BRPI0919881B1 - Proteína de arcabouço e seu método de geração, biblioteca e seu método de construção, molécula de ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, célula hospedeira, composição, dispositivo médico e artigo de fabricação - Google Patents

Abstract

composições, métodos e usos para arcabouço com base no domínio fibronectina tipo iii. a presente invenção refer-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência de consenso de proteínas de fibronectina tipo iii (fn3), como a décima repetição fn3 da fibronectina humana (tenascina humana), incluindo ácidos nucleicos isolados que codificam um arcabouço de proteína, vetores, células hospedeiras e métodos para fabricação e uso do mesmo, com aplicações em composições, métodos e dispositivos diagnósticos e/ou terapêuticos. em particular, as moléculas do arcabouço de proteína que se ligam a lgg foram identificados como úteis para aplicações diagnósticas e/ou terapêuticas

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a arcabouços de proteína com propriedades inovadoras, inclusive a capacidade de ligar-se a alvos celulares. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um arcabouço de proteína com base em uma sequência consenso de uma repetição da fibronectina tipo III (FN3).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os anticorpos monoclonais são a classe mais amplamente usada de proteínas terapêuticas quando são desejadas alta afinidade e especificidade para uma molécula-alvo. Entretanto, proteínas não- anticorpo que possam ser engenheiradas para ligar-se a esses alvos também são de alto interesse na indústria biofarmacêutica. Essas proteínas de "arcabouço alternativo" podem apresentar vantagens sobre anticorpos tradicionais, devido a seu pequeno tamanho, falta de ligações dissulfeto, alta estabilidade e capacidade de serem expressas em hospedeiros procarióticos. Métodos de purificação inovadores são prontamente aplicados e as mesmas são facilmente conjugadas a fármacos/toxinas, penetram com eficácia nos tecidos e são prontamente formatadas em ligantes multiespecíficos (Skerra 2000, Binz e Pluckthun 2005).

[0003] Um desses arcabouços alternativos é a dobra de imunoglobulina (Ig). Essa dobra é encontrada nas regiões variáveis dos anticorpos, bem como milhares de proteínas não-anticorpo. Demonstrou-se que uma proteína Ig desse tipo, a décima repetição de fibronectina tipo III (FN3) obtida de fibronectina humana, pode tolerar inúmeras mutações em laços expostos na superfície, ao mesmo tempo em que retém a estrutura geral da dobra de Ig. Dessa forma, bibliotecas de variantes de aminoácido foram integradas a esses laços e ligantes específicos selecionados para um certo número de alvos diferentes (Koide et al. 1998, Karatan et al. 2004). Descobriu-se, também, que esses domínios FN3 se ligam aos alvos com um grau muito alto de afinidade, ao mesmo tempo em que retêm importantes propriedades biofísicas (Parker et al. 2005).

[0004] As propriedades físicas desejáveis de potenciais moléculas de arcabouço alternativo incluem alta estabilidade térmica e reversibilidade de dobragem e desdobragem térmica. Vários métodos têm sido aplicados para aumentar a estabilidade térmica aparente das proteínas e enzimas, inclusive design racional baseado em comparação a sequências termoestáveis altamente similares, design de pontes de dissulfeto estabilizantes, mutações para aumentar a propensão a a-hélices, engenharia de pontes de sal, alteração da carga de superfície da proteína, evolução dirigida e composição de sequências consenso (Lehmann e Wyss 2001). A alta estabilidade térmica é uma propriedade desejada desses arcabouços, já que pode aumentar o rendimento da proteína recombinante obtida, otimizar a solubilidade da molécula purificada, otimizar a atividade dos arcabouços intracelulares, diminuir a imunogenicidade, e minimizar a necessidade por uma cadeia fria na fabricação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0005] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteína baseado em uma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), ácidos nucleicos codificantes ou complementares, vetores, células hospedeiras, composições, combinações, formulações, dispositivos e métodos para fabricação e uso do mesmo. Em uma modalidade preferencial, o arcabouço de proteína é compreendido por uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 obtidos de Tenascina- C humana (deste ponto em diante do presente documento "Tenascina"). Em uma outra modalidade preferencial, o arcabouço de proteína da presente invenção é uma sequência consenso de 15 domínios FN3. Os arcabouços de proteína da invenção pode ser projetados para ligar várias moléculas, por exemplo uma proteína-alvo celular.

[0006] Os arcabouços de proteína da invenção podem incluir moléculas ou porções adicionais, por exemplo, a região Fc de um anticorpo, um domínio de ligação a albumina, ou outra porção que influencie a meia-vida. Em modalidades adicionais, os arcabouços de proteína da invenção podem ser ligados a uma molécula de ácido nucleico que possa codificar o arcabouço de proteína.

[0007] A presente invenção apresenta, também, pelo menos um método para expressão pelo menos um arcabouço de proteína baseado em uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3, em uma célula hospedeira, compreendendo cultivar a célula hospedeira conforme descrito na presente invenção, sob condições nas quais pelo menos um arcabouço de proteína seja expresso em quantidades detectáveis e/ou recuperáveis.

[0008] A presente invenção apresenta, também, pelo menos uma composição compreendendo: (a) um arcabouço de proteína baseado em uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e/ou ácido nucleico codificante conforme descrito na presente invenção, e (b) um veículo ou diluente adequado e/ou farmaceuticamente aceitável.

[0009] A presente invenção compreende, adicionalmente, um método para geração de bibliotecas de um arcabouço de proteína baseado em uma proteína de repetição da fibronectina tipo III (FN3), de preferência uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 e, com mais preferência, uma sequência consenso de múltiplos domínios FN3 de Tenascina humana. A biblioteca é formada mediante a produção de sucessivas gerações de arcabouços, alterando-se (por mutação) os aminoácidos ou o número de aminoácidos nas moléculas, em posições específicas nas porções do arcabouço, por exemplo nas regiões de laço. As bibliotecas podem ser geradas pela alteração da composição de aminoácido de um único laço, ou pela alteração simultânea de múltiplos laços ou posições adicionais da molécula de arcabouço. Os laços que são alterados podem ser alongados ou encurtados de acordo com a necessidade. Essas bibliotecas podem ser geradas para incluir, em cada posição, todos os aminoácidos possíveis ou um determinado subconjunto de aminoácidos. Os elementos da biblioteca podem ser usados para triagem por exibição, como por exibição in vitro (exibição de DNA, RNA, ribossoma, etc.), bem como exibição de levedura, bactéria e fago.

[00010] Os arcabouços de proteína da presente invenção oferecem propriedades biofísicas otimizadas, como estabilidade sob condições redutoras e solubilidade em altas concentrações, podendo ser expressos e dobrados em sistemas procarióticos como E. coli, em sistemas eucarióticos como levedura, e em sistemas de transcrição/translação in vitro como o sistema de lisado de reticulócitos de coelho.

[00011] Em um aspecto adicional, a presente invenção apresenta um método para geração de uma molécula de arcabouço que se liga a um alvo específico percorrendo a biblioteca de arcabouços da invenção com os ligantes de alvo e detecção. Em outros aspectos relacionados, a invenção compreende métodos de triagem que podem ser usados para gerar ou amadurecer por afinidade os arcabouços de proteína com a atividade desejada, por exemplo, capazes de ligação a proteínas-alvo com uma certa afinidade. A maturação por afinidade pode ser obtida mediante ciclos iterativos de mutagênese e seleção, usando sistemas como exibição de fago ou exibição in vitro. A mutagênese durante esse processo pode ser o resultado de mutagênese direcionada pelo sítio a resíduos de arcabouço específicos, mutagênese aleatória devida a PCR propenso a erro, embaralhamento de DNA e/ou uma combinações dessas técnicas. A presente invenção apresenta, adicionalmente, qualquer invenção aqui descrita.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00012] Figura 1 Análise SDS-PAGE de Tencon purificada, realizada em um gel NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) e corado com azul de coomassie. N corresponde a condições nativas e R a condições reduzidas.

[00013] Figura 2 Análise por dicroísmo circular de Tencon em PBS.

[00014] Figura 3 Análise por calorimetria de varredura diferencial (DSC) do 3° domínio FN3 obtido de Tenascina e Tencon em PBS. Foram obtidas as temperaturas de fusão de 54°C e 78°C, respectivamente.

[00015] Figura 4 Design de plasmídio fagomídio de pTencon-pIX. A expressão é conduzida por um promotor Lac e a secreção através da sequência de sinais OmpA.

[00016] Figura 5 Exibição de Myc-Tencon em fago M13. Resultados de ELISA mostrando a ligação do fago a cavidades revestidas com α- Myc, revestidas com CNTO95 e não-revestidas.

[00017] Figura 6 Estrutura de laço do 3° domínio FN3 da Tenascina humana.

[00018] Figura 7 Triagem da produção de seleções de IgG por ELISA. Os clones individuais foram testados quanto à ligação a IgG biotinilada ou HSA biotinilado como controle.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[00019] A presente invenção apresenta um arcabouço de proteína isolado, recombinante e/ou sintético baseado em uma sequência consenso de proteína de repetição de fibronectina tipo III (FN3) incluindo, sem limitação, arcabouço derivado de mamífero, bem como composições e moléculas de ácido nucleico codificantes compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína codificante de polinucleotídeos, baseado na sequência FN3 de consenso. A presente invenção inclui adicionalmente, mas não se limita a, métodos para fabricação e uso desses ácidos nucleicos e arcabouços de proteína, inclusive composições, métodos e dispositivos diagnósticos e terapêuticos.

[00020] Os arcabouços de proteína da presente invenção oferecem vantagens sobre a terapêutica convencional, como a capacidade de administração local, oral ou através da barreira sangue-cérebro, a capacidade de expressão em E. Coli, que permite um aumento na expressão de proteína como uma função dos recursos versus expressão das células de mamífero, a capacidade de ser engenheirada em moléculas bi-específicas que se ligam a múltiplos alvos ou múltiplos epítopos do mesmo alvo, a capacidade para conjugação a fármacos, polímeros e sondas, a capacidade de ser formulado em altas concentrações, e a capacidade dessas moléculas para penetrar de maneira eficaz os tecidos doentes e os tumores.

[00021] Além do mais, os arcabouços de proteína apresentam muitas das propriedades dos anticorpos em relação à sua dobragem, que imita a região variável de um anticorpo. Essa orientação permite que os laços de FN3 sejam expostos de modo similar ao das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo. Os mesmos precisam ser capazes de ligar-se a alvos celulares, e os laços podem ser alterados, por exemplo maturados por afinidade, para otimizar certas propriedades de ligação ou propriedades relacionadas.

[00022] Três dos seis laços do arcabouço de proteínas da invenção correspondem topologicamente às regiões determinantes de complementaridade (CDRs de 1 a 3), isto é, as regiões de ligação a antígeno de um anticorpo, enquanto os três laços restantes são expostos na superfície de maneira similar às CDRs de anticorpos. Esses laços abrangem os resíduos 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 da SEQ. ID NO:16 ou em torno dos mesmos, conforme mostrado na Tabela 3, abaixo, e na figura 6. De preferência, as regiões de laço nos resíduos 22-28, 51-54 e 75-81, ou em redor dos mesmos, são alteradas para especificidade e afinidade de ligação. Uma ou mais dentre essas regiões de laço são selecionadas aleatoriamente com outras regiões de laço e/ou outros filamentos mantendo sua sequência como porções de cadeia principal para povoar uma biblioteca, e ligantes potentes podem ser selecionados a partir da biblioteca tendo alta afinidade por uma proteína-alvo específica. Uma ou mais das regiões de laço podem interagir com uma proteína-alvo, de modo similar a uma interação de CDR de anticorpo com a proteína.

[00023] Os arcabouços da presente invenção podem incorporar outras subunidades, por exemplo, via interação covalente. O todo ou uma porção de uma região constante de um anticorpo pode ser ligado ao arcabouço para conferir ao mesmo propriedades similares às de um anticorpo, por exemplo atividade de complemento (ADCC), meia- vida, etc. Por exemplo, a função efetora pode ser oferecida e/ou controlada, por exemplo, modificando-se a ligação C1q e/ou a ligação FCYR e, desse modo, alterando-se a atividade de CDC e/ou de ADCC. As "funções efetoras" são responsáveis pela ativação ou diminuição de uma atividade biológica (por exemplo, em um indivíduo). Os exemplos de funções efetoras incluem, mas não se limitam a: ligação C1q, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células e dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, regulação para baixo de receptores na superfície celular (por exemplo, receptor para célula B, BCR), etc. Essas funções efetoras podem requerer que a região Fc seja combinada a um domínio de ligação (por exemplo, laços do arcabouço de proteína) e podem ser avaliadas com o uso de vários testes (por exemplo, testes de ligação de Fc, testes de ADCC, testes de CDC, etc.).

[00024] Adicionalmente, moléculas de um conjugado de toxinas, de albumina, de ligantes de albumina ou de polietileno glicol (PEG) podem ser ligadas à molécula de arcabouço para obtenção de propriedades desejadas. Qualquer dessas fusões pode ser gerada por meio de técnicas-padrão, por exemplo mediante expressão da proteína de fusão a partir de um gene de fusão recombinante construído com o uso de sequências gênicas publicamente disponíveis.

[00025] Os arcabouços da presente invenção podem ser usados como monoespecíficos sob forma monomérica, ou como bi ou multi- específicos (para diferentes proteínas-alvo ou diferentes epítopos na mesma proteína-alvo) sob forma multimérica. As ligações podem ser covalentes ou não-covalentes. Por exemplo, um arcabouço biespecífico dimérico tem uma subunidade com especificidade para uma primeira proteína-alvo ou epítopo e uma segunda subunidade com especificidade para uma segunda proteína-alvo ou epítopo. As subunidades do arcabouço podem estar unidas em uma variedade de conformações que podem aumentar a valência e, portanto, a avidez da ligação a antígeno.

[00026] Para uso na presente invenção, um "anticorpo" inclui qualquer molécula contendo proteína ou peptídeo que compreenda pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve, ou um porção de ligação do ligando da mesma, uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou de cadeia leve, uma região de estrutura, ou qualquer porção das mesmas. Esse anticorpo opcionalmente afeta, ainda, um ligando específico incluindo, mas não se limitando a, os casos em que o anticorpo modula, diminui, aumenta, antagoniza, agoniza, mitiga, alivia, bloqueia, inibe, anula e/ou interfere com pelo menos uma atividade ou ligação, ou com a atividade ou ligação do receptor, in vitro, in situ e/ou in vivo.

[00027] O termo "anticorpo" se destina, adicionalmente, a abranger anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas e suas variantes, incluindo, sem limitação, mimetismo de anticorpo ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou a função de um anticorpo ou fragmento especificado ou porção do mesmo, incluindo, sem limitação, anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único e fragmentos dos mesmos. Os fragmentos funcionais incluem fragmentos de ligação a antígeno que se ligam a um alvo específico. Por exemplo, fragmentos de anticorpo capazes de ligação a um alvo específico ou porções do mesmo, incluindo, mas não se limitando a, fragmentos Fab (por exemplo, mediante digestão por papaína), Fab' (por exemplo, mediante digestão por pepsina e redução parcial) e F(ab’)2 (por exemplo, mediante digestão por pepsina), facb (por exemplo, mediante digestão por plasmina), pFc’ (por exemplo, mediante digestão por pepsina ou por plasmina), Fd (por exemplo, mediante digestão por pepsina, redução parcial e reagregação), Fv ou scFv (por exemplo, mediante técnicas de biologia molecular), estão abrangidos pela invenção (consulte, por exemplo, Colligan, Immunology, supracitado).

[00028] Tais fragmentos podem ser produzidos por clivagem enzimática, técnicas sintéticas ou recombinantes, conforme conhecido na técnica e/ou conforme descrito na presente invenção. Os anticorpos podem também ser produzidos em uma variedade de formas truncadas com o uso de genes de anticorpo nos quais um ou mais códons de parada foram introduzidos a montante do sítio de parada natural. Por exemplo, um gene de combinação que codifica uma porção de cadeia pesada F(ab')2 pode ser projetado para incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e/ou a região de articulação da cadeia pesada. As várias porções de anticorpos podem ser unidas quimicamente por técnicas convencionais, ou podem ser preparadas como uma proteína contígua com o uso de técnicas de engenharia genética.

[00029] Uma proteína de arcabouço da presente invenção pode ser usada para medir ou obter um efeito em uma célula, tecido, órgão ou animal (inclusive mamíferos e seres humanos), para diagnosticar, monitorar, modular, tratar, aliviar, ajudar a prevenir a incidência de, ou reduzir os sintomas de, pelo menos uma doença ou condição selecionada de, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre transtorno ou doença imunológico, transtorno ou doença cardiovascular, transtorno ou doença infeccioso, maligno e/ou neurológico, ou outra condição relacionada conhecida ou especificada.

[00030] Esse tipo de método pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma proteína de arcabouço a uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento, alívio, prevenção ou redução nos sintomas, efeitos ou mecanismos. A quantidade eficaz pode compreender de cerca de 0,001 a 500 mg/kg por administração única (por exemplo, bolo), múltipla ou contínua, ou o suficiente para atingir uma concentração sérica de 0,01 a 5.000 μg/ml por administração única, múltipla ou contínua, ou qualquer faixa ou valor eficaz nesse intervalo, conforme realizado e determinado mediante o uso de métodos conhecidos, conforme descrito na presente invenção ou conhecido nas técnicas relevantes.

Proteína de arcabouço da presente invenção - produção e geração

[00031] Pelo menos uma proteína de arcabouço da presente invenção pode ser opcionalmente produzida por uma linhagem de células, uma linhagem mista de células, uma célula imortalizada ou uma população clonal de células imortalizadas, conforme é bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY, E.U.A. (1987-2001), Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989), Harlow e Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EUA (1989), Colligan, et al., editores, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY, EUA (1994-2001), Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, E.U.A., (1997-2001).

[00032] Os aminoácidos obtidos de uma proteína de arcabouço podem ser alterados, adicionados e/ou deletados para reduzir a imunogenicidade ou reduzir, acentuar ou modificar a ligação, a afinidade, velocidade de associação, velocidade de dissociação, avidez, especificidade, meia-vida, estabilidade, solubilidade ou qualquer outra característica adequada, conforme é conhecido na técnica.

[00033] Opcionalmente, as proteínas de arcabouço podem ser engenheiradas com retenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, as proteínas de arcabouço podem ser opcionalmente preparadas por meio de um processo de análise das sequências parentais e de vários produtos engenheirados conceituais usando-se modelos tridimensionais das sequências parentais e engenheiradas. Os modelos tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares para os versados na técnica. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas conformacionais tridimensionais de sequências candidatas selecionadas, e podem medir a possível imunogenicidade (por exemplo, o programa Immunofilter da Xencor, Inc., de Monrovia, CA, EUA). A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel desempenhado pelos resíduos no funcionamento da sequência candidata, isto é, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da proteína de arcabouço candidata para ligar-se a seu antígeno. Desse modo, os resíduos podem ser selecionados e combinados a partir das sequências parental e de referência, de modo que seja obtida a característica desejada, como afinidade por um ou mais antígenos-alvo. Alternativamente, ou adicionalmente aos procedimentos acima citados, podem ser usados outros métodos de engenharia adequados.

Triagem

[00034] A triagem de arcabouços de proteína para ligação específica a proteínas similares ou fragmentos pode ser convenientemente obtida com o uso de bibliotecas de exibição de nucleotídeo (exibição de DNA ou RNA) ou peptídeo, por exemplo exibição in vitro. Esse método envolve a triagem de amplas coleções de peptídeos quanto a membros individuais com a função ou a estrutura desejada. As sequências de nucleotídeo ou peptídeo exibidas podem ter um comprimento de 3 a 5.000 ou mais nucleotídeos ou aminoácidos, frequentemente de 5 a 100 aminoácidos e, frequentemente, de cerca de 8 a 25 aminoácidos. Além dos métodos de síntese química direta para geração de bibliotecas de peptídeos, foram descritos vários métodos com DNA recombinante. Um tipo envolve a exibição de uma sequência de peptídeo na superfície de um bacteriófago ou célula. Cada bacteriófago ou célula contém a sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de peptídeo específica exibida. Esses métodos são descritos nas publicações de patente PCT n° 91/17271, 91/18980, 91/19818 e 93/08278.

[00035] Outros sistemas para geração de bibliotecas de peptídeos têm aspectos tanto da síntese química in vitro como dos métodos recombinantes. Consulte as publicações de patente PCT n° 92/05258, 92/14843 e 96/19256. Consulte, também, as Patentes US nos 5.658.754 e 5.643.768. As bibliotecas de exibição de peptídeos, o vetor e os kits para triagem estão disponíveis comercialmente junto a fornecedores como Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA), e Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, Reino Unido). Consulte, por exemplo, as Patentes US nos 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260 e 5856456 atribuídas a Enzon, 5223409, 5403484, 5571698 e 5837500 atribuídas a Dyax, 5427908 e 5580717 atribuídas a Affymax, 5885793 atribuída a Cambridge Antibody Technologies, 5750373 atribuída a Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493 e 5698417 atribuídas a Xoma, Colligan, supracitado, Ausubel, supracitado, ou Sambrook, supracitado.

[00036] Os arcabouços de proteína da invenção podem ligar-se a proteínas humanas ou de outros mamíferos, com uma ampla gama de afinidades (KD). Em uma modalidade preferencial, pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção pode, opcionalmente, ligar-se a uma proteína-alvo com um grau muito alto de afinidade, por exemplo com uma KD igual a ou menor que cerca de 10-7 M, incluindo, mas não se limitando a, de 0,1 a 9,9 (ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo, conforme determinado por ressonância plasmônica de superfície ou pelo método KinExA, conforme praticado pelos versados na técnica.

[00037] A afinidade ou avidez de um arcabouço de proteína por um antígeno pode ser experimentalmente determinada usando-se qualquer método adequado. (Consulte, por exemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions" em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Editor, Raven Press: New York, NY, EUA (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY, EUA (1992), bem como os métodos aqui descritos). A afinidade medida de uma interação específica entre arcabouço de proteínae antígeno pode variar se for medida sob diferentes condições (por exemplo, concentração de sal, pH). Portanto, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação a antígeno (por exemplo, KD, Kon, Koff) são, de preferência, feitas com soluções padronizadas de arcabouço de proteína e antígeno, e com um tampão padronizado, como o tampão aqui descrito.

[00038] Ensaios competitivos podem ser realizados com o arcabouço de proteína da presente invenção, de modo a determinar quais proteínas, anticorpos e outros antagonistas competem pela ligação a uma proteína-alvo com o arcabouço de proteína da presente invenção, e/ou compartilham a região de epítopo. Esses ensaios, conforme é prontamente conhecido pelos versados na técnica, avaliam a competição entre antagonistas ou ligantes por um número limitado de sítios de ligação em uma proteína. Imobiliza-se ou torna-se insolúvel a proteína e/ou o anticorpo, antes ou depois da competição, e a amostra ligada à proteína-alvo é separada da amostra não-ligada, por exemplo mediante decantação (nos casos em que se tenha previamente tornado insolúvel a proteína ou o anticorpo) ou mediante centrifugação (nos casos em que se tenha precipitado a proteína ou o anticorpo após a reação competitiva). Além disso, a ligação competitiva pode ser determinada pelo fato de a função ter sido alterada pela ligação ou pela ausência de ligação do arcabouço de proteína à proteína-alvo, por exemplo, se a molécula do arcabouço de proteína inibe ou potencializa a atividade enzimática de, por exemplo, um marcador. ELISA e outros testes funcionais podem ser usados, conforme é bem conhecido na técnica.

