RS55218B1 - Kompozicije fibronektin tip iii skalno baziranih domena, metode i upotrebe - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na skalni protein sa novim svojstvima, uključujući sposobnost da se veže na ćelijske mete. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na skalni protein baziran na ponovljanju konsenzus sekvence fibronektina tipa III (FN3).

POZADINA PRONALASKA

[0002]Monoklonalna antitela su najraširenija klasa terapijskih proteina kada su željeni visoki afinitet i specifičnost za ciljani molekul. Međutim, ne-antitielo proteini koji mogu biti konstruisani da vežu takve mete su od velikog interesa u biofarmaceutskoj industriji. Ovi "alternativni skalni" proteini mogu imati prednosti u odnosu na tradicionalna antitela zbog njihove male veličine, nedostatka disulfidm'h veza, visoke stabilnosti i sposobnosti da budu izraženi u prokariotskim domačinama. Nove metode prečišćavanja se lako primenjuju; oni su tako konjugovani sa tekovima/toksinima, prodiru efikasno u tkivo i lako su formatirani u multispecifična veziva (Skerra 2000; Binz and Pluckthun 2005).

[0003]Jedan takav alternativni skafold je sklop imunogtobutina (Ig). Ovaj sklop je nađen u varijabilnim regijama antitela, kao i hiljadama proteina ne-antitela. Pokazano je da jedan takav Ig protein, deseti fibronektin tipa III (FN3) ponovljen iz ljudskog fibronektina može tolerisati broj mutacija u površinski izloženim petljama zadržavajući ukupnu Ig-strukturu sklopa. Tako, biblioteke varijanti a mi no kiseli na su ugrađene u ove petlje i specifična veziva izabrana za više različitih meta (Koide et al. 1998; Karatan et al. 2004). Pronađeno je da se tako konstruisane FN3 domene vežu za mete sa visokim afinitetom, uz zadržavanje važnih biofizičkih svojstava (Parker et al. 2005).

[0004] Poželjna fizička svojstva potencijalnih alternativnih skalnih molekula uključuju visoku termičku stabilnost i reverzibilnost termičkog savijanja i odvijanja. Primenjeno je nekoliko metoda za povećanje prividne termičke stabilnosti proteina i enzima, uključujući racionalni dizajn baziran na poređenju sa vrlo sličnim termostabilnim sekvencama, dizajn stabilizirajućih disulfidm'h mostova, mutacije da se poveća a-heliks sklonost, inženjering soli mostova, menjanje naelektrisanja površine proteina, usmerenu evoluciju, i kompoziciju konsenzus sekvenci (Lehmann and Wyss 2001). Visoka termička stabilnost je poželjno svojstvo takvih skafolda, jer to može povećati prinos dobijenog rekombinantnog proteina, poboljšati rastvorljivost prečišćenog molekula, poboljšati aktivnost intraćetijskih skafolda, smanjiti imunogenost, i minimizirati potrebu hladnog lanca u proizvodnji.

[0005]W0-02-04523-A2 i US 2008/220049 A1 se odnose se na domen desetog Fibronektina tipa III.

REZIME PRONALASKA

[0006]Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani skalni protein koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 75% identičnosti od SEQID NO: 16, koja ima 7 lanaca i 6 petlji između lanaca, i koja sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 16, ali u kojoj je jedna ili više petlji promenjeno u cilju da se vežu za metu dok lanci zadržavaju svoju sekvencu kao delove okosnice, pri čemu su petlje na ostacima 13-16, 22-28, 38-43, 51-54 , 60-64 i 75-81 od SEQ ID NO: 16, a sposobne su za vezivanje za ćelijske proteine i/ili molekule nukleinske kiseline.

[0007]Pronalazak takođe obezbeđuje metod izgradnje biblioteke skalnih proteina prema pronalasku, obuhvatajući korake obezbeđivanja polipeptida koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ. ID NO: 16; i uvođenje različitosti u kopije polipeptiđa koje imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID N0:16 da se formira biblioteka skalnih proteina, pri čemu uvođenje koraka različitosti opciono sadrži mutiranje najmanje jedne regije petlje izabrane iz grupe koja se sastoji od ostataka na ili oko pozicija 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64, i 75-81 od SEQ ID NO:16.

[0008]Pronalazak takođe obezbeđuje biblioteku proizvedenu metodom prema pronalasku.

[0009]Pronalazak takođe obezbeđuje metod za generisanje vezujućeg skalnog proteina za određenu metu sa unapred definisanim afinitetom vezivanja, koji sadrži dovođenje u kontakt biblioteke iz pronalaska sa određenom metom i izolovanje vezujućeg skalnog proteina za određenu metu sa unapred definisanim afinitetom.

[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira skalni protein iz pronalaska.

[0011 ]Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani vektor nukleinske kiseline koji obuhvata izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0012]Pronalazak takođe obezbeđuje prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz pronalaska, pri čemu je navedena ćelija domaćina opciono najmanje jedna izabrana iz E. koli BL21Star (DE3), druge ćelije E. koli, kvasca, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mijeloma ili ćelija limfoma, ili bilo kojeg derivata, besmrtne ili transformisane ćelije od njih.

[0013]Pronalazak takođe obezbeđuje kompoziciju koja sadrži skalni protein iz pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživać, koji opciono dalje sadrži najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid izabran od detektabilnih oznaka ili reportera, TNF antagonista, anti-infektivnog teka, teka kardiovaskularnog (CV) sistema, leka centralnog nervnog sistema (CNS), teka autonomnog nervnog sistema (AKS), teka respiratornog trakta, teka gastrointestinalniog (Gl) trakta, hormonskog leka, teka za ravnotežu tečnosti iti elektrolita, hematološkog leka, antineoptastičnog, imunomodulacionog leka, oftalmološkog, otičkog ili nazalnog leka, topičkog leka, nutricionog leka, citokina, ili antagonista citokina.

[0014]Pronalazak takođe obezbeđuje medicinski uređaj, koji obuhvata skalni protein iz pronalaska , pri čemu je navedeni uređaj pogodan za kontaktiranje ili primenu navedenog skalnog proteina najmanje jednim načinom izabranim od parenteralnog, supkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginoznog, intrakavitalnog, intracelularnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastiČnog, intrahepatičnog, intramiokardijatnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardi jalnog, intraperitonealnog, intrapteuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonalnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterinog, intravezikalnog, intralezionalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog.

[0015]Pronatazak takođe obezbeđuje artkal proizvodnje za farmaceutsku ili dijagnostičku upotrebu kod ljudi, koja obuhvata materijal za pakovanje i kontejner koji sadrži rastvor ili liofilizovani oblik skalnog proteina iz pronalaska, pri čemu je navedeni kontejner opciono komponenta parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhijalnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginoznog, intrakavitalnog, intracelularnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastiČnog, intrahepatičnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardi jalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonarnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterinog, intravezikalnog, intralezionalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog, ili transdermalnog uređaja za isporuku ili sistema.

REZIME

[0016]Ovde je otkriven skatni protein baziran na fibronektinu tipa III (FN3) ponovljenog proteina, kodirajuće ili komplementarne nukleinske kiseline, vektora, ćelija domaćina, kompozicija, kombinacija, formulacija, uređaja, i metoda za njihovo pripremanje i korišćenje. U poželjnom izvođenju, skalni protein se sastoji od konsenzus sekvence višestrukih FN3 domena iz ljudskog Tenascina-C (u daljem tekstu "Tenascin"). U daljem poželjnom izvođenju, skalni protein iz ovog pronalaska je konsenzus sekvence 15 FN3 domena. Skalni protein iz pronalaska može biti dizajniran da veže različite molekule, na primer, ćelijski ciljni protein.

[0017]Skalni protein iz pronalaska može uključiti dodatne molekule ili delove funkcionalne grupe, na primer, Fc region antitela, vezujući domen albumina, ili drugi deo funkcionalne grupe koji utiču na vreme poluraspada. U daljim izvođenjima, skalni proteina iz pronalaska može biti vezan za molekul nukleinske kiseline koji može kodirati skalni protein.

[0018]Ovde je otkriven najmanje jedan metod za ekspresiju najmanje jednog skalnog proteina na osnovu konsenzusa sekvence višestrukih FN3 domena, u ćeliji domaćina, koji obuhvata kultivirajuću ćeliju domaćina kao što je ovde opisano pod uslovima pri čemu je najmanje jedan skalni protein izražen u detektibilnim i/ili nadoknadivim količinama.

[0019]Ovde je takođe otkrivena najmanje jedna kompozicija koja obuhvata (a) skalni protein na osnovu konsenzusa sekvence višestrukih FN3 domena i/ili kodirajuću nukleinsku kiselinu kao Što je opisano ovde; i (b) pogodni i/ili farmaceutski prihvatljiv nosač ili razbtaživač.

[0020]Ovo otkriće dalje obuhvata metod generisanja biblioteka skalnog proteina na osnovu fibronektina tipa III (FN3) ponovljenog proteina, poželjno, konsenzus sekvence višestrukih FN3 domena i, poželjnije, konsenzus sekvence višestrukih FN3 domena iz ljudskog Tenascina. Biblioteka je formirana pravljenjem sukcesivnih generacija skafolda menjanjem (mutacijom) amino kiselina iti broja aminokiselina u molekulima u određenim pozicijama u delovima skafolda, na primer, regiji petlje. Biblioteke mogu biti generisane pramenom kompozicije amino kiseline pojedinačne petlje ili istovremenom promenom više petlji ili dodatnim pozicijama skalnih molekula. Petlje koje su izmenjene mogu prema tome biti produžene ili skraćene. Takve biblioteke mogu biti generisane da uključe sve moguće aminokiseline na svakoj poziciji, ili -dizajnirani podskup aminokiselina. Članovi biblioteke mogu biti korišćeni za skrining pomoću displeja, kao što je in vitro displej (DNA, RNA, displej ribozoma, itd.), kvasca, bakterije i displej faga.

[0021]Skalni protein iz ovog pronalaska obezbeđuje poboljšana biofizička svojstva, kao Što su stabilnost pod redukcijskim uslovima i rastvortjivost pri visokim koncentracijama; oni mogu biti izraženi i presavijeni u prokariotskim sistemima, kao što je E. koli, u eukariotskim sistemima, kao što je kvasac, i u in vitro transkripciji/translaciji sistema, kao što je sistem lizata retikulocita zeca.

[0022]U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje metod generisanja skalnog molekula koji se veže na određenu metu pomeranjem skalne biblioteke iz pronalaska sa metom i otkrivanjem veziva. U drugim srodnim aspektima, otkriće obuhvata skrining metode koje mogu biti korišćene za generisanje ili afinitet zrelog skalnog proteina sa željenom aktivnosti, npr., koja je sposobna da se veže na ciljne proteine sa određenim afinitetom. Sazrevanje afiniteta se može postići ponavljajućim krugovima mutageneze i selekcijom koriŠćenja sistema, kao što je displej faga ili in vitro displej. Mutageneza tokom ovog procesa može biti rezultat mutageneze na određenim ostacima skafolda, slučajne mutageneze zbog mogućnosti grešaka PCR, DNAmešanja, i/ili kombinacija ovih tehnika.

OPIS SLIKA

[0023]Slika 1. SDS-PAGE analiza prečišćenog Tencona izvedena na NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen) i obojana sa kumasi plavom. N označava prirodne uslove i R redukovane uslove.

Slika 2. Cirkutarna dihroizam analiza Tencona u PBS-u

Slika 3. DSC analiza 3. FN3 domene iz Tenascina i Tencona u PBS-u. Temperature topljenja od 54°C do 78<*>C, su dobijene respektivno.

Slika 4. Fagemid plazmid dizajn od pTencona- p!X. Ekspresija je vođena putem Lac promotera i sekrecije preko OmpA signalne sekvence.

Slika 5. Displej od Myc-Tencona na M13 fagu. ELIZA rezultati pokazuju vezivanje faga na a- Myc obložen, CNTO 95 obložen i neobložene jažice.

Slika 6. Struktura petlje od 3. FN3 domena humanog Tenascina.

Slika 7. Skrining izlaza IgG izabranog pomoću ELIZA testa. Pojedinačni klonovi su testirani za vezivanje za biotinilisani IgG ili biotinilisani HSA kao kontrolom.

OPIS PRONALASKA

[0024]Ovde je prikazan izolovani, rekombinantni i/ili sintetski skalni protein na osnovu konsenzusa sekvence fibronektina tipa III (FN3) ponovljenog proteina, uključujući, bez ograničenja, izvedene skafolde sisara, kao i kompozicije i kodirajuće molekule nukleinske kiseline koji sadrže najmanje jedan polinukleotid koji kodira skelu proteina na osnovu konsenzusa FN3 sekvence. Prikazani pronalazak dalje uključuje, ali bez ograničenja na, metode pripremanja i koriŠćenja takvih nukleinskih kiselina i skalnog proteina, uključujući dijagnostičke i terapijske kompozicije, metode i uređaje.

[0025] Skalni protein iz ovog pronalaska nudi prednosti preko konvencionalnih terapeutika, kao što je sposobnost da se primeni lokalno, oralno, ili pređe krvno-moždanu barijeru, sposobnost da se izrazi u E. Koli omogućavajući povećanu ekspresiju proteina kao funkciju resursa u odnosu na sposobnost ekspresije ćelije sisara da bude ugrađena u bispecifičnim molekulima koji se vežu na više meta ili više epitopa iste mete, sposobnosti da bude konjugovan sa lekovima, polimerima i sondama, sposobnosti da bude formulisan u visokim koncentracijama, i sposobnosti takvih molekula da efikasno prodru u obolela tkiva i tumore.

[0026]Štaviše, skalni protein poseduje mnoga svojstva antitela u odnosu prema njihovom freklopu koji imitira-oponaša varijabilnu regiju antitela. Ova orijentacija omogućuje FN3 petljama da budu izložene slično regijama koji određuje komplementarnost na antitelu (CDRs). One treba da budu u stanju da se vežu za ćelijske mete i petlje mogu biti izmenjene npr., afinitetom sazrevanja, za poboljšanje određenih vezivanja ili povezanih svojstava.

[0027]Tri od šest petlji skalnog proteina iz pronalaska odgovaraju topološki regijama koje određuju komplementarnost (CDRs1-3), tj. antigen-vezujućim regijama, od antitela, dok su tri preostale petlje izložene na površini na način sličan na CDRs antitela. Ovaj raspon petlji na ili oko ostataka 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 i 75-81 od SEQ ID NO: 16 je kao što je prikazano u Tabeli 3 ispod i na Slici 6. Poželjno, regije petlje na ili oko ostataka 22-28, 51-54 i 75-81 su promenjene za specifičnost vezivanja i afinitet. Jedna ili više ovih regija petlji su nasumično izabrane sa drugim regijama petlje i/iti drugim lancima koji održavaju njihove sekvence kao delove skeleta da popune biblioteku i potentn-snažna veziva mogu biti odabrana iz biblioteke koji ima visoki afinitet za određeni đlj-metu proteina- Jedna ili više regija petlji može biti u interakciji sa ciljnim proteinom slično CDR interakciji antitela sa proteinom.

[0028] Skafotdi iz ovog pronalaska mogu uključiti i druge podjedinice, npr. preko kovalentne interakcije. Sve iti deo konstantne regije antitela može biti spojeno na skafold da prenesu antitelu-slična svojstva, na primer, dopunsku aktivnost (ADCC), vreme poluraspada, itd., Na primer, efektorna funkcija može biti obezbeđena i/iti kontrolisana, npr., modifikovanjem C1q vezivanja i/ili FcyR vezivanja i time menjajući CDC aktivnost i/ili ADCC aktivnost. "Efektorske funkcije" su odgovorne za aktiviranje ili smanjenje biološke aktivnosti (npr., kod subjekta). Primeri efektorskih funkcija uključuju, ati nisu ograničeni na: C1q vezivanje; komptement zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptor vezivanja; antitelo zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju površinskih receptora ćelije (npr., receptor B ćelije, BCR) itd. Takve efektorske funkcije mogu zahtevati Fc regiju da bude kombinovana sa vezujućom domenom (npr., petlje skelnog proteina) i mogu biti procenjene korišćenjem različitih testova (npr., Fc testovi vezivanja, ADCC testovi, CDC testovi itd.)

[0029] Dodatno, konjugat toksina, albumin ili veziva albumina, potietilen gtikol (PEG), molekuli mogu biti prikačeni na skafold molekula za željena svojstva. Bilo koje od ovih fuzija mogu biti generisane standardnim tehnikama, na primer, ekspresijom fuzionog proteina iz rekombinantnog fuzionog gena konstruisanog upotrebom javno dostupnih genskih sekvenci.

[0030] Skafoldi iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni kao monospecifični u monomernom obliku ili kao bi-ili multi-specifični (za različite proteinske mete ili epitope na istom ciljnom proteinu) u multimerom obliku. Veze mogu biti kovalentne ili ne-kovalentne. Na primer, dimerni bispecifični skafold ima jednu podjedinicu sa specifičnošću za prvi ciljni protein ili epitop, i drugu podjedinicu sa specifičnošću za drugi ciljni protein iti epitop. Skatne subjedinice mogu biti spojene u različitim konformacijama koje mogu povećati valencu, a tako i sklonost vezivanja antigena.

[0031] Kao što se ovde koristi, "antitelo" uključuje bilo koji protein ili peptid sadržavajući molekul koji obuhvata najmanje jedan deo imunoglobulinskog molekula, kao što je ali bez ograničenja najmanje jedna regiju koja određuje komplementarnost (CDR) teškog ili lakog lanca ili deo vezujućeg Uganda od njih, teškog lanca ili varijabilnu regiju lakog lanca, teškog ili lakog lanca konstantne regije, okvirnu regiju, ili bilo koji deo od njih. Takvo antitelo opciono dalje deluje na specifičan tigand, kao što je, ali bez ograničenja na, gde takvo antitelo modulira, smanjuje, povećava, antagonizuje, agonizuje, ublažava, olakšava, blokira, inhibira, prekida i/ili interferira sa najmanje jednom aktivnošću ili vezivanjem, iti sa aktivnošću receptora iti vezivanjem, in vitro, na licu mesta i/ili in vivo.

[0032] Termin "antitelo" je dalje namenjen da obuhvata antitela, fragmente digestije, specificrane delove i varijante od njih, uključujući, bez ograničenja, mimetike antitela ili obuhvatajući delove antitela koji oponašaju strukturu i/ili funkciju antitela ili specificirani fragment ili deo od njih, uključujući, bez ograničenja, jednotančana antitela, jednu domenu antitela, i fragmente od njih. Funkcionalni fragmenti uključuju antigen-vezujuće fragmente koji se vežu za određenu metu. Na primer, fragmenti antitela sposobni vezivanju za određenu metu ili delove od njih, uključujući, ati bez ograničenja na Fab (npr., papainskom digestijom), Fab (npr., pepsinskom digestijom i parcijalnom redukcijom) i F(ab>2 (npr., pepsinskom digestijom), facb (npr. digestijom plazmina), pFc'(npr. digestijom pepsina ili plazmina), Fd (npr., pepsinskom digestijom, parcijalnom redukcijom i reagregacijom), Fv ili scFv (npr., tehnikama molekularne biologije) fragmentima, su obuhvaćeni putem otkrića (videti, npr., Coltigan, Immunologv, supra).

[0033] Takvi fragmenti mogu biti proizvedeni enzimskim cepanjem, sintetskim ili rekombinantnim tehnikama, kao što je poznato u stanju tehnike i/ili kao što je opisano ovde. Antitela mogu takođe biti proizvedena u različitim skraćenim oblicima upotrebljavajući gene antitela u kojima je jedan ili više stop kodona uvedeno uzvodno od prirodne stope mesta. Na primer, kombinacija gena koji kodira F(ab')ideo teškog lanca može biti dizajnirana da uključi DNA sekvence koje kodiraju CH, domenu i/ili zglobnu regiju teškog lanca. Različiti delovi antitela mogu biti hemijski spojeni zajedno konvencionalnim tehnikama, ili mogu biti pripremljeni kao susedni protein korišćenjem tehnika genetskog inženjeringa.

[0034] Skatni protein ovog pronalaska može biti korišćen za merenje efekta u ćeliji, tkivu, organu ili životinji (uključujući sisare i ljude), za dijagnozu, monitor, modulaciju, tečenje, ublažavanje, kao pomoć u prevenciji pojave, ili smanjenju simptoma, najmanje jedne bolesti ili stanja, odabranog od, ati bez ograničenja na, najmanje jedan imunološki poremećaj iti bolest, kardiovaskularni poremećaj ili bolest, infekciju, maligni i/ili neurološki poremećaj iti bolest, ili drugo poznato ili specificirano povezano stanje.

[0035] Takav metod može obuhvatiti primenu efikasne količine kompozicuje iti farmaceutske kompozicije obuhvatajući najmanje jedan skalni protein u ćeliji, tkivu, organu, životinji iti pacijentu kome je potrebna takva modulacija, lečenje, ublažavanje, prevencija, ili redukcija simptoma, efekata ili mehanizama. Efikasna količina može obuhvatiti količinu od oko 0.001 do 500 mg/kg za jednokratnu (np., bolus), multiptu ili kontinuiranu primenu, ili da bi se postigla koncentracija u serumu od 0.01 do 5000 ug/mt serumske koncentracije za jednokratnu, višekratnu, iti kontinuiranu primenu, ili bilo koji efikasni raspon ili vrednost u njoj, kao što je učinjeno i određeno primenom poznatih metoda, kao što je opisano ovde ili poznato u odgovarajućim stanjima tehnike.

Skalni Protein Ovog Pronalaska- Proizvodnja i Generisanje

[0036] Najmanje jedan skalni protein iz ovog pronalaska može biti opciono proizveden od strane ćetijske linije, mešane ćetijske linije, besmrtne ćelije ili klonalne populacije besmrtnih ćelija, kao što je dobro poznato u tehnici. Videti, npr., Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biologv, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunologv, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley &Sons, NY, NY, (1997-2001).

[0037] Aminokiseline iz skalnog proteina mogu biti izmenjene, dodate i/ili izbrisane da bi se smanjila imunogenost ili smanjila, poboljšala ili modifikovala sposobnost vezivanja, afinitet, uključivanje, isključivanje, sklonost, specifičnost, vreme poluraspada, stabilnost, rastvorljivost ili bilo koja druga pogodna karakteristika, kao što je poznato u tehnici.

[0038] Opciono, skala proteina može biti konstruisana sa zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i drugim povoljnim biološkim svojstvima. Da bi se postigao ovaj cilj, skalni proteini mogu biti opciono pripremljeni procesom analize matičnih sekvenci i različitih konceptualnih projektovanih produkata pomoću trodimenzionalnih modela matičnih i projektovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli su uobičajeno dostupni i poznati stručnjacima u ovom području tehnike. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustriraju i pokazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture odabranih sekvenci kandidata, i mogu meriti moguću imunogenost (e.g., Immunofilter program of Xencor, Inc. of Monrovia, CA). Inspekcija ovih displeja dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju sekvence kandidata, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata skalnog proteina da veže svoj antigen. Na ovaj način, ostatci mogu biti odabrani i kombinovani iz matičnih i referentnih sekvenci tako da je željena karakteristika, kao što je afinitet za ciljni antigen (antigene) ostvarena. Alternativno, kao dopuna za gornje procedure mogu se koristiti i druge pogodne metode inženjeringa.

"Skrining"

[0039] Skrining skalnog proteina za specifično vezivanje na slične proteine ili fragmente može biti lako ostvaren upotrebom nukleotida (DNA ili RNA displeja) ili displeja biblioteke peptida, na primer, in vitro displej prikaz. Ovaj metod obuhvata skrining velikih kolekcija peptida za individualne članove koji imaju željenu funkciju ili strukturu. Prikazani nukleotid ili sekvence peptida mogu biti od 3 do 5000 ili više nukleotida ili aminokiselina dužine, često duge od 5-100 amino kiselina, i često duge od 8 do 25 amino kiselina. Pored direktnih hemijskih sintetskih metoda za generisanje peptidnih biblioteka, opisano je nekoliko rekombinantnih DNA metoda. Jedan tip vrsta obuhvata prikaz - displej peptidne sekvence na površini bakteriofaga ili ćelije. Svaki bakteriofag ili ćelija sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određenu prikazanu peptiđnu sekvencu. Takve metode su opisane u PCT Patent Publication Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818, and 93/08278.

[0040] Drugi sistemi za generisanje biblioteka peptida imaju oba aspekta, in vitro hemijsku sintezu i rekombinantne metode. Videti, PCT Patent Publication Nos. 92/05258, 92/14843, i 96/19256.Videti takođe, U.S. Patent Nos. 5,658,754; and 5,643,768. Displej-prikaz biblioteka peptida, vektora i setova su komercijalno dostupni od dobavljača kao što je Invitrogen (Carlsbad, CA), and Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Videti npr., U.S. Pat. Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, assigned to Enzon; 5223409, 5403484, 5571698 , 5837500, assigned to Dyax, 5427908 , 5580717, assigned to Affymax; 5885793, assigned to Cambridge Antibody Technologies; 5750373, assigned to Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, assigned to Xoma, Colligan, supra; Ausubel, supra; or Sambrook, supra.

[0041] Skalni proteini iz pronalaska mogu vezati ljudski ili druge proteine sisara sa širokim rasponom afiniteta (KD). U poželjnom izvođenju, najmanje jedan skalni protein iz ovog pronalaska se može opciono vezati za ciljni protein sa visokim afinitetom, na primer sa KD jednakim iti manjim od oko 10 ' M, kao Što je, ati bez ograničenja na, 0.1 -9,9 (iti bilo koji raspon ili vrednost u njima) X 10'', 10', 10'", 10 ", 10 ", 10<13>, 10 ", 10 '5 ili bilo koji raspon iti vrednost u njima, kao što je određivanje rezonance površinskog plazmona ili tzv. "Kinexa" metoda kao što praktikuju stručnjaci u ovom području tehnike.

