BRPI0918483A2 - organismo microbiano que não ocorre naturalmente, e, método para produzir um composto - Google Patents

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Anthony P. Burgard
Robin E. Osterhout
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Abstract

ORGANISMO MICROBIANO QUE NÃO OCORRE NATURALMENTE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO A invenção fornece organismos microbianos que não ocorrem naturalmente que. compreendem uma via de l,4-butanodiol (BDO) que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima da via de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO. A invenção adicionalmente fornece métodos de usar tais organismos microbianos para produzir BDO.

Description

“ORGANISMO MICROBIANO QUE NÃO OCORRE NATURALMENTE, E, MÉTODO PARA PRODUZIR BDO”
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E Este pedido reivindica o benefício de prioridade do pedido S — provisório U.S. serial Nº 61/191.710, depositado em 10 de setembro de 2008, e pedido provisório U.S. serial Nº 61/192.511, depositado em 17 de setembro de 2008, cada uma das quais os conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência.
Esta invenção diz respeito no geral ao planejamento em ambiente virtual de organismos e, mais particularmente aos organismos tendo capacidade de biossíntese de 1,4-butanodiol.
O composto ácido 4-hidroxibutanóico (4-hidroxibutanoato, 4- hidroxibutirato, 4HB) é um ácido carboxílico de 4 carbonos que tem potencial industrial como um bloco de construção para vários produtos químicos de 15º commodity e specialty. Em particular, 4-HB tem o potencial para servir como um novo ponto de entrada na família do 1,4-butanodiol de produtos químicos, que inclui solventes, resinas, precursores de polímero, e produtos químicos specialty. O 1,4-butanodiol (BDO) é um intermediário polimérico e solvente industrial com um mercado global de cerca de 3 bilhões de 0,45kg/ano. BDO é correntemente produzido a partir de precursores petroquímicos, : primariamente acetileno, anidrido maleico, e óxido de propileno.
Por exemplo, acetileno é reagido com 2 moléculas de formaldeído na reação de síntese de Reppe (Kroschwitz e Grant, É Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque .25 — (1999)), seguido pela hidrogenação catalítica para formar 1,4-butanodiol. Foi estimado que 90% do acetileno produzido nos U.S. é consumido para a produção de butanodiol. Alternativamente, o mesmo pode ser formado pela esterificação e hidrogenação catalítica de anidrido maleico, que é derivado de butano. A jusante, o butanodiol pode ser ainda transformado; por exemplo,
TE 2 , pela oxidação para y-butirolactona, que pode ser convertida ainda à pirrolidona e N-metilpirrolidona, ou hidrogenólise ao tetraidrofurano. Estes compostos têm usos variados como intermediários poliméricos, solventes, e aditivos, e têm um mercado combinado de quase 2 bilhões 0,45kg/ano. fi É desejável desenvolver um método para a produção destes ê . produtos químicos por meios alternativos que não apenas substituam estoques de alimentação renováveis no lugar dos com base em petróleo, e também usem processes menos intensivos em energia e capital. O Departamento, de Energia tem proposto 1,4-diácidos, e particularmente ácido succínico, como intermediários chave biologicamente produzidos para a fabricação da família do butanodiol de produtos (DOE Report, “Top Value-Added Chemicals from Biomass”, 2004). Entretanto, o ácido succínico é caro para isolar e purificar e , requer altas temperaturas e pressões para a redução catalítica para butanodiol. Assim, existe uma necessidade quanto a meios alternativos para produzir eficazmente quantidades comerciais de 1,4-butanodiol e seus precursores químicos. A presente invenção satisfaz esta necessidade e fornece também vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece organismos microbianos que não ocorrem — naturalmente contendo um caminho do 1,4-butanodiol (BDO) que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO. A invenção adicionalmente fornece métodos de usar tais organismos microbianos para produzir BDO.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama esquemático que mostra caminhos bioquímicos para 4-hidroxibutiurato (4-HB) e à produção de 1,4-butanodiol. As primeiras 5 etapas são endógenas para E. coli, enquanto as remanescentes podem ser expressadas heterologamente. As Enzimas que catalisam as
- Í : 3 reações biossintéticas são: (1) succinil-CoA sintetase; (2) semialdeído desidrogenase —succínica independente de -CoA; (3) a-cetoglutarato desidrogenase; (4) glutamato:succinato semialdeído transaminase; (5) glutamato — descarboxilase; (6) semialdeído desidrogenase succeínica — dependente de -CoA; (7) 4-hidroxibutanoato desidrogenase; (8)-o- cetoglutarato descarboxilase; (9) 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase; (10) butirato cinase; (11) fosfotransbutirilase; (12) aldeído desidrogenase; (13) álcool desidrogenase. A Figura 2 é um diagrama esquemático que mostra a — biossíntese de homosserina na E. coli. S A Figura 3 mostra a produção de 4-HB em meio mínimo de glicose usando cepas E. coli que abrigam plasmídeos que expressam várias ç combinações de genes do caminho do 4-HB. (a) concentração de 4-HB em caldo de cultura; (b) concentração de succinato em caldo de cultura; (c) OD da cultura, medida a 600 nm. Os grupos de barras representam os pontos de tempo de 24 horas, 48 horas, e 72 horas (se medidos). Os códigos junto com o eixo x indicam a combinação de cepa/plasmídeo usada. o primeiro índice refere-se à cepa hospedeira: 1, MG1655 lacIº; 2, MG1655 AgabD laclº; 3, MG1655 AgabD AaldA lacIº. O Segundo índice refere-se à combinação de —plasmídeo usada: 1, pZEl3-0004-0035 e pzZA33-0036; 2, pZE130004-0035 e pZA33-0010n; 3, pZE13-0004-0008 e pZA33-0036; 4, pZE13-0004-0008 e pZA33-0010n; 5, Vetores de controle pZE13 e pzA33. A Figura 4 mostra a produção de 4-HB a partir de glicose em cepas de E. coli que expressam a-cetoglutarato descarboxilase de Mycobacterium tuberculosis. As cepas 1 a 3 contêm pZE13-0032 e pZA33-
0036. A cepa 4 expressa apenas os vetores vazios pZE13 e pZA33. As cepas hospedeiras são como segue: 1 e 4, MG1655 lacIQ; 2, MG1655 AgabD lacIQ; 3, MG1655 AgabD AaldA lacIQ. As barras referem-se à concentração em 24 e 48 horas.
E 4 A Figura 5 mostra a produção de BDO a partir de 10mM de 4- HB em cepas E. coli recombinantes. As posições numeradas correspondem aos experimentos com MG1655 lacIQ contendo pZA33-0024, que expressa cat2 de P. gingivalis, e os seguintes genes expressados em pZE13: 1, nenhum — (controle); 2, 0002; 3, 0003; 4, 0003n; 5, 0011; 6, 0013; 7, 0023; 8, 0025; 9, 0008n; 10, 0035. Os números de gene são definido na Tabela 6. Para cada posição, as barras referem-se às condições aeróbicas, microaeróbicas, e anaeróbicas, respectivamente. As condições microaeróbicas foram criadas selando-se os tubos de cultura mas não evacuando os mesmos.
A Figura 6 mostra o espectro de massa de 4-HB e BDO produzido por MG1655 lacIQ pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036 cultivado em meio mínimo M9 suplementado com 4 g/L de glicose não rotulada (a, c, e, e g), PC-glicose uniformemente rotulada (b, d, £, e h). (a) e (b), massa 116 fragmentos característicos de BDO derivado, contendo 2 átomos de carbono; (c) e (d), massa 177 fragmentos característicos de BDO derivado, contendo | átomo de carbono; (e) e (f), massa 117 fragmentos característicos de 4-HB derivado, contendo 2 átomos de carbono; (g) e (b), massa 233 fragmentos característicos de 4-HB derivado, contendo 4 átomos de carbono.
A Figura 7 é um diagrama de fluxo de processo esquemático de bioprocessos para a produção de 7-butirolactona. O Painel (a) ilustra a fermentação de lote alimentado com separação de lote e o painel (b) ilustra a fermentação de lote alimentado com separação contínua.
As Figuras 8A e 8B mostram os caminhos do 1,4-butanodiol —(BDO) exemplares. A Figura 8A mostra os caminhos de BDO de succinil- CoA. A Figura 8B mostra os caminhos de BDO de alfacetoglutarato.
As Figuras 9A a 9€ mostram caminhos de BDO exemplares. A Figura 9A e 9B mostram caminhos de 4-aminobutirato. A Figura 9C mostra um caminho da acetoactil-CoA para 4-aminobutirato.
* ! 5 A Figura 10 mostra caminhos de BDO exemplares de alfa- cetoglutarato.
A Figura 11 mostra caminhos de BDO exemplares de glutamato.
A Figura 12 mostra caminhos de BDO exemplares de - acetoacetil-CoA.
A Figura 13 mostra caminhos de BDO exemplares de homosserina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção está direcionada ao planejamento e h produção de células e organismos tendo capacidades de produção biossintética para o ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB), y-butirolactona e 1,4- Y butanodiol (BDO). A invenção, em particular, diz respeito ao planejamento de organismos microbianos capazes de produzir BDO pela introdução de um ou —maisácidosnucleicos que codificam uma enzima do caminho de BDO.
Em uma forma de realização, a invenção utiliza modelos estequiométricos em ambiente virtual do metabolismo de Escherichia coli que identifica planejamentos metabólicos para a produção biossintética do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO). Os resultados aqui descritos indicam que caminhos metabólicos podem ser planejados e recombinantemente engendrados para se obter a biossíntese de 4HB e os produtos a jusante tais como 1,4-butanodiol em Escherichia coli e outras células ou organismos. A produção biossintética de 4-HB, por exemplo, para os planejamentos em ambiente virtual pode ser confirmada pela construção de — cepas tendo o genótipo metabólico planejado. Estas células ou organismos metabolicamente engendrados também podem ser submetidos à evolução adaptiva para aumentar ainda mais a biossíntese de 4-HB, incluindo sob condições que se aproximam do crescimento máximo teórico.
Em certas formas de realização, as características da
O 6 biossíntese de 4-HB das cepas planejadas as tornam geneticamente estáveis e particularmente úteis em bioprocessos contínuos. Estratégias de planejamento de cepas separadas foram identificadas com a incorporação de capacidades de reação não nativas ou heterólogas diferentes na E. coli ou outros organismos — hospedeiros que levam a produzir caminhos metabólicos de 4-HB e 1;,4- butanodiol a partir da semialdeído desidrogenase succínica independente de - CoA, succinilCoA sintetase e semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, ou glutamato:succínico semialdeído transaminase. Em ambiente virtual planejamentos metabólicos foram identificados que resultaram na biossíntese de 4-HB tanto na E. coli quanto em espécies de levedura de cada um destes caminhos metabólicos. O intermediário de 1,4- butanodiol, a y-butirolactona, pode ser gerado em cultura pela ciclização É expontânea sob condições no pH < 7,5, particularmente sob condições ácidas, tais como abaixo do pH 5,5, por exemplo, pH < 7, pH < 6,5, pH <6, e particularmente no pH < 5,5 ou mais baixo.
As cepas identificadas via o componente computacional da plataforma podem ser colocadas na produção real engendrando-se geneticamente qualquer uma das alterações metabólicas prognosticadas que levam à produção biossintética de 4-HB, 1,4-butanodiol ou outro intermediário e/ou os produtos a jusante. Já em uma outra forma de realização, as cepas que exibem a produção biossintética destes compostos podem ser submetidas ainda à evolução adaptativa para aumentar ainda mais a biossíntese de produto. Os níveis de produção da biossíntese de produto que seguem a evolução adaptativa também podem ser prognosticado pelo — componente computacional do sistema.
Em outras formas de realização específicas, organismos microbianos foram construídos para expressar um caminho biossintético de 4- HB que codifica as etapas enzimáticas de succinato para 4-HB e para 4-HB- CoA. A co-expressão da succinato coenzima A transferase, semialdeído
7 ' 7 desidrogenase succínica dependente de -CoA, 4-hidroxibutirato desidrogenase dependente de NAD e 4-hidroxibutirato coenzima A transferase em um organismo microbiano hospedeiro resultou na produção significante de 4-HB comparado aos organismos microbianos hospedeiros que carecem de um — caminho biossintético de 4-HB.
Em uma outra forma de realização específica, organismos microbianos que produzem 4-HB foram gerados que utilizaram a- cetoglutarato como um substrato pela introdução de ácidos nucleicos que codificam a-cetoglutarato descarboxilase e 4-hidroxibutirato desidrogenase dependente de NAD.
Em uma outra forma de realização específica, organismos : microbianos contendo um caminho biossintético de 1,4-butanodiol (BDO) foram construídos que biossintetizaram BDO quando cultivados na presença de 4-HB.
O caminho biossintético de BDO consistiu de um ácido nucleico que codifica uma aldeído/álcool desidrogenase multifuncional ou ácidos nucleicos que codifiam uma aldeído desidrogenase e uma álcool desidrogenase.
Para sustentar o crescimento nos substratos de 4-HB, estes organismos microbianos que produzem BDO também expressaram 4- hidroxibutirato-CoA transferase ou 4-butirato cinase em conjunção com a fosfotransidroxibutirilase. já em uma outra forma de realização específica, organismos microbianos foram gerados que sintetizaram BDO através da expressão exógena de ácidos nucleicos que codificam um caminho biossintético funcional de 4-HB e um caminho biossintético funcional de BDO.
O caminho biossintético de 4-HB consistiu da succinato coenzima À transferase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, 4- —hidroxibutirato desidrogenase dependente de NAD e 4-hidroxibutirato coenzima A transferase.
O caminho de BDO consistiu de uma aldeído/álcool desidrogenase multifuncional.
São ainda aqui descritos caminhos adicionais para a produção de BDO (ver as Figuras 8 a 13). Como aqui usado, o termo “que não ocorrem naturalmente”
Y é 8 quando usado em referência a um organismo ou microorganismo microbianos da invenção é intencionado a significar que o organismo microbiano tem pelo menos uma alteração genética não normalmente encontrada em uma cepa que ocorra naturalmente da espécie dada como referência, incluindo cepas do tipo — selvagem da espécie dada como referência. As alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações que introduzem ácidos nucleicos expressáveis que codificam polipeptídeos metabólicos, outras adições de ácido nucleico, deleções de ácido nucleico e/ou outros rompimentos funcionais do material genético microbiano. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões —codificadoras e fragmentos funcionais destes, para polipeptídeos heterólogos, ã homólogos ou tanto heterólogos quanto homólogos para a espécie dada como referência. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões Y reguladoras não codificadoras em que as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Os polipeptídeos metabólicos exemplares incluem enzimas ou proteínas dentro de um caminho biossintético para uma família BDO de compostos.
Uma modificação metabólica refere-se a uma reação bioquímica que é alterada do seu estado que ocorre naturalmente. Portanto, os microorganismos que não ocorrem naturalmente podem ter modificações genéticas para os ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos metabólicos ou, fragmentos funcionais destes. As modificações metabólicas exemplares são aqui divulgadas.
Como aqui usado, o termo “isolado” quando usado em referência a um organismo microbiano é intencionado a significar um — organismo que é substancialmente livre de pelo menos um componente como o organismo microbiano dado como referência é encontrado na natureza. O termo inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou todos os componentes como o mesmo é encontrado no seu ambiente natural. O termo também inclui um organismo microbiano que é removido de alguns ou todos
2 t 9 os componentes como o organismo microbiano é encontrado em ambientes que não ocorrem naturalmente.
Portanto, um organismo microbiano isolado é parcial ou completamente separado de outras substâncias como o mesmo é encontrado na natureza ou como o mesmo é cultivado, armazenado ou —subsistido em ambientes que não ocorrem naturalmente.
Os exemplos específicos de organismos microbianos isolados incluem micróbios parcialmente puros, micróbios substancialmente puros e micróbios cultivados em um meio que não é de ocorrência natural.
Como aqui usado, os termos “microbiano,” “organismo microbiano” ou “microorganismo” são intencionados a significar qualquer : organismo que exista como uma célula microscópica que é incluída dentro dos domínios de archaea, bacteria ou eukarya.
Portanto, o termo é É intencionado a abranger células procarióticas ou eucarióticas ou organismos tendo um tamanho microscópico e incluem bactérias, archaea e eubactérias de todas as espécies assim como microorganismos eucarióticos tais como levedura e fungos.
O termo também inclui culturas de célula de qualquer espécie que possa ser cultivada para a produção de um produto bioquímico.
Como aqui usado, o termo “ácido 4-hidroxibutanóico” é intencionado a significar um derivado de 4-hidróxi do ácido butírico tendo a fórmula química CJHgO; e uma massa molecular de 104,11 g/mol (126,09 g/mol para o seu sal de sódio). O composto químico ácido 4-hidroxibutanóico também é conhecido na técnica como 4-HB, 4-hidroxibutirato, ácido gama- hidroxibutírico ou GHB.
O termo como é aqui usado é intencionado a incluir qualquer uma das várias formas alinas do composto e incluem, por exemplo, —4-hidroxibutanoato e 4-hidroxibutirato.
Os exemplos específicos de formas salinas para o 4-HB incluem 4-HB de sódio e 4-HB de potássio.
Portanto, os termos — ácido — 4-hidroxibutanóico, 4-HB, —4-hidroxibutirato, —4- hidroxibutanoato, ácido gama-hidroxibutírico e GHB assim como outros nomes reconhecidos na técnica são aqui usados como sinônimos.
dd : 10 Como aqui usado, o termo “monomérico” quando usado em referência a 4-HB é intencionado a significar 4-HB em uma forma não polimérica ou não derivada. Os exemplos específicos de 4-HB polimérico incluem ácido poli-4-hidroxibutanóico e copolímeros, por exemplo, de 4-HB e3-HB. Um exemplo específico de uma forma derivada de 4-HB é 4-HB- CoA. Outras formas de 4-HB poliméricas e outras formas derivadas de 4-HB também são conhecidas na técnica.
Como aqui usado, o termo “y-butirolactona” é intencionado a significar uma lactona tendo a fórmula química C4H;O, e uma massa molecular de 86,089 g/mol. O composto químico y-butirolactona também é Sã conhecido na técnica como GBL, butirolactona, 1,4-lactona, 4-butirolactona, ácido 4-hidroxibutírico lactona, e ácido gama-hidróxi-butírico lactona. O " termo como é aqui usado é intencionado a incluir qualquer uma das várias formas salinas do composto.
Como aqui usado, o termo “1,4-butanodiol” é intencionado a significar um derivado de álcool do alcano butano, que carrega dois grupos hidroxila que têm a fórmula química C4H0O, e uma massa molecular de 90,12 g/mol. O composto químico 1,4-butanodiol também é conhecido na técnica como BDO e é um intermediário ou precursor químico para uma —famíliade compostos aqui aludidos como família BDO de compostos.
Como aqui usado, o termo “tetraidrofurano” é intencionado a significar um composto orgânico heterocíclico que corresponde ao análogo totalmente hidrogenado do composto aromático furano que tem a fórmula química C4H;gO e uma massa molecular de 72,11 g/mol. O composto químico — tetraidrofurano também é conhecido na técnica como THF, tetraidrofurano, 1,4-epoxibutano, óxido de butileno, óxido de ciclotetrametileno, oxaciclopentano, óxido de dietileno, oxolano, furanidina, hidrofurano, óxido de tetra-metileno. O termo como é aqui usado é intencionado a incluir qualquer uma das várias formas salinas do composto.
Como aqui usado, o termo “CoA” ou “coenzima A” é intencionado a significar um cofator orgânico ou grupo protético (porção não protéica de uma enzima) cuja presença é requerida para a atividade de muitas enzimas (a apoenzima) para formar um sistema de enzima ativa. As funções —decoenzimaA em certas enzimas de condensação, atuam na transferência de : acetila ou outro grupo acila e na síntese e oxidação de ácido graxo, oxidação de piruvato e em outra acetilação.
Como aqui usado, o termo “substancialmente anaeróbico” quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento é intencionado a significar que a quantidade de oxigênio é menor do que cerca de 10% da saturação para o oxigênio dissolvido em meio líquido. O termo também é intencionado a incluir câmaras seladas de meio líquido ou sólido * mantido com uma atmosfera de menos do que cerca de 1% de oxigênio.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem conter alterações genéticas estáveis, que se referem a microorganismos que podem ser cultivados por mais do que cinco gerações sem perda da alteração. No geral, as alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem por mais do que 10 gerações, particularmente as modificações estáveis persistirão por mais do que cerca de 25 gerações, e mais particularmente, as modificações genéticas estáveis serão por mais do que 50 gerações, incluindo indefinidamente.
Aqueles habilitados na técnica entenderão que as alterações genéticas, incluindo as modificações metabólicas aqui exemplificadas são descritas com referência a um hospedeiro ou organismo fonte adequados tais como£. coli, levedura, ou outros organismos aqui divulgados e suas reações metabólicas correspondentes ou um organismo fonte adequado para o material genético desejado tais como genes que codificam enzimas para as suas reações metabólicas correspondentes. Entretanto, dado o sequenciamento de genoma completo de uma ampla variedade de organismos e o nível alto de e. 12 habilidade na área dos genômicos, aqueles habilitados na técnica será facilmente capaz de aplicar as divulgações e orientações aqui fornecidas essencialmente a todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas da E. coli aqui exemplificadas pode facilmente ser aplicada a — outras espécies pela incorporação do mesmo ácido nucleico codificador ou análogo de espécies outras que não a dada como espécie de referência. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de homólogos de espécie, no geral, e em particular, deslocamentos de gene ortólogo, parálogo ou não ortólogo. . Um ortólogo é um gene ou genes que são relacionados pela : descente vertical e são responsáveis substancialmente pelas mesmas funções ou idênticas em organismos diferentes. Por exemplo, epóxido hidrolase de : ' camundongo e epóxido hidrolase de ser humano podem ser consideradas ortólogos para a função biológica da hidrólise de epóxidos. Os genes são — relacionados pela descente vertical quando, por exemplo, eles compartilham similaridade de sequência de quantidade suficiente para indicar que eles são homólogos, ou relacionados pela evolução a partir de um ancestral comum. Os genes também podem ser considerados ortólogos se eles compartilham a estrutura tridimensional! mas não necessariamente a similaridade de
20. sequência, de uma quantidade suficiente para indicar que eles tenham evoluído de um ancestral comum até o grau em que a similaridade de sequência primária não é identificável. Os genes que são ortólogos podem codificar proteínas com similaridade de sequência de cerca de 25% a 100% de identidade de sequência de aminoácido. Os genes que codificam proteínas que — compartilham uma similaridade de aminoácido menor do que 25% também podem ser consideradas ter surgido pelo descente vertical se sua estrutura tridimensional também mostra similaridades. Os membros da família da serina protease de enzimas, incluindo ativador de plasminogênio de tecido e elastase, são considerados ter surgido pelo descente vertical de um ancestral
:! 13 comum.
Ortólogos incluem genes ou seus produtos de gene codificados que, por exemplo, através da evolução, têm divergido em estrutura ou atividade global. Por exemplo, onde uma espécie codifica um produto de gene —que exibe duas funções e onde tais funções foram separadas em genes distintos em uma segunda espécie, os três genes e seus produtos correspondentes são considerados ser ortólogos. Para a produção ligada pelo crescimento de um produto bioquímico, aqueles habilitados na técnica entenderão que o gene ortólogo que abriga a atividade metabólica a ser introduzido ou rompido deve ser escolhido para a construção do . microorganismo que não ocorre naturalmente. Um exemplo de ortólogos que exibem atividades separáveis é onde atividades distintas foram separados em À produtos de gene distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma espécie única. Um exemplo específico é a separação de proteólise de elastase e proteólise de plasminogênio, dois tipos de atividade da serina protease, em moléculas distintas como ativador de plasminógeno e elastase. Um segundo exemplo é a separação de atividade 5º a 3' exonuclease micoplasma e DNA polimerase IH de Drosófila. A DNA polimerase das primeiras espécies pode ser considerada um ortólogo para cada um ou ambas das exonuclease ou da
20. polimerase da segunda espécie e vice e versa.
Ao contrário, os parálogos são homólogos relacionados, por exemplo, pela duplicação seguido pela divergência evolucionária e têm funções similares ou comuns, mas não idênticas. Os parálogos podem se originar ou derivar, por exemplo, da mesma espécie ou de uma espécie — diferente. Por exemplo, epóxido hidrolase microssômica (epóxido hidrolase 1) e epóxido hidrolase solúvel (epóxido hidrolase II) podem ser consideradas parálogos porque elas representam duas enzimas distintas, co-evoluídas de um ancestrais comuns, que catalisam reações distintas e têm funções distintas na mesma espécie. Os parálogos são proteínas da mesma espécie com
" É 14 similaridade de sequência significante entre si sugerindo que eles são homólogos, ou relacionados através da co-evolução de um ancestral comum. Grupos de famílias de proteína parálogas incluem homólogos de HipA, genes da luciferase, peptidases, e outros.
Um deslocamento de gene não ortólogo é um gene não ortólogo de uma espécie que pode substituir um dado como função de gene de referência em uma espécie diferente. A substituição inclui, por exemplo, ser capaz de realizar substancialmente a mesma função ou uma similar na espécie de origem comparada à função dada como referência na espécie diferente.
Embora no geral, um deslocamento de gene não ortólogo será identificável ã como estruturalmente relacionado a um gene conhecido que codifica a função dada como referência, genes menos estruturalmente relacionados mas É funcionalmente similares e os seus produtos de gene correspondentes não obstante ainda cairão dentro do significado do termo como é aqui usado. À similaridade funcional requer, por exemplo, pelo menos alguma similaridade estrutural no sítio ativo ou região de ligação de um produto de gene não ortólogo comparado a um gene que codifica a função procurada ser substituída. Portanto, um gene não ortólogo inclui, por exemplo, um parálogo ou um gene não relacionado.
Portanto, na identificação e construção dos organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção tendo capacidade biossintética de 4-HB, GBL e/ou BDO, aqueles habilitados na técnica entenderão com a aplicação da divulgação e orientação aqui fornecida a uma espécie particular que a identificação de modificações metabólicas podem — incluir identificação e inclusão ou inativação de ortólogos. Até o grau em que os deslocamentos de gene parálogo e/ou não ortólogo estão presentes no microorganismo dado como referência que codificam uma enzima que catalisa uma reação metabólica similar ou substancialmente similar, aqueles habilitados na técnica também podem utilizar estes genes evolucionariamente
" f 15 relacionados.
Os deslocamentos de gene ortólogo, parálogo e não ortólogo podem ser determinados pelos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, a inspeção de sequências de ácido —nucleico ou aminoácido para dois polipeptídeos revelarão a identidade e similaridade de sequência entre as sequências comparadas. Com base em tais similaridades, uma pessoa habilitada na técnica pode determinar se a similaridade é suficientemente alta para indicar se as proteínas são relacionadas através da evolução de um ancestral comum. Algoritmos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, tais como Align, BLAST, . Clustal W e outros comparam e determinam uma similaridade ou identidade de sequência brutas, e também determinam a presença ou significância de : intervalos na sequência que pode ser designada com um peso ou contagem. Tais algoritmos também são conhecidos na técnica e são similarmente aplicáveis para determinar a similaridade ou identidade de sequência de nucleotídeo. Os parâmetros para similaridade suficiente para determinar a relacionabilidade são computadas com base em métodos bem conhecidos para calcular a similaridade estatística ou a chance de descobrir um emparelhamento similar em um polipeptídeo aleatório, e a significância do —emparelhamento determinado. Uma comparação computadorizada de duas ou mais sequências pode, se desejado, também ser visualmente otimizada por aqueles habilitados na técnica. Os produtos ou proteínas de genes relacionados podem ser esperados ter uma alta similaridade, por exemplo, de 25% a 100% de identidade de sequência. As proteínas que não são — relacionadas podem ter uma identidade que é essencialmente a mesma como seria esperado ocorrer ao acaso, se uma base de dados de tamanho suficiente é escaneado (cerca de 5%). As sequências entre 5% e 24% podem representar ou não homologia suficiente para concluir que as sequências comparadas são relacionadas. A análise estatística adicional para determinar a significância de
A À 16 tais emparelhamentos dado o tamanho do conjunto de dados pode ser realizada para determinar a relevância destas sequências.
Os parâmetros exemplares para determinar a relacionabilidade de duas ou mais sequências usando o algoritmo BLAST, por exemplo, pode —sercomo apresentado abaixo. Em resumo, os alinhamentos da sequência de aminoácido podem ser realizados usando a versão BLASTP 2.0.8 (05 de Jan de 1999) e os parâmetros que seguem: Matriz: O BLOSUMG62; abertura de intervalo: 11; extensão de intervalo: 1; x queda: 50; expectativa: 10,0; tamanho da palavra: 3; filtro: ligado. Os alinhamentos de sequência de ácido —nucleico podem ser realizados usando BLASTN versão 2.0.6 (16 de Set de Ê 1998) e os parâmetros que seguem: Emparelhamento: 1; desemparelhamento: -2; abertura de intervalo: 5; extensão de intervalo: 2; x queda: 50; : expectativa: 10,0; tamanho da palavra: 11; filtro: desligado. Aqueles habilitados na técnica saberão quais modificações podem ser fabricadas para os parâmetros acima para aumentar ou diminuir a severidade da comparação, por exemplo, e determinar a relacionabilidade de duas ou mais sequências.
A invenção fornece um biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano tendo um caminho biossintético do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) que inclui pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica a 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, glutamato:succínico semialdeído transaminase, alfa-cetoglutarato descarboxilase, ou glutamato descarboxilase, em que o ácido nucleico —exógeno é expressado em quantidades suficientes para produzir ácido 4- hidroxibutanóico (4-HB) monomérico. A 4-hidroxibutanoato desidrogenase também é aludida como 4-hidroxibutirato desidrogenase ou 4-HB desidrogenase. A succinil-CoA sintetase também é aludida como succinil- CoA sintase ou succinil-CoA ligase.
A 17 Também é fornecido um biocatalisador microbiano que não ocorrem naturalmente incluindo um organismo microbiano tendo um caminho biossintético do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) tendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica a 4-hidroxibutanoato desidrogenase, succinil- —CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, ou a-cetoglutarato descarboxilase, em que o ácido nucleico exógeno é expressado em quantidades suficientes para produzir o ácido 4 hidroxibutanóico (4-HB) monomérico. Os biocatalisadores microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção incluem organismos microbianos que utilizam : combinações de reações metabólicas para produzir biossinteticamente os compostos da invenção. Os compostos biossintetizados podem ser produzidos : intracelularmente e/ou secretados no meio de cultura. Os compostos exemplares produzidos pelos microorganismos que não ocorrem naturalmente
15. incluem, por exemplo, o ácido 4-hidroxibutanóico, 1,4-butanodiol e y- butirolactona. Em uma forma de realização, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente é engendrado para produzir 4-HB. Este composto é um ponto de entrada útil na família do 1,4-butanodiol de compostos. As reações bioquímicas para a formação de 4-HB a partir de succinato, de succinato através da succinil-CoA ou de a-cetoglutarato são mostradas nas etapas | a 8 da Figura |. É entendido que qualquer combinação de enzimas apropriadas de um caminho de BDO pode ser usada contanto que a conversão de um componente de partida para o produto de BDO seja obtido. Assim, é entendido que qualquer um dos caminhos metabólicos aqui divulgados pode ser utilizado e que é bem entendido para aqueles habilitados na técnica como selecionar enzimas apropriadas para se obter um caminho desejado, como aqui divulgado.
Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um caminho do 1,4-butanodiol (BDO) que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima — do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO que compreende 4-aminobutirato-CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril- CoA oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutiril-CoA transaminase, ou 4- hidroxibutiril-CoA desidrogenase (ver Exemplo VII Tabela 17). O caminho de BDO pode compreender ainda a 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butanodiol desidrogenase. É entendido por aqueles habilitados na técnica que várias É combinações dos caminhos podem ser utilizadas, como aqui divulgado. Por exemplo, em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, os ácidos nucleicos podem codificar a 4-aminobutirato-CoA transferase, 4- aminobutiril-CoA hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase; 4-aminobutiril- CoA oxidorredutase (desaminação) ou 4-aminobutiril-CoA transaminase; e 4- hidroxibutiril-CoA desidrogenase. Outras combinações exemplares são especificamente descritas abaixo e ainda podem ser encontradas nas Figuras 8-13. Por exemplo, o caminho de BDO pode compreender ainda 4- hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
A invenção adicionalmente fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano — tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO que compreende a 4-aminobutirato-COoA transferase, 4-aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril-CoA redutase (que e Í 19 forma — álcool), 4-aminobutiril-CoA redutase, 4-aminobutan-1-ol desidrogenase, 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutan-l-ol transaminase (ver Exemplo VII e Tabela 18), e pode compreender ainda a 1,4-butanodiol desidrogenase. Por exemplo, os ácidos —nucleicos exógenos podem codificar a 4-aminobutirato-CoA transferase, 4- — . aminobutiril-CoA hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase; 4-amino-butiril- CoA redutase (que forma álcool); e 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4-aminobutan-l-ol transaminase. Além disso os ácidos nucleicos podem codificar a 4-aminobutirato-CoA transferase, 4-aminobutiril- CoA hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase; 4-aminobutiril-CoA redutase; : 4-aminobutan-l-ol desidrogenase; e 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4-aminobutan-1-ol transaminase.
É A invenção fornece ainda um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO que compreende a 4- aminobutirato cinase, 4-aminobutiraldeído desidrogenase (fosforilação), 4- aminobutan-l-ol — desidrogenase, 4-aminobutan-1-ol oxidorredutase —(desaminação), 4-aminobutan-1-ol transaminase, ácido [4- aminobutanolil)óxilfosfônico —oxidorredutase (desaminação), ácido [(4- aminobutanolil)óxi]fosfônico transaminase, 4-hidroxibutiril-fosfato desidrogenase, ou 4-hidroxibutiraldeído desidrogenase (fosforilação) (ver Exemplo VII e Tabela 19). Por exemplo, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar a 4-aminobutirato cinase; 4-aminobutiraldeído desidrogenase (fosforilação); 4-aminobutan-l-ol desidrogenase; e 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase — (desaminação) ou 4-aminobutan-l-ol transaminase. Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar a 4- aminobutirato cinase; ácido [(4-aminobutanolil)óxi]fosfônico oxidorredutase
Do 20 (desaminação) ou ácido [(4-aminobutanolil)óxilfosfônico transaminase; 4- hidroxibutiril-fosfato desidrogenase; e 4-hidróxi-butiraldeído desidrogenase (fosforilação). Também é fornecido um organismo microbiano que não — ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um — caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo alfa- cetoglutarato 5-cinase, 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação), ácido 2,5-dioxopentanóico redutase, alfa-cetoglutarato-CoA S transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, alfa-cetoglutaril-CoA ligase, alfa- cetoglutaril-CoA redutase, ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase, É alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool), ácido S-hidróxi-2- oxopentanóico — descarboxilase, ou ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico — desidrogenase (descarboxilação) (ver Exemplo VIII e Tabela 20). O caminho de BDO pode compreender ainda 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
Por exemplo, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-cetoglutarato 5- cinase; 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação); ácido 2,5-dioxopentanóico redutase; e ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase.
Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-cetoglutarato S-cinase; 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação); ácido 2,5-dioxopentanóico redutase; e ácido 5- hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação). Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-cetoglutarato-CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfacetoglutaril-CoA ligase; alfa-cetoglutaril-CoA redutase, ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase; e ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase.
Em uma outra forma de realização, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-
a 21 cetoglutarato-CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa- cetoglutaril-CoA ligase; alfa-cetoglutaril-CoA redutase, ácido 5-hidróxi-2- oxopentanóico — desidrogenase, e ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação). Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-cetoglutarato-CoA transferase, alfa cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase; alfa-cetoglutaril- CoA redutase (que forma álcool); e ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase.
Ainda em uma outra forma de realização, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar alfa-cetoglutarato-CoA transferase, alfa- —cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase; alfa-cetoglutaril- ; CoA redutase (que forma álcool); e ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação). É A invenção adicionalmente fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo glutamato-CoA transferase, glutamil-CoA hidrolase, glutamil-CoA ligase, glutamato 5-cinase, glutamato-S-semialdeído desidrogenase (fosforilação), —glutamil-CoA redutase, glutamato-5-semialdeído redutase, glutamil-CoA redutase (que forma álcool), ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico oxidorredutase — (desaminação), — ácido — 2-amino-S-hidroxipentanóico transaminase, ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase, ácido 5- hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação) (ver Exemplo IX e Tabela 21). Por exemplo, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar glutamato-CoA transferase, glutamil-CoA hidrolase, ou glutamil-CoA ligase; glutamil-CoA redutase; glutamato-S-semialdeído redutase; ácido 2-amino-5- hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação) ou ácido 2-amino-5- hidroxipentanóico — transaminase; e ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico
: 22 descarboxilase —ou ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico — desidrogenase (descarboxilação). Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar glutamato S-cinase; glutamato-S-semialdeído desidrogenase (fosforilação); — glutamato-S-semialdeído — redutase; ácido 2-amino-5- S —hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação) ou ácido 2-amino-S- hidroxipentanóico — transaminase; e ácido S5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase —=ou ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico — desidrogenase (descarboxilação). Ainda em uma outra forma de realização, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar glutamato-CoA transferase, glutamil- CoA hidrolase, ou glutamil-Coà ligase; glutamil-CoA redutase (que forma ; álcool); ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação) ou ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase; e ácido 5S-hidróxi-2- : oxopentanóico — descarboxilase —ou ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação). Ainda em uma outra forma de realização, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar glutamato 5-cinase; glutamato-5- semialdeído — desidrogenase * (fosforilação); ácido 2-amino-S-hidróxi- pentanóico — oxidorredutase — (desaminação) ou ácido 2-amino-5- hidroxipentanóico — transaminase; e ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico — desidrogenase —(descarboxilação).
Adicionalmente é fornecido um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma — quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo 3-hidroxibutiril-CoA — desidrogenase, 3-hidroxibutiril-COA —desidratase, vinilacetil-CoA A-isomerase, ou 4hidroxibutiril-CoA desidratase (ver Exemplo X e Tabela 22). Por exemplo, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar — 3-hidroxibutiril-CoA — desidrogenase; 3-hidroxibutiril-CoA
Y 23 E Eefeitaditr desidratase; vinilacetil-CoA A-isomerase; e 4-hidroxibutiril-CoA desidratase.
Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo —menosum ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de À
Ê BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo homosserina desaminase, homosserina- CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, homosserina-CoA ligase, homosserina-CoA desaminase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA transferase, 4- hidroxibut-2-enoil-CoA hidrolase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase, 4- : hidroxibut-2-enoato — redutase, — 4-hidroxibutiril-CoA transferase, 4- hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, ou 4-hidroxibut-2- r enoil-CoA redutase (ver Exemplo XI e Tabela 23). Por exemplo, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar homosserina desaminase; 4hidroxibut-2- —enoil-CoA transferase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA hidrolase, 4-hidroxibut-2- enoil-CoA ligase; 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase.
Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar homosserina-CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, ou homosserina-CoA ligase; homosserina-CoA desaminase; e 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase.
Em uma outra forma de 20 . realização, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar homosserina desaminase; —4-hidroxibut-2-enoato “redutase; e 4-hidroxibutiril-CoA transferase, 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, ou 4-hidroxibutiril-CoA ligase.
Alternativamente, os ácidos nucleicos exógenos podem codificar homosserina-CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, ou homosserina- CoA ligase; homosserina-CoA desaminase; e 4- hidroxibut-2-enoil-CoA redutase.
Além disso é fornecido pela invenção um organismo microbiano que não ocorre naturalmente, que compreendem um organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um frias aih 24 ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BOD, o caminho de BDO compreendendo succinil-COA redutase (que forma álcool), 4- hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, 4-hidroxibutanal — desidrogenase (fosforilação) (também aqui aludida como acilfosfato redutase). (ver a Tabela 15). Um tal caminho de BDO pode compreender ainda succinil- CoA redutase, 4-hidroxibutirato desidrogenase, 4-hidroxibutiril-CoA transferase, 4-hidroxibutirato cinase, fosfotrans-4-hidroxibutirilase, 4- hidroxibutiril-CoA redutase, 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
Em uma outra forma de realização, a invenção fornece um organismo microbiano que não ocorrem naturalmente, que compreende um É organismo microbiano tendo um caminho de BDO que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo glutamato desidrogenase, 4-amino-butirato oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutirato transaminase, glutamato descarboxilase, 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (acilfosfato redutase)(ver a Tabela 16). Um tal caminho de BDO pode compreender ainda alfa- cetoglutarato — descarboxilase, — 4-hidroxibutirato — desidrogenase, — 4- hidroxibutiril-CoA transferase, 4-hidroxibutirato cinase, fosfotrans-4- hidroxibutirilase, — 4-hidroxibutiril-CoA — redutase, 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
Em uma forma de realização adicional, a invenção fornece um organismo microbiano que não ocorrem naturalmente tendo um caminho de 4-HB ou BDO, em que o organismo microbiano que não ocorre naturalmente compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica um enzima ou proteína que converte um substrato a um produto em um caminho de 4-HB
: wo 25 ou BDO, por exemplo, succinil-CoA para semialdeído succeínico, semialdeído succínico para 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutirato para 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA para 4-hidroxibutiraldeído, 4-hidroxibutiraldeído para 1,4-butanodiol, como exemplificado na Figura 1. Em uma outra forma de — realização, um substrato para o produto em um caminho de 4-HB ou BDO pode ser, por exemplo, succinil-CoA para semialdeído succínico, semialdeído succínico para 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutirato para 4-hidroxibutiril- fosfato, 4-hidroxibutiril-fosfato para 4-hidroxibutiril-CoA, 4-hidroxibutiril- CoA para 4-hidroxibutanal, 4-hidroxibutanal para 1,4-butanodiol, como exemplificado em uma forma de realização da Figura 8A. Assim, a invenção f fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente contendo pelo : menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima ou proteína, onde a enzima ou proteína converte os substratos e produtos de um caminho de 4- HB ou BDO, tal como aqueles mostrados nas Figuras 8-13, e uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente determinar tais substratos e produtos com base nos caminhos de 4-HB ou BDO aqui divulgados.
Os caminhos descritos acima são meramente exemplares. Uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente selecionar caminhos apropriados daqueles aqui divulgados para obter um caminho de 4-HB ou BDO adequado — ououtro caminho metabólico, como desejado.
A invenção é aqui descrita com referência geral à reação metabólica, reagente ou produto desta, ou com referência específica a um ou mais ácidos nucleicos ou genes que codificam uma enzima associada com ou que catalisa a reação metabólica dado como referência, reagente ou produto.
