.
VI. Produção de isopreno em células de sintonização (tuner) de E. coli BL2KDE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de15 L
Células de sintonização BL21(DE3) expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD55o de 1,0. Este material é semeado em um biorreatorde 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 26 μΜ quando a OD550 atinge um valor de 10. A concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 175. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 64A. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 1,3 g/L (figura 64B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 64C e a comparação com a figura 64A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 48,6 horas é de 9,9 g para 1,6 kg de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 1,34%.
VIL Produção de isopreno em células de E. coli MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de15 L
Células MG1655 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a
206/291
OD55o de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo
4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 24 μΜ quando a OD550 atinge um valor de 45. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 65A. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 393 mg/L (figura 65B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 65C e a comparação com a figura 65A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 67,4 horas é de 2,2 g para 520 g de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 0,92%.
VIII. Produção de isopreno em células de E. co/í MG 1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de 15 L
Células MG1655ack-pta expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11,1 são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD55o de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo
4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 30 μΜ quando a OD55o atinge um valor de 10. O perfil da OD55o no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 66A. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 368 mg/L (figura 66B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 66C e a comparação com a figura 66A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 56,7 horas é de 1,8 g para 531 g de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 0,73%.
IX. Produção de isopreno em células de E. coli FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS em uma escala de 15 L
Células FM5 expressando os plasmídeos pCL PtrcUpperMVA e
207/291 pTrc KKDylklS que são cultivadas em uma placa como explicado acima no Exemplo 11, parte I são inoculadas em um frasco contendo 500 mL de meio triptona-extrato de levedura e cultivadas em 30°C a 160 rpm até a OD550 de 1,0. Este material é semeado em um biorreator de 15 L contendo 4,5 kg de meio. A concentração de IPTG é levada a 27 μΜ quando a OD550 atinge um valor de 15. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 67A. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de caldo de 235 mg/L (figura 67B). O perfil de produtividade específica ao longo da fermentação é apresentado na figura 67C e a comparação com a figura 67A ilustra o desacoplamento entre crescimento e produção de isopreno. A quantidade total de isopreno produzido durante a fermentação de 52,3 horas é de 1,4 g para 948 g de glicose utilizada. O rendimento molar do carbono utilizado que entra na produção de isopreno durante a fermentação é de 0,32%.
Exemplo 12: Produção de isopreno durante a fase de crescimento exponential de E. coli expressando genes da via do mevalonato e fermentada em uma cultura de batelada alimentada
O Exemplo 12 ilustra a produção de isopreno durante a fase de crescimento exponencial das células.
Receita do meio (por litro de meio de fermentação):
O meio é gerado usando os seguintes componentes por litro de meio de fermentação: 7,5g de K2HPO4, 2g de MgSO4 * 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 0,5g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução é autoclavada. O pH é ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e q.s. até o volume. Dez gramas de glicose, 0,1g de tiamina * HCI e antibióticos são adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X é gerada usando os seguintes componentes: 40 g de ácido cítrico * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 *
208/291
7Η2Ο, Ί θθ mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em Di H2O, pH a 3,0 com HCl/NaOH, em seguida q.s. até o volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 microns.
A fermentação é realizada em um biorreator de 15 L com células £ coli ATCC11303 contendo os plasmfdeos pCL PtrcUpperMVA e pTrc KKDylklS. Este experimento é realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em j uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia é inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL são usados para inocular um biorreator de 15 L contendo um volume de trabalho inicial de 5 L.
A glicose é adicionada em taxa exponencial até que as células atinjam a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose é diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 50 horas é de 2,0 kg. A indução é feita pela adição de IPTG. A concentração de IPTG é levada a 25 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD55o) atinge um valor de 10. A 20 concentração de IPTG é elevada a 50 uM quando a OD550 atinge 190. O perfil da OD55o no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 99. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado conforme aqui descrito. O título de isopreno aumenta ao longo da fermentação até um valor final de 1,4 g/L (figura 100). A quantidade total de isopreno produzida 25 durante a fermentação de 50 horas é de 10,0 g. O perfil de produtividade específica de isopreno ao longo do tempo no biorreator é apresentado na figura 101. O rendimento molar do carbono utilizado que contribui para a produção de isopreno durante a fermentação é de 1,1%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose é de 0,5%.
3Q Exemplo 13: Modelagem de inflamabilidade e testes de isopreno
I. Resumo de modelagem de inflamabilidade e testes de isopreno Modelagem de inflamabilidade e experimentos são realizados para várias
209/291 misturas de hidrocarboneto/oxigênio/nitrogênio/água/dióxido de carbono. Esta modelagem e testes experimentais têm como objetivo definir as curvas de inflamabilidade de isopreno e oxigênio/nitrogênio sob concentrações de monóxido de carbono e vapor especificadas em uma pressão e temperatura 5 fixas. Uma matriz das condições do modelo é apresentada na Tabela 4 e uma matriz dos experimentos realizados é apresentada na Tabela 5.
Tabela 4. Resumo da Inflamabilidade de Isopreno do Modelo
Séries Temperatura (°C) Pressão Kg/cm2 (psig) Concentração de Vapor (peso %) Concentração de Dióxido de Carbono (peso %) Concentração de Isopreno (vol. %) Concentração de Oxigênio (vol. %)
A 40 0 0 0 Variável Variável
B 40 0 4 0 Variável Variável
C 40 0 0 5 Variável Variável
D 40 0 0 10 Variável Variável
E 40 0 0 15 Variável Variável
F 40 0 0 20 Variável Variável
G 40 0 0 30 Variável Variável
Tabela 5. Resumo de Teste de Inflamabilidade de Isopreno
N° de Série Temperatura (°C) Pressão Kg/cm2 (psig) Concentração de Vapor (vol. %) Concentração de Isopreno (vol. %) Concentração de Oxigênio (vol. %)
1 40 0 0 Variável Variável
2 40 0 4 Variável Variável
II. Descrição de modelo de temperatura de chama adiabática calculada (CAFT)
Temperaturas de chamas adiabáticas calculadas (CAFT) junto com uma temperatura de chama limite selecionada para a propragação da 15 combustão são usadas para determinar a curva envelope de inflamabilidade
210/291 para o isopreno. O programa computacional usado neste estudo para calcular as temperaturas de chama é o software CEA (Chemical Equilibrium with Applications) do Centro de Pesquisa Glenn da NASA.
Existem cinco etapas envolvidas na determinação da curva envelope da inflamabilidade usando um modelo de temperatura de chama adiabática para um mecanismo de combustão homogêneo (onde tanto o combustível como o comburente estão no estado gasoso): a seleção dos reagentes desejados, seleção da condição de teste, seleção da temperatura de chama limite, modificação dos reagentes e construção de uma curva envelope de inflamabilidade para cálculos.
Nesta primeira etapa, de seleção dos reagentes desejados, deve ser tomada uma decisão quanto às espécies de reagentes que estarão presentes no sistema e às quantidades de cada uma. Em muitos casos, os programas computacionais usados para os cálculos têm uma lista de espécies de reagentes e produtos. Se quaisquer dos dados para as espécies a serem estudadas não são encontrados no programa, eles podem ser obtidos a partir de outras fontes tais como as tabelas JANAF ou a partir da internet. No modelo atual, dados para água, nitrogênio, oxigênio e dióxido de carbono estão presentes na base de dados do programa. A base de dados do programa não tem isopreno como uma espécie; portanto, as propriedades termodinâmicas são incorporadas manualmente.
A próxima etapa é para decidir as condições de temperatura e pressão iniciais em que o processo de combustão está ocorrendo. Neste modelo, a pressão é de 1 atmosfera (absoluta) e a temperatura é de 40°C, o ponto de ebulição do isopreno.
A temperatura de chama limite para combustão pode ser selecionada com base em princípios teóricos ou determinada experimentalmente. Cada método tem suas próprias limitações.
Com base em estudos anteriores, as temperaturas de chamas limites de hidrocarbonetos se encaixam no intervalo de 726,85 a 1226,85°C (1000 K a 1500 K). Para este modelo, o valor de 1226,85°C (1500 K) é selecionado. Esta é a temperatura em que a reação de monóxido de carbono a
211/291 dióxido de carbono (uma reação altamente exotérmica e que constitui uma proporção significativa da energia da chama) se torna autossustentável.
Uma vez que se tenha decidido sobre a temperatura de chama limite, cálculos de modelo são realizados na mistura de reagentes determinada (concentrações de espécies) e a temperatura de chama adiabática é determinada. Considera-se que a propagação da chama tenha ocorrido apenas se a temperatura for maior que a temperatura de chama limite. A composição de mistura de reagentes é em seguida modificada para criar conjuntos de dados para misturas de propagação e não propagação.
Este tipo de modelo mostra boa correlação com os limites de inflamabilidade determinados experimentalmente. Regiões fora da curva envelope derivada não são inflamáveis e regiões dentro dela são inflamáveis. O formato da curva envelope forma um nariz. O nariz da curva envelope está relacionado com a concentração limite de oxigênio (CLO) para combustíveis gasosos.
III. Resultados do modelo de temperatura de chama adiabática calculada (CAFT)
Os resultados de modelo CAFT são plotados nas figuras 68 a 74 para as Séries A a G, respectivamente. As figuras plotam a temperatura de chama adiabática calculada (usando o programa CEA da NASA) como uma função da concentração de combustível (em peso) para várias proporções de oxigênio/nitrogênio (em peso). As partes da curva que estão acima de 1226,85°C (1500 K), a temperatura de chama limite selecionada, contêm níveis de combustível suficientes para a propagação da chama. Os resultados podem ser difíceis de interpretar na forma apresentada nas figuras 68 a 74. Adicionalmente, a forma atual não conduz à comparação com dados experimentais o que é geralmente apresentado em termos de porcentual de volume.
Usando a Série A como um exemplo, os dados na figura 68 podem ser plotados na forma de uma curva envelope de inflamabilidade tradicional. Usando a figura 68 e a leitura através da linha de temperatura de 1226,85°C (1500 K) na ordenada uma pessoa pode determinar a concentra
212/291 ção de combustível para esta temperatura de chama limite pela colocação de uma tangente para a abscissa de cada curva (proporção de oxigênio para nitrogênio) com que ela possua interseção. Esses valores podem em seguida ser tabelados como porcentual de peso de combustível para um determinado porcentual de peso de oxidante (figura 75A). Em seguida, tendo conhecimento sobre a composição do combustível (100% em peso de isopreno) e a composição do oxidante (teor relativo de água, oxigênio e nitrogênio) quantidades molares podem ser estabelecidas.
A partir dessas quantidades molares concentrações de volume em porcentagem podem ser calculadas. As concentrações em termos de volume porcentual podem em seguida ser plotadas para gerar uma curva envelope de inflamabilidade (figura 75B). A área delimitada pela curva envelope é o intervalo explosível e a área excluída é o intervalo não explosível. O nariz da curva envelope é a concentração limite de oxigênio. As figuras 76A e 76B contêm as concentrações de volume calculadas para a curva envelope de inflamabilidade para a Série B gerada a partir dos dados apresentados na figura 69. Uma abordagem similar pode ser usada nos dados apresentados nas figuras 70-74.
IV. Procedimento e equipamento experimental para testes de inflamabilidade
Testes de inflamabilidade são conduzidos em um vaso de alta pressão de 4 litros. O vaso é de formato cilíndrico com um diâmetro interno de 15 cm (6) e uma altura interna de 22 cm (8,625). A temperatura do vaso (e os gases dentro dele) é mantida usando aquecedores externos que são controlados por um controlador PID. Para prevenir perdas de calor, lã cerâmica e isolamento reflectivo são embrulhados em torno do vaso de pressão. Termopares tipo K são usados para medir a temperatura do espaço do gás assim como a temperatura do vaso em si. A figura 77 ilustra o vaso de teste.
Antes de um teste ser executado, o vaso é evacuado e limpo com nitrogênio para garantir que quaisquer gases de testes anteriores sejam removidos. Em seguida, o vaso é submetido a vácuo. A pressão após isto ter sido feito está tipicamente em torno de 6 KPa (0,06 bar(a)). Devido à limpeza com nitrogênio, assume-se que o gás responsável por esta pressão inicial
213/291 seja o nitrogênio. Usando pressões parciais, água, isopreno, nitrogênio e oxigênio são em seguida adicionados nas quantidades apropriadas para obter as condições de teste em questão. Uma pá de mistura acionada magneticamente dentro do vaso garante a mistura dos conteúdos gasosos. Os gases são misturados por cerca de 2 minutos com a pá sendo desligada aproximadamente 1 minuto antes da ignição.
O dispositivo para iniciar a ignição é compreendido por uma serpentina de nicromo de 1,5 ohm e uma fonte de tensão CA em um circuito de temporizador. Usando um osciloscópio, determina-se que 34,4 VAC são distribuídos ao dispositivo de ignição por 3,2 segundos. Uma corrente máxima de 3,8 amps ocorre aproximadamente no meio do caminho do ciclo de ignição. Assim, a potência máxima é de 131 W e a energia total fornecida no decorrer do ciclo de ignição é de aproximadamente 210 J.
Os dados de deflagração são adquiridos usando um transdutor de pressão Validyne DP215 de relutância variável conectado a um sistema de aquisição de dados. Uma mistura de gás é considerada como deflagradora se a elevação de pressão tiver sido maior que ou igual a 5%.
V. Resultados de testes de inflamabilidade
A primeira série experimental (Série 1) é executada a 40°C e 0 Kg/cm2 (0 psig) sem vapor. A execução dos testes em diferentes concentrações de isopreno e oxigênio produz a curva de inflamabilidade apresentada na figura 78A. Os pontos de dados mostrados nesta curva são apenas aqueles que delineiam a curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados tomados para esta série é mostrada nas figuras 80A e 80B.
A figura 78B resume os pontos de dados de explosibilidade mostrados na figura 78A. A figura 78C é uma comparação dos dados experimentais com a curva envelope de inflamabilidade predita do modelo CAFT. O modelo coincide muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem ser devido à natureza não adiabática da câmara de teste e limitações do modelo. O modelo considera um horizonte temporal infinito para a reação de oxidação e não leva em conta qualquer limitação cinética da reação.
Adicionalmente, o modelo é limitado pelo número de espécies
214/291 químicas em equilíbrio que estão em sua base de dados e assim, pode não predizer apropriadamente espécies pirolíticas. Além disso, a curva envelope de inflamabilidade desenvolvida pelo modelo usa um valor para uma temperatura de chama limite 1226,85°C(1500K). A temperatura de chama limite pode estar em um intervalo de valores de 726,85 a 1226,85°C (1.000K a 1.500K) dependendo da espécie química reagente. A natureza complexa de espécies químicas pirolíticas formadas em concentrações de combustível acima do nível de combustível/comburente estequiométrico é uma razão pela qual o modelo pode não predizer com precisão o limite inflamável superior para este sistema.