Moléculas de ácido nucleico

[00039] As moléculas de ácido nucleico da presente invenção codificando arcabouços de proteína podem estar sob a forma de RNA, como mRNA, hnRNA, tRNA ou qualquer outra forma, ou sob a forma de DNA incluindo, mas não se limitando a, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente, ou qualquer combinação dos mesmos. O DNA pode ser de filamento triplo, duplo ou único, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer porção de pelo menos um filamento do DNA ou RNA pode ser um filamento codificante, também conhecido como filamento senso, ou pode ser o filamento não-codificante, também conhecido como filamento antissenso.

[00040] As moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção podem incluir moléculas de ácido nucleico compreendendo uma fase de leitura aberta (ORF), opcionalmente com um ou mais íntrons, por exemplo, mas não se limitando a, pelo menos uma porção especificada de ao menos um arcabouço de proteína, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência de codificação para um arcabouço de proteína ou região de laço que se liga à proteína-alvo, e moléculas de ácido nucleico que compreendem uma sequência de nucleotídeo substancialmente diferente daquelas acima descritas mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam o arcabouço de proteína conforme descrito na presente invenção e/ou conforme é conhecido na técnica. Evidentemente, o código genético é bem conhecido na técnica. Portanto, seria rotineiro para o versado na técnica gerar tais variantes degeneradas de ácido nucleico que codificam os arcabouços de proteína da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, et al., acima, e tais variantes de ácido nucleico estão incluídos na presente invenção.

[00041] Conforme aqui indicado, as moléculas de ácido nucleico da presente invenção que compreendem um ácido nucleico codificando um arcabouço de proteína podem incluir, mas não se limitam a, aquelas codificando a sequência de aminoácidos de um fragmento de arcabouço de proteínapor si só, a sequência de codificação para o arcabouço de proteína inteiro ou para uma porção do mesmo, a sequência de codificação para um arcabouço de proteína, um fragmento ou uma porção, bem como sequências adicionais, como a sequência de codificação de ao menos um líder de sinalização ou peptídeo de fusão, com ou sem as supracitadas sequências de codificação adicionais, como pelo menos um íntron, juntamente com sequências adicionais não-codificantes, incluindo, mas não se limitando a, sequências não-codificantes 5’ e 3’, como as sequências transcritas e não-transladadas que desempenham uma função na transcrição, no processamento de mRNA, inclusive nos sinais de splicing e poliadenilação (por exemplo, ligação de ribossoma e estabilidade do mRNA), uma sequência de codificação adicional que codifica aminoácidos adicionais, como aqueles que proporcionam funcionalidades adicionais. Portanto, a sequência codificando um arcabouço de proteína pode ser fundida a uma sequência de marcador, como uma sequência codificando um peptídeo que facilita a purificação do arcabouço de proteína fundido que compreende um fragmento ou porção de arcabouço de proteína.

Polinucleotídeos hibridizando-se seletivamente para um polinucleotídeo conforme descrito na presente invenção

[00042] A presente invenção apresenta ácidos nucleicos isolados que se hibridizam sob condições de hibridização seletiva em um polinucleotídeo apresentado aqui. Portanto, os polinucleotídeos dessa modalidade podem ser usados para isolar, detectar e/ou quantificar ácidos nucleicos que compreendem tais polinucleotídeos. Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados para identificar, isolar ou amplificar clones parciais ou de tamanho integral em uma biblioteca depositada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são sequências genômicas ou de cDNA isoladas, ou, de outro modo, complementares a um cDNA obtido de uma biblioteca de ácido nucleico humano ou de mamífero.

[00043] De preferência, a biblioteca de cDNA compreende pelo menos 80% de sequências com comprimento total, de preferência pelo menos 85% ou 90% de sequências com comprimento total e, com mais preferência, pelo menos 95% de sequências com comprimento total. As bibliotecas de cDNA podem ser normalizadas para aumentar a representação de sequências raras. As condições de hibridização de estringêngia baixa ou moderada são, tipicamente mas não exclusivamente, empregadas com sequências que têm uma identidade de sequência reduzida em relação a sequências complementares. As condições de estringência moderada e alta podem, opcionalmente, ser empregadas para sequências com maior identidade. As condições de baixa estringência permitem a hibridização seletiva de sequências que tem cerca de 70% de identidade de sequência e podem ser empregadas para identificar sequências ortólogas ou parálogas.

[00044] Opcionalmente, os polinucleotídeos da presente invenção codificarão pelo menos uma porção de um arcabouço de proteína codificado pelos polinucleotídeos aqui descritos. Os polinucleotídeos da presente invenção abrangem sequências de ácido nucleico que podem ser usadas para hibridização seletiva com um polinucleotídeo que codifica um arcabouço de proteína da presente invenção. Consulte, por exemplo, Ausubel, supracitado, e Colligan, supracitado, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

Construção de ácidos nucleicos

[00045] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser produzidos usando-se (a) métodos recombinantes, (b) técnicas de síntese, (c) técnicas de purificação, e/ou (d) combinações das mesmas, conforme é bem conhecido na técnica.

[00046] Os ácidos nucleicos podem compreender, de modo conveniente, sequências além de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem que compreende um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo. Ademais, as sequências transladáveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo transladado da presente invenção. Por exemplo, uma sequência marcadora de hexa-histidina fornece um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. O ácido nucleico da presente invenção, excluindo-se a sequência de codificação, é opcionalmente um vetor, adaptador ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotídeo da presente invenção.

[00047] As sequências adicionais podem ser adicionadas a tais sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função em clonagem e/ou expressão para auxiliar no isolamento do polinucleotídeo, ou para otimizar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem conhecido na técnica. (Consulte, por exemplo, Ausubel, acima, ou Sambrook, acima)

Métodos recombinantes para a construção de ácidos nucleicos

[00048] As composições de ácido nucleico isoladas desta invenção, como RNA, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação dos mesmos, podem ser obtidas a partir de fontes biológicas com o uso de inúmeras metodologias de clonagem conhecidas para aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, as sondas de oligonucleotídeo que se hibridizam seletivamente, sob condições estringentes, com os polinucleotídeos da presente invenção são usadas para identificar a sequência desejada em uma biblioteca de cDNA ou DNA genômico. O isolamento de RNA e a construção de bibliotecas genômicas e de cDNA são bem conhecidos pelos versados na técnica. (Consulte, por exemplo, Ausubel, supracitado, ou Sambrook, supracitado)

Triagem de ácido nucleico e métodos de isolamento

[00049] Uma biblioteca genômica e de cDNA pode ser triada com o uso de uma sonda baseada na sequência de um polinucleotídeo da presente invenção, como aqueles aqui apresentados. As sondas podem ser usadas para hibridizar em sequências de DNA genômico ou de cDNA para isolar genes homólogos no mesmo organismo ou em diferentes organismos. Os versados na técnica compreenderão que vários graus de estringência de hibridização podem ser empregados no teste, sendo que ou a hibridização ou o meio de lavagem podem ser estringentes. À medida que as condições para a hibridização se tornam mais severas, deve haver um grau maior de complementaridade entre a sonda e o alvo para que a formação bidirecional ocorra. O grau de estringência pode ser controlado por um ou mais dentre temperatura, resistência iônica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante, como formamida. Por exemplo, a severidade de hibridização é convenientemente variada através da alteração da polaridade da solução reagente através de, por exemplo, manipulação da concentração de formamida dentro da faixa de 0% a 50%. O grau de complementaridade (identidade de sequência) necessário para a ligação detectável irá variar de acordo com a severidade do meio de hibridização e/ou do meio de lavagem. O grau de complementaridade será, otimamente, de 100%, ou de 70 a 100%, ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo. Entretanto, deve-se compreender que variações de sequência mínimas nas sondas e nos iniciadores podem ser compensadas mediante a redução da estringência da hibridização e/ou do meio de lavagem.

[00050] Os métodos de amplificação de RNA ou DNA são bem conhecidos na técnica e podem ser usados de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida, com base nas orientações e nos ensinamentos aqui apresentados.

[00051] Os métodos conhecidos de amplificação de DNA ou RNA incluem, mas não se limitam a, reação em cadeia de polimerase (PCR) e processos de amplificação relacionados (consulte, por exemplo, as Patentes U.S. nos 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188, atribuída a Mullis, et al., 4.795.699 e 4.921.794 atribuída a Tabor, et al, 5.142.033 atribuída a Innis, 5.122.464 atribuída a Wilson, et al., 5.091.310 atribuída a Innis, 5.066.584 atribuída a Gyllensten, et al, 4.889.818 atribuída a Gelfand, et al, 4.994.370 atribuída a Silver, et al, 4.766.067 atribuída a Biswas, 4.656.134 atribuída a Ringold) e amplificação mediada por RNA que usa RNA antissenso para a sequência alvo como um molde para a síntese de DNA de filamento duplo (Patente US n° 5.130.238 a Malek et al., sob o nome comercial NASBA), cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade. (Consulte, por exemplo, Ausubel, supra, or Sambrook, supra.)

[00052] Por exemplo, a tecnologia de reação em cadeia de polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar as sequências de polinucleotídeos da presente invenção e genes relacionados diretamente das bibliotecas de cDNA ou DNA genômico. A PCR e outros métodos de amplificação in vitro podem também ser úteis, por exemplo, para clonar as sequências de ácido nucleico que codificam as proteínas a serem expressas, para produzir ácidos nucleicos, com o objetivo de usá-los como sondas para detectar a presença de mRNA desejado em amostras, para sequenciamento de ácido nucleico, ou para outros propósitos. Os exemplos de técnicas suficientes para direcionar as pessoas versadas através dos métodos de amplificação in vitro são encontrados em Berger, acima, Sambrook, acima, e Ausubel, acima, bem como Mullis, et al., Patente US n° 4.683.202 (1987), e Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Os kits comercialmente disponíveis para amplificação de PCR genômica são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Adicionalmente, por exemplo, a proteína 32 do gene T4 (Boehringer Mannheim) pode ser usada para otimizar o rendimento de produtos de PCR longos.

Métodos sintéticos para construir ácidos nucleicos

[00053] Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção também podem ser preparados pela síntese química direta por meio de métodos (consulte, por exemplo, Ausubel, et al., acima). A síntese química, em geral, produz um oligonucleotídeo de filamento único, o qual pode ser convertido em DNA de filamento duplo através de hibridização com uma sequência de complementaridade, ou através de polimerização com uma polimerase de DNA com o uso de filamento único como um molde. O elemento versado na técnica irá reconhecer que, embora a síntese de DNA possa ser limitada a sequências de cerca de 100 ou mais bases, as sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.

Cassetes de expressão recombinantes

[00054] A presente invenção adicionalmente fornece cassetes de expressão recombinantes que compreendem um ácido nucleico da presente invenção. Uma sequência de ácido nucleico da presente invenção, por exemplo uma sequência genômica ou de cDNA que codifica um arcabouço de proteína da presente invenção, pode ser usada para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido em pelo menos uma célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante irá compreender, tipicamente, um polinucleotídeo da presente invenção ligado, de modo operável, a sequência reguladora de iniciação transcricional que irá direcionar a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira pretendida. Os promotores heterólogos e não-heterólogos (isto é, endógeno) podem ser empregados para direcionar a expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção.

[00055] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos isolados que funcionam como promotor, intensificador ou outros elementos podem ser introduzidos na posição adequada (a montante, a jusante ou no íntron) de uma forma não-heteróloga de um polinucleotídeo da presente invenção, de modo a regular para cima ou para baixo a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, os promotores endógenos podem ser alterados in vivo ou in vitro através de mutação, eliminação e/ou substituição.

Vetores e células hospedeiras

[00056] A presente invenção também se refere a vetores que incluem as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, células hospedeiras que são geneticamente elaboradas com os vetores recombinantes, e a produção de pelo menos um arcabouço de proteína por meio de técnicas recombinantes, conforme é bem conhecido na técnica. Consulte, por exemplo, Sambrook, et al., supra, Ausubel, et al., supra, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[00057] Os polinucleotídeos podem ser opcionalmente unidos a um vetor que contém um marcador selecionável para propagação em um hospedeiro. Em geral, um vetor plasmídio é introduzido em um precipitado, como um precipitado de fosfato de cálcio, ou em um complexo com um lipídio carregado. Se o vetor é um vírus, o mesmo pode ser armazenado in vitro com o uso de uma linhagem de células de armazenamento adequada e, então, convertido em células hospedeiras.

[00058] O elemento de inserção de DNA deve ser operacionalmente ligado a um promotor adequado. Os construtos de expressão irão conter, ainda, sítios para iniciação de transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação ribossomal para transladação. A porção de codificação das transcrições maduras expressa através de construtos irão incluir, preferencialmente, uma iniciação de transladação no início e um códon de terminação (por exemplo, UAA, UGA ou UAG) adequadamente posicionado no fim do mRNA a ser transladado, sendo que UAA e UAG são preferenciais para a expressão de célula eucariótica ou de mamífero.

[00059] Os vetores de expressão irão incluir, preferencialmente, porém de opcional, pelo menos um marcador selecionável. A título de exemplo, esses marcadores incluem, mas não se limitam a, metotrexato (MTX), diidrofolato reductase (DHFR, Patentes US nos 4.399.216, 4.634.665, 4.656.134, 4.956.288, 5.149.636, 5.179.017), ampicilina, neomicina (G418), ácido micofenólico ou resistência a glutamina sintetase (GS, Patentes US nos 5.122.464, 5.770.359,5.827.739) para cultura de células eucarióticas, e genes de resistência a tetraciclina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias ou procarióticos (as patentes acima estão aqui incorporadas, a título de referência, em sua totalidade). Os meios e condições de cultura adequados para as células hospedeiras supracitadas são conhecidos na técnica. Os vetores adequados serão prontamente aparentes ao versado na técnica. A introdução de uma construção de vetor em uma célula hospedeira pode ser afetada através de transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos conhecidos. Tais métodos são descritos na técnica, como Sambrook, acima, capítulos 1 a 4 e 16 a 18, Ausubel, acima, capítulos 1, 9, 13, 15, 16.

[00060] Pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção pode ser expresso em uma forma modificada, como uma proteína de fusão, e pode incluir não só sinais de secreção, como também regiões funcionais heterólogas adicionais. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao amino-terminal de um arcabouço de proteína para otimizar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante os subsequentes manuseio e armazenamento. Além disso, porções de peptídeo podem ser adicionadas a um arcabouço de proteína da presente invenção, para facilitar a purificação. Essas regiões podem ser removidas antes da preparação final de um arcabouço de proteína, ou pelo menos de um fragmento do mesmo. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, como Sambrook, supracitado, capítulos 17.29 a 17.42 e 18.1 a 18.74, e Ausubel, supracitado, capítulos 16, 17 e 18.

[00061] Os elementos versados na técnica são instruídos a respeito dos diversos sistemas de expressão disponíveis para expressar um ácido nucleico que codifica uma proteína da presente invenção. Alternativamente, os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser expressos em uma célula hospedeira mediante o acionamento (por manipulação) de um arcabouço de proteína da presente invenção em uma célula hospedeira que contém codificação de DNA endógena. Esses métodos são bem conhecidos na técnica, por exemplo conforme descrito nas Patentes US nos 5.580.734, 5.641.670, 5.733.746 e 5.733.761, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade.

[00062] Ilustrativo das culturas celulares úteis para a produção dos arcabouços de proteína, porções especificadas ou variantes das mesmas, são células bacterianas, de levedura e de mamíferos, conforme é conhecido na técnica. Os sistemas de células de mamífero estarão, com frequência, sob a forma de camadas únicas de células, embora as suspensões ou os bioreatores de células de mamífero também possam ser usados. Inúmeras linhagens de células hospedeiras adequadas, capazes de expressar proteínas glicosiladas intactas, foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhagens de células COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), COS-7 (por exemplo, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 (por exemplo, ATCC CRL-10), CHO (por exemplo, ATCC CRL 1610) e BSC-1 (por exemplo, ATCC CRL-26), células Cos-7, células CHO, células hep G2, P3X63Ag8.653, células SP2/0-Ag14, 293, células HeLa e similares, as quais estão prontamente disponíveis, por exemplo, junto à American Type Culture Collection, de Manassas, VA, EUA (www.atcc.org). As células hospedeiras preferenciais incluem células de origem linfoide, como células de mieloma e linfoma. As células hospedeiras particularmente preferenciais são células P3X63Ag8.653 (número de acesso ATCC CRL-1580) e células SP2/0-Ag14 (número de acesso ATCC CRL- 1851). Em uma modalidade particularmente preferencial, a célula recombinante é uma célula P3X63Ab8.653 ou uma célula SP2/0-Ag14.

[00063] Os vetores de expressão para essas células podem incluir uma ou mais dentre as seguintes sequências de controle de expressão, como, mas não se limitando a, uma origem de replicação, um promotor (por exemplo, promotores SV40 tardios ou precoces, o promotor CMV (Patentes US nos 5.168.062, 5.385.839), um promotor HSV tk, um promotor pgk (fosfoglicerato quinase), um promotor EF-1 alfa (Patente US n° 5.266.491), pelo menos um promotor humano, um amplificador, e/ou sítios de processamento de informações como sítios de ligação a ribossomas, sítios de emenda de RNA, sítios de poliadenilação (por exemplo, um sítio de adição SV40 grande T Ag poli A), e sequências terminadoras transcricionais. Consulte, por exemplo, Ausubel et al., acima, Sambrook, et al., acima. Outras células úteis para a produção de ácidos nucleicos ou de proteínas da presente invenção são conhecidas e/ou disponíveis, por exemplo, a partir do American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (www.atcc.org) ou outros conhecidos ou fontes comerciais.

[00064] Quando células hospedeiras eucarióticas são empregadas, as sequências terminadoras de poliadenilação ou de transcrição são tipicamente incorporadas ao vetor. Um exemplo de uma sequência terminadora é a sequência de poliadenilação proveniente do gene do hormônio de crescimento bovino. As sequências para a emenda adequada da transcrição também podem ser incluídas. Um exemplo de uma sequência de emenda é o íntron VP1 proveniente de SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Adicionalmente, assequências de gene que controlam a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas ao vetor, conforme conhecido na técnica.

Purificação de um arcabouço de proteína

[00065] Um arcabouço de proteína pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por meio de métodos bem conhecidos incluindo, mas não se limitando a, purificação por proteína A, precipitação por sulfato de amônio ou etanol, extração por ácido, cromatografia por troca de ânions ou cátions, cromatografia de fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidróxi apatita e cromatografia de lectina. A cromatografia líquida de alta eficiência ("HPLC") também pode ser empregada para purificação. Consulte, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, ou Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, E.U.A., (1997-2001), por exemplo, Capítulos 1, 4, 6, 8, 9 e 10, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[00066] Os arcabouços de proteína da presente invenção incluem produtos naturalmente purificados, produtos de procedimentos de sintetização química e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico incluindo, por exemplo, células de E. Coli, de levedura, de plantas superiores, de insetos e de mamíferos. Dependendo do hospedeiro empregado em um procedimento de produção recombinante, o arcabouço de proteína da presente invenção pode ser glicosilado ou não-glicosilado. Esses métodos são descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, como Sambrook, supracitado, seções 17.37 a 17.42, Ausubel, supracitado, capítulos 10, 12, 13, 16, 18 e 20, e Colligan, Protein Science, supracitado, capítulos 12 a 14, estando todos aqui incorporados a título de referência, em sua totalidade.

Códigos de aminoácido

[00067] Os aminoácidos que formam os arcabouços de proteína da presente invenção são frequentemente abreviados. As designações de aminoácido podem ser indicadas designando-se o aminoácido por seu código de letra única, seu código de três letras, seu nome, ou um ou mais códons de três nucleotídeos conforme é bem conhecido na técnica (consulte Alberts, B. et al., Molecular Biology of The Cell, Terceira Edição, Garland Publishing, Inc., New York, EUA, 1994). Um arcabouço de proteína da presente invenção pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido, sejam estas oriundas de mutações naturais ou de manipulação humana, conforme especificado na presente invenção. Os aminoácidos em um arcabouço de proteína da presente invenção que são essenciais para sua função podem ser identificados com o uso de métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese por varredura de alanina (por exemplo, Ausubel, supracitado, Capítulos 8 e 15, Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). O último procedimento citado introduz mutações únicas de alanina em cada um dos resíduos na molécula. As moléculas mutantes resultantes sõa então testadas quanto à atividade biológica como, mas não se limitando a, pelo menos uma atividade neutralizante. Os sítios que têm importância crítica para a ligação do arcabouço de proteína podem, também, ser identificados por meio de análise estrutural, como cristalização, ressonância magnética nuclear ou marcação por fotoafinidade (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992), e de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).

[00068] Conforme será compreendido pelos versados na técnica, a presente invenção inclui pelo menos um arcabouço de proteína biologicamente ativo da presente invenção. Os arcabouços de proteína biologicamente ativos têm uma atividade específica de pelo menos 20%, 30% ou 40%, de preferência pelo menos 50%, 60% ou 70% e, com a máxima preferência, pelo menos 80%, 90% ou de 95% a 1.000% ou mais em comparação ao arcabouço de proteína nativo (não-sintético), endógeno ou relacionado e conhecido. Os métodos para testar e quantificar as medidas de atividade enzimática e de especificidade de substrato são bem conhecidos pelos versados na técnica.

[00069] Em outro aspecto, a invenção refere-se a arcabouços de proteína e fragmentos, conforme descritos na presente invenção, que são modificados pela ligação covalente de uma porção orgânica. Esse tipo de modificação pode produzir um fragmento de arcabouço de proteína com propriedades farmacocinéticas otimizadas (por exemplo, meia-vida em soro in vivo aumentada). A porção orgânica pode ser um grupo polimérico hidrofílico linear ou ramificado, um grupo de ácido graxo, ou um grupo de éster de ácido graxo. Em modalidades particulares, o grupo polimérico hidrofílico pode ter um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 120.000 Dáltons e pode ser um polialcano glicol (por exemplo, polietileno glicol ("peg")), polipropileno glicol (PPG)), polímero de carboidrato, polímero de aminoácido ou polivinila pirrolidona, e o ácido graxo ou o grupo de éster de ácido graxo pode compreender de cerca de oito a cerca de quarenta átomos de carbono.