A menos que de outro modo aqui expressamente estabelecido, aqueles habilitados na técnica entenderão que referência a uma reação também constitui referência aos reagentes e produtos da reação. Similarmente, a menos que de outro modo aqui expressamente estabelecido, referência a um reagente ou produto também se refere à reação e que referência a qualquer um fita dad 26 destes constituintes metabólicos também se refere ao gene ou genes que codifica(m) as enzimas que catalisam a reação, reagente ou produto dados como referência. Do mesmo modo, dados os campos bem conhecidos da bioquímica metabólica, enzimologia e genômicas, referência aqui a um gene ou ácido nucleico codificador também constitui uma referência à enzima codificadora correspondente e à reação que a mesma catalisa assim como os reagentes e produtos da reação.
A produção de 4-HB via modos biossintéticos usando os organismos microbianos da invenção é particularmente útil porque a mesma pode produzir 4-HB monomérico. Os organismos microbianos que não f ocorrem naturalmente da invenção e a sua biossíntese de compostos da õ família 4-HB e BDO também são particularmente úteis porque o produto de 4-HB pode ser (1) secretado; (2) pode ser destituído de quaisquer derivatizações tais como Coenzima A; (3) evita mudanças termodinâmicas durante a biossíntese; (4) possibilita a biossíntese direta de BDO, e (5) possibilita a conversão química expontânea de 4-HB para y-butirolactona (GBL) em meio de pH ácido. Esta última característica também é particularmente útil para a síntese ou biossíntese químicas eficientes de compostos da família BDO tal como 1,4-butanodiol e/ou tetraidrofurano —(THF),por exemplo.
Os organismos microbianos no geral carecem da capacidade para sintetizar 4-HB. Qualquer um dos compostos aqui divulgado estar dentro da família 1,4-butanodiol de compostos ou conhecido por aqueles na técnica estar dentro da família do 1,4-butanodiol de compostos são considerados estar — dentro da família do 1,4-butanodiol de compostos. Além disso, organismos tendo todas as capacidades enzimáticas metabólicas requisitadas não são conhecidos para produzir 4-HB a partir das enzimas descritas e caminhos bioquímicos aqui exemplificados. Ao invés, com a exceção possível de uns poucos “microorganismos —anaeróbicos descritos mais abaixo, os eo 27 microorganismos tendo a capacidade enzimática usa 4HB como um substrato para produzir, por exemplo, succinato. Ao contrário, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem gerar 4-HB ou BDO como um produto. Como descrito acima, a biossíntese de 4-HB na — sua forma monomérica não é apenas particularmente útil na síntese química da família BDO de compostos, a mesma também permite quanto à biossíntese adicional de compostos da família BDO e evita completamente procedimentos de síntese química.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção que podem produzir 4-HB ou BDO são produzidos garantindo-se d que um organismo microbiano hospedeiro inclui capacidades funcionais para : a biossíntese química completa de pelo menos um caminho biossintético de 4- HB ou BDO da invenção. Garantir pelo menos um caminho biossintético de 4-HB ou BDO requerido confere capacidade de biossíntese de 4-HB no organismo microbiano hospedeiro.
Cinco caminhos biossintétios de 4-HB são aqui exemplificados e mostrados para os propósitos de ilustração na Figura 1. Os caminho de 4-HB e BDO adicionais são descritos nas Figuras 8 a 13. Um caminho biossintético de 4-HB inclui a biossíntese de 4-HB a partir de —succinato (o caminho do succinato). As enzimas que participam neste caminho de 4-HB incluem semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Neste caminho, a semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA catalisa a reação reversa para a seta mostrada na Figura 1. Um outro caminho biossintético de 4-HB inclui a — biossíntese de succinato através da succinil-CoA (o caminho da succinil- CoA). Às enzimas que participam neste caminho de 4-HB incluem succinil- CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA e 4- hidroxibutanoato desidrogenase. Três outros caminhos biossintéticos de 4-HB incluem a biossíntese de 4-HB a partir de acetoglutarato (os caminhos do a-
 28 cetoglutarato). Consequentemente, um terceiro caminho biossintético de 4- HB é a biossíntese do semialdeído succínico através da glutamato: semialdeído —“succínico transaminase, glutamato descarboxilase e 4- hidroxibutanoato desidrogenase.
Um quarto caminho biossintético de 4-HB — também incluia biossíntese de 4-HB a partir de a-cetoglutarato, mas utiliza a- cetoglutarato descarboxilase para catalisar a síntese do semialdeído succínico.
A 4-hidroxibutanoato desidrogenase catalisa a conversão do semialdeído suceínico para 4-HB.
Um quinto caminho biossintético de 4-HB inclui a biossíntese de a-cetoglutarato através da succinil-COA e utiliza a- —cetoglutarato desidrogenase para produzir succinil-CoA, que converge no : caminho da succinil-CoA descrito acima.
Cada um destes caminhos õ biossintéticos de 4-HB, seus substratos, reagentes e produtos são descritos mais abaixo nos Exemplos.
Como aqui descrito, 4-HB pode ser biossinteticamente convertido ainda ao BDO pela inclusão de enzimas apropriadas para produzir BDO (ver Exemplo). Assim, é entendido que um caminho de 4-HB pode ser usado com enzimas para converter 4-HB para
BDO para gerar um caminho de BDO.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem ser produzidos pela introdução de ácidos nucleicos —expressáveis que codificam uma ou mais das enzimas que participam em um ou mais caminhos biossintéticos de 4-HB ou BDO.
Dependendo do organismo microbiano hospedeiro escolhido para a biossíntese, ácidos nucleicos para alguns ou todos de um caminho biossintético de 4-HB ou BDO particular podem ser expressados.
Por exemplo, se um hospedeiro escolhido é — deficiente em uma ou mais enzimas em um caminho biossintético desejado, por exemplo, o succinato para o caminho de 4-HB, então ácidos nucleicos expressáveis para a(s) enzima(s) deficiente(s), por exemplo, tanto a semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA quanto a 4- hidroxibutanoato “desidrogenase neste exemplo, são introduzidas no e 29 hospedeiro para a expressão. Alternativamente, se o hospedeiro escolhido exibe expressão endógena de alguma enzima do caminho, mas é deficiente em outras, então um ácido nucleico codificador é necessário para a enzima(s) deficiente(s) para se obter a biossíntese 4-HB ou BDO. Por exemplo, se o hospedeiro escolhido exibe a semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA endógena, mas é deficiente na 4-hidroxibutanoato desidrogenase, então um ácido nucleico codificador é necessário para esta enzima para se obter a biossíntese de 4-HB. Assim, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção pode ser produzido pela introdução de atividades de enzima ou de proteína exógenas para obter um caminho í biossintético desejado ou um caminho biossintético desejado pode ser obtido ã pela introdução de uma ou mais atividades de enzimas ou de proteína exógenas que, juntas com uma ou mais enzimas ou proteínas endógenas, produzem um produto desejado tal como 4-HB ou BDO. Em maneira semelhante, onde a biossíntese de 4-HB é selecionada para ocorrer através do caminho do succinato para succinil-CoA (o caminho da succinil-CoA), que codifica ácidos nucleicos quanto as deficiências do hospedeiro nas enzimas succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA e/ou 4-hidroxibutanoato —desidrogenase devem ser exogenamente expressadas no hospedeiro receptor. A seleção da biossíntese de 4-HB através do caminho da a-cetoglutarato para semialdeído succínico (o caminho da a-cetoglutarato) pode utilizar a expressão exógena para as deficiências do hospedeiro em uma ou mais das enzimas para a glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato — descarboxilase e/ou 4-hidroxibutanoato desidrogenase, ou a-cetoglutarato descarboxilase e 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente determinar as enzimas do caminho para a produção de 4HB ou BDO, como aqui divulgadas.
Dependendo dos constituintes dos caminhos biossintéticos de
Sia 30 4-HB ou BDO de um organismo microbiano hospedeiro selecionado, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção incluirão pelo menos um caminho do ácido nucleico codificador de 4-HB ou BDO exogenamente expressado e até que todos os ácidos nucleicos codificadores —paraum ou mais caminhos biossintéticos de 4-HB ou BDO. Por exemplo, a biossíntese de 4-HB ou BDO pode ser estabelecida em um hospedeiro deficiente em um caminho enzima ou proteína através da expressão exógena do ácido nucleico codificador correspondente. Em um hospedeiro deficiente em todas as enzimas ou proteínas de um caminho de 4-HB ou BDO, a expressão exógena de todas as enzimas ou proteínas no caminho pode ser . incluída, embora seja entendido que todas as enzimas ou proteínas de um caminho possam ser expressadas mesmo se o hospedeiro contenha pelo menos uma das enzimas ou proteínas do caminho. Por exemplo, a expressão exógena de todas as enzimas ou proteínas em um caminho para a produção de BDO pode ser incluída. Por exemplo, a biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todos os caminhos em um hospedeiro deficiente na 4- hidroxibutanoato desidrogenase através da expressão exógena de um ácido nucleico codificador da 4-hidroxibutanoato desidrogenase. Ao contrário, a biossíntese de 4-HB pode ser estabelecida a partir de todos os cinco caminhos emum hospedeiro deficiente em todas as oito enzimas através da expressão exógena de todas as oito de semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica — dependente = de -CoA, glutamato:semialdeíido — succínico transaminase, glutamato descarboxilase, a-cetoglutarato descarboxilase, a- — cetoglutarato desidrogenase e 4-hidroxibutanoato desidrogenase.
Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica entenderão que o número de ácidos nucleicos codificadores para introduzir em uma forma expressável, pelo menos, igualar- se-á às deficiências do caminho de 4-HB ou BDO do organismo microbiano a 31 hospedeiro selecionado.
Portanto, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção pode ter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou até todos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas aqui divulgadas que constituem um ou mais caminhos biossintéticos de 4-HB ou BDO. Em algumas formas de realização, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente também podem incluir outras modificações genéticas que facilitam ou otimizam a biossíntese de 4-HB ou BDO ou que conferem outras funções úteis no organismo microbiano hospedeiro. Uma tal outra funcionalidade pode incluir, por exemplo, o aumento da síntese de um ou mais dos precursores do caminho de 4-HB tais como succinato, succinil-CoA, a-cetoglutarato, —4d-aminobutirato, glutamato, acetoacetil-COA, e/ou homosserina.
No geral, um organismo microbiano hospedeiro é selecionado
15. talqueomesmo produza o precursor de um caminho de 4-HB ou BDO, como uma molécula naturalmente produzida ou como um produto engendrado que fornece a produção de novo de um precursor desejado ou produção aumentada de um precursor naturalmente produzido pelo organismo microbiano hospedeiro. Por exemplo, succinil-CoA, a-cetoglutarato, 4-aminobutirato, — glutamato, acetoacetil-CoA, e homosserina são produzidos naturalmente em um organismo hospedeiro tal como E. coli. Um organismo hospedeiro pode ser engendrado para aumentar a produção de um precursor, como aqui divulgado. Além disso um organismo microbiano que foi engendrado para produzir um precursor desejado pode ser usado como um organismo — hospedeiro e engendrados ainda para expressar enzimas ou proteínas de um caminho de 4-HB ou BDO.
Em algumas formas de realização, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção é gerado a partir de um hospedeiro que contém a capacidade enzimática para sintetisar 4-HB ou BDO. Nesta o 32 forma de realização específica pode ser útil aumentar a síntese ou o acúmulo de um produto do caminho de 4-HB ou BDO, por exemplo, para direcionar as reações do caminho de 4-HB ou BDO na direção da produção de 4-HB ou BDO.
A síntese ou acúmulo aumentados podem ser realizados, por exemplo, pela superexpressão de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais das enzimas do caminho de 4-HB ou BDO aqui divulgadas.
A super expressão da enzima ou enzimas do caminho de 4-HB ou BDO pode ocorrer, por exemplo, através da expressão exógena do gene ou genes endógenos, ou através da expressão exógena do gene ou genes heterólogos.
Portanto, organismos que ocorrem naturalmente podem ser facilmente gerados para serem organismos - microbianos que produzem 4-HB ou BDO que não ocorrem naturalmente da invenção através da superexpressão de um, dois, três, quatro, cinco, seis e | assim por diante até todos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas do caminho biossintético de 4-HB ou BDO.
Além disso, um organismo que não — ocorre naturalmente pode ser gerado pela mutagênese de um gene endógeno que resulta em um aumento na atividade de uma enzima no caminho biossintético de 4-HB ou BDO.
Em formas de realização particularmente úteis, a expressão exógena dos ácidos nucleicos codificadores é utilizada.
A expressão exógena confere a capacidade para adaptar sob medida a expressão e/ou elementos regulatórios para o hospedeiro e aplicar para se obter um nível de expressão desejado que é controlado pelo usuário.
Entretanto, a expressão endógena também pode ser utilizada em outras formas de realização tais como pela remoção de um efetor regulador negativo ou indução do promotor do gene — quando ligado a um promotor indutível ou outro elemento regulador.
Assim, um gene endógeno tendo um promotor indutível que ocorre naturalmente pode ser supra-regulado pelo fornecimento do agente indutor apropriado, ou a região reguladora de um gene endógeno pode ser engendrado para incorporar um elemento regulador indutível, permitindo deste modo que a regulagem da
E E 33 expressão aumentada de um gene endógeno em um tempo desejado. Similarmente, um promotor indutível pode ser incluído como um elemento regulador para um gene exógeno introduzido em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente (ver os Exemplos).
É “Exógeno” como é aqui usado é intencionado a significar que a molécula dada como referência ou a atividade dada como referência são introduzidos no organismo microbiano hospedeiro. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, pela introdução de um ácido nucleico codificador no material genético hospedeiro tal como pela integração em um cromossoma hospedeiro ou como material genético não cromossômico tal como um plasmídeo. Portanto, o termo como é usado na referência para a expressão de um ácido nucleico codificador refere-se à introdução do ácido nucleico codificador em uma forma expressável no organismo microbiano. Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo refere-se a uma atividade que é introduzida no organismo hospedeiro de referência. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico codificador homólogo ou heterólogo que expresse a atividade dada como referência que segue a introdução no organismo microbiano hospedeiro. Portanto, o termo “endógeno” refere-se a uma molécula ou atividade dadas como referência que estão presentes no hospedeiro. Similarmente, o termo quando. usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificador refere-se à expressão de um ácido nucleico codificador contido dentro do organismo microbiano. O termo “heterólogo” refere-se a uma molécula ou atividade derivadas de uma fonte outra que não à dada como espécie de referência ao passo que “homólogos” refere-se a uma molécula ou atividade derivadas do organismo microbiano hospedeiro. Consequentemente, a expressão exógena de um ácido nucleico codificador da invenção pode utilizar cada um ou ambos de um ácido nucleico codificador heterólogo ou homólogo.
As fontes de ácidos nucleicos codificadores para uma enzima
Do 34 do caminho de 4-HB ou BDO podem incluir, por exemplo, qualquer espécie onde o produto de gene codificado é capaz de catalisar a reação dada como referência. Tal espécie inclui organismos tanto procarióticos quanto eucarióticos incluindo, mas não limitados a, bactérias, incluindo archaea e — eubactérias, e eucariotas, incluindo levedura, planta, inseto, animal, e mamíferos, incluindo o ser humano. As espécies exemplares para tais fontes incluem, por exemplo, aqueles organismos listados abaixo assim como outras espécies exemplares aqui divulgadas ou disponíveis como organismos fonte para o genes correspondente, incluindo mas não limitados a Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, Clostridium kluyveri, - Clostridium — acetobutylicum, Clostridiuam beijerinckil, Clostridium sacceharoperbutylacetonicum, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, À Clostridium — botulinum, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium tetanomorphum, Clostridium tetani, Clostridium propionicum, Clostridium
15. aminobutyricum, Clostridium subterminale, Clostridium sticklandii, Ralstonia eutropha, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Porphyromonas gingivalis, Arabidopsis thaliana, Thermus thennophilus, espécies Pseudomonas, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Homo sapiens, —Oryctolagus cuniculus, Rhodobacter spaeroides, Thermoanaerobacter brockii, Metallosphaera sedula, Leuconostoc mesenteroides, Chloroflexus aurantiacus, Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter, Simmondsia chinensis, Acinetobacter species, incluindo Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter baylyi, Porphyromonas gingivalis, Sulfolobus tokodaii, Sulfolobus — solfataricus, Sulfolobus acidocaldarius, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus pumilus, Rattus norvegicus, Klebsiella pneumonia, Klebsiella oxytoca, Euglena gracilis, Treponema denticola, Moorella thennoacetica, Thermotoga maritima, Halobacterium salinarum, Geobacillus stearothermophilus, Aeropyrum pernix, Sus scrofa,
ed 35
Caenorhabditis elegans, Corynebacterium glutamicum, Acidaminococcus fermentans, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterobacter aerogenes, Candida, Aspergillus terreus, Pedicoccus pentosaceus, Zymomonas mobilus, Acetobacter pasteurians, Klwveromyces lactis, Eubacterium barkeri, Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, Natranaerobius thermophilusm, Campylobacter jejuni, Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Citrobacter amalonaticus, Myxococcus xanthus, Fusobacterium nuleatum, Penicillium chrysogenum marine gamma proteobacterium, bactéria que produz butirato, e outras aqui divulgadas (ver os Exemplos). Por exemplo, organismos : microbianos tendo produção biossintética de 4-HB ou BDO são aqui exemplificados com referência à E. coli e hospedeiros de levedura. | Entretanto, com a sequência de genoma completa disponível agora para mais do que 550 espécies (com mais da metade destas disponíveis em bases de dados públicas tais como a NCBD, incluindo 395 genomas de microorganismo e uma variedade de genomas de levedura, fungos, planta, e mamífero, a identificação de genes que codificam a atividade biossintética de 4-HB ou BDO requerida para um ou mais genes em espécies relacionadas ou distantes, incluindo por exemplo, deslocamento de genes homólogos, —ortólogos, parálogos e não ortólogos de genes conhecidos, e a intermudança de alterações genéticas entre organismos é rotina e bem conhecida na técnica.
Consequentemente, as alterações metabólicas que possibilitam a biossíntese de 4-HB ou BDO e outros compostos da invenção aqui descritos com referência a um organismo tal como E. coli ou levedura podem ser facilmente — aplicados a outros microorganismos, incluindo organismos procarióticos e eucarióticos semelhantes.
Dadas as divulgações e orientações aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica saberão que uma alteração metabólica exemplificada em um organismo pode ser aplicada igualmente a outros
Organismos.
aa 36 Em alguns casos, tal como quando um caminho biossintético de 4-HB ou BDO alternativo existe em uma espécie não relacionada, a biossíntese de 4-HB ou BDO pode ser conferida na espécie hospedeira, por exemplo, a expressão exógena de um parálogo ou parálogos da espécie não — relacionada que catalisa uma reação metabólica similar, porém não idêntica para substituir a reação dada como referência. Porque certas diferenças entre redes metabólicas existem entre organismos diferentes, aqueles habilitados na técnica entenderão que o uso de genes reais entre organismos diferentes pode diferir. Entretanto, dadas as divulgações e orientações aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica também entenderão que as divulgações e - métodos da invenção podem ser aplicados a todos os organismos microbianos usando as alterações metabólicas cognatas àquelas aqui exemplificadas para : construir um organismo microbiano em uma espécie de interesse que sintetizará 4-HB, tal como 4-HB, ou BDO monoméricos.
Os organismos microbianos hospedeiros podem ser selecionados de, e os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente gerados em, por exemplo, bactérias, levedura, fungos ou qualquer um de uma variedade de outros microorganismos aplicáveis aos processos de fermentação. As bactérias exemplares incluem as espécies selecionadas de Escherichia coli, Klebsiella oxitoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxidans, Zymomonas — mobilis,, Lactococcus lactisó, Lactobacillus plantarum, Streptomyces — coelicolor, Clostridium —acetobutilicum, Pseudomonas — fluorescens, e Pseudomonas putida. As leveduras ou fungos exemplares incluem — espécies — selecionadas de Saccharomyces — cerevisiae, Schizosaccharomyces — pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger e Pichia pastoris. E. coli é um organismo hospedeiro particularmente útil visto que é um organismo e so 37 microbiano bem caracterizado adequado para o engenheiramento genético. Outros organismos hospedeiros particularmente úteis incluem levedura tais como Saccharomyces cerevisiae.
Métodos para construir e testar os níveis de expressão de um — hospedeiro que produz 4-HB ou BDO que não ocorre naturalmente podem ser realizados, por exemplo, pelos métodos recombinantes e de detecção bem conhecidos na técnica. Tais métodos podem ser encontrados descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque (2001); Ausubel er al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, .- MD (1999). 4-HB e GBL podem ser separados, por exemplo, pela HPLC usando uma coluna Spherisorb 5 ODS1 e uma fase móvel de 70% de tampão : de fosfato a 10mM (pH=7) e 30% de metanol, e detectados usando um detector de UV a 215 nm (Hennessy et al. 2004, J. Forensic Sci. 46(6): 1-9). BDO é detectado pela cromatografia a gás ou pela HPLC e detetor de índice refrativo usando uma coluna Aminex HPX-87H e uma fase móvel de 0,5mM de ácido sulfúrico (Gonzalez-Pajuelo et al., Met. Eng. 7: 329-336 (2005)). As sequências de ácido nucleico exógeno envolvidas em um caminho para a produção de 4-HB ou BDO podem ser introduzidas estável ou transitoriamente em uma célula hospedeira usando técnicas bem conhecidas no ramo incluindo, mas não limitadas à, conjugação, eletroporação, transformação química, transdução, transfecção, e transformação por ultra- som. Para a expressão exógena em E. coli ou outras células procarióticas, algumas sequências de ácido nucleico nos genes ou cDNAs de ácidos —nucleicos eucarióticos pode codificar sinais alvejadores tais como um mitocondrial de terminal N ou outro sinal alvejador, que possa ser removido antes da transformação em células hospedeiras procarióticas, se desejado. Por exemplo, a remoção de uma sequência líder mitocondrial leva à expressão aumentada na E. coli (Hoffmeister ef al., J. Biol. Chem. 280: 4329-4338
ASA 38
(2005)). Para a expressão exógena em levedura ou outras células eucarióticas, os genes podem ser expressados no citossol sem a adição de sequência líder, ou podem ser alvejados à mitocondria ou outras organelas, ou alvejados para a secreção, pela adição de uma sequência de alvejamento adequada tal como —um alvejamento mitocondrial ou sinal de secreção adequado para as células hospedeiras.
Assim, é entendido que modificações apropriadas para uma sequência de ácido nucleico para remover ou incluir uma sequência de alvejamento pode ser incorporada em uma sequência de ácido nucleico exógena para comunicar propriedades desejadas.
Além disso, os genes podem ser submetidos à otimização de códon com técnicas bem conhecidas na
- técnica para se obter a expressão otimizada das proteínas.
Um vetor ou vetores de expressão podem ser construídos para É abrigar um ou mais caminhos biossintéticos 4-HB e/ou um ou mais ácidos nucleicos codificadores biossintéticos de BDO como aqui exemplificados operavelmente ligados para expressar sequências de controle funcional no organismo hospedeiro.
Os vetores de expressão aplicáveis para o uso nos organismos hospedeiros microbianos da invenção incluem, por exemplo, plasmídeos, vetores de fago, vetores virais, epissomas e cromossomas artificiais, incluindo vetores e sequências de seleção ou marcadores operáveis —paraa integração estável em um cromossoma hospedeiro.
Adicionalmente, os vetores de expressão podem incluir um ou mais genes marcadores selecionáveis e sequências de controle de expressão apropriadas.
Os genes marcadores selecionáveis também podem ser incluídos que, por exemplo, fornecem resistência aos antibióticos ou toxinas, deficiências auxotróficas — complementares, ou fornecem nutrientes críticos não no meio de cultura.
As sequências de controle de expressão podem incluir promotores constitutivos e indutíveis, realçadores de transcrição, terminadores de transcrição, e outros que são bem conhecidos na técnica.
Quando dois ou mais ácidos nucleicos codificadores exógenos devam ser co-expressados, ambos ácidos nucleicos
A ASEo 39 podem ser inseridos, por exemplo, em um único vetor de expressão ou em vetores de expressão separados.
Para a expressão de vetor único, os ácidos nucleicos codificadores podem ser operavelmente ligados a uma sequência de controle de expressão comum ou ligados a sequências de controle de expressão diferentes, tais como um promotor indutível e um promotor constitutivo.
A transformação das sequências de ácido nucleico exógenas envolvidas em um caminho metabólico ou sintético pode ser confirmada usando métodos bem conhecidos na técnica.
Tais métodos incluem, por exemplo, a análise de ácido nucleico tal como Northern blots ou amplificação pela reação da cadeia da polimerase (PCR) de mRNA, ou . imunomanchamento para a expressão de produtos de gene, ou outros métodos analíticos adequados para testar a expressão de uma sequência de ácido H nucleico introduzida ou seu produto de gene correspondente.
É entendido por aqueles habilitados na técnica que o ácido nucleico exógeno é expressado em uma quantidade suficiente para produzir o produto desejado, e é entendido ainda que os níveis de expressão podem ser otimizados para se obter expressão suficiente usando métodos bem conhecidos na técnica e como aqui divulgados.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção são construídos usando métodos bem conhecidos na técnica como aqui exemplificados para expressar exogenamente pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima do caminho de 4-HB ou BDO em quantidades suficientes para produzir 4-HB, tal como 4-HB monomérico, ou BDO.
É entendido que os organismos microbianos da invenção são cultivados — sob condições suficientes para produzir 4-HB ou BDO.
Os níveis exemplares de expressão para as enzimas 4-HB em cada caminho são descritos mais abaixo nos Exemplos.
Seguindo as divulgações e orientações aqui fornecidas, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem obter a biossíntese de 4-HB, tal como 4-HB monomérico, ou BDO o 40 resultando em concentrações intracelulares entre cerca de 0,1 e 200mM ou mais, por exemplo, de 0,1 a 25mM ou mais. No geral, a concentração intracelular de 4-HB, tal como 4-HB monomérico, ou BDO está entre cerca de 3 e 150mM ou mais, particularmente de cerca de 5 a 125mM ou mais, e — mais particularmente entre cerca de 8 e 100mM, por exemplo, de cerca de 3a 20mM, particularmente entre cerca de 5 e 15mM e mais particularmente entre cerca de 8 e 12mM, incluindo cerca de 10mM, 20mM, SOmM, 80mM ou mais. As concentrações intracelulares entre e acima de cada uma destas faixas exemplares também podem ser obtidas a partir dos organismos microbianos —quenão ocorrem naturalmente da invenção.
” Em algumas formas de realização, as condições de cultura incluem condições de crescimento ou manutenção anaeróbicas ou 7 substancialmente anaeróbicas. As condições anaeróbicas exemplares foram descritas anteriormente e são bem conhecidas na técnica. As condições —anaeróbicas exemplares para os processos de fermentação são aqui descritos e são descritos, por exemplo, no pedido de patente U.S. serial Nº 11/891.602, depositado em 10 de agosto de 2007. Qualquer uma destas condições pode ser utilizada com os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente assim como outras condições anaeróbicas bem conhecidas na técnica. Sob tais — condições anaeróbicas, os produtores de 4-HB ou BDO podem sintetizar 4- HB ou BDO nas concentrações intracelulares de 5 a 10mM ou mais assim como todas as outras concentrações aqui exemplificadas. É entendido que, embora a descrição acima se refira às concentrações intracelulares, os organismos microbianos que produzem 4-HB ou BDO podem produzir 4-HB —ouBDO intracelularmente e/ou secretar o produto no meio de cultura.
As condições de cultura podem incluir, por exemplo, procedimentos de cultura líquida assim como fermentação e outros procedimentos de cultura em larga escala. Como aqui descritos, os campos particularmente úteis dos produtos biossintético da invenção podem ser
Do 41 obtidos sob condições de cultura anaeróbica ou substancialmente anaeróbica.
Como aqui descrito, uma condição de crescimento exemplar para se obter a biossíntese de 4-HB ou BDO inclui condições de cultura anaeróbica ou fermentação. Em certas formas de realização, os organismos —microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem ser sustentados, cultivados ou fermentados sob condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Em resumo, as condições anaeróbicas referem- se a um ambiente destituído de oxigênio. As condições substancialmente anaeróbicas incluem, por exemplo, uma cultura, fermentação de lote ou fermentação contínua tal que a concentração de oxigênio dissolvida no meio permanece entre O e 10% de saturação. As condições substancialmente anaeróbicas também incluem células em crescimento ou repouso em meio líquido ou em ágar sólido dentro de uma câmara selada mantida com uma atmosfera de menos do que 1% de oxigênio. A porcentagem de oxigênio pode ser mantida, por exemplo, espargindo-se a cultura com uma mistura de Ny/CO, ou outro gás ou gases que não oxigênio adequados.
A invenção também fornece um biocatalisador microbiano que não ocorrem naturalmente incluindo um organismo microbiano tendo caminhos biossintéticos do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) e 1,4-butanodiol —(BDO) que incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato —desidrogenase, semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase suceínica dependente de -CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferase, glutamato:semialdeído succínico transaminase, glutamato descarboxilase, —aldeído desidrogenase independente de -CoA, aldeído desidrogenase dependente de -CoA ou álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expressado em quantidades suficientes para produzir 1,4- butanodiol (BDO). A 4-hidroxibutirato:CoA transferase também é conhecida como 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase. As enzimas do caminho de o 42 4-HB ou BDO adicionais também são aqui divulgadas (ver os Exemplos e Figuras de 8 - 13). A invenção fornece ainda biocatalisador microbiano que não ocorre naturalmente incluindo um organismo microbiano tendo caminhos — biossintéticos do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), os caminhos incluem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica a 4- hidroxibutanoato — desidrogenase, succinil-CoA * sintetase, semialdeído desidrogenase —succínica dependente de -CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferase, —=4-butirato cinase, fosfotransbutirilase, — acetoglutarato descarboxilase, aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase ou uma aldeído/álcool desidrogenase, em que o ácido nucleico exógeno é expressado em quantidades suficientes para produzir 1,4-butanodiol (BDO). Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente também podem ser gerados os quais biossintetizam BDO.
Como com os organismos microbianos que produzem 4-HB da invenção, os organismos microbianos que produzem BDO também podem produzir intracelularmente ou secretar o BDO no meio de cultura.
Seguindo as divulgações e orientações fornecidas anteriormente para a construção de organismos microbianos que seintetizam 4-HB, caminhos de BDO adicionais podem ser incorporados nos 20: organismos microbianos que produzem 4HB para gerar organismos que também sintetizam BDO e outros compostos da família de BDO.
A síntese química de BDO e seus produtos a jusante é conhecida.
Os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção capazes de contornar a síntese de BDO esta síntese química usando 4-HB como um ponto de — entrada como ilustrado na Figura 1. Como descrito mais abaixo, os produtores de 4-HB também podem ser usados para converter quimicamente 4-HB para GBL e depois para BDO ou THF, por exemplo.
Alternativamente, os produtores de 4-HB podem ser modificados ainda para incluir capacidades biossintéticas para a conversão de 4-HB e/ou GBL ao BDO.
Ea 43
Os caminhos de BDO adicionais para introduzir em produtores de 4-HB incluem, por exemplo, a expressão exógena em um fundo hospedeiro deficiente ou a superexpressão de uma ou mais das enzimas exemplificadas na Figura 1 como etapas 9 a 13. Um tal caminho inclui, por exemplo, as — atividades de enzima necessárias para realizar as reações mostradas como etapas 9, 12 e 13 na Figura 1, onde a aldeído e a álcool desidrogenases podem ser enzimas separadas ou uma enzima multifuncional tendo atividade tanto da aldeído quanto da álcool desidrogenases.
Um outro tal caminho inclui, por exemplo, as atividades de enzima necessárias para realizar as reações mostradas como etapas 10, 11, 12 e 13 na Figura 1, também onde a aldeído e álcool desidrogenases podem ser enzimas separadas ou uma enzima multifuncional tendo a atividade tanto de aldeído quanto de álcool desidrogenases.
Consequentemente, os caminhos de BDO adicionais para introduzir em produtores de 4-HB incluem, por exemplo, a expressão exógena emum fundo hospedeiro deficiente ou a superexpressão de uma ou mais de uma 4-hidroxibutirato:CoA transferase, butirato cinase, fosfotransbutirilase, aldeído desidrogenase independente de -CoA, aldeído desidrogenase dependente de -CoA ou uma álcool desidrogenase.
Na ausência de acil-CoA sintetase endógena capaz de modificar 4-HB, os organismos microbianos que - produzem BDO que não ocorrem naturalmente podem incluir ainda uma acil- CoA sintetase exógeno seletiva para 4-HB, ou a combinação de enzimas múltiplas que têm como uma reação líquida a conversão de 4-HB em 4-HB- CoA.
Como exemplificado mais abaixo nos Exemplos, a butirato cinase e fosfotransbutirilase exibem atividade do caminho de BDO e catalisam as — conversões ilustradas na Figura 1 com um substrato de 4-HB.
Portanto, estas enzimas também podem ser aqui aludidas como 4-hidroxibutirato cinase e fosfotranshidroxibutirilase respectivamente.
As álcool e aldeído desidrogenases exemplares que podem ser usadas para estas conversões in vivo de 4-HB para BDO são listadas abaixo
Eine 44 na Tabela 1. Tabela 1. Álcool e Aldeído Desidrogenases para a Conversão de 4-HB para BDO.
ÁLCOOL DESIDROGENASES ec: 1.1.1.77 lactaldeído redutase ec: 1.1.1.1 álcool desidrogenase ec: 1.1.1.78 metilglioxal redutase ec: 1.1.1.2 álcool desidrogenase (NADP+) (dependente de NADH) ec: 1.1.1.4 (R.R)-butanodio] desidrogenase ec: 1.1.1.79 glioxilato redutase (NADP+) ec: 1.1.1.5 acetoína desidrogeriase ec: 1.1.1.80 isopropanol desidrogenase ec: 1.1.1.6 glicerol desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.7 propanediol-fosfato ec: 1.1.1.81 hidroxipiruvato redutase desidrogenase ec: 1.1.1.82 malato desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.8 glicerol-3-fosfato ec: 1.1.1.83 D-malato desidrogenase desidrogenase (NAD+) (descarboxilação) ec: 1.1.1.11 D-arabinito] 4-desidrogenase ec: 1.1.1.84 dimetilmalato desidrogenase ec: 1.1.1.12 L-arabinito] 4-desidrogenase ec: 1.1.1.85 3-isopropilmalato desidrogenase ec: 1.1.1.13 L-arabinitol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.86 cetol-ácido redutoisomerase ec: 1.1.1.14 L-iditol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.87 homoisocitrato desidrogenase ec: 1.1.1.15 D-iditol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA ec: 1.1.1.16 galactito] 2-desidrogenase redutase ec: 1.1.1.17 manitol-1-fosfato S- ec: 1.1.1.90 aril-álcoo] desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.91 aril-álcool desidrogenase ec: 1.1.1.18 inositol 2-desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.21 aldeído redutase ec: 1.1.1.92 oxaloglicolato redutase ec: 1.1.1.23 histidinol desidrogenase (descarboxilação) ec: 1.1.1.26 glioxilato redutase ec: 1.1.1.94 glicerol-3-fosfato desidrogenase ec: 1.1.1.27 L-lactato desidrogenase [NAD(P)+] ec: 1.1.1.28 D-lactato desidrogenase ec: 1.1.1.95 fosfoglicerato desidrogenase ec: 1.1.1.29 glicerato desidrogenase ec: 1.1.1.97 3-hidroxibenzil-álcoo] ec: 1.1.1.30 3-hidroxibutirato desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.31 3-hidroxiisobutirato ec: 1.1.1.101 acilglicerona-fosfato redutase desidrogenase ec: 1.1.1.103 L-treonina 3-desidrogenase ec: 1.1.1.35 3-hidroxiacil-CoA desidrogenase ec: 1.1.1.104 4-oxoprolina redutase ec: 1.1.1.36 acetoacetil-CoA redutase ec: 1.1.1.105 retinol desidrogenase ec: 1.1.1.37 malato desidrogenase ec: 1.1.1.110 indollactato desidrogenase ec: 1.1.1.38 malato desidrogenase ec: 1.1.1.112 indanol desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação) ec: 1.1.1.113 L-xilose 1-desidrogenase ec: 1.1.1.39 malato desidrogenase ec: 1.1.1.129 L-treonato 3-desidrogenase (descarboxilação) ec: 1.1.1.137 ribitol-S-fosfato 2- ec: 1.1.1.40 malato desidrogenase desidrogenase (oxaloacetato-descarboxilação) (NADP+) ec: 1.1.1.138 manito] 2-desidrogenase ec: 1.1.1.4] isocitrato desidrogenase (NAD+) (NADP+) ec: 1.1.1.42 isocitrato desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.140 sorbitol-6-fosfato 2- ec: 1.1.1.54 alil-álcoo] desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.55 lactaldeído redutase (NADPH) ec: 1.1.1.142 D-pinitol desidrogenase ec: 1.1.1.56 ribitol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.143 sequoiitol desidrogenase ec: 1.1.1.59 3-hidroxipropionato ec: 1.1.1.144 perilil-álcool desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.156 glicerol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.60 2-hidróxi-3-oxopropionato (NADP+) redutase ec: 1.1.1.157 3-hidroxibutiril-CoA ec: 1.1.1.61 4-hidroxibutirato desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.66 omega-hidroxidocanoato ec: 1.1.1.163 ciclopentano] desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.164 hexadecanol desidrogenase ec: 1.1.1.67 manitol 2-desidrogenase ec: 1.1.1.165 2-alquin-1-o0l desidrogenase ec: 1.1.1.71 álcool desidrogenase [NAD(P)+] ec: 1.1.1.166 hidroxiciclohexanocarboxilato ec: 1.1.1.72 glicerol desidrogenase (NADP+) desidrogenase ec: 1.1.1.73 octanol desidrogenase ec: 1.1.1.167 hidroximalonato desidrogenase ec: 1.1.1.75 (R)-aminopropano] desidrogenase ec: 1.1.1.174 ciclohexano-1.2-diol ec: 1.1.1.76 (S.S)-butanodiol desidrogenase desidrogenase e 45 ec: 1.1.1.177 gltcerol-3-fosfato 1- ALDEÍDO DESIDROGENASES desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.178 3-hidróxi-2-metilbutiril-CoA ec: 1.2.1.2 formiato desidrogenase desidrogenase ec: 1.2.1.3 aldeído desidrogenase (NAD+) ec: 1.1.1.185 L-glicol desidrogenase ec: 1.2.1.4 aldeído desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.190 indol-3-acetaldeído redutase ec: 1.2.1.5 aldeído desidrogenase (NADH) [NAD(P)*+] ec: 1.1.1.191 indol-3-acetaldeído redutase ec: 1.2.1.7 benzaldeído desidrogenase (NADPH) (NADP+) ec: 1.1.1.192 álcool desidrogenase de cadeia longa = ec: 1.2.1.8 betaína-aldeído desidrogenase ec: 1.1.1.194 coniferil-álcool desidrogenase ec: 1.2.1.9 gliceraldeído-3-fosfato ec: 1.1.1.195 cinamil-álcool desidrogenase desidrogenase (NADP+) ec: 1.1.1.198 (+)-borneol desidrogenase ec: 1.2.1.10 acetaldeído desidrogenase ec: 1.1.1.202 1.3-propanodio! desidrogenase (acetilação) ec: 1.1.1.207 ()-mentol desidrogenase ec: 1.2.1.11 aspartato-semialdeído ec: 1.1.1.208 (+)-neomentol desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.216 farnesol desidrogenase ec: 1.2.1.12 gliceraldeído-3-fosfato ec: 1.1.1.217 benzil-2-metil-hidroxibutirato desidrogenase (fosforilação) desidrogenase ec: 1.2.1.13 gliceraldeído-3-fosfato ec: 1.1.1.222 (R)-4-hidroxifenillactato desidrogenase (NADP+) (fosforilação) desidrogenase ec: 1.2.1.15 malonato-semialdeído ec: 1.1.1.223 isopiperiteno! desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.226 4-hidroxiciclohexanocarboxilato ec; 1.2.1.16 succinato-semialdeído desidrogenase desidrogenase [NAD(P)+] ec: 1.1.1.229 dietil 2-metil-3-oxosuccinato ec: 1.2.1.17 glioxilato desidrogenase redutase (acilação) ec: 1.1.1.237 hidroxifenilpiruvato redutase ec: 1.2.1.18 malonato-semialdeído ec: 1.1.1.244 metanol desidrogenase desidrogenase (acetilação) ec: 1.1.1.245 ciclohexanol desidrogenase ec: 1.2.1.19 aminobutiraldeído ec: 1.1.1.250 D-arabinito] 2-desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.251 galactitol [-fosfato 5- ec: 1.2.1.20 glutarato-semialdeído desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.255 manito] desidrogenase ec: 1.2.1.21 glicolaldeído desidrogenase ec: 1.1.1.256 fluoren-9-ol desidrogenase ec: 1.2.1.22 lactaldeído desidrogenase ec: 1.1.1.257 4- ec: 1.2.1.23 2-oxoaldeído desidrogenase (hidroximetil)benzenossulfonato desidrogenase (NAD+) ec: 1.1.1.258 6-hidroxihexanoato ec: 1.2.1.24 succinato-semialdeído desidrogenase desidrogenase ec: 1.1.1.259 3-hidroxipimeloil-CoA ec: 1.2.1.25 2-oxoisovalerato desidrogenase desidrogenase (acilação) ec: 1.1.1.261 glicerol-1-fosfato ec: 1.2.1,26 2.5-dioxovalerato desidrogenase desidrogenase [NAD(P)+] ec: 1.2.1.27 metilmalonato-semialdeído ec: 1.1.1.265 3-metilbutanal redutase desidrogenase (acilação) ec: 1.1.1.283 metilglioxal redutase (dependente ec: 1,2.1.28 benzaldeído desidrogenase de NADPH) (NAD+) ec: 1.1.1.286 isocitrato-homoisocitrato ec: 1.2.1.29 aril-aldeído desidrogenase desidrogenase ec: 1.2.1.30 aril-aldeído desidrogenase ec: 1.1.1.287 D-arabinitol desidrogenase (NADP+) (NADP+) ec: 1.2.1.31 L-aminoadipato-semialdeído butanol desidrogenase desidrogenase ec: 1.2.1.32 aminomuconato-semialdeído desidrogenase ec: 1.2.1.36 retinal desidrogenase ec: 1.2.1.39 fenilacetaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.41 glutamato-5-semialdeído desidrogenase ec: 1.2.1.42 hexadecanal desidrogenase (acilação) ec: 1.2.1.43 formiato desidrogenase (NADP+) ec: 1.2.1.45 4-carbóxi-2-hidroximuconato-6- semialdeído desidrogenase ec: 1.2.1.46 formaldeído desidrogenase
: 46 ec: 1.2.1.47 4-trimetilamôniobutiraldeído desidrogenase ec: 1.2.1.48 aldeído de cadeia longa desidrogenase ec: 1.2.1.49 2-o0xoaldeído desidrogenase (NADP+) ec: 1.2.1.51 piruvato desidrogenase (NADP+) ec: 1.2.1.52 oxoglutarato desidrogenase (NADP+) ec: 1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.57 butanal desidrogenase ec: 1.2.1.58 fenilglioxilato desidrogenase (acilação) ec: 1.2.1.59 gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (NAD(P)+) (fosforilação) ec: 1.2.1.62 4-formilbenzenossulfonato desidrogenase ec: 1.2.1.63 6-oxohexanoato desidrogenase ec: 1.2.1.64 4-hidroxibenzaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.65 salicilaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.66 formaldeído dependente micotiol desidrogenase ec: 1.2.1.67 vanilina desidrogenase ec: 1.2.1.68 coniferil-aldeído desidrogenase ec: 1.2.1.69 fluoroacetaldeído desidrogenase ec: 1.2.1.7] succinilglutamato-semialdeído desidrogenase Outras enzimas e caminhos exemplares são aqui divulgados (ver os Exemplos). Além disso, é entendido que as enzimas podem ser utilizadas para realizar reações para as quais o substrato não é o substrato natural.
