BRPI0919406B1 - Método para produção de aditivo para a degradação enzimática de fumonisinas, aditivo e uso de genes para a expressão recombinante para a produção de um aditivo para a degradação de fumonisinas em uma matéria-prima vegeta - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ADITIVO PARA A DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DE MICOTOXINAS E ADITIVOS E O USO DO MESMO. A presente invenção refere-se a um método para produzir um aditivo para a degradação enzimática de fumonisinas, é previsto que pelo menos seja provida uma sequência de ácido nucleico de genes correspondentes a sequências ID NO: (1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24), pelo menos uma sequência de ácido nucleico ser expressa em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, e pelo menos uma enzima assim preparada correspondente a sequências ID NO: (3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25), opcionalmente junto com um cossubstrato, são usados em um material bruto vegetal. (figura 3).

Description

[0001] A presente invenção refere-se a um método para produção de aditivo para a degradação enzimática de fumonisinas, em matérias- primas vegetais e misturas contendo matérias-primas vegetais, assim como o uso de genes.

[0002] Micotoxinas ocorrem muito frequentemente em produtos vegetais agrícolas e, dependendo do tipo de micotoxinas, causam severo prejuízo econômico, particularmente nos alimentos produzidos a partir de produtos agrícolas e mesmo em alimentação de animal e seres humanos com tais alimentos, sendo que dito prejuízo é extremamente diversificado. Numerosos métodos já foram desenvolvidos, na tentativa de desintoxicar ou degradar, ou tornar inofensivas tais micotoxinas a fim de inibir qualquer prejuízo causado por micotoxinas nos campos de nutrição animal e humana, melhoramento animal, processamento de alimentos e similares.

[0003] Micotoxinas conhecidas compreendem uma pluralidade de micotoxinas estruturalmente inter-relacionadas tais como, por exemplo, fumonisinas, entre as quais a fumonisina B1 é a toxina do grupo que mais frequentemente ocorre. Existem, porém, numerosos derivados e moléculas relacionadas que também são conhecidas por exibir efeitos nocivos em humanos e animais. Desse modo, é conhecido o fato de fumonisinas prejudicarem o metabolismo de esfingolipídeos pela interação com a enzima ceramida sintase. Esfingolipídeos não são apenas componentes de membranas celulares, mas também desempenham um importante papel como moléculas sinais e mensageiras em muitos processos celulares elementares, tal como crescimento celular, migração celular e adesão celular, em processos inflamatórios e procedimentos de transporte intracelular. Devido à esse dano do metabolismo de esfingolipídeos, as fumonisinas foram consideradas responsáveis pelos efeitos tóxicos em várias espécies animais e também em humanos. Verificou-se que as fumonisinas apresentam efeitos cancerígenos em roedores, e com base em dados epidemiológicos, elas foram associadas ao câncer de esôfago e a defeitos do tubo neural em humanos. Elas foram consideradas responsáveis pela toxicose típica causada por edemas pulmonares, por exemplo, em várias espécies animais tais como, por exemplo, suína. Neste contexto, as fumonisinas constituem uma fonte de combinação quase onipresente em várias culturas de cereais, particularmente milho assim como nozes e vegetais, e este efeito extremamente negativo relacionado à saúde de humanos e animais não deve ser negligenciado.

[0004] A degradação microbiana de fumonisinas já foi descrita no documento EP-A n° 1 860 954, de acordo com o qual são utilizados microrganismos para desintoxicar fumonisinas e derivados de fumonisina mediante adição a alimentos de bactérias desintoxicantes ou leveduras selecionadas de cepas precisamente definidas para desintoxicação de fumonisinas.

[0005] Vias metabólicas catabólicas para a degradação biológica de fumonisinas e os genes e enzimas responsáveis por ela já foram descritos também. Assim sendo, o documento EP n° 0 988 383, por exemplo, descreve composições e métodos de desintoxicação de fumonisina, sendo que as enzimas de degradação de fumonisina utilizadas são produzidas a princípio em plantas transgênicas nas quais a desintoxicação de fumonisinas é realizada utilizando-se uma oxidase de amina que necessita de oxigênio molecular para sua atividade enzimática.

[0006] Além disso, o documento WO n° 2004/085624 descreve transaminases, deaminases e aminomutases assim como composições e métodos para a desintoxicação enzimática para desintoxicar, particularmente, toxinas aminadas, por exemplo, fumonisinas. Neste contexto, polipeptídeos que processam atividade deaminase são usados para desintoxicação.

[0007] Através do documento WO n° 00/04158, tornou-se conhecido o uso de amina oxidase de ação degradadora da fumonisina na produção de alimentos ou rações e no processamento de matérias-primas vegetais.

[0008] Métodos até então conhecidos, apresentam em comum o fato de com o objetivo de desintoxicar micotoxinas, eles necessitarem de oxigênio molecular para as vias metabólicas catabólicas descritas, sendo que as amina oxidases, que são particularmente necessárias, não podem trabalhar sob condições oxigênio-independentes. O uso de tais genes e enzimas para a desintoxicação de rações, por exemplo nos tratos digestivos de animais, não é possível por causa do ambiente basicamente livre de oxigênio nos tratos digestivos de animais, sendo que os genes e enzimas conhecidos não apresentam assim nenhuma atividade.

[0009] O objetivo da invenção em prover um método para a produção de aditivo para a degradação enzimática de micotoxinas, pelo qual é possível degradar com segurança e eficácia substâncias toxicologicamente inofensivas ou desintoxicar fumonisinas.

[00010] Para solucionar essas tarefas, o método, de acordo com a invenção, é conduzido de tal forma que é provida pelo menos uma sequência de ácido nucleico de genes correspondente a SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24, pelo menos uma sequência de ácido nucléico é expressa em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, e pelo menos uma enzima assim preparada correspondente a SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25, opcionalmente junto com um co-substrato, são usados em uma matéria-prima vegetal. Ao prover pelo menos uma sequência de ácido nucleico, de genes correspondentes às SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24, é possível clonar e expressar genes específicos de ação degradadora de fumonisina ou micotoxina, sendo que a expressão por exemplo é conduzida em E. coli e Pichia pastoris utilizando-se processos padrões, através dos quais são obtidas enzimas de expressão correspondentes a SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25, em que pelo menos uma enzima é opcionalmente utilizada junto com um co-substrato em uma matéria- prima a ser tratada. Um aditivo, produzido de acordo com tal método, por um lado, permite degradar completamente e com segurança, por exemplo, micotoxinas diretamente em matérias-primas, com as respectivas enzimas produzidas por este método que catalisam a degradação de fumonisinas e produtos intermediários da via de degradação, e, por outro lado, permite degradar micotoxinas, por exemplo diretamente durante a produção de bioetanol no mosto para a produção de álcool, ou para degradar e tornar inofensivas micotoxinas mesmo durante a produção de alimentos diretamente no processo de produção.

[00011] Matérias-primas vegetais, neste contexto, incluem cereais ou produtos cereais, gramíneas, frutas e vegetais e produtos intermediários contendo essas substâncias para a produção de alimentos e rações tais como, por exemplo, silagem, mosto de fruta ou similares.

[00012] Aditivos neste contexto são especialmente aditivos de ração, aditivos de alimento assim como para a produção de bioetanol.

[00013] Um método deste tipo, além disso permite manter o metabolismo de esfingolipídeo prejudicado pela interação de fumonisinas com a enzima ceramida sintase enquanto, ao mesmo tempo, degrada biologicamente as fumonisinas formando substâncias atóxicas. Finalmente, aplicações de desintoxicação tecnológicas podem ser obtidas uma vez que este método também é aplicável em larga escala industrial, permitindo assim a produção segura e confiável de produtos livres de micotoxina pelo método de acordo com a invenção.