[00070] Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados da invenção podem compreender uma ou mais porções orgânicas que estão ligadas de modo covalente, direta ou indiretamente, ao anticorpo. Cada porção orgânica que está ligada a um arcabouço ou fragmento de proteína da invenção pode, independentemente, ser um grupo polimérico hidrofílico, um grupo de ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo. Para uso na presente invenção, o termo "ácido graxo" abrange ácidos monocarboxílicos e ácidos dicarboxílicos. Para uso na presente invenção, o termo "grupo polimérico hidrofílico" refere- se a um polímero orgânico que é mais solúvel em água do que em octano. Por exemplo, a polilisina é mais solúvel em água que em octano. Dessa forma, um arcabouço de proteína modificado pela ligação covalente de polilisina é abrangido pela invenção. Polímeros hidrofílicos adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser lineares ou ramificados e incluem, por exemplo, polialcano glicóis (por exemplo, PEG, monometóxi-polietileno glicol (mPEG), PPG e similares), carboidratos (por exemplo, dextrano, celulose, oligossacarídeos, polissacarídeos e similares), polímeros de aminoácidos hidrofílicos (por exemplo, polilisina, poliarginina, poliaspartato e similares), óxido de polialcano (por exemplo, óxido de polietileno, óxido de polipropileno e similares) e polivinil pirrolidona. De preferência, o polímero hidrofílico que modifica o arcabouço de proteína da invenção tem um peso molecular de cerca de 800 a cerca de 150.000 Dáltons, como uma entidade molecular separada. Podem ser usados, por exemplo, PEG5.000 e PEG20.000, em que o subscrito é o peso molecular médio do polímero em Dáltons. O grupo polimérico hidrofílico pode ser substituído por um a cerca de seis grupos de alquila, ácido graxo ou éster de ácido graxo. Os polímeros hidrofílicos que são substituídos por um ácido graxo ou um grupo de éster de ácido graxo pode ser preparado ao empregar métodos adequados. Por exemplo, um polímero que compreende um grupo de amina pode ser acoplado a um carboxilato do ácido graxo ou éster de ácido graxo, e um carboxilato ativado (por exemplo, ativado com N, N-carbonila diimidazol) em um ácido graxo ou éster de ácido graxo pode ser acoplado a um grupo hidroxila em um polímero.

[00071] Os ácidos graxos e ésteres de ácido graxo adequados para modificar os arcabouços de proteína da invenção podem ser saturados ou podem conter uma ou mais unidades de insaturação. Os ácidos graxos que são adequados para modificação de arcabouços de proteína da invenção incluem, por exemplo, n-dodecanoato (C12, laurato), n-tetradecanoato (C14, miristato), n-octadecanoato (C18, estearato), n-eicosanoato (C20, araquidato), n-docosanoato (C22, beenato), n-triacontanoato (C30), n-tetracontanoato (C40), cis-Δ9- octadecanoato (C18, oleato), todos os cis-Δ5,8,11,14-eicosatetraenoato (C20, araquidonato), ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico, e similares. Os ésteres de ácido graxo adequados incluem mono-ésteres de ácidos dicarboxílicos que compreendem um grupo alquila inferior linear ou ramificada. O grupo alquila inferior pode compreender de um a cerca de doze, preferencialmente de um a cerca de seis, átomos de carbono.

[00072] Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados podem ser preparados com o uso de métodos adequados, como pela reação com um ou mais agentes modificadores. Um "agente modificador" como o termo é usado na presente invenção, refere-se a um grupo orgânico adequado (por exemplo, um polímero hidrofílico, um ácido graxo, um éster de ácido graxo) que compreende um grupo ativador. Um "grupo ativador" é uma porção química ou um grupo funcional que pode, sob condições apropriadas, reagir com um segundo grupo químico formando assim uma ligação covalente entre o agente modificador e o segundo grupo químico. Por exemplo, os grupos ativadores amina-reativos incluem grupos eletrofílicos, como tosilato, mesilato, halo (cloro, bromo, fluoro, iodo), ésteres N-hidróxi succinimidil (NHS) e similares. Grupos ativadores que podem reagir com tióis incluem, por exemplo, maleimida, iodo-acetila, acriloila, dissulfetos de piridila, 5-tiol-2-ácido nitrobenzoico tiol (TNB-tiol), e similares. Um grupo funcional de aldeído pode ser acoplado a moléculas que contêm amina- ou hidrazida-, e um grupo azida pode reagir com um grupo fosforoso trivalente para formar ligações fosforamidato ou fosforamida. Métodos adequados para introduzir grupos ativadores em moléculas são conhecidos na técnica (consulte por exemplo, Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA, EUA (1996)). Um grupo de ativação pode ser ligado diretamente ao grupo orgânico (por exemplo, polímero hidrofílico, ácido graxo, éster de ácido graxo), ou por meio de uma porção ligante, por exemplo um grupo divalente C1-C12 em que uma ou mais átomos de carbono podem ser substituídos por um heteroátomo, como oxigênio, nitrogênio ou enxofre. Porções de ligação adequadas incluem, por exemplo, tetraetileno glicol, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, - (CH2)2-NH- e -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-. Agentes modificadores que compreendem uma porção de ligação podem ser produzidos, por exemplo, ao reagir um mono-Boc-alquildiamina (por exemplo, mono-Boc-etilenodiamina, mono-Boc-diaminohexano) com um ácido graxo na presença de 1-etil-3-(3-dimetil amino propila) carbodiimida (EDC) para formar uma ligação amida entre a amina livre e o carboxilato ácido graxo. O grupo protetor Boc pode ser removido do produto mediante tratamento com ácido trifluoroacético (TFA), para expor uma amina primária que pode ser acoplada a outro carboxilato, conforme descrito, ou pode ser reagida com anidrido maleico, sendo o produto resultante ciclizado para produzir um derivado de maleimido ativado do ácido graxo. (Consulte, por exemplo, Thompson, et al., WO 92/16221, cujos ensinamentos estão aqui incorporados a título de referência, em sua totalidade.)

[00073] Os arcabouços de proteína modificados da invenção podem ser produzidos mediante a reação do arcabouço ou fragmento de proteína com um agente modificador. Por exemplo, as porções orgânicas podem ser ligadas a um arcabouço de proteína de forma não específica para sítio, mediante o uso de um agente modificador amina-reativo, por exemplo um éster NHS de PEG. Os arcabouços e fragmentos de proteína modificados compreendendo uma porção orgânica que está ligada a sítios específicos de um arcabouço de proteína da presente invenção podem ser preparados com o uso de métodos adequados, como proteólise reversa (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992), Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994), Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997), Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996), Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), e os métodos descritos em Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA, EUA (1996).

Composições de arcabouço de proteína compreendendo ingredientes terapeuticamente ativos adicionais

[00074] As composições de arcabouço de proteína da invenção podem opcionalmente compreender, ainda, uma quantidade eficaz de pelo menos um composto ou proteína (molécula pequena ou grande) selecionado a partir de pelo menos um dentre um fármaco anti- infectivo, um fármaco para o sistema cardiovascular (CV), um fármaco para o sistema nervoso central (SNC), um fármaco para o sistema nervoso autônomo (SNA), um fármaco para o trato respiratório, um fármaco para o trato gastrointestinal (GI), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluidos ou eletrólitos, um fármaco hematológico, um antineoplásico, um fármaco para imunomodulação, um fármaco para uso oftálmico, ótico ou nasal, um fármaco para uso tópico, um fármaco nutricional ou similares. Esses fármacos são bem conhecidos na técnica, incluindo formulações, indicações, dosagem e administração para cada um daqueles apresentados na presente invenção (consulte, por exemplo, Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21a Edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, EUA, 2001, Health Professional’s Drug Guide 2001, Editores, Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, EUA, Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., Editores, Appleton & Lange, Stamford, CT, EUA, cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade).

[00075] O fármaco anti-infectivo pode ser pelo menos um selecionado a partir de amebicidas, ou pelo menos um dentre antiprotozoários, anti-helmínticos, antifúngicos, antimaláricos, antituberculínicos ou pelo menos um dentre antilepróticos, aminoglicosídeos, penicilinas, cefalosporinas, tetraciclinas, sulfonamidas, fluoroquinolonas, antivirais, anti-infectivos à base de macrolídeo e anti-infectivos variados. O fármaco CV pode ser pelo menos um selecionado a partir de inotrópicos, antiarrítmicos, antianginosos, anti-hipertensivos, antilipêmicos e fármacos cardiovasculares variados. O fármaco para SNC pode ser pelo menos um selecionado a partir de analgésicos não-narcóticos, ou ao menos um selecionado a partir de antipiréticos, drogas antiinflamatórias não- esteroidais, analgésicos narcóticos ou ao menos um analgésico opioide, hipnóticos sedativos, anticonvulsivos, antidepressivos, fármacos antiansiedade, antipsicóticos, estimulantes do sistema nervoso central, antiparkinsonianos e fármacos para o sistema nervoso central variados. O fármaco para SNA pode ser pelo menos um selecionado a partir de colinérgicos (parassimpatomiméticos), anticolinérgicos, adrenérgicos (simpatomiméticos), bloqueadores adrenérgicos (simpatolíticos), relaxantes de músculos esqueléticos, e bloqueadores neuromusculares. O fármaco para o trato respiratório pode ser pelo menos um selecionado a partir de anti-histamínicos, broncodilatadores, expectorantes ou ao menos um antitussivo, e fármacos para o trato respiratório variados. O fármaco para o trato GI pode ser pelo menos um selecionado a partir de antiácidos, ou pelo menos um adsorvente, ou pelo menos um antiflatulento, uma enzima digestiva, ou pelo menos um solubilizante de cálculo biliar, antidiarreicos, laxativos, antieméticos e fármacos antiúlcera. O fármaco hormonal pode ser pelo menos um selecionado de corticosteroides, androgênios ou pelo menos um esteroide anabólico, estrogênio ou pelo menos uma progestina, uma gonadotropina, um fármaco antidiabético ou pelo menos um glucagon, hormônio da tiroide, antagonista de hormônio da tiroide, hormônio da hipófise e fármaco similar a paratiroide. O fármaco para equilíbrio de fluidos e eletrólitos pode ser pelo menos um selecionado de diuréticos, eletrólitos ou pelo menos uma solução de reposição, um acidificante ou pelo menos um alcalinizante. O fármaco hematológico pode ser pelo menos um selecionado de hematínicos, anticoagulantes, derivados de sangue e enzimas trombolíticas. Os antineoplásicos podem ser pelo menos um selecionado de fármacos alquilantes, antimetabólitos, antineoplásicos antibióticos, antineoplásicos que alteram o equilíbrio hormonal e antineoplásicos variados. O fármaco imunomodulador pode ser pelo menos um selecionado de imunosupressores, vacinas, ou pelo menos um toxoide, uma antitoxina, ou pelo menos um antiveneno, um soro imune e um modificador de resposta biológica. Os fármacos oftálmicos, óticos e nasais podem ser pelo menos um selecionado de anti-infecciosos oftálmicos, anti-inflamatórios oftálmicos, mióticos, midriáticos, vasoconstritores oftálmicos, e fármacos oftálmicos, óticos e nasais variados. O fármaco de uso tópico podem ser pelo menos um selecionado de anti-infectivos locais, escabicidas ou pelo menos um pediculicida ou corticosteroide tópico. O fármaco nutricional pode ser pelo menos um selecionado de vitaminas, minerais, ou calóricos. Consulte, por exemplo, o conteúdo de Nursing 2001 Drug Handbook, acima.