Embora a atividade para o substrato não natural possa ser mais baixa do quea do substrato natural, é entendido que tais enzimas podem ser utilizadas, como de ocorrência natural ou modificada usando a evolução direcionada ou evolução adaptativa, como aqui divulgada (ver também os Exemplos). A produção de BDO através de qualquer um dos caminhos aqui divulgados são com base, em parte, na identificação das enzimas apropriadas para a conversão de precursores para BDO.
Várias enzimas específicas para diversas das etapas de reação foram identificadas.
Para aquelas transformações onde as enzimas específicas para os precursores da reação não foram identificadas, os candidatos de enzima foram identificados que são melhor adaptados para catalisar as etapas de reação.
As enzimas a 47 foram mostradas operar em uma ampla faixa de substratos, como debatido abaixo.
Além disso, avanços no campo do engenheiramento de proteína também torna praticável alterar enzimas para atuarem eficientemente sobre os substratos, mesmo se não um substrato natural.
São descritos abaixo diversos — exemplos de enzimas de especificidade ampla de diversas classes adequadas para um caminho de BDO assim como métodos que foram usadas para evoluir enzimas para atuar sobre os substratos não naturais.
Uma classe chave de enzimas nos caminhos de BDO é a das - oxidorredutases que interconvertem cetonas ou aldeídos aos álcoois (1.1.1). —Numerosas enzimas exemplares nesta classe podem operar em uma ampla faixa de substratos.
Uma álcool desidrogenase (1.1.1.1) purificada da bactéria do solo Brevibacterium sp KU 1309 (Hirano et al., J.
Biosc.
Bioeng. 100: 318-322 (2005)) foi mostrada operar em uma pletora de alcoóis alifáticos assim como aromáticos com altas atividades.
A Tabela 2 mostra a atividade daenzimae o seu K,, em alcoóis diferentes.
A enzima é reversível e tem também atividade muito alta em diversos aldeídos (Tabela 3). Tabela 2. Atividades relativas de uma álcool desidrogenase de Brevibacterium sp KU para oxidar vários álcoois.
Atividade Relativa (0 %) 0,025 (S)-2-Fenilpropanol R)-2-Fenilpropanol 0,033 EEE an a A EE E oO Ea Seas EO SNS SES REL EEE EGP o A ME A na E agoetemel IO aaa OO OO A EE EDOGeeaRol o E LOS E RR RECTA [E T-Fenifetanol si ss EO 2-bropana o A Di iara * A atividade de 2-feniletanol, correspondente a 19,2 U/mg, foi tomada como 100%. Tabela 3. Atividades relativas de uma álcool desidrogenase de Brevibacterium —spKU 1309 para reduzir vários compostos de carbonila.
Fenilacetaláeído E tDetilaldeido o o O MA a A E [ Acetofenona Ng E o 48 A lactato desidrogenase (1.1.1.27) de Ralstonia eutropha é uma outra enzima que foi demonstrada ter altas atividades em diversos 2- oxoácidos tais como 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato e 2-oxoglutarato (um composto C5 análogo ao 2-oxoadipato) (Steinbuchel e Schlegel, Eur.
J. —Biochem. 130: 329-334 (1983)). A coluna 2 na Tabela 4 demonstra as atividades de IdhA de R. eutropha (antigamente A. eutrophus) sobre substratos diferentes (Steinbuchel e Schlegel, supra, 1983). Tabela 4. A atividade in vitro de R. eutropha IdhA (Steinbuchel e Schlegel, supra, 1983) sobre substratos diferentes e comparada com aquela sobre o —piruvato. astra vt Atvidadeo)de | L(+)-lactato L(+)-lactato D(-)-lactato desidrogenase de 4. desidrogenase de desidrogenase eutrophus Músculo de coelho de L. leichmanii Pimavato oo o oo [ESORO VASTAS E OI o IRD O | 3-Metil-2-oxobunirato a oxovalerato E ndo e e DO a RD ida | 4-Metil-2-oxopentaneato q aa fosatoassiata Io o SA o esa [a-postutaraio o o IO a a DD eo O Oxidorredutases que podem converter 2-0xoácidos nas suas contrapartes de acil-CoA (1.2.1) forma mostradas aceitar também substratos múltiplos.
Por exemplo, complexo de 2-ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada (BCKAD), também conhecido como 2-oxoisovalerato desidrogenase (1.2.1.25), participa nos caminhos da degradação de aminoácido de cadeia ramificada, convertendo derivados de 2-ceto ácidos de valina, leucina e isoleucina nos seus derivados de acil-CoA e CO,. Em alguns organismos incluindo Rattus norvegicus (Paxton et al., Biochem.
J. 234: 295- 303 (1986)) e Saccharomyces cerevisiae (Sinclair et al., Biochem.
Mol Biol.
Int 32:911-922 (1993), este complexo foi mostrado ter uma ampla faixa de substrato que inclui oxo-ácidos lineares tais como 2-oxobutanoato e alfa- cetoglutarato, além dos precursores de aminoácido de cadeia ramificada.
: a 49
Membros de uma outra classe até agora de enzimas, a saber as aminotransferases (2.6.1), foram relatados atuar sobre substratos múltiplos.
À aspartato aminotransferase (aspAT) de Pirococcus fursious foi identificada, expressada na E. coli e a proteína recombinante caracterizada para demonstrar queacenzimatem as atividades mais altas para aspartato e alfa-cetoglutarato mas atividades mais baixas, embora significantes para alanina, glutamato e os aminoácidos aromáticos (Ward et al., Archaea 133-141 (2002)). Em um outro caso, uma aminotransferase identificada de Leishmania mexicana €& expressada na E. coli (Vernal et al., FEMS Microbiol.
Lett. 229: 217-222 (2003)) foi relatada ter uma ampla especificidade de substrato para a tirosina (atividade considerada 100% na tirosina), fenilalanina (90%), triptofano (85%), aspartato (30%), leucina (25%) e metionina (25%), respectivamente (Vernal et al., Mol.
Biochem.
Parasitol 96: 83-92 (1998)). Especificidade ampla similar foi relatada para uma tirosina aminotransferase de Trypanosoma cruzi, embora ambas destas enzimas tenham uma homologia de sequência de apenas 6%. A última enzima pode aceitar leucina, metionina assim como tirosina, fenilalanina, triptofano e alanina como doadores de amino eficientes (Nowicki et al., Biochim.
Biophys.
Acta 1546: 268-281
(2001). As-CoA transferases (2.8.3) foram demonstradas ter a capacidade para atuar sobre mais do que um substrato.
Especificamente, uma- CoA transferase foi purificada a partir de Clostridium acetobutilicum e foi relatada ter as atividades mais altas sobre acetato, propionato, e butirato.
À mesma também teve atividades significantes com valerato, isobutirato, e — crotonato (Wiesenbom et al., Appl.
Environ.
Microbiol. 55: 323-329 (1989)). Em um outro estudo, a enzima de E. coli acil-CoA: acetato-CoA transferase, também conhecida como acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.8), foi mostrada transferir a porção-CoA para acetato a partir de uma variedade de substratos de acil-CoA ramificados e lineares, incluindo isobutirato (Matthies e Schink,
E so App.
Environm.
Microbiol. 58: 1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel er al., Biochem.
Biophys.
Res Commun. 33: 902-908 (1968b)) e butanoato (Vanderwinkel et al., Biochem.
Biophys.
Res Commun. 33: 902-908 (1968a). Outras classes de enzima adicionalmente sustentam S — especificidade de substrato ampla para as enzimas.
Algumas isomerases (5.3.3) também provaram operar sobre substratos múltiplos.
Por exemplo, a L-ramnose isomerase de Pseudomonas stutzeri catalisa a isomerização entre várias aldolases e cetoses (Yoshida er al., J.
Mol.
Biol. 365: 1505-1516 (2007)). Estas incluem a isomerização entre L-ramnose e L-ramnulose, L- 10 manose e L-frutose, L-xilose e L-xilulose, D-ribose e D-ribulose, e D-alose e D-psicose.
Ainda em uma outra classe de enzimas, as fosfotransferases (2.7.1), a homosserina cinase (2.7.1.39) da E. coli que converte L- homosserina em fosfato de L-homosserina, foi descoberta fosforilar 15 numerosos análogos de homosserina.
Nestes substratos, o grupo funcional carboxila na posição R foi substituído por um éster ou por um grupo hidroximetila (Huo e Viola, Biochemistry 35: 16180-16185 (1996)). A Tabela demonstra a ampla especificidade de substrato desta cinase.
Tabela 5. A especicidade de substrato da homosserina cinase. |L2-amino-S-hidroxivalerato — >| 2504 | 99 | 11305 | 23+03 | [Ester Lhomosserinametilico — — | 14726 | 8 | 49220 | 3006 | Uma outra classe de enzimas úteis nos caminhos de BDO é a ácido-tiol ligase (6.2.1). Semelhante às enzimas em outras classes, certas enzimas nesta classe foram determinadas ter ampla especificidade de substrato.
Por exemplo, acil-CoA ligase de Pseudomonas putida foi o s1 demonstrada funcionar em vários substratos alifáticos incluindo os ácidos acético, propiônico, butírico, valérico, hexanóico, heptanóico, e octanóico e nos compostos aromáticos tais como os ácidos fenilacéticos e fenoxiacéticos (Fernandez-Valverde et al., Appl.
Environ.
Microbiol. 59: 1149-1154 (1993)). Uma enzima relacionada, a malonil-CoA sintetase (6,3,4,9) de Rhizobium | í trifolii pode converter diversos diácidos, a saber, etil-, propil-, alil-, isopropil-, dimetil-, ciclopropil-, ciclopropilmetileno-, ciclobutil-, e benzil-malonato em seus monotioésteres correspondentes (Pohl et al., J.
Am.
Chem.
Soc. 123: : 5822-5823 (2001)). Similarmente, as descarboxilases (4.1.1) também foram “10 descobertas com amplas faixas de substrato.
Piruvato descarboxilase (PDC), t também chamada de ceto-ácido descarboxilase, é uma enzima chave na - ? fermentação alcoólica, que catalisa a descarboxilação de piruvato para S acetaldeído.
A enzima isolada de Saccharomyces cerevisiae tem uma ampla 5 faixa de substrato para os 2-ceto ácidos alifáticos incluindo 2-cetobutirato, 2- —cetovalerato, e 2-fenilpiruvato (Li e Jordan, Biochemistry 38: 10004-10012 (1999)). Similarmente, benzoilformiato descarboxilase tem uma ampla faixa de substrato e foi o alvo de estudos de engenheiramento de enzima.
A enzima de Pseudomonas putida foi extensivamente estudada e estruturas cristalinas desta enzima são disponíveis (Polovnikova et al., Biochemistry 42: 1820- 1830 (2003); Hasson et al., Biochemistry 37: 9918-9930 (1998)). A alfa- cetoácido descarboxilase de cadeia ramificada (BCKA) foi mostrada atuar sobre uma variedade de compostos que variam no comprimento de cadeia de 3 a 6 carbonos (Oku e Kaneda, J.
Biol.
Chem. 263: 18386-18396 (1998); Smit et al., Appl.
Environ.
Microbiol. 71: 303-311 (2005)). A enzima em —Lactococcus lactis foi caracterizada em uma variedade de substratos ramificados e lineares incluindo 2-oxobutanoato, 2-oxohexanoato, 2- oxopentanoato, —3-metil-2-oxobutanoato, 4-metil-2- - oxobutanoato — e isocaproato (Smit et al., Appl.
Environ.
Microbiol. 71: 303-311 (2005). De maneira interessante, as enzimas conhecidas ter uma
: ' 52 atividade dominante também foi relatada catalisar uma função muito diferente. Por exemplo, a fosfoglicerato mutase dependente de co-fator (5.4.2.1) de Bacillus stearothermophilus e Bacillus subtilis é conhecida funcionar também como uma fosfatase (Rigden et al., Protein Sci. 10: 1835- S —1846(2001)) A enzima de B. stearothermophilus é conhecida ter atividade sobre diversos substratos, incluindo 3-fosfoglicerato, alfa-naftilfosfato, p- nitrofenilfosfato, AMP, frutose-6-fosfato, ribose-5-fosfato e CMP. Ao contrário a estes exemplos onde as enzimas naturalmente À têm amplas especificidades de substrato, numerosas enzimas foram modificadas usando a evolução direcionada para ampliar a sua especificidade x para os seus substratos não naturais. Alternativamente, a preferência de S é substrato de uma enzima também foi mudada usando a evolução direcionada. E Portanto, é praticável engendrar uma dada enzima quanto a função eficiente - sobre um substrato natural, por exemplo, eficiência melhorada, ou um não natural, por exemplo, eficiência aumentada. Por exemplo, foi relatado que a enantiosseletividade de uma lipase de Pseudomonas aeruginosa foi significantemente melhorada (Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Ed Engl. 36: 2830-2832 (1997)). Esta enzima hidrolisou o 2-metildecanoato de p- nitrofenila com apenas 2% de excesso enantiomérico (ee) em favor do (S)- ácido. Entretanto, depois de quatro rodadas sucessivas de mutagênese propensa a erro e triagem, uma variante foi produzida que catalisou a reação requerida com 81% ee (Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Ed Engl. 36: 2830- 2832 (1997)).
Os métodos de evolução direcionada foram usados para —modificar uma enzima para funcionar em um arranjo de substratos não naturais. A especificidade de substrato da lipase em P. aeruginosa foi ampliada pela randomização de resíduos de aminoácido próximos ao sítioo ativo. Isto permitiu a aceitação de ésteres do ácido carboxílico alfa-substituído por esta enzima (Reetz et al., Agnew. Chem. Int. Ed Engl. 44: 4192-4196
Doo s3 (2005)). Em uma outra modificação bem sucedida de uma enzima, o embaralhamento de DNA foi utilizado para criar uma aminotransferase de Escherichia coli que aceitou substratos B-ramificados, que foram deficientemente aceitos pela enzima do tipo selvagem (Yano et al., Proc.
Nat. — Acad.
Sci.
U.S.A.95: 5S11-5515 (1998)). Especificamente, no final de quatro rondadas de embaralhamento, a atividade da aspartato aminotransferase para valina e 2-oxovalina aumentou em até cinco ordens de magnitude, enquanto diminuindo a atividade para o substrato natural, aspartato, em até 30 vezes.
Recentemente, um algoritmo foi usado para planejar uma retro-aldolase que À 10 seria usada para catalisar a clivagem da ligação carbono-carbono em um ” substrato não natural e não biológico, 4-hidróxi-4-(6-metóxi-2-naftil)-2- * . butanona (Jiang et al., Science 319: 1387-1391 (2008)). Estes algoritmos S usaram combinações diferentes de quatro motivos catalíticos diferente para é planejar nova enzima, e 20 dos planejamentos selecionados para a caracterização experimental tiveram taxas de melhora de quatro vezes em relação à reação não catalisada (Jiang et al., Science 319: 1387-1391 (2008)). Assim, não apenas são estes métodos de engenheiramento capazes de expandir o arranjo de substratos sobre os quais uma enzima pode atuar, mas eles permitem o planejamento e construção de enzimas muito eficientes.
Por exemplo, um método de embaralhamento de DNA (quimeragênese aleatória sobre padrões transitórios ou RACHITT) foi relatado levar a uma monooxigenase engendrada que teve uma taxa melhorada de dessulfurização sobre substratos complexos assim como conversão 20 vezes mais rápida de um substrato não natural (Coco et al., Nat.
Biotechnol. 19: 354-359 (2001)). — Similarmente, a atividade específica de uma enzima de triosefosfato isomerase mutante lenta foi melhorada em até 19 vezes de 1,3 vezes (Hermes et al., Proc.
Nat.
Acad.
Sci.
U.S.A. 87: 696-700 1990)). Este realce na atividade específica foi realizada pelo uso da mutagênese aleatória no comprimento inteiro da proteína e a melhora pôde ser rastreada de volta para
; É 54 mutações em seis resíduos de aminoácido.
A eficácia dos métodos de engenheiramento de proteína para alterar a especificidade de substrato de uma enzima para um substrato desejado também foi demonstrada em diversos estudos. A isopropilmalato — desidrogenase de Therms thermophilus foi modificada pela mudança de. resíduos próximos ao sítio ativo de modo que a mesma pudesse agora atuar sobre o malato e D-lactato como substratos (Fujita er al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 2695-2700 (2001)). Neste estudo assim como em outros, foi : salientado que um ou uns poucos resíduos podem ser modificados para alterar aespecificidade de substrato. Por exemplo, a dihidroflavonol 4-redutase para . a qual um único aminoácido foi mudado na região de ligação de substrato - r presumida preferencialmente reduziria dihidrocaempferol (Johnson et al., & Plant. J. 25: 325-333 (2001)). A especificidade de substrato de uma isocitrato í desidrogenase muito específica de Escherichia coli foi mudada de isocitrato para isopropilmalato pela troca de um resíduo no sítio ativo (Doyle er al., Biochemistry 40: 4234-4241 (2001)). Similarmente, a especificidade de cofator de uma 1,5-hidroxiprostaglandina desidrogenase dependente de NAD* foi alterada para NADP* pela mudança de uns poucos resíduos próximos da extremidade de terminal N (Cho et al., Arch. Biochem. Biophys. 419: 139- 146 (2003)) A análise de sequência e a análise de modelagem molecular foram usadas para identificar os resíduos chave para a modificação, que foram ainda estudados pela mutagênese direcionada ao sítio.
Numerosos exemplos existem que transpõem diversas classes de enzimas onde a função da enzima foi mudada para favorecer um substrato —não natural em relação ao substrato natural da enzima. Uma fucosidase foi evoluída a partir de uma galactosidase na E. coli pelo embaralhamento de : DNA e triagem (Zhang et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 94: 4504-4509 (1997)). Similarmente, a aspartato aminotransferase da E. coli foi convertida em uma tirosina aminotransferase usando a modelagem de homologia e
: t 55 mutagênese direcionada ao sítio (Onuffer e Kirsch Protein Sci., 4: 1750-1757 (1995)). A mutagênese direcionada ao sítio de dois resíduos no sítio ativo da benzoilformiato descarboxilase de P. putida relacionadamente alterou a afinidade (Km) para substratos naturais e não naturais (Siegert er al., Protein Eng Des Sel 18: 345-357 (2005)). A citocromo c peroxidase (CCP) de Sicofiaronates cerevisiae foi submetida à evolução molecular direcionada para gerar mutantes com atividade aumentada contra o substrato de peroxidase clássica guaiacol, mudando assim a especificidade de substrato de É CCP da proteína citocromo c a uma molécula orgânica pequena. Depois de trêsrodadas de embaralhamento de DNA e triagem, mutantes foram isolados ” que possuíram uma atividade aumentada em 300 vezes contra guaiacol e S Ê. especificidade aumentada em até 1000 vezes para este substrato em relação . àquela para o substrato natural (Iffland et al., Biochemistry 39: 10790-10798 (2000)).
Em alguns casos, as enzimas com preferências de substrato diferentes do que cada uma das enzimas precursoras foram obtidas. Por exemplo, a degradação mediada pela bifenil-dioxigenase de bifenilas policloradas foi melhorada pelo embaralhamento de genes de duas bactérias, Pseudomonas pseudoalcaligens e Burkholderia cepacia (Kumamaru et al., Nat. Biotechnol. 16: 663-666 (1998)). As bifenil oxigenases quiméricas resultantes mostraram. preferências de substrato diferentes do que ambas as enzimas precursoras e realçaram a atividade de degradação para os compostos de bifenila relacionados e hidrocarbonetos de anel aromático único tais como tolueno e benzeno que foram originalmente substratos pobres para a enzima.
Além de mudar a especificidade da enzima, também é possível realçar as atividades sobre os substratos para os quais as enzimas naturalmente têm atividades baixas. Um estudo demonstrou que a aminoácido racemase de P. putida que teve especificidade de substrato ampla (sobre lisina, arginina, alanina, serina, metionina, cisteína, leucina e histidina entre
À: 56 outros) mas atividade baixa para triptofano pôde ser significantemente melhorada pela mutagênese aleatória (Kino et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 73: 1299-1305 (2007)). Similarmente, o sítio ativo do BCKAD bovino foi engendrado para favorecer substrato alternativo de acetil-CoA (Meng e Chuang, Biochemistry 33: 12879-12885 (1994)). Um aspecto interessante destes métodos é que mesmo se métodos aleatórios foram aplicados para gerar estas enzimas mutadas com atividades eficazes, as mutações exatas ou mudanças estruturais que conferem a melhora na Ê atividade podem ser identificadas. Por exemplo, no estudo anteriormente mencionado, as mutações que facilitaram a atividade melhorada sobre o * triptofano foi rastreada de volta para duas posições diferentes.
- f A evolução direcionada também foi usada para expressar proteínas que são difíceis de expressar. Por exemplo, submetendo-se a peroxidase de rábano à mutagênese aleatória e recombinação de gene, mutantes foram identificados que tiveram atividade mais do que 14 vezes mais alta do que o tipo selvagem (Lin et al., Biotechnol. Prog. 15: 467-471 (1999)). Um outro exemplo de evolução direcionada mostra as modificações extensivas às quais uma enzima pode ser submetida para se obter uma faixa de funções desejadas. A enzima lactato desidrogenase de Bacillus stearothermophilus foi submetida à mutagênese direcionada ao sítio, e três substituições de aminoácido foram feitas em sítios que foram acreditados determinar a especificidade para hidroxiácidos diferentes (Clarke et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 148: 15-23 (1987)). Depois destas —mutações, a especificidade para oxaloacetato em relação ao piruvato foi aumentada para 500 ao contrário da enzima tipo selvagem que teve uma especificidade catalítica para piruvato em relação ao oxaloacetato de 1000. Esta enzima foi engendrada ainda usando a mutagênese direcionada ao sítio para ter atividade para piruvatos substituídos de cadeia ramificada (Wilks et
MA 57 al., Biochemistry 29: 8587-8591 (1990)). Especificamente, a enzima teve uma melhora de 55 vezes em Kra para a alfa-cetoisocaproato. Três modificações estruturais foram feitas na mesma enzima para mudar a sua especificidade de substrato de lactato para malato. À enzima foi altamente ativa e específica — paramalato(Wilks er al., Science 242: 1541-1544 (1988)). A mesma enzima de B. stearothermophilus foi subseqilentemente engendrada para ter alta atividade catalítica para os alfa-ceto ácidos com cadeias laterais positivamente carregadas, tais como aquelas contendo grupos amônio (Hogan et al., . Biochemistry 34: 4225-4230 (1995)). Mutantes com aminoácidos ácidos introduzidos na posição 102 da enzima favoreceram a ligação de tais grupos x amônio de cadeia lateral. Os resultados obtidos provaram que os mutantes - apresentaram melhoras de até 25 vezes nos valores de K.W/Km para os - substratos de omega-amino-alfa-ceto ácido. De maneira interessante, esta enzima também foi estruturalmente modificada para funcionar como uma —fenillactato desidrogenase ao invés de uma lactato desidrogenase (Wilks er al., Biochemistry 31: 7802-7806 1992). Sítios de restrição foram introduzidos no gene para a enzima que permitiu que uma região do gene fosse excisada. Esta região codificou uma alça de superfície móvel do polipeptídeo (resíduos 98 a 110) que normalmente sela o sítio ativo do solvente volumoso e é um determinante principal da especificidade de substrato. O comprimento variável e as alças de sequência foram inseridas de modo que as hidroxiácido desidrogenases com especificidades de substrato alteradas fossem geradas. Com uma construção de alça mais longa, a atividade com piruvato foi reduzida um milhão de vezes mas a atividade com fenilpiruvato foi amplamente inalterada. Uma comutação na especificidade (Kk.a/Km) de
390.000 vezes foi obtida. A seletividade 1700:1 desta enzima para fenilpiruvato em relação ao piruvato é aquela requerida em uma fenillactato desidrogenase. Os estudos descritos acima indicam que vários métodos de engenheiramento de enzima podem ser usados para se obter enzimas para os
A 58 caminhos de BDO como aqui divulgado.
Como aqui divulgado, caminhos biossintéticos para 1,4- butanodiol a partir de vários intermediários metabólicos centrais podem ser utilizados, incluindo acetil-CoA, succinil-CoA, alfa-cetoglutarato, glutamato, —4-aminobutirato, e homosserina. Acetil-CoA, succinil-COoA e alfa cetoglutarato são intermediários comuns do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), uma série de reações que está presente em sua inteireza em quase todas as células vivas que utilizam oxigênio para a respiração celular e está É presente nas formas truncadas em vários organismos anaeróbicos. Glutamato é um aminoácido que é derivado de alfa-cetoglutarato via glutamato Tm desidrogenase ou qualquer uma de várias reações de transaminação (ver a - Figura 8B). O 4-aminobutirato pode ser formado pela descarboxilação de . glutamato (ver a Figura 8B) ou a partir da acetoacetil-CoA via o caminho À divulgado na Figura 9C. A acetoacetil-CoA é derivada da condensação de duas moléculas de acetil-CoA por via da enzima, acetil-coenzima A acetiltransferase, ou equivalentemente, acetoacetil-coenzima A tiolase. À homosserina é um intermediário no metabolismo de treonina e metionina, formados a partir de oxaloacetato via aspartato. À conversão de oxaloacetato para homosserina requer um NADH, dois NADPH, e um ATP. Caminhos outros que não aqueles exemplificados acima também podem ser utilizados para gerar a biossíntese de BDO em organismos s microbianos que não ocorrem naturalmente. Em uma forma de realização, a biossíntese pode ser obtida usando uma L-homosserina para o caminho de BDO (ver a Figura 13). Este caminho tem um rendimento molar de 0,90 —molmol de glicose, que parece restringido pela disponibilidade de equivalentes redutores. Um segundo caminho sintetiza BDO a partir de acetoacetil-CoA (acetoacetato) e é capaz de obter o rendimento teórico máximo de 1,091 mol/mol de glicose (ver a Figura 9). A implementação de cada caminho pode ser obtida pela introdução de duas enzimas exógenas em
MA 59 um organismo hospedeiro, tal como E. coli, e ambos os caminhos podem adicionalmente complementar a produção de BDO via succinil-CoA. As enzimas do caminho, as termodinâmicas, rendimento teóricos e praticabilidade global são descritos mais abaixo.
Ss Um caminho da homosserina também pode ser engendrado para gerar organismos microbianos que produzem BDO. A homosserina é um intermediário no metabolismo da treonina e metionina, formado a partir de oxaloacetato via aspartato. À conversão de oxaloacetato para homosserina É requer um NADH, dois NADPH, e um ATP. Uma vez formados, a —homosserina sustenta nos caminhos biossintéticos tanto para treonina quanto * para metionina. Na maioria dos organismos, altos níveis de treonina ou - f metionina retroalimentam-se para reprimir o caminho da biossíntese de é homosserina (Caspi et al., Nucleic Acids Res. 34: D511-DS516 (1990)).
A transformação de homosserina para 4-hidroxibutirato (4- HB) pode ser realizado em duas etapas enzimáticas como aqui descrito (ver a Figura 13). A primeira etapa deste caminho é a desaminação de homosserina por uma amônia liase putativa. Na etapa 2, o produto de alceno, 4-hidroxibut- 2-enoato é reduzido para 4-HB por uma redutase putativa no custo de um NADH. 4-HB pode então ser convertido para BDO.
Enzimas disponíveis para catalisar as transformações acima . são aqui divulgadas. Por exemplo, a amônia liase na etapa 1 do caminho e intimamente se parece com a química de aspartato amônia-liase (aspartase). À aspartase é uma enzima amplamente disseminada em microorganismos, e foi caracterizada extensivamente (Viola, R. E., Mol. Biol. 74: 295-341 (2008)). À — estrutura cristalina da E. coli aspartase foi resolvida (Shi er al., Biochemistry 36: 9136-9144 (1997)), assim é portanto possível engendrar diretamente mutações no sítio ativo da enzima que alteraria a sua especificidade de substrato para incluir homosserina. A oxidorredutase na etapa 2 tem química similar às diversas enzimas bem caracterizadas incluindo a fumarato redutase
É . 60 no ciclo TCA da E. coli. Visto que as termodinâmicas desta reação são altamente favoráveis, uma redutase endógena com ampla especificidade de substrato provavelmente será capaz de reduzir 4-hidroxibut-2-enoato. O rendimento deste caminho sob condições anaeróbicas é de 0,9 mol de BDO —pormolde glicose.
O caminho da succinil-CoA foi descoberto ter um rendimento mais alto devido ao fato de que o mesmo é mais energeticamente eficiente. À conversão de uma molécula de oxaloacetato para BDO via o caminho da homosserina requerirá o gasto de 2 equivalentes de ATP. Porque a conversão de glicose para duas moléculas de oxaloacetato pode gerar um máximo de 3 moléculas de ATP assumindo que a PEP carboxicinase seja reversível, a - , conversão global de glicose para BDO via homosserina tem um rendimento enérgetico. Como esperados, se é assumido que a energia pode ser gerada via S respiração, o rendimento máximo do caminho da homosserina aumenta para 1,05 mol/mol de glicose que é 96% do caminho do rendimento da succinil- CoA. O caminho da succinil-CoA pode catalisar um pouco do fluxo de carbono através da piruvato desidrogenase e o ramo oxidativo do ciclo de TCA para gerar tanto equivalentes de redução quanto succinil-CoA sem um gasto energético. Assim, o mesmo não encontra as mesmas dificuldades energéticas como o caminho da homosserina porque nem todo do fluxo é " canalizado através da oxaloacetato para succinil-CoA para BDO. No geral, o : caminho da homosserina demonstra uma via de alto rendimento para BDO. Um caminho da acetoacetil-CoA (acetoacetato) também pode ser engendrado para gerar organismos microbianos que produzem BDO. À — acetoacetil-CoA (acetoacetato) pode ser formada a partir da acetil-CoA pelas enzimas envolvidas no metabolismo do ácido graxo, incluindo acetil-CoA acetiltransferase e acetoacetil-CoA transferase. As vias biossintéticas através de acetoacetato também são particularmente úteis em organismos microbianos que podem metabolizar compostos de carbono único tal como monóxido de t Í 61 carbono, dióxido de carbono ou metanol para formar acetil-CoA.
Uma via de três etapas de acetoacetil-CoA (acetoacetato) para 4-aminobutirato (ver a Figura 9C) pode ser usada para sintetizar BDO através da acetoacetil-CoA (acetoacetato). A 4-aminobutirato pode ser convertida ao semialdeído succínico como mostrado na Figura 8B. O semialdeído succínico, que é uma etapa de redução removida da succinil-COA ou uma etapa de descarboxilação removida de a-cetoglutarato, pode ser convertida ao BDO seguindo três etapas de redução (Figura 1). Em resumo, a etapa 1 deste caminho envolve a conversão de acetoacetil-CoA para acetoacetato, por exemplo, pela acetoacetil-CoA transferase de E. coli codificada pelos genes f atoA e atoD (Hanai et al., Appl. Environ. Microbiol. 73: 7814-7818 (2007)). . . A etapa 2 do biocaminho da acetoacetil-CoA acarreta necessariamente a conversão de acetoacetato para 3-aminobutancoato por uma co- aminotransferase. A co-aminoácido: piruvato aminotransferase (co-APT) de Alcaligens denitrificans foi superexpressada na E. coli e mostrada ter uma alta atividade para 3-aminobutanoato in vitro (Yun et al, Appl. Environ.
Microbiol. 70: 2529-2534 (2004)).
Na etapa 3, uma aminomutase putativa muda o grupo amina da posição 3 para a 4 da cadeia carbônica principal. Uma aminomutase que realiza esta função no 3-aminobutanoato não foi caracterizada, mas uma : enzima de Clostridium sticklandii tem um mecanismo muito similar. À . enzima, D-lisina-5,6-aminomutase, está envolvida na biossíntese de lisina.
A via sintética para BDO a partir da acetoacetil-CoA (acetoacetato) passa através do 4-aminobutanoato, um metabólito na E. coli — que é normalmente formado a partir da descarboxilação de glutamato. Uma vez formado, o 4-aminobutanoato pode ser convertido ao semialdeído succínico pela 4-aminobutanoato transaminase (2.6.1.19), uma enzima que foi bioquimicamente caracterizada.
Uma consideração para selecionar enzimas candidatas neste
Et 62 caminho é a estereosseletividade das enzimas envolvidas nas etapas 263. À mw-ABT em Alcaligens denitrificans é específico para o estereoisômero L do 3-aminobutanoato, enquanto a D-lisina-5,6-aminomutase provavelmente requer o D-estereoisômero. Se enzimas com estereosseletividade — complementar não são inicialmente encontradas ou engendradas, uma terceira enzima pode ser adicionada ao caminho com atividade de racemase que pode converter L-3-aminobutanoato para D-3-aminobutanoato. Enquanto as racemases de aminoácido são amplamente difundidas, se estas enzimas : podem funcionar em co-aminoácidos não é conhecido.
O rendimento molar teórico máximo deste caminho sob , condições anaeróbicas é 1,091 mol/mol de glicose. De modo a gerar fluxo a ” r partir da acetoacetil-CoA (acetoacetato) para BDO foi assumido que a acetil- CoA:acetoacetil-CoA transferase é reversível. A função desta enzima na E.
: : coli é metabolizar ácidos graxos de cadeia curta primeiro convertendo-a em tioésteres.
Embora a operação da acetil-CoA:acetoacetil-CoA transferase na direção que consome acetato não foi demonstrado experimentalmente na E. coli, estudos sobre enzimas similares em outros organismos sustentam a suposição de que este reação é reversível. A enzima butiril-CoA:acetato:CoA transferase em micróbios intestinais Roseburia sp. e F. prasnitzii opera na - direção que utiliza acetato para produzir butirato (Duncan er al., Appl.
; Environ. Microbiol 68: 5186-5190 (2002)). Uma outra enzima muito similar, a acetil:succinato-CoA-transferase em Trypanosoma brucei, também opera na direção que utiliza acetato. Esta reação tem um ArÃG próxima ao equilíbrio, — concentrações tão altas de acetato pode provavelmente direcionar a reação na direção de interesse. Na razão de produção de BDO teórica máxima de 1,09 mol/mol simulações de glicose prognosticam que a E. coli pode gerar 1,098 mol de ATP por mol de glicose sem nenhum dos subprodutos de fermentação.
Esta produção de ATP deve ser suficiente para o crescimento, manutenção, e i f 63 À produção celulares. O biocaminho da acetoacetil-CoA (acetoacetato) é uma via de alto rendimento para BDO a partir da acetil-CoA.
Portanto, além de qualquer uma das várias modificações anteriormente exemplificadas para o estabelecimento da biossíntese de 4-HB em um hospedeiro selecionado, os organismos microbianos que produzem BDO podem incluir qualquer uma das combinações e permutações anteriores das modificações metabólicas do caminho de 4-HB assim como qualquer combinação da expressão para a aldeído desidrogenase independente de - CoA, aldeído desidrogenase dependente de -CoA ou uma álcool : 10 —desidrogenase ou outras enzimas aqui divulgadas para gerar caminhos - biossintéticos para GBL e/ou BDO. Portanto, os produtores de BDO da í invenção podem ter expressão exógena, por exemplo, de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou até todas as enzimas correspondentes a Í qualquer uma das enzimas do caminho de 4-HB e/ou qualquer uma do —caminhodeBDO aqui divulgadas.
O planejamento e a construção dos organismos microbianos geneticamente modificados são realizados usando métodos bem conhecidos na técnica para se obter quantidades suficientes de expressão para produzir BDO. Em particular, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção podem obter a biossíntese de BDO que resulta em - concentrações intracelulares entre cerca de 0,1 e 200mM ou mais, tal como de ; cerca de 0,1 a 25mM ou mais, como debatido acima. Por exemplo, a concentração intracelular de BDO está entre cerca de 3 e 20mM, particularmente entre cerca de 5 e 15mMM e mais particularmente entre cerca de 8 e l2mM, incluindo cerca de 10OMM ou mais. As concentrações intracelulares entre e acima de cada uma destas faixas exemplares também podem ser obtidas a partir dos organismos microbianos que não ocorrem naturalmente da invenção. Como com os produtores de 4-HB, os produtores de BDO também podem ser sustentados, cultivados ou fermentados sob
SE 64 condições anaeróbicas.
A invenção fornece ainda um método para a produção de 4- HB.
O método inclui cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho biossintético do ácido 4-hidroxibutanóico (4- —HB) que compreende pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato — desidrogenase, semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, glutamato: semialdeído succínico . transaminase, a-cetoglutarato descarboxilase, ou glutamato descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de ú tempo para produzir o ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) monomérico.
O - : método pode adicionalmente incluir a conversão química de 4-HB para GBL S e para BDO ou THF, por exemplo. : Adicionalmente é fornecido um método para a produção de 4- HB. o método inclui cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho biossintético do ácido 4-hidroxibutanóico (4- HB) incluindo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica 4- hidroxibutanoato — desidrogenase, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase — succínica dependente “de -CoA ou a-cetoglutarato —descarboxilase sob condições substancialmente anaeróbicas por um período * suficiente de tempo para produzir ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) : monomérico.
O produto de 4-HB pode ser secretado no meio de cultura.
É fornecido ainda um método para a produção de BDO.
O método inclui cultivar um Dbiocatalisador microbiano que não ocorre — naturalmente, que compreende um organismo microbiano tendo caminhos biossintéticos do ácido 4-hidroxibutanóico (4-HB) e 1,4-butanodiol (BDO), os caminhos incluindo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica a 4- hidroxibutanoato — desidrogenase, succinil-COA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, 4-hidróxi-butirato:CoA os 65 É transferase, —4-hidroxibutirato —cinase, fosfotranshidróxi-butirilase, a- cetoglutarato descarboxilase, aldeído desidrogenase, álcool desidrogenase ou um aldeído/álcool desidrogenase por um período suficiente de tempo para produzir 1,4-butanodiol (BDO). O produto de BDO pode ser secretado no S —meiodecultura.
Adicionalmente são fornecidos métodos para produzir BDO cultivando-se um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO da invenção. O caminho de BDO pode compreender pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho “10 deBDO expressado em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob F condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o À : caminho de BDO compreendendo 4-aminobutirato-CoA transferase, 4- aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril-CoA É oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutiril-COA transaminase, ou 4- —hidroxibutiril-CoA desidrogenase (ver Exemplo VII e Tabela 17).
Alternativamente, o caminho de BDO pode compreender pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo 4-aminobutirato-CoA transferase, 4- . aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4-aminobutiril-CoA redutase, 4-aminobutan-1-ol í desidrogenase, 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutan-1-ol transaminase (ver Exemplo VII e Tabela 18).
Além disso a invenção fornece um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob a 66 condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo 4-aminobutirato —cinase, 4- aminobutiraldeído — desidrogenase — (fosforilação), 4-aminobutan-l-ol desidrogenase, —4-aminobutan-l1-ol — oxidorredutase (desaminação), — 4- —aminobutan-l-ol transaminase, ácido [(4-aminobutanolil)óxilfosfônico s oxidorredutase — (desaminação), ácido [(4-aminobutanolil)óxilfosfônico transaminase, — 4-hidroxibutiril-fosfato — desidrogenase, ou 4-hidróxi- butiraldeído desidrogenase (fosforilação) (ver Exemplo VII e Tabela 19). Á A invenção fornece ainda um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente É tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido - nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada . em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um É período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo alfa-cetoglutarato 5-cinase, 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação), ácido 2,5-dioxopentanóico redutase, alfa- cetoglutarato-CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, alfa- cetoglutaril-CoA ligase, alfa-cetoglutaril-CoA redutase, ácido 5-hidróxi-2- oxopentanóico desidrogenase, alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool), ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase, ou ácido 5-hidróxi- : 2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação) (ver Exemplo VII e À Tabela 20).
A invenção adicionalmente fornece um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre — naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo glutamato-CoA transferase, glutamil-CoA
A 67 hidrolase, glutamil-CoA ligase, glutamato 5-cinase, glutamato-5-semialdeído desidrogenase — (fosforilação), — glutamil-CoA * redutase, glutamato-5- semialdeído redutase, glutamil-CoA redutase (que forma álcool), ácido 2- amino-5-hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação), ácido 2-amino-5- — hidroxipentanóico transaminase, ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico- descarboxilase, ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação) (ver Exemplo IX e Tabela 21). A invenção adicionalmente inclui um método para produzir S BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo ' menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de - f BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob E condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o í caminho de BDO compreendendo 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, 3- hidroxibutirillCOA desidratase, vinilacetil-COA A-isomerase, ou 4 hidroxibutiril-CoA desidratase (ver Exemplo X e Tabela 22).
Também é fornecido um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido —nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada 1 em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um : período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo homosserina desaminase, homosserina-CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, homosserina-CoA ligase, homosserina-CoA — desaminase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA transferase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA hidrolase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase, 4- hidroxibut-2-enoato redutase, 4-hidroxibutiril-CoA transferase, 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4- hidroxibutiril-CoA ligase, ou 4-hidroxibut-2-enoil-COoA redutase (ver Exemplo XI e Tabela 23).
o 68 A invenção adicionalmente fornece um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de —BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o caminho de BDO compreendendo succinil-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (acilfosfato redutase). Um tal caminho de BDO i 10 pode compreender ainda succinil-COA redutase, 4-hidroxibutirato " desidrogenase, 4-hidroxibutiril-CoA transferase, 4hidroxibutirato cinase, é. . fosfotrans-4-hidroxibutirilase, 4-hidroxibutiril-CoA redutase, 4-hidroxibutiril- CoA redutase (que forma álcool), ou 1,4-butanodiol desidrogenase. É é Também é fornecido um método para produzir BDO, que compreende cultivar um organismo microbiano que não ocorre não naturalmente tendo um caminho de BDO, o caminho compreendendo pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima do caminho de BDO expressada em uma quantidade suficiente para produzir BDO, sob condições e por um período suficiente de tempo para produzir BDO, o — caminho de BDO compreendendo glutamato desidrogenase, 4-aminobutirato - oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutirato transaminase, glutamato descarboxilase, 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4hidroxibutiril-CoA ligase, 4- | hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (acilfosfato redutase).
