BRPI0920263B1 - Compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado, composição e uso dos mesmos - Google Patents

Compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado, composição e uso dos mesmos Download PDF

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Susan M. Freier
Brett P. Monia
Hong Zhang
Chenguang Zhao
Jeffrey R. Crosby
Andrew M. Siwkowski
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Ionis Pharmaceuticals, Inc
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Abstract

composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado, uso do referido composto, e composição. são aqui rebelados compostos anti-sentido e métodos para diminuir o fator 11 e tratar ou prevenir complicações tromboembolitícas em um indivíduo que necessita deste. exemplos de condições de doença que podem ser melhoradas com a administração de compostos anti-sentido que alvejam o fator 11 incluem trombose, embolia e tromboembolia, tais como, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular. os compostos anti-sentido que alvejam o fator 11 também podem ser usados como um tratamento profilático para prevenir indivíduos em risco para trombose e embolia.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica a prioridade em 35 U.S.C. § 119(e) para o pedido provisório U.S. 61/105.772, depositado em 15 de outubro de 2008 e para o pedido provisório U.S. 61/174.461, depositado em 30 de abril de 2009. Cada uma das aplicações anteriores são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[002] O presente pedido foi depositado junto com uma listagem de sequência no formato eletrônico. A listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado 20091015_BIOL0107WOSEQ.txt, criado em 15 de outubro de 2009, que tem 92 Kb de tamanho. A informação no formato eletrônico da listagem de sequência é aqui incorporada pela referência na sua íntegra.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] As modalidades da presente invenção fornecem métodos, compostos, e composições para reduzir a expressão de fator 11 RNAm e proteína em um animal. Tais métodos, compostos, e composições são usados para tratar, prevenir ou melhorar complicações tromboembolíticas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] O sistema circulatório exige mecanismos que previnem perda sanguínea, bem como aqueles que neutralizam as obstruções intravasculares inapropriadas. Em geral, a coagulação compreende uma cascata de reações que culminam na conversão de fibrinogênio solúvel em um gel de fibrina insolúvel. As etapas da cascata envolvem a conversão de um zimogênio inativo em uma enzima ativada. A enzima ativa então catalisa a próxima etapa na cascata. Cascata de coagulação
[005] A cascata de coagulação pode ser iniciada por meio de duas ramificações, a via do fator tecidual (também “via extrínseca”), que é a via principal, e a via de ativação de contato (também “via intrínseca”).
[006] A via do fator tecidual é iniciada pelo fator tecidual do receptor de superfície celular (TF, também referido como fator III), que é expresso constitutivamente por células extravasculares (pericitos, cardiomiocitos, células de músculo liso e queratinócitos) e expresso por monócitos vasculares e células endoteliais mediante indução por citocinas inflamatórias ou endotoxina. (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097). O TF é o receptor celular de alta afinidade para o fator de coagulação VIIa, uma serina protease. Na ausência de TF, VIIa apresenta atividade catalítica muito baixa, e a ligação à TF é necessária para tornar VIIa funcional por meio de um mecanismo alostérico. (Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097). O complexo TF-VIIa ativa o fator X em Xa. Xa, por sua vez, associa-se com seu co-fator do fator Va em um complexo de protrombinase que por sua vez ativa protrombina, (também conhecida como fator II ou fator 2) em trombina (também conhecida como fator IIa, ou fator 2a). A trombina ativa plaquetas, converte fibrinogênio em fibrina e promove reticulação de fibrina ativando fator XIII, formando assim um plugue estável em sítios onde TF é exposto em células extravasculares. Além do mais, a trombina reforça a resposta da cascata de coagulação ativando fatores V e VIII.
[007] A via de ativação de contato é desencadeada por ativação do fator XII em XIIa. O fator XIIa converte XI em XIa, e XIa converte IX em IXa. IXa associa-se com seu co-fator VIIIa para converter X em Xa. As duas vias convergem neste ponto, já que o fator Xa associa-se ao fator Va para ativar a protrombina (fator II) em trombina (fator IIa). Inibição de coagulação.
[008] Pelo menos três mecanismos mantêm a cascata de coagulação sob controle, a saber, a ação de proteína C ativada, antitrombina e inibidor da via do fator tecidual. A proteína C ativada é uma serina protease que degrada co-fatores Va e VIIIa. A proteína C é ativada por trombina com trombomodulina, e exige co-enzima de proteína S para funcionar. A antitrombina é um inibidor de serina protease (serpina) que inibe serina proteases: trombina, Xa, XIIa, XIa e IXa. O inibidor da via do fator tecidual inibe a ação de Xa e do complexo TF-VIIa. (Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997; 7:234 -239.) Doença
[009] A trombose é o desenvolvimento patológico de coágulos sanguíneos, e uma embolia ocorre quando um coágulo sanguíneo migra para uma outra parte do corpo e interfere com função do órgão. A tromboembolia pode causar condições tais como trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular. De maneira significativa, a tromboembolia é uma das principais causas de morbidade que afeta cerca de 2 milhões de norte americanos a cada ano. (Adcock et al. American Journal de Clinical Pathology. 1997;108:434-49). Embora as principais causas de trombose sejam em virtude de problemas extrínsecos adquiridos, por exemplo, cirurgia, câncer, imobilidade, alguns casos são em virtude de uma pré- disposição genética, por exemplo, síndrome antifosfolipídica e a condição dominante autossômica, Fator V Leiden. (Bertina RM et al. Nature 1994; 369:64-67.) Tratamento
[0010] Os anticoagulantes mais comumente usados, varfarina, heparina e heparina de baixo peso molecular (LMWH), possuem todos desvantagens significativas.
[0011] A varfarina é usada tipicamente para tratar pacientes que sofrem de fibrilação atrial. O medicamento interage com fatores de coagulação dependentes de vitamina K que incluem fatores II, VII, IX e X. As proteínas anticoagulantes C e S são também inibidas por varfarina. A terapia medicamentosa que usa varfarina é mais complicada pelo fato de que a varfarina interage com outras medicações, incluindo medicamentos usados para tratar fibrilação atrial, tal como amiodarona. Em decorrência de a terapia com varfarina ser difícil de prever, os pacientes devem ser cuidadosamente monitorados a fim de detectar quaisquer sinais de hemorragia irregular.
[0012] A heparina funciona ativando a antitrombina que inibe tanto a trombina quanto o fator X. (Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182). O tratamento com heparina pode causar uma reação imunológica que faz com que as plaquetas se agreguem nos vasos sanguíneos, o que pode levar à trombose. Este efeito colateral é conhecido como trombocitopenia induzida por heparina (HIT) e exige monitoramento do paciente. O tratamento prolongado com heparina também pode levar à osteoporose. LMWH também pode inibir o fator 2, mas em um grau menor que a heparina não fracionada (UFH). A LMWH resultou no desenvolvimento de HIT.
[0013] Assim, os agentes anticoagulantes atuais perdem a previsibilidade e especificidade e, portanto, exigem monitoramento cuidadoso do paciente para prevenir efeitos colaterais adversos, tais como complicações de hemorragia. Não existe atualmente nenhum anticoagulante que alveja apenas a via intrínseca ou extrínseca.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] São fornecidos aqui métodos, compostos e composições para modular a expressão de RNAm e proteína do fator 11. Em certas modalidades, os inibidores específicos do fator 11 modulam a expressão de RNAm e proteína do fator 11. Em certas modalidades, os inibidores específicos do fator 11 são ácidos nucleicos, proteínas ou moléculas pequenas.
[0015] Em certas modalidades, a modulação pode ocorrer em uma célula ou tecido. Em certas modalidades, a célula ou tecido está em um animal. Em certas modalidades, o animal é um humano. Em certas modalidades, os níveis de RNAm do fator 11 são reduzidos. Em certas modalidades, os níveis de proteína do fator 11 são reduzidos. Tal redução pode ocorrer de uma maneira dependente do tempo ou de uma maneira dependente da dose.
[0016] São também fornecidos métodos, compostos e composições usados para prevenir, tratar e melhorar doenças, distúrbios e condições. Em certas modalidades, tais doenças, distúrbios e condições são complicações tromboembolíticas. Tais complicações tromboembolíticas incluem as categorias de trombose, embolia e tromboembolia. Em certas modalidades, tais complicações tromboembolíticas incluem trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular.
[0017] Tais doenças, distúrbios e condições podem apresentar um ou mais fatores de risco, causas, ou consequências em comum. Certos fatores de risco e causas para o desenvolvimento de uma complicação tromboembolítica incluem imobilidade, cirurgia (particularmente cirurgia ortopédica), malignidade, gravidez, idade avançada, uso de contraceptivos orais, fibrilação atrial, complicação tromboembolítica prévia, doença inflamatória crônica e distúrbios de coagulação protrombótica inerente ou adquirida. Certas consequências associadas ao desenvolvimento de uma complicação tromboembolítica incluem diminuição do fluxo sanguíneo por meio de um vaso afetado, morte de tecido e morte.
[0018] Em certas modalidades, os métodos de tratamento incluem administrar um inibidor específico do fator 11 a um indivíduo que necessita deste.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0019] Entende-se que tanto a descrição geral precedente quanto a descrição detalhada a seguir são apenas exemplares e explicativas e não são restritivas da invenção, da maneira reivindicada. Aqui, o uso do singular inclui o plural, a menos que de outra forma especificamente declarada. Da maneira aqui usada, o uso de “ou” significa “e/ou”, a menos que de outra forma declarada. Além do mais, o uso da palavra “incluindo”, bem como outras formas, tais como “inclui” e “incluído”, não é limitante. Igualmente, palavras tais como “elemento” ou “componente” incluem tanto elementos quanto componentes que compreendem uma unidade e elementos e componentes que compreendem mais de uma subunidade, a menos que de outra forma especificamente declarada.
[0020] Os títulos de seção aqui usados são apenas para propósitos organizacionais e não pretende-se que sejam limitantes do assunto em questão descrito. Todos os documentos, ou porções de documentos, citados neste pedido, incluindo, mas sem limitação, patentes, pedidos de patente, artigos, livros e tratados, são aqui expressamente incorporados pela referência das porções do documento aqui discutido, bem como na sua íntegra.
Definições
[0021] A menos que as definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada junto com, e os procedimentos e técnicas, química analítica, química orgânica sintética e química médica e farmacêutica aqui descritas são aquelas conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrões podem ser usadas para a síntese química e análise química. Onde permitido, todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações, números de acesso ao GENBANK e informação de sequência associada obtida por meio das bases de dados, tal como National Center for Biotechnology Information (NCBI), e outros dados referidos em toda a revelação são aqui incorporados pela referência nas porções do documento aqui discutido, bem como na sua íntegra.
[0022] A menos que de outra forma indicada, os termos a seguir apresentam os seguintes significados:
[0023] “2’-O-metoxietila” (também 2’-MOE e 2’-O(CH2)2-OCH3) refere-se a uma modificação O-metóxi-etila da posição 2’ de um anel furosila. Um açúcar modificado de 2’-O-metoxietila é um açúcar modificado.
[0024] “Nucleotídeo de 2’-O-metoxietila” significa um nucleotídeo compreendendo um açúcar modificado da fração de 2’-O-metoxietila.
[0025] “5-metilcitosina” significa uma citosina modificada por um grupo metila anexado à posição 5. Uma 5-metilcitosina é uma nucleobase modificada.
[0026] “Agente farmacêutico ativo” significa a substância ou substâncias em uma composição farmacêutica que fornecem um benefício terapêutico quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, em certas modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido alvejado pelo fator 11 é um agente farmacêutico ativo.
[0027] “Região alvo ativa” ou “região alvo” significa uma região na qual um ou mais compostos ativos anti-sentido são alvejados. “Compostos ativos anti-sentido” significa compostos anti-sentido para reduzir os níveis de ácido nucleico ou níveis de proteína alvo.
[0028] “Administrado ao mesmo tempo” refere-se à co- administração de dois agentes de qualquer maneira, na qual os efeitos farmacológicos de ambas são manifestados no paciente ao mesmo tempo. A administração concomitante não exige que ambos os agentes sejam administrados em uma única composição farmacêutica, na mesma forma de dosagem, ou pela mesmo via de administração. Os efeitos de ambos os agentes não precisam ser manifestados ao mesmo tempo. Os efeitos precisam ser apenas sobrepostos por um período de tempo e não precisam ser coincidentes.
[0029] “Administração” significa fornecer um agente farmacêutico a um indivíduo e inclui, mas sem limitação, administração por um profissional médico e auto administração.
[0030] “Melhora” refere-se a uma diminuição de pelo menos um indicador, sinal ou sintoma de uma doença, distúrbio ou condição associada. A gravidade de indicadores pode ser determinada por medidas subjetivas ou objetivas, que são conhecidas pelos versados na técnica.
[0031] “Animal” refere-se a um animal humano ou não humano, incluindo, mas sem limitação, camundongos, ratos, coelhos, cães, gatos, porcos e primatas não humanos, incluindo, mas sem limitação, macacos e chimpanzés.
[0032] “Composto antídoto” refere-se a um composto capaz de diminuir a intensidade ou duração de qualquer atividade mediada por anti-sentido.
[0033] “Oligonucleotídeo antídoto” significa um composto antídoto compreendendo um oligonucleotídeo que é complementar a e é capaz de hibridizar em um composto anti-sentido.
[0034] “Proteína antídoto” significa um composto antídoto que compreende um peptídeo.
[0035] “Anticorpo” refere-se a uma molécula caracterizada por reagir especificamente com um antígeno de alguma maneira, onde o anticorpo e o antígeno são cada qual definidos nos termos do outro. O anticorpo pode se referir a uma molécula de anticorpo completa ou qualquer fragmento ou região desta, tais como a região de cadeia pesada, a região de cadeia leve, região Fab e região Fc.
[0036] “Atividade anti-sentido” significa qualquer atividade detectável ou mensurável atribuída à hibridização de um composto anti-sentido em seu ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a atividade anti-sentido é uma diminuição na quantidade ou expressão de um ácido nucleico alvo ou proteína codificada por tal ácido nucleico alvo.
[0037] “Composto anti-sentido” significa um composto oligomérico que é capaz de se submeter à hibridização em um ácido nucleico alvo por meio da ligação de hidrogênio.
[0038] “Inibição anti-sentido” significa redução de níveis de ácido nucleico alvo ou níveis de proteína alvo na presença de um composto anti-sentido complementar a um ácido nucleico alvo comparado aos níveis de ácido nucleico alvo ou níveis de proteína alvo na ausência do composto anti-sentido.
[0039] “Oligonucleotídeo anti-sentido” significa um oligonucleotídeo de fita simples com uma sequência de nucleobases que permite a hibridização em uma região ou segmento correspondente de um ácido nucleico alvo.
[0040] “Açúcar bicíclico” significa um anel furosila modificado pela ponte de dois átomos de anel não geminal. Um açúcar bicíclico é um açúcar modificado.
[0041] “Ácido nucleico bicíclico” ou “BNA” refere-se a um nucleosídeo ou nucleotídeo no qual a porção furanose do nucleosídeo ou nucleotídeo inclui uma ponte que conecta dois átomos de carbono no anel furanose, formando por meio disso um sistema de anel bicíclico.
[0042] “Estrutura cap” ou “fração cap terminal” significa modificações químicas, que foram incorporadas em ambas as terminações de um composto anti-sentido.
[0043] “Região quimicamente distinta” refere-se a uma região de um composto anti-sentido que é de alguma maneira quimicamente diferente de uma outra região do mesmo composto anti-sentido. Por exemplo, uma região com nucleotídeos 2’-O-metoxietila é quimicamente distinta de uma região com nucleotídeos sem modificações 2’-O-metoxietila.
[0044] “Composto anti-sentido quimérico” significa um composto anti-sentido que apresenta pelo menos duas regiões quimicamente distintas.
[0045] “Co-administração” significa administração de dois ou mais agentes farmacêuticos a um indivíduo. Os dois ou mais agentes farmacêuticos podem estar em uma única composição farmacêutica ou podem estar em composições farmacêuticas separadas. Cada um dos dois ou mais agentes farmacêuticos pode ser administrado por meio da mesmo ou diferentes vias de administração. A co- administração inclui administração em paralelo ou sequencial.
[0046] “Fator de coagulação” significa quaisquer dos fatores I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, ou TAFI na cascata de coagulação sanguínea. “Ácido nucleico do fator de coagulação” significa qualquer ácido nucleico que codifica um fator de coagulação. Por exemplo, em certas modalidades, um ácido nucleico do fator de coagulação inclui, sem limitação, uma sequência de DNA que codifica um fator de coagulação (incluindo DNA genômico compreendendo introns e exons), uma sequência de RNA transcrita do DNA que codifica um fator de coagulação, e uma sequência de RNAm que codifica um fator de coagulação. “RNAm do fator de coagulação” significa um RNAm que codifica uma proteína do fator de coagulação.
[0047] “Complementaridade” significa a capacidade de pareamento entre nucleobases de um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico.
[0048] “Nucleobases contíguas” significa nucleobases imediatamente adjacentes umas às outras.
[0049] “Diluente” significa um ingrediente em uma composição que perde a atividade farmacológica, mas é farmaceuticamente necessário ou desejável. Por exemplo, o diluente em uma composição injetada pode ser um líquido, por exemplo, solução de salina.
[0050] “Dose” significa uma quantidade especificada de um agente farmacêutico fornecido em uma única administração, ou em um período de tempo especificado. Em certas modalidades, uma dose pode ser administrada em um, dois ou mais bolos, comprimidos ou injeções. Por exemplo, em certas modalidades onde a administração subcutânea é desejada, a dose desejada exige um volume que não é acomodado facilmente por uma única injeção, portanto, duas ou mais injeções podem ser usadas para atingir a dose desejada. Em certas modalidades, o agente farmacêutico é administrado por infusão por um período de tempo prolongado ou continuamente. As doses podem ser declaradas como a quantidade de agente farmacêutico por hora, dia, semana ou mês.
[0051] “Quantidade eficaz” significa a quantidade de agente farmacêutico ativo suficiente para efetuar uma consequência fisiológica desejada em um indivíduo que necessita do agente. A quantidade eficaz pode variar entre indivíduos dependendo da saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, do grupo taxonômico dos indivíduos a serem tratados, da fórmula da composição, da avaliação da condição médica do indivíduo e de outros fatores relevante.
[0052] “Ácido nucleico do fator 11” ou “ácido nucleico do fator XI” ou “ácido nucleico do F 11” ou “ácido nucleico do F XI” significa qualquer ácido nucleico que codifica o fator 11. Por exemplo, em certas modalidades, um ácido nucleico do fator 11 inclui uma sequência de DNA que codifica o fator 11, uma sequência de RNA transcrita do DNA que codifica o fator 11 (incluindo DNA genômico que compreende introns e exons), e uma sequência de RNAm que codifica o fator 11. “RNAm do fator 11” significa um RNAm que codifica uma proteína do fator 11.
[0053] “Inibidor específico do fator 11” refere-se a qualquer agente capaz de inibir especificamente a expressão de RNAm do fator 11 e/ou a proteína do fator 11 no nível molecular. Por exemplo, os inibidores específicos do fator 11 incluem ácidos nucleicos (incluindo compostos anti-sentido), peptídeos, anticorpos, moléculas pequenas, e outros agentes capazes de inibir a expressão de RNAm do fator 11 e/ou proteína do fator 11. Em certas modalidades, modulando especificamente a expressão do RNAm do fator 11 e/ou a expressão da proteína do fator 11, os inibidores específicos do fator 11 podem afetar outros componentes da cascata de coagulação, incluindo componentes à jusante. De maneira similar, em certas modalidades, os inibidores específicos do fator 11 podem afetar outros processos moleculares em um animal.
[0054] “Antídoto do inibidor específico do fator 11” significa um composto capaz de diminuir o efeito de um inibidor específico do fator 11. Em certas modalidades, um antídoto do inibidor específico do fator 11 é selecionado de um peptídeo do fator 11; um antídoto de oligonucleotídeo do fator 11, incluindo um antídoto do composto do fator 11 complementar a um composto anti-sentido do fator 11; e qualquer composto ou proteína que afeta a via de coagulação intrínseca ou extrínseca.
[0055] “Totalmente complementar” ou “100 % complementar” significa que cada nucleobase de um primeiro ácido nucleico apresenta uma nucleobase complementar em um segundo ácido nucleico. Em certas modalidades, um primeiro ácido nucleico é um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo é um segundo ácido nucleico.
[0056] “Gap-mer” significa um composto anti-sentido quimérico no qual uma região interna com uma pluralidade de nucleosídeos que auxilia a clivagem de RNase H está posicionada entre regiões externas com um ou mais nucleosídeos, em que os nucleosídeos compreendendo a região interna são quimicamente distintos do nucleosídeo ou nucleosídeos compreendendo as regiões externas. A região interna pode ser referida como um “segmento de intervalo” e as regiões externas podem ser referidas como “segmentos em asa”.
[0057] “Maior em intervalo” significa um composto anti-sentido quimérico com um segmento de intervalo de 12 ou mais 2’- desoxirribonucleosídeos contíguos posicionado entre e imediatamente adjacente aos segmentos em asa 5’ e 3’ que apresentam de um a seis nucleosídeos.
[0058] “Hibridização” significa o anelamento de moléculas de ácido nucleico complementar. Em certas modalidades, as moléculas de ácido nucleico complementar incluem um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo.
[0059] “Identificar um animal em risco para complicações tromboembolíticas” significa identificar um animal que foi diagnosticado com uma complicação tromboembolítica ou identificar um animal pré- disposto para desenvolver uma complicação tromboembolítica. Os indivíduos pré-dispostos para desenvolver uma complicação tromboembolítica incluem aqueles com um ou mais fatores de risco para complicações tromboembolíticas incluindo imobilidade, cirurgia (particularmente cirurgia ortopédica), malignidade, gravidez, idade avançada, uso de contraceptivos orais, e distúrbios de coagulação protrombótica inerente ou adquirida. Tal identificação pode ser realizada por qualquer método incluindo avaliar um histórico médico do indivíduo e testes clínicos ou avaliações padrões.
[0060] “Imediatamente adjacente” significa que não existem elementos de intervenção entre os elementos adjacentes imediatos.
[0061] “Indivíduo” significa um animal humano ou não humano selecionado para tratamento ou terapia.
[0062] “Ligação internucleosídeos” refere-se à ligação química entre os nucleosídeos.
[0063] “Nucleosídeos ligados” significam nucleosídeos adjacentes que são ligados juntos.
[0064] “Incompatibilidade” ou “nucleobase não complementar” refere-se ao caso quando uma nucleobase de um primeiro ácido nucleico não é capaz de parear com a nucleobase correspondente de um segundo ou ácido nucleico alvo.
[0065] “Ligação internucleosídeos modificados” refere-se a uma substituição ou qualquer mudança de uma ligação internucleosídeo de ocorrência natural (isto é, uma ligação internucleosídeo de fosfodiéster).
[0066] “Nucleobase modificada” refere-se a qualquer nucleobase sem ser adenina, citosina, guanina, timidina ou uracila. Uma “nucleobase não modificada” significa as bases púricas adenina (A) e guanina (G), e as bases pirimídicas timina (T), citosina (C) e uracila (U).
[0067] “Nucleotídeo modificado” significa um nucleotídeo que apresenta, independentemente, uma fração de açúcar modificado, ligação internucleosídeos modificada, ou nucleobase modificada. Um “nucleosídeo modificado” significa um nucleosídeo que apresenta, independentemente, uma fração de açúcar modificado ou nucleobase modificada.
[0068] “Oligonucleotídeo modificado” significa um oligonucleotídeo compreendendo uma ligação internucleosídeos modificados, um açúcar modificado, ou uma nucleobase modificada.
[0069] “Açúcar modificado” refere-se a uma substituição ou mudança de um açúcar natural.
[0070] “Motivo” significa o padrão de regiões quimicamente distintas em um composto anti-sentido.
[0071] “Ligação internucleosídeos de ocorrência natural” significa uma ligação de fosfodiéster 3’ a 5’.
[0072] “Fração de açúcar natural” significa um açúcar observado em DNA (2’-H) ou RNA (2’-OH).
[0073] “Ácido nucleico” refere-se a moléculas compostas de nucleotídeos monoméricos. Um ácido nucleico inclui ácidos ribonucleicos (RNA), ácidos desoxirribonucleicos (DNA), ácidos nucleicos de fita simples, ácidos nucleicos de fita dupla, ácidos ribonucleicos de pequena interferência (RNAsi), e RNAsmicro (RNAmi).
[0074] “Nucleobase” significa uma fração heterocíclica capaz de parear com uma base de um outro ácido nucleico.
[0075] “Sequência de nucleobases” significa a ordem de nucleobases contíguas independente de qualquer modificação de açúcar, ligação ou nucleobase.
[0076] “Nucleosídeo” significa uma nucleobase ligada a um açúcar.
[0077] "Mimético de nucleosídeo" inclui aquelas estruturas usadas para substituir o açúcar ou o açúcar e a base, e não necessariamente a ligação em uma ou mais posições de um composto oligomérico tal como, por exemplo, mimético de nucleosídeos com morfolino, cicloexenila, cicloexila, tetraidropiranila, miméticos de açúcar biciclo ou triciclo, por exemplo, unidades de açúcar não furanose. O mimético de nucleotídeo inclui aquelas estruturas usadas para substituir o nucleosídeo e a ligação em uma ou mais posições de um composto oligomérico tal como, por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos ou morfolinos (morfolinos ligados por -N(H)-C(=O)-O- ou outra ligação não fosfodiéster). Os representantes de açúcar sobrepõem-se com o termo levemente mais amplo de mimético de nucleosídeo, mas pretende-se que indiquem apenas a substituição da unidade de açúcar (anel furanose). Os anéis de tetraidropiranila aqui fornecidos são ilustrativos de um exemplo dos representantes de açúcar em que o grupo do açúcar furanose foi substituído por um sistema de anel de tetraidropiranila.
[0078] “Nucleotídeo” significa um nucleosídeo com um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo.
[0079] “Composto oligomérico” ou “oligômero” significa um polímero de subunidades monoméricas ligadas que é capaz de hibridizar em pelo menos uma região de uma molécula de ácido nucleico.
[0080] “Oligonucleotídeo” significa um polímero de nucleosídeos ligados, em que cada qual pode ser modificado ou não modificado, independente um do outro.
[0081] “Administração parenteral” significa administração por meio de injeção ou infusão. A administração parenteral inclui administração subcutânea, administração intravenosa, administração intramuscular, administração intra-arterial, administração intraperitonial ou administração intracranial, por exemplo, administração intratecal ou intracerebroventricular.
[0082] “Peptídeo” significa uma molécula formada ligando pelo menos dois aminoácidos por ligações de amida. Peptídeo refere-se a polipeptídeos e proteínas.
[0083] “Composição farmacêutica” significa uma mistura de substâncias adequadas para administrar a um indivíduo. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode compreender um ou mais agentes farmacêuticos ativos e um solução aquosa estéril.
[0084] “Sais farmaceuticamente aceitáveis” significa sais farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis de compostos anti- sentido, isto é, sais que mantêm a atividade biológica desejada do oligonucleotídeo pai e não transmitem efeitos toxicológicos indesejados a este.
[0085] “Ligação de fosforotioato” significa uma ligação internucleosídeos onde a ligação fosfodiéster é modificada substituindo um dos átomos de oxigênio sem conexão com um átomo de enxofre. Uma ligação de fosforotioato (P=S) é uma ligação modificada entre nucleosídeos.
[0086] “Porção” significa um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) de um ácido nucleico. Em certas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção é um número definido de nucleobases contíguas de um composto anti-sentido.
[0087] “Prevenção” refere-se a retardar ou evitar o início ou desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição por um período de tempo de minutos a indefinidamente. Prevenção também significa reduzir o risco de desenvolver uma doença, distúrbio ou condição.
[0088] “Pró-medicamento” significa um agente terapêutico que é preparado em uma forma inativa que é convertida para uma forma ativa no corpo ou células destes pela ação de enzimas endógenas ou outros produtos químicos ou condições.
[0089] “Efeitos colaterais” significam respostas fisiológicas atribuíveis a um tratamento sem ser os efeitos desejados. Em certas modalidades, os efeitos colaterais incluem reações de sítio de injeção, anormalidades no teste de função hepática, anormalidades da função renal, toxicidade hepática, toxicidade renal, anormalidades do sistema nervoso central, miopatias e indisposição. Por exemplo, maiores níveis de aminotransferase no soro pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática. Por exemplo, o aumento da bilirrubina pode indicar toxicidade hepática ou anormalidade da função hepática.