[00076] Pelo menos um amebicida ou antiprotozoário pode ser pelo menos um selecionado de atovaquona, cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, metronidazol, cloridrato de metronidazol e isetionato de pentamidina. Pelo menos um anti-helmíntico pode ser pelo menos um selecionado de mebendazol, pamoato de pirantel e tiabendazol. Pelo menos um antifúngico pode ser pelo menos um selecionado de anfotericina B, complexo de anfotericina B e sulfato de colesterila, complexo lipídico de anfotericina B, anfotericina B lipossomal, fluconazol, flucitosina, griseofulvina micronizada, griseofulvina ultramicronizada, itraconazol, cetoconazol, nistatina e cloridrato de terbinafina. Pelo menos um antimalárico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de cloroquina, fosfato de cloroquina, doxiciclina, sulfato de hidróxi cloroquina, cloridrato de mefloquina, fosfato de primaquina, pirimetamina e pirimetamina com sulfadoxina. Pelo menos um antituberculínico ou antileprótico pode ser pelo menos um selecionado de clofazimina, ciclosserina, dapsona, cloridrato de etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampin, rifapentina e sulfato de estreptomicina. Pelo menos um aminoglicosídeo pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de amicacina, sulfato de gentamicina, sulfato de neomicina, sulfato de estreptomicina e sulfato de tobramicina. Pelo menos uma penicilina pode ser pelo menos uma selecionada de amoxicilina/clavulanato de potássio, triidrato de amoxicilina, ampicilina, ampicilina sódica, tri- hidrato de ampicilina, ampicilina sódica/sulbactama sódica, cloxacilina sódica, dicloxacilina sódica, mezlocilina sódica, nafcilina sódica, oxacilina sódica, penicilina G benzatina, penicilina G potássica, penicilina G procaína, penicilina G sódica, penicilina V potássica, piperacilina sódica, piperacilina sódica/tazobactama sódica, ticarcilina dissódica e ticarcilina dissódica/clavulanato de potássio. Pelo menos uma cefalosporina pode ser pelo menos uma selecionada de cefaclor, cefadroxila, cefazolina sódica, cefdinir, cloridrato de cefepima, cefixima, cefmetazol sódico, cefonicida sódica, cefoperazona sódica, cefotaxima sódica, cefotetam dissódico, cefoxitina sódica, cefpodoxima proxetil, cefprozil, ceftazidima, ceftibuteno, ceftizoxima sódica, ceftriaxona sódica, cefuroxima axetil, cefuroxima sódica, cloridrato de cefalexina, monoidrato de cefalexina, cefradina e loracarbefe. Pelo menos uma tetraciclina pode ser pelo menos uma selecionada a partir de cloridrato de demeclociclina, doxiciclina cálcica, hiclato de doxiciclina, cloridrato de doxiciclina, monoidrato de doxiciclina, cloridrato de minociclina e cloridrato de tetraciclina. Pelo menos uma sulfonamida pode ser pelo menos uma selecionada de co-trimoxazol, sulfadiazina, sulfametoxazol, sulfissoxazol e acetil sulfissoxazol. Pelo menos uma fluoroquinolona pode ser pelo menos uma selecionada de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina e mesilato de trovafloxacina. Pelo menos uma fluoroquinolona pode ser pelo menos uma selecionada de mesilato de alatrofloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, levofloxacina, cloridrato de lomefloxacina, ácido nalidíxico, norfloxacina, ofloxacina, esparfloxacina e mesilato de trovafloxacina. Pelo menos um antiviral pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de abacavir, aciclovir sódico, cloridrato de amantadina, amprenavir, cidofovir, mesilato de delavirdina, didanosina, efavirenz, famciclovir, fomivirsen sódico, foscarnet sódico, ganciclovir, sulfato de indinavir, lamivudina, lamivudina/zidovudina, mesilato de nelfinavir, nevirapina, fosfato de oseltamivir, ribavirina, cloridrato de rimantadina, ritonavir, saquinavir, mesilato de saquinavir, estavudina, cloridrato de valaciclovir, zalcitabina, zanamivir e zidovudina. Pelo menos um macrolídeo anti- infectivo pode ser pelo menos um selecionado de azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina base, estolato de eritromicina, etil succinato de eritromicina, lactobionato de eritromicina e estearato de eritromicina. Pelo menos um anti-infectivo variado pode ser pelo menos um selecionado de aztreonama, bacitracina, succinato sódico de cloranfenicol, cloridrato de clindamicina, cloridrato palmitato de clindamicina, fosfato de clindamicina, imipenema e cilastatina sódica, meropenema, macrocristais de nitrofurantoína, microcristais de nitrofurantoína, quinupristina/dalfopristina, cloridrato de espectinomicina, trimetoprima e cloridrato de vancomicina. (Consulte, por exemplo, páginas 24 a 214 do Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00077] Pelo menos um inotrópico pode ser pelo menos um selecionado de lactato de amrinona, digoxina e lactato de milrinona. Pelo menos um antiarrítmico pode ser pelo menos um selecionado de adenosina, cloridrato de amiodarona, sulfato de atropina, tosilato de bretílio, cloridrato de diltiazem, disopiramida, fosfato de disopiramida, cloridrato de esmolol, acetato de flecainida, fumarato de ibutilida, cloridrato de lidocaina, cloridrato de mexiletina, cloridrato de moricizina, fenitoína, fenitoína sódica, cloridrato de procainamida, cloridrato de propafenona, cloridrato de propranolol, bissulfato de quinidina, gluconato de quinidina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina, sotalol, cloridrato de tocainida e cloridrato de verapamil. Pelo menos um antianginoso pode ser pelo menos um selecionado de besilato de anlodipidina, nitrito de amila, cloridrato de bepridil, cloridrato de diltiazem, dinitrato de isossorbida, mononitrato de isossorbida, nadolol, cloridrato de nicardipino, nifedipina, nitroglicerina, cloridrato de propranolol, verapamil e cloridrato de verapamil. Pelo menos um anti-hipertensivo pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de acebutolol, besilato de anlodipina, atenolol, cloridrato de benazepril, cloridrato de betaxolol, fumarato de bisoprolol, candesartano cilexetila, captoprila, cloridrato de carteolol, carvedilol, clonidina, cloridrato de clonidina, diazóxido, cloridrato de diltiazem, mesilato de doxazosina, enalaprilate, maleato de enalapril, mesilato de eprosartano, felodipina, mesilato de fenoldopam, fosinopril sódico, acetato de guanabenz, sulfato de guanadrel, cloridrato de guanfacina, cloridrato de hidralazina, irbesartano, isradipina, cloridrato de labetalol, lisinopril, losartano potássico, metildopa, cloridrato de metildopato, succinato de metoprolol, tartarato de metoprolol, minoxidil, cloridrato de moexiprila, nadolol, cloridrato de nicardipina, nifedipina, nisoldipina, nitroprussiato sódico, sulfato de penbutolol, perindoprila erbumina, mesilato de fentolamina, pindolol, cloridrato de prazosina, cloridrato de propranolol, cloridrato de quinaprila, ramiprila, telmisartano, cloridrato de terazosina, maleato de timolol, trandolaprila, valsartano e cloridrato de verapamila. Pelo menos um antilipêmico pode ser pelo menos um selecionado de atorvastatina cálcica, cerivastatina sódica, colestiramina, cloridrato de colestipol, fenofibrato (micronizado), fluvastatina sódica, genfibrozila, lovastatina, niacina, pravastatina sódica e sinvastatina. Pelo menos um fármaco variado para CV pode ser pelo menos um selecionado de abciximabe, alprostadila, cloridrato de arbutamina, cilostazol, bissulfato de clopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, cloridrato de midodrina, pentoxifilina, cloridrato de ticlopidina e cloridrato de tirofibana. (Consulte, por exemplo, páginas 215 a 336 do Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00078] Pelo menos um analgésico ou antipirético não-narcótico pode ser pelo menos um selecionado de acetaminofeno, aspirina, trissalicilato de magnésio colina, diflunisal e salicilato de magnésio. Pelo menos um medicamento anti-inflamatório não-esteroidal pode ser pelo menos um selecionado de celecoxibe, diclofenaco potássico, diclofenaco sódico, etodolaco, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, triidrato de sódio indometacina, cetoprofeno, cetorolaco trometamina, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxaprozina, piroxicame, rofecoxibe e sulindaco. Pelo menos um analgésico narcótico ou opioide pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de alfentanil, cloridrato de buprenorfina, tartarato de butofanol, fosfato de codeína, sulfato de codeína, citrato de fentanila, sistema transdérmico de fentanila, sistema transmucoso de fentanila, cloridrato de hidromorfona, cloridrato de meperidina, cloridrato de metadona, cloridrato de morfina, sulfato de morfina, tartarato de morfina, cloridrato de nalbufina, cloridrato de oxicodona, pectinato de oxicodona, cloridrato de oximorfona, cloridrato de pentazocina, cloridrato de pentazocina e cloridrato de naloxona, lactato de pentazocina, cloridrato de propoxifeno, napsilato de propoxifeno, cloridrato de remifentanil, citrato de sufentanil e cloridrato de tramadol. Pelo menos um sedativo-hipnótico pode ser pelo menos um selecionado de hidrato de cloral, estazolam, cloridrato de flurazepam, pentobarbital, pentobarbital sódico, fenobarbital sódico, secobarbital sódico, temazepam, triazolam, zaleplom e tartarato de zolpidem. Pelo menos um anticonvulsivo pode ser pelo menos um selecionado de acetazolamida sódico, carbamazepina, clonazepam, clorazepato dipotássico, diazepam, divalproex sódico, etossuximida, fosfenitoína sódico, gabapentina, lamotrigina, sulfato de magnésio, fenobarbital, fenobarbital sódico, fenitoína, fenitoína sódica, fenitoína sódica (estendida), primidona, cloridrato de tiagabina, topiramato, valproato sódico e ácido valproico. Pelo menos um antidepressivo pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de amitriptilina, pamoato de amitriptilina, amoxapina, cloridrato de bupropiona, bromidrato citalopram, cloridrato de clomipramina, cloridrato de desipramina, cloridrato de doxepina, cloridrato de fluoxetina, cloridrato de imipramina, pamoato de imipramina, mirtazapina, cloridrato de nefazodona, cloridrato de nortriptilina, cloridrato de paroxetina, sulfato de fenelzina, cloridrato de sertralina, sulfato de tranilcipromina, maleato de trimipramina e cloridrato de venlafaxina. Pelo menos um fármaco antiansiedade pode ser pelo menos um selecionado de alprazolam, cloridrato de buspirona, clordiazepóxido, cloridrato de clordiazepóxido, clorazepato dipotássico, diazepam, cloridrato de doxepina, embonato de hidroxizina, cloridrato de hidroxizina, pamoato de hidroxizina, lorazepam, meprobamato, cloridrato de midazolam e oxazepam. Pelo menos um fármaco antipsicótico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de cloropromazina, clozapina, decanoato de flufenazina, enantato de flufenazina, cloridrato de flufenazina, haloperidol, decanoato de haloperidol, lactato de haloperidol, cloridrato de loxapina, succinato de loxapina, besilato de mesoridazina, cloridrato de molindona, olanzapina, perfenazina, pimozida, proclorperazina, fumatato de quetiapina, risperidona, cloridrato de tioridazina, tiotixeno, cloridrato de tiotixeno e cloridrato de trifluoroperazina. Pelo menos um estimulante do sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de anfetamina, cafeína, sulfato de dextroanfetamina, cloridrato de doxapram, cloridrato de metanfetamina, cloridrato de metilfenidato, modafinil, pemolina e cloridrato de fentermina. Pelo menos um antiparkinsoniano pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de amantadina, mesilato de benztropina, cloridrato de biperideno, lactato de biperideno, mesilato de bromocriptina, carbidopa-levodopa, entacapona, levodopa, mesilato de pergolida, dicloridrato de pramipexol, cloridrato de ropinirol, cloridrato de selegilina, tolcapona e cloridrato de triexilfenidila. Pelo menos um fármaco variado para o sistema nervoso central pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de bupropiona, cloridrato de donepezila, droperidol, maleato de fluvoxamina, carbonato de lítio, citrato de lítio, cloridrato de naratriptano, nicotina polacrilex, sistema transdérmico de nicotina, propofol, benzoato de rizatriptano, cloridrato monoidrato de sibutramina, succinato de sumatriptano, cloridrato de tacrina e zolmitriptano. (Consulte, por exemplo, páginas 337 a 530 do Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00079] Pelo menos um colinérgico (por exemplo, parassimpatomimético) pode ser pelo menos um selecionado de cloreto de betanecol, cloreto de edrofônio, brometo de neostigmina, metilsulfato de neostigmina, salicilato de fisostigmina e brometo de piridostigmina. Pelo menos um anticolinérgico pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de atropina, cloridrato de diciclomina, glicopirrolato, hiosciamina, sufato de hiosciamina, brometo de propantelina, escopolamina, butil brometo de escopolamina e bromidrato de escopolamina. Pelo menos um adrenérgico (simpatomimético) pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de dobutamina, cloridrato de dopamina, bitartarato de metaraminol, bitartarato de norepinefrina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de pseudoefedrina e sulfato de pseudoefedrina. Pelo menos um bloqueador adrenérgico (simpatolítico) pode ser pelo menos um selecionado de mesilato de diidroergotamina, tartarato de ergotamina, maleato de metisergida e cloridrato de propranolol. Pelo menos um músculo esquelético relaxante pode ser pelo menos um selecionado de baclofeno, carisoprodol, clorzoxazona, cloridrato de ciclobenzaprina, dantroleno sódico, metocarbamol e cloridrato de tizanidina. Pelo menos um bloqueador neuromuscular pode ser pelo menos um selecionado de besilato de atracúrio, besilato de cisatracúrio, cloreto de doxacúrio, cloreto de mivacúrio, brometo de pancurônio, brometo de pipecurônio, brometo de rapacurônio, brometo de rocurônio, cloreto de succinil colina, cloreto de tubocurarina e brometo de vecurônio. (Consulte, por exemplo, páginas 531-84 de Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00080] Pelo menos um anti-histaminico pode ser pelo menos um selecionado de maleato de bromfeniramina, cloridrato de cetirizina, maleato de clorfeniramina, fumarato de clemastina, cloridrato de ciproheptadina, cloridrato de difenidramina, cloridrato de fexofenadina, loratadina, cloridrato de prometazina, teoclato de prometazina, cloridrato de triprolidina. Pelo menos um broncodilatador pode ser pelo menos um selecionado de albuterol, sulfato de albuterol, aminofilina, sulfato de atropina, sulfato de efedrina, epinefrina, bitartarato de epinefrina, cloridrato de epinefrina, brometo de ipratrópio, isoproterenol, cloridrato de isoproterenol, sulfato de isoproterenol, cloridrato de levalbuterol, sulfato de metaproterenol, oxtrifilina, acetato de pirbuterol, xinafoato de salmeterol, sulfato de terbutalina e teofilina. Pelo menos um expectorante ou antitussivo pode ser pelo menos um selecionado de benzonatato, fosfato de codeína, sulfato de codeína, bromidrato de dextrametorfano, cloridrato de difenidramina, guaifenesina e cloridrato de hidromorfona. Pelo menos um fármaco respiratório variado pode ser pelo menos um selecionado de acetilcisteína, dipropionato de beclometazona, beractanto, budesonida, calfactanto, cromolina sódica, dornase alfa, epoprostenol sódico, flunisolida, propionato de fluticasona, montelucaste sódico, nedocromila sódica, palivizumabe, triancinolona acetonido, zafirlucaste e zileutona. (Consulte, por exemplo, páginas 585 a 642 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00081] Pelo menos um antiácido, adsorvent ou antiflatulento pode ser pelo menos um selecionado de carbonato de alumínio, hidróxido de alumínio, carbonato de cálcio, magaldrato, hidróxido de magnésio, óxido de magnésio, simeticona e bicarbonato de sódio. Pelo menos uma enzima digestiva ou solubilizante de cálculo biliar pode ser pelo menos um selecionado de pancreatina, pancrelipase e ursodiol. Pelo menos um antidiarreico pode ser pelo menos um selecionado de atapulgita, subsalicilato de bismuto, cálcio policarbófilo, cloridrato de difenoxilato e sulfato de atropina, loperamida, acetato de octreotida, tintura de ópio e tintura de ópio (canforada). Pelo menos um laxativo pode ser pelo menos um selecionado de bisocodil, cálcio policarbófilo, cáscara sagrada, extrato fluido aromático de cáscara sagrada, extrato fluido de cáscara sagrada, óleo de mamona, docusato cálcico, docusato sódico, glicerina, lactulose, citrato de magnésio, hidróxido de magnésio, sulfato de magnésio, metil celulose, óleo mineral, polietileno glicol ou solução eletrolítica, plantago, sene e fosfatos de sódio. Pelo menos um antiemético pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de cloropromazina, dimenidrinato, mesilato de dolasetrona, dronabinol, cloridrato de granisetrona, cloridrato de meclizina, cloridrato de metocloproamida, cloridrato de ondansetrona, perfenazina, proclorperazina, edisilato de proclorperazina, maleato proclorperazino, cloridrato de prometazina, escopolamina, maleato tietilperazina e cloridrato de trimetobenzamida. Pelo menos um fármaco antiúlcera pode ser pelo menos um selecionado de cimetidina, cloridrato de cimetidina, famotidina, lansoprazol, misoprostol, nizatidina, omeprazol, rabeprazol sódico, ranitidina citrato de bismuto, cloridrato de ranitidina e sucralfato. (Consulte, por exemplo, páginas 643 a 95 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00082] Pelo menos um corticosteroide pode ser pelo menos um selecionado de beta-metasona, acetato de beta-metasona ou fosfato sódico de beta-metasona, acetato de cortisona, dexametasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, acetato de fludrocortisona, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, metil prednisolona, acetato de metil prednisolona, succinato sódico de metil prednisolona, prednisolona, acetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, prednisona, triancinolona, acetonido de triancinolona e diacetato de triancinolona. Pelo menos um androgênio ou esteroide anabolizante pode ser pelo menos um selecionado de danazol, fluoximesterona, metiltestosterona, decanoato de nandrolona, fenpropionato de nandrolona, testosterona, cipionato de testosterona, enantato de testosterona, propionato de testosterona e sistema transdérmico de testosterona. Pelo menos um estrogênio ou uma progestina pode ser pelo menos um selecionado de estrogênios esterificados, estradiol, cipionato de estradiol, sistema transdérmico de estradiol/acetato de noretindrona, valerato de estradiol, estrogênios (conjugados), estropipato, etinil estradiol, etinil estradiol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e desogestrel, etinil estradiol e diacetato de etinodiol, etinil estradiol e levonorgestrel, etinil estradiol e noretindrona, etinil estradiol e acetato de noretindrona, etinil estradiol e norgestimato, etinil estradiol e norgestrel, etinil estradiol e noretindrona e acetato e fumarato ferroso, levonorgestrel, acetato de medróxi progesterona, mestranol e noretindrona, noretindrona, acetato de noretindrona, norgestrel e progesterona. Pelo menos uma gonadrotropina pode ser pelo menos uma selecionada de acetato de ganirelix, acetato de gonadorrelina, acetato de histrelina e menotropinas. Pelo menos um antidiabético ou glucagon pode ser pelo menos um selecionado de acarbose, clorpropamida, glimepirida, glipizida, glucagon, gliburida, insulinas, cloridrato de metformina, miglitol, cloridrato de pioglitazona, repaglinida, maleato de rosiglitazona e troglitazona. Pelo menos um hormônio da tiroide pode ser pelo menos um selecionado de levotiroxina sódica, liotironina sódica, liotrix e tiroide. Pelo menos um antagonista de hormônio da tiroide pode ser pelo menos um selecionado de metimazol, iodeto de potássio, iodeto de potássio (solução saturada), propil tiouracil, iodo radioativo (iodeto de sódio 131I) e solução forte de iodo. Pelo menos um hormônio da hipófise pode ser pelo menos um selecionado de corticotropina, cosintropina, acetato de desmopressina, acetato de leuprolida, corticotropina de repositório, somatrem, somatropina e vasopressina. Pelo menos um fármaco similar a paratiroide pode ser pelo menos um selecionado de calcifediol, calcitonina (humana), calcitonina (de salmão), calcitriol, diidrotaquisterol e etidronato dissódico. (Consulte, por exemplo, páginas 696 a 796 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00083] Pelo menos um diurético pode ser pelo menos um selecionado de acetazolamida, acetazolamida sódica, cloridrato de amilorida, bumetanida, clortalidona, etacrinato sódico, ácido etacrínico, furosemida, hidroclorotiazida, indapamida, manitol, metolazona, espirono lactona, torsemida, triantereno e ureia. Pelo menos um eletrólito ou solução de reposição pode ser pelo menos um selecionado de acetato de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, lactato de cálcio, fosfato de cálcio (dibásico), fosfato de cálcio (tribásico), dextrano (alto peso molecular), dextrano (baixo peso molecular), hetamido, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, acetato de potássio, bicarbonato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, injeção de Ringer, injeção de Ringer (lactato) e cloreto de sódio. Pelo menos um acidificante ou alcalinizante pode ser pelo menos um selecionado de bicarbonato de sódio, lactato de sódio e trometamina. (Consulte, por exemplo, páginas 797 a 833 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00084] Pelo menos um hematínico pode ser pelo menos um selecionado de fumarato ferroso, gluconato ferroso, sulfato ferroso, sulfato ferroso (seco), ferro dextrano, ferro sorbitol, complexo de polissacarídeo-ferro e complexo de sódio e gluconato férrico. Pelo menos um anticoagulante pode ser pelo menos um selecionado de ardeparina sódica, dalteparina sódica, danaparoide sódico, enoxaparina sódica, heparina cálcica, heparina sódica e varfarina sódica. Pelo menos um derivado de sangue pode ser pelo menos um selecionado de albumina a 5%, albumina a 25%, fator anti-hemofílico, complexo coagulante anti-inibidor, antitrombina III (humana), fator IX (humano), complexo de fator IX, e frações de proteína plasmática. Pelo menos uma enzima trombolítica pode ser pelo menos uma selecionada de alteplase, anistreplase, reteplase (recombinante), estreptoquinase e uroquinase. (Consulte, por exemplo, páginas 834-66 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00085] Pelo menos um fármaco alquilante pode ser pelo menos um selecionado de bussulfano, carboplatina, carmustina, clorambucila, cisplatina, ciclofosfamida, ifosfamida, lomustina, cloridrato de mecloretamina, melfalana, cloridrato de melfalana, estreptozocina, temozolomida e tiotepa. Pelo menos um antimetabólito pode ser pelo menos um selecionado de capecitabina, cladribina, citarabina, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracila, hidróxi ureia, mercaptopurina, metotrexato, metotrexato sódico e tioguanina. Pelo menos um antibiótico antineoplásico pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de bleomicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina lipossomal, cloridrato de daunorrubicina, cloridrato de doxorrubicina, cloridrato de doxorrubicina liposomal, cloridrato de epirrubicina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, pentostatina, plicamicina e valrubicina. Pelo menos um antineoplásico que altera o equilíbrio hormonal pode ser pelo menos um selecionado de anastrozol, bicalutamida, fosfato sódico de estramustina, exemestano, flutamida, acetato de goserelina, letrozol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, nilutamida, citrato de tamoxifeno, testolactona e citrato de toremifeno. Pelo menos um antineoplásico variado pode ser pelo menos um selecionado de asparaginase, bacilo Calmette-Guerin (BCG) (vivo intravesical), dacarbazina, docetaxel, etoposida, fosfato de etoposida, cloridrato de gencitabina, cloridrato irinotecano, mitotano, cloridrato de mitoxantrona, paclitaxel, pegaspargase, porfímero sódico, cloridrato de procarbazina, rituximabe, teniposida, cloridrato de topotecano, trastuzumabe, tretinoína, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina e tartarato de vinorelbina. (Consulte, por exemplo, páginas 867 a 963 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00086] Pelo menos um imunosupressor pode ser pelo menos um selecionado de azatioprina, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe, imunoglobulina linfocitária, muromonabe-CD3, micofenolato de mofetil, cloridrato de micofenolato de mofetil, sirolimo e tacrolimo. Pelo menos uma vacina ou um toxoide pode ser pelo menos um selecionado de vacina BCG, vacina para cólera, toxoides de difteria e tétano (adsorvido), toxoides de difteria e tétano e vacina acelular adsorvida para coqueluche, toxoides de difteria e tétano e vacina com célula inteira para coqueluche, vacinas conjugadas para Haemophillus b, vacina para hepatite A (inativada), vacina para hepatite B (recombinante), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (antígeno de superfície purificado), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (subvírion ou subvírion purificado), vacina para vírus da gripe 1999 a 2000 tipos trivalentes A & B (vírion inteiro), vacina para vírus de encefalite japonesa (inativado), vacina para doença de Lyme (OspA recombinante), vacina para vírus de rubéola, sarampo e caxumba (viva), vacina para vírus de rubéola, sarampo e caxumba (viva atenuada), vacina para vírus do sarampo (viva atenuada), vacina anti-meningocócica à base de polissacarídeo, vacina para vírus de caxumba (viva), vacina para peste bubônica, vacina pneumocócica (polivalente), vacina para poliovírus (inativado), vacina para poliovírus (viva, oral, trivalente), vacina para raiva (adsorvida), vacina para raiva (célula diploide humana), vacina para vírus de rubéola e caxumba (viva), vacina para vírus de rubéola (viva, atenuada), toxoide de tétano (adsorvido), toxoide de tétano (fluido), vacina para febre tifoide (oral), vacina para febre tifoide (parenteral), vacina para febre tifoide polissacarídica VI, vacina para vírus de varicela e vacina para febre amarela. Pelo menos uma antitoxina ou um antiveneno pode ser pelo menos um selecionado de antiveneno de aranha viúva-negra, antiveneno para Crotalidae (polivalente), antitoxina para difteria (equina) e antiveneno para Micrurus fulvius. Pelo menos um soro imune pode ser pelo menos um selecionado de imunoglobulina contra citomegalovírus (intravenoso), imunoglobulina contra hepatite B (humana), imunoglobulina intramuscular, imunoglobulina intravenoso, imunoglobulina contra raiva (humana), imunoglobulina contra vírus sincicial respiratório intravenosa (humana), imunoglobulina contra Rh0(D) (humana), imunoglobulina contra Rh0(D) intravenosa (humana), imunoglobulina contra tétano (humana) e imunoglobulina contra varicela-zóster. Pelo menos um modificador de resposta biológica pode ser pelo menos um selecionado de aldesleucina, epoetina alfa, filgrastim, acetato de glatirâmero para injeção, interferon alfacon-1, interferon alfa-2a (recombinante), interferon alfa-2b (recombinante), interferon beta-1a, interferon beta-1b (recombinante), interferon gama-1b, cloridrato de levamisol, oprelvecina e sargramostim. (Consulte, por exemplo, páginas 964 a 1040 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00087] Pelo menos um anti-infectivo de uso oftálmico pode ser selecionado de bacitracina, cloranfenicol, cloridrato de ciprofloxacina, eritromicina, sulfato de gentamicina, ofloxacina a 0,3%, sulfato de polimixina B, sulfacetamida sódica a 10%, sulfacetamida sódica a 15%, sulfacetamida sódica a 30%, tobramicina e vidarabina. Pelo menos um anti-inflamatório de uso oftálmico pode ser pelo menos um selecionado de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diclofenaco sódico a 0,1%, fluorometolona, flurbiprofeno sódico, cetorolaco trometamina, acetato de prednisolona (suspensão) e fosfato sódico de prednisolona (solução). Pelo menos um miótic pode ser pelo menos um selecionado de cloreto de acetilcolina, carbacol (intraocular), carbacol (tópico), iodeto de ecotiofato, pilocarpina, cloridrato de pilocarpina e nitrato de pilocarpina. Pelo menos um midriático pode ser pelo menos um selecionado de sulfato de atropina, cloridrato de ciclopentolato, cloridrato de epinefrina, borato de epinefrila, bromidrato de homatropina, cloridrato de fenilefrina, bromidrato de escopolamina e tropicamida. Pelo menos um vasoconstritor oftálmico pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina e cloridrato de tetra-hidrozolina. Pelo menos um oftálmico variado pode ser pelo menos um selecionado de cloridrato de apraclonidina, cloridrato de betaxolol, tartarato de brimonidina, cloridrato de carteolol, cloridrato de dipivefrina, cloridrato de dorzolamida, difumarato de emedastina, fluoresceína sódica, fumarato de cetotifeno, latanoprosta, cloridrato de levobunolol, cloridrato de metipranolol, cloreto de sódio (hipertônico) e maleato de timolol. O pelo menos um ótico pode ser pelo menos um selecionado de ácido bórico, peróxido de carbamida e cloranfenicol, oleato-condensado de trietanolamina polipeptídica. Pelo menos um fármaco nasal pode ser pelo menos um selecionado de dipropionato de beclometazona, budesonida, sulfato de efedrina, cloridrato de epinefrina, flunisolida, proprionato de fluticasona, cloridrato de nafazolina, cloridrato de oximetazolina, cloridrato de fenilefrina, cloridrato de tetra-hidrozolina, acetonido de triancinolona, cloridrato de xilometazolina. (Consulte, por exemplo, páginas 1041-97 do Nursing 2001 Drug Handbook.)

[00088] Pelo menos um anti-infectivo local pode ser pelo menos um selecionado de aciclovir, anfotericina B, creme de ácido azeláico, bacitracina, nitrato de butoconazol, fosfato de clindamicina, clotrimazol, nitrato de econazol, eritromicina, sulfato de gentamicina, cetoconazol, acetato de mafenida, metronidazol (tópico), nitrato de miconazol, mupirocina, cloridrato de naftifina, sulfato de neomicina, nitrofurazona, nistatina, sulfadiazina de prata, cloridrato de terbinafina, terconazol, cloridrato de tetraciclina, tioconazol e tolnaftato. Pelo menos um escabicida ou pediculicida pode ser pelo menos um selecionado de crotamitona, lindano, permetrina e piretrinas. Pelo menos um corticosteroide de uso tópico pode ser pelo menos um selecionado de dipropionato de beta-metasona, valerato de beta-metasona, propionato de clobetasol, desonida, desoximetasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, diacetato de diflorasona, acetonido de fluocinolona, fluocinonida, flurandrenolida, propionato de fluticasona, halcionida, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona, furoato de mometasona e acetonida de triancinolona. (Consulte, por exemplo, páginas 1098 a 1136 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00089] Pelo menos uma vitamina ou um mineral pode ser pelo menos um selecionado de vitamina A, complexo de vitamina B, cianocobalamina, ácido fólico, hidróxi cobalamina, leucovorina cálcica, niacina, niacinamida, cloridrato de piridoxina, riboflavina, cloridrato de tiamina, vitamina C, vitamina D, colecalciferol, ergocalciferol, análogo de vitamina D, doxercalciferol, paricalcitol, vitamina E, análogo de vitamina K, fitonadiona, fluoreto de sódio, fluoreto de sódio (tópico), elementos-traço, cromo, cobre, iodo, manganês, selênio e zinco. Pelo menos um calórico pode ser pelo menos um selecionado de infusões de aminoácido (cristalino), infusões de aminoácido em dextrose, infusões de aminoácido com eletrólitos, infusões de aminoácido com eletrólitos em dextrose, infusões de aminoácido para insuficiência hepática, infusões de aminoácido para alto estresse metabólico, infusões de aminoácido para insuficiência renal, dextrose, emulsões de gordura e triglicerídeos de cadeia média. (Consulte, por exemplo, páginas 1137-63 do Nursing 2001 Drug Handbook).

[00090] As composições de arcabouço de proteína da presente invenção podem compreender, ainda, ao menos um dentre quaisquer quantidade adequada e eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo um arcabouço de proteína colocado em contato com, ou administrado a, uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia, opcionalmente compreendendo, adicionalmente, pelo menos um selecionado de pelo menos um antagonista de TNF (por exemplo, mas não se limitando a, um antagonista químico ou proteico de TNF, um anticorpo monoclonal ou policlonal de TNF ou fragmento do mesmo, um receptor de TNF solúvel (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou fragmento do mesmo, polipeptídeos de fusão do mesmo, ou um antagonista de TNF de molécula pequena, por exemplo, uma proteína de ligação I ou II a TNF (TBP-1 ou TBP-II), nerelimomabe, infliximabe, etanercepte, CDP-571, CDP-870, afelimomabe, lenercepte, e similares), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auranofina, aurotioglicose, azatioprina, etanercept, tiomalato sódico de ouro, sulfato de hidróxi cloroquina, leflunomida, sulfassalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um medicamento anti-inflamatório não-esteroidal (NSAID), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um microbicida (por exemplo, um aminoglicosídeo, um fungicida, um antiparasítico, um antiviral, um carbapenema, uma cefalosporina, uma fluoroquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, outro microbicida), um antipsoríase, um corticoesteroide, um esteroide anabolizante, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente para tiroide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarreico, um antitussivo, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM- CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossuppressivo (por exemplo, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe), um hormônio do crescimento, um fármaco de reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, um medicamento para asma, um beta agonista, um esteroide inalável, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo da mesma, dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista de citocina. Alguns exemplos não-limitadores eessas citocinas incluem, mas não se limitam a, qualquer dentre IL-1 a IL-28 (por exemplo, IL-1, IL-2, etc.). Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Wells et al., editores, Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT, EUA (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA, EUA (2000), cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

[00091] Essas substâncias anticâncer ou anti-infectivas podem, também, incluir moléculas de toxina que são associadas, ligadas, co- formuladas ou coadministradas com pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção. A toxina pode, opcionalmente, agir para matar células ou tecidos patológicos, de modo seletivo. A célula patológica pode ser uma célula de câncer ou outra célula. Tais toxinas podem ser, mas não são limitadas a, toxina purificada ou recombinante ou fragmento de toxina que compreende pelo menos um domínio citotóxico funcional de toxina, por exemplo, selecionado a partir de pelo menos um de ricina, toxina de difteria, uma toxina venenosa, ou uma toxina bacteriana. O termo toxina inclui, também tanto endotoxinas quanto exotoxinas produzidas por qualquer bactéria ou vírus de ocorrência natural, mutante ou recombinante que possam causar qualquer condição patológica em seres humanos e outros mamíferos, incluindo choque de toxina, que pode resultar em morte. Tais toxinas podem incluir, mas não se limitam a, enterotoxina lábil ao aquecimento enterotoxigênico de E. coli (LT), enterotoxina estável em aquecimento (ST), citotoxina Shiguela, enterotoxinas Aeromonas, toxina-1 da síndrome do choque tóxico (TSST-1), enterotoxina Staphylococcal A (SEA), B (SEB), ou C (SEC), enterotoxinas Streptococcal e similares. Tais bactérias incluem, mas não se limitam a, cepas de uma espécie de enterotoxigênico de E. coli (ETEC), enterohemorrágico de E. coli (por exemplo, cepas de serotipo 0157:H7), espécie estafilococo (por exemplo, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pyogenes), espécie Shigella (por exemplo, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, e Shigella sonnei), Salmonella species (por exemplo, Salmonella typhi, Salmonella cholera-suis, Salmonella enteritidis), espécie Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens, Clostridium dificile, Clostridium botulinum), espécie Camphlobacter (por exemplo, Camphlobacter jejuni, Camphlobacter fetus), espécie Heliobacter, (por exemplo, Heliobacter pylori), espécie Aeromonas (por exemplo, Aeromonas sobria, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae), Pleisomonas shigelloides, Yersina enterocolitica, espécie Vibrios (por exemplo, Vibrios cholerae, Vibrios parahemolyticus), espécie Klebsiella, Pseudomonas aeruginosa e Streptococci. Consulte, por exemplo, Stein, Editor, INTERNAL MEDICINE, 3a. Edição, páginas 1 a 13, Little, Brown and Co., Boston, EUA (1990), Evans et al., Editores, Bacterial Infections of Humans: Epidemiology and Control, 2a. Edição, páginas 239 a 254, Plenum Medical Book Co., New York, EUA (1991), Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3a. Edição, Churchill Livingstone, New York, EUA (1990), Berkow et al, Editores, The Merck Manual, 16a. Edição, Merck and Co., Rahway, NJ, EUA, 1992, Wood et al, FEMS Microbiology Immunology, 76:121-134 (1991), Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990), cujo conteúdo está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[00092] Os compostos, composições ou combinações de arcabouço de proteína da presente invenção podem compreender, ainda, ao menos um dentre qualquer auxiliar adequado, incluindo, mas não se limitando a, diluente, ligante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similares. são preferenciais os auxiliares farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos não- limitadores dessas soluções estéreis, e métodos para preparo das mesmas, são bem conhecidos na técnica incluindo, mas limitando-se a, Gennaro, Editores, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Mack Publishing Co. (Easton, PA, EUA) 1990. Podem ser rotineiramente selecionados veículos farmaceuticamente aceitáveis que sejam adequados para o modo de administração, a solubilidade e/ou a estabilidade da composição de arcabouço de proteína, seu fragmento ou variante, conforme é bem conhecido na técnica ou conforme descrito na presente invenção.