É entendido que, nos métodos da invenção, qualquer um do um ou mais ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos em um organismo microbiano para produzir um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos de modo a conferir, por exemplo, um caminho biossintético de 4-HB, BDO, THF ou GBL no organismo microbiano. Alternativamente, ácidos nucleicos
1 * 69 codificadores podem ser introduzidos para produzir um organismo microbiano intermediário tendo a capacidade biossintética para catalisar algumas das reações requeridas para conferir capacidade biossintética de 4- HB, BDO, THF ou GBL.
Por exemplo, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho Dbiossintético de 4-HB pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos que codificam enzimas desejadas, tais como a combinação de H4-hidróxi-butanoato desidrogenase e a-cetoglutarato —“descarboxilase; d4-hidróxi-butanoato desidrogenase e semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA; í 10 4hidroxibutanoato desidrogenase e semialdeído desidrogenase succínica : dependente de -CoA; semialdeído desidrogenase succínica dependente de - sã . CoA e succinil-CoA sintetase; succinil-COoA sintetase e glutamato descarboxilase, e outros.
Assim, é entendido que qualquer combinação de É duas ou mais enzimas de um caminho biossintético podem ser incluídas em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção.
Similarmente, é entendido que qualquer combinação de três ou mais enzimas de um caminho biossintético podem ser incluídas em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, por exemplo, 4- hidroxibutanoato desidrogenase, a-cetoglutarato descarboxilase e semialdeído —desidrogenase succínica dependente de -CoA; semialdeído desidrogenase . succínica independente de -CoA e succinil-CoA sintetase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA e glutamato: semialdeído succínico transaminase, e assim por diante, como desejado, contanto que a combinação de enzimas do caminho biossintético
— desejado resulte na produção do produto desejado correspondente.
Similarmente, por exemplo, com respeito a qualquer um ou mais ácidos nucleicos exógenos introduzidos para conferir a produção de BDO, um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho de BDO biossintético pode compreender pelo menos dois ácidos
E 7O nucleicos exógenos que codificam as enzimas desejadas, tais como a combinação de d4hidroxibutanoato desidrogenase e a-cetoglutarato descarboxilase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e 4-hidroxibutiril-CoA: acetil-CoA transferase; 4-hidroxibutanoato desidrogenase e butirato cinase; 4-
—hidroxibutanoato desidrogenase e fosfotransbutirilase; 4-hidroxibutiril- : CoA:acetil-CoA transferase e aldeído desidrogenase; 4-hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferase e álcool desidrogenase; 4hidroxibutiril- CoA:acetil-CoA transferase e uma aldeído/álcool desidrogenase, 4- í aminobutirato-CoA transferase e 4-aminobutiril-COA transaminase; 4- —aminobutirato cinase e 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação), e : outros.
Assim, é entendido que qualquer combinação de duas ou mais 7 f enzimas de um caminho biossintético pode ser incluído em um organismo fis microbiano que não ocorre naturalmente da invenção.
Similarmente, é entendido que qualquer combinação de três ou mais enzimas de um caminho —Dbiossintético pode ser incluída em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, por exemplo, 4-hidroxibutanoato desidrogenase, a- cetoglutarato descarboxilase e 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase; 4- hidroxibutanoato desidrogenase, butirato cinase e fosfotransbutirilase; 4- hidroxibutanoato desidrogenase, 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase ealdeído desidrogenase; 4-hidroxibutiril-CoA:acetil-CoA transferase, aldeído f desidrogenase e álcool desidrogenase; butirato cinase, fosfotransbutirilase e . um aldeído/álcool desidrogenase; 4-aminobutiril-CoA hidrolase, 4amino- butiril-CoA redutase e 4-amino butan-1-ol transaminase; 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, 3-hidroxibutiril-CoA desidratase e 4-hidroxibutiril-CoA — desidratase, e outros.
Similarmente, qualquer combinação de quatro, cinco ou mais enzimas de um caminho biossintético como aqui divulgado pode ser incluído em um organismo microbiano que não ocorre naturalmente da invenção, como desejado, contanto que a combinação de enzimas do caminho biossintético = desejado resulte na produção do produto desejado
: 71 correspondente.
Qualquer um dos organismos microbianos que não ocorrem naturalmente aqui descritos pode ser cultivado para produzir e/ou secretar os produtos biossintéticos da invenção. Por exemplo, os produtores de 4-HB — podem ser cultivados para a produção biossintética de 4-HB. O 4-HB pode ser isolado ou ser tratado como descrito abaixo para gerar GBL, THF e/ou BDO. Similarmente, os produtores de BDO podem ser cultivados para a produção biossintética de BDO. O BDO pode ser isolado ou submetido a tratamentos adicionais para a síntese química de compostos da família de BDO, como Ê 10 aqui divulgado.
. O meio de crescimento pode incluir, por exemplo, qualquer k fonte de carboidrato que possa fornecer uma fonte de carbono ao microorganismo que não ocorre naturalmente. Tais fontes incluem, por É * exemplo, açúcares tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, —frutose, sacarose e amido. Outras fontes de carboidrato incluem, por exemplo, estoques de alimentação e biomassa renováveis. Os tipos exemplares de biomassas que podem ser usadas como estoques de alimentação nos métodos da invenção incluem estoques de alimentação de biomassa celulósica, biomassa hemicelulósica e lignina ou porções de estoques de alimentação. Taisestoques de alimentação de biomassa contêm, por exemplo, substratos de : carboidrato úteis como fontes de carbono tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Dadas as divulgações e orientações aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica entenderão que estoques de alimentação e biomassa renováveis outras que não aquelas exemplificadas — acima também podem ser usadas para cultivar os organismos microbianos da invenção para a produção de 4-HB ou BDO e outros compostos da invenção.
Consequentemente, dada as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica entenderão que um organismo microbiano que não ocorre naturalmente pode ser produzido que secreta os o TP compostos biossintetizados da invenção quando cultivados em uma fonte de carbono tal como um carboidrato. Tais compostos incluem, por exemplo, 4- HB, BDO e qualquer um dos metabólitos intermediários no caminho de 4- HB, o caminho de BDO e/ou os caminhos de 4-HB e BDO combinados. Tudo S —que é requerido é engendrar em uma ou mais das atividades de enzima i mostradas na Figura 1 para se obter a biossíntese do composto ou intermediário desejados incluíndo, por exemplo, a inclusão de alguns ou todos dos caminhos biossintéticos de 4-HB e/ou BDO. Consequentemente, a : invenção fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que secreta 4-HB quando cultivado em um carboidrato, secreta BDO quando à cultivado em um carboidrato e/ou secreta qualquer um dos metabólitos - , intermediários mostrados na Figura 1 quando cultivados em um carboidrato. E Os organismos microbianos que produzem BDO da invenção podem iniciar a síntese, por exemplo, a partir do succinato, succinil-CoA, a-cetoglutarato, —semialdeído succínico, 4-HB, 4-hidroxibutiril-fosfato, 4-hidroxibutiril-CoA (4-HB-CoA) e/ou 4-hidroxibutiraldeído.
Em algumas formas de realização, as condições de cultura incluem condições de crescimento ou manutenção anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. As condições anaeróbicas exemplares foram descritas anteriormente e são bem conhecidas na técnica. As condições : anaeróbicas exemplares para os processos de fermentação são descritos S abaixo nos exemplos. Qualquer uma destas condições pode ser utilizada com os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente assim como outras condições anaeróbicas bem conhecidas na técnica. Sob tais condições —anaeróbicas, os produtores de 4-HB e BDO podem sintetizar 4-HB e BDO monoméricos, respectivamente, em concentrações intracelulares de 5 a 10mM ou mais assim como todas as outras concentrações anteriormente exemplificadas.
Vários compostos a jusante também podem ser gerados para os oo TB organismos microbianos que produzem 4-HB e BDO que não ocorrem naturalmente da invenção.
Com respeito aos organismos microbianos que produzem 4-HB da invenção, 4-HB e GBL monoméricos existem em equilíbrio no meio de cultura.
A conversão de 4-HB para GBL pode ser eficientemente realizaday por exemplo, cultivando-se os organismos microbianos em meio de pH ácido.
Um pH menor do que ou igual a 7,5, em particular no ou abaixo do pH 5,5, espontaneamente converte 4-HB a GBL.
O GBL resultante pode ser separado de 4-HB e outros e componentes na cultura usando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica.
Tais métodos de separação incluem, por exemplo, os É procedimentos de extração exemplificados nos Exemplos assim como “ " métodos que incluem a extração líquido-líquido contínua, pervaporação, E. filtração em membrana, separação em membrana, osmose reversa, í eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de absorção, e ultrafiltração.
Todos dos métodos acima são bem conhecidos na técnica.
GBL separado pode ser purificado ainda, por exemplo, pela destilação.
Um outro composto a jusante que pode ser produzido a partir do 4HB para produzir organismos microbianos que não ocorrem f naturalmente da invenção inclui, por exemplo, BDO.
Este composto pode ser i sintetizado, por exemplo, pela hidrogenação química de GBL.
As reações de hidrogenação química são bem conhecidas na técnica.
Um procedimento exemplar inclui a redução química de 4-HB e/ou GBL ou uma mistura destes dois componentes que derivam da cultura usando um catalisador de hidrogenação heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio, ou um agente de redução com base em hidreto usado estequiométrica ou cataliticamente, para produzir 1,4-butanodiol.
Outros procedimentos bem conhecidos na técnica são f h 74 igualmente aplicáveis para a reação química acima e incluem, por exemplo, WO Nº 82/03854 (Bradley, et al.), que descreve a hidrogenólise da gama- butirolactona na fase de vapor em um catalisador de óxido de cobre e óxido de zinco. Pat. Britânica Nº 1.230.276, que descreve a hidrogenação da gama- — butirolactona usando um catalisador de óxido de cobre-óxido de cromo. À hidrogenação é realizada na fase líquida. As reações de batelada também são exemplificadas tendo pressões totais de reator altas. Reagente e pressões parciais de produto nos reatores estão bem acima dos respectivos pontos de orvalho. Pat. Britânica Nº 1.314.126, que descreve a hidrogenação de gama- : 10 —butirolactona na fase líquida em um catalisador de óxido de níquel-cobalto- , tório. As reações em lote são exemplificados como tendo altas pressões totais : , e pressões parciais dos componentes bem acima dos respectivos pontos de orvalho do componente. Pat. Britânica Nº 1.344.557, que descreve a : hidrogenação de gama-butirolactona na fase líquida em um catalisador de óxido de cobre-óxido de cromo. Uma fase de vapor ou fase mista contendo vapor é indicada como adequada em alguns casos. Um reator tubular de fluxo contínuo é exemplificado usando pressões totais de reator altas. A Pat. Britânica Nº 1.512.751, que descreve a hidrogenação de gama-butirolactona para 1,4-butanodiol na fase líquida em um catalisador de óxido de cobre- óxido de cromo. Às reações de batelada são exemplificadas com pressões . totais de reator alta e, onde determinável, pressões parciais de reagente e ; produto bem acima dos respectivos pontos de orvalho. A Pat. U.S. Nº
4.301.077, que descreve a hidrogenação para 1,4-butanodiol de gama- butirolactona em um catalisador de Ru-Ni-Co-Zn. A reação pode ser — conduzida na fase líquida ou gasosa ou em uma fase de líquido-gás mista. Exemplificadas são as reações de fase líquida de fluxo contínuo em altas pressões totais de reator e produtividades de reator relativamente baixas. A Pat. U.S. Nº 4.048.196, que descreve a produção de 1,4-butanodiol pela hidrogenação da fase líquida de gama-butirolactona em
Eiaia 75 um catalisador de óxido de cobre-óxido de zinco. É ainda exemplificado um reator tubular de fluxo contínuo operando em pressões totais de reator altas e pressões parciais de reagente e produto altas. E a Patente U.S. Nº 4.652.685, que descreve a hidrogenação de lactonas para glicóis.
S Um outro composto a jusante que pode ser produzido a partir dos organismos microbianos que produzem 4-HB da invenção inclui, por exemplo, THF. Este composto pode ser sintetizado, por exemplo, pela hidrogenação química de GBL. Um procedimento exemplar bem conhecido & na técnica aplicável para a conversão de GBL para THF inclui, por exemplo, a redução química de 4-HB e/ou GBL ou uma mistura destes dois É componentes que derivam da cultura usando um catalisador de hidrogenação - h heterogêneo ou homogêneo junto com hidrogênio, ou um agente redutor com MS base em hidreto usado estequiométrica ou cataliticamente, para produzir tetraidrofurano. Outros procedimentos bem conhecidos na técnica são igualmente aplicáveis para a reação química acima e incluem, por exemplo, Patente U.S. Nº 6.686.310, que descreve catalisadores de hidrogenação preparados via sol-gel de área de supefície alta. Os processos para a redução de ácido maleico para tetraidrofurano (THF) e 1,4-butanodiol (BDO) e para a redução de gama butirolactona para tetraidrofurano e 1,4-butanodiol também — são descritos.
: As condições de cultura podem incluir, por exemplo, : procedimentos de cultura líquida assim como fermentação e outros procedimentos de cultura em larga escala. Como descrito mais abaixo in nos Exemplos, rendimentos particularmente úteis dos produtos biossintéticos da invenção podem ser obtidos sob condições de cultura anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas.
A purificação e/ou ensaios adequados para testar quanto a produção de 4-HB ou BDO podem ser realizados usando métodos bem conhecidos. As réplicas adequadas tais como culturas em triplicata podem ser
É É 76 cultivadas para cada cepa engendrada a ser testada. Por exemplo, a formação de produto e subproduto no hospedeiro de produção engendrado pode ser monitorada. O produto final e intermediários, e outros compostos orgânicos, podem ser analisados pelos métodos tais como HPLC (Cromatografia Líquido de Alto Desempenho), GC-MS (Cromatografia gasosa-Espectroscopia de Massa) e LC-MS (Cromatografia Líquida-Espectroscopia de Massa) ou outros métodos analíticos adequados usando procedimentos de rotina bem conhecidos na técnica. A liberação de produto no caldo de fermentação É também pode ser testado com o sobrenadante da cultura. Subprodutos e —glicoseresidual podem ser quantificados pela HPLC usando, por exemplo, um * detetor de índice refrativo para glicose e álcoois, e um detetor de UV para .- , ácidos orgânicos (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90: 775-779 (2005)), ou outros ensaios e métodos de detecção adequados bem conhecidos na técnica. ' Í As atividades da enzima ou proteína individuais a partir de sequências de DNA exógeno também podem ser ensaiadas usando métodos bem conhecidos na técnica.
Os produtos de 4-HB ou BDO podem ser separados de outros componentes na cultura usando uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração assim como métodos que incluem a extração líquido-líquido " contínua, pervaporação, filtração em membrana, separação de membrana, . osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de absorção, e ultrafiltração. Todos os métodos acima — sãobem conhecidos na técnica.
A invenção fornece ainda um método de fabricar 4-HB. O método inclui fermentar um organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo um caminho biossintético do ácido 4-hidroxibutanóico (4- HB) que compreendem pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica a á: . T7 4-hidroxibutanoato desidrogenase, semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, glutamato: semialdeído succínico transaminase, a-cetoglutarato descarboxilase, ou glutamato descarboxilase —sob condições substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para produzir o ácido 4-hidroxibutanóico monomérico (4-HB), o processo compreendendo a fermentação de lote alimentado e separação de lote; a fermentação de lote alimentado e a separação contínua, ou fermentação contínua e separação contínua. “10 A cultura e hidrogenações químicas descritas acima também - podem ser aumentadas e cultivadas continuamente para a fabricação de 4-HB, s GBL, BDO e/ou THF.
Os procedimentos de cultivo exemplares incluem, por Ô exemplo, a fermentação de lote alimentado e a separação por lote; a E , fermentação de lote alimentado e separação contínua, ou a fermentação contínua e separação contínua.
Todos estes processos são bem conhecidos na técnica.
Utilizar os produtores de 4-HB permite a biossíntese simultânea de 4- HB e a conversão química para GBL, BDO e/ou THF pela utilização dos procedimentos de hidrogenação acima simultâneo com métodos de cultura contínua tal como fermentação.
Outros procedimentos de hidrogenação — também são bem conhecidos na técnica e podem ser igualmente aplicados aos . métodos da invenção.
Os procedimentos de fermentação são particularmente úteis : para a produção biossintética de quantidades comerciais de 4-HB e/ou BDO.
No geral, e como com os procedimentos de cultura não contínuos, a produção contínua e/ou quase contínua de 4-HB ou BDO incluirá cultivar um organismo que produz 4-HB ou BDO que não ocorre naturalmente da invenção em nutrientes e meio suficientes para sustentar e/ou quase sustentar o crescimento em uma fase exponencial.
A cultura contínua sob tais condições pode ser incluída, por exemplo, 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou o 78 mais. Adicionalmente, a cultura contínua pode incluir 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até diversos meses. Alternativamente, os organismos da invenção podem ser cultivados por horas, se adequado para uma aplicação particular. Deve ser entendido que as condições de cultura contínua e/ou — próximas da contínua também podem incluir todos os intervalos de tempo entre estes períodos exemplares. É ainda entendido que o tempo de cultivar o organismo microbiano da invenção é por um período suficiente de tempo para produzir uma quantidade suficiente de produto para um propósito desejado. : Os procedimentos de fermentação são bem conhecidos na técnica. Em resumo, a fermentação para a produção biossintética de 4-HB, É BDO ou outros produtos derivados de 4-HB da invenção pode ser utilizada, - ' por exemplo, na fermentação de lote alimentado e separação de lote; a O fermentação de lote alimentado e separação contínua, ou fermentação : contínua e separação contínua. Os exemplos de procedimentos de fermentação de lote e contínua bem conhecidos na técnica são exemplificados mais abaixo nos Exemplos.
Além disso para os procedimentos de fermentação acima usando os produtores de 4-HB ou BDO da invenção para a produção contínua de quantidades substanciais de 4-HB e BDO monoméricos, respectivamente, os produtores de 4-HB também podem ser, por exemplo, : simultaneamente submetidos aos procedimentos de síntese química como : anteriormente descritos para a conversão química de 4-HB monomérico, por exemplo, para GBL, BDO e/ou THF. Os produtores de BDO podem ser de modo similar, por exemplo, simultaneamente submetidos aos procedimentos — de síntese química como descrito anteriormente para a conversão química de BDO, por exemplo, para THF, GBL, pirrolidonas e/ou outros compostos da família BDO. Além disso, os produtos dos produtores de 4-HB e BDO podem ser separados da cultura de fermentação e sequencialmente submetidos à conversão química, como aqui divulgado. —
. : go Em resumo, a hidrogenação de GBL no caldo de fermentação pode ser realizada como descrita por Frost er al., Biotechnology Progress 18: 201-211 (2002). Um outro procedimento para a hidrogenação durante a fermentação incluem, por exemplo, os métodos descritos, por exemplo, na — Patente U.S.
Nº 5.478.952. Este método é exemplificado ainda nos Exemplos abaixo.
Portanto, a invenção adicionalmente fornece um método de fabricar 7-butirolactona (GBL), tetraidrofurano (THF) ou 1,4-butanodiol (BDO). O método inclui fermentar um organismo microbiano que não ocorre “10 naturalmente tendo caminhos biossintéticos do ácido 4-hidroxi-butanóico (4- - HB) e/ou 1,4-butanodiol (BDO), os caminhos compreendendo pelo menos um & ácido nucleico exógeno que codifica a 4-hidroxibutanoato desidrogenase, : semialdeído desidrogenase succínica independente de -CoA, succinil-CoA : 2. sintetase, semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, 4- hidroxibutirato:-CoA transferase, glutamato: semialdeído —succínico transaminase, a-cetoglutarato descarboxilase, glutamato descarboxilase, 4- hidroxibutanoato cinase, fosfotransbutirilase, 1,4-butanodiol semialdeído desidrogenase — independente de -CoA, 1,4-butanodiol semialdeído desidrogenase dependente de -CoA, 1,4-butanodiol álcool desidrogenase ou —1,4-butanodiol álcool desidrogenase dependente de -CoA, sob condições : substancialmente anaeróbicas por um período suficiente de tempo para produzir 1,4-butanodiol (BDO), GBL ou THF, a fermentação compreendendo É a fermentação de lote alimentado e separação de lote; a fermentação de lote alimentado e a separação contínua, ou fermentação contínua e separação — contínua Além disso, a biossíntese de 4-HB, BDO e outros produtos da invenção como aqui descritos, os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente e métodos da invenção também podem ser utilizados em várias combinações entre si e com outros organismos microbianos e métodos bem
. : 80 conhecidos na técnica para se obter a biossíntese de produto por outras vias. Por exemplo, uma alternativa para produzir BDO outra que não o uso dos produtores de 4-HB e etapas químicas ou outras que não o uso do produtor de BDO diretamente é através da adição de um outro organismo microbiano capaz de converter 4-HB ou um produto de 4-HB aqui exemplificado ao BDO.
Um tal procedimento inclui, por exemplo, a fermentação de um organismo microbiano produtor de 4-HB da invenção para produzir 4-HB, como descrito acima e abaixo. O 4-HB pode então ser usado como um “10 substrato para um segundo organismo microbiano que converte 4-HB, por : exemplo, no BDO, GBL e/ou THF. O 4-HB pode ser adicionado diretamente a uma outra cultura do segundo organismo ou a cultura original de produtores Ô de 4-HB pode ser esgotada destes organismos microbianos, por exemplo, pela ” separação de célula, e depois a adição subsequente do segunda organismo ao caldo de fermentação pode ser utilizado para produzir o produto final sem etapas de purificação intermediárias. Um segundo organismo exemplar tendo a capacidade para utilizar bioquimicamente 4-HB como um substrato para a conversão a BDO, por exemplo, é Clostridium acetobutilicum (ver, por exemplo, Jewell et al., Current Microbiology, 13: 215-19 (1986)). Em outras formas de realização, os organismos microbianos ; que não ocorrem naturalmente e métodos da invenção podem ser montados em uma ampla variedade de subcaminhos para se obter a biossíntese, por É exemplo, de 4-HB e/ou BDO como descrito. Nestas formas de realização, os caminhos biossintéticos para um produto desejado da invenção pode ser segregado em organismos microbianos diferentes e os organismos microbianos diferentes podem ser co-cultivados para produzir o produto final. Em um tal esquema biossintético, o produto de um organismo microbiano é o substrato para um segundo organismo microbiano até que o produto final seja sintetizado. Por exemplo, a biossíntese de BDO pode ser realizada como
A 81 . — descrito anteriormente pela construção de um organismo microbiano que contenha caminhos Dbiossintéticos para a conversão de um caminho intermediário para um outro caminho intermediário ou o produto, por exemplo, um substrato tal como succinato endógeno através de 4-HB para o produto final BDO. Alternativamente, BDO também pode ser bio sinteticamente produzido a partir de organismos microbianos através da co- cultura ou co-fermentação usando dois organismos no mesmo vaso. Um primeiro organismo microbiano sendo um produtor de 4-HB com genes para À produzir 4-HB a partir de ácido succeínico, e um segundo organismo —microbiano sendo um produtor de BDO com genes para converter 4-HB " no BDO.
- Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica entenderão que uma ampla variedade de combinações e í permutações existe para os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente e métodos da invenção juntos com outros organismos microbianos, com a co-cultura de outros organismos microbianos que não ocorrem naturalmente tendo subcaminhos e com combinações de outros procedimentos químicos e/ou bioquímicos bem conhecidos na técnica para produzir produtos de 4-HB, BDO, GBL e THF da invenção. Para gerar melhores produtores, a modelagem metabólica pode "' ser utilizada para otimizar as condições de cultivo. A modelagem também á pode ser usada para planejar silenciamentos de gene que adicionalmente otimizam a utilização do caminho (ver, por exemplo, as publicações de Patente U.S. US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466, e Patente U.S. Nº 7.127.379). A análise de modelagem permite prognósticos confiáveis dos efeitos sobre o cultivo de células de mudar o metabolismo para produção mais eficiente de BDO.
Um método computacional para identificar e planejar
Í ' 82 alterações metabólicas que favorecem a biossíntese de um produto desejado é Ô a matriz computacional OptKnock (Burgard et al., Biotechnol.
Bioeng. 84: 647-657 (2003)). OptKnock é um programa de modelagem e simulação metabólicas que sugere estratégias de rompimento ou deleção de gene que — resultam em microorganismos geneticamente estáveis que super produzem o produto alvo.
Especificamente, a matriz examina a rede metabólicas e/ou bioquímica completas de um microorganismo de modo a sugerir manipulações genéticas que forçam a bioquímica desejada para tornar-se um subproduto obrigatório do cultivo de célula, Pela ligação da produção “10 bioquímica com o cultivo de célula através de rompimentos ou deleções de . gene estrategicamente colocados ou outros rompimentos de gene funcionais, : : por exemplo, deleção do gene inteiro, deleção de uma sequência reguladora requerida para a transcrição ou tradução, deleção de uma porção do gene que : e resulta em um produto de gene truncado, ou por qualquer uma de várias estratégias de mutação que inativam o produto de gene codificado, as pressões de seleção de crescimento impostas sobre as cepas engendradas depois de períodos longos de tempo em um biorreator leva a melhoras no desempenho como um resultado da produção bioquímica ligada ao crescimento compulsório.
Por último, quando as deleções de gene são construídas existe uma possibilidade negligenciável das cepas planejadas reverterem para os . seus estados do tipo selvagem porque os genes selecionados pelo OptKnock : deve ser completamente removidos do genoma.
Portanto, esta metodologia computacional pode ser usada para identificar caminhos alternativos que levam à biossíntese de um produto desejado ou usado em conexão com os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente para otimização adicional da biossíntese de um produto desejado.
Em resumo, OptKnock é um termo aqui usado para se referir a um método e sistema computacional para modelar o metabolismo celular.
O programa OptKnock diz respeito a uma matriz de modelos e métodos que
. : 83 incorporam constrangimentos particulares nos modelos de análise de equilíbrio de fluxo (FBA). Estes constrangimentos incluem, por exemplo, informação cinética qualitativa, informação reguladora qualitativa, e/ou dados experimentais de microssérie de DNA.
OptKnock também computa soluções — para vários problemas metabólicos, por exemplo, pelo esticamento dos limites de fluxo derivado através de modelos de equilíbrio de fluxo e subsegiientemente sondando os limites de desempenho de redes metabólicas na presença de adições ou rompimentos/deleções de gene.
A matriz computacional OptKnock permite a construção de formulações modelo que “10 possibilitim uma questão eficaz dos limites de desempenho de redes R metabólicas e fornece métodos para solucionar os problemas de programação linear de números inteiros mistos resultantes.
Os métodos de modelagem e Ú simulação metabólicos aqui aludidos como OptKnock são descritos, por 7 - exemplo, na publicação U.S. 2002/0168654, depositado em 10 de janeiro de 15 — 2002, na Patente Internacional Nº PCT/US02/00660, depositada em 10 de janeiro de 2002, e pedido de Patente U.S. serial Nº 11/891.602, depositado em de agosto de 2007. Um outro método computacional para identificar e planejar alterações metabólicas que favoreçam a produção biossintética de um produto -é um sistema de modelagem e simulação metabólicas chamadas de SimFenyO&. Este método e sistema computacionais são descritos, por exemplo, na publicação U.S. 2003/0233218, depositada em 14 de Junho de Ê 2002, e no Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US03/18838, depositado em 13 de junho de 2003. SimFenyQ& é um sistema computacional que pode ser usado para produzir um modelo de rede em ambiente virtual e para simular o fluxo de massa, energia ou carga através das reações químicas de um sistema biológico para definir um espaço de solução que contêm qualquer e todas as funcionalidades possíveis das reações químicas no sistema, determinando deste modo uma faixa de atividades permitidas para o sistema
Do 84 - biológico Este método é aludido como modelagem com base em constrangimentos porque o espaço de solução é definido pelos constrangimentos tais como a estequiometria conhecida das reações incluídas assim como termodinâmicos de reação e constrangimentos de capacidade associadas com fluxos máximos através de reações. OQ espaço definido por estes constrangimentos pode ser interrogado para determinar as capacidades fenotípicas e comportamento do sistema biológico ou dos seus componentes bioquímicos.
À Estes métodos computacionais são compatíveis com as realidades biológicas porque os sistemas biológicos são flexíveis e podem ' atingir os mesmos resultados em muitos modos diferentes. Os sistemas . : biológicos são planejados através de mecanismos evolucionários que foram restritos pelos constrangimentos fundamentais que todos os sistemas vivos õ * devem enfrentar. Portanto, estratégias de modelagem com base em constrangimentos abrangem estas realidades gerais. Além disso, a capacidade para impor continuamente outras restrições em um modelo de rede via o aperto de constrangimentos resulta em uma redução no tamanho do espaço de solução, realçando deste modo a precisão com que o desempenho fisiológico ou fenótipo pode ser prognosticado. Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles f habilitados na técnica serão capazes de aplicar várias matrizes computacionais k para a modelagem e simulação metabólicas para planejar e implementar a biossíntese de um composto desejado em organismos microbianos hospedeiros. Tais métodos de modelagem e simulação metabólicas incluem, por exemplo, os sistemas computacionais exemplificados acima como SimFenyQ& e OptKnock. Para ilustração da invenção, alguns métodos são aqui descritos com referência à matriz de computação OptKnock para a modelagem e simulação. Aqueles habilitados na técnica saberão como aplicar a identificação, planejamento e implementação das alterações metabólicas
DEDO
E 85
. usando OptKnock a qualquer de outras tais matrizes computacionais de modelagem e simulação e métodos bem conhecidos na técnica.
Os métodos descritos acima fornecerão um conjunto de reações metabólicas para rompimento.
A eliminação de cada reação dentro do — conjunto ou modificação metabólica pode resultar em um produto desejado como um produto obrigatório durante a fase de crescimento do organismo.
Porque as reações são conhecidas, uma solução para o problema OptKnock de nível duplo também fornecerá o gene ou genes associados que codificam uma o ou mais enzimas que catalisam cada reação dentro do conjunto de reações.
A identificação de um conjunto de reações e seus genes correspondentes que f codificam as enzimas que participam em cada reação é no geral um processo - E automatizado, realizado através da correlação das reações com uma base de dados de reação tendo uma relação entre as enzimas e os genes codificadores. ff Uma vez identificado, o conjunto de reações que deve ser rompido de modo a se obter a produção de um produto desejado é implementado na célula ou organismo alvos pelo rompimento funcional de pelo menos um gene que codifica cada reação metabólica dentro do conjunto.
Um meio particularmente útil para se obter o rompimento funcional do conjunto de reação é pela deleção de cada gene codificador.
Entretanto, em alguns casos, pode ser benéfico romper a reação por outras aberrações : genética incluindo, por exemplo, mutação, deleção de regiões reguladoras tais : como promotores ou sítios de ligação cis para fatores reguladores, ou pela truncagem da sequência codificadora em qualquer uma de várias localizações.
Estas últimas aberrações, resultando em menos do que a deleção total do — conjunto de gene pode ser útil, por exemplo, quando avaliações rápidas da ligação de um produto são desejadas ou quando a reversão genética é menos provável de ocorrer.
Para identificar soluções produtivas adicionais para O problema de OptKnock de nível duplo descrito acima que leva a conjuntos o í . 86 adicionais de reações para rompimento ou modificações metabólicas que pode resultar na biossíntese, incluindo biossíntese ligada ao crescimento de um produto desejado, um método de optimização, chamado de cortes de números inteiros, pode ser implementado. Este método processa-se resolvendo-se = —iterativamente o problema OptKnock exemplificado acima com a incorporação de um constrangimento adicional aludido como um corte de número inteiro em cada iteração. Os constrangimentos de corte de número inteiro eficazmente impedem o procedimento de solução de escolher exatamente o mesmo conjunto de reações identificadas em qualquer iteração anterior que obrigatoriamente liga a biossíntese de produto ao crescimento.
” Por exemplo, se uma modificação metabólica ligada ao crescimento S : anteriormente identificada especifica as reações 1, 2, e 3 para rompimento, então o constrangimento que segue impede as mesmas reações de serem S v simultâneamente considerada em soluções subsequentes. O método do corte —denúmero inteiro é bem conhecido na técnica e pode ser encontrado descrito, por exemplo, em Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17: 791-797 (2001). Como com todos os métodos aqui descritos com referência ao seu uso em combinação com a matriz computacional OptKnock para a modelagem e simulação metabólicas, o método do corte de número inteiro de redundância redutora na análise computacional iterativa também pode ser aplicada com . outras matrizes computacionais bem conhecidas na técnica incluindo, por : exemplo, SimFenyQ.
Os métodos aqui exemplificados permitem a construção de células e organismos que biossinteticamente produzem um produto desejado, — incluindo a ligação obrigatória de produção de um produto bioquímico alvo para o crescimento da célula ou organismo engendrados para abrigar as alterações genéticas identificadas. Portanto, os métodos computacionais aqui descritos permitem a identificação e implementação de modificações metabólicas que são identificadas por um método em ambiente virtual ——
f , 87 selecionado de OptKnock ou SimFenyQ&. O conjunto de modificações “metabólicas pode incluir, por exemplo, a adição de uma ou mais enzimas do caminho biossintético e/ou rompimento funcional de uma ou mais reações metabólicas incluindo, por exemplo, rompimento pela deleção de gene.
Ss Como debatido acima, a metodologia de OptKnock foi desenvolvida sobre a premissa de que redes microbianas mutantes podem ser evoluídas na direção dos seus fenótipos de crescimento máximo computacionalmente prognosticados quando submetidos a longos períodos de seleção de crescimento. Em outras palavras, o método alavanca uma “10 capacidade do organismo para auto-optimização sob pressões seletivas. À matriz OptKnock permite que a enumeração exaustiva de combinações de deleção de gene que força uma ligação entre a produção bioquímica e o í | crescimento de célula com base na estequiometria de rede. A identificação de * . silenciamentos de gene/reação ideais requer a solução de um problema de otimização de nível duplo que escolhe o conjunto de reações ativas tal que uma solução de crescimento ideal para a rede resultante produz em excesso o produto bioquímico de interesse (Burgard et al., Biotechnol. Bioeng. 84: 647- 657 (2003)). Um modelo estequiométrico em ambiente virtual de metabolismo da E. coli pode ser utilizado para identificar genes essenciais : para os caminhos metabólicos como exemplificado anteriormente e descritos, por exemplo, nas publicações de Patente U.S. US 2002/0012939, US : 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466, e na Patente U.S. Nº 7.127.379. Como aqui divulgado, a matriz matemática OptKnock pode ser aplicada para identificar com precisão deleções de gene que levam à produção ligada ao crescimento de um produto desejado. Além disso, a solução do problema OptKnock de nível duplo fomece apenas um conjunto de deleções. Para enumerar todas as soluções significativas, isto é, todos os conjuntos de já É 88 Sã silenciamentos que levam à formação da produção ligada ao crescimento, uma técnica de optimização, chamada de corte de números inteiros, pode ser implementada. Isto acarreta necessariamente solucionar iterativamente o problema OptKnock com a incorporação de um constrangimento adicional — aludido como um corte de número inteiro em cada iteração, como debatido acima.
Os métodos exemplificado acima e ilustrados ainda mais nos Exemplos abaixo possibilitam a construção de células e organismos que biossinteticamente produzem, incluindo a produção de par obrigatório de um à 10 produto bioquímico alvo para o crescimento da célula ou organismo o engendrados para abrigar as alterações genéticas identificadas. A este é À respeito, as alterações metabólicas foram identificadas que resultam na biossíntese de 4-HB e 1,4-butanodiol. As cepas de microorganismo É 7 construídos com as alterações metabólicas identificadas produzem níveis elevados de 4-HB ou BDO comparada aos organismos microbianos não modificados. Estas cepas podem ser beneficamente usadas para a produção comercial de 4-HB, BDO, THF e GBL, por exemplo, em processo de fermentação contínua sem estar submetidas às pressões seletivas negativas.
Portanto, os métodos computacionais aqui descritos possibilitam a identificação e implementação de modificações metabólicas f- que são identificadas por um método em ambiente virtual selecionado de : OptKnock ou SimFenyO. O conjunto de modificações metabólicas pode incluir, por exemplo, a adição de um ou mais enzimas do caminho biossintético e/ou rompimento funcional de uma ou mais reações metabólicas — incluindo, por exemplo, rompimento pela deleção de gene.
É entendido que modificações que não afetam substancialmente a atividade das várias formas de realização desta invenção também são incluídas dentro da definição da invenção aqui fornecida. Consequentemente, os exemplos que seguem são intencionados a ilustrar mas
, : 89 não limitar a presente invenção.
: Qualquer um dos organismos microbianos que não ocorrem naturalmente aqui descritos podem ser cultivados para produzir e/ou secretar os produtos biossintéticos da invenção. Por exemplo, os produtores de BDO S — podem ser cultivados para a produção biossintética de BDO.
Para a produção de BDO, as cepas recombinantes são cultivadas em um meio com fonte de carbono e outros nutrientes essenciais. É altamente desejável manter as condições anaeróbicas no fermentador para reduzir o custo do processo global. Tais condições podem ser obtidas, por “10 exemplo, espargindo-se primeiro o meio com nitrogênio e depois selando os í frascos com um septo e tampa plissada. Para as cepas onde o crescimento não é observado anaerobicamente, as condições microaeróbicas podem ser ! aplicadas perfurando-se o septo com um pequeno furo para a aeração is limitada. As condições anaeróbicas exemplares foram descritos anteriormente e são bem conhecidos na técnica. As condições aeróbicas e anaeróbicas exemplares são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente dos Estados Unidos serial Nº 11/891.602, depositado em 10 de agosto de 2007. As fermentações podem ser realizadas em uma maneira por lote, lote alimentado ou contínua, como aqui divulgado. Se desejado, o pH do meio pode ser mantido em um pH . desejado, em particular pH neutro, tal como um pH em torno de 7 pela adição de uma base, tal como NaOH ou outras bases, ou ácido, como necessário para É manter o meio de cultura em um pH desejável. A taxa de crescimento pode ser determinada medindo-se a densidade ótica usando um espectrofotômetro —(600nm),eataxade captação de glicose pela monitoração do esgotamento da fonte de carbono com o tempo.
Além dos estoques de alimentação renováveis tais como aqueles exemplificado acima, os organismos microbianos que produzem BDO da invenção também podem ser modificados quanto ao crescimento em
REI A RSRSRS o 90 . —syngas como a sua fonte de carbono. Nesta forma de realização específica, uma ou mais proteínas ou enzimas são expressadas nos organismos que produzem BDO para fornecer um caminho metabólico para a utilização de syngas ou outra fonte de carbono gasoso.
O gás de síntese, também conhecido como Syngas ou gás produtor, é o produto maior da gaseificação de carvão vegetal e de materiais carbonáceos tais como materiais de biomassa, incluindo safras e resíduos agrícolas. O syngas é uma mistura primariamente de H, e CO e pode ser à; obtido a partir da gaseificação de qualquer estoque de alimentação orgânico, incluindo mas não limitado a carvão, petróleo, gás natural, biomassa, e f matéria orgânica residual. A gaseificação é no geral realizada sob uma alta » razão de combustível para oxigênio. Embora basicamente H, e CO, o syngas pode também incluir CO, e outros gases em quantidades menores. Assim, o É gás de síntese fornece uma fonte eficaz em custo de carbono gasoso tal como COe, adicionalmente, CO;.
O caminho de Wood-Ljungdah! catalisa a conversão de CO e H, para acetil-CoA e outros produtos tais como acetato. Os organismos capazes de utilizar CO e syngas também no geral têm a capacidade de utilizar CO, e misturas de COy/H, através do mesmo conjunto básico de enzimas e transformações abrangidas pelo caminho de Wood-Ljungdahl. À conversão E dependente do H, de CO, para acetato pelos microorganismos foi reconhecida : muito antes que fosse revelado que CO também pode ser usado pelos mesmos organismos e que os mesmos caminhos foram envolvidos. Muitos acetógenos foram mostrados crescer na presença de CO, e produzir compostos tais como — acetato contanto que o hidrogênio esteja presente para suprir os equivalentes de redução necessários (ver por exemplo, Drake, Acetogenesis, pp. 360 Chapman e Hall, Nova Iorque, (1994)). Isto pode ser resumido pela seguinte equação: 2CO; +4 Hoy +n ADP + n Pi > CH;COOH + 2 HO + n ATP feita 91 : Consequentemente, os microorganismos que não ocorrem naturalmente que possuem o caminho de Wood-Ljungdahl podem utilizar misturas de CO, e H7, também para a produção de acetil-CoA e outros produtos desejados.
O caminho de Wood-Ljungdah! é bem conhecido na técnica e consiste de 12 reações que podem ser separadas em duas ramificações: (1) a ramificação metila e (2) a ramificação carbonila. A ramificação metila converte syngas para metil-tetrahidrofoliato (metil-THF) ao passo que a ramificação carbonila converte metil-THF a acetil-CoA. As reações na É 10 ramificação metila são catalisadas na ordem pelas seguintes enzimas ou . proteínas: ferredoxina oxidorredutase, formiato desidrogenase, . É formiltetrahidrofoliato sintetase, meteniltetrahidrofoliato ciclodesidratase, metilenotetrahidrofoliato desidrogenase e metilenotetrahidrofoliato redutase.
õ As reações na ramificação carbonila são catalisadas na ordem pelas seguintes enzimas ou proteínas: metiltetrahidrofoliato:proteína corrinóide metiltransferase (por exemplo, AcsE), proteína de ferro-enxofre corrinóide, proteína de montagem da níquel-proteína (por exemplo, AcsF), ferredoxina, acetil-CoA sintase, monóxido de carbono desidrogenase e proteína de montagem da níquel-proteíina (por exemplo, CooC). Que seguem as divulgações e orientação aqui fornecidas para introduzir um número f suficiente de ácidos nucleicos codificadores para gerar um caminho de BDO, E aqueles habilitados na técnica entenderão que o mesmo planejamento de engenheiramento também pode ser realizada com respeito à introdução de pelo menos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas de —Wood-Ljungdahl ausentes no organismo hospedeiro. Portanto, a introdução de um ou mais ácidos nucleicos codificadores nos organismos microbianos da invenção tal que o organismo modificado contenha o caminho de Wood- Ljungdah! completo conferirá capacidade de utilização de syngas.