[0090] “Oligonucleotídeo de fita simples” significa um oligonucleotídeo que não é hibridizado em uma fita complementar.
[0091] “Especificamente hibridizável” refere-se a um composto anti-sentido com um grau suficiente de complementaridade entre um oligonucleotídeo anti-sentido e um ácido nucleico alvo para induzir um efeito desejado, exibindo ao mesmo tempo efeitos mínimos ou nenhum efeito em ácidos nucleicos não alvos em condições nas quais a ligação específica é desejada, isto é, em condições fisiológicas no case de ensaios in vivo e tratamentos terapêuticos.
[0092] “Alvejar” ou “alvejado” significa o processo de projeto e seleção de um composto anti-sentido que hibridizará especificamente em um ácido nucleico alvo e induzirá um efeito desejado.
[0093] “Ácido nucleico alvo”, “RNA alvo”, e “transcrito de RNA alvo” referem-se todos a um ácido nucleico capaz de ser alvejado por compostos anti-sentido.
[0094] “Segmento alvo” significa a sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico alvo no qual um composto anti-sentido é alvejado. “sítio alvo 5’” refere-se ao principal nucleotídeo 5’ de um segmento alvo. “sítio alvo 3’” refere-se ao principal nucleotídeo 3’ de um segmento alvo.
[0095] “Quantidade terapeuticamente eficaz” significa uma quantidade de um agente farmacêutico que fornece um benefício terapêutico a um indivíduo.
[0096] “Complicação tromboembolítica” significa qualquer doença, distúrbio ou condição que envolve uma embolia causada por um trombo. Exemplos de tais doenças, distúrbios e condições incluem as categorias de trombose, embolia, e tromboembolia. Em certas modalidades, tais doenças, distúrbios e condições incluem trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular.
[0097] “Tratar” refere-se a administrar uma composição farmacêutica para realizar uma alteração ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição.
[0098] “Nucleotídeo não modificado” significa um nucleotídeo composto de nucleobases de ocorrência natural, frações de açúcar e ligações entre nucleosídeos. Em certas modalidades, um nucleotídeo não modificado é um Nucleotídeo de RNA (isto é, β-D- ribonucleosídeos) ou um nucleotídeo de DNA (isto é, β-D- desoxirribonucleosídeo). Certas modalidades
[0099] As modalidades da presente invenção fornecem métodos, compostos e composições para diminuir a expressão de RNAm e proteína do fator 11.
[00100] As modalidades da presente invenção fornecem métodos, compostos e composições para o tratamento, prevenção ou melhora de doenças, distúrbios e condições associadas ao fator 11 em um indivíduo que necessita destes. São também contemplados métodos e compostos para a preparação de um medicamento para o tratamento, prevenção, ou melhora de uma doença, distúrbio ou condição associada ao fator 11. Doenças, distúrbios e condições associados ao fator 11 incluem complicações tromboembolíticas tais como trombose, embolia, tromboembolia, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular.
[00101] As modalidades da presente invenção fornecem um inibidor específico do fator 11 para uso no tratamento, prevenção ou melhora de uma doença associada ao fator 11. Em certas modalidades, os inibidores específicos do fator 11 são ácidos nucleicos (incluindo compostos anti-sentido), peptídeos, anticorpos, moléculas pequenas, e outros agentes capazes de inibir a expressão de RNAm do fator 11 e/ou proteína do fator 11.
[00102] Em certas modalidades da presente invenção, os inibidores específicos do fator 11 são peptídeos ou proteínas, tais como, mas sem limitação, inibidores de alfa 1 protease, antitrombina III, inibidores de C1 e inibidores de alfa 2 plasmina da maneira descrita em J Clin Invest 1982, 69:844-852; alfa 1 antitripsina (alfa 1AT) da maneira descrita em Thromb Res 1987, 48:145-151; inibidores do peptídeo do fator 11 da maneira descrita em USPPN 2008/021998 e Blood 1998, 92:4198-206; MAP4-RGKWC da maneira descrita em Thromb Res 2001, 104:451-465; beta 2 GPI da maneira descrita em Proc Natl Acad Sci 2004, 101:3939-44; inibidor da proteinase de Lentinus da maneira descrita em Eur J Biochem 1999, 262:915-923; inibidor do domínio Kunitz precursor da proteína protease nexina-2/beta amilóide (APPI) e antitrombina (AT) da maneira descrita em J Biol Chem 2004, 279:29485-29492; e aprotinina da maneira descrita em J Biol Chem 2005, 280:23523-30.
[00103] Em certas modalidades da presente invenção, os inibidores específicos do fator 11 são anticorpos, tais como, mas sem limitação, Winston-Salem (IgG3 kapa) e Baltimore (IgG1 kapa) da maneira descrita em Blood 1988, 72:1748-54; 5F4, 3C1, e 1F1 da maneira descrita em J Biol Chem 1985, 260:10714-719; anticorpos monoclonais da maneira descrita em Throm Haemost 1990, 63:41723; XI-5108 da maneira descrita em J Thromb Haem 2006, 4:14961501; anticorpos monoclonais 4-1 da maneira descrita em Thromb Res 1986, 42:225-34; e anticorpo abcixmab da maneira descrita no exemplo 19 de USPN 6.566.140.
[00104] Em certas modalidades da presente invenção, os inibidores específicos do fator 11 são moléculas pequenas, tal como, mas sem limitação, fluorfosfatos de diisopropila (DFP); os inibidores de molécula pequena da maneira descrita nos exemplos 1-7 de USPPN 2004/0180855; e p-aminobenzamidina (pAB) da maneira descrita em J Biol Chem 2005, 280:23523-30.
[00105] As modalidades da presente invenção fornecem um inibidor específico do fator 11, da maneira aqui descrita, para uso no tratamento, prevenção ou melhora das complicações tromboembolíticas tais como trombose, embolia, tromboembolia, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular.
[00106] As modalidades da presente invenção fornecem o uso de inibidores específicos do fator 11 da maneira aqui descrita na fabricação de um medicamento para tratar, melhorar ou prevenir uma complicação tromboembolítica tais como trombose, embolia, tromboembolia, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular.
[00107] As modalidades da presente invenção fornecem um inibidor específico do fator 11 da maneira aqui descrita para uso no tratamento, prevenção ou melhora de uma complicação tromboembolítica, da maneira aqui descrita, por terapia de combinação com um agente ou terapia adicional, da maneira aqui descrita. Os agentes ou terapias podem ser co-administrados ou administrados ao mesmo tempo.
[00108] As modalidades da presente invenção fornecem o uso de um inibidor específico do fator 11, da maneira aqui descrita, na fabricação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma complicação tromboembolítica, da maneira aqui descrita, por terapia de combinação com um agente ou terapia adicional da maneira aqui descrita. Os agentes ou terapias podem ser co-administrados ou administrados ao mesmo tempo.
[00109] As modalidades da presente invenção fornecem o uso de um inibidor específico do fator 11, da maneira aqui descrita, na fabricação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma complicação tromboembolítica da maneira aqui descrita em um paciente que é subsequentemente administrado com um agente ou terapia adicional da maneira aqui descrita.
[00110] As modalidades da presente invenção fornecem um estojo para tratar, prevenir ou melhorar uma complicação tromboembolítica, da maneira aqui descrita, em que o estojo compreende: (i) um inibidor específico do fator 11 da maneira aqui descrita; e alternativamente (ii) um agente ou terapia adicional da maneira aqui descrita.
[00111] Um estojo da presente invenção pode incluir adicionalmente instruções para usar o estojo para tratar, prevenir ou melhorar uma complicação tromboembolítica, da maneira aqui descrita, por terapia de combinação da maneira aqui descrita.
[00112] As modalidades da presente invenção fornecem compostos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11. Em certas modalidades, o ácido nucleico do fator 11 é qualquer das sequências apresentadas no acesso ao GENBANK No. NM_000128.3 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 1), acesso ao GENBANK No. NT_022792.17, truncado de 19598000 a 19624000, (aqui incorporado como SEQ ID NO: 2), acesso ao GENBANK No. NM_028066.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 6), exons 1-15 do acesso ao GENBANK No. NW_001118167.1 (aqui incorporado como SEQ ID NO: 274).
[00113] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado. Em certas modalidades, o composto da invenção compreende um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados.
[00114] Em certas modalidades, o composto da invenção pode compreender um oligonucleotídeo modificado compreendendo uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o composto da invenção pode compreender um oligonucleotídeo modificado compreendendo uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1.
[00115] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 656 a 676 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 656 a 676 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00116] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 665 a 687 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 665 a 687 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 50 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00117] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 675 a 704 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 675 a 704 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 50 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00118] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 677 a 704 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 677 a 704 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 60 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00119] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 678 a 697 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 678 a 697 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 70 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00120] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 680 a 703 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 680 a 703 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3 e exemplo 30).
[00121] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 683 a 702 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 683 a 702 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 90 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00122] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 738 a 759 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 738 a 759 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3 e exemplo 30).
[00123] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 738 a 760 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 738 a 760 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 60 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00124] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 738 a 762 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 738 a 762 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 45 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00125] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.018 a 1.042 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.018 a 1.042 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00126] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.062 a 1.089 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.089 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 70 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00127] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.062 a 1.090 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.090 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 60 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00128] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 20 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00129] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.275 a 1.301 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00130] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.276 a 1.301 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 30).
[00131] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.284 a 1.308 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00132] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.291 a 1.317 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00133] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que compreende uma sequência de nucleobases complementar a pelo menos uma porção de nucleobases 1.275 a 1.318 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18 ou 20 nucleobases contíguas complementares a uma porção de tamanho igual de nucleobases 1.275 a 1.318 de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode compreender uma sequência de nucleobases 100 % complementar a uma porção de tamanho igual de SEQ ID NO: 1. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 70 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00134] As modalidades da presente invenção fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 241.
[00135] As modalidades da presente invenção fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 269.
[00136] As modalidades da presente invenção fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 242 a 269.
[00137] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de No ISISs: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51to 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 to 103, 105 a 109, 113 to 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 to 197, 199 to 211, e 213 a 232. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51 a 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 a 103, 105 a 109, 113 a 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 a 197, 199 a 211, e 213 a 232. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 22, 31, 32, 34, 36 a 38, 40, 41, 43, 51 a 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 a 103, 105 a 109, 113 a 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 a 197, 199 a 211, e 213 a 232. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 70 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00138] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de No ISISs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210, e 213 a 232. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210, e 213 a 232. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 a 53, 60, 98, 100 a 102, 105 a 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 a 193, 195, 196, 199 a 210, e 213 a 232. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00139] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de No ISISs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 e 231. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 e 231. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 31, 37, 100, 105, 179, 190 a 193, 196, 202 a 207, 209, 210, 214 a 219, 221 a 224, 226, 227, 229 e 231. O dito oligonucleotídeo modificado pode atingir pelo menos 90 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 3).
[00140] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260, e 262 a 266. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260, e 262 a 266. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 232, 242 a 260, e 262 a 266. Os ditos oligonucleotídeos modificados podem atingir pelo menos 70 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 30).
[00141] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 216, 218 a 226, 243 a 246, 248, 249, 252 a 259, 264 e 265. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 216, 218 a 226, 243 a 246, 248, 249, 252 a 259, 264 e 265. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 a 216, 218 a 226, 243 a 246, 248, 249, 252 a 259, 264 e 265. Os ditos oligonucleotídeos modificados podem atingir pelo menos 80 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 30).
[00142] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, ou pelo menos 18 nucleobases de uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, e 254. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado compreende uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, e 254. Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em uma sequência de nucleobases selecionadas de SEQ ID NOs: 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, e 254. Os ditos oligonucleotídeos modificados podem atingir pelo menos 90 % de inibição dos níveis de RNAm humano da maneira determinada usando um método de ensaio de RT-PCR, opcionalmente em células HepG2 (por exemplo, da maneira descrita no exemplo 30).
[00143] Em certas modalidades, o composto consiste em um oligonucleotídeo modificado de fita simples.
[00144] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado consiste em 20 nucleosídeos ligados.
[00145] Em certas modalidades, a sequência de nucleobases do oligonucleotídeo modificado é 100 % complementar a uma sequência de nucleobases de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 274.
[00146] Em certas modalidades, o composto apresenta pelo menos uma ligação modificada entre nucleosídeos. Em certas modalidades, a ligação internucleosídeos é uma ligação internucleosídeos de fosforotioato.
[00147] Em certas modalidades, o composto apresenta pelo menos um nucleosídeo compreendendo um açúcar modificado. Em certas modalidades, o pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico. Em certas modalidades, o pelo menos um açúcar modificado compreende um 2’-O-metoxietila.
[00148] As modalidades da presente invenção fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 241, SEQ ID NOs: 15 a 269, ou SEQ ID NOs: 242 a 269, em que pelo menos um nucleosídeo compreende um açúcar modificado.
[00149] Em certas modalidades, o dito pelo menos um açúcar modificado é um açúcar bicíclico.
[00150] Em certas modalidades, o dito pelo menos um açúcar bicíclico compreende uma ponte 4’- (CH2)n-O-2’, em que n é 1 ou 2.
[00151] Em certas modalidades, o dito pelo menos um açúcar bicíclico compreende uma ponte 4’-CH(CH3)-O-2’.
[00152] Em certas modalidades, o dito pelo menos um açúcar modificado compreende um grupo 2’-O-metoxietila.
[00153] As modalidades da presente invenção fornecem compostos compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo menos 16, pelo menos 18, ou 20 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 241, SEQ ID NOs: 15 a 269, ou SEQ ID NOs: 242 a 269, compreendendo pelo menos um nucleosídeo de tetraidropirano modificado, em que um anel de tetraidropirano substitui o anel furanose.
[00154] Em certas modalidades, o dito pelo menos um nucleosídeo de tetraidropirano modificado apresenta a estrutura:
Figure img0001
[00155] Em certas modalidades, o composto apresenta pelo menos um nucleosídeo compreendendo uma nucleobase modificada. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é uma 5-metilcitosina.
[00156] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste em desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento em asa 5’ que consiste em nucleosídeos ligados; (iii) um segmento em asa 3’ que consiste em nucleosídeos ligados, em que o segmento de intervalo é posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5’ e o segmento em asa 3’, e em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar modificado. Em algumas tais modalidades, cada citosina no oligonucleotídeo modificado é uma 5-metilcitosina.
[00157] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento em asa 5’ que consiste em cinco nucleosídeos ligados; (iii) um segmento em asa 3’ que consiste em cinco nucleosídeos ligados, em que o segmento de intervalo é posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5’ e o segmento em asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2’-O-metoxietila; e em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato. Em algumas tais modalidades, cada citosina no oligonucleotídeo modificado é uma 5- metilcitosina.
[00158] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste em quatorze desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento em asa 5’ que consiste em três nucleosídeos ligados; (iii) um segmento em asa 3’ que consiste em três nucleosídeos ligados, em que o segmento de intervalo é posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5’ e o segmento em asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2’-O-metoxietila; e em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato. Em algumas tais modalidades, cada citosina no oligonucleotídeo modificado é uma 5- metilcitosina.
[00159] Em certas modalidades, o oligonucleotídeo modificado do composto compreende: (i) um segmento de intervalo que consiste em treze desoxinucleosídeos ligados; (ii) um segmento em asa 5’ que consiste em dois nucleosídeos ligados; (iii) um segmento em asa 3’ que consiste em cinco nucleosídeos ligados, em que o segmento de intervalo é posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5’ e o segmento em asa 3’, em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2’-O-metoxietila; e em que cada ligação internucleosídeos é uma ligação de fosforotioato. Em algumas tais modalidades, cada citosina no oligonucleotídeo modificado é uma 5- metilcitosina.
[00160] As modalidades da presente invenção fornecem uma composição compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 241 ou um sal destas e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00161] As modalidades da presente invenção fornecem uma composição compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 269 ou um sal destas e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00162] As modalidades da presente invenção fornecem uma composição compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 12 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 241 a 269 ou um sal destas e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00163] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem administrar a um animal um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 241.
[00164] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem administrar a um animal um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 15 a 269.
[00165] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem administrar a um animal um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados e com uma sequência de nucleobases compreendendo pelo menos 8 nucleobases contíguas de uma sequência de nucleobases selecionadas entre as sequências de nucleobases citadas em SEQ ID NOs: 241 a 269.
[00166] Em certas modalidades, o animal é um humano.
[00167] Em certas modalidades, a administração previne trombose venosa profunda ou embolia pulmonar.
[00168] Em certas modalidades, o composto é co-administrado com qualquer um do grupo selecionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamol, heparina, lepirudina, ticlopidina, varfarina, apixaban, rivaroxaban e LOVENOX.
[00169] Em certas modalidades, o composto é co-administrado com qualquer inibidor do fator Xa.
[00170] Em certa modalidade, o inibidor do fator Xa é qualquer um de Rivaroxaban, LY517717, YM150, apixaban, PRT054021 e DU- 176b.
[00171] Em certas modalidades, o composto é administrado ao mesmo tempo com qualquer um do grupo selecionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamol, heparina, lepirudina, ticlopidina, varfarina, apixaban, rivaroxaban, e LOVENOX que são administrados ao mesmo tempo.
[00172] Em certas modalidades, a administração é administração parenteral. Em certas modalidades, a administração parenteral é qualquer uma de administração subcutânea ou intravenosa.
[00173] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem identificar um animal em risco de desenvolver complicações tromboembolíticas e administrar no animal em risco uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico do fator 11.
[00174] Em certas modalidades, a complicação tromboembolítica é trombose venosa profunda, embolia pulmonar, ou uma combinação destas.
[00175] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem identificar um animal com um distúrbio de coagulação administrando ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico do fator 11.
[00176] Em certas modalidades, o composto é co-administrado com qualquer um do grupo selecionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamol, heparina, lepirudina, ticlopidina, varfarina, apixaban, rivaroxaban e LOVENOX.
[00177] Em certas modalidades, o composto é administrado ao mesmo tempo com qualquer um do grupo selecionado de aspirina, clopidogrel, dipiridamol, heparina, lepirudina, ticlopidina, varfarina, apixaban, rivaroxaban, e LOVENOX que são administrados ao mesmo tempo.
[00178] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem reduzir o risco de complicações tromboembolíticas em um animal administrando ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico do fator 11.
[00179] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem tratar um distúrbio de coagulação em um animal administrando ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico do fator 11.
[00180] As modalidades da presente invenção fornecem métodos que compreendem inibir a expressão do fator 11 em um animal, administrando ao animal uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto compreendendo um oligonucleotídeo modificado que consiste em 12 a 30 nucleosídeos ligados, em que o oligonucleotídeo modificado é complementar a um ácido nucleico do fator 11.
[00181] Em certas modalidades, a inibição do fator 11 no animal é revertida administrando um antídoto para o oligonucleotídeo modificado.
[00182] Em certas modalidades, o antídoto é um oligonucleotídeo complementar ao oligonucleotídeo modificado. Compostos anti-sentido
[00183] Os composto oligoméricos incluem, mas sem limitação, oligonucleotídeos, oligonucleosídeos, análogos de oligonucleotídeo, miméticos de oligonucleotídeo, compostos anti-sentido, oligonucleotídeos anti-sentido, e RNAssi. Um composto oligomérico pode ser “anti-sentido” a um ácido nucleico alvo, o que significa que é capaz de se submeter à hibridização em um ácido nucleico alvo por meio da ligação de hidrogênio.
[00184] Em certas modalidades, um composto anti-sentido apresenta uma sequência de nucleobases que, quando escrita na direção 5’ para 3’, compreende o complemento reverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo no qual é alvejado. Em certas tais modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido apresenta uma sequência de nucleobases que, quando escrita na direção 5’ para 3’, compreende o complemento reverso do segmento alvo de um ácido nucleico alvo no qual é alvejado.
[00185] Em certas modalidades, um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 apresenta 12 a 30 subunidades de comprimento. Em outras palavras, tais compostos anti-sentido apresentam de 12 a 30 subunidades ligadas. Em outras modalidades, o composto anti-sentido apresenta 8 a 80, 12 a 50, 15 a 30, 18 a 24, 19 a 22, ou 20 subunidades ligadas. Em certas tais modalidades, os compostos anti-sentido apresentam 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 subunidades ligadas de comprimento, ou uma faixa definida por quaisquer dos valores anteriores. Em algumas modalidades, o composto anti-sentido é um oligonucleotídeo anti- sentido, e as subunidades ligadas são nucleotídeos.
[00186] Em certas modalidades, os oligonucleotídeos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 podem ser encurtados ou truncados. Por exemplo, uma subunidade simples pode ser deletada da extremidade 5’ (truncação 5’), ou alternativamente da extremidade 3’ (truncação 3’). Um composto anti-sentido encurtado ou truncado alvejado em um ácido nucleico do fator 11 pode apresentar duas subunidades deletadas da extremidade 5’ ou, alternativamente pode apresentar duas subunidades deletadas da extremidade 3’, do composto anti-sentido. Alternativamente, os nucleosídeos deletados podem ser dispersos em todo o composto anti-sentido, por exemplo, em um composto anti-sentido com um nucleosídeo deletado da extremidade 5’ e um nucleosídeo deletado da extremidade 3’.
[00187] Quando uma subunidade adicional simples está presente em um composto anti-sentido aumentado, a subunidade adicional pode estar localizada na extremidade 5’ ou 3’ do composto anti- sentido. Quando duas ou mais subunidades adicionais estão presentes, as subunidades adicionadas podem ser adjacentes umas as outras, por exemplo, em um composto anti-sentido com duas subunidades adicionadas na extremidade 5’ (adição 5’), ou alternativamente na extremidade 3’ (adição 3’), do composto anti- sentido. Alternativamente, as subunidades adicionadas podem ser dispersas em todo o composto anti-sentido, por exemplo, em um composto anti-sentido com uma subunidade adicionada na extremidade 5’ e uma subunidade adicionada na extremidade 3’.
[00188] É possível aumentar ou diminuir o tamanho de um composto anti-sentido, tal como um oligonucleotídeo anti-sentido, e/ou introduzir bases de incompatibilidade sem eliminar a atividade. Por exemplo, em Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), uma série de oligonucleotídeos anti-sentido com 13-25 nucleobases de comprimento foi testada com relação à sua capacidade de induzir a clivagem de um RNA alvo em um modelo de injeção de oócito. Os oligonucleotídeos anti-sentido com 25 nucleobases de comprimento com 8 ou 11 bases de incompatibilidade próximas às extremidades dos oligonucleotídeos anti-sentido foram capazes de direcionar a clivagem específica do RNAm alvo, embora em um grau menor que os oligonucleotídeos anti-sentido que não continham incompatibilidades. De maneira similar, a clivagem específica alvo foi atingida usando oligonucleotídeos anti-sentido com 13 nucleobases, incluindo aqueles com 1 ou 3 incompatibilidades.
[00189] Gautschi et al (J. Natl. Câncer Inst. 93:463-471, março de 2001) demonstraram a capacidade de um oligonucleotídeo com 100 % de complementaridade com o bcl-2 RNAm e com 3 incompatibilidades com o bcl-xL RNAm para reduzir a expressão tanto de bcl-2 quanto bcl-xL in vitro e in vivo. Além do mais, este oligonucleotídeo demonstrou potente atividade anti-tumor atividade in vivo.
[00190] Maher e Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) testaram uma série de oligonucleotídeos anti-sentido com 14 nucleobases em tandem, e oligonucleotídeos anti-sentido com 28 e 42 nucleobases compreendidos da sequência de dois ou três dos oligonucleotídeos anti-sentido em tandem, respectivamente, com relação à sua capacidade de interromper a tradução de DHFR humano em um ensaio de reticulócito de coelho. Cada um dos três oligonucleotídeos anti-sentido com 14 nucleobases sozinho foi capaz de inibir a tradução, embora em um nível mais modesto que os oligonucleotídeos anti-sentido com 28 ou 42 nucleobases. Motivos de composto anti-sentido
[00191] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 apresentaram subunidades quimicamente modificadas arranjadas em padrões, ou motivos, para conferir aos compostos anti-sentido propriedades tais como a melhor atividade inibitória, maior afinidade de ligação com relação a um ácido nucleico alvo, ou resistência à degradação por nucleases in vivo.
[00192] Os compostos anti-sentido quiméricos contêm tipicamente pelo menos uma região modificada de maneira a conferir maior resistência à degradação da nuclease, maior absorção celular, maior afinidade de ligação com relação ao ácido nucleico alvo, e/ou maior atividade inibitória. Uma segunda região de um composto anti-sentido quimérico funcionar opcionalmente como um substrato para a endonuclease celular RNase H, que cliva a fita de RNA de um duplex RNA:DNA.
[00193] Os compostos anti-sentido com um motivo Gap-mer são considerados compostos anti-sentido quiméricos. Em um Gap-mer, uma região interna com uma pluralidade de nucleotídeos que auxilia a clivagem de RNaseH está posicionada entre as regiões externas com uma pluralidade de nucleotídeos que são quimicamente distintos dos nucleosídeos da região interna. No caso de um oligonucleotídeo anti- sentido com um motivo Gap-mer, o segmento de intervalo funciona, em geral, como o substrato para clivagem de endonuclease, enquanto os segmentos em asa compreendem nucleosídeos modificados. Em certas modalidades, as regiões de um Gap-mer são diferenciadas pelos tipos de frações de açúcar compreendendo cada região distinta. Os tipos de frações de açúcar que são usados para diferenciar as regiões de um Gap-mer podem, em algumas modalidades, incluir β-D- ribonucleosídeos, β-D-desoxirribonucleosideos, 2'-nucleosídeos modificados (tais 2’-nucleosídeos modificados podem incluir 2’-MOE, e 2’-O-CH3, entre outros) e nucleosídeos modificados de açúcar bicíclico (tais nucleosídeos modificados de açúcar bicíclico podem incluir aqueles com uma ponte 4’-(CH2)n-O-2’, onde n=1 ou n=2). Preferivelmente, cada região distinta compreende frações uniformes de açúcar. O motivo asa-intervalo-asa é descrito com frequência como “X-Y-Z”, onde “X” representa o tamanho da região em asa 5’, “Y” representa o tamanho da região de intervalo, e “Z” representa o tamanho da região em asa 3’. Da maneira aqui usada, um Gap-mer descrito como “X-Y-Z” apresenta uma configuração de maneira tal que o segmento de intervalo esteja posicionado imediatamente adjacente a cada um do segmento em asa 5’ e do segmento em asa 3’. Assim, não existem nucleotídeos de intervenção entre o segmento em asa 5’ e o segmento de intervalo, ou o segmento de intervalo e o segmento em asa 3’. Quaisquer dos compostos anti-sentido aqui descritos podem apresentar um motivo Gap-mer. Em algumas modalidades, X e Z são os mesmos, em outras modalidades, são diferentes. Em uma modalidade preferida, Y apresenta entre 8 e 15 nucleotídeos. X, Y ou Z pode apresentar de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Assim, os Gap-mers da presente invenção incluem, mas sem limitação, por exemplo, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 110-1, 2-8-2, 5-8-5, ou 6-8-6.
[00194] Em certas modalidades, o composto anti-sentido apresenta um motivo “wingmer”, com uma configuração asa-intervalo ou intervalo-asa, isto é, uma configuração X-Y ou Y-Z, da maneira descrita anteriormente para a configuração Gap-mer. Assim, as configurações do tipo wingmer da presente invenção incluem, mas sem limitação, por exemplo 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 103, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8, ou 6-8.
[00195] Em certas modalidades, os alvejados em um ácido nucleico do fator 11 mer 5-10-5.
[00196] Em certas modalidades, os alvejados em um ácido nucleico do fator 11 mer 3-14-3.
[00197] Em certas modalidades, os alvejados em um ácido nucleico do fator 11 mer 2-13-5.
[00198] Em certas modalidades, os alvejados em um ácido nucleico do fator 11 mer 5-8-5.
[00199] Em certas modalidades, os alvejados em um ácido nucleico do fator 11 possuem um motivo Gap- mer 6-8-6.
[00200] Em certas modalidades, um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 apresenta um motivo maior em intervalo.
[00201] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido maior em intervalo alvejado em um ácido nucleico do fator 11 apresenta um segmento de intervalo de quatorze 2’- desoxirribonucleotídeos posicionados imediatamente adjacente e entre segmentos em asa de três nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas modalidades, a modificação química compreende uma modificação 2’-açúcar. Em uma outra modalidade, a modificação química compreende uma modificação 2’-açúcar MOE.