A segunda série experimental (Série 2) é executada a 40°C e 0 Kg/cm2 (0 psig) com uma concentração de vapor fixa de 4%. A execução dos testes em diferentes concentrações de isopreno e oxigênio produz a curva de inflamabilidade apresentada na figura 79A. Os pontos de dados mostrados nesta curva são apenas aqueles que delineiam a curva. Uma lista detalhada de todos os pontos de dados tomados para esta série é mostrada na figura 81. Devido à similaridade entre com os dados na Série 1, apenas os pontos essenciais de limite inflamável inferior, concentração limite de oxigênio e limites inflamáveis superiores são testados. A adição de 4% de vapor à mistura em teste não altera significativamente os limites essenciais da curva envelope de inflamabilidade. Deve-se notar que concentrações mais elevadas de vapor/água e ou outras substâncias inertes podem influenciar a curva envelope de inflamabilidade.
A figura 79B resume os pontos de dados de explosibilidade mostrados na figura 79A. A figura 79C é uma comparação dos dados experimentais com a curva envelope de inflamabilidade predita do modelo CAFT. O modelo coincide muito bem com os dados experimentais. Discrepâncias podem ser devido aos mesmos fatores descritos na Série 1.
V. Cálculo de Limites de Inflamabilidade de Isopreno no Ar sob 3 Atmosferas de Pressão
Os métodos descritos no Exemplo 12, partes I a IV também são usados para calcular os limites de inflamabilidade de isopreno em uma pres
215/291 são de sistema absoluta de 3 atmosferas e 40°C. Esses resultados são comparados àqueles do Exemplo 12, partes I a IV em uma pressão de sistema absoluta de 1 atmosfera e 40°C. A pressão mais elevada é testada porque a curva envelope de inflamabilidade se expande ou torna-se maior à medida que pressão de sistema inicial é aumentada. O limite de inflamabilidade superior é o mais afetado, seguido pela composição limite de oxigênio. O limite de inflamabilidade inferior é o menos afetado (veja, por exemplo, Bulletin 627 - Flammability Characteristics of Combustible Gases e Vapors escrito por Michael G. Zabetakis e publicado pelo antigo US Bureau of Mines (1965), que é por meio deste incorporada como referência em sua totalidade, em particular com relação ao cálculo de limites de inflamabilidade).
Na figura 82, a temperatura de chama adiabática calculada é plotada como uma função da concentração de isopreno (combustível), expressa em porcentagem de peso do combustível/nitrogênio/oxigênio total, onde a pressão de sistema foi inicialmente de 3 atmosferas. As temperturas de chama calculadas são muito similares àquelas determinadas inicialmente no sistema de 1 atmosfera (figura 83). Como resultado, quando curvas envelopes de inflamabilidade são geradas usando os dados de inflamabilidade adiabática calculada, as curvas são muito similares (veja as figuras 84 e 85). Portanto, com base nesses cálculos teóricos, um aumento de pressão de sistema de uma atmosfera a 3 atmosferas não resulta em um aumento/expansão significativo da curva envelope de inflamabilidade. Se desejado, esses resultados de modelo podem ser validados usando testes experimentais (tal como os testes experimentais aqui descritos em uma pressão de 1 atmosfera).
VII. Resumo de estudos de inflamabilidade
Um modelo temperatura adiabática calculada é desenvolvido para a curva envelope de inflamabilidade do sistema isopreno/oxigênio/ nitrogênio/água/dióxido de carbono a 40°C e 0 Kg/cm2 (0 psig). O modelo CAFT que é desenvolvido coincide bem com os dados experimentais gerados pelos testes conduzidos neste trabalho. Os resultados experimentais das Séries 1 e 2 validam os resultados do modelo das Séries A e B.
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Exemplo 14: Construtos de Expressão e Cepas
Construção de plasmídeos que codificam mevalonato quinase.
A construção que codifica a via inferior do MVA de Methanosarcina mazei (Números de acesso NC_003901.1, NC_003901.1,
NC 003901.1, e NC_003901.1, que são aqui incorporados, cada um, como referência em suas totalidades) é sintetizada com otimização de códon para a expressão em E. coli. Este construto é nomeado operon da Via Inferior de Archaea de M. mazei (figuras 112A-112C; SEQ ID N°:102) e codifica as enzimas IDI, IPK, uma descarboxilase putativa e MVK de M. mazei. O gene que codifica MVK (Número de acesso NC_003901.1) é amplificado por PCR usando os iniciadores MCM165 e MCM177 (Tabela 11) usando o kit de fusão Herculase II da Strategene de acordo com o protocolo do fabricante usando 30 ciclos com uma temperatura de ligação de 55°C e tempo de extensão de 60 segundos. Este amplicon é purificado usando uma coluna para PCR da Qiagen e em seguida digerido a 37°C em uma reação de 10 pL com Pmel (na presença de tampão NEB 4 e BSA). Após uma hora, Nsil e o tampão H da Roche são adicionados por uma hora adicional a 37°C. O DNA digerido é purificado em uma coluna para PCR da Qiagen e ligado a um plasmídeo digerido e purificado de modo similar MCM29 (MCM29 E. coli TOP10 (Invitrogen) transformada com pTrcKudzu codificando isopreno sintase de kudzu) em uma reação de 11uL com 5uL de tampão 1 Quick Ligase da Roche, 1 uL de tampão 2, 1 uL de plasmídeo, 3 uL de amplicon e 1 uL de ligase (1 hora à temperatura ambiente). MCM29 é pTrcKudzuKan. A reação de ligação é introduzida em células TOP10 da Invitrogen e transformantes selecionados em placas LA/kan50 incubadas a 37°C durante a noite. O inserto MVK no plasmídeo resultante MCM382 é sequenciado (figuras 113A113C; SEQ ID N°:103).
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Tabela 11. Qliqonucleotídeos
MCM161 M.mazei MVK for CACCATGGTATCCTGTTCTGCG (SEQ ID N°: 104)
MCM162 M.mazei MVK rev TTAATCTACTTTCAGACCTTGC (SEQ ID N°: 105)
MCM165 M.mazei MVK for w/ RBS gcgaacgATGCATaaaggaggtaaaaaaac ATGGTATCCTGTTCTGCGCCGGGTAA GATTTACCTG (SEQ ID N°: 106)
MCM177 M.mazei MVK rev Pst gggcccgtttaaactttaactagactTTAATCTAC TTTCAGACCT TGC (SEQ ID N°: 107)
II. Criação de cepas superexpressando mevalonato quinase e isopreno sintase·
O plasmídeo MCM382 é transformado em células MCM331 (que contêm o construto cromossomal gi1.2KKDyl que codifica mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato decarboxilase, e IPP isomerase de S. cerevisiae) que tinham sido cultivadas até midlog em meio LB e lavadas três vezes em água gelada, estéril. Um microlitro de DNA é adicionado a 50 pL de suspensão celular e esta mistura é eletroporada em uma cuveta de 2 mm a 2,5 volts, 2,4 C (25 uFd) seguida por imediata recuperação em 500 pL de meio LB por uma hora a 37°C. O transformante foi selecionado em LA/can50 e nomeado MCM391. O plasmídeo MCM82 é introduzido nesta cepa pelo mesmo protocolo de eletroporação seguido pela seleção em LA/can50/espec50. A cepa resultante MCM401 contém um construto cromossomal marcado com cmp gi1.2KKDyl, o plasmídeo MCM382 marcado com can e o plasmídeo MCM82 marcado com espec (que é pCL PtrcUpperPathway codificando mvaE e mvaS de E. faecalis). Veja a Tabela 12.
Tabela 12. Cepas superexpressando mevalonato quinase e isopreno sintase
Cepa Genótipo
MCM382 E. coli BL21 (lambdaDE3) pTrcKudzuMVK(M. mazei) GI1.2KKDyl
MCM391 MCM331 pTrcKudzuMVK(M mazei)
MCM401 MCM331 pT rcKudzuMVK(Mn7aze/)pCLPtrcUpperpathway
MCM396 MCM333pTrcKudzuMVK(/W. mazei)
MCM406 MCM333pTrcKudzuMVK(/W.n?aze/)pCLPtrcUpperpathway
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III. Construção do plasmídeo MCM376 - MVK a partir de Inferior da Archaea M. maze/' em pET200D.
A ORF de MVK do operon da Via Inferior de Archaea de M. maze! (figuras 112A-112C; SEQ ID N°:102) é amplificada por PCR usando os iniciadores MCM161 e MCM162 (Tabela 14-1) usando a mistura do Platinum HiFi PCR da Invitrogen. Quarenta e cinco microlitros da mistura de PCR são combinados com 1 uL de molde, 1 uL de cada iniciador a 10 uM e 2 uL de água. A reação foi submetida à ciclagem como se segue: 94°C por 2:00; 30 ciclos de 94°C por 0:30, 55°C por 0:30; e 68°C por 1:15; e em seguida 72°C por 7:00 e 4°C até o resfriamento. Três microlitros desta reação de PCR são ligados ao plasmídeo pET200D da Invitrogen de acordo com o protocolo do fabricante. Três microlitros desta ligação são introduzidos em células TOP10 da Invitrogen e transformantes são selecionados em LA/can50. Um plasmídeo de um transformante é isolado e o inserto sequenciado, resultando em MCM376 (figuras 114A-114C; SEQ ID N°:108).
V. Criação da cepa de expressão MCM378.
O plasmídeo MCM376 é transformado em células BL21(DE3) pLysS da Invitrogen de acordo com o protocolo do fabricante. O transformante MCM378 é selecionado em LA/can50.
Exemplo 15: Produção de isopreno por E. coli expressando a via inferior integrada do mevalonato (MVA) e a via superior do MVA, mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de batelada de 20 mL
Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
Cada litro de meio de fermentação continha: 13,6g de K2HPO4, 13,6g de MgSO4* 7H2O, 2g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3g de citrato de amônio férrico, 3,2g de (NH4)2SO4, 1g de extrato de levedura e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes são adicionados e dissolvidos em diH2O. O pH é ajustado para 6,8 com hidróxido de amônio (30%) e levado ao volume. Os meios foram esterilizados por filtração em filtro de 0,22 microns. Glicose (2,5 g),e antibióticos foram adicionados após a esterilização e ajuste de pH.
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Solução de Metal Traço 1000X:
A solução de metal traço 1000X continha 40 g de ácidos cítricos * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3, 100 mg de NaMoO4* 2H2O. Os componentes são dissolvidos um por vez em diH2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, em seguida levados ao volume e esterilizados por filtração em filtro de 0,22 microns.
Cepas:
Células MCM343 são células de E. coli BL21 (DE3) que contêm a via superior do mevalonato (MVA) (pCL Upper), a via inferior do MVA integrada (gi1.2KKDyl) e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzu).
Células MCM401 são células de E. coli BL21 (DE3) que contêm a via superior do mevalonato (MVA) (pCL PtrcUpperPathway), a via inferior do MVA integrada (gi1.2KKDyl), e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzuMVK (M. mazei)).
A produção de isopreno foi analisada através do crescimento das cepas em biorreatores de 100 mL com um volume de trabalho de 20 mL, a uma temperatura de 30°C. Um inóculo de cepa de E.coli tirada de um frasco congelado foi semeado em uma placa de ágar LB (com antibióticos) e incubado a 30°C. Uma única colônia foi inoculada em meios e cultivada durante a noite. As bactérias foram diluídas em 20 mL de meios para atingir uma densidade óptica de 0,05 medida a 550 nm. Os biorreatores de 100 mL foram selados e o ar era bombeado através de uma taxa de 8mL/min. A adequada agitação dos meios foi obtida por agitação a 600 rpm utilizando barras de agitação magnética. O gás de escape dos biorreatores foi analisado usando um espectrômetro de massa on-line Hiden HPR-20. Massas correspondentes a isopreno, CO2 e outros gases que ocorrem naturalmente no ar foram monitoradas. O isopreno acumulado e a produção de CO2 foram calculados somando-se a concentração (em porcentagem) dos gases respectivos ao longo do tempo. O CO2 atmosférico foi subtraído do total, a fim de estimar o CO2 liberado devido à atividade metabólica.
A produção de isopreno a partir de uma cepa expressando a via
220/291 do mevalonato completa e isopreno sintase de Kudzu (MCM343) foi comparada com uma cepa que, em adição, superexpressava MVK de M. mazei e isopreno sintase de Kudzu (MCM401) em biorreatores de 100 mL. As bactérias foram cultivadas em condições idênticas em meio definido com a glicose como fonte de carbono. A indução da produção de isopreno foi realizada pela adição de isopropil-beta-D-1 tiogalactopiranosídeo (IPTG) para uma concentração final de 100 uM ou 200 uM. Medições de efluentes gasosos revelaram que a cepa superexpressando tanto MVK como isopreno sintase (MCM401) produziu significativamente mais isopreno em comparação com a cepa expressando apenas a via do mevalonato e isopreno sintase de Kudzu (MCM343), conforme mostrado nas figuras 115A-115D. Em 100 uM de indução, a cepa MCM401 produziu duas vezes mais isopreno comparada com a cepa MCM343. Em 200 uM de indução com IPTG, a cepa MCM401 produziu 3,4 vezes mais do isopreno, quando comparada com a cepa MCM343. Análise de CO2 no gás de escape dos biorreatores, que é uma medida da atividade metabólica, indica que a atividade metabólica foi independente da indução de IPTG e produção de isopreno.
Exemplo 16: Produção de isopreno por E.coli expressando a via superior do mevalonato (MVA), a via inferior integrada do MVA (qi1.2KKDyl), mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L.
Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
Cada litro de meio de fermentação continha 7,5 g de K2HPO4, 2 g de MgSO4* 7H2O, 2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de amônio férrico, 0,5 g de extrato de levedura, e 1 ml de solução com traços de Metal modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em Dl H2O. Esta solução foi autoclavada. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e quantidade suficiente para o volume. Dez grams de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI, e antibióticos foram adicionados após a esterilização e o ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X continha 40 g de á
221/291 cidos cítricos * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3 e 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Cada componente foi dissolvido um de cada vez em Dl H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então quantidade suficiente para o volume e esterilizado por filtração com filtro de 0,22 microns.
A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via superior do mevalonato (MVA) (pCL PtrcUpperPathway que codifica mvaE e mvaS de E. faecalis), a via inferior do MVA integrada (gi1. 2KKDyl que codifica mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e IPP isomerase de S. cerevisiae) e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzuMVK(/W. mazei)). Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular 5 L de meio celular em um biorreator de 15 L.
A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 68 horas foi de 3,8 kg. A indução foi feita pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG é levada a 51 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atinge um valor de 9. A concentração de IPTG foi elevada para 88 uM quando a OD550 atingiu 149. Adições de IPTG adicionais elevaram a concentração para 119 uM na OD550 = 195 e 152 uM na OD55o = 210. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 116. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator é determinado usando um espectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumen
222/291 tou ao longo da fermentação até um valor final de 23,8 g/L (figura 117). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 68 horas foi de 227,2 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 118. O perfil de atividade metabólica, como medido por TCER é mostrado na figura 119. A contagem viável total (unidades formadoras de colônia) diminuiu em duas ordens de grandeza entre 10 e 29 horas de fermentação (figura 120). O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação é de 13,0%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 6,3%.
Exemplo 17: Produção de isopreno por Eco//'expressando a via superior do mevalonato (MVA), a via inferior integrada do MVA (gi1,2KKDyl), mevalonato guinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L (indução de 2x 100uM de IPTG) Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
Cada litro de meio de fermentação continha 7,5 g de K2HPO4, 2 g de MgSO4 * 7H2O, 2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de amônio férrico, 0,5 g de extrato de levedura, e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em Dl H2O. Esta solução foi autoclavada. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e quantidade suficiente para o volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI, e antibióticos foram adicionados após a esterilização e o ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X continha 40 g de ácidos cítricos * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3 e 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Cada componente foi dissolvido um de cada vez em Dl H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então quantidade suficiente para o volume e esterilizado por filtração com filtro de 0,22 microns.