Consequentemente, dadas as divulgações e orientação aqui
É : 92 fornecidas, aqueles habilitados na técnica entenderão que um organismo microbiano que não ocorre naturalmente pode ser produzido que secreta os compostos biossintetizados da invenção quando cultivados em uma fonte de carbono tal como um carboidrato. Tais compostos incluem, por exemplo, —BDO e qualquer um dos metabólitos intermediários no caminho de BDO. Tudo o que é requerido é engendrar em uma ou mais das atividades de enzima ou proteína requeridas para se obter a biossíntese do composto ou intermediário desejados incluindo, por exemplo, a inclusão de alguns ou todos os caminhos de BDO biossintéticos. Consequentemente, a invenção fornece um organismo microbiano que não ocorre naturalmente que produz e/ou - secreta BDO quando cultivado em um carbohidrato ou outra fonte de carbono S S e produz e/ou secreta qualquer um dos metabólitos intermediários mostrados no caminho de BDO quando cultivados em um carboidrato ou outra fonte de f f carbono. Os organismos microbianos que produzem BDO da invenção podem iniciar a síntese de um intermediário em um caminho de BDO, como aqui divulgado.
Para gerar melhores produtores, a modelagem metabólica pode ser utilizada para otimizar as condições de crescimento. A modelagem também pode ser usada para lanejar silenciamentos de gene que adicionalmente otimizam a utilização do caminho (ver, por exemplo, as . publicações de Patente U.S. US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e À US 2004/0009466, e Patente U.S. Nº 7.127.379). A análise de modelagem possibilita prognósticos confiáveis dos efeitos sobre o crescimento celular de —mudaro metabolismo para produção mais eficiente de BDO.
Um método computacional para identificar e planejar alterações metabólicas que favoreçam a biossíntese de um produto desejado é a matriz computacional OptKnock (Burgard et a/l., Biotechnol. Bioeng. 84: 647-657 (2003)). OptKnock é um program de modelagem e simulação
Do 93 metabólicas que sugere as estratégias de deleção de gene que resultam em microorganismos geneticamente estáveis que superproduzem o produto alvo.
Especificamente, a matriz examina a rede metabólica e/ou bioquímica completa de um microorganismo de modo a sugerir manipulações genéticas —que forcem o produto bioquímico desejado a se tornar um subproduto obrigatório do crescimento celular.
Pela ligação da produção bioquímica com crescimento celular através de deleções de gene estrategicamente colocadas ou outro rompimento de gene funcional, as pressões de seleção de crescimento impostas sobre as cepas engendradas depois de longos períodos “10 de tempo em um biorreator levam a melhoras no desempenho como um É resultado da produção bioquímica ligada ao crescimento compulsória.
Por último, quando as deleções de gene são construídas há uma possibilidade ' negligenciável das cepas planejadas reverterem para os seus estados do tipo " -- selvagem porque os genes selecionados pelo OptKnock devem ser completamente removidos do genoma.
Portanto, esta metodologia computacional pode ser usada para identificar caminhos alternativos que levam à biossíntese de um produto desejado ou usado em conexão com os organismos microbianos que não ocorrem naturalmente para otimização adicional da biossíntese de um produto desejado.
Em resumo, OptKnock é um termo aqui usado para se referir a , um método e sistema computacional para modelar o metabolismo celular.
O À programa OptKnock diz respeito a uma matriz de modelos e métodos que incorporam constrangimentos particulares dentro de modelos da análise de equilíbrio de fluxo (FBA). Estes constrangimentos incluem, por exemplo, informação cinética qualitativa, informação regulatória qualitativa, e/ou dados experimentais de microarranjo de DNA.
OptKnock também computa soluções para vários problemas metabólicos, por exemplo, pelo aperto dos limites de fluxo derivados através de modelos de equilíbrio de fluxo e subsequentemente sondando os limites de desempenho de redes metabólicas na presença de
. , 94 adições ou deleções de gene.
À matriz computacional OptKnock permite a construção de formulações modelo que possibilitam um questionamento eficaz dos limites de desempenho de redes metabólicas e fomece métodos para solucionar os problemas de programação lineares de número inteiro — misto resultantes.
Os métodos de modelagem e simulação metabólicas aqui aludidos como OptKnock são descritos, por exemplo, na publicação U.S. 2002/0168654, depositada em 10 de janeiro de 2002, na Patente Internacional Nº PCT/US02/00660, depositada em 10 de janeiro de 2002, e pedido de Patente U.S. serial Nº 11/891.602, depositado em 10 de agosto de 2007. Ss) Um outro método computacional para identificar e designar . alterações metabólicas que favoreçam a produção biossintética de um produto é um sistema de modelagem e simulação metabólicas chamado de SimFenyQ&. Este método e sistema computacionais são descritos, por exemplo, na f . publicação U.S. 2003/0233218, depositada em 14 de junho de 2002, e no Pedido de Patente Internacional Nº PCT/US03/18838, depositado em 13 de Junho de 2003. SimFenyQ& é um sistema computacional que pode ser usado para produzir um modelo de rede em ambiente virtual e para simular o fluxo de massa, energia ou carga através das reações químicas de um sistema biológico para definir um espaço de solução que contenha qualquer uma e todas as funcionalidades possíveis das reações químicas no sistema, é determinando deste modo uma faixa de atividades permitidas para o sistema biológico.
Este método é aludido como modelagem básica com à constrangimentos tendo em vista que o espaço de solução é definido pelos constrangimentos tal como a estequiometria conhecida das reações incluídas assim como constrangimentos termodinâmicos e de capacidade de reação associados com fluxos máximos através das reações.
O espaço definido por estes constrangimentos pode ser interrogado para determinar as capacidades fenotípicas e comportamentais do sistema biológico ou de seus componentes bioquímicos.
: À 95 é: Estes métodos computacionais são compatíveis com as realidades biológicas porque os sistemas biológicos são flexíveis e podem atingir o mesmo resultado em muitos modos diferentes. Sistema biológicos são planejados através de mecanismos evolucionários que foram restringidos S — pelos constrangimentos fundamentais que todos os sistemas vivos devem encarar. Portanto, a estratégia da modelagem básica com constrangimentos abrange estas realidades gerais. Além disso, a capacidade para impor continuamente outras restrições em um modelo de rede via o aperto dos : constrangimentos resulta em uma redução no tamanho do espaço de solução, realçando deste modo a precisão com que o desempenho fisiológico ou Á fenotípico pode ser prognosticado. Dadas as divulgações e orientação aqui fornecidas, aqueles habilitados na técnica serão capazes de aplicar várias matrizes computacionais para a modelagem e simulação metabólicas para planejar e implementar a biossíntese de um composto desejado em organismos microbianos hospedeiros. Tais métodos de modelagem e simulação metabólicas incluem, por exemplo, os sistemas computacionais exemplificados acima como SimFeny& e OptKnock. Para ilustração da invenção, alguns métodos são aqui descritos com referência à matriz de computação OptKnock para modelagem e simulação. Aqueles habilitados na técnica saberão como aplicar a ' identificação, planejamento e implementação das alterações metabólicas usando OptKnock para qualquer um de tais outras matrizes e métodos computacionais de modelagem e simulação metabólicas bem conhecidos na técnica.
Os métodos descritos acima fornecerão um conjunto de reações metabólicas para romper. A eliminação de cada reação dentro do conjunto ou modificação metabólica pode resultar em um produto desejado como um produto obrigatório durante a fase de crescimento do organismo. Porque as reações são conhecidas, uma solução para o problema OptKnock de
Á 9% nível duplo também fornecerá o gene ou genes associados que codificam uma ou mais enzimas que catalisam cada reação dentro do conjunto de reações. À identificação de um conjunto de reações e seus genes correspondentes que codificam as enzimas que participam em cada reação é no geral um processo — automatizado, realizado através da correlação das reações com uma base de dados de reação tendo uma relação entre as enzimas e os genes codificadores. Uma vez identificado, o conjunto de reações que deva ser rompido de modo a se obter a produção de um produto desejado são implementados na célula ou organismo alvos pelo rompimento funcional de ão pelo menos um gene que codifica cada reação metabólica dentro do conjunto. . Um meio particularmente útil para se obter o rompimento funcional do conjunto de reação é pela deleção de cada gene codificador. Entretanto, em alguns casos, pode ser benéfico romper a reação por outras aberrações É : genéticas incluindo, por exemplo, mutação, deleção de regiões reguladoras tais como promotores ou sítios de ligação cis para fatores regulatórios, ou pela truncagem da sequência codificadora em qualquer uma de várias localizações. Estas últimas aberrações, resultando em menos do que a deleção total do conjunto de gene pode ser útil, por exemplo, quando avaliações rápidas da ligação de um produto são desejadas ou quando a reversão genética é menos — provável ocorrer.
ó Para identificar soluções produtivas adicionais para oO problema OptKnock de nível duplo descrito acima que leva a conjuntos adicionais de reações para romper ou modificações metabólicas que podem resultar na biossíntese, incluindo a biossíntese ligada ao crescimento de um — produto desejado, um método de otimização, chamado de cortes de número inteiro, pode ser implementado. Este método processa-se resolvendo-se iterativamente o problema OptKnock exemplificado acima com a incorporação de um constrangimento adicional aludido como um corte de número inteiro em cada iteração. Os constrangimentos de corte de número
É 97 S inteiro eficazmente impede o procedimento de solução de escolher o mesmo conjunto exato de reações identificadas em qualquer iteração anterior que obrigatoriamente liga a biossíntese de produto ao crescimento. Por exemplo, se uma modificação metabólica ligada ao crescimento anteriormente identificada especifica as reações 1, 2, e 3 para o rompimento, então o constrangimento que segue impede as mesmas reações de serem simultaneamente consideradas em soluções subsequentes. O método de corte de número inteiro é bem conhecido na técnica e pode ser encontrado descrito, por exemplo, em Burgard et al., Biotechnol. Prog. 17: 791-797 (2001). Como com todos os métodos aqui descritos com referência ao seu uso em : combinação com a matriz computacional OptKnock para modelagem e simulação metabólicas, o método de corte de número inteiro de redundância redutora na análise computacional iterativa também pode ser aplicado com À À outras matrizes computacionais bem conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, SimFeny€.
Os métodos aqui exemplificados possibilitam a construção de células e organismos que biossinteticamente produzem um produto desejado, incluindo a ligação obrigatória da produção de um produto bioquímico alvo ao crescimento da célula ou organismo engendrados para abrigar as alterações genéticas identificadas. Portanto, os métodos computacionais aqui descritos possibilitam a identificação e implementação de modificações metabólicas : que são identificadas por um método em ambiente virtual selecionado de OptKnock ou SimFenyQ. O conjunto de modificações metabólicas podem incluir, por exemplo, a adição de uma ou mais enzimas do caminho — biossintético e/ou rompimento funcional de uma ou mais reações metabólicas incluindo, por exemplo, rompimento pela deleção de gene.
Como debatido acima, a metodologia OptKnock foi desenvolvida sobre a premissa de que redes microbianas mutantes podem ser evoluídas na direção dos seus fenótipos de crescimento náximo
SEetaaia 98 . — computacionalmente prognosticados quando submetidos a longos períodos de seleção de crescimento.
Em outras palavras, o método alavanca uma capacidade do organismo para auto-otimização sob pressões seletivas.
À matriz OptKnock possibilita a enumeração exaustiva de combinações — de deleção de gene que forçam uma ligação entre a produção bioquímica e o crescimento celular com base na estequiometria de rede.
A identificação de silenciamentos de gene/reação ideais requer a solução de um problema de otimização de nível duplo que escolhe o conjunto de reações . ativas tal que uma solução de crescimento ideal para a rede resultante — super produz a bioquímica de interesse (Burgard et al., Biotechnol.
Bioeng. . 84: 647-657 (2003)). Um modelo estequiométrico em ambiente virtual de metabolismo de E. coli pode ser utilizado para identificar genes essenciais : E para caminhos metabólicos como exemplificado anteriormente e descritos, por exemplo, nas publicações de Patente U.S.
US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466, e na Patente U.S.
Nº 7.127.379. Como aqui divulgada, a matriz matemática OptKnock pode ser aplicada para identificar com precisão deleções de gene levando à produção ligada ao crescimento de um produto desejado.
Além disso, a solução do problema , OptKnock de nível duplo fornece apenas um conjunto de deleções.
Para À enumerar todas as soluções significativas, isto é, todos os conjuntos de silenciamentos que leva à formação de produção ligada ao crescimento, uma técnica de optimização, chamada de cortes de número inteiro, pode ser implementada.
Isto acarreta necessariamente resolver iterativamente o problema OptKnock com a incorporação de um constrangimento adicional aludido como um corte de número inteiro em cada iteração, como debatido acima.
É entendido que modificações que não afetem
: 99 substancialmente a atividade das vários formas de realização desta invenção : também são fornecidas dentro da definição da invenção aqui fornecida.
Consequentemente, os seguintes exemplos são intencionados a ilustrar mas não limitar a presente invenção. “EXEMPLO! : Biossíntese do ácido 4-hidroxibutanóico Este exemplo descreve caminhos bioquímicos exemplares para a produção de 4-HB.
Relatos anteriores da síntese de 4-HB em micróbios têm “0 focalizado neste composto como um intermediário na produção do plástico - biodegradável poli-hidroxialcanoato (PHA) (Patente U.S.
Nº 6.117.658). O uso de copolímeros de 4-HB/3-HB em polímero de poli-3-hidroxibutirato (PHB) pode resultar em plástico que é menos quebradiço (Saito e Doi, Intl.
J.
É " Biol.
Macromol, 16: 99-104 (1994)). A produção de 4-HB monomérico aqui descrita é um processo fundamentalmente distinto por diversas razões: (1) o produto é secretado, como oposto ao PHA que é produzido intracelularmente e permanece na célula; (2) para organismos que produzem polímeros de hidroxibutanoato, 4-HB livre não é produzido, mas ao invés o derivado da Coenzima À é usado pela polihidroxialcanoato sintase; (3) no caso do — polímero, a formação do produto granular muda as termodinâmicas; e (4) o k pH extracelular não é um problema para a produção do polímero, ao passo À que o mesmo afetará se 4-HB estiver presente no estado de ácido livre ou base conjugada, e também o equilíbrio entre 4-HB e GBL. 4-HB pode ser produzido em duas etapas de redução — enzimática a partir de succinato, um metabólito central do ciclo de TCA, com semialdeído succínico como o intermediário (Figura 1). A primeira destas enzimas, a semialdeído succínico desidrogenase, é nativa a muitos organismos incluindo E. coli, em que as enzimas dependentes tanto de NADH quanto de NADPH foram encontradas (Donnelly e Cooper, Eur.
J.
Biochem.
. ; 100
' 113: 555-561 (1981); Donnelly e Cooper, J.
Bacteriol. 145: 1425-1427 (1981); Marek e Henson, J.
Bacteriol, 170: 991-994 (1988)). Também existe evidência que sustenta a atividade da semialdeído succínico desidrogenase em S. cerevisiae (Ramos et al., Eur.
J.
Biochem. 149: 401-404 (1985)), e um gene - putativo foi identificado pela homologia de sequência.
Entretanto, a maioria dos relatos indicam que esta enzima se processa na direção da síntese de succinato, como mostrado na Figura 1 (Donnelly e Cooper, supra; Lutke- Eversloh e Steinbuchel, FEMS Microbiol.
Lett. 181: 63-71 (1999)), que participam no caminho da degradação de 4-HB e gama-aminobutirato.
O - 10 —semialdeído succínico também é nativamente produzido por certos r organismos microbianos tais como E. coli através do intermediário do ciclo de S TCA ao-cetogluterato via a ação de duas enzimas: glutamato:semialdeído succínico transaminase e glutamato descarboxilase.
Um caminho alternativo, í e usado pelo anaeróbio obrigatório Clostridium Kkluyveri para degradar succinato, ativa succinato para succinil-CoA, depois converte succeinil-CoA para semialdeído succínico usando uma semialdeído succínico desidrogenase alternativa que é conhecida funcionar nesta direção (Sohling e Gottschalk, Eur.
J.
Biochem. 212: 121-127 (1993)). Entretanto, esta via tem o custo energético de ATP requerido para converter succinato para succinil-CoA.
A segunda enzima do caminho, a 4-hidroxibutanoato . desidrogenase, não é nativa à E. coli ou levedura mas é encontrada em várias ; bactérias tais como C. klwyveri e Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh e Steinbuchel, supra; Sohling e Gottschalk, J.
Bacteriol. 178: 871-880 (1996); Valentin et al., Eur.
J.
Biochem. 227: 43-60 (1995); Wolff e Kenealy, Protein Expr Purif. 6: 206-212 (1995)) Estas enzimas são conhecidas ser dependentes de NADH, embora formas dependentes de NADPH também existam.
Um caminho adicional para 4-HB a partir de alfa-cetoglutarato foi demonstrado na E. coli resultando no acúmulo de poli(ácido 4- hidroxibutírico) (Song er al., Wei Sheng Wu Xue.
Bao. 45: 382-386 (2005)).
e A 101 : A cepa recombinante requereu a superexpressão de três genes heterólogos, PHA sintase (R. eutropha), 4-hidroxibutirato desidrogenase (R. eutropha) e 4- hidroxibutirato:CoA transferase (C. kluyveri), junto com dois genes de E. coli nativos: glutamato:semialdeído —“succínico transaminase e glutamato — descarboxilase. As etapas 4 e 5 na Figura 1 podem ser alternativamente realizadas por um alfa-cetoglutarato descarboxilase tal como aquela identificada em Euglena gracilis (Shigeoka et al., Biochem. J. 282(Pt2): 319- 323 (1992); Shigeoka e Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288: 22-28 (1991); Shigeoka e Nakano, Biochem J. 292(Pt 2): 463-467 (1993)). Entretanto, esta enzima não foi anteriormente aplicada para impactar a produção de 4-HB ou polímeros relacionados em qualquer organismo.
As capacidades de produção microbiana de 4-hidroxibutirato foram exploradas em dois micróbios, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, usando modelos metabólicos em ambiente virtual de cada organismo. Os caminhos potenciais para 4-HB processou-se via um intermediário de succinato, succinil-CoA, ou alfa-cetoglutarato como mostrado na Figura 1. Uma primeira etapa no caminho de produção de 4-HB a partir de succinato envolve a conversão de succinato para semialdeído succínico via um semialdeído succínico desidrogenase dependente de NADH ou NADPH. f Na E. coli, gabD é uma semialdeído succínico desidrogenase dependente de í NADP e é parte de um grupo de gene envolvido na captação e degradação de 4-aminobutirato (Niegemann er al... Arch. Microbiol. 160: 454-460 (1993); Schneider er al., J. Bacteriol. 184: 6976-6986 (2002)). Acredita-se que sad —codifiquea enzima para a atividade de semialdeído succínico desidrogenase dependente de NAD (Marek e Henson, supra). A S. cerevisiae contém apenas a semialdeído succínico desidrogenase dependente de NADPH, putativamente designada para UGA?2 , que localiza no citossol (Huh er al., Nature 425: 686- 691 (2003)). Os cálculos de rendimento máximo assumindo o caminho de o 102 E succinato para 4-HB tanto na E. coli quanto na S. cerevisiae requer apenas a suposição de que uma desidrogenase 4-HB não nativa foi adicionada às suas redes metabólicas.
O caminho da succinil-CoA para 4-hidroxibutirato foi descrito na Patente US.
Nº 6.117.658 como parte de um processo para fabricar polihidroxialcanoatos que compreendem unidades monoméricas de 4- hidroxibutirato.
Clostridium kluyveri é um organismo de exemplo conhecido possuir Atividade de semialdeído succínico desidrogenase dependente de - CoA (Sohling e Gottschalk, supra; Sohling e Gottschalk, supra). Neste estudo, é assumido que esta enzima, de C. kluyveri ou um outro organismo, é expressada na E. coli ou S. cerevisiae junto com uma 4-HB desidrogenase não nativa ou heteróloga para completar o caminho da succinil-CoA para 4-HB.
O caminho de alfa-cetoglutarato para 4-HB foi demonstrado na E. coli resultando no acúmulo de poli(ácido 4-hidroxibutírico) a 30% do peso de célula seca (Song et al., supra). Como E. coli e S. cerevisiae nativa ou endogenamente —possuem tanto a glutamato:semialdeído —suceínico transaminase quanto a glutamato descarboxilase (Coleman et al., J.
Biol.
Chem. 276: 244-250 (2001)), o caminho de AKG para 4-HB pode ser completado em ambos os organismos assumindo-se apenas que uma 4-HB —desidrogenase não nativa esteja presente. f EXEMPLO II ã Biossíntese de 1,4-Butanodiol a partir de Succinato e Alfa- cetoglutarato Este exemplo ilustra a construção e produção biossintética de 4-HBeBDO a partir de organismos microbianos.
Os caminhos para 4-HB e BDO são aqui divulgados.
Existem diversas enzimas alternativas que podem ser utilizadas nos caminhos descritos acima.
A enzima nativa ou endógena para a conversão de succinato para succinil-CoA (etapa 1 na Figura 1) pode ser
. 103 : substituída por uma -CoA transferase tal como aquela codificada pelo gene cat! de C. kluyveri (Sohling e Gottschalk, Eur. J Biochem. 212: 121-127 (1993)), que funciona em uma maneira similar à Etapa 9. Entretanto, a produção de acetato por esta enzima pode não ser ideal, como seria secretada —aoinvésde ser convertida de volta para acetil-CoA. A este respeito, também pode ser benéfico eliminar a formação de acetato na Etapa 9. Como uma alternativa a esta -CoA transferase, um mecanismo pode ser utilizado em que o 4-HB é primeiro fosforilado pelo ATP e depois convertido para o derivado de -CoA, similar ao caminho da acetato cinase/fosfotransacetilase na E. coli —paraa conversão de acetato para acetil-CoA. O custo líquido desta via é um ATP, que é o mesmo como é requerido para regenerar para acetil-CoA a partir de acetato. As enzimas fosfotransbutirilase (ptb) e butirato cinase (bk) são conhecidas realizar estas etapas nas moléculas não hidroxiladas para a produção de butirato em C. acetobutilicum (Cary et al., Appl Environ Microbiol 56: 1576-1583 (1990); Valentina, R. C. e R. S. Wolfe, J Biol Chem. 235: 1948-1952 (1960)). Estas enzimas são reversíveis, permitindo que a síntese se processe na direção de 4-HB. BDO também pode ser produzido via a-cetoglutarato além ou ao invés de através do succinato. Um descrito anteriormente, e exemplificado mais abaixo, um caminho para realizar a biossíntese de f produto é com a produção de semialdeído succínico via a-cetoglutarato usando as enzimas endógenas (Figura 1, Etapas 4 a 5). Uma alternativa é usar uma a-cetoglutarato descarboxilase que pode realizar esta conversão em uma etapa (Figura 1, Etapa 8; Tian et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A 102: 10670- 10675(2005)).
Para a construção de cepas diferentes de organismos microbianos que produzem BDO, uma lista de genes aplicáveis foi montada para corroboração. Em resumo, um ou mais genes dentro dos caminhos de 4- HB e/ou BDO biossintéticos foram identificados para cada etapa do caminho que produz BDO completo mostrados na Figura 1, usando fontes da literatura disponíveis, a base de dados genéticos NCBI, e pesquisas de homologia.
Os genes clonados e avaliados neste estudo estão apresentados abaixo na Tabela 6, junto com as referências apropriadas e citações da URL para a sequência de — polipeptídeo.
Como debatido mais abaixo, alguns genes foram sintetizados quanto a otimização de códon enquanto outros foram clonados via PCR a partir do DNA genômico do organismo nativo ou do tipo selvagem.
Para alguns genes ambos os métodos foram usados, e neste caso os genes nativos são indicados por um sufixo “n” ao número de identificação do gene quando usado em um experimento.
Observe que apenas as sequências de DNA diferem; as proteínas são idênticas.
Tabela 6. Genes expressados em organismos microbianos hospedeiros que produzem BDO.
Número Número daNome dolOrganismo lome da enzima — [Link para a sequência de proteína da ID doreação jene fonte jene Fig. 1) o p a Clostridium — I-hidroxibutirato — Wwww.ncbi.nim.nih.gov/entrez/ leluyveri oenzima À iewer.fegi?db=nuccore&id= IDSM555S — hransferase 1228100 poo2 fiz2/13 hd lostridium — JAldeído/ álcool w.ncbi.nim.nih.gov/entrez/ lacetobutylicum Idesidrogenase iewer.fegi?db=protein&val=" ATCC 824 [15004739 voos 1/13 BdhE2 Tlostridium — jAldeído/ álcool rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Acetobutylicu Idesidrogenase iewer.fegi?val=NP 149325. Im ATCC 824 1 po04 at 1 lostridium — Succinato w.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Ikluyveri oenzima À iewer.fegi? db-nuceore&id= IDSM555 — Rransferase 1228100 . pboog 6 bucD Tlostridium — emialdeido -nebi.nlm.nih.gov/entrez/ KKluyveri desidrogenase iewer.fegi?db=nuccore&id= IDSMS555 — uceínica 1228100 : dependente dei (CoA o 4 Ralstonia A4-hidroxibutirato : Pr ; .nebi.nim.nih.gov/entrez/ utropha H16 desidrogenase — > hiowerfogidval=YP 726053. dependente — del, (AD) P FEB ciostridium — A bidroxibutirato — hr nobi.nlm.nih.gov/entrez/ : desidrogenase q... A luyveri > viewer.fegi?db=nuccore&id= Dependente de DSM 555 1228100 INAD) 001 — 2/13 adhE E. coli Aldeído/ álcool ww.shigen.nig.acjp/ecoli/pe Desidrogenase 'genes.List.
DetailAction.do?f FomListFlag=true&featureTyp es1&orfid=1219 poa [1/3 VahD IE. coli Aldeído/ álcool ww.shigen.nig.ac jp/ecoli/pe Desidrogenase 'genes.List.DetailAction.do
S 105 Número Número daNome dolDrganismo lome da enzima — [Link para a sequência de proteina S da ID doreação jene fonte iene Fig. 1 0013 13 b lostridium — |Butanol w.nebi.nlm.nih.gov/entrez/ Acetobutylicu IDesidrogenase II — viewer.fegi?val=NP 349891. ATCC 824 H 0020 bp lostridium 'osfo- nw.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Acetobutylicu ittransbutirilase iewer.fegi?db=protein&id=] Mm ATCC 824 896327 0021 bukl lostridium — |Butirato cinase T vww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ Acetobutylicu iewer.fegi?db=protein&id=2 m ATCC 824 0137334 p022 10 buley. lostridium — Butirato cinase TI rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ acetobutylicum iewer.fogi?db=protein&id=2 ATCC 824 0137415 0023 13 adhEm isolada da Álcool Imetabiblioteca desidrogenase de consórcios) Imicrobianos de digestor de água de esgoto) anaeróbico Tabela 6 (continuação) fúmero dalNúmero daNome dolOrganismo fome da enzima — [ink para a sequência de proteína ID do Gene reação iene Ifonte Fig. 1) rermocellum —Idesidrogenase bin/www bget?cth:Cthe 0423 a p Devaneio — ação aideido — POvwncbiim-aih goventrez/viewe desidrogenase I.fegi?db=protein&id=4903668] 0026 13 bdhA lostridium |Butanol rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewe acetobutylicum |Desidrogenase I.fegi?val=-NP 349892. ATCC 824 1 0027 12 b lostridium Butiraldeído rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewe ;accharoperbui desidrogenase |fogi?db=protein&id=31075383 placetonicum 0028 13 bd lostridium [Butano] rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewe raccharoperbut desidrogenase r.fegi?db=protein&id=124221917 Wlacetonicum 7 tetani desidrogenase bin/www bget?cte:CTCO1366 perfringens desidrogenase bin/www bget?cpe:CPE2531 a Aa A difficile desidrogenase bin/www bget?cdf.CD2966 0032 sucA rcobacterium la-cetoglutarato rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewe bovis descarboxilase r.fegi?val=YP 977400. BCG, Pasteur 1 po033 at2 lostridium 4-hidroxibutirato á ” ; > : .nebi.nim.nih.gov/entrez/viewe |O nem Eme onte um ransferase pasa o bie oo e na o ww.ncbi.nlm.nib.gov/entrez/viewe Nv83 transferase fegi?rdb=protein&val=34541558 0035 6 kucD — [Porphyromonas Semialdeido rww.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewe Bingivalis desidrogenase r.fogi?val=NP 904963. 1 W83 uccínica dependente = de A)
o 106 é ID do Gene reação iene — fonte SETA aa SIA Arneiro HORAS O Ea AREAS TER FE ss
E EEE RS EE Construção de Vetor de Expressão para o caminho de BDO. As cadeias principais de vetor e algumas cepas foram obtidas do Dr. Rolf Lutz da Expressys (www.expressys.de/). Os vetores e cepas são com base no Sistema de Expressão pZ desenvolvido pelo Dr. Rolf Lutz e Prof. Hermann —Bujard(Lutz, R.eH. Bujard, Nucleic Acids Res 25: 1203-1210 (1997)). Os vetores obtidos foram pZEl3luc, pzZA33luc, pZS*13luc e pZE22luc e contiveram o gene da luciferase como um fragmento de vedação. Para substituir o fragmento de vedação da luciferase com um fragmento lacZ-alfa flanqueado pelos sítios de enzima de restrição apropriados, o fragmento de vedação da luciferase foi primeiro removido de cada vetor pela digestão com EcoRI e Xbal. O fragmento lacZ-alfa foi amplificado pela PCR a partir de PpUC19 com os seguintes iniciadores: lacZalfa-RI S" GACGAATTCGCTAGCAAGAGGAGAAGTCGACATGTCC AATTCACTGGCCGTCGTTTTAC3* lacZalfa 3'BB 5*-GACCCTAGGAAGCTTTCTAGAGTCGACCTATGCGG : CATCAGAGCAGA-3'. Isto gerou um fragmento com uma extremidade 5º do sítio EcoRI, sítio Nhel, um Sítio de Ligação de Ribossoma, um sítio Sall e o códon de partida. Na extremidade 3º do fragmento conteve o códon de parada, sítios Xbal, Hindlll, e AvrIll. O produto de PCR foi digerido com EcoRI e AvrlI e ligado nos vetores base digeridos com EcoRI e Xbal (Xbal e Avrll têm extremidades compatíveis e geram um não sítio). Porque os sítios de enzima de restrição Nhel e Xbal geram extremidades compatíveis que podem ser ligadas entre si (mas geram um não a AA 107
. sítio Nhel/Xbal que não é digerido por cada uma das enzimas), os genes “clonados nos vetores podem ser “Biobrickel' entre si (http://openwetware.org/wiki/Synthetic Biology:BioBricks). Em resumo, este método possibilita a união de um número ilimitado de genes no vetor usando os mesmos 2 sítios de restrição (contanto quê os sítios do não apareçam internos para o genes), porque os sítios entre os genes são destruídos depois de cada adição.
Todos os vetores têm a designação pZ seguida pelas letras e números que indicam a origem de replicação, marcador de resistência a antibiótico e unidade promotora/reguladora.
A origem de replicação é a segunda letra e é denotada por E para ColE1, A para pl5A e S para pSC101 - com base nas origens.
O primeiro número representa o marcador de resistência a antibiótico (1 para Ampicilina, 2 para Canamicina, 3 para Cloranfenicol, 4 para Espectinomicina e 5 para Tetraciclina). O número final define o promotor que regulou o gene de interesse (1 para Priio-1, 2 para Priaco-1, 3 para Pariaco-1, 6 4 para Piaciara-1). O MCS e o gene de interesse segue imediatamente depois.
Para o trabalho debatido aqui nós utilizamos dois vetores base, pZA33 e pZEl3, modificado para as inserções de biobricks como debatido acima.
Uma vez que o(s) gene(s) de interesse foi/foram —clonado(s) dentro deles, os plasmídeos resultantes são indicados usando os ' códigos de gene de quatro dígitos dados na Tabela 6; por exemplo, pZA33- Construção de Cepa Hospedeira.
A cepa precursora em todos os estudos aqui descritos é a E. coli K-12 cepa MG1655. As cepas de deleção sem marcador em adhE, gabD, e aldA foram construídas sob contrato de serviço por uma terceira parte usando o método de redET (Datsenko, K.
A. e B.
L.
Wanner, Proc Natl Acad Sci U.S.A 97: 6640-6645 (2000)). As cepas subsequentes foram construídas via transdução mediada pelo bacteriófago P1 (Miller, J.
Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor
DE Tao 108 : Laboratories, Nova Iorque (1973)). A cepa C600Z1 (laci%, PN25-tetR, SP lacY 1, leuB6,mcrB+, supE44, thi-1, thr-1, tonA21) foi obtido da Expressys e foi usada como uma fonte de um alelo lacIº para a transdução de PI. O bacteriófago Pl vir foi cultivado na cepa C600Z1 da E. coli, que tem o gene de resistência à espectinomicina ligado ao lacIº. O lisado Pl cultivado em C600Z1 foi usado para infectar MG1655 com seleção quanto a resistência à espectinomicina. As colônias resistentes à espectinomicina foram então triadas quanto ao lacIº ligado determinando-se a capacidade dos transdutores para reprimir a expressão de um gene ligado a um promotor Panaco-1. À cepa resultante foi designada MG1655 lacIº. Um procedimento similar foi usado para introduzir lacIº nas cepas de deleção.
Produção de 4-HB de Succinato. Para a construção de um produtor 4-HB a partir de succinato, os genes que codificam as etapas de succinato para 4-HB e 4-HB-CoA (1, 6, 7, e 9 na Figura 1) foram montados sobre os vetores pZA33 e pZE13 como descrito abaixo. Várias combinações de genes foram avaliadas, assim como construções que carregam caminhos incompletos como controles (Tabelas 7 e 8). Os plasmídeos foram então transformados em cepas hospedeiras contendo lacIº, que possibilita a expressão indutível pela adição de isopropil O-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG). Tanto do tipo selvagem quanto hospedeiros com deleções nos genes f que codificam a semialdeído succínico desidrogenase nativa (etapa 2 na ; Figura 1) foram testados.
A atividade das enzimas heterólogas foi primeiro testada em ensaios in vitro, usando a cepa MG1655 lacIº como o hospedeiro para as — construções de plasmídeo contendo os genes do caminho. As células foram cultivadas aerobicamente em meio LB (Difco) contendo os antibióticos apropriados para cada construção, e induzidos pela adição de IPTG a ImM quando a densidade óptica (ODçoo) atingiu aproximadamente 0,5. As células foram colhidas depois de 6 horas, e os ensaiso de enzima conduzidos como
So 109 Ê debatido abaixo.
Ensaios de Enzima In Vitro. Para obter os extratos brutos para os ensaios de atividade, as células foram colhidas pela centrifugação a 4.500 rpm (Beckman-Coulter, Allegera X-15R) por 10 min. As pelotas foram recolocadasem suspensão em 0,3 ml de reagente BugBuster (Novagen) com : benzonase e lisozima, e a lise processou-se por 15 minutos na temperatura ambiente com agitação suave. O lisado isento de célula foi obtido pela centrifugação a 14.000 rpm (centrífuga Eppendorf 5402) por 30 min a 4ºC. À proteína de célula na amostra foi determinada usando o método de Bradford er al, Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976), e os ensaios de enzima específicos conduzidos como descrito abaixo. As atividades são relatadas em Unidades/mg de proteína, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima requerida converter 1 umol de substrato em 1 min. Na temperatura ambiente. No geral, os valores relatados são médias de pelo menos3 ensaios em réplica. A atividade de succinil-CoA (Catl) foi determinada pela monitoração da formação de acetil-CoA a partir de succinil-CoA e acetato, que segue um procedimento anteriormente descrito Sohling e Gottschalk, J. Bacteriol. 178: 871-880 (1996). A atividade da succinil-CoA sintetase —(SucCD) foi determinada seguindo-se a formação de succinil-CoA a partir de : succinato e-CoA na presença de ATP. O experimento seguiu um ã procedimento descrito por Cha e Parks, J. Biol. Chem. 239: 1961-1967 (1964). A atividade de succinato semialdeído desidrogenase (SucD) dependente de -CoA foi determinada seguindo-se a conversão de NAD para —NADH a340 nm na presença de succinato semialdeído e-CoA (Sohling e Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212: 121-127 (1993)). A atividade da enzima 4- HB desidrogenase (4-HBd) foi determinada monitorando-se a oxidação de NADH para NAD a 340 nm na presença de succinato semialdeído. O experimento seguiu um procedimento publicado Gerhardt et al. Arch.
to 110 - — Microbiol. 174: 189-199 (2000). A atividade da 4-HB-CoA transferase (Cat2) foi determinada usando um procedimento modificado de Scherf e Buckel, Appl. Environ. Microbiol. 57: 2699-2702 (1991). A formação de 4-HB-CoA ou a formação de butiril-CoA a partir de acetil-CoA e 4-HB ou butirato foi — determinada usando HPLC. O A álcool (ADH) e aldeído (ALD) desidrogenase foram ensaiadas na direção redutiva usando um procedimento adaptado de diversas fontes da literatura (Durre et al., FEMS Microbiol. Rev. 17: 251-262 (1995); Palosaari e Rogers, J. Bacteriol. 170: 2971-2976 (1988) e Welch et al., Arch. Biochem. Biophys. 273: 309-318 (1989). A oxidação de NADH é seguida pela leitura da absorbância a 340 nM a cada quatro segundos por um total de 240 segundos na temperatura ambiente. Os ensaios redutivos foram realizados em 100mM de MOPS (ajustado ao pH 7,5 com KOH), 0,AmM de NADH, e de 1 a 50 ul de extrato de célula. A reação é iniciada pela adição dos seguintes reagentes: 100 ul de acetaldeído ou butiraldeído a 100mM para ADH, ou 100 ul de acetil-CoA ou butiril-CoA ImM para ALD. O espectrofotômetro é rapidamente ajustado ao branco e então a leitura cinética é iniciada. À inclinação resultante da redução na absorbância a 340 nM por minuto, junto com o coeficiente de extinção molar de NAD(P)H a 340 nM (6000) e a concentração de proteína do extrato, pode ser usado para determinar a atividade específica.
: A atividade de enzima de PTB é medida na direção do butiril- CoA para butiril-fosfato como descrito em Cary et al. J. Bacteriol. 170: 4613- 4618 (1988). O mesmo fornece fosfato inorgânico para a conversão, e segue o — aumento no-CoA livre com o reagente 5,5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico), ou DTNB. DTNB rapidamente reage com grupos tiol tal como-CoA livre para liberar o ácido 2-nitro-S-mercaptobenzóico colorido de amarelo (TNB), que absorve em 412 nm com um coeficiente de extinção molar de 14,140 M em". O tampão de ensaio conteve 150mM de fosfato de potássio no pH 7,4, 0,ImM
E 1 de DTNB, e 0,2mM de butiril-CoA, e a reação foi começada pela adição de 2 a 50 ul de extrato de célula. A atividade de enzima de BK é medida na direção do butirato para a formação de butirilfosfato às custas do ATP. O procedimento é similar ao ensaio para a acetato cinase anteriormente descrita —Roseetal,].Biol. Chem. 211: 737-756 (1954). Entretanto nós descobrimos um outro protocolo de ensaio de enzima da acetato cinase fornecido por Sigma como sendo mais útil e sensível. Este ensaio liga a conversão de ATP ao ADP pela acetato cinase para a conversão ligada de ADP e fosfoenol piruvato (PEP) para ATP e piruvato pela piruvato cinase, seguido pela conversão de piruvato e NADH para lactato e NAD+ pela lactato desidrogenase. Substituir butirato no lugar do acetato é a única modificação principal para permitir que o ensaio siga a atividade da enzima BK. A mistura de ensaio conteve 80mM de tampão de trietanolamina no pH 7,6, 200mM de butirato de sódio, 10OmM de MgCl, 0,ImM de NADH, 6,6mM de ATP, 13 1,8mM de fosfoenolpiruvato. A piruvato cinase, lactato desidrogenase, e miocinase foram adicionadas de acordo com as intruções do fabricante. À reação foi iniciada pela adição de 2 a 50 ul de extrato de célula, e a reação foi monitorada com base na diminuição na absorbância a 340 nm indicando oxidação de NADH.
Análise de Derivados de -CoA pela HPLC. Um ensaio com É base na HPLC foi desenvolvida para monitorar reações enzimáticas ã envolvendo a transferência da coenzima A (CoA). O método desenvolvido permitiu a caracterização da atividade de enzima pela determinação quantitativa de misturas de -CoA, acetil-CoA (AcCoA), butiril-CoA (BuCoA) e 4-hidroxibutirato-CoA (4-HBCoA) presentes na reação in vitro. À sensibilidade até uM mais baixo foi obtida, assim como excelente resolução de todos os derivados de -CoA de interesse. A química e preparação da amostra foram realizadas como segue. Em resumo, -CoA, AcCoA, BuCoA e todos os outros produtos
EA 112 . — químicos, foram obtidos da Sigma-Aldrich. Os solventes, metanol e acetonitrila, foram do grau de HPLC. As curvas de calibração padrão exiram excelente linearidade na faixa de concentração de 0,01 a 1 mg/ml. As misturas de reação enzimáticas contiveram 100mM de tampão de Tris HCl (pH 7), as alíquotas foram tiradas em pontos de tempo diferentes, extintas com ácido fórmico (0,04% concentração final) e diretamente analisada pela HPLC. A análise de HPLC foi realizada usando um sistema Agilent 1100 HPLC equipado com uma bomba binária, degaseificador, autoamostrador controlado com termostato e compartimento de coluna, e — detetor de série de diodo (DAD), foi usado para a análise. Uma coluna de fase reversa, Kromasil 100 5 um C18, 4,6 x 150mM (Peeke Scientific), foi utilizada. 25SmM de fosfato de potássio (pH 7) e metanol ou acetonitrila, foram usados como solventes aquosos e orgânicos a 1 ml/min de taxa de fluxo. Dois métodos foram desenvolvidos: um curto com um gradiente mais rápido para a análise de bem resolvido-CoA, AcCoA e BuCoA, e um método mais longo para distinguir entre ACCOA e 4-HBCoA que eluem mais próximo. O método curto utilizou gradiente de acetonitrila (O min - 5%, 6 min - 30%, 6,5 min - 5%, 10 min - 5%) e resultou nos tempos de retenção de 2,7, 4,1 e 5,5 min para-CoA, AcCoA e BuCoA, respectivamente. No método longo metanol foi usado com o seguinte gradiente linear: O min - 5%, 20 min - * 35%, 20,5 min - 5%, 25 min - 5%. Os tempos de retenção para-CoA, AcCoA, 4-HBCoA e BuCoA foram 5,8, 8,4, 9,2 e 16,0 min, respectivamente. O volume de injeção foi de 5 ul, a temperatura de coluna 30ºC, e a absorbância UV foi monitorada a 260 nm.