[00014] As sequências de ácido nucleico usadas no método de acordo com a invenção, e as enzimas expressa nas células hospedeiras procarióticas e eucarióticas por ditas sequências de ácido nucléico e que apresentam ação catalítica em ambiente oxigênio- independente, aparecem listadas abaixo. Ácidos nucléicos Sequências: >SEQ ID NO: 1 (fum (catabolismo de fumonisina) cluster gênico, 15,420 bp) TGTCGGCGATCRGTAAACTTCTACCGTGGTCCTCGTTC GCCCACAKCATACATCACAGACRTCGGGATTTCCAACTGAAC GGGTCCCGGCCTGCCGGCCCACATTTCCCGGAACGCC ATATGGGTGATTTCGACAATCCGGTTCCAGGCGAAGATGGGTG CGCCCCATTTAACCGCGGGTCGAAAGAGGTCGATCTG GTCTTGTCCCTGAAAGGTTTTTGGCGTGCAGGGATAAACGACA CCAAGTTGATGCTGGGACGTTATTGCGACGAAGGGAA CCCCTTCGTGGCGTGCCGTCACGACTCCAGGCAGAAGGTTTGC CGTACCGGGACCCGGATTCGTGACAATCGCGGCGACC TGTCCGGTGGTCTTGTAAATGCCCTCGGCCATATAGGCTGCGG CGGCCTCGTGCCGCACCGGGACGAACAATATCCCATT GTCTTCGAGCGCAGCCAGGAGCGGATCCACCTCCGGCGACATG AGGCCGAAGACATACCGGACGCCTTCGACGGCCAAAC ATCGTGCCAATAATTCTCCGCCCGTGAGGCGCATGACGATCTC CAGTACGAAAGGTGAGTGCCCAGGTTCCGGCACATTC GCTGTGGTTAGTTGATGCGCTGATCGGCCAACCGACTGAGTGG AGTTGGATGGCCGCACCTTACCCTGTCGCGCATAACTC TCAGATCCGGAAACGGACCCCGACATTAAAATAGCGGCCGAC CGGATCATAGGCAGAGCTGGTCGGGCTGGAAAAACTG CTGGGGTCGTTCGTCGCTATTGGCGGATCTCGGTCGAACAAAT TATTGACCGATAGAAACAGCTGCTGCTTCTGGCCAAAA GCCGCGATGTCGAAGGTCAATGTCGCGTCGGTGTACCAAACC GCCGGAGCGTGGTTCAAATTCGTATCGACGCCCTCCA CATTGTCGGCATTGAACACCGATGCTGCGATGAAGCGCTGCTG CACGAGAAGCGCCCAATCGTCGGTCGAATATCGCGCC TGGAAGTTGGCCGACCATTTTGGCGTGTCCGGTTGTCCGAGCG AACGGATGGGCGCCGAGCCGGTCGCGATGCGATAGG CAGAGGTATGGTGCGTTGCCAGCGCACGAAGACTGAACGTGCCG CCGCCGACGGGGCGTGAGTAATAGGCCTCGAAGTCAA TTCCCGCCGCTTTCTGGACAGCCAGGTTGAGATTGGGACCCGT CACTGTGATGGTGCCGTCCGGATTCTCCGTTATGAGGT CGCAGAAGAAGGTGTTTCCTGCATCGCACGCGTCGATTTCCT GCTGGGGAAGGAGGAAATCGATCGCGCCCTTCACCTT CACCACATAGCGATCGACCGAAAACTGAAACCCCGGCACGAAG GCGGGGCGTAGCACCGCGCCGAATGTAAGGACGTCC GCCTTTTCAGGGCGCAAATCCGCGTTGCCGGCGGTAAAGAACCG CGTCTGCACAGCCTGTCCGCCATAAATTGAATTGAGCG TCGCCTGACGGCCGGGGTCGAATAGCTCGACAAGGCTTGGCC CGCGGATATCTCGCGAACGGGTCGCGCGGAACCTGAG GCCGTCGATCGGCTCATATTCTCCGCCCAGCTTCCAGGTTGTT ACTCCACCGGACTGGCTGTAATCGGCATATCGGACGG CGCCGTTTAAGTTCAGCGAACGTCCCAGCGCGCTGTCCTTCAG AATCGGGACGCCGATTTCGACAAAACCTTCCTTGATGT CATAGCTTCCCGAGAAGGGAAGTGGGTTGTAGAGATTGAAGC CTCCAGGCCGACCTGCCTGCGCCGCCGGAGCCCCCCT GATTCCCGTGATCGAGGTCGTCGCCTGCGATATCGCGTCGGTT TCCTGCCGGGCCTTCTCCTTGCGATATTCGATACCAGC GGCGACCGAGACCGGGCCCGCGCCGAACGACAGGCTATCGCC GAGGTCGCCGGAAATCGTGAGTCCCGCCACATATTGC TCAAGCCTCAGCTGAGCGACGCCATCAGCGGTGACATAGTCGA TGGCCGACGCGCTCGGCGAGCCTGTGCCGAAGAGATT GAGCGGCACGCAATCTTGGTCGAGGCCGGCCAGTGTTGAACGG CAGACGATATTGCCCGCGGGATCGCGGACCGCATCGA CGGCGGCGTAGAGATTGCGGTTGATGGTGAGATTGTTTTCACG AAGCTCGAGGTCCGTAAGGCCAAAGGAGGCCGAGCCA TCGAGTTTCCAGCCATTGCCAATGTCTGCCCGGAAGCCGGCAG CGCCGCGGTAGACCTTTGCGAAATTCTCGATTTCGACC AAGGGAAAGTCGCTTGAGAAGCGACCGACAACGATCGAAGCC TGGGCATTTCTGTCCATGAGCGTCGCGAGTGGAGCCG GAAGGAAGGCGTTATCACGGAAGATCCGGAAATTATTCGAGCC ACCGACATGCGATATTACGAATGCACCCAGGTTGGTGT GGGAATAAGCATAGGTGCCCTCCGCATACACCTGCACAGTGT CGGACACATCATATGCGGCGCGTAGGAACGCGTTGTA GCGAAGCTGATCCGGGGCGAAGCCGATATTCACGCGCGGTCCA TCGCCGCCGCTCTGGAACGACGAGCTCGTAAAATTCC CGTAGTCGAAGGTCCCTAGGACTCCTCCGGGCAAAAACGCGAT GCCTTTCAGAGGGCCGGACGTGACAAGTCCGCCGTAG GATCCGCGAGAACTGCGAATATCGGGCACGACCGTGACGCCTG TCGTAGCGCCGGGCACGGGATATTGGCCGGCGGCGAT GTCGAACCAGCGGCGACCCGTTGCTTCATCGGCCCGGATTCCG TCCTGTCGAAAATATTCGAAGCTGCCGAGCAAGTGCAA CCGGTCGTCGGCAAACGAAGTGCCGAAGGCGATCGAACCGCC GTAGGACGGGAGGTCGCCGCGGGTTGAAACACCCGAC TGGAGCTCGGCCCTGATGCCTTCCAGATCTTCGTCGAGCACGA AGTTGATGACGCCCGAAACGGCATCGGAACCGTAGGC GGCCGAGGCGCCGCCCGTCACGACATCGACGCGCTTGACCAAC GCCTGCGGCAGCACGTTGATATCGACCGAGCCTGTGA AATTGGTCGCGACGAAACGGTTGCCGTTCAGCAGGACGAGGTT CCGGTTTGACCCGAGGCCGCGCATGTTGAGCAGGTTC TGACCGCTGTTCCCCGTTCCGGGTGTCGTGCCAGGGTTGGAGG TCTTCAAGCTGTCGTTGAACACGGGCAGCTGGTTGAGT GCGTCGGCAAGGTTGGTCGGAGATGCCTCCTTCAACTGCTCG CTGGATACGGCTGTAACCGGCGTCGGCGAATTGAAGC CGTTCTGGAGGCGGCTGCCGGTCACGACGATTTCGCTCGTTCC CCGGTCCGTGTCCGCTTCGTCCGGCTGACCTATCGAT GCGGGATCGCTATCCTGAGCACTGGCAGAGACAGGAAATGCGA GGGTGCCGAGCGCTACTGCGCCGAGCAAACTATTTGC CTTGCCGGGCTTTTCGATTCTGAACTTCCGATACATCTGCAGT CCCTCCCGAATTGATAGGGACTCCGTTTGAGTCCCCTT GTTTCTTGACGCCGCCGTCGCTCACCACGGTCCGGTCGGAGG CTAAGCGTCGGGCCTAAGGACCCGCAATTTGAACATCA AATGCAATGATCGGAGGCTTCATTGCACTTCGCGCATAGACC GGCGCGGTAGCTGAAAGTGCCAATAATCAGGGATTTTG CTGAACAGTTGCGGCATGACGTCCGGCATCGGCCACGCGGTT GGCGGCATCGACGTGGCTTTCGCGTCGCCGCCCCTCA AGCACCGGCGAGTTGCATTAAAATGGGATGAGGCTGGAGAGAC GCAAAATCTCTGAGGACCGCGCTGAACGCGCGATCCG TCGCCTCGAGGGTCTCCGTTACATCGTCAACTGTATGGGCCGC AGAGAGAAACATATTGTGATAGGGATGAACATAGACGC CGCCCTTCAGGCACGCCGCGGCCCACGCATAGCCGATCCGAA AATCGGGATCGTCCGCAAAGAATATTTGCGGCATCTGC GCCGGGCCCGTCTGCTTCAACTCAAGACCATGGCGCTGAGAC TGTGCCTCCAGGCCTGCCCGCAGGGCGGCGCCGCTG GCGATCAGCGTTTCGAGATAAGGCGTCTCTCGAATGATCCTGAG GGTTTCGATCGCGGCCGCCATCGGTACCGCAGAGAAC CAGAAGGAGCCGGTCACAAATATATCCCGCGCCGCATCGCGCG CCTTGTTCGAGCCCAGCAGGGCGGAGATCGGATAGCC ATTCGCAAAGCATTTTCCCCAGCAACTGAGATCGGGTTCGATA CCCAAATGCGTCCAGCTGCAATCGCGCGCCACCCGGA AACCTGCGCGCACATCGTCAACGACCAGAAGCGCACCGGTCTC GTCACAACATTTTCGAGCGGTGCGCGCGAACTCAAGCT GGGCGAGGGCCTGGTCCTCAAATACTTCGTGTCGGAAAGGTG TGGCAAAGACAGCCGCAATATCGCCATCGTGCGCCTT GAACGCGTCCGATAAGCTTTGGGCGTCGTTATAGGTATAATAT GCGACATGCACGCGATCGGAAGCGAGAATCCCGGCAG TATGCGGAGTGTTCCACGGGGAAGCGCCATGATAGGCGCCTTT GGCGCATAATATGGTTTTGCGCCCCGTATGGGCACGC GCGAGAACCATCGCCGTTGAGGTGGCATCGCTGCCATTTTTGC AGAACATCGCCCAATCCGCATGACGGACCATGCCCAC AAAGGCTTCGGCGAGGTTGACCATGATCTCCGAAGGACCGGTC ATGGTGTCGCCGAGAAGTCGCTGCGCATCAGCCGCGG CTTCGATTTCGGATTGCCGGTAACCGAGCAAATTTGGCCCATA CGCGCACATATAGTCGATATAGGGCTGCTCGTCGGCG TCCCAAATTCGTGCCCCCAGCGCGCGCCTGAAGAACTGGGGGA ATTCTGGCGGCAGCAACCGTGTCGACTCGTGGCCGTA CATCCCGCCCGGAATGACCCGTTCGGCGCGTTCTCTGAGATCT TTCTGCCTTGTTCCGTTCGCCATAATGCACCTCTCGCG ATAAATAATGGGTAAAAATCCACGAAATTCAACGATTCGTGA TCTGAAAGAGATATATCTTGTAATATACTGTATAATTATA CACAATGCGCAATCGGACGACGGGATAGCGGGGCAGGGAG GACGGGGAAATCTATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCG CCGCCCCACGAGACGCTCACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCG TTGGCACGGCCGCCTTGATGGTGCTTGGAATACAGCC CATCCTTCTCGGCGCCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCC GAGGGGTTGGGATCGGCGGCAACGGTGGAAATACTGG CGATCGCGGCGGGAACATGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGAC GGGATATCTGCGGGCGAAATGCGCGGCACTCTGCTTA ATGCTCGCCGCAATCAACTTCGGATTGACGTTGCCGGGTTTCG ATTTGCCCATCGTGGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGC CCTGGAAGGTCTTTCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACT CATAATCGGCGGCCGGACCGGCTGAGCGGAATATTTC TGGGCGCGCAGACGATACCGCAGGTAATATCTGCTTATTTGCT CCCGACGGAGATTATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGC GGCTTCACGATCCTGGGCATTCTCGCGGCGATCGCCGCGATCG CGGCTCTGTGCCTCGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCC GACGACCGTTAACGACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATC GTCATTTCGATGGCGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGT CGGTGCCGCATGGAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCA CGGATTTTCGGGAGAAACGATCGGTATCGCCATTTCCG GGAGTTTGCTTTGCCAGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTT GGATCGGTGGGCGGGTCGGATATCGCTTCGCCTTAAT CGCTGGGAGCCTGCTTCAGGCGGGCAACGTGATCGCATTGGCG GTGGCCGATCAGCCAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTG TGCTTTCGGCCTGTTCTGGTTGGCGATGCAGCCCTTCCAAAT CCGCTTCGCGATCGCGATAGATAACAGCCGGCAGCTT GCTGTACTGCTGACGCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGG GGCCCTTGTTGCTCTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGA CTTGCGCTGGATCTTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCC AGCGCGCTTCTGTATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACC GCGCGGAAAGGTGATCGCTGAAACGGTGGACGTATGAAAAAG ACGGATCGGGGTTCGCGATGACATCGCAGGTCAAGCT TCGTAGCGCGGCAAAGCGGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGA GGTCTTGCTCGTTACGAGTCCTTGCTTGATGCGACCGA CAGGCTGTTGGTCGATCTAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTA TCAGATTGCAGAGGAAGCGGGTGCCTCACCGTCGTCC GTCTATCATTTCTTTCCGACCAAGGAAGTGGCTCATCTCGCTC TGATGCGCCGCTATCTGGAGGGGCTCCGGAATCTCGA CGCGATGGAAGTCGACATCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGAC CTGATGAAGTTGGATCAGATCAGGGCGCGAGACTATTA TAATAGCCACCCGCCCGCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATA TGGCGGGGTCGAGGCCAGAAAGCTTGACGAGCGATAC TCCGAGGAAATCGTGAGCTCCATGTATGGCAGATACAACGGCA TTTTCCATATGCCGCAAATGGAGAATGAGGCTCTCATG TTCACGATCTGCTTCGCAATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTC TCCTTTCGCCGGTTCGGTGAAATTACGTCGGATTTTCTT CGGGAGGGGCAAGCGGCTTGCATTGCCTATTGCCGACACTA TCTGCCCGAGCGAACGCCATCAGCGTGAATCCGTTCAA CGATATGCAGGAATGTCCGTTGCGTTGAGTTCGGTTCTGAGT TCGGTCGGTTAGGAGGCCCCGCGATAAACCAACGCTC TTCTGTCGAAGGGATGTCGCCTGGTTCGACCAGGCCCTGCGAA GTCAGCCGCAATCAACGAGGCAGATGTCAACGTGGCC AGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCGATCATTTGTTG CGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGCCGCGCG GCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGCCGGAGAATCCAG CGCCTCGAGAGTCTCGTGGGCGGTCCGTTGTTCGAGC GGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCTCGGCAAAGAGTT GCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTTGTCGAT ACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGGAGTTCCGCTGGA CAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGCCGCCTTC CATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACATGGATCAAAAT CCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGCCGGCGG TCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCGAGGCGGAGTTCGG CATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGCCTGCGGT TCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCCTGGCATGCCACC GAAGCCATCCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCTTGAATG GACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCGTTCACCGTGCG AGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAACTCGCGC GCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGAGGTCGCGCATCT GACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAATTGGGT GTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCGCTCGGGTCGGT CGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCCGGTCG TCCAACGCACGATCGGCATCGTTCAGCGCCGCACCGGCTCGATG CACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGCTCCGCG CGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACATCGCGTCTCGCGA AGATGGGGCATCGTGACACGCGTTCTATGCGCCTGCA GCATCGATGCTCACGATCATTGCATTTGCTGAGAGACGAACGC GAAGATACCGCTGGGTCACAGGATATCAGTCCATCGAG GCGGGAGAGAAATGTGTGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGC CGGGCGTCCCCCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCG CGGATCAGCGTTTCCCGGGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTT CATGCTTGGCGCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAA ACTGACGATCCGAAGCTCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCG TCGAGGGCGTCGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGG AATACCCTTCGCGGCTCCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGG CCGCCGGCTCCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGG GACGGCCGCCGCTTTGCGCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCT TAGAGAGGGGAGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGA CTGCCTCTATCTGAATATCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGG GGGGGCTCCCCGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGG GTTTAGCGGCGGTTCTGGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCT GCGCTCGCGCAGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCA ACTATCGCGCCGGGATTCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCT TTCAAAGGAAAGTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATG GTCTTCTCGACATGCTCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACA ACATAAGGGAGTTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCAC GGTCTTTGGCGAGTCCGCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTC CTGACCTCGCCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGG CGATACTGCAAAGTCCGGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCT TTCTGAAAGCGAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCC GATATTTCTGCTCTACGGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGA AGATCGCGCAATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTC ACCAAGCCGCGGCCGATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTT TTGCGCACCCTTGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGG CCTTCCGCAAGATACCCGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGA AGGGCGCGCTTTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACG GTCCTTGAATATCGAGCCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACG AGGCGGACGCATGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTC CGACGCCGACGTCCCCGCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGAT AGTCAGTTCAACAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAG CCTTCGCGAAATGGCGAACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTAC GGGCATTCCAGGAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCAT GGAGACGAAATTCCCTATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGT CCGTATCTATGTTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGG GGCGTCGGACATCAAACTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGG GTGAGCTTCGCGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCA CGAAATCGCACTGGCCGCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCAT GACTTTTGGTTCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTG GAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAATAGCGCC CGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTTGC GGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGTAAGTTGCG CTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTGCA TTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGGCCTCGGTTC TTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGCGG CAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCACGAACGT CCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGACG AATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGGCGCACCGA CGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCACC GACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCGTTTCCAGC CCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACCAA CGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAACGCATAT TACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCTCTA TGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAGGCGTCGT GCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTGTC GAAGTGGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGGAGGATTCC AGGCAAATCTTGACTGGCTCTCAAGCGCATGGGGGCC TGCTGCGGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCATATGCGACT GGCACGGTGCTCAAGAACCTGTTGGAGCAAGGCGTCG CCTCGGTGGGAGATCCAACCCAATGCCATGCTGTCGCGATCGA TGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCACA CGACTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTCAACAAGGACG CCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGGCC GAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGGCACAGCAGCCT GATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAGGCCGA AGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGCAAGCGGA CACGATCGCGGGTCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGAAT CCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCAACGCCGCAT GCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCCAAGATCTCGACGA CCTCCACACCGAGGGAATCGAACCAAAGAAATCCAACTGGGCC CGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCCTCT CCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCAAGGTAGA CAGCCGTGCGCGGGTCATCATGGAGACAGGTGAGCCG ACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCGGGCAGCA TTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATGGCG ATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGGAGGCCGCA CGTCATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGA CTTGCCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCCAGGCGCGTTATGG AGGTGTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTG CGCGGTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGC GGCGATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTG CCAAGGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGA GTTCGGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGC GGCTCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCG CCGCTCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCT TGTCGGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCC ATCTTCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATC GGTGCCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGC GATGATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCG CGCTGGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGA TCGGTCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCG GTTCTTCGGGCGCTACGCGATGCGGCGACTCTGCGATATCTC GGCGGCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGAC GAGACATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGC CTATGGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGG GCACGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATG CGCTTTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGG GGGGATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTC AAGCTGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCAC TGCTTGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCAT AGCGGCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGC ACCGAAGTCATGGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATCTCGGCGTCG TCTTGGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTG TCCACGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCAT GCTGACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCC CTCCCACGAAAAAGGGTTAAACAATGGAACATATGAAGTCCGT TCGCGATCGCAGTAGCGTCATGCAGATCGTGAGAGTG GCGAGTGGCAACTGTCTCGAGCAATATGATTTCTTCGTTTACG GCTTCTATGCGGCATATATTGCGAGAAGCTTTTTTCCGA CCGGCGATAACGCGACATCGCTCATGCTTTCATTGGCCACT TTTGGCGCTGGTTTCCTCATGAGGCCCTTGGGGGCGA TTTTTCTCGGGTCCTACATCGATCGCGTCGGGCGTCGGAAAGG CCTGATCGTGACACTCGCGATCATGGCCGTCGGAACC CTCACCATTGCGATGACTCCAAGCTATGAGGCAATTGGATTAC TCGCACCGGTTATCGTGCTCGTCGGGCGACTTTTGCAG GGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGTCGGGTGGCGTCTCAGTGTAC TTGGCGGAAATTGCGTCGCCCAAATCGAGAGGCTTCTT CACCTCGTGGCAGTCTGCCAGCCAGCAGGTGGCCGTCATGAT CGCCGCCGCGATCGGTCTTGCGCTGCAATCAACGCTT TCACCGGAGCAAATGAACGACTGGGGATGGCGGGTGCCCTTGT TGATCGGATGCTTGATTATCCCCGTGATACTCTGGCTG CGCCGGTCTCTCCCGGAAACGAAAGCCTATCTCCACATGGAG CACAAGGCGCATTCGATCGGCGAATCCCTCCGCGAATT GCAACAGAGCTGGGGGCTGATCTTGACGGGCATGGCGATGTC GATCCTCACGACGACCACCTTTTACATGATTACCGCCT ATACGCCGACATTTGGCGAGAAAGCACTCGGACTGAGCCCGC AAGATGTCCTGCTGGTTACCATCATGGTCGGCGTGTCG AACTTCCTGTGGCTTCCGATCGGGGGTGCTCTCTCGGATCGT ATCGGTAGAACCCCGATCCTACTGGTCGTGCCGGTCA CCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCCCTGATGAGCTGGCTCGTCGC GGCACCGACATTCGGAGCGCTTGCAGCTGTTCTGCTG ACTTTCTCCGCATGCTTTGGACTCTATAATGGGGCGCTCATCG CGAGACTCACCGAGATTATGCCTCCCGCCATTAGAACC CTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCAGTCTCGCGACCTCGCTGTTC GGCGGCTTCACCCCATTGGTAAGTACGGCGCTAATCCA CGCGACGGGCAGCAATTCCGCGCCTGCAATCTGGCTCTGTTT TGCGGCTTTCATCAGCTTCGTCGGTGTGGCCGCATCGA CCCGGCTGAGCCGGCCAATCGCCGAAGGCGCCAGATAGGACA ATCAGAGAATGCCCGTGCGGCAATGAAGCGAGATTCG GGCGGTAGGTGCGCTGGCGGCACTTCGCGAAGAGCCGTTGCGG ACGGCTGAAACGATGATGGTATGAATGGGCTAAGACAT GAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCTGGGGGC CTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCTC GTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGACCTTCATT TTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCATCG CGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGTCGAGAC ATCGTTCTGGGGCATGAATTCTGTGGCGAGATTATGGA GTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCGGACAGCT TGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGGA GCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGCGGGCTCG GCGAATATATGGTCCTCACGGAAGCGCTCTTGCTGCCT GTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTTGACGGAG CCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCGC AGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCGGGTGCGGACC GGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAAG CAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCGATCGGC GTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTGT CGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGAGAAGATC GCACGCCCGGTCGGACAAGGTGGGGCCCTGTCCAGCT CATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAATGCGTAGGGGT GCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTCC GACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATGCAGCCGG ACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGCTC ACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAATTCGCC GCGGTGCTTCACATGATAGGTGAGGGCGCACTCGACG TATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGATGTCCC GTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCAA GCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGAGCCTGAGGATGCC AAGGGTGCGACGTTGGGCATCGTCAAAGAAGGCGACG TTGACCCGGTATGTGAACATCCCCATATTCTTCCGCAGCTGAA GCAGTTGGTAAACATGCCAAAATATGAACTGTAGTATTG CGTCGGGGTTCTCATTGTGGGGTTTGCCATTGTCATCGCTC GCACCCGGCGACAAAGATTAGATGTACTTCCGATAATC CGTGCTCTCGACCTGGCCTTCCTTCATATATTTCAGGACCTC TCCGACCATGCGTGCGGCGCGGATCGGGATCGGCAG GCGTTGGTTCATCTGGGTCGAGTTCCAGTTGATCTTCGTAAGAG AGAACACCTCCTCGGCTAACTGCGCCGCGGTACTATC GCAGGATCGTCTCGAGCGTYCGC >SEQ ID NO: 2 (fumA) ATGCGGAACGTCAGCGACAAGGCGCCGCCCCACGAGA CGCTCACCGTAGTCGTCGCGGCAATGATCGTTGGCACGGCCGC CTTGATGGTGCTTGGAATACAGCCCATCCTTCTCGGCG CCCTTGTAGAGGAGGGGCGTATTCCCGCCGAGGGGTTGGGAT CGGCGGCAACGGTGGAAATACTGGCGATCGCGGCGG GAACATGCATCGGACCCGTTCTTATGAAGACGGGATATCTGCGG GCGAAATGCGCGGCACTCTGCTTAATGCTCGCCGCAAT CAACTTCGGATTGACGTTGCCGGGTTTCGATTTGCCCATCGT GGCTTGCCGAGCGGCAGCGGGAGCCCTGGAAGGTCTT TCGCTCAGCGCGGCGATCCTGATCATGACTCATAATCGGCGGC CGGACCGGCTGAGCGGAATATTTCTGGGCGCGCAGAC GATACCGCAGGTAATATCTGCTTATTTGCTCCCGACGGAGATT ATTCCGCGCTGGGGGAGCGCAGGCGGCTTCACGATCC TGGGCATTCTCGCGGCGATCGCCGCGATCGCGGCTCTGTGCCT CGTCGATCGCGTTGAGCTCGATCCGACGACCGTTAAC GACGACTTGCAGTGGTCACCCGCGGCGATCGTCATTTCGATGG CGGCATTCGTTCAATTCTCGGGGGTCGGTGCCGCATG GAGCTATCTGGAGCGACTGGCTGCGCAGCACGGATTTTCGGGA GAAACGATCGGTATCGCCATTTCCGGGAGTTTGCTTTG CCAGGTAGGCGGGGCTTGGCTGGCCGCTTGGATCGGTGGGCG GGTCGGATATCGCTTCGCCTTAATCGCTGGGAGCCTG CTTCAGGCGGGCAACGTGATCGCATTGGCGGTGGCCGATCAGC CAAGCTGGTTTATTTCCGCTTCCTGTGCTTTCGGCCTG TTCTGGTTGGCGATGCAGCCCTTCCAAATCCGCTTCGCGATC GCGATAGATAACAGCCGGCAGCTTGCTGTACTGCTGAC GCCGATCGCCCTCGTCGGGTTGAGCGCGGGGCCCTTGTTGCT CTCTCGCTTTGCCGGGGCGACCGACTTGCGCTGGATC TTTGTGGGGAGTTCGACCTTGTTGCTGGCCAGCGCGCTTCTGT ATCTTTGCGCTTCTCTGTTTCAACCGCGCGGAAAGGTG ATCGCTGAAACGGTGGACGTA >SEQ ID NO: 4 (fumB) ATGACATCGCAGGTCAAGCTTCGTAGCGCGGCAAAGC GGCCGCGCAGTCCTAAAAGCGAGCGAGGTCTTGCTCGTTACGA GTCCTTGCTTGATGCGACCGACAGGCTGTTGGTCGATC TAGACCCCGATCAGGTCGGTCTCTATCAGATTGCAGAGGAAG CGGGTGCCTCACCGTCGTCCGTCTATCATTTCTTTCCG ACCAAGGAAGTGGCTCATCTCGCTCTGATGCGCCGCTATCTG GAGGGGCTCCGGAATCTCGACGCGATGGAAGTCGACA TCGGCCAGCTCGAAAGCTGGCAGGACCTGATGAAGTTGGATCA GATCAGGGCGCGAGACTATTATAATAGCCACCCGCCC GCCCTCAAGCTTCTGTTCGGCGGATATGGCGGGGTCGAGGCCA GAAAGCTTGACGAGCGATACTCCGAGGAAATCGTGAG CTCCATGTATGGCAGATACAACGGCATTTTCCATATGCCGCAA ATGGAGAATGAGGCTCTCATGTTCACGATCTGCTTCGC AATTCTCGACGCGGTATGGGCCGTCTCCTTTCGCCGGTTCGG TGAAATTACGTCGGATTTTCTTCGGGAGGGGCAAGCGG CTTGCATTGCCTATTGCCGACACTATCTGCCCGAGCGAACGC CATCAGCGTGA >SEQ ID NO: 6 (fumC) GTGGCCAGCAAGTTCAACTGTGAGTTACTCGATCTGCG ATCATTTGTTGCGGTGTATGAAACGCGAAGTTTTAGCCACGC CGCGCGGCTTCTGAATCAATCGCAGCCCGCGCTCAGC CGGAGAATCCAGCGCCTCGAGAGTCTCGTGGGCGGTCCGTTGT TCGAGCGGACCAGTCGGTCGCTTGCCGAAACGGCGCT CGGCAAAGAGTTGCTCCCGGTCGCCCACCGAGCGTTGGAACTT GTCGATACGTCGCTGTTTGCGTCGCCCAATGTCCGGG AGTTCCGCTGGACAGACATCACGATTGCCTGTGTACAGACCGC CGCCTTCCATGTTCTCCCGCGAGCTGCGCGCTTGTACA TGGATCAAAATCCGAGGGTCCGACTCCGCATCCTTGACGTGC CGGCGGTCGAGGCTGCGGACCTGGTTGCGAGCGGCG AGGCGGAGTTCGGCATCAGCATTGAGAGCCTGTTGCCATCAAGC CTGCGGTTCGATGCGCTCCACGAGGACCCGTTCGGCC TGGCATGCCACCGAAGCCATCCGCTGGCGTCGCTCGAGATCCT TGAATGGACGCAATTGAAAGGTGAAAGCCTGATCGCCG TTCACCGTGCGAGCCGGAACCGCACGTTGCTCGATGCCGAAC TCGCGCGCAACAATATCGCGCTGGAATGGCGGTATGA GGTCGCGCATCTGACGACGGCGCTGGGATTGATCGATGCGCAA TTGGGTGTCGCTGTTATGCCCCGCATGGTTATGCCCCG CTCGGGTCGGTCGGAGGTCGTCTGGCGCCCCGTCGTCGCGCC GGTCGTCCAACGCACGATCGGCATCGTTCAGCGCCGC ACCGGCTCGATGCACCCTGCCGCACAGCAATTGCTTGCGCGGC TCCGCGCGGCCTGGTCGTCCGCCAATCTGGGCGACAT CGCGTCTCGCGAAGATGGGGCATCGTGA >SEQ ID NO: 8 (fumD) GTGAAAGAGCACCAATGCCGTGGCGGCCGGGCGTCCC CCGCTGCGCCCGCCACGTGGCTTGCGCGGATCAGCGTTTCCCG GGGGGCCTCCGCCATCGCCTGGACCTTCATGCTTGGC GCAACTGCCATTCCCGTGGCTGCGCAAACTGACGATCCGAAGC TCGTTCGTCATACCCAGTCGGGCGCCGTCGAGGGCGT CGAGGGCGACGTCGAGACTTTTTTGGGAATACCCTTCGCGGCT CCGCCGGTCGGCGACCTGCGATGGCGGCCGCCGGCT CCGCCGAGGGCGTGGGCGGGCACCAGGGACGGCCGCCGCTTTG C GCCCGATTGCATCGGGAACGAGCGGCTTAGAGAGGGG AGCCGGGCTGCCGGGACGAGCGAAGACTGCCTCTATCTGAATA TCTGGTCTCCCAAACAGGTCGGTAAGGGGGGGCTCCC CGTCATGATCTGGGTTTACGGCGGTGGGTTTAGCGGCGGTTCT GGCGCGGTGCCATATTATGACGGCTCTGCGCTCGCGC AGAAGGGCGTGGTGGTCGTCACGTTCAACTATCGCGCCGGGAT TCTGGGCTTTCTTGCCCATCCGGCGCTTTCAAAGGAAA GTCCGAATGGCGTGTCGGGCAACTATGGTCTTCTCGACATGC TCGCGGCGTTCAAATGGGTTCAGAACAACATAAGGGAG TTCGGCGGAGACCCGAACCGTGTCACGGTCTTTGGCGAGTCC GCCGGCGCGAGCGCGCTCGGACTGCTCCTGACCTCG CCGCTCAGTGAGAGCGCCTTCAATCAGGCGATACTGCAAAGTCC GGGTCTGGCCAGGCCGCTCGCCACGCTTTCTGAAAGC GAAGCGAATGGGCTGGAGCTGGGAGCCGATATTTCTGCTCTAC GGCGTGCCGATGCGGGCGAATTGACGAAGATCGCGCA ATCGCGAATACCCATGTCGCGCCAGTTCACCAAGCCGCGGCCG ATGGGTCCGATTCTGGACGGCTATGTTTTGCGCACCCT TGACGTCGATGCCTTCGCCAAGGGGGCCTTCCGCAAGATACC CGTTCTGGTCGGCGGAAACGCCGACGAAGGGCGCGCT TTTACGGATCGCCTGCCGGTCAAAACGGTCCTTGAATATCGAG