A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via superior do mevalonato (MVA) (pCL
223/291
PtrcUpperPathway que codifica mvaE e mvaS de E. faecalis), a via inferior do MVA integrada (gi1. 2KKDyl que codifica mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e IPP isomerase de S. cerevisiae) e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzuMVK(/W. mazei)). Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular 5 L de meio celular em um biorreator de 15 L.
A glicose foi adicionada em taxa exponential até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 55 horas foi de 1,9 kg. A indução foi feita pela adição de isopropil-beta-D-1tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG é levada a 111 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD550) atingiu um valor de 9. A concentração de IPTG foi elevada para 193 uM quando a OD550 atingiu 155. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 121. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado usando um espectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 19,5 g/L (figura 122). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 55 horas foi de 133,8 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 123. Níveis de produtividade volumétrica instantânea atingiram valores tão altos quanto 1,5 g de isopreno/L caldo/h (figura 124). Níveis de rendimento instantâneo atingiram tão alto quanto 17,7% p/p (figura 125). O perfil de atividade metabólica, como medido por TCER é mostrado na figura 126. A contagem viável total (unidades formadoras de colônia) diminuiu em duas ordens de grandeza entre 8 e 36 horas de fermentação (figura 127). O rendimento mo
224/291 lar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação é de 15,8%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 7,4%.
Além disso, como controle, a fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via superior do mevalonato (MVA) (pCL PtrcUpperPathway que codifica mvaE e mvaS de E. faecalis), a via inferior do MVA integrada (gi1. 2KKDyl que codifica mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e IPP isomerase de S. cerevisiae) e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzuMVK(A4. maze/)). Este experimento foi realizado para monitorar a atividade metabólica de células não induzidas como medido por CER a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli (MCM401 descrita acima) tirado de um recipiente congelado é esfriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular 5 L de meio em um biorreator de 15 L. A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas.
A figura 148 compara os perfis de CER para as células não induzidas descritas acima e as células induzidas pela adição de isopropil-betaD-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nos Exemplos 16 e 17.
Exemplo 18: Produção de isopreno por E.coli expressando a via superior do mevalonato (MVA), a via inferior integrada do MVA (qi1.2KKDyl), mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu e cultivada em cultura de batelada alimentada na escala de 15 L (indução alimentada de 1x 50μΜ de IPTG+ 150uM de IPTG)
Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
Cada litro de meio de fermentação continha 7,5 g de K2HPO4, 2 g de MgSO4 * 7H2O, 2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de
225/291 amônio férrico, 0,5 g de extrato de levedura, e 1 ml_ de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi autoclavada. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e quantidade suficiente para o volume. Dez gramas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI, e antibióticos foram adicionados após a esterilização e o ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X continha 40 g de ácidos cítricos * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3 e 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Cada componente foi dissolvido um de cada vez em Dl H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então quantidade suficiente para o volume e esterilizado por filtração com filtro de 0,22 microns.
A fermentação foi realizada em um biorreator de 15 L com células de E. coli BL21 (DE3) contendo a via superior do mevalonato (MVA) (pCL PtrcUpperPathway que codifica mvaE e mvaS de E. faecalis), a via inferior do MVA integrada (gi1. 2KKDyl que codifica mevalonato quinase, mevalonato fosfato quinase, mevalonato pirofosfato descarboxilase e IPP isomerase de S. cerevisiaé) e alta expressão de mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de kudzu (pTrcKudzuMVK(/W. mazei)). Este experimento foi realizado para monitorar a formação de isopreno a partir de glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli tirado de um recipiente congelado é estriado em uma placa de LB ágar (com antibióticos) e incubado a 37°C. Uma única colônia foi inoculada em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 500 mL foram usados para inocular 5 L de meio celular em um biorreator de 15 L.
A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. A quantidade total de glicose distribuída ao biorreator durante a fermentação de 55 horas foi de 2,2
226/291 kg. A indução foi feita pela adição de isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG). A concentração de IPTG é levada a 51 uM quando a densidade ótica a 550 nm (OD55o) atingiu um valor de 10. Além do pico de IPTG, na OD550 = 10, uma alimentação constante teve início e distribuiu 164 mg de IPTG por 18 horas. O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 128. O nível de isopreno no gás de escape do biorreator foi determinado usando um espectrômetro de massas Hiden. O título de isopreno aumentou ao longo da fermentação até um valor final de 22,0 g/L (figura 129). A quantidade total de isopreno produzida durante a fermentação de 55 horas foi de 170,5 g e a evolução da produção ao longo do tempo é apresentada na figura 130. O perfil de atividade metabólica, como medido por TCER é mostrado na figura 131. Quando o fluxo de ar para o biorreator foi diminuído de 8 slpm para 4 slpm por um período de cerca de 1,7 horas, a concentração de isopreno no gás de escape aumentou de 0,51 para 0,92 p/p% (figura 132). Esses níveis elevados de isopreno não parecem ter qualquer impacto negativo na atividade metabólica celular como medido pela taxa de evolução de dióxido de carbono (TCER), visto que o TCER declinou apenas 7% entre 37,2 e 39,3 horas (figura 132). A contagem viável total (unidades formadoras de colônia) diminuiu em duas ordens de grandeza entre 7 e 36 horas de fermentação (figura 133). O rendimento molar do carbono utilizado que entrou na produção de isopreno durante a fermentação é de 16,6%. O rendimento em porcentagem de peso de isopreno a partir da glicose foi de 7,7%.
Exemplo 19: O efeito de isopreno aplicado externamente no cultivo de E. coli selvagem em cultura de batelada alimentada na escala de 1 L
Receita do Meio (por litro de meio de fermentação):
Cada litro de meio de fermentação continha 7,5 g de K2HPO4, 2 g de MgSO4 * 7H2O, 2 g de ácido cítrico mono-hidratado, 0,3 g de citrato de amônio férrico, 0,5 g de extrato de levedura, e 1 mL de solução de metal traço modificada 1000X. Todos os componentes foram adicionados e dissolvidos em diH2O. Esta solução foi autoclavada. O pH foi ajustado para 7,0 com hidróxido de amônio (30%) e quantidade suficiente para o volume. Dez gra
227/291 mas de glicose, 0,1 g de tiamina * HCI, e antibióticos foram adicionados após a esterilização e o ajuste de pH.
Solução de Metal Traço Modificada 1000X:
A solução de metal traço modificada 1000X continha 40 g de ácidos cítricos * H2O, 30 g de MnSO4 * H2O, 10 g de NaCI, 1 g de FeSO4 * 7H2O, 1 g de CoCI2 * 6H2O, 1 g de ZnSO4 * 7H2O, 100 mg de CuSO4 * 5H2O, 100 mg de H3BO3 e 100 mg de NaMoO4 * 2H2O. Cada componente foi dissolvido um de cada vez em Dl H2O, pH a 3,0 com HCI/NaOH, então quantidade suficiente para o volume e esterilizado por filtração com filtro de 0,22 microns.
A fermentação foi realizada em um biorreator de 1 L com células de E. coli BL21 (DE3). Este experimento foi realizado para monitorar os efeitos do isopreno na viabilidade celular e atividade metabólica em um biorreator de batelada alimentada com glicose na temperatura de 30°C e pH 7,0 de fermentação desejados. Um inóculo de cepa de E. coli de um recipiente congelado foi inoculado em meio de triptona-extrato de levedura. Após o inóculo ser cultivado até a OD de 1,0, medida a 550 nm, 50 mL foram usados para inocular 0,5 L de meio em um biorreator de 1 L.
A glicose foi adicionada em taxa exponencial até que as células atingissem a fase estacionária. Após este momento, a alimentação de glicose foi diminuída para atender demandas metabólicas. O isopreno foi adicionado no biorreator usando gás nitrogênio como um veículo. A taxa de alimentação de isopreno foi de 1 g/L/h durante a fase de crescimento intermediária (OD550 = 31-44) e durou por um total de 75 minutos (13,2 a 14,4 horas). O perfil da OD550 no biorreator ao longo do tempo é apresentado na figura 134. O perfil de atividade metabólica, como medido por TCER é mostrado na figura 135. A contagem viável total (unidades formadoras de colônia) aumentou 14 vezes durante o período que o isopreno foi introduzido no biorreator (figura 136).
Exemplo 20: Produção de Isopreno e expressão de isopreno sintase por Saccharomyces cerevisiae
A enzima isopreno sintase kudzu foi otimizada para a expressão
228/291 de acordo com uma tabela de uso de códons do híbrido Saccharomyces cerevisiae/Pichia pastoris, sintetizada e clonada em pDONR221:19430 (por DNA 2.0, figura 140 para o mapa e figura 141 para a sequência (SEQ ID N°: 115)). Uma reação de clonagem GATEWAY® (Invitrogen) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. Já que pDQNR221:19430 era um vetor vazio, a enzima LR Clonase II (a Reação LR) foi usada para introduzir a isopreno sintase com otimização de códons no vetor de destino pYESDEST52 (Invitrogen).
A reação LR foi em seguida transformada em células quimicamente competentes Top10 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante, e bactérias com os plasmídeos pYES-DEST52 com a ORF de isopreno sintase foram selecionadas em placas de LA contendo 50 pg/mL de carbenicilina. Transformantes positivos individuais foram testados por PCR de colônia (veja abaixo concentrações de iniciadores e parâmetros de termociclagem) usando as microesferas de PCR PuReTaq READY-TO-GO™ (GE Healthcare) com o iniciador T7 direto e o iniciador para isopreno sintase de Ievedura-Rev2 (Veja a aTabela 13)
Tabela 13. Sequências de iniciadores para amplificar isopreno sintase
Nome do Iniciador Sequência (5' a 3') Propósito
Levedura HGS -For2 CACCAAAGACTTCA- TAGACT (SEQ ID N°: 116) Iniciador direto para isopreno sintase otimizada para levedura
Levedura HGS -Rev2 AGAGA- TATCTTCCTGCTGCT (SEQ ID N°: 117) Iniciador reverso para isopreno sintase otimizada para levedura
T7 Direto TAATACGACTCACTA- TAGGG (SEQ ID N°: 118) Iniciador de PCR e sequenciamento
Plasmídeos que renderam um fragmento de PCR do tamanho correto (1354 bp) foram purificados por miniprep (Qiagen) e enviados para sequenciamento (Quintara Biosciences, Berkeley, CA) com os iniciadores 17 Direto e isopreno sintase de Ievedura-For2 (Veja a Tabela 13). Resultados
229/291 de corridas de sequenciamento são comparados com a sequência conhecida de pDQNR221:19430 (usando o software Vetor NTI, Invitrogen), e um único plasmídeo, pDW14 foi selecionado para estudo adicional (figura 142A para o mapa e figuras 142B e C para a sequência completa (SEQ ID N°:119)). A sequência da isopreno sintase de kudzu de pDW14 diverge daquela de pDONR221:19430 por um único nucleotídeo (marcado em negrito na figura 142B). A alteração de nucleotídeo único (G para A) não resultou em uma alteração na ORF, já que ela está na terceira posição de um códon codificador de lisina.
O pDW14 purificado foi transformado na cepa INVSc-1 de Saccharomyces cerevisiae usando o protocolo descrito no kit de transformação S. c. EasyComp (Invitrogen). Cepas INVSc-1 contendo pDW14 ou pYESDEST52 (que contêm um gene de URA3 intacto) são selecionadas por e mantidas em Meio Mínimo SC com 2% de glicose sem uracila, conforme descrito no manual do Vetor Gateway pYES-DEST52 (Invitrogen). Dois isolados independentes de INVSc-1 contendo pDW14 e uma única cepa controle com pYES-DEST52 são escolhidos para análise adicinal.
Para induzir a expressão de isopreno sintase, culturas são cultivadas durante a noite em Meio Mínimo SC líquido. As culturas são em seguida diluídas para uma OD6oo de aproximadamente 0,2 e cultivadas por 2-3 horas. As culturas são centrifugadas, lavadas uma vez, ressuspendidas em um volume igual (10 mL) de Meio Mínimo SC com 1% de rafinose, 2% de galactose sem uracila e cultivadas durante a noite para induzir a expressão de isopreno sintase. A OD60o das cepas foi determinada (figura 144A) e cepas foram recuperadas por centrifugação e ressuspendidas em 2 mL de tampão de lise (uma mistura 1:1 de 50% de glicerol e PEB pH 7,4: base tris 2,423g/L, MgCIs (Anidro) 1,904g/L, KCI 14,91 Og/L, DTT 0,154 g/L, glicerol 50 mUL).
As misturas de lise são passadas em uma prensa de French três vezes e lisados são analisados por SDS-PAGE. Para a análise de gel de Coomassie (figura 143A), amostras são diluídas 1:1 com tampão de amostra com SDS 2X com agente redutor, carregadas (20 pL de volume total) em um
230/291 gel de 4-12% de bis-tris, corridas em tampão MES e coradas usando SimplyBlue SafeStain de acordo com o protocolo do fabricante (o sistema Novex da Invitrogen).
O kit WesternBreeze (Invitrogen) é usado para transferir e detecção cromogênica de isopreno sintase em uma membrana de nitrocelulose. O anticorpo primário é 1799A 10 semanas diluído 1:1000 no diluente de anticorpo da Invitrogen. A ligação de anticorpo primário foi seguida pelo desenvolvimento com um anticorpo secundário marcado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen No. do catálogo A-11008) para permitir a determinação de sinal quantitativo. O procedimento de western blot foi realizado como descrito pela Invitrogen. O sinal de fluorescência foi registrado com um instrumento Molecular Dynamics Storm usando o ajuste de filtro azul e analisado quantitativamente com o pacote de software para análise de imagens Molecular Dynamics ImageQuant. A atividade específica dos membros da biblioteca foi calculada a partir da razão da quantidade de isopreno produzida dividida pela A600 das culturas de indução ou pela concentração de proteína isopreno sintase determinada por western blot. A figura 143B mostra que a isopreno sintase estava presente nas cepas INVSc-1 induzidas contendo pDW14 (figura 118B, raias 2 e 3) em comparação com o controle contendo pYESDEST52 (raia 1).
O ensaio DMAPP para headspace de isopreno sintase é realizado em 25 pl_ do lisado de cada cepa para a qual 5 μΙ_ de MgCI2 1 M, 5 μΙ_ de DMAPP 100mM e 65 pL de 50 mM de Tris pH 8 foram adicionados. A reação foi realizada a 30°C por 15 minutos em um tubo GC de 1,8 mL com vedação para gás. Reações foram interrompidas pela adição de 100 pL de EDTA a 250 mM (pH 8). A figura 144B mostrou os valores de atividade específica (em pg de HG/L/OD) das cepas induzidas contendo pDW14 em comparação com o controle. Cepas induzidas contendo pDW14 exibem atividade aproximadamente 20X mais alta que o controle que não possui isopreno sintase.