Os resultados demonstraram atividade de cada uma das quatro etapas do caminho (Tabela 7), embora a atividade seja claramente dependente da fonte de gene, posição do gene no vetor, e do contexto de outros genes com que a mesma é expressada. Por exemplo, o gene 0035 codifica uma semialdeído succínico desidrogenase que é mais ativa do que aquela codificada por 0008, e 0036 e 0010n são genes da 4-HB desidrogenase mais ativos do que 0009. Também parece haver melhor atividade da 4-HB desidrogenase quando existe um outro gene que a precede no mesmo operon.
Tabela 7. As atividades de enzima in vitro em extratos de célula de MG1655 — lack contendo os plasmídeos que expressam genes no caminho da 4-HB- CoA.
As atividades são relacionados em Unidades/mg de proteína, onde uma unidade de atividade é definida como a quantidade de enzima requerida para converter | umol de substrato em 1 min. na temperatura ambiente.
Ea O ear ooo II a os | og EB eso seo BP ng so on as Ea ear (0008) ooo Pu oa [ao [ow on | | | Fo asia Ea Tra O OCO OA O sc o a LIDO aaa OCO OO OA o near o AHPAINOA La ao BD O eos O LE Io amaro as ga Ed O o Ao Aabdfontia a as EE [— eaçooos)sucDro0ss| —arsaçõoos) — [3207 | soa | o600 | 185 [om | | . [160 eat (0004)-sucD(0035)) — anbaçoose) — | 208 | sao os | 173 | oa | [1 eat (0004)-sucD (0035)|— Anba(o0lOm) — | 244 | 473. | 0679 | 228 | 037 | | Ss [12 eat (0004)-sucD (0008) anbaçõoos) Togo 572 | oo og - [13 JearooonsucDrooos)| —anbaçoosa) To | so | Gs898 | oo [oa | | [14 ear (0008)sucD(0008)] “anbaçootomy “| 063 | 47 | 0776 | 066 | 000 | | E O O O at (tos) ass Tao PO ECC uase Es reposa-neaçosa | 313 | 80 | | | 286 | 099] A uu eaçoo3 4) anbaçootona [a ras ras | 0,675 | EB | nanosa-canroosa) | 2.69 | 826 [| | 215 | 749 | us uns Appd(0010n)-camçoosa) | aaa Pe Cosa | 4101 | (a) Genes expressados a partir de Plac em pZE13, um plasmídeo de cópia alta com origem colE1 e resistência à ampicilina.
Os números de identificação de gene são como dados na Tabela 6 (b) Genes expressados a partir de Plac em pZA33, um plasmídeo de meia-cópia com origem pACYC e resistência ao cloranfenicol. (c) A proteína de célula dada como mg de proteína por ml de extrato.
As cepas recombinantes contendo genes no caminho de 4-HB foram então avaliadas quanto a capacidade para produzir 4-HB in vivo a partir de intermediários metabólicos centrais.
As células foram cultivadas anaerobicamente em meio LB para ODçoo de aproximadamente 0,4, depois induzidas com ImM de IPTG.
Uma hora mais tarde, succinato de sódio foi adicionado a. 10mM, e as amostras coletadas para análise a seguir de um adicional de 24 e 48 horas. 4-HB no caldo de cultura foi analisado pela GC- MS como descrito abaixo.
Os resultados indicam que a cepa recombinante pode produzir acima de 2mM de 4-HB depois de 24 horas, comparado com essencialmente zero na cepa de controle (Tabela 8).
e 114 Tabela 8. Produção de 4-HB a partir de succinato em cepas de E. coli que abrigam plasmídeos que expressam várias combinações de genes do caminho de 4-HB [OL | MISS Ea | ca 0004sucD (0085) | ARRaDO09) | OX7 | 487 | 1036 | 108 | 1780 | 170 | [2 | MGi6ssiada | car! (0004)-sucD (0035) | anbaçooa7) | o41 | mm | 27% | 09% | 24 5 | [3 | MGi655iacaq | cart (0004)-sucD(0035) | “anbaçooss) | 047 | 863 | 1835 | 048 | 2152 | 4484 | | 4 | MGI655Tacaq | catl (0004)-sucD(0035) | 4anbdçooiom) | 046 | 956 | 2078 | 049 | 2221 | 4533 | [5 | MGI65SIada | cart ç0004)sucD(0008) | snbaçonos) | 038 | 493 | 1296 | 037 | 1338 | 3616 | | s | MGI6SSIada | cati(0004)sucD(0008) | anbaçoan | 032 | 26 | 8 | 027 | 8 | 33) cat] (0004)-sucD (0008) [8 | MGI65S aca — | cat (0004)sucD(0008) | Ahbaçooron | 024 | 78 | 324 | 0,56 | 233 | 416 | | —9 — | MGI655 laclg gabD | cat1 (0004)-sucD (0035) | “anbaçooos) | o53 | se | 137 | 103 [163 | 1595 | | 10 | MGI655laciq gabD | catl (0004)sucD(0035) | anbaçonam | o | 92 | 209 | nos | 214 | 218 | | 14 — | MGI655Iaclg gabD | catl (0004)-sucD (0008) | anbaçooam | ost | 19 36 | o7 (so | 47 | | 15 | MGI655TaclggabD | catl (0004)-sucD (0008) | 4nbdçõoso) | 035 | 584 | 1669 | 078 | 1350 | 1731 | [7 |] MGi6ssida | —apenasvetor — | apenasvetor | 08 | 7 12 ag po pa) [18 |MGI65SIaciggabD| —apenasvetor — | apenas vetor | 089 | 1 | 2 [1a (a) Concentração de 4-HB normalizado, unidades de uM/OD600 Uma alternativa para usar uma-CoA transferase (catl) para — produzir succinil-CoA a partir de succinato é usar os genes sucCD de E. coli nativo, que codifica a succinil-CoA sintetase.
Este grupo de genes foi clonado em pZE13 junto com genes candidatos para as etapas remanescentes a 4-HB para criar pZE13-0038-0035-0036. Produção de 4-HB a partir de Glicose.
Embora os experimentos acima demonstrem um caminho funcional para 4-HB a partir de um intermediário metabólico central (succinato), um processo industrial requeriria a produção de produtos químicos a partir de estoques de . alimentação de carboidrato de custo baixo tal como glicose ou sacarose.
Assim, o conjunto seguinte de experimentos foi almejado determinar se —succinato endógeno produzido pelas células durante o crescimento em glicose incentivaria o caminho de 4-HB.
As células foram cultivadas anaerobicamente em meio mínimo M9 (6,78 g/L de Na?HPO,, 3,0 g/L de KHPO,, 0,5 g/L de NaCl, 1,0 g/L de NH,CI, IMM de MgSO,, 0,ImM de CaCb) suplementado com 20 g/L de glicose, 100mM do ácido 3-(N- —morfolino)propanossulfônico (MOPS) para melhorar a capacidade de
+ 115 tamponação, 10 ug/ml de tiamina, e os antibióticos apropriados. 0,25mM de Í IPTG foi adicionado quando ODrçoo atingiu aproximadamente 0,2, e as amostras tomadas para a análise de 4-HB a cada 24 horas a seguir da indução.
Em todos os casos 4-HB estabilizou-se depois de 24 horas, com um máximo de cerca de IMM nas melhores cepas (Figura 3a), enquanto que a E concentração de succinato continuou a subir (Figura 3b). Isto indica que o fornecimento de succinato para o caminho é provavelmente não limitante, e que o gargalo pode estar na atividade das próprias enzimas ou na disponibilidade de NADH. 0035 e 0036 são claramente os melhores — candidatos a gene para a semialdeído succínico desidrogenase dependente de - CoA e 4-HB desidrogenase, respectivamente.
A eliminação de um ou ambos os genes codificadores conhecidos (gabD) ou putativo (aldA) as semialdeído ! succínico desidrogenases nativas tiveram pouco efeito sobre o desempenho. à.
Finalmente, deve ser mencionado que as células cresceram a uma OD muito mais baixanas cepas que produzem 4-HB do que nos controles (Figura 3c). Um caminho alternativo para a produção de 4-HB a partir de glicose é via a-cetoglutarato.
Nós exploramos o uso de uma a-cetoglutarato descarboxilase de Mycobacterium tuberculosis Tian et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 102: 10670-10675 (2005) para produzir semialdeído succínico diretamente de a-cetoglutarato (etapa 8 na Figura 1). Para demonstrar que este õ gene (0032) foi funcional in vivo, nós o expressamos em pZEl3 no mesmo À hospedeiro como a 4-HB desidrogenase (gene 0036) em pZA33. Esta cepa foi capaz de produzir acima de 1,0mM de 4-HB dentro de 24 horas que seguem a indução com 1ImM de IPTG (Figura 4). Visto que esta cepa não expressa uma —semialdeído desidrogenase succínica dependente de -CoA, a possibilidade de produção da semialdeído succínico via succinil-CoA é eliminada.
Também é possível que os genes nativos responsáveis pela produção de semialdeído suceínico funcionaria neste caminho (etapas 4 e 5 na Figura 1); entretanto, a quantidade de 4-HB produzida quando o plasmídeo pZE13-0032 foi deixado
- 116 - — forado hospedeiro é negligenciável.
Produção de BDO a partir de 4-HB. A produção de BDO a partir de 4-HB requereu duas etapas de redução, catalisadas pelas desidrogenases. A álcool e aldeído desidrogenases (ADH e ALD, — respectivamente) são enzimas dependentes de NAD+/H e/ou NADP+/H que juntas podem reduzir um grupo do ácido carboxílico em uma molécula para um grupo álcool, ou ao contrário, podem realizar a oxidação de um álcool para um ácido carboxílico. Esta biotransformação foi demonstrada em Clostridium acetobutilium do tipo selvagem (Jewell er al., Current Microbiology, 13: 215-19 (1986)), mas nenhuma das enzimas responsáveis nem os genes responsáveis foram identificados. Além disso não é conhecido se a ativação para 4-HB-CoA é primeiro requerida (etapa 9 na Figura 1), ou se : a aldeído desidrogenase (etapa 12) pode atuar diretamente sobre 4-HB. Nós " desenvolvemos uma lista de enzimas candidatas de C. acetobutilicum e organismos relacionados com base na atividade conhecida com os análogos não hidroxilados para 4-HB e caminhos intermediários, ou pela similaridade a estes genes caracterizados (Tabela 6). Visto que alguns dos candidatos são desidrogenases multifuncionais, eles potencialmente catalisariam tanto a redução dependente de NAD(P)H do ácido (ou derivado de -CoA) para o —aldeído,e do aldeído para o álcool. Antes de começar a trabalhar com estes f genes na E. coli, nós primeiro validamos o resultado dado como referência : acima usando C. acetobutilicum ATCC 824. As células foram cultivadas em caldo de Schaedler (Accumedia, Lansing, MI) suplementado com 10mM de 4-HB, em uma atmosfera anaeróbica de 10% de CO», 10% de H,, e 80% de —N;a30ºC.as amostras de cultura periódicas foram coletadas, centrifugadas, e o caldo analisado para BDO pela GC-MS como descrito abaixo. As concentrações de BDO de 0,ImMM, 0,9mM, e 1,5mM foram detectadas depois de 1 dia, 2 dias, e 7 dias de incubação, respectivamente. Nenhum BDO foi detectado em cultura cultivada sem adição de 4-HB. Para demonstrar que o
- 17 BDO produzido foi derivado de glicose, nós cultivamos a melhor cepa produtora de BDO MG1655 lacIº pZE13-0004-0035-0002 pZA33-0034-0036 em meio mínimo M9 suplementado com 4 g/L de "C-glicose uniformemente rotulado. As células foram induzidas na OD de 0,67 com ImM de IPTG, e uma amostra tirada depois de 24 horas. A ânálise do sobrenadante de cultura foi realizado pela espectrometria de massa.
Os candidatos a gene para o caminho da conversão de 4-HB para BDO foram em seguida testados quanto a atividade quando expressada no hospedeiro E. coli MG1655 lacIº. As cepas recombinantes contendo cada candidato a gene expressadas em pZA33 foram cultivadas na presença de 0,25mM de IPTG por quatro horas a 37ºC para induzir totalmente a expressão da enzima. Quatro horas depois da indução, as células foram colhidas e ensaiadas quanto a atividade de ADH e ALD como descrito acima. Visto que E 4-HB-CoA e 4-hidroxibutiraldeído não são comercialmente disponíveis, os ensaios foram realizados usando os substratos não hidroxilados (Tabela 9). À razão na atividade entre os substratos de 4-carbono e 2-carbono para C. acetobutilicum adhE2 (0002) e E. coli adhE (0011) foram similares a aqueles anteriormente relatados na literatura Atsumi et al., Biochim. Biophys. Acta. 1207: 1-11 (1994). Tabela9. Atividades in vitro de enzima em extrato de células de MG1655 : lacIº contendo candidatos a gene que expressam pZA33 para aldeído e álcool é desidrogenases. As atividades são expressadas em umol min" mg célula proteína”. N.D., não determinado. [| [| Aldeídodesidrogense — ] ————AÁlcooldesidrogenase == >| EO ad OO ND ND. oa aços | oo | ooo | Para os experimentos de produção de BDO, cat? de — Porphyromonas gingivalis W83 (gene 0034) foi incluído no pZA33 para a
* 118 À conversão de 4-HB para 4-HB-CoA, enquanto os genes da desidrogenase candidatos foram expressados em pZE13. A cepa hospedeira foi MG1655 lacIº.
Junto com os candidatos para álcool e aldeído desidrogenase, nós também testamos a capacidade das semialdeído desidrogenases succínicas — dependente de-CoA (sucD) para funcionar nesta etapa, devido à similaridade dos substratos.
As células foram cultivadas a uma OD de cerca de 0,5 em meio suplementado com 10mM de 4-HB, induzido com ImM de IPTG, e as amostras do caldo de cultura tiradas depois de 24 horas e analisadas quanto a BDO como descrito abaixo.
A melhor produção de BDO ocorreu usando —adhE2 de C. acetobutilicum, sucD de C. kluyveri, ou sucD de P. gingivalis (Figura 5). De maneira interessante, a quantidade absoluta de BDO produzida foi mais alta sob condições aeróbicas; entretanto, isto é primariamente devido à densidade de célula mais baixa obtida em culturas anaeróbicas.
Quando f normalizado para a OD de célula, a produção de BDO por biomassa unitária é —maisaltaem condições anaeróbicas (Tabela 10). Tabela 10. Concentrações de BDO absolutas e normalizadas de culturas de células que expressam adhE2 de C. acetobutilicum, sucD de C. kluyveri, ou sucD de P. gingivalis (dados dos experimentos 2, 9, e 10 na Figura 3), assim como o controle negativo (experimento 1). Eee ND o OO as Eae O Agróbis n | nenhum — | Mieroaeróbicas | os o | oo : | ooosm — | Anaeróbicas 608 og 98 | Como debatido acima, pode ser vantajoso usar uma via para converter 4-HB para 4-HB-CoA que não gera acetato como um subproduto.
Para este objetivo, nós testamos o uso de fosfotransbutirilase (ptb) e butirato
. — cinase(bk)deC. acetobutilicum realizar esta conversão via etapas 10 e 11 na Figura 1. O operon nativo ptb/bk de C. acetobutilicum (genes 0020 e 0021) foi clonado e expressado em pZA33. Os extratos de células contendo a construção resultante foram coletados e ensaiados quanto as duas atividades de enzima como aqui descrito.
A atividade específica de BK foi de aproximadamente 65 U/mg, enquanto que a atividade específica de PTB foi de aproximadamente 5 U/mg.
Uma unidade (U) de atividade é definida como conversão de 1 uM de substrato em 1 minuto na temperatura ambiente.
Finalmente, a construção foi testada quanto a participação na conversão de 4- HB para BDO.
As cepas hospedeiras foram transformadas com a construção pZA33-0020-0021 descrita e pZE13-0002, e comparada ao uso de cat2 na . produção de BDO usando o procedimento aeróbico usado acima na Figura 5. A cepa BK/PTB produziu IMM de BDO, comparada a 2mM quando do uso x de cat2 (Tabela 11). De maneira interessante, os resultados foram dependentes desea cepa hospedeira conteve uma deleção no gene adhE nativo.
Tabela 11. Concentrações de BDO absolutas e normalizadas de culturas de células que expressam adhE2 de C. acetobutilicum em pZE13 junto com cat2 de P. gingivalis (0034) ou os genes PTB/BK de C. acetobutilicum em pZA33. As cepas hospedeiras foram MG1655 lacIº ou MG1655 AadhE lacIº. - ooo | MGi6SSieo | ow 8 | ooo | Produção de BDO a partir de Glicose.
A etapa final de corroboração do caminho é expressar tanto o segmento 4-HB quanto o BDO do caminho em £. coli e demonstrar a produção de BDO em meio mínimo de glicose.
Novos plasmídeos foram construídos de modo que todos os genes requeridos ajustam-se aos dois plamídeos.
No geral, os genes catl, adhE, e — sucD foram expressados a partir de pZE13, e cat2 e 4-HBd foram expressados a partir de pZA33. Várias combinações de fonte de gene e ordem de foram testadas no fundo MGI655 laclº.
As células foram cultivadas
” 120 anaerobicamente em meio mínimo M9 (6,78 g/L de Na;HPO;,, 3,0 g/L de KH3PO,, 0,5 g/L de NaCl, 1,0 g/L de NH,CI, IMM de MgSO,, 0,1ImM de CaCl;) suplementado com 20 g/L de glicose, I00MM do ácido 3-(N- morfolino)propanossulfônico (MOPS) para melhorar a capacidade de — tamponamento, 10 ug/ml de tiamina, e os antibióticos apropriados. 0,25mM de IPTG foi adicionado aproximadamente 15 horas a seguir da inoculação, e as amostras de sobrenadante de cultura coletadas para análise de BDO, 4-HB, e succinato 24 e 48 horas a seguir da indução. A produção de BDO pareceu mostrar uma dependência na ordem de gene (Tabela 12). A produção de BDO maisalta, em 0,5SmM, foi obtida com cat2 expressada primeiro, seguido por 4- HBd em pZA33, e cat! seguido por sucD de P. gingivalis em pZE13. À adição de adhE2 de C. acetobutilicum na última posição no pZE13 resultou em leve melhora. 4-HB e succinato foram também produzidos em . concentrações mais altas.
Tabela 12. Produção de BDO, 4-HB, e succinato em cepas de E. coli recombinantes que expressam combinações de genes do caminho de BDO, cultivados em meio mínimo suplementado com 20 g/L de glicose. As concentrações são dadas emmM.
EEE Eos fe aeee recon e as oAOREE ea A EErAS mm o so [eps fes mos = Jus [mo] 1 [1 enioaIsacD(doss) — | anbarooso)-camçoosa) | 0,92 | 1,29] 544 | 1,37 [o240 | 1,24 [642 | 1,49 | 0380 | 2 | — catl(0004)sucD(ooosn) — hba(oo36)-carçõosa) | 0,36 | 1,11 | 6,90 | 1,24 [0017] 1,06 | 7,63 | 1,33 [0.01 | 3 | adhB(0002)-catI(0004)-sucIN(0035] |. anba(ons6)-caiaço3A) | 0,20 | 0,44 | 0,34 | 184 [0,050] 0,60 | 1,93 [267 [0119] 4 | eatli(0004)-sucD(0035)-adhE(0002) | Ahbá(oo36)-caraçoosa) | 1,31 | 1,90 [9,02 | 0,73 10,073 | 1,95 | 9,73 | 0,82 | 0.077 | ” 5 — | adhE(0002)-cat1(0004)-sucD(0008N) | 4hbáço036)-caraçõo3a) | 0.17 o.45 | 1,04 | 1,04 [0,008 | 0,94 [7,13 | 1,02 [0.017 | 6 — | eat1(0004)-sucIX0008N)-adhE(0002) | anbd(oo36)-caaçoosa) | 1:30 | 1,77 [10,7] 0,25 [0,004] 1,80 | 1149 | 0,28 [0.003 | 7 | eariçooos)sucDiooss) —) carifoosa)-anbaçõoss) | 1,09 | 1,29 [5.63 | 215 Jo461] 1,38 | 666 | 2,30 [0,520 | 8 1 carl(0004)-sucD(O00SN) — — | caranosa)enháçõoss) | 181 | 201 1128] 0,02 [0,000] 224 [1113 0,02 [0.000 | 9 | adh E(0002)-cati(0004)-sucD(0035) | caroosa)-anhaçõoss) | 024 | 1,99 [202 [232 [0,106] 0,89 | 485 | 2,41 [0,186] 10 | cati(0004)-sucD(0035)-adhE(0002) | caroo34s)-anbaçõoss) | 0.98 | 1,17 | 5,30 | 208 Jo569 | 1,33 | 615) 214 | 0,640] 11 [adhE(0002)-cat1(0004)-sucD(0008N) | cararoo34)-4nbaçooss) | 020 ) 0,53 | 1,38 | 2,30 [0,019 | 0,91 | 8.10 | 1,49 [0,034 | 12 — | cati(0004)-sucD(0008N)-adhE(0002) | caraoo34)4nbaçõoss) | 214 | 273 (12,07) 0.16 6,000] 3,10 | 11,79) 0,17 [0,002 | 13 1 ApenasVetor — 1 apenas Vetor — | 217 12,62 | 9,03 | 0,01 Jo,000]| 3,00 | 12,05] 0,01 10,000 | Análise de BDO, 4-HB e succinato pelo GCMS. BDO, 4-HB e — succinato em amostras de fermentação e cultura de célula foram derivados pela sililação e quantitativamente analisados pela GCMS usando métodos adaptados a partir de relatos da literatura ((Simonov et al., J. Anal Chem, 59: 965-971 (2004)). O método desenvolvido demonstrou boa sensibilidade abaixo de 1 uM, linearidade até pelo menos 25mM, assim como excelente
* 121 seletividade e reprodutibilidade.
A preparação de amostra foi realizada como segue: 100 ul de amostras filtradas (filtros de seringa de 0,2 um ou 0,45 um), por exemplo, caldo de fermentação, cultura de célula ou soluções padrão, foram secados em um Concentrador Speed Vac (Savant SVC-100H) por aproximadamente 1 hora na temperatura ambiente, seguido pela adição de 20 ul de solução 10mM de ciclohexanol, como um padrão interno, em dimetilformamida. As misturas foram turbilhonadas e sonicadas em um banho de água (Branson 3510) por 15 min para garantir homogeneidade. 100 ul de reagente de derivação de sililação, N,O- bis(trimetilsilil)trifluoro-acetimida (BSTFA) com 1% de trimetilcloro-silano, foram adicionados, e a mistura foi incubada a 70ºC por ã 30 min. As amostras derivadas foram centrifugadas por 5 min, e as soluções claras foram diretamente injetadas em GCMS. Todos os produtos químicos e : reagentes foram da Sigma-Aldrich, com a exceção de BDO que foi adquirido daJ.T. Baker.
A GCMS foi realizada em um cromatógrafo a gás 6890N, interfaceado a um detector seletivo de massa (MSD) 5973N operado no modo de ionização de impacto de elétron (EI) foi usada para a análise. Uma coluna capilar DB-SMS (J&W Scientific, Agilent Technologies), 30m x 0,25mM 1.d. x0,25um de espessura de película, foi usada. A GC foi operada em um modo « — de injeção dividida que introduz 1 ul de amostra na razão dividida de 20:1. À temperatura do orifício de injeção foi de 250ºC. Hélio foi usado como um gás À carregador, e a taxa de fluxo foi mantida a 1,0 ml/min. Um programa de gradiente de temperatura foi otimizado para garantir boa resolução dos —analitos de interesse e interferência de matriz mínima. A estufa foi inicialmente mantida a 80ºC por 1 min, depois elevada a 120ºC a 2ºC/min, seguido pela elevação rápida para 320ºC a 100º C/min e contensão final por 6 min a 320ºC. A linha de transferência de interface MS foi mantida a 280ºC. Os dados foram adquiridos usando ajustes de sintonia MS de massa baixa e r*, 122 30 a 400 m/z de varredura de faixa de massa. O tempo de análise total foi de : 29 min incluindo 3 min de demora de solvente. Os tempos de retenção corresponderam a 5,2, 10,5, 14,0 e 18,2 min para ciclohexanol derivado com BSTFA, BDO, 4-HB e succinato, respectivamente. Para a análise quantitativa, os seguintes fragmentos de massa específicos foram selecionados (cromatogramas de íon extraídos): m/z 157 para o padrão interno ciclohexanol, 116 para BDO, e 147 tanto para 4-HB quanto para succinato. As curvas de calibração padrão foram construídas usando soluções de analito na cultura de célula ou meio de fermentação correspondentes para se igualar coma matriz de amostra tão próximo quanto possível. Os dados de GCMS foram processados usando o software Environmental Data Analysis ChemsStation (Agilent Technologies). í Os resultados indicaram que a maior parte do 4-HB e BDO - produzidos foi rotulada com BC (Figura 6, lados à direita). Os espectros de massa de uma cultura paralela cultivada em glicose não rotulada são mostrados para comparação (Figura 6, lados à esquerda). Observe que os picos observados são para fragmentos da molécula derivada contendo números diferentes de átomos de carbono do metabólito. O reagente de derivação também contribui com alguns átomos de carbono e silício que — ocorrem naturalmente na distribuição de rótulo, assim os resultados não são . estritamente quantitativos.
Produção de BDO a partir de 4-HB usando caminhos í alternativos. Os vários caminhos alternativos também foram testados quanto a produção de BDO. Isto inclui o uso da enzima SucCD de £. coli nativa para — converter succinato para succinil-CoA (Tabela 13, linhas 2-3), o uso de a- cetoglutarato descarboxilase no caminho da a-cetoglutarato (Tabela 13, linha 4), e uso de PTB/BK como um meio alternativo para gerar o derivado de - CoA de 4HB (Tabela 13, linha 1). As cepas foram construídas contendo plasmídeos que expressam os genes indicados na Tabela 13, que abrangem ra 123 estas variantes. Os resultados mostraram que em todos os casos, a produção de 4-HB e BDO ocorreu (Tabela 13). Tabela 13. Produção de BDO, 4-HB, e succinato em genes de cepa da E. coli recombinantes para caminho diferente de variantes de BDO, cultivadas — anaerobicamente em meio mínimo suplementado com 20 g/L de glicose, e colhidas 24 horas depois da indução com 0,ILmMM de IPTG. As concentrações são dadas emmM. | oosgrooss —| —ooxsoosa | oo 1 ota |
EXEMPLO III Biossíntese do ácido 4-hidroxibutanóico, y-Butirolactona e í 10 —1,4-Butanodiol ] Este Exemplo descreve a produção biossintética de ácido 4- hidroxibutanóico, y-butirolactona e 1,4-butanodiol usando fermentação e outros bioprocessos. Métodos para a integração da etapa de fermentação de 4-HB emum processo completo para a produção de GBL purificado, 1,4-butanodiol (BDO) e tetraidrofurano (THF) são descritos abaixo. Visto que 4-HB e GBL estão em equilíbrio, o caldo de fermentação conterá ambos os compostos. Em : pH baixo este equilíbrio é mudado para favorecer GBL. Portanto, a fermentação pode operar no pH 7,5 ou menos, no geral pH 5,5 ou menos. — Depois da remoção da biomassa, a corrente de produto entra em uma etapa de separação em que GBL é removido e a corrente remanescente enriquecida em 4-HB é reciclada. Finalmente, GBL é destilada para remover quaisquer impurezas. O processo opera em um de três modos: 1) a fermentação de lote alimentado e separação de lote; 2) a fermentação de lote alimentado e separação contínua; 3) fermentação contínua e separação contínua. Os primeiros dois destes modos são mostrados esquematicamente na Figura 7. Os rr 124 : procedimentos de fermentação integrados descritos abaixo também são usados para as células que produzem BDO da invenção para a biossíntese de BDO e produtos da família BDO subsequentes. Protocolo de fermentação para produzir 4-HB/GBL (lote): O organismo de produção é cultivado em um biorreator de 10 L espargido com uma mistura de N/CO,, usando caldo de 5 L contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, e 30 g/L de líquido da maceração do milho, e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Conforme as células crescem e utilizam a glicose, glicose a 70% adicional é alimentada no biorreator a uma razão que aproximadamente equilibra com o consumo de glicose. A temperatura do biorreator é mantida É em 30 graus C. O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que 4-HB atingisse uma concentração entre 20 e 200 g/L, com a densidade de célula sendo entre 5 e 10 g/L. O pH não é controlado, e tipicamente diminuirá paraopH3a6 no final da rodada. Na conclusão do período de cultivo, os conteúdos do fermetador são passados através de uma unidade de separação de célula (por exemplo, centrífuga) para remover células e fragmentos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de separação de produto. A isolação de 4-HB e/ou GBL ocorreria pelos procedimentos de separação padrão utilizados na técnica para separar produtos orgânicos de . soluções aquosas diluídas, tais como extração líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer À uma solução orgânica de 4-HB/GBL. A solução resultante é depois submetida aos métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico —epara fornecer GBL (ponto de ebulição 204 a 205ºC) que é isolado como um líquido purificado.
Protocolo de fermentação para produzir 4-HB/GBL (totalmente contínuo): O organismo de produção é primeiro cultivado no modo de lote usando o aparelho e composição de meio descritos acima,
o 125 exceto que a concentração de glicose inicial é de 30 a 50 g/L. Quando a ' glicose é exaurida, meio alimentado da mesma composição é fornecido continuamente a uma razão entre 0,5 L/h e 1 L/h, e líquido é retirado na mesma taxa. A concentração de 4-HB no biorreator permanece constante de 30a40g/L, ea densidade de célula permanece constante entre 3 e 5 g/L. À temperatura é mantida a 30 graus C, e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCl concentrado, como requerido. O biorreator é operado continuamente por um mês, com amostras coletadas a cada dia para garantir uniformidade da concentração de 4-HB. No modo contínuo, os conteúdos do fermentador são — constantemente removidos conforme novo meio alimentado é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio, e produtos 4-HB e/ou GBL, é então submetida a um procedimento de separação de produto contínuo, com ou sem É remover células e fragmentos de célula, e pode ocorrer pelos métodos de ” separação contínua padrão utilizados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tais como extração de líquido-líquido contínua usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de 4-HB/GBL. A solução resultante é subsequentemente submetida aos métodos de destilação contínua padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e para fornecer GBL — (ponto de ebulição 204 a 205ºC) que é isolado como um líquido purificado.
. Protocolo de Redução de GBL: Uma vez que GBL é isolado e purificado como descrito acima, o mesmo então será submetido aos protocolos de redução tais como aqueles bem conhecidos na técnica (referências citadas) para produzir 1,4-butanodiol ou tetraidrofurano (THF) ou uma mistura destes. Os catalisadores de hidrogenação heterogêneos ou homogêneos combinados com GBL sob pressão de hidrogênio são bem conhecidos para prover os produtos 1,4-butanodiol ou tetraidrofurano (THF) ou uma mistura destes. É importante mencionar que a mistura de produto 4- HB/GBL que é separada do caldo de fermentação, como descrito acima, pode tro 126
- ser submetido diretamente, antes da isolação e purificação de GBL, a estes mesmos protocolos de redução para fornecer os produtos 1,4-butanodiol ou tetraidrofuranno ou uma mistura destes.
Os produtos resultantes, 1,4- butanodiol e THF são então isolados e purificados pelos procedimentos bem
— conhecidos na técnica.
Ss scipiaacaa .——. E Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO ou THF diretamente (lote): As células são cultivadas em um biorreator de 10 L espargido com uma mistura de Ny/CO,, usando 5 L de caldo contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, e 30 g/L de líquido da maceração do milho, e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L.
Conforme as células crescem e utilizam a glicose, é glicose a 70% adicional é alimentada no biorreator a uma razão que aproximadamente equilibra com o consumo de glicose.
A temperatura do : biorreator é mantida a 30 graus C.
O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que 4-HB atinja uma concentração entre 20 e 200 g/L, com a densidade de célula sendo entre 5 e 10 g/L.
O pH não é controlado, e tipicamente diminuirá para pH 3 a 6 no final da rodada.
Na conclusão do período de cultivo, os conteúdos do fermentador são passados através de uma unidade de separação de célula (por exemplo, centrífuga) para remover células e fragmentos de célula, e o caldo de fermentação é - transferido para uma unidade de redução (por exemplo, vaso de hidrogenação), onde a mistura 4-HB/GBL é diretamente reduzida a 1,4- í butanodiol ou THF ou uma mistura destes.
À seguir da conclusão do procedimento de redução, os conteúdos do reator são transferidos para uma — unidade de separação de produto.
A isolação de 1,4-butanodiol e/ou THF pode ocorrer pelos procedimentos de separação padrão utilizados na técnica para separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tais como extração de líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de 1,4-butanodiol
Po 127
= e/ouTHF.A solução resultante é então submetida aos métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e para fornecer 1,4-
butanodiol e/ou THF que são isolados como um líquidos purificados.
Protocolo de fermentação e hidrogenação para produzir BDO —ouTHF diretamente (totalmente contínua): As células são primeiro cultivadas no modo de lote usando o aparelho e composição de meio descritos acima, exceto que a concentração de glicose inicial é de 30 a 50 g/L.
Quando a glicose é exaurida, meio alimentado da mesma composição é fornecido continuamente a uma razão entre 0,5 L/h e 1 L/h, e o líquido é retirado na mesma taxa.
À concentração de 4-HB no biorreator permanece constante de 30 a 40 g/L, e a densidade de célula permanece constante entre 3 e 5 g/L.
À | temperatura é mantida a 30 graus C, e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCl concentrado, como requerido.
O biorreator é operado continuamente por À um mês, com amostras tiradas a cada dia para garantir uniformidade de concentração de 4-HB.
No modo contínuo, os conteúdos do fermentador são constantemente removidos conforme meio alimentado novo é fornecido.
À corrente de saída, contendo células, meio, e produtos 4-HB e/ou GBL, é então passada através de uma unidade de separação de célula (por exemplo, centrífuga) para remover as células e fragmentos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de redução contínua (por . exemplo, vaso de hidrogenação), onde a mistura 4-HB/GBL é diretamente Ê reduzida para 1,4-butanodiol ou THF ou uma mistura destes.
A seguir da conclusão do procedimento de redução, os conteúdos do reator são transferidos para uma unidade de separação de produto contínua.
A isolação —de 1,4-butanodiol e/ou THF ocorreria pelos procedimentos de separações contínuas padrão utilizadas na técnica para separar produtos orgânicos das soluções aquosas diluídas, tais como extração de líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de 1,4-butanodiol e/ou THF.
A solução resultante é
EA 128 - então submetida aos métodos para remover e reciclar o solvente orgânico e para fornecer 1,4-butanodiol e/ou THF que são isolados como um líquido purificado.
Protocolo de fermentação para produzir BDO diretamente (lote): O organismo de produção é cultivado em um biorreator de 10 L espargido com uma mistura de N/CO,, usando 5 L de caldo contendo 5 g/L de fosfato de potássio, 2,5 g/L de cloreto de amônio, 0,5 g/L de sulfato de magnésio, e 30 g/L de líquido da maceração do milho, e uma concentração de glicose inicial de 20 g/L. Conforme as células crescem e utilizam a glicose, glicose a 70% adicional é alimentada no biorreator a uma razão que aproximadamente equilibre com o consumo de glicose. A temperatura do à biorreator é mantido a 30 graus C. O crescimento continua por aproximadamente 24 horas, até que BDO atinja uma concentração entre 20 e f 200 g/L, com a densidade de célula no geral sendo entre 5 e 10 g/L. Na conclusão do período de cultivo, os conteúdos do fermentador são passados através de uma unidade de separação de célula (por exemplo, centrífuga) para remover células e fragmentos de célula, e o caldo de fermentação é transferido para uma unidade de separação de produto. A isolação de BDO ocorreria pelos procedimentos de separação padrão utilizados na técnica para — separar produtos orgânicos de soluções aquosas diluídas, tais como extração . de líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de BDO. A solução í resultante é então submetida aos métodos de destilação padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e para fornecer BDO (ponto de ebulição 228 a — 229ºC) que é isolado como um líquido purificado. Protocolo de fermentação para produzir BDO diretamente (totalmente contínuo): O organismo de produção é primeiro cultivado no modo de lote usando o aparelho e composição de meio descritos acima, exceto que a concentração de glicose inicial é de 30 a 50 g/L. Quando a oo 129 glicose é exaurida, o meio alimentado da mesma composição é fornecido continuamente a uma razão entre 0,5 L/h e 1 L/h, e líquido é retirado na mesma taxa. A concentração de BDO no biorreator permanece constante de 30 a 40 g/L, e a densidade de célula permanece constante entre 3 e 5 g/L. A — temperatura é mantida a 30 graus C, e o pH é mantido a 4,5 usando NaOH e HCl concentrados, como requerido. O biorreator é operado continuamente por um mês, com amostras coletadas todos os dias para garantir a uniformidade da concentração de BDO. No modo contínuo, os conteúdos do fermentador são constantemente removidos conforme novo meio alimentado é fornecido. A corrente de saída, contendo células, meio, e o produto BDO, é então submetida a um procedimento de separação de produto contínua, com ou sem a remoção de células e fragmentos de célula, e pode ocorrer pelos métodos de : separação contínua padrão utilizada na técnica para separar produtos . orgânicos de soluções aquosas diluídas, tais como extração contínua de líquido-líquido usando um solvente orgânico imiscível em água (por exemplo, tolueno) para fornecer uma solução orgânica de BDO. A solução resultante é subsequentemente submetida aos métodos de destilação contínua padrão para remover e reciclar o solvente orgânico e para fornecer BDO (ponto de ebulição 228 a 229ºC) que é isolado como um líquido purificado (pf 20ºC).
EXEMPLO IV : Caminhos de BDO exemplares Este exemplo descreve enzimas exemplares e genes Á correspondentes para os caminhos sintéticos do 1,4-butandiol (BDO). Os caminhos sintéticos do BDO exemplares são mostrados nas Figuras 8-13. Os caminhos representados nas Figuras 8-13 são de intermediários metabólicos centrais comuns para o 1,4-butanodiol. Todas as transformações representadas nas Figuras 8-13 situam-se nas 18 categorias gerais de transformações mostradas na Tabela 14. Abaixo é descrito vários genes candidatos bioquimicamente caracterizados em cada categoria.
fieis 130 Especificamente listados são os genes que podem ser aplicados para catalisar as transformações apropriadas nas Figuras 9 a 13 quando clonados e expressados em um organismo hospedeiro. Os três genes exemplares de topo para cada uma das etapas chaves nas Figuras 9 a 13 são fornecidos nas —Tabelas15a23 (ver abaixo). Os genes exemplares que foram fornecidos para os caminhos representados na Figura 8 são aqui descritos.
Tabela 14. Tipos de enzima requeridos para converter intermediários metabólicos centrais comuns em 1,4-butanodiol. Os primeiros três dígitos de cada rótulo correspondem aos primeiros três dígitos do número da Enzyme Commission que denotam o tipo geral de transformação independente da especificidade de substrato.
Orxidorredutase (cetona para hidroxila ou aldeído para álcool) Oxidorredutase (2 etapas, acil-CoA para álcool) Orxidorredutase (acil-CoA para aldeído) : Orxidorredutase (2-0xo ácido para acil-CoÃ, descarboxilação) Oxidorredutase (fosforilação/desfosforilação) Orxidorredutase que opera nos doadores de CH-CH Aciltransferase (que transfere grupo fosfato) Fosfotransferase, aceitador do grupo carboxila . Oxidorredutase (aldeído para álcool ou cetona para hidroxila) : Aldeído para álcool. Os genes exemplares que codificam enzimas que catalisam a conversão de um aldeído para álcool, isto é, a álcool desidrogenase ou equivalentemente a aldeído redutase, incluem alrA que codifica uma álcool desidrogenase de cadeia média para C3-Ci, (Tani et al. Appl. Environ. Microbiol. 66: 5231-5235 (2000)), ADH2 de Saccharomyces cerevisiae (Atsumi et al. Nature 451: 86-89 (2008)), yqhD de £. coli que tem preferência por moléculas mais longas do que C(3) (Sulzenbacher et al. Journal of Molecular Biology 342: 489-502 (2004)), e bdh I e bdh MI de C.
Wa 131 acetobutilicum que converte butirialdeído em butanol (Walter er al.
Journal of Bacteriology 174: 7149-7158 (1992)). As sequências de proteína para cada um destes produtos de gene exemplares, se disponíveis, podem ser encontradas usando os seguintes números de acesso do GenBank: E o o AEE dE | yanD | NP4174841 | 161300096 | ———Escherichiacoli = =>) As enzimas que exibem atividade de 4-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1,1,1,61) também se situam nesta categoria.
Tais enzimas foram caracterizadas em Ralstonia eutropha (Bravo et al.
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Forensic Sci. 49: 379-387 (2004), Clostridium kluyveri (Wolff et al.
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Chem. 278: 41552-41556 (2003)). | Uma outra enzima exemplar é a 3-hidroxiisobutirato desidrogenase que catalisa a oxidação reversível de 3-hidroxiisobutirato para metilmalonato semialdeído.
Esta enzima participa na degradação da valina, leucina e isoleucina e foi identificada em bactérias, eucariotas, e mamíferos.
A enzima codificada por P84067 de Thermus thermophilus HB8 foi í estruturalmente caracterizada (Lokanath er al.
J Mol Biol 352: 905-17 (2005)). A reversibilidade da 3-hidroxiisobutirato desidrogenase humana foi demonstrada usando substrato isotopicamente rotulado (Manning et al.
Biochem J 231: 481-484 (1985)). Os genes adicionais que codificam esta enzima incluem 3hidh em Homo sapiens (Hawes et al.
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Methods Enzymol. 324: 218-228 (2000)), mMsb em Pseudomonas aeruginosa, e dhat em Pseudomonas putida (Aberhart et al. ] Chem.
Soc. [Perkin 1] 6: 1404-1406 ar 132 (1979); Chowdhury et al. Biosci. Biotechnol Biochem. 67: 438-441 (2003); Chowdhury et al. Biosci. Biotechnol Biochem. 60: 2043-2047 (1996)).
oo Diversas enzimas da 3-hidroxiisobutirato desidrogenase também foram mostradas converter semialdeído malônico para o ácido 3- S — hidroxipropriônico (3-HP). Três candidatos a gene que exibem esta atividade sãomMsB de Pseudomonas aeruginosa PAO1(62),mMsB de Pseudomonas putida KT2440 (Liao et al., Publicação US 2005/0221466) emMsB de Pseudomonas putida E23 (Chowdhury er al., Biosci. Biotechnol. Biochem. F 60: 2043-2047 (1996)) Uma enzima com atividade de 3-hidroxibutirato —desidrogenase em Alcaligenes faecalis M3A também foram identificados É (Gokam er al., Patente US Nº 7.393.676; Liao et al., Publicação US Nº 2005/0221466). Candidatos a gene adicionais de outros organismos incluindo Rhodobacter spaeroides podem ser deduzidos pela similaridade de sequência. [ Gene | AcessoNo | GINo [| Organismo =| A conversão de semialdeído malônico para 3-HP também pode ser realizada por duas outras enzimas: a 3-hidroxipropionato desidrogenase x dependente de NADH e a malonato semialdeído redutase dependente de NADPH. Uma 3-hidroxipropionato desidrogenase dependente de NADH é considerada participar nos caminhos da biossíntese de beta-alanina a partir do propionato em bactérias e plantas (Rathinasabapathi, B. Journal of Plant Pathology 159:671-674 (2002); Stadtman, E. R. J. Am. Chem. Soc. 77: 5765- 5766 (1955)). Esta enzima não foi associada com um gene em nenhum organismo até agora. A malonato semialdeído redutase dependente de NADPH catalisa a reação reversa em bactérias que fixam CO; autotróficas.