CCTATCTCACAGAACAATTTGGTGACGAGGCGGACGCA TGGGAGCGTTGTTATCCCGCGAACTCCGACGCCGACGTCCCC GCCGCCGTTGCCCGTCTTTTTGGGGATAGTCAGTTCAA CAACGGGATCGAGCTGCTCTCGGCAGCCTTCGCGAAATGGCG AACGCCGCTTTGGAGATATCGCTTTACGGGCATTCCAG GAGCCGGCCGTCGCCCCGCCACGCATGGAGACGAAATTCCCT ATGTCTTCGCAAATCTGGGGCCGTCGTCCGTATCTATG TTTGGGTCGCTCGAAGGCGGCGCCGGGGCGTCGGACATCAAA CTTGCGACCGAAATGTCCGCGGCCTGGGTGAGCTTCG CGGTGCACGGGGTCCCCGATCAGGGCACGAAATCGCACTGGCC GCGCTTCGAGCGGCGAGGGGAGATCATGACTTTTGGT TCGCAGGTTGGCTCTGGGGAAGGTCTTGGAGTTTCGCCGAGCA AAGCCTGCCAACCCTCAAAATAG >SEQ ID NO: 10 (fumE) TTGGAGTTTCGCCGAGCAAAGCCTGCCAACCCTCAAAA TAGCGCCCGGCCTGTGCGTGCTTCAGCACGCCGTCCCGCTTT GCGGGCGACGGGCTGTGCCCTCTGCCTAGAAGGAAGT AAGTTGCGCTACGACGTCGCGATAATTGGAGGTGGCAACGCTG CATTGACGGCAGCCGTGACGGCGCGTGAAGCGGGGG CCTCGGTTCTTGTGATCGAGCATGCGCCGCGCGCCATGCGCGGC GGCAACAGTCGTCACACACGCAATATGCGTACGATGCA CGAACGTCCCCTGTCGCCGTTGACCGGTGAATATTCGGCGGA CGAATATTGGAATGATCTTGTCCGCGTCACGGGGGGG CGCACCGACGAAGAACTCGCGCGGCTCGTTATCCGCAACACCA CCGACGCTATTCCCTTCATGACGCGCTGCGGTGTGCG TTTCCAGCCCTCGCTGTCGGGCACGCTGAGTTTATCGCGAACC AACGCATTCTTCCTTGGCGGCGGGAAGGCGCTTGTAAA CGCATATTACGCCACGGCCGAACGGCTAGGCGTCGATATTCT CTATGATTCTGAGGTGACCGAGATCAACCTTCAGCAAG GCGTCGTGCAGCGTCTGCAATTGCGCAGCCGGGGATTCCCTG TCGAAGTGGAAGCCAAGGCTGCCATCGCCTCGTCCGG AGGATTCCAGGCAAATCTTGACTGGCTCTCAAGCGCATGGGGG CCTGCTGCGGCGAACTTCATCGTACGGGGCACGCCAT ATGCGACTGGCACGGTGCTCAAGAACCTGTTGGAGCAAGGCGT CGCCTCGGTGGGAGATCCAACCCAATGCCATGCTGTC GCGATCGATGGGCGAGCGCCCAAATACGACGGCGGCATCGTCA CACGACTGGACTGCGTTCCCTTCTCGATCGTCGTCAAC AAGGACGCCTTGCGCTTCTACGATGAAGGCGAAGATGTGTGG CCGAAGCGTTACGCCATATGGGGTCGCTTGGTGGCAC AGCAGCCTGATCAGATCGCTTTCAGCATAATCGATCGGCAGGC CGAAGACCTCTTCATGCCGTCAGTGTTCCCCCCCGTGC AAGCGGACACGATCGCGGGTCTGGCCGAGAAACTCGGTCTGA ATCCCGTAACCCTGGAACGCACGGTGGCCGAATTCAA CGCCGCATGCGTGCCCGGCGAATTCGGCGGCCAAGATCTCGAC GACCTCCACACCGAGGGAATCGAACCAAAGAAATCCAA CTGGGCCCGACCGATTATTGTGCCCCCGTTCAGCGCCTATCC TCTCCGGCCCGGGATCACCTTCACCTATCTCGGCGTCA AGGTAGACAGCCGTGCGCGGGTCATCATGGAGACAGGTGAGC CGACAAAAAACCTGTTTGCTTCGGGGGAAATAATGGCG GGCAGCATTCTCGGCCAAGGTTATCTCGCTGGATTTGGAATG GCGATTGGTACCGTATTCGGCCGCATCGCGGGTTGGG AGGCCGCACGTCATGCAGGATTTTGA >SEQ ID NO: 12 (fumF) ATGCAGGATTTTGATCTCGTAAAAATGCTGTCTGACTTG CCGTCGGCGCCGGAGCTGGAAGCCAGGCGCGTTATGGAGGT GTGCAACGCGTGCCGCTATTGCGAAGGGTTCTGCGCG GTATTTCCTGCAATGACCTTGCAGCGTCATTTCGCCAGCGGCG ATCTCAGCCACCTCGCCAATCTCTGCCACTCGTGCCAA GGTTGCTATTACGCCTGCCAATACGCCCCTCCGCATGAGTTC GGAATAAACGTTCCAAAGGCGCTGTCGGAGTTGCGGC TCGAGAGCTACGAGCAGCATGCTTGGCCCCGGCCGGTCGCCGC TCTCTATCGCAAGAATGCGCTCATCATTTCCATCTTGTC GGCGGCATGCATAACCGGCGTCCTTCTGCTTGCCGCCATCT TCAACGGGGATGCACTTTTCGCGAAACACGCATCGGTG CCCGGCGGCGGGTTTTACAACGTTATTCCTTATCAGGCGATG ATTGCCGTCGCGGCGACCACATTTCTTTATTCCGCGCT GGCGCTGGCGATCAGTCTCGTTCGCTTTTCGCGGACGATCGG TCTGGGAATTAAGGTTCTTTATCAGCACGTGCCGGTTC TTCGGGCGCTACGCGATGCGGCGACTCTGCGATATCTCGGCG GCAGCGACGGCGAGGGGTGTAACGACGCGGACGAGA CATTTTCGACGACCCGGCGAAAATTTCATCACGCCCTTGCCTAT GGCTTCGGACTTTGTTTCGCGGCCACAGCCACGGGCA CGATCTACGATCATATGTTCGGCTGGCCGGCGCCCTATGCGCT TTTCAGCTTGCCGGTCGTCCTAGGGACCGTTGGGGGG ATCGGAATGGTCGTGGGCGCGATCGGCCTACTCTGGCTCAAGC TGGCCGGCGAAGACGCTCCTCGATCACCGGCACTGCT TGGGCCGGATGTTGCCCTGTTGGTGCTTCTGCTTGCCATAGCG GCAACGGGCCTCCTCCTTTTAGCGGTCCGCAGCACCG AAGTCATGGGCGTCGCGCTCGCCGTCCATCTCGGCGTCGTCTT GGCCTTCTTTTTGGTGATGCCATACAGCAAATTTGTCCA CGGTATCTTCAGGCTCACGGCTCTCGTGCGCCATCATGCTG ACCGCGAGGCAAGTAATGGCTTCGCCTCCAGCCCTCC CACGAAAAAGGGTTAA >SEQ ID NO: 14 (fumG) ATGGAACATATGAAGTCCGTTCGCGATCGCAGTAGCGT CATGCAGATCGTGAGAGTGGCGAGTGGCAACTGTCTCGAGCA ATATGATTTCTTCGTTTACGGCTTCTATGCGGCATATAT TGCGAGAAGCTTTTTTCCGACCGGCGATAACGCGACATCGC TCATGCTTTCATTGGCCACTTTTGGCGCTGGTTTCCTCA TGAGGCCCTTGGGGGCGATTTTTCTCGGGTCCTACATCGAT CGCGTCGGGCGTCGGAAAGGCCTGATCGTGACACTCG CGATCATGGCCGTCGGAACCCTCACCATTGCGATGACTCCAAG CTATGAGGCAATTGGATTACTCGCACCGGTTATCGTGC TCGTCGGGCGACTTTTGCAGGGTTTTTCCGCTGGAGCAGAGT CGGGTGGCGTCTCAGTGTACTTGGCGGAAATTGCGTC GCCCAAATCGAGAGGCTTCTTCACCTCGTGGCAGTCTGCCAGC CAGCAGGTGGCCGTCATGATCGCCGCCGCGATCGGTC TTGCGCTGCAATCAACGCTTTCACCGGAGCAAATGAACGACTG GGGATGGCGGGTGCCCTTGTTGATCGGATGCTTGATTA TCCCCGTGATACTCTGGCTGCGCCGGTCTCTCCCGGAAACGA AAGCCTATCTCCACATGGAGCACAAGGCGCATTCGATC GGCGAATCCCTCCGCGAATTGCAACAGAGCTGGGGGCTGATC TTGACGGGCATGGCGATGTCGATCCTCACGACGACCA CCTTTTACATGATTACCGCCTATACGCCGACATTTGGCGAGAA AGCACTCGGACTGAGCCCGCAAGATGTCCTGCTGGTT ACCATCATGGTCGGCGTGTCGAACTTCCTGTGGCTTCCGATCG GGGGTGCTCTCTCGGATCGTATCGGTAGAACCCCGAT CCTACTGGTCGTGCCGGTCACCGTTCTCGCCATCGCCTTTCCC CTGATGAGCTGGCTCGTCGCGGCACCGACATTCGGAG CGCTTGCAGCTGTTCTGCTGACTTTCTCCGCATGCTTTGGACT CTATAATGGGGCGCTCATCGCGAGACTCACCGAGATTA TGCCTCCCGCCATTAGAACCCTTGGCTTCTCGCTGGCGTTCA GTCTCGCGACCTCGCTGTTCGGCGGCTTCACCCCATT GGTAAGTACGGCGCTAATCCACGCGACGGGCAGCAATTCCGCG CCTGCAATCTGGCTCTGTTTTGCGGCTTTCATCAGCTT CGTCGGTGTGGCCGCATCGACCCGGCTGAGCCGGCCAATCGC CGAAGGCGCCAGATAG >SEQ ID NO: 16 (fumH) ATGAGAGCAGTAGTTTACCGAAATGGCGAACTTGTCCT GGGGGCCTATGCTGATCCGATACCCGCCGCCGGGCAGGTGCT CGTCAAGACCAGAGCATGCGGCATCTGCGGATCTGAC CTTCATTTTTGCGATCATGCGCAGGCGTTTACGAACCTTGCAT CGCGGGCGGGTATCGCCTCTATGGAAGTTGATTTGTGT CGAGACATCGTTCTGGGGCATGAATTCTGTGGCGAGATTATG GAGTTCGGGCCCTCTGCGGATCGTCGCTTCAAACCCG GACAGCTTGTGTGCTCGCTGCCGCTGGCGATCGGTCCGACCGG AGCGCGGACGATTGGCTACTCGGATGAGTATCCCGGC GGGCTCGGCGAATATATGGTCCTCACGGAAGCGCTCTTGCTGC CTGTTCCGAACGGCCTTCCGGCGACCTGCGCGGCGTT GACGGAGCCGATGGCGGTGGGATGGCATGCCGTCGAGATCGCG CAGGTTCAACCACATCACATCCCTGTGGTGATCGGGTG CGGACCGGTCGGGTTGGCAGTCGTCGCTGCCCTGAAACATAA GCAAGTTGCTCCGATTATTGCGTCGGATCCATCGCCCG ATCGGCGTGCTCTTGCTCTGCGGATGGGCGCCGACGCCGTTG TCGATCCGCGCGAAGAATCACCCTTTCGCCAGGCCGA GAAGATCGCACGCCCGGTCGGACAAGGTGGGGCCCTGTCCAGC TCATTGCTGTCAAAGTCTCAAATGATATTCGAATGCGTA GGGGTGCCGGGCATGCTTCGGCATGCGATGGACGGCGCGTC CGACGGGTCCGAGATCATGGTCGTTGGCGCATGCATG CAGCCGGACGCGATCGAGCCCATGATCGGGATGTTTAAAGCGC TCACGATCAAATTCTCGCGAACTTACACGGGTGAGGAA TTCGCCGCGGTGCTTCACATGATAGGTGAGGGCGCACTCGAC GTATCTCCGCTCGTTACCGATGTGATTGGCCTGTCCGA TGTCCCGTCCGCGTTTGAGGCTCTACGGAGTCCAGGCGCCCA AGCAAAAGTGATTGTGGACCCTTGGCGCTGA >SEQ ID NO: 18 (fumI) ATGGCGAACGGAACAAGGCAGAAAGATCTCAGAGAAC GCGCCGAACGGGTCATTCCGGGCGGGATGTACGGCCACGAGTC GACACGGTTGCTGCCGCCAGAATTCCCCCAGTTCTTCAGGCGCG CGCTGGGGGCACGAATTTGGGACGCCGACGAGCAGCCCTATATC GACTATATGTGCGCGTATGGGCCAAATTTGCTCGGTTACCGGCAA TCCGAAATCGAAGCCGCGGCTGATGCGCAGCGACTTCTCGGCGA CACCATGACCGGTCCTTCGGAGATCATGGTCAACCTCGCCGAAG CCTTTGTGGGCATGGTCCGTCATGCGGATTGGGCGATGTTCTGCA AAAATGGCAGCGATGCCACCTCAACGGCGATGGTTCTCGCGCGT GCCCATACGGGGCGCAAAACCATATTATGCGCCAAAGGCGCCTAT CATGGCGCTTCCCCGTGGAACACTCCGCATACTGCCGGGATTCTC GCTTCCGATCGCGTGCATGTCGCATATTATACCTATAACGACGCC CAAAGCTTATCGGACGCGTTCAAGGCGCACGATGGCGATATTGC GGCTGTCTTTGCCACACCTTTCCGACACGAAGTATTTGAGGACCA GGCCCTCGCCCAGCTTGAGTTCGCGCGCACCGCTCGAAAATGTT GTGACGAGACCGGTGCGCTTCTGGTCGTTGACGATGTGCGCGCA GGTTTCCGGGTGGCGCGCGATTGCAGCTGGACGCATTTGGGTAT CGAACCCGATCTCAGTTGCTGGGGAAAATGCTTTGCGAATGGCTA TCCGATCTCCGCCCTGCTGGGCTCGAACAAGGCGCGCGATGCGG CGCGGGATATATTTGTGACCGGCTCCTTCTGGTTCTCTGCGGTAC CGATGGCGGCCGCGATCGAAACCCTCAGGATCATTCGAGAGACG CCTTATCTCGAAACGCTGATCGCCAGCGGCGCCGCCCTGCGGGC AGGCCTGGAGGCACAGTCTCAGCGCCATGGTCTTGAGTTGAAGC AGACGGGCCCGGCGCAGATGCCGCAAATATTCTTTGCGGACGAT CCCGATTTTCGGATCGGCTATGCGTGGGCCGCGGCGTGCCTGAA GGGCGGCGTCTATGTTCATCCCTATCACAATATGTTTCTCTCTGCG GCCCATACAGTTGACGATGTAACGGAGACCCTCGAGGCGACGGA TCGCGCGTTCAGCGCGGTCCTCAGAGATTTTGCGTCTCTCCAGCC TCATCCCATTTTAATGCAACTCGCCGGTGCTTGA >SEQ ID NO: 20 (fumJ) ATGTATCGGAAGTTCAGAATCGAAAAGCCCGGCAAGGC AAATAGTTTGCTCGGCGCAGTAGCGCTCGGCACCCTCGCATTTCC TGTCTCTGCCAGTGCTCAGGATAGCGATCCCGCATCGATAGGTCA GCCGGACGAAGCGGACACGGACCGGGGAACGAGCGAAATCGTC GTGACCGGCAGCCGCCTCCAGAACGGCTTCAATTCGCCGACGCC GGTTACAGCCGTATCCAGCGAGCAGTTGAAGGAGGCATCTCCGA CCAACCTTGCCGACGCACTCAACCAGCTGCCCGTGTTCAACGACA GCTTGAAGACCTCCAACCCTGGCACGACACCCGGAACGGGGAAC AGCGGTCAGAACCTGCTCAACATGCGCGGCCTCGGGTCAAACCG GAACCTCGTCCTGCTGAACGGCAACCGTTTCGTCGCGACCAATTT CACAGGCTCGGTCGATATCAACGTGCTGCCGCAGGCGTTGGTCA AGCGCGTCGATGTCGTGACGGGCGGCGCCTCGGCCGCCTACGG TTCCGATGCCGTTTCGGGCGTCATCAACTTCGTGCTCGACGAAGA TCTGGAAGGCATCAGGGCCGAGCTCCAGTCGGGTGTTTCAACCC GCGGCGACCTCCCGTCCTACGGCGGTTCGATCGCCTTCGGCACT TCGTTTGCCGACGACCGGTTGCACTTGCTCGGCAGCTTCGAATAT TTTCGACAGGACGGAATCCGGGCCGATGAAGCAACGGGTCGCCG CTGGTTCGACATCGCCGCCGGCCAATATCCCGTGCCCGGCGCTA CGACAGGCGTCACGGTCGTGCCCGATATTCGCAGTTCTCGCGGA TCCTACGGCGGACTTGTCACGTCCGGCCCTCTGAAAGGCATCGC GTTTTTGCCCGGAGGAGTCCTAGGGACCTTCGACTACGGGAATTT TACGAGCTCGTCGTTCCAGAGCGGCGGCGATGGACCGCGCGTGA ATATCGGCTTCGCCCCGGATCAGCTTCGCTACAACGCGTTCCTAC GCGCCGCATATGATGTGTCCGACACTGTGCAGGTGTATGCGGAG GGCACCTATGCTTATTCCCACACCAACCTGGGTGCATTCGTAATAT CGCATGTCGGTGGCTCGAATAATTTCCGGATCTTCCGTGATAACG CCTTCCTTCCGGCTCCACTCGCGACGCTCATGGACAGAAATGCCC AGGCTTCGATCGTTGTCGGTCGCTTCTCAAGCGACTTTCCCTTGG TCGAAATCGAGAATTTCGCAAAGGTCTACCGCGGCGCTGCCGGC TTCCGGGCAGACATTGGCAATGGCTGGAAACTCGATGGCTCGGC CTCCTTTGGCCTTACGGACCTCGAGCTTCGTGAAAACAATCTCAC CATCAACCGCAATCTCTACGCCGCCGTCGATGCGGTCCGCGATC CCGCGGGCAATATCGTCTGCCGTTCAACACTGGCCGGCCTCGAC CAAGATTGCGTGCCGCTCAATCTCTTCGGCACAGGCTCGCCGAG CGCGTCGGCCATCGACTATGTCACCGCTGATGGCGTCGCTCAGC TGAGGCTTGAGCAATATGTGGCGGGACTCACGATTTCCGGCGAC CTCGGCGATAGCCTGTCGTTCGGCGCGGGCCCGGTCTCGGTCGC CGCTGGTATCGAATATCGCAAGGAGAAGGCCCGGCAGGAAACCG ACGCGATATCGCAGGCGACGACCTCGATCACGGGAATCAGGGGG GCTCCGGCGGCGCAGGCAGGTCGGCCTGGAGGCTTCAATCTCTA CAACCCACTTCCCTTCTCGGGAAGCTATGACATCAAGGAAGGTTT TGTCGAAATCGGCGTCCCGATTCTGAAGGACAGCGCGCTGGGAC GTTCGCTGAACTTAAACGGCGCCGTCCGATATGCCGATTACAGCC AGTCCGGTGGAGTAACAACCTGGAAGCTGGGCGGAGAATATGAG CCGATCGACGGCCTCAGGTTCCGCGCGACCCGTTCGCGAGATAT CCGCGGGCCAAGCCTTGTCGAGCTATTCGACCCCGGCCGTCAGG CGACGCTCAATTCAATTTATGGCGGACAGGCTGTGCAGACGCGGT TCTTTACCGCCGGCAACGCGGATTTGCGCCCTGAAAAGGCGGAC GTCCTTACATTCGGCGCGGTGCTACGCCCCGCCTTCGTGCCGGG GTTTCAGTTTTCGGTCGATCGCTATGTGGTGAAGGTGAAGGGCGC GATCGATTTCCTCCTTCCCCAGCAGGAAATCGACGCGTGCGATGC AGGAAACACCTTCTTCTGCGACCTCATAACGGAGAATCCGGACGG CACCATCACAGTGACGGGTCCCAATCTCAACCTGGCTGTCCAGAA AGCGGCGGGAATTGACTTCGAGGCCTATTACTCACGCCCCGTCG GCGGCGGCACGTTCAGTCTTCGTGCGCTGGCAACGCACCATACC TCTGCCTATCGCATCGCGACCGGCTCGGCGCCCATCCGTTCGCT CGGACAACCGGACACGCCAAAATGGTCGGCCAACTTCCAGGCGC GATATTCGACCGACGATTGGGCGCTTCTCGTGCAGCAGCGCTTCA TCGCAGCATCGGTGTTCAATGCCGACAATGTGGAGGGCGTCGAT ACGAATTTGAACCACGCTCCGGCGGTTTGGTACACCGACGCGAC ATTGACCTTCGACATCGCGGCTTTTGGCCAGAAGCAGCAGCTGTT TCTATCGGTCAATAATTTGTTCGACCGAGATCCGCCAATAGCGAC GAACGACCCCAGCAGTTTTTCCAGCCCGACCAGCTCTGCCTATGA TCCGGTCGGCCGCTATTTTAATGTCGGGGTCCGTTTCCGGATCTG A >SEQ ID NO: 22 (fumK) not complete ATGCGCCTCACGGGCGGAGAATTATTGGCACGATGTTT GGCCGTCGAAGGCGTCCGGTATGTCTTCGGCCTCATGTCGCCGG AGGTGGATCCGCTCCTGGCTGCGCTCGAAGACAATGGGATATTGT TCGTCCCGGTGCGGCACGAGGCCGCCGCAGCCTATATGGCCGA GGGCATTTACAAGACCACCGGACAGGTCGCCGCGATTGTCACGA ATCCGGGTCCCGGTACGGCAAACCTTCTGCCTGGAGTCGTGACG GCACGCCACGAAGGGGTTCCCTTCGTCGCAATAACGTCCCAGCA TCAACTTGGTGTCGTTTATCCCTGCACGCCAAAAACCTTTCAGGG ACAAGACCAGATCGACCTCTTTCGACCCGCGGTTAAATGGGGCG CACCCATCTTCGCCTGGAACCGGATTGTCGAAATCACCCATATGG CGTTCCGGGAAATGTGGGCCGGCAGGCCGGGACCCGTTCAGTTG GAAATCCCGARGTCTGTGATGTATGKTGTGGGCGAACGAGGACC ACGGTAGAAGTTTACRGATCGCCGACA... >SEQ ID NO: 24 ATGGAATTGAGCCGCCAACGAGACCAGGCCTTGAGGG AGCGCGCCCAAGCGGTGATCCCGGGCGGGATGTACGGTCACGA GTCGACCTATCTGATGCCCGAGGGCACGCCACAGTTCTTCAGTCG CGGCAAAGGCGCCCGACTTTGGGACGCCGACGGCAACGAGTATG TCGATTACATGTGCGCCTATGGCCCCAACCTGCTGGGTTACGGCT TCGAACCCGTCGAAGCGGCCGCCGCAGCCCAGCAAGCCCGGGG CGATACCCTGACCGGGCCGTCGGAGGTGATGGTGCAGTTGGCGG AAGACTTCGTCGCGCAAATCAGCCACGCGGACTGGGCCATGTTCT GCAAGAACGGCACAGACGCCACCTCAATGGCGATGGTCATCGCG CGCGCACACACCGGCCGGAAGACGATCCTCTGCGCGAAAGGCG CCTATCATGGGGCCGCGCCTTGGTGCACGCCGATCCTGGCCGGA ACGCTACCGGAGGATCGCGCCTTTGTAGTCTACTACGACTACAAT GACGCCCAAAGCCTCGTCGACGCCTTCGAGGCCCATCAGGACGA CGTCGCGGCGATCTTCGCCACCCCTCACCGTCACGAGGTGTTCA GCGACCAGATCGATCCTGATCCGGAATATGCGGCCAGCGTGCGG GCGCTCTGCGACAAGAGCGGCGCCCTGCTCGTCGTCGACGAAGT TCGAGCCGGGTTCAGGATCGCGCGCGACTGCAGCTGGGCCAAGA TCGGCGTCGCTCCGGATCTGAGCACCTGGGGCAAGTGCTTCGCC AACGGCTATCCGATCTCGGCGGTCCTAGGGGGCGAAAAGGTGCG CAGCGCGGCAAAGGCCGTCTACGTCACCGGCTCGTTCTGGTTCT CGGCCACGCCCATGGCCGCAGCCGTCGAAACCCTGAAGCAAATC CGCGAGACCGACTATCTCGAGCGGATCAACGCGGCCGGGACCC GCCTGCGCGAGGGCCTGCAGCAGCAGGCTGCTCACAACGGCTTT ACGTTGCGCCAAACGGGGCCCGTCTCCATGCCCCAAGTCCTCTT CGAGGAAGATCCCGATTTTCGGGTCGGCTACGGCTGGGTTCGCG AATGCCTGAAGCGAGGGGTGTACTTCAGCCCCTACCATAACATGT TCCTGTCGGCGGCCCATAGCGAGGCGGACCTGGCCAAGACCCTT GCGGCTACCGGCGACGCCTTCGTCGAGCTACGCGCCAAGCTTCC GAGCCTAGAAATCCACCAACCCCTCCTCGCCCTGAGAGCGGCCT AA Enzimas Sequências: >SEQ ID NO: 3 (FumA) MRNVSDKAPPHETLTVVVAAMIVGTAALMVLGIQPILLGAL VEEGRIPAEGLGSAATVEI LAIAAGTCIGPVLMKTGYLRAKCAALCLMLAAINFGLTLPG FDLPIVACRAAAGALEGLS LSAAILIMTHNRRPDRLSGIFLGAQTIPQVISAYLLPTEIIPR WGSAGGFTILGILAAIA AIAALCLVDRVELDPTTVNDDLQWSPAAIVISMAAFVQFSG VGAAWSYLERLAAQHGFSG ETIGIAISGSLLCQVGGAWLAAWIGGRVGYRFALIAGSLLQ AGNVIALAVADQPSWFISA SCAFGLFWLAMQPFQIRFAIAIDNSRQLAVLLTPIALVGLSA GPLLLSRFAGATDLRWIF VGSSTLLLASALLYLCASLFQPRGKVIAETVDV