[00093] Os excipientes e aditivos farmacêuticos úteis na presente composição incluem, mas não se limitam a, proteínas, peptídeos, aminoácidos, lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, inclusive monossacarídeos, di, tri, tetra e oligossacarídeos, açúcares derivatizados como alditóis, ácidos aldônicos, açúcares esterificados e similares, e polissacarídeos ou polímeros de açúcar), que podem estar presentes por si sós ou em combinação, e que compreendem, por si sós ou em combinação, de 1 a 99,99%, em peso ou volume. Exemplos de excipientes à base de proteína incluem albumina sérica, como albumina sérica humana (HSA), albumina humana recombinante (rHA), gelatina, caseína e similares. Componentes de aminoácido/proteína representativos, que podem também funcionar como tampão, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenilalanina, aspartame e similares. Um aminoácido preferencial é a glicina.

[00094] Os excipientes à base de carboidrato adequados ao uso na invenção incluem, por exemplo, monossacarídeos como frutose, maltose, galactose, glicose, D-manose, sorbose e similares, dissacarídeos como lactose, sacarose, trealose, celobiose e similares, polissacarídeos como rafinose, melezitose, maltodextrinas, dextranos, amidos e similares, e alditóis, como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol sorbitol (glucitol), mioinositol e similares. Excipientes de carboidrato preferenciais para uso na presente invenção são manitol, trehalose, e rafinose.

[00095] As composições de arcabouço de proteína podem, também, incluir um tampão ou um agente de ajuste de pH, sendo que tipicamente o tampão é um sal preparado a partir de ácido ou base orgânicos. Os tampões representativo incluem sais de ácido orgânico, como sais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético ou ácido ftálico, Tris, cloridrato de trometamina ou tampões de fosfato. Os tampões preferenciais para uso nas presentes composições são sais de ácido orgânico, como citrato.

[00096] Adicionalmente, as composições de arcabouço de proteína da invenção podem incluir excipientes/aditivos poliméricos, como polivinil pirrolidonas, Ficoll (um açúcar polimérico), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas como 2-hidróxi propil-β-ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes flavorizantes, agentes microbicidas, adoçantes, antioxidantes, agentes anti-estática, tensoativos (por exemplo, polissorbatos como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (por exemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteroides (por exemplo, colesterol) e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

[00097] Estes e outros excipientes farmacêuticos conhecidos e/ou aditivos adequados para uso nas composições de arcabouço de proteína, suas porções ou variantes, de acordo com a presente invenção, são conhecidos na técnica, por exemplo conforme mencionados em "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19a Edição, Williams & Williams, (1995), e em "Physician’s Desk Reference", 52a Edição, Medical Economics, Montvale, NJ, EUA (1998), cujas descrições estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade. Os materiais de veículo ou excipiente preferenciais são os carboidratos (por exemplo, sacarídeos e alditóis) e tampões (por exemplo, citrato) ou agentes poliméricos. Uma molécula carreadora exemplificadora consiste em um mucopolissacarídeo, ácido hialurônico, o qual pode ser útil para aplicação intra-articular.

Formulações

[00098] Conforme observado acima, a invenção apresenta formulações estáveis, as quais compreendem, de preferência, um tampão de fosfato com solução salina ou um sal escolhido, bem como soluções e formulações preservadas contendo um conservante, bem como formulações preservadas multi-uso adequadas para uso farmacêutico ou veterinário, compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína em uma formulação farmaceuticamente aceitável. As formulações preservadas contêm pelo menos um conservante conhecido ou, opcionalmente, selecionado do grupo consistindo em pelo menos um fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, nitrito fenilmercúrico, fenóxi etanol, formaldeído, clorobutanol, cloreto de magnésio (por exemplo, hexa- hidrato), alquil parabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, polímeros, ou misturas dos mesmos em um diluente aquoso. Pode-se usar qualquer concentração ou mistura adequada, conforme é conhecido na técnica, como cerca de 0,0015%, ou qualquer faixa, valor ou fração das mesmas. Alguns exemplos não- limitadores incluem: nenhum conservante, de cerca de 0,1 a 2% de m- cresol (por exemplo 0,2, 0,3. 0,4, 0,5, 0,9, 1,0%), cerca de 0,1 a 3% de álcool benzílico (por exemplo 0,5, 0,9, 1,1, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5%), cerca de 0,001 a 0,5% de timerosal (por exemplo 0,005, 0,01), cerca de 0,001 a 2,0% de fenol (por exemplo 0,05, 0,25, 0,28, 0,5, 0,9, 1,0%), 0,0005 a 1,0% alquil parabenos (por exemplo 0,00075, 0,0009, 0,001, 0,002, 0,005, 0,0075, 0,009, 0,01, 0,02, 0,05, 0,075, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 0,75, 0,9, 1,0%) e similares.

[00099] Conforme observado acima, a invenção apresenta um artigo de manufatura compreendendo material de embalagem e pelo menos um frasco compreendendo uma solução de ao menos um arcabouço de proteína com os tampões e/ou conservantes prescritos, opcionalmente em um diluente aquoso, sendo que o dito material de embalagem compreende um rótulo que indica que essa solução pode ser mantida ao longo de um período de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66 ou 72 horas, ou mais. A invenção compreende, adicionalmente, um artigo de manufatura compreendendo material de embalagem, um primeiro frasco compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, e um segundo frasco compreendendo um diluente aquoso com o tampão ou conservante prescrito, sendo que o dito material de embalagem compreende um rótulo que instrui um paciente a reconstituir o pelo menos um arcabouço de proteína no diluente aquoso para formar uma solução que pode ser mantida ao longo de um período de vinte e quatro horas ou mais.

[000100] O pelo menos um arcabouço de proteína usado de acordo com a presente invenção pode ser produzido por meiosrecombinantes, inclusive a partir de células de mamífero ou preparações transgênicas, ou pode ser purificado a partir de outras fontes biológicas, conforme descrito na presente invenção ou conforme é conhecido na técnica.

[000101] A faixa de teores do ao menos um arcabouço de proteína no produto da presente invenção inclui quantidades que resultem, após a reconstituição no caso de um sistema molhado/seco, em concentrações de cerca de 1,0 μg/ml a cerca de 1.000 mg/ml, embora concentrações mais baixas ou mais altas sejam funcionais e dependam do veículo de aplicação a que se destina o produto, por exemplo formulações de solução serão diferentes daquelas para emplastros transdérmicos, ou métodos de aplicação pulmonar, transmucosal, osmótico ou por microbomba.

[000102] De preferência, o diluente aquoso opcionalmente compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamente aceitável. Conservantes preferenciais incluem aqueles selecionados do grupo que consiste em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquil parabeno (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos. A concentração de conservante usada na formulação é uma concentração suficiente para resultar em um efeito microbicida. Tais concentrações são dependentes do conservante selecionado e são prontamente determinadas pelo versado na técnica.

[000103] Outros excipientes, por exemplo, agentes de isotonicidade, tampões, antioxidantes e conservantes intensificadores, podem ser opcionalmente, e de preferência, adicionados ao diluente. Um agente de isotonicidade, como a glicerina, é comumente usado em concentrações conhecidas. Um tampão fisiologicamente tolerado é, de preferência, adicionado para fornecer um controle de pH aprimorado. As formulações podem abranger uma ampla gama de pHs, como de cerca de pH 4 a cerca de pH 10, faixas preferenciais de cerca de pH 5 a cerca de pH 9, e uma faixa da máxima preferência de cerca de 6,0 a cerca de 8,0. De preferência, as formulações da presente invenção têm um pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,8. Os tampões preferenciais incluem tampões de fosfato e, com a máxima preferência, fosfato sódico, particularmente solução salina tamponada com fosfato (PBS).

[000104] Outros aditivos, como solubilizantes farmaceuticamente aceitáveis como Tween 20 (polióxi etileno (20) monolaurato de sorbitano), Tween 40 (polióxi etileno (20) monopalmitato de sorbitano), Tween 80 (polióxi etileno (20) mono-oleato de sorbitano), Pluronic F68 (copolímeros de bloco de polióxi etileno e polióxi propileno) e PEG (polietileno glicol), ou tensoativos não-iônicos como polissorbato 20 ou 80, ou poloxâmero 184 ou 188, polióis Pluronic®, outros copolímeros de bloco, e quelantes como EDTA e EGTA, podem ser opcionalmente adicionados às formulações ou composições para reduzir a agregação. Esses aditivos são particularmente úteis se uma bomba ou recipiente plástico for usado para administrar a formulação. A presença de tensoativo farmaceuticamente aceitável atenua a propensão de a proteína agregar-se.

[000105] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por meio de um processo que compreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína e um conservante selecionado do grupo consistindo em fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquil parabeno, (metila, etila, propila, butila e similares), cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, desidroacetato de sódio e timerosal, ou misturas dos mesmos, em um diluente aquoso. A misturação do pelo menos um arcabouço de proteína e um conservante em um diluente aquoso é feita com o uso de procedimentos convencionais de dissolução e misturação. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em solução tamponada é combinada ao conservante desejado em uma solução tamponada em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o conservante nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000106] As formulações reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco contendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, que é reconstituído com um segundo frasco contendo água, um conservante e/ou excipientes, de preferência um tampão de fosfato e/ou solução salina e um sal escolhido, em um diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, pode fornecer um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000107] Os presentes artigos de fabricação reivindicados são úteis para administração de um período que está na faixa de imediato a vinte e quatro horas ou mais. Em conformidade, os artigos de fabricação presentemente reivindicados oferecem vantagens significativas para o paciente. As formulações da invenção podem, opcionalmente, ser armazenadas com segurança a temperaturas de cerca de 2°C a cerca de 40°C, e reter a atividade biológica da proteína durante extensos períodos de tempo, permitindo assim o uso de um rótulo na embalagem indicando que a solução pode ser mantida e/ou usada ao longo de um período de 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 ou 96 horas, ou mais. Se for usado um diluente conservante, esse rótulo pode incluir o uso de 1 a 12 meses, meio ano, um ano e meio e/ou dois anos.

[000108] As soluções de pelo menos um arcabouço de proteína da invenção podem ser preparadas por meio de um processo quecompreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína em um diluente aquoso. A misturação é realizada com o uso deprocedimentos convencionais de dissolução e misturação. Para preparar um diluente adequado, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em água ou tampão é combinada em quantidade suficiente para fornecer a proteína e, opcionalmente, um conservante ou tampão, nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000109] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos a pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco contendo pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000110] Os produtos reivindicados podem ser fornecidos indiretamente para os pacientes, mediante o fornecimento a farmácias, clínicas ou outras instituições e instalações, de soluções límpidas ou frascos duplos compreendendo um frasco de pelo menos um arcabouço de proteína liofilizado, que é reconstituído com um segundo frasco contendo o diluente aquoso. A solução límpida, nesse caso, pode ser de até um litro ou mesmo de um tamanho maior, oferecendo um reservatório grande de onde porções menores da solução de pelo menos um arcabouço de proteína podem ser retiradas uma ou diversas vezes e transferidas para frascos menores a serem fornecidos pelas farmácias ou clínicas a seus clientes e/ou pacientes.

[000111] Os dispositivos reconhecidos compreendendo sistemas de frasco único incluem dispositivos injetores do tipo caneta para aplicação de uma solução, como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® e OptiPen®, GenotropinPen®,Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®,Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, Intraject® e Medi-Ject®, por exemplo como aqueles desenvolvidos pela Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, EUA, www.bectondickenson.com), pela Disetronic (Burgdorf, Suíça, www.disetronic.com), pela Bioject (Portland, Oregon, EUA, www.bioject.com), pela National Medical Products, pela Weston Medical (Peterborough, Reino Unido, www. weston-medical.com), pela Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, EUA, www. mediject.com) e dispositivos adequados similares. Os dispositivos reconhecidos que compreende um sistema de frasco duplo incluem aqueles sistemas injetores do tipo caneta para reconstituir um fármaco liofilizado em um cartucho para aplicação da solução reconstituída, como aHumatroPen®. Exemplos de outros dispositivos adequados incluem seringas pré-abastecidas, auto-injetores, injetores sem agulha econjuntos para infusão IV sem agulha.

[000112] Os produtos presentemente reivindicados incluem material de embalagem. O material de embalagem apresenta, em adição às informações requeridas pelos órgãos fiscalizadores, as condições sob as quais o produto pode ser usado. O material de embalagem da presente invenção apresenta instruções ao paciente para reconstituir pelo menos um arcabouço de proteína no diluente aquoso de modo a formar uma solução, e para usar a dita solução ao longo de um período de 2 a 24 horas ou mais para o produto com dois frascos de conteúdo molhado/seco. Para o produto com um único frasco contendo uma solução, o rótulo indica que essa solução pode ser usada ao longo de um período de 2 a 24 horas ou mais. Os produtos presentemente reivindicados são úteis para uso em produtos farmacêuticos destinados a seres humanos.

[000113] As formulações da presente invenção podem ser preparadas por um processo que compreende misturar pelo menos um arcabouço de proteína e um tampão selecionado, de preferência um tampão de fosfato contendo solução salina ou um sal escolhido. A mistura de pelo menos um arcabouço de proteína e tampão em um diluente aquoso é realizada usando-se procedimentos convencionais de dissolução e misturação. Para preparar uma formulação adequada, por exemplo, uma quantidade medida de pelo menos um arcabouço de proteína em água ou tampão é combinada com o agente tampão desejado em água, em quantidades suficientes para fornecer a proteína e o tampão nas concentrações desejadas. Variações desse processo serão reconhecidas pelo versado na técnica. Por exemplo, a ordem na qual os componentes são adicionados, o uso de aditivos adicionais, e a temperatura e o pH no qual a formulação é preparada são fatores que podem ser otimizados para a concentração e os meios de administração usados.

[000114] As formulações estáveis ou preservadas reivindicadas podem ser fornecidas aos pacientes sob a forma de soluções límpidas ou sob a forma de frascos duplos compreendendo um frasco de arcabouço de proteína liofilizado que é reconstituído com um segundo frasco contendo um conservante ou tampão e excipientes em um diluente aquoso. Tanto um único frasco de solução, ou um frasco duplo que requer reconstituição, pode ser reutilizado diversas vezes e pode ser suficiente para um ciclo único ou ciclos múltiplos do tratamento do paciente e, dessa forma, fornece um regime de tratamento mais conveniente do que o atualmente disponível.

[000115] Outras formulações ou outros métodos para estabilização do arcabouço de proteína podem resultar em uma solução não necessariamente límpida de pó liofilizado compreendendo o arcabouço de proteína. Entre as soluções não-límpidas estão formulações que compreendem suspensões de particulado, sendo que os ditos particulados consistem em uma composição contendo o arcabouço de proteína em uma estrutura de dimensão variável e conhecida, entre outros, como microesfera, micropartícula, nanopartícula, nanoesfera ou lipossoma. Essas formulações relativamente homogêneas de particulado essencialmente esférico contendo um agente ativo podem ser formadas colocando-se uma fase aquosa contendo o agente ativo e um polímero em contato com uma fase não-aquosa, seguido de evaporação da fase não-aquosa para causar a coalescência de partículas da fase aquosa, conforme apresentado na US n° 4.589.330. As micropartículas porosas podem ser preparadas com o uso de uma primeira fase contendo agente ativo e um polímero disperso em um solvente contínuo, e removendo-se o dito solvente da suspensão por meio de secagem por congelamento ou diluição-extração-precipitação, conforme apresentado na US n° 4.818.542. Os polímeros preferenciais para essas preparações são copolímeros ou polímeros naturais ou sintéticos, selecionados do grupo consistindo em gelatina, ágar, amido, arabinogalactano, albumina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido polilático, glicolídeo-L(-) lactídeo poli(epsílon-capro-lactona, poli(ácido epsílon-caprolactona-CO-lático), poli(ácido epsílon-caprolactona-CO- glicólico), poli(ácido β-hidr0xi butírico), óxido de polietileno, polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(hidróxi etil metacrilato), poliamidas,poli(aminoácidos), poli(2-hidróxi etil DL-aspartamida), poli(éster ureia), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/1,6-di-isocianato hexano) epoli(metacrilato de metila). Os polímeros particularmente preferenciais são poliésteres, como ácido poliglicólico, ácido polilático, glicolídeo-L(-) lactídeo poli(epsílon-caprolactona, poli(ácido epsílon-caprolactona-CO- lático) e poli(ácido epsílon-caprolactona-CO-glicólico. Os solventes úteis para dissolver o polímero e/ou o ativo incluem: água, hexafluoroisopropanol, cloreto de metileno, tetra-hidrofurano, hexano, benzeno, ou hexafluoroacetona sesquihidrato. O processo de dispersar o ativo que contém fase com uma segunda fase pode incluir pressão a fim de forçar a dita primeira fase através de um orifício em um bocal para afetar a formação de gotícula.

[000116] As formulações de pó seco podem resultar de processos além da liofilização, como secagem por atomização ou extração de solvente por evaporação ou precipitação de uma composição cristalina, seguida de uma ou mais etapas para remover o solvente aquoso ou não-aquoso. A preparação de uma composição de arcabouço de proteína seco por atomização é apresentada na US n° 6.019.968. As composições de arcabouço de proteína sob a forma de pó seco podem ser produzidas mediante a secagem por atomização de soluções ou pastas fluidas do arcabouço de proteína e, opcionalmente, excipientes, em um solvente sob condições para se obter um pó seco respirável. Os solventes podem incluir compostos polares, como água e etanol, que podem ser prontamente secos. A estabilidade do arcabouço de proteína pode ser otimizada mediante a execução dos procedimentos de secagem por atomização na ausência de oxigênio, como sob um lençol de nitrogênio, ou mediante o uso do nitrogênio como gás secante. Uma outra formulação relativamente seca é uma dispersão de uma pluralidade de micro-estruturas perfuradas dispersas em um meio de suspensão que compreende, tipicamente, um propelente hidrofluoro alcano conforme apresentado no WO 9916419. As dispersões estabilizadas podem ser administradas aos pulmões de um paciente com o uso de um inalador de dosagem medida. Os equipamentos úteis na fabricação comercial dos medicamentos de secagem por atomização são produzidos pela Buchi Ltd. ou pela Niro Corp.

[000117] Pelo menos um arcabouço de proteína, seja nasformulações estáveis ou preservadas, ou nas soluções aqui descritas, pode ser administrado a um paciente de acordo com a presenteinvenção, por meio de uma variedade de métodos de aplicação, inclusive injeção subcutânea ou intramuscular, transdérmico, pulmonar, transmucosal, implante, bomba osmótica, cartucho, microbomba ou outros meios conhecidos pelo versado na técnica, conforme é bem conhecido na técnica.

Aplicações Terapêuticas

[000118] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de uma doença, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente, conforme é conhecido na técnica ou conforme descrito na presente invenção, usando-se pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção, por exemplo, administrando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz do arcabouço de proteína a, ou colocando-se a mesma em contato com, a célula, o tecido, o órgão, o animal ou o paciente. A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de uma doença, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre obesidade, uma doença imunológica, uma doença cardiovascular, uma doença infecciosa, uma doença maligna ou uma doença neurológica.

[000119] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença imunológica em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos uma dentre artrite reumatoide, artrite reumatoide juvenil, artrite reumatoide juvenil de início sistêmico, artrite psoriática, espondilite anquilosante, úlcera gástrica, artropatias soronegativas, osteoartrite, osteólise, afrouxamento asséptico de implantes ortopédicos, doença inflamatória intestinal, colite ulcerativa, Lupus erythematosus sistêmico, síndrome antifosfolipídio, iridociclite/uveíte/neurite óptica, fibrose pulmonar idiopática, vasculite sistêmica/granulomatose de Wegener, sarcoidose, orquite/procedimentos para reversão de vasectomia, doenças alérgicas/atópicas, asma, rinite alérgica, eczema, dermatite de contato alérgica, conjuntivite alérgica, pneumonite de hipersensibilidade, transplantes, rejeição a transplante de órgão, doença de enxerto- versus-hospedeiro, síndrome de resposta inflamatória sistêmica, síndrome de sepse, sepse gram-positiva, sepse gram-negativa, sepse negativa para culturas, sepse fúngica, febre neutropênica, urosepse, meningococcemia, trauma/hemorragia, queimaduras, exposição à radiação ionizante, pancreatite aguda, síndrome do desconforto respiratório em adultos, artrite reumatoide, hepatite induzida por álcool, patologias inflamatórias crônicas, sarcoidose, patologia de Crohn, anemia falciforme, diabetes, nefrose, doenças atópicas, reações de hipersensibilidade, rinite alérgica, febre do feno, rinite perene, conjuntivite, endometriose, asma, urticária, anafilaxia sistêmica, dermatite, anemia perniciosa, doença hemolítica, trombocitopenia, rejeição de enxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição a transplante de rim, rejeição a transplante de coração, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pâncreas, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante de medula óssea (TMO), rejeição a aloenxerto de pele, rejeição a transplante de cartilagem, rejeição a enxerto ósseo, rejeição a transplante de intestino delgado, rejeição a implante de timo fetal, rejeição a transplante de paratiroide, rejeição a xenoenxerto de qualquer órgão ou tecido, rejeição a aloenxerto, reações de hipersensibilidade antirreceptor, doença de Graves, doença de Raynaud, diabetes tipo B resistente à insulina, asma, miastenia grave, citotoxicidade mediada por anticorpos, reações de hipersensibilidade tipo III, síndrome de POEMS (síndrome de polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal e alterações de pele), síndrome de polineuropatia, organomegalia, endocrinopatia, gamopatia monoclonal, alterações de pele, síndrome antifosfolipídio, pênfigo, escleroderma, doença mista do tecido conjuntivo, doença de Addison idiopática, diabetes mellitus, hepatite ativa crônica, cirrose biliar primária, vitiligo, vasculite, síndrome de cardiotomia pós-IM, hipersensibilidade tipo IV, dermatite de contato, pneumonite por hipersensibilidade, rejeição a aloenxerto, granulomas devidos a organismos intracelulares, sensibilidade a fármacos, doença de Wilson metabólica/idiopática, hemocromatose, deficiência de alfa-1- antitripsina, retinopatia diabética, tiroidite de Hashimoto, osteoporose, avaliação do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, cirrose biliar primária, tiroidite, encefalomielite, caquexia, fibrose cística, doença pulmonar crônica neonatal, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), linfoistiocitose hematofagocítica familiar, problemas dermatológicos, psoríase, alopécia, síndrome nefrótica, nefrite, nefrite glomerular, insuficiência renal aguda, hemodiálise, uremia, toxicidade pré-eclâmpsia, terapia com okt3, terapia anti-cd3, terapia com citocinas, quimioterapia, radioterapia (por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, astenia, anemia, caquexia e similares), intoxicação crônica por salicilato, e similares. Consulte, por exemplo, o Merck Manual, 12a a 17a Edições, Merck & Company, Rahway, NJ, EUA (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), e Pharmacotherapy Handbook, Wells et al., Editores, Segunda Edição, Appleton e Lange, Stamford, CT, EUA (1998, 2000), cada um dos quais está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.