MiitidA 133 Embora a atividade da enzima fosse detectada em Metallosphaera sedula, a identidade do gene não é conhecida (Alber et al. J. Bacteriol. 188: 8551-8559 (2006)).
Cetona para hidroxila. Existem diversas álcool desidrogenases exemplares que convertem uma cetona à um grupo funcional em hidroxila. í Duas de tais enzimas de E. coli são codificadas pela malato desidrogenase (mdh) e lactato desidrogenase (IdhA). Além disso a lactato desidrogenase de Ralstonia eutropha foi mostrada demonstrar altas atividades sobre os substratos de vários comprimentos de cadeia tais como lactato, 2-oxobutirato, 2-oxopentanoato e 2-oxoglutarato (Steinbuchel, A. e H. G. Schlegel Eur. J. Biochem. 130: 329-334 (1983)). A conversão de alfa-cetoadipato em alfa- é hidroxiadipato pode ser catalisada pela 2-cetoadipato redutase, uma enzima relatada ser encontrada na placenta de rato e ser humano (Suda et al. Arch. õ Biochem. Biophys. 176: 610-620 (1976); Suda et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 77: 586-591 (1977)). Um candidato adicional para esta etapa é a 3- hidroxibutirato desidrogenase (bdh) mitocondrial do coração humano que foi clonada e caracterizada (Marks er al. J. Biol. Chem. 267: 15459-15463 (1992)). Esta enzima é uma desidrogenase que opera em um 3-hidroxiácido. Uma outra álcool desidrogenase exemplar converte acetona para isopropanol como foimostrado em C. beijerinckii (Ismaiel et al. J. Bacteriol. 175: 5097- - 5105 (1993)) e T. brockii (Lamed er al. Biochem. J. 195: 183-190 (1981); : Peretz e Burstein Biochemistry 28: 6549-6555 (1989)). As 3-hidroxiacil desidrogenases exemplares que convertem acetoacetil-CoA para 3-hidroxibutiril-CoA incluem hbd de C. acetobutilicum —(Boynton et al. Journal of Bacteriology 178: 3015-3024 (1996)), hbd de C.
e 134 beijerinckii (Colby et al. Appl Environ. Microbiol 58: 3297-3302 (1992)), e várias enzimas similares de Metallosphaera sedula (Berg et al. Archaea. Science. 318: 1782-1786 (2007)).
1.1.1.c - Oxidorredutase (2 etapas, acil-CoA para álcool) As oxidorredutases de 2 etapas exemplares que convertem uma acil-CoA para álcool incluem aquelas que transformam substratos tais como acetil-CoA para etanol (por exemplo, adhE da E. coli (Kessler et al. FEBS. Lett. 281: 59-63 (1991)) e butiril-CoA para butanol (por exemplo, É adhE2 de C. acetobutilicum (Fontaine et al. J. Bacteriol. 184: 821-830 -10 (2002)). Além de reduzir acetil-CoA para etanol, a enzima codificada por adhE em Leuconostoc mesenteroides foi mostrada oxidar o composto de cadeia ramificada isobutiraldeído para isobutiril-CoA (Kazahaya et al. J. Gen. Appl. Microbiol. 18: 43-55 (1972); Koo et al. Biotechnol Lett. 27: 505-510 (2005)).
Uma outra enzima exemplar pode converter malonil-CoA a 3- HP. Uma enzima dependente de NADPH com esta atividade tem caracterizado em Chloroflexus aurantiacus onde a mesma participa no ciclo do 3-hidroxipropionato (Hugler et al., J. Bacteriol. 184: 2404-2410 (2002); Strauss e Fuchs, Eur. J. Biochem. 215: 633-643 (1993)). Esta enzima, com uma massa de 300 kDa, é altamente específica de substrato e mostra pouca similaridade de sequência a outras oxidorredutases conhecidas (Hugler et al., J. Bacteriol. 184: 2404-2410 (2002)). Nenhuma enzima em outros organismos foram mostradas catalisar esta reação específica; entretanto existe evidência ado 135 de bioinformática de que outros organismos podem ter caminhos similares (Klatt er al., Environ. Microbiol. 9: 2067-2078 (2007)). Candidatos de enzima em outros organismos incluindo Roseiflexus castenholzii, Erythrobacter sp. NAPI e gama proteobactéria marinha HICC2080 podem ser deduzidos pela — similaridade de sequência. : : Moléculas de acil-CoA de cadeia longa podem ser reduzidas pelas enzimas tais como a FAR da jojoba (Simmondsia chinensis) que codifica uma acil-CoA redutase graxa que forma álcool. A sua superexpressão : na E. coli resultou na atividade de FAR e o acúmulo de álcool graxo (Metz et al Plant Physiology 122: 635-644) 2000)).
1.2.1.b - Oxidorredutase (acil-CoA para aldeído) Diversas acil-CoA desidrogenases são capazes de reduzir uma acil-CoA ao seu aldeído correspondente. Os genes exemplares que codificam tais enzimas incluem o acrl de Acinetobacter calcoaceticus que codifica uma —acil-CoA redutase graxa (Reiser e Somerville, J. Bacteriology 179: 2969-2975 (1997)), A acil-CoA redutase graxa M-1 de Acinetobacter sp. (Ishige et al. E Appl. Environ. Microbiol. 68: 1192-1195 (2002)), e uma succinato . semialdeído desidrogenase dependente de -CoA e NADP codificada pelo gene sucD em Clostridium kluyveri (Sohling e Gottschalk J Bacteriol 178: —871-80 (1996); Sohling e Gottschalk J Bacteriol. 178: 871-880 (1996)). SucD de P. gingivalis é uma outra succinato semialdeído desidrogenase (Takahashi et al. J. Bacteriol. 182: 4704-4710 (2000)). A acilação da enzima acetaldeído desidrogenase em Pseudomonas sp, codificada pelo bphG, é ainda uma outra visto que foi demonstrada oxidar e acilar acetaldeído, propionaldeído, — butiraldeído, isobutiraldeído e formaldeído (Powlowski et al. J Bacteriol. 175:
e 136 377-385 (1993)).
Gene NP. 904963.1 Um tipo de enzima adição que converte uma acil-CoA ao seu aldeído correspondente é a malonil-CoA redutase que transforma a malonil- CoA ao semialdeído malônico. Malonil-CoA redutase é uma enzima chave na S fixação de carbono autotrófico via o ciclo do 3-hidroxipropionato em bactérias archael termoacidofílicas (Berg ef al. Science 318: 1782-1786 (2007); Thauer, R. K. Science 318: 1732-1733 (2007)). A enzima utiliza NADPH como um cofactor e foi caracterizada em Metallosphaera e Á Sulfolobus spp (Alber et al. J. Bacteriol. 188: 8551-8559 (2006); Hugler et al. -10 DJ. Bacteriol. 184: 2404-2410 (2002)). A enzima é codificada pelo Msed 0709 em Metallosphaera sedula (Alber et al. J. Bacteriol. 188: 8551-8559 (2006); Berg et al. Science 318: 1782-1786 (2007)). Um gene que codifica uma malonil-CoA redutase de Sulfolobus tokodaii foi clonado e heterologamente expressado na E. coli (Alber et al. J. Bacteriol. 188: 8551-8559 (2006)). Embora a funcionalidade da aldeído desidrogenase destas enzimas seja similar à desidrogenase bifuncional de Chloroflexus aurantiacus, existe pouca similaridade de sequência. Ambos os candidatos de enzima da malonilCoA redutase têm alta similaridade de sequência para a aspartato-semialdeído , desidrogenase, uma enzima que catalisa a redução e desfosforilação concorrente da aspartil-4-fosfato para aspartato semialdeído. Candidatos a gene adicionais podem ser encontrados pela homologia de sequência para proteínas em outros organismos incluindo Sulfolobus solfataricus e Sulfolobus acidocaldarius.
to 137
1.2.1.c - Oxidorredutase (2-0xo ácido para acil-CoA, descarboxilação) As enzimas nesta família incluem 1) 2-ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada, 2) alfa-cetoglutarato desidrogenase, e 3) S o complexo de enzima múltipla da piruvato desidrogenase (PDHC). Estas O beiras são complexos de enzima múltipla que catalisam uma série de reações parciais que resultam na descarboxilação oxidativa na acilação de 2- ceto-ácidos. Cada um dos complexos de 2-ceto-ácido desidrogenase ocupa posições chave no metabolismo intermediário, e a atividade de enzima é de modo típico firmemente regulada (Fries et al. Biochemistry 42: 6996-7002 (2003)). As enzimas compartilham uma estrutura complexa mas comum composta de cópias múltiplas de três componentes catalíticos: a alfa- : cetoácido descarboxilase (El), dihidrolipoamida aciltransferase (E2) e - dihidrolipoamida desidrogenase (E3). O componente E3 é compartilhado entre todos os complexos da 2-ceto-ácido desidrogenase em um organismo, enquanto os componentes E1 e E2 são codificados pelos genes diferentes. Os componentes de enzima estão presentes em numerosas cópias no complexo e utilizam cofatores múltiplos para catalisar uma sequência direcionada de reações via canalização de substrato. O tamanho global destes complexos da desidrogenase é muito grande, com massas moleculares entre 4 e 10 milhões - de Da (isto é, maior do que um ribossoma). A atividade de enzimas na família da 2-ceto-ácido Í desidrogenase é normalmente baixa ou limitada sob condições anaeróbicas na E. coli. A produção aumentada de NADH (ou NADPH) pode levar a um — desequilíbrio de redox, e o próprio NADH serve como um inibidor para a função da enzima. Esforços de engenheiramento têm aumentado a atividade anaeróbica do complexo da piruvato desidrogenase de E. coli (Kim et al. Appl. Environ. Microbiol. 73: 1766-1771 (2007); Kim et al. J. Bacteriol. 190: 3851-3858) 2008); Zhou et al. Biotechnol. Lett. 30: 335-342 (2008)). Por parda 138 exemplo, o efeito inibidor de NADH pode ser superado pelo engenheiramento de uma mutação H322Y no componente E3 (Kim et al. J. Bacteriol. 190: 3851-3858 (2008)). Estudos estruturais de componentes individuais e como eles funcionam entre si no complexo fornecem discernimento dentro dos S — mecanismos catalíticos e arquitetura de enzimas nesta família (Aevarsson et al. Nat. Struct. Biol. 6: 785-792 (1999); Zhou et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 14802-14807 (2001)) A especificidade de substrato dos complexos de desidrogenase varia em organismos diferentes, mas no geral as ceto-ácido desidrogenases de cadeia ramificada têm a faixa de substrato mais ampla. O alfa-cetoglutarato desidrogenase (AKGD) converte o alfa- cetoglutarato em succinil-CoA e é o sítio primário de controle do fluxo à metabólico através do ciclo TCA (Hansford, R. G. Curr. Top. Bioenerg. 10: 217-278 (1980)). Codificada pelos genes sucA, sucB e Ipd na E. coli, a
15. expressão do gene AKGD é infrarregulada sob condições anaeróbicas e durante o crescimento em glicose (Park et al. Mol. Microbiol. 15: 473-482 (1995)). Embora a faixa de substrato de AKGD seja estreita, estudos estruturais do núcleo catalítico do componente E2 para identificar com precisão resíduos específicos responsáveis pela especificidade de substrato (Knapp er al. J. Mol. Biol. 280: 655-668 (1998)). O AKGD de Bacillus - subtilis, codificado pelo odhAB (El e E2) e pdhD (E3, domínio ; compartilhado), é regulado ao nível de transcricional e é dependente da fonte de carbono e fase de crescimento do organismo (Resnekov er al. Mol. Gen. Genet. 234: 285-296 (1992)). Em levedura, o gene LPDI1 que codifica o componente E3 é regulado ao nível transcricional pela glicose (Roy e Dawes J. Gen. Microbiol. 133: 925-933 (1987)). O componente El, codificado pelo KGDI, também é regulado pela glicose e ativado pelos produtos de HAP2 e HAP3 (Repetto e Tzagoloff Mol. Cell Biol. 9: 2695-2705 (1989)). O complexo da enzima AKGD, inibido pelos produtos NADH e suceinil-CoA, é
Faiaiituafeii 139 bem estudado nos sistemas de mamífero, como função prejudicada de foi ligada a diversas doenças neurológicas (Tretter e dam-Vizi Philos. Trans. R.
Soc. Lond B Biol. Sci. 360: 2335-2345 (2005)). O complexo da 2-ceto-ácido desidrogenase de cadeia ramificada (BCKAD), também conhecido como 2-oxoisovalerato É desidrogenase, participa nos caminhos da degradação de aminoácido de : cadeia ramificada, convertendo os derivados de 2-ceto ácidos de valina, leucina e isoleucina aos seus derivados de acil-CoA e CO». O complexo foi estudado em muitos organismos incluindo Bacillus subtilis (Wang et al. Eur. J.Biochem. 213: 1091-1099 (1993)), Rattus norvegicus (Namba et al. J. Biol. Chem. 244: 4437-4447 (1969)) e Pseudomonas putida (Sokatch J. Bacteriol. 148: 647-652 (1981)). Em Bacillus subtilis a enzima é codificada pelos genes pdhD (componente E3), bfmBB (componente E2), BfmBAA e bfmBAB (componente E1) (Wang et al. Eur. J. Biochem. 213: 1091-1099 (1993)). Em mamíferos, o complexo é regulado pela fosforilação pelas fosfatases e cinases * de proteína específicas. O complexo foi estudado em hepatócitos de rato (Chicco et al. J. Biol. Chem. 269: 19427-19434 (1994)) e é codificado pelos genes Bckdha (El alfa), Bckdhb (El beta), Dbt (E2), e DId (E3). Os componentes El e E3 do complexo BCKAD de Pseudomonas putida foram cristalizados (Aevarsson et al. Nat. Struct. Biol. 6: 785-792 (1999); Mattevi Science 255: 1544-1550 (1992)) e o complexo de enzima foi estudado (Sokatch et al. J. Bacteriol. 148: 647-652 (1981)). A transcrição dos genes BCKAD de P. putida é ativada pelo produto de gene de bkdR (Hester et al.
LaRRRnia Gases 140
Eur.
J.
Biochem. 233: 828-836 (1995)). Em alguns organismos incluindo Rattus norvegicus (Paxton et al.
Biochem.
J. 234: 295-303 (1986)) e Saccharomyces cerevisiae (Sinclair er al.
Biochem.
Mol.
Biol.
Int. 31: 911- 922 (1993)), este complexo foi mostrado ter uma ampla faixa de substrato que Ss inclui oxoácidos lineares s tais como 2-oxobutanoato e alfa-cetoglutarato, Além disso, para os precursores de aminoácido de cadeia ramificada.
O sítio ativo do BCKAD bovino foi engendrado para favorecer o substrato alternativo acetil-CoA (Meng e Chuang, Biochemistry 33: 12879-12885 (1994)). . : O complexo da piruvato desidrogenase, que catalisa a conversão de piruvato para acetil-CoA, também foi extensivamente estudado.
Na enzima E. coli, resíduos específicos no componente El são responsáveis pela especificidade de substrato (Bisswanger, H.
J Biol Chem. 256: 815-822 (1981); Bremer, J.
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J Biochem. 8: 535-540 (1969); Gong et al.
J Biol : Chem. 275: 13645-13653 (2000)). Como mencionado anteriormente, os esforços de engenheiramento de enzima têm melhorado a atividade da enzima . PDH da E. coli sob condições anaeróbicas (Kim et al.
Appl.
Environ.
Microbiol. 73: 1766-1771 (2007); Kim J.
Bacteriol. 190: 3851-3858 (2008); Zhou et al.
Biotechnol.
Lett. 30: 335-342 (2008)). Ao contrário da PDH de E. coli, o complexo de B. subrilis é ativo e requer crescimento sob condições —anaeróbicas (Nakano J.
Bacteriol. 179: 6749-6755 (1997)). A PDH de Klebsiella pneumoniae, caracterizada durante o crescimento em glicerol, também é ativa sob condições anaeróbicas (Menzel et al.
J.
Biotechnol. 56:
toa 141
135-142 (1997)). Estrutura cristalinas do complexo de enzima de rim bovino (Zhou et al.
Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 98: 14802-14807 (2001)) e o domínio catalítico E2 de Azotobacter vinelandii são disponíveis (Mattevi et al.
Science 255: 1544-1550 (1992)). Alguns complexos de enzimas PDH de mamífero podem reagir em substratos alternativos tais como 2-oxobutanoato, embora cinéticas comparativas de PDH e BCKAD de Rattus norvegicus indicam que BCKAD tem atividade mais alta no 2-oxobutanoato como um substrato (Paxton et al.
Biochem.
J. 234: 295-303 (1986)). . - Como uma alternativa para os complexos de 2-ceto-ácido — desidrogenase de enzima múltipla grande descritos acima, alguns organismos anaeróbicos utilizam enzimas na família da 2-cetoácido oxidorredutase * (OFOR) para catalisar a descarboxilação oxidativa na acilação de 2-ceto- ácidos.
Diferente dos complexos da desidrogenase, estas enzimas contêm grupos de ferro-enxofre, utilizam cofatores diferentes, e usam ferredoxina ou flavodixina como aceitadores de elétron no lugar de NAD(P)H.
Embora a maior parte das enzimas nesta família sejam específicas para piruvato como um substrato (POR) algumas 2-ceto-ácido:ferredoxina oxidorredutases foram mostradas aceitar uma ampla faixa de 2-cetoácidos como substratos incluindo alfa-cetoglutarato e 2-oxobutanoato (Fukuda e Wakagi Biochim.
Biophys.
rd, 142 Acta 1597: 74-80 (2002); Zhang et al. J. Biochem. 120: 587-599 (1996)). Um tal enzima é a OFOR da Sulfolobus tokodaii 7 archaeon termoacidofílica, que contém uma subunidade alfa e beta codificada pelo gene ST2300 (Fukuda e Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597: 74-80 (2002); Zhang et al. J. Biochem. 120: 587-599 (1996)). Um sistema de expressão com base em plasmídeo foi desenvolvido para expressar eficientemente esta proteína na E. coli (Fukuda et al. Eur. J. Biochem. 268: 5639-5646 (2001)) e resíduos envolvidos na especificidade de substrato foram determinados (Fukuda e Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597: 74-80 (2002)). Duas OFORs de Aeropirum pernix str. K1 também foram recentemente clonadas em E. coli, caracterizadas, e descobertas reagir com uma ampla faixa de 2-oxoácidos (Nishizawa et al. FEBS Lett. 579: 2319-2322 (2005)). As sequências de gene destes candidatos a OFOR estão disponíveis, embora elas não tenham identificadores no f GenBank designados até agora. Existe evidência bioinformática de que enzimas similares estão presentes em todas as archaea, algumas bactérias anaeróbicas e eucariotas amitocondriais (Fukuda e Wakagi Biochim. Biophys. Acta 1597: 74-80 (2005)). Esta classe de enzima também é interessante de um ponto de vista energético, visto que a ferredoxina reduzida pode ser usada para gerar NADH pela ferredoxina-NAD redutase (Petitdemange et al. —Biochim. Biophys. Acta 421: 334-337 (1976)). Também, visto que a maioria - das enzimas são planejadas para operar sob condições anaeróbicas, menos engenheiramento de enzima pode ser requerida em relação às enzimas na família do complexo de 2-ceto-ácido desidrogenase para a atividade em um ambiente anaeróbico.
1.2.1.d - Oxidorredutase (fosforilação/desfosforilação) As enzimas exemplares nesta classe incluem a gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase que converte gliceraldeído-3-fosfato em D-glicerato 1,3-bisfosfato (por exemplo, gapÁA da E. coli (Branlant e Branlant Eur. J.
ata 143 Biochem. 150: 61-66 (1985)), aspartato-semialdeído desidrogenase que converte a L-aspartato-4-semialdeído no L-4-aspartil-fosfato (por exemplo, asd da E. coli (Biellmann et al. Eur. J. Biochem. 104: 53-58 (1980)), a N- acetil-gamaglutamil-fosfato redutase que converte N-acetil-I-glutamato-S- —semialdeídoem N-acetil-L-glutamil-S-fosfato (por exemplo, argC da E coli (Parsot er al. Gene 68: 275-283 (1988)), e a glutamato-S-semialdeído desidrogenase que converte L-glutamato-S-semialdeído no L-glutamil-S- fosfato (por exemplo, prod da E. coli (Smith et al. J. Bacteriol. 157: S45-551 (1984).
“10 1.3.1.a - Oxidorredutase que opera nos doadores de CH-CH : Uma enoil-CoA redutase exemplar é o produto de gene de bed da C. acetobutilicum (Atsumi et al. Metab Eng (2007); Boynton er al. Journal of Bacteriology 178: 3015-3024 (1996), que naturalmente catalisa a redução de crotonil-CoA para butiril-CoA. A atividade desta enzima pode ser realçada pela expressão de bcd em conjunção com a expressão dos genes etfAB de C. acetobutilicum, que codificam uma flavoproteína de transferência de elétron. Um candidato adicional para a etapa da enoil-CoA redutase é a enoil-CoA ã redutase mitocondrial de E. gracilis (Hoffmeister et al. Journal of Biological Chemistry 280: 4329-4338 (2005)). Uma construção derivada desta sequência que segue a remoção da sua sequência líder alvejadora mitocondrial foi clonada na E. coli resultando em uma enzima ativa (Hoffmeister et al., supra, (2005)). Este método é bem conhecido por aqueles habilitados na técnica de expressar genes eucarióticos, particularmente aqueles com sequências líder que podem alvejar o produto de gene a um compartimento intracelular — específico, em organismos procarióticos. Um homólogo próximo deste gene, TDE0597, da procariota Treponema denticola representa uma terceira enoil-
tda 144 CoA redutase que foi clonada e expressada na E. coli (Tucci e Martin FEBS Letters 581: 1561-1566 (2007)). [ Gene [| —AcessoNo ÚÚ[--"WUGNe [| Organismo — | As enzimas da 2-enoato redutase (EC 1.3.1.31) exemplares são conhecidas catalisar a redução dependente de NADH de uma ampla variedade — de ácidos carboxílicos e aldeídos a,B-insaturados (Rohdich er al. J. Biol. Chem. 276: 5779-5787 (2001)). A 2-Enoato redutase é codificada por enr em diversas espécies de Clostridia (Giesel e Simon Arch Microbiol. 135(1): p. 51-57 (2001) incluindo C. tyrobutiricum, e C. thermoaceticum (agora : chamada Moorella thermoaceticum) (Rohdich et al., supra, (2001)). Na — sequência de genoma recentemente publicada de C. kluyveri, 9 sequências : codificadoras para as enoato redutases foram relatadas, das quais uma foi caracterizada (Ver odorf et al. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 105(6): 2128-33 (2008)). Os genes enr tanto de C. tyrobutiricum quanto de C. thermoaceticum foram clonados e sequenciados e mostram 59% de identidade entre si. O primeiro gene também é descoberto ter aproximadamente 75% de similaridade com o gene caracterizado em C. kluyveri (Giesel e Simon Arch Microbiol 135(1): 51-57 (1983)). Foi relatado com base nestes resultados de À sequência que enr é muito similar à dienoil-CoA redutase na E. coli (fadH) « (163 Rohdich et al., supra (2001)). O gene enr de C. thermoaceticum também —foiexpressado em uma forma enzimaticamente ativa na E. coli (163 Rohdich et al., supra (2001)).
1.4.1.a - Oxidorredutase que opera nos aminoácidos A maioria das oxidorredutases que operam nos aminoácidos
TA 145 catalisam a desaminação oxidativa de alfa-aminoácidos com NAD+ ou NADP+ como aceitador.
As oxidorredutases exemplares que operam nos aminoácidos incluem glutamato desidrogenase (desaminação), codificada pelo gdhA, leucina desidrogenase (desaminação), codificada pelo ldh, e S —aspartato desidrogenase (desaminação), codificada pelo nadX.
O produto de gene gdhA da Escherichia coli (Korber et al.
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Biol. 289:357-369 (1999)), e gdhAl de Halobacterium salinarum (Ingoldsby et al.
Gene 349: 237-244 (2005)) catalisam a interconversão reversível de : glutamato para 2-oxoglutarato e amônia, enquanto favorece NADP(H), NAD(H), ou ambos, respectivamente.
O gene ldh de Bacillus cereus codifica * a proteína LeuDH que tem uma ampla faixa de substratos incluindo leucina, —isoleucina, valina, e 2-aminobutanoato (Ansorge e Kula Biotechnol Bioeng. 68: 557562 (2000); Stoyan et al.
J.
Biotechnol 54: 77-80 (1997)). O gene nadX de Thermotoga maritime que codifica a aspartato desidrogenase está envolvida na biossíntese de NAD (Yang et al.
J.
Biol.
Chem. 278: 8804-8808
(2003)). . A lisina 6-desidrogenase (desaminação), codificada pelo gene IysDH, catalisam a desaminação oxidativa do grupo e-amino da L-lisina para formar 2-aminoadipate-6-semialdeído, que por sua vez cicliza não enzimaticamente para formar Al-piperidina-6-carboxilato (Misono e Nagasaki J.
Bacteriol. 150: 398-401 (1982)) O gene lysDH gene de —Geobacillus stearothermophilus codifica uma lisina 6-desidrogenase termofílica dependente de NAD (Heydari et al.
Appl Environ.
Microbiol 70:
CSA 146 937-942 (2004)). Além disso o gene lysDH de Aeropirum pernix K1 é identificado através da homologia de projetos genômicos.
2.3.1. - Aciltransferase (que transfere grupo fosfato) As aciltransferases que transferem fosfato exemplares incluem — fosfotransacetilase, codificada pelo pta, e fosfotransbutirilase, codificada pelo ptb. O gene pta de E. coli codifica uma enzima que pode converter acetil-CoA em acetil-fosfato, e vice e versa (Suzuki, T. Biochim. Biophys. Acta 191: 559-569 (1969)). Esta enzima pode também utilizar propionil-CoA ao invés de acetil-CoA que forma propionato no processo (Hesslinger ef al. Mol.
2.10 Microbiol 27: 477-492 (1998)) Similarmente, o gene prb de C. acetobutilicum codifica uma enzima que pode converter butiril-COA em butiril-fosfato (Walter et al. Gene 134(1): p. 107-11 (1993)); Huang et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2(1): p. 33-38 (2000). Os genes ptb adicionais podem ser encontrados na bactéria que produz butirato L2-50 (Louis et al. J. Bacteriol. 186: 2099-2106 (2004)) e Bacillus megaterium (Vazquez et al. Curr. Microbiol 42: 345-349 (2001)). :
2.6.1.a - Aminotransferase í A aspartato aminotransferase transfere um grupo amino do aspartato paro alfa-cetoglutarato, formando glutamato e oxaloacetato. Esta conversão é catalisada, por exemplo, pelos produtos de gene de aspC de Escherichia coli (Yagi et al. FEBS Lett. 100: 81-84 (1979); Yagi et al. Methods Enzymol. 113: 83-89 (1985)), AAT2 de Saccharomyces cerevisiae (Yagi et al. J Biochem. 92: 35-43 (1982)) e ASPS de Arabidopsis thaliana (48, 108, 225 48. de la et al. Plant J 46: 414-425 (2006); Kwok e Hanson J ro 147
Exp.
Bot. 55: 595-604 (2004); Wilkie e Warren Protein Expr.
Purif. 12: 381- 389 (1998)). A valina aminotransferase catalisa a conversão da valina e piruvato para 2-cetoisovalerato e alanina.
O gene da E. coli, avtA, codifica uma tal enzima (Whalen e Berg J.
Bacteriol. 150: 739-746 (1982)). Este — produto de gene também catalisa a aminação de a-cetobutirato para gerar a- aminobutirato, embora o doador de amina nesta reação não tenha sido identificado (Whalen e Berg J.
Bacteriol. 158: 571-574 (1984)). O produto de gene da E. coli serC catalisa duas reações, a fosfoserina aminotransferase e a fosfohidroxitreonina aminotransferase (Lam e Winkler J.
Bacteriol. 172: 6518-6528 (1990)), e a atividade sobre substratos não fosforilados não puderam ser detectados (Drewke et al.
FEBS.
Lett. 390: 179-182 (1996)). - A Cargill desenvolveu uma Dbeta-alanina/alfa-cetoglutarato aminotransferase para produzir 3-HP a partir de beta-alanina via malonil- semialdeído (PCT/US2007/076252 (lessen et al)). O produto de gene de SkPYDA em Saccharomyces Kluyveri também foi mostrados preferencialmente usar beta-alanina como o doador de grupo amino : (Andersen et al.
FEBS.
J. 274: 1804-1817 (2007)). SKUGA1 codifica um homólogo de Saccharomyces cerevisiae GABA aminotransferase, UGA1 À (Ramos et al.
Eur.
J.
Biochem. 149: 401-404 (1985)), ao passo que SkPYD4 —codificauma enzima envolvida na transaminação tanto de B-alanina quanto de GABA (Andersen et al.
FEBS.
J. 274: 1804-1817 (2007)). A 3-Amino-2- metilpropionato transaminase catalisa a transformação de metilmalonato semialdeído para 3-amino-2-metilpropionato.
A enzima foi caracterizada em Rattus norvegicus e Sus scrofa e é codificada por Abat (Kakimoto et al. —Biochim.
Biophys.
Acta 156: 374-380 (1968); Tamaki et al.
Methods as 148 Enzymol. 324: 376-389 (2000)). Candidatos de enzima em outros organismos com alta homologia de sequência para a 3-amino-2-metilpropionato transaminase incluem Gta-l em C. elegans e gabT em Bacillus subtilus. Adicionalmente, uma das GABA aminotransferases nativas na E. coli, — codificada pelo gene gabT, foi mostrada ter ampla especificidade de substrato (Liu er al. Biochemistry 43: 10896-10905 (2004); Schulz er al. Appl Environ Microbiol 56: 1-6 (1990)). O produto de gene de puuE catalisa a outra 4- aminobutirato transaminase na E. coli (Kurihara et al. J. Biol. Chem. 280: 4602-4608 (2005)). ' As estruturas cristalinas de raio X da 4-aminobutirato transaminase de E. coli não ligadas e ligadas ao inibidor foram relatadas (Liu et al. Biochemistry 43: 10896-10905 (2004)). A ligação de substrato e as especificidades de substrato foram estudadas e sugeridas. Os papéis de resíduos de sítio ativo foram estudados pela mutagênese direcionada ao sítio e cristalografia de raio X (Liu er al. Biochemistry 44: 2982-2992 (2005)). Com * — base na informação estrutural, tentativas foram feitas para engendrar a 4- aminobutirato transaminase de E. coli com nova atividade enzimática. Estes estudos fornecem uma base para desenvolver a atividade de transaminase para os caminhos de BDO.
2.7.2.a - Fosfotransferase, aceitador do grupo carboxila As cinases exemplares incluem a acetato cinase de E. coli, codificada pelo ackA (Skarstedt e Silverstein J. Biol. Chem. 251: 6775-6783 (1976)), as butirato cinases de C. acetobutilicum, codificada pelo bukl e buk2 (Walter er al. Gene 134(1): 107-111 (1993) (Huang et al. ] Mol Microbiol
Casstih ticas 149 Biotechnol 2(1): 33-38 (2000)], e a gama-glutamil cinase de E. coli, codificada pelo proB (Smith et al. J. Bacteriol. 157: 545-551 (1984)). Estas enzimas fosforilam acetato, butirato, e glutamato, respectivamente. O produto de gene ackA da E. coli também fosforila propionato (Hesslinger et al. Mol. —Microbiol27:477-492(1998)) Clostridium acetobutylicum
2.8.3.a - Coenzima-A transferase Na família da-CoA-transferase, a enzima acil-CoA:acetato- CoA transferase da E. coli, também conhecida como acetato-CoA transferase (EC 2.8.3.8), foi mostrada transferir a porção-CoA para acetato a partir de "10 uma variedade de substratos de acil-CoA ramificados e lineares, incluindo : isobutirato (Matthies e Schink Appl Environ Microbiol 58: 1435-1439 (1992)), valerato (Vanderwinkel et al. Biochem. Biophys. Res Commun. 33: 902-908 (1968)) e butanoato (Vanderwinkel, supra (1968)). Esta enzima é codificada pelo atoA (subunidade alfa) e atoD (subunidade beta) na E. coli sp.
K12 (Korolev et al. Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 58: 2116-2121 (2002); Vanderwinkel, supra (1968)) e actA e cg0592 em Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 (Duncan et al. Appl Environ Microbiol! 68: 5186- 5190 (2002)). Os genes adicionais encontrados pela homologia de sequência incluem atoD e atoA na Escherichia coli UT189.
Transformações similares são catalisadas pelo produto de genes de catl, cat2, e cat3 de Clostridium kluyveri que foram mostrados exibir a atividade da succinil-CoA, 4-hidroxibutiril-CoA, e butiril-CoA acetiltransferase, respectivamente (Ver odorf et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A.
a 150 105(6): 2128-2133 (2008); Sohling e Gottschalk J Bacteriol 178(3): 871-880 (1996)]. Gene Acesso No reanismo — A enzima glutaconato-CoA-transferase (EC 2.8.3.12) da bactéria anaeróbica Acidoaminococcus fermentans reage com diácido — glutaconil-CoA e 3-butenoil-CoA (Mack e Buckel FEBS Lett. 405: 209-212 (1997)). Os genes que codificam esta enzima são gctd e gecrB. Esta enzima tem atividade reduzida mas detectável com outros derivados de -CoA incluindo glutaril-CoA, 2-hidroxiglutaril-CoA, adipil-COA e acrilil-CoA (Buckel et al. Eur. J. Biochem. 118: 315-321 (1981)). A enzima foi clonada e 210 expressadana £. coli (Mac et al. Eur. J. Biochem. 226: 4151 (1994)).
'
3.1.2.a - Tioléster hidrolase (específica de -CoA) Na família da-CoA hidrolase, a enzima 3-hidroxiisobutiril- CoA hidrolase é específica para 3-HIBCoA e foi descrita catalisar eficazmente a transformação desejada durante a degradação da valine (Shimomura et al. J Biol Chem 269: 14248-14253 (1994)). Genes que codificam esta enzima incluem hibch de Rattus norvegicus (Shimomura et al., supra (1994); Shimomura et al. Methods Enzymol. 324: 229-240 (2000) e Homo sapiens (Shimomura et al., supra, 2000). Os genes candidatos pela homologia de sequência incluem hibch de Saccharomyces cerevisiae e BC 2292 de Bacillus cereus.
[Gene PO Acesso No areanismo — A conversão de adipil-CoA para adipato pode ser realizada por uma acil-CoA hidrolase ou equivalentemente uma tioesterase. O candidato de o 151 gene da E. coli de topo é tesB (Naggert et al. J Biol Chem. 266(17): 11044- 11050 (1991)] que mostra alta similaridade com o gene acot8 humano que é uma ácido dicarboxílico acetiltransferase com atividade na adipil-CoA (Westin et al. J Biol Chem 280(46): 38125-38132 (2005). Esta — atividade também foi caracterizada no fígado de rato (Deana, Biochem Int. 26(4): p. 767-773 (1992). Outras tioléster hidrolases da E. coli potenciais incluem os produtos de gene de tesA (Bonner e Bloch, J Biol Chem. 247(10): 3123-3133 (1972)), ybgC (Kuznetsova et al., FEMS Microbiol Rev. 29(2): 263-279 (2005); Zhuang et al., FEBS Lett. 516(1-3): 161-163 (2002)) paa! (Song et al., J Biol Chem. 281(16): 11028-11038 (2006)), e ybdB (Leduc et al., J E Bacteriol. 189(19): 7112-7126 (2007)). Diversas acetil-CoA hidrolases eucarióticas (EC 3.1.2.1) têm ampla especificidade de substrato. A enzima do cérebro de Rattus norvegicus
15. (Robinson et al. Biochem.Biophys. Res. Commun. 71: 959-965 (1976)) pode reagir com butiril-CoA, hexanoil-CoA e malonil-CoA.
4.1.1.a - Carbóxi-liase Uma carbóxi-liase exemplar é a acetolactato descarboxilase que participa no catabolismo de citrato e biossíntese de aminoácido de cadeia ramificada, convertendo 2-acetolactato em acetoina. Em Lactococcus lactis a enzima é composta de seis subunidades, codificadas pelo gene aldB, e é ativada pela valina, leucina e isoleucina (Goupil et al. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2636-2640 (1996); Goupil-Feuillerat er al. J. Bacteriol. 182:
et 152 í 5399-5408 (2000)). Esta enzima foi superexpressada e caracterizada na E. coli (Phalip et al. FEBS Lett. 351: 95-99 (1994)). Em outros organismos a enzima é um dímero, codificado por aldC em Streptococcus thermophilus (Monnet et al. Lett. Appl. Microbiol. 36: 399-405 (2003)), aldB em Bacillus brevis — (Diderichsen et al.]. Bacteriol. 172: 4315-4321 (1990); Najmudin et al. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59: 1073-1075 (2003)) e budA de Enterobacter aerogenes (Diderichsen et al. J. Bacteriol. 172: 4315-4321 (1990)). A enzima de Bacillus brevis foi clonada e superexpressada em Bacillus subtilis e caracterizada cristalograficamente (Najmudin et al. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 59: 1073-1075 (2003)). Adicionalmente, a enzima de Leuconostoc lactis foi purificada e caracterizada mas o gene não foi isolado (O'Sullivan et al. FEMS Microbiol. Lett. 194: 245-249 (2001)). i A aconitato descarboxilase catalisa a etapa final na biossíntese de itaconato em uma cepa de Candida e também no fungo filamentoso Aspergillus terreus (Bonnarme et al. J Bacteriol. 177: 3573-3578 (1995); Willke e Vorlop Appl Microbiol Biotechnol 56: 289-295 (2001)). Embora o itaconato seja um composto de interesse biotecnológico, o gene da aconitato descarboxilase ou a sequência de proteína não foram até agora relatados.
A 4-oxalocronato descarboxilase foi isolada a partir de numerosos organismos e caracterizados. Os genes que codificam esta enzima incluem dmpH e dmpE em Pseudomonas sp. (cepa 600) (Shingler et al. J Bacteriol. 174: 711-724 (1992)), xilll e xilIIT de Pseudomonas putida (Kato e Asano Arch. Microbiol 168: 457-463 (1997); Lian e Whitman J. Am. Chem. Soc. 116: 10403-10411 (1994); Stanley et al. Biochemistry 39: 3514 (2000)) —eReut B5691 e Reut B5692 de Ralstonia eutropha JMP134 (Hughes et al. J Bacteriol. 158: 79-83 (1984)). Os genes que codificam a enzima de o 153 Pseudomonas sp. (cepa 600) foram clonados e expressados na E. coli (Shingler et al. J Bacteriol. 174: 711-724 (1992)).
Uma classe adicional de descarboxilases foi caracterizada que catalisam a conversão de cinamato (fenilacrilato) e derivados de cinamato — substituídos aos derivados de estireno correspondente. Estas enzimas são comuns em uma variedade de organismos e genes específicos que codificam estas enzimas que foram clonadas e expressadas na E. coli são: pad 1 de Saccharomyces cerevisae (Clausen et al. Gene 142: 107-112 (1994)), pde de : Lactobacillus plantarum (Barthelmebs er al. Appl Environ Microbiol 67: 210 1063-1069 (2001); Qi et al. Metab Eng 9: 268-276 (2007); Rodriguez et al. J. Agric. Food Chem. 56: 3068-3072 (2008)), pofK (pad) de Klebsiella oxitoca (Hashidoko er al. Biosci. Biotech. Biochem. 58: 217-218 (1994); Uchiyama et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 72: 116-123 (2008)), Pedicoccus pentosaceus (Barthelmebs er al. Appl Environ Microbiol 67: 1063-1069
15. (2001), e padC de Bacillus subtilis e Bacillus pumilus (Lingen et al. Protein Eng 15: 585-593 (2002)). Uma ácido ferúlico descarboxilase de Pseudomonas É fluorescens também foi purificada e caracterizada (Huang er al. J. Bacteriol. 176: 5912-5918 (1994)). Importantemente, esta classe de enzimas foram mostradas ser estáveis e não requerem co-fatores exógenos ou internalmente ligados, tornando assim estas enzimas idealmente adequadas para biotransformações (Sariaslani, Annu. Rev. Microbiol. 61: 51-69 (2007)). [Gm [| AvesoNo PO BIN OTEGREMD As enzimas de descarboxilase adicionais podem formar a
RE 154 o semialdeído succínico a partir do alfa-cetoglutarato.
Estas incluem as enzimas alfa-cetoglutarato descarboxilase de Euglena gracilis (Shigeoka et al.
Biochem.
J. 282 (Pt 2): 319-323 (1992); Shigeoka e Nakano Arch.
Biochem.
Biophys. 288: 22-28 (1991); Shigeoka e Nakano Biochem.
J. 292 ( Pt 2): 463- 467 (1993)), cuja sequência de gene correspondente já foi determinada, ea = partir de Mycobacterium tuberculosis (Tian et al.
Proc Natl Acad Sci U.S.A. 102: 10670-10675 (2005)) Além disso as enzimas da glutamato descarboxilase podem converter glutamato em 4-aminobutirato tal como os produtos dos genes gadA e gadB da E. coli (De Biase et al.
Protein.
Expr. —Purif.8:430-438 (1993). Gene í Ceto-ácido descarboxilases . A piruvato descarboxilase (PDC, EC 4.1.1.1), também chamada de ceto-ácido descarboxilase, é uma enzima chave na fermentação alcoólica, que catalisa a descarboxilação de piruvato para acetaldeído.
Esta enzima tem uma ampla faixa de substrato para 2-ceto ácidos alifáticos incluindo 2-cetobutirato, 2-cetovalerato, 3-hidroxipiruvato e 2-fenilpiruvato (Berg et al.
Science 318: 1782-1786 (2007)). A PDC de Zymomonas mobilus, codificada pela pdc, foi um objeto de estudos de engenharia direcionados que alteraram a afinidade quanto a substratos diferentes (Siegert et al.
Protein Eng Des Sel 18: 345-357 (2005)). A PDC de Saccharomyces cerevisiae também foi extensivamente estudada, engendrada quanto a atividade alterada, e funcionalmente expressada na E. coli (Killenberg-Jabs et al.