[00202] Em certas modalidades, um oligonucleotídeo anti-sentido maior em intervalo alvejado em um ácido nucleico do fator 11 apresenta um segmento de intervalo de treze 2’- desoxirribonucleotídeos posicionados imediatamente adjacente e entre um segmento em asa 5’ de dois nucleosídeos quimicamente modificados e um segmento em asa 3’ de cinco nucleosídeos quimicamente modificados. Em certas modalidades, a modificação química compreende uma modificação 2’-açúcar. Em uma outra modalidade, a modificação química compreende uma modificação 2’- açúcar MOE. Ácidos nucleicos alvos, regiões e sequências de nucleotídeos alvos
[00203] As sequências de nucleotídeos que codificam o fator 11 incluem, sem limitação, o seguinte: acesso ao GENBANK No. NM_000128.3, depositada primeiro no GENBANK em 24 de março de 1999, aqui incorporada como SEQ ID NO: 1; NT_022792.17, truncada de 19598000 a 19624000, depositada primeiro no GENBANK em 29 de novembro de 2000, e aqui incorporada como SEQ ID NO: 2; acesso ao GENBANK No. NM_028066.1, depositada primeiro no GENBANK em 2 de junho de 2002, aqui incorporada como SEQ ID NO: 6; e exons 1-15 do acesso ao GENBANK No. NW_001118167.1, depositados primeiro no GENBANK em 28 de março de 2006, aqui incorporados como SEQ ID NO: 274.
[00204] Entende-se que a sequência apresentada em cada SEQ ID NO nos exemplos aqui contidos é independente de qualquer modificação em uma fração de açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Com tal, os compostos anti-sentido definidos por uma SEQ ID NO pode compreender, independentemente, um ou mais modificações em uma fração de açúcar, uma ligação internucleosídeos, ou uma nucleobase. Os compostos anti-sentido descritos pelo número Isis (No ISIS) indicam uma combinação de sequência de nucleobases e motivo.
[00205] Em certas modalidades, uma região alvo é uma região estruturalmente definida do ácido nucleico alvo. Por exemplo, uma região alvo pode incluir uma UTR 3’, uma UTR 5’, um exon, um intron, uma junção exon/intron, uma região codificante, uma região de início de tradução, região de final de tradução ou outra região de ácido nucleico definido. As regiões estruturalmente definidas para o fator 11 podem ser obtidas pelo número de acesso de bases de dados de sequência, tal como NCBI, e tal informação é aqui incorporada pela referência. Em certas modalidades, uma região alvo pode incluir a sequência a partir de um sítio alvo 5’ de um segmento alvo na região alvo para um sítio alvo 3’ de um outro segmento alvo na mesma região alvo.
[00206] Alvejar inclui a determinação de pelo menos um segmento alvo no qual um composto anti-sentido hibridiza, de maneira tal que um efeito desejado ocorra. Em certas modalidades, o efeito desejado é uma redução nos níveis de ácido nucleico alvo de RNAm. Em certas modalidades, o efeito desejado é redução de níveis de proteína codificados pelo ácido nucleico alvo ou uma mudança fenotípica associada com o ácido nucleico alvo.
[00207] Uma região alvo pode conter um ou mais segmentos alvos. Múltiplos segmentos alvos em uma região alvo podem ser sobrepostos. Alternativamente, pode ser não sobrepostos. Em certas modalidades, os segmentos alvos em uma região alvo são separados por não mais que cerca de 300 nucleotídeos. Em certas modalidades, os segmentos alvos em uma região alvo são separados por inúmeros nucleotídeos, isto é, apresenta cerca de, apresenta não mais que, apresenta não mais que cerca de 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, ou 10 nucleotídeos no ácido nucleico alvo, ou apresenta uma faixa definida por qualquer de dois dos valores precedentes. Em certas modalidades, os segmentos alvos em uma região alvo são separados por não mais que, ou não mais que cerca de, 5 nucleotídeos no ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, os segmentos alvos são contíguos. São contempladas regiões alvo definidas por uma faixa com um ácido nucleico inicial que é qualquer um dos sítios alvos 5’ ou sítios alvos 3’ aqui listados.
[00208] Os segmentos alvos adequados podem ser observados em uma UTR 5’, uma região codificante, uma UTR 3’, um intron, um exon ou uma junção exon/intron. Os segmentos alvos contendo um códon inicial ou um códon de parada são também os segmentos alvos adequados. Um segmento alvo adequado pode excluir especificamente uma certa região estruturalmente definida, tal como o códon inicial ou o códon de parada.
[00209] A determinação dos segmentos alvos adequados pode incluir uma comparação da sequência de um ácido nucleico alvo com outras sequências em todo o genoma. Por exemplo, o algoritmo BLAST pode ser usado para identificar regiões de similaridade entre os diferentes ácidos nucleicos. Esta comparação pode prevenir a seleção das sequências do composto anti-sentido que podem hibridizar de uma maneira não específica nas sequências sem ser um ácido nucleico alvo selecionado (isto é, sequências não alvo ou fora do alvo).
[00210] Pode existir variação na atividade (por exemplo, da maneira definida por redução percentual de níveis de ácido nucleico alvo) dos compostos anti-sentido em uma região alvo ativa. Em certas modalidades, as reduções nos níveis de RNAm do fator 11 são indicativas de inibição da expressão do fator 11. As reduções em níveis de uma proteína do fator 11 são também indicativas de inibição da expressão do RNAm alvo. Adicionalmente, mudanças fenotípicas são indicativas de inibição da expressão do fator 11. Por exemplo, um período prolongado de aPTT pode ser indicativo de inibição da expressão do fator 11. Em um outro exemplo, período prolongado de aPTT junto com um período normal de PT pode ser indicativo de inibição da expressão do fator 11. Em um outro exemplo, uma menor quantidade de fator plaquetário (PF-4) pode ser indicativa de inibição da expressão do fator 11. Em um outro exemplo, menor formação de trombo ou aumento do tempo para a formação do trombo pode ser indicativo de inibição da expressão do fator 11. Hibridização
[00211] Em algumas modalidades a hibridização ocorre entre um composto anti-sentido aqui revelado e um ácido nucleico do fator 11. O mecanismo de hibridização mais comum envolve a ligação de hidrogênio (por exemplo, ligação de hidrogênio de Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa) entre nucleobases complementares das moléculas de ácido nucleico.
[00212] A hibridização pode ocorrer em condições variadas. As condições severas são dependentes de sequência e são determinadas pela natureza e composição das moléculas de ácido nucleico a serem hibridizadas.
[00213] Os métodos de determinar se uma sequência é especificamente hibridizável em um ácido nucleico alvo são bem conhecidos na técnica. Em certas modalidades, os compostos anti- sentido aqui fornecidos são especificamente hibridizáveis com um ácido nucleico do fator 11. Complementaridade
[00214] Um composto anti-sentido e um ácido nucleico alvo são complementares um ao outro quando um número suficiente de nucleobases do composto anti-sentido podem hidrogenar a ligação com as nucleobases correspondentes do ácido nucleico alvo, de maneira tal que um efeito desejado ocorra (por exemplo, a inibição anti-sentido de um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico do fator 11).
[00215] As nucleobases não complementares entre um composto anti-sentido e um ácido nucleico do fator 11 podem ser toleradas, contanto que o composto anti-sentido permaneça capaz de hibridizar especificamente em um ácido nucleico alvo. Além do mais, um composto anti-sentido pode hibridizar em um ou mais segmentos de um ácido nucleico do fator 11, de maneira tal que segmentos de intervenção ou adjacentes não estejam envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura em alça, estrutura de incompatibilidade ou em grampo).
[00216] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido aqui fornecidos, ou uma porção especificada destes, são, ou são pelo menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, ou 100 % complementares a um ácido nucleico do fator 11, uma região alvo, segmento alvo, ou porção especificada destes. A complementaridade percentual de um composto anti-sentido com um ácido nucleico alvo pode ser determinada usando métodos de rotina.
[00217] Por exemplo, um composto anti-sentido no qual 18 de 20 nucleobases do composto anti-sentido são complementares a uma região alvo e, portanto, hibridizariam especificamente, representariam complementaridade percentual de 90. Neste exemplo, o restante das nucleobases não complementares pode ser agrupado ou intercalado com nucleobases complementares e não precisam ser contíguas umas às outras ou às nucleobases complementares. Como tal, um composto anti-sentido que apresenta 18 nucleobases de comprimento com 4 (quatro) nucleobases não complementares, que são flanqueadas por duas regiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo, apresentaria 77,8 % de complementaridade total com o ácido nucleico alvo e estaria, assim, no escopo da presente invenção. A complementaridade percentual de um composto anti-sentido com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada de maneira rotineira usando os programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento local básico) e programas PowerBLAST conhecidos na técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang e Madden, Genoma Res., 1997, 7, 649 656). A homologia percentual, identidade ou complementaridade de sequência podem ser determinadas, por exemplo, pelo programa Gap (Pacote de análise de sequência Wisconsin, versão 8 para Unix, grupo Genetics Computer, University Research Park, Madison Wis.), usando ajustes padrões que utilizam o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
[00218] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido aqui fornecidos, ou porções especificadas destes, são totalmente complementares (isto é 100 % complementares) a um ácido nucleico alvo, ou porção especificada destes. Por exemplo, composto anti- sentido pode ser totalmente complementar a um ácido nucleico do fator 11, ou uma região alvo, ou um segmento alvo ou sequência alvo deste. Da maneira aqui usada, “totalmente complementar” significa que cada nucleobase de um composto anti-sentido é capaz de parear bases precisamente com as nucleobases correspondentes de um ácido nucleico alvo. Por exemplo, um composto anti-sentido com 20 nucleobases é totalmente complementar a uma sequência alvo que apresenta 400 nucleobases de comprimento, enquanto existe uma porção correspondente do ácido nucleico alvo com 20 nucleobases que é totalmente complementar ao composto anti-sentido. Totalmente complementar também pode ser usado com relação a uma porção especificada deste do primeiro e /ou do segundo ácido nucleico. Por exemplo, uma porção com 20 nucleobases de um composto anti- sentido com 30 nucleobases pode ser “totalmente complementar” a uma sequência alvo que apresenta 400 nucleobases de comprimento. A porção com 20 nucleobases do oligonucleotídeo com 30 nucleobases é totalmente complementar à sequência alvo se o sequência alvo apresentar uma porção com 20 nucleobases correspondente, em que cada nucleobase é complementar à porção com 20 nucleobases do composto anti-sentido. Ao mesmo tempo, todo o composto anti-sentido com 30 nucleobases pode ou não ser totalmente complementar à sequência alvo, dependendo se as 10 nucleobases restantes do composto anti-sentido são também complementares à sequência alvo.
[00219] O local de uma nucleobase não complementar pode ser na extremidade 5’ ou extremidade 3’ do composto anti-sentido. Alternativamente, a nucleobase não complementar, ou nucleobases, pode estar em uma posição interna do composto anti-sentido. Quando duas ou mais nucleobases não complementares são presentes, elas pode ser contíguas (isto é, ligadas) ou não contíguas. Em uma modalidade, uma nucleobase não complementar está localizada no segmento em asa de um oligonucleotídeo anti-sentido Gap-mer.
[00220] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido que apresentam, ou apresentam até, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleobases de comprimento compreendem não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2, ou não mais que 1 nucleobase não complementar com relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico do fator 11, ou porção especificada deste.
[00221] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido que apresentam, ou apresentam até, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleobases de comprimento compreendem não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2, ou não mais que 1 nucleobase não complementar com relação a um ácido nucleico alvo, tal como um ácido nucleico do fator 11, ou porção especificada deste.
[00222] Os compostos anti-sentido aqui fornecidos também incluem aqueles que são complementares a uma porção de um ácido nucleico alvo. Da maneira aqui usada, “porção” refere-se a um número definido de nucleobases contíguas (isto é, ligadas) em uma região ou segmento de um ácido nucleico alvo. Uma “porção” também pode se referir a um número definido de nucleobases contíguas de um composto anti-sentido. Em certas modalidades, os compostos anti- sentido são complementares a pelo menos uma porção de um segmento alvo com 8 nucleobases. Em certas modalidades, os compostos anti-sentido são complementares a pelo menos uma porção de um segmento alvo com 12 nucleobases. Em certas modalidades, os compostos anti-sentido são complementares a pelo menos uma porção de um segmento alvo com 15 nucleobases. São também contemplados compostos anti-sentido que são complementares a pelo menos uma porção de um segmento alvo com 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais nucleobases, ou uma faixa definida por qualquer de dois destes valores. Identidade
[00223] Os compostos anti-sentido aqui fornecidos também podem apresentar uma identidade percentual definida em uma sequência particular de nucleotídeos, SEQ ID NO, ou composto representado por um número Isis específico, ou porção deste. Da maneira aqui usada, um composto anti-sentido é idêntico à sequência aqui revelada se apresentar a mesma capacidade de parear nucleobase. Por exemplo, um RNA que contém uracila no lugar de timidina em uma sequência de DNA revelada seria considerado idêntico à sequência de DNA uma vez que tanto uracila quanto timidina pareiam com adenina. Versões menores e maiores dos compostos anti-sentido aqui descritos, bem como os compostos com bases não idênticas aos compostos anti- sentido aqui fornecidos, também são contempladas. As bases não idênticas podem ser adjacentes umas às outras ou dispersas em todo o composto anti-sentido. A identidade percentual de um composto anti- sentido é calculada de acordo com o número de bases que apresenta pareamento de base idêntico à sequência na qual está sendo comparado.
[00224] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido, ou porções destes, são pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idênticos a um ou mais dos compostos anti-sentido ou SEQ ID NOs, ou uma porção destes, aqui revelados.
[00225] Em certas modalidades, uma porção do composto anti- sentido é comparada a uma porção de tamanho igual a do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleobases é comparada a uma porção de tamanho igual a do ácido nucleico alvo.
[00226] Em certas modalidades, uma porção do oligonucleotídeo anti-sentido é comparada a uma porção de tamanho igual a do ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, uma porção com 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 nucleobases é comparada a uma porção de tamanho igual a do ácido nucleico alvo. Modificações
[00227] Um nucleosídeo é uma combinação base-açúcar. A porção de nucleobase (também conhecida como base) do nucleosídeo é em geral uma fração de base heterocíclica. Os nucleotídeos são os nucleosídeos que incluem adicionalmente um grupo fosfato covalentemente ligado à porção de açúcar do nucleosídeo. Para aqueles nucleosídeos que incluem um açúcar pentofuranosila, o grupo fosfato pode estar ligado na fração hidroxila 2', 3' ou 5' do açúcar. Os oligonucleotídeos são formados por meio da ligação covalente de nucleosídeos adjacentes uns aos outros para formar um oligonucleotídeo polimérico linear. Na estrutura do oligonucleotídeo, os grupos fosfato são comumente referidos como os que formam as ligações entre nucleosídeos do oligonucleotídeo.
[00228] As modificações nos compostos anti-sentido incluem substituições ou mudanças nas ligações entre nucleosídeos, frações de açúcar, ou nucleobases. Os compostos anti-sentido modificados são frequentemente preferidos com relação às formas nativas em decorrência de propriedades desejadas tais como, por exemplo, melhor absorção celular, melhor afinidade com o ácido nucleico alvo, maior estabilidade na presença de nucleases, ou maior atividade inibitória.
[00229] Os nucleosídeos quimicamente modificados também podem ser empregados para aumentar a afinidade de ligação de um oligonucleotídeo anti-sentido menor ou truncado com relação ao seu ácido nucleico alvo. Consequentemente, os resultados comparáveis podem ser frequentemente obtidos com compostos anti-sentido menores que apresentam tais nucleosídeos quimicamente modificados. Ligações modificadas entre nucleosídeos
[00230] A ligação de ocorrência natural entre nucleosídeos de RNA e DNA é uma ligação de fosfodiéster 3’ a 5’. Os compostos anti- sentido com uma ou mais ligações modificadas, isto é, de ocorrência não natural, entre nucleosídeos são selecionados frequentemente com relação aos compostos anti-sentido com ligações entre nucleosídeos de ocorrência natural em decorrência de propriedades desejáveis tais como, por exemplo, melhor absorção celular, melhor afinidade com relação aos ácidos nucleicos alvos, e maior estabilidade na presença de nucleases.
[00231] Os oligonucleotídeos com ligações modificadas entre nucleosídeos incluem ligações entre nucleosídeos que mantêm um átomo de fósforo, bem como as ligações entre nucleosídeos que não apresentam um átomo de fósforo. As ligações contendo fósforo representativas entre nucleosídeos incluem, mas sem limitação, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato e fosforotioatos. Os métodos de preparação de ligações contendo fósforo e não contendo fósforo são bem conhecidos.
[00232] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 compreendem uma ou mais ligações modificadas entre os nucleosídeos. Em certas modalidades, as ligações modificadas entre os nucleosídeos são ligações fosforotioato. Em certas modalidades, cada ligação entre os nucleosídeos de um composto anti-sentido é uma ligação internucleosídeos de fosforotioato. Frações de açúcar modificado
[00233] Os compostos anti-sentido da invenção podem conter opcionalmente um ou mais nucleosídeos nos quais o grupo de açúcar foi modificado. Tais nucleosídeos com açúcar modificado podem transmitir melhor estabilidade da nuclease, maior afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica aos compostos anti- sentido. Em certas modalidades, os nucleosídeos compreendem frações quimicamente modificadas de anel ribofuranose. Exemplos de anéis ribofuranose quimicamente modificados incluem sem limitação, a adição de grupos substituintes (incluindo grupos substituintes 5' e 2', ligação de átomos do anel não germinal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), substituição do átomo de oxigênio do anel ribosila por S, N(R), ou C(R1)(R)2 (R = H, alquila C1-C12 ou um grupo protetor) e combinações destes. Exemplos de açúcares quimicamente modificados incluem nucleosídeo substituído por 2'-F-5'-metila (ver pedido internacional PCT WO 2008/101157, publicado em 8/21/08 para outros nucleosídeos revelados substituídos por 5',2'-bis) ou a substituição do átomo de oxigênio do anel ribosila por S com substituição adicional na posição 2' (ver pedido de patente U.S. publicado US2005-0130923, publicado em 16 de junho de 2005) ou, alternativamente, a substituição 5' de um BNA (ver pedido internacional PCT WO 2007/134181, publicado em 11/22/07, em que o LNA é substituído por, por exemplo, um grupo 5'-metila ou um 5'- vinila).
[00234] Exemplos de nucleosídeos com frações de açúcar modificado incluem, sem limitações, nucleosídeos compreendendo grupos substituintes 5'-vinila, 5'-metila (R ou S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 e 2'-O(CH2)2OCH3. O substituinte na posição 2’ também pode ser selecionado de alila, amino, azido, tio, O-alila, O-alquila C1-C10, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn) e O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), onde cada Rm e Rn é, independentemente, H ou alquila C1-C10 substituída ou não substituída.
[00235] Exemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNAs) incluem, sem limitações, nucleosídeos compreendendo uma ponte entre os átomos 4' e 2' do anel ribosila. Em certas modalidades, os compostos anti-sentido aqui fornecidos incluem um ou mais nucleosídeos BNA, nos quais a ponte compreende uma das fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-C(CH3)2- O-2’ (ver PCT/US2008/068922); 4’-CH(CH3)-O-2’ e 4’- CH(CH2OCH3)--O-2‘ (ver patente U.S. 7.399.845, depositada em 15 de julho de 2008); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (ver PCT/US2008/064591); 4’- CH2-O-N(CH3)-2’ (ver pedido de patente U.S. publicado US2004- 0171570, publicado em 2 de setembro de 2004 ); 4’-CH2-N(R)-O-2’ (ver patente U.S. 7.427.672, depositada em 23 de setembro de 2008); 4’-CH2-C(CH3)-2’e 4’-CH2-C(=CH2)-2’ (ver PCT/US2008/066154); e em que R é, independentemente, H, alquila C1-C12 ou um grupo protetor. Cada um dos BNAs precedentes inclui várias configurações estereoquímicas de açúcar incluindo, por exemplo, α-L-ribofuranose e β-D-ribofuranose (ver pedido internacional PCT PCT/DK98/00393, publicado em 25 de março de 1999 como WO 99/14226).
[00236] Em certas modalidades, os nucleosídeos são modificados por substituição do anel de ribosila por um dos substitutos de açúcar. Tal modificação inclui, sem limitação, substituição do anel ribosila por um sistema de anel substituto (algumas vezes referido como análogos de DNA), tais como um anel morfolino, um anel de cicloexenila, um anel de cicloexila ou um anel de tetraidropiranila, tal como um com uma das fórmulas:
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[00237] Muitos outros sistemas de anel substituto de açúcar biciclo e triciclo são também conhecidos na técnica e podem ser usados para modificar nucleosídeos para incorporação nos compostos anti-sentido (ver, por exemplo, o artigo de revisão: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854). Tais sistemas de anel podem se submeter a várias substituições adicionais para melhorar a atividade.
[00238] Os métodos para as preparações de açúcares modificados são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[00239] Em nucleotídeos com frações de açúcar modificado, as frações de nucleobase (natural, modificada ou uma combinação destas) são mantidas para hibridização com um ácido nucleico alvo apropriado.
[00240] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 compreendem um ou mais nucleotídeos com frações de açúcar modificado. Em certas modalidades, a fração de açúcar modificado é 2’-MOE. Em certas modalidades, os nucleotídeos modificados 2’-MOE são arranjados em um motivo Gap-mer. Nucleobases modificadas
[00241] As modificações ou substituições de nucleobase (ou base) são estruturalmente distinguíveis, ainda que indiferentemente de maneira fucional, das nucleobases de ocorrência natural ou sintéticas não modificadas. Tanto as nucleobases naturais quanto modificadas são capazes de participar da ligação de hidrogênio. Tais modificações de nucleobase podem transferir a estabilidade da nuclease, a afinidade de ligação ou alguma outra propriedade biológica benéfica aos compostos anti-sentido. As nucleobases modificadas incluem nucleobases sintéticas e naturais tal como, por exemplo, 5- metilcitosina (5-me-C). Certas substituições de nucleobase, incluindo substituições de 5-metilcitosina, são particularmente usadas para aumentar a afinidade de ligação de um composto anti-sentido por um ácido nucleico alvo. Por exemplo, as substituições 5-metilcitosina mostraram aumentar a estabilidade do duplex de ácido nucleico em 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. e Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276278).
[00242] Nucleobases modificadas adicionais incluem 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alquil de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados alquila de adenina e guanina, 2-tiouracila, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5- halouracila e citosina, 5-propinil (-C=C-CH3) uracila e citosina e outros derivados alquinila de bases pirimídicas, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8- tioalquil, 8-hidroxila e outras 8-adeninas e guaninas substituídas, 5- halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil e outras 5-uracilas e citosinas substituídas, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina e 8-aza-aenina, 7-deazaguanina e 7- deaza-adenina e 3-deazaguanina e 3-deaza-adenina.
[00243] As frações de base heterocíclica também incluem aquelas nas quais a base púrica ou pirimídica é substituída por outros heterocíclos, por exemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2- aminopiridina e 2-piridona. As nucleobases que são particularmente usadas para aumentar a afinidade de ligação dos compostos anti- sentido incluem 5-pirimidinas substituídas, 6-azapirimidinas e N-2, N-6 e O-6 purinas substituídas, incluindo 2 aminopropiladenina, 5- propiniluracila e 5-propinilcitosina.
[00244] Em certas modalidades, os compostos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 compreendem uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos anti-sentido maiores em intervalo alvejados em um ácido nucleico do fator 11 compreendem uma ou mais nucleobases modificadas. Em certas modalidades, a nucleobase modificada é 5- metilcitosina. Em certas modalidades, cada citosina é uma 5- metilcitosina. Composições e métodos para formular composições farmacêuticas
[00245] Os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser misturados com substâncias ativas farmaceuticamente aceitáveis ou inertes para a preparação de composições ou formulações farmacêuticas. Composições e métodos para a formulação de composições farmacêuticas são dependentes de inúmeros critérios incluindo, mas sem limitação, via de administração, grau da doença ou dose a ser administrada.
[00246] Um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 pode ser utilizado em composições farmacêuticas combinando o composto anti-sentido com um diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado. Um diluente farmaceuticamente aceitável inclui salina tamponada com fosfato (PBS). PBS é um diluente adequado para uso em composições a serem distribuídas parenteralmente. Dessa maneira, em uma modalidade, é empregada nos métodos aqui descritos uma composição farmacêutica compreendendo um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 e um diluente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, o diluente farmaceuticamente aceitável é PBS. Em certas modalidades, o composto anti-sentido é um oligonucleotídeo anti-sentido.
[00247] As composições farmacêuticas compreendendo os compostos anti-sentido incluem qualquer dos sais farmaceuticamente aceitáveis, ésteres, ou sais de tais ésteres, ou qualquer outro oligonucleotídeo que, mediante administração a um animal, incluindo um humano, é capaz de fornecer (direta ou indiretamente) o metabólito biologicamente ativo ou resíduo deste. Dessa maneira, por exemplo, a revelação é também projetada para sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos anti-sentido, pró-medicamentos, sais farmaceuticamente aceitáveis de tais pró-medicamentos e outros bioequivalentes. Os sais farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas sem limitação, sais de sódio e potássio.
[00248] Um pró-medicamento pode incluir a incorporação de nucleosídeos adicionais em uma ou ambas as extremidades de um composto anti-sentido que são clivadas por nucleases endógenas no corpo, para formar o composto ativo anti-sentido. Compostos anti-sentido conjugados
[00249] Os compostos anti-sentido podem ser covalentemente ligados a uma ou mais frações ou conjugados que melhoram a atividade, distribuição celular ou absorção celular dos oligonucleotídeos anti-sentido resultantes. Os grupos de conjugados típicos incluem frações de colesterol e frações lipídicas. Os grupos de conjugados adicionais incluem carboidratos, fosfolipídeos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, coumarinas e corantes.
[00250] Os compostos anti-sentido também podem ser modificados para apresentar um ou mais grupos estabilizadores que são em geral anexados a uma ou ambas as terminações de compostos anti-sentido para melhorar propriedades tal como, por exemplo, estabilidade da nuclease. São incluídos nos grupos estabilizadores as estruturas cap. Estas modificações terminais protegem o composto anti-sentido com o ácido nucleico terminal da exodegradação da nuclease, e podem auxiliar na distribuição e/ou localização em uma célula. O cap pode estar presente na terminação 5' (5'-cap), ou na terminação 3' (3'-cap), ou pode estar presente em ambas as terminações. As estruturas cap são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, caps não básicas de desóxi invertidas. Os grupos estabilizadores 3' e 5' adicionais que podem ser usados para transformar em cap uma ou ambas as extremidades de um composto anti-sentido, para transmitir estabilidade da nuclease, incluem aqueles revelados em WO 03/004602, publicado em 16 de janeiro de 2003. Tratamento com cultura de células e compostos anti-sentido
[00251] Os efeitos de compostos anti-sentido no nível, atividade ou expressão de ácidos nucleicos com fator 11 podem ser testados in vitro em uma variedade de tipos celulares. Os tipos celulares usados para tais análises são disponíveis a partir de vendedores comerciais (por exemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen- Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) e são cultivados de acordo com as instruções do vendedor usando reagentes disponíveis comercialmente (por exemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Os tipos celulares ilustrativos incluem, mas sem limitação, células HepG2, células Hep3B e hepatócitos primários. Teste in vitro de oligonucleotídeos anti-sentido
[00252] São descritos aqui métodos para tratamento de células com oligonucleotídeos anti-sentido, que podem ser modificados de maneira apropriada para tratamento com outros compostos anti-sentido.
[00253] Em geral, as células são tratadas com oligonucleotídeos anti-sentido quando estas atingem aproximadamente 60-80 % confluência na cultura.
[00254] Um reagente comumente usado para introduzir oligonucleotídeos anti-sentido em células cultivadas inclui o reagente de transfecção de lipídeo catiônico LIPOFECTINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os oligonucleotídeos anti-sentido são misturados com LIPOFECTINA em OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração final desejada de oligonucleotídeo anti-sentido e uma concentração de LIPOFECTINA que varia tipicamente de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleotídeo anti-sentido.