[0042] Afnitet i sklonost skalnog proteina za antigen može biti određena eksperimentalno korišćenjem bilo koje pogodne metode. (Videti, na primer, Berzofskv, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunologv, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunologv, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); and methods described herein). Izmereni afinitet određenog skalnog proteina-antigen interakcije može varirati ako se meri pod različitim uslovima (npr., koncentracija soli, pH).Tako, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara su (npr., K0K„, Ko«) poželjno napravljeni sastandardizovanim rastvorima skalnog proteina i antigena, i standardizovanim puferom, kao što je ovde opisani pufer.

[0043] Konkurentni testovi mogu biti izvedeni sa skatnim proteinom iz ovog pronalaska da bi se odredilo kako se proteini, antitela, i drugi antagonisti takmiče za vezivanje za ciljni protein sa skatnim proteinom iz ovog pronalaska i/ili dele epitop regiju. Ovi testovi kao dobro poznati prosečnim stručnjacima u ovom području tehnike procenjuju konkurenciju između antagonista ili liganda za ograničeni broj vezujućih mesta na proteinu. Protein i/ili antitelo je imobilizovano ili insolubilizovano pre ili poste takmičenja, i uzorak vezan za ciljni protein je odvojen od nevezanog uzorka, na primer dekantovanjem (gde je protein/antiteto prethodno insolubilizovano) ili centrifugiranjem (gde je protein/antitelo istaloženo posle reakcije konkurencije). Takođe, kompetitivno vezivanje može odrediti da li je funkcija promenjena vezivanjem ili nedostatkom vezivanja skalnog proteina za ciljni protein, npr., bilo da molekul skalnog proteina inhibira ili pojačava enzimsku aktivnost, na primer, oznaku. Mogu se upotrebiti ELIZA i drugi funkcionalni testovi, kao što je dobro poznato u tehnici.

Molekuli Nukleinske Kiseline

[0044] Molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska kodirajući skalni protein mogu biti u obliku RNA, kao što je rnRNA, hnRNA, tRNA ili bilo kojem drugom obliku, ili u obliku DNA, uključujući, ali bez ograničenja na, cDNA i genomsku DNA dobijenu kloniranjem ili proizvedenu sintetski, ili bilo koje kombinacije od njih. DNA može biti trolančana, dvolančana ili jednolančana, ili bilo koja kombinacija od njih. Bilo koji deo najmanje jednog tanca DNA ili RNA može biti kodirajući lanac, takođe poznat kao senzitivni lanac, ili može biti ne-kodirajući tanac, takođe označen kao anti-senzitivni lanac.

[0045] Izolovani molekuli nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu uključiti molekule nukleinske kiseline obuhvatajući otvoreni okvir očitavanja (ORF), opciono, sa jednim ili više introna, npr., ali bez ograničenja na, najmanje jedan specificirani deo najmanje jednog skalnog proteina; molekule nukelinske kiseline koji obuhvataju kodirajuću sekvencu za skalni protein iti regiju petlje koja se veže za ciljani protein; i molekule nukleinske kiseline koji sadrže nukleotidnu sekvencu suštinski drugačiju od onih opisanih iznad, ali koja zbog degeneracije genetskog koda, još uvijek kodira skalni protein kao što je opisano ovde i/iti poznato u tehnici. Naravno, genski kod je dobro poznat u tehnici. Tako, bila bi rutina za stručnjaka sa ovog područja tehnike da generiše takve degenerisane varijante nukleinske kiseline koje kodiraju specifični skalni protein ovog pronalaska. Videti, na primer, Ausubel, et al., Supra, i takve varijante nukleinske kiseline su uključene u ovom pronalasku.

[0046] Kao što je ovde navedeno, molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, koji sadrže kodirajuću nukleinsku kiselinu skalnog proteina mogu uključiti, ali bez ograničenja na, one koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu skalnog proteina same po sebi; kodirajuću sekvencu za ceti skalni protein ili njegov deo; kodirajuću sekvencu za skalni protein, fragment ili deo, kao i dodatne sekvence, kao Što je kodirajuća sekvenca najmanje jednog vodećeg signala ili fuzionog peptida, sa ili bez prethodno pomenutih dodatnih kodirajućih sekvenci, kao što je najmanje jedan intron, zajedno sa dodatnim, nekodirajućim sekvencama, uključujući, ati bez ograničenja na, ne-kodirajuće 5 ' i 3' sekvence, kao što su transkribovane, netranslatirane sekvence koje igraju ulogu u transkripciji, rnRNA procesuiranju, obuhvaćajući splajsovanje i poliadenitacione signale (na primer, vezivanje ribozoma i stabilnost rnRNA); dodatnu kodirajću sekvencu koja kodira dodatne amino kiseline, kao što su one koje obezbeđuju dodatne funkcionalnosti. Tako, sekvenca koja kodira skalni protein može biti fuzionisna sa marker sekvencom, kao što sekvenca kodirajući peptid koji omogućava prečišćavanje fuzionisanog skalnog proteina sadrži fragment skalnog proteina ili deo.

Selektivno hibriđiziranje polinukleotida na polinukleotidu kao što je ovde opisano

[0047] Ovde su opisane nukleinske kiseline koje hibridiziraju pod selektivnim uslovima hibridizacije na polinukleotidu prikazanom u navedenom tekstu. Tako, potinukteotidi ovog izvođenja mogu biti korišćeni za izolovanje, detektovanje, i/ili kvantifikovanje nukleinskih kiselina koje sadrže takve polinukleotide. Na primer, polinukteotidi ovog pronalaska mogu biti korišćeni za identifikaciju, izolaciju, ili pojačavati delimične ili ktonove pune dužine u deponovanoj biblioteci. U nekim izvođenjima, polinukleotidi su genomski iti cDNA izolovane sekvence iti na drugi način komplementarni sa, cDNA iz biblioteke nukleinske kiseline ljudske ili od sisara.

[0048] Poželjno, biblioteka cDNA sadrži najmanje 80% sekvenci pune dužine, poželjno najmanje 85% ili 90% sekvenci pune dužine, i poželjnije, najmanje 95% sekvenci pune dužine. Biblioteke cDNA mogu biti normalizovane da bi se povećala zastupljenost retkih sekvenci. Niski ili umereni uslovi hibridizacije su tipični, ali ne isključivo, korišćeni sa sekvencama imajući smanjenu identičnost sekvence u odnosu na komplementarne sekvence. Umereni i visoki kriterijumi ustova hibridizacije mogu opciono biti korišćeni za sekvence većeg identiteta. Manje strogi uslovi dozvoljavaju selektivnu hibridizaciju sekvenci sa 70% identiteta sekvenci mogu biti korišćenii u identifikaciji ortotognih ili paratognih sekvenci.

[0049] Opciono, polinukleotidi prema ovom otkriću će kodirati najmanje jedan deo skalnog proteina kodiranog od strane prethodno opisanih polinukleotida. Polinukleotidi prema ovom otkriću obuhvataju sekvence nukleinske kiseline koje mogu biti korišćene za selektivnu hibridizaciju polinukleotida koji kodira skalni protein iz ovog pronalaska. Videti, npr., Ausubel, supra; Colligan, supra.

Konstrukcija nukleinskih kiselina

[0050] Izolovane nukleinske kiseline ovog pronalaska mogu biti napravljene upotrebom (a) rekombinantnih metoda, (b) sintetskih tehnika, (c) tehnika prečišćavanja, i/ili (d) kombinacija od njih, kao što je dobro poznato u tehnici.

[0051] Nukleinske kiseline mogu pogodno sadržavati sekvence pored polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer, multi-klonirajuće mesto koje sadrži jedno ili više endonukteaznih restrikcionih mesta može biti umetnuto u nukleinsku kiselinu da pomogne izolaciji polinukleotida. Takođe, sekvence za translaciju mogu biti umetnute da bi se olakšala izolacija transtiranih polinukleotida ovog pronalaska. Na primer, heksa-histidin marker sekvenca obezbeđuje pogodna sredstva za prečišćavanje proteina iz ovog pronalaska. Nukleinska kiselina iz ovog pronalaska, isključujući kodirajuću sekvencu, je opciono vektor, adapter, ili veznik za kloniranje i/ili ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska.

[0052] Dodatne sekvence mogu biti dodate takvim ktonirajućim i/iti ekspresionim sekvencama da optimiziraju njihovu funkciju u kloniranju i/ili ekspresiji, da pomognu u izolaciji polinukleotida, ili da poboljšaju uvođenje polonukleotida u ćeliju. Upotreba ktonirajućih vektora, ekspresija vektora, adaptera, i veznika dobro je poznata u tehnici. (Videti, npr., Ausubel, supra; or Sambrook, supra)

Rekombinantne metode za konstruisanje nukleinskih kiselina

[0053] Izolovane kompozicije nukleinskih kiselina iz ovog otkrića, kao što je RNA, cDNA, genomska DNA, ili bilo koja kombinacija od njih, mogu biti dobijene iz bioloških izvora koristeći bilo koji broj metodologija kloniranja poznatih stručnjacima sa ovog područja tehnike. U nekim izvođenjima, uzorci otigonukleotida koji selektivno hibridiziraju, pod kontrolisanim uslovima, u polinukleotide ovog otkrića su korišćeni da se identifikuje željena sekvenca u cDNA ili genomska biblioteka DNA. Izolacija RNA, i konstrukcija cDNA i genomskih biblioteka, su dobro poznati stručnjacima u ovom području tehnike. (Videti, npr., Ausubel, supra; or Sambrook, supra).

Skrining nukleinske kiseline i metode izolacije

[0054] cDNA ili genomska biblioteka mogu biti ispitivane primenom uzorka baziranog na sekvenci polinukleotida ovog pronalaska, kao što su oni otkriveni ovde. Uzorci mogu biti korišćeni za hibridizaciju sa genomskim DNA ili cDNA sekvencama da izoluju homologne gene u istim ili različitim organizmima. Stručnjaci sa ovog područja tehnike će ceniti da različiti stepeni striktnosti hibridizacije mogu biti primenjeni u testu; bilo hibridizacija, ili sredstvo za ispiranje mogu biti striktni. Kako uslovi za hibridizaciju postaju stroži, mora postojati veći stepen komplementarnosti između uzorka i mete za nastanak dvostruke formacije. Stepen strogoće-podudarnosti može biti kontrolisan putem jedne ili više od, temperature, jonske jačine, pH i prisustvom delimično denaturišućeg rastvarača kao što je formamid. Na primer, strogoća hibridizacije povoljno varira promenom polariteta rastvora reaktanta kroz, na primer, manipulaciju koncentracije formamida u rasponu od 0% do 50%. Stepen komplementarnosti (identičnosti sekvence) potreban za detektabilno vezivanje će varirati u skladu sa strogošću hibridizacijskog medijuma i/ili ispiranja medijuma. Stepen komplementarnosti će optimalno biti 100%, ili 70-100%, ili bilo koji raspon ili vrednost u njemu. Međutim, treba shvatiti da manje varijacije sekvence u uzorcima i prajmerima mogu biti kompenzovane smanjenjem striktnosti- strogoće hibridizacije i/ili medijuma za ispiranje.

[0055] Metode amplifikacije RNA ili DNA su dobro poznate u tehnci i mogu biti korišćene u skladu sa ovim otkrićem, bez nepotrebnog eksperimentiranja, na osnovu učenja i smernice koji su prezentovane ovde.

[0056] Poznate metode amplifikacije DNA ili RNA obuhvataju, ali bez ograničenja na, polimeraznu lančanu reakciju (PCR) i povezane procese amplifikacije (videti, npr., U.S. Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, to Multis, et al.; 4,795,699 and 4,921,794 to Tabor, et al; 5,142,033 to Innis; 5,122,464 to VVilson, et al.; 5,091,310 to Innis; 5,066,584 to Gvltensten, et al; 4,889,818 to Gelfand, et al; 4,994,370 to Silver, et al; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold) i RNA posredovanu amptifikaciju koja koristi anti-senzitivnu RNA za ciljnu sekvencu kao obrazac za sintezu dvolančane DNA (U.S. Patent No. 5,130,238 to Malek, et al, with the tradename NASBA) (See, e.g., Ausubel, supra; or Sambrook, supra).

[0057] Na primer, tehnologija polimerazne lančane reakcije (PCR) može biti korišćena da amplificira sekvence polinukleotida ovog pronalaska i srodnih gena direktno iz genomskih DNA ili biblioteka cDNA. PCR i druge in vitro metode amplifikacije mogu takođe biti korisne, na primer, da bi se klonirale sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ekspresiju proteina, da nukelinske kiseline koriste kao uzorke za detekciju prisustva željene rnRNA u uzorcima, za sekvenciranje nukleinske kiseline, ili za druge svrhe. Primeri tehnika dovoljnih za usmeravanje stručnih osoba kroz in vitro amplifikacijske metode mogu se naći u Berger, supra, Sambrook, supra, and Ausubel, supra, as well as Mullis, et al., U.S. Patent No. 4,683,202 (1987); and Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Commerciatlv available kits for genomic PCR amplification are knovvn in the art. See, e.g., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). Dodatno, npr., T4 gen 32 protein (Boehringer Mannheim) može biti korišćen da bi se poboljšao prinos dugih PCR produkata.

Sintetske metode za konstrkciju nukleinskih kiselina

[0058] Izolovane nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu takođe biti pripremljene direktnom hemijskom sintezom poznatim metodama (vidti, np.r, Ausubel, et al., supra). Hemijska sinteza generalno proizvodi jednolančani olignonukleotid, koji može biti konvertovan u dvolančanu DNA hibridizacijom sa komplementarnom sekvencom, ili polimerizacijom sa DNA polimerazom korišćenjem jednostrukog lanca kao uzorka. Stručnjak u ovom području tehnike će prepoznati da dok hemijska sinteza DNA može biti ograničena na sekvence od oko 100 iti više baza, duže skvence mogu biti dobijene vezivanjem kraćih sekvenci.

Rekombinantne Ekspresione Kasete

[0059]Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantne ekspresione kasete koje obuhvataju nukleinsku kiselinu iz ovog pronalaska. Sekvenca nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, na primer cDNA ili genomska sekvenca kodirajući skalni protein iz ovog pronalaska, može biti korišćena za konstrukciju rekombinantne ekspresione kasete koja može biti uvedena u najmanje jednu željenu ćeliju domaćina. Rekombinantna ekspresiona kaseta će tipično obuhvatiti polinukleotid ovog pronalaska operativno povezan sa inicijacijom transkripcione regulatorne sekvence koja će usmeravati transkripciju polinukleotida u nameravanoj ćeliji domaćina. Oba heterologna i ne-heterologna (tj. endogena) promotera mogu biti korišćena da usmere ekspresiju nukleinskih kiselina iz ovog pronalaska.

[0060]U nekim izvođenjima, izolovane nukleinske kiseline koje služe kao promoter, pojačivač, ili drugi elementi mogu biti uvedeni na odgovarajuću poziciju (uzvodno, nizvodno ili u intron) ne-heterolognog oblika polinukleotida iz ovog pronalaska da bi pojačali ili smanjili ekspresiju polinukleotida iz ovog pronalaska. Na primer, endogeni promoteri mogu biti promenjem in vivo ili in vitro mutacijom, detecijom i/ili supstitucijom.

Vektori ićelijedomaćina

[0061]Ovaj pronalazak se takođe odnosi na vektore koji obuhvataju izolovane molekule nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, ćelije domaćina koje su genetski proizvedene inženjeringom sa rekombinantnim vektorima, i proizvodnju najmanje jednog skalnog proteina rekombinantnim tehnikama, kao što je dobro poznato u tehnici. Videti, npr., Sambrook, et al., supra; Ausubel, et at., supra.

[0062]Polinukleotidi mogu opciono biti spojeni sa vektorom sadržavajući selektivnii marker za umnožavanje u domaćinu. Generalno, vektor plazmida je uveden u precipitat, kao što je kalcijum fosfat precipitat, iti u kompleksu sa naelektrisanim lipidom. Ako je vektor virus, može biti upokovan in vitro korišćenjem odgovarajućeg pakovanja ćetijske linije, i zatim transdukovan u ćelije domaćina.

[0063] DNA umetak trebao bi biti operativno povezan za odgovarajući promoter. Ekspresione konstrukcije će dalje sadržavati mesta za inicijaciju transkripcije, terminaciju i u transkribovanoj regiji, vezujeće mesto ribozorna za translaciju. Kodirajući deo zrelih transkripcija izražen konstrukcijama će poželjno uključiti inicijaciju translacije na početku i kodon terminacije (npr., UAA, UGA ili UAG) odgovarajuće pozicioniran na kraju rnRNA da se translatuje, sa UAA i UAG poželjnim za sisare ili za ekspresiju eukariotske ćelije.

[0064]Vektori ekspresije će poželjno, ali opciono uključiti najmanje jedan selektivni marker. Takvi markeri uključuju, npr., ali nisu ograničeni na, metotreksat (MTX), dihidrofolat reduktazu (DHFR, US Pat.Nos. 4,399,216; 4,634,665; 4,656,134; 4,956,288; 5,149,636; 5,179,017, ampicilin, neomicin (G418), mikofenolnu kiselinu, ili sintezu gtutamina (GS, US Pat.Nos. 5,122,464; 5,770,359; 5,827,739) rezistenciju na eukariotsku ćetijsku kulturu, i tetraciklin ili ampicilin rezistentne gene za kultivisanje u E.koli i drugim bakterijama ili prokariotima. Odgovarajući mediji za kulturu i uslovi za iznad-opisane ćelije domaćina su poznati u tehnici. Pogodni vektori će biti očigledni prosečnom stručnjaku. Uvođenje konstrukcije sa vektorom u ćeliju domaćina se može izvesti transfekcijom kalcijum fosfata, DEAE-dekstran posredovanom transfekcijom, katjonskom lipid posredovanom transfekcijom, elektroporacijom, transdukcijom, infekcijom iti drugim poznatim metodama. Takve metode su opisane u tehnici, kao što je Sambrook, supra, Chapters 1-4 and 16-18; Ausubel, supra, Chapters 1, 9, 13, 15, 16.

[0065] Najmanje jedna skalni protein ovog pronalaska može biti izražena u modifikovanom obliku, kao što je fuzioni protein, i može uključiti ne samo sekrecione signale, već i dodatne heterologne funkcionalne regije. Na primer, regija dodatnih aminokiselina, naročito naelektrisanih aminokiselina, može biti dodata na N-terminatnom detu skalnog proteina da poboljša stabilnost i postojanost-perzistenciju u ćeliji domaćina, tokom prečišćavanja, ili tokom rukovanja i skladištenja. Takođe, peptidni delovi mogu biti dodati u skatni protein iz ovog pronalaska da se olakša prečišćavanje. Takve regije mogu biti uklonjene pre konačne pripreme skalnog proteina ili najmanje jednog njegovog fragmenta. Takvi postupci su opisani u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što su Sambrook, supra, Chapters 17.29-17.42 i 18.1-18.74; Ausubel, supra, Chapters 16, 17 and 18.

[0066]Stručnjaci sa ovog područja tehnike su upoznati u brojne ekspresione sisteme dostupne za ekspresiju nukleinske kiseline kodirajući protein iz ovog pronalaska. Alternativno, nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu biti izražene u ćeliji domaćina uključivanjem (manipulacijom) u ćeliju domaćina koja sadrži endogenu DNA kodirajući skalni protein iz ovog pronalaska. Takve metode su dobro poznate u tehnici, npr., kao što je opisano u US patent Nos. 5,580,734, 5,641,670,5,733,746, and 5,733,761.

[0067]Ilustrativni primer ćelijskih kultura korisnih za produkciju skalnog proteina, specificiranih delova ili varijanti od njih, su ćelije bakterija, kvasaca, i ćelije sisara kao što je poznato u tehnici. Sistemi ćelije sisara često će biti u obliku monoslojeva ćelija, mada se isto tako mogu koristiti i suspenzije ćelija sisara ili bioreaktora. Brojne pogodne ćelijske linije domaćina sposobne eksprimiranju intaktnih glikoziliranih proteina, razvijene su u tehnici, i uključuju COS-1(npr., ATCC CRL 1650), COS-7 ((npr., ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21 ((npr., ATCC CRL-10), CHO ((npr., ATCC CRL 1610) i BSC-1 ((npr, ATCC CRL-26) ćetijske linije, Cos-7ćelije, CHO ćelije, hep G2 ćetije, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 ćetije, HeLa ćelije i slično, koje su dostupne kod, na primer, American Type Culture Collection, Manassas, Va ( www. atcc. org). Poželjne ćelije domaćina uključuju ćelije limfoidnog porekla kao što su ćelije mijeloa i timfoma. Naročito poželjne ćetije domaćina su P3X63Ag8.653 ćetije (ATCC Accession Number CRL-1580) i SP2/0-Ag14 ćelije

(ATCC Accession Number CRL-1851). U naročito poželjnom izvođenju, rekombinantna ćelija je P3X63Ab8.653 ili SP2/0-Ag14 ćelija.

[0068]Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu uključiti jedan ili više sledećih ekspresionih kontrolnih skvenci, kao što su, ali bez ograničenja na poreklo replikacije; promoter (npr., kasni ili rani SV40 promoteri, CMV promoter (US Pat.Nos. 5,168,062; 5,385,839), HSV tk promoter, pgk (fosfoglicerat kinaza) promoter, EF 1 alfa promoter (US Pat.No. 5,266,491), najmanje jedan ljudski promotor; pojačivač, i/ili obrada informacije mesta, kao što su mesta vezivanja ribozoma, RNA mesta splajsovanja, poliadenilaciona mesta (npr., SV40 veliki T Ag poly A adiciono mesto), transkripcioni terminator sekvence. Videti npr., Ausubel et al., supra; Sambrook, et al., supra. Druge ćelije korisne za produkciju nukleinskih kiselina ili proteina iz ovog pronalaska su poznate i/ili dostupne, na primer, iz American Type Culture CoUection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas ( www. atcc. org) ili drugih poznatih komercijalnih izvora.

[0069]Kada se koriste eukariotske ćelije domaćina, poliadenilacioni ili transkripcioni terminator sekvenci su obično inkorporisani u vektor. Primer terminatora sekvence je poliadenilaciona sekvenca iz goveđeg gena hormona rasta. Sekvence za precizno splajsovanje transkripta mogu takođe biti uključene. Primer sekvenci za splajsovanje je VP1 intron iz SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). Dodatno, sekvence gena na kontrolnoj replikaciji u ćeliji domaćina mogu biti inkorporisane u vektor, kao što je poznato u tehnici.

Prečišćavanje skalnog proteina

[0070]Skalni protein može biti oporavljen i prečišćen iz rekombinantnih ćelijskih kultura dobro poznatim metodama uključujući, ali bez ograničenja na, prečišćavanje proteina A, amonijum sulfata ili precipitaciju etanola, ekstrakciju kiselinom, anjon iti katjon-izmjenjivačku hromatografiju, fosfocelutoznu hromatografiju, hidrofobnu interaktivnu hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, hidroksilapatitnu hromatografiju i tecitinsku hromatografiju. Tečna hromatografija visokih performansi ("HPLC") takođe može biti korišćena za prečišćavanje. Videti, npr., Colligan, Current Protocols in lmmunology, ili Current Protocols in Protein Science, John Wiley 6 Sons, NY, NY, (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10.

[0071]Skalni protein iz ovog pronalaska uključuje prirodno prečišćene produkte, produkte hemijskih sintetičkih procedura, i produkte proizvedene rekombinantnim tehikama iz prokariotskih iti eukariotskih domaćina, uključujući, na primer, E. koli, kvasac, više biljke, insekte i ćelije sisara. U zavisnosti od korišćenog domaćina u proceduri rekombinantne produkcije, skalni protein iz ovog pronalaska može biti glikoziliran iti može biti ne-glikoziliran. Takve metode su opisane u mnogim standardnim laboratorijskim priručnicima, kao što je Sambrook, supra, Sections 17.37-17.42; Ausubel, supra, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, supra, Chapters 12-14.

Kodoviamino kiselina

[0072]Amino kiseline koje sačinjavaju skalni protein iz ovog pronalaska su često skraćene. Oznake amino kiselina mogu biti predstavljene označavanjem amino kiseline njenim jedinstvenim kodom od jednog slova, tri slova, imena, ili tri nukteotidna kodona (više kodona), kao što je dobro poznato u tehnici (videti Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994). Skalni protein iz ovog pronalaska može uključiti jednu iti više amino kiselinskih supstitucija, delecija iti adicija, bilo od prirodnih mutacija ili ljudskom manipulacijom, kao što je ovde specificirano. Amino kiseline u skalnomi proteinu ovog pronalaska koje su esencijalne za funkciju mogu biti identifikovane metodama poznatim u struci, kao što je mutageneza usmerena na određeno mestoo ili atanin-skenirajuća mutageneza (e.g., Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Poslednja procedura uvodi pojedinačne mutacije atanina na svaki ostatak u molekulu. Dobijeni mutantni molekuli su zatim testirani za biološku aktivnost, kao što je, ali bez ograničenja na, najmanje jedna neutralizirajuća aktivnost. Mesta koja su kritična za vezivanje skalnog proteina mogu takođe biti identifikovana strukturnom analizom kao što su kristalizacija, nuklearna magnetna rezonanca ili fotoafinitetno obeležavanje (Smith, et al., J. Mol. Biot. 224:899-904

(1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).

[0073]Kao što će osobe iz struke uočiti, ovaj pronalazak uključuje najmanje jedan biološki aktivni skalni protein iz ovog pronalaska. Biološki aktivni skatni proteini imaju specifičnu aktivnost od najmanje 2056, 30%, ili 40%, i, poželjno, najmanje 50%, 60%, ili 70%, i najpoželjnije, najmanje 80%, 90%, iti 95% -1000% ili više nativnog (ne-sintetskog), endogenog ili povezanog i poznatog skalnog proteina. Metode testiranja i kvantifikovanje mera enzimske aktivnosti i specifičnost supstrata, dobro su poznate stručnjacima u ovom području tehnike.