Eur.
J.
Biochem. 268: 1698-1704 (2001); Li e Jordan Biochemistry 38: 10004-10012 (1999); ter Schure et al.
Appl.
Environ.
Microbiol. 64: 1303-1307 (1998)). A estrutura cristalina desta enzima está disponível (Killenberg-Jabs Eur.
J.
Biochem. 268: 1698-1704 (2001)). Outros candidatos de PDC bem caracterizados incluem as enzimas de Acetobacter pasteurians (Chandra et al.
Arch.
Microbiol. 176:
e 155 443-451 (2001)) e Kluyveromyces lactis (Krieger et al. Eur. J. Biochem. 269: 3256-3263 (2002)). Como a PDC, a benzoilformiato descarboxilase (EC 4.1.1.7) tem uma ampla faixa de substrato e foi o alvo de estudos de engenheiramento —deenzima A enzima de Pseudomonas putida foi extensivamente estudada e as estruturas cristalinas desta enzima estão disponíveis (Hasson ef al. Biochemistry 37: 9918-9930 (1998); Polovnikova et al. Biochemistry 42: 1820-1830 (2003)). A mutagênese direcionada ao sítio de dois resíduos no sítio ativo da enzima de Pseudomonas putida alterou a afinidade (Km) de * 10 substratos que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente (Siegert : Protein Eng Des Sel 18: 345-357 (2005)). As propriedades desta enzima foram modificadas ainda mais pelo engenheiramento direcionado (Lingen et al. Protein Eng 15: 585-593 (2002)); Lingen Chembiochem 4: 721-726 (2003)). A enzima de Pseudomonas aeruginosa, codificada pelo malC, também foi caracterizada experimentalmente (Barrowman et al. FEMS Microbiology Letters 34: 57-60 (1986)). Candidatos a gene adicionais de Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens e outros organismos podem ser deduzidas pela homologia de sequência ou identificadas usando um sistema de seleção de crescimento desenvolvido em Pseudomonas putida —(Henningetal. Appl. Environ. Microbiol. 72: 7510-7517 (2006)).
4.2.1.a - Hidro-liase A 2-(hidroximetil)glutarato desidratase de Eubacterium barkeri é uma hidro-lyase exemplar. Esta enzima foi estudada no contexto do catabolismo de nicotinato e é codificada pelo hhmd (Alhapel et al. Proc Natl a 156 e Acad Sci US A 103: 12341-12346 (2006)). Enzimas similares com alta í homologia de sequência são encontradas em Bacteroides capillosus, Anaerotruncus colihominis, e Natranaerobius Thermophilius.
Uma segunda hidro-liase exemplar é a fumarato hidratase, uma enzima que catalisa a desidratação de malato para fumarato.
Uma abundância de informação estrutural está disponível para esta enzima e pesquisadores têm engendrado com êxito a enzima para alterar a atividade, inibição e localização (Weaver, T.
Acta Crystallogr.
D Biol Crystallogr. 61: 1395-1401 (2005)). As Í fumarato hidratases adicionais incluem aquelas codificadas pelo fumC da * 10 Escherichia coli (Estevez er al.
Protein Sci. 11: 1552-1557 (2002); Hong e Lee Biotechnol.
Bioprocess Eng. 9: 252-255 (2004); Rose e Weaver Proc Natl Acad Sci U.S.A 101: 3393-3397 (2004)), Campilobacter jejuni (Smith et al.
Int.
J Biochem.
Cell Biol 31: 961-975 (1999)) e Thermus thermophilus (Mizobata et al.
Arch.
Biochem.
Biophys. 355: 49-55 (1998)), e fumH de Rattus norvegicus (Kobayashi et al.
J Biochem. 89: 1923-1931(1981)). Enzimas similares com alta homologia de sequência incluem fuml de Arabidopsis thaliana e fumC de Corynebacterium glutamicum.
A citramalato hidroliase, também chamada de 2-metilmalato desidratase, converte 2-metilmalato para mesaconato.
A atividade de 2- metilmalato desidratase foi detectada na Clostridium tetanomorphum, Morganella morganii, Citrobacter amalonaticus no contexto do caminho VI
"o . 187 da degradação de glutamato (Kato e Asano Arch. Microbiol 168: 457-463 (1997)); entretanto os genes que codificam esta enzima não foram sequenciados até agora.
O produto de gene de crt de C. acetobutilicum catalisa a — desidratação de 3-hidroxibutiril-CoA para crotonil-CoA (Atsumi er al. Metab Eng.; 29 (2007)); Boynton et al. Journal of Bacteriology 178: 3015-3024 (1996)). Acredita-se que as enoil-CoA hidratases, phaà e phaB, de P. putida carreguem a hidroxilação de ligações duplas durante o catabolismo de fenilacetato; (Olivera er al. Proc Natl Acad Sci USA 95(11): 6419-6424 (1998)). O paaà e paaB de P. fluorescens catalisam transformações análogas (14 Olivera ef al., supra, 1998). Por último, vários genes de Escherichia coli foram mostrados demonstrar funcionalidade de enoil-CoA hidratase incluindo 1 maoC (Park e Lee J Bacteriol 185(18): 5391-5397 (2003)), paaF (Park e Lee - Biotechnol Bioeng. 86(6): 681-686 (2004a)); Park e Lee Appl Biochem —Biotechnol. 113-116: 335-346 (2004b)); Ismail et al. Eur J Biochem 270(14): p. 3047-3054 (2003), e paaG (Park e Lee, supra, 2004; Park e Lee supra, 2004b; Ismail et al., supra, 2003). Os genes da E. coli fadA e fadB codificam um complexo de enzima múltipla que exibe as atividades de cetoacil-CoA tiolase, 3- —hidroxiacil-COA desidrogenase, e enoil-CoA hidratase (Yang et al. Biochemistry 30(27): p. 6788-6795 (1991); Yang et al. J Biol Chem 265(18): p. 10424-10429 (1990); Yang et al. J Biol Chem 266(24): p. 16255 (1991); Nakahigashi e Inokuchi Nucleic Acids Res. 18(16): p. 4937 (1990)). Os genes Jfadl e fadJ codificam funções similares e são naturalmente expressados oO, 158 apenas anaerobicamente (Campbell et al. Mol Microbiol 47(3): p. 793-805 ' (2003). Um método para produzir poli[(R)-3-hidroxibutirato] em E. coli que envolve ativar fadB (pelo silenciamento de um regulador negativo, fadR) e que co-expressa uma cetotiolase não nativa (phad de Ralstonia eutropha) foi — descrito anteriormente (Sato et al. J Biosci Bioeng 103(1): 38-44 (2007)).
Este trabalho claramente demonstra que uma enzima de f-oxidação, em particular o produto de gene de fadB que codifica as atividades tanto da 3- hidroxiacil-CoA desidrogenase quanto da enoil-CoA hidratase, pode funcionar como parte de um caminho para produzir moléculas de cadeia mais longaa partir de precursores de acetil-CoA.
[ Gee Acesso No No Organismo ——— | - 4.3.1.a - Amônia-liase A aspartase (EC 4.3.1.1), que catalisa a desaminação de aspartato para fumarato, é uma enzima amplamente difundida em microorganismos, e foi caracterizada extensivamente (Viola, R. E. Adv.
—Enzymol.Relat Areas Mol. Biol 74: 295-341 (2000)). A estrutura cristalina da aspartase de E. coli, codificada pela aspA, foi resolvida (Shi er al.
Biochemistry 36: 9136-9144 (1997)). A enzima da E. coli também foi mostrada reagir com substratos alternativos do éster aspartatofenilmetílico, asparagina, benzil-aspartato e malato (Ma et al. Ann N. Y. Acad Sci 672: 60- 65 (1992)) Em um estudo separado, a evolução direcionada foi utilizada nesta enzima para alterar a especificidade de substrato (Asano ef al. Biomol.
Eng 22: 95-101 (2005)). Enzimas com a funcionalidade de aspartase também foram caracterizadas em Haemophilus influenzae (Sjostrom et al. Biochim.
Biophys. Acta 1324: 182-190 (1997)), Pseudomonas fluorescens (Takagi er al J. Biochem. 96: 545-552 (1984)), Bacillus subtilus (Sjostrom et al.
Biochim. Biophys. Acta 1324: 182-190 (1997)) e Serratia marcescens as 159 (Takagi e Kisumi J Bacteriol. 161: 1-6 (1985)). [| Gene T AccessionNo —] GN |] - oOrganismm | Lane passo O Bacillus subrilas = | 3-metilaspartase (EC 4.3.1.2), também conhecida como beta- metilaspartase ou 3-metilaspartato amônia-liase, catalisa a desaminação de treo-3-metilasparatato para mesaconato. A 3-metilaspartase de Clostridium tetanomorphum foi clonada, funcionalmente expressada na E. coli, e cristalizada (Asuncion et al. Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr. 57: 731733 (2001); Asuncion et al. J Biol Chem. 277: 8306-8311 (2002); Botting et al. Biochemistry 27: 2953-2955 (1988); Goda et al. Biochemistry 31: 10747- ' 10756 (1992). Em Citrobacter amalonaticus, esta enzima é codificada pela BAA2Z8709 (Kato e Asano Arch.Microbiol 168: 457-463 (1997)). A 3- metilaspartase também foi cristalisada a partir da YG1002 da E. coli (Asano e Kato FEMS Microbiol Lett. 118: 255-258 (1994)) embora a sequência de proteína não esteja listada em bases de dados públicas tais como o GenBank. A homologia de sequência pode ser usada para identificar genes candidatos adicionais, incluindo CTC 02563 em C. tetani e ECS0761 na Escherichia coli 0157: H7.
Candidatos de enzima da amônia-liase que formam produtos da enoil-CoA incluem beta-alanil-COA amônia-liase (EC 4.3.1.6), que deamina a beta-alanil-CoA, e 3-aminobutiril-CoA amônia-liase (EC 4,3,1,14).
Duas beta-alanil-CoA amônia liases foram identificadas e caracterizadas em Clostridium propionicum (Herrmann et al. FEBS J. 272: 813-821 (2005)). Nenhuma outra das beta-alanil-CoA amônia liases foi estudada até agora, mas candidatos a gene podem ser identificados pela similaridade de sequência.
E 160 Um tal candidato é MXAN 4385 em Myxococcus xanthus.
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5.3.3.a - Isomerase As 4-hidroxibutiril-CoA desidratases tanto de Clostridium aminobutirium quanto de C. kluyveri catalisam a conversão reversível de 4- — hidroxibutiril-CoA para crotonil-CoA e possui uma atividade de vinilacetil- CoA A-isomerase intrínseca (Scherf e Buckel Eur. J Biochem. 215: 421-429 (1993); Scherf et al. Arch. Microbiol 161: 239-245 (1994)). Ambas as enzimas nativas foram purificadas e caracterizadas, incluindo as sequências de aminoácido de terminal N (Scherf e Buckel, supra, : 10 1993; Scherf et al., supra, 1994). Os genes abfD de C. aminobutirium e C. Kkluyveri se igualam exatamente com estas sequências de aminoácido de . terminal! N, assim são codificadoras das 4-hidroxibutiril-COA desidratases/vinilacetil-CoA A-isomerase. Além disso o gene abfD de Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 é identificado através de homologia de projetos genômicos. [ Gene | -—AcessoNo TO UGNe Organismo = |
5.4.3.a - Aminomutase A lisina 2,3-aminomutase (EC 5.4.3.2) é uma aminomutase exemplar que converte lisina para (3S)-3,6-diaminohexanoato, mudando um grupo amina da posição 2 para a 3. À enzima é encontrada em bactérias que fermentam lisina para acetato e butirato, incluindo como Fusobacterium nuleatum (kamA) (Barker et al. J. Bacteriol. 152: 201-207 (1982)) e Clostridium subterminale (kamA) (Chirpich et al. J. Biol. Chem. 245: 1778- 1789 (1970)). A enzima de Clostridium subterminale foi cristalizada (Lepore et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 102: 13819-13824 (2005)). Uma enzima
SEA 161 que codifica esta função também é codificada pelo yodO em Bacillus subtilus ' (Chenertal. Biochem. J. 348 Pt 3: 539-549 (2000)). A enzima utiliza piridoxal 5*-fosfato como um cofactor, requer a ativação pela S-Adenosilmetoionina, e é estereosseletivo, reagindo apenas com L-lisina. A enzima não mostrou —reagircom substratos alternativos. E. is Uma segunda aminomutase, beta-lisina 5,6-aminomutase (EC
5.4.3.3), catalisa a etapa seguinte da fermentação de lisina para acetato e butirato, que transforma (3S)-3,6-diaminohexanoato para (3S,5S8)-3,5- diaminohexanoato, mudando um grupo amina terminal da posição 6 para a 5. 210 Estaenzimatambém catalisa a conversão de lisina para 2,5-diaminohexanoato e também é chamada de lisina-5,6-aminomutase (EC 5.4.3.4). A enzima foi " cristalizada em Clostridium sticklandii (kamD, kamE) (B erkovitch et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101: 15870-15875 (2004)). A enzima de Porphyromonas gingivalis também foi caracterizada (Tang et al. Biochemistry 41: 8767-8776 (2002)).
[Gene | AcessoNo | GN | Organismo —) A ornitina 4,5-aminomutase (EC 5.4.3.5) converte D-ornitina para 2,4-diaminopentanoato, também mudando uma amina terminal para o carbono adjacente. A enzima de Clostridium sticklandii é codificada por dois genes, oraE e oras, e foi clonada, sequenciada e expressada na E. coli (Chen etal JJ. Biol. Chem. 276: 44744-44750 (2001)). Esta enzima não foi caracterizada em outros organismos até agora.
e . 162 ; A tirosina 2,3-aminomutase (EC 5.4.3.6) participa na biossíntese da tirosina, reversivelmente convertendo tirosina a 3-amino-3-(4- hidroxifenil)propanoato pela mudança de uma amina da posição 2 para a 3. Em Streptomyces globisporus a enzima também mostrou reagir com — derivados de tirosina (Christenson et al. Biochemistry 42: 12708-12718. (2003)). A informação de sequência não está disponível. A leucina 2,3-aminomutase (EC 5.4.3.7) converte L-leucina para beta-leucina durante a degradação e biossíntese de leucina. Um ensaio para leucina 2,3-aminomutase detectou atividade em muitos organismos (Poston, J. M. Methods Enzymol. 166: 130-135 (1988)) mas os genes que codifiam a enzima não foram identificados até agora. Í A Cargill desenvolveu uma novo enzima de 2,3-aminomutase . para converter L-alanina a B-alanina, criando assim um caminho de piruvato para 3-HP em quatro etapas bioquímicas (Liao et al., Publicação U.S. Nº 2005-0221466).
6.2.1.a - Ácido-tiol ligase Uma ácido-tiol ligase exemplar é o produto de genes de sucCD da E. coli que juntos catalisam a formação de succinil-CoA a partir de —succinato com o consumo concomitante de um ATP, uma reação que é reversível in vivo (Buck et al. Biochemistry 24(22): p. 6245-6252 (1985)).- CoA-ligases exemplares adicionais incluem a dicarboxilato-CoA ligase de rato para a qual a sequência ainda não foi caracterizada (Vamecq et al. Biochem J. 230(3): p. 683-693 (1985)), cada uma das duas fenilacetato-CoA — ligases caracterizadas de P. chrysogenum (Lamas-Maceiras et al. Biochem J 395(1): 147-155 (2006); Wang er al. Biochem Biophys Res Commun, 360(2): 453-458 (2007)), a fenilacetato-COoA ligase de Pseudomonas putida (Martinez-Blanco et al. J] Biol Chem. 265(12): 7084-7090 (1990)), e a 6- carboxihexanoato-CoA ligase de Bacillus subtilis (Bower et al. J Bacteriol e. 2 163 : 178(14): 4122-4130 (1996)). 152002983 E o ES EXEMPLO V a Caminho de BDO Exemplar de Succinil-CoA ESte exemplo descreve caminhos de BDO exemplares da — succinil-CoA. Os caminhos de BDO de succinil-CoA são aqui descritos e foram anteriormente descritos (ver o Pedido U.S. serial Nº 12/049.256, depositado em 14 de março de 2008, e Pedido PCT serial Nº US08/57168, f depositado em 14 de março de 2008, cada um dos quais é aqui incorporado , 10 —porreferência). Caminhos adicionais são mostrados na Figura 8A. As enzimas de tais caminhos de BDO exemplares são listados na Tabela 15, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas. Em resumo, a succinil-CoA pode ser convertida para semialdeído succínico pela succinil-CoA redutase (ou succinato semialdeído desidrogenase) (EC 1.2.1.b). Succinato semialdeído pode ser convertido para 4-hidroxibutirato pela 4-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1.1.1.a), como anteriormente descrito. Alternativamente, a succinil-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutirato pela succinil-CoA redutase (que forma álcool) (EC
1.1.1.0). A 4-Hidroxibutirato pode ser convertida para 4-hidroxibutirilCoA pela 4-hidroxibutiril-CoA transferase (EC 2.8.3.a), como anteriormente descrito, ou pela 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.9) ou 4 hidroxibutiril-CoA ligase (ou 4-hidroxibutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). Alternativamente, a 4-hidroxibutirato pode ser convertida para 4- hidroxibutiril-fosfato pela 4-hidroxibutirato cinase (EC 2.7.2.A), como anteriormente descrito. 4-hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido a 4-
E 164
| hidroxibutiril-CoA pela fosfotrans-4-hidroxibutirilase (EC 2.3.1.a), como Í anteriormente descrito.
Alternativamente, o 4-hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.d) (acilfosfato redutase). A 4-hidroxibutiril-CoA —podeser convertida para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4-hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b). Alternativamente, a 4- hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 4- hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). O 4 Hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol
—desidrogenase (EC 1.1.1.a), como anteriormente descrito.
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É o - 167 . EXEMPLO VI Caminhos de BDO adicionais exemplares de Alfa cetoglutarato Este exemplo descreve caminhos de BDO exemplares de alfa- cetoglutarato. : Os caminho de BDO de succinil-CoA são aqui descritos e foram anteriormente descritos (ver o Pedido U.S. serial Nº 12/049.256, depositado em 14 de março de 2008, e Pedido PCT serial Nº US08/57168, depositado em 14 de março de 2008, cada um dos quais é aqui incorporado —porreferência). Caminhos adicionais são mostrados na Figura 8B.
As enzimas de tais caminhos de BDO exemplares são listados na Tabela 16, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas. é Em resumo, o alfa-cetoglutarato pode ser convertido para : semialdeído succínico pelo alfa-cetoglutarato descarboxilase (EC 4.1.1.a), como anteriormente descrito.
Alternativamente, o alfa-cetoglutarato pode ser convertido para glutamato pela glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.a). O 4- aminobutirato pode ser convertido para semialdeído succínico pela 4- aminobutirato oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.1.a) ou 4-aminobutirato transaminase (EC 2.6.1.9). O glutamato pode ser convertido para 4- —aminobutirato pela glutamato descarboxilase (EC 4.1.1.9). O succinato semialdeído pode ser convertido para 4-hidroxibutirato pela 4-hidroxibutirato desidrogenase (EC 1.1.1.9), como anteriormente descritos.
O 4 hidroxibutirato pode ser convertido para 4-hidroxibutiril-COoA pela 4- hidroxibutiril-CoA transferase (EC 2.8.3.a), como anteriormente descrito, ou pela 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a), ou 4-hidroxibutiril-CoA ligase (ou 4-hidroxibutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). O 4-Hidroxibutirato pode ser convertido para 4-hidroxibutiril-fosfato pela 4-hidroxibutirato cinase (EC 2.7.2.9). A 4hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido para 4- hidroxibutiril-CoA pela fosfotrans-4-hidroxibutirilase (EC 2.3.1.9), como AV———
o 168
: anteriormente descrito.
Alternativamente, o 4-hidroxibutiril-fosfato pode ser É convertido para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.d) (acilfosfato redutase). A 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase S (ou 4-hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b), como anteriormente descrito.
A 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). O 4 Hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a), como anteriormente descrito.
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EXEMPLO VII É Caminhos de BDO a partir de 4-Aminobutirato Este exemplo descreve o caminho exemplar de BDO a partir de 4-aminobutirato. s$ A Figura 9A representa caminhos de BDO exemplares em que 4-aminobutirato é convertido para BDO. As enzimas de um tal caminho de BDO exemplar são listadas na Tabela 17, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas. Em resumo, o 4-aminobutirato pode ser convertido para 4- —aminobutiril-CoA pela 4-aminobutirato-CoA transferase (EC 2.8.3.a), 4- aminobutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a), ou 4-aminobutirato-CoA ligase (ou 4-aminobutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). A 4-aminobutiril-CoA pode ser " convertida para 4-oxobutiril-CoA pela 4-aminobutiril-CoA oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.1.a) ou 4-aminobutiril-CoA transaminase (EC 2.6.1.a). A 4-oxobutiril-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutiril-CoA pela 4- hidroxibutiril-CoA desidrogenase (EC 1.1.1.a). A 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). Alternativamente, a 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4- —hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b). A 4-hidroxibutanal pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC
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Em resumo, o 4-aminobuíívato. pode ser convertido para 4- aminobutiril-CoA pela 4-aminobutirato-CoA transferase (EC 2.8.3.a), 4- aminobutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a) ou 4-aminobutirato-CoA ligase (ou 4-aminobutiril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). A 4-aminobutiril-CoA pode ser convertida para 4-aminobutan-l-ol pela 4-aminobutiril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). Alternativamente, a 4-aminobutiril-CoA pode ser convertida para 4-aminobutanal pela 4-aminobutiril-CoA redutase (ou 4- aminobutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b), e 4-aminobutanal convertido para ” 4-aminobutan-1-ol pela 4-aminobutan-l-ol desidrogenase (EC 1.1.1.9). 4- r aminobutan-l-ol pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela 4- —aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.1.) ou 4 aminobutan-l-ol transaminase (EC 2.6.1.a). 4-hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC
11.1).
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RR oo. 176 : A Figura 9B representa caminho de BDO exemplar em que o 4-aminobutirato é convertido para BDO. As enzimas de um tal caminho de BDO exemplar estão listadas na Tabela 19, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas.
Ss Em resumo, o 4-aminobutirato pode ser convertido para o ácido [(4-aminobutanolil)óxilfosfônico pela 4-aminobutirato cinase (EC
2.7.2.a). O ácido [(4-aminobutanolil)óxi] fosfônico pode ser convertido para 4-aminobutanal pela 4-aminobutiraldeído desidrogenase (fosforilação) (EC
1.2.1.d). 4-aminobutanal pode ser convertido para 4-aminobutan-1-ol pela 4- —aminobutan-l-ol desidrogenase (EC 1.1.1.a). O 4-aminobutan-1l-ol pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.1.a) ou 4-aminobutan-1-ol transaminase (EC 2.6.1.a). Alternativamente, o ácido [(4-aminobutanolil)óxi]l fosfônico pode ser convertido “para [(4-oxobutanolil)óxil fosfônico pela ácido [(4 —aminobutanolil)9óóxilfosfônico oxidorredutase (desaminação) (EC 1.4.1.a) ou ácido [(4-aminobutanolil)óxilfosfônico transaminase (EC 2.6.1.a). O ácido [(4-oxobutanolil)óxi] fosfônico pode ser convertido para 4-hidroxibutiril- fosfato pela 4-hidroxibutiril-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.9). O 4 hidroxibutiril-fosfato pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela 4- hidroxibutiraldeído desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.0). O 4 hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a).
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EXEMPLO VIII Caminhos de BDO exemplares a partir de Alfa-cetoglutarato Este exemplo descreve caminhos de BDO exemplares a partir de alfa-cetoglutarato.
A Figura 10 representa caminhos de BDO exemplares em que o alfa-cetoglutarato é convertido para BDO. As enzimas de um tal caminho de BDO exemplar estão listadas na Tabela 20, junto com genes exemplares que —codificam estas enzimas.
Em resumo, o alfa-cetoglutarato pode ser convertido para alfa- cetoglutaril-fosfato pela alfa-cetoglutarato S-cinase (EC 2.7.2.a). Alfa- cetoglutaril-fosfato pode ser convertido para ácido 2,5-dioxopentanóico pela 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.0). O 15) ácido 2,5-dioxopentanóico pode ser convertido para ácido 5-hidróxi-2- oxopentanóico pela ácido 2,5-dioxopentanóico redutase (EC 1.1.1.a). Alternativamente, O alfa-cetoglutarato pode ser convertido para alfa- cetoglutaril-CoA pela alfa-cetoglutarato-CoA transferase (EC 2.8.3.a), alfa- cetoglutaril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a) ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase (ou —alfa-cetoglutaril-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). A alfa-cetoglutaril-CoA pode ser convertida para o ácido 2,5-dioxopentanóico pela alfa-cetoglutaril-CoA redutase (ou ácido 2,5-dioxopentanóico desidrogenase) (EC 1.2.1.b). O ácido 2,5-dioxopentanóico pode ser convertido para o ácido S-hidróxi-2- oxopentanóico pela ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase.
: 25 — Alternativamente, a alfa-cetoglutaril-CoA pode ser convertida para o ácido 5- ' hidróxi-2-oxopentanóico pela alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). O ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase (EC 4.1.1.a). 4-hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela CRER o
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É o, 183 . EXEMPLO IX Caminhos de BDO exemplares a partir de Glutamato Este exemplo descreve caminhos de BDO exemplares a partir de glutamato. s A Figura 11 representa caminhos de BDO exemplares em que o glutamato é convertido para BDO.
As enzimas de um tal caminho exemplar de BDO são listadas na Tabela 21, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas.
Em resumo, o glutamato pode ser convertido para glutamil- —CoA pela glutamato-CoA transferase (EC 2.8.3.a), glutamil-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a) ou glutamil-CoA ligase (ou glutamil-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). Alternativamente, o glutamato pode ser convertido para glutamato-5-fosfato pela glutamato 5-cinase (EC 2.7.2.9). A glutamate-S-fosfato pode ser convertido para glutamato-S-semialdeído pela glutamato-5S-semialdeído —desidrogenase (fosforilação) (EC 1.2.1.0). A glutamil-CoA pode ser convertida para glutamato-S-semialdeído pela glutamil-CoA redutase (ou glutamato-S-semialdeído —desidrogenase) (EC 1.2.1.b). O glutamato-S- semialdeído pode ser convertido para ácido 2-amino-5-hidróxi-pentanóico pela glutamato-S-semialdeído redutase (EC 1.1.1.a). Alternativamente, a — glutamil-CoA pode ser convertida para o ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico pela glutamil-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). O ácido 2- amino-S-hidroxipentanóico pode ser convertido para o ácido 5-hidróxi-2- oxopentanóico pela ácido 2-amino-S-hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação) (EC 14.1.) ou ácido 2-amino-S-hidroxipentanóico —transaminase (EC 2.6.1.9). O ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico pode ser convertido para 4-hidroxibutanal pela ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase (EC 4.1.1.a). O 4-Hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4- butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a). Alternativamente, o ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico pode ser convertido para 4-hidroxibutiril-
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A, 187 : EXEMPLO X BDO Exemplar a partir de Acetoacetil-COoA Este exemplo descreve um caminho de BDO exemplar a partir de acetoacetil-COA. A Figura 12 representa caminhos de BDO exemplares em que a acetoacetil-CoA é convertida para BDO. As enzimas de um tal caminho de BDO exemplar estão listados na Tabela 22, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas. Em resumo, a acetoacetil-CoA pode ser convertida para 3- — hidroxibutiril-CoA pela 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase (EC 1.1.1.a). a 3- Hidroxibutiril -CoA pode ser convertida para crotonoil-COA pela 3- - hidroxibutiril-CoA desidratase (EC 4.2.1.9). A crotonoil-CoA pode ser convertida para vinilacetil-CoA pela vinilacetil-COA A-isomerase (EC E 5.3.3.3). A vinilacetil-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutiril-CoA pela 4-hidroxibutiril-CoA desidratase (EC 4.2.1.a). A 4-Hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.0). Alternativamente, a 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4- hidroxibutanal desidrogenase) (EC 1.2.1.b). O 4-Hidroxibutanal pode ser convertido para 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC
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EXEMPLO XI É Caminho de BDO Exemplar a partir de Homosserina Este exemplo descreve um caminho de BDO exemplar da homosserina. A Figura 13 representa caminhos de BDO exemplares em que a homosserina é convertida para BDO. Enzimas de um tal caminho de BDO exemplar são listados na Tabela 23, junto com genes exemplares que codificam estas enzimas. Em resumo, a homosserina pode ser convertida para 4- —hidroxibut-2-encato “pela homosserina desaminase (EC 43.1.a). Alternativamente, a homosserina pode ser convertida para homosserina-CoA pela homosserina-CoA transferase (EC 2.8.3.a), homosserina-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a) ou homosserina-CoA ligase (ou homosserina-CoA sintetase) (EC à 6.2.1.a). Homosserina-CoA pode ser convertida para 4-hidroxibut-2-enoil- —CoA pela homosserina-CoA desaminase (EC 4.3.1.a). 4-Hidroxibut-2-enoato pode ser convertido para 4-hidroxibut-2-enoil-CoA pela 4-hidroxibut-2-enoil- CoA transferase (EC 2.8.3.a), 4-hidroxibut-2-enoil-CoA hidrolase (EC
3.1.2.a), ou 4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase (ou 4-hidroxibut-2-enoil-CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). Alternativamente, o 4-hidroxibut-2-enoato pode ser convertido para 4-hidroxibutirato pela 4-hidroxibut-2-enoato redutase (EC
1.3.1.9). O 4-Hidroxibutirato pode ser convertido para 4-hidroxibutiril-coA pela 4-hidroxibutiril-COA transferase (EC 2.8.3.9), 4-hidroxibutiril-CoA hidrolase (EC 3.1.2.a), ou 4-hidroxibutiril-CoA ligase (ou 4-hidroxibutiril- CoA sintetase) (EC 6.2.1.a). a 4-Hidroxibut-2-enoil-CoA pode ser convertida í 25 para 4-hidroxibutiril-CoA pela 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase (EC , 1.3.1.a). A 4-Hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 1,4-butanodiol pela 4-hidroxibutiril-CoA “redutase (que forma álcool) (EC 1.1.1.) Alternativamente, a 4-hidroxibutiril-CoA pode ser convertida para 4- hidroxibutanal pela 4-hidroxibutiril-CoA redutase (ou 4-hidroxibutanal
EA 190 ' desidrogenase) (EC 1.2.1.b). O 4-Hidroxibutanal pode ser convertido para í 1,4-butanodiol pela 1,4-butanodiol desidrogenase (EC 1.1.1.a).
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SN 193 Por todo este pedido várias publicações foram dadas como S referência.
As divulgações destas publicações em suas totalidades são por meio deste incorporadas por referência neste pedido de modo a descrever mais completamente o estado da técnica à qual esta invenção pertence. —Embora a invenção fosse descrita com referência aos exemplos fornecidos acima, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito da invenção.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES : 1. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente tendo : uma via de 1,4-butanodiol (BDO), caracterizado pelo fato de que o dito organismo microbiano compreende ácidos nucleicos exógenos que codificam as enzimas da via de BDO expressadas em uma quantidade suficiente para produzir BDO, a dita via de enzimas de BDO compreendendo (A) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de 3-hidroxibutiril-CoA desidrogenase, 3-hidroxibutiril-CoA desidratase, vinilacetil-CoA A-isomerase, e 4-hidroxibutiril-CoA desidratase; (B) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de glutamato CoA transferase, glutamil-CoA hidrolase, glutamil- CoA ligase, glutamato 5-cinase, glutamato-S-semialdeído desidrogenase (fosforilação), glutamil-CoA redutase, glutamato-S-semialdeído redutase, glutamil-CoA redutase (que forma álcool), ácido 2-amino-5- hidroxipentanóico —oxidorredutase (desaminação), ácido 2-amino-5- hidroxipentanóico transaminase, ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase e ácido —S-hidróxi-2-oxopentanóico — desidrogenase (descarboxilação); (C) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de glutamato desidrogenase, 4-aminobutirato oxidorredutase : (desaminação), 4-aminobutirato transaminase, glutamato descarboxilase, 4- hidroxibutiril-CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, ou 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação); ! (D) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo “25 que consiste de 4-aminobutirato CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril-CoA oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutiril-COA transaminase, e 4-hidroxibutiril-COA desidrogenase; (E) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de 4-aminobutirato CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA hidrolase, 4-aminobutirato-CoA ligase, 4-aminobutiril-CoA redutase (que forma álcool),
    : 4-aminobutiril-CoA — redutase, 4-aminobutan-1-ol desidrogenase, —4-
    . aminobutan-l-ol — oxidorredutase (desaminação) ou 4-aminobutan-1-ol
    . transaminase;
    (E) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de d-aminobutirato cinase, 4-aminobutiraldeído desidrogenase (fosforilação), — 4-aminobutan-1-ol desidrogenase, — 4-aminobutan-1-o] oxidorredutase (desaminação), 4-aminobutan-1-ol transaminase, ácido [(4-
    —aminobutanolil)9óxilfosfônico oxidorredutase (desaminação), ácido [(4- aminobutanolil)óxilfosfônico transaminase, 4-hidroxibutiril-fosfato desidrogenase, ou 4-hidroxibutiraldeído desidrogenase (fosforilação);
    (G) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de alfa-cetoglutarato 5-cinase, 2,5-dioxopentanóico semialdeído
    15º desidrogenase (fosforilação), ácido 2,5-dioxopentanóico redutase, alfa- cetoglutarato CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, alfa cetoglutaril-CoA ligase, alfa-cetoglutaril-CoA redutase, ácido 5-hidróxi-2- oxopentanóico desidrogenase, alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool), ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase, e ácido 5-hidróxi-2- —oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação);
    : (H) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de homosserina desaminase, homosserina CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, homosserina-CoA ligase, homosserina-CoA desaminase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA transferase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA
    .25 — hidrolase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase, 4-hidroxibut-2-enoato redutase, 4- hidroxibutiril-CoA — transferase, —d4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, = 4- hidroxibutiril-CoA ligase, ou 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase;
    ou (D) pelo menos uma enzima da BDO selecionada do grupo que consiste de succinil-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril- CoA hidrolase, 4-hidroxibutiril-CoA ligase, e 4-hidroxibutanal desidrogenase (fosforilação). :' 2. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de — acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas enzimas da via de BDO como definidas nas alternativas (A), (B), (D), (G) ou (H) compreendem ainda 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4- hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
    3. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de — acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas enzimas da via de BDO como definidas na alternativa (C) compreendem ainda a alfa- cetoglutarato — descarboxilase, — 4-hidroxibutirato desidrogenase, — 4- hidroxibutiril-CoA transferase, d4-hidroxibutirato cinase, fosfotrans-4- hidroxibutirilase, — 4-hidroxibutiril-CoA redutase, — 4-hidroxibutiril-CoA — redutase (que forma álcool), ou 1,4- butanodiol desidrogenase.
    4. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas enzimas da via de BDO como definidas nas alternativas (E) ou (F) compreendem ainda a 1,4-butanodiol desidrogenase.
    5. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de . acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas enzimas da via de BDO como definidas na alternativa (1) compreendem ainda a É succinil-CoA redutase, 4-hidroxibutirato desidrogenase, 4-hidroxibutiril-CoA À transferase, 4-hidroxibutirato —cinase, fosfotrans-4-hidroxibutirilase, 4- hidroxibutiril-CoA redutase, 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), ou 1,4- butanodiol desidrogenase.
    6. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito organismo microbiano como definido nas alternativas 6), D), (E), (E), (GQ) e (HD)
    compreende dois ou três ácidos nucleicos exógenos, cada um codificando " uma enzima da via de BDO. | 7. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de , acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito organismo —microbiano como definido nas alternativas (B), (E), (E) e (G) compreende quatro ácidos nucleicos exógenos, cada um codificando uma enzima da via de BDO.
    8. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito organismo microbiano como definido na alternativa (B) compreende cinco ácidos nucleicos exógenos, cada um codificando uma enzima da via de BDO.
    9. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito organismo microbiano compreende (1) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) glutamato CoA transferase, glutamil-CoA hidrolase, ou glutamil-CoA ligase, (b) glutamil-CoA redutase (que forma álcool), f (c) ácido 2-amino-S-hidroxipentanóico — oxidorredutase (desaminação) ou ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase e . (d) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação) “25 ou (K) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) glutamato 5-cinase,
    Ss (b) glutamato-5-semialdeído desidrogenase (fosforilação), . (c) ácido 2-amino-S-hidroxipentanóico — oxidorredutase : (desaminação) ou ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase, e É (d) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou ácido —S-hidróxi-2d-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação); ou (L) cinco ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d, e) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos cinco ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) glutamato CoA transferase, glutamil-CoA hidrolase, ou glutamil-CoA ligase, (b) glutamil-CoA redutase, (c) glutamato-5-semialdeído redutase, (d) ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico — oxidorredutase
    15. —(desaminação) ou ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase e (e) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação); ou (M) cinco ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d, e) cada um —codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos cinco ácidos : nucleicos exógenos codificam: ; (a) glutamato 5-cinase, : (b) glutamato-5-semialdeído desidrogenase (fosforilação), (c) glutamato-5-semialdeído redutase, Ds (d) ácido 2-amino-S-hidroxipentanóico oxidorredutase (desaminação) ou ácido 2-amino-5-hidroxipentanóico transaminase e (e) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação); ou
    (N) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, c) cada um . codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos : nucleicos exógenos codificam: - (a) 4-aminobutirato CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA — hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase, (b) 4-aminobutiril-CoA oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutiril-CoA transaminase e (c) 4-hidroxibutiril-CoA desidrogenase; ou (O) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, c) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) 4-aminobutirato CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase, (b) 4-aminobutiril-CoA redutase (que forma álcool) e (c) 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutan-1-ol transaminase ou (P) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um —codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos : nucleicos exógenos codificam: (a) 4-aminobutirato CoA transferase, 4-aminobutiril-CoA ' hidrolase, ou 4-aminobutirato-CoA ligase, | (b) 4-aminobutiril-CoA redutase, "25 (c) 4-aminobutan-1-ol desidrogenase, e (d) 4-aminobutan-l-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutan-1-ol transaminase; ou (Q) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um q codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos / nucleicos exógenos codificam: S (a) 4-aminobutirato cinase, f (b) 4-aminobutiraldeído desidrogenase (fosforilação), (c) 4-aminobutan-1-ol desidrogenase e (d) 4-aminobutan-1-ol oxidorredutase (desaminação) ou 4- aminobutan-1-ol transaminase. ou (R) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um —codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) 4-aminobutirato cinase, (b) ácido [(4-aminobutanolil)óxi]fosfônico oxidorredutase (desaminação) ou ácido [(4-aminobutanolil)óxi]fosfônico transaminase, (c) 4-hidroxibutiril-fosfato desidrogenase e (d) 4-hidroxibutiraldeído desidrogenase (fosforilação); ou (S) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, o) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos — nucleicos exógenos codificam: ' (a) alfa-cetoglutarato CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA . hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase, : (b) alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool) e (c) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou (TD) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, O) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) alfa-cetoglutarato CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase, . (b) alfa-cetoglutaril-CoA redutase (que forma álcool) e : (c) ácido — S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase . (descarboxilação); s ou (U) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) alfa-cetoglutarato 5-cinase, (b) 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação), (c) ácido 2,5-dioxopentanóico redutase e (d) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou (V) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) alfa-cetoglutarato 5-cinase, (b) 2,5-dioxopentanóico semialdeído desidrogenase (fosforilação), . (c) ácido 2,5-dioxopentanóico redutase e (DD ácido — S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação); : ou "25 (W) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) alfa-cetoglutarato CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase,
    (b) alfa-cetoglutaril-CoA redutase, - (c) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase e (d) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico descarboxilase ou Ss (X) quatro ácidos nucleicos exógenos (a, b, c, d) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos quatro ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) alfa-cetoglutarato CoA transferase, alfa-cetoglutaril-CoA hidrolase, ou alfa-cetoglutaril-CoA ligase, (b) alfa-cetoglutaril-CoA redutase, (c) ácido 5-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase e (d) ácido S-hidróxi-2-oxopentanóico desidrogenase (descarboxilação) ou (Y) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, c) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) homosserina desaminase, (b) 4-hidroxibut-2-enoil-CoA transferase, 4-hidroxibut-2- — enoil-CoA hidrolase, 4-hidroxibut-2-enoil-CoA ligase e f (c) 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase : ou . (Z) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, c) cada um codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos — nucleicos exógenos codificam: (a) homosserina CoA transferase, homosserina-CoA hidrolase, ou homosserina-CoA ligase, (b) homosserina-CoA desaminase e (c) 4-hidroxibut-2-enoil-CoA redutase ou : (AA) três ácidos nucleicos exógenos (a, b, c) cada um Y codificando uma enzima da via de BDO e em que os ditos três ácidos nucleicos exógenos codificam: (a) homosserina desaminase, (b) 4-hidroxibut-2-enoato redutase e (c) 4-hidroxibutiril-CoA *transferase, d4-hidroxibutiril-CoA hidrolase, ou 4-hidroxibutiril-CoA ligase.
    10. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita via de BDO como definida nas alternativas (J), (K), (L), (M), (N), (D, (VU), DO, (Y), (Z) ou (AA) compreende ainda 4-hidroxibutiril-CoA redutase (que forma álcool), 4-hidroxibutiril-CoA redutase, ou 1,4-butanodiol desidrogenase.
    11. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a dita via de BDO de acordo com as alternativas (O), (P), (Q), (RD, (S), (U) ou (W) compreende ainda a 1,4-butanodiol desidrogenase.
    12. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato —dequeo dito pelo menos um ácido nucleico exógeno é um ácido nucleico . heterólogo.
    13. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente de | acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato | de que o dito organismo microbiano que não ocorre naturalmente está em um * 25 meiode cultura substancialmente anaeróbico.
    14. Organismo microbiano que não ocorre naturalmente, caracterizado pelo fato de ter uma via de 1,4-butanodiol (BDO), dito organismo microbiano compreendendo ácidos nucleicos exógenos que codificam enzimas da via BDO expressas em uma quantidade suficiente para produzir BDO, as ditas enzimas da via de BDO compreendendo pelo menos . uma enzima da via de BDO como mostrada em qualquer uma das figuras | ou 8-13 ou como descrito no relatório descritivo. é 15. Método para produzir BDO, caracterizado pelo fato de que — compreende cultivar organismo microbiano que não ocorre naturalmente como definido em qualquer uma das reivindicações 1-14, sob condições e por um período de tempo suficiente para produzir BDO.
    16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito organismo microbiano que não ocorre naturalmente estiemum meio de cultura substancialmente anaeróbico.
    17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dito pelo menos um ácido nucleico exógeno é um ácido nucleico heterólogo.
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