Parâmetros de Ciclaqem de PCR
Microesferas de PCR illustra PuReTaq READY-TO-GO™ (GE
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Healthcare) foram usadas com pares de iniciador oligonucleotídico em uma concentração de 0,4 μΜ cada em 25 pL de volume total/reação. Para a análise de plasmídeos resultando da reação de LR Clonase (Invitrogen), uma pequena quantidade de bactérias de colônias individuais em uma placa seletiva é adicionada a cada tubo contendo a mistura de PCR descrita acima. O ciclo de reação foi o seguinte: 1) 95°C - 4 minutos; 2) 95°C - 20 segundos; 3) 52°C - 20 segundos; 4) 72°C - 30 segundos; 5 ciclos das etapas 2 a 4; 5) 95°C - 20 segundos; 6) 55°C - 20 segundos; 7) 72°C - 30 segundos; 25 ciclos das etapas 5 a 7; 72°C - 10 min; e 4°C até o resfriamento.
Exemplo 21: Produção de isopreno em Pseudomonas e outras bactérias Gram-neqativas
Construção de pBBR5HGSOpt2 2, conjugação em Pseudomonas e medição de atividade de isopreno sintase
Um gene codificando isopreno sintase de Pueraria lobata (planta kudzu) foi otimizado por códon para diferentes espécies microbianas de interesse (Tabela 14; fluo-opt2v2 foi a sequência escolhida) e foi sintetizado por DNA2.0, Menlo Park, CA. O mapa e a sequência de fluo-opt2v2 podem ser encontrados nas figuras 145A e 145B (SEQ ID N°: 120). Sítios de restrição de Hindlll e BamHI foram adicionados à sequência sintetizada para clonagem mais fácil e um RBS foi adicionado na frente do ATG para acentuar a transcrição.
Número de códons raros, em função das espécies microbianas, em diferentes versões isopreno sintase com códon otimizado de Pueraria lobata. Várias rodadas de otimização levaram a um gene sem códons raros em todas as espécies de interesse.
Tabela 14. Número de códons raros
Organismo fluo-opt1 (cota) fluo-opt2 fluo-opt3 E. coli opt fluoopt2v2
Pseudomonas fluorescens Pf-5 19 X X 57 0
Phodopseudomonas palustris CGA009 37 13 3 74 0
Pseudomonas putida F1 0 0 0 29 0
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Organismo fluo-opt1 (cota) fluo-opt2 fluo-opt3 E. coli opt fluoopt2v2
Corynebacterium glutamicum (ATCC) 4 (Ser) 0 0 0 0
Pseudomonas fluorescens PfO-1 1 (Vai) 0 0 57 0
O gene foi fornecido por DNA2.0 em um vetor de clonagem. O vetor foi digerito com Hindlll/BamHI, a banda correspondente ao inserto de interesse foi gel-purificado e religado com pBBR1MCS5 digerido com Hindlll/BamHI (Kovach et al, Gene 166:175-176, 1995, que é incorporado como referência em sua totalidade, particularmente com relação a pBBR1MCS5), figura 146A para o mapa e 146B e C para a sequência (SEQ ID N°: 121). Isto resultou no plasmídeo pBBR5HGSOpt2_2 (figura 147A para o mapa e 147B e C para a sequência (SEQ ID N°: 122)) em que a isopreno sintase foi expressa a partir do promotor lac apresentado em pBBR1 MCS5.
O vetor foi transformado e,m E. coli S17-1 e conjugado com Pseudomonas putida F1 ATCC700007 e Pseudomonas fluorescens ATCC 13525. Após a conjugação em LB, a seleção para cepas de Pseudomonas contendo plasmídeo em M9 + 16 mM de citrato de sódio + Gentamicina 50 ug/ml. A presença do plasmídeo em cepas assim geradas foi checada por uma preparação de plasmídeos usando o kit da Qiagen (Valencia, CA).
Atividades de isopreno sintase das cepas recombinantes de P. putida, pBBR5HGSOpt2_2 e P. fluorescens pBBR5HGSOpt2_2, foram ensaiadas pelo crescimento das cepas em meio de TM3 (como descrito no Exemplo 1 da parte 11) + 10 g/L de glicose, coletando a biomassa em fase log intermediária, quebrando as células pela prensa francesa e prosseguindo com o teste DMAPP. Os resultados do ensaio foram apresentados na Tabela 15. A presença de atividade medida pelo ensaio DMAPP confirmou que a isopreno sintase foi expressa em Pseudomonas.
A atividade de isopreno sintase foi examinada em Pseudomonas putida e Pseudomonas fluorescens expressando isopreno sintase a partir do promotor lac, usando o plasmídeo pBBR5HGSOpt2_2.
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Tabela 15. Atividade de isopreno sintase em Pseudomonas putida e Pseudomonas fluorescens.
Cepa OD Atividade de isopreno sintase mg de isopreno/(L.h.OD)
P. fluorescens, pBBR5HGSOpt2 2 1,46 0,96
P. putida, pBBR5HGSOpt2 2 3,44 0,65
Controle (P. putida s/ plasmídeo) 8,32 A ser determinado
Exemplo 22: Crescimento de cepas de E. coli e Pseudomonas em cana-deaçúcar comparada com glicose e expressão de isopreno sintase usando os dois substratos
I, Preparação de cana-de-açúcar líquida
Açúcar de cana bruto cristalizado foi dissolvido em água, da seguinte forma: 750 g de H2O foram adicionados a 250 g de açúcar. A solução foi agitada e aquecida suavemente até a dissolução. Alguns materiais não eram solúveis. O peso da solução foi ajustado para 1 kg, após dissolução para repor a água evaporada. O volume da solução foi medido a 940 mL. Daí a concentração da solução era de 265 g/L. O rótulo do produto reclamava 14 g de carboidratos para 15 g de açúcar de cana bruto. Daí a concentração de carboidratos solúveis da solução foi de 248 g/L. Sólidos secos foram medidos a 24,03%, perto o suficiente do esperado de 250 g/kg. O pH da solução foi de 5,49. A concentração de glicose foi medida usando um teste enzimático/espectrofotométrico, com glicose oxidase. A concentração de glicose foi de 17,4 g/L.
Como a maioria dos micro-organismos não usam a sacarose, mas podem usar a glicose e frutose, a solução foi dividida em duas. Uma metade foi autoclavada uma vez por 30 minutos (cana-de-açúcar como é). Algumas inversões resultaram, visto que o teor de glicose aumentou para 29,75 g/L (Veja a figura 149). A outra metade da solução foi ajustada ao pH 4,0 com ácido fosfórico, então a solução foi invertida por autoclave (açúcar de cana invertido). Três ciclos de 30 minutos foram suficientes para obter a inversão completa, conforme mostrado na figura 149. Ambas as soluções foram utilizadas para as curvas de crescimento descritas a seguir.
234/291
II. Curvas de crescimento de diferentes cepas de E. coli e Pseudomonas em cana-de-açúcar em relação à glicose
Uma colônia de cada uma das cepas apresentadas na Tabela 16 foi inoculada em 25 ml de TM3 + 10 g/L de glicose, e foi cultivada durante a noite a 30°C e 200 rpm. TM3 é descrito no Exemplo 7, Seção II. Na manhã seguinte, 1 ml de cada cultura foi utilizado para inocular frascos contendo 25 mL de TM3 e 10 g/L de glicose, 10 g/L de cana-de-açúcar como é, ou 10 g/L de açúcar de cana invertido (soluções de açúcar de cana descritas acima). Os frascos foram incubados a 30°C e 200 rpm e as amostras foram tiradas regularmente para medir a OD600. As figuras 150 e 151 mostram que a taxa de crescimento e produção de biomassa foram comparáveis para a glicose e açúcar de cana invertido, tanto para as cepas de E. coli como as de Pseudomonas. P. fluorescens mostrou alguns sinais de ser capaz de utilizar um açúcar de cana que não foi invertido também.
Tabela 16. Cepas usadas neste estudo
Cepa
Escherichia coli BL21
MG1655
ATCC11303
B REL 606
Pseudomonas putida F1 (ATCC700007)
Fluorescens (ATCC13525)
III. Comparação da produção de isopreno de E. coli expressando isopreno sintase quando cultivada em glicose ou cana-de-açúcar
E. coli MCM401 (BL21 (DE3)) contendo a via completa do MVA, mevalonato quinase de M. mazei e isopreno sintase de Pueraria lobata, conforme descrito no Exemplo 14, Seção II, foi cultivada em TM3 + 10 g/L de glicose ou 10 g/L de açúcar de cana invertido (com base na concentração de carboidratos solúveis do xarope). Frascos foram inoculados a partir de uma cultura cultivada durante a noite em TM3 + 10 g/L de glicose em uma OD6oo = 0,2. Os antibióticos foram adicionados, quando necessário. Após duas horas, as culturas de E. coli foram induzidas com 400 mM de IPTG. Após 6
235/291 horas de crescimento, a produção de isopreno e atividades de isopreno sintase, utilizando o ensaio DMAPP como descrito no Exemplo 2B, foram medidas. Os resultados são apresentados na Tabela 17 e mostram claramente que o açúcar de cana invertido é equivalente à glicose em termos de produção de isopreno e isopreno sintase em uma base por célula.
Tabela 17
Cepa Fonte de Carbono OD Atividade de isopreno sintase mg de isopreno /(L.h.OD) Produção de isoprene mg de isopreno/ (L.h.OD)
MCM401 Glicose 2,20 21,06 8,98
MCM401 Açúcar de cana invertido 2,32 20,20 9,23
A menos que definido de outro modo, os significados de todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados são aqueles comumente entendidos por alguém versado na técnica a que esta invenção pertence. Singleton, etal., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) provêem alguém versado na técnica com um dicionário geral de muitos dos termos utilizados nesta invenção. Entenda-se que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares descritos, já que estes podem variar. Alguém versado na técnica também apreciará que quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser usados para praticar ou testar a invenção.
Os tópicos aqui fornecidos não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que podem ser tomados como referência ao relatório descritivo como um todo.
Para utilização aqui, salvo clara indicação em contrário, o uso dos termos um, uma e semelhantes se refere a um(a) ou mais.
Referência a cerca de um valor ou parâmetro aqui inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas àquele valor ou parâmetro por si. Por exemplo, descrição que se refere a cerca de X inclui a descrição de X. Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.
236/291
Entende-se que aspectos e modalidades da invenção aqui descrita incluem compreender, consistir e consistir essencialmente em aspectos e modalidades.
Exemplo 23: Produção de etileno em E. coli
I. Construção de uma cepa de E. coli produtora de etileno
O produto do gene da enzima formadora de etileno (efe) de Pseudomonas syríngae converte 2-oxoglutarato, um intermediário do ciclo de TCA, em etileno. Os iniciadores que amplificam o gene efe bacteriano foram derivados do gene efe de Pseudomonas syríngae pv. glycinea cepa ICMP2189 (Acc.No. EF175870). O gene efe foi amplificado por PCR usando par de iniciador efe_rev 5' CGGACCGTCATGAGCCTGTCGCGCGGG-3' (SEQ ID N°: 127), em que TCA = códon de parada de efe-gene, e efePffh_oe: 5'-CCACCCCAGGCGAGAGACAATGACCAACCTACAGACTTTC-3' (SEQ ID N°: 128), em que ATG = códon de início de gene efe, dando o fragmento de PCR A. O DNA genômico preparado a partir de Pseudomonas syríngae serviu como molde.
A região promotora putativa do gene ffh de E. coli MG1655 codificando o componente proteico da partícula de reconhecimento do sinal foi amplificada por PCR usando o par de iniciadores Pffhfwd: 5'-CGGTCCG GAAAGAGAAGCAGTATAGCG-3 '(SEQ ID N°:129) e Pffh_oe: 5' -GAAA GTCTGTAGGTTGGTCATTGTCTCTCGCCTGGGGTGG-3 '(SEQ ID N°:130), onde CAT = códon de início de ffh gene, para dar o fragmento de PCR B. O fragmento de PCR B abrange 147 pb a montante do códon de início do gene ffh e, assim, o putativo promotor de ffh. Os fragmentos de PCR A e B foram excisados pela sobreposição de extensão dePCR gerando um fragmento de DNA que codifica o gene efe sob o controle do promotor de ffh. Depois da excisão dos fragmentos de PCR A e B usando o par de iniciadores Pffh fwd e efe_rev, o produto de PCR com extremidades cegas foi clonado em vetor pCR-zero-blunt (Invitrogen) para dar o plasmídeo pCR-blunt_Pffh-efe (SEQ ID 1x, figuras 152Ae 152B).
II. Produção de etileno por E. coli
E. coli DH5a, pCRblunt-Pffh-efe foi inoculada em 5 ml de LB +
237/291 ppm de canamicina e incubada durante a noite a 30°C e 200 rpm. Na manhã seguinte, foi inoculada em meio HM1, pH 6,8 (Tabela 1x), contendo 10 g/L de glicose e 1 g/L de extrato de levedura, a uma OD600 de 0,1. A cultura foi incubada a 30°C e 200 rpm. Após 3 h de incubação, 4X1 mle4x5 ml da cultura foram transferidos para um frasco headspace de 20 ml selado com uma tampa de teflon. Após 7,5 h de incubação, um outro conjunto de 4 X 5 mL da cultura foi transferido para um frasco headspace de 20 ml selado com uma tampa de teflon. Os frascos foram incubados a 30°C e agitação de 200 rpm. Em intervalos regulares de tempo, um frasco foi retirado e analisado para concentração de etileno no headspace, OD600 e ácidos orgânicos. Tabela 1x: Composição de meio HM1
Compostos Concentração (g/L)
K2HPO4 13,6
KH2PO4 13,6
MgSO4 * 7H2O 2
Ácido Cítrico Mono-hidratado 2
Citrato Férrico e de Amônio 0,3
(NH4)2SO4 3,2
Solução de metal traço 1 ml
O etileno foi medido pela análise GC/FID com um instrumento Agilent 7890 GC equipado com um amostrador automático CTC PAL headspace. A coluna GC era uma coluna GS-GasPro (30 m x 0,25 mm x 1 um) conectada a um detector FID. O gás de arraste era hélio a uma vazão de 1,076 mL/min (28,8 cm/seg) com a porta injetora operada em razão de separação de 20:1, e o detector FID mantido a 260°C. Amostras headspace (100 uL/injeção) foram retiradas de frascos de vidro de 20mL e analisadas utilizando um programa isotérmico, com uma temperatura do forno regulada em 90°C durante o tempo de execução de 5 min. O método foi calibrado com 100 ppm de etileno em mistura de gases padrão de nitrogênio obtido de Scott Specialty Gases (PA, USA).
Ácidos orgânicos foram analisados por HPLC (coluna de exclusão iônica Aminex HPX-87H, 300 mm X 7,8 mm, 0,005 M H2SO4, 0,6 mL/min
238/291 como a fase móvel). O succinato não podería ser detectado por este método já que o pico interferiu com um componente no meio.
As figuras 153, 154 e 155 apresentam concentração de etileno (mg/L de headspace), OD, glicose (g/L), acetato (g/L) e lactato (g/L) para os três conjuntos de incubação de frascos headspace (figura 153: 5 mL de caldo na OD 0,23; figura 154: 1 mL de caldo na OD 0,23; figura 155: 5 mL de caldo na OD 0,45). Não foi detectado etileno em frascos controle contendo E. coli DH5a apenas, com caldo transferido para os frascos de mesma OD e incubado durante o mesmo período de tempo.