[0074] Udrugom aspektu, otkriće se odnosi na skalni protein i fragmenate, kao što je opisano ovde, koji su modifikovani kovalentnom vezom organskog ostatka. Takva modifikacija može proizvesti fragment skalnog proteina sa poboljšanim farmakokinetičkim svojstvima (npr., povećano in vivo vreme poluraspada u serumu). Organski ostatak može biti ravna iti razgranata hidrofilna polimerna grupa, grupa masne kiseline, ili estarska grupa masne kiseline. U određenim izvođenjima, hidrofilna polimerna grupa može imati molekulsku težinu od oko 800 do 120,000 Daltona i može biti potialkan glikol (npr., polietiten glikol (PEG), polipropilen glikol (PPG)), polimer ugljenog hidrata, potimer amino kiseline ili polivinil pirolidon, i masna kiselina ili estarska grupa masne kiseline koja sadrži od oko osam do oko četrdeset atoma ugljenika.

[0075]Modifikovani skalni protein i fragmenti iz ovog pronalaska mogu sadržavati jedan iti više organskih ostataka koji su kovalentno vezani, direktno ili indirektno, na antitelo. Svaki organski ostatak koji je vezan za skalni protein ili fragment iz ovog pronalaska može nezavisno biti hidrofilna polimerna grupa, grupa masne kiseline ili estarska grupa masne kiseline. Kao što se ovde koristi, termin "masna kiselina" obuhvata monokarboksilne kiseline i di-karboksilne kiseline. "Hidrofilna polimerna grupa", kao što se termin ovde koristi, se odnosi na organski polimer koji je više rastvorljiv u vodi nego u oktanu. Na primer, polilizin je više rastvorljiv u vodi nego u oktanu. Tako, skalni protein modifikovan kovalentnim vezivanjem polilizina je obuhvaćen pronalaskom. Hidrofilni polimeri pogodni i za modifikovanje skalnog proteina iz pronalaska mogu biti ravni ili razgranati, i uključuju, na primer, polialkan glikole (npr., PEG, monometoksipolietilen glikol (mPEG), PPG i slično), ugljene hidrate (npr., dekstran, celulozu, oligosaharide, polisaharide i slično), polimere of hidrofilm'h amino kiselin (npr., polilizin, poliarginin, poliaspartat i slično), polialkan okside (npr., polietilen oksid, polipropilen oksid i slično) i polivinil pirolidon. Poželjno, hidrofilni polimer koji menja skalni protein iz pronalaska ima molekularnu -težinu od oko 800 do oko 150,000 Daltona kao odvojeni molekularni entitet. Na primer PEG5000 i PEG20.000, pri čemu se supskript prosečne molekularne težine potimera u Dattonima, može koristiti. Hidrofilna polimerna grupa može biti supstituisana sa jednim do oko šest alkila, masnom kiselinom ili estarskim grupama masne kiseline. Hidrofilni polimeri koji su supstituisani sa masnom kiselinom ili estarskom grupom masne kiseline mogu biti pripremljeni primenom pogodnih metoda. Na primer, polimer sadržavajući amino grupu može biti uparen sa karboksilatom masne kiseline ili estrom masne kiseline, i aktivirani karboksilat (npr., aktivirani sa N, N-karbonil diimidazolom) na masnoj kiselini ili estru masne kiseline može biti uparen sa hidroksilnom grupom na polimeru.

[0076]Masne kiseline i estri masnih kiselina pogodni za modifikovanje skalnog proteina iz pronalaska mogu biti zasićene ili mogu sadržavati jednu ili više nezasićenih jedinica. Masne kiseline koje su pogodne za modifikovanje skalnog proteina iz pronalaska uključuju, na primer, n-dodekanoat (Cu, laurat), n-tetradekanoat (C,<, miristat), n-oktadekanoat (Gs, stearat), n-eikozanoat { Cio, arahidat), n-dokozanoat (CJ2, behenat), n-triakontanoat (Cjo), n-tetrakontanoat (C«), cis- A9-oktadekanoat (C18, oleat), svi cis-A5,8,11,14 eikozatetraenoat (C!0, arahidonat), oktandionsku kiselinu, tetradekandionsku kiselinu, oktadekandionsku kiselinu, dokozandioinsku kiselinu, i slično. Pogodni estri masnih kiselina uključuju mono-estre dikarboksilnih kiselina koji sadrže ravnu ili razgranatu grupu nižeg alkila. Niža alkil grupa može sadržavati od jednog do oko dvanaest, poželjno od jednog do oko šest atoma ugljenika.

[0077]Modifikovani skalni protein i fragmenti mogu biti pripremljeni korišćenjem pogodnih metoda, kao što je reakcija sa jednim ili više modifikujućih agenasa. "Modifikujući agens", kao što je termin ovde korišćen, se odnosi na pogodne organske grupe (npr., hidrofilni polimer, masnu kisetinu, estar masne kiseline) koja sadrži aktivirajuću skupinu. "Aktivirajuća grupa" je hemijski ostatak ili funkcionalna grupa koja može, pod odgovarajućim uslovima, reagovati sa drugom hemijskom grupom tako formirajući kovalentnu vezu između modifikujućeg agensa- i druge hemijske grupe. Na primer, amino reaktivne aktivirajuće grupe uključuju elektrofilne grupe kao što su tozilat, mezilat, halogen (hloro, bromo, fluoro, jodo), N-hidroksisukcinimidil estre (NHS), i slično. Aktivirajuće grupe koje mogu reagovati sa tiolima uključuju, na primer, maleimid, jodoacetil, akrilotil, piridil disulfide, 5-tiol-2 nitrobenzojevu kiselinu tiol (TNB-tiol), i slično. Aldehid funkdonatna grupa može biti uparena na amin ili hidrazid sadržavajući molekule, i azid grupa može reagovati sa trovalentnom fosfornom grupom da se formiraju fosforamidatne ili fosforimidne veze. Pogodne metode za uvođenje aktivirajućih grupa u molekule su poznate u tehnici (videti, na primer, Hermanson, G. T, Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)). Aktivirajuća grupa može biti vezana direktno na organsku grupu (npr., hidrofilni polimer, masnu kiselinu, estar masne kiseline), ili preko linker grupe, na primer dvovalentne G-Cu grupe pri čemu jedan ili više atoma ugljenika može biti zamenjeno heteroatom, kao što su kiseonik, azot ili sumpor. Pogodne linker grupe obuhvataju, na primer, tetraetilen glikol, -(CH2)r, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)z-NH- i -CHz-O-CHj-CHrO-CHj-CHi-O-CH-NH-. Modifikujući agensi koji sadrže linker grupu mogu biti proizvedeni, na primer, reagovanjem mono-Boc-alkildiamina (npr., mono-Boc-etilendiamina, mono-Boc-diaminoheksana) sa masnom kiselinom u prisustvu 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida (EDC) da se formira amidna veza između slobodnog amina i karboksilata masne kiseline. Boe zaštitna grupa može biti uklonjena iz produkta tretiranjem sa trifluorosirćetnom kiselinom (TFA) da bi se izložio primarni amin koji može biti sparen za drugi karboksilat kao što je opisano, iti može reagovati sa mateinskim anhidridom i dobijeni produkt ciktizira do nastanka aktiviranog maleimido derivata masne kiseline (Videti npr., Thompson, et al., WO 92/16221.)

[0078]Modifikovani skalni protein iz ovog otkrića može biti proizveden reagovanjem skalnog proteina ili fragmenta sa modifikujućim agensom. Na primer, organski ostaci mogu biti vezani na skalni protein na način koji nije na specifičnom mestu korišćenjem amin-reaktivnog modifikujućeg agensa, na primer, NHS estra PEG-a. Modifikovani skalni protein sadržavajući organski ostatak koji je vezan na specifična mesta skalnog proteina iz ovog pronalaska može biti pripremljen korišćenjem pogodnih metoda, kao što je reverzna proteoliza (Fisch et at., Bioconjugate Chem., 3:147-153

(1992); VVerlen et al, Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et at., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnot. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), i metoda opisanim u Hermanson, G. T, Bioconjugate Technigues, Academic Press: San Diego, CA (1996).

Kompozicije skalnog proteina koje obuhvataju dalje terapijski aktivne sastojke

[0079]Kompozicije skalnog proteina iz pronalaska mogu opciono dalje sadržavati efikasnu količinu najmanje jednog jedinjenja ili proteina {mali ili veliki molekul) izabranog od najmanje jednog anti-infektivnog leka, leka kardiovaskularnog (CV) sistema, leka centralnog nervnog sistema (CNS), leka autonomnog nervnog sistema (ANS), leka respiratornog trakta, leka gastrointestinalnog (Gl) trakta, hormonskog leka, leka za balans tečnosti ili elektrolita, hematološkog leka, antineoplastičnog, imunomodulacionog leka, očnog, otičkog-ušnog ili nazalnog leka, topikalnog leka, nutricionog leka ili slično. Takvi lekovi su dobro poznati u tehnici, uključujući formulacije, indikacije, doziranje i primenu za svaki prezentovan ovde (videti, na primer, Nursing 2001 Handbook of Drugs, Z1st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professionat's Drug Guide 2001, ed., Shannon, VVilson, Stang, Prentice-Hall, Ine, Upper Saddle River, NJ; PharmcotherapvnHandbook, Wells et al., ed., Appleton & Lange, Stamford, CT).

[0080]Antiinfektivni lek može biti najmanje jedan izabran od amebicida ili najmanje jedan od antiprotozoalnih, sredstava protiv glista-antelminitika, antifungalnih, protiv malarije, antituberkutotika ili najmanje jedan od antileprotika, aminoglikozida, penicilina, cefalosporina, tetraciklina, sulfonamida, fluorohinolona, antivirusnih, makrolid anti-infektivnih, i raznih antiinfektivnih. Lek CV može biti najmanje jedan izabran od jonotropskih, antiaritmika, antianginalnih, antihipertenzivnih, antilipemika i ostalih kardiovaskularnih lekova. Lek CNS može biti najmanje jedan izabran od nenarkotičnih analgetika i najmanje jedan izabran od antipiretika, nesteroidnih anti-inflamatornih lekova, narkotika ili najmanje jednan od opioidnih analgetika, sedativa hipnotika, antiepileptika-antikolvulzanata, antidepresiva, anksiolitika, antipsihotika, stimulanata centralnog nervnog sistema , antiparkinsonika, i raznih drugih lekova centralnog nervnog sistema. ANS lek može biti namanje jedan izabran od holinergika (parasimpatomimetika), antiholinergika, adrenergika (simpatomimetika), adrenergičkih blokatora (simpatolitika), skeletno mišićnih relaksanata, i neuromuskularnih blokatora. Lek respiratornog trakta može biti najmanje jedan izabran od antihistamina, bronhodilatatora, eksektoranasa ili najmanje jednog atitusika, i raznih respiratornih lekova. Lek Gl trakta može biti najmanje jedan izabran od antacida, ili najmanje jednog apsorbensa, ili najmanje jednog antiflatulenta, digestivnog enzima, iti najmanje jednog rastvarača-solubilizatora žučnih kamenaca, antidiaretika, laksativa, antiemetika i antiulceroznih lekova. Hormonatni lek može biti najmanje jedan izabran od kortikosteroida, androgena iti najmanje jednog anaboliČkog steroida, estrogena, ili najmanje jednog progestina, gonadotropina, antidijabetičkog leka iti najmanje jednog glukagona, tiroidnog hormona, antagonista tiroidnog hormona, hormona hipofize i paratiroidnog-kao leka. Lek za balans tečnosti i elektrolita može biti najmanje jedan izabran od diuretika, elektrolita, ili najmanje jednog za zamenu rastvora, zakiseljivača iti najmanje jednog alkalinizera. Hematološki lek može bitinajmanje jedan izabran od hematinika-za poboljšanje kvaliteta km", antikoagulanata, krvnih derivata, i trombolitičkih enzima. Antineoptastici -hemoterapijski agensi mogu biti najmanje jedan zabran od alkilirajućih lekova, a nti meta boli ta, antineoplastičnih antibiotika, antineoptastika koji menjaju ravnotežu hormona i raznih antineoplastika. Imunomodulacionii lek može biti najmanje jedan izabran od imunosupresiva, vakcina, ili najmanje jednan toksoid, antitoksin ili najmanje jednan antivenin, imuni serum i modifikator biološkog odgovora. Oftalmološki, otički, i nazalni lekovi mogu biti najmanje jedan izabran od oftalmoloških anti-infektivnih sredstava, očnih anti - inftamatornih sredstava, miotika, midriatika, oftalmoloških vazokonstriktora, raznih oftalmika, otičnih i nazalnih lekova. Topikalni lek može biti najmanje jedan izabran od lokalnih anti-infektivnh sredstava, protiv šuge ili najmanje jedan protiv vaške ili topikalni kortikosteroid. Nutritivni lek može biti najmanje jedan izabran od vitamina, minerala i kalorija. Videti, npr, contents of Nursing 2001 Drug Handbook, supra.antihistamina, bronhodilatatora, ekspektoranasa, ili najmanje jednog antitusiva i raznih respiratornih tekova.

[0081]Najmanje jedan amebicid iti antiprotozoik može biti najmanje jedan izabran od atovaksona, hlorokvin-hidrohlorida, hlorokvin-fosfata, metronidazola, metronidazol hidrohlorida ipentamidin izetionata. Najmanje jedan antelmintik može biti najmanje jedan izabran od mebendazola, pirantet pamoata i tiabendazola. Najmanje jedan antifungatni tek može biti najmanje jedan izabran od amfotericina B, kompleksa amfotericin B hotesteril sulfata, kompleksa amfotericin B lipida, amfotericin B lipozomalnog, flukonazota, flucitozina, griseofulvina mikro veličine, griseofulvina ultra mikro veličine, itrakonazola, ketokonazola, nistatina i terbinafin hidrohlorida. Najmanje jedan antimalarijski lek može biti najmanje jedan izabran od htorokvin-hidrohlorida, hlorokvin-fosfata, doksiciktina, hidroksihlorokvin sulfata, meflokvin hidrohlorida, primakvin fosfata, pirimetamina i pirimetamina sa sulfadoksinom. Najmanje jedan antituberkulotik ili antileprotik može biti najmanje jedan izabran od klofazimina, cikloserina, dapsona, etambutol hidrohlorida, izoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina, rifapentina i streptomicin sulfata. Najmanje jedan aminogtikozid može biti najmanje jedan izabran od amikadn sulfata, gentamicin sulfata, neomicin sulfata, streptomicin sulfata i tobramicin sulfata. Najmanje jedan penicilin može biti najmanje jedan izabran od amokscilin/klavutanat kalijuma, amoksicilin trihidrata, ampicilina, ampicilin natrijuma, ampicilin trihidrata, ampicilin natrijum/sulbaktam natrijuma, kloksacilin natrijuma, dikloksacilin natrijuma, mezlocilin natrijuma, nafeilin natrijuma, oksacilin natrijuma, penicilin G benzatina, penicilin G kalijuma, penicilin G prokaina, penicitin G natrijuma, penicilin V kalijuma, piperacilin natrijuma, piperacilin natrijum/tazobaktam natrijuma, tikarđlin dinatrijuma i tikarcilin dinatrijum/klavulanat kalijuma. Najmanje jedan cefalosporin može biti najmanje jedan izabran od cefaklora, cefadroksila, cefazolin natrijuma, cefdinira, cefepim hidrohlorida, cefiksima, cefmetazol natrijuma, cefonicid natrijuma, cefoperazon natrijuma, cefotaksim natrijuma, cefotetan dinatrijuma, cefoksitin natrijuma, cefpodoksim proksetita, cefprozila, ceftazidima , ceftibutena, ceftizoksim natrijuma, ceftriakson natrijma, cefuroksim aksetila, cefuroksim natrijuma, cefaleksin hidrohlorida, cefaleksin monohidrata, cefradina i lorakarbefa. Najmanje jedan tetraciklin može biti najmanje jedan izabran od demeklociktin hidrohlorida, doksiciklin kalcijuma, doksiciklin hiklata, doksiciklin hidrohlorida, doksiciklin monohidrata, minociktin hidrohlorida i tetraciklin hidrohlorida. Najmanje jedan sulfonamid može biti najmanje jedan izabran od ko-trimoksazola, sulfadiazina, sulfametoksazola, sulfisoksazola i sulfisoksazol acetila. Najmanje jedan fluorohinolon može biti najmanje jedan izabran iz alatrofloksacin mezilata, ciprofloksacina, enoksacina, levofloksacina, lomefloksacin hidrohlorida, nalidiksične kiseline, norfloksacina, sparfloksacina i trovafloksacin mezilata. Najmanje jedan fluorohinolon može biti najmanje jedan izabran od alatrofloksacin mezilata, ciprofloksacina, enoksacina, levofloksacina, lomefloksacin hidrohlorida, nalidiksinske kiseline, norfloksacina, ofloksacina, sparfloksacina i trovafloksacin mezilata. Najmanje jedan antivirusni lek može biti najmanje jedan izabran od abakavir sulfata, aciklovir natrijma, amantadin hidrohlorida, amprenavira, cidofovira, delavirdin mezilata, didanozina, efavirenza, famciklovira, fomivirsen natrijuma, foskarnet natrijuma, ganciklovira, indinavir sulfata, lamivudina, lamivudin/zidovudina , nelfinavir mezilata, nevirapina, oseltamivir fosfata, ribavirina, rimantadin hidrohlorida, ritonavira, sakvinavira, sakvinavir mezilata, stavudina, valaciklovir hidrohlorida, zalcitabina, zanamivira i zidovudina. Najmanje jedan antiinfektivni makrolin može biti najmanje jedan izabran od azitromicina, klaritromicina, eritromicina, baze eritromicina, eritromicin estolata, eritromicin etilsukcinata, eritromicin laktobionata, i eritromicin stearata. Najmanje jedan razni anti-infektiv može biti najmanje jedan izabran od aztreonama, bacitrađna, hloramfenikol natrijum sukcinata, klindamicin hidrohlorida, klindamicin-palmitat-hidrohlorida, klindamicin-fosfata, imipenema i cilastatin natrijuma, meropenema, nitrofurantoin makrokristala, nitrofurantoin mikrokristala hinupristin/dalfopristina, spektinomicin hidrohlorida, trimetoprima i vankomicin hidrohlorida. (Videti npr., pp. 24-214 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0082]Najmanje jedan jonotropni lek može biti najmanje jedan izabran od amrinon laktata, digoksina, milrinon i laktata. Najmanje jedan antiaritmik može biti najmanje jedan izabran od adenozina, amiodaron hidrohlorida, atropin sulfata, bretilijum tozilata, diltiazem hidrohlorida, dizopiramida, dizopiramid fosfata, esmolol hidrohlorida, flekainid acetata, ibutitid fumarata, lidokain hidrohlorida, meksiletin hidrohlorida, moricizin hidrohlorida, fenitoina, fenitoin natrijuma, prokainamid-hidrohlorida, propafenon-hidrohlorida, propranolol hidrohlorida, hinidin bisulfata, hinidin glukonata, hinidin poligalakturonata, hinidin sulfata, sotaloa, tokainid hidrohlorida i verapamil hidrohlorida. Najmanje jedan antianginalni lek može biti najmanje jedan izabran od amlodipidin bezilata, amil nitrita, bepridil hidrohlorida, diltiazem hidrohlorida, izosorbid dinitrata, izosorbid mononitrata, nadolola, nikardipin hidrohlorida, nifedipina, nitroglicerina, propranolola, verapamila, i verapamil hidrohlorida. Najmanje jedan antihipertenziv može biti najmanje jedan izabran od acebutolol-hidrohlorida, amlodipin-bezilata, atenolola, benazepril hidrohlorida, betaksolol hidrohlorida, bisoprolol fumarata, kandesartan cileksetila, kaptoprila, karteolol hidrohlorida, karvedilola, klonidina, klonidin-hidrohlorida, diazoksida, diltiazem-hidrohlorida, doksazosin mezilata, enalaprilata, enalapril maleata, eprosartan mezilata, felodipina, fenoldopam mezilata, fosinopril natrijma, guanabenz acetata, guanadrel sulfata, guanfacin hidrohlorida, hidralazin hidrohlorida, irbesartana, isradipina, labetalol hidrhlorida, lizinoprila, losartan kalijuma, metildopa, metildopat hidrohlorida, metoprolol-sukcinata, metoprolol tartarata, minoksidila, moeksipril hidrohlorida, nadolola, nikardipin hidrohlorida, nifedipina, nisoldipina, nitroprusid natrijma, penbutolol sulfata, perindopril erbumina, fentolamin mezilata, pindolola, prazosin hidrohlorida, propranolol hidrohlorida, kvinapril hidrohlorida, ramiprila, telmisartana, terazosin hidrohlorida, timolol maleata, trandotaprila, valsartana, i verapamil hidrohlorida. Najmanje jedan antilipidni lek može biti najmanje jedan izabran od atorvastatin kalcijuma, cerivastatin natrijuma, holestiramina, kolestipol hidrohlorida, fenofibrata (mikronizovani), fluvastatin natrijuma, gemfibrozila, lovastatina, niacina, pravastatin natrijuma, i simvastatina. Najmanje jedan razni CV tek može biti najmanje jedan izabran od abciksimaba, alprostadila, arbutamin hidrohlorida, cilostazola, klopidogrel bisulfata, dipiridamola, eptifibatida, midodrin hidrohlorida, pentoksifilina, tiklopidin-hidrohlorida i tirofiban hidrohlorida. (Videti, npr., pp. 215-336 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0083]Najmanje jedan ne narkotic analgetik ili antipiretik može biti najmanje jedan izabran od acetaminofena, aspirina, holin magnezijum trisa lici tata, diflunisata i magnezijum salicitata. Najmanje jedan ne steroidni anti inftamatorni lek može biti najmanje jedan izabran od celekoksiba, diklofenak kalijuma, diklofenak natrijuma, etodolaka, fenoprofen kalcijuma, flurbiprofena, ibuprofena, indometacina, indometacin natrijum trihidrata, ketoprofena, ketorolaka, trometamina, nabumetona, naproksena, naproksen natrijuma, oksaprozina, piroksikama, rofekoksiba i sulindaka. Najmanje jedan narkotik ili opioidni analgetik može biti najmanje jedan izabran od alfentanit hidrohlorida, buprenorfin hidrohlorida, butorfanol tartarata, kodein fosfata, kodein sulfata, fentanil citrata, fentanit transdermalnog sistema, fentanit transmukozni, hidromorfon hidrohlorida, meperidin hidrohlorida, metadon hidrohlorida, morfin-hidrohlorida, morfin sulfata, morfin tartrata, nalbufin hidrohlorida, oksikodon hidrohlorida, oksikodon pektinata, oksimorfon hidrohlorida, pentazocin hidrohlorida, pentazocin hidrohlorida i nalokson hidrohlorida, pentazocin laktata, propoksifen hidrohlorida, propoksifen napsilata, remifentanil hidrohlorida, sufentanil citrata i tramadol hidrohlorida. Najmanje jedan sedativ-hipnotik može biti najmanje jedan izabran od htoral hidrata, estazolama, flurazepam hidrohlorida, pentobarbitala, fenobarbitala, pentobarbital natrijuma, fenobarbital natrijuma, sekobarbital natrijuma, temazepama, triazolama, zateplona i zolpidem tartarata. Najmanje jedan antikonvutziv može biti najmanje jedan izabran od acetazolamid natrijuma, karbamazepina, klonazepama, klorazepat dikalijuma, diazepama, divalproeks natrijuma, etosuksimda, fosfenitoin natrijuma, gabapentina, lamotrigina, magnezijum sulfata, fenobarbitala, fenobarbital natrijuma, fenitoina, fenitoin natrijuma, fenitoin natrijuma (proširenog), primidona, tiagabin hidrohlorida, topiramata, valproat natrijuma i valproinske kiseline. Najmanje jedan antidepresiv može biti najmanje jedan izabran od amitriptilin hidrohlorida, amitriptilin pamoata, amoksapina, bupropion hidrohlorida, citalopram hidrobromida, klomipramin hidrohlorida, desipramin hidrohlorida, doksepin hidrohlorida, fluoksetin hidrohlorida, imipramin hidrohlorida, imipramin pamoata, mirtazapina, nefazodon hidrohlorida, nortriptilin hidrohlorida, paroksetin hidrohlorida, fenelzin sulfata, sertratin hidrohlorida, tranilcipromin sulfata, trimipramin maleata i venlafaksin hidrohlorida. Najmanje jedan antianksiozni liek može biti najmanje jedan izabran od alprazolama, buspiron hidrohlorida, hlordiazepoksida, hlordiazepoksid hidrohlorida, klorazepat dikalijuma, diazepama, doksepin hidrohlorida, hidroksizin embonata, hidroksizin hidrohlorida, hidroksizin pamoata, lorazepama, mefrobamata, midazolam hidrohlorida i oksazepama. Najmanje jedan antipsihotik može biti najmanje jedan izabran od hlorpromazin hidrohlorida, klozapina, flufenazin dekanoata, fluefenazin enantata, flufenazin hidrohlorida, haloperidola, haloperidol dekanoata, haloperidol laktata, loksapin hidrohlorida, loksapin sukcinata, mezoridazin bezilata, molindon hidrohlorida, olanzapina, perfenazina, pimozida, prohlorperazina, kvetijapin fumarata, risperidona, tioridazin hidrohlorida, tiotiksena, tiotiksen hidrohlorida, i trifluoperazin hidrohlorida. Najmanje jedan stimulans centralnog nervnog sistema može biti najmanje jedan izabran od amfetamin sulfata, kofeina, dekstroamfetamin sulfata, doksapram hidrohlorida, metamfetamin hidrohlorida, metitfenidat hidrohlorida, modafinila, pemolina, i fentermin hidrohlorida. Najmanje jedan antiparkinsonik može biti najmanje jedan izabran od amantadin hidrohlorida, benztropin mezilata, biperiden hidrohlorida, biperiden laktata, bromokriptin mezilata, karbidopa-levodopa entakapona, levodopa, pergolid mezilata, pramipeksol dihidrohlorida, ropinirol hidrohlorida, selegilin hidrohlorida, tolkapona, i triheksifenidil hidrohlorida. Najmanje jedan od raznih lekova centralnog nervnog sistema može biti najmanje jedan izabran od bupropion hidrohlorida, donepezil hidrohlorida, droperidola, fluvoksamin maleata, litijum karbonata, litijum citrata, naratriptan hidrohlorida, nikotin polacrileksa, nikotin transdermalnog sistema, propofola, rizatriptan benzoata, sibutramin hidrohlorid monohidrata, sumatriptan sukcinata, takrin hidrohlorida i zolmitriptana.