[000120] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença cardiovascular em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre síndrome de atordoamento cardíaco, infarto do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, acidente vascular cerebral, acidente vascular cerebral isquêmico, hemorragia, síndrome coronária aguda, arterioesclerose, ateroesclerose, reestenose, doença arterioesclerótica diabética, hipertensão, hipertensão arterial, hipertensão renovascular, síncope, choque, sífilis do sistema cardiovascular, insuficiência cardíaca, cor pulmonale, hipertensão pulmonar primária, arritmias cardíacas, batidas ectópicas atriais, flutter atrial, fibrilação atrial (prolongado ou paroxístico), síndrome de pós-perfusão, resposta inflamatória à revascularização cardiopulmonar, taquicardia atrial caótica ou multifocal, taquicardia com QRS estreita regular, arritmias específicas, fibrilação ventricular, arritmias do feixe His, bloqueio atrioventricular, bloqueio da ramificação do feixe, transtornos isquêmicos do miocárdio, doença das artérias coronárias, angina pectoris, infarto do miocárdio, cardiomiopatia, cardiomiopatia congestiva dilatada, cardiomiopatia restritiva, doenças cardíacas valvulares, endocardite, doença do pericárdio, tumores cardíacos, aneurismas aórticos e periféricos, dissecção aórtica, inflamação da aorta, oclusão da aorta abdominal e suas ramificações, transtornos vasculares periféricos, transtornos arteriais oclusivos, doença aterosclerótica periférica, tromboangeíte obliterante, transtornos arteriais periféricos funcionais, fenômeno e doença de Raynaud, acrocianose, eritromelalgia, doenças venosas, trombose venosa, veias varicosas, fístula arteriovenosa, linfedema, lipedema, angina instável, lesão por reperfusão, síndrome pós- bombeamento, lesão por isquemia-reperfusão, e similares. Esse método pode, opcionalmente, compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína, a uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia.

[000121] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença infecciosa em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: infecção bacteriana aguda ou crônica, processos parasíticos ou infecciosos agudos ou crônicos, inclusive infecções bacterianas, virais e fúngicas, infecção por HIV/neuropatia por HIV, meningite, hepatite (por exemplo, A, B ou C, ou similares), artrite séptica, peritonite, pneumonia, epiglotite, E. coli 0157:h7, síndrome hemolítica urêmica/púrpura trombocitopênica trombolítica, malária, dengue hemorrágica, leishmaniose, hanseníase, síndrome do choque tóxico, miosite estreptocócica, gangrena gasosa, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium intracellulare, pneumonia por Pneumocystis carinii, doença inflamatória pélvica, orquite/epididimite, legionela, doença de Lyme, gripe A, vírus Epstein- Barr, síndrome hemofagocítica associada a vírus, encefalite viral/meningite asséptica, e similares.

[000122] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença maligna em uma célula, um tissue, um órgão, um animal ou um paciente, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia linfocítica aguda, células B, células T ou FAB ALL, leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mielógena aguda, leucemia mielocítica crônica (LMC),leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas, síndrome mielodisplásica (SMD), linfoma, doença de Hodgkin, linfoma maligno, linfoma não-hodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, sarcoma de Kaposi, carcinoma colorretal, carcinoma pancreático, carcinoma nasofaríngeo, histiocitose maligna, síndrome paraneoplásica/hipercalcemia por malignidade, tumores sólidos, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de cabeça, câncer de pescoço, câncer hereditário não-polipoide, linfoma de Hodgkin, câncer de fígado, câncer pulmonar, câncer pulmonar de células não-pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer de próstata, carcinoma de células renais, câncer testicular, adenocarcinomas, sarcomas, melanoma maligno, hemangioma, doença metastática, reabsorção óssea relacionada a câncer, dor óssea relacionada a câncer, e similares.

[000123] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma doença neurológica em uma cell, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: doenças neurodegenerativas, esclerose múltipla, dor de cabeça por enxaqueca, complexo de demência da AIDS, doenças de desmielinização como esclerose múltipla e mielite transversal aguda, transtornos extrapiramidais e cerebelares como lesões do sistema corticoespinhal, transtornos dos gânglios basais, transtornos de movimento hipercinéticos como coreia de Huntington e coreia senil, transtornos de movimento induzidos por medicamento, como aqueles induzidos por fármacos que bloqueiam os receptores de dopamina do SNC, transtornos de movimento hipocinéticos, como doença de Parkinson, paralisia supranuclear progressiva, lesões estruturais do cerebelo, degenerações espinocerebelares, como ataxia espinhal, ataxia de Friedreich, degenerações corticais cerebelares, degenerações de múltiplos sistemas (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager e Machado- Joseph), transtornos sistêmicos (doença de Refsum, abetalipoproteinemia, ataxia, telangiectasia e transtorno mitocondrial multi-sistemas), transtornos de desmielinização do núcleo, como esclerose múltipla, mielite transversal aguda, e transtornos da unidade motora, como atrofias musculares neurogênicas (corneta degeneração da célula anterior, como esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal infantil e atrofia muscular espinhal juvenil), doença de Alzheimer, síndrome de Down na meia-idade, doença difusa dos corpos de Lewy, demência senil do tipo relacionado a corpos de Lewy, síndrome de Wernicke-Korsakoff, alcoolismo crônico, doença de Creutzfeldt-Jakob, panencefalite esclerosante subaguda, doença de Hallerrorden-Spatz, demência pugilística, lesão neurotraumática (por exemplo, lesão da medula espinhal, lesão cerebral, concussão, concussão repetitiva), dor, dor de origem inflamatória, autismo, depressão, acidente vascular cerebral, transtornos cognitivos, epilepsia e similares. Tal método pode opcionalmente compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica que compreende pelo menos um anticorpo TNF variante ou porção especificada de uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia. Consulte, por exemplo, o Merck Manual, 16a Edição, Merck & Company, Rahway, NJ, EUA (1992).

[000124] A presente invenção apresenta, também, um método para modulação ou tratamento de pelo menos uma ferida, um trauma ou uma lesão tecidual ou problema crônico relacionado, em uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um dentre: lesão física ou trauma associado a cirurgia bucal, inclusive cirurgia periodontal, extração de dentes, tratamento endodôntico, inserção de implantes dentários, aplicação e uso de próteses dentárias, ou em que a ferida é selecionada do grupo consistindo em feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas por laceração, feridas não-penetrantes, feridas abertas, feridas penetrantes, feridas por perfuração, feridas por punção, feridas sépticas, infartos e feridas subcutâneas, ou em que a ferida é selecionada do grupo consistindo em úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador, ou em que a ferida é uma lesão aftosa, uma ferida traumática ou uma lesão associada a herpes.

[000125] As feridas e/ou úlceras são normalmente encontradas projetando-se a partir da pele ou sobre uma superfície mucosa, ou como resultado de um infarto em um órgão ("acidente vascular"). Uma ferida pode ser o resultado de um defeito nos tecidos moles, de uma lesão ou de uma condição subjacente. No presente contexto, o termo "pele" refere-se a superfície mais externa do corpo de um animal, inclusive de um ser humano, e abrange a pele intacta ou quase intacta bem como uma superfície de pele que esteja ferida. O termo "mucosa" refere-se à mucosa intacta ou danificadà de um animal, como um ser humano, e pode ser a mucosa oral, bucal, aural, nasal, pulmonar, ocular, gastrointestinal, vaginal ou retal.

[000126] No presente contexto, o termo "ferida" denota uma lesão corporal com perturbação da integridade normal das estruturas teciduais. O termo também se destina a abranger os termos "chaga", "lesão", "necrose" e "úlcera". Normalmente, o termo "ferida" é um termo popular para quase qualquer lesão da pele ou das membranas mucosas, enquanto o termo "úlcera" é um defeito local, ou uma escavação, da superfície de um órgão ou tecido, a qual é produzida pela eliminação de tecido necrótico. O termo "lesão" refere-se de modo geral a qualquer defeito tecidual. A necrose está relacionada a tecidos mortos resultantes de infecção, lesão, inflamação ou infartos.

[000127] O termo "ferida", usado no presente contexto, denota qualquer ferida (consulte abaixo para uma classificação de feridas) e em qualquer estágio específico no processo de cicatrização, inclusive o estágio antes que qualquer cicatrização tenha se iniciado, ou mesmo antes de uma ferida específica, como uma incisõa cirúrgica, ter sido feita (tratamento profilático). Exemplos de feridas que podem ser prevenidas e/ou tratadas de acordo com a presente invenção são, por exemplo, feridas assépticas, feridas por contusão, feridas por incisão, feridas por laceração, feridas não-penetrante (isto é, feridas em que não há perturbação da pele, porém há lesão a estruturas subjacentes), feridas abertas, feridas penetrantes, feridas perfurantes, feridas por punção, feridas sépticas, feridas subcutâneas, etc. Os exemplos de úlceras de decúbito, úlceras bucais, úlceras por cromo, aftas, úlceras de pressão, etc. Os exemplos de úlceras são, por exemplo, úlcera péptica, úlcera duodenal, úlcera gástrica, úlcera gotosa, úlcera diabética, úlcera isquêmica de hipertensão, úlcera de estase, ulcus cruris (úlcera venosa), úlcera sublingual, úlcera submucosa, úlcera sintomática, úlcera trófica, úlcera tropical e úlcera venérea, por exemplo, causada por gonorreia (inclusive uretrite, endocervicite e proctite). As condições relacionadas a ferimentos ou úlceras que podem ser corretamente tratadas de acordo com a presente invenção são queimaduras, antraz, tétano, gangrena gasosa, escarlatina, erisipela, sicose da barba, foliculite, impetigo contagioso ou impetigo bolhoso, etc. Frequentemente há uma certa sobreposição entre o uso dos termos "ferida" e "úlcera", e dos termos "ferida" e "lesão" sendo que, além disso, os termos são frequentemente usados de maneira aleatória. Consequentemente, conforme mencionado acima, no presente contexto o termo "ferida" abrange os termos "úlcera", "lesão", "chaga" e "infarto", sendo esses termos indiscriminadamente usados, exceto onde indicado em contrário.

[000128] Os tipos de feridas a serem tratados de acordo com a presente invenção incluem, também: (i) feridas em geral, como feridas cirúrgicas, traumáticas, infecciosas, isquêmicas, térmicas, químicas e bolhosas, (ii) feridas específica da cavidade bucal, como feridas pós- extração, feridas endodônticas especialmente em conexão com tratamento de cistos e abscessos, úlceras e lesões de origgem bacteriana, viral ou autoimune, feridas mecânicas, químicas, térmicas, infecciosas e liquenoides, sendo que úlceras herpéticas, estomatite aftosa, gengivite ulcerativa necrosante aguda e síndrome da boca ardente são exemplos específicos, e (iii) feridas sobre a pele, como neoplasma, queimaduras (por exemplo química ou térmica), lesões (bacteriana, viral, autoimune), mordidas e incisões cirúrgicas.

[000129] Um outro modo para classiicação de feridas é: (i) pequena perda de tecido devido a incisões cirúrgicas, abrasões mínimas e mordidas menores, ou (ii) perda significativa de tecido. Esse último grupo inclui úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, lacerações, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador (em tecidos moles e duros), bem como infartos.

[000130] Outras feridas que têm importância em conexão com a presente invenção são feridas como úlceras isquêmicas, úlceras por pressão, fístulas, mordidas graves, queimaduras térmicas e feridas de sítio doador. As úlceras isquêmicas e as úlceras por pressão são feridas que normalmente só se curam muito lentamente e, especialmente nesses casos, um processo de cicatrização aprimorado e mais rápido é claramente de grande importância para o paciente. Além disso, os custos envolvidos no tratamento de pacientes sofrendo dessas feridas são marcadamente reduzidos quando a cicatrização é otimizada e ocorre mais rapidamente.

[000131] As feridas de sítio doador são aquelas que, por exemplo, ocorrem em conexão com a remoção de tecidos duros de uma parte do corpo para outra, por exemplo em conexão com transplantes. As feridas resultantes dessas operações são muito dolorosas e uma cicatrização otimizada é, portanto, extremamente valiosa. O termo "pele" é usado em um sentido muito amplo, abrangendo a camada epidérmica da pele e — nos casos em que a superfície da pele está mais ou menos ferida — também a camada dérmica da pele. Além da estrato córneo, a camada epidérmica da pele é a camada externa (epitelial), e a camada do tecido conjuntivo da pele é denominada derme.

[000132] Qualquer método da presente invenção pode compreender a administração de uma quantidade eficaz de uma composição ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína a uma célula, um tecido, um órgão, um animal ou um paciente precisando de tal modulação, tratamento ou terapia. Esse método pode, opcionalmente, compreender ainda a coadministração ou a terapia de combinação para tratamento dessas doenças ou desses transtornos, sendo que a administração do dito pelo menos um arcabouço de proteína, ou da porção ou variante específica do mesmo, compreende adicionalmente a administração, anterior, simultânea e/ou posterior de pelo menos um selecionado de at least one antagonista de TNF (por exemplo, mas não se limitando a, um antagonista químico ou proteico de TNF, um anticorpo monoclonal ou policlonal para TNF ou um fragmento do mesmo, um receptor para TNF solúvel (por exemplo, p55, p70 ou p85) ou um fragmento do mesmo, polipeptídeos de fusão do mesmo, ou um antagonista de TNF de molécula pequena, por exemplo uma proteína I ou II de ligação a TNF (TBP-1 ou TBP-II), nerelimomabe, infliximabe, etanercepte (Enbrel®), adalimumabe (Humira®), CDP-571, CDP-870, afelimomabe, lenercepte e similares), um antirreumático (por exemplo, metotrexato, auranofino, aurotioglicose, azatioprina, tiomalato sódico de ouro, sulfato de hidróxi cloroquina, leflunomida, sulfassalazina), um relaxante muscular, um narcótico, um medicamento anti-inflamatório não-esteroidal (AINE), um analgésico, um anestésico, um sedativo, um anestésico local, um bloqueador neuromuscular, um microbicida (por exemplo, um aminoglicosídeo, um antifúngico, um antiparasítico, um antiviral, uma carbapenema, uma cefalosporina, uma fluoroquinolona, um macrolídeo, uma penicilina, uma sulfonamida, uma tetraciclina, ou outro microbicida), um antipsoriático, um corticosteroide, um esteroide anabólico, um agente relacionado a diabetes, um mineral, um nutricional, um agente de tiroide, uma vitamina, um hormônio relacionado a cálcio, um antidiarreico, um antitussivo, um antiemético, um antiúlcera, um laxativo, um anticoagulante, uma eritropoietina (por exemplo, epoetina alfa), um filgrastim (por exemplo, G-CSF, Neupogen), um sargramostim (GM-CSF, Leukine), uma imunização, uma imunoglobulina, um imunossupressor (por exemplo, basiliximabe, ciclosporina, daclizumabe), um hormônio do crescimento, um fármaco para reposição hormonal, um modulador do receptor de estrogênio, um midriático, um cicloplégico, um agente alquilante, um antimetabólito, um inibidor mitótico, um radiofarmacêutico, um antidepressivo, um agente antimaníaco, um antipsicótico, um ansiolítico, um hipnótico, um simpatomimético, um estimulante, donepezil, tacrina, um fármaco para asma, um beta agonista, um esteroide inalável, um inibidor de leucotrieno, uma metilxantina, uma cromolina, uma epinefrina ou análogo da mesma, uma dornase alfa (Pulmozyme), uma citocina ou um antagonista de citocina. Dosagens adequadas são bem conhecidas na técnica. Consulte, por exemplo, Wells et al., Editores, Pharmacotherapy Handbook, 2a Edição, Appleton and Lange, Stamford, CT, EUA (2000), PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Edição de luxo, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA, EUA (2000), Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21a Edição, Springhouse Corp., Springhouse, PA, EUA, 2001, Health Professional’s Drug Guide 2001, Editor, Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, NJ, EUA, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência, em sua totalidade.

[000133] As citocinas incluem qualquer citocina conhecida. Consulte, por exemplo, CopewithCytokines.com. Os antagonistas de citocina incluem, mas não se limitam a, qualquer anticorpo, fragmento ou mimético do arcabouço de proteína, qualquer receptor solúvel, fragmento ou mimético, qualquer antagonista de molécula pequena, ou qualquer combinação dos mesmos.

[000134] Tipicamente, o tratamento de condições patológicas é realizado mediante a administração de uma quantidade ou dosagem eficaz de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína que resulte em um total, em média, na faixa de ao menos cerca de 0,01 a 500 miligramas de ao menos um arcabouço de proteína por quilograma de paciente por dose e, de preferência, de pelo menos cerca de 0,1 a 100 miligramas de arcabouço de proteína/quilograma de paciente por administração simples ou múltipla, dependendo da atividade específica do agente ativo contido na composição. Alternativamente, a concentração sérica pode compreender de 0,1 a 5.000 μg/ml de concentração sérica por administração simples ou múltipla. As dosagens adequadas são conhecidas por profissionais da área médica e irão, certamente, depender do estado particular da doença, atividade específica da composição administrada e do paciente particular sendo submetido ao tratamento. Em alguns casos, para alcançar a quantidade terapêutica desejada, pode ser necessário fornecer administrações repetidas, isto é, administrações individuais repetidas de uma dosagem particular medida ou monitorada, onde as administrações individuais são repetidas até que a dose diária desejada ou efeito seja alcançado.

[000135] As doses preferenciais podem, opcionalmente, incluir de cerca de 0,1 a 99 e/ou de 100 a 500 mg/kg/administração, ou qualquer faixa, valor ou fração das mesmas, ou até se obter uma concentração sérica de cerca de 0,1 a 5.000 μg/ml por administração única ou múltipla, ou qualquer faixa, valor ou fração da mesma. Uma faixa de dosagem preferencial para o arcabouço de proteína da presente invenção é de cerca de 1 mg/kg, até cerca de 3, cerca de 6 ou cerca de 12 mg/kg de peso corporal do paciente.

[000136] Alternativamente, a dosagem administrada pode variar dependendo de fatores conhecidos, como as características farmacodinâmicas do agente específico, e do modo e via de administração do mesmo, idade, saúde e peso do recipiente, natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concomitante, frequência do tratamento e efeito desejado. Normalmente, uma dosagem do ingrediente ativo pode ser de cerca de 0,1 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal. Usualmente de 0,1 a 50 e, de preferência, de 0,1 a 10 miligramas por quilograma por administração, ou em uma forma com liberação prolongada, são dosagens eficazes para se obter os resultados desejados.

[000137] Como um exemplo não-limitador, o tratamento de seres humanos ou animais pode ser oferecido como uma dosagem única ou periódica de pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção, de cerca de 0,1 a 100 mg/kg ou qualquer faixa, valor ou fração dos mesmos por dia, em pelo menos um dentre os dias de 1 a 40 ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos uma dentre uma semana de 1 a 52 ou, alternativa ou adicionalmente, pelo menos um dentre 1 a 20 anos, ou qualquer combinação dos mesmos, com o uso de doses únicas, por infusão ou repetidas.

[000138] As formas de dosagem (composição) adequadas para administração interna, em geral, contêm de cerca de 0,001 miligrama a cerca de 500 miligramas de ingrediente ativo por unidade ou recipiente. Nessas composições farmacêuticas, o ingrediente ativo estará usualmente presente em uma quantidade de cerca de 0,5 a 99,999%, em peso, com base no peso total da composição.

[000139] Para a administração parenteral, o arcabouço de proteína pode ser formulado como uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma partícula, um pó ou um pó liofilizado em associação, ou fornecido separadamente, com um veículo parenteral farmaceuticamente aceitável. Os exemplos desses veículos são água, solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e de 1 a 10% de albumina de soro humano. Os lipossomas e veículos não-aquosos, como óleos fixos, também podem ser usados. O veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantém a isotonicidade (por exemplo, cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (por exemplo, tampões e conservantes). A formulação é esterilizada através de técnicas conhecidas ou adequadas.

[000140] Veículos farmacêuticos adequados são descritos na edição mais recente de Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão nesse campo.

Administração Alternativa

[000141] Muitos modos desenvolvidos e conhecidos podem ser usados de acordo com a presente invenção para administrar quantidades farmaceuticamente eficazes de pelo menos um arcabouço de proteína de acordo com a presente invenção. Enquanto a administração pulmonar é usada na descrição seguinte, outros modos de administração podem ser usados de acordo com a presente invenção, com resultados adequados. Os arcabouços de proteína da presente invenção podem ser aplicados em um carreador, sob a forma de uma solução, uma emulsão, um coloide ou uma suspensão, ou sob a forma de um pó seco, com o uso de qualquer dentre uma variedade de dispositivos e métodos adequados para a administração por inalação ou outros modos descritos neste documento ou conhecidos na técnica.

Administração e Formulações Parenterais

[000142] As formulações para a administração parenteral podem conter como excipientes comuns água estéril ou solução salina, glicóis polialquilenos como polietileno glicol, óleos de origem vegetal, naftalenos hidrogenados e similares. As suspensões aquosas ou oleosas para injeção podem ser preparadas pelo uso de um umidificador ou emulsificante adequados e de um agente de suspensão, de acordo com métodos conhecidos. Os agentes para injeção podem ser um agente diluente não-tóxico e não-administrável por via oral, como uma solução aquosa, uma solução injetável estéril ou uma suspensão em um solvente. Como veículo ou solvente útil, são permitidos água, solução de Ringer e solução salina isotônica, entre outros, e como solvente comum ou solvente para suspensão, pode ser usado um óleo estéril não-volátil. Para esses propósitos, qualquer tipo de óleo não-volátil e ácido graxo podem ser usados, incluindo ácidos graxos ou óleos graxos naturais, sintéticos ou semissintéticos, tri, di ou monoglicerídeo natural, sintético ou semissintético. A administração parenteral é conhecida na técnica e inclui, mas não se limita a, meios convencionais de injeção, um dispositivo de injeção a gás pressurizado e sem agulha conforme descrito na patente US n° 5.851.198, e um dispositivo perfurador a laser conforme descrito na patente US n° 5.839.446, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade.