III. Recuperação de etileno do headspace
O etileno foi recuperado usando adsorção em uma argila montmorilonita modificada por prata, como descrito por Cho et al. (Korean J. Chem. Eng. (2002) 19(5), 821-826.). O gás de escape da fermentação foi desumidificado e posto em um filtro de argila modificada por prata (Cho (2002)) para remover o etileno do fluxo de gás de escape. O fluxo de gás de escape pode ser ainda tratado antes da sua introdução no filtro de prataargila através do qual o dióxido de carbono é eliminado do fluxo de gás de escape por pulverização através de uma solução aquosa de hidróxido de sódio. O etileno foi dessorvido do filtro de prata-argila usando um ciclo de oscilação de pressão, como descrito por Cho et al.
Apêndice 1
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de 1-desóxi-D-xilulose-5fosfato sintase
ATH: AT3G21500(DXPS1) AT4G15560(CLA1) AT5G11380(DXPS3)
OSA: 4338768 4340090 4342614
CME: CMF089C
PFA: MAL13P1.186
TAN: TA20470
TPV: TP01_0516 ECO: b0420(dxs) ECJ: JW0410(dxs) ECE: Z0523(dxs)
239/291
ECS: ECS0474
ECC: c0531(dxs)
ECI: UTI89_C0443(dxs)
ECP: ECP 0479
ECV: APECO1_1590(dxs)
ECW: EcE24377A_0451(dxs)
ECX: EcHS_A0491
STY: STY0461(dxs)
STT: t2441(dxs)
SPT: SPA2301(dxs)
SEC: SC0463(dxs)
STM: STM0422(dxs)
YPE: YPO3177(dxs)
YPK: y1008(dxs)
YPM: YP_0754(dxs)
YPA: YPA 2671
YPN: YPN 0911
YPP: YPDSF 2812
YPS: YPTB0939(dxs)
YPI: YpslP31758_3112(dxs)
SFL: SF0357(dxs)
SFX: S0365(dxs)
SFV: SFV_0385(dxs)
SSN: SSON_0397(dxs)
SBO: SBO_0314(dxs)
SDY: SDY_0310(dxs)
ECA: ECA1131(dxs)
PLU: plu3887(dxs)
BUG: BU464(dxs)
BAS: BUsg448(dxs)
WBR: WGLp144(dxs)
SGL: SG0656
240/291
KPN: KPN_00372(dxs)
BFL: Bfl238(dxs)
BPN: BPEN_244(dxs)
HIN: HI1439(dxs)
HIT: NTHI1691(dxs)
HIP: CGSHiEE_04795
HIQ: CGSHÍGG 01080
HDU: HD0441(dxs)
HSO: HS_0905(dxs)
PMU: PM0532(dxs)
MSU: MS1059(dxs)
APL: APL_0207(dxs)
XFA: XF2249
XFT: PD1293(dxs)
XCC: XCC2434(dxs)
XCB: XC_1678
XCV: XCV2764(dxs)
XAC: XAC2565(dxs)
XOO: XOO2017(dxs)
XOM: X00 1900(X001900)
VCH: VC0889
WU: W10315
WY: W0868
VPA: VP0686
VFI: VF0711
PPR: PBPRA0805
PAE: PA4044(dxs)
PAU: PA14_11550(dxs)
PAP: PSPA7_1057(dxs)
PPU: PP_0527(dxs)
PST: PSPTO_0698(dxs)
PSB: Psyr_0604
241/291
PSP: PSPPH_0599(dxs)
PFL: PFL_5510(dxs)
PFO: Pfl_5007
PEN: PSEEN0600(dxs)
PMY: Pmen_3844
PAR: Psyc_0221(dxs)
PCR: Pcryo_0245
ACI: ACIAD3247(dxs)
SON: SO_1525(dxs)
SDN: Sden_2571
SFR: Sfri_2790
SAZ: Sama_2436
SBL: Sbal_1357
SLO: Shew_2771
SHE: Shewmr4_2731
SHM: Shewmr7_2804
SHN: Shewana3_2901
SHW: Sputw3181-2831
ILO: IL2138(dxs)
CPS: CPS_1088(dxs)
PHA: PSHAa2366(dxs)
PAT: Patl_1319
SDE: Sde_3381
PIN: Ping_2240
MAQ: Maqu_2438
MCA: MCA0817(dxs)
FTU: FTT1018c(dxs)
FTF: FTF1018c(dxs)
FTW: FTW_0925(dxs)
FTL: FTL-1072
FTH: FTH—1047(dxs)
FTA: FTA_1131(dxs)
242/291
FTN: FTN_0896(dxs)
NOC: Noc_1743
AEH: Mlg_1381
HCH: HCH_05866(dxs)
CSA: Csal_0099
ABO: ABO_2166(dxs)
AHA: AHA_3321(dxs)
BCI: BCI_0275(dxs)
RMA: Rmag_0386
VOK: COSY_0360(dxs)
NME: NMB1867
NMA: NMA0589(dxs)
NMC: NMC0352(dxs)
NGO: NG00036
CVI: CV_2692(dxs)
RSO: RSc2221(dxs)
REU: Reut_A0882
REH: H16_A2732(dxs)
RME: Rmet_2615
BMA: BMAA0330(dxs)
BMV: BMASAVP1_1512(dxs)
BML: BMA10299_1706(dxs)
BMN: BMA10247_A0364(dxs)
BXE: Bxe_B2827
BUR: Bcep18194_B2211
BCN: Bcen_4486
BCH: Bcen2424_3879
BAM: Bamb_3250
BPS: BPSS1762(dxs)
BPM: BURPS1710b_A0842(dxs)
BPL: BURPS1106A_A2392(dxs)
BPD: BURPS668_A2534(dxs)
243/291
BTE: BTH_IIO614(dxs)
ΒΡΕ: BP2798(dxs)
BPA: BPP2464(dxs)
BBR: BB1912(dxs)
RFR: Rfer_2875
POL: Bpro_1747
PNA: Pnap_1501
AJS: Ajs_1038
MPT: Mpe_A2631
HAR: HEAR0279(dxs)
MMS: mma_0331
NEU: NE1161(dxs)
NET: Neut_1501
NMU: Nmul_A0236
EBA: ebA4439(dxs)
AZO: azo1198(dxs)
DAR: Daro_3061
TBD: Tbd_0879
MFA: Mfla_2133
HPY: HP0354(dxs)
HPJ: jhp0328(dxs)
HPA: HPAG1_0349
HHE: HH0608(dxs)
HAC: Hac_0968(dxs)
WSU: WS1996
TDN: Tmden_0475
CJE: Cj0321(dxs)
CJR: CJE0366(dxs)
CJJ: CJJ81176_0343(dxs)
CJU: C8J_0298(dxs)
CJD: JJD26997_1642(dxs)
CFF: CFF8240_0264(dxs)
244/291
CCV: CCV52592_1671(dxs) CCV52592_1722
CHA: CHAB381_1297(dxs)
CCO: CCC13826_1594(dxs)
ABU: Abu_2139(dxs)
NIS: NIS_0391(dxs)
SUN: SUN_2055(dxs)
GSU: GSU0686(dxs-1) GSU1764(dxs-2)
GME: Gmet_1934 Gmet_2822
PCA: Pcar_1667
PPD: Ppro_1191 Ppro_2403
DVU: DVU1350(dxs)
DVL: Dvul_1718
DDE: Dde_2200
LIP: LI0408(dsx)
DPS: DP2700
ADE: Adeh_1097
MXA: MXAN_4643(dxs)
SAT: SYN 02456
SFU: Sfum_1418
PUB: SAR11_0611(dxs)
MLO: mlr7474
MES: Meso_0735
SME: SMc00972(dxs)
ATU: Atu0745(dxs)
ATC: AGR C1351
RET: RHE_CH00913(dxs)
RLE: RL0973(dxs)
BME: BMEI1498
BMF: BAB1 0462(dxs)
BMS: BR0436(dxs)
BMB: BruAb1_0458(dxs)
BOV: BOV_0443(dxs)
245/291
BJA: bll2651(dxs)
BRA: BRADO2161(dxs)
BBT: BBta_2479(dxs)
RPA: RPA0952(dxs)
RPB: RPB 4460
RPC: RPC1149
RPD: RPD_4305
RPE: RPE1067
NWI: Nwi_0633
NHA: Nham_0778
BHE: BH04350(dxs)
BQU: BQ03540(dxs)
BBK: BARBAKC583_0400(dxs)
CCR: CC 2068
SIL: SPO0247(dxs)
SIT: TM1040 2920
RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs)
JAN: Jann_0088 Jann_0170
RDE: RD1_0101(dxs) RD1_0548(dxs)
MMR: Mmar10_0849
HNE: HNE_1838(dxs)
ZMO: ZMO1234(dxs) ZMO1598(dxs)
NAR: Saro_0161
SAL: Sala_2354
ELI: ELI12520
GOX: GOX0252
GBE: GbCGDNIH1_0221 GbCGDNIH1_2404
RRU: Rru_A0054 Rru_A2619
MAG: amb2904
MGM: Mmc1_1048
SUS: Acid_1783
BSU: BG11715(dxs)
246/291
BHA: BH2779
BAN: BA4400(dxs)
BAR: GBAA4400(dxs)
BAA: BA 4853
BAT: BAS4081
BCE: BC4176(dxs)
BCA: BCE_4249(dxs)
BCZ: BCZK3930(dxs)
BTK: BT9727_3919(dxs)
BTL: BALH_3785(dxs)
BLI: BL01523(dxs)
BLD: BLiO2598(dxs)
BCL: ABC2462(dxs)
BAY: RBAM_022600
BPU: BPUM 2159
GKA: GK2392
GTN: GTNG_2322
LMO: Imo1365(tktB)
LMF: LMOÍ2365 1382(dxs)
LIN: lin1402(tktB)
LWE: lwe1380(tktB)
LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB)
LLC: LACR 1572 LACR_1843
LLM: Hmg_0749(dxsB)
SAK: SAK 0263
LPL: lp_2610(dxs)
LJO: LJ0406
LAC: LBA0356
LSL: LSL_0209(dxs)
LGA: LGAS 0350
STH: STH 1842
CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs)
247/291
CPE: CPE1819
CPF: CPF_2073(dxs)
CPR: CPR_1787(dxs)
CTC: CTC01575
CNO: NT01CX_1983
CTH: Cthe_0828
CDF: CD1207(dxs)
CBO: CBO1881(dxs)
CBA: CLB_1818(dxs)
CBH: CLC_1825(dxs)
CBF: CLI_1945(dxs)
CKL: CKL_1231(dxs)
CHY: CHY_1985(dxs)
DSY: DSY2348
DRM: Dred_1078
PTH: PTH_1196(dxs)
SWO: Swol_0582
CSC: Csac_1853
TTE: TTE1298(dxs)
MTA: Moth_1511
MPE: MYPE730
MGA: MGA_1268(dxs)
MTU: Rv2682c(dxs1) Rv3379c(dxs2)
MTC: MT2756(dxs)
MBO: Mb2701c(dxs1) Mb3413c(dxs2)
MLE: ML1038(dxs)
MPA: MAP2803c(dxs)
MAV: MAV_3577(dxs)
MSM: MSMEG_2776(dxs)
MMC: Mmcs_2208
CGL: NCgl1827(cgl1902)
CGB: cg2083(dxs)
248/291
CEF: CE1796
CDI: DIP1397(dxs)
CJK: jk1078(dxs)
NFA: nfa37410(dxs)
RHA: RHA1_ro06843
SCO: SC06013(SC1C3.01) SCO6768(SC6A5.17)
SMA: SAV1646(dxs1) SAV2244(dxs2)
TWH: TWT484
TWS: TW280(Dxs)
LXX: Lxx10450(dxs)
CMI: CMM_1660(dxsA)
AAU: AAur_1790(dxs)
PAC: PPA1062
TFU: Tfu_1917
FRA: Francci3_1326
FAL: FRAAL2088(dxs)
ACE: Acel_1393
SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351
BLO: BL1132(dxs)
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Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de acetil-CoA-acetiltransferase
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251/291
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252/291
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253/291
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PSP: PSPPH_0850(phbA1) PSPPH_2209(phbA2)
PFL: PFL_1478(atoB-2) PFL_2321 PFL_3066 PFL_4330(atoB-2) PFL_5283
PFO: Pfl_1269 Pfl_1739 Pfl_2074 Pfl_2868
PEN: PSEEN3197 PSEEN3547(fadAx) PSEEN4635(phbA)
PMY: Pmen_1138 Pmen_2036 Pmen_3597 Pmen_3662 Pmen_3820
PAR: Psyc_0252 Psyc_1169
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PRW: PsycPRwf_2011
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SON: SO_1677(atoB)
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SAZ: Sama_1375
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SBN: Sbal195_1525
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SPL: Spea_2783
SHE: Shewmr4_2597
SHM: Shewmr7_2664
SHN: Shewana3_2771
SHW: Sputw3181_2704
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SDE: Sde_3149
PIN: Ping_0659 Ping_2401
254/291
MAQ: Maqu_2117 Maqu_2489 Maqu_2696 Maqu_3162
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LPF: Ipl1789
LPP: Ipp1788
NOC: Noc_1891
AEH: Mlg_0688 Mlg_2706
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HCH: HCH_05299
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CVI: CV_2088(atoB) CV_2790(phaA)
RSO: RSc0276(atoB) RSc1632(phbA) RSc1637(bktB) RSc1761(RS02948)
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Reut_B5587 Reut_C5943 Reut_C6062
REH: H16_A0170 H16_A0867 H16_A0868 H16_A0872 H16_A1297
H16_A1438(phaA) H16_A1445(bktB) H16_A1528 H16_A1713 H16_A1720
H16_A1887 H16_A2148 H16_B0380 H16_B0381 H16_B0406 H16_B0662
H16B0668 H16_B0759 H16_B1369 H16_B1771
RME: Rmet_0106 Rmet_1357 Rmet_1362 Rmet_5156
BMA: BMA1316 BMA1321(phbA) BMA1436
BMV: BMASAVP1_A1805(bktB) BMASAVP1_A1810(phbA)
BML: BMA10299_A0086(phbA) BMA10299_A0091
BMN: BMA10247 1076(bktB) BMA10247_1081(phbA)
BXE: Bxe_A2273 Bxe_A2335 Bxe_A2342 Bxe_A4255 Bxe_B0377
Bxe_B0739
Bxe_C0332 Bxe_C0574 Bxe_C0915
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255/291
BUR: Bcep18194_A3629 Bcep18194_A5080 Bcep18194_A5091
Bcep18194_A6102 Bcep18194_B0263 Bcep18194_B1439
Bcep18194_C6652 Bcep18194_C6802 Bcep18194_C6874
Bcep18194_C7118 Bcep18194_C7151 Bcep18194_C7332
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Bcen_6289
BCH: Bcen2424_0542 Bcen2424_1790 Bcen2424_2772 Bcen2424_5368
Bcen2424_6232 Bcen2424_6276
BAM: Bamb_0447 Bamb_1728 Bamb_2824 Bamb_4717 Bamb_5771
Bamb_5969
BPS: BPSL1426 BPSL1535(phbA) BPSL1540
BPM: BURPS1710b_2325(bktB) BURPS1710b_2330(phbA)
BURPS 1710b_2453(atoB-2)
BPL: BURPS1106A_2197(bktB) BURPS1106A_2202(phbA)
BPD: BURPS668_2160(bktB) BURPS668_2165(phbA)
BTE: BTHJ2144 BTHJ2256 BTHJ2261
PNU: Pnuc_0927
ΒΡΕ: BP0447 BP0668 BP2059
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Rfer_3839
POL: Bpro_1577 Bpro_2140 Bpro_3113 Bpro_4187
PNA: Pnap_0060 Pnap_0458 Pnap_0867 Pnap_1159 Pnap_2136
Pnap_2804