(Videti npr., pp. 337-530 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0084]Najmanje jedan holinergični lek (npr., parasimatomimetik) može biti najmanje jedan izabran od betanehol hlorida, edrofonijum hlorida, neostigmin bromida, neostigmin metilsulfata, fizostigmin salicilata, i piridostigmin bromida. Najmanje jedan antiholinergični lek može biti najmanje jedan izabran od atropin sulfata, diciklomin hidrohlorida, glikopirolata, hiosđamina, hiosciamin sulfata, propantelin bromida, skopotamina, skopolamin butilbromida i skopolamin hidrobromida. Najmanje jedan adrenergični lek -adrenergik (simpatomimetik), može biti najmanje jedan izabran od dobutamin hidrohlorida, dopamin hidrohlorida, metaraminol bitartrata, norepinefrin bitartrata, fenilefrin hidrohlorida, pseudoefedrin hidrohlorida i pseudoefedrin sulfata. Najmanje jedan adrenergički blokator (simpatolitik) može biti najmanje jedan izabran od dihidroergotamin mezilata, ergotamin tartarata, metisergid maleata i propranolol hidrohlorida. Najmanje jedan retaksant skeletnih mišića može biti najmanje jedan izabran iz baklofena, karisoprodola, hlorzoksazona, ciklobenzaprin hidrohlorida, dantroten natrijuma, metokarbamola i tizanidin-hidrohlorida. Najmanje jedan neuromuskularni blokator može biti najmanje jedan izabran od atrakurijum bezilata, cisatrakurijum besilata, doksakurijum hlorida, mivakurijum hlorida, pankuronijum bromida, pipekuronijum bromida, rapakuronijum bromida, rokuronijum bromida, sukeinilholin hlorida, tubokurarin hlorida i vekuronijum bromida. (Videti npr., pp. 531-84 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0085]Najmanje jedan antihistamin može biti najmanje jedan izabran od bromfeniramin maleata, cetirizin hidrohlorida, hlorfeniramin maleata, klemastin fumarata, ciproheptadin hidrohlorida, difenhidramin hidrohlorida, feksofenadin hidrohlorida, loratadina, prometazin hidrohlorida, prometazin teoklata i triprolidin hidrohlorida. Najmanje jedan bronhodilatator može biti najmanje jedan izabran od albuterola, albuterol sulfata, aminofilina, atropin sulfata, efedrin sulfata, epinefrina, epinefrin bitartrata, epinefrin hidrohlorida, ipratropijum bromida, izoproterenola, izoproterenol hidrohlorida, izoproterenol sulfata, levalbuterot hidrohlorida, metaproterenol sulfata, okstrifilina, irbuterol acetata, salmaterol ksinafoata, terbutalin sulfata i teofilina. Najmanje jedan lek za iskašljavanje-ekspektorans ili lek protiv kašlja-antitusiv može biti najmanje jedan izabran od benzonatata, kodein fosfata, kodein sulfata, dekstrametorfan hidrobromida, difenhidramin hidrohlorida, guaifenesina i hidromorfon hidrohlorida. Najmanje jedan razni respiratorni lek može biti najmanje jedan izabran od acetilcisteina, beklometazon dipropionata, beraktanta, budezonida, calfactanta, kromolin natrijuma, dornaza alfe, epoprostenol natrijuma, flunizolida, flutikazon propionata, montelukast natrijuma, nedojromil natrijuma, palivizumaba, triamđnolon acetonida, zafirlukasta i zileutona. (Videti, npr., pp. 585-642 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0086]Najmanje jedan antacid, apsorbens ili antiflatulent može biti najmanje jedan izabran od alumim'jum karbonata, aluminijum hidroksida, kalcijum karbonata, magalđrata, magnezijum hidroksida, magnezijum oksida, simetikona i natrijum bikarbonata. Najmanje jedan digestivni enzim ili rastvarač žučnih kamenaca može biti najmanje jedan izabran od pankreatina, pankrelipaze i ursodiola. Najmanje jedan lek protiv diareje-antidijaroik može biti najmanje jedan izabran od atapulgita, bizmut subsalicilata, kalcijum polikarbofila, difenoksilat hidrohlorida i atropin sulfata, loperamida, oktreotid acetata, tinkture opijuma i tinkture opijuma (kamforisane). Najmanje jedan laksativ može biti najmanje jedan izabran od bisakodila, kalcijum polikarbofila, tzv. "cascara sagrada" -američke jove, aromatičnog ekstrakta tečnosti cascara sagrada, ekstrakta tečnosti cascara sagrada, ricinusovog ulja, natrijum dokusat kalcijuma, dokusat natrijuma, glicerina, laktutoze, magnezijum citrata, magnezijum hidroksida, magnezijum sulfata, metilceluloze, mineralnog ulja, polietilen glikola ili rastvora elektrolita, psiliuma-indijske bokvice, sene i natrijum fosfata. Najmanje jedan antiemetik može biti najmanje jedan izabran od hlorpromazin hidrohlorida, dimenhidrinata, đolasetron mezilata, dronabinola, granisetron hidrohlorida, meklizin hidrohlorida, metoklopramid hidrohlorida, ondansetron hidrohlorida, perfenazina, prohlorperazina, prohlorperazin edizilata, prohlorperazin maleata, prometazin hidrohlorida, skopolamina, tietilperazin maleata iCrimetobenzamid hidrohlorida. Najmanje jedan antiulcerozni lek može biti najmanje jedan izabran iz cimetidina, cimetidin hidrohlorida, famotidina, lanzoprazola, mizoprostola, nizatidina, omeprazola, rabeprozol natrijuma, rantidin bizmut citrata, ranitidin hidrohlorida, i sukralfata. (Videti, npr., pp. 643-95 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0087]Najmanje jedan kortikosteroid može biti najmanje jedan izabran od betametazona, betametazon acetata ili betametazon natrijum fosfata, betametazon natrijum fosfata, kortizon acetata, deksametazona, deksametazon acetata, deksametazon natrijum fosfata, fludrokortizon-acetata, hidrokortizona, hidrokortizon acetata, hidrokortizon cipionata, hidrokortizon natrijum fosfata, hidrokortizon natrijum sukcinata, metilprednizolona, metilprednizolon acetata, metilprednizolon natrijum sukcinata, prednizolona, prednizolon acetata, prednizolon natrijum fosfata, prednizoton tebutata, prednizona, triamcinolona, triamcinolon acetonida, triamcinolon diacetata. Najmanje jedan androgen ili anabolički steroid može biti najmanje jedan izabran od danazoala, fluoksimesterona, metiltestosterona, nandrolon dekanoata, nandrolon fenpropionata, testosterona, testosteron cipionata, testosteron enantata, testosteron propionata, i testosteron transdermalnog sistema. Najmanje jedan estrogen ili progesteron može biti najmanje jedan izabran od esterifikovanih estrogena, estradiola, estradiol cipionata, estradiol/noretindron acetata transdermalnog sistema, estradiol valerata, estrogena (konjugovanih), estropipata, etinil estradiola, etinil estradiola i dezogestrela, etinil estradiola i etinodiol diacetata, etinil estradiol i desogestrela, etinil estradiola i etinodiol diacetata, etinil estradiola i levonorgestrela, etinil estradiol i noretindrona, etinil estradiola i noretindron acetata, etinil estradiola i norgestimata, etinil estradiola i norgestrela, etinil estradiola i noretindrona i acetata i fero fumarata, levonorgestrela, medroksiprogesteron acetata, mestranola i nortindrona, nortindrona, noretindron acetata, norgestrela i progesterona. Najmanje jedan gonadroptropin može biti najmanje jedan izabran od ganireliks acetata, gonadoretin acetata, histrelin acetata, i menotropina. Najmanje jedan antidijabetik ili glukagon može biti najmanje jedan izabran od akarboe, hlorpropamida, glimepirida, glipizia, glukagona, gliburida, insulina, metformin hidrohlorida, miglitola, pioglitazon hidrohlorida, repaglinida, rosiglitazon maleata i trogtitazona. Najmanje jedan tiroidni hormon može biti najmanje jedan izabran od levotiroksin natrijuma, liotironin natrijuma, liotriksa i tiroida. Najmanje jedan antagonist tiroidnog hormona može biti najmanje jedan izabran od metimazola, kalijum jodida, kalijum jodida (zasićen rastvor), propiltiouracila, radioaktivnog joda (natrijum jodid "' I) i jakog rastvora joda. Najmanje jedan hormon hipofize

-pituiitarni može biti najmanje jedan izabran od kortikotropina, kosintropina, desmofresin acetata, leuprolid acetata, repozitorij kortikotropina, somatrema, somatropina, i vazopresina. Najmanje jedan paratiroidni-kao tiek može biti najmanje jedan izabran od kalcifediola, kalcitonina (ljudski), kalcitonina (losos), kalcitriola, dihidrotakisterola, i etidronat dinatrijum etidronata. (Videti, npr., pp. 696-796 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0088]Najmanje jedan diuretik može biti najmanje jedan izabran od acetazolamida, acetazolamid natrijma, amilorid hidrohlorida, bumetanida, hlortalidona, etakrinat natrijuma, etakrinske kiseline, furosemida, hidrohlorotiazida, indapamida, manitola, metolazona, spironolaktona, torsemida, triamterena, i ureje. Najmanje jedan elektrolit ili zamena rastvora može biti najmanje jedan izabran od kalcijum acetata, kalcijum karbonata, kalcijum hlorida, kalcijim citrata, kalcijum glubionata, kalcijum gluceptata, kalcijum glukonata, kalcijum laktata, kalcijum fosfata (dvobazni), kalcijum fosfata (trobazni), dekstrana (visoke molekularne težine), dekstrana (niske molekularne težine), hetastarha, magnezijum hlorida, magnezijum sulfata, kalijum acetata, kalijum bikarbonata, kalijum hlorida, kalijum glukonata, injekcije Ringerovog rastvora, injekcije Ringerovog rastvora (laktata), i natrijum hlorida. Najmanje jedan zakiseljivač ili alkalinizer može biti najmanje jedan izabran od natrijum bikarbonata, natrijum laktata i trometamina. (Vidi, npr., 797-833 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0089]Najmanje jedan hematinik može biti najmanje jedan izabran od fero fumarata, glukonata, fero sulfata, fero sulfata (osušenog), gvožđe dekstrana, gvožđe sorbitola, polisaharida-kompleksa natrijum feri glukonata. Najmanje jedan antikoagulans može biti najmanje jedan izabran od ardeparin natrijuma, dalteparin natrijuma, danaparoid natrijuma, enoksaparin natrijuma, heparin kalcijuma, heparin natrijuma i varfarin natrijuma. Najmanje jedan derivat krvi može biti najmanje jedan izabran od albumina 5%, 25% albumina, antihemofilnog faktora, kompleksa anti-inhibitornog koagulanta, antitrombina III (ljudskog), faktora IX (ljudskog), kompleksa faktora IX, i frakcija plazma proteina. Najmanje jedan trombolitički enzim može biti najmanje jedan izabran od alteplaze, anistreplaze, reteplaze (rekombinantne), streptokinaze, i urokinaze. (Videti, npr., pp. 834-66 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0090]Najmanje jedan alkilirajući lek može biti najmanje jedan izabran od busulfana, karboptatina, karmustina, hlorambucila, cisptatina, ciklofosfamida, ifosfamida, lomustina, mehloretamin hidrohlorida, melfalana, melfalan hidrohlorida, streptozocina, temozolomida i tiotepa. Najmanje jedan antimetabolit može biti najmanje jedan izabran od kapecitabina, kladribina, citarabina, floksuridina, fludarabin fosfata, fluorouracila, hidroksiureje, merkaptopurina, metotreksata, metotreksat natrijuma, i tiogvanina. Najmanje jedan antineoplastični antibiotik može biti najmanje jedan izabran iz bleomicin sulfata, daktinomicina, lipozomskog daunorubicin citrata, daunorubicin hidrohlorida, doksorubicin hidrohlorida, lipozomalnog doksorubicin hidrohlorida, epirubicin hidrohlorida, idarubicin hidrohlorida, mitomicina, pentostatina, plikamicina i valrubicina. Najmanje jedan antineoplastični lek koji menja ravnotežu hormona može biti najmanje jedan izabran od anastrozola, bikalutamida, estramustin fosfat natrijuma, eksemestana, flutamida, goseretin acetata, letrozola, leuprolid acetata, megestrol acetata, nitutamida, tamoksifen citrata, testolaktona i toremifen citrata. Nahmanje jedan razni antineoplastični lek može biti najmanje jedan izabran od asparaginaze, Bacil Kalmet-Gerina (BCG) (živa intravezikalna), dakarbazina, doketakseta, etopozida, etopozid fosfata, gemcitabin hidrohlorida, irinotekan hidrohlorida, mitotana, mitoksantron hidrohlorida, paklitaksela, pegaspargaze, porfimer natrijuma, prokarbazin hidrohlorida, rituksimaba, tenipozida, topotekan hidrohlorida, trastuzumaba, tretinoina, vinblastin sulfata, vinkristin sulfata, i vinorelbin tartrata. (Videti, npr., pp. 867-963 of Nursing 2001 Drug Handbook.}

[0091]Najmanje jedan imunosupresant može biti najmanje jedan izabran od azatioprina, basiliksimaba, ciklosporina, daklizumaba, limfocit imuno globulina, muromonaba-CD3, mikofenolat mofetila, mikofenolat mofetil hidrohlorida, sirolimusa, i takrolimusa. Najmanje jedna vakcina ili toksoid može biti najmanje jedan izabran od BCG vakcine, vakcine protiv kolere, difterije i tetanus toksoida (apsorbovanih), difterije i toksoida tetanusa i apsorbovane acelularne vakcine pertusisa, difterije i toksoida tetanusa i vakcine cele ćelije pertusisa, Hemofilius b konjugovanih vakcina Hemofiliusa b, vakcine hepatitisa A (inaktivirane), vakcine hepatisisa B (rekombinantne), vakcine virusa influence 1999-2000 trovalentne vrste A & B (prečišćen površinski antigen), vakcine virusa influence 1999-2000 trovatentne vrste A & B (subvirion ili prečišćeni subvirion), vakcine virusa influence 1999-2000 trovalentne vrste A & B (celi virion), vakcine virusa japanskog encefalitisa (inaktivisani), vakcine Lajmske bolesti (rekombinantne OspA), boginja i zauški i vakcine virusa rubeole (žive), boginja i zauški i vakcine virusa rubeole (žive, oslabljene), vakcine virusa boginja (žive, oslabljene), vakcine meningokoknog potisaharida, vakcine virusa zauški (žive), vakcine kuge, pneumokokne vakcine (polivalentne), vakcine poliovirusa (inaktiviranog), vakcine poliovirusa (živ, oralno, trovalentni), vakcine besnila (apsorbovane), vakcine besnila (ljudska diploidna ćelija), vakcine virusa rubeole i zauški (žive), vakcine virusa rubeole (žive, oslabljene), tetanusnog toksoida (apsorbovan), tetanusnog toksoida (tečan), vakcine tifusa (oralno), vakcine tifusa (parenteralno), vakcine Vi polisaharida tifusa, vakcine virusa varičele i vakcine žute groznice. Najmanje jedan protivotrov ili antivenin može biti najmanje jedan izabran od antivenina pauka crne udovice,Crotalidaeantivenoma (polivalentni), protivotrov difterije (konjski), i antivenin američke kobre. Najmanje jedan imunološki serum može biti najmanje jedan izabran od imuno globulina citomegalovirusa (intravenozni), hepatitis B imuno globulina hepatitisa B (humani), intramuskularnog imunoglobulina, intravenoznog imunoglobulina, imunoglobulina besnila (ljudski), intravenoznog imuno globulina (ljudski) respiratornog sincitijalnog virusa , Rho (0) imuno globulina (ljudski), Rho (D) intravenoznog imuno globulina (ljudski), imuno globulina tetanusa (ljudski), i varičela-zoster imunoglobulina. Najmanje jedan modifikator biološkog odgovora može biti najmanje jedan izabran od aldesleukina, epoetin alfe, filgrastima, glatiramer acetata za injekcije, interferon alfakon-1, interferon alfa-2a (rekombinantni), interferon alfa-2b (rekombinantni), interferon beta- 1a, interferon beta-1b (rekombinantni), interferon gama-1b, levamizol hidrohlorida, oprelvekina i sargramostima. (Videti, npr., pp. 964-1040 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0092]Najmanje jedan oftalmički anti-infektivni tek može biti izabran od bacitracina, hloramfenikola, ciprofloksacin hidrohlorida, eritromicina, gentamicin sulfata, ofloksacina 0,3%, polimiksin B sulfata, sulfacetamid natrijuma 10%, sulfacetamid natrijuma 15%, sulfacetamid natrijuma 30%, tobramicina i vidarabina. Najmanje jedan oftatmični anti-inflamatomi lek može biti najmanje jedan izabran od deksametazona, deksametazon natrijum fosfata, diklofenak natrijuma 0.1%, fluorometolona, flurbiprofen natrijuma, ketorolak trometamina, prednizolon acetata (suspenzija) i prednizolon natrijum fosfata (rastvor). Najmanje jedan miotik može biti najmanje jedan izabran od acetiloholin hlorida, karbahola (intraokularnog) karbahola (topikalnog), ehotiofat jodida, pilokarpina, pilokarpin hidrohlorida i pilokarpin nitrata. Najmanje jedan midrijatik može biti najmanje jedan izabran od atropin sulfata, ciklopentolat hidrohlorida, epinefrin hidrohlorida, epinefril borata, homatropin hidrobromida, fenitefrin hidrohlorida, skopolamin hidrobromida, i tropikamida. Najmanje jedan očni vazokonstriktor može biti najmanje jedan izabran od nafazolin hidrohlorida, oksimetazolin hidrohlorida, tetrahidrozolin hidrohlorida. Najmanje jedan razni očni lek može biti najmanje jedan izabran od apraklonidin hidrohlorida, betaksolot hidrohlorida, brimonidin tartarata, karteolol hidrohlorida, dipivefrin hidrohlorida, dorzolamid hidrohlorida, emedastin difumarata, fluorescein natrijuma, ketotifenom fumarata, latanoprosta, levobunolol hidrohlorida, metipranolol hidrohlorida, natrijum hlorida (hipertonični) i timolol maleata. Najmanje jedan usni -otički lek može biti najmanje jedan izabran od borne kiseline, karbamid peroksida, hloramfenikola i trietanolamin oleat polipeptida-kondenzata. Najmanje jedan nazalni lek može biti najmanje jedan izabran od beklometazondipropionata, budesom'da, efedrin sulfata, epinefrin hidrohlorida, flunisolida, flutikazon propionata, nafazolin hidrohlorida, oksimetazolin hidrohlorida, fenilefrin hidrohlorida, tetrahidrozolin hidrohlorida, triamcinolon acetonida, i ksilometazolin hidrohlorida. (Videti, npr., pp. 1041-97 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0093]Najmanje jedan lokalni anti-infektivni lek može biti najmanje jedan izabran od aciklovira, amfotericina B, kreme azelainske kiseline, bacitracina, butokonazol nitrata, ktindamicin fosfata, klotrimazola, ekonazot nitrata, eritromicina, gentamicin sulfata, ketokonazola, mafenid acetata, metronidazola (topikalni), mikonazol nitrata, mupirocina, naftifin hidrohlorida, neomicin sulfata, nitrofurazona, nistatina, srebro sulfadiazina, terbinafin hidrohlorida, terkonazola, tetraciklin hidrohlorida, tiokonazola i tolnaftata. Najmanje jedan lek protiv šuge ili vaši može biti najmanje jedan izabran iz krotamitona, lindana, permetrina i piretrina. Najmanje jedan topikalni kortikosteroid može biti najmanje jedan izabran od betametazon dipropionata, betametazon valerata, klobetazol propionata, dezonida, dezoksimetazon, deksametazona, deksametazon natrijum fosfata, diflorazon diacetata, fluocinolon acetonida, fluocinonida, flurandrenolida, flutikazon propionata, halcionida, hidrokortizona, hidrokortizon acetata, hidrokortizon butirata, hidrokortizon valerata, mometazon furoata, i triamcinolon acetonida. (Videti, npr., pp. 1098-1136 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0094]Najmanje jedan vitamin ili mineral može biti najmanje jedan izabran od vitamina A, kompleksa vitamina B, cijanokobalamina, folne kiseline, hidroksokobalamina, leukovorin kalcijuma, niacina, niacinamida, piridoksin-hidrohlorida, riboflavina, tiamin-hidrohlorida, vitamina C, vitamina D, holekalciferola, ergokalciferola, analoga vitamina D, dokserkalđferola, parikalcitola, vitamina E, analoga vitamina K, fitonadiona, natrijum fluorida, natrijum fluorida (topikalni), elementa u tragovima, hroma, bakra, joda, mangana, selena i cinka. Najmanje jedan kalorijski lek može biti najmanje jedan izabran od infuzije amino kiseline (kristalna), infuzije amino kiseline u dekstrozi, infuzije amino kiseline sa elektrolitima, infuzije amino kiseline sa elektrolitima u dekstrozi, infuzije amino kiseline za insuficijenciju jetre, infuzije amino kiseline za za visoki metabolički stres, infuzije amino kiseline za insuficijenciju bubrega, dekstroze, masnih emulzija i triglicerida srednjeg lanca. (Videti, npr., pp. 1137-63 of Nursing 2001 Drug Handbook.)

[0095]Kompozicije skalnog proteina iz ovog pronalaska mogu dalje sadržavati najmanje jednu od bilo koje pogodne i efektivne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije sadržavajući kontaktiranu skalu proteina ili primenjenu na ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacjentu gde je potrebna takva modulacija, tretman ili terapija, opciono dalje sadržavajući najmanje jednu izabranu od najmanje jednog TNF antagonista (npr., ali bez ograničenja na TNF hemijski ili proteinski antagonist, TN monoklonalno ili poliklonalno antitelo ili fragment, rastvorljivi TNF receptor (npr., p55, p70 ili p85) ili fragmenta fuzionog potipeptida od njih, ili malog molekuta TNF antagonista, npr.,TNF vezujućeg proteina I ili II (TBP-1 ili TBP-II), neretimonmaba, inflisiimaba, etanercepta, CDP-571, CDP-870, afelimomaba, lenercepta, i slično), antireumatika (npr., metotreksata, auranofina, aurotioglukoze, azatioprina, etanrcepta, zlatnog natrijum tiomalata, hidroksihlorohin sulfata, leflunomida, sulfasalzina), mišićnog relaksanta, narkotika, ne-steroidnog anti-inflammatornog leka (NSAID), analgezika, anestetika, sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog (npr., aminoglikozida, antifungala, antiparazitika, antivirusa, karbapenema, cefalosporina, flurorhinolona, makrolida, penicilina, sulfonamida, tetraciklina, drugih antimikrobnih), antiparazitika, antivirusa, karbapenema, cefalosporina, flurorhinolona, makrolida, penicilina, sulfonamida, tetraciklina, drugog antimikrobinog, antipsorijatika, kortikosterioda, anaboličkog steroida, diabetesa pvezaog sa agensom, minerala, nutritivnog, tiroidnog agensa, vitamina, hormona povezanog sa kalcijumom, protiv diareje, antitusiva, antiemetika, antiulcera, laksativa, antikoagulanta, ertropoetina (npr., epoetin alfe), filgrastima (npr., G-CSF, Neupogena), sargramostima (GM-CSF, Leukina), agensa za imunizaciju, imunoglobulina, imunosupresiva (npr., basiliksimaba, ciklosporina, dađizumaba), hormona rasta, leka kao zamene hormona, estrogen receptor modutatora, midrijatika, cikloplegika, alkilirajućeg agensa, antimetabolita, mitotičkog inhibitora, radiofarmaceutika, antidepresanta, antimaničkog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulansa, donepezila, takrina, leka za astmu, beta agonista, steroida za inhalaciju, leukotrien inhibitora, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaza alfe (Pulmozima), citokina ili antagonista citokina. Ne-limitirajući primeri takvih citokina uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji od IL-1 do IL-28 (npr., IL-1, IL-2, itd.). Pogodne doze su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., eds., Pharmacotherapv Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000.

[0096]Takvi anti-kanceri ili anti-infektivi mogu takođe ukjlučiti molekule toksina koji su spojeni, vezani, ko-formulisani ili ko-primenjeni sa najmanje jednim skalnim proteinom iz ovog pronalaska. Toksin može opciono delovati da selektivno ubije patološku ćeliju ili tkivo. Patološka ćelija može biti kancer ili druga ćelija. Takvi toksini mogu biti, ali bez ograničenja na, prečišćeni ili rekombinantni toksin ili fragment toksina sadržavajući najmanje jedan funkcionalni citotoksični domen toksina, npr., izabran od najmanje jednog ricina, toksina difterje, toksina venoma, ili bakterijskog toksina. Termin toksin takođe uključuje oba i endotoksine i egzotoksine proizvedene bilo kojim prirodnim pojavljivanjem, mutantne ili rekombinantne bakterje ili viruse koji mogu uzrokovati bilo koje patološko stanje kod ljudi i drugih sisara, uključujući toksički šok, koji može rezultirati smrću. Takvi toksini mogu uključiti, ali_ nisu ogfrant'čeni na, enterotoksogeni E.koli termolabilan enterotoksin (LT), toplotno stabilni enterotoksin (ST), Šigela citotoksin, Aeromonas enterotoksine, sindrom toksičkog šoka toksin-1 (TSST-1), Stafilokokni enterotoksin A (SEA), B (SEB), ili C (SEC), Streptokokne enterotoksine i slično. Takva baterija uključuje, ali nije ograničena na, sojeve vrsta enterotoksogene E.koli (ETEC), enterohemoragijske E. koli (npr., sojeve serotipa 0157:H7), vrste Stafilokoka (npr., Stafilokokus aureus, Stafilokokus pvogenes), vrsteŠigele (npr., Šigela dizenterie, Šigella fleksneri, Šigela boidi, i Šigela sonei), vrste salmonele (npr., Salmonela tifi, Salmonela holerazuis, Salmonela enteritidis), vrste Klostridiuma (npr., Klostridium perfringens, Klostridium dificile, Klostridium botulinum), vrste Kampilobaktera (npr., Kampilobakter jejuni, Kampilobacter fetus), vrste Heliobaktera, (npr., Heliobakter pilon), vrste Aeromonas (npr., Aeromonas sobria, Aeromonas hidrofila, Aeromonas kavie), Pleizomonas šigeloide, Yersina enterokolitika, Vibrios vrste (npr., Vibrios kolere, Vibrios parahemolitikusa), vrste Klebsiella, Pseudomonas aeruginoza, i Streptokoka. Videti npr., Stein, ed., INTERNALMEDICINE, 3rd ed., pp 1-13, Little, Brovvn and Co., Boston, (1990); Evans et al., eds., Bacterial Infections of Humans: Epidemiologv and Control, 2d. Ed., pp 239-254, Plenum Medical Book Co., New York (1991); Mandell et al, Principles and Practice of Infectious Diseases, 3d. Ed., Churchill Livingstone, New York (1990); 8erkow et al, eds., The Merck Manual, 16th edition, Merck and Co., Rahway, NJ., 1992; Wood et al, FEMS Microbiology lmmunology, 76:121-134 (1991); Marrack et al, Science, 248:705-711 (1990.