[00255] Um outro reagente usado para introduzir oligonucleotídeos anti-sentido em células cultivadas inclui LIPOFECTAMINA (Invitrogen, Carlsbad, CA). O oligonucleotídeo anti-sentido é misturado com LIPOFECTAMINA em meio de soro reduzido de OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para atingir a concentração desejada de oligonucleotídeo anti-sentido e uma concentração de LIPOFECTAMINA que varia tipicamente de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleotídeo anti-sentido.
[00256] Uma outra técnica usada para introduzir oligonucleotídeos anti-sentido em células cultivadas inclui eletroporação.
[00257] As células são tratadas com oligonucleotídeos anti-sentido por métodos de rotina. As células são tipicamente colhidas 16-24 horas após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido, no qual os níveis de tempo de RNA ou de proteína dos ácidos nucleicos alvos são medidos por métodos conhecidos na técnica e qui descritos. Em geral, quando os tratamentos são realizados em réplicas múltiplas, os dados são apresentados como a média dos tratamentos em réplica.
[00258] A concentração do oligonucleotídeo anti-sentido usada varia de linhagem celular para linhagem celular. Os métodos para determinar a concentração ideal de oligonucleotídeo anti-sentido para uma linhagem celular particular são bem conhecidos na técnica. Os oligonucleotídeos anti-sentido são usados tipicamente em concentrações que variam de 1 nM a 300 nM quando transfectados com LIPOFECTAMINA. Os oligonucleotídeos anti-sentido são usados em concentrações maiores que variam de 625 a 20.000 nM, quando transfectados usando eletroporação. Isolamento de RNA
[00259] A análise de RNA pode ser realizada no RNA celular total ou poli(A)+ RNAm. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. O RNA é preparado usando métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acordo com os protocolos recomendados pelo fabricante. Análise de inibição de níveis ou expressão de alvo
[00260] A inibição de níveis ou expressão de um ácido nucleico do fator 11 pode ser ensaiada em uma variedade de maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, os níveis de ácido nucleico alvo podem ser quantificados, por exemplo, por análise de Northern blot, reação em cadeia da polimerase competitiva (PCR), ou PCR em tempo real quantitativa. A análise de RNA pode ser realizada em RNA celular total ou poli(A)+ RNAm. Os métodos de isolamento de RNA são bem conhecidos na técnica. A análise de Northern blot análise também é de rotina na técnica. PCR em tempo real quantitativa pode ser realizada convenientemente usando o sistema de detecção de sequência ABI PRISM 7600, 7700 ou 7900, disponível comercialmente pela PE- Applied Biosystems, Foster City, CA e usado de acordo com as instruções do fabricante. Análise de PCR em tempo real quantitativa dos níveis de RNA alvo
[00261] A quantificação dos níveis de RNA alvo pode ser realizada por PCR em tempo real quantitativa usando o sistema de detecção de sequência ABI PRISM 7600, 7700 ou 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os métodos de PCR em tempo real quantitativa são bem conhecidos na técnica.
[00262] Antes da PCR em tempo real, o RNA isolado é submetido a uma reação com transcriptase reversa (RT), que produz DNA complementar (DNAc) que é então usado como o substrato para a amplificação por PCR em tempo real. As reações de RT e PCR em tempo real são realizadas sequencialmente na mesma amostra de maneira igual. Os reagentes de RT e PCR em tempo real são obtidos da Invitrogen (Carlsbad, CA). As reações de RT-PCR em tempo real são realizadas por métodos bem conhecidos pelos versados na técnica.
[00263] As quantidades de gene (ou RNA) alvo obtidas por PCR em tempo real são normalizadas usando tanto o nível de expressão de um gene cuja expressão é constante, tal como ciclofilina A, quanto quantificando o RNA total usando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). A expressão de ciclofilina A é quantificada por PCR em tempo real, sendo corrida simultaneamente com o alvo, em multiplex, ou separadamente. O RNA total é quantificado usando o reagente de quantificação de RNA RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OU). Os métodos de quantificação de RNA por RIBOGREEN são preceituados em Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Um instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) é usado para medir a fluorescência de RIBOGREEN.
[00264] Sondas e oligonucleotídeos iniciadores são desenhados para hibridizar um ácido nucleico do fator 11. Os métodos para desenhar sondas e oligonucleotídeos iniciadores de PCR em tempo real são bem conhecidos na técnica, e podem incluir o uso de software, tal como o software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA). Análise dos níveis de proteína
[00265] A inibição anti-sentido de ácidos nucleicos de fator 11 pode ser avaliada medindo os níveis de proteína do fator 11. Os níveis de proteína de fator 11 podem ser avaliados ou quantificados em uma variedade de maneiras bem conhecidas na técnica, tais como imunoprecipitação, análise por Western blot (immunoblotting), ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaios quantitativos de proteína, ensaios de atividade protéica (por exemplo, ensaios dede atividade da caspase), imuno-histoquímica, imunocitoquímica ou classificação de célula ativada por fluorescência (FACS). Os anticorpos direcionados a um alvo podem ser identificados e obtidos de uma variedade de fontes, tais como o catálogo MSRS de anticorpos (Aerie Corporation, Birmingham, MI), ou podem ser preparados por meio de métodos de geração convencionais de anticorpo monoclonal ou policlonal bem conhecidos na técnica. Os anticorpos usados para a detecção de fator 11 de camundongo, rato, macaco e humano são disponíveis comercialmente. Teste in vivo de compostos anti-sentido
[00266] Os compostos anti-sentido, por exemplo, oligonucleotídeos anti-sentido, são testados em animais para garantir sua capacidade de inibir a expressão de fator 11 e produzir mudanças fenotípicas, tais como aPTT prolongado, período prolongado de aPTT junto com um PT normal, menor quantidade de fator plaquetário (PF-4), e formação reduzida de trombo ou aumento do tempo para a formação de trombo. O teste pode ser realizado em animais normais, ou em modelos experimentais de doença. Para a administração em animais, os oligonucleotídeos anti-sentido são formulados em um diluente farmaceuticamente aceitável, tal como salina tamponada com fosfato. A administração inclui vias de administração parenterais, tais como intraperitoneal, intravenosa e subcutânea. O cálculo de dosagem de oligonucleotídeo anti-sentido e frequência de dose está nas capacidades dos versados na técnica e, depende de fatores tais como via de administração e peso corporal do animal. Após um período de tratamento com oligonucleotídeos anti-sentido, o RNA é isolado do tecido hepático e as mudanças na expressão do ácido nucleico do fator 11 são medidas. As mudanças nos níveis de proteína do fator 11 são também medidas usando um ensaio de geração de trombina. Além do mais, os efeitos nos tempos de coagulação, por exemplo, PT e aPTT, são determinados usando plasma de animais tratados. Tolerabilidade
[00267] Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos exibem efeitos colaterais mínimos. Os efeitos colaterais incluem respostas à administração do composto anti-sentido, que são tipicamente não relacionados com o alvejamento do fator 11, tal como uma resposta inflamatória no animal. Em certas modalidades, os compostos são bem tolerados pelo animal. Maior tolerabilidade pode depender de inúmeros fatores, incluindo, mas sem limitação, a sequência de nucleotídeos do composto anti-sentido, modificações químicas nos nucleotídeos, o motivo particular de nucleosídeos modificados e não modificados no composto anti-sentido, ou combinações destes. A tolerabilidade pode ser determinada por inúmeros fatores. Tais fatores incluem peso corporal, peso do órgão, função hepática, função renal, contagem de plaqueta, contagem de célula branca do sangue.
[00268] Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram efeito mínimo no peso do órgão. Em certas modalidades, os compostos demonstram menos de um aumento de 7 vezes, 6 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou nenhum no peso do baço e/ou fígado.
[00269] Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram efeito mínimo na função hepática. Os fatores para a avaliação da função hepática incluem níveis de ALT, níveis de AST, níveis de bilirrubina do plasma e níveis de albumina no plasma. Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento significativo de 7 vezes, menos de um de 6 vezes, menos de um de 5 vezes, menos de um de 4 vezes, menos de um de 3 vezes ou menos de um de 2 vezes ou nenhum em ALT ou AST. Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento significativo de 3 vezes, menos de um de 2 vezes ou nenhum nos níveis de bilirrubina no plasma.
[00270] Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram efeito mínimo na função renal. Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento significativo de 3 vezes, menos de um de 2 vezes ou nenhum nas plasma concentrações plasmáticas de nitrogênio-uréia no sangue (BUN). Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento significativo de 6 vezes, 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou nenhum na razão de proteinúria para creatinina.
[00271] Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram efeito mínimo nos fatores hematológicos. Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento de 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % ou 5 % na contagem de plaquetas. Em certas modalidades, os compostos aqui fornecidos demonstram menos de um aumento significativo de 4 vezes, menos de um de 3 vezes, menos de um de 2 vezes ou nenhum na contagem de monócito.
[00272] Em certas modalidades, os compostos exibem adicionalmente farmacocinética favorável. Em certas modalidades, os compostos anti-sentido exibem meias vidas relativamente altas nos fluidos ou tecidos biológicos relevantes.
[00273] Em certas modalidades, os compostos ou composições exibem adicionalmente viscosidade favorável. Em certas modalidades, a viscosidade do composto ou composição é não mais que 40cP em uma concentração de 165-185 mg/mL.
[00274] Em outras modalidades, os compostos exibem combinações das características anteriores e reduzem a expressão do RNAm do fator 11 em um modelo animal com alta eficiência. Certas indicações
[00275] Em certas modalidades, a invenção fornece métodos de tratar um indivíduo compreendendo administrar uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em certas modalidades, o indivíduo apresenta uma complicação tromboembolítica. Em certas modalidades, o indivíduo está em risco de um distúrbio de coagulação sanguínea, incluindo, mas sem limitação, infarto, trombose, embolia, tromboembolia tais como trombose venosa profunda, embolia pulmonar, infarto do miocárdio e acidente vascular. Isto inclui indivíduos com um problema, doença ou distúrbio adquirido que leva a um risco de trombose, por exemplo, cirurgia, câncer, imobilidade, sepse, aterosclerose por fibrilação atrial, bem como predisposição genética, por exemplo, síndrome anti- fosfolipídica e a condição dominante autossômica, o fator V de Leiden. Em certas modalidades, o indivíduo foi identificado como aquele que precisa de terapia de anticoagulação. Exemplos de tais indivíduos incluem, mas sem limitação, aqueles que se submetem à principal cirurgia ortopédica (por exemplo, substituição de costela/joelho ou cirugia de fratura de costela) e pacientes que precisam de tratamento crônico, tais como aqueles que sofrem de fibrilação arterial para prevenir acidente vascular. Em certas modalidades, a invenção fornece métodos para reduzir profilaticamente a expressão do fator 11 em um indivíduo. Certas modalidades incluem tratar um indivíduo que necessita deste, administrando a um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11.
[00276] Em uma modalidade, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 é acompanhada pelo monitoramento dos níveis do fator 11 no soro de um indivíduo para determinar a resposta de um indivíduo à administração do composto anti-sentido. Uma resposta do indivíduo à administração do composto anti-sentido é usada pelo médico para determinar a quantidade e duração da intervenção terapêutica.
[00277] Em certas modalidades, a administração de um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 resulta na redução da expressão do fator 11 em pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %, ou uma faixa definida por qualquer de dois destes valores. Em certas modalidades, a administração de um composto anti-sentido alvejado em um ácido nucleico do fator 11 resulta em uma mudança em uma medida de coagulação sanguínea, da maneira medida por um teste padrão, por exemplo, mas sem limitação, teste de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), teste de tempo de protrombina (PT), tempo de trombina (TCT), tempo de hemorragia ou D-dímero. Em certas modalidades, a administração de um composto anti-sentido do fator 11 aumenta a medida em pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %, ou uma faixa definida por qualquer de dois destes valores. Em algumas modalidades, a administração de um composto anti-sentido do fator 11 diminui a medida em pelo menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 %, ou uma faixa definida por qualquer de dois destes valores.
[00278] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um composto anti-sentido alvejado pelo fator 11 são usadas para a preparação de um medicamento para tratar um paciente que sofre ou é susceptível a uma complicação tromboembolítica. Certas terapias de combinação
[00279] Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com um ou mais outros agentes farmacêuticos. Em certas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos como estes são projetados para tratar a mesma doença, distúrbio ou condição assim como a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em certas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos como estes são projetados para tratar uma doença, distúrbio ou condição diferentes, assim como a uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em certas modalidades, um ou mais outros agentes farmacêuticos como estes são projetados para tratar um efeito colateral indesejado de uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co-administradas com um outro agente farmacêutico para tratar um efeito indesejado deste outro agente farmacêutico. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co- administradas com um outro agente farmacêutico para produzir um efeito de combinação. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção são co- administradas com um outro agente farmacêutico para produzir um efeito sinergístico.
[00280] Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados ao mesmo tempo. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são administrados em períodos diferentes. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados juntos em uma única formulação. Em certas modalidades, uma ou mais composições farmacêuticas da presente invenção e um ou mais outros agentes farmacêuticos são preparados separadamente.
[00281] Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem agentes anti-coagulantes ou anti- plaquetários. Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem inibidores de NSAID/Ciclo-oxigenase, tal como aspirina. Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem inibidores do receptor adenosina difosfato (ADP), tais como clopidogrel (PLAVIX) e ticlopidina (TICLID). Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co- administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem inibidores de fosfodiesterase, tal como cilostazol (PLETAL). Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, inibidores de glicoproteína IIB/IIIA, tais como abciximab (REOPRO), eptifibatida (INTEGRILINA), tirofiban (AGGRASTAT) e defibrotida. Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem inibidores de reabsorção de adenosina, tal como dipiridamol (PERSANTINA). Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co- administrados com uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas sem limitação, varfarina (e coumarinas relacionadas), heparina, inibidores diretos de trombina (tais como lepirudina, bivalirudina), apixaban, LOVENOX, e compostos moleculares pequenos que interferem diretamente com a ação enzimática de fatores de coagulação particulares (por exemplo, rivaroxaban, que interfere com o fator Xa). Em certas modalidades, os agentes farmacêuticos que podem ser co-administrados com um inibidor específico do fator 11 da presente invenção incluem, mas sem limitação, um inibidor adicional do fator 11. Em certas modalidades, o agente anti-coagulante ou anti-plaquetário é administrado antes da administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades, o agente anti-coagulante ou anti-plaquetário é administrado após a administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades o agente anti- coagulante ou anti-plaquetário é administrado ao mesmo tempo que uma composição farmacêutica da presente invenção. Em certas modalidades a dose de um agente anti-coagulante ou anti-plaquetário co-administrado é a mesma dose que seria administrada se o agente anti-coagulante ou anti-plaquetário fosse administrado sozinho. Em certas modalidades a dose de um agente anti-coagulante ou anti- plaquetário co-administrado é menor que a dose que seria administrada se o agente anti-coagulante ou anti-plaquetário fosse administrado sozinho. Em certas modalidades a dose de um agente anti-coagulante ou anti-plaquetário co-administrado é maior que a dose que seria administrada se o agente anti-coagulante ou anti- plaquetário fosse administrado sozinho.
[00282] Em certas modalidades, a co-administração de um segundo composto melhora o efeito anticoagulante de um primeiro composto, de maneira tal que co-administração dos compostos resulte em um efeito anticoagulante que é maior que o efeito de administrar o primeiro composto sozinho. Em outras modalidades, a co- administração resulta em efeitos anticoagulantes que são aditivos dos efeitos dos compostos quando administrados sozinhos. Em certas modalidades, a co-administração resulta em efeitos anticoagulantes que são supra-aditivos dos efeitos dos compostos quando administrados sozinhos. Em certas modalidades, a co-administração de um segundo composto aumenta a atividade anti-trombótica sem aumentar o risco de hemorragia. Em certas modalidades, o primeiro composto é um composto anti-sentido. Em certas modalidades, o segundo composto é um composto anti-sentido.
[00283] Em certas modalidades, um antídoto é administrado a qualquer momento após a administração de um inibidor específico do fator 11. Em certas modalidades, um antídoto é administrado a qualquer momento após a administração de um oligonucleotídeo anti- sentido que alveja o fator 11. Em certas modalidades, o antídoto é administrado minutos, horas, dias, semanas ou meses após a administração de um composto anti-sentido que alveja o fator 11. Em certas modalidades, o antídoto é um complementar (por exemplo, a fita sentido) ao composto anti-sentido que alveja o fator 11. Em certas modalidades, o antídoto é uma proteína do fator 7, do fator 7a, do fator 11, ou do fator 11a. Em certas modalidades, a proteína do fator 7, do fator 7a, do fator 11 ou do fator 11a é uma proteína do fator 7 humano, fator 7a humano, fator 11 humano ou fator 11a humano. Em certas modalidades, a proteína do fator 7 é NOVOSEVEN. Certas terapias anti-plaquetárias co-administradas
[00284] Em certas modalidades, os inibidores do fator 11 são combinados com terapias anti-plaquetárias. Em certas modalidades, a administração de um inibidor do fator 11 em combinação com uma terapia anti-plaquetária resulta em pouco ou nenhum aumento apreciável ou detectável no risco de hemorragia, comparado à terapia antiplaquetária sozinha. Em certas modalidades, o perfil de risco ou indicações de risco não mudam com relação à terapia anti-plaquetária sozinha.
[00285] A combinação de terapia anti-plaquetária e anti-coagulante é usada na prática clínica mais frequentemente em pacientes diagnosticados com, por exemplo, tromboembolia, fibrilação atrial, um distúrbio de válvula cardíaca, doença de válvula cardíaca, acidente vascular, CAD e em pacientes com uma válvula mecânica. O benefício da terapia dupla diz respeito ao provável efeito aditivo de suprimir tanto as atividades plaquetárias quanto as do fator de coagulação. O risco da terapia dupla é o potencial para maior risco de hemorragia (Dowd, M. Plenary Sessions/Trombose Research 123 (2008)).
[00286] Combinações prévias de terapia anti-plaquetária e anti- coagulante terem mostraram aumento do risco de hemorragia comparadas com a terapia anti-coagulante ou anti-plaquetária sozinha. Tais combinações incluem, inibidores de FXa (por exemplo, apixiban e rivaroxaban) com receptores de ADP/inibidores de P2Y12 (Tienopiridinas tal como clopidogrel, também conhecida como PLAVIX) e NSAIDs (por exemplo, aspirina e naproxen) (Kubitza, D. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 63:4 (2006); Wong, P.C. et al. Journal fo Thrombosis and Haemostasis 6 (2008); FDA Advisory Committee Briefing Document for New Drug Application 22-406 (2009)). Por exemplo, Wong relata que a adição de certas doses de apixaban em aspirina e em aspirina adicionada de clopidogrel produziu um aumento significativo no tempo de hemorragia comparado com aspirina sozinha e aspirina adicionada de clopidogrel. Kubitza reporta que a combinação da administração de rivaroxaban e naproxeno aumentou significativamente o tempo de hemorragia com relação à naproxeno sozinho. EXEMPLOS Revelação não limitante e incorporação por referência
[00287] Embora certos compostos, composições e métodos aqui descritos tenham sido descritos com especificidade de acordo com certas modalidades, os exemplos a seguir servem apenas para ilustrar os compostos aqui descritos e não pretende-se que sejam limitantes dos mesmos. Cada uma das referências citadas no presente pedido é aqui incorporada pela referência na sua íntegra. Exemplo 1: Inibição anti-sentido de fator 11 humano em células HepG2
[00288] Os oligonucleotídeos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 foram testados com relação a seus efeitos no RNAm do fator 11 in vitro. As células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10.000 células por poço foram transfectadas usando reagente lipofectina com oligonucleotídeo anti-sentido 75 nM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas.
[00289] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos nas tabelas 1 e 2 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE. Os Gap-mers apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. O “sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 1 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3) e cada Gap-mer listado na tabela 2 é alvejado em SEQ ID NO: 2 (acesso ao GENBANK No. NT_022792.17, truncado de 19598000 a 19624000). Tabela 1
[00290] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos com asas 5-10-5 MOE e intervalo desóxi alvejado em SEQ ID NO: 1
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Tabela 2
[00291] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos com asas 5-10-5 MOE e intervalo desóxi alvejado em SEQ ID NO: 2
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Exemplo 2: Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2
[00292] Doze Gap-mers, que exibem em 8 porcento ou mais a inibição de fator 11 humano in vitro, foram testados em várias doses em células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando reagente lipofectina com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 9,375nM, 18,75 nM, 37,5 nM, 75 nM e 150 nM, da maneira especificada na tabela 3. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 (sequência sentido: CAGCCTGGAGCATCGTAACA, aqui incorporada como SEQ ID NO: 3; sequência reversa: TTTATCGAGCTTCGTTATTCTGGTT, aqui incorporada como SEQ ID NO: 4; sequência da sonda: TTGTCTACTGAAGCACACCCAAACAGGGAX, aqui incorporada como SEQ ID NO: 5) foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 3, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 3
[00293] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2
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Exemplo 3: Inibição anti-sentido de fator 11 humano em células HepG2 por oligonucleotídeos projetados por micro caminhada
[00294] Gap-mers adicionais foram projetados com base nos Gap- mers apresentados na tabela 3. Estes Gap-mers foram desenhados criando Gap-mers deslocados levemente à montante e à jusante (isto é, “micro caminhada”) dos Gap-mers originais da tabela 3. Os Gap- mers foram também criados com vários motivos, por exemplo, 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. Estes Gap-mers foram testados in vitro. As células HepG2 cultivadas em uma densidade de 10.000 células por poço foram transfectadas usando reagente lipofectina com oligonucleotídeo anti-sentido 75 nM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas.
[00295] Os dados de inibição in vitro para os Gap-mers designados por micro caminhada foram então comparados com os dados de inibição in vitro para os Gap-mers da tabela 3, da maneira indicada nas tabelas 4, 5, 6, 7, e 8. Os oligonucleotídeos são exibidos de acordo com a região no RNAm humano (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3) na qual eles foram mapeados.
[00296] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 4 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. Os primeiros Gap-mers listados na tabela 4 são os Gap-mers originais (ver tabela 3), a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada e são designados por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 3-14-3 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 14 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 3 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 213-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 13 2’- desoxinucleotídeos. O intervalo central é flanqueado na extremidade 5’ com uma asa compreendendo 2 nucleotídeos e na extremidade 3’ com uma asa compreendendo 5 nucleotídeos. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3 e 2-13-5), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 4 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3).
[00297] Da maneira mostrada na tabela 4, todos os Gap-mers 5-105 MOE, Gap-mers 3-14-3 MOE e Gap-mers 2-13-5 MOE alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 656 e que terminam no sítio de parada alvo 704 (isto é, nucleobases 656-704) de SEQ ID NO: 1, exibem pelo menos 20 % de inibição de RNAm do fator 11. Muitos dos Gap-mers exibem pelo menos 60 % de inibição. Vários dos Gap- mers exibem pelo menos 80 % de inibição, incluindo os números ISIS: 416806, 416809, 416811, 416814, 416821, 416825, 416826, 416827, 416828, 416868, 416869, 416878, 416879, 416881, 416883, 416890, 416891, 416892, 416893, 416894, 416895, 416896, 416945, 416946, 416969, 416970, 416971, 416972, 416973, 412203, 413467, 413468, e 413469. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 90 % de inibição: 412203, 413467, 416825, 416826, 416827, 416868, 416878, 416879, 416892, 416893, 416895, 416896, 416945, 416972, e 416973. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 95 % de inibição: 416878, 416892, 416895, e 416896. Tabela 4
[00298] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados nas nucleobases 656 a 704 de SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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[00299] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 5 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. O primeiro Gap-mer listado na tabela 5 é o Gap-mer original (ver tabela 3), a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada, e é designado por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 314-3 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 14 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 3 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 213-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 13 2’- desoxinucleotídeos. O intervalo central é flanqueado na extremidade 5’ com uma asa compreendendo 2 nucleotídeos e na extremidade 3’ com uma asa compreendendo 5 nucleotídeos. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3, e 2-13-5), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 5 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3).
[00300] Da maneira mostrada na tabela 5, todos os Gap-mers 5-105 MOE, Gap-mers 3-14-3 MOE, e Gap-mers 2-13-5 MOE alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 738 e que terminam no sítio de parada alvo 762 (isto é, nucleobases 738-762) de SEQ ID NO: 1, exibem pelo menos 45 % de inibição de RNAm do fator 11. A maioria dos Gap-mers exibe pelo menos 60 % de inibição. Vários dos Gap-mers exibem pelo menos 80 % de inibição, incluindo os números ISIS: 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977, e 416980. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 90 % de inibição: 412206, 416831, e 416900. Tabela 5
[00301] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados nas nucleobases 738 a 762 de SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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[00302] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 6 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. Os primeiros Gap-mers listados na tabela 6 são os Gap-mers originais (ver tabela 3), a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada e são designados por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 3-14-3 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 14 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 3 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 213-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 13 2’- desoxinucleotídeos. O intervalo central é flanqueado na extremidade 5’ com uma asa compreendendo 2 nucleotídeos e na extremidade 3’ com uma asa compreendendo 5 nucleotídeos. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3, e 2-13-5), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 6 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3).
[00303] Da maneira mostrada na tabela 6, todos os Gap-mers 5-105 MOE, Gap-mers 3-14-3 MOE, e Gap-mers 2-13-5 MOE alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 1.018 e que terminam no sítio de parada alvo 1.042 (isto é, nucleobases 1.018-1.042) de SEQ ID NO: 1, exibem pelo menos 80 % de inibição de RNAm do fator 11. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 90 % de inibição: 413474, 416837, 416838, 416904, 416907, e 416908. Tabela 6
[00304] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados nas nucleobases 1.018 a 1.042 de SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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[00305] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 7 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. O primeiro Gap-mer listado na tabela 7 é o Gap-mer original (ver tabela 3), a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada, e é designado por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 314-3 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 14 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 3 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 213-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 13 2’- desoxinucleotídeos. O intervalo central é flanqueado na extremidade 5’ com uma asa compreendendo 2 nucleotídeos e na extremidade 3’ com uma asa compreendendo 5 nucleotídeos. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3, e 2-13-5), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 7 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3).
[00306] Da maneira mostrada na tabela 7, todos os Gap-mers 5-105 MOE, Gap-mers 3-14-3 MOE, e Gap-mers 2-13-5 MOE alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 1.062 e que terminam no sítio de parada alvo 1.091 (isto é, nucleobases 1.062-1.091) de SEQ ID NO: 1, exibem pelo menos 20 % de inibição de RNAm do fator 11. Muitos dos Gap-mers exibem pelo menos 50 % de inibição, incluindo: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 80 % de inibição: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993, e 416994. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 90 % de inibição: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917, e 416993. Tabela 7
[00307] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados nas nucleobases 1.062 a 1.091 de SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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[00308] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 8 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE e 2-13-5 MOE. Os primeiros Gap-mers listados na tabela 8 são os Gap-mers originais (ver tabela 3), a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada e são designados por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 3-14-3 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 14 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 3 nucleotídeos cada. Os Gap-mers 213-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 13 2’- desoxinucleotídeos. O intervalo central é flanqueado na extremidade 5’ com uma asa compreendendo 2 nucleotídeos e na extremidade 3’ com uma asa compreendendo 5 nucleotídeos. Para cada um dos motivos (5-10-5, 3-14-3, e 2-13-5), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Cada Gap-mer listado na tabela 8 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3).