[00015] >SEQ ID NO: 5 (FumB) MTSQVKLRSAAKRPRSPKSERGLARYESLLDATDRLLVDL DPDQVGLYQIAEEAGASPSS VYHFFPTKEVAHLALMRRYLEGLRNLDAMEVDIGQLESW QDLMKLDQIRARDYYNSHPPA LKLLFGGYGGVEARKLDERYSEEIVSSMYGRYNGIFHMP QMENEALMFTICFAILDAVWA VSFRRFGEITSDFLREGQAACIAYCRHYLPERTPSA >SEQ ID NO: 7 (FumC) VASKFNCELLDLRSFVAVYETRSFSHAARLLNQSQPALSR RIQRLESLVGGPLFERTSRS LAETALGKELLPVAHRALELVDTSLFASPNVREFRWTDITI ACVQTAAFHVLPRAARLYM DQNPRVRLRILDVPAVEAADLVASGEAEFGISIESLLPSSL RFDALHEDPFGLACHRSHP LASLEILEWTQLKGESLIAVHRASRNRTLLDAELARNNIAL EWRYEVAHLTTALGLIDAQ LGVAVMPRMVMPRSGRSEVVWRPVVAPVVQRTIGIVQR RTGSMHPAAQQLLARLRAAWSS ANLGDIASREDGAS >SEQ ID NO: 9 (FumD) VKEHQCRGGRASPAAPATWLARISVSRGASAIAWTFMLG ATAIPVAAQTDDPKLVRHTQS GAVEGVEGDVETFLGIPFAAPPVGDLRWRPPAPPRAWA GTRDGRRFAPDCIGNERLREGS RAAGTSEDCLYLNIWSPKQVGKGGLPVMIWVYGGGFSG GSGAVPYYDGSALAQKGVVVVT FNYRAGILGFLAHPALSKESPNGVSGNYGLLDMLAAFKW VQNNIREFGGDPNRVTVFGES AGASALGLLLTSPLSESAFNQAILQSPGLARPLATLSESEA NGLELGADISALRRADAGE LTKIAQSRIPMSRQFTKPRPMGPILDGYVLRTLDVDAFAK GAFRKIPVLVGGNADEGRAF TDRLPVKTVLEYRAYLTEQFGDEADAWERCYPANSDADV PAAVARLFGDSQFNNGIELLS AAFAKWRTPLWRYRFTGIPGAGRRPATHGDEIPYVFANL GPSSVSMFGSLEGGAGASDIK LATEMSAAWVSFAVHGVPDQGTKSHWPRFERRGEIMTF GSQVGSGEGLGVSPSKACQPSK >SEQ ID NO: 11 (FumE) LEFRRAKPANPQNSARPVRASARRPALRATGCALCLEGS KLRYDVAIIGGGNAALTAAVT AREAGASVLVIEHAPRAMRGGNSRHTRNMRTMHERPLS PLTGEYSADEYWNDLVRVTGGR TDEELARLVIRNTTDAIPFMTRCGVRFQPSLSGTLSLSRTN AFFLGGGKALVNAYYATAE RLGVDILYDSEVTEINLQQGVVQRLQLRSRGFPVEVEAKA AIASSGGFQANLDWLSSAWG PAAANFIVRGTPYATGTVLKNLLEQGVASVGDPTQCHAVA IDGRAPKYDGGIVTRLDCVP FSIVVNKDALRFYDEGEDVWPKRYAIWGRLVAQQPDQIAF SIIDRQAEDLFMPSVFPPVQ ADTIAGLAEKLGLNPVTLERTVAEFNAACVPGEFGGQDLD DLHTEGIEPKKSNWARPIIV PPFSAYPLRPGITFTYLGVKVDSRARVIMETGEPTKNLFAS GEIMAGSILGQGYLAGFGM AIGTVFGRIAGWEAARHAGF >Seq ID 13 (FumF) MQDFDLVKMLSDLPSAPELEARRVMEVCNACRYCEGFC AVFPAMTLQRHFASGDLSHLAN LCHSCQGCYYACQYAPPHEFGINVPKALSELRLESYEQH AWPRPVAALYRKNALIISILS AACITGVLLLAAIFNGDALFAKHASVPGGGFYNVIPYQAMI AVAATTFLYSALALAISLV RFSRTIGLGIKVLYQHVPVLRALRDAATLRYLGGSDGEGC NDADETFSTTRRKFHHALAY GFGLCFAATATGTIYDHMFGWPAPYALFSLPVVLGTVGGI GMVVGAIGLLWLKLAGEDAP RSPALLGPDVALLVLLLAIAATGLLLLAVRSTEVMGVALAV HLGVVLAFFLVMPYSKFVH GIFRLTALVRHHADREASNGFASSPPTKKG >SEQ ID NO: 15 (FumG) MEHMKSVRDRSSVMQIVRVASGNCLEQYDFFVYGFYAA YIARSFFPTGDNATSLMLSLAT FGAGFLMRPLGAIFLGSYIDRVGRRKGLIVTLAIMAVGTLTI AMTPSYEAIGLLAPVIVL VGRLLQGFSAGAESGGVSVYLAEIASPKSRGFFTSWQSA SQQVAVMIAAAIGLALQSTLS PEQMNDWGWRVPLLIGCLIIPVILWLRRSLPETKAYLHME HKAHSIGESLRELQQSWGLI LTGMAMSILTTTTFYMITAYTPTFGEKALGLSPQDVLLVTI MVGVSNFLWLPIGGALSDR IGRTPILLVVPVTVLAIAFPLMSWLVAAPTFGALAAVLLTFS ACFGLYNGALIARLTEIM PPAIRTLGFSLAFSLATSLFGGFTPLVSTALIHATGSNSAPA IWLCFAAFISFVGVAAST RLSRPIAEGAR >SEQ ID NO: 17 (FumH) MRAVVYRNGELVLGAYADPIPAAGQVLVKTRACGICGSDL HFCDHAQAFTNLASRAGIAS MEVDLCRDIVLGHEFCGEIMEFGPSADRRFKPGQLVCSL PLAIGPTGARTIGYSDEYPGG LGEYMVLTEALLLPVPNGLPATCAALTEPMAVGWHAVEIA QVQPHHIPVVIGCGPVGLAV VAALKHKQVAPIIASDPSPDRRALALRMGADAVVDPREES PFRQAEKIARPVGQGGALSS SLLSKSQMIFECVGVPGMLRHAMDGASDGSEIMVVGACM QPDAIEPMIGMFKALTIKFSR TYTGEEFAAVLHMIGEGALDVSPLVTDVIGLSDVPSAFEAL RSPGAQAKVIVDPWR >SEQ ID NO: 19 (FumI) MANGTRQKDLRERAERVIPGGMYGHESTRLLPPEFPQFF RRALGARIWDADEQPYIDYMC AYGPNLLGYRQSEIEAAADAQRLLGDTMTGPSEIMVNLAE AFVGMVRHADWAMFCKNGSD ATSTAMVLARAHTGRKTILCAKGAYHGASPWNTPHTAGIL ASDRVHVAYYTYNDAQSLSD AFKAHDGDIAAVFATPFRHEVFEDQALAQLEFARTARKCC DETGALLVVDDVRAGFRVAR DCSWTHLGIEPDLSCWGKCFANGYPISALLGSNKARDAA RDIFVTGSFWFSAVPMAAAIE TLRIIRETPYLETLIASGAALRAGLEAQSQRHGLELKQTGP AQMPQIFFADDPDFRIGYA WAAACLKGGVYVHPYHNMFLSAAHTVDDVTETLEATDRA FSAVLRDFASLQPHPILMQLA GA >SEQ ID NO: 21 (FumJ) MYRKFRIEKPGKANSLLGAVALGTLAFPVSASAQDSDPAS IGQPDEADTDRGTSEIVVTG SRLQNGFNSPTPVTAVSSEQLKEASPTNLADALNQLPVFN DSLKTSNPGTTPGTGNSGQN LLNMRGLGSNRNLVLLNGNRFVATNFTGSVDINVLPQALV KRVDVVTGGASAAYGSDAVS GVINFVLDEDLEGIRAELQSGVSTRGDLPSYGGSIAFGTSF ADDRLHLLGSFEYFRQDGI RADEATGRRWFDIAAGQYPVPGATTGVTVVPDIRSSRGS YGGLVTSGPLKGIAFLPGGVL GTFDYGNFTSSSFQSGGDGPRVNIGFAPDQLRYNAFLRA AYDVSDTVQVYAEGTYAYSHT NLGAFVISHVGGSNNFRIFRDNAFLPAPLATLMDRNAQASI VVGRFSSDFPLVEIENFAK VYRGAAGFRADIGNGWKLDGSASFGLTDLELRENNLTINR NLYAAVDAVRDPAGNIVCRS TLAGLDQDCVPLNLFGTGSPSASAIDYVTADGVAQLRLEQ YVAGLTISGDLGDSLSFGAG PVSVAAGIEYRKEKARQETDAISQATTSITGIRGAPAAQAG RPGGFNLYNPLPFSGSYDI KEGFVEIGVPILKDSALGRSLNLNGAVRYADYSQSGGVTT WKLGGEYEPIDGLRFRATRS RDIRGPSLVELFDPGRQATLNSIYGGQAVQTRFFTAGNAD LRPEKADVLTFGAVLRPAFV PGFQFSVDRYVVKVKGAIDFLLPQQEIDACDAGNTFFCDLI TENPDGTITVTGPNLNLAV QKAAGIDFEAYYSRPVGGGTFSLRALATHHTSAYRIATGS APIRSLGQPDTPKWSANFQA RYSTDDWALLVQQRFIAASVFNADNVEGVDTNLNHAPAV WYTDATLTFDIAAFGQKQQLF LSVNNLFDRDPPIATNDPSSFSSPTSSAYDPVGRYFNVGV RFRI >SEQ ID NO: 23 (FumK) incompleta MRLTGGELLARCLAVEGVRYVFGLMSPEVDPLLAALEDN GILFVPVRHEAAAAYMAEGIY KTTGQVAAIVTNPGPGTANLLPGVVTARHEGVPFVAITSQ HQLGVVYPCTPKTFQGQDQI DLFRPAVKWGAPIFAWNRIVEITHMAFREMWAGRPGPVQ LEIPXSVMYVVGERGPR-KFX DRR >SEQ ID NO: 25 MELSRQRDQALRERAQAVIPGGMYGHESTYLMPEGTPQ FFSRGKGARLWDADGNEYVDYM CAYGPNLLGYGFEPVEAAAAAQQARGDTLTGPSEVMVQL AEDFVAQISHADWAMFCKNGT DATSMAMVIARAHTGRKTILCAKGAYHGAAPWCTPILAGT LPEDRAFVVYYDYNDAQSLV DAFEAHQDDVAAIFATPHRHEVFSDQIDPDPEYAASVRAL CDKSGALLVVDEVRAGFRIA RDCSWAKIGVAPDLSTWGKCFANGYPISAVLGGEKVRSA AKAVYVTGSFWFSATPMAAAV ETLKQIRETDYLERINAAGTRLREGLQQQAAHNGFTLRQT GPVSMPQVLFEEDPDFRVGY GWVRECLKRGVYFSPYHNMFLSAAHSEADLAKTLAATGD AFVELRAKLPSLEIHQPLLAL RAA-