[0097]Jedinjenja skalnog proteina, kompozicije ili kombinacije iz ovog pronalaska mogu dalje sadržavati najmanje jedan od bilo kojeg pogodnog pomagača, kao što je, ali bez ograničenja na, razblaživač, vezivač, stabilizator, puferi, soli, lipofilni razblaživači, konzervansi, adjuvanti ili slično. Farmaceutski prihvatljivi pojačivači su poželjni. Ne-ograničavajući primeri od, i metode pripremanja kao sterilni rastvori su dobro poznati u tehnici, kao što je, ali bez ograničenja na , Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, PA) 1990. Rutinski mogu biti izabrani farmaceutski prihvatljivi nosači koji su pogodni za način primene, rastvorljivost i/ili stabilnost skalnog proteina, fragmenta ili varijantu kompozicije kao što je dobro poznato u tehnici ili kao što je opisano ovde.

[0098]Farmaceutski ekscipijenti i aditivi korisni u ovoj kompoziciji uključuju, ali bez ograničenja na, proteine, peptide, aminokiseline, lipide, i ugljene hidrate (npr., šećere, uključujući monosaharide, di-, tri-, tetra-, i oligosaharide; derivatizovane šećere, kao što su alditoli, aldonske kiseline, esterifikovani šećeri islično; i potisaharidi ili polimeri šećera), koji mogu biti prisutni pojedinačno ili mogu biti prisutni pojedinačno ili u kombinaciji, obuhvatajući same ili u kombinaciji 1-99. 99% po težini ili zapremini. Primeri proteinskih ekscicipijenata uključuju serum albumin, kao što je ljudski serum albumin (HSA), rekombinantni humani albumin (rHA), želatin, kazein, i slično. Reprezentativna amino kiselina/komponente proteina, koje takođe funkcionišu u puferujućem kapacitetu, uključuju alanin, gticin, arginin, betain, histidin, glutaminsku kiselinu, asparaginsku kiselinu, cistein, lizin, leucin, izoleucin, valin, metionin, fenilalanin, aspartam, i slično. Jedna poželjna amino kiselina je glicin.

[0099]Ekscipijensi ugljenog hidrata pogodni za upotrebu u pronalsku uključuju, na primer, monosaharide, kao što su fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-manoza, sorboza, i slično; disaharide, kao što je laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slično; polisaharide, kao što su rafinoza, metezitoza, mattodekstrini, dekstrani, škrobovi, i slično; i alditole, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol sorbitol (glucitol), mioinozitol i slično. Poželjni ekscipijensi ugljenog hidrata za upotrebu u ovom pronalasku su manitol, trehaloza, i rafinoza.

[0100]Kompozicije skalnog proteina mogu takođe uključiti pufer ili pH-prilagođavajući agens; tipično, pufer je so pripremljena od organske kiseline ili baze. Reprezentativni puferi uključuju soli organske kiseline, kao što su soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, vinske kiseline, sukcinske kiseline, sirćetne kiseline, ili ftalne kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid, ili fosfatne pufere. Poželjni puferi za upotrebu u ovim kompozicijama su soli organske kiseline, kao što je citrat.

[0101]Dodatno, kompozicije skalnog proteina iz pronalaska mogu uključiti polimerne ekscipijente/aditive, kao Što su polivinilpirolidoni, fikoli (polimerni šećer), dekstrati (npr., ciklodekstrini, kao što je 2-hidroksipropil-B-ciklodekstrin), polietilen glikoli, -arome, antimikrobni agensi, zaslađivači, antioksidanti, antistatički agensi, surfaktanti (npr., polisorbati, kao što je TWEEN 20" i 'TVVEEN 80"), lipidi (npr., fosfolipidi, masne kiseline), steroidi (npr.,holesterol), i helirajući agensi (npr., EDTA).

[0102]Ovi i dodatni poznati farmaceutski ekscipijenti i/ili aditivi pogodni za upotrebu u kompozicijama skalnog proteina prema pronalasku su poznati u tehnici, kao što izlistano u "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., VVilliams & Williams, (1995), i u "Phvsician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ

(1998). Poželjni nosač ili materijali ekscipijensa su ugljeni hidrati (npr., saharidi i alditoli) i puferi (npr., citrati) iti polimerni agensi. Primer nosača molekula je mukopolisaharid, hijaluronska kiselina, koja može biti korisna za intraartikularno davanje.

Formulacije

[0103]Kao Što je zabeleženo gore, pronalazak obezbeđuje za stabilne formulacije, koje poželjno sadrže fosfatni pufer sa fiziološkim rastvorom ili izabranom soli, kao i konzervisane rastvore i formulacije sadržavajući konzervans kao i višenamenske konzervisane formulacije pogodne za farmaceutsku i veterinarsku upotrebu, obuhvatajući najmanje jedan skalni protein u farmaceutski prihvatljivoj formulaciji. Konzervisane formulacije sadrže najmanje jedan poznati konzervans ili opciono izabran iz grupe sastojeći se od najmanje jednog fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, fenilživinog nitrita, fenoksietanota, formaldehida, hlorobutanota, magnezijium hlorida (npr., heksahidrata), alkilparabena (metila, etila, propila, butitai slično), benzalkonijum hlorida, benzetonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala, polimera, ili smeše od njih u vodenom razblaživaču. Bilo koja pogodna koncentracija ili smeša može biti korišćena kao što je poznato u stanju tehnike, kao što je oko 0.0015%, ili bilo koji raspon, vrednost, ili frakcija u njoj. Ne-ograničavajući primeri uključuju, bez konzervansa , oko 0.1-2% m-krezola (npr., 0.2, 0.3. 0.4, 0.5, 0.9, 1.0%), oko 0.1-3% benzil alkohola (npr., 0.5, 0.9,1.1, 1.5,1.9, 2.0, 2.5%), oko 0.001-0.5% timerosala (npr., 0.005, 0.01), oko 0.001-2.0% fenola (npr., 0.05, 0.25, 0.28,0.5, 0.9, 1.0%), 0.0005-1.0% alkilparabena (više alkilparabena) (npr., 0.00075, 0.0009, 0.001, 0.002, 0.005, 0.0075, 0.009, 0.01, 0.02, 0.05, 0.075, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.75, 0.9, 1.0%), i slično.

[0104]Kao što je notirano gore, pronalazak obezbeđuje segment proizvodnje, obuhvatajući materijal za pakovanje i najmanje jednu laboratorijsku posudu sadržavajući rastvor od najmanje jednog skalnog proteina sa prepisanim puferima i/ili konzervansima, opciono u vodenom razblaživaču, pri čemu navedeni materijal za pakovanje sadrži oznaku koja indikuje da takav rastvor može biti držan preko perioda od 1,2, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 40, 48, 54, 60, 66 , 72 sata ili više. Pronalazak dalje sadrži segment proizvodnje, obuhvatajući materijal za pakovanje, prvu laboratorijsku posudu sadržavajući liofilizovanu najmanje jedan skalni protein, i drugu laboratorijsku posudu sadržavajući vodeni razblaživač prepisanog pufera ili konzervansa, pri čemu navedeni materijal za pakovanje sadrži oznaku koja upućuje pacijenta da rekonstituiše najmanje jedan skalni protein u vodenom razblaživaču da formira rastvor koji može biti držan preko perioda od dvadeset četiri sata ili više.

[0105]Najmanje jedan skalni protein korišćen u skladu sa ovim pronalaskom može biti proizvedena rekombinantnim sredstvima, uključujući iz ćelije sisara ili transgenih preparata, ili može biti prečišćen od drugih bioloških izvora,kao što je opisano ovde ili je poznato u stanju tehnike.

[0106]Raspon najmanje jednog skalnog proteina u produktu ovog pronalaska uključuje količine prinosa po rekonstituciji, ako su u vlažnom/suvom sistemu, koncentracije od oko 1.0 ug/mL do oko 1000 mg/mL, iako su niže i više koncentracije operabilne i zavisne su od nameravanog nosača isporuke, npr., formulacije rastvora će se razlikovati od transdermalnih flstera, pulmonalne, transmukozne, ili osmotske ili metoda mikro pumpe.

[0107]Poželjno, vodeni razblaživač opciono dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. Poželjni konzervansi uključuju one izabrane od grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezola, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena (metila, etila, propila, butila i slično), benzalkonijum hlorida, benzetonijum hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala, ili smeše od njih. Koncentracija konzervansa korišćena u formulaciji je suficijentna koncentracija da bi se dobio prinos anti-mikrobnog efekta. Takve koncentracije su zavisne od izabranog konzervansa i spremne od strane stručnjaka.

[0108] Drugi ekscipijensi, npr., izotonični agensi, puferi, antioksidanti, i pojačivaći konzervansa, mogu biti opciono i poželjno dodati u razblaživač. Izotonični agens, kao što je glicerin, je uobičajno korišćen u poznatim koncentracijama. Fiziološki tolerisani pufer je poželjno dodat da obezbedi pH kontrolu. Formulacije mogu pokriti širok raspon od pHs, kao što je od oko pH 4 do oko pH 10, i poželjne raspone od oko pH 5 do oko pH 9, i najpoželjniji raspon od oko 6.0 do oko 8.0. Poželjno, formulacije ovog pronalaska imaju pH između oko 6.8 i oko 7.8. Poželjni puferi uključuju fosfatne pufere, poželjnije, natrijum fosfatat, konkretno, puferisani fiziološki rastvor (PBS).

[0109]Drugi aditivi, kao Što su farmaceutski prihvatljivi solubilizeri kao Tween 20 (polioksietilen (20) sorbitan monolaurat), Tvveen 40 (polioksietilen (20) sorbitan monopalmitat), Tween 80 (polioksietilen (20) sorbitan monooleat), Pluronic F68 (polioksietilen polioksipropilen blok kopolimeri), i PEG (polietilen glikol) ili nejonski surfaktanti, kao Što je polisorbat 20 ili 80 ili poloksamer 184 ili 188, "Pluronic® polvls", drugi blok ko-polimeri, i helatori, kao što su EDTAi EGTA, mogu opciono biti dodati u formulacije ili kompozicije da redukuiju agregaciju. Ovi aditivi su naročito korisni ako je pumpa ili plastična posuda korišćena radi davanja formulacije. Prisustvo farmaceutski prihvatljivog surfaktanta mitigenira propenzitet proteina da agregira.

[0110]Formulacije iz ovog pronalaska mogu biti pripremljene procesom koji sadrži mešanje najmanje jedne skale proteina i konzervansa izabranih iz grupe koja se sastoji od fenola, m-krezola, p-krezola, o-krezota, hlorokrezola, benzil alkohola, alkilparabena, (metila, etila, propila, butilai slično), benzalkonium hlorida, benztonium hlorida, natrijum dehidroacetata i timerosala ili smeše od njih tu vodenom razblaživaču. Mešanje najmanje jedne skale proteina i konzervansa u vodenom razblaživaču je izvedena upotrebom konvencionalne dissolution i procedura mešanja. Da se pripremi pogodna formulacija, na primer, izmerena količina najmanje jedne skale proteina u puferisanom rastvoru je kombinovana sa željenim konzervansom u puferisanom rastvoru količinama suficijentnim da se obezbedi potein i konzervans u željenim koncentracijama. Varijacije ovog procesa treba da budu prepoznate od strane prosečnog stručnjaka u tehnici. Na primer, dodate su druge komponente, bez obzira da li su korišćeni dodatni aditivi, temperatura i pH na kojima je formulacija pripremljena, su svi korišćeni faktori koji mogu biti optimizovani za koncentraciju i sredstva primene.

[0111]Formulacije iz patentnog zahteva mogu biti obezbeđene za pacijente kao bistri rastvori ili kao dvojne posude obuhvatajući posudu liofilizovane najmanje jedne skale proteina koja je rekonstituisana sa drugom posudom koja sadrži vodu, konzervans i/ili ekscipijente, poželjno fosfatni pufer i/ili fiziološki rastvor i izabranu so, u vodenom razblaživaču. I pojedinačna ampula-bočica-posuda rastvora, ili dvostruka bočica koja zahteva rekonstituciju može biti korišćena više puta i može biti dovoljna za jedan ili mnogostruke cikluse lečenjapacijenta, i tako mogu obezbeditii prikladniji režim lečenja od tekućeg-trenutno dostupnog.

[0112]Prikazani segmenti proizvodnje iz patentnih zahteva su korisni za primenu za period koji varira, dvadeset četiri časa ili više. Prema tome, prikazani segmenti proizvodnje iz patentnih zahteva pružaju značajne prednosti zapacijenta. Formulacije pronalaska mogu opciono biti sigurno pohranjene na temperaturama od oko 2°C do oko 40"C, i zadržavaju biološku aktivnost proteina tokom produženog vremenskog perioda, na taj način-tako, -omogućavajući oznaku na pakovanju koja označava da se rastvor može držati i/ili koristiti tokom vperioda od 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, ili 96 sati ili više. Ako je korišćen konzervisani razblaživač, takve oznake mogu uključiti upotrebu do 1-12 meseci, pola, jednu i po, i/ili dve godine.

[0113]Rastvori najmanje jedne skale proteina iz pronalaska mogu biti pripremljeni procesom koji sadrži mešanje najmanje jedne skale proteina u vodenom razblaživaču. Mešanje je sprovedeno korišćenjem konvencionalnog rastvarana i procedura mešanja. Da se pripremi pogodan razblaživač, na primer, izmerena količina najmanje jedne skale proteina u vodi ili puferu je kombinovana u količinama dovoljnim da obezbede protein i opciono konzervans ili pufer u željenim koncentracijama. Varijacije ovog procesa treba da budu prepoznate od strane prosečnog stručnjaka u oblasti tehnike. Na primer, redosled dodavanja komponenata, -bilo da su korišćeni dodatni aditivi, temperatura i pH na kojima je formulacija pripremljena, su svi faktori koji mogu biti optimizovani za koncentraciju i sredstava korišćene primene.

[0114]Produkti iz patentnog zahteva mogu biti obezbeđeni za pacijente kao bistri rastvori ili kao dvojne posude sadržavajući posudu liofilizovane najmanje jedne skale proteina koja je rekonstituisana sa drugom posudom koja sadrži vodeni razblaživač. I pojedinačna posuda rastvora ili dvojna posuda koja zahteva rekonstituciju može biti korišćena više puta i može biti dovoljna za jedan ili mnogostruke cikluse lečenja pacijenta i tako obezbeđuje prikladniji režim lečenja od tekućeg- trenutno dostupnog.

[0115]Produkti iz patentnog zahteva mogu biti obezbeđeni indirektno za pacijente putem snabdevanja apoteka, domova zdravlja, ili drugih sličnih institucija i ustanova, bistrih rastvora ili dvojnih posuda obuhvatajući posudu od liofilizovane najmanje jedne skale proteina koja je rekonstituisana sa sadržajem druge posude koja sadrži vodeni razblaživač. Bistri rastvor u ovom slučaju se može popeti-može iznositi do jedne litre ili čak veće size-veličine-količine, obezbeđujući veći rezervoar iz kog se mogu dobiti manji delovi najmanje jednog rastvora skale proteina jednom ili više puta za transfer u manje posude i obezbeđeni su putem apoteka ili domova zdravlja za njihove klijente i/ili pacijente.

[0116]Prepoznata sredstva koja obuhvataju sisteme pojedinačne posude uključuju injektorska sredstva za isporuku rastvora kao što je BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, and OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free InjectortB, Intraject®, Medi-Ject®, npr., ako su napravljeni ili razvijeni od strane Becton Dickensen (Franklin Lakes, NJ, www.bectondickenson.com), Disetronic (Burgdorf, Switzerland, www.disetronic.com; Bioject, Portland, Oregon (www.bioject.com); National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, UK, www. weston-medical.com), Medi-Ject Corp (Minneapolis, MN, www. mediject.com), i slične odgovarajuće uređaje. Poznati uređaji koji obuhvataju sistem dvojnih posuda uktjučuju one olovka-injektorske sisteme za rekonstituciju liofilizovanog teka u ketridžu za isporuku rekonstituisanog rastvora kao što je HumatroPen®. Primeri drugih pogodnih uređaja uključuju prethodno napunjene špriceve, auto-injektore, injektore bez igle infuzione setove IV bez igle.

[0117]Predstavljeni produkti iz patentnog zahteva uključuju materijale za pakovanje. Materijal za pakovanje obezbeđuje, pored tražene informacije za zakonske agencije, uslove pod kojima proizvod može biti korišćen. Materijal za pakovanje ovog pronalaska obezbeđuje instrukcije namijenjene pacijentu da rekonstituiše najmanje jednu skalu proteina u vodenom razblaživaču da se formira rastvor i koristi rastvor preko perioda od 2-24 sata, ili duže za dve ampule-posude, vlažnog/suvog, produkta. Za pojedinačnu ampulu-posudu, rastvora produkta, oznaka označava da takav rastvor može biti korišćen preko perioda od 2-24 sata, ili duže. Predstavljeni produkti iz patentnog zahteva su korisni za upotrebu u ljudskoj farmaciji produkta.

[0118]Formulacije iz ovog pronalaska mogu biti pripremljene procesom koji obuhvata mešanje najmanje jedne skale proteina i izabranog pufera, poželjno fosfatnog pufera koji sadrži fiziološki rastvor ili izabranu so. Mešanje najmanje jedne skale proteina i pufera u vodenom razblaživaču je izvedeno korišćenjem konvencionalnih procedura rastvaranja i mešanja. Da se pripremi pogodna formulacija, na primer, izmerena količina najmanje jedne skale proteina u vodi ili puferu je kombinovana sa željenim agensom za puferovanje u vodi u dovoljnoj količini da obezbedi protein i pufer u željenim koncentracijama. Varijacije ovog procesa bi trebale biti prepoznate od strane prosečnog stručnjaka u ovom području tehnike. Na primer, sled kojim su komponente dodavane, da li su dodatni aditivi korišćeni, temperatura i pH na kojima je formulacija pripremjena, predstavljaju sve faktore koji se mogu biti optimalizovani u skladu sa koncentracijom i načinom primene.

[0119]Stabilne iti konzervisane formulacije iz patentnog zahteva se mogu biti obezbeđene -date pacijentima kao bistrirastvori ili kao dualne -posude-ampule koje obuhvataju ampulu -posudu liofilizovane skale proteina koje je rekonstituisana sa drugom posudom- amputom koja sadrži konzervans ili pufer i ekscipijense u vodenom razblaživaču. I rastvor pojedinačne ampule-posude, ili dvojna arnpula koja zahteva rekonstituciju može biti korišćena više puta i može biti dovoljna za jedan iti mnogostruke cikluse lečenja pacijenta i tako obezbeđuje prikladniji režim lečenja od trenutno dostupnog.

[0120]Druge formulacije i metode stabiliziranja skale proteina mogu rezultirati u različito od bistrog rastvora liofilizovanog praška koji sadrži skalu proteina. Među rastvorima koji nisu bistri su formulacije koje sadrže česticu suspenzije, spomenute Čestice bivaju kompozicija koja sadrži skalu proteina u strukturi varijabilne dimenzije i poznate različito kao mikrosfera, mikročestica, nanočestica, nanosfera ili lipozom. Takva relativno homogena u suštini sferična čestica formulacija sadržavajući aktivni agens može biti formirana kontaktiranjem vodene faze koja sadrži aktivni agens i polimer i bezvodne faze praćene evaporacijom bezvodne faze da uzrokuje -srastanje čestica iz vodene faze, kako je učeno u US 4,589,330. Porozne mikročestice mogu biti pripremljene korišćenjem prve faze koja sadrži aktivni agens i polimer raspršen u kontinuiranom rastvaraču i uklanjanje navedenog rastvarača iz suspenzije ili razrblaživanjem-ekstrakcijom-precipitacijom, ka što je učeno u US 4,818,542. Ppželjni polimeri za takve pripravake su prirodni ili sintetski kopolimeri ili polimeri izabrani iz grupe koju čine gleatin agar, škrob, arabinogalaktan, albumin, kolagen, poliglikolna kiselina, polimlečna kiselina, glikolid-L(-)taktid poli(episilon-kaprotakton, poti(epsilon-kaprolakton-CO-mtečna kiselina), poli(epsilon-kaprolakton-CO-glikotna kiselina), poliffi-hidroksi- -buterna- mastačna kiselina), polietilen oksid, polietilen, poli(alkil-2-cijanoakrilat), poti(hidroksietil metakritat), potiamidi, poti(amino kiseline), poli(2-hidroksietil DL-aspartamid), poli(ester urea), poli(L-fenilalanin/etiten glikol/1,6-diizocijanatoheksan) i poli(metil-metakrilat). Naročito poželjni polimeri su poliestri, kao Što je poliglikolna kiselina, polimlečnakiselina, glikolid-L(-)laktid poli (episilon-kaprolakton, poli(epsilon-kaprotakton-CO-mlečna kiselina), i poli (epsilon-kaprolakton-CO-glikolna kiselina. Ratvarači korisni za rastvaranje polimera i/ili aktivni uključuju: vodu, heksafluorizopropanol, metilen hlorid, tetrahidrofuran, heksan, benzen ili heksafluoraceton seskvihidrat .Proces dispergovanja aktivnog sadržavajući fazu sa drugom fazom može uključiti pritisak prisiljavajući navedene prve faze kroz otvor u mlaznicu utičući formiranju kapljica.

[0121]Formulacije suvog praha mogu biti postedica procesa -osim-drugačijeg od liofilizacije, kao što je sušenje raspršivanjem ili ekstrakcija rastvarača evaporacijom iti precipitacijom kristalne kompozicije praćene jednim ili više koraka da se ukloni vodeni ili bezvodni rastvarač . -Priprema preparata skale proteina raspršivanjem je učena u U.S. 6,019,968. Kompozicije skfold proteina na bazi suvog praha mogu biti proizvedene -respirirani suhi prah. Rastvarači mogu uključiti polarna jedinjenja, kao što su voda i etanol, koji se mogu lako sušiti. Stabilnost skafold proteina se može se poboljšati izvođenjem procedura sušenja raspršivanjem u odsustvu kiseonika, kao što nitrogen blanket -pod šatorom azota ili upotrebom azota kao gasa za sušenje. Druga relativno suva formulacija je disperzija većeg broja perforiranih mikrostruktura raspršenih u sredini suspenzije koja obično sadrži hidrofluoroalkan propetant-pogonski gas kao što je učeno u W0 9916419. Postojane disperzije mogu biti davane u pluća pacijenta pomoću inhalatora sa odmerenom dozom. Oprema korisna u komercijalnoj proizvodnji lekova osušenih raspršivanjem proizvedenih od Buchi Ltd. ili Niro Corp.

[0122]Najmanje jedan skafold protein bio u stabilnim ili konzervisanim formulacijama ili rastvorima opisanim ovde, mogu biti davani pacijentu u skladu sa ovim otkrićem putem različitih metoda isporuke uključujući SC ili IM injekcije; transdermalno, pulmonalno, transmukozno, putem implantata, osmotske pumpe, katridža, mikro pumpe, ili drugh načina određenih od strane iskusnog stručnjaka, kao što je dobro poznato ustanju tehnike.

Therapeutic Applications Terapijske aplikacije

[0123]Ovde je otkriven metod za moduliranje ili lečenje bolesti, ućeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacijentu, kao što je poznato u stanju tehnike ili kao Što je opisano ovde, korišćenjem najmanje jednog skafold proteina iz ovog pronalaska, npr., davanjem ili kontaktiranjem ćelije, tkiva, organa, životinje ili pacijenta sa terapijski efikasnom količinom skafold proteina. Takođe ovde je otkriven metod za moduliranje ili lečenje bolesti, u ćeliji, tkivu, organu, Životinji, ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od gojaznosti, bolesti povezane sa imunitetom, kardiovaskularnu bolest, infektivnu bolest, malignu bolest ili neurološku bolest.