[00309] Da maneira mostrada na tabela 8, todos os Gap-mers 5-105 MOE, Gap-mers 3-14-3 MOE, e Gap-mers 2-13-5 MOE alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 1.275 e que terminam no sítio de parada alvo 1.318 (isto é, nucleobases 1.275-1.318) de SEQ ID NO: 1, exibem pelo menos 70 % de inibição de RNAm do fator 11. Muitos dos Gap-mers exibem pelo menos 80 % de inibição, incluindo: 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019, e 417020. Os números ISIS a seguir exibiram pelo menos 90 % de inibição: 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854, e 416859. Tabela 8
[00310] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados nas nucleobases 1.275 a 1.318 de SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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Exemplo 4: Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2
[00311] Os Gap-mers do exemplo 3 (ver tabelas 4, 5, 6, 7, e 8), que exibem inibição in vitro de fator 11 humano, foram testados em várias doses em células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando reagente lipofectina com concentrações de oligonucleotídeo anti- sentido 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM e 75 nM, da maneira especificada na tabela 9. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 9, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti- sentido. Tabela 9
[00312] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por meio da transfecção de oligonucleotídeos com lipofectina
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[00313] Os Gap-mers foram também transfectados por meio de eletroporação e sua inibição dose dependente de RNAm do fator 11 humano foi medida. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas por meio de eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 0,7 μM, 2,2 μM, 6,7 μM e 20 μM, da maneira especificada na tabela 10. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 10, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 10
[00314] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por meio da transfecção de oligonucleotídeos com eletroporação
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Exemplo 5: Seleção e confirmação de inibição anti-sentido eficaz dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2
[00315] Gap-mers que exibem inibição dose-dependente significativa de fator 11 humano no exemplo 4 foram selecionados e testados em várias doses em células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células por poço e transfectadas usando reagente lipofectina com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 2,34 nM, 4,69 nM, 9,375 nM, 18,75 nM, 37,5 nM e 75 nM, da maneira especificada na tabela 11. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e níveis de RNAm do fator 11 humano foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11 humano, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 11, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido, comparados com o controle. Tabela 11
[00316] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por meio da transfecção de oligonucleotídeos com lipofectina
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[00317] Os Gap-mers foram também transfectados por meio de eletroporação e sua inibição dose dependente de RNAm do fator 11 humano foi medida. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas por meio de eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 625 nM, 1.250 nM, 2.500 nM, 5.000 nM, 10.000 nM e 20.000 nM, da maneira especificada na tabela 12. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e níveis de RNAm do fator 11 humano foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11 humano, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 12, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido comparados com o controle. Tabela 12
[00318] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por meio da transfecção de oligonucleotídeos com eletroporação
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Exemplo 6: Seleção e confirmação de inibição anti-sentido dose- dependente eficaz de fator 11 humano em hepatócitos principais de ciano
[00319] Gap-mers do exemplo 4 que exibem significativa inibição in vitro dose dependente de fator 11 humano também foram testados em várias doses em hepatócitos principais de ciano. As células foram plaqueadas em uma densidade de 35.000 células por poço e transfectadas por meio de eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 0,74 nM, 2,2 nM, 6,7 nM, 20 nM, 60 nM e 180 nM, da maneira especificada na tabela 13. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e níveis de RNAm do fator 11 humano foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11 humano, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 13, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido comparados com o controle. Tabela 13
[00320] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em hepatócitos principais de ciano
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Exemplo 7: Seleção e confirmação de inibição anti-sentido dose dependente eficaz de fator 11 humano em células HepB3 por Gap- mers
[00321] Os Gap-mers que exibem inibição de fator 11 humano in vitro no exemplo 4 foram testados em várias doses em células HepB3 humanas. As células foram plaqueadas em uma densidade de 4.000 células por poço e transfectadas usando reagente lipofectina com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 2,3 nM, 4,7 nM, 9,4 nM, 18,75 nM, 37,5 nM e 75 nM, da maneira especificada na tabela 14. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e níveis de RNAm do fator 11 humano foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 14, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido comparados com o controle. Tabela 14
[00322] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepB3
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[00323] Os Gap-mers foram também transfec ados por meio de eletroporação e sua inibição dose dependente de RNAm do fator 11 humano foi medida. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas por meio de eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 41,15 nM, 123,457 nM, 370,37 nM, 1.111,11 nM, 3.333,33 nM e 10.000 nM, da maneira especificada na tabela 15. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e níveis de RNAm do fator 11 humano foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11 humano, com relação às células controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 15, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido comparados com o controle. Tabela 15
[00324] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepB3
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Exemplo 8: Inibição anti-sentido de fator 11 de murino em hepatócitos primários de camundongo
[00325] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos que alvejam o fator 11 de murino foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE que alvejam o fator 11 de murino (acesso ao GENBANK No. NM_028066.1, aqui incorporado como SEQ ID NO: 6). Os Gap-mers apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3') por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Cada nucleotídeo em cada segmento em asa apresenta uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada gaper são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. Os oligonucleotídeos anti-sentido foram avaliados por sua capacidade de reduzir RNAm do fator 11 de murino em hepatócitos primários de camundongo.
[00326] Os hepatócitos primários de camundongo foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM e 200 nM por um período de aproximadamente 24 horas. O RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 de murino foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do fator 11 de murino RTS 2898 (sequência sentido ACATGACAGGCGCGATCTCT, aqui incorporada como SEQ ID NO: 7; sequência reversa TCTAGGTTCACGTACACATCTTTGC, aqui incorporada como SEQ ID NO: 8; sequência da sonda TTCCTTCAAGCAATGCCCTCAGCAATX, aqui incorporada como SEQ ID NO: 9) foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total da maneira medida por RIBOGREEN. Vários dos oligonucleotídeos anti-sentido de murino reduziram os níveis do RNAm do fator 11 de uma maneira dependente da dose. Exemplo 9: Inibição anti-sentido com reação cruzada de fator 11 de murino em hepatócitos primários de camundongo
[00327] Os oligonucleotídeos anti-sentido alvejados em um ácido nucleico do fator 11 de murino foram testados com relação a seus efeitos no RNAm do fator 11 in vitro. Os hepatócitos primários de camundongo cultivados em uma densidade de 10.000 células por poço foram tratados com oligonucleotídeo anti-sentido 100 nM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 de camundongo foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas.
[00328] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos nas tabelas 16 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE. Os Gap-mers apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de 10 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo 5 nucleotídeos cada. Cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo de camundongo” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado. “Sítio de parada alvo de camundongo” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado. Todos os oligonucleotídeos de camundongos listados mostram reatividade cruzada entre o RNAm do fator 11 de camundongo (acesso ao GENBANK No. NM_028066.1), aqui incorporado como SEQ ID NO: 6 e o RNAm do fator 11 humano (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3), aqui incorporado como SEQ ID NO: 1. “Sítio inicial alvo humano” indica o principal nucleotídeo 5’ no RNAm humano (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3) no qual o oligonucleotídeo anti-sentido é alvejado. “Sítio de parada alvo humano” indica o principal nucleotídeo 3’ no RNAm humano (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3) no qual o oligonucleotídeo anti- sentido é alvejado. “Número de incompatibilidades” indica as incompatibilidades entre o oligonucleotídeo de camundongo e a sequência RNAm de humano. Tabela 16
[00329] Inibição de os níveis do RNAm do fator 11 de camundongo por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos com asas 5-10-5 MOE e intervalo desóxi alvejado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6
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Exemplo 10: Inibição anti-sentido in vivo de fator 11 de murino
[00330] Vários oligonucleotídeos anti-sentido alvejados em RNAm do fator 11 de murino (acesso ao GENBANK No. NM_028066.1, aqui incorporado como SEQ ID NO: 6) que mostram inibição dose- dependente estatisticamente significativa foram avaliados in vivo. Camundongos BALB/c foram tratados com ISIS 404057 (TCCTGGCATTCTCGAGCATT, sítio inicial alvo 487, aqui incorporado como SEQ ID NO: 10) e ISIS 404071 (TGGTAATCCACTTTCAGAGG, sítio inicial alvo 869, aqui incorporado como SEQ ID NO: 11). Tratamento
[00331] Os camundongos BALB/c foram injetados com 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, ou 50 mg/kg de ISIS 404057 ou ISIS 404071 duas vezes por semana, por 3 semanas. Um grupo controle de camundongos foi injetado com salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes por semana, por 3 semanas. Os camundongos foram sacrificados 5 dias após receberem a última dose. Todo o fígado foi coletado para análise do RNA e o plasma foi coletado para análise de coagulação (PT e aPTT) e análise de proteína. Análise de RNA
[00332] O RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11. Da maneira mostrada na tabela 17, os oligonucleotídeos anti-sentido atingiram redução dose-dependente de fator 11 de murino com relação ao controle com PBS. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle. Tabela 17
[00333] Inibição anti-sentido dose-dependente de RNAm do fator 11 de murino em camundongos BALB/c
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Ensaio PT e aPTT
[00334] O tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) foram medidos usando plasma pobre em plaquetas (PPP) de camundongos tratados com ISIS 404057 e ISIS 404071. Os valores PT e aPTT fornecidos na tabela 18 são relatados como valores de razão normalizada internacional (INR). Os valores INR para PT e aPTT foram determinados dividindo o valor PT ou aPTT para cada grupo experimental (isto é, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, e 50 mg/kg de tratamento com ISIS 404057 ou ISIS 404071) pelo PT ou aPTT para o grupo tratado com PBS. Esta razão foi então originada com relação à energia do índice de sensibilidade internacional (ISI) do fator do tecido usado. Da maneira mostrada na tabela 18, PT não se prolongou significativamente em camundongos tratados com ISIS 404057 ou ISIS 404071. Entretanto, aPTT prolongou-se de uma maneira dependente da dose em camundongos tratados com ISIS 404057 e ISIS 404071. Estes dados sugerem que a redução anti- sentido do fator 11 afeta a via de ativação de contato, mas não a via extrínseca de coagulação do sangue. Tabela 18
[00335] Efeito de ISIS 404071 e 404057 em PT e aPTT em camundongos BALB/c
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Análise protéica
[00336] A pro-enzima do fator 11 do plasma de camundongos tratados com ISIS 404071 foi medida usando um ensaio de F11 com base no tempo de coagulação. Os tempos de coagulação foram determinados em duplicata com um instrumento de coagulação semi- automatizado ST4 (Diagnostica Stago, NJ). Trinta μL de amostra de plasma citratada diluída 1/20 em tampão HEPES-NaCl com BSA foram incubados com 30 μL de reagente aPTT (Reagente do fator plaquetário 3 adicionado de ativador particulado) e 30 μL de plasma citratado deficiente de fator 11 (congênito humano, George King BioMedical Inc.) a 37°C para iniciar a coagulação. Os resultados foram interpolados em uma curva padrão de plasma de murino controle citratado diluído em série.
[00337] Da maneira mostrada na tabela 19, o tratamento com ISIS 404071 resultou em uma redução dose-dependente significativa de proteína do fator 11. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Tabela 19
[00338] Inibição dose-dependente de proteína do fator 11 de murino por ISIS 404071 em camundongos BALB/c
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Exemplo 11: Efeito in vivo da inibição anti-sentido do fator 11 de murino no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3 (VT) comparado à varfarina Tratamento
[00339] ISIS 404071 e varfarina (COUMADIN) foram avaliados em o modelo de camundongo com VT induzida por FeCl3. Seis grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ou 40 mg/kg de ISIS 404071 administradas subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois dias após receberem a última dose de ISIS 404071, os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. 6 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg e 5 mg/kg de varfarina, administrada por via intraperitonial diariamente por 6 dias. Quatro horas após a última dose de varfarina, os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. Dois grupos controle de camundongos BALB/c foram tratados com PBS, administrado subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois dias após a última dose de PBS, os camundongos em ambos os grupos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. A formação do trombo foi induzida com FeCl3 em todos os grupos de camundongos, exceto o primeiro grupo controle.
[00340] Em camundongos submetidos ao tratamento com FeCl3, a formação do trombo foi induzida aplicando um pedaço de filtro de papel (2 x 4 mm) pré-saturado com 10 % de solução de FeCl3 diretamente na veia cava. Após 3 minutos de exposição, o papel de filtro foi removido. Trinta minutos após a aplicação do papel de filtro, um tamanho fixo da veia contendo o trombo foi dissecado para análise de plaquetas. O fígado foi coletado para análise de RNA. Análise de RNA
[00341] O RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Da maneira mostrada na tabela 20, o tratamento com ISIS 404071 resultou em redução dose-dependente significativa de RNAm do fator 11 em comparação ao controle com PBS. De maneira inversa, o tratamento com varfarina não resultou em redução significativa de fator 11 comparado ao controle com PBS. Tabela 20
[00342] Redução dose-dependente de RNAm do fator 11 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3 Tratamento Dose em mg/kg % de inibição
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Quantificação de composição plaquetária
[00343] A quantificação por PCR em tempo real de fator plaquetário 4 (PF-4) foi usada para quantificar plaquetas na veia cava como uma medida da formação do trombo. Os resultados são apresentados como um percentual de PF-4 em Camundongos tratados com ISIS 404071 ou varfarina, comparados aos dois grupos controle tratados com PBS. Da maneira mostrada na tabela 21, o tratamento com ISIS 404071 resultou em uma redução dose-dependente de PF-4 em comparação ao controle com PBS para dosagens de 5 mg/kg e maiores. O tratamento com varfarina resultou em uma redução de PF-4 em comparação ao controle com PBS para dosagens de 2 mg/kg e maiores. Portanto, a redução de fator 11 pelos compostos aqui fornecidos é usada para inibir a formação de trombo e coágulo. Tabela 21
[00344] Análise da formação do trombo pela quantificação por PCR em tempo real de PF-4 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 12: Efeito In vivo da inibição anti-sentido do fator 11 de murino comparado à varfarina em um ensaio de sangramento na cauda Tratamento
[00345] O sangramento na cauda foi medido para observar se o tratamento com ISIS 404071 ou varfarina causa hemorragia interna em camundongos. ISIS 404071 e varfarina (COUMADIN) foram avaliados no ensaio de sangramento na cauda. Seis grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ou 40 mg/kg de ISIS 404071, administrados subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. 6 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, e 5 mg/kg de varfarina, administrada por via intraperitonial diariamente por 6 dias. Um grupo controle separado de camundongos BALB/c foi tratado com PBS, administrada subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Ensaio de sangramento na cauda
[00346] Dois dias após o tratamento final de ISIS 404071, varfarina, ou PBS, os camundongos foram colocados em uma câmara para sangrar a cauda. Os camundongos foram anestesiados na câmara com isoflurano e um pedaço pequeno da cauda (aproximadamente 4mm a partir da ponta) foi cortado com tesouras estéreis. O corte da cauda foi colocado imediatamente em um tubo Falcon de 15 mL preenchido com aproximadamente 10 mL de solução de tampão de NaCl a 0,9 % aquecida a 37°C. O sangue foi coletado durante 40 minutos. Os tubos com salina foram pesados tanto antes quanto após o sangramento. Os resultados são fornecidos na tabela 22.
[00347] O tratamento com ISIS 404071 não afetou o sangramento, comparado aos camundongos tratados com PBS. Entretanto, varfarina não aumentou o sangramento em camundongos comparado ao controle com PBS. Doses maiores de varfarina correlacionaram positivamente com o aumento da perda sanguínea. Estes dados sugerem que o potencial hemorrágico dos compostos aqui fornecidos é baixo, especialmente em comparação com varfarina. Estes dados obtidos com os resultados fornecidos no exemplo 11 sugerem que a inibição de fator 11 com os compostos aqui descritos é usada para fornecer atividade anti-trombótica sem risco de sangramento associado. Tabela 22
[00348] Ensaio de sangramento na cauda no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 13: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino comparado à varfarina em PT e aPTT Tratamento
[00349] PT e aPTT foram medidos usando PPP de camundongos tratados com ISIS 404071 ou varfarina. Seis grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ou 40 mg/kg de ISIS 404071, administradas subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. 6 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg e 5 mg/kg de varfarina, administrada por via intraperitonial diariamente por 6 dias. Em um grupo controle, os camundongos BALB/c foram tratados com PBS, administrada subcutaneamente nos camundongos duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois dias após a dose final ser administrada, o PPP foi coletado e os ensaios de PT e aPTT foram realizados. Ensaios de PT e aPTT
[00350] Os valores PT e aPTT fornecidos na tabela 16 são relatados como os valores de razão normalizada internacional (INR). Os valores de INR para PT e aPTT foram determinados dividindo o valor PT ou aPTT para cada grupo experimental (isto é, tratamento com 5 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, e 50 mg/kg de ISIS 404071) pelo PT ou aPTT para o grupo tratado com PBS. Esta razão foi então originada com relação à energia do índice de sensibilidade internacional (ISI) do fator do tecido usado. Da maneira mostrada na tabela 23, PT em camundongos tratados com varfarina é prolongado significativamente a cada dosagem. O aPTT em camundongos tratados com varfarina foi prolongado, particularmente em dosagens de 1 mg/kg e maiores. ISIS 404071 não afetou significativamente PT, mas não prolongou aPTT; entretanto, não foi tão significativamente quanto em camundongos tratados com varfarina. Estes dados sugerem que ISIS 404071 afeta a via de ativação de contato, mas não a via extrínseca de coagulação do sangue, ao passo que a varfarina afeta tanto a via de ativação de contato quanto a via extrínseca de coagulação do sangue. Tabela 23
[00351] Efeito de ISIS 404071 e varfarina em PT e aPTT em camundongos BALB/c Tratamento Dose em mg/kg PT INR aPTT INR
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Exemplo 14: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3 (VT) comparado à Apixaban Tratamento
[00352] ISIS 404071 e Apixaban foram avaliados no modelo de camundongo com VT induzida por FeCl3. Seis grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ou 40 mg/kg de ISIS 404071, administradas subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois dias após receberem a última dose de ISIS 404071, os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. 6 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, e 5 mg/kg de Apixaban, administradas subcutaneamente uma vez. Vinte minutos após receber Apixaban, os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. Dois grupos controle de camundongos BALB/c foram tratados com PBS, administrada subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois dias após a última dose de PBS, os camundongos em ambos os grupos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina, administrada por injeção intraperitonial. A formação do trombo foi induzida com FeCl3 em todos os camundongos, exceto o primeiro grupo controle.
[00353] Em camundongos que se submetem ao tratamento com FeCl3, a formação do trombo foi induzida aplicando um pedaço de filtro de papel (2 x 4 mm) pré-saturado com solução de FeCl3 10 % diretamente na veia cava. Após 3 minutos de exposição, o papel de filtro foi removido. Trinta minutos após a aplicação do papel de filtro, um tamanho fixo da veia contendo o trombo foi dissecado para análise de plaquetas. O fígado foi coletado para análise de RNA. Análise de RNA
[00354] O RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Da maneira mostrada na tabela 24, o tratamento com ISIS 404071 resultou na redução dose-dependente significativa de RNAm do fator 11 em comparação ao controle com PBS. De maneira inversa, o tratamento com Apixaban não resultou em redução significativa de fator 11 comparado ao controle com PBS. Tabela 24
[00355] Redução dose-dependente de RNAm do fator 11 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Quantificação de composição plaquetária
[00356] A quantificação por PCR em tempo real de fator plaquetário 4 (PF-4) foi usada para quantificar plaquetas na veia cava como uma medida da formação do trombo. Da maneira mostrada na tabela 25, o tratamento com ISIS 404071 resultou na redução de PF-4 em comparação ao controle com PBS. O tratamento com Apixaban também resultou na redução de PF-4, em comparação ao controle com PBS. Os resultados são apresentados como um percentual de PF-4 em camundongos tratados com ISIS 404071 ou Apixaban, comparados aos dois grupos controle tratados com PBS. Tabela 25
[00357] Análise da formação do trombo pela quantificação por PCR em tempo real de PF-4 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 15: In vivo efeito de inibição anti-sentido de fator 11 de murino comparado à Apixaban no ensaio de sangramento na cauda Tratamento
[00358] O sangramento da cauda foi medido para observar se o tratamento com ISIS 404071 ou varfarina causa hemorragia interna em camundongos. ISIS 404071 e Apixaban foram avaliados no modelo de sangramento de cauda. Seis grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg ou 40 mg/kg de ISIS 404071, administradas subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. 6 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, e 5 mg/kg de Apixaban, administrados em uma dose subcutânea única. Um grupo controle separado de camundongos BALB/c foi tratado com PBS, administrada subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Ensaio de sangramento na cauda
[00359] Dois dias após o tratamento final com ISIS 404071, Apixaban ou PBS, os camundongos foram colocados em uma câmara para sangrar a cauda. Os camundongos foram anestesiados na câmara e um pedaço pequeno da cauda (aproximadamente 4 mm a partir da ponta) foi cortado com tesouras estéreis. A cauda cortada foi imediatamente colocada em um tubo Falcon de 15 mL preenchido com aproximadamente 10 mL de solução tampão de NaCl a 09 % aquecida a 37 °C. O sangue foi coletado durante 40 minutos. Os tubos com salina foram pesados antes e após o sangramento.
[00360] Da maneira mostrada na tabela 26, o tratamento com ISIS 404071 não afetou o sangramento comparado aos camundongos tratados com PBS. Entretanto, Apixaban não aumentou o sangramento em camundongos comparado ao controle com PBS. Doses maiores de Apixaban correlacionaram positivamente com o aumento da perda sanguínea. Estes dados sugerem que o potencial hemorrágico dos compostos aqui fornecidos é baixo, especialmente em comparação com Apixaban. Estes dados obtidos com os resultados fornecidos no exemplo 14 sugerem que a inibição de fator 11 com os compostos aqui descritos é usada para fornecer risco anti-trombótico sem sangramento associado. Tabela 26
[00361] Ensaio de sangramento na cauda em camundongos BABL/c
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Exemplo 16: Efeito ex vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com LOVENOX Tratamento
[00362] Três grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 10 mg/kg, 20 mg/kg, ou 40 mg/kg de ISIS 404071, administradas subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Um grupo de camundongo controle foi tratado com PBS, administrada duas vezes por semana, por 3 semanas. Cinco dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados e plasma foi coletado. A heparina de baixo peso molecular (LMW), LOVENOX, foi administrada no plasma ex vivo em concentrações variadas de 0 μg/ml, 2,5 μg/ml, 5,0 μg/ml e 7,5 μg/ml. PT e aPTT foram medidos 20 minutos após o LOVENOX ser administrado. Ensaio de PT e aPTT
[00363] Da maneira mostrada na tabela 27, o tratamento com LOVENOX aumenta o PT de uma maneira dependente da dose. O tratamento com ISIS 404071 não aumenta significativamente o PT. O PT não é significativamente afetado pelo tratamento com ISIS 404071. Não existe nenhuma evidência de um efeito combinacional no PT no plasma tratado com ISIS 404071 e LOVENOX. Tabela 27
[00364] Efeito de combinação de ISIS 404071 e LOVENOX em PT INR no plasma de murino
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[00365] Da maneira mostrada na tabela 28, o tratamento com LOVENOX aumenta o aPTT de uma maneira dependente da dose. O tratamento com ISIS 404071 também aumenta o aPTT de uma maneira dependente da dose. Além do mais, o tratamento combinado de ISIS 404071 e LOVENOX parece ter um efeito sinergístico no aPTT. Tabela 28
[00366] Efeito de combinação de ISIS 404071 e LOVENOX no aPTT INR no plasma de murino
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Exemplo 17: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com LOVENOX no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3 (VT) Tratamento
[00367] A combinação de ISIS 404071 e LOVENOX foi avaliada no modelo de camundongo com VT induzido por FeCl3. Quatro grupos de camundongos BALB/c foram tratados com 15 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg ou 60 mg/kg de LOVENOX, administradas subcutaneamente uma vez por dia durante 3 dias. 4 grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados com 20 mg/kg de ISIS 404071, administrada subcutaneamente duas vezes por semana, durante 3 semanas. Após a última dose de ISIS 404071, os camundongos foram tratados com 15 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg ou 60 mg/kg de LOVENOX, administradas subcutaneamente uma vez ao dia, durante 3 dias. Dois grupos controle de camundongos BALB/c foram tratados com PBS, administrada subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. A formação do trombo foi induzida com FeCl3 em todos os camundongos, exceto o primeiro grupo controle. Todos os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina administrada por injeção intraperitonial.
[00368] Em camundongos que se submetem ao tratamento com FeCl3, a formação do trombo foi induzida aplicando um pedaço de filtro de papel (2 x 4 mm) pré-saturado com solução de FeCl3 a 10 % diretamente na veia cava. Após 3 minutos de exposição, o papel de filtro foi removido. Trinta minutos após a aplicação do papel de filtro, um tamanho fixo da veia contendo o trombo foi dissecado para análise de plaquetas. Quantificação de Composição plaquetária
[00369] A quantificação por PCR em tempo real de PF-4 foi usada para quantificar plaquetas na veia cava como uma medida da formação do trombo. Da maneira mostrada na tabela 29, o tratamento com LOVENOX resultou em uma redução de PF-4 em comparação ao controle com PBS. O tratamento com LOVENOX em combinação com ISIS 404071 resultou em uma maior redução de PF-4 em comparação ao LOVENOX sozinho. Tabela 29
[00370] Análise da formação do trombo pela quantificação por PCR em tempo real de PF-4 no modelos de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 18: Efeito in vivo de inibição anti-sentido d e fator 11 de murino em combinação com LOVENOX no sangramento Tratamento
[00371] O sangramento na cauda foi medido para observar se o tratamento com ISIS 404071 e LOVENOX causa hemorragia interna em camundongos. ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em uma dosagem de 20 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas em 4 grupos de camundongos BALB/c, e LOVENOX foi administrada subcutaneamente em dosagens variadas de 15 mg/kg, 30 mg/kg, 45 mg/kg e 60 mg/kg uma vez por dia nos três últimos dias de tratamento com ISIS 404071. Em um quinto grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 20 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas. Em um sexto grupo, PBS foi administrada subcutaneamente duas vezes por semana por três semanas em camundongos BALB/c, como um controle. Ensaio de sangramento na cauda
[00372] Dois dias após receber seu tratamento final, os camundongos foram colocados em uma câmara para sangrar a cauda. Os camundongos foram anestesiados na câmara com isoflurano e um pedaço pequeno da cauda (aproximadamente 4 mm a partir da ponta) foi cortado com tesouras estéreis. A cauda cortada foi imediatamente colocada em um tubo Falcon de 15 mL preenchido com aproximadamente 10 mL de solução tampão de NaCl a 09 % aquecida a 37 °C. O sangue foi coletado durante 40 minutos. Os tubos com salina foram pesados tanto antes quanto após o sangramento.