Aplicação Alternativa

[000143] A invenção refere-se, ainda, à administração de pelo menos um arcabouço de proteína por meio parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra- abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, subligual, intranasal ou transdérmico. Pelo menos uma composição de arcabouço de proteína pode ser preparada para uso em administração parenteral (subcutânea, intramuscular ou intravenosa) ou qualquer outro tipo de administração particularmente sob a forma de soluções líquidas ou suspensões, para uso em administração vaginal ou retal particularmente em formas semissólidas por exemplo, mas não se limitando a, cremes e supositórios, para administração bucal ou subligual por exemplo, mas não se limitando a, sob a forma de tabletes ou cápsulas, ou para administração intranasal, por exemplo, mas não se limitando a, sob a forma de pós, gotas ou aerossóis nasais ou certos agentes, ou transdermicamente, por exemplo, mas não se limitando a, um gel, uma pomada, uma loção, uma suspensão ou um sistema de liberação por emplastro com intensificadores químicos como sulfóxido de dimetila para modificar a estrutura da pele ou para aumentar a concentração do fármaco no emplastro transdérmico (Junginger, et al. em "Drug Permeation Enhancement," Hsieh, D. S., Editores, páginas 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York, EUA 1994), aqui incorporados a título de referência, em sua totalidade), ou com agentes oxidantes que permitem a aplicação, sobre a pele, de formulações contendo proteínas e peptídeos (WO 98/53847), ou aplicações de campos elétricos para criar rotas de transporte temporárias, como eletroporação, ou para aumentar a mobilidade de fármacos carregados através da pele, como iontoforese, ou aplicação de ultrassom, como sonoforese (patentes US nos 4.309.989 e 4.767.402) (as publicações e patentes acima citadas estão aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade).

Administração Pulmonar/Nasal

[000144] Para a administração pulmonar, de preferência, pelo menos uma composição de arcabouço de proteína é aplicada em um tamanho de partícula eficaz para atingir as vias aéreas inferiores dos pulmões ou os sinus. De acordo com a presente invenção, pelo menos um arcabouço de proteína pode ser aplicado por meio de qualquer dentre uma variedade de dispositivos de inalação ou nasais conhecidos na técnica para a administração de um agente terapêutico por inalação. Esses dispositivos capazes de depositar formulações aerossolizadas na cavidade dos seios paranasais ou alvéolos de um paciente incluem dosagem medida de inaladores, nebulizadores, pó seco geradores, aspersores e similares. Também são conhecidos na técnica outros dispositivos adequados para dirigir a administração pulmonar ou nasal de arcabouços de proteína. Todos esses dispositivos podem usar formulações adequadas à administração e liberação de arcabouço de proteína em um aerossol. Tais aerossóis podem consistir em qualquer uma das soluções (aquosa e não-aquosa) ou partículas sólidas.

[000145] Os inaladores de dosagem medida, como o Ventolin®, tipicamente usam um gás propelente e requerem acionamento durante a inspiração (Consulte, por exemplo, WO 94/16970, WO 98/35888). Os inaladores de pó seco, como Turbuhaler® (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), o inalador Spiros® (Dura), os dispositivos comercializados pela Inhale Therapeutics, e o inalador de pó Spinhaler® (Fisons), usam acionamento pela respiração de um pó misturado (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons, aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade). Os nebulizadores como AERx® (Aradigm), Ultravent® (Mallinckrodt), e Acorn II® (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376, estando as referências acima aqui incorporadas a título de referência, em sua totalidade), produzem aerossóis a partir de soluções, enquanto os inaladores de dosagem medida e os inaladores de pó seco, entre outros, geram pequenos aerossóis de partículas. Esses exemplos específicos de dispositivos de inalação comercialmente disponíveis se destinam a representar os dispositivos específicos adequados à prática desta invenção, e não a limitar o escopo da mesma.

[000146] De preferência, uma composição compreendendo pelo menos um arcabouço de proteína é liberada por um inalador de pó seco ou um aspersor. Há várias caracteristicas desejáveis em um dispositivo de inalação para administração de pelo menos um arcabouço de proteína da presente invenção. Por exemplo, a liberação por um dispositivo de inalação é vantajosamente confiável, reproduzível e precisa. O dispositivo para inalação pode, opcionalmente, fornecer pequenas partículas secas, por exemplo, menor que cerca de 10 μm, de preferência cerca de 1 a 5 μm, para oferecer uma boa respirabilidade.

Administração de composições de arcabouço de proteína sob a forma de aspersão

[000147] Uma aspersão que inclui a composição de arcabouço de proteína pode ser produzida forçando-se uma suspensão ou solução 'contendo pelo menos um arcabouço de proteína a passar através de um bocal, sob pressão. O tamanho e a configuração do bocal, a pressão aplicada e a taxa de alimentação do líquido podem ser escolhidos de modo que se obtenha a saída e o tamanho de partícula desejados. Uma aspersão elétrica pode ser produzida, por exemplo, por um campo elétrico em conexão com um dispositivo para alimentação de um capilar ou bocal. Vantajosamente, as partículas de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína liberadas por um aspersor têm um tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm.

[000148] As formulações de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína, adequada ao uso com um aspersor, tipicamente incluem a composição de arcabouço de proteína em uma solução aquosa a uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg da pelo menos uma composição de arcabouço de proteína por ml de solução, ou mg/g, ou qualquer faixa, valor ou fração da mesma. A formulação pode incluir agentes, como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação pode, também, incluir um excipiente ou agente para estabilização da composição de arcabouço de proteína, como um tampão, um agente redutor, uma proteína bruta, ou um carboidrato. As proteínas brutas úteis na formulação de composições de arcabouço de proteína incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis para a formulação de composições de arcabouço de proteína incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A formulação da composição de arcabouço de proteína pode, também, incluir um tensoativo que pode reduzir ou impedir a agregação, induzida pela superfície, da composição de arcabouço de proteína causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser usados vários tensoativos convencionais, como ésteres de ácido graxo e alcoóis de polióxi etileno, e ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbitol. As quantidades estarão, geralmente, na faixa entre 0,001 e 14%, em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferenciais para os propósitos desta invenção são o monooleato de polióxi etileno sorbitano, o polissorbato 80, o polissorbato 20 ou similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, como arcabouços de proteína, ou porções ou variantes específicas dos mesmos, também podem estar incluídos na formulação.

Administração de composições de arcabouço de proteína por meio de nebulizador

[000149] As composições de arcabouço de proteína da presente invenção podem ser administradas por um nebulizador, como nebulizador de jato ou um nebulizador ultrassônico. Tipicamente, em um nebulizador de jato, uma fonte de ar comprimido é usada para criar um jato de ar em alta velocidade através de um orifício. Conforme o gás se expande para além do bocal, é criada uma região de baixa pressão que arrasta uma solução de composição de arcabouço de proteína através um tubo capilar conectado a um reservatório de líquido. O fluxo de líquido proveniente do tubo capilar é separado em filamentos e gotículas instáveis ao sair do tubo, criando o aerossol. Uma variedade de configurações, taxas de fluxo e tipos de defletor pode ser usada para se obter, de um determinado nebulizador de jato, as características de desempenho desejadas. Em um nebulizador ultrassônico, energia elétrica em alta frequência é usada para criar energia mecânica vibracional, tipicamente empregando um transdutor piezelétrico. Essa energia é transmitida à formulação da composição de arcabouço de proteína, seja diretamente ou por meio de um fluido de acoplamento, criando um aerossol que inclui a composição de arcabouço de proteína. Vantajosamente, as partículas da composição de arcabouço de proteína liberadas por um nebulizador têm um tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência na faixa de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm.

[000150] As formulações de pelo menos um arcabouço de proteína adequadas ao uso com um nebulizador, seja este de jato ou ultra- sônico, tipicamente incluem uma concentração de cerca de 0,1 mg a cerca de 100 mg de pelo menos um arcabouço de proteína por ml de solução. A formulação pode incluir agentes, como um excipiente, um tampão, um agente de isotonicidade, um conservante, um tensoativo e, de preferência, zinco. A formulação pode, também, incluir um excipiente ou agente para estabilização da pelo menos uma composição de arcabouço de proteína, como um tampão, um agente redutor, uma proteína bruta ou um carboidrato. As proteínas brutas úteis na pelo menos uma formulação de composições de arcabouço de proteína incluem albumina, protamina ou similares. Os carboidratos típicos úteis para a formulação de pelo menos um arcabouço de proteína incluem sacarose, manitol, lactose, trealose, glicose ou similares. A formulação de pelo menos um arcabouço de proteína pode, também, incluir um tensoativo que pode reduzir ou impedir a agregação, induzida pela superfície, do pelo menos um arcabouço de proteína causada pela atomização da solução na formação de um aerossol. Podem ser usados vários tensoativos convencionais, como ésteres de ácido graxo e alcoóis de polióxi etileno, e ésteres de ácido graxo de polióxi etileno sorbital. As quantidades estarão, geralmente, na faixa entre cerca de 0,001 e 4%, em peso da formulação. Os tensoativos especialmente preferenciais para os propósitos desta invenção são o monooleato de polióxi etileno sorbitano, o polissorbato 80, o polissorbato 20 ou similares. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para formulação de uma proteína, como um arcabouço de proteína, podem também estar incluídos na formulação.

Administração de composições de arcabouço de proteínapor meio de um inalador de dosagem medida

[000151] Em um inalador de dosagem medida (IDM), um propelente, pelo menos um arcabouço de proteína, e quaisquer excipientes ou outros aditivos estão contidos em um tubo sob a forma de uma mistura que inclui um gás comprimido liquefeito. O acionamento da válvula de medição libera a mistura sob a forma de um aerossol, de preferência contendo partículas em uma faixa de tamanho menor que cerca de 10 μm, de preferência de cerca de 1 μm a cerca de 5 μm e, com a máxima preferência, de cerca de 2 μm a cerca de 3 μm. O tamanho de partícula de aerossol desejável pode ser obtido mediante o uso de uma formulação da composição de arcabouço de proteína produzida por vários métodos conhecidos pelos versados na técnica, incluindo moagem por jato, secagem por atomização, condensação no ponto crítico ou similares. Os Inaladores de dosagem medida preferenciais incluem aqueles produzidos pela 3M ou Glaxo e que empregam um propelente de hidrofluorocarbono. As formulações de pelo menos um arcabouço de proteína para uso com um dispositivo inalador de dosagem medida incluirão, de modo geral, um pó finamente dividido contendo pelo menos um arcabouço de proteína sob a forma de uma suspensão em um meio não-aquoso, por exemplo, suspenso em um propelente com o auxílio de um tensoativo. O propelente pode ser qualquer material convencional empregado para este propósito, como clorofluorocarbono, um hidroclorofluorocarbono, um hidrofluorocarbono ou um hidrocarboneto, que inclui tricloro fluoro metano, dicloro difluoro metano, dicloro tetrafluoro etanol e 1,1,1,2-tetrafluoro etano, HFA-134a (hidrofluoroalcano-134a), HFA-227 (hidrofluoroalcano-227) ou similares. De preferência, o propelente é um hidrofluorocarboneto. O tensoativo pode ser escolhido para estabilizar pelo menos um arcabouço de proteína sob a forma de uma suspensão no propelente, para proteger o agente ativo contra degradação química e similares. Os tensoativos adequados incluem trioleato de sorbitano, lecitina de soja, ácido oleico ou similares. Em alguns casos, os aerossóis de solução que usam solventes como o etanol são preferenciais. Os agentes adicionais conhecidos na técnica para a formulação de uma proteína também podem estar incluídos na formulação. O versado na técnica reconhecerá que os métodos da presente invenção podem ser realizados mediante a administração pulmonar de pelo menos uma composição de arcabouço de proteína por meio de dispositivos que não estão aqui descritos.

Administração e Formulações para Uso Oral

[000152] As formulações para administração oral dependem da coadministração de adjuvantes (por exemplo, resorcinóis e tensoativos não-iônicos, como éter oleílico de polióxi etileno e éter n-hexadecil polietileno) para aumentar artificialmente a permeabilidade das paredes intestinais, bem como da coadministração de inibidores enzimáticos (por exemplo, inibidores de tripsina pancreática, fluorofosfato de di-isopropila (DFF) e trasilol) para inibir a degradação enzimática. As formulações para aplicação de agentes hidrofílicos que incluem proteínas e arcabouços de proteína, bem como umacombinação de pelo menos dois tensoativos destinados àadministração oral, bucal, mucosal, nasal, pulmonar, vaginal,transmembrana ou retal, são apresentadas na US n° 6.309.663. O composto constituinte ativo da forma de dosagem do tipo sólido, para administração oral, podem ser misturada com pelo menos um aditivo, inclusive sacarose, lactose, celulose, manitol, trealose, rafinose, maltitol, dextrano, amidos, ágar, arginatos, quitinas, quitosanos, pectinas, goma tragacanta, goma arábica, gelatina, colágeno, caseína, albumina, polímero sintético ou semissintético, e glicerídeo. Essas formas de dosagem podem, também, conter outros tipo de aditivos, por exemplo, agente de diluição inativo, lubrificantes como estearato de magnésio, parabeno, agente conservante como ácido sórbico, ácido ascórbico, .alfa.-tocoferol, antioxidantes como cisteína, desintegrador, ligante, espessante, agente tampão, agente adoçante, agente flavorizante, agente perfumante, etc.

[000153] Comprimidos e pílulas podem ser adicionalmente processados em preparações com revestimento entérico. As preparações líquidas para administração oral incluem emulsão, xarope, elixir, suspensão e preparações de soluções permitidas para o uso médico. Essas preparações podem conter agentes diluentes inativos usados usualmente no dito campo, por exemplo, água. Os lipossomas também foram descritos como sistemas de aplicação de medicamentos para insulina e heparina (patente US n° 4.239.754). Mais recentemente, microesferas de polímeros artificiais de aminoácidos mistos (proteinoides) foram usadas para liberar fármacos (patente US n° 4.925.673). Adicionalmente, os compostos de veículo descritos na patente US n° 5.879.681 e na patente US n° 5.871.753, e usados para aplicação via oral de agentes biologicamente ativos, são conhecidos na técnica.

Administração e Formulações Mucosais

[000154] Uma formulação para administração oral de um agente bioativo encapsulado em um ou mais excipientes à base de polímeros ou copolímeros biocompatíveis, de preferência um polímero ou copolímero biodegradável, forma microcápsulas que, devido ao tamanho adequado das mesmas, resultam no fato de o agente alcançar os nódulos linfáticos agregados, também conhecidos como "placa de Peyer" ou "GALT" do animal, e ser absorvido pelos mesmos, sem perda de eficácia devida à passagem do agente através do trato gastrointestinal. Nódulos linfáticos agregados similares podem ser encontrados nos tubos bronquiais (BALT) e no intestino grosso. Os tecidos descritos acima são, em geral, chamados de tecidos linforreticulares associados à mucosa (MALT). Para absorção através de superfícies mucosais, as composições e os métodos de administração de pelo menos um arcabouço de proteína incluem uma emulsão compreendendo uma pluralidade de partículas, uma macromolécula mucoadesiva, um peptídeo bioativo e uma fase aquosa contínua que promove a absorção através das superfícies mucosas ao obter a mucoadesão das partículas da emulsão (patente US n° 5.514.670). As superfícies mucosais adequadas para a aplicação das emulsões da presente invenção podem incluir rotas de administração corneana, conjuntival, bucal, sublingual, nasal, vaginal, pulmonar, estomacal, intestinal e retal. As formulações para a administração vaginal ou retal, por exemplo em supositórios, podem conter excipientes, por exemplo polialquileno glicóis, vaselina, manteiga de cacau e similares. As formulações para a administração intranasal podem ser sólidas e conter como excipientes, por exemplo, lactose, ou pode ser uma solução aquosa ou oleosa de gotas nasais. Para administração bucal, os excipientes incluem açúcares, estearato de cálcio, estearato de magnésio, amido pré-gelatinizado e similares (Patente US n° 5.849.695).

Administração e Formulações Transdérmicas

[000155] Para administração transdérmica, o pelo menos um arcabouço de proteína é encapsulado em um dispositivo de aplicação, como um lipossoma ou nanopartículas, micropartículas, microcápsulas ou microesferas poliméricas (aqui chamadas, coletivamente, de micropartículas, exceto onde especificado em contrário). São conhecidos inúmeros dispositivos adequados, inclusive micropartículas produzidas a partir de polímeros sintéticos, como poliidróxi ácidos, como ácido polilático, ácido poliglicólico e copolímeros dos mesmos, poliortoésteres, polianidridos e polifosfazenos, e polímeros naturais como colágeno, poliaminoácidos, albumina e outras proteínas, alginato e outros polissacarídeos, e combinações dos mesmos (Patente US n° 5.814.599).

Formulações e Administração Prolongada

[000156] Pode ser desejável a liberação dos compostos da presente invenção ao indivíduo ao longo de períodos de tempo prolongados, por exemplo durante períodos de uma semana a um ano, a partir de uma única administração. Várias formas de dosagem de liberação lenta, depósito ou implante podem ser utilizadas. Por exemplo, uma forma de dosagem pode conter um sal não-tóxico farmaceuticamente aceitável dos compostos, com um baixo grau de solubilidade em fluidos corpóreos, por exemplo (a) um sal de adição de ácido com um ácido polibásico, como ácido fosfórico ácido sulfúrico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido tânico, ácido pamoico, ácido algínico, ácido poliglutâmico, ácidos naftaleno mono ou dissulfônicos, ácido poligalacturônico e similares, (b) um sal com um cátion de metal polivalente, como zinco, cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio e similares, ou com um cátion orgânico formado a partir de, por exemplo, N,N'-dibenzil-etileno diamina ou etileno diamina, ou (c) combinações de (a) e (b), por exemplo um sal de tanato de zinco. Adicionalmente, os compostos da presente invenção ou, de preferência, um sal relativamente insolúvel como aqueles descritos acima, podem ser formulados em um gel, por exemplo um gel de monoestearato de alumínio com, por exemplo, óleo de gergelim, adequado para injeção. Os sais particularmente preferenciais são os sais de zinco, sais de tanato de zinco, sais de pamoato e similares. Um outro tipo de formulação de depósito com liberação lenta para injeção poderia conter o composto ou sal disperso para encapsulação em um polímero não-antigênico e não-tóxico de degradação lenta, como um polímero de ácido polilático/ácido poliglicólico, por exemplo conforme descrito na Patente US n° 3.773.919. Os compostos ou, de preferência, os sais relativamente insolúveis, como aqueles descritos acima, também podem ser formulados em péletes silasticos de matriz de colesterol, particularmente para uso em animais. Formulações adicionais para liberação lenta, depósito ou implante, por exemplo lipossomas de gás ou líquido, são conhecidas na literatura (Patente US n° 5.770.222 e "Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems", J. R. Robinson Editor, Marcel Dekker, Inc., NY, EUA, 1978).

[000157] Tendo descrito a invenção em geral, a mesma será entendida mais prontamente por referência aos exemplos a seguir, que são fornecidos por meio de ilustração e não são propositados como limitadores.

Exemplos Exemplo 1 - Design de Tencon

[000158] O terceiro domínio FN3 obtido de Tenascina humana (SEQ. ID N° 3) pode ser usado como um arcabouço alternativo capaz de ser engenheirado para ligar-se a moléculas-alvo específicas por meio de laços expostos na superfície, estruturalmente análogos às regiões determinantes de complementaridade (CDR) do anticorpo. A temperatura de fusão desse domínio é 54°C em PBS, em sua forma nativa. Para produzir uma molécula de arcabouço com estrutura similar e propriedades físicas aprimoradas, como uma estabilidade térmica otimizada, uma sequência de consenso foi projetada com base em um alinhamento de 15 domínios FN3 obtidos de Tenascina humana (SEQ. ID NO: 1 a 15).

[000159] A análise dos alinhamento de múltiplas sequências na Tabela 1 mostra que esses 15 domínios têm entre si identidades de sequência na faixa de 13 a 80%, com uma identidade de sequência média entre pares de 29%. Uma sequência de consenso (SEQ. ID NO: 16) foi criada mediante a incorporação do aminoácido mais conservado (frequente) em cada posição, conforme o alinhamento mostrado na Tabela 1. Em alinhamentos aos pares, a sequência de consenso da presente invenção (SEQ. ID NO:16), designada como Tencon, é idêntico aos domínios FN3 da Tenascina em 34 a 59% das posições, com uma identidade de sequência média de 43%.

Expressão e purificação

[000160] A sequência de aminoácidos da Tencon (SEQ. ID NO: 16) foi transladada de volta, resultando na sequência de DNA mostrada na SEQ. ID NO: 17. Essa sequência foi montada mediante sobreposição de PCR, subclonada em um vetor pET15 modificado, transformada em E. coli BL21Star(DE3) (Invitrogen) e aplicada sobre placas de ágar LB contendo 75 μg/mL de carbenicilina. Uma única colônia foi selecionada e cultivada de um dia para o outro a 37°C, em 50 ml de meio TB contendo 2% de glicose e 100 μg/mL de carbenicilina. Essa cultura foi usada para semear 500 mL de meio de auto-indução (meio Overnight Express Instant TB, Novagen) em um frasco de 2,5 L Ultra Yield (Thomson Instrument Company). A proliferação e a expressão foram feitas usando-se um programa dual (3 horas a 37°C, 300 rpm, seguido de 16 horas a 30°C, 250 rpm) em uma incubadora de agitação ATR Multitron.

[000161] A cultura foi coletada e centrifugada a 7.000 rpm durante 15 minutos em um rotor JL8,1 para formar péletes com as células. As células foram ressuspensas em 30 ml de tampão contendo 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol, 20 mM de imidazol, 0,37 mg/mL de lisozima, 1X de inibidor Complete Protease (isento de EDTA, Roche) e Benzonase (Sigma-Aldrich, 0,25 μl/ml final), e lisadas com um sonicador Misonix XL2020 durante 5 minutos sobre gelo, em modo pulso (5 segundos ligado, 30 segundos desligado). O material insolúvel foi removido por centrifugação a 17.000 rpm durante 30 minutos em um rotor JA-17.

[000162] A proteína Tencon foi purificada a partir do lisado solúvel em um processo cromatográfico em duas etapas. Primeiro, a proteína foi capturada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado, adicionando-se 2 mL de microesferas de agarose Ni-NTA (Qiagen) ao lisado e colocando-o em uma plataforma de agitação durante 1 hora a 4°C. A resina foi, então, compactada em uma coluna Poly-Prep (BioRad) e lavada com 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 20 mM de imidazol, para remover o material não- ligado. As proteínas foram eluídas da resina com 20 mM de fosfato sódico, pH 7,5, 500 mM de NaCl, 10% de glicerol e 500 mM de imidazol. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, tanto com coloração Coomassie como com Western blot, usando-se anticorpo HRP-conjugado anti-His (Immunology Consultants Laboratory). As frações desejadas foram agrupadas e dialisadas em PBS com pH 7,4. Como uma segunda etapa de purificação, a proteína foi carregada em uma coluna Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), equilibrada em PBS. As frações foram analisadas por SDS-PAGE, e aquelas contendo Tencon foram agrupadas e concentradas com o uso de um concentrador Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).