[00016] De acordo com outro aperfeiçoamento, o método de acordo com a invenção é conduzido de tal forma que as fumonisinas são degradadas de forma oxigênio-independente ou anaeróbica. Através da degradação das fumonisinas de forma oxigênio-independente, é possível desenvolver também o método de acordo com a invenção para o fim de as sequências de ácido nucléico de genes ou enzimas realizarem as reações de degradação de modo seguro e confiável sem qualquer adição de oxigênio molecular para tonar o aditivo assim produzido utilizável em qualquer meio oxigênio-independente ou anaeróbico onde micotoxinas tenham que ser possivelmente degradadas, tais como por exemplo em alimentos para humanos e animais, na produção de bioetanol, mas também para a produção de culturas agrícolas geneticamente modificadas.

[00017] De acordo com um outro aperfeiçoamento, o método de acordo com a invenção é conduzido de tal forma que, antes do uso das enzimas no material de partida vegetal, estas são modificadas por métodos de genética molecular, mutagênese ou evolução molecular. Ao conduzir o método de forma que as enzimas, antes de seu uso no material de partida vegetal, sejam modificadas por métodos de genética molecular, mutagênese ou evolução molecular, é possível produzir as enzimas em uma forma até mais estável adaptada à finalidade seguinte de uso de forma a melhorar ainda mais ou aperfeiçoar a degradação oxigênio-independente de fumonisinas.