[00373] Da maneira mostrada na tabela 30, LOVENOX aumentou o sangramento em camundongos, comparado aos camundongos tratados com PBS. Doses maiores de LOVENOX correlacionaram positivamente com o aumento da perda sanguínea. ISIS 404071 combinada com LOVENOX não aumentou significativamente o sangramento, além da maior perda sanguínea mostrada em camundongos tratados apenas com LOVENOX. Tabela 30
[00374] Ensaio de sangramento na cauda comparando LOVENOX e a combinação de LOVENOX e ISIS 404071
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Exemplo 19: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com LOVENOX em PT e aPTT Tratamento
[00375] PT e aPTT foram medidos usando PPP de camundongos tratados com ISIS 404071 em combinação com LOVENOX. No primeiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 25 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas. O plasma foi coletado destes camundongos 5 dias após receberem a última dose de ISIS 404071. No segundo grupo, LOVENOX foi administrada subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 20 mg/kg uma vez por dia durante três dias. O plasma foi coletado destes camundongos 4 horas após receberem a última dose de LOVENOX. No terceiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 20 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas, e 2 dias após receberem a última dose de ISIS 404071, LOVENOX foi administrado subcutaneamente em uma dosagem de 20 mg/kg uma vez ao dia. O plasma foi coletado destes camundongos 4 horas após a última dose de LOVENOX. O quarto grupo, PBS foi administrada subcutaneamente duas vezes por semana por três semanas, como um controle. O plasma foi coletado destes camundongos 5 dias após a última dose. Ensaio de PT e aPTT
[00376] Os valores de PT e aPTT fornecidos na tabela 31 são relatados como os valores da razão normalizada internacional (INR). Da maneira mostrada na tabela 31, PT não é significativamente afetado pelo tratamento com ISIS 404071, LOVENOX, ou tratamento com ISIS 40471 combinado com LOVENOX. Estes dados sugerem que não existe nenhum efeito combinado em PT por ISIS 404071 combinado com LOVENOX. É também mostrado na tabela 31 que o tratamento com LOVENOX e o tratamento com ISIS 404071 combinado com LOVENOX aumenta o aPTT. Estes dados sugerem que o tratamento combinado de ISIS 404071 e LOVENOX apresenta um efeito adicional no aPTT. Tabela 31
[00377] Efeito de combinação de ISIS 404071 e LOVENOX no PT e aPTT em plasma de murino
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Exemplo 20: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com Apixaban em PT e aPTT Tratamento
[00378] PT e aPTT foram medidos usando PPP de camundongos tratados com ISIS 404071 em combinação com Apixaban. No primeiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 25 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas. O plasma foi coletado destes camundongos 5 dias após receberem a última dose de ISIS 404071. No segundo grupo, Apixaban foi administrada subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 6 mg/kg duas vezes ao dia durante três dias. O plasma foi coletado destes camundongos 20 minutos após receberem a última dose de Apixaban. No terceiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c em uma dosagem de 20 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas, e Apixaban foi administrado subcutaneamente em uma dosagem de 6 mg/kg duas vezes ao dia nos últimos três dias de tratamento com ISIS 404071. O plasma foi coletado destes camundongos 20 minutos após receberem a última dose de Apixaban. No quarto grupo, PBS foi administrada subcutaneamente duas vezes por semana por três semanas, como um controle. O plasma foi coletado 5 dias após a última dose de PBS. Ensaio de PT e aPTT
[00379] Os valores de PT e aPTT fornecidos na tabela 32 são relatados como valores da razão normalizada internacional (INR). Da maneira mostrada na tabela 32, PT não é significativamente afetado pelo tratamento com ISIS 404071. Entretanto, Apixaban e Apixaban combinado com ISIS 404071 aumentou o PT. É também mostrado na tabela 32 que Apixaban, ISIS 404071, e ISIS 404071 combinada com Apixaban aumentam o aPTT. Tabela 32
[00380] Efeito de combinação de ISIS 404071 e Apixaban no PT e aPTT em plasma de murino
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Exemplo 21: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com varfarina em PT e aPTT Tratamento
[00381] PT e aPTT foram medidos usando PPP de camundongos tratados com ISIS 404071 em combinação com varfarina. Dois grupos de camundongos BALB/c foram tratados tanto com 25 mg/kg quanto com 50 mg/kg de ISIS 404071, administrados subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. O plasma foi coletado de cada grupo 5 dias após a última dose ser administrada. Em um terceiro grupo, os camundongos BALB/c foram tratados com 2 mg/kg de varfarina uma vez ao dia por 5 dias. O plasma foi coletado 6 horas após a última dose de varfarina ser administrada. Dois grupos adicionais de camundongos BALB/c foram tratados tanto com 25 mg/kg quanto com 50 mg/kg de ISIS 404071, administrados subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas e a varfarina foi administrada subcutaneamente em uma dosagem de 2 mg/kg uma vez ao dia nos últimos 5 dias de tratamento com ISIS 404071. O plasma foi coletado de cada grupo 6 horas após o último tratamento com varfarina. Em um grupo final de camundongos BALB/c, PBS foi administrada subcutaneamente duas vezes por semana por três semanas, como um controle. O plasma foi coletado 5 dias após o último tratamento com PBS. Ensaio de PT e aPTT
[00382] Os valores de PT e aPTT fornecidos na tabela 33 são relatados como os valores da razão normalizada internacional (INR). Da maneira mostrada na tabela 33, PT não é afetado pelo tratamento com PBS ou ISIS 404071 em nenhuma dosagem. Entretanto, o tratamento com 2 mg/kg de varfarina, 25 mg/kg de ISIS 404071 em combinação com 2 mg/kg de varfarina, e 50 mg/kg de ISIS 404071 em combinação com 2 mg/kg de varfarina aumenta o PT. Estes dados sugerem que o tratamento combinado de ISIS 404071 e varfarina apresenta um efeito aditivo no PT. É também mostrado na tabela 33 que aPTT é afetado pelo tratamento com ISIS 404071 e varfarina. A combinação de ISIS 404071 e varfarina mostra um aumento em aPTT maior que ambos os medicamentos sozinhos. Estes dados sugerem que o tratamento combinado de ISIS 404071 e varfarina apresenta um efeito sinergístico no aPTT. Tabela 33
[00383] Efeito de combinação de ISIS 404071 e varfarina no PT e aPTT em plasma de murino
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Exemplo 22: Efeito anti-trombótico in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino na trombose de veia mesentérica em camundongos Tratamento
[00384] Em um primeiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos C57BL/6 duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 50 mg/kg. Em um segundo grupo, um oligonucleotídeo controle, ISIS 405277 (AAGGACCTACACTATGGAAT; oligonucleotídeo anti-sentido para fator 2), aqui incorporado como SEQ ID NO: 12 foi administrado subcutaneamente em camundongos C57BL/6 duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 50 mg/kg. Preparação plaquetária
[00385] O sangue foi coletado do plexo venoso retro-orbital de camundongos C57BL/6 naive por punção e coletado em tubos de polipropileno contendo 300 μL de heparina (30U/mL). O plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido por centrifugação a 1.000 rpm por 5 minutos. O PRP foi transferido para tubos novos contendo 2 μL de prostaglandina I2 (PGI2) (2 μg/mL) e incubados a 37 °C por 5 minutos. Após a centrifugação a 2.600 rpm, os precipitados foram re-suspensos em 1 mL de tampão HEPES modificado para tireóide (NaCl 137 mM, Na2HPO4 0,3 mM, KCl 2 mM, NaHCO3 12 mM, HEPES 5 mM, glicose 5 mM, BSA a 0,35 %, pH 7,2) contendo 2 μL de PGI2 e incubados a 37 °C por 5 minutos. O precipitado suspenso foi centrifugado a 2.600 rpm por 5 minutos. Para remover o PGI2, a etapa de lavagem foi repetida duas vezes e as plaquetas foram marcadas de maneira fluorescente com calceína AM 2,5 μg/mL (Molecular Probes, Eugene, OU) por 10 minutos em temperatura ambiente. Microscopia intravital para trombose
[00386] As plaquetas marcadas de maneira fluorescentes foram injetadas intravenosamente em camundongos C57BL/6 tratados com ISIS 404071 e tratados com oligonucleotídeo controle. Os camundongos foram anestesiados com avertina 2,5 %, e uma incisão foi feita por meio da parede abdominal para expor as veias mesentéricas com 250-300-μm de diâmetro e com uma taxa de cisalhamento de aproximadamente 150 s-1. O mesentério exposto foi mantido úmido em todo o experimento por superfusão periódica com PBS aquecido (37°C). O mesentério foi transluminado com uma fonte de 12V, 100W, DC estabilizada. As veias foram visualizadas usando um microscópio invertido Zeiss (Alemanha) Axiovert 135 (Objetiva 32X) conectado a um gravador de vídeo SVHS (AG-6730; Panasonic, Tóquio, Japão) usando uma câmera de vídeo CCD (Hamamatsu Fotonic Systems, Hamamatsu City, Japão). A velocidade do eritrócito da linha central (Vrbc) foi medida usando um velocímetro ótico Doppler (Microcirculation Research Institute, Texas A&M College of Medicine, College Station, TX). A taxa de cisalhamento venular () foi calculada com base na lei de Poiseuille para um fluiodo newtoniano, =8(Vmédia/Dv), onde Dv é o diâmetro da vênula e Vmédia é estimada a partir da Vrbc medida usandoa correlação empírica Vmédia=Vrbc/1,6. Análise dos resultados
[00387] A trombose de veia mesentérica foi realizada dois dias após a última injeção de oligonucleotídeo anti-sentido. A trombose foi induzida aplicando papel de Whatman encharcado em uma solução de FeCl3 a 10 % por 5 minutos na veia mesentérica. A veia foi monitorada por 40 minutos, ou até a oclusão. O tempo decorrido antes do primeiro trombo de 30-50 μm em diâmetro e o tempo decorrido antes do sangue parara de fluir por 30 segundos foram observados.
[00388] A formação do trombo (30 μm em diâmetro) ocorreu em camundongos tratados com ISIS 404071 em 14,8 ± 1,7 minutos. A formação do trombo (30 μm em diâmetro) ocorreu em camundongos controle em 8,9 ± 0,6 minutos. Os trombos oclusivos se formaram em camundongos controle em 19,3 ± 0,8 minutos e todas as vênulas lesadas fecharam. Ao contrário, a maioria das veias em camundongos tratados com ISIS 404071 não fecharam quando a observação terminou 40 minutos após a lesão e aquelas veias mostraram oclusão. Apenas a veia que mostra oclusão nos camundongos tratados com ISIS 404071 ocluíram em 29,5 minutos e reabriram após 5 minutos, antes do final do estudo. Exemplo 23: Antídoto de oligonucleotídeo sentido in vivo para a inibição anti-sentido de fator 11 de murino em camundongos BALB/c Tratamento
[00389] O efeito dos oligonucleotídeo sentido específicos para ISIS 404071 como um antídoto foi testado em camundongos BALB/c. Em um primeiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 40 mg/kg. Em um segundo grupo, ISIS 404057 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 40 mg/kg. O antídoto específico de ISIS 404071, ISIS 418026 (CCTCTGAAAGTGGATTACCA; complementar a ISIS 404071), aqui incorporado como SEQ ID NO: 13, foi administrado em ambos os grupos subcutaneamente em uma injeção única de 90 mg/kg, 48 horas após o tratamento final de ISIS 404071 ou 404057. Em um terceiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 40 mg/kg. Após o último tratamento de ISIS 404071, os camundongos foram injetados subcutaneamente com PBS. Em um quarto grupo, ISIS 404057 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana por três semanas em uma dose de 40 mg/kg. Após o último tratamento de ISIS 404057, os camundongos foram injetados subcutaneamente com PBS. Após a administração do antídoto, um conjunto de 4 camundongos de cada grupo foi sacrificado em 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 7 dias e 14 dias. Todo o fígado foi coletado para análise de RNA e PPP foi coletado para a análise de aPTT. Análise de RNA
[00390] O RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Da maneira mostrada na tabela 34, os camundongos tratados com ISIS 404071 sem antídoto mostraram diminuição progressiva na inibição pelo período de observação de 14 dias. Entretanto, os camundongos tratados com ISIS 404071 e antídoto mostraram uma diminuição acelerada pelo período de observação de 14 dias em comparação com camundongos que não receberam antídoto. É também mostrado na tabela 34 que o tratamento com ISIS 418026 não apresentou nenhum efeito na inibição de RNAm do fator 11 expressão em camundongos tratados com ISIS 404057. Tabela 34
[00391] Inibição percentual de RNAm do fator 11 de camundongo comparada ao controle com PBS
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[00392] Da maneira mostrada na tabela 35, os camundongos tratados com ISIS 404071 e antídoto (ISIS 418026) mostraram diminuição progressiva de aPTT pelo período de observação de 14 dias, comparados aos camundongos tratados com ISIS 404071 sem antídoto. Tabela 35
[00393] Efeito de tratamento com antídoto na INR de aPTT
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Exemplo 24: Antídoto da proteína do fator 7a in vivo para a inibição anti-sentido de fator 11 de murino em camundongos BALB/c Tratamento
[00394] O efeito das proteínas do fator 7a humano (Fator VIIa) como um antídoto para ISIS 404071 foi testado em camundongos BALB/c. Dois grupos Two experimentais de camundongos BALB/c foram tratados com 20 mg/kg de ISIS 404071, administrados subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. Dois grupos controle de camundongos BALB/c foram tratados com PBS, administrados subcutaneamente duas vezes por semana, por 3 semanas. A formação do trombo foi induzida com FeCl3 em todos os camundongos, exceto no primeiro grupo controle. Quinze minutos antes do tratamento com FeCl3, o primeiro grupo experimental foi tratado com 5 μg/kg de antídoto de proteína do fator 7a humano (produto no. 407act, American Diagnostic Inc.). Dois dias após sua última dose, todos os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina administrada por injeção intraperitonial.
[00395] Em camundongos que se submetem ao tratamento com FeCl3, a formação do trombo foi induzida aplicando um pedaço de filtro de papel (2 x 4 mm) pré-saturado com solução de FeCl3 a 10 % diretamente na veia cava. Após 3 minutos de exposição, o papel de filtro foi removido. Trinta minutos após a aplicação do papel de filtro, um tamanho fixo da veia contendo o trombo foi dissecado para análise de plaquetas. Quantificação da composição plaquetária
[00396] A quantificação por PCR em tempo real do fator plaquetário 4 (PF-4) foi usada para quantificar plaquetas na veia cava como uma medida da formação do trombo. Os resultados são apresentados como um percentual de PF-4 em camundongos tratados e não tratados com antídoto, comparados aos dois grupos controle tratados com PBS. Da maneira mostrada na tabela 36, os animais tratados com o antídoto de proteína do fator 7a humano expressaram mais PF-4 em comparação aos animais tratados com ISIS 404071 sozinho. Estes dados indicam que o fator 7a humano é satisfatório em resgatar o efeito da inibição do oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 36
[00397] Análise da formação do trombo pela quantificação por PCR em tempo real de PF-4 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 25: Inibição anti-sentido in vivo de fator 11 de murino no modelo de hemorragia cerebral induzida por colagenase Tratamento
[00398] ISIS 404071 e varfarina (COUMADIN) foram examinados no modelo de hemorragia cerebral induzida por colagenase. Em um primeiro grupo, ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana, por duas semanas, em uma dose 40 mg/kg. Em um segundo grupo, varfarina foi administrada intraperioniamente em camundongos duas vezes por semana, por duas semanas, em uma dose de 2 mg/kg. Em um terceiro grupo, ISIS 421208 (TCGGAAGCGACTCTTATATG, 8 incompatibilidades no fator 11 de murino, aqui incorporado como SEQ ID NO: 14) foi administrado subcutaneamente em camundongos BALB/c duas vezes por semana, por duas semanas, em uma dose 40 mg/kg. Em um quarto grupo, o PBS foi administrado aos camundongos BALB/c duas vezes por semana, por duas semanas.
[00399] Dois dias após receber sua dose final, todos os camundongos em todos os grupos foram anestesiados com 5 μg/g de avertina. A seguir, os camundongos foram injetados em -1 mm AP, 1 mm R ML, -4 mm DV do bregma do crânio plano com uma seringa Hamilton de 10 μL contendo 0,075 U de colagenase (150 U/mL). A colagenase foi distribuída por 5 minutos e a agulha foi mantida no local por mais 5 minutos para evitar o refluxo. Os camundongos foram então analisados quanto à extensão da hemorragia, pontuação de déficit neurológico e mortalidade.
[00400] A tabela 37 apresenta o volume de hemorragia detectado em camundongos após tratamento com a colagenase, a tabela 38 apresenta a pontuação de déficit neurológico dos camundongos, e a tabela 39 apresenta a taxa de mortalidade dos camundongos. O déficit neurológico é medido por um sistema de pontuação padrão, onde nenhuma deficiência é zero e o déficit grave é cinco. Coletivamente, os dados sugerem que ISIS 404071 não apresentou um efeito significativo no tamanho da hemorragia, pontuação de déficit neurológico ou mortalidade dos camundongos. Assim, o risco de hemorragia intracerebral (um fator de risco para indivíduos tratados com varfarina) é significativamente reduzido em camundongos tratados com ISIS 404071, em comparação aos camundongos tratados com varfarina. Tabela 37
[00401] Volume hemorrágico após tratamento com colagenase
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Tabela 38
[00402] Pontuação de déficit neurológico após tratamento com
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Tabela 39
[00403] Mortalidade após tratamento com colagenase
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Exemplo 26: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com PLAVIX no modelo de trombose venosa (VT) induzida por FeCl3 Tratamento
[00404] A combinação de ISIS 404071 e PLAVIX foi avaliada no modelo de camundongo com VT induzida por FeCl3. Quatro grupos de oito camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada, foram tratados com 6,25 mg/kg, 12,50 mg/kg, 25,00 mg/kg ou 50,00 mg/kg de PLAVIX. Os camundongos receberam duas doses de PLAVIX no dia um e uma dose de PLAVIX no dia dois, duas horas antes da cirurgia.
[00405] Quatro grupos adicionais de oito camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada, foram tratados com 20 mg/kg de ISIS 404071, administrado subcutaneamente duas vezes por semana, durante três semanas. Após a última dose de ISIS 404071, os camundongos foram tratados com 6,25 mg/kg, 12,50 mg/kg, 25,00 mg/kg ou 50,00 mg/kg de PLAVIX. Duas doses de PLAVIX foram administradas aos camundongos no dia um e uma dose de PLAVIX foi administrada no dia dois, duas horas antes da cirurgia.
[00406] Dois grupos controle de oito camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada, não foram tratados com ISIS 404071 ou PLAVIX. Dois grupos controle adicionais de oito camundongos BALB/c, pesando aproximadamente 25 g cada, foram tratados com 20 mg/kg de ISIS 404071, administrado subcutaneamente duas vezes por semana por três semanas, mas não foram tratados com PLAVIX. A formação do trombo foi induzida com FeCl3 em todos os camundongos, exceto o primeiro e terceiro grupos controle. Todos os camundongos foram anestesiados com 150 mg/kg de cetamina misturada com 10 mg/kg de xilazina administrada por injeção intraperitonial.
[00407] Em camundongos que se submetem ao tratamento com FeCl3, a formação do trombo foi induzida aplicando um pedaço de filtro de papel (2 x 4 mm) pré-saturado com solução de FeCl3 a 10 % diretamente na veia cava inferior. Após 3 minutos de exposição, o papel de filtro foi removido. Trinta minutos após a aplicação do papel de filtro, um tamanho fixo da veia contendo o trombo foi dissecado para análise de plaquetas. Quantificação da composição plaquetária
[00408] A quantificação por PCR em tempo real de PF-4 foi usada para quantificar plaquetas na veia cava como uma medida da formação do trombo. Da maneira mostrada na tabela 40, o tratamento com PLAVIX resultou em uma redução de PF-4 em comparação ao controle com PBS. O tratamento com PLAVIX em combinação com ISIS 404071 resultou em uma maior redução de PF-4 em comparação ao PLAVIX sozinho. Portanto, a combinação de terapia anti- plaquetária com ASO do fator 11 aumenta a atividade anti-trombótica. Os dados são apresentados como percentual de PF-4 RNAm, comparados ao controle PBS+ FeCl3. Tabela 40
[00409] Análise da formação do trombo pela quantificação por PCR em tempo real de PF-4 no modelo de trombose venosa induzida por FeCl3
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Exemplo 27: Efeito in vivo de inibição anti-sentido de fator 11 de murino em combinação com PLAVIX no sangramento Tratamento
[00410] O sangramento na cauda foi medido para observar se o tratamento com ISIS 404071 em combinação com PLAVIX causa um aumento na tendência ao sangramento. ISIS 404071 foi administrado subcutaneamente em uma dosagem de 20 mg/kg duas vezes por semana, por 3 semanas a 5 grupos de oito camundongos BALB/c. Após a última dose de ISIS 404071, os camundongos foram tratados com 0 mg/kg, 6,25 mg/kg, 12,50 mg/kg, 25,00 mg/kg ou 50,00 mg/kg de PLAVIX. Duas doses de PLAVIX foram administradas aos camundongos no dia um e uma dose de PLAVIX foi administrada no dia dois, duas horas antes do sangramento.
[00411] 5 grupos adicionais de oito camundongos BALB/c foram tratados de maneira similar, com a exceção de que eles não receberam injeções de ISIS 404071. Ensaio de sangramento na cauda
[00412] Duas horas após receber seu tratamento final, os camundongos foram colocados em uma câmara para sangrar a cauda. Os camundongos foram anestesiados na câmara com isoflurano e um pedaço pequeno da cauda (aproximadamente 4 mm a partir da ponta) foi cortado com tesouras estéreis. A cauda cortada foi imediatamente colocada em um tubo Falcon de 15 mL preenchido com aproximadamente 10 mL de solução tampão de NaCl a 09 % aquecida a 37°C. O sangue foi coletado durante 40 minutos. Os tubos com salina foram pesados tanto antes quanto após o sangramento.
[00413] Obtidos com os resultados do exemplo 26, estes dados mostram que a combinação de terapia anti-plaquetária com o fator 11 ASO aumenta a atividade anti-trombótica sem aumentar o risco de sangramento. Tabela 41
[00414] Ensaio de sangramento na cauda comparando PLAVIX e a combinação de PLAVIX e ISIS 404071
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Exemplo 28: Efeito in vivo de um inibidor de molécula pequena do fator Xa em combinação com PLAVIX no sangramento Tratamento
[00415] O sangramento na cauda foi medido para observar se o tratamento com uma molécula pequena do fator 10a em combinação com PLAVIX causa um aumento na tendência ao sangramento. Cinco grupos de oito camundongos BALB/c foram tratados com 0 mg/kg, 6,25 mg/kg, 12,50 mg/kg, 25,00 mg/kg ou 50,00 mg/kg de PLAVIX. Os camundongos receberam duas doses de PLAVIX no dia um e uma dose de PLAVIX no dia dois, duas horas antes do sangramento.
[00416] Cinco grupos adicionais de oito camundongos BALB/c foram tratados com 0 mg/kg, 6,25 mg/kg, 12,50 mg/kg, 25,00 mg/kg ou 50,00 mg/kg de PLAVIX. Os camundongos receberam duas doses de PLAVIX no dia um e uma dose de PLAVIX no dia dois, duas horas antes do sangramento. Estes camundongos também foram tratados com 0,5 mg/kg de Apixaban, um inibidor da molécula pequena do fator 10a, intraperitoniamente uma vez, 20 minutos antes do sangramento. Ensaio de sangramento na cauda
[00417] Duas horas após receber seu tratamento final, os camundongos foram colocados em uma câmara para sangrar a cauda. Os camundongos foram anestesiados na câmara com isoflurano e um pedaço pequeno da cauda (aproximadamente 4 mm a partir da ponta) foi cortado com tesouras estéreis. A cauda cortada foi imediatamente colocada em um tubo Falcon de 15 mL preenchido com aproximadamente 10 mL de solução tampão de NaCl a 09 % aquecida a 37°C. O sangue foi coletado durante 40 minutos. Os tubos com salina foram pesados tanto antes quanto após o sangramento.
[00418] Da maneira mostrada a seguir na tabela 42, estes dados mostram que a combinação de terapia anti-plaquetária com um inibidor de molécula pequena do fator 10a, tal como Apixaban, aumenta o risco de sangramento. Portanto, o tratamento com a combinação de terapia anti-plaquetária com um fator 11 ASO fornece um melhor perfil de segurança, em comparação ao perfil de segurança de uma combinação de terapia anti-plaquetária com um inibidor de molécula pequena do fator 10a. Tabela 42
[00419] Ensaio de sangramento na cauda comparando PLAVIX, Apixaban e a combinação de PLAVIX e Apixaban
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Exemplo 29: Duração da redução mediada por anti-sentido in vivo do fator 11 de murino e anticoagulação correspondente no sangue Tratamento
[00420] A duração da redução mediada por anti-sentido de RNAm do fator 11 de murino foi observada em camundongos BALB/c. Uma dose de 50 mg/kg de ISIS 404071 foi administrada subcutaneamente em camundongos BALB/c. Após a administração de ISIS 404071, os camundongos foram sacrificados em 12 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 28 dias e 56 dias. Todo o fígado foi coletado para análise de RNA e PPP foi coletado análise de aPTT. Um grupo controle de camundongos foi tratado com uma dose subcutânea de PBS. Análise de RNA
[00421] O RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11. Os resultados são apresentados com relação ao controle com PBS. Os camundongos tratados com ISIS 404071 mostraram infra-regulação significativa do RNAm do fator 11 no dia 1. Os camundongos começam a recuperação da expressão do RNAm do fator 11 no dia 14. Os camundongos recuperaram completamente a expressão do RNAm do fator 11 no dia 28 e os resultados do dia 56 indicam que o RNAm do fator foi mantido nos níveis de pre-tratamentos. Portanto, os camundongos tratados com ISIS 404071 não experimenta um efeito rebote.
[00422] O efeito rebote foi previamente observado na redução mediada por anticorpo do fator 11 (Sangue, First Edition Paper, prepublicado na rede em 22 de outubro de 2008; Prevention of vascular graft occlusion and trombo-associated thrombin generation by inhibition of fator XI). Em decorrência de a super expressão do fator 11 poder ser prejudicial levando à maior coagulação, estes dados sugerem que a inibição mediada por anti-sentido do fator 11 é mais segura que a inibição mediada por anticorpo do fator 11, uma vez que a inibição mediada por anti-sentido do fator 11 não apresenta rebote. Ensaio de aPTT
[00423] Os valores aPTT fornecidos na tabela 43 são relatados como os valores da razão normalizada internacional (INR). Os valores de INR para aPTT foram determinados dividindo o valor de aPTT para camundongos tratados com ISIS 404071 pelo aPTT para o grupo tratado com PBS. Esta razão foi então originada com relação à energia do índice de sensibilidade internacional (ISI) do fator do tecido usado. Da maneira mostrada na tabela 43, os camundongos tratados com ISIS 404071 mostraram diminuição progressiva de aPTT até o dia 4 e, a seguir, aumento progressivo nos níveis de pré-tratamentos níveis do dia 7 ao dia 28. Tabela 43
[00424] Efeito do tratamento com ISIS 404071 em INR de aPTT*
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Exemplo 30: Inibição anti-sentido de fator 11 humano em células HepG2 por oligonucleotídeos projetados por micro caminhada
[00425] Os Gap-mers adicionais foram projetados com base em ISIS 416850 e ISIS 416858 (ver tabela 8 anterior). Estes Gap-mers foram deslocados levemente à montante e à jusante (isto é, “micro caminhada”) de ISIS 416850 e ISIS 416858. Os Gap-mers de micro caminhada foram desenhados tanto com motivos 5-8-5 MOE quanto com 6-8-6 MOE.
[00426] Estes Gap-mers de micro caminhada foram testados in vitro. As células HepG2 cultivadas em uma densidade de 20.000 células por poço foram transfectadas usando eletroporação com oligonucleotídeo anti-sentido 8.000 nM. Após um período de tratamento de aproximadamente 24 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas.
[00427] ISIS 416850 e ISIS 416858, bem como Gap-mers selecionados das tabelas 1 e 8 (isto é, ISIS 412206, ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416825, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866, e ISIS 416867) foram testados novamente in vitro junto com os Gap-mers de micro caminhada na mesma condição da maneira descrita anteriormente.
[00428] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 44 foram designados como Gap-mers 5-10-5 MOE, 5-8-5 e 6-8-6 MOE. Os dois primeiros Gap-mers listados na tabela 44 são os Gap-mers originais (ISIS 416850 e ISIS 416858), dos quais ISIS 445493-445543 foram desenhados por meio de micro caminhada, e são designados por um asterisco. Os Gap-mers 5-10-5 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de dez 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo cinco nucleotídeos cada. Os Gap-mers 5-8-5 apresentam 18 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de oito 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo cinco nucleotídeos cada. Os Gap- mers 6-8-6 apresentam 20 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de oito 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo seis nucleotídeos cada. Para cada um dos motivos (5-10-5, 5-8-5 e 6-8-6), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap- mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo humano” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência humana. “Sítio de parada alvo humano” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência humana. Cada Gap-mer listado na tabela 44 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3). Cada Gap-mer da tabela 44 também apresenta reatividade completamente cruzada com o a sequência do gene do fator 11 de macaco reso, aqui representada como a SEQ ID NO: 274 (exons 1-15 acesso ao GENBANK No. NW_001118167.1). “Sítio inicial de macaco reso” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência de macaco reso. “Sítio de parada de macaco reso” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência de macaco reso.
[00429] Da maneira mostrada na tabela 44, todos os Gap-mers designados a partir da micro caminhada alvejados na região alvo, que começam no sítio inicial alvo 1.275 e que terminam no sítio de parada alvo 1.317 (isto é, nucleobases 1.275-1.317) de SEQ ID NO: 1, exibiram pelo menos 60 % de inibição de RNAm do fator 11. De maneira similar, todos os Gap-mers que foram testados novamente das tabelas 1 e 8 exibiram pelo menos 60 % de inibição.
[00430] Vários dos Gap-mers exibiram pelo menos 70 % de inibição, incluindo os números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542 e 445543.
[00431] Vários dos Espaçâmeros exibiram pelo menos 80 % de inibição, incluindo os números ISIS: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541 e 445542.
[00432] Vários dos Espaçâmeros exibiram pelo menos 90 % de inibição, incluindo os números ISIS: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522 e 445531. Tabela 44
[00433] Inibição de níveis de RNAm do fator 11 humano por oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejados em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3)
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Exemplo 31: Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2
[00434] Os Espaçâmeros do exemplo 30 que exibem inibição in vitro de fator 11 humano foram testados em várias doses em células HepG2. As células foram colocadas em placas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 123,46 nM, 370,37 nM, 1.111,11 nM, 3.333,33 nM e 10.000 nM, da maneira especificada na tabela 45. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células de controle não tratadas. Da maneira ilustrada na tabela 45, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido.