AAV: Aave_0031 Aave_2478 Aave_3944 Aave_4368
AJS: Ajs_0014 Ajs_0124 Ajs_1931 Ajs_2073 Ajs_2317 Ajs_3548
Ajs_3738 Ajs_3776
VEI: Veis_1331 Veis_3818 Veis_4193
DAC: Daci_0025 Daci_0192 Daci_3601 Daci_5988
MPT: Mpe_A1536 Mpe_A1776 Mpe_A1869 Mpe_A3367
HAR: HEAR0577(phbA)
256/291
MMS: mma_0555
NEU: NE2262(bktB)
NET: Neut_0610
EBA: ebA5202 p2A409(tioL)
AZO: azo0464(fadA1) azo0469(fadA2) azo2172(thlA)
DAR: Daro_0098 Daro_3022
HPA: HPAG1_0675
HAG: Hac_0958(atoB)
GME: Gmet_1719 Gmet_2074 Gmet_2213 Gmet_2268 Gmet_3302
GUR: Gura_3043
BBA: Bd0404(atoB) Bd2095
DOL: Dole_0671 Dole_1778 Dole_2160 Dole_2187
ADE: Adeh_0062 Adeh_2365
AFW: Anae109_0064 Anae109_1504
MXA: MXAN_3791
SAT: SYN 02642
SFU: Sfum_2280 Sfum_3582
RPR: RP737
RCO: RC1134 RC1135
RFE: RF_0163(paaJ)
RBE: RBE_0139(paaJ)
RAK: A1C_05820
RBO: A1l_07215
ROM: A1E_04760
PUB: SAR11_0428(thlA)
MLO: mlr3847
MES: Meso_3374
PLA: Plav_1573 Plav_2783
SME: SMa1450 SMcO3879(phbA)
SMD: Smed_0499 Smed_3117 Smed_5094 Smed_5096
ATU: Atu2769(atoB) Atu3475
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257/291
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RHE_PF00014(phbAf)
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BME: BMEI0274 BMEII0817
BMF: BAB1_1783(phbA-1) BAB2_0790(phbA-2)
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BMB: BruAb1_1756(phbA-1) BruAb2_0774(phbA-2)
BOV: BOV_1707(phbA-1)
OAN: Oant_1130 Oant_3107 Oant_3718 Oant_4020
BJA: bll0226(atoB) bll3949 bll7400 bll7819 blr3724(phbA)
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BBT: BBta_3558 BBta_3575(atoB) BBta_5147(pimB) BBta_7072(pimB)
BBta_7614(phbA)
RPA: RPA0513(pcaF) RPA0531 RPA3715(pimB)
RPB: RPB_0509 RPB_0525 RPB_1748
RPC: RPC_0504 RPC_0636 RPC_0641 RPC_0832 RPC_1050 RPC_2005
RPC_2194 RPC_2228
RPD: RPD_0306 RPD_0320 RPD_3105 RPD_3306
RPE: RPE_0168 RPE_0248 RPE_3827
NWI: Nwi_3060
XAU: Xaut_3108 Xaut_4665
CCR: CC 0510 CC_0894 CC_3462
SIL: SPO0142(bktB) SPO0326(phbA) SPO0773 SPO3408
SIT: TM1040_0067 TM1040_2790 TM1040_3026 TM1040_3735
RSP: RSP 0745 RSP_1354 RSP_3184
RSH: Rsph17029_0022 Rsph17029_2401 Rsph17029_3179 Rsph17029_3921
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JAN: Jann_0262 Jann_0493 Jann_4050
RDE: RD1_0025 RD1_0201(bktB) RD1_3394(phbA)
PDE: Pden_2026 Pden_2663 Pden_2870 Pden_2907 Pden_4811
258/291
Pden_5022
DSH: Dshi_0074 Dshi_3066 Dshi_3331
MMR: Mmarl 0 0697
HNE: HNE_2706 HNE_3065 HNE_3133
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Swit_5309
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GBE: GbCGDNIH1_0447
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MGM: Mmc1_1165
ABA: Acid345_3239
BSU: BG11319(mmgA) BG13063(yhfS)
BHA: BH1997 BH2029 BH3801(mmgA)
BAN: BA3687 BA4240 BA5589
BAR: GBAA3687 GBAA4240 GBAA5589
BAA: BA_0445 BA_4172 BA_4700
BAT: BAS3418 BAS3932 BAS5193
BCE: BC3627 BC4023 BC5344
BCA: BCE 3646 BCE_4076 BCE_5475
BCZ: BCZK3329(mmgA) BCZK3780(thl) BCZK5044(atoB)
BCY: Bcer98_2722 Bcer98_3865
BTK: BT9727_3379(mmgA) BT9727_3765(thl) BT9727_5028(atoB)
BTL: BALH_3262(mmgA) BALH_3642(fadA) BALH_4843(atoB)
BLI: BL03925(mmgA)
BLD: BLiO3968(mmgA)
BCL: ABC0345 ABC2989 ABC3617 ABC3891(mmgA)
BAY: RBAM 022450
BPU: BPUM_2374(yhfS) BPUM_2941 BPUM_3373
259/291
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GKA: GK1658GK3397
SAU: SA0342 SA0534(vraB)
SAV: SAV0354 SAV0576(vraB)
SAM: MW0330 MW0531(vraB)
SAR: SAR0351(thl) SAR0581
SAS: SAS0330 SAS0534
SAC: SACOL0426 SACOL0622(atoB)
SAB: SAB0304(th1) SAB0526
SAA: SAUSA300 0355 SAUSA300_0560(vraB)
SAG: SAOUHSC_00336 SAQUHSC_00558
SAJ: SaurJH9_0402
SAH: SaurJH1_0412
SEP: SE0346 SE2384
SER: SERP0032 SERP0220
SHA: SH0510(mvaC) SH2417
SSP: SSP0325 SSP2145
LMO: Imo1414
LMF: LMOf2365_1433
LIN: Iin1453
LWE: Iwe1431
LLA: L11745(thiL) L25946(fadA)
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LLM: llmg_0930(thiL)
SPY: SPy_0140 SPy_1637(atoB)
SPZ: M5005_Spy_0119 M5005_Spy_0432 M5005_Spy_1344(atoB)
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SPS: SPs0110 SPsO484
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MGAS10270_Spy 1461 (atoB)
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260/291
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SAK: SAK_0568
LJO: LJ1609
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LDB: Ldb0879
LBU: LBUL 0804
LBR: LVIS_2218
LCA: LSEM787
LGA: LGAS_1374
LRE: Lreu_0052
EFA: EF1364
OOE: OEOE 0529
STH: STH2913 STH725 STH804
CAC: CAC2873 CA_P0078(thiL)
CPE: CPE2195(atoB)
CPF: CPF 2460
CPR: CPR 2170
CTC: CTC00312
CNO: NT01CX 0538 NT01CX_0603
CDF: CD1059(thlA1) CD2676(thlA2)
CBO: CBG3200(thl) '30 CBE: Cbei_0411 Cbei_3630
CKL: CKL_3696(thlA1) CKL_3697(thlA2) CKL_3698(thlA3)
AMT: Amet_4630
261/291
AOE: Clos_0084 Clos_0258
CHY: CHY 1288 CHY_1355(atoB) CHY_1604 CHY_1738
DSY: DSY0632 DSY0639 DSY1567 DSY1710 DSY2402 DSY3302
DRM: Dred_0400 Dred_1491 Dred_1784 Dred_1892
SWO: Swol_0308 Swol_0675 Swol_0789 Swol_1486 Swol_1934 Swol_2051
TTE: TTE0549(paaJ)
MTA: Moth_1260
MTU: Rv1135A Rv1323(fadA4) Rv3546(fadA5)
MTC: MT1365(phbA)
MBO: Mb1167 Mb1358(fadA4) Mb3576(fadA5) Mb3586c(fadA6)
MBB: BCG_1197 BCG_1385(fadA4) BCG_3610(fadA5)
BCG_3620c(fadA6)
MLE: ML1158(fadA4)
MPA: MAP2407c(fadA3) MAP2436c(fadA4)
MAV: MAV_1544 MAV_1573 MAV_1863 MAV_5081
MSM: MSMEG 2224 MSMEG_4920
MUL: MUL_0357
MVA: Mvan_1976 Mvan_1988 Mvan_4305 Mvan_4677 Mvan_4891
MGI: Mflv_1347 Mflv_1484 Mflv_2040 Mflv_2340 Mflv_4356 Mflv_4368
MMC: Mmcs_1758 Mmcs_1769 Mmcs_3796 Mmcs_3864
MKM: Mkms_0251 Mkms_1540 Mkms_1805 Mkms_1816 Mkms_2836
Mkms_3159
Mkms_3286 Mkms_3869 Mkms_3938 Mkms_4227 Mkms_4411
Mkms_4580
Mkms_4724 Mkms_4764 Mkms_4776
MJL: Mjls_0231 Mjls_1739 Mjls_1750 Mjls_2819 Mjls_3119 Mjls_3235
Mjls_3800 Mjls_3850 Mjls_4110 Mjls_4383 Mjls_4705 Mjls_4876
Mjls_5018 Mjls_5063 Mjls_5075
CGL: NCgl2309(cgl2392)
CGB: cg2625(pcaF)
CEF: CE0731 CE2295
CJK: jk1543(fadA3)
262/291
NFA: nfa10750(fadA4)
RHA: RHA1_ro01455 RHA1_ro01623 RHA1_ro01876
RHA1_ro02517(catF)
RHA1_ro03022 RHA1_ro03024 RHA1_ro03391 RHA1_ro03892
RHA1_ro04599 RHA1_ro05257 RHA1_ro08871
SCO: SCO5399(SC8F4.03)
SMA: SAV1384(fadA5) SAV2856(fadA1)
ART: Arth_1160 Arth_2986 Arth_3268 Arth_4073
NCA: Noca_1371 Noca_1797 Noca_1828 Noca_2764 Noca_4142
TFU: Tfu_1520 Tfu_2394
FRA: Francci3_3687
FRE: Franean1_1044 Franean1_2711 Franean1_2726 Franean1_3929
Franean1_4037 Franean1_4577
FAL: FRAAL2514 FRAAL2618 FRAAL5910(atoB)
ACE: Acel_0626 Acel_0672
SEN: SACE_1192(mmgA) SACE_2736(fadA6) SACE_4011(catF)
SACE 6236(fadA4)
STR: Strop_3610
SAQ: Sare_1316 Sare_3991
RXY: Rxyl_1582 Rxyl_1842 Rxyl_2389 Rxyl_2530
FNU: FN0495
BGA: BG0110(fadA)
BAF: BAPKO_0110(fadA)
LIL: LYK0457(thiL1) LA0828(thiL2) LA4139(fadA)
LIC: LIC10396(phbA)
LBJ: LBJ_2862(paaJ-4)
LBL: LBL_0209(paaJ-4)
SYN: slr1993(phaA)
SRU: SRU_1211(atoB) SRU_1547
CHU: CHU_1910(atoB)
GFO: GFO_1507(atoB)
FJO: Fjoh_4612
263/291
FPS: FP0770 FP1586 FP1725
RRS: RoseRS_3911 RoseRS_4348
RCA: Rcas_0702 Rcas_3206
HAU: Haur_0522
DRA: DR 1072 DR_1428 DR_1960 DR_2480 DR_A0053
DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441 Dgeo_1883
TTH:TTC0191 TTC0330
TTJ: TTHA0559
TME: Tmel_1134
FNO: Fnod_0314
PMO: Pmob_0515
HMA: rrnAC0896(acaB3) rrnAC2815(aca2) rrnAC3497(yqeF) rrnB0240(aca1) rrnB0242(acaB2) rrnB0309(acaB1)
TAC: Ta0582
TVO: TVN0649
PTO: PTO1505
APE: APE 2108
SSO: SSO2377(acaB-4)
STO: ST0514
SAI: Saci_0963 Saci_1361(acaB1)
MSE: Msed_0656
PAI: PAE 1220
PIS: Pisl_0029 Pisl_1301
PCL: Pcal_0781
PAS: Pars_0309 Pars_1071
CMA: Cmaq_1941
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de HMG-CoA sintase
HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2)
PTR: 457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1)
MCC: 702553(HMGCS1) 713541(HMGCS2)
MMU: 15360(Hmgcs2) 208715(Hmgcs1)
RNO: 24450(Hmgcs2) 29637(Hmgcs1)
264/291
CFA: 479344(HMGCS1) 607923(HMGCS2)
BTA: 407767(HMGCS1)
SSC: 397673(CH242-38B5.1)
GGA: 396379(HMGCS1)
XLA: 380091 (hmgcsl) 447204(MGC80816)
DRE: 394060(hmgcs1)
SPU: 578259(LOC578259)
DME: Dmel_CG4311(Hmgs)
CEL: F25B4.6
ATH: AT4G11820(BAP1)
OSA: 4331418 4347614
CME: CMM189C
SCE: YML126C(ERG13)
AGO: AGOS ADL356C
PIC: PICST-83020
CAL: CaO19-7312(CaO19.7312)
CGR: CAGL0H04081g
SPO: SPAC4F8.14c(hcs)
MGR: MGG_01026
ANI: AN4923.2
AFM: AFUA_3G10660 AFUA_8G07210
AOR: A0090003000611 A0090010000487
CNE: CNC05080 CNG02670
UMA: UM05362.1
ECU: ECU10-0510
DDI: DDBDRAFT_0217522 DDB_0219924(hgsA)
TET: TTHERM-00691190
TBR: Tb927.8.6110
YPE: YPO1457
YPK: y2712(pksG)
YPM: YP_1349(pksG)
YPA: YPA 0750
265/291
YPN: YPN 2521
YPP: YPDSF_1517
YPS: YPTB1475
CBD: COXBU7E9121931
TCX:Tcr_1719
DNO: DNO 0799
BMA: BMAA1212
BPS: BPSS1002
BPM: BURPS1710b_A2613
BPL: BURPS1106A A1384
BPD: BURPS668 A1470
BTE: BTHJI1670
MXA: MXAN_3948(tac) MXAN_4267(mvaS)
BSU: BG10926(pksG)
OIH: OB2248
SAU: SA2334(mvaS)
SAV: SAV2546(mvaS)
SAM: MW2467(mvaS)
SAR: SAR2626(mvaS)
SAS: SAS2432
SAC: SACOL2561
SAB: SAB2420(mvaS)
SAA: SAUSA300 2484
SAG: SAOUHSC 02860
SAJ: SaurJH9_2569
SAH: SaurJH1_2622
SEP: SE2110
SER: SERP2122
SHA: SH0508(mvaS) '30 SSP: SSP0324
LMO: Imo1415
LMF: LMOf2365_1434(mvaS)
266/291
LIN: Iin1454
LWE: lwe1432(mvaS)
LLA: L13187(hmcM)
LLC: LACR_1666
LLM: llmg_0929(hmcM)
SPY: SPy_0881(mvaS.2)
SPZ: M5005_Spy_0687(mvaS.1)
SPM: spyM18_0942(mvaS2)
SPG: SpyM3_0600(mvaS.2)
SPS: SPs1253
SPH: MGAS10270_Spy0745(mvaS1)
SPI: MGAS10750_Spy0779(mvaS1)
SPJ: MGAS2096_Spy0759(mvaS1)
SPK: MGAS9429_Spy0743(mvaS1)
SPF: SpyM51121 (mvaS)
SPA: M6_Spy0704
SPB: M28_SpyO667(mvaS.1)
SPN: SP_1727
SPR: spr1571 (mvaS)
SPD: SPD_1537(mvaS)
SAG: SAG1316
SAN: gbs1386
SAK: SAK1347
SMU: SMU.943C
STC: strO577(mvaS)
STL: stuO577(mvaS)
STE: STER 0621
SSA: SSA_0338(mvaS)
SSU: SSU05_1641 '30 SSV: SSU98_1652
SGO: SGO 0244
LPL: lp_2067(mvaS)
267/291
LJO: LJ1607
LAC: LBA0628(hmcS)
LSA: LSA1484(mvaS)
LSL: LSL0526
LDB: LdbO881(mvaS)
LBU: LBUL_0806
LBR: LVIS1363
LCA: LSEI1785
LGA: LGAS_1372
LRE: Lreu_0676
PPE: PEPE 0868
EFA: EF1363
OOE: OEOE_0968
LME: LEUM1184
NFA: nfa22120
SEN: SACE_4570(pksG)
BBU: BB0683
BGA: BG0706
BAF: BAPKO_0727
FJO: Fjoh_0678
HAL: VNG1615G(mvaB)
HMA: rrnAC1740(mvaS)