[0124]Ovo otkriće isto takođe obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne bolesti povezane sa imunitetom, u ćeliji, tkivu, organu, životinji, ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od reumatoidnog artritisa, juvenilnog reumatoidnog artritisa, sistemske pojave juvenilnog reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa, ankilozantni spondilitisa, čira želuca, seronegativnih artropatija, osteoartritisa, osteolize, aseptičkog labavljenja ortopedskih implantata-implanta, inflamatorne bolesti creva, ulceroznog kolitisa, sistemskog lupus eritematozusa, antifosfolipidnog sindroma, iridociklitisa/ uveitisa /optičkog neuritisa, idiopatske plućne fibroze, sistemskog vaskulitisa /Wegenerove granulomatoze, sarkoidoze, orhitisa /vazektomije postupaka obrtanja, alergijskih/atopijskih bolesti, astme, alergijskog rinitisa, ekcema, alergijskog kontaktnog dermatitisa, alergijskog konjunktivitisa, hipersenzitivnog pneumonitisa, transplantacija, odbacivanja presađenog organa, graft-versus-host bolesti, sindroma sistemskog inflamatornog odgovora, sindroma sepse, gram pozitivne sepse, gram negativne sepse, sepse negativne kulture, gljivične sepse, neutropenijske groznice, urosepse, meningococemia, traume/krvarenja, opeketona, izloženosti jonizirajućem zračenju, akutnog pankreatitisa, sindroma respiratornog distresa sindrom odraslih, reumatoidnog artritisa, alkoholom indukovanog hepatitisa, hroničnih inflamatornih patoloških stanja, sarkoidoze, Kronove patologije-bolesti, anemije srpastih ćelija, dijabetesa, nefroze, atopijske bolesti, reakcija hipersenzitivnosti, alergijskog rinitisa, peludne groznice, stalnog rinitisa, konjunktivitisa, endometrioze , astme, urtikarije, sistemske anafilaksije, dermatitisa, perniciozne anemije, hemolitičkebolesti, trombocitopenije, odbacivanja transplantata bilo kog organa ili tkiva, odbacivanja translplantata bubrega, odbacivanja transplantata srca, odbacivanja transplantata jetre, odbacivanja transplantata pankreasa, odbacivanja transplantata pluća, odbacivanja transplantacija koštane srži (BMT), odbacivanja transplantata kože, odbacivanja transplantata hrskavice, odbacivanja transplantata kostiju, mali odbacivanja transplantata tankog creva, odbacivanja implantata fetalnog timusa, odbacivanja transplantata paratiroidne žlezde, odbacivanja paratiroidni bilo kog organa ili tkiva, odbacivanja alografta, reakcija preosjetljivosti anti-receptora, Gravesove bolesti, Ravnauđova bolesti, inzulinske rezistencije dijabetesa tipa B, astme, mijastenije gravis, -citotoksičnost povezana antitelom, reakcije preosetljivosti tipa III, P0EMS sindroma (polineuropatije, organomegalije, endokrinopatije, monoklonalne gamopatije, i sindrom promena na koži), polineuropatije, organomegalije, endokrinopatijei, monoklonalne gamopatije, sindrom promena na koži, antifosfolipidnog sindroma, pemfigusa, skleroderme, miešane bolesti vezivnog tkiva, idiopatske Addisonove bolesti, dijabetes melitusa, hroničnog aktivnog hepatitisa, primarne bilijarne ciroze, vitiliga, vaskulitisa, post-MI kardiotom sindrom, hipersenzitivnost tipa IV, kontaktnog dermatitisa, preosetljivi pneumonitis, odbacivanje alografta, granuloma nastalih zbog intracelularnih organizama, osetljivosti na lek, metaboličke/idiopatske, Wilsonove bolesti, hemahromatoze, nedostatka alfa-1-antitripsina, dijabetičke retinopatije, Hašimotovog tiroiditisa, osteoporoze, hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna evaluacije osi, primarne bilijarne ciroze, tiroiditisa, encefalomijelitisa , kaheksije, cistične fibroze, neonatalne hronične bolesti pluća, hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD), familijarne hematofagocitične limfohistiocitoze, dermatoloških stanja, psorijaze, alopecije, -nefrotskog sindroma, nefritisa, glomerularnog nefritisa, akutno zatajenje bubrega, hemodijalize, uremije, toksičnosti, preektampsije, okt3 terapije, anti-cd3 terapije, citokin terapije, hemoterapije, terapije zračenjem (npr., uključujući, ali ne ograničavajući se na, asteniju, anemiju, kaheksiju, i slično), kronične salicilat intoksikacije, i slično. Videti, npr., the Merck Manual, 12th-17th Editions, Merck a Companv, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Welts et al., eds., Second Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000).

[0125]Ovo otkriće takođe obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od srčanog omamljivanja, infarkta miokarda, kongestivnog zastoja srca , moždanog udara, ishemijskog moždanog udara, krvarenja, akutnog koronarnog sindroma, arterioskleroze, ateroskleroze, restenoze, dijabetičke aterosklerotične bolesi, hipertenzije, arterijske hipertenzije, renovaskularne hipertenzije, sinkope, šoka, sifilis kardiovaskularnog sistema, zastoja srca, plućnog srca, primarne pulmonalne hipertenzije, srčane aritmije, atrijske ektopične otkucaje, undulaciju atrija, afibrilaciju atrija (trajnu ili paroksizmalnu), post perfuzijonog sindroma, inflamatornog odgovora na kardiopulmonalni bajpas-izvantjelesna cirkulacija upala odgovor, haotične ili multifokalne atrijske tahikardije, uobičajene uske QRS tahikardije, specifične aritmije, ventrikularne fibritacije, njegove bundle aritmije, atrioventrikularnog bloka, bbloka zajedničke grane, poremećaja ishemije miokarda, bolesti koronarne arterije, angine pektoris infarkta miokarda, kardiomiopatije, kongestivne kardiomiopatije, restriktivne kardiomiopatije, vulvarne bolesti srca, endokarditisa, perikardialne bolesti , tumora srca, inflammacije aorte, okluzije abdominalne aorte i njenih grana, perifernih vaskularnih poremećaja, perifernih aterosklerotičnih bolesti, "thromboangitis obliterans", functional peripheral arterial disorders, Raynaud's phenomenon and disease, akrocijanoze, eritromelalgije, bolesti vena, tromboze vena, varikoze vena, arteriovenozne fistule, lymphederma, lipedema, nestabilna angina, reperfuzione povrede, "post pump" sindrom, ischemia-reperfuszione povrede, i slično. Takav metod može opciono obuhvatiti davanje efikaasne količine kompozicije ili farmaceutske kompozicije obuhvatajući najmanje jedan skafold protein na ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu kojem je potrebna takva modulacija, tretman ili terapija.

[0126]Ovo otkriće takođe obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne kardiovaskularne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: akutne ili hronične bakterijske infekcije, akutne ili hronične parazitske ili infektivne procese, uključujući bakterijske, virusne i gljivične infekcije, HIV infekciju/HIV neuropatiju, meningitis, hepatitis (npr., A, B ili C, ili slično), septički artritis, peritonitis, pneumoniju, epiglotitis, e. koli 0157:h7, hemolitički uremijski sindrom/trombolitičku trombocitopenijsku purpuru, malariju, hemoragična tropska groznica, "leishmaniasis", leproza, sindrom toksičkog šok, streptokokni miozitis, gas gangrenu, mikobakterium tuberkulozis, mvcobacterium avium intracellulare, "pneumocvstis carinii pneumonia", upalne bolesti kartice, orhitis/epididimitis, "legionella", lajmsku bolest, grip, epštajn-barov virus, "viralno povezan hemafagorični sindrom, virusni encefatitis/aseptički meningitis, i slično.

[0127]Ovo otkriće takođe obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne maligne bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: leukemije, akutne leukemije, akutne limfoblastične leukemije (ALL), akutne limfocitne leukemije, B-ćelije, T-ćelije ili FAB ALL, akutne mijeloidne leukemije (AML), akutne mijelogene leukemije, hronične mijelocitne leukemije (CML), hronične limfocitne leukemije (CLL), teukemia dlakavih ćelija, mijelodiplastičnog sindroma (MDS), limfoma, Hočkinsonove bolesti, malignog limfoma, ne-Hočkinsonovog limfoma, Burkitt's limform, multiplog mijeloma, Kapošijevog sarkoma, kolorektalnog karcinoma, karcinoma pankreasa, nazofaringeanog karcinoma, maligne histiocitoze, paraneoplastičnog sindroma, solidnih tumora, kancera bešike, kancera dojke, kolorektalnog kaancera, endometiral kancer, kancera glave, kancera vrata, nasledni nonpolipozni kancer, Hočkinsovog limfoma, kancera jetre, kancera pluća, nemali kancera jajnika, kancera pankreasa, kancera prostate, karcinoma ćelija bubrega, t-karcinoma testisa, adenokarcinoma, sarkoma, malignog melanoma, hemangioma, metastatske bolesti, resorpcije kostiju povezane sa kancerom, bolom u kostima povezanim sa kancerom, i slično.

[0128]Ovo otkriće takođe obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne neurološke bolesti u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: neurodegenerativih bolesti, multiple skleroze, migrene glavobolje, AIDS demencia "complexa", demielinating bolest kao što je multipla skleroza i acutni transverzni mielitis; ekstrapiramidalnih i cerebetarnih poremećaja, kao što su lezije kortikospinalnog sistema; poremećaja bazalnih ganglija; hiperkinetičkih poremećaja kretanja, kao što je Hantingtonova Horea i senilna Horea; poremećaja kretanja indukovaih lekom kao što su oni indukovani lekovima koji blokiraju receptore dopamina CNS, hipokinetičke poremećaje kretanja, kao što je Parkinsonova bolest; tzv "Progressive supranucleo Palsy"; strukturalnih lezija cerebeluma; spinocerebelarne degeneracije, kao što je spinanalna ataksija, -Fridrajhova ataksija, cerebro kortikalne degeneracije, multiple degeneracije (Mencel, Dejerine-Thomas, Shi-Drager, and Machado-Joseph); sistemskih poremećaja ( Refsumova bolest, abetaliporotemiam ataksija, telangiectasia, i poremećaj mitohondriatnog multi-sistema ); "demielinating ćore" poremećaj, kao što je multipla skleroza, acute transverse myelitis; i poremećaja motorne jedinice, kao što je neureogenicna maskularna atrofija ("anterior horn cell degeneration@, kao što je amiotrofična lateralna skleroza, atrofinfantilna sinalna musklularna i juvenilna spinatna muskularna atrofija); Alchajmerove bolesti; Daunovog Sindroma u srednjem dobu; Senilne Demencije Lewy body tipa; VVernicke-Korsakoff sindrom; hroničnog alkoholizma; Krojcfeld-Jakobsove bolesti; Subacutni sclerosni panencefalitis, Hallerrorden-Spatz bolest; Demencia pugilistika; neurotraumatične povrede (npr., spinal cord injury, povreda mozga, concussion, repetitive concussion); bola; inflammatornog bola; autizma; depresije; udara; kognitivnog poremećaja; epilepsije; i slično. Takva metoda može opciono obuhvatiti davanje efikasne količine kompozicije amount ili farmaceutske kompozicije obuhvatajući najmanje jedno TNF antitelo ili specificiran deo ili varijantu na ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu kojem je potrebna takva modulacija, tretman ili terapija. Videti npr, the Merck Manual, 16<1*>Edition, Merck & Companv, Rahway, NJ (1992).

[0129]Ovo otkriće takode obezbeđuje metod za moduliranje ili lečenje najmanje jedne rane,

traume ili povrede tkiva ili povezanog hroničnog stanja, u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu, uključujući, ali bez ograničenja na, najmanje jednu od: povrede tela ili traume povezane sa oralnom hirurgijom uključujući periodontalnu hirurgiju, vađenje zuba (više zuba), endodonsko lečenje, inserciju zubnih implanta, aplikaciju i upotrebu zubnih proteza; ili pri čemu je rana izabrana iz grupe koja se sastoji od aseptičkih rana, kontuzovanih rana, incizionih rana, poderotina, ne-penetirrajućih rana, otvorenih rana, penetrirajućih rana, perforirajućih rana, puncture-tačkastih rana, septičkih rana , infekcije subkutanih rana; ili pri čemu je rana izabrana iz grupe koja se sastoji od ishemijskih ulcera, bolovi na pritisak i rane, fistule, teških ugriza, toplotne povrede i rane donora ili pri Čemu je rana aftozna rana, traumatska rana ili rana povezana sa herpesom.

[0130]Rane i/ li čirevi-ulceacije obično su pronađene vireći-šrtrčeći iz kože ili površine sluzokože ili kao posledica infarkta u organu ("udara"). Rana može biti rezultat defekta mekog tkiva ili lezije ili nekog osnovnog stanja. U ovom kontekstu, termin "koža" se odnosi na krajnu spoljnu površinom tela životinje, uključujući i čoveka, i obuhvata intaktnu, ili skoro intaktnu kožu, kao i povređenu površinu kože. Termin "sluzokoža" se odnosi na neoštećenu ili oštećenu mukozu-sluzokožu animalnog bića, kao što je čovek, i može biti oralna, bukalna, auralna, nazalna, plućna, očna, gastrointestinalna, vaginalna ili rektalna mukoza-sluzokoža.

[0131]U ovom kontekstu termin "rana" označava telesnu povredu sa prekodom normalnog integriteta struktura tkiva. Termin je takođe namenjen da obuhvatiti pojmove "bolna rana", "lezija", "nekroza," i "ulcer-čir". Normalno, termin " sore -upaljeno bolno" je popularan naziv za gotovo svaku leziju membrana kože ili sluzokože i termin "čir-ulcer" je lokalni defekt ili iskopovanje -ekskavacija, površine organa ili tkiva, koji je proizveden od strane odlubljivanja nekrotičnog tkiva. Lezija se generalno odnosi na bolo koji defekt tkiva. Nekroza se odnosi na mrtvo tkivo rezultirajući od posledica infekcije, povrede, inflamacije ili infarkta.

[0132]Termin "rana" koji se koristi u ovom kontekstu označava ranu (videti -dote-ispod za klasifikaciju rana) i bilo koju određenu fazu u procesu ozdravljenja-zarastanja, uključujući fazu pre nego što je zarasteanje bilo pokrenuto-inicirano -počelo ili čak i pre napravljene specifične rane poput hirurškog reza (profilaktičko lačenje). Primeri rana koje mogu mogu sprečene i/ili lečene u skladu sa ovim otkrićem su, npr., aseptičke rane, kontuzione rane, incizalne rane, poderotine, ne-penetrirajuće rane (t. rane u kojima ne postoji prekid kože ali postoji povreda osnovnih struktura), otvorene rane, penetrirajuće rane, perforirajuće rane, ubođne rane, septičke rane, potkožne-subkutane rane, itd. Primeri bolnih rana su dekubitusi od ležanja, aftozni stomatitis, hrom bolne rane, herpesi, dekubitusi, itd. Primeri ulcera su npr., peptički ulcer, duodenalni ulcer, ulcer želuca, gihtični ulcer, dijabetički ulcer, hipertenzivni ishemijski ulcer, ulcer staze, ulkus kruris (venski ulcer), sublingvalni ulcer, submukozni ulcer, simptomatični ulcer, trofički ulcer, tropski ulcer i veneralni ulcer, npr., uzrokovana gonorejom (uključujući uretritis, endocervicitis i proktitis). Stanja koja se odnose na rane ili bolne rane koje se mogu uspešno lečiti prema otkriću su opekotine, antraks, tetanus, gasna gangrena, šarlah, crveni vetar-ulu erizipel, sikoza barbe-brade, folikulitis, kontaginozni impetigo ili impetigo buloza, itd. Često postoje određena preklapanja upotrebom pojmova "rane" i "ulcera" i "rane" i "bolne rane", a, osim toga, termini su često se koriste nasumice. Zbog toga, kao što je navedeno iznad, u ovom kontekstu termin "rana" obuhvata pojmove "ulcer", "lezija", "bolna rana" i "infarkt", i termini se koriste bez razlike, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0133]Vrste rana koje će biti tretirane prema otkriću uključuju takođe (i) opšte rane, kao što su, npr., hiruške, traumatske, infektivne, ishemijske, toplotne, hemijske i bulozne rane; (ii) rane specifične za usnu šupljinu, kao što su, npr, post-ekstrakcione rane, endodonske rane posebno u svezi sa tečenjem cista i apscesa, ulcera i lezije bakterijskog, virusnog ili auto imunološkog porekla, mehaničke, hemijske, toplotne, infekcijske i lihenoidne rane; herpes ulcere, stomatitis ftozu, akutni nekrotizujući ulcerozni gingivitis i sindrom pečenja usta su konkretni-specificirani primeri; i (iii) rane na koži, kao što su, na npr., neoplazma, opekotine (npr., kemijske, toplotne) lezije (bakterijske, virusne, autoimunološke), ugrize i hirurške rezove. Drugi način klasifikovanja rana je kao što je (i) mali gubitak tkiva zbog hirurških incizija, manje ogrebotine i manjii ugrizi, ili kao (ii) značajan gubitak tkiva. Potonja skupina uključuje ishemijskeulcere, dekubitus, fistule, razderotine, ozbiljne ubode, toplotne opeklotine i rane donatorskog mesta (u mekim i čvrstim tkivima) i infarkte.

[0134]Druge rane koje su od važnosti u vezi sa ovom otkrićem su rane kao što su ishemijski čirevi, dekubitusi, fistule, teške ugrizi, toplotne opekotine i rane donatorskog mesta. Ishemijski ulceri i dekubitusi su rane koji obično sami zarastaju veoma sporo, i posebno u takvim slučajevima, poboljšani i brži proces ozdravljenja je, naravno od velike važnosti za pacijenta. Dalje, troškovi uključeni u lečenje pacijenata koji pate od takvih rana su značajno smanjeni kada je ozdravljenje poboljšano i kada se odvija mnogo brže.

[0135]Rane donatorskog mesta su rane koje se, npr., javljaju u vezi s uklanjanjem čvrstih tkiva iz jednog dela tijela na drugi deo tela, npr., u vezi sa transplantacijom. Rane rezultirajući iz takvih operacija su vrlo bolne i pobotjšanje ozdravljenja je zbog toga najvrednije. Termin "koža" je korišćen u vrlo širokom smislu obuhvatajući epidermalni sloj kože i - u onim slučajevima kada je površina kože manje ili više povređena - također dermalni sloj kože. Osim stratum korneuma, epidermalni sloj kože je spoljašnji (epitelijalni) sloj i dublji vezivni sloj tkiva kože se zove dermis.

[0136] Bilo koji metod ovog otkrića može obuhvatiti primenu efikasne količine koompozicije ili farmaceutske kompozicije koja sadrži najmanje jedan skafold protein u ćeliji, tkivu, organu, životinji ili pacijentu kome je potrebna takva modulacija, lečenje ili terapija. Takav metod može opcioni dalje sadržavati istovremenu primenu ili kombinovanu terapiju za lečenje takvih bolesti ili poremećaja, pri čemu davanje navedenog najmanje jednog skafold proteina, specificiranog dela ili njegove varijante, dalje sadrži davanje, pre istovremenog i /ili posle, najmanje jednog izabranog od najmanje jednog TNF antagonista (npr., ali bez ograničenja na, TNF hemijski ili proteinski antagonist TNF monoklonalano ili poliklonalno antitelo ili fragment, rastvorljiv TNF receptor (npr., p55, p70 ili p85) ili fragmenta, fuzionog polipeptida od njih ili malog molekula TNF antagonist, npr., TNF vezujući protein I ili II (TBP-1 ili TBP-II), nerelimonmab, infliksimab, etanercepta (Enbret<w>), adalimulaba ( Humira<M>),CDP-571, CDP-870, afetimomaba, lenercepta, i slično), antireumatika (npr., metotreksata, auranofina, aurotioglukoze, azatioprina, zlatnog natrijum tiomalata, hidroksihlorohin sulfata, leflunomida, sulfasalazina), mišićnog relaksanta, narkotika, ne-steroidnog anti inflamatornog leka (NSAID), analgetika, anestetika sedativa, lokalnog anestetika, neuromuskularnog blokatora, antimikrobnog agensa (npr., aminoglikozida, antifungalnog agensa, antiparazitika, antivirusnog agensa, karbapenema, cefalosporina, flurorhuinolona, makrolida, penicilina, sulfonamida, tetraciklina, drugog antimikrobnog agensa), antipsorijatika, kortikosteroida, anaboličkog steroida, agensa povezanog sa dijabetesom, minerala, nutricionog agensa, tiriodnog agensa, vitamina, hormona povezanog sa kalcijumom, antidijaretika, antitusativa, antiemetika, protiv ulcera, laksativa, antikoagulansa, eritropoetina (npr., epoetin alfa), filgrastima (npr., G-C5F, Neupogen), sargramostima (GM-CSF, Leukine), imunizacionog agensa, imunoglobulina, imunosupresiva (npr., baziliksimaba, ciklosporina, daklizumaba), hormona rasta, leka kao zamene hormona, modulatora estrogenog receptora, midrijatika, antidepresiva, antimaničnog agensa, antipsihotika, anksiolitika, hipnotika, simpatomimetika, stimulansa, donepezita, takrina, lekova za astmu, beta agonista, inhalacionog steroida, inhibitora leukotriena, metilksantina, kromolina, epinefrina ili analoga, dornaza alfe (Pulmozima), citokina ili antagonista citokina. Pogodne doze su dobro poznate u stanju tehnike, Videti npr., Wells et al., eds., Pharmacotherapv Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, CT (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, CA (2000); Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21 st edition, Springhouse Corp., Springhouse, PA, 2001; Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Ine, Upper Saddte River, NJ.

[0137] Citokini uključuju bilo koji poznati citokin. Videti npr., CopewithCytokines.com. Antagonisti citokona uključuju, ali nisu ograničeni na, bilo koji skafold protein, antitelo, fragment ili mimetik, bilo koji rastvorljiv; receptor, fragment ili mimetik, bilo koji antagonist malog molekula, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0138]Tipično, lečenje patoloških stanja se vrši primenom efikasne količine ili doze najmanje jedne kompozicije skafold proteina koja je ukupno, u prošeku, u rasponu od najmanje oko 0.01 do 500 miligrama najmanje jednog skafold proteina po kilogramu telesne težine pacijenta po dozi, i, poželjno, od najmanje oko 0.1 do 100 miligrama skafold proteina/kilogramu telesne težine pacijenta za jednokratnu ili višekratnu primenu, u zavisnosti od specifične aktivnosti aktivnog agensa sadržanog u kompoziciji. Alternativno efektivna serumska koncentracija može sadržavati od 0,1-5000 mg/ml serumske koncentracije za jednokratnu ili višekratnu primenu. Pogodne doze su poznate lekarima, i naravno, zavisiće od stanja određene bolesti, specifične aktivnosti kompozicije koja je primenjena, i određenog lečenja kome je podvrgnut pacijent. U nekim slučajevima, da bi se postigao željeni terapijski efekat, može biti neophodno da se obezbedi ponovljena primena, tj, pojedinačne ponovljene primene konkretno praćene ili odmerene doze, gde se individualne doze ponavljaju sve dok se ne postigne željena dnevna doza ili efekat.

[0139]Poželjne doze mogu opciono uključiti oko 0.1-99 i/ili 100-500 mg/kg/primeni, ili bilo koji raspon, vrednost ili frakciju u njoj, ili da bi se postigla koncentracija u serumu od oko 0.1-5000 pg/ml serumske koncentracije za jednokratnu ili višekratnu primenu ili bilo koji raspon, vrednosti ili frakciju u njoj. Poželjan raspon doza za skafold protein iz ovog pronalaska je od oko 1 mg/kg do oko 3, oko 6 ili oko 12 mg/kg telesne težine pacijenta.

[0140]Alterativno primenjena doza može varirati u zavisnosti od poznatih faktora, kao što su farmakodinamske karakteristike određenog agensa, i njegov način i put primene; godine, zdravstveno stanje, telesna težina primaoca; priroda i obim simptoma, vrsta trenutnog lečenja, učestalost lečenja, i željeni efekat. Obično doziranje aktivnog sastojka može biti oko 0.1 do 100 miligrama po kilogramu telesne težine. Obično 0.1 do 50, i poželjno 0.1 do 10 miligrama po kilogramu telesne težine po primeni ili u obliku pripravka sa produženim otpuštanjem, da bi se dobili željeni rezultati.

[0141]Kao ne-ograničavajući primer, lečenje ljudi ili životinja može biti obezbeđeno u obliku jednokratne ili periodične doze od najmanje jednog skafold proteina ovog pronalaska oko 0.1 do 100 mg/kg ili bilo kog raspona, vrednost ili frakcije u njoj dnevno, na najmanje jednom od 1-40 dana, ili, alternativno ili dodatno, najmanje jednom od 1-52 nedelje, ili, alternativno ili dodatno, najmanje jednom od 1-20 godina, ili bilo koju njihovu kombinaciju, koristeći jednokratne, infuzije ili ponovljene doze.

[0142]Dozni oblici (kompozicije) pogodni za unutrašnju primenu generalno sadrže od oko 0.001 miligrama do oko 500 miligrama aktivnog sastojka po jedinici ili kontejneru-spremniku. U ovim farmaceutskim kompozicijama aktivni sastojak će obično biti prisutan u količini od oko 0.5 do 99,999% težine zasnovane na ukupnoj težini kompozicije.

[0143]Za parenteralnu primenu, skafold protein može biti formulisan kao rastvor, suspenzija, emulzija, čestica, prah ili liofilizovani prah u asocijaciji, ili odvojeno obezbeđen, sa farmaceutski prihvatljivim parenteralnim nosačem. Primeri takvih nosača su voda, fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, i oko 1-10% ljudskog serumskog albumina. Lipozomi i ne-vodeni nosači kao što su fiksacijska ulja isto tako mogu biti korišćeni. Nosač ili liofilizovani prah može sadržavati aditive koji održavaju izotoniČnost (npr., natrijum hlorid, manitol) i hemijsku stabilnost (npr,, puferi i konzervansi). Formulacija je sterilizovana poznatim ili pogodnim tehnikama.

[0144]Pogodni farmaceutski nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington 's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, koji predstavlja standardnu literaturu u ovoj oblasti.

Alternativnaprimena-administracija

[0145] Mnogi poznati i razvijeni načini mogu biti korišćeni u skladu sa ovim otkrićem za primenu farmaceutski efikasne količine najmanje jednog skafold proteina prema ovom otkriću. Dok je putmonalna primena korišćena u sedećem opisu, drugi načini primene mogu biti korišćeni u skladu sa ovimokrićem, sa podesnimrezultatima. Skafold proteini iz ovog pronalaska mogu biti isporučeni na nosaču, kao rastvor, emulzija, koloid, ili suspenzija, ili kao suvi prah, primenom bilo kojeg od različitih sredstava i metoda pogodnih za primenu putem inhalacije ili drugim metodama opisanim ovde načinima ili poznatim u struci.