[00435] A metade da concentração inibitória máxima (IC50) de cada oligonucleotídeo foi calculada representando graficamente as concentrações de oligonucleotídeos anti-sentido usadas versus a inibição percentual da expressão do RNAm do fator 11 atingida em cada concentração, e anotando a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido em que 50 % da expressão da inibição de RNAm do fator 11 expressão foi atingida, comparada ao controle com PBS. Os valores IC50 são apresentados na tabela 45. Tabela 45
[00436] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG por meio da transfecção de oligonucleotídeos usando eletroporação
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Exemplo 32: Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por oligonucleotídeos projetados por micro caminhada
[00437] Os Gap-mers adicionais foram projetados com base em ISIS 416850 e ISIS 416858 (ver tabela 8 anterior). Estes Gap-mers são deslocados levemente à montante e à jusante (isto é, micro caminhada) de ISIS 416850 e ISIS 416858. Os Gap-mers designados por micro caminhada apresentam motivos 3-8-3 MOE, 4-8-4 MOE, 210-2 MOE, 3-10-3 MOE ou 4-10-4 MOE.
[00438] Estes Gap-mers foram testados em várias doses em células HepG2. As células foram plaqueadas em uma densidade de 20.000 células por poço e transfectadas usando eletroporação com concentrações de oligonucleotídeo anti-sentido 375 nM, 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM e 12.000 nM, da maneira especificada na tabela 47. Após um período de tratamento de aproximadamente 16 horas, o RNA foi isolado das células e os níveis do RNAm do fator 11 foram medidos por PCR em tempo real quantitativa. O conjunto de sonda do oligonucleotídeo iniciador do fator 11 humano RTS 2966 foi usado para medir os níveis de RNAm. Os níveis do RNAm do fator 11 foram ajustados de acordo com o teor de RNA total, da maneira medida por RIBOGREEN. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação às células controle não tratadas.
[00439] ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 445522 e ISIS 445531 (ver tabela 45 anterior) foram testados novamente in vitro junto com os Gap-mers de micro caminhada nas mesmas condições descritas anteriormente.
[00440] Os oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos na tabela 46 foram designados como Gap-mers 3-8-3 MOE, 4-8-4 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE, ou 4-10-4 MOE. O Gap-mer 3-8-3 apresenta 14 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de oito 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo três nucleotídeos cada. O Gap-mer 4-8-4 apresenta 16 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de oito 2’-desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo quatro nucleotídeos cada. O Gap-mer 2-10-2 apresenta 14 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de dez 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo dois nucleotídeos cada. O Gap-mer 3-10-3 apresenta 16 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de dez 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo três nucleotídeos cada. O Gap-mer 4-10-4 apresenta 18 nucleotídeos de comprimento, em que o segmento central de intervalo é compreendido de dez 2’- desoxinucleotídeos e é flanqueado em ambos os lados (nas direções 5’ e 3’) por asas compreendendo quatro nucleotídeos cada. Para cada um dos motivos (3-8-3, 4-8-4, 2-10-2, 3-10-3, e 4-10-4), cada nucleotídeo no segmento em asa 5’ e cada nucleotídeo no segmento em asa 3’ apresentam uma modificação 2’-MOE. As ligações entre nucleosídeos em cada Gap-mer são ligações fosforotioato (P=S). Todos os resíduos de citidina em cada Gap-mer são 5-metilcitidinas. “Sítio inicial alvo humano” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência humana. “Sítio de parada alvo humano” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência humana. Cada Gap-mer listado na tabela 46 é alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3). Cada Gap-mer apresentado na tabela 46 também apresenta reatividade completamente cruzada com a sequência do gene do fator 11 de macaco reso, representado aqui como a SEQ ID NO: 274 (exons 1-15 acesso ao GENBANK No. NW_001118167.1). “Sítio inicial de macaco reso” indica o principal nucleotídeo 5’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência de macaco reso. “Sítio de parada de macaco reso” indica o principal nucleotídeo 3’ no qual o Gap-mer é alvejado na sequência de macaco reso. Tabela 46
[00441] Oligonucleotídeos anti-sentido quiméricos alvejado em SEQ ID NO: 1 (acesso ao GENBANK No. NM_000128.3) e projetados por micro caminhada de ISIS 416850 e ISIS 416858
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[00442] Os dados de inibição dose-resposta são fornecidos na tabela 47. Da maneira ilustrada na tabela 47, os níveis de RNAm do fator 11 foram reduzidos de uma maneira dependente da dose em células tratadas com oligonucleotídeo anti-sentido. A IC50 de cada oligonucleotídeo anti-sentido também foi calculada e apresentada na tabela 47. Os primeiros dois Gap-mers listados na tabela 47 são os Gap-mers originais (ISIS 416850 e ISIS 416858) a partir dos quais os Gap-mers restantes foram projetados por meio da micro caminhada e são designados por um asterisco. Tabela 47
[00443] Inibição anti-sentido dose-dependente de fator 11 humano em células HepG2 por meio da transfecção de oligonucleotídeos usando eletroporação
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Exemplo 33: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam o fator 11 humano em camundongos CD1
[00444] Os camundongos CD1 foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam fator 11 humano e avaliados com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00445] Grupos de cinco camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana por 2, 4, ou 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 ou ISIS 417003. Um grupo controle de cinco camundongos foi injetado subcutaneamente com PBS por 2 semanas. Todos os grupos experimentais (isto é, camundongos tratados com ASO em 2, 4, 6 semanas) foram comparados ao grupo controle (isto é, PBS, 2 semanas).
[00446] Três dias após a última dose ser administrada a todos os grupos, os camundongos foram sacrificados. O peso dos órgãos foi medido e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso do órgão
[00447] Os pesos do fígado, baço e rim foram medidos no final do estudo, e são apresentados nas tabelas 48, 49 e 50 como um percentual do controle com PBS, normalizado com o peso corporal. Aqueles oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram o aumento mais de seis vezes no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBSs foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 48
[00448] Mudança percentual no peso do fígado de camundongos
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Tabela 49
[00449] Mudança percentual no peso do baço de camundongos CD1 após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
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Tabela 50
[00450] Mudança percentual no peso do rim de camundongos CD1 após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
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Função hepática
[00451] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressas em IU/L e os resultados são apresentados nas tabelas 51 e 52. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico e expressos em mg/dL. Os resultados são apresentados nas tabelas 53 e 54. Aqueles oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST anteriores sete vezes a partir dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Aqueles oligonucleotídeos anti-sentido que não aumentaram os níveis de bilirrubina mais de duas vezes a partir dos níveis de controle foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 51
[00452] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em ALT (IU/L) em camundongos CD1
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Tabela 52
[00453] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em
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Tabela 53
[00454] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em bilirrubina (mg/dL) em camundongos CD1
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Tabela 54
[00455] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em albumina (mg/dL) em camundongos CD1
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Função renal
[00456] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados nas tabelas 55 e 56, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN, comparados ao controle com PBS, foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 55
[00457] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em BUN (mg/dL) em camundongos CD1
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Tabela 56
[00458] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em creatinina (mg/dL) em camundongos CD1
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Ensaios de hematologia
[00459] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foi enviado à Antech Diagnostics para medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos e monócitos), RBC e plaquetas e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 57-67. Os percentuais fornecidos nas tabelas indicam o percentual de contagem de célula de sangue total. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaqueta em mais de 50 % e/ou um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 57
[00460] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em HCT (%) em camundongos CD1
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Tabela 58
[00461] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCV (fL) em camundongos CD1
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Tabela 59
[00462] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCH (pg) em camundongos CD1
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Tabela 60
[00463] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCHC (%) em camundongos CD1
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Tabela 61
[00464] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de WBC (células/nL) em camundongos CD1
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Tabela 62
[00465] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de RBC (células/pL) em camundongos CD1
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Tabela 63
[00466] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de neutrófilo (%) em camundongos CD1
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Tabela 64
[00467] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de linfócito (%) em camundongos CD1
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Tabela 65
[00468] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de monócito (%) em camundongos CD1
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Tabela 66
[00469] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de plaqueta (células/nL) em camundongos CD1
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Tabela 67
[00470] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido no teor de hemoglobina (g/dL) em camundongos CD1
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Exemplo 34: Medição da meia vida de oligonucleotídeo anti- sentido no fígado de camundongos CD1
[00471] Os camundongos CD1 foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam fator 11 humano e a meia vida do oligonucleotídeo, bem como o tempo gasto para degradação e eliminação do oligonucleotídeo do fígado foi avaliado. Tratamento
[00472] Grupos de quinze camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 2 semanas com 50 mg/kg de ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 ou ISIS 417003. Cinco camundongos de cada grupo foram sacrificados 3 dias, 28 dias e 56 dias após a dose final. Os fígados foram coletados para análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00473] A concentração do oligonucleotídeo de comprimento total, bem como a concentração total de oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foram medidas. O método usado é uma modificação de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consistem em uma extração com fenol-clorofórmio (líquido- líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado por 2’-O- metoxietila 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, aqui designado como SEQ ID NO: 270) foi adicionado antes da extração. As concentrações de amostra de tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite menor de quantificação (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. As meias vidas foram então calculadas usando o software WinNonlin (PHARSIGHT).
[00474] Os resultados são apresentados nas tabelas 68 e 69, expressos como μg/g de tecido hepático. A meia vida de cada oligonucleotídeo é apresentada na tabela 70. Tabela 68
[00475] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento total (μg/g) no fígado de camundongos CD1
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Tabela 69
[00476] Concentração do oligonucleotídeo total (μg/g) no fígado de camundongos CD1
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Tabela 70
[00477] Meia vida de oligonucleotídeos anti-sentido no fígado de camundongos CD1
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Exemplo 35: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam o fator 11 humano em ratos Sprague-Dawley
[00478] Os ratos Sprague-Dawley foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam o fator 11 humano e avaliados com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00479] Grupos de quatro ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416848, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002 ou ISIS 417003. Um grupo controle de quatro ratos Sprague Dawley foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e durante todo o tratamento. Amostras de urina foram obtidas antes do início do tratamento. Três dias após a última dose, as amostras de urina foram obtidas e os ratos foram sacrificados. Os pesos dos órgãos foram medidos e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e peso do órgão
[00480] Os pesos corporais dos ratos foram medidos no início do estudo e, subsequentemente, duas vezes por semana. Os pesos corporais são apresentados na tabela 71 e são expressos como uma mudança percentual com relação aos pesos obtidos no início do estudo. Os pesos do fígado, baço e rim foram medidos no final do estudo e são apresentados na tabela 71 como um percentual do controle com salina normalizado com o peso corporal. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento mais seis vezes no peso do fígado e baço acima do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 71
[00481] Mudança percentual no peso do órgão de ratos Sprague Dawley após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
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Função hepática
[00482] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressass em IU/L e os resultados são apresentados na tabela 72. Os oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram um aumento nos níveis ALT/AST acima de sete vezes dos níveis do controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos com o mesmo analisador clínico e os resultados são também apresentados na tabela 72, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis do controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 72
[00483] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de Sprague-Dawley ratos
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Função renal
[00484] Para avaliar o efeito da função renal, as concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 73, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN, comparados ao controle com PBS, foram selecionados para estudos adicionais. A razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina total também foi calculada antes e após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido e é apresentada na tabela 74. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de cinco vezes um aumento nas razões proteinúria/creatinina, comparados ao controle com PBS, foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 73
[00485] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0096
Tabela 74
[00486] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na razão proteinúria/creatinina em ratos Sprague Dawley
Figure img0097
Ensaios de hematologia
[00487] O sangue obtido de todos os grupos de rato foi enviado para Antech Diagnostics para medições e análises de hematócrito (HCT), volume corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCV) e concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), bem como medições de várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos e monócitos), RBC e plaquetas, bem como o teor de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 75 e 76. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaqueta em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 75
[00488] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em ratos Sprague-Dawley
Figure img0098
Tabela 76
[00489] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos (controle %) em ratos Sprague-Dawley
Figure img0099
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Exemplo 36: Medição da meia vida de oligonucleotídeo anti- sentido no fígado e rim de rato Sprague-Dawley
[00490] Os ratos Sprague Dawley foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam o fator 11 humano e a meia vida do oligonucleotídeo, bem como o tempo gasto para degradação e eliminação do oligonucleotídeo do fígado e rim foi avaliado. Tratamento
[00491] Grupos de quatros ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 2 semanas com 20 mg/kg de ISIS416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002, ou ISIS 417003. Três dias após a última dose, os ratos foram sacrificados e os fígados e rins foram coletados para análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00492] A concentração do oligonucleotídeo de comprimento total, bem como a concentração total de oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada) foram medidas. O método usado é uma modificação de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consistem em uma extração com fenol-clorofórmio (líquido- líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado por 2’-O- metoxietila 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, aqui designado como SEQ ID NO: 270) foi adicionado antes da extração. As concentrações de amostra de tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite menor de quantificação (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Os resultados são apresentados nas tabelas 77 e 78, expressos como μg/g de tecido de fígado ou rim. As meias vidas foram então calculadas usando o software WinNonlin (PHARSIGHT). Tabela 77
[00493] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento total (μg/g) no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0101
Tabela 78
[00494] Concentração do oligonucleotídeo total (μg/g) no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
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Tabela 79
[00495] Meia vida (dias) de oligonucleotídeos ISIS no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
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Exemplo 37: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam o fator 11 humano em camundongos CD1
[00496] Os camundongos CD1 foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam fator 11 humano e avaliados com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00497] Grupos de cinco camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866, ou ISIS 416867, ou. Um grupo controle de dez camundongos CD1 foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e durante todo o tratamento. Três dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e pesos dos órgãos
[00498] O peso corporal foi medido no início do estudo e, subsequentemente, duas vezes por semana. Os pesos corporais dos camundongos são apresentados na tabela 80 e os aumentos são expressos em gramas com relação ao peso do controle com PBS obtido antes do início do tratamento. Os pesos do fígado, baço e rim foram medidos no final do estudo, e são também apresentados na tabela 80 como percentual do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de seis vezes os aumentos no peso do fígado e baço acima do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 80
[00499] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de camundongos CD1 após o tratamento com oligonucleotídeo anti- sentido
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Função hepática
[00500] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressas em IU/L e os resultados são apresentados na tabela 81. Os oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina, colesterol e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico e são apresentados na tabela 81 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 81
[00501] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1
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Função renal
[00502] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, as concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado e os resultados são apresentados na tabela 82, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 82
[00503] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis BUN (mg/dL) no rim de camundongos CD1
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Ensaios de hematologia
[00504] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foi enviado para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições de várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC e plaquetas, bem como análise do teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 83 e 84. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 83
[00505] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em camundongos CD1
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Tabela 84
[00506] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em camundongos CD1
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Exemplo 38: 1 Medição da meia vida de oligonucleotídeo anti- sentido no fígado de camundongo CD1
[00507] Quinze oligonucleotídeos anti-sentido que foram avaliados em camundongos CD1 (Exemplo 37), foram avaliados adicionalmente. Os camundongos CD1 foram tratados com oligonucleotídeos anti- sentido ISIS e a meia vida do oligonucleotídeo, bem como o tempo gasto para degradação e eliminação do oligonucleotídeo no fígado, foi avaliada. Tratamento
[00508] Grupos de quinze camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 2 semanas com 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, ISIS 416867, ISIS 412224, ISIS 416848 ou ISIS 416859. Cinco camundongos de cada grupo foram sacrificados 3 dias, 28 dias e 56 dias após a última dose, os fígados foram coletados para análise. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00509] A concentração do oligonucleotídeo de comprimento total foi medida. O método usado é uma modificação de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consistem em uma extração com fenol-clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado por 2’-O- metoxietila 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, aqui designado como SEQ ID NO: 270) foi adicionado antes da extração. As concentrações de amostra de tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite menor de quantificação (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Os resultados são apresentados na tabela 85 expressos como μg/g de tecido hepático. A meia vida de cada oligonucleotídeo também foi apresentada na tabela 85. Tabela 85
[00510] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento total e meia vida no fígado de camundongos CD1
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Exemplo 39: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em ratos Sprague-Dawley
[00511] Quinze oligonucleotídeos anti-sentido que foram avaliados em camundongos CD1 (Exemplo 37), foram avaliados adicionalmente em ratos Sprague-Dawley com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00512] Grupos de quatros ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 ou ISIS 416867. Um grupo controle de quatros ratos Sprague Dawley foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e durante todo o tratamento. Três dias após a última dose, amostras de urina foram coletadas e os ratos foram então sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos, e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e pesos dos órgãos
[00513] Os pesos corporais dos ratos foram medidos no início do estudo e, subsequentemente, duas vezes por semana. Os pesos corporais são apresentados na tabela 86 e são expressos como aumento em gramas com relação ao peso do controle com PBS obtido antes do início do tratamento. Os pesos do fígado, baço e rins foram medidos no final do estudo, e são também apresentados na tabela 86 como um percentual do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram mais de seis vezes o aumento no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 86
[00514] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de ratos Sprague Dawley após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
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Função hepática
[00515] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, as concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressas em IU/L e os resultados são apresentados na tabela 87. Os oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico e os resultados são apresentados na tabela 87 e expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 87
[00516] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de ratos Sprague-Dawley
Figure img0117
Figure img0118
Função renal
[00517] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, as concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 88, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. A proteinúria tutal e razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina total após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foi calculada e é também apresentada na tabela 88. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de cinco vezes um aumento nas razões proteinúria/creatinina comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 88
[00518] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0119
Figure img0120
Ensaios de hematologia
[00519] O sangue obtido de todos os grupos de rato foi enviado para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos e linfócitos), RBC e plaquetas, e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 89 e 90. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 89
[00520] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em ratos Sprague-Dawley
Figure img0121
Figure img0122
Tabela 90
[00521] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em ratos Sprague-Dawley
Figure img0123
Exemplo 40: Medição da meia vida de oligonucleotídeo anti- sentido no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
[00522] Os ratos Sprague Dawley foram tratados com oligonucleotídeos anti-sentido ISIS que alvejam fator 11 humano e a meia vida do oligonucleotídeo, bem como o tempo gasto para degradação e eliminação do oligonucleotídeo do fígado e rim, foi avaliada. Tratamento
[00523] Grupos de quatros ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 2 semanas com 20 mg/kg de ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866 ou ISIS 416867. Três dias após a última dose, os ratos foram sacrificados e os fígados e rins foram coletados. Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00524] A concentração do oligonucleotídeo de comprimento total, bem como a concentração total de oligonucleotídeo (incluindo a forma degradada), foi medida. O método usado é uma modificação de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consistem em uma extração com fenol-clorofórmio (líquido- líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado por 2’-O- metoxietila 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, aqui designado como SEQ ID NO: 270) foi adicionado antes da extração. As concentrações de amostra de tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite menor de quantificação (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. Os resultados são apresentados nas tabelas 91 e 92, expressos como μg/g de tecido de fígado ou rim. As meias vidas foram então calculadas usando o software WinNonlin (PHARSIGHT). Tabela 91
[00525] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento total (μg/g) no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0124
Figure img0125
Tabela 92
[00526] Concentração do oligonucleotídeo total (μg/g) no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0126
Tabela 93
[00527] Meia vida (dias) de oligonucleotídeos ISIS no fígado e rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0127
Figure img0128
Exemplo 41: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em camundongos CD1
[00528] Os oligonucleotídeos ISIS com motivos 6-8-6 MOE e 5-8-5 MOE que alvejam fator 11 humano foram administrados em camundongos CD1 avaliados com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00529] Grupos de cinco camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 416850, ISIS 445498, ISIS 445503, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530, ISIS 445531 ou ISIS 445532. Um grupo controle de cinco camundongos CD1 foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e no final do período de tratamento. Três dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos, e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e peso do órgão
[00530] As mudanças no peso corporal nos camundongos são apresentados na tabela 94 e são expressos como aumento em gramas com relação ao peso do controle com PBS obtido antes do início do tratamento. Os pesos do fígado, baço e rins foram medidos no final do estudo, e são também apresentados na tabela 94 como porcentagem do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de seis vezes o aumento no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 94
[00531] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de camundongos CD1 após o tratamento com oligonucleotídeo anti- sentido
Figure img0129
Função hepática
[00532] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As medições de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) são expressas em IU/L e os resultados são apresentados na tabela 95. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos e resultados são também apresentados na tabela 95 e expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 95
[00533] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1
Figure img0130
Função renal
[00534] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, as concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 96, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 96
[00535] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis BUN (mg/dL) no rim de camundongos CD1
Figure img0131
Figure img0132
Ensaios de hematologia
[00536] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foi enviado para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos e linfócitos), RBC e plaquetas, e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 97 e 98. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 97
[00537] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em camundongos CD1
Figure img0133
Figure img0134
Tabela 98
[00538] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em camundongos CD1
Figure img0135
Exemplo 42: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em ratos Sprague-Dawley
[00539] Oito oligonucleotídeos anti-sentido, que foram avaliados em camundongos CD1 (Exemplo 41), foram avaliados adicionalmente em ratos Sprague-Dawley com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00540] Grupos de quatros ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 445498, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530 ou ISIS 445531. Um grupo controle de ratos Sprague Dawley foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e durante todo o tratamento. Três dias após a última dose, amostras de urina foram coletadas e os ratos foram então sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos, e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e peso do órgão
[00541] Os pesos corporais dos ratos foram medidos no início do estudo e, subsequentemente, duas vezes por semana. Os pesos corporais são apresentados na tabela 99 e são expressos como aumento percentual com relação ao peso do controle com PBS obtido antes do início do tratamento. Os pesos do fígado, baço e rins foram medidos no final do estudo e são também apresentados na tabela 99 como um percentual do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti- sentido que não afetaram mais de seis vezes o aumento no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 99
[00542] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de ratos Sprague Dawley após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido (%)
Figure img0136
Função hepática
[00543] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). As concentrações plasmáticas de ALT (alanina transaminase) e AST (aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na tabela 100, expressos em IU/L. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico; os resultados são apresentados na tabela 100 e expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 100
[00544] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de ratos Sprague-Dawley
Figure img0137
Função renal
[00545] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, as concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 101, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. A proteinúria tutal e razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina total após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foi calculada e é também apresentada na tabela 101. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de cinco vezes um aumento nas razões proteinúria/creatinina comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 101
[00546] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no rim de ratos Sprague-Dawley
Figure img0138
Ensaios de hematologia
[00547] O sangue obtido de todos os grupos de rato foi enviado para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC e plaquetas, e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 102 e 103. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 102
[00548] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em ratos Sprague-Dawley
Figure img0139
Tabela 103
[00549] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em ratos Sprague-Dawley
Figure img0140
Exemplo 43: To erabilidade d e oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em camundongos CD1
[00550] Os oligonucleotídeos ISIS com motivos 4-8-4 MOE, 3-8-3 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE e 4-10-4 MOE que alvejam o fator 11 humano foram administrados em camundongos CD1, avaliados com relação às mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00551] Os grupos de cinco camundongos CD1 cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449409, ISIS 449710 ou ISIS 449711. Um grupo controle de cinco camundongos CD1 foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e no final do período de tratamento. Três dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos, e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e peso do órgão
[00552] Os pesos corporais dos camundongos obtidos no final do estudo são apresentados na tabela 104 e são expressos em gramas. Os pesos do fígado, baço e rins também foram medidos no final do estudo e são também apresentados na tabela 104 como porcentagem do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de seis vezes o aumento no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 104
[00553] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de camundongos CD1 após o tratamento com oligonucleotídeo anti- sentido
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Função hepática
[00554] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Concentrações plasmáticas de ALT (alanina transaminase) e AST (aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados na tabela 105, expressos em IU/L. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos usando o mesmo analisador químico clínico e os resultados são apresentados na tabela 105 e expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 105
[00555] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de camundongos CD1
Figure img0142
Função renal
[00556] Para avaliar o efeito de oligonucleotídeos ISIS na função renal, concentrações plasmáticas de nitrogênio e uréia no sangue (BUN) e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 106, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 106
[00557] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos (mg/dL) no rim de camundongos CD1
Figure img0143
Ensaios de hematologia
[00558] O sangue obtido de todos os grupos de camundongos foram enviados para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC e plaquetas, e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 107 e 108. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 107
[00559] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em camundongos CD1
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Tabela 108
[00560] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em camundongos CD1
Figure img0145
Exemplo 44: Tolerabilidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em ratos Sprague-Dawley
[00561] Cincos oligonucleotídeos anti-sentido que foram avaliados em camundongos CD1 (Exemplo 43) foram avaliados adicionalmente em ratos Sprague-Dawley com relação à mudanças nos níveis de vários marcadores metabólicos. Tratamento
[00562] Grupos de quatros ratos Sprague Dawley cada foram injetados subcutaneamente duas vezes por semana durante 6 semanas com 50 mg/kg de ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449709, ISIS 449710 ou ISIS 449711. Um grupo controle de quatros ratos Sprague Dawley foi injetado subcutaneamente com PBS duas vezes por semana durante 6 semanas. As medições de peso corporal foram obtidas antes e durante todo o tratamento. Três dias após a última dose, amostras de urina foram coletadas e os ratos foram então sacrificados, os pesos dos órgãos foram medidos e o sangue foi coletado para análise adicional. Peso corporal e peso do órgão
[00563] Os pesos corporais dos ratos foram medidos no início do estudo e no final do estudo. As mudanças no peso corporal são apresentados na tabela 109 e são expressos como aumento em gramas com relação ao peso do controle com PBS obtido antes do início do tratamento. Os pesos do fígado, baço e rins foram medidos no final do estudo, e são também apresentados na tabela 109 como um percentual do peso corporal. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de seis vezes o aumento no peso do fígado e baço abaixo do controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 109
[00564] Mudança nos pesos do corpo e dos órgãos de ratos Sprague Dawley após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
Figure img0146
Função hepática
[00565] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de ALT e AST foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Concentrações plasmáticas de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) foram medidas e os resultados são apresentados na tabela 110 expressos em IU/L. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina e albumina também foram medidos e os resultados são apresentados na tabela 110 e expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 110
[00566] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no fígado de ratos Sprague-Dawley
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Função renal
[00567] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função renal, concentrações plasmáticas de BUN e creatinina foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Os resultados são apresentados na tabela 111, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de duas vezes o aumento nos níveis de BUN comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. A proteinúria tutal e razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina total após o tratamento com oligonucleotídeo anti- sentido foi calculada e é também apresentada na tabela 111. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de cinco vezes um aumento nas razões proteinúria/creatinina comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 111
[00568] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em marcadores metabólicos no rim de ratos Sprague-Dawley
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Ensaios de hematologia
[00569] O sangue obtido de todos os grupos de rato foi enviado para Antech Diagnostics para medições de hematócrito (HCT), bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos, e monócitos), RBC e plaquetas, e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 112 e 113. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 112
[00570] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos fatores hematológicos em ratos Sprague-Dawley
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Tabela 113
[00571] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de células de sangue em ratos Sprague-Dawley
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Exemplo 45: Efeito farmacológico dose-dependente de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam fator 11 humano em macacos cinomolgos
[00572] Vários oligonucleotídeos anti-sentido foram testados em macacos cinomolgos para determinar os efeitos farmacológicos dos oligonucleotídeos na atividade do fator 11, períodos de anti- coagulação e sangramento, distribuições no fígado e rim e tolerabilidade. Todos os oligonucleotídeos ISIS usados neste estudo alvejam o RNAm do fator 11 humano e apresentam também reação totalmente cruzada com a sequência de gene do macaco reso (ver tabela 44). Espera-se que os oligonucleotídeos ISIS de macacos reso apresente reação completamente cruzada com a sequência de gene do macaco cinomolgo igualmente. Durante o período que o estudo foi submetido, a sequência genômica de macaco cinomolgo não estava disponível na base de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI); portanto, a reatividade cruzada com a sequência de gene do macaco cinomolgo pode ser confirmada. Tratamento
[00573] Os grupos, cada um consistindo em dois macacos macho e três fêmeas, foram injetados subcutaneamente com ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864 ou ISIS 417002 em doses escalonadas. O oligonucleotídeo anti-sentido foi administrado aos macacos em 5 mg/kg três vezes por semana durante 1 semana; 5 mg/kg duas vezes por semana durante as semanas 2 e 3; 10 mg/kg três vezes por semana na semana 4; 10 mg/kg duas vezes por semana durante semanas 5 e 6; 25 mg/kg três vezes por semana na semana 7; e 25 mg/kg duas vezes por semana durante semanas 8, 9, 10, 11, e 12. Um grupo controle, que consiste em dois macacos machos e três fêmeas, foi injetado subcutaneamente com PBS de acordo com o mesmo regime de dosagem. Um grupo experimental adicional, que consiste em dois macacos machos e três fêmeas, foi injetado subcutaneamente com ISIS 416850 em um regime de dose crônica menor. O oligonucleotídeo anti-sentido foi administrado aos macacos em 5 mg/kg três vezes por semana durante a semana 1; 5 mg/kg duas vezes por semana durante a semana 2 e 3; 10 mg/kg três vezes por semana durante a semana 4; e 10 mg/kg duas vezes por semana durante as semanas 5 a 12. Os pesos corporais foram medidos semanalmente. As amostras de sangue foram coletadas 14 dias e 5 dias antes do início do tratamento e, subsequentemente, uma vez por semana para a análise da atividade protéica do fator 11 no plasma, medição de fibrinogênio, medições PT e aPTT, períodos de sangramento, e medição de vários fatores hematológicos. No dia 85, os macacos foram eutanizados por sangria, embora em anestesia profunda, e os órgãos coletados para análise adicional. Análise RNA
[00574] No dia 85, o RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11, usando conjunto de sonda de oligonucleotídeo iniciador LTS00301 (sequência de oligonucleotídeo iniciador sentido ACACGCATTAAAAAGAGCAAAGC, aqui designado como SEQ ID NO 271; sequência de oligonucleotídeo iniciador anti-sentido CAGTGTCATGGTAAAATGAAGAATGG, aqui designado como SEQ ID NO: 272; e sequência da sonda TGCAGGCACAGCATCCCAGTGTTCTX, aqui designado como SEQ ID NO. 273). Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Da maneira mostrada na tabela 114, o tratamento com oligonucleotídeos ISIS resultou na redução significativa de RNAm do fator 11 em comparação ao controle com PBS. Tabela 114
[00575] Inibição de RNAm do fator 11 no fígado de macaco cinomolgo com relação ao controle com PBS
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Análise protéica
[00576] Amostras de plasma obtidas de todos os grupos de macaco em dias diferentes foram analisadas por um ensaio ELISA do estilo sanduíche (Affinity Biologicals Inc.) usando um anticorpo anti-fator 11 policlonal purificado por afinidade como o anticorpo de captura e um anticorpo anti-fator 11 policlonal purificado por peroxidase como o anticorpo de detecção. O plasma de macaco foi diluído 1:50 para o ensaio. A atividade da peroxidase foi expressa por incubação com o substrato o-fenilenodiamina. A cor produzida foi quantificada usando um leitor de microplaca a 490 nm e foi considerada ser proporcional à concentração de fator 11 nas amostras.