[00018] De acordo com um outro aperfeiçoamento preferido da invenção, o método é conduzido de tal forma que as enzimas são isoladas. Ao conduzir o método desta forma as fumonisinas, particularmente, são completamente degradadas de modo oxigênio- independente.

[00019] De acordo com outra concretização preferida da invenção, o método é conduzido de tal forma que as enzimas são encapsuladas em um revestimento protetor. Através do encapsulamento das enzimas em um revestimento protetor, é possível transportar as enzimas para o seu destino de uso, por exemplo, particularmente para o trato digestivo sem ser alterada particularmente, degradada ou danificada, de forma que as enzimas não começam a agir antes da dissolução do revestimento protetor, por exemplo nos tratos gastrointestinais de humanos ou animais, assegurando assim uma degradação ainda mais seletiva, rápida e completa das micotoxinas no ambiente oxigênio-independente do trato gastrointestinal enquanto, ao mesmo tempo, impede que as fumonisinas exerçam seus efeitos nocivos em seres vivos que ingeriram as mesmas com o alimento.

[00020] De acordo com outro aperfeiçoamento preferido o método de acordo com a invenção é conduzido de forma que as enzimas sejam selecionadas a partir da permeasse de SEQ ID NO: 3, carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, tricarbalilato desidrogenase de SEQ ID NO: 11, proteína de utilização de citrato de SEQ ID NO: 13, álcool desidrogenase de SEQ ID NO: 17, aminotransferase de SEQ ID NO: 19 e/ou acetolactato sintase deSEQ ID NO: 23. Ao conduzir o método desta forma as fumonisinas podem ser degradadas facilmente e completamente em um ambiente oxigênio-independente. Neste caso, a transcrição das fases abertas de leitura nos clusters gênicos FUM isolados do cluster gênico da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, que é derivada de uma cepa procariótica que apresenta o número de acesso DSM 16254, é controlada por um promotor bidirecional localizado entre FumA e FumI, conforme consta da tabela 1 abaixo. Os clusters codificam proteínas que são envolvidas na regulação da expressão gênica, como por exemplo, FumB e FumC, na amostragem do substrato e seu transporte, como por exemplo FumA, FumJ, FumG, e no catabolismo do substrato, como por exemplo FumD, FumE, FumF, FumH, FumI, FumK. A partir dessas sequências de ácido nucleico que codificam genes especiais e enzimas, cujos genes foram selecionados de acordo com um outro aperfeiçoamento preferido do método de acordo com a invenção, que são responsáveis pelo catabolismo do substrato, permitindo assim que as enzimas respectivamente formadas catabolizar completamente o substrato, ou seja, fumonisinas.

[00021] Neste caso, fases abertas de leitura selecionadas, por exemplo, do cluster gênico da sequência de ácido nucléico que apresenta SEQ ID NO: 1 são expressas em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A transcrição das fases abertas de leitura contidas no cluster gênico que apresenta SEQ ID NO: 1, na cepa bacteriana com o número de acesso DSM 16254, ocorre de forma controlada através de um promotor bidirecional localizado entre fumA e fumI, conforme consta na figura anexa figura 1. Os genes codificam proteínas que estão envolvidas na regulação da expressão gênica, como por exemplo, FumB e FumC, no reconhecimento do substrato e seu transporte, como por exemplo FumA, FumJ, FumG, e no catabolismo do substrato, como por exemplo FumD, FumE, FumF, FumH, FumI e FumK.

[00022] Na tabela 1 abaixo, as designações dos genes do cluster gênico fumonisina-catabolizada aparecem relacionadas, sendo que O indica a orientação, a saber f adiante e r reverso. Tabela 1

[00023] Ao conduzir o método de acordo com a invenção preferivelmente de forma que é usada uma enzima, que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma das enzimas que apresentam SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ou 25, é possível assegurar uma degradação ainda mais completa das fumonisinas, sendo que não apenas fumonisinas mas também micotoxinas correlatas ou estruturalmente semelhantes podem ser, ao mesmo tempo, completamente desintoxicadas, particularmente em ambientes anaeróbicos ou oxigênio- independentes, tais como por exemplo, toxina AAL.

[00024] Ao conduzir o método preferivelmente de tal forma que ao se utilizar aminotransferase de SEQ ID NO: 19, é usado um ácido α- ceto como um cossubstrato, é possível particularmente com a degradação do grupo amino de fumonisina e o uso simultâneo de um ácido α-ceto tal como, por exemplo, ácido pirúvico, substituir um grupo ceto para o grupo amino na molécula de fumonisina, sendo formada alanina como um produto secundário desta reação, que é totalmente inofensiva, assegurando assim a degradação completa de fumonisinas formando substâncias inofensivas.

[00025] De acordo com um outro aperfeiçoamento preferido o método de acordo com a invenção também pode ser conduzido de tal forma que ao utilizar carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, é adicionalmente empregado pelo menos um adsorvente selecionado, particularmente, de minerais argilosos. Ao utilizar adicionalmente pelo menos um adsorvente selecionado, particularmente, de minerais argilosos ao se utilizar carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, é possível tornar fumonisinas totalmente inofensivas mesmo sem a adição de quaisquer outras enzimas, mediante clivagem das duas cadeias laterais de ácido tricarbalílico através da carboxilesterase a partir da molécula de fumonisina em uma primeira etapa e formando o que é chamada de fumonisina hidrolisada. Fumonisina hidrolisada que é substancialmente molécula semelhante à cadeia, pode ser em seguida adsorvida, por exemplo, em minerais argilosos, permitindo assim que fumonisinas sejam tornadas completamente inofensivas mesmo em um processo de degradação enzimática de etapa única.

[00026] De acordo com outro aperfeiçoamento preferido, o método de acordo com a invenção é conduzido de forma que o aditivo assim produzido é usado em um material de partida vegetal a ser fermentado ou em um mosto para a produção de bioetanol. Ao utilizar o aditivo produzido pelo método de acordo com a invenção em um material de partida vegetal a ser fermentado ou em um mosto para a produção de bioetanol, é possível liberar coprodutos que ocorrem na produção de etanol, a saber bagaço de maça, ou seja resíduos de grão secos e componentes não dissolvidos, ou vinhoto seco (dried distiller’s grains with solubles - DDGS) de fumonisinas ou micotoxinas, particularmente em ambiente oxigênio-independente.

[00027] A invenção tem também como finalidade prover um aditivo para a degradação enzimática de fumonisinas, pelo qual é possível degradar ou desintoxicar de forma segura e confiável, tais micotoxinas, em um ambiente oxigênio-independente.

[00028] Para solucionar essas tarefas, um aditivo deste tipo é caracterizado pelo fato de ele conter pelo menos uma enzima das SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 assim como opcionalmente, também, pelo menos um cossubstrato para pelo menos uma ou várias das enzimas usadas, em um portador inerte.

[00029] Tal aditivo contém pelo menos uma enzima ou um organismo hospedeiro recombinante completo para a expressão de dita enzima assim como opcionalmente, também, pelo menos um cossubstrato para pelo menos uma ou várias das enzimas usadas, e um portador inerte, destaca-se pelo fato de ele degradar seletivamente, e portanto, de desintoxicar micotoxinas, especialmente fumonisinas. O uso de um aditivo de acordo com a invenção que consiste basicamente em enzimas isoladas assim como, opcionalmente, de seus cossubstratos e portadores, oferece a vantagem de este último manter suas atividades catalíticas em um ambiente e sob condições nos quais, por exemplo, microrganismos completos não seriam ativos ou dificilmente seriam ativos, sendo que, ao mesmo tempo, pode ser obtida uma atividade específica significativamente mais elevada e a catalisação de reações definidas com o impedimento de reações secundárias indesejadas.

[00030] Além disso, problemas causados de acordo com o estado da técnica em matérias-primas agrícolas pelo uso de germes reproduzíveis são seguramente evitados, e aditivos contendo meramente enzimas isoladas apresentam além disso uma aptidão de formulação melhorada para uma ativação seletiva e controlada, isto é, por exemplo, em um local particular do trato digestivo, assim como o fato de impedir um consumo elevado, indesejado de substrato. Para aumentar ainda mais esta especificidade, o aditivo de acordo com a invenção é preferivelmente desenvolvido ainda para que enzimas modificadas por métodos de genética molecular, mutagênese ou evolução molecular sejam utilizadas.

[00031] De acordo com um outro aperfeiçoamento preferido, o aditivo é projetado de tal forma que seja usada uma enzima, que compreenda pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima contendo SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ou 25. Ao ser utilizada uma enzima que compreende pelo menos 90% de identidade de sequência com uma enzima que apresenta SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 ou 25, é possível degradar com segurança e confiabilidade em ambiente oxigênio-independente ainda outras micotoxinas além das fumonisinas a serem preferivelmente, permitindo assim a desintoxicação extensiva das fuminisinas presentes, por exemplo, em produtos brutos vegetais.

[00032] Ao projetar o aditivo de forma que sejam usadas as enzimas, enzimas modificadas e/ou pelo menos 90% de enzimas idênticas revestidas com um revestimento protetor, tal como corresponde a um aperfeiçoamento preferido da invenção, é possível assegurar que as enzimas, as enzimas em pelo menos 90% idênticas e enzimas modificadas sejam protegidas contra qualquer perda prematura de atividade e desenvolvam de forma segura e confiável sua ação no local pretendido, por exemplo, no trato gastrointestinal.

[00033] Na medida em que o aditivo é preferivelmente aperfeiçoado de forma que as enzimas sejam selecionadas de carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, tricarbalilato desidrogenase de SEQ ID NO: 11, proteína de utilização de citrato de SEQ ID NO: 13, álcool desidrogenase de SEQ ID NO: 17, aminotransferase de SEQ ID NO: 19 e/ou de SEQ ID NO: 25, e/ou acetolactato sintase de SEQ ID NO: 23, são empregadas substancialmente as enzimas qualificadas para catabolismo de substrato de forma a assegurar, além de uma quantidade reduzida de enzimas a ser aplicada, que nenhuma reação secundária indesejada ocorrerá ao serem utilizadas tais enzimas.

[00034] De acordo com um outro aperfeiçoamento preferido da invenção, o aditivo é projetado de forma que ele contenha uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, uma aminotransferase de SEQ ID NO: 19 ou de SEQ ID NO: 25, um ácido α-ceto como um cossubstrato e um portador inerte. Através do aditivo contendo uma carboxilesterase, uma aminotransferase, um ácido α-ceto como um cossubstrato, além de um portador inerte, é particularmente possível hidrolisar inicialmente fuminisinas presentes em alimentos mediante clivagem de resíduos de ácido tricarbalílico à partir das fumonisinas utilizando carboxilesterase, e reagir ainda em seguida a fumonisina assim hidrolisada sob a ação da aminotransferase e ácido α-ceto como um cossubstrato, preferivelmente ácido pirúvico no presente caso, mediante substituição de um grupo ceto por um grupo amino da molécula de fumonisina hidrolisada para formar uma fumonisina 2- ceto-hidrolisada, que é totalmente inofensiva por exemplo para mamíferos e pode ser excretada inalterada, e alanina como um produto secundário, que também não exerce ou apresenta quaisquer efeitos negativos, por exemplo, em organismos.

[00035] De acordo com um aperfeiçoamento preferido da invenção, o aditivo é ainda desenvolvido de forma que ele contenha uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, pelo menos um adsorvente como um mineral argiloso assim como, opcionalmente, um portador inerte. Mas ao utilizar uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9 e pelo menos um adsorvente, a desintoxicação das fumonisinas também pode ser feita de forma que apenas resíduos de ácido tricarbalílico são clivados e a fumonsina assim formada, hidrolisada é adsorvida em dito adsorvente. Através da clivagem dos resíduos de ácido tricarbalílico com auxílio de carboxilesterase, é formada uma molécula de cadeia substancialmente longa, que pode ser prontamente adsorvida de forma a assegurar a desintoxicação completa meramente pelo uso selecionado de uma única enzima, particularmente, pela degradação oxigênio-independente de fumonisina e subsequente adsorção.

[00036] Na medida em que, de acordo com um outro aperfeiçoamento da invenção, o aditivo é usado em um meio oxigênio- independente durante a produção de bioetanol, particularmente junto com um mosto ou um material de partida vegetal, sendo selecionado o aditivo de tal forma que as enzimas presentes ali sejam completamente derivadas de bactéria, que catalisam o catabolismo de fumonisinas via uma degradação altamente específica, é possível usar o mesmo com elevada especificidade, atividade e eficiência de forma a permitir que o aditivo também seja usado tecnologicamente em um ambiente oxigênio-independente.

[00037] Finalmente, a presente invenção refere-se ao uso de genes conforme representado nas sequências, ou de organismos hospedeiros recombinantes completes para a expressão de sequências gênicas que apresentam SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 assim como, opcionalmente, de cossubstratos para produzir um aditivo para a degradação de fumonisinas, no processamento ou uso de matérias-primas vegetais. Um aditivo produzido desta forma permite a degradação confiável e completa de fumonisinas, particularmente em ambiente oxigênio-independente.

[00038] Preferivelmente, um cossubstrato selecionado do grupo consistindo em uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, uma aminotransferase de SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 25, ou um ácido α-ceto, e um carreador inerte são usados de acordo com a invenção, cujo uso permite a degradação segura e confiável formando componentes inofensivos do total de fumonisinas em, por exemplo, matérias-primas vegetais ou materiais de partida.

[00039] Um uso preferido é caracterizado pelo fato de serem usados uma carboxilesterase, pelo menos um adsorvente, particularmente mineral argiloso, assim como, opcionalmente, um carreador inerte. Ao se utilizar uma carboxilesterase e pelo menos um adsorvente, é possível desintoxicar de forma segura e confiável fumonisinas pelo mero uso de uma única enzima sendo que os resíduos secundários de ácido tricarbalílico são clivados a partir da fumonisina, ou pelo auxílio de dita enzima e a fumonisina hidrolisada de cadeia longa assim formada é em seguida adsorvida no adsorvente, tornando a toxina inofensiva de forma segura e confiável.

[00040] De acordo com um uso preferido, o aditivo de acordo com a invenção é usado para o tratamento oxigênio-independente ou anaeróbico de um material de partida vegetal ou um mosto na produção de bioetanol. Neste caso, é possível tornar as micotoxinas presentes no material de partida vegetal inofensivas de modo seguro e confiável durante a produção de bioetanol em um ambiente oxigênio- independente de forma a permitir em seguida o uso dos resíduos derivados da produção de etanol, a saber o bagaço de maça ou vinhotos secos, diretamente ou após secagem e peletização sem outro processamento e, particularmente, desintoxicação como ração isenta de fumonisinas.

[00041] A seguir, a invenção será esclarecida mais detalhadamente por meio de concretizações a título de exemplo e de figuras, onde: a figura 1 mostra o cluster gênico fumonisina-catabólico; a figura 2 ilustra a curva de Michaelis-Menten para fumonisina carboxilesterase FumD; a figura 3 mostra a curva de degradação de fumonisina hidrolisada B1; a figura 4 ilustra a conversão de fumonisina FB1 em fumonisina fumonisin HFB1 hidrolisada após a adição de carboxilesterase de SEQ ID NO: 9; e a figura 5 ilustra a degradação de fumonisina hidrolisada HFB1 pela adição de aminotransferase de SEQ ID NO: 19.