[000163] A concentração de proteína foi determinada usando-se um leitor de placas BioTek, para medir a absorbância da amostra a 280 nm. A preparação final foi analisada por coloração Coomassie (figura 1), Western blot com anticorpo anti-His, e por HPLC-SEC usando-se uma coluna G3000SW-XL (TOSOH Biosciences) equilibrada em PBS. A análise por SDS-PAGE mostra que a Tencon migra entre 6 e 14 kDa, de acordo com a massa esperada de 10,7 kDa para a proteína monomérica. Obteve-se um rendimento de >50 mg de proteína Tencon pura por litro de cultura.

Caracterização biofísica

[000164] A estrutura e a estabilidade da Tencon foram caracterizadas por espectroscopia em dicroísmo circular e calorimetria de varredura diferencial, respectivamente. As medições de dicroísmo circular foram feitas em um espectrômetro AVIV a 20°C em PBS, e com uma concentração de 0,2 mg/mL. O espectro na figura 2 mostra um mínimo a 218 nm, o que sugere uma estrutura em folha β, conforme o esperado para uma proteína pertencente à família FN3, conforme o projetado. Os dados de calorimetria de varredura diferencial foram obtidos mediante aquecimento de soluções a 0,5 mg/mL do 3° domínio FN3 da Tenascina ou da Tencon em PBS, de 35°C a 95°C, a uma velocidade de 1°C/minuto em um calorímetro N- DSCII (Applied Thermodynamics). Uma curva exclusiva do tampão foi subtraída para produzir os perfis mostrados na figura 3. A partir desses dados, as temperaturas de fusão de 54°C e 78°C foram calculadas para o 3° domínio FN3 e para a Tencon, respectivamente, com o uso do software CpCalc (Applied Thermodynamics). A dobragem e desdobragem de ambos os domínios é reversível a essas temperaturas.

Análise da imunogenicidade

[000165] Um programa de computador que modela a imunogenicidade de sequências de aminoácido para seres humanos foi usado para comparar a imunogenicidade predita das sequências de aminoácido representando o 3° domínio FN3 da Tenascina humana, Tencon, e vários anticorpos terapêuticos (mostrado na Tabela 2). As mAbs quiméricas e uma mAb humana (adalimumabe) analisadas com o programa foram seguidas pela aplicação de um limite de tolerância (remove peptídeos de 9 mer com 100% de identidade para sequência codificada por linhagem germinativa humana). O limite de tolerância não foi aplicado à Tenascin ou à Tencon. O limite de tolerância presume ampla tolerância das células T a sequências de mAb codificadas pela linhagem germinativa, e focaliza a análise em sequências inovadoras, primariamente em CDRs e domínios de flanco.

[000166] Essas análises predizem um baixo risco imunogênico tanto para Tenascin como para Tencon com base na probabilidade de que um peptídeo de 9 meros, derivado da sequência analisada, vá ligar-se a uma ou mais moléculas HLA. A pontuação é ponderada em relação à prevalência de cada alelo HLA. As pontuações para os modelos foram somadas para cada sequência, de modo a se obter um único número descrevendo o PIR geral de cada sequência (soma das pontuações). Os resultados dessa análise estão resumidos na Tabela 2. A Tenascina apresentou a pontuação total mais baixa (11,9). A Tencon, como a Tenascina, pontuou principalmente em não-ligantes e agretopos de baixo risco imunogênico predito (pontuação = 13,2). As sequências de Tenascina e Tencon pontuaram favoravelmente em comparação aos anticorpos terapêuticos.

Exibição de Tencon em fago M13 por fusão a pIX

[000167] O gene codificando a sequência de aminoácidos Tencon foi subclonado por PCR no vetor de expressão fagomídio pPep9 e por clonagem com digestão por restrição, resultando no vetor pTencon- pIX. Esse sistema expressa Tencon marcada com Myc no aminoterminal como uma fusão do carbóxi-terminal ao amino-terminal da proteína M13 pIX (Figura 4). O promotor Lac permite níveis mais baixos de expressão sem IPTG e expressão aumentada após a adição de IPTG. A sequência de sinais OmpA foi anexada ao amino-terminal da Tencon para promover uma translocação eficiente para o periplasma. Um ligante TSGGGGS curto (SEQ. ID N° 141) foi construído entre Tencon e pIX para impedir interações estéricas entre essas proteínas.

[000168] Para confirmação da exibição sobre a superfície das partículas de fago M13, pTencon-pIX foi transformada em E. coli XL1- Blue, e uma única colônia foi usada para inocular uma cultura de 5 mL de LB suplementada com ampicilina. Essa cultura foi cultivada a 37°C até atingir a fase mid-log, ponto no qual 610 UFP de fago auxiliar VCSM13 foram adicionadas, sendo a cultura incubada a 37°C durante 10 minutos sem agitação, seguido de 50 minutos sob agitação. A cultura recuperada do fago auxiliar foi, então, diluída em 50 mL de meio 2YT suplementado com ampicilina e canamicina, e cultivado a 37°C sob agitação até O.D.600 atingisse 0,7, ponto no qual se adicionou IPTG até uma concentração final de 1 mM, sendo a temperatura reduzida até 30°C. Após 16 horas, a cultura foi centrifugada a 4.000 X g durante 20 minutos, e o sobrenadante foi coletado e armazenado a 4°C para análise.

[000169] A ligação das partículas de fago a um anticorpo anti-Myc (Invitrogen) foi usada para confirmar a exibição do constructo Myc- Tencon na superfície do fago M13. Uma placa Maxisorp foi revestida de um dia para o outro a uma concentração de 2,5 μg/mL com α-Myc ou um anticorpo anti-αv (controle negativo) e bloqueada com SuperBlock T20 (Pierce). Diluições seriais duplas do sobrenadante da cultura de fagomídio descrita acima foram feitas em PBS e adicionadas às cavidades da placa revestida. Após 1 hora, a placa foi lavada com TBST e um anticorpo α-M13 HRP foi adicionado a cada cavidade e lavado com TBST em seguida a uma incubação de 1 hora. Adicionou-se o substrato Roche BD ELISA POD, e foi detectada luminescência em um leitor de placas (Tecan). A figura 5 mostra que as partículas de fago Myc-Tencon se ligam às cavidades revestidas com α-myc, mas não àquelas com anti-αv ou às cavidades de controle não-revestidas na placa, de maneira dependente da concentração, confirmando a exibição específica de Myc-Tencon nas partículas de fago M13.

[000170] Um vetor de fagomídio adicional pode ser construído para exibir Tencon e membros da biblioteca (vide Exemplo 2) sobre o fago M13 como fusões para revestir a proteína pIII. Para esse sistema, o gene para pIX é substituído por um gene que codifica uma versão truncada de pIII (Bass et al., 1990). Alterações adicional, em comparação ao sistema mostrado na figura 4, incluem a reposição da sequência de sinais OmpA pela sequência de sinais para DsbA, já que a secreção com o uso dessa sequência se mostrou benéfica para a exibição de moléculas de arcabouço alternativo estáveis (Steiner et al., 2006).

Exemplo 2 - Geração de bibliotecas de Tencon

[000171] As bibliotecas de variantes de Tencon podem ser feitas com o uso de muitos métodos diferentes, dependendo da complexidade desejada e da localização relativa das mutações na molécula. Os métodos de síntese de DNA são preferenciais para criar as mutações espalhadas por todo o gene Tencon. A clonagem da enzima de restrição também pode ser usada para recombinar os fragmentos de DNA contendo mutações em regiões diferentes do gene. A saturação de mutagênese em uma pequena região definida, como um único laço de Tencon, pode ser introduzida mediante o uso de um oligonucleotídeo degenerado e de uma mutagênese direta do oligonucleotídeo (Kunkel et al., 1987).

[000172] Foi construída uma biblioteca Tencon, a biblioteca FG7, projetada para substituir o laço FG por 7 aminoácidos aleatórios com o uso de mutagênese dirigida por oligonucleotídeo. Um oligonucleotídeo (TconFG7-For-5’pho) foi sintetizado para ter uma sequência degenerada de 21 pares de base (pb) de NNS nas posições que codificam o laço FG e duas sequências de nucleotídeo de flanco com 20 a 27 bp de complementaridade com a sequência de codificação do Tencon. Nesse design, todos os vinte aminoácidos são capazes de representação no laço FG. A diversidade calculada no nível de nucleotídeo é de 1,3 x 109. TconFG7-For5’pho: (SEQ. ID NO: 18) GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNS NNSCCGCTGTCTGCGGAATTCAC

[000173] O molde para mutagênese dirigida por oligonucleotídeo, pDsbA-Tencon-Asc-laço-Myc-pIII, foi construído mediante a substituição do laço F:G da Tencon que codifica a sequência por um sequência haste-laço contendo um sítio de restrição AscI. Esse sistema permite a eliminação do DNA de molde inicial após a mutagênese, mediante digestão do DNA resultante com AscI antes da transformação. Para purificar um molde de DNA de filamento único para a mutagênese, uma única colônia de E. coli CJ236 portando pDsbA-Tencon-Asc-laço-Myc-pIII foi colocada em 5 mL de meio de crescimento 2YT com carbenicilina (50 ug/ml de concentração final) e cloranfenicol (10 ug/ml). Após 6 horas, o fago auxiliar VCSM13 foi adicionado até uma concentração final de 1010 UFP/ml, e incubado sem agitação durante 10 minutos, antes de ser transferido para 150 mL de 2YT com carbenicilina (10 ug/ml) e uridina (0,25 ug/ml) e incubado a 37°C sob agitação a 200 rpm, de um dia para o outro. As células foram agrupadas em péletes por centrifugação, o sobrenadante foi coletado e o fago foi agrupado em peletes com PEG NaCl. O DNA de filamento único foi purificado a partir desse pélete, usando-se um kit QIAprep Spin M13 (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[000174] Para a ligação por recozimento do oligonucleotídeo degenerado ao molde, 5 μg do DNA de molde foram combinados com oligo TconFG7-For-5-pho a uma razão molar de 10:1 em Tris-HCl (50 mM, pH 7,5) e MgCl2 (10 mM), com incubação a 90°C durante 2 minutos, 60°C durante 3 minutos, e 20°C durante 5 minutos. Após a reação de recozimento, ATP (10 mM), dNTPs (25 mM cada), DTT (100 mM), T4 ligase (7 unidades) e T7 DNA polimerase (10 unidades) foram adicionados à mistura de reação, com incubação a 14°C durante 6 horas, seguida de 20°C durante 12 horas. O DNA resultante foi purificado com o uso de um kit de purificação por PCR (Qiagen), e recuperado em 100 μL de água. O DNA da biblioteca foi digerido com 10 unidades de AscI durante 4 horas e, então, purificado novamente com o kit de purificação por PCR da Qiagen. O DNA final da biblioteca foi recuperado em 50 μL de água. O produto de DNA de filamento duplo resultante foi, então, transformado em E. coli MC1061F’ por eletroporação.

[000175] Os transformantes foram coletados em 20 mL de meio SOC, e deixados recuperar durante 1 hora a 37°C. Ao final da recuperação, uma alíquota da transformação foi submetida à diluição serial e aplicada sobre placas com carbenicilina (100 ug/ml) contendo 1% de glicose para avaliar o número total de transformantes. O restante da cultura SOC foi, então, usado para inocular 1 L de meio 2xYT com carbenicilina e 1% de glicose, sendo cultivado até que OD600 atingisse 0,6. Inoculou-se 100 mL dessa cultura com fago auxiliar M13 a 1010/mL, incubando-se a 37°C antes da centrifugação. O pélete de células resultante foi ressuspenso em 500 mL de meio 2xYT sem uso prévio contendo carbenicilina (100 ug/mL) e canamicina (35 ug/mL) e cultivado a 30°C de um dia para o outro, antes da centrifugação. As partículas de fago foram precipitadas mediante a adição de PEG/NaCl e armazenadas a -80°C.

[000176] Uma segunda biblioteca, BC6/FG7, foi projetada para simultaneamente introduzir diversidade nos laços B:C e F:G da Tencon. Para tanto, foram sintetizados dois oligonucleotídeos: Tc- BC6-For-5’phos e POP149. O oligo direto era fosforilado e continha 18 bases de códon NNS em cada posição codificando o laço B:C, enquanto o oligo reverso era biotinilado na extremidade 5’ e continha 21 bases de códon NNS em cada posição codificando o laço F:G. Ambos os oligonucleotídeos são flanqueados por duas sequências de nucleotídeo de 18 pb idênticos à região precedente e seguinte à região a ser mutagenizada (consulte abaixo para obter detalhes sobre o iniciador). Tc-BC6-For-5’phos: (SEQ. ID N° 19) gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCT GATCCAGTACC POP 2149: (SEQ. ID N° 20) GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAAC ACCGTAGATAGAAACGGTG

[000177] Para construir a biblioteca, dezesseis reações de PCR de 100 μL foram realizadas usando os oligos Tc-CB6-For5’phos e POP2149 para amplificar o molde de DNA para Tencon, introduzindo códons NNS nos laços B:C e F:G simultaneamente no processo. O produto de PCR com filamentos duplos foi misturado a microesferas magnéticas de estreptavidina (Dynal) em tampão B&W (10 mM Tris- HCl, pH 7,5, 1 mM de EDTA, 2 M de NaCl, 0,1% de Tween-20) e incubado durante 20 minutos, puxado para baixo com um magneto e lavado duas vezes com tampão B&W. O filamento direto foi eluído das microesferas com 300 μL de 150 mM NaOH. Esse "megainiciador", uma mistura de iniciadores longos com mais de 8 x 1016 em diversidade teórica, foi usado para a ligação por recozimento a um molde de biblioteca de filamento único. A construção da biblioteca foi realizada conforme descrito acima para a biblioteca FG7.

Exemplo 3 - Seleção de ligantes IgG

[000178] Para realizar as seleções dos membros da biblioteca Tencon que se ligam a IgG, um IgG recombinante (subtipo IgG1 humano) foi biotinilado com o uso de sulfo-NHS-LC-biotina (Pierce) antes de diálise em PBS. Para as seleções, 200 μL de fagos exibindo as bibliotecas FG7 ou BC6/FG7 foram bloqueados com 200 μL de bloqueador químico antes da adição de IgG biotinilado a concentrações de 500 nM (ciclo 1) ou 100 nM (ciclos 2 e 3). Os fagos ligados foram recuperados por microesferas magnéticas com neutravidina (Seradyne) no ciclo 1, ou com microesferas magnéticas com estreptavidina (Promega) nos ciclos 2 e 3. Os fagos não-ligados foram lavados das microesferas com o uso de 5 a 10 lavagens com 1 mL de solução salina Tris tamponada com Tween (TBST), seguido de duas lavagens de 1 mL com solução salina Tris tamponada (TBS). Os fagos ligados foram eluídos das microesferas mediante a adição de E. coli MC1061F’ em fase mid-log. As células infectadas foram colocadas placas de ágar LB suplementadas com carbenicilina e glicose. No próximo dia, as células foram raspadas da placa e cultivadas até a fase mid-log, antes de recuperação com fago auxiliar VCSM13 e cultivo de um dia para o outro. As partículas de fago foram isoladas por precipitação em PEG/NaCl e usadas para o ciclo de seleções seguinte.

[000179] Após 3 ciclos de panning contra IgG, o resultado foi subclonado em um vetor pET27 modificado para incluir um sítio de clonagem independente de ligase, mediante amplificação por PCR do gene Tencon. Esse produto de PCR foi ligado por recozimento ao vetor e transformado em células BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). As colônias individuais foram coletadas em culturas de 1 mL em placas com 96 cavidades profundas (Corning) e cultivadas até a saturação de um dia para o outro, a 37°C. No dia seguinte, 50 μL da cultura feita de um dia para o outro foram usados para inocular uma cultura de 1 mL sem uso prévio. As culturas foram cultivadas a 37°C durante 2 horas antes da adição de IPTG a 1 mM e da redução da temperatura para 30°C. As células foram coletadas por centrifugação 16 horas após a indução, e lisadas com 100 μL de BugBuster (Novagen). Os lisados resultantes foram clarificados por centrifugação e usados para testar quanto à ligação a IgG por meio de ELISA.

[000180] Placas Maxisorp (Nunc) foram revestidas com 0,1 μg de anticorpos anti-HIS (Qiagen), deixadas de um dia para o outro, lavadas com TBST e bloqueadas com Starting Block T20 (Thermo Scientific). Os lisados clarificados diluídos a 1:4 em Starting Block foram adicionados às placas e deixados ligar durante 1 hora antes da lavagem com TBST. Adicionou-se IgG biotinilado ou HSA biotinilado a uma concentração de 1 μg/ml, lavando-se com TBST após 1 hora de incubação. A detecção de IgG ou HSA ligado foi obtida pela adição de estreptavidina-HRP (Jackson Immunoresearch), seguida de detecção com substrato POD para quimioluminescência. Os resultados do teste ELISA são mostrados na Figura 7. Foram sequenciados os constructos que se ligaram a IgG biotinilado mais de 10 vezes em comparação ao HSA biotinilado, conforme julgado pelo sinal de ELISA. Após a conclusão de vários experimentos de seleção, foram obtidas 60 sequências de ligação exclusivas da biblioteca FG7 e 10 sequências exclusivas da biblioteca BC6FG7, sendo que a Tabela 4 mostra sequências representativas de ligantes IgG em que os laços B:C e/ou F:G são mostrados na medida em que são diferentes daqueles da SEQ. ID N° 16. Na Tabela 4 são mostradas, também, numerosas mutações em outras regiões do arcabouço.

[000181] A proteína Tencon projetada, expressa e purificada na presente invenção tem uma estabilidade térmica aprimorada em 26°C em relação àquela do 3° domínio FN3 da Tenascina humana, a qual foi usada como uma molécula de arcabouço alternativo. Com base nesse aumento de estabilidade, essa molécula de arcabouço está propensa a ser mais compatível com a substituição de aminoácidos, e mais fácil de fabricar. As mutações que diminuem a estabilidade da proteína tendem a ser melhor toleradas no contexto de um arcabouço mais estável e, portanto, um arcabouço com estabilidade otimizada está propenso a produzir ligantes mais funcionais e bem dobrados a partir de uma biblioteca de variantes de arcabouço. Como essa proteína inovadora não é uma proteína codificada pelo genoma humano, a mesma pode também oferecer menos riscos em relação à geração de uma resposta imunológica que o risco contra, por exemplo, Tenascina humana nativa quanto usada como agente terapêutico (essencialmente, menos risco que com um terapêutico baseado no domínio de tipo selvagem).

[000182] Para os propósitos da presente invenção, de 70 a 100% de identidade da sequência de aminoácido ou de nucleotídeo (isto é, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ou qualquer faixa ou valor nesse intervalo) é determinado usando-se um algoritmo de computador adequado, conforme é conhecido na técnica.

[000183] Ficará claro que a invenção pode ser posta em prática de outro modo do que aquele particularmente descrito na descrição e exemplos acima mencionados. Modificações numerosas e variações da presente invenção são possíveis à luz dos ensinamentos acima e, portanto, estão dentro do escopo das reivindicaçãoes em anexo.Tabela 1

Tabela 2

Sequências: SEQ. ID N° 1: sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfir vfailenkksipvsarvat SEQ. ID N° 2: tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqe yeislhivknntrgpglkrvtttrld SEQ. ID N° 3: dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevsli srrgdmssnpaketftt SEQ. ID N° 4 tgldaprnlrrvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgte ygigvsavkedkesnpatinaateldtpkd SEQ. ID N° 5 dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltae kgrhkskpakskparvk SEQ. ID N° 6 qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatp ytvsiygviqgyrtpvlsaeastge SEQ. ID N° 7 etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaat hytitirgvtqdfsttplsvevlte SEQ. ID N° 8 evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragt pytvtlhgevrghstrplavevvte SEQ. ID N° 9 dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaat pyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe SEQ. ID N° 10 kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglppstdfivyl sglapsirtktisatatte SEQ. ID N° 11 alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevm vsgftqghqtkplraeivte SEQ. ID N° 12 aepevdnllvsdatpdgfrlswtadegvfdnfvlkirdtkkqsepleitllapertrdltglreateyeiel ygiskgrrsqtvsaiattam SEQ. ID N° 13 gspkevifsditensatvswraptaqvesfrityvpitggtpsmvtvdgtktqtrlvklipgveylvsiia mkgfeesepvsgsfttal SEQ. ID N° 14 dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepateytlrifa ekgpqksstitakfttdl SEQ. ID N° 15 dsprdltatevqsetalltwrpprasvtgyllvyesvdgtvkevivgpdttsysladlspsthytakiqa lngplrsnmiqtifttigl SEQ. ID N° 16 LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT SEQ. ID N° 17 ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgtcttggaccg cgccggacgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaagttggtgaagcg atcaacctgaccgttccgggttctgaacgttcttacgacctgaccggtctgaaaccgggtaccgaa tacaccgtttctatctacggtgttaaaggtggtcaccgttctaacccgctgtctgcggaattcaccac cSequência de Tencon mostrando laços (SEQ. ID N° 16)

Tabela 3 - laços de Tencon

Tabela 4 - arcabouços ligando-se a IgG

Claims (13)

1. Proteína de arcabouço, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16.

2. Método para construção de uma biblioteca de uma proteína de arcabouço, como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: obter um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16; e introduzir diversidade em cópias do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 para formar a biblioteca de proteína de arcabouço, em que a etapa de introdução de diversidade compreende a mutação de pelo menos uma região de loop selecionada dentre o grupo que consiste em ou próximos aos resíduos nas posições 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 e 75-81 da SEQ ID NO: 16.

3. Biblioteca, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método, como definido na reivindicação 2.

4. Método para generação de uma proteína de arcabouço que se liga a um alvo específico com uma afinidade de ligação predefinida, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a biblioteca, como definida na reivindicação 3, em contato com o alvo específico, e isolar uma proteína de arcabouço que se ligue ao alvo específico com a afinidade predefinida.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende isolar moléculas de arcabouço que se ligam ao alvo específico, e testar as moléculas de arcabouço isoladas quanto a sua afinidade de ligação ao alvo específico, em que opcionalmente: (i) a etapa de isolamento compreende filtrar a biblioteca com o alvo específico, identificar moléculas do alcabouço que se ligam ao alvo específico e isolar as moléculas do arbabouço de ligação; ou (ii) a afinidade é menor ou igual a cerca de 10-7M.

6. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 17.

7. Vetor de ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 6.

8. Célula hospedeira originada de bacteria ou levedura, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 6.

9. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que consiste em pelo menos uma célula selecionada dentre E. coli BL21Star(DE3), outra célula de E. coli e levedura.

10. Composição, caracterizado pelo fato de que compreende a proteína de arcabouço, como definida na reivindicação 1, e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

11. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende a proteína de arcabouço, como definida na reivindicação 1, em que o referido dispositivo é adequado para entrar em contato com, ou administrar, a referida proteína de arcabouço por pelo menos um modo selecionado dentre parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabrônquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavidade, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocárdico, intraósteo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal e transdérmico.

12. Artigo de fabricação para uso diagnóstico ou farmacêutico em ser humano, caracterizado pelo fato de que compreende material de embalagem e um recipiente compreendendo uma solução ou uma forma liofilizada da proteína de arcabouço, como definida na reivindicação 1.

13. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido recipiente é um componente de um dispositivo ou sistema de aplicação parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articulatório, intrabronquico, intra-abdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitário, intracelíaco, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intra-hepático, intramiocardíaco, intraósseo, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretiniano, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesicular, intralesional, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdérmico.

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