HWA: HQ2868A(mvaB)
NPH: NP2608A(mvaB_1) NP4836A(mvaB_2)
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de hidroximetilqlutaril-CoA redutase
HSA: 3156(HMGCR)
PTR: 471516(HMGCR)
MCC: 705479(HMGCR)
MMU: 15357(Hmgcr)
RNO: 25675(Hmgcr)
CFA: 479182(HMGCR)
268/291
BTA: 407159(HMGCR)
GGA: 395145(RCJMB04_14m24)
SPU: 373355(LOC373355)
DME: Dmel_CG10367(Hmgcr)
CEL: F08F8.2
OSA: 4347443
SCE: YLR450W(HMG2) YML075C(HMG1)
AGO: AGOS AER152W
CGR: CAGL0L11506g
SPO: SPCC162.09c(hmg1)
ANI: AN3817.2
AFM: AFUA1G11230 AFUA_2G03700
AOR: AO090103000311 AO090120000217
CNE: CNF04830
UMA: UM03014.1
ECU: ECU10_1720
DDL DDB_0191125(hmgA) DDB_0215357(hmgB)
TBR: Tb927.6.4540
TCR: 506831.40 509167.20
LMA: LmjF30.3190
VCH: VCA0723
VCO: VC0395 0662
WU: W2_0117
WY: WA0625
VPA: VPA0968
VFI: VFA0841
PAT: Patl_0427
CBU: CBU 0030 CBU_0610
CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622(hmgA)
TCX: Tcr_1717
DNO: DNO 0797
CVI: CV 1806
269/291
SUS: Acid_5728 Acid_6132
SAU: SA2333(mvaA)
SAV: SAV2545(mvaA)
SAM: MW2466(mvaA)
SAB: SAB2419c(mvaA)
SEP: SE2109
LWE: lwe0819(mvaA)
LLA: L10433(mvaA)
LLC: LACR_1664
LLM: llmg_0931(mvaA)
SPY: SPy_0880(mvaS.1)
SPM: spyM18_0941(mvaS1)
SPG: SpyM3_0599(mvaS.1)
SPS: SPs1254
SPH: MGAS10270_Spy0744
SPI: MGAS10750_Spy0778
SPJ: MGAS2096_Spy0758
SPK: MGAS9429_Spy0742
SPA: M6_Spy0703
SPN: SP_1726
SAG: SAG1317
SAN: gbs1387
STC: strO576(mvaA)
STL: stuO576(mvaA)
STE: STER 0620
SSA: SSA_0337(mvaA)
LPL: lp_0447(mvaA)
LJO: LJ1608
LSL: LSL 0224
LBR: LVIS_0450
LGA: LGAS_1373
EFA: EF1364
270/291
NFA: nfa22110
BGA: BG0708(mvaA)
SRU: SRU 2422
FPS: FP2341
MMP: MMP0087(hmgA)
MMQ: MmarC5_1589
MAC: MA3073(hmgA)
MBA: Mbar_A1972
MMA: MM 0335
MBU: Mbur_1098
MHU: Mhun_3004
MEM: Memar_2365
MBN: Mboo_0137
MTH: MTH562
MST: Msp_0584(hmgA)
MS I: Msm_0227
MKA: MK0355(HMG1)
AFU: AF1736(mvaA)
HAL: VNG1875G(mvaA)
HMA: rrnAC3412(mvaA)
HWA: HQ3215A(hmgR)
NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_1)
TAC: Ta0406m
TVO: TVN1168
PTO:PTO1143
PAB: PAB2106(mvaA)
PFU: PF1848
TKO: TK0914
RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA) '30 APE:APE_1869
I HO: lgni_0476
HBU: Hbut 1531
271/291
SSO: SSO0531
STO:ST1352
SAI: Saci_1359
PAI: PAE2182
PIS: Pisl_0814
PCL: Pcal_1085
PAS: Pars_0796
Ácidos nucléicos e polipeptídeos exemplares de mevalonato quinase
HSA: 4598(MVK)
MCC: 707645(MVK)
MMU: 17855(Mvk)
RNO: 81727(Mvk)
CFA: 486309(MVK)
BTA: 505792(MVK)
GGA: 768555(MVK)
DRE: 492477(zgc: 103473)
SPU: 585785(LOC585785)
DME: Dmel_CG33671
OSA: 4348331
SCE: YMR208W(ERG12)
AGO: AGOS_AER335W
PIC: PICST_40742(ERG12)
CGR: CAGL0F03861g
SPO: SPAC13G6.11C
MGR: MGG_06946
ANI: AN3869.2
AFM: AFUA_4G07780
AOR: A0090023000793
CNE: CNK01740 ‘30 ECU: ECU09 1780
DDI: DDBDRAFT_0168621
TET: TTHERM_00637680
272/291
TBR: Tb927.4.4070
TCR: 436521.9 509237.10
LMA: LmjF31.0560
CBU: CBU 0608 CBU_0609
CBD: COXBU7E912_0620(mvk)
LPN: lpg2039
LPF: lpl2017
LPP: lpp2022
BBA: Bd1027(lmbP) Bd1630(mvk)
MXA: MXAN_5019(mvk)
OIH: OB0225
SAU: SA0547(mvaK1)
SAV: SAV0590(mvaK1)
SAM: MW0545(mvaK1)
SAR: SAR0596(mvaK1)
SAS: SAS0549
SAC: SACOL0636(mvk)
SAB: SAB0540(mvaK1)
SAA: SAUSA300_0572(mvk)
SAO: SAOUHSC_00577
SEP: SE0361
SER: SERP0238(mvk)
SHA: SH2402(mvaK1)
SSP: SSP2122
LMO: Imo0010
LMF: LMOf2365_0011
LIN: lin0010
LWE: lwe0011(mvk)
LLA: L7866(yeaG) ’30 LLC: LACR_0454
LLM: llmg_0425(mvk)
SPY: SPy_0876(mvaK1)
273/291
SPZ: M5005_Spy_0682(mvaK1)
SPM: spyM18_0937(mvaK1)
SPG: SpyM3_0595(mvaK1)
SPS: SPs1258
SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaK1)
SPI: MGAS10750_Spy0774(mvaK1)
SPJ: MGAS2096_Spy0753(mvaK1)
SPK: MGAS9429_Spy0737(mvaK1)
SPF: SpyM51126(mvaK1)
SPA: M6_SpyO699
SPB: M28_SpyO662(mvaK1)
SPN: SP_0381
SPR: spr0338(mvk)
SPD: SPD_0346(mvk)
SAG: SAG 1326
SAN: gbs1396
SAK: SAK_1357(mvk)
SMU: SMU.181
STC: str0559(mvaK1)
STL: stuO559(mvaK1)
STE: STER_0598
SSA: SSA_0333(mvaK1)
SSU: SSU05 0289
SSV: SSU98 0285
SGO: SGO_0239(mvk)
LPL: lp_1735(mvaK1)
LJO: LJ1205
LAC: LBA1167(mvaK)
LSA: LSA0908(mvaK1) '30 LSL: LSL_0685(eRG)
LDB: Ldb0999(mvk)
LBU: LBUL 0906
274/291
LBR: LVIS_0858
LCA: LSEM491
LGA: LGAS1033
LRE: Lreu_0915
PPE: PEPE_0927
EFA: EF0904(mvk)
OOE: ΟΕΘΕ1100
LME: LEUMJ385
NFA: nfa22070
BGA: BG0711
BAF: BAPKO_0732
FPS: FP0313
MMP: MMP1335
MAE: Maeo_0775
MAC: MA0602(mvk)
MBA: Mbar_A1421
MMA: MM.1762
MBU: Mbur_2395
MHU: Mhun_2890
MEM: Memar_1812
MBN: Mboo_2213
MST: Msp_0858(mvk)
MSI: Msm_1439
MKA: MK0993(ERG12)
HAL: VNG1145G(mvk)
HMA: rrnAC0077(mvk)
HWA: HQ2925A(mvk)
NPH: NP2850A(mvk)
PTO: PTO1352
PHO: PH1625
PAB: PAB0372(mvk)
PFU: PF1637(mvk)
275/291
ΤΚΟ: ΤΚ1474
RCI: LRC399(mvk)
APE: APE 2439
HBU: Hbut_0877
SSO: SSO0383
STO: ST2185
SAI: Saci_2365(mvk)
MSE: Msed_1602
PAI: PAE3108
PIS: Pisl_0467
PCL: Pcal_1835
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplares de fosfomevalonato quinase
HSA: 10654(PMVK)
PTR: 457350(PMVK)
MCC: 717014(PMVK)
MMU: 68603(Pmvk)
CFA: 612251 (PMVK)
BTA: 513533(PMVK)
DME: Dmel_CG10268
ATH: AT1G31910
OSA: 4332275
SCE: YMR220W(ERG8)
AGO: AGOS_AER354W
PIC: PICST_52257(ERG8)
CGR: CAGL0F03993g
SPO: SPAC343.01c
MGR: MGG_05812
ANI:AN2311.2
AFM: AFUA_5G10680 ‘30 AOR: A0090010000471
CNE: CNM00100
UMA: UM00760.1
276/291
DDL DDBDRAFT0184512
TBR: Tb09.160.3690
TCR: 507913.20 508277.140
LMA: LmjF15.1460
MXA: MXAN_5017
OIH: OB0227
SAU: SA0549(mvaK2)
SAV: SAV0592(mvaK2)
SAM: MW0547(mvaK2)
SAR: SAR0598(mvaK2)
SAS: SAS0551
SAC: SACOL0638
SAB: SAB0542(mvaK2)
SAA: SAUSA300_0574
SAO: SAOUHSC 00579
SAJ: SaurJH9_0615
SEP: SE0363
SER: SERP0240
SHA: SH2400(mvaK2)
SSP: SSP2120
LMO: Imo0012
LMF: LMOf2365_0013
LIN: lin0012
LWE: lwe0013
LLA: L10014(yebA)
LLC: LACR.0456
LLM: llmg_0427
SPY: SPy_0878(mvaK2)
SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2) '30 SPM: spyM18_0939
SPG: SpyM3_0597(mvaK2)
SPS: SPs1256
277/291
SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SPI: MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2)
SPK: MGAS9429_Spy0739(mvaK2)
SPF: SpyM51124(mvaK2)
SPA: M6_Spy0701
SPB: M28_Spy0664(mvaK2)
SPN: SP 0383
SPR: spr0340(mvaK2)
SPD: SPD_0348(mvaK2)
SAG: SAG 1324
SAN: gbs1394
SAK: SAK_1355
SMU: SMU.938
STC: strO561(mvaK2)
STL: stuO561(mvaK2)
STE: STER 0600
SSA: SSA_0335(mvaK2)
SSU: SSU05_0291
SSV: SSU98 0287
SGO: SGO 0241
LPL: lp_1733(mvaK2)
LJO: LJ1207
LAC: LBA1169
LSA: LSA0906(mvaK2)
LSL: LSL 0683
LDB: LdbO997(mvaK)
LBU: LBUL_0904
LBR: LVIS 0860 '30 LCA: LSEI_1092
LGA: LGAS1035
LRE: Lreu 0913
278/291
PPE: PEPE-0925
EFA: EF0902
NFA: nfa22090
BGA: BG0710
BAF: BAPKO-0731
NPH: NP2852A
SSO: SSO2988
STO: ST0978
SAI: Saci_1244
Ácidos nucleicos e polipeptideos exemplares de difosfomevalonato descarboxilase
HSA: 4597(MVD)
PTR: 468069(MVD)
MCC: 696865(MVD)
MMU: 192156(Mvd)
RNO: 81726(Mvd)
CFA: 489663(MVD)
GGA: 425359(MVD)
DME: Dmel_CG8239
SCE: YNR043W(MVD1)
AGO: AGOS AGL232C
PIC: PICST—90752
CGR: CAGL0C03630g
SPO: SPAC24C9.03
MGR: MGG_09750
ANI: AN4414.2
AFM: AFUA 4G07130
AOR: A0090023000862
ONE: CNL04950 ‘30 UMA: UM05179.1
DDI: DDBDRAFT—0218058
TET: TTHERM—00849200
279/291
TBR: Tb10.05.0010 Tb10.61.2745
TOR: 507993.330 511281.40
LMA: LmjF18.0020
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN: lpg2040
LPF: lpl2018
LPP: lpp2023
TCX: Tcr_1734
DNO: DNO_0504(mvaD)
BBA: Bd1629
MXA: MXAN_5018(mvaD)
OIH: OB0226
SAU: SA0548(mvaD)
SAV: SAV0591(mvaD)
SAM: MW0546(mvaD)
SAR: SAR0597(mvaD)
SAS: SAS0550
SAC: SACOL0637(mvaD)
SAB: SAB0541(mvaD)
SAA: SAUSA300_0573(mvaD)
SAG: SAOUHSC_00578
SAJ: SaurJH9_0614
SAH: SaurJH1_0629
SEP: SE0362
SER: SERP0239(mvaD)
SHA: SH2401(mvaD)
SSP: SSP2121
LMO: Imo0011 '30 LMF: LMOf2365_0012(mvaD)
LIN: lin0011
LWE: lwe0012(mvaD)
280/291
LLA: L9089(yeaH)
LLC: LACR_0455
LLM: Hmg_0426(mvaD)
SPY: SPy_0877(mvaD)
SPZ: M5005_Spy_0683(mvaD)
SPM: spyM18_0938(mvd)
SPG: SpyM3_0596(mvaD)
SPS: SPs1257
SPH: MGAS10270_Spy0741(mvaD)
SPI: MGAS10750_Spy0775(mvaD)
SPJ: MGAS2096_Spy0754(mvaD)
SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD)
SPF: SpyM51125(mvaD)
SPA: M6_Spy0700
SPB: M28_SpyO663(mvaD)
SPN: SP_0382
SPR: spr0339(mvd1)
SPD: SPD_0347(mvaD)
SAG: SAG1325(mvaD)
SAN: gbs1395
SAK: SAK_1356(mvaD)
SMU: SMU.937
STC: str0560(mvaD)
STL: stu0560(mvaD)
STE: STER_0599
SSA: SSA_0334(mvaD)
SSU: SSU05_0290
SSV: SSU98_0286
SGO: SGO_0240(mvaD) '30 LPL: lp_1734(mvaD)
LJO: LJ1206
LAC: LBA1168(mvaD)
281/291
LSA: LSA0907(mvaD)
LSL: LSL_0684
LDB: LdbO998(mvaD)
LBU: LBUL 0905
LBR: LVIS 0859
LCA: LSEM492
LGA: LGAS1034
LRE: Lreu_0914
PPE: PEPE 0926
EFA: EF0903(mvaD)
LME: LEUMJ386
NFA: nfa22080
BBU: BB0686
BGA: BG0709
BAF: BAPKO_0730
GFO: GFO 3632
FPS: FP0310(mvaD)
HAU: Haur_1612
HAL: VNG0593G(dmd)
HMA: rrnAC1489(dmd)
HWA: HQ1525A(mvaD)
NPH: NP1580A(mvaD)
PTO: ΡΤΘ0478 PTO1356
SSO: SSO2989
STO: ST0977
SAI: Saci_1245(mvd)
MSE: Msed_1576
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de isopentenil fosfato guinases (IPK1
Methanobacterium thermoautotrophicum gi|2621082
Meth anococcus jannaschii DSM 2661 gi| 1590842 ;
Methanocaldococcus jannaschii gi11590842
282/291
Methanothermobacter thermautotrophicus gi|2621082
Picrophilus torridus DSM9790 (IG-57) gi|48477569
Pyrococcus abyssi gi| 14520758
Pyrococcus horikoshii OT3 gi|3258052
Archaeoglobus fulgidus DSM4304 gi|2648231
Ácidos nuclèicos e polipeptideos exemplares de isopentenil-difosfato Deltaisomerase (IDI)
HSA: 3422(IDI1) 91734(1DI2)
PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1)
MCC: 710052(LGC710052) 721730(LOC721730)
MMU: 319554(ldi1)
RNO: 89784(ldi1)
GGA: 420459(1 D11)
XLA: 494671 (LOC494671)
XTR: 496783(idi2)
SPU: 586184(LOC586184)
CEL: K06H7.9(idi-1)
ATH: AT3G02780(IPP2)
OSA: 4338791 4343523
CME: CMB062C
SCE: YPL117C(IDI1)
AGO: AGOS_ADL268C
PIC: PICST_68990(IDI1)
CGR: CAGL0J06952g
SPO: SPBC106.15(idi1)
ANI: AN0579.2
AFM: AFUA 6G11160
AOR: A0090023000500
CNE: CNA02550 '30 UMA: UM04838.1
ECU: ECU02_0230
DDL DDB_0191342(ipi)
283/291
TET: TTHERM_00237280 TTHERM_00438860
TBR: Tb09.211.0700
TCR: 408799.19 510431.10
LMA: LmjF35.5330
EHI: 46100025
ECO: b2889(idi)
EC J: JW2857(idi)
ECE: Z4227
ECS: ECs3761
ECC: c3467
ECI: UTI89 C3274
ECP: ECP_2882
ECV: APECO1 3638