[00042] A figura 1 mostra um cluster gênico fumonisina-catabólico como uma sequência parcial de 15420 pares base de uma cepa microbiana que apresenta o número de acesso DSM 16254. No cluster fum-gene da cepa procariótica DSM 16254, a transcrição da fase aberta de leitura é controlada por um promotor bidirecional localizado entre fumA e fumI. O cluster codifica proteínas envolvidas na regulação da expressão gênica, como por exemplo, FumB e FumC, na recognição do substrato e seu transporte, como por exemplo, FumA, FumJ, FumG, e no catabolismo de um substrato, como por exemplo FumD, FumE, FumF, FumH, FumI e FumK.

Exemplos Exemplo 1: a cinética enzimática de fumonisina carboxilesterase

[00043] O fumD gene (SEQ ID NO: 8), que codifica uma fumonisina carboxilesterase, foi clonado e expressado em Pichia pastoris utilizando procedimentos padrões. A enzima his-marcada foi recuperada e purificada a partir da solução de cultura sobrenadante por cromatografia de afinidade. A concentração de enzimas foi determinada e os parâmetros de cinética enzimática forma determinados com sete diferentes concentrações de substrato na faixa de 50 μg a 25 mg FB1 por litro e uma concentração de enzima de 0,33 ng/ml. As reações foram tamponadas em um tampão de 20 mM Tris-Cl (pH 8,0) com 0,1 mg/ml de albumina de soro bovino e incubadas a 30°C. Foram retiradas amostras após 0, 30, 60, 120 e 240 minutos de incubação e analisadas pelo método HPLC-MS/MS. Fumonisina B1 (FB1) e fumonisina B1 hidrolisada foram quantificadas, baseada em uma calibração com as substâncias de referência purificadas e um padrão FB1 interno marcado com 13C.

[00044] A figura 2 ilustra a curva de Michaelis-Menten para a hidrólise de fumonisina B1 (FB1) pela fumonisina carboxilesterase FumD, que foi determinada em uma concentração enzimática de 0,33 ng/ml no tampão Tris-Cl (pH 8,0), com velocidades enzimáticas iniciais que foram colocadas contra as concentrações de substrato. A curva de Michaelis-Menten mostra uma queda em concentrações de substrato mais elevadas, já que a velocidade enzimática foi calculada com base no produto, ou seja, na formação de FB1 hidrolisado. Visto que a FB1 hidrolisada é formada a partir de uma reação de duas etapas através de FB1 parcialmente hidrolisada, porém, com uma cadeia lateral de ácido tricarbalílico que foi retida e uma cadeia lateral que foi clivada, a formação do produto final foi protelada a elevadas concentrações de substrato. A constante de Michaelis-Menten KM foi calculada como 0,90 μmol/l, que foi equivalente a 650 ppb, e a taxa de conversão foi 900 por segundo.

[00045] Consta da figura 2 que fumonisinas podem ser hidrolisadas completa e rapidamente com a carboxilesterase nas faixas de concentração relevantes.

Exemplo 2: a atividade catalítica de HFB1 (fumonisina hidrolisada B1) aminotransferase.

[00046] SEQ ID NOs: 18 e 24 foram clonadas utilizando-se procedimentos padrões e expressas em E. coli sob o controle de um promotor do bacteriofago T7. As células bacterianas foram coletadas, ressuspensas em tampão fosfato de sódio 50 mM e lisadas sob ação ultrassônica. A fumonisina hidrolisada foi adicionada e as amostras foram incubadas sob 25°C. Amostras foram retiradas em intervalos e analisadas pelo método HPLC-MS/MS. Não foi observada redução da concentração de FB1 hidrolisada. Ao ser adicionado um cossubstrato tal como por exemplo um ácido α-ceto como por exemplo ácido pirúvico, ou oxalacetato, à reação, verificou-se uma completa degradação da fumonisina hidrolisada formando 2-ceto-HFB1 conforme ilustrado na figura 3. Esta substância é totalmente inofensiva para mamíferos.

Exemplo 3: atividade enzimática no ambiente intestinal

[00047] Para examinar a atividade enzimática da FUM- carboxilesterase no trato digestivo, tripas de porco recentemente abatidas foram usadas e transportadas para o laboratório sob exclusão de oxigênio e examinadas em uma bancada anaerobicamente esterilizada. Peças do duodeno de aproximadamente 10 cm de comprimento e jejuno presas e cortadas. A Fumonisina B1, diluída para uma concentração final de aproximadamente 10 ppm em uma solução aquosa concentrada foi injetada por agulhas e misturadas com conteúdo de intestino. Em seguida, foi injetada e incorporada 5 μg de fumonisina carboxilesterase em uma solução aquosa, ou o mesmo volume de água nos controles negativos. As seções intestinais foram incubadas a 39°C. Amostras foram retiradas com auxílio de agulhas e analisadas pelo método HPLC-MS/MS. Verificou-se que no intervalo da primeira amostragem após duas horas, a fumonisina B1 já havia sido totalmente hidrolisada no duodeno e jejuno.

Exemplo 4: determinação da faixa de temperatura da atividade de fumonisina carboxilesterase.

[00048] Para determinar a faixa de temperatura na qual fumonisina carboxilesterase é ativa, 1,6 ng/ml de FUM-carboxilesterase em tampão 20 mM Tris-Cl, pH 7,0, foi incubado com 0,1 mg/ml de BSA e 10 ppm de fumonisina B1 a diferentes temperaturas. Verificou-se que a temperatura ideal para a enzima foi 30°C. A atividade enzimática foi ainda determinada a 40°C e mesmo a 50°C. FUM-carboxilesterase é, portanto, adequada para aplicação sob as condições de temperatura prevalecentes no trato digestivo, ou no curso de etapas de processo na produção de alimentos e rações, que ocorrem sob elevadas temperaturas.

Exemplo 5: determinação da faixa de pH da atividade de fumonisina carboxilesterase.

[00049] Para determinar a faixa de pH na qual a fumonisina carboxilesterase é ativa, foi utilizado tampão Teorell-Stenhagen. Este tampão pode ser ajustado a uma faixa de 10 pH unidades com a mesma capacidade de tampão pela combinação de citrato, fosfato e borato. FUM-carboxilesterase foi incubada neste tampão com 10 ppm de fumonisina B1 a diferentes valores de pH e 25°C, a uma temperatura de 3,3 ng/ml. A atividade máxima foi mostrada a pH 8,0, podendo ser ainda determinada atividade em toda a faixa de pH 5 a pH 10. Esta atividade dentro desta ampla faixa de pH permitiu a aplicação tecnológica da enzima como um aditivo de ração ou no curso de processamento de alimento ou ração.

Exemplo 6: teste de alimentação com leitões

[00050] O teste foi realizado em um estábulo de teste com 12 baias para 10 animais respectivamente. O estábulo foi equipado com um piso de ripas, gamelas e sistema de alimentação assistido por computador. As unidades automáticas foram dispostas ao longo das paredes. Todo dia, o clima era automaticamente registrado, e a temperatura ajustada de acordo com as recomendações padrões para criação de leitões.

[00051] Para este teste, foram usados 120 leitões desmamados de sexo misturado (idade: aproximadamente. 4 semanas, peso médio de ajuste: 8.21 kg). Cada leitão foi marcado e individualmente pesado. Os 120 leitões foram randomicamente distribuídos entre 12 baias. Todos os leitões vieram do Programa de Criação Australiano OHYB (= (edelschwein x landrasse) x Pietrain).

[00052] Imediatamente após os desmame, os leitões foram alimentados com uma ração de amido por dois dias, após este período de adaptação foi feita a mudança para a ração de teste. A alimentação foi feita em duas fases: 1-14 dias da fase de desmame, 15-42 dias da fase de alimentação com ração. A ração de teste foi misturada individualmente por baia via a instalação de alimentação “spotmix” e distribuída na forma seca duas vezes ao dia como uma função do número de leitões, desenvolvimento de peso e consumo de ração. Água estava disponível ad libitum. As 12 baias foram divididas em quatro diferentes grupos de aplicação a cada três repetições e obtidas as seguintes co-misturas na reação acima descrita:

[00053] Problemas respiratórios foram observados no controle positivo com praticamente a metade dos animais, tendo ocorrido também um abandono. Todos os outros grupos pareceram saudáveis. Dados de desempenho

Exemplo 7: degradação enzimática de fumonisinas em mosto de bioetanol

[00054] Amostras de mosto de milho para a produção de bioetanol foram retiradas e incubadas a 30 a 65°C sob agitação, a degradação de fumonisina B1 foi investigada após a adição de 770 unidades de carboxilesterase de SEQ ID NO: 9 por metro cúbico de mosto sob agitação (tempo de agitação em minutos). Amostras foram inativadas por ebulição após terem sido retiradas e seguida centrifugadas para análise, e uma alíquota do sobrenadante foi evaporada. O resíduo foi retirado em tampão de amostra de 200 μl contendo padrão de fumonisina interno marcado com C13, agitados por 1,5 minutos, removido por centrifugação, e em seguida submetido a análise LC-MS. Disso resulta que conforme ilustrado na figura 4, a fumonisina FB1 é completamente convertida em fumonisina hidrolisada HFB1. Após a adição de aminotransferase de SEQ ID NO: 19, a fumonisina hidrolisada HFB1 é completamente degradada formando componentes inofensivos conforme ilustrado na figura 5.

Exemplo 8: degradação de fumonisinas e seus derivados em mosto de fajita e mosto de flocos de milho.

[00055] A atividade das enzimas de ação degradadora de fumonisina foi examinada em amostras de mosto de milho (corn grits) para a produção de fajitas e flocos de milho. Milho contaminado com fumonisina (aproximadamente 1 ppm) foi moído formando farinha de milho, misturado com água e fervido. Para a produção de tortillas, o mosto de milho resfriado à aproximadamente, 50 a 60°C, foi suplementado com uma mistura de proteinases em solução alcalina. Após 30 a 180 minutos, quando o pH caiu abaixo de 9, preferivelmente abaixo de 8, uma mistura de carboxilesterase e aminotransferase (500 - 1000 U/m3 cada) foi adicionada e incubada por mais 30 a 60 minutos. Com relação à produção de flocos de milho, um mosto de milho moído e malte de cevada foi fervido em um recipiente de pressão por aproximadamente uma hora; após resfriamento abaixo de 60°C (preferivelmente 50°C), uma mistura enzimática compreendendo carboxilesterase e aminotransferase (500 - 1000 U/m3 cada) foi adicionada e incubada por mais 30 a 60 minutos. Amostras foram retiradas desta mistura e examinadas para resíduos FB1 e HFB1 conforme no exemplo 7. Níveis de HFB1 estavam abaixo de 80 ppb em todas as amostras, a HFB1 feita de FB1 aparentemente continuou reagindo. Os valores medidos para FB1 estão indicados na tabela abaixo. Tabela: degradação enzimática de FB1 e HFB1 em mosto de milho; concentração de fumonisina em ppb (μg/kg)

Claims (13)

1. Método para produção de aditivo para a degradação enzimática de fumonisinas em matérias-primas vegetais ou misturas contendo matérias-primas vegetais, caracterizado pelo fato de que é fornecida uma sequência de ácido nucleico de genes correspondentes a SEQ ID NO: 8 e 18, as sequência de ácido nucleico são expressas em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, e uma enzima assim preparada correspondente a SEQ ID NO: 9, apresentando atividade de degradação de micotoxinas e SEQ ID NO: 19 apresentando atividade de degradação de micotoxinas, opcionalmente com um cossubstrato, são usados em uma matéria-prima vegetal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as fumonisinas são degradadas de um modo independente de oxigênio.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as enzimas são isoladas.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as enzimas são carboxilesterase de SEQ ID NO: 9 e aminotransferase de SEQ ID NO: 19.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que ao usar uma aminotransferase de SEQ ID NO: 19, uma cetona, particularmente um ácido α-ceto, é usado como um cossubstrato.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que ao usar carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, pelo menos um adsorvente selecionado de minerais argilosos, é adicionalmente usado.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o aditivo é usado em um material de partida vegetal a ser fermentado ou em um mosto para a produção de bioetanol.

8. Aditivo para degradação enzimática de fumonisinas em matérias-primas vegetais ou misturas contendo matérias-primas vegetais, caracterizado pelo fato de que contém uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, e opcionalmente contém uma aminotransferase de SEQ ID NO: 19, um ácido α-ceto como um cossubstrato e um carreador inerte.

9. Aditivo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que contém uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, pelo menos um adsorvente, particularmente pelo menos um mineral argiloso, assim como, opcionalmente um carreador inerte.

10. Aditivo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o aditivo é usado em um ambiente independente de oxigênio durante a produção de bioetanol junto com um mosto ou um material de partida vegetal.

11. Uso de genes correspondentes a uma sequência de SEQ ID NO: 8 ou 18, caracterizado pelo fato de que é para a expressão de genes recombinantes para a produção de um aditivo para a degradação de fumonisinas em uma matéria-prima vegetal, em que o aditivo compreende uma carboxilesterase de SEQ ID NO: 9, e opcionalmente uma aminotransferase de SEQ ID NO: 19, e um ácido α-ceto como um cossubstrato, e um carreador inerte.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que são usados uma carboxilesterase, pelo menos um adsorvente, particularmente mineral argiloso, assim como opcionalmente um carreador inerte.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que é para o tratamento independente de oxigênio de um material de partida vegetal ou um mosto na produção de bioetanol.

Images