[00577] Os resultados são apresentados na tabela 115, expressos como redução percentual com relação àquela do controle com PBS. Tratamento com ISIS 416850 e ISIS 416858 resultou em uma diminuição dependente do tempo nos níveis de proteína. Tabela 115
[00578] Inibição de proteína do fator 11 no fígado de macaco cinomolgo com relação ao controle com PBS
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Ensaio de PT e aPTT
[00579] Amostras de sangue foram coletadas em tubos contendo citrato de sódio. PT e aPTT foram determinados em duplicata com um instrumento de coagulação ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Itália). Os resultados foram interpolados em uma curva padrão de plasma de macaco controle citratado em diluições seriadas testada para fornecer um resultado relatado em percentual normal.
[00580] O tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) foram medidos usando plasma pobre em plaquetas (PPP) de macacos tratados com oligonucleotídeos ISIS. Os valores de PT e aPTT são fornecidos nas tabelas 116 e 117 e são relatados como os valores da razão normalizada internacional (INR). Os valores INR para PT e aPTT foram determinados dividindo o valor PT ou aPTT para cada grupo experimental pelo PT ou aPTT para o grupo tratado com PBS. Esta razão foi então originada com relação à energia do índice de sensibilidade internacional (ISI) do fator do tecido usado. O ISIS oligonucleotídeo, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crômica, é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*).
[00581] Da maneira mostrada na tabela 116, PT não se prolongou significativamente em macacos tratados com oligonucleotídeos ISIS tanto no regime de dose em escala quanto no regime de dose crônica. Entretanto, aPTT prolongou-se de uma maneira dependente da dose, da maneira apresentada na tabela 117. Estes dados sugerem que a redução anti-sentido de fator 11 afeta a via de ativação de contato, mas não a via extrínseca de coagulação do sangue. Portanto, redução anti-sentido de fator 11 é usada para inibir o formação de um trombo ou coágulo em resposta à uma parede de vaso anormal, mas não em resposta à lesão tecidual. Tabela 116
[00582] Efeito de oligonucleotídeos ISIS anti-sentido na razão de PT em macacos cinomolgos
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Tabela 117
[00583] Efeito de oligonucleotídeos ISIS anti-sentido na razão de aPTT em macacos cinomolgos
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Análise da atividade protéica
[00584] Amostras de sangue foram coletadas em diversos períodos de tempo e a pró-enzima do fator 11 foi medida usando um ensaio de F11 com base no tempo de coagulação. Os tempos de coagulação foram determinados em duplicata com um instrumento de coagulação semi-automatizado ST4 (Diagnostica Stago, NJ). Trinta μL de amostra de plasma citratado diluído 1/20 em tampão HEPES-NaCl com BSA foram incubados com 30 μL de reagente aPTT (aPTT automatizada, Organon Technika, NC) e 30 μL de plasma citratado deficiente de fator 11 (George King Bio-Medical Inc.) a 37 °C por 5 minutos, seguido pela adição de 30 μL de CaCl2 25 mM, iniciaram a coagulação. Os resultados foram interpolados em uma curva padrão de plasma controle citratado diluído em série.
[00585] Os resultados são apresentados na tabela 118 como inibição percentual da atividade do fator 11, com relação ao controle com PBS. O oligonucleotídeo ISIS, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 118
[00586] Inibição de proteína do fator 11 por oligonucleotídeos anti- sentido ISIS fornecidos em regime de dose/dose crônica em escala em macacos cinomolgos
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Ensaio do fibrinogênio
[00587] Nove partes do plasma fresco de macaco foram coletadas em uma parte de citrato de trisódio. As amostras foram avaliados com relação ao teor de fibrinogênio usando um instrumento de coagulação ACL 9000 (Instrumentation Laboratory, Itália). Os resultados são apresentados na tabela 119, expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos ISIS, ISIS 416850, fornecidos com o regime de dose crônica são distinguidos dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 119
[00588] Efeito de oligonucleotídeos ISIS anti-sentido nos níveis de fibrinogênios em macacos cinomolgos
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Ensaios de sangramento
[00589] Em dias diferentes, durante o período de tratamento, o ensaio de sangramento foi realizado usando um dispositivo Surgicutt Jr. (ITC, New Jersey). Os macacos foram colocados em cadeira de macaco com seu braço colocado em um suporte firme. O braço foi levemente depilado e um esfigmomanômetro foi colocado na porção superior do braço. O medidor do esfigmomanômetro foi inflado a 40 mm Hg e esta pressão foi mantida em todo o procedimento. A área na porção superior do braço a ser incisada foi limpa com um sabão antiséptico e o dispositivo Surgicutt Jr foi usado para fazer uma incisão com o aspecto lateral, na superfície volar do antebraço, paralela e 5 cm abaixo da dobra antecubital. No exato momento que a incisão foi feita, foi iniciado um cronômetro. A cada 30 segundos, o sangue a partir da incisão foi absorvido usando um papel absorvente sem tocar diretamente a incisão, de maneira tal que a formação do tampão de plaqueta não seja interrompido. Sangue foi absorvido a cada 30 segundos até que o sangue não corasse mais o papel. O cronômetro foi então parado e o tempo de sangramento determinado. O esfigmomanômetro foi removido do braço do animal, o sítio da incisão foi esfregado anti-septicamente e uma fita para fechar a ferida foi aplicada. Os resultados são fornecidos na tabela X, expressos em segundos. Os resultados são fornecidos na tabela 120. Os oligonucleotídeos ISIS, ISIS 416850, fornecidos com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*).
[00590] Estes dados sugerem que o potencial hemorrágico dos compostos aqui fornecidos é baixo. Tabela 120
[00591] Ensaio de sangramento em macacos cinomolgos
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Ensaio α e agregação plaquetária
[00592] A agregação plaquetária iniciou adicionando 1 mmol/L ADP e/ou 3 μg de colágeno (dependendo do dia da coleta, da maneira representada na tabela 121) às amostras de plasma, e procegiu naturalmente por 10 minutos. A agregação foi caracterizada registrando a mudança na resistência elétrica ou impedância e a mudança no declínio inicial da agregação após a mudança na forma da plaqueta. O teste de agregação foi realizado duas vezes por amostra em cada dia de coleta e o valor médio foi obtido. O oligonucleotídeo ISIS, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 121
[00593] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na agregação plaquetária em macacos cinomolgos em Ohms
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Pesos do corpo e dos órgãos
[00594] Os pesos corporais foram obtidos uma vez por semana em todo o regime de dosagem. As medições de cada grupo são fornecidas na tabela 122 expressos em gramas. Os resultado indicam que o tratamento com os oligonucleotídeos anti-sentido não causou nenhuma mudança adversa na saúde dos animais, o que pode ter resultado em uma alteração significativa nos pesos comparados ao controle com PBS. Os pesos dos órgãos foram obtidos após os animais serem eutanizados e fígados, rins e baços serem coletados e pesados. Os resultados são apresentados na tabela 123 e também não mostram nenhuma alteração significativa nos pesos comparados ao controle com PBS, exceto com relação a ISIS 416858, que mostra aumento no peso do baço. O oligonucleotídeo ISIS, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 122
[00595] Medições semanais dos pesos corporais (g) de macacos cinomolgos
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Tabela 123
[00596] Os pesos dos órgãos (g) de macacos cinomolgos após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
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Função hepática
[00597] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de transaminases foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Concentrações plasmáticas de ALT (alanina transaminase) e AST (aspartato transaminase) foram medidas e os resultados são apresentados nas tabelas 124 e 125 expressos em IU/L. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de ALT/AST sete vezes abaixo dos níveis controle foram selecionados para estudos adicionais. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos e os resultados são apresentados na tabela 126 expressos em mg/dL. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram um aumento nos níveis de bilirrubina mais de duas vezes dos níveis controle por tratamento com oligonucleotídeo anti- sentido foram selecionados para estudos adicionais. O oligonucleotídeo ISIS, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 124
[00598] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em ALT (IU/L) no fígado de macacos cinomolgos
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Tabela 125
[00599] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em AST (IU/L) no fígado de macacos cinomolgos
Figure img0164
Tabela 126
[00600] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em bilirrubina (mg/dL) no fígado de macacos cinomolgos
Figure img0165
Função renal
[00601] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função renal, amostras de urina foram coletadas. A razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido foi calculada e é apresentada na tabela 127. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram mais de cinco vezes um aumento nas razões proteinúria/creatinina comparados ao controle com PBS foram selecionados para estudos adicionais. Tabela 127
[00602] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na razão de proteinúria para creatinina em macacos cinomolgos
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Medição da concentração do oligonucleotídeo
[00603] A concentração do oligonucleotídeo de comprimento total, bem como o tempo gasto para degradação e eliminação do oligonucleotídeo do fígado e rim foram avaliados. O método usado é uma modificação de métodos publicados previamente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consistem em uma extração com fenol- clorofórmio (líquido-líquido) seguida por uma extração de fase sólida. Um padrão interno (ISIS 355868, um oligonucleotídeo fosforotioato modificado por 2’-O-metoxietila 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, aqui designado como SEQ ID NO: 270) foi adicionado antes da extração. As concentrações de amostra de tecido foram calculadas usando curvas de calibração, com um limite menor de quantificação (LLOQ) de aproximadamente 1,14 μg/g. As meias vidas foram então calculadas usando o software WinNonlin (PHARSIGHT). Os resultados são apresentados nas tabelas 128 e 129, expressos como μg/g de tecido de fígado ou rim. Tabela 128
[00604] Concentração do oligonucleotídeo de comprimento total (μg/g) no fígado e rim de macacos cinomolgos
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Tabela 129
[00605] Concentração do oligonucleotídeo total (μg/g) no fígado e rim de macacos cinomolgos
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Ensaios de hematologia
[00606] O sangue obtido de todos os grupos de macaco foi enviado para Korea Institute of Toxicology (KIT) para análise de HCT, MCV, MCH e MCHC, bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos, linfócitos, monócitos, eosinófilos, basófilos, reticulócitos), RBC, plaquetas e teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 130-143. Os oligonucleotídeos anti-sentido que não afetaram uma diminuição na contagem de plaquetas em mais de 50 % e um aumento na contagem de monócito em mais de três vezes foram selecionados para estudos adicionais. O oligonucleotídeo ISIS, ISIS 416850, fornecido com o regime de dose crônica é distinguido dos outros oligonucleotídeos com um asterisco (*). Tabela 130
[00607] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de WBC (x103/μL) em macacos cinomolgos
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Tabela 131
[00608] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de RBC (x106/μL) em macacos cinomolgos
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Tabela 132
[00609] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em hemoglobina (g/dL) em macacos cinomolgos
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Tabela 133
[00610] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em hematócrito (%) em macacos cinomolgos
Figure img0172
Tabela 134
[00611] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCV (fL) em macacos cinomolgos
Figure img0173
Tabela 135
[00612] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCH (pg) em macacos cinomolgos
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Tabela 136
[00613] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCHC (g/dL) em macacos cinomolgos
Figure img0175
Tabela 137
[00614] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em contagem de plaquetas (x 103/μL) em macacos cinomolgos
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Tabela 138
[00615] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em reticulócitos (%) em macacos cinomolgos
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Tabela 139
[00616] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em neutrófilos (%) em macacos cinomolgos
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Tabela 140
[00617] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em linfócitos (%) em macacos cinomolgos
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Tabela 141
[00618] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em eosinófilos (%) em macacos cinomolgos
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Tabela 142
[00619] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em monócitos (%) em macacos cinomolgos
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Tabela 143
[00620] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em basófilos (%) em macacos cinomolgos
Figure img0182
Ensaios de citocina e quimiocina
[00621] Amostras de sangue obtidas dos grupos de macaco tratados com PBS, ISIS 416850 e ISIS 416858 administrados no regime de dose em escala, foram enviadas para Pierce Biotechnology (Woburn, MA) para medição dos níveis de quimiocina e citocina. Níveis de IL-1β, IL-6, IFN-Y e TNF-α foram medidos usando os respectivos anticorpos de primata e os níveis de IL-8, MIP-1α, MCP-1, MIP-1β e RANTES foram medidos usando os respectivos anticorpos humanos de reação cruzada. As medições foram obtidas 14 dias antes do início do tratamento e no dia 85, quando o macacos foram eutanizados. Os resultados são apresentados nas tabelas 144 e 145. Tabela 144
[00622] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis de citocina/quimiocina (pg/mL) em macacos cinomolgos no dia - 14
Figure img0183
Tabela 145
[00623] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis de citocina/quimiocina (pg/mL) em macacos cinomolgos no dia 85
Figure img0184
Exemplo 46: Efeito farmacológico de oligonucleotídeos anti- sentido que alvejam fator 11 humano em macacos cinomolgos
[00624] Vários oligonucleotídeos anti-sentido escolhidos a partir de estudos de tolerabilidade de roedores (exemplos 41-44) foram testados em macacos cinomolgos para determinar seus efeitos farmacológicos, eficiência relacionada na atividade do fator 11 e tolerabilidade em um modelo de macaco cinomolgo. Os oligonucleotídeos anti-sentido também foram comparados a ISIS 416850 e ISIS 416858, selecionados do estudo de macaco descrito anteriormente (exemplo 45). Todos os oligonucleotídeos ISIS usados neste estudo alvejam o RNAm do fator 11 humano e apresentam também reação totalmente cruzada com a sequência de gene do macaco reso (ver tabelas 44 e 46). Espera-se que os oligonucleotídeos ISIS de macacos reso apresentem reação completamente cruzada com a sequência de gene do macaco cinomolgo igualmente. Durante o período que o estudo foi submetido, a sequência genômica de macaco cinomolgo não estava disponível na base de dados National Center for Biotechnology Information (NCBI); portanto, a reatividade cruzada com a sequência de gene do macaco cinomolgo não pode ser confirmada. Tratamento
[00625] Os grupos, cada um consistindo em dois macacos machos e duas fêmeas, foram injetados subcutaneamente com 25 mg/kg de ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449711, ISIS 449708, 416858 e ISIS 445531. O oligonucleotídeo anti-sentido foi administrado aos macacos em 25 mg/kg três vezes por semana durante a semana 1 e 25 mg/kg duas vezes por semana durante as semanas 2 a 8. Um grupo controle, que consiste em dois macacos machos e duas fêmeas, foi injetado subcutaneamente com PBS de acordo com o mesmo regime de dosagem. Os pesos corporais foram obtidos 14 dias e 7 dias antes do início do tratamento e foram então medidos semanalmente em todo o período de tratamento. As amostras de sangue foram coletadas 14 dias e 5 dias antes do início do tratamento e, subsequentemente, várias vezes durante o regime de dosagem para as medições de PT e aPTT, e medição de vários fatores hematológicos. No dia 55, os macacos foram eutanizados por sangria, mesmo em anestesia profunda, e os órgão foram coletados para análise adicional. Análise de RNA
[00626] No dia 55, o RNA foi extraído do tecido hepático para análise por PCR em tempo real do fator 11 usando conjunto de sonda de oligonucleotídeo iniciador LTS00301. Os resultados são apresentados como inibição percentual do fator 11, com relação ao controle com PBS. Da maneira mostrada na tabela 146, o tratamento com ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 416858 e ISIS 445531 resultou na redução significativa de RNAm do fator 11 em comparação ao controle com PBS. Tabela 146
[00627] Inibição de RNAm do fator 11 no fígado de macaco cinomolgo com relação ao controle com PBS
Figure img0185
Análise protéica
[00628] As amostras de plasma de todos os grupos de macaco obtidas nos diferentes dias foram analisadas por um ensaio ELISA do estilo sanduíche (Affinity Biologicals Inc.) usando um anticorpo anti- fator 11 policlonal purificado por afinidade como o anticorpo de captura e um anticorpo anti-fator 11 policlonal purificado por peroxidase como o anticorpo de detecção. O plasma de macaco foi diluído 1:50 para o ensaio. A atividade da peroxidase foi expressa por incubação com o substrato o-fenilenodiamina. A cor produzida foi quantificada usando um leitor de microplaca a 490 nm e foi considerada ser proporcional à concentração de fator 11 nas amostras.
[00629] Os resultados são apresentados na tabela 147, expressos como redução percentual com relação àquela do controle com PBS. O tratamento com ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522 e ISIS 416858 resultou em uma diminuição dependente do tempo nos níveis de proteína. Tabela 147
[00630] Inibição de proteína do fator 11 no fígado de macaco cinomolgo com relação ao controle com PBS
Figure img0186
Ensaio de PT e aPTT
[00631] PT e aPTT foram medidos usando plasma pobre em plaquetas (PPP) de camundongos tratados com oligonucleotídeos ISIS. Os valores de PT e aPTT são fornecidos nas tabelas 148 e 149 e são relatados como os valores da razão normalizada internacional (INR). Os valores de INR para PT e aPTT foram determinados dividindo o valor PT ou aPTT para cada grupo experimental pelo PT ou aPTT para o grupo tratado com PBS. Esta razão foi então originada com relação à energia do índice de sensibilidade internacional (ISI) do fator do tecido usado. Da maneira mostrada na tabela 148, PT não se prolongou significativamente em camundongos tratados com oligonucleotídeos ISIS. Entretanto, aPTT foi significativamente prolongado em grupos tratados com ISIS 416850, ISIS 445522 e ISIS 416858, da maneira apresentada na tabela 149. Estes dados sugerem que a redução anti-sentido de fator 11 afeta a via de ativação de contato, mas não a via extrínseca de coagulação do sangue. Portanto, redução anti-sentido de fator 11 com estes oligonucleotídeos ISIS é usada para inibir a formação de um trombo ou coágulo em resposta à uma parede de vaso anormal, mas não em resposta à lesão tecidual. Tabela 148
[00632] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na razão de PT em macacos cinomolgos
Figure img0187
Tabela 149
[00633] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na razão de aPTT em macacos cinomolgos
Figure img0188
Figure img0189
Pesos do corpo e dos órgãos
[00634] Os pesos corporais de cada grupo são fornecidos na tabela 150, expressos em gramas. Os resultados indicam que o tratamento com os oligonucleotídeos anti-sentido não causou nenhuma mudança adversa na saúde dos animais, o que pode ter resultado em uma alteração significativa no peso comparado ao controle com PBS. Os pesos dos órgãos foram obtidos após os animais terem sido eutanizados no dia 55, e os fígados, rins e baços foram coletados. Os resultados são apresentados na tabela 150, expressos como um percentual do peso corporal e também n]ão mostram nenhuma alteração significativa nos pesos comparados ao controle com PBS, com a exceção de ISIS 449711, que causou um aumento no peso do baço. Tabela 150
[00635] Medições semanais dos pesos corporais (g) de macacos cinomolgos
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Tabela 151
[00636] Os pesos dos órgãos (g) de macacos cinomolgos após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido
Figure img0191
Função hepática
[00637] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função hepática, concentrações plasmáticas de ALT e AST foram medidas usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Concentrações plasmáticas de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) foram medidas e os resultados são apresentados nas tabelas 152 e 153, expressos em IU/L. Os níveis plasmáticos de bilirrubina também foram medidos e os resultados são apresentados na tabela 154, expressos em mg/dL. Da maneira observada nas tabelas 152-154, não existem aumentos significativos em nenhum dos marcadores metabólicos hepáticos após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 152
[00638] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em ALT (IU/L) no fígado de macacos cinomolgos
Figure img0192
Figure img0193
Tabela 153
[00639] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em AST (IU/L) no fígado de macacos cinomolgos
Figure img0194
Tabela 154
[00640] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em bilirrubina (mg/dL) no fígado de macacos cinomolgos
Figure img0195
Função renal
[00641] Para avaliar o impacto de oligonucleotídeos ISIS na função renal, as amostras de urina foram coletadas em dias diferentes. Os níveis de BUN foram medidos em diversos períodos de tempo usando um analisador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY) e os resultados são apresentados na tabela 155. A razão de proteinúria para creatinina em amostras de urina após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido também foi calculada no dia 49 e os resultados são apresentados na tabela 156. Da maneira observada nas tabelas 155 e 156, não existem aumentos significativos em nenhum dos marcadores metabólicos renais após o tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido. Tabela 155
[00642] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis BUN (mg/dL) em macacos cinomolgos
Figure img0196
Tabela 156
[00643] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na razão de proteinúria para creatinina em macacos cinomolgos
Figure img0197
Ensaios de hematologia
[00644] O sangue obtido de todos os grupos de macaco em diferentes dias foi enviado para Korea Institute of Toxicology (KIT) para medições de HCT, MCV, MCH e MCHC, bem como medições das várias células de sangue, tais como WBC (neutrófilos e monócitos), RBC e plaquetas, bem como teor total de hemoglobina. Os resultados são apresentados nas tabelas 157-166. Tabela 157
[00645] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em HCT (%) em macacos cinomolgos
Figure img0198
Tabela 158
[00646] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de plaquetas (x 100/μL) em macacos cinomolgos
Figure img0199
Tabela 159
[00647] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em neutrófilos (%) em macacos cinomolgos
Figure img0200
Figure img0201
Tabela 160
[00648] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em monócitos (%) em macacos cinomolgos
Figure img0202
abela 161
[00649] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido no teor de hemoglobina (g/dL) em macacos cinomolgos
Figure img0203
Tabela 162
[00650] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de WBC (x103/μL) em macacos cinomolgos
Figure img0204
Tabela 163
[00651] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido na contagem de RBC (x106/μL) em macacos cinomolgos
Figure img0205
Tabela 164
[00652] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCV (fL) em macacos cinomolgos
Figure img0206
Figure img0207
Tabela 165
[00653] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCH (pg) em macacos cinomolgos
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Tabela 166
[00654] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido em MCHC (g/dL) em macacos cinomolgos
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Ensaios de citocina e quimiocina
[00655] As amostras de sangue obtidas de todos os grupos de macaco foram enviadas para Pierce Biotechnology (Woburn, MA) para medições dos níveis de quimiocina e citocina. Níveis de IL-1β, IL-6, IFN-Y, e TNF-α foram medidos usando os respectivos anticorpos de primata e os níveis de IL-8, MIP-1α, MCP-1, MIP-1β e RANTES foram medidos usando os respectivos anticorpos humanos de reação cruzada. As medições foram obtidas 14 dias antes do início do tratamento e no dia 55, quando os macacos foram eutanizados. Os resultados são apresentados nas tabelas 167 e 168. Tabela 167
[00656] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis de citocina/quimiocina (pg/mL) em macacos cinomolgos no dia - 14
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Tabela 168
[00657] Efeito do tratamento com oligonucleotídeo anti-sentido nos níveis de citocina/quimiocina (pg/mL) em macacos cinomolgos no dia 55
Figure img0211
Exemplo 47: Medição de viscosidade de oligonucleotídeos ISIS anti-sentido que alvejam o fator 11 humano
[00658] A viscosidade de oligonucleotídeos anti-sentido que alvejam o fator 11 humano foi medida com o auxílio de oligonucleotídeos anti-sentido de seleção que apresentam uma viscosidade maior que 40 cP, em uma concentração de 165-185 mg/mL.
[00659] Os oligonucleotídeos ISIS (32-35 mg) foram pesados em uma garrafa de vidro, 120 μL de água foram adicionados e o oligonucleotídeo anti-sentido foi dissolvido em solução aquecendo a garrafa a 50 °C. Parte (75 μL) da amostra pré-aquecida foi pipetada em um micro-viscômetro (Cambridge). A temperatura do micro- viscômetro foi ajustada a 25 °C e a viscosidade da amostra foi medida. Uma outra parte (20 μL) da amostra pré-aquecida foi pipetada em 10 mL de água para leitura em UV em 260 nM a 85 °C (instrumento Cary UV). Os resultados são apresentados na tabela 169. Tabela 169
[00660] Viscosidade e concentração do oligonucleotídeos ISIS anti- sentido que alvejam fator 11 humano
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Claims (10)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de fita simples que consiste em 20 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo 20 nucleobases contíguas da SEQ ID NO: 223, e em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados; um segmento em asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; um segmento em asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5' e o segmento em asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil, em que pelo menos uma ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica de fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina; e em que o oligonucleotídeo modificado de fita simples é covalentemente ligado a um grupo conjugado.
2. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de fita simples que consiste em 20 nucleosídeos ligados e tendo uma sequência de nucleobases compreendendo 20 nucleobases contíguas da SEQ ID NO: 223, e em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados; um segmento em asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; um segmento em asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento de asa 5' e o segmento de asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil, em que cada ligação internucleosídica é uma ligação internucleosídica de fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
3. Composto, caracterizado pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo modificado de fita simples que consiste em 20 nucleosídeos ligados e apresenta uma sequência de nucleobase compreendendo 20 nucleobases contíguas da SEQ ID NO: 217, e em que o oligonucleotídeo modificado compreende: um segmento de intervalo que consiste em dez desoxinucleosídeos ligados; um segmento em asa 5' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; um segmento em asa 3' consistindo em cinco nucleosídeos ligados; em que o segmento de intervalo está posicionado imediatamente adjacente e entre o segmento em asa 5' e o segmento em asa 3', em que cada nucleosídeo de cada segmento em asa compreende um açúcar 2'-O-metoxietil, em que pelo menos uma ligação internucleotídica é uma ligação de internucleotídica de fosforotioato, e em que cada citosina é uma 5-metilcitosina.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado de fita simples é covalentemente ligado a um grupo conjugado.
5. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo modificado de fita simples é um sal do oligonucleotídeo modificado de fita simples.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o sal é um sal de sódio ou um sal de potássio.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um diluente farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que o diluente farmaceuticamente aceitável é solução salina tamponada com fosfato (PBS).
8. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso em terapia.
9. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso no: (i) tratamento de uma complicação tromboembólica, em que opcionalmente a complicação tromboembólica é selecionada dentre trombose venosa profunda, embolia pulmonar, enfarte do miocárdio e acidente vascular cerebral; ou (ii) tratamento de um distúrbio de coagulação.
10. Uso do composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, com um membro do grupo selecionado dentre aspirina, clopidogrel, dipiridamol, heparina, lepirudina, ticlopidina, varfarina, apixaban, rivaroxabano e Lovenox, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma complicação tromboembólica, em que a complicação tromboembólica é selecionada dentre trombose venosa profunda, embolia pulmonar, ou uma combinação dos mesmos, enfarte do miocárdio ou acidente vascular cerebral.
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