ECW: EcE24377A_3215(idi)
ECX: EcHS_A3048
STY: STY3195
STT: t2957
SPT: SPA2907(idi)
SEC: SC2979(idi)
STM: STM3039(idi)
SFL: SF2875(idi)
SFX: S3074
SFV: SFV_2937
SSN: SSON 3042 SSON_3489(yhfK)
SBO: SBO 3103
SDY: SDY 3193
ECA: ECA2789
PLU: plu3987
ENT: Ent638_3307
SPE: Spro_2201
VPA: VPA0278
VFI: VF0403
284/291
PPR: PBPRA0469(mvaD)
PEN:PSEEN4850
CBU: CBU_0607(mvaD)
CBD: COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN: lpg2051
LPF: lpl2029
LPP: lpp2034
TCX: Tcr_1718
HHA: Hhal_1623
DNO: DNO 0798
EBA: ebA5678 p2A143
DVU: DVU1679(idi)
DDE: Dde_1991
LIP: LI1134
BBA: Bd1626
AFW: Anae109_4082
MXA: MXAN_5021(fni)
RPR: RP452
RTY: RT0439(idi)
RCO: RC0744
RFE: RF_0785(fni)
RBE: RBE_0731(fni)
RAK: A1C 04190
RBO: A1l_04755
RCM: A1E_02555
RRI: A1G_04195
MLO: mlr6371
RET: RHE_PD00245(ypd00046)
XAU: Xaut_4134 '30 SILSPO0131
SIT: TM1040_3442
RSP: RSP 0276
285/291
RSH: Rsph17029_1919
RSQ: Rsph17025_1019
JAN: Jann_0168
RDE: RD1_0147(idi)
DSH: Dshi_3527
BSU: BG11440(ypgA)
BAN: BA1520
BAR: GBAA1520
BAA: BA2041
BAT: BAS 1409
BCE: BC1499
BCA: BCE1626
BCZ: BCZK1380(fni)
BCY: Bcer98_1222
BTK: BT9727_1381(fni)
BTL: BALH1354
BLI: BL02217(fni)
BLD: BLÍ02426
BAY: RBAM_021020(fni)
BPU: BPUM_2020(fni)
OIH: OB0537
SAU: SA2136(fni)
SAV: SAV2346(fni)
SAM: MW2267(fni)
SAR: SAR2431(fni)
SAS: SAS2237
SAC: SACOL2341(fni)
SAB: SAB2225c(fni)
SAA: SAUSA300_2292(fni) ‘ 30 SAG: SAOUHSC 02623
SEP: SE1925
SER: SERP1937(fni-2)
286/291
SHA: SH0712(fni)
SSP: SSP0556
LMO: Imo1383
LMF: LMOf2365_1402(fni)
LIN: lin1420
LWE: Iwe1399(fni)
LLA: L11083(yebB)
LLC: LACR_0457
LLM: llmg_0428(fni)
SPY: SPy_0879
SPZ: M5005_Spy_0685
SPM: spyM18_0940
SPG: SpyM3_0598
SPS: SPs1255
SPH: MGAS10270_Spy0743
SPI: MGAS10750_Spy0777
SPJ: MGAS2096_Spy0756
SPK: MGAS9429_Spy0740
SPF: SpyM51123(fni)
SPA: M6_Spy0702
SPB: M28_SpyO665
SPN: SP 0384
SPR: spr0341(fni)
SPD: SPD_0349(fni)
SAG: SAG1323
SAN: gbs1393
SAK: SAK_1354(fni)
SMU: SMU.939
STC: str0562(idi) ' 30 STL: stu0562(idi)
STE: STER 0601
SSA: SSA 0336
287/291
SGO: SGO_0242
LPL: Ip_1732(idi1)
LJO: LJ1208
LAC: LBA1171
LSA: LSA0905(idi)
LSL: LSL 0682
LDB: Ldb0996(fni)
LBU: LBUL_0903
LBR: LVIS 0861
LCA: LSEI1493
LGA: LGAS1036
LRE: Lreu_0912
EFA: EF0901
OOE: OEOE1103
STH: STH 1674
CBE: Cbei_3081
DRM: Dred_0474
SWO: Swol_1341
MTA: Moth_1328
MTU: Rv1745c(idi)
MTC: MT1787(idi)
MBO: Mb1774c(idi)
MBB: BCG_1784c(idi)
MPA: MAP3079C
MAV: MAV_3894(fni)
MSM: MSMEG_1057(fni) MSMEG_2337(fni)
MUL: MUL_0380(idi2)
MVA: Mvan_1582 Mvan_2176
MGI: Mflv_1842 Mflv_4187 '30 MMC: Mmcs_1954
MKM: Mkms_2000
MJL: Mjls_1934
288/291
CGL: NCgl2223(cgl2305)
CGB: cg2531(idi)
CEF: CE2207
CDI: DIP1730(idi)
NFA: nfa19790 nfa22100
RHA: RHA1_ro00239
SCO: SCO6750(SC5F2A.33c)
SMA: SAV1663(idi)
LXX: Lxx23810(idi)
CMI: CMM_2889(idiA)
AAU: AAur_0321(idi)
PAC: PPA2115
FRA: Francci3_4188
FRE: Franean1_5570
FAL: FRAAL6504(idi)
KRA: Krad_3991
SEN: SACE_2627(idiB_2) SACE_5210(idi)
STP: Strop_4438
SAQ: Sare_4564 Sare_4928
RXY: Rxyl_0400
BBU: BB0684
BGA: BG0707
SYN: SII1556
SYC: syc2161_c
SYF: Synpcc7942_1933
CYA: CYA—2395(fni)
CYB: CYB_2691(fni)
TEL: tll1403
ANA: all4591 ' 30 AVA: Ava_2461 Ava_B0346
TER: Tery_1589
SRU: SRU_1900(idi)
289/291
CHU: CHU_0674(idi)
GFO: GFO_2363(idi)
FJO: Fjoh_0269
FPS: FP1792(idi)
CTE: CT0257
CCH: Cag_1445
CPH: Cpha266_0385
PVI: Cvib_1545
PLT: Plut_1764
RRS: RoseRS_2437
RCA: Rcas_2215
HAU: Haur_4687
DRA: DR_1087
DGE: Dgeo_1381
TTH:TT_P0067
TTJ: TTHB110
MJA: MJ0862
MMP: MMP0043
MMQ: MmarC5_1637
MMX: MmarC6_0906
MMZ: MmarC7_1040
MAE: Maeo_1184
MVN: Mevan_1058
MAC: MA0604(idi)
MBA: Mbar_A1419
MMA: MM1764
MBU: Mbur_2397
MTP: Mthe_0474
MHU: Mhun_2888 ' 30 MLA: Mlab_1665
MEM: Memar_1814
MBN: Mboo_2211
290/291
MTH: MTH48
MST: Msp_0856(fni)
MSI: Msm_1441
MKA: MK0776(lldD)
AFU: AF2287
HAL: VNG1818G(idi) VNG6081G(crt_1) VNG6445G(crt_2) VNG7060
VNG7149
HMA: rrnAC3484(idi)
HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB)
NPH: NP0360A(idiB_1) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2)
TAC: Ta0102
TVO: TVN0179
PTO: PTO0496
PHO: PH1202
PAB: PAB1662
PFU: PF0856
TKO: TK1470
RCI: LRC397(fni)
APE: APE 1765.1
SMR: Smar_0822
IHO: lgni_0804
HBU: Hbut_0539
SSO: SS00063
STO: ST2059
SAI: Saci_0091
MSE: Msed_2136
PAI: PAE0801
PIS: Pisl 1093
PCL: Pcal_0017
- 30 PAS: Pars_0051
TPE: Tpen_0272
291/291
Ácidos nucleicos e polipeptídeos exemplares de isopreno sintase
Nos. de Acesso do Genbank
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (5)

1. Método para produzir isopreno, o método compreendendo (a) cultivar células compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo de isopreno sintase sob condições adequadas para a produção de isopreno; e (b) produzir isopreno, em que as células produzem mais que cerca de 400 nmol gwcm/hora de isopreno e em que a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10'18 mmol/L/hora.
2/4 * 30
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, em que as células são selecionadas do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor, Streptomyces gríseus, Escherichia coli, Pantoea citrea, Trichoderma reesei, Aspergillus oryzae e Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae e Yarrowia.
10. Método para produzir isopreno, o método compreendendo:
(a) cultivar células compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam polipeptideo de isopreno sintase sob condições adequadas para a produção de isopreno; e (b) produzir isopreno, em que a concentração de fase líquida de isopreno é inferior a cerca de 1 g/L e as células produzem mais que cerca de 400 nmol gwcm/hora de isopreno.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, que compreende adicionalmete recuperar o isopreno.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que as células compreendem um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptideo de isopreno sintase.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que as células compreendem ainda um ou mais ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucléico endógeno codificando um polipeptideo IDI, uma enzima da via do MVA e uma enzima da via da DXP.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, em que a enzima da via do MVA é mevalonato quinase.
15. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o polipeptideo de isopreno sintase é um polipeptídio de Pueraria ou Populus ou de um híbrido, Populus alba x Populus tremula.
16. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que as células são células bacterianas gram-positivas, células de Streptomyces, células bacterianas gram-negativas, células de Escherichia, células de Pantoea, células fúngicas, células de fungo filamentoso, células de Trichoderma, células de Aspergillus, ou células de levedura.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, que compreende adicionalmete recuperar o isopreno.
3/4
17. Método para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L, o método compreendendo:
a) cultivar células compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo de isopreno sintase sob condições adequadas para a produção do composto, em que é adicionado gás em uma taxa de pulverização gasosa entre cerca de 0,01 vvm e cerca de 2 wm; e
b) produzir o composto.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, que compreende adicionalmete recuperar o composto.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o composto produzido é etileno.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o composto produzido é isopreno.
21. Células em cultura compreendendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de isopreno sintase, em que as células produzem mais que cerca de 400 nmol gWCm/hora de isopreno e a taxa de evolução de dióxido de carbono das células é maior que cerca de 1 x 10’18 mmol/L/hora.
22. Sistema compreendendo uma câmara de reação com células como definidas na reivindicação 21.
23. Método para produzir um composto, em que o composto tem uma ou mais características selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L, o método compreendendo:
a) cultivar células compreendendo um ou mais ácidos nucleicos que codificam polipeptídeo de isopreno sintase sob condições adequadas para a produção do composto, em que. o composto tem uma ou mais carac• 30 terísticas selecionadas do grupo que consiste em (a) um coeficiente da lei de Henry inferior a cerca de 250M/atm e (b) uma solubilidade em água de menos de cerca de 100 g/L;
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as células compreendem ainda um ou mais, ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídeo de isopreno sintase.
4/4
b) produzir o composto;
c) e recuperar o composto da fase gasosa.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o composto produzido é etileno.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as células compreendem ainda um ou mais, ácidos nucleicos heterólogos ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico endógeno codificando um polipeptídeo IDI, uma enzima da via do MVA e uma enzima da via da DXP.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que a enzima da via do MVA é mevalonato quinase.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo de isopreno sintase é um polipeptídio de Pueraria ou Populus ou de um híbrido, Populus alba x Populus tremula.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o polipeptídeo de isopreno sintase é selecionado do grupo que consiste em Pueraria montana ou Pueraria lobata, Populus tremuloides, Populus alba, Populus nigra, e Populus trichocarpa.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as células são células bacterianas gram-positivas, células de Streptomyces, células bacterianas gram-negativas, células de Escherichia, células de Pantoea, células fúngicas, células de fungo filamentoso, células de Trichoderma, células de Aspergillus, ou células de levedura.
5 25. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o composto é isopreno.
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