Parenteralne formulacije i primena

[0146] Formulacije za parenteralnu primenu mogu sadržavati kao zajednički ekscipijens sterilnu vodu ili fiziološki rastvor, polialkilen glikole kao što su polietilen glikol, ulja biljnog porekla, hidrogenizoani naftaleni i slično. Vodene ili uljane suspenzije za injekciju mogu biti pripremljene pkorišćenjem odgovarajućeg emulgatora ili ovlaživača i agensa za suspendovanje, u skladu sa poznatim metodama. Agensi za injekcije mogu biti ne-toksični, ne-oralno primenjivi agensi za razblaživanje, kao što je vodeni rastvor ili sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija urastvaraču. Kao primenjivi nosač ili rastvarač, voda, Ringerov rastvor, izotonični fiziološki rastvor, itd. su dopušteni; kao uobičajeni rastvarač ili suspendujući rastvarač, sterilno involatilno ulje može biti korišćeno. U tu svrhu može se koristiti bilo koja vrsta involatilnog ulja i masne kiseline, uključujući prirodna ili sintetska ili polusintetska ulja ili masne kiseline; prirodne ili sintetske ili polusintetske mono- ili di- ili trigliceridi. Parenteralna primena je poznata u tehnici, i uključuje, ali nije ograničena na konvencionalne načine injekcija, uređaj za injektiranje koji koristi pritisak gasa kao što je opisano u U.S. Pat. No. 5,851,198, and a laser perforator device as described in U.S. Pat. No. 5,839,446.

Alternativna Isporuka

[0147]Otkriće se dalje odnosi na primenu najmanje jednog skafold proteina parenteralnu, supkutanu, intramuskularnu, intravenoznu, intraartikularnu, intrabronhijalnu, intraabdominalnu, intrakapsularnu, intracartilaginous -intrakavitarnu, intracelial, intracerebelarnog, intracerebelarnu, intracerebroventrikularnu, intrakoličnu, intracervikalnu, intragastiČnu, intrahepatičnu, intramiokardijalnu, intraostealnu, intrapelvičnu, intraperikardijalnu, intraperitonealnu, intrapleuralnu, intraprostatičnu, intrapulmonarnu, intrarektalnu, intrarenalnu, intraretinalnu, intraspinalnu, intrasinovijalnu, intratorakalnu, intrauterinu, intravezikalnu, intralezionalnu u botusu, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno, ili transdermalno. Najmanje jedan skafold protein može biti pripremljen za upotrebu parenteralnu (subkutanu, intramuskularnu ili intravenoznu) ili bilo kojim drugim putem primene naročito u obliku tečnih rastvora ili suspenzija; za vaginalnu ili rektalnu primenu naročito u polučvrstim oblicima kao što su, ali bez ograničenja na, kreme i supozitorijie; za bukalnu, ili sublingvalnu primenu, kao što je, ali bez ograničeno na, u obliku tableta ili kapsula; ili intranazalnu kao što su, ali bez ograničenja na, oblik praha, nazalne kapi ili aerosol ili određeni agensi; ili transdermalnu kao što je, ali bez ograničenja gel, mast, tosion, suspenzija ili sistem flastera za isporuku sa hemijskim pojačivačima kao što je dimetit sulfoksid koji modifikuju strukturu kože ili povećavaju koncentraciju leka u transdermalnom flasteru (Junginger, et al. In "Drug Permeation Enhancement;" Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994), ili sa oksidirajućim sredstvima koja omogućuju primenu formulacija koje sadrže proteine i peptide na kožu (WO 98/53847), ili primene električnih polja kako bi se stvorili prolazni transportni putevi kao što je elektroporacija, ili da bi se povećala pokretljivost naelektrisanih lekova kroz kožu kao što je jontoforeza, ili aplikacija ultrazvukom kao što je sonoforeza (U.S. Pat. Nos. 4,309,989 and 4,767,402).

Pulmonarna/Nazalnaprimena

[0148]Za plućnu primenu, pogodna najmanje jedna kompozicija skafold proteina je isporučena u efikasnoj veličini čestice za dosezanje nižih đisajnih puteva pluća ili sinusa. Prema otkriću, najmanje jedan skafold proteina može biti isporučen bilo kojim od različitih inhalacionih ili nazalnih uređaja poznatih u struci za primenu terapijskog agensa putem inhalacije. Ovi uređaji namenjeni za deponovanje aerosolizovanih formulacija u sinusnu šupljinu ili alveole pacijenata, uključuju inhalatore sa odmerenim dozama, nebulizatore, generatore suvog praha, raspršivače, i slično. Drugi uređaji pogodni za usmeravanje plućne ili nazalne primene formulacije skafold proteina su takođe poznati u tehnici. Svi takvi uređaji mogu koristiti formulacije pogodne za primenu u obliku raspršivanja skafold proteina u obliku aerosola. Takvi aerosoli mogu biti sadržavam' i u rastvorima (oba vodena ili bezvona) ili čvrstim česticama.

[0149]Inhalatori sa odmerenom dozaom kao Ventolin® inhalator sa odmerenom dozom, uobičajeno koriste potisni gas , te zahtievaju aktivaciju tokom udisanja (Videti., npr., W0 94/16970, WO 98/35888). Inhalatori sa suvim prahom kao Turbuhaler™ (Astra), Rotahaler® (Glaxo), Diskus® (Glaxo), Spiros<1*>inhaler (Dura), uređaji na tržištu od strane Inhale Therapeutics, and the Spinhaler® inhalatori sa prahom (Fisons), koriste aktivaciju daha mešanog praha (US 4668218 Astra, EP 237507 Astra, WO 97/25086 Glaxo, WO 94/08552 Dura, US 5458135 Inhale, WO 94/06498 Fisons). Nebulizatori kaoAERxm Aradigm,the Ultravent® nebulizator (Mallinckrodt), I Acorn II®nebulizator (Marquest Medical Products) (US 5404871 Aradigm, WO 97/22376), proizvode aerosole iz rastvora, dok inhalatori sa odmerenom dozom, inhalatori sa suvim prahom, itd generišu male čestice aerosola. Takvi specifični primeri na tržištu dostupnih inhalacionih uređaja su namenjeni da predstavljaju specifične uređaje pogodne za praksu ovog otkrića i nisu namijenjeni da ograničavaju obim ovog otkrića.

[0150]Poželjno, kompozicija koja sadrži najmanje jedan skafold protein dostavljena putem inhalatora sa suvim prahom ili raspršivačem. Postoji nekoliko poželjnih karakteristika inhalacionog uređaja za primenu najmanje jednog skafold proteina iz ovog otkrića. Na primer, isporuka putem inhalacionog uređaja ima prednost u pouzdanosti prenosa, reproduktivnosti.i tačnosti. Inhalacioni uređaj može opciono isporučiti male suve čestice, npr., manje od oko 10 mm, poželjno oko 1-5 mm, uz dobru respiraciju.

Primena kompozicija skafold proteina u obliku raspršivača

[0151]Raspršivač koji sadrži kompoziciju skafold proteina može biti proizveden potiskom-forsiranjem suspenzije ili rastvora najmanje jednog skafold proteina kroz mlaznicu pod pritiskom. Veličina mlaznice i konfiguracija, primenjeni pritisak, i brzina dodavanja tečnosti mogu biti izabrani da se postigne željeni izlaz i veličina čestice. Elektrorasprsivač može biti proizveden, na primer, električnim poljem u vezi sa kapilarnim punjenjem ili mlaznicom. Povoljno je da čestice najmanje jedne kompozicije skafold proteina proizvedene-isporučene-prenesene raspršivačem imaju veličinu čestice manju od 10 pm, poželjno u rasponu od oko 1 pm do oko 5 pm, a najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm.

[0152]Formulacije najmanje jedne kompozicije skafold proteina pogodne za upotrebu u raspršivaču tipično uključuje kompoziciju skafold proteina u vodenom rastvoru u koncentraciji od oko 0.1 mg do oko 100 mg najmanje jedne kompozicije skafold proteina po ml rastvora ili mg/gm, ili bilo kom rasponu, vrednosti ili frakcije u njemu. Formulacija može obuhvatiti agense kao Što je ekscipijens, pufer, izotonični agens, konzervans, surfaktant, i poželjno cink. Formulacija može takođe uključiti ekscipijens ili agens za stabilizaciju kompozicije skafold proteina kao što je pufer, redukujući agens, protein, ili ugljeni hidrat. Celoviti- Bulk proteini korisni u formulisanju kompozicija skafold proteina uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korišćeni u formulisanju kompozicija skafold proteina uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu, ili slično. Formulacija kompozicije skafold proteina može takođe uključiti surfaktant, koji može smanjiti ili sprečiti površinski-indukovanu agregaciju kompozicije skafold proteina uzrokovanu atomizacijom rastvora u formiranju aerosola. Različiti konvencionalni surfaktanti mogu biti korišćeni, kao što su polioksietilen estri masnih kiselina i alkoholi, i polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina. Količine će generalno varirati između 0.001 i 14% po težini formulacije. Naročito poželjni surfaktanti za svrhe ovog otkrića su polioksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, potisorbat 20, i slično. Dodatni agensi poznati ustanju tehnike za formulaciju proteina kao što su skafold protein skele, ili specificirani delovi ili varijante, mogu takođe biti uključeni u formulacije.

Primena kompozicija skafold proteina putem nebulizatora

[0153]Kompozicije skafold proteina iz pronalaska mogu biti primenjeni putem nebulizatora, kao što je vodeni nebulizator ili ultrazvučni nebulizator. Tipično, u jet nebulizatoru, je komprimovani izvor vazduha kako bi se stvorio mlaz vazduha velike brzine kroz otvor. Kako se gas širi iznad mlaznice, stvara se polje niskog pritiska, koje odvodi rastvor kompozicije skafold proteina kroz kapilarnu cev povezanu na rezervoar sa tečnošću. Formirana tečna struja iz kapilarne cevi je soblikovana u nestabilne filamente i kapljice tokom izlaska iz cevi, stvarajući aerosol. Raspon konfiguracija, stopa protoka, kao i -vrste pregrade mogu biti korišćene da se postigne željeno izvođenje karakteristika iz jet nebulizatora. U ultrazvučnom nebulizatoru, visoke frekvencije električne energije su korišćene da bi se stvorila vibraciona, mehanička energija, obično koričenjem pizoelektričnog prenosnika-transduktora. Ova energija je prenesena u formulaciju kompozicije skafold proteina, bilo direktno ili kroz tečnost spojnice-hidrautičnu spojnicu, stvarajući aerosol koji uključije kompoziciju skafold proteina. Povoljno, Čestice kompozicije skafold proteina prensesne nebulizatorom imaju veličinu čestica manju od oko 10 pm, poželjno u rasponu od oko 1 pm do oko 5 pm, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm.

[0154]Formulacije najmanje jednog skafold proteina pogodne za upotrebu sa nebulizatorom, bilo mlaznog ili ultrazvučnog, tipično uključuju koncentracije od oko 0.1 mg do oko 100 mg najmanje jednog skafold proteina po ml rastvora. Formulacija može uključiti agense kao što je ekscipijens, pufer, izotonični agens, konzervans, surfaktant, i poželjno cink. Formulacija može takođe uključiti ekscipijens ili agens za stabilizaciju najmanje jedne kompozicije skafold proteina, kao što je pufer, redukujući agens, protein, ili ugljeni hidrat. Objedinjeni-Bulk proteini prikladni zaformulisanje najmanje jedne kompozicije skafold proteina uključuju albumin, protamin, ili slično. Tipični ugljeni hidrati korisni u formulisanju najmanje jedne kompozicije skafold proteina uključuju saharozu, manitol, laktozu, trehalozu, glukozu, ili slično. Najmanje jedna formulacija kompozicije skafold proteina može takođe uključiti surfaktant, koji može smanjiti ili sprečiti površinski- indukovanu agregaciju kompozicije skafold proteina uzrokovanu atomizacijom rastvora u formiranju aerosola. Različiti konvencionalni surfaktanti mogu biti korišćeni, kao što su polioksietilen estri masnih kiselina i alkoholi, i polioksietilen sorbitol estri masnih kiselina. Količine će generalno varirati između 0.001 i 14% po težini formulacije. Naročito poželjni surfaktanti za svrhe ovog otkrića su polioksietilen sorbitan monooleat, polisorbat 80, polisorbat 20, i slično. Dodatni agensi poznati u stanju tehnike za formulaciju proteina kao što je skafold protein, može takođe biti uključen u formulaciju.

Primena kompozicija skafold proteina putem i hala tora sa odmernom dozom

[0155]U inhalatoru sa odmerenom dozom (MDI), potisni gas, najmanje jednog skafold proteina, i bilo koji ekscipijens ili drugi aditivi se nalaze se u kanistru kao smeša uključujući i tečni komprimovani gas. Aktivacija ventila za doziranje oslobađa smešu u obliku aerosola, poželjno sadržavajući čestice u veličini raspona manjeg od oko 10 pm, poželjno oko 1 pm do oko 5 pm, i najpoželjnije oko 2 pm do oko 3 pm. Željena veličina čestice aerosola se može dobiti primenom formulacije skafold proteina proizvedenog različitim metodama poznatim osobama iz struke, uključujući mevenje u mlazu, sušenje raspršivanjem, kritičnu tačku kondenzacije, i slično. Poželjni inhalatori sa odmerenom dozom uključuju one proizvedene od strane 3M ili Glakso, koristeći hidro fluorougljenik potisni gas. Formulacije od najmanje jednog skafold proteina za upotrebu sa uređajem inhatatora sa odmerenom doom će generalno uključiti fino usitnjen prah koji sadrži najmanje jedan skafold protein skele u obliku suspenzije u ne-vodenom medijumu, na primer, suspendovan u potisnom gasu sa dodatkom surfaktanta. Potisni gas maže biti bilo koji konvencionalan* materijal korišćen za ovu svrhu, kao što je hlorofluorougljenik, hidrohlorofluorougljenik, hidrofluorougljenik, ugljovodonik , uključujući trihlorofluorometan, dihlorodifluorometan, dihlorotetrafluoroetanol i 1,1,1,2-tetrafluoroetan, HFA-134a (hidrofluroalkan-134a), HFA-227 (hidrofluroalkan-227), i slično. Poželjno , potisni gas je hidrofluorougljenik. Surfaktant može biti izabran da stabiliše najmanje jedan skafold protein kao suspenziju u potisnom gasu, da zaštiti aktivni agens od hemijske degradacije, i slično. Pogodni surfaktanti uključuju sorbitan trioleat, sojin lecitin, oteinsku kiselinu, i slično. U nekim slučajevima, rastvori aerosola su poželjni koristeći srastvarače, kao što je etanol. Dodatni agensi poznati u stanju tehnike za formulaciju proteina mogu takođe biti uključeni u formulaciju. Prosečan stručnjak sa ovog područja tehnike će uočiti da metode prikazanog otkrića mogu biti ostvarene putem plućne primene najmanje jedne kompozicije skafold proteina preko uređaja koje nisu opisani ovde.

Oralne formulacije i primena

[0156]Formulacije za oralnu primenu se oslanjaju na istovremenu primenu adjuvanata (npr., rezorcinola i nejonskih surfaktanata kao što su polioksietilen oleil etar i n-heksadecilpolietilen etar) da bi se veštački povećala permeabilnost intestinalnih zidova, kao i istovremenu primenu enzimskih inhibitora (npr., inhibitora tripsina pankreasa, diizopropilfluorofosfata (DFF) i trasilola) da se inhibira enzimska dezintegracija. Formulacije za unos hidrofilnih agenasa uključujući proteine i skafold proteine i kombinaciju od najmanje dva surfaktanta namenjena za oralnu, bukalnu, mukoznu, nazalnu, pulmonalnu, vaginalnu transrrtembransku ili rektalnu primenu je učeno u U.S. 6,309,663. Aktivan konstituent jedinjenja doznog oblika čvrstog tipa za oralnu primenu može biti mešan sa najmanje jednim aditivom, uključujući saharozu, laktozu, celulozu, manitol, trehalozu, rafinozu, maltitol, dekstran, škrobove, agar, arginate, hitine, hitosane, pektine, tragakant, gumu arabiku, želatin, kolagen, kazein, albumin, sintetske ili polusintetske polimere, i glicerid. Ovi dozni oblici mogu takođe sadržavati druge vrste (više vrsta), aditiva, npr., inaktivne agense za razblaživanje, lubrikante-maziva kao što je magnezijum stearat, paraben, konzervans kao što je sorbinska kiselina, askorbinska kiselina, alfa-tokoferol, antioksidans kao što je cistein , dezintegrator, vezivo, agens za puferovanje, zaslađivač, agens za aromu, agens za miris, itd.

[0157]Tablete i pilule mogu dalje biti obrađene u obliku enteričko-obloženih pripravaka. Tečni pripravci za oralnu primenu uključuju emulziju, sirup, eliksir, suspenziju i sve druge rastvore pripravaka odobrene za medicinsku upotrebu. Ovi pripravci mogu sadržavati neaktivne agense za razblaživanje koji se uobičajeno koriste u struci, na primer., vodu. Lipozomi su isto tako bili opisani kao sistemi za isporuku leka, za insulin i heparin (U.S. Pat. No.. 4,239,754). U novije vreme, mikrosfere veštsčkih-artificijelnih polimera mešanih amino kiselina (proteinoida) su korišćeni za isporuku farmaceutika (U.S. Pat. No. 4,925,673).Dalje, nosači jedinnjenja su opisani u U.S. Pat. No. 5,879,681 i U.S. Pat. No. 5,5,871,753 i korišćeni za isporuku biološki aktivnih agenasa oralnim putem poznatih ustanju tehnike.

Mukozne formulacije i primena

[0158]Formulacija za oralno primenjivanje bioaktivnog agensa en ka psu li ranog u jednom ili više biokompatibilnih polimera ili ekscipijenasa kopolimera, poželjno, biorazgradivog polimera ili kopolimera, dajući mikrokapsule koje zbog odgovarajuće veličine dobijenih mikrokapsula rezultira u agensu koji dostiže i biva izdvojen od agregata limfnih folikula, inače poznatog kao "Pever's patch" ili "GALT -"Pejerova ploča" ili "GALT" životinje bez gubitka efikasnosti s obzirom da je agens prošao kroz gastrointestinatni trakt. Slični agregati limfnih folikula mogu biti nađeni naći u bronhialnim kanalima (BALT) i debelom crevu. Iznad opisana tkiva se generalno odnose na mukozno povezano limforetikularnim tkivima (MALT). Za apsorpciju preko mukoznih površina, kompozicije i metode primenjivanja najmanje jednog skafold proteina uključuju emulziju koja sadrži raznolike submikronske čestice, mukoadhezivne makromolekule, bioaktivne peptide, i vodenu kontinuiranu fazu, koja pospešuje mukoadheziju -apsorpciju preko mukoznih površina ostvarujući adheziju čestica emulzije (U.S. Pat. No. 5,514,670). Mukozne površine pogodne za aplikaciju emulzija ovog otkrića mogu uključiti kornealni, konjunktivalni, bukalni, sublingvalni, nazalni, vaginalni, plućni, želudačani, intestinalni, i rektalni put primene. Formulacije za vaginalnu ili rektatnu primenu, npr., supozitoriji, mogu sadržavati ekscipijense, na primer, polialkilenglikole, vazelin, kakao puter, i slično. Formulacije za intranazalnu primenu mogu biti čvrste i sadržavati ekscipijense, na primer, laktozu ili mogu biti vodeni ili uljani rastvori nazalnih kapi. Za bukalnu primenu ekscipijensi uključuju šećere, kalcijum stearat, magnezijum stearat, preželatinizirani škrob, i slično (U.S. Pat. No. 5,849,695).

Transdermalne formulacije i primena

[0159]Za transdermalnu primenu, najmanje jedan skafold protein je inkapsuliran u uređaju za prenos kao što su lipozom ili polimerne nanočestice, mikročestice, mikrokapsule, ili mikrosfere (pod zajedničkim nazivom mikročestice ako nije drugačije navedeno). Niz pogodnih uređaja su poznati, uključujući mikročestice koje potiču od sintetskih polimera kao što su polihidroksi kiseline, kao što su polimleČna kiselina, poliglikolna kiselina i kopolimeri od njih, poliortoestri, polianhidridi, i polifosfazeni, i prirodini polimeri kao što je kolagen, poliamino kiseline, albumin i drugi proteini, alginat i drugi polisaharidi, i kombinacije od njih (U.S. Pat. No. 5,814,599).

Produžena primena i formulacije

[0160]Može biti poželjno isporučiti jedinjenja ovog otkrića subjektu tokom produženih vremenskih perioda, na primer, tokom perioda od jedne nedelje do jedne godine jednom primenom. Razno sporo otpuštanje-oslobadanje, depo ili implant oblici doziranja mogu biti korišćeni. Na primer, oblik doziranja može sadržavati farmaceutski prihvatljivu ne-toksičnu so jedinjenja koja imaju nizak stepen rastvorljivosti u telesnim tečnostima, na primer, (a) kisela adiciona so sa polibaznom kiselinom kao što je fosforna kiselina, sumporna kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, taninska kiselina, palmitinska kiselina, algininska kiselina, poliglutaminska kiselina, naftalen mono- ili di-sulfonske kiseline, poligalakturonska kiselina, i slično; (b) so sa polivalentnim metalnim katjonom kao što su cink, kalcijum, bizmut, barijum, magnezijum, aluminijum, bakar, kobalt, nikl, kadmijum i slično, ili sa organskim katjonom formiranim iz npr, N,N dibenzil-etilendiamina ili etilendiamina; ili (c) kombinacija (a) i (b), npr., cink tanatna so. Pored toga, jedinjenja ovog otkrića, ili poželjno, relativno nerastvorljiva so kao što su oneupravo opisane, mogu biti u obliku gela, na primjer, aluminijum monostearatni gel sa npr., susamovim uljem, pogodnim za injekciju.Naročito poželjne soli su cinkove soli, cink tanatna so, pamoatna so i slično. Druga vrsta depo formulacije za odloženo oslobađanjeza injekcije treba da sadrži jedinjenje iti so dispergovanu u inkapsuliranom sporo razgrađujućem, netoksičnom, ne-antigenom polimeru, kao što je polimer polimliečne kiseline/ poliglikolne kiseline, npr., kao što je opisano u U.S. Pat. No. 3,773,919. Jedinjenja ili poželjno, relativno nerastvorljive soli, kao što su one opisane iznad, mogu takođe biti formulisane u holesterolskom matriksu silastičnih kuglica, naročito za upotrebu kod životinja. Dodatno odloženo oslobađanje, depo ili implant formulacija, npr., gasoviti ili tečnii lipozomi su poznati u literaturi (U.S. Pat. No. 5,770,222 and "Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems", J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y., 1978).

[0161]Nakon detaljnog opisa pronalaska, isti će biti lakše razumeti pozivanjem na sledeće primere, koji su prikazani kao neka vrsta ilustracije, ali nisu namenjeni kao ograničavajući.

Primeri

Primer 1 - Tencon Dizajn

[0162] Treći FN3 domen ljudskog Tenascina (SEQ ID NO: 3) može biti korišćeni kao alternativa skafolda koji se može konstruisati tako da se veže na određene ciljne molekule preko površina izloženih petlji strukturno analognim za regione antitela koji određuju komplementarnost (CDR). Temperatura topljenja ove domene je 54<*>C u PBS u njegovom prirodnom obliku. Da bi se proizveo skafold molekul sa sličnom strukturom i poboljšanim fizičkim svojstvimaa, kao što je poboljšana toplotna stabilnost, konsenzus sekvenca je dizajnirana na osnovu usklađivanja 15 FN3 domena iz ljudskog Tenascina (SEQ ID NOS: 1-15).

[0163]Analiza višestrukog poravnanja sekvence u Tabeli 1 pokazuje da ove 15 domene imaju indentičnost sekvence međusobno u rasponu od 13 do 80%, sa prosećnim identitetom sekvence među parovima od 29%. Konsenzus sekvenca (SEQ ID NO: 16) je dizajnirana inkorporisanjem najviše konzervisane (učestale) amino kiseline na svakoj poziciji iz poravnanja prikazanog u Tabeli 1. U parovima poravnanja, konsenzus sekvenca iz ovog otkrića (SEQ ID NO: 16 ), označena kao Tencon, je identičana sa FN3 domenama iz Tenascina na 34 - 59% pozicijama sa prosečnom identitetom sekvence od 43%.

Ekspresija i prečišćavanje

[0164]Aminokiselinska sekvenca Tencona (SEQ ID NO:16) je ponovo translatovana -prevedena, rezultirajući u DNA sekvencu prikazanog u SEQ ID NO: 17. Ova sekvenca je sastavljen od preklapajućih PCR, subkloniranih u modifikovani pET15 vektor, transformisan u BL21Star (DE3 ) E. koli (Invitrogen), i zasađen na LB agar pločama koje sadrže 75 pg/mL karbenicilina. Jedna kolonija je bila pokupljena i rasla preko noći na 37 °C u 50 ml TB medijuma koji sadrži 2% glukoze i 100 pg/mL karbenicilina. Ova kultura je korišćena za seme 500 ml autoindukcionog medija (Overnight Express Instant TB media, Novagen) u 2.5 L ultra prinosa po boci (Thomson Instrument Companv). Rast i ekspresija su urađene korišćenjem dvojnog programa (3 sata na 37<*>C, 300 rpm, a nakon toga 16 sati na 30°C, 250 rpm) u ATR Multitron šejker inkubatoru.

[0165]Kultura je skupljena i centrifugirana na 7000 obrtaja u minuti tokom 15 minuta u rotoru JL8.1 do kuglica ćelija. Ćelije su resuspendovane u 30 mL puferu koji sadrži 20 mM natrijum fosfata, pH 7.5, 500 mM NaCt, 10% glicerola, 20 mM imidazola, 0.37 mg/mL lizozima, 1X Kompletne inhibitor proteaze (bez EDTA; Roche), i benzonazu (Sigma - Aldrich, 0.25 pl/mL finalne) i lizirane sa Misonix XL2020 sonikatom tokom 5 minuta na ledu u puls modulaciji (5 sekundi, 30 sekundi isključiti). Nerastvorljiv materijal je uklonjen centrifugiranjem na 17.000 obrtaja u minuti kroz 30 minuta u JA-17 rotoru.

[0166]Tencon protein je prečišćen iz rastvortjivog lizata u 2- koraku hromatografskog procesa. Prvo, protein je uhvaćen pomoću afinitetne hromatografije imobiliziranog metala, dodavanjem 2 mL Ni-NTAagaroze (Ojagen) zrnaca na lizat i stavljen na njihajuću platformu tokom 1 sata na 4°C. Smola je zatim pakovana u Poly-Prep kolonu (Bio-Rad) i isprana sa 20 mM natrijum fosfata, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerola i 20 mM imidazola da bi se uklonilo nevezani materijal. Proteini su eluirani iz smole uz 20 mM natrijum fosfata, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% glicerola i 500 mM imidazola. Frakcije su analizirane pomoću SDS-PAGE, i putem Coomassie stain - Kumasi mrlja i Western btot -Vestern blot korišćenjem HRP-konjugovanog anti-His antitela (lmmunology Consultants Laboratorv). Željene frakcije su skupljene i dijalizirane u PBS, pH 7.4. Kao drugi korak prečišćavanja protein je napunjen na tzv. "Superdex-75 HiLoad 16/60 kolone(GE Healthcare)" uravnotežen sa PBS. Frakcije su analizirane pomoću SDS-PAGE, te se frakcije koje sadrže Tencon su skupljene i koncentrovane korišćenjem Centriprep UltraCel YM-3 koncentratora (Amicon).

[0167]Koncentracija proteina je određena pomoću BioTek čitača ploča za merenje apsorbancije uzorka na 280 nm. Konačni pripravak je analiziran pomoću Kumasi mrlja (Slika 1), Vestern blot sa anti-His antitelom i HPLC-SEC upotrebom G3000SW-XL kolone (tzv. "TOSOH Biosciences"), ekvilibrirane-uravnotežene u PBS. S0S-PAGE analiza pokazuje da Tencon migrira između 6 i 14 kDa, u skladu sa očekivanom masom od 10,7 kDa za monomerni protein. Dobijen je prinos od > 50 mg čistog Tencon proteina po litri kulture.

Biofizička Karakterizacija

[0168]Struktura i stabilnost Tencona je karakterisana spektroskopijom cirkularnog dihroizma i diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom respektivno. CD merenja su izvedena na Aviv spektrometru na 20° C u PBS-u i u koncentraciji od 0.2 mg/mL. Spektar na Slici 2 prikazuje minimum na 218 nm, što upućuje na strukturu B-ptoče kao što se očekuje za protein koji pripada familiji FN3 kao što je dizajnirao. DSC podaci se dobijeni zagrevanjem 0.5 mg/mL rastvora 3. FN3 domene iz Tenascina ili Tencona u PBS od 35"C do 95<*>C, pri brzini od 1<*>C / minuti u N-DSCII kalorimetru (Primenjena Termodinamika). Samo krivulja pufera je oduzeta dabi se proizveli profili prikazani na Slici 3. Iz ovih podataka, temperature topljenja od 54"C i 78 °C su izračunate za 3. FN3 domenu i Tencon, redom, korišćenjem CpCalc (Primenjena termodinamika) softvera. Savijanje i odvijanje obe domene je reverzibilno na ovim temperaturama.

Analiza Imunogenosti

[0169]Korišćen je komjuterski program koji su modeli za imunogenost kod ljudi od amino kiselinskih sekvenci korišćeni da uporede predviđene imunogenosti aminokiselinskih sekvenci predstavljajući 3. FN3 domen ljudskog Tenascina, Tencona i više terapijskih antitela (prikazano u Tabeli 2). Himerni mAbs i ljudski mAb (adalimumab) analizirani sa programom su praćeni primenom praga tolerancije (uklanja 9-mernih peptida sa 100% identiteta na ljudskoj embrionskoj kodiranoj sekvenci). Prag tolerancije nije primenjen na Tenascin ili Tencon. Prag tolerancije podrazumeva široku toleranciju T ćelije na embrionskim kodiranim mAb sekvencama i fokusira analizu na novu sekvencu pre svega u CDRs i "flanking domains" tj. bočnim-podupirućim domenama.

[0170]Ove analize predviđaju niski imunogeni rizik, i za Tenascina i Tencon na osnovu verovatnoće da će 9-merni peptid, dobijen iz analizirane sekvence vezati jedan ili više HLA molekula. Rezultat je ponderisan s obzirom na prevalenciju svakog HLA alela. Rezultati za modele za modele su sumirani za svaku sekvencu da obezbede jedan broj koji opisuje ukupnu PIR od svake sekvence (suma rezultata). Rezultati iz ove analize susumirani u Tabeli 2. Tenascin je pokazao da ima najniži ukupni rezultat-ocenu (11.9). Tencon, kao Tenascina, je postignut pre svega bez veziva i niski predviđeni imunogeni rizik agretopes (Rezultat = 13.2). Tenascin i Tencon postignute sekvence su povoljne u odnosu na terapijska antitela.

Prikaz Tencona na M13faguputem plX fuzije

[0171]Gen koji kodira Tencon amino kiselinsku sekvencu je subkloniran u fagemid ekspresioni vektor pPep9 pomoću PCR i ograničeno digestivno kloniranje, rezultirajući u vektor pTencon- plX. Ovaj sistem izražava N-terminalni Myc-označen Tencon kao C-terminalnu fuziju na N-terminusu M13 plX proteina (Slika 4). Lac promotor omogućava niže nivoe ekspresije bez IPTG i povećanu ekspresiju posle dodatka IPTG. Signal OmpA sekvence je priključen na N-terminusu Tencona da promoviše efikasnu translokaciju u periplazmi. Kratki TSGGGGS veznik (SEQ ID NO: 141) je izgrađen-konstruisan između Tencona i plX da bi se sprečila sterička interakcija između ovih proteina.

[0172]Za potvrdu prikaza na površini M13 faga čestice, pTencon-plX je transformisan u XL1-Blue E. koli i jedna kolonija je korišćena za inokulaciju 5 mL LB kulture dopunjene sa ampicilinom. Ova kultura je gajena na 37"C, do postizanja sredine- log faze na kojoj tački 6'° pfu od VCSM13 je dodat pomagač faga i kultura je inkubirana na 37<*>C tokom 10 minuta bez mućkanja, zatim 50 minuta uz mešanje. Pomagač faga je spasio kulturu koja je zatim razbtažena u 50 Ml od 2YT mediju obogaćenom sa ampicilinom i kanamicinom, i uzgajana na 37 *C uz mućkanje do O.D.™ dostigla 0.7, na kojoj tački IPTG je dodat do konačne koncentracije od 1 mM, i temperaturi smanjenoj na 30" C. Nakon 16 sati, kultura je centrifugirana na 4000 x g tokom 20 minuta i supernatant je sakupljen i pohranjen na 4'C, za analizu.

[0173] Vezivanje čestica faga na anti-Myc antitelo (Invitrogen) je korišćeno za potvrdu prikaza Myc-Tencon konstrukcije M13 površine faga. Tzv. "Maxisorp" pločica je obložena preko noći pri koncentraciji od 2.5 ug/mLsa a-Myc ili anti-av antitelom (negativna kontrola) i blokirana sa SuperBlock T20 (Pierce). Dvostruka serijska razblaženja supernatanta fagemid kulture opisana iznad su u PBS-u i dodata u jažice obložene ploče. Posle 1 sata, pločica je isprana sa TBST i a-M13 HRP antitelo je dodato u svaku jažicu i isprano sa TBST nakon inkubacije od 1 sata. Roche BD ELISA POD supstrat je dodat i luminiscencija je otkrivena na čitaču ploča (Tečan). Slika 5 pokazuje da se Myc-Tencon čestice faga vežu na a-myc, ali ne anti-av antitelo obloženih jažica ili neobložene kontrole jažice ploče na način zavisan od koncentracije, potvrđujući specifičan prikaz Myc-Tencon na M13 fag čestici.

[0174]Dodatni fagemid vektor može biti konstruisan da prikaže Tencon i članove biblioteke (videti Primer 2) na M13 kao fuzije protein pili. Za ovaj sustem, gen za plX je zamenjen sa genom koji kodira skraćenu verziju pili (Bass et al. 1990). Dodatne promene u odnosu na sistem prikazan na Slici 4 uključuje zamenu OmpA signalne sekvence sa signalnom sekvencom za DsbA, što je sekrecija koristeći ove sekvence pokazala da je korisna za prikaz stabilnih alternativnih skafold molekula (Steineret al. 2006).

Primer 2 - Stvaranje biblioteka Tencona

[0175]Tencon varijanta biblioteka mogu biti proizvedena raznim metodama, zavisno od željene složenosti i relativnog pesta mutacije u molekulu. Metode sinteze DNA su pželjne da stvore mutacije razasutih širom Tencon gena. Kloniranje restrikcionog enzima može takođe biti korišćeno da se rekombinuju fragmenti DNA koji sadrže mutacije u različitim regijama gena. Zasićenje mutageneze u maloj- đefinisanoj regiji kao što je jedna Tencon petlja, može biti uvedeno korišćenjem degenerisanog oligo-nukleotida i oligonukleotida usmerene mutageneze (Kunkel et al. 1987).

[0176]Konstruisana je -Izgrađena jeTencon biblioteka, biblioteka FG7, dizajnirana da zameni FG petlju sa 7 slučajnih aminokiselina korišćenjem oligonukleotidna usmerene mutageneze. Oligonukleotid (TconFG7-za-5'pho) je sintetizovan da ima 21 bazni par (bp) degenerisane sekvence NNS na pozicijama koje kodiraju FG petlju i dva bočna dela 20-27 bp nukleotidnih sekvenci komplementarnosti na Tencon kodirajućoj sekvenci. U ovom dizajnu, svih dvadeset aminokiselina mogu biti prikazane u FG petlji. Izračunata različitost na nivou nukleotida je 1.3x10'.

TconFG7-For5'pho: (SEQ ID NO: 18).

[0177]Obrazac za usmerenu mutagenezu oligonukteotiđa, pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-plll, je konstruisan zamenom Tencon F:G petlje kodirajući sekvencu sa matičnom petljom sekvence koja sadrži AscI mesto restrikcije. Ovaj sistem omogućuje uklanjanje pozadine obrasca DNA posle mutageneze razgradnjom dobijene DNA sa AscI pre transformacije. Za pročišćavanje-Da se prečisti obrazac jednolančane DNA za mutagenezu, jedna kolonija E. koli CJ236 koja nosi pDsbA-Tencon-ASC-loop-Myc-plll, je preuzeta u 5 ml od 2YT medijuma za rast sa karbenicilinom (50 pg/ml konačne koncentracije) i Horamfenikolom (10ug/ml). Posle 6 sati, VCSM13 pomagač faga je dodat do konačne koncentracije od 10'° pfu/mL i inkubiran bez mućkanja tokom 10 minuta pre nego što je prebačen u 150 mL od 2YT sa karbenicilinom (10pg/mL) i uridinom (0,25 pg/ml) i inkubiran na 37°C, sa mešanjem na 200 obtraja u minuti preko noći. Ćelije su peletirane centrifugiranjem i sakupljen je supernatant i fag peletiran sa PEG NaCl. Jednolančana DNA je prečišćena iz ovog peleta korišćenjem OJAprep Spin Ml 3 seta (Ojagen) prema instrukcijama proizvođača.

[0178]Da bi se prekalio -očvrsnuo degenerisani oligonukleotid na obrascu, 5 pg DNA obrasca je kombinovano sa oligo TconFG7-For-5-pho u molarnom odnosu od 10: 1 u Tris-HCl (50 mM, pH 7.5) i MgCU (10 mM ), i inkubirano na 90°C tokom 2 minuta, 60'C tokom 3 minute i 20 °C tokom 5 minuta. Posle reakcije prekaljen ja , ATP (10 mM), dNTPs (25 mM svaki), DTT (100 mM), T4 ligaze (7 jedinica), i T7 DNA polimeraze (10 jedinica) je dodato u reakcijsku smešu i inkubirano na 14°C tokom 6 sati nakon čega sledi 20"C tokom 12 sati. Dobijena DNA je prečišćena korišćenjem PCR seta za prečišćavanje (Ojagen), i oporavljena u 100 mL vode. DNA biblioteka je razložena sa 10 jedinica AscI tokom 4 sata, i zatim još jednom prečišćena sa Ojagen PCR setoma za prečišćavanje. Konačna biblioteke DNA je oparavtjena u 50 mL vode. Dobijena dvostruka DNA produkta je zatim transformisana u E. koli MC1061F 'elektroporacijom.

[0179]Transformanti su sakupljeni u 20 mL SOC medijuma i ostavljeni da se oporave tokom 1 sata na 37 "C. Na kraju oporavka, alikvot transformacije je bio serijski razblažen, i zasejan na Karbenicilin (100 ug/mL)ploče sadržavajući 1% glukoze za procenu ukupnog broja transformanta. Preostala SOC kultura je zatim korišćena za inokulaciju 1L od 2xYT medijuma sa Karbinicilinom i 1% glukoze i rasla dok je OD™ dostigla 0.6. 100 mL ove kulture je inokulisano sa M13 pomagačem faga 10,<0>/mL i inkubirano na 37<*>C pre centrifugiranja. Dobijem ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 500 mL svežeg 2xYT medijuma koji sadrži 100 (100pg/mL) Karbenicilina i Kanamicina (35ug/mL) i gajen na 30T preko noći pre centrifugiranja. Cestice faga su precipitirane dodavanjem PEG/NaCl i pohranjene na -80"C.

[0180]Druga biblioteka, BC6/FG7, je dizajnirana da uvede različitost unutar B:C i F:G petlji Tencona istovremeno. Da bise to postiglo, dva nukleotida, Tc-BC6-For-5'phos i POP149 su sintetizovani. Prednji oligo je bio fosforilovan i sadržavao je 18 baza od NNS kodona na svakoj poziciji koja kodira B:C petlju, dok je obrnuti -reverzni oligo bio biotinilovan na 5 'kraju i sadržavo je 21 baza od NNS kodona na svakoj poziciji koja kodira F:G petlju. Obaoligonukleotida su flankirana-okružena putem dve 18 bp identične nukleotidne sekvence za regiju prethodeći i prateći regiju da bude mutagenizovana.

[0181]Da se konstruiše biblioteka, šesnaest 100 pL PCR reakcije su pizvedene korišćenjem oligonukleotida Tc-CB6-For5'phos i POP2149 da se pojača Tencon DNA obrazac, uvođenjem NNS kodona u B:C i F:G petlji istovremeno u procesu. DvolanČani PCR produkt je pomešan sa magnetskim streptavidin kuglicama (Dynal) u B&W puferu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, 0,1% Tween-20) i inkubiran tokom 20 minuta, izvađen-srušen sa magnetom i ispran sa B&W puferom dvaput. Prednji lanac je ispran sa kuglicama sa 300 pLod 150 mM NaOH. Ovaj "megaprimer" smeše dugih prajmera sa više od 8x10" teorijske različitosti, je korišćen da bi se prekalio na jedan lanac obrasca biblioteke. Konstrukcija biblioteke je izvedena kao što je opisano iznad za FG7 biblioteku.

Primer 3 - Izbor IgG veziva

[0182]U ciju obavljanja selekcija Tencon članova biblioteke koj se vežu na IgG, rekombinantni IgG (ljudski lgG1 podtip) je bio biotinilovan korišćenjem sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce) pre dijaliziranja u PBS-u. Za selekcije, 200 uL Fag prikazujućih biblioteka FG7 ili BC6/FG7 su bili blokirani sa 200 pL chemiblocker pre dodavanja biotinilovanih IgG pri koncentracijama od 500 nM (krug -ciklus 1), ili 100 nM (krugova 2 i 3). Vezani fagi su regenerisani-oparavljeni putem Neutravidin magnetskih kuglica (Seradn) u kolu 1 ili streptavidin magnetskih kuglica (Promega) u rundi-ciklusima 2 i 3. Nevezani fagi su isprani sa kuglicama korišćenjem 5-10 ispiranja sa 1 mLTris puferiranog fiziološkog rastvora sa (TBST) između, a zatim 2 1 mL ispiranja sa Tris puferisanim fiziološkim rastvorom (TBS). Vezani fagi su eluirani iz kuglica dodatkom sredine-log faze, E. koli MC1061F '. Inficirane ćelije su stavljene na LB agar ploče uz dodatak karbenicilina i glukoze. Sedećeg dana, ćelije su sastrugane sa ploča i uzgajane do sredine log faze pre spašavanja sa VCSM13 pomagača faga i gajene preko noći. Čestice faga su izolovane precipitacijom PEG/NaCl i korišćene za sledeći krug selekcije.

[0183]Posle 3 kruga pretraživanja prema IgG, izlazni je subkloniran u pET27 modifikovanogm vektoru da uključi klonirajuće mesto nezavisne ligaze putem umnožavanja Tencon gena putem PCR. PCR produkt je prekaljen na vektor i transformisan u BL21-GOLD (DE3) ćelija (Stratagene). Pojedinačne kolonije su sakupljene u 1 mL kulture u 96 dubokih jažica ploča (Corning) i gajene do zasićenja preko noći na 37°C. Sledećeg dana, 50 uL kulture preko noći je korišćeno za inokulaciju sveže 1 pL kulture. Kulture su gajene na 37° C tokom 2 sata pre dodavanja IPTG do 1 mM i smanjenjem temperature do 30°C. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem 16 sati posle indukcije i lizirane sa 100 mL BugBustera (Novagen). Dobijem<*>lizati su izbistreni centrigom i korišćeni za test za vezivanje IgG putem ELIZA testa.

[0184]Maksisorp ploče (Nunc) su prevučene sa 01 pg anti-HIS antitelom (Ojagen) preko noći, isprane sa TBST i blokirane sa Starting Block T20 (Thermo Scientific). Izbistreni lizati razblaženi 1: 4 u Starting Block -Startnom Bloku su dodati na ploče, te ostavljeni da se vežu tokom 1 sata pre ispiranja sa TBST. Biotinilovani IgG ili biotinilovan HSA je dodat pri koncentraciji od 1 mg/mL i ispran sa TBST posle 1 sata inkubacije. Detekcija vezanog IgG ili HSA je postignuta dodavanjem streptavidin-HRP (Jackson Immunoresearch) i detektiranje sa POD hemiluminescentnim supstratom. Rezultati ELIZA testa su prikazani na Slici 7. Konstrukcije koje vežu biotinilovrani IgG više od 10 puta preko biotinilovanog HSA kao što je procenjeno putem ELIZA signala koji su seauened-sekvencirani. Posle završetka nekoliko eksperimenata selekcije, đobijeno je 60 jedinstvenih vezujućih sekvenci iz biblioteke FG7 i 10 jedinstvenih sekvenci iz biblioteke BC6FG7; Tabela 4 prikazuje reprezentativne sekvence IgG veziva u kojima su B:C i/ili F: G petlje prikazane u meri u kojoj se razlikuju od onih u SEOJD NO:16. Takođe su prikazane uTabeli 4 brojne mutacije u drugim regijama skafolda.

[0185]Tencon protein konstruisan-dizajniran, izražen, prečišćen ovde ima termičku stabilnost poboljšanu po 26°C u odnosu na onu 3. FN3 domene iz humanog Tenascina, koji je bio korišćen kao alternativni skafold molekul. Na osnovu ovog povećanja stabilnosti, ovaj skafold molekul će verovatno biti podložniji supstituciji amino kiseline i lakši za proizvodnju. Mutacije koje smanjuju stabilnost proteina će verovatno biti bolje tolerisane u kontekstu stabilnijeg skafolda, a time i skafold sa poboljšanom stabilnošću verovatno dajući funkcionalnija, dobro savijena veziva iz biblioteke skafold varijanti. Kao što ovaj novi protein nije protein kodiran od strane ljudskog genoma, može takođe obezbediti manje rizika prema stvaranju imunog odgovora od rizika od, na primjer, nativnog ljudskog Tenascin kada se koristi kao terapeutik (u suštini, manje rizika nego sa terapeutikom baziranom na divljem tipu domene).

[0186]Za svrhe ovog pronalaska , 70-100% amino kiselinskog ili nukleotidnog identiteta sekvence (tj., 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 ili bilo koji raspon ili vrijednost u njoj) je određena korišćenjem pogodnog kompjutorskog algoritma, kao što je poznato u stanju tehnike.

Claims (14)

1.Izolovana skala proteina koja obuhvata sekvencu amino kiseline koja ima najmanje 75% identičnosti sa SEQ ID BR: 16, koja ima 7 lanaca i 6 petlji između lanaca, i koja obuhvata sekvencu amino kiseline od SEQ ID BR: 16, ali u kojoj je jedna ili više petlji izmenjeno da bi se vezale za metu, dok lanci održavaju svoje sekvence kao delove skeleta, pri čemu su petlje na ostacima 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60- 64 i 75 do 81 od SEQ ID BR: 16, i sposobne su za vezivanje na ćelijske proteine i/ili molekule nukleinske kiseline.

2.Izolovana skala proteina prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su, regije petlje na ili oko 22-28 ostataka, 51-54 i 75-81 od SEQ ID BR: 16 promenjene za specifičnost vezivanja i afinitet.

3.Izolovana skala proteina prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu se izolovana skala proteina veže na ciljni protein sa KDjednakom ili manjom od oko IO"<7>M, kao Što je 0,1-9,9 X IO 8, IO'<9>, 10'<K>, 10 ", IO'<12>, IO'13, 10'M ili 10'<15>M, kao što je određeno površinskom plazmon rezonancom od "Kinexa" metode.

4.Metoda konstruisanja biblioteke skala proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, obuhvatajući korake obezbeđivanja polipeptida koji ima amino kiselinsku sekvencu od SEQ ID BR: 16; i uvođenje različitosti u kopijama polipeptida koji imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID BR: 16 da se formira biblioteka skale proteina, pri čemu korak uvođenja različitosti obuhvata mutiranje najmanje jedne regije petlje izabrane iz grupe koja se sastoji od ostataka na oko položajima 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 i 75-81 iz SEQ ID BR: 16.

5.Biblioteka proizvedena metodom prema patentnom zahtevu 4.

6.Metoda generisanja skale proteina vezujući se za određenu metu sa prethodno definisanim afinitetom vezivanja, obuhvatajući dovođenje u dodir biblioteke iz patentnog zahteva 5 sa specifičnom metom i izolovanjem skale proteina vezivanjem za određenu metu sa prethodno definisanim afinitetom.

7.Metod prema patentnom zahtevu 6, pri čemu korak izolovanja obuhvata izolovanje skale molekula za vezivanje na određenu metu i testiranje izolovanih molekula skele za afinitet vezivanja na određenu metu, pri čemu, opciono: (i) korak izolovanja sadrži pomicanje biblioteke sa određenom metom, identifikovanje skale molekula koji se vezuju na određenu metu i izolovanje vezujuće skale molekula; ili (ii) afinitet je manji od ili jednak do oko 10 7M.

8.Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira skalu proteina prema iz bilo kog od patentnih zahteva od 1-3.

9.Izolovani molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 8, obuhvatajući nukleotidnu sekvencu datu u SEQ ID BR: 17.

10.Izolovani vektor nukleinske kiseline koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

11.Prokariotska ili eukariotska ćelija domaćina koja sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je navedena ćelija domaćina opciono najmanje jedna izabrana od E. koli BL21Star (DE3), druga ćelija E. koli, kvasca, COS-1, COS- 7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, mijeloma ili ćelija limfoma, ili bilo kojeg derivata, besmrtne ili transformisane ćelije, od njih.

12.Kompozicija koja sadrži skalu proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač, opciono dalje sadržavajući najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid odabran od detektabilnih oznaka ili reportera, TNF antagonista, antiinfektivnog leka, leka kardiovaskularnog (CV) sistema, leka centralnog nervnog sistema (CNS), leka autonomnog nervnog sistema (ANS), leka respiratornog trakta, leka gastrointestinalnog (Gl) trakta, hormonskog leka, leka za ravnotežu tečnosti ili elektrolita, hematološkog leka, antineoplastičnog, imunomodulacionog leka, oftalmološkog, otičkog ili nazalnog leka, topičnog leka, nutricionog leka, citokina, ili antagonista citokina.

13.Medicinski uređaj, koji sadrži skalu proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, pri čemu je navedeni uređaj pogodan za dovođenje u dodir ili primenu navedene skale proteina sa najmanje jednim od sledećih načina, izabrano od, parenteralnog, supkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhojalng, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginoznog, intrakavitamog, intracelularnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastiČnog, intrahepatičnog, intramiokardialnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonalnog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterinog, intravezikalnog, intralezionalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog i transdermalnog.

14.Segment proizvodnje za ljudsku, farmaceutsku ili dijagnostičku upotrebu, koji sadrži materijal za pakovanje i posudu koja sadrži rastvor ili liofilizovani oblik skale proteina prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu je opciono navedena posuda komponenta parenteralnog, subkutanog, intramuskularnog, intravenoznog, intraartikularnog, intrabronhialnog, intraabdominalnog, intrakapsularnog, intrakartilaginoznog, intrakavitalnog, intracelularnog, intracerebelarnog, intracerebroventrikularnog, intrakoličnog, intracervikalnog, intragastiČnog, intrahepatičnog, intramiokardialnog, intraostealnog, intrapelvičnog, intraperikardijalnog, intraperitonealnog, intrapleuralnog, intraprostatičnog, intrapulmonamog, intrarektalnog, intrarenalnog, intraretinalnog, intraspinalnog, intrasinovijalnog, intratorakalnog, intrauterinog, intravezikalnog, intralezionalnog, bolusnog, vaginalnog, rektalnog, bukalnog, sublingvalnog, intranazalnog, ili transdermalnog uređaja za isporuku